—120

شکل (1-2) : دسته بندی کلی آنتن های فرکتالیدسته سوم آنتنهای فرکتالی که از نظر کاربرد و تنوع نسبت به دو دسته قبلی معروفیت بیشتری دارند، آنتنهای فرکتالی چندبانده میباشند. در این آنتنها وجود چندین بخش یکسان در مقیاسهای مختلف سبب می شود که آنتن در چندین باند فرکانسی مختلف، عملکرد یکسانی از لحاظ تشعشعی داشته باشد. به این آنتنها اصطلاحاً آنتن های خودمتشابه میگویند. شکل فوق یک نمونه از این آنتنها را که به آنتنهای سرپینسکی معروف هستند، نشان میدهد.
برای کسب اطلاعات بیشتر در خصوص ساختارهای فرکتالی مختلف می توان به مراجع [1] و [2] مراجعه کرد. همچنین در خصوص کاربرد ساختارهای فرکتالی در آنتنها میتوان به مرجع [3] مراجعه کرد. همچنین در مرجع [4] میتوان مروری بر مقالات چاپ شده در خصوص آنتنهای فرکتالی داشت. در مراجع فوق، آنتنهای فرکتالی در دو حالت تک المانی و آرایهای مورد بررسی قرار گرفته است.
1-2 روش ممانبه طور کلی برای تحلیل سیستمهای تشعشعی و آنتنها نیاز به ابزارهای شبیهسازی نیرومندی میباشد، که از آن جمله میتوان به روش ممان اشاره کرد. در این قسمت مروری بر روش ممان جهت تحلیل آنتن های فرکتالی خواهیم داشت. روش ممان در واقع یک تکنیک عددی جهت حل معادلات انتگرالی حاکم بر آنتن می باشد که این معادلات انتگرالی از توزیع جریان بر روی بدنه آنتن به دست می آیند. در واقع معادلات انتگرالی که با استفاده از روش ممان حل می شوند، معادلات میدان الکتریکی می باشند. که این معادلات با فرض شرایط مرزی برای هادی الکتریکی کامل به دست می آیند. لذا در این روش جریان ها از طریق شرط مماسی میدان الکتریکی بر روی سطح آنتن به دست می آیند، یعنی :
Etangentialtotal=Etangentialincident+Etangentialscatterd (1-1)که در عبارت فوق میدان برخوردی، بیانگر میدان در حالت عدم وجود هادی الکتریکی می باشد. و میدان های پراکندگی نیز ناشی از جریان های القایی بر روی سطح آنتن می باشند. حال با استفاده از اصل هم ارزی و فرض جریان بر روی هادی به صورت زیر :
J=nanIn (2-1)می توان معادلات انتگرالی حاکم بر آنتن را به دست آورد. توجه داشته باشید که In در عبارت فوق، توابع پایه شناخته شده ای می باشند، که مجموعه آنها خاصیت متعامد بودن و کامل بودن را امتناع می کنند.
1-3 روش های ساختطراحی و ساخت آنتن های فرکتالی همانند آنتن های پچ مایکرواستریپی میباشند. یعنی از چاپ هادی بر روی لایه ای دی الکتریک به دست میآیند. از آنجا که هر چه ضریب دی الکتریک زیرلایه کوچکتر باشد تلفات زیرلایه کمتر بوده و آنتن دارای خواص تشعشعی بهتری است. لذا یکی از بهترین زیرلایهها هوا میباشد. اما در عمل ساخت آنتنهای فرکتالی با زیرلایهای از هوا بسیار دشوار است. لذا معمولاً آنتنها را بر روی لایهای از دی الکتریک میسازند. تأثیر ضخامت دی الکتریک و ضریب دی الکتریک بر خواص تشعشعی آنتن قابل بررسی می باشد. که نتایج این بررسی در جدول (1-1) آمده است.
جدول (1-1) : تأثیر دی الکتریک زیرلایه بر روی خواص تشعشعی آنتنپارامترهای زیرلایه پهنای باند تلفات بازده تشعشعی
افزایش εrکاهش افزایش کاهش
افزایش ضخامت دی الکتریک افزایش افزایش کاهش
در طراحی و ساخت آنتن های فرکتالی دوقطبی و حلقوی با توجه به انتخاب صحیح تغذیه از اهمیت زیادی برخوردار است. برای مثال استفاده از بالن در این آنتن ها به منظور ایجاد تغذیه مناسب ضروری است.
از جمله تکنیکهای متداول جهت تغذیه آنتنهای دوقطبی، استفاده از آنتنهای تک قطبی در حضور صفحه زمین به دست میآید. روش مشابهی نیز برای آنتنهای حلقوی وجود دارد به طوری که نیمی از حلقه بر روی دی الکتریک چاپ شده و سپس بر روی صفحه زمین مطابق شکل (1-3) قرار میگیرد.

شکل (1-3) : آنتن فرکتالی نیمه حلقوی بر روی صفحه زمین بزرگدر این حالت همان طور که در شکل فوق ملاحظه می کنید، یک طرف حلقه توسط کابل هم محور تغذیه می گردد و طرف دیگر زمین می شود. از آنجا که حلقه در حالت تشدید باید جریانی برابر با صفر در محل اتصال خود با زمین داشته باشد، لذا اتصال زمین تأثیر بسیار کمی در نقطه انتهایی حلقه در حالت تشدید دارد. توزیع جریان در این حالت بنا بر نظریه تصویر، نیاز به صفحه زمین بزرگ می باشد. که این خود مشکلاتی را از جهت ساخت آنتن ایجاد می کند. برای رفع این مشکل معمولاً در ساخت آنتن های حلقوی از روش تغذیه هم صفحه CPS استفاده می شود.


در این روش از کل حلقه به جای نیمی از آن استفاده می شود و در واقع تغذیه هم صفحه به صورت یک بالن عمل می کند. در واقع تغذیه هم صفحه از دو خط انتقال با 180 درجه اختلاف فاز نسبت به هم تشکیل شده است. به همین منظور در این روش از دو خط مایکرواستریپی و خط تأخیر، جهت تغذیه خطوط هم صفحه با 180 درجه اختلاف فاز استفاده می شود. این روش در شکل (1-4) نشان داده شده است.

شکل (1-4) : تغذیه هم صفحه برای یک آنتن حلقویهمان طور که در شکل فوق مشاهده می کنید، اولین قسمت شامل یک خط انتقال مایکرواستریپی و یک خط تأخیری می باشد. که در واقع این قسمت به عنوان تغذیه ای برای بخش CPS می باشد. همان طور که در این شکل مشخص است، صفحه زمین تنها بر زیر بخش مایکرواستریپی قرار دارد. به عبارتی دیگر بخش CPS نیازی به صفحه زمین ندارد.
از آنجا که در روش فوق آنتن حلقوی تنها بر روی لایه ای از دی الکتریک (بدون صفحه زمین) قرار دارد، لذا این امر باعث کند کردن امواج الکترومغناطیسی شده و موجب می شود که آنتن از لحاظ الکتریکی بزرگتر به نظر برسد. با فرض اینکه ضریب دی الکتریک مؤثر زیر آنتن، میانگین ضریب دی الکتریک فضای آزاد و ضریب دی الکتریک زیرلایه باشد، آنگاه می توان طول موج مؤثر امواج الکترومغناطیسی را به صورت زیر محاسبه کرد.
λeff=λλ0 εr+12در تمامی تحلیل های فوق از تأثیر امواج سطحی صرف نظر شده است. در حالی که تأثیر این امواج را می توان از طریق کاهش εr و ضخامت دی الکتریک، کاهش داد.

فصل دومآشنایی با ساختارهای فرکتالی بهبود یافته با ابعاد کوچک2-1 مقدمه
در این فصل هدف بررسی استفاده از ساختارهای فرکتالی جهت کوچک کردن ابعاد آنتن می باشد اما لازم است به منظور درک بهتر ابتدا مروری مختصر بر روند تولید حلقه های فرکتالی در آنت های فرکتال داشته باشیم.
در این فصل ساختارهای فرکتالی حلقوی، دوقطبی و سه بعدی به طور مجزا مورد بررسی قرار می گیرند. در فصل سوم و چهارم با آنتن مایکرواستریپ، طراحی و شبیه سازی این آنتن با ذکر نتایج و مقایسه با کارهای انجام شده خواهیم پرداخت.
2-2 کوچک سازی آنتن مایکرو استریپ با استفاده از ساختارهای فرکتالیبه طور کلی به کارگیری ساختارهای فرکتالی در طراحی آنتن ها نه تنها باعث کوچک شدن ابعاد آنتن و بهبود امپدانس ورودی آنتن می گردد بلکه با استفاده از بعضی از ساختارهای فرکتالی آنتن ها این قابلیت را پیدا می کنند که در چندین باند فرکانسی عمل کنند. پس یکی از مزیت های اساسی استفاده از هندسه فرکتالی در آنتن ها قابلیت حداقل کردن ابعاد آنتن و افزایش نسبت سطح موثر آنتن به سطح واقعی آن می گردد. ساختارهای فرکتالی دارای یک روند تکرارشونده می باشند لذا می توان در یک حجم محدود به سطح و یا طول بسیار زیاد دست پیدا کنند که این خواص ذاتی هندسه های فرکتالی باعث ایجاد ویژگی های مناسبی در تشعشع کننده ها، منعکس کننده ها و آنتن ها می گردد که سبب می شود این ادوات عملکرد بهتری را در محیط انتشاری داشته باشند در این خصوص می توان به ساختارهای فرکتالی همچون درختی، هیلبرت، مینکوسکی و کخ اشاره کرد.
2-3 آنتن فرکتال حلقویبه طور کلی آنتن های حلقوی برای رسیدن به امپدانس ورودی مناسب به منظور تطبیق بهتر با سیستم تغذیه، نیاز به سطح مقطع بزرگ می باشند. یا به عبارتی دیگر آنتن های حلقوی ساده با سطح مقطع کوچک، دارای امپدانس ورودی کمی می باشند که این مشکلات زیادی را برای فراهم کردن شرایط تطبیق آنتن ایجاد می کند.
معمولاً از ساختارهای فرکتالی حلقوی جهت غلبه بر این مشکل استفاده می کنند. شکل (2-1) دو نمونه از ساختارهای فرکتالی حلقوی را نشان می دهد.

شکل (2-1) : دو نمونه از ساختارهای فرکتالی حلقوی، فرکتالی مینکوسکی و فرکتالی کخ [10]در شکل (2-1)، از دو ساختار فرکتالی حلقوی مینکوسکی و کخ استفاده شده است. مهمترین خاصیت هندسه های فرکتالی ذکر شده این است که در یک حجم محدود می توان به محیطی با طول نامحدود رسید. وجود این خاصیت در این ساختارها سبب می گردد تا آنتن هایی که از هندسه های فرکتالی فوق استفاده می کنند، دارای خواص تشعشعی بهتری باشند. برای مثال با افزایش طول آنتن می توان امپدانس ورودی حلقه را افزایش داد. این افزایش امپدانس ورودی، به آنتن کمک می کند تا بتواند بهتر با خط تغذیه ورودی تطبیق گردد.
در ادامه هر دو ساختار شکل (2-1) به طور جداگانه مورد بررسی قرار می گیرند.
2-3-1 آنتن فرکتال حلقوی کخ اولین آنتن فرکتالی حلقوی را که مورد بررسی قرار می دهیم، آنتن حلقوی کخ می باشد. برای طراحی آنتن فرکتالی کخ، همانند شکل (2-2) عمل می کنیم. همانگونه که در این شکل نشان داده شده است، حلقه اولیه در روند تولید ساختار کخ، یک مثلث می باشد. در مرحله بعدی هر کدام از اضلاع این مثلث با یک یک عملگر جایگزین می شود. در زیر شکل (2-2) جایگزینی یک ضلع با عملگر کخ نشان داده شده است. شکل (2-2) چهار تکرار اول در روند تولید ساختار کخ را نشان می دهد.

شکل (2-2) : روند تولید حلقه فرکتالی کخ برای چهار تکرار اول و عملگر کخ [10]با توجه به اینکه عملگر کخ، طول هر ضلع را به اندازه 13 مقدار اولیه اش افزایش می دهد، لذا در هر تکرار، طول محیط کل حلقه به اندازه 13 محیطش، افزایش می یابد.
در طراحی آنتن های فرکتالی حلقوی کخ معمولاً از چند تکرار اول حلقه استفاده می شود که در اینجا چهار تکرار اول حلقه فرکتالی کخ در نظر گرفته شده است، و نتایج آن با آنتن دایره ای مقایسه گردیده است. شکل (2-3) ابعاد این دو ساختار را با هم نشان می دهد. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، به ازای تمامی تکرارها همواره حلقه فرکتالی کخ در داخل حلقه دایره ای محاط می باشد. لذا سطح اشغالی حلقه دایروی همواره بزرگتر از سطح اشغالی توسط حلقه فرکتالی کخ می باشد. برای مثال سطح حلقه فرکتالی اشغال شده در تکرار چهارم به صورت زیر می باشد.
SKoch-loop=1+39+1281+48729+1926561×12 3 32r2=2.05r2 (1-2)در این حالت سطح حلقه دایروی برابر است با :
SKoch-loop=πr2 (2-2)لذا نسبت دو سطح برابر است با :
SKoch-loopScircl-loop=0.65 (3-2)لذا همان طور که رابطه (2-3) نشان می دهد، سطح اشغال شده توسط حلقه فرکتالی کخ پس از چهارمین تکرار، 35% کوچکتر از حلقه دایروی می باشد.

شکل (2-3) : مقایسه حلقه فرکتالی کخ در تکرار چهارم با حلقه دایروی [10]محیط فرکتالی پس از n امین تکرار به صورت زیر محاسبه می شود:
PKoch-loop=3343n (4-2)لذا برای تکرار چهارم محیط حلقه برابر است با :
PKoch-loop=16.42r (5-2)در تمامی این حالات حلقه دایروی دارای محیط زیر می باشد:
Pcircl-loop=2πr (6-2)لذا نسبت محیط حلقه کخ به محیط حلقه دایروی برابر است با :
PKoch-loopPcircl-loop=2.614 (7-2)در بخش های بعدی از این نسبت ها برای توضیح خواص تشعشعی آنتن فرکتالی کخ در مقایسه با آنتن دایروی استفاده می شود. در ادامه نتایج حاصل از اندازه گیری امپدانس ورودی آنتن و پترن راه دور را برای این دو ساختار، که توسط روش ممان به دست آمده است، با هم مقایسه می کنیم. امپدانس ورودی این دو آنتن در شکل (2-4) بر حسب محیط حلقه دایروی در طول موج، نشان داده شده است. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، حلقه دایروی با محیطی برابر با 0.05λ دارای امپدانس ورودی 0.000004Ω می باشد، که این مقدار برای زمانی که حلقه دایروی دارای محیطی برابر 0.26λ باشد، به 1.17Ω افزایش می یابد. این نتایج در حالی است که حلقه فرکتالی کخ در همان گستره فرکانسی، دارای تغییرات امپدانسی ورودی بسیار بالاتری می باشد، یعنی تغییرات فرکانس از نقطه شروع تا انتها، امپدانس ورودی را در گستره (0.000015Ω تا 26.65Ω) تغییر می دهد. اختلال کوچکی که در شکل (2-4) مشاهده می کنید، به محدودیت های عددی موجود در روش ممان مربوط می شود.
در حالت کلی برای یک حلقه کوچک دایروی می توان مقاومت تشعشعی را از رابطه تقریبی زیر محاسبه کرد:
Rr≈31.171 S2λ4 (8-2)
شکل (2-4) : امپدانس ورودی برای دو آنتن حلقوی کخ و آنتن حلقوی دایره ای [10]پترن تشعشعی برای این دو آنتن حلقهای در شکل (2-5) نشان داده شده است. شکل (2-5-a) پترن تشعشعی را در دو صفحه XZ و YZ نشان می دهد و شکل (2-5-b) پترن تشعشعی را در صفحه XY نشان می دهد. باید توجه داشت که در تمامی این حالات آنتن در صفحه XY قرار دارد. سمت گرایی آنتن حلقوی دایره ای برابر با 1.63db می باشد. این در حالی است که برای آنتن حلقوی کخ، این مقدار به 1.53db تغییر می یابد. یک تقریب مرتبه اول برای محاسبه سمت گرایی آنتن حلقوی دایره ای کوچک، به صورت زیر می باشد.
D=4πUmaxP--=32=1.76db (9-2)
شکل (2-5) : پترن تشعشعی برای آنتن حلقوی کخ و آنتن حلقوی دایروی [10]که در عبارت فوق Umax حداکثر تشعشع و P-- کل توان تشعشعی می باشد. سطح مؤثر روزنه برای آنتن حلقوی دایره ای برابر است با :
Aem=λ24πD=0.119λ2 (10-2)با توجه به دو رابطه (2-9) و (2-10) ضریب بازده روزنه برای آنتن حلقوی دایره ای برابر است با :
AemS=0.119λ2π0.0414λ2=22.12 (11-2)این مقادیر بیانگر این است که، سطح مؤثر آنتن دایروی 12/22 برابر بزرگتر از سطح واقعی آن می باشد. برای آنتن فرکتالی کخ ضریب بازدهی روزنه و سطح مؤثر آنتن برابر است با :
Aem=λ24πD=0.113λ2 (12-2)AemS=0.113λ22.050.0414λ2=32.21 (13-2)با توجه به مطالب فوق، ضریب بازدهی روزنه برای آنتن فرکتال کخ 5/1 برابر آنتن حلقوی دایره ای متناظر با آن می باشد، لذا برای رسیدن به گین یکسان برای این دو آنتن، به سطح مقطع کوچکتری در آنتن های فرکتالی در مقایسه با آنتن های حلقوی ساده نیاز می باشد.
با توجه به اینکه پترن تشعشعی برای آنتن حلقوی کوچک همانند آنتن دوقطبی (مغناطیسی) می باشد، لذا در صورتی که محیط حلقه از 0.5λ افزایش یابد با پدیده ایجاد گلبرگ فرعی در پترن تشعشعی آنتن مواجه خواهیم شد.
2-3-2 آنتن فرکتال حلقوی مینکوسکییکی دیگر از آنتن های فرکتالی حلقوی رایج، آنتن مینکوسکی می باشد. در این بخش ضمن بررسی ساختار این آنتن، از طریق مقایسه این آنتن با آنتن مربعی متناظرش، به تفصیر خواص آن می پردازیم. شکل (2-6) آنتن حلقوی مینکوسکی را در چهار تکرار اول نشان می دهد. علاوه بر این در این شکل می توانید عملگر تولید ساختار فرکتالی مینکوسکی را نیز مشاهده کنید. تفاوت اصلی بین ساختار فرکتالی مینکوسکی با ساختار کخ در نوع حلقه ابتدایی آنها می باشد، به طوری که حلقه ابتدایی در ساختار مینکوسکی یک مربع، و در ساختار کخ یک مثلث می باشد.

شکل (2-6) : روند تولید حلقه فرکتالی مینکوسکی برای چهار تکرار اول و عملگر مینکوسکی [10]در عملگر مینکوسکی، طول دو جزء اول و آخر و جزء میانی، هر کدام برابر 13 طول عنصر اولیه می باشند و طول دو جزء دیگر عملگر بسته به کاربرد ساختار، متغیر بوده و به آنها عرض فرورفتگی می گویند.
تغییر عرض فرورفتگی، باعث ایجاد تغییر در ابعاد شکل فرکتالی منتجه شده که این خود باعث تغییر خواص آنتن فرکتالی میشود. به عنوان مثال، افزایش عرض فرورفتگی باعث افزایش ابعاد فرکتال میگردد که نتیجه آن افزایش امپدانس ورودی آنتن میباشد. در ادامه این بخش ابتدا، مقایسهای بین تغییرات فرکانس رزنانس آنتن فرکتالی مینکوسکی و آنتن مربعی خواهیم داشت.
برای این منظور پارامتر فاکتور مقیاس را معرفی می کنیم. این پارامتر معیاری برای مقایسه فرکانس رزنانس آنتن فرکتالی، با آنتن مربعی با عرض λ4 می باشد. شکل (2-7) نتایج مقایسه این دو حلقه را در تکرارهای مختلف و عرض فرورفتگی مختلف، برای فاکتور مقیاس نشان می دهد.

شکل (2-7) : تغییرات فاکتور مقیاس برای تکرارها و عرض فرورفتگی های مختلف آنتن مینکوسکی [10]همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، با افزایش عرض فروروفتگی، تغییرات فرکانس رزنانس مینکوسکی افزایش می یابد. که این نتیجه افزایش طول ساختار فرکتالی، بر اثر افزایش عرض فرورفتگی می باشد.
شکل (2-8) پترن تشعشعی را برای آنتنهای فرکتالی مینکوسکی با درجات تکرار و عرضهای فرورفتگی مختلف نشان می دهد. با توجه به اینکه آنتن ها در صفحه XZ قرار دارند، پترن تشعشعی در صفحه YZ رسم شده است. نتایج حاصل از اندازه گیری سمت گرایی آنتن حلقوی در جدول (2-1) آمده است. همان گونه که در این جدول مشاهده می کنید، سمت گرایی آنتن حلقوی، پس از فرکتالی شدن کاهش ناچیزی پیدا می کند و این در حالی است که ضریب بهره روزنه به شدت افزایش می یابد. یا به عبارتی دیگر، برای رسیدن به سطح مؤثر مشخص، در ساختار فرکتالی نیاز به سطح واقعی بسیار کمتری نسبت به حلقه مربعی، می باشد. برای مثال برای یک حلقه مربعی ساده ضریب بهره روزنه 254/2 می باشد در حالی که برای حلقه فرکتالی مینکوسکی در تکرار دوم و عرض فرورفتگی 9/0 ، ضریب بهره روزنه برابر با 59/11 می باشد. مقایسه سمت گرایی این دو آنتن نیز، تلفات سمت گرایی 1.28db را برای آنتن فرکتالی، در مقایسه با آنتن مربعی نشان می دهد. اگرچه کاهش سمت گرایی نامطلوب می باشد، اما از آنجا که سطح اشغالی آنتن پس از فرکتالی شدن 7 برابر کمتر شده است، این مقدار کاهش سمت گرایی قابل اغماض می باشد.

شکل (2-8) : پترن تشعشعی آنتن فرکتالی مینکوسکی با درجات تکرار و عرض های فرورفتگی مختلف [10]جدول (2-1) : سمت گرایی و سطح مؤثر آنتن های فرکتالی مینکوسکی با درجات تکرار و عرض های فرورفتگی مختلف [10]Indentation Iteration Width Area D0 (dB)AemAemS0.200 1 0.2680 λ0.0654λ23.21 0.1666λ22.547
2 0.2640 λ0.06005λ23.12 0.1632λ22.718
0.333 1 0.2543 λ0.05510λ23.02 0.1595λ22.895
2 0.2462 λ0.04665λ22.87 0.1541λ23.303
0.500 1 0.2379 λ0.04400λ22.82 0.1523λ23.462
2 0.2240 λ0.03284λ22.61 0.1451λ24.420
0.666 1 0.2222 λ0.03477λ22.66 0.1468λ24.223
2 0.2025 λ0.02212λ22.40 0.1383λ26.252
0.800 1 0.2097 λ0.02833λ22.56 0.1435λ25.064
2 0.1862 λ0.01549λ22.27 0.1342λ28.662
0.900 1 0.2010 λ0.2423λ22.51 0.1418λ25.853
2 0.1731 λ0.01132λ22.17 0.1312λ211.59
Square 0 0.2795 λ0.07812λ23.45 0.1761λ22.254
شکل (2-9) و شکل (2-10) آنتن های طراحی شده فوق را برای دو حالت تغذیه در حضور صفحه زمین و تغذیه هم صفحه نشان می دهند.

شکل (2-9) : آنتن های حلقوی فرکتالی مینکوسکی و حلقوی مربعی در حضور صفحه زمین [10]
شکل (2-10) : آنتن های حلقوی فرکتالی مینکوسکی و حلقوی مربعی با تغذیه هم صفحه [10]نتایج حاصل از اندازه گیری تلفات بازگشتی برای آنتن های شکل (2-9)، در شکل (2-11) نشان داده شده است. در این شکل امپدانس مرجع برابر با 50Ω می باشد. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، فرکانس رزونانس تقریباً ثابت نگه داشته شده است، اما در این حالت سطح اشغالی توسط آنتن فرکتالی بسیار پایین تر از آنتن مربعی می باشد. شکل (2-12) پترن تشعشعی این دو آنتن را نشان می دهد. این پترن، پترن صفحه عمود بر آنتن می باشد. نتایج اندازه گیری برای ساختارهای نشان داده شده در شکل (2-10)، بسیار شبیه به نتایج به دست آمده برای ساختارهای شکل (2-9) می باشد.
2-4 آنتن های سه بعدی درختیدر اینجا ضمن بررسی ساختارهای درختی سه بعدی، با چندین رابطه مهم بین خواص تشعشعی این آنتن ها و ساختار اصلی آنها، آشنا می شویم. بدون شک توجه به این روابط، ما را در طراحی صحیح این آنتن ها برای کاربرد مورد نظر، کمک می کند. در ادامه این بخش با چندین مثال از کاربردهای آنتن های درختی سه بعدی، به منظور کوچک کردن ابعاد آنتن های دو قطبی و تک قطبی آشنا می شویم. برای مثال درک نمونه از آنتن های دوقطبی درختی سه بعدی که در این بخش معرفی می گردد، کاهش 57% در ابعاد آنتن و افزایش 70% در پهنای باند را داریم.
2-4-1 مولد ساختار فرکتالی درختیاز آنجا که فرکتال ها ساختارهای خود متشابهی می باشند، لذا به منظور تولید آنها نیاز به تکرار یک مولد می باشد. برای یک ساختار درختی، مولد به صورت اتصالی از چند شاخه کوچک که به بچه شاخه ها معروف می باشند، تشکیل شده است. این شاخه ها از تقسیم یک شاخه اصلی که به شاخه والد معروف می باشد، بدست می آیند.
به طور کلی سه خانواده مختلف آنتن های فرکتالی سه بعدی درختی به منظور ایجاد یک دوقطبی مورد استفاده قرار می گیرند. این سه خانواده مختلف، آنتن های درختی 4 شاخه ای، آنتن های درختی 6 شاخه ای و آنتن های درختی 8 شاخه ای می باشند. به طور کلی آنتن های 4 شاخه ای در این بخش به عنوان یک معیار برای مقایسه آنتن های 6 شاخه ای و 8 شاخه ای مورد استفاده قرار می گیرند. ساختار کلی یک آنتن 4 شاخه ای در چهار تکرار اول آن در شکل (4-1) نشان داده شده است. در جدول (4-1) نیز پارامترهای تولید، برای یک آنتن درختی 4 شاخه ای داده شده است.

شکل (2-11) : چهار تکرار اول برای آنتن های درختی 4 شاخه ایجدول (2-2) : پارامترهای طراحی آنتن درختی 4 شاخه ایRotation Elevation Scale Branch
0°30°0.5 1
90°30°0.5 2
180°30°0.5 3
270°30°0.5 4
براساس پارامترهای داده شده در جدول فوق، مولدهای ساختاری آنتن های درختی 4 شاخهای دارای خواص زیر می باشند. اول اینکه بچه شاخه ها از نظر طول به اندازه نصف شاخه های مولد والد می باشند. دوم اینکه بچه شاخه ها دارای زاویه 30 درجه می باشند. همچنین تمامی بچه شاخهها دارای زاویه 90 درجه نسبت به هم می باشند. برای آنتن های درختی 6 شاخهای زاویه بین بچه شاخهها به 60 درجه و برای آنتنهای درختی 8 شاخهای، زاویه بین بچه شاخهها به 45 درجه کاهش مییابد. جدول (4-2) پارامترهای طراحی را برای آنتن 6 شاخهای و 8 شاخهای را نشان می دهد.
در ادامه این بخش به مقایسه نتایج حاصل از شبیه سازی پارامترهای آنتن 6 شاخه ای و 8 شاخه ای با آنتن 4 شاخه ای می پردازیم. نکته قابل توجه در این مقایسه، یکسان بودن فاصله منبع تا راس برای تمامی آنتن ها می باشد، که این مقدار برابر با cm 5/7 انتخاب شده است. نکته دوم در این مقایسه این است که تمامی آنتن ها از مرکز تغذیه می شوند. با توجه به فرضیات فوق، نتایج حاصل از شبیه سازی برای تلفات بازگشتی آنتن های 8 شاخه ای و 6 شاخه ای برای دو تکرار اول، به همراه چهار تکرار اول آنتن 4 شاخه ای، تماماً در شکل (4-2) نشان داده شده است.
نتایج نشان داده شده در این شکل نشان می دهد که در تمامی آنتن ها با افزایش درجه تکرار، فرکانس های رزنانس کاهش می یابند.
جدول (2-3) : پارامترهای طراحی آنتن درختی 6 شاخه ای و 8 شاخه ای8- Branch Class 6- Branch Class
Rotation
(Ф)Elevation
(θ)Scale Branch Rotation
(Ф)Elevation
(θ)Scale Branch
0°30°0.5 1 0°30°0.5 1
45°30°0.5 2 60°30°0.5 2
90°30°0.5 3 120°30°0.5 3
135°30°0.5 4 180°30°0.5 4
180°30°0.5 5 240°30°0.5 5
225°30°0.5 6 300°30°0.5 6
270°30°0.5 7 315°30°0.5 8
شکل (2-12) : مقایسه پارامتر S11 برای آنتن های 4 شاخه ای، 6 شاخه ای و 8 شاخه ایاز طرفی دیگر نتایج نشان میدهد که آنتن 6 شاخهای دارای فرکانسهایی به اندازه MHz 100 از آنتن 4 شاخهای بوده و این در حالی است که آنتن 8 شاخهای دارای فرکانسهایی به اندازه MHz150 پایین تر از آنتن 4 شاخهای می باشد.
نکته قابل توجه دیگر این است که برای آنتن های 6 شاخه ای و 8 شاخه ای تکرار سوم وجود ندارد. که این بدلیل تقاطع بچه شاخه ها در تکرار سوم این آنتن می باشد. اما با این حال آنتن های 6 و 8 شاخه ای در تکرارهای پایین، نسبت به تکرار های بالای آنتن های 4 شاخه ای عملکرد بهتری دارند، یا به عبارتی دیگر ساختارهای 6 و 8 شاخه ای در تکرارهای پایین، نسبت به تکرارهای بالای آنتن های 4 شاخه ای عملکرد بهتری دارند، یا به عبارتی دیگر ساختارهای 6 و 8 شاخه ای در تکرارهای پایین، قابلیت فشرده سازی بیشتری را برای آنتن، در مقایسه با ساختارهای 4 شاخه ای فراهم می کنند. از طرفی دیگر بدلیل کمتر بودن تعداد اتصالات در آنتن های 6 و 8 شاخه ای در تکرارهای پایین، نسبت به آنتن های 4 شاخه ای در تکرارهای بالا، ساخت آنتن های 6 و 8 شاخه ای راحت تر می باشد.
علیرغم پیچیدگی آنتن های فرکتالی درختی سه بعدی، پترن آنها به پترن آنتن دوقطبی معمولی بسیار نزدیک می باشد. شکل (4-3) مقایسه ای را بین پترن تشعشعی برای آنتن های درختی 4، 6 و 8 شاخه ای با آنتن دوقطبی معمولی نشان می دهد. پلاریزاسیون تداخلی برای پترن تشعشعی این آنتنها بسیار ناچیز(کمتر از dB150-) می باشد.

شکل (2-13) : پترن تشعشعی برای آنتن های درختی 4، 6 و 8 شاخه ای2-4-2 مولد ساختار فرکتالی درختی با زاویه متغیردر این قسمت هدف بررسی تأثیر تغییرات زاویه بین شاخه ای θ بر روی خواص تشعشعی آنتن های 4 شاخه ای در تکرار دوم و سوم می باشد. در این آنتن ها زاویه بین شاخه ای از 10 تا 90 درجه در تغییر است. در این حالت سایر پارامترهای طراحی برای این آنتن ثابت در نظر گرفته می شود. شکل (2-14) ساختار چند نمونه از این آنتن ها را نشان می دهد. جدول (2-4) نیز پارامترهای طراحی را برای ساختارهای شکل (2-14) نشان می دهد.
نتایج حاصل از شبیه سازی نسبت موج ایستان (VSWR) برای آنتن 4 شاخه ای برای تکرارهای دوم و سوم، به ازای مقادیر مختلف زاویه بین شاخه ای، در شکل (2-15) نشان داده شده است. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، تغییرات نسبت موج ایستان برای این آنتن به ازای فرکانس های مختلف، روند یکسانی ندارد. به عبارتی دیگر در زاویه بین شاخه ای نزدیک 50 درجه، روند تغییر فرکانس به منظور افزایش VSWR، تغییر می کند.
پترن تشعشعی برای آنتن ها نسبت به تغییرات زاویه بین شاخه ای، ثابت بوده و شبیه شکل (2-13) می باشد.

شکل (2-14) : آنتن 4 شاخه ای در تکرار سوم، برای چند زاویه بین شاخه ای متغیرجدول (2-4) : پارامترهای طراحی برای آنتن 4 شاخه ای در تکرار سوم94869075565Rotation
(Ф)Elevation
(θ)Scale Branch
0°10°→90°0.5 1
90°10°→90°0.5 2
180°10°→90°0.5 3
270°10°→90°0.5
4
00Rotation
(Ф)Elevation
(θ)Scale Branch
0°10°→90°0.5 1
90°10°→90°0.5 2
180°10°→90°0.5 3
270°10°→90°0.5
4

شکل (2-15) : نسبت موج ایستان برای آنتن 4 شاخهای برای تکرارهای دوم و سوم برای زوایای بین شاخهای مختلف2-4-3 ساختارهای فرکتالی درختی مرکبهمان طور که در قبل مشاهده کردیم، آنتن درختی 8 شاخه ای، در حالت عادی تکرارهای سوم و بالاتر را دارا نمی باشد. برای رفع این مشکل معمولاً از یک سری تغییرات بر روی مولد ساختار 8 شاخه ای استفاده می شود.
یک نمونه از آنتنهایی که برای رفع این مشکل مورد استفاده قرار میگیرند. آنتنهای مرکب میباشند که در ادامه مورد بررسی قرار میگیرند. شکل (2-16) آنتن درختی 8 شاخهای مرکب را برای سه تکرار اول نشان میدهد. جدول (2-4) پارامترهای طراحی را برای آنتن درختی 8 شاخهای مرکب، نشان میدهد. در این آنتن، برخلاف آنتن 8 شاخهای بخش قبل، طول تمامی بچه شاخهها برابر نمیباشد، بلکه بچه شاخهها در زوایای (0 و 90 و 180 و 270 درجه) دارای طولی برابر با نصف طول شاخه والد بوده و بچه شاخهها در زوایای (45 و 135 و 225 و 315 درجه) دارای طولی برابر با 4/0 طول شاخه والد میباشند. لذا در ساختار 8 شاخهای مرکب، آنتن، ترکیبی از بچه شاخهها با طولهای نابرابر میباشد. سایر پارامترهای طراحی برای آنتن 8 شاخهای مرکب مانند آنتن 8 شاخهای در بخش قبل میباشد. نتایج حاصل از شبیه سازی برای پارامتر S11 آنتن 8 شاخه ای مرکب در شکل (2-17) نشان داده شده است. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، در این آنتن یک کاهش در فرکانس های رزونانس در مقایسه با آنتن 4 و 6 شاخه ای متناظر، دیده می شود. پترن تشعشعی برای آنتن 8 شاخه ای مرکب نیز همانند دو قطبی معمولی می باشد.

شکل (2-16) : آنتن درختی 8 شاخه ای مرکب، برای سه تکرار اولجدول (2-5) : پارامترهای طراحی برای آنتن درختی 8 شاخه ای مرکبRotation(Ф)Elevation(θ)Scale
Branch
0°30°0.5 1
45°30°0.4 2
90°30°0.5 3
135°30°0.4 4
180°30°0.5 5
225°30°0.4 6
270°30°0.5 7
315°30°0.4 8

شکل (2-17) : نتایج حاصل از شبیه سازی برابر پارامتر S11 آنتن 8 شاخه ای مرکب2-4-4 آنتن های درختی با شاخه مرکزیدر این بخش با نمونهای از آنتنهای درختی آشنا میشویم که در آنها به منظور افزایش چگالی شاخههای مرکزی استفاده شده است. استفاده از شاخه مرکزی باعث کاهش فرکانس رزنانس در آنتنهای درختی میگردد. در این بخش دو ساختار فرکتالی درختی با شاخه مرکزی و بدون شاخه مرکزی با هم مقایسه میشوند. در این حالت آنتن درختی انتخاب شده، آنتن 4 شاخهای می باشد. ساختار کلی این آنتنها در شکل (2-18) نشان داده شده است و پارامترهای طراحی این آنتن در جدول (2-5) آمده است. مقایسه نتایج حاصل از شبیهسازی برای آنتن درختی با شاخه مرکزی، یک جابجایی فرکانسی منفی را برای فرکانسهای رزنانس، در مقایسه با آنتن درختی بدون شاخه مرکزی نشان میدهد. البته میزان تلفات بازگشتی برای آنتن درختی با شاخه مرکزی، به مقدار ناچیزی افزایش یافته است. این نتایج را در شکل (2-19) مشاهده میکنید. براساس نتایج داده شده در این شکل، میزان کاهش فرکانس برای آنتن درختی با شاخه مرکزی برابر با MHz60، و میزان افزایش پارامتر S11 نیز برابر با dB1 تا dB3 میباشد. پترن تشعشعی برای آنتن ها نیز شبیه به آنتنهای دوقطبی ساده میباشد.
جدول (2-6) : پارامترهای طراحی آنتن 4 شاخه ای درختی، با شاخه مرکزی و بدون شاخه مرکزی8- Branch, 45° Tree with Center stub 4- Branch,45° Tree
Rotation
(Ф)Elevation
(θ)Scale Branch Rotation
(Ф)Elevation
(θ)Scale Branch
45°45°0.5 1 45°45°0.5 1
135°45°0.5 2 135°45°0.5 2
225°45°0.5 3 225°45°0.5 3
315°45°0.5 4 315°45°0.5 4
45°0°0.5 5
شکل (2-18) : آنتن های درختی 4 شاخه ای با شاخه مرکزی و بدون شاخه مرکزی
شکل (2-19) : نتایج حاصل از شبیه سازی برای پارامتر S11 آنتن 4 شاخه ای با شاخه مرکزی و بدون شاخه مرکزی2-4-5 آنتن درختی تک قطبی با بارگزاری راکتیودر این بخش به بررسی آنتن هایی می پردازیم که با استفاده از بارگزاری راکتیو در آنها امکان ایجاد چندین فرکانس رزنانس فراهم می شود. این بار راکتیو به صورت اتصال باز برای بازه ای از فرکانس و به صورت اتصال کوتاه برای بازه دیگری از فرکانس عمل می کند. که این ویژگی سبب می گردد که این آنتن ها بتوانند به صورت خود ساخته، طول الکتریکی خود را تغییر دهند. استفاده از نظریه فوق برای ساختارهای فرکتالی درختی باعث ایجاد آنتنی می شود که نه تنها در بیش از یک فرکانس رزنانس می کند، بلکه از لحاظ ابعاد نیز کوچک می باشد.
اولین ساختاری که در این بخش مورد بررسی قرار می گیرد، ساختار درختی 4 شاخه ای می باشد که بر روی شاخه اصلی آن یک اتصال LC موازی قرار دارد. در این حالت در فرکانس های پایین به دلیل اتصال کوتاه شدن مدار LC موازی، طول آنتن برابر طول یک آنتن درختی 4 شاخه ای ساده می باشد و این در حالی است که برای فرکانس های بالا به دلیل اتصال باز شدن مدار LC موازی، طول آنتن تنها برابر با طول شاخه اصلی آنتن درختی 4 شاخه ای می باشد. با توجه به توضیحات فوق این آنتن درای کاری می باشد. به منظور ایجاد آنتن سه بانده می توان از دو اتصال LC موازی، به صورت سری نسبت به هم بر روی شاخه اصلی استفاده کرد. شکل (2-20) ساختار کلی آنتن 4 شاخه ای درجه سوم را برای بارگزاری راکتیو، در دو حالت دو بانده و سه بانده نشان می دهد. جدول (2-7) نیز محل قرار گرفتن بارها را نشان می دهد.
مقادیر S11 برای این ساختارها در شکل (2-21) نشان داده شده است. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، استفاده از المان بارگزاری، علاوه بر ایجاد آنتن چند بانده باعث ایجاد کاهش در فرکانس رزنانس نیز می گردد. که این خود یکی دیگر از امتیازات استفاده از این ساختار نسبت به آنتن درختی معمولی می باشد.
شکل (2-22) پترن تشعشعی را برای تمامی فرکانس های رزنانس در آنتن های 4 شاخه ای تک بانده، دوبانده و سه بانده نشان می دهد. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید پترن تشعشعی برای آنتن بدون بارگزاری در فرکانس رزنانس MHz910 تنها دارای یک گلبرگ اصلی می باشد. فرکانس رزنانس دوم در این آنتن، که ناشی از مد رزنانسی دوم می باشد، برابر با MHz6100 بوده و پترن آن دارای دو گلبرگ اصلی می باشد. برای آنتن درختی با یک المان بارگزاری اولین فرکانس های رزنانس برابر با MHz 800 و MHz2460 می باشند که پترن تشعشعی برای این دو فرکانس بسیار به هم نزدیک می باشند. دومین فرکانس رزنانس آنتن درختی با یک المان بارگزاری نیز برابر با MHz 5240 می باشند. پترن تشعشعی برای این سه فرکانس بسیار به هم نزدیک می باشند.
در ادامه به بررسی یک آنتن تک قطبی 4 شاخه ای با زاویه θ=45° در تکرار سوم می پردازیم. در این ساختار از اتصالات LC سری، برای بارگزاری آنتن استفاده شده است. نکته قابل توجه در این ساختار این است که اتصالات سری LC می توانند بر روی هر دو نوع شاخه اصلی و یا بچه شاخه قرار گیرند. بطور کلی قابلیت قرارگیری کلیدهای LC بر روی قسمت های مختلف ساختار درختی، باعث ایجاد درجات آزادی زیادی در طراحی این آنتن ها می شود. در واقع به هنگامی که المان LC بر روی شاخه اصلی قرار دارد، فرکانس های رزنانس آنتن چند بانده در فاصله زیادی نسبت به هم قرار دارند.

شکل (2-20) : آنتن 4 شاخه ای درجه سوم بارگزاری شده، در دو حالت دو بانده و سه باندهجدول (2-7) : پارامترهای طراحی آنتن 4 شاخه ای درجه سوم بارگزاری شده، در دو حالت دوبانده و سه باندهDual- band Loaded Fractal Tree Monopole Antenna
C L Distance
From Ground Plane Branch
Length Position
Configuration Load
#
0.5pF 10nH 1.95 cm 2 cm Base Parallel 1
Tri- band Loaded Fractal Tree Monopole Antenna
C L Distance
From Ground Plane Branch
Length Position
Configuration Load
#
0.5pF 10nH 1.95 cm 2 cm Base Parallel 1
50nF 50μH 1.65 cm 2 cm Base Parallel 2

شکل (2-21) : پارامتر S11 آنتن 4 شاخه ای درجه سوم بارگزاری شده
شکل (2-22) : پترن تشعشعی آنتن 4 شاخه ای درجه سوم بارگزاری شدهعلت این اثر نیز، اختلاف زیاد طول الکتریکی آنتن برای فرکانس های رزنانس مختلف می باشد. به همین ترتیب، با قراردادن المان LC بر روی شاخه فرعی، این امکان به طراح داده می شود که بسته به نیاز خود فاصله بین باندهای مختلف آنتن چند بانده درختی را کاهش دهد. ساختار کلی آنتن 4 شاخه ای بارگزاری شده با المان های LC سری، در شکل (2-23) نشان داده شده اند. جدول (2-7) نیز پارامترهای طراحی را برای این آنتن نشان می دهد.
نتایج شبیه سازی، وجود سه فرکانس رزنانس MHz330 و MHz 800 و MHz2220 را برای این آنتن نشان می دهد. که این نتایج در شکل (2-24) نشان داده شده است. در این آنتن از یک شبکه تطبیق به منظور ایجاد تطبیق در تمامی فرکانس ها استفاده شده است. ساختار کلی این شبکه در شکل (2-25) نشان داده شده است. جهت کسب اطلاعات بیشتر در خصوص نحوه انتخاب این شبکه می توانید به مرجع مراجعه کنید. در نهایت نیز پترن تشعشعی برای این آنتن در شکل (4-26) نشان داده شده است. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید پترن تشعشعی در هر سه فرکانس رزنانس این آنتن دارای یک گلبرگ می باشد.

شکل (2-23) : ساختار آنتن 4 شاخه ای بارگزاری شده با 5 المان LC سریجدول (2-8) : پارامترهای طراحی آنتن 4 شاخه ای بارگزاری شده با 5 المان LC سریLoaded Tri- band Center Stubbed Fractal Tree Monopole Antenna
C L Distance
From Base
Of Branch Branch
Length Position Configuration Load
#
50nF 50nH 0.1 cm 1 cm Center Stub 1st Stage Series 1
5nF 600nH 0.9 cm 1 cm Outer branch
1st Stage Series 2
5nF 600nH 0.9 cm 1 cm Outer branch
1st Stage Series 3
5nF 600nH 0.9 cm 1 cm Outer branch
1st Stage Series 4
5nF 600nH 0.9 cm 1 cm Outer branch
1st Stage Series 5

شکل (2-24) : پارامتر S11 آنتن 4 شاخه ای بارگزاری شده با 5 المان LC سری
شکل (2-25) : شبکه تطبیق برای آنتن 4 شاخه ای بارگزاری شده با 5 المان LC سری
شکل (2-26) : پترن تشعشعی برای آنتن 4 شاخه ای بارگزاری شده با 5 المان LC سریتا اینجا با چند نمونه از آنتن های درختی سه بعدی آشنا شدیم. استفاده اصلی این ساختارها جهت کوچک کردن ابعاد آنتن های دوقطبی و یا تک قطبی می باشد. در ادامه این فصل با ساختارهای فرکتالی سه بعدی هیلبرت آشنا می شویم.
2-5- آنتن های سه بعدی هیلبرتدر این بخش با یکی دیگر از آنتن های فرکتالی سه بعدی آشنا می شویم. ویژگی اصلی این آنتن ها وجود گین قابل قبول برای باندهای مختلف می باشد. پهنای باند امپدانسی برای این ساختارها به اندازه ای می باشد که می توان از آن ها جهت پوشش سیستم های DCS و PCS و UMTS استفاده نمود. در این بخش با دو نمونه از ساختارهای سه بعدی هیلبرت آشنا می شویم. که ضمن بررسی خواص آنها با نتایج حاصل از شبیه سازی و اندازه گیری این ساختارها نیز آشنا می شویم.
2-5-1 ساختارهای هیلبرت سه بعدی معمولی
اولین ساختار هیلبرتی که مورد بررسی قرار می دهیم، ساختار هیلبرت معمولی می باشد. نمای کلی این آنتن ها در تکرارهای اول، دوم و سوم در شکل (2-27) نشان داده شده است. این آنتن ها دارای ضخامت mm 2/0 و عرض mm 10 و mm 5 و mm5/2 به ترتیب برای تکرارهای اول، دوم و سوم می باشند. از طرفی دیگر اندازه طول هر المان آنتن سه بعدی هیلبرت در شکل (2-27)، یعنی پارامترهای L1 , L2, L3، برابر با mm10 و mm20 و mm40 می باشد و عرض هر المان نیز (W1,W2,W3)، برابر با mm5/2 و mm 5 و mm10 می باشد. این آنتن ها در ارتفاع mm3 از صفحه زمینی با ابعاد mm70 mm ×70 قرار گرفته اند.
تغذیه این آنتن ها نیز از طریق یک کابل هم محور در فاصله mm5/2 از ابتدای بازوهای آزاد برای تکرار اول و دوم و در فاصله mm 5/1 برای تکرار سوم، فراهم می شود. همان طور که در شکل (2-27) نشان داده شده است، آنتن فرکتالی سه بعدی هیلبرت در تکرار سوم در دو حالت مورد بررسی قرار گرفته است. در حالت اول آنتن در فضای آزاد قرار دارد و در حالت دوم آنتن در داخل یک استوانه دی الکتریک قرار گرفته است. در ادامه نتایج حاصل از شبیه سازی این دو آنتن مورد بررسی قرار می گیرد.
2-5-1-1 آنتن هیلبرت سه بعدی معمولی در فضای آزادشکل (2-28) نتایج حاصل از شبیه سازی پارامتر S11، را برای این آنتن را در تکرارهای مختلف نشان می دهد.

شکل (2-27) : آنتن هیلبرت سه بعدی معمولی در سه تکرار اول
شکل (2-28) : پارامتر S11 برای آنتن هیلبرت سه بعدی معمولی در سه تکرار اولبراساس آنچه در شکل (2-28) مشاهده میکنید، تعداد فرکانسهای رزنانس برای آنتن هیلبرت معمولی با افزایش درجات تکرار افزایش مییابد. نکته قابل توجه در این شکل این است که فرکانسهای رزنانس در این آنتن همانند آنتن سرپینسکی، متناوب لگاریتمی نمیباشند. شکل (2-29) نیز پترن تشعشعی را برای این آنتن در فرکانس GHz 5 در تکرارهای مختلف نشان می دهد. در این حالت گین آنتن برای تکرارهای اول، دوم، و سوم به ترتیب برابر با 3dBi و 7dBi و 6dBi می باشد. همان طور که در شکل (2-29) مشاهده می کنید، آنتن هیلبرت معمولی دارای پترن نامتقارن می باشد که این ویژگی به دلیل خاصیت نامتقادن ساختار آنتن هیلبرت می باشد. نکته دوم اینکه، با توجه به شکل (2-28) این آنتن دارای تلفات بازگشتی زیادی در اغلب باندهای رزنانسی می باشد. یک راه حل ساده برای رفع این مشکل استفاده از آنتن هیلبرت سه بعدی معمولی در داخل استوانه دی الکتریک، می باشد، که در ادامه مورد بررسی قرار می گیرند.

شکل (2-29) : پترن تشعشعی برای آنتن هیلبرت معمولی در فرکانس GHz5، برای تکرار اول (a) و برای تکرار دوم (b) و برای تکرار سوم (c)2-5-1-2 آنتن هیلبرت سه بعدی معمولی در داخل استوانه دی الکتریکهمان طور که اشاره شد، هدف از استفاده آنتن هیلبرت معمولی در داخل استوانه دی الکتریک، کاهش تلفات بازگشتی می باشد. در این بخش نتایج حاصل از بررسی آنتن هیلبرت معمولی در تکرار سوم را، که در داخل یک استوانه ای از دی الکتریک قرار دارد مورد بررسی قرار می دهیم. ضرایب دی الکتریک برای ماده داخل استوانه دو مقدار 07/1 و 25/2 انتخاب شده است. شکل (2-30) نتایج حاصل از شبیه سازی این آنتن ها را نشان می دهد. همان طور که در این شکل مشاهده می کنید، هنگامی که استوانه دارای ضریب دی الکتریک 07/1 می باشد، عملکرد آنتن در فرکانس های پایین مانند حالت فضای آزاد می باشد. این درحالی است که برای استوانه دارای ضریب دی الکتریک 25/2، آنتن باند فرکانسی بالای خود را در فضای آزاد از دست خواهد داد و به جای آن در فرکانس های پایین دارای دو باند می گردد.

شکل (2-30) : پارامتر S11 برای آنتن هیلبرت سه بعدی معمولی در تکرار سوم در فضای آزاد و محیط دی الکتریک2-5-2 آنتن هیلبرت سه بعدی معکوسیکی دیگر از ساختارهای هیلبرت سه بعدی، آنتن های هیلبرت معکوس می باشند، که نمای کلی آنها در شکل (2-31) نشان داده شده است. در این ساختارها بدلیل تقارن آنتن و قرار گرفتن محل تغذیه در مرکز، پترن تشعشعی این آنتن ها در مقایسه با آنتن های هیلبرت معمولی دارای کیفیت بهتری می باشد. نتایج حاصل از شبیه سازی این آنتن ها برای سه تکرار اول در شکل (2-32) نشان داده شده است. شکل (2-33) نیز پترن تشعشعی برای این آنتن در سه تکرار اول نشان می دهد. با توجه به این نتایج، گین بدست آمده برای این آنتن در سه تکرار اول به ترتیب برابر با 8dBi و 6dBiو 6dBi می باشد. که مقادیر بدست آمده بهبود گین این آنتن را در مقایسه با آنتن هیلبرت معمولی نشان می دهد.
همانگونه که در این بخش مشاهده کردید، با چند نمونه از آنتن های فرکتالی سه بعدی هیلبرت آشنا شدیم. نتایج بدست آمده در این بخش نشان می دهد که از این آنتن ها می توان برای کاربردهای چند بانده که نیاز به گین بیشتری می باشد استفاده نمود. مطمئناً به منظور افزایش پهنای باند امپدانسی و کاهش ابعاد این آنتن ها، نیاز به تغییرات بیشتری در این ساختارها می باشد. برای کسب اطلاعات بیشتر در این مورد می توان به مراجع 29 و 30 رجو ع کرد.

شکل (2-31) : آنتن هیلبرت سه بعدی معکوس در سه تکرار اول
شکل (2-32) : پارامتر S11 برای آنتن هیلبرت سه بعدی معکوس در سه تکرار اول
شکل (2-33) : پترن تشعشعی برای آنتن هیلبرت معکوس در فرکانس GHz5، برای تکرار اول (a)، تکرار دوم (b) و تکرار سوم (c)فصل سومآنتن های مایکرو استریپ3-1 مقدمهدر این فصل با آنتن های مایکرواستریپ ویژگی، عملکرد و میدان تشعشعی در این آنتن ها آشنا می شویم.
در ادامه روش های تغذیه آنتن مایکرو استریپ اشاره خواهیم کرد و سپس روش های کاهش ابعاد آنتن مایکرواستریپ را به طور جامع مورد بررسی قرار می گیرد.
3-2 تعریف آنتن های مایکرو استریپیک آنتن مایکرواستریپ، همان طور که در شکل(3-1) نشان داده شده است، شامل یک عایق است که در یک طرف آن، صفحه زمین و در طرف دیگر آن، صفحه تشعشعی قرارگرفته است که این صفحه تشعشع کننده هادی، شکلهای مختلفی میتواند داشته باشد ولی معمولا شکلهایی مورد استفاده قرار میگیرند که بتوان به راحتی مورد تحلیل قرار داد.
جنس هادی، معمولا مس و طلا انتخاب میشود و جنس لایه عایق معمولا به گونهای باید باشد که میدانهای پراکندگی و تشعشع کننده از لبههای آنتن بیشتر باشد، بنابراین ثابت دیالکتریک باید تا حد امکان کم باشد[1]-[3] .
وقتی فرکانس سیگنال به فرکانس تشدید نزدیک میشود، دامنه جریانهای سطحی که روی هادی جریان پیدا میکنند اهمیت مییابند و تشدید هنگامی اتفاق میافتد که اندازه هادی به اندازه نصف طول موج برسد. رزوناتورهای مایکرواستریپ را میتوان به دو دسته اصلی طبقه بندی کرد که بستگی به نسبت طول به عرض آنتنها دارد.

user8314

جدول 3-4 : تغییرات ابعادی افقی بافت نرم در 1، 3 و 7 میلیمتری از CEJ دو دندان
مجاور48
جدول 3-5 : تغییرات عمودی بافت سخت در نقاط باکال، مزیوباکال و دیستوباکال از CEJ
دو دندان مجاور50
جدول 3-6 : تغییرات عمودی بافت سخت در نقاط پالاتال،مزیوپالاتال و دیستوپالاتال
از CEJدو دندان51
جدول 3-7 : تغییرات عمودی بافت سخت در نقاط دیستال و مزیال از CEJ دو دندان
مجاور52
جدول 3-8 : تغییرات افقی بافت سخت در 1، 3 و 7 میلیمتری خطوط واصل CEJ دو دندان
مجاور54
فهرست نمودارها
نمودار3-1: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه میدباکال در گروه تست و کنترل44
نمودار3-2: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه میدپالاتال در گروه تست و کنترل45
نمودار3-3: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه دیستال در گروه تست و کنترل46
نمودار3-4: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه مزیال در گروه تست و کنترل47
نمودار 3-5: تغییرات افقی بافت نرم از 1 میلی متری خط واصل دو CEJ دندان مجاور48
مودار 3-6: تغییرات افقی بافت نرم از 3 میلی متری خط واصل دو CEJ دندان مجاور49
نمودار 3-7: تغییرات افقی بافت نرم از 7 میلی متری خط واصل دو CEJ دندان مجاور49
نمودار 3-6: تغییرات عمودی بافت سخت در نقطه مبدباکال50
نمودار 3-7: تغییرات عمودی بافت سخت در نقطه میدپالاتال51
نمودار 3-8: تغییرات عمودی بافت سخت درنقطه دیستال52
نمودار3-9: تغییرات عمودی بافت سخت در نقطه مزیال53
نمودار 3-10: تغییرات افقی بافت سخت در 1 میلیمتری از خط واصل دو CEJ دندان
مجاور55
نمودار 3-11: تغییرات افقی بافت سخت در 3 میلیمتری از خط واصل دو CEJ دندان
مجاور55
نمودار 3-12: تغییرات افقی بافت سخت در 7 میلیمتری از خط واصل دو CEJ دندان
مجاور56

چکیده :
مقدمه:
ایمپلنت گذاری فوری در دندان های تک ریشه دارای مزایایی است که از جمله می توان به حفظ استخوان موجود اشاره کرد.هدف از این مطالعه بررسی تغییرات ریج پس از قراردادن فوری ایمپلنت درمقایسه با خارج کردن معمولی دندان و ترمیم ساکت دندانی به صورت طبیعی بود.
مواد و روش کار:
این مطالعه بر روی 21 بیمار با دندان تک ریشه Hopeless جهت گذاشتن ایپملنت انجام شده است. پس از قالب گیری و تهیه قالب گچی بیماران در 2 گروه تست و کنترل به طوری تقسیم شدند که در هر گروه 12 ساکت دندانی قرار گرفت. در دو گروه دندان به صورت آتروماتیک خارج شد. بعد با کولینگوالی استخوان ناحیه در فواصل 1 و 3 و 7 میلیمتری از CEJ دو دندان مجاور و فاصله عمودی CEJ تا لبه ی کرست استخوان در 8 نقطه میدباکال، میدپاتال ، مزیال، دستیال ، دیستوباکال، دیستوپالاتال ، مزیوباکال، مزیوپالاتال اندازه گیری شد. در گروه تست در ناحیه ایمپلنت Biohorizone قرار داده شد ودر گروه کنترل ساکت ها برای ترمیم طبیعی به حال خود گذاشته شد. 4 ماه بعد در هر دو گروه فلپ کنار زده شد واندازه گیری ها عینا تکرار گردید اندازه گیری های بافت نرم نیز مشابه بافت سخت و با استفاده از کست ها و استنت های ساخته شده مشابه قبل اندازه گیری و ثبت شد.

یافته ها:
تغییرات عمودی بافت نرم در تمام نقاط اندازه گیری شده در گروه تست نسبت به گروه کنترل کمتر بود و این اختلاف فقط در ناحیه میدباکال معنی دار نبود و در سایر نقاط معنی دارد.
تغییرات ابعادی افقی بافت نرم نیز در 1 و3 و7 میلیمتری از CEJ دندان های مجاور در گروه تست کمتر از گروه کنترل بود.
تغییرات عمودی بافت سخت نیز در تمامی نقاط اندازه گیری شده در گروه تست کمتر از گروه کنترل بود. البته این تغییرات درنواحی میدباکال ومیدپالاتال معنی دار بود.
تغییرات افقی بافت سخت نیز در نواحی 1و 3 و 7 میلیمتری از CEJ دندان های مجاور در گروه تست کمتر بود که در ناحیه 7 میلیمتری این تغییر معنی دار نبود.
نتیجه گیری:
بر اساس یافته های مطالعه حاضر می توان نتیجه گیری کرد که قراردادن ایمپلنت فوری در محل ساکت دندان تازه کشیده شده برای کاهش دادن تغییرات عمودی و افقی استخوان و نیز جهت کاهش تغییرات عمودی و افقی بافت نرم ناحیه موثر می باشد.
کلمات کلیدی:
ایمپلنت فوری – خارج کردن دندان- تغییرات ابعادی ریج الوئل
-320664-922595ل
فصل اول
مروری بر متون و مقالات
کلیات :
روند ترمیم ساکت دندان های خارج شده :
ترمیم ساکت دندان های خارج شده با یک سری تغییرات داخلی که منجر به تشکیل استخوان در داخل ساکت و یک سری تغییرات خارجی که منجر به از دست رفتن عرض و ارتفاع ریج آلوئول می شود، مشخص می گردد. پس از خارج کردن دندان، خونریزی اتفاق می افتد، به دنبال آن با تشکیل لخته ساکت راپر می کند، با شروع واکنش التهابی سلول های تحریک شده بافت جوانه ای (Granulation) ایجاد می کند، طی 48 تا 72 ساعت، به همان نسبتی که بافت جوانه ای رشد می کند، لخته شروع به از بین رفتن کرده، جای لخته راپر می کند و بافت همبند نابالغ تشکیل می شود.
پس از هفت روز بافت جوانه ای به طور کامل جایگزین لخته خونی شده است، در این مرحله وجود Osteoid در قاعده ساکت به صورت تکه هائی از استخوان غیرکلسیفیه مشهود است. دو هفته بعد از کشیدن دندان، استخوان woven (استخوان اولیه تازه تشکیل شده) در قسمت های طرفی و اپیکالی ساکت تشکیل می شود. در حالیکه قسمت های مرکزی و مارژین ها از بافت همبندی پر شده ، در قسمت های مارژین و خارجی دیواره ساکت، تعداد زیادی استئوکلاست قابل رؤیت می باشد و در قسمت های متعدد دیواره ساکت استخوان woven جایگزین Bondle bone می شود.
طی 3-2 هفته بعدی و 3 تا 4 هفته بعد از خارج کردن دندان، تکه های استخوانی غیرکلسیفیه شروع به مینرالیزه شدن از قاعده ساکت به طرف کرونال می کنند، در این زمان تمام استخوان ساکت با استخوان woven پر شده است و تعداد زیادی استئوکلاست در دیواره های خارجی و مارژین بافت سخت دیده می شوند و استئوکلاست ها در مرکز و اطراف استخوان woven حاضر در ساکت ردیف می شود و به عبارت دیگر استخوان woven به وسیله استخوان بالغ جایگزین می شود. این سیر همراه با Re-epithelization ادامه پیدا می کند که در نهایت به طور کامل ساکت را تا 6 هفته پس از خارج کردن دندان می پوشاند. در هفته هشتم، یک لایه استخوان کورتیکال، مدخل را می پوشاند. استخوان woven که در هفته چهارم تشکیل شده بود، بوسیله مغز استخوان و مقداری ترابکول استخوان لاملار در هفته 8 جایگزین می شود. در سطح فوقانی و خارجی دیواره های باکال و لینگوال علائمی از تحلیل رفتن بافت سخت به چشم می خورد. کرست دیواره باکالی استخوان نسبت به کرست لینگوال آپیکالی تر قرار می گیرد. سطح مارژین دیواره لینگوال بدون تغییر باقی می ماند. در حالیکه دیواره باکال چندین میلی متر به سمت آپیکال شیفت پیدا می کند.
یک سری فاکتورها ممکن است روند ترمیم ساکت را تحت تأثیر قرار دهند. اندازه ساکت مهم است، یک ساکت عریض تر، زمان بیشتری را برای پر کردن نقص موجود نسبت به یک ساکت با عرض کم تر نیاز دارد. ساکت دندان های مبتلا به تحلیل افقی استخوان، زودتر ترمیم می شوند. زیرا کم شدن حجم استخوان آلوئولار به منزله کم شدن حجم حفره برای پر شدن می باشد، استخوان به حد کرونالی تر از حد افقی خود و یا حد کرست استخوان دندان های مجاور بازسازی نمی شود، یعنی هرگز به طور 100درصد ساکت دندانی با استخوان پر نخواهد شد(1).
تدابیر پس از کشیدن دندان :
به دلیل اینکه کشیدن دندان و یا از دست دادن آن، اغلب منجر به تحلیل یا جمع شدگی ریج آلوئولار می گردد، حفظ حجم استخوان در زمان کشیدن دندان یک هدف مطلوب می باشد. حداکثر تحلیل استخوان پس از کشیدن دندان ها در محدوده 6 تا 24 ماه اول اتفاق می افتد.
بنابراین زمانی که کلینسین امکان مداخله در کشیدن دندان را داشته باشد، حفظ استخوان آلوئولار بایستی مدنظر باشد. حفظ محافظه کارانه بافت های اطراف دندان کشیده شده می تواند نیاز به روش های پیشرفته جراحی استخوان را حذف و یا به طور قابل توجهی کاهش دهد.
زمانی که یک دندان کشیده و آماده قرار دادن ایمپلنت می گردد، پیشگیری از تحلیل استخوان آلوئولار بسیار مطلوب است.
زمان قرار دادن ایمپلنت نسبت به زمان کشیدن دندان همچنان مورد بحث بسیاری از کلینسین ها می باشد، بسته به کمیت و کیفیت و حمایت استخوان موجود و همچنین توانائی کلینسین ها و بیمار، قرار دادن ایمپلنت پس از کشیدن دندان می تواند بلافاصله (immediate)، تأخیری (delayed) و یا مرحله ای (staged) باشد. طبق تعریف قرار دادن فوری ایمپلنت در زمان کشیدن دندان انجام می شود. قراردهی تأخیری ایمپلنت حدوداً 2 ماه پس از کشیدن دندان انجام می گیرد تا امکان ترمیم بافت نرم فراهم شود. قرار دادن مرحله ای ایمپلنت به منظور ترمیم کامل استخوان درون نواحی کشیدن دندان به طور معمول نیازمند 6-4 ماه بیشتر است.
در آوردن دندان به صورت غیرتراماتیک و با استفاده از یک وسیله باریک و پهن نظیر Periotome انجام می شود. این وسیله به عمق سالکوس وارد شده و لیگامان پریودنتال را پاره می کند و مختصری بافت های پریودنتال مجاور را توسعه می دهد. دندان، بلند شده و توسط فورسپس با استفاده از حرکت آهسته و چرخشی درآورده می شود. باید از اعمال نیروهای باکولینگوالی اجتناب گردد تا از آسیب به استخوان لبیال پیشگیری شود.
با استفاده از کورت های جراحی، بافت نرم روی استخوان موجود در ناحیه extraction کاملاً دبریدمان می شود. پس از دبریدمان ناحیه extraction کاملاً با سالین استریل شستشو داده می شود. در این مرحله، پس از ارزیابی استخوان و ساپورت آن، کلینسین تصمیم می گیرد که آیا ناحیه را با پیوند استخوان پر کند یا نه و اینکه چه زمانی ایمپلنت را در ناحیه قرار دهد؟ (فوری، تأخیری،مرحله ای) (2).
زمان های مختلف قرار دادن ایمپلنت :
Type 1) قرار دادن ایمپلنت به طور فوری به دنبال کشیدن دندان،
مزایا : کاهش تعداد دفعات جراحی، کاهش طول دوره درمان، مقدار استخوان مطلوب باقیمانده. معایب : مورفولوژی منطقه ممکن است قرار دادن ایمپنت را پیچیده کند، فقدان بالقوه بافت نرم برای تطابق فلپ، روش های جراحی کمکی و حساسیت این روش.
Type 2) بافت نرم به طور کامل ساکت را پوشش دهد، حدوداً 8-4 هفته بعد از کشیدن.
مزایا : افزایش مقدار بافت نرم منطقه و بالطبع آسانتر شدن تطابق فلپ، اجازه به برطرف شدن پاتولوژی های موضعی منطقه.
معایب : مورفولوژی منطقه ممکن است قرار دادن ایمپلنت را پیچیده کند، افزایش طول دوره درمان، تحلیل متفاوت دیواره های ساکت، احتمال نیاز به روش های جراحی کمکی و حساسیت این روش.
Type 3) ایمپلنت در ساکت دندانی قرارداده می شود که مقداری استخوان تازه و قابل توجه درون آن شکل گرفته است.
مزایا : مقدار استخوانی که در ساکت تشکیل شده، قرار دادن ایمپلنت را ساده تر می کند و همچنین بافت نرم تکامل یافته تطابق فلپ را راحت تر می سازد.
معایب : افزایش طول دوره درمان، تحلیل متفاوت دیواره ساکت و احتمال نیاز به روش های جراحی کمکی.
Type 4) قرار دادن ایمپلنت در ساکت دندانی که به طور کامل ترمیم یافته است.
مزایا : ریجی که به طور کلینیکی ترمیم یافته است و تطابق بهتر فلپ.
معایب : افزایش طول دروه درمان، نیاز به روش های جراحی کمکی، تفاوت زیاد در حجم استخوان باقیمانده (3).
قراردادن فوری ایمپلنت :
مزیت اصلی قرار دادن فوری ایمپلنت متعاقب کشیدن دندان، کاهش زمان ترمیم می باشد. چون ایمپلنت در زمان کشیدن دندان قرار داده می شود، ترمیم استخوان به ایمپلنت بلافاصله با کشیدن دندان شروع می شود. مزیت دیگر آن این است که ترمیم نرمال استخوان که عموماً درون حفره کشیدن دندان اتفاق می افتد، در اطراف ایمپلنت تأثیر می گذارد. این فعالیت تشکیل استخوان می تواند تماس استخوان به ایمپلنت را در مقایسه با ایمپلنتی که در ناحیه ای با فعالیت استئوژنتیکی کم تر قرار داده شده است، بهبود بخشد.
معایب احتمالی قرار دادن ایمپلنت فوری شامل نیاز به جراحی موکوژنژیوال (جهت تصحیح بافت هایی که در اثر فلپ های repositioned جابجا شده اند) و پیوند استخوان (جهت پر کردن فضاهای خالی اطراف ایمپلنت) می باشند. زمانی که ایمپلنت دو مرحله ای، در زمان کشیدن دندان قرار داده می شود باید با استفاده از روش های آزاد کننده فلپ موکوژنژیوال ایمپلنت کاملاً پوشیده شود.
همچنین ممکن است نیاز باشد تا از پیوند استخوان درون ناحیه extraction که با ایمپلنت در تماس نمی باشد استفاده شود تا از نفوذ بافت نرم به اطراف ایمپلنت جلوگیری شود.
اگر استخوان موجود برای ثبات ایمپلنت ناکافی باشد، قرار دادن فوری ایمپلنت پیشنهاد نمی شود، همچنین عفونت های مرتبط با دندان ممکن است ترمیم را مختل کرده و موفقیت ایمپلنت را به مخاطره اندازد. عفونت حاد یا تحت حاد از موارد عدم تجویز برای قرار دادن فوری ایمپلنت به شمار می آیند (2).
تصحیح ریج در رابطه با قرار دادن ایمپلنت :
جایگزینی ایمپلنت متعاقب کشیدن دندان به دلایل مختلفی عمومیت یافته است. در طول سال ها، امیتازهای زیادی برای ایمپلنت فوری عنوان شده است. این مزایا شامل قرار دادن ساده تر ایمپلنت، کاهش تعداد ملاقات ها در مطب دندانپزشک، کاهش طول دوره درمان و هزینه ها، نگهدرای از استخوان در محل ایمپلنت، زیبائی بافت نرم و افزایش رضایت بیمار می باشد.
جایگذاری ایمپلنت در ساکت دندان تازه کشیده شده ممکن است شکل گیری استخوان و استخوان سازی را تحریک کند و یا اختلال در تغییرات سازگاری که به دنبال کشیدن دندان اتفاق می افتد، ایجاد کند. تایپ I قرا ردادن ایمپلنت باعث حفظ استخوان ساکت و استخوان فک مجاور ساکت می گردد و می تواند از آتروفی استخوان جلوگیری کند (3).
Botticelli و همکاران در سال 2004 به بررسی تغییرات ریج در طول یک دوره 4 ماهه به دنبال قرار دادن ایمپلنت فوری در ساکت دندان تازه کشیده شده پرداختند. 21 ساکت دندانی با پریودنتیت مزمن متوسط مورد مطالعه قرار گرفتند که طول درمان شامل کشیدن دندان های کانین، انسیزور و پرمولرهای تک ریشه و سپس جایگزینی ایمپلنت در این مناطق بود.
پس از ایجاد برش های سالکولار و کشیدن دندان، ایمپلنت پیچ شونده در ناحیه قرار داده شد. بعد از قرار دادن ایمپلنت :
فاصله ی بین ایمپلنت و سطوح داخلی و خارجی استخوان باکال و لینگوال
عرض گپ مارژینی که بین ایمپلنت و سطوح باکال و لینگوال، مزیال و دیستال وجود داشت به وسیله ی کولیس اندازه گیری شد.
فلپ به محل اولیه برگردانده شد و ایمپلنت ها به طور Semi-Submerged قرار گرفتند. بعد از4 ماه، جراحی reentry انجام شد و اندازه گیری های کلینیکی دوباره تکرار شد و بنابراین تغییراتی که در طی ترمیم انجام شده بود از جمله ضخامت و ارتفاع دیواره ی باکال و لینگوال ساکت و عرض گپ مارژین محاسبه شد.
در طی جراحی انجام شده مشاهده گردید که گپ مارژین به طور کامل از بین رفته است، علاوه بر این ضخامت دیواره ی باکال و همچنین دیواره پالاتال به طور واضحی کاهش یافته بود. طبق مطالعه انجام شده در طی 4 ماه از ترمیم بعد از کشیدن دندان و قرار دادن ایمپلنت به طور عملی تمام گپ های مارژین از بین رفته بود. کاهش ابعاد باکال mm9/1 یا 56 درصد بود. در حالیکه کاهش ابعاد در سطح لینگوال mm8/0 یا 27 درصد بود. این یافته ها به طور قوی نشان داد، قرار دادن ایمپلنت در ساکت دندان تازه کشیده شده در حقیقت از رمدلینگ فیزیولوژیک که به دنبال کشیدن دندان در ریج اتفاق می افتد جلوگیری نمی کند (4).
به منظور بررسی رمودلینگ استخوان که در ساکت کشیده شده ی دندان بعد از ایمپلنت گذاری اتفاق می افتد، Lindhe و Araujo در سال 2005، یک مطالعه ای بر روی سگ انجام دادند. در این مطالعه محققین به منظور بررسی تغییرات ابعادی که در ریج آلوئولار اتفاق می افتد، بررسی هیستولوژیک انجام دادند. در باکال و لینگوال هر دو کودرانت مندیبل سگ، فلپ به صورتfull thikness کنار زده شد. ریشه های دیستال سومین و چهارمین پرمولر خارج شد. در کودرانت سمت راست ایمپلنت هایی با سطح خشن به گونه ای در داخل ساکت قرار گرفتند که مارژین ایمپلنت، آپیکالی تر از مارژین استخوان باکال و لینگوال قرار داده شد. فلپ ها به محل اولیه برگردانده شدند، در سمت چپ ساکت های کشیده شده بدون قرار دادن ایمپلنت به وسیله ی فلپ کاملاً پوشیده شدند.
بعد از 3 ماه مخاط در مناطق مورد نظر در کودرانت چپ و راست فک کاملاً ترمیم یافت. سگ ها کشته شدند و برش های بافتی شامل ایمپلنت و ساکت های بدون دندان تهیه و برای مطالعه ی هیستولوژیک آماده شد. برش باکولینگوالی ناحیه ی بی دندان بعد از 3 ماه ترمیم نشان داد که استخوان تازه تشکیل شده، مدخل ساکت را پوشش داده است. صفحه کورتیکال استخوان لاملار در سمت باکال در حدود 3/2 میلی متر، آپیکالی تر از کانتور لینگوال قرار گرفته است.
برش های باکولینگوالی تهیه شده از ناحیه ی دارای ایمپلنت نشان داد که مارژین کرست استخوان باکال در حدود 4/2 میلی متر پائین تر از کرست لینگوال قرار گرفته است. به عبارت دیگر قرار دادن ایمپلنت در ساکت دندان تازه کشیده شده موجب شکست در روند مدلینگ بافت سخت در دیواره های ساکت، به دنبال کشیدن دندان می شود. در نتیجه، بعد از 3 ماه از ترمیم، میزان تحلیل عمودی در استخوان باکال در مقایسه با استخوان لینگوال جایگزین شده در دو گروه دارای ایمپلنت و بی دندان مشابه بود. در ماه سوم اختلاف عمودی بین مارژین باکال و لینگوال در هر دو گروه بیش از 2 میلی متر بود که در گروه بی دندان 2/2 میلی متر در مناطق دارای ایمپلنت 4/2 میلی متر گزارش شد (5).
در مطالعه ی دیگری که Araujo و همکاران در سال 2006 بر روی سگ برای بررسی اینکه، آیا مدلینگ استخوان در ساکت دندان تازه کشیده شده باعث از دست رفتن استئواینتگریشن ایمپلنت قرار داده شده در ساکت می گردد؟ انجام دادند. همچون مطالعه ی قبلی پس از آماده سازی فلپ، ریشه دیستال سومین و چهارمین دندان پرمولر در هر دو کودرانت مندیبل کشیده شد. ایمپلنت ها در داخل ساکت تازه کشیده شده، طوری قرار گرفتند که دارای ثبات اولیه بودند. سپس فلپ ها به گونه ای به سر جای خود برگردانده شدند که ایمپلنت ها به طوری semi-submerged قرار گرفتند. بلافاصله پس از بستن فلپ، بیوپسی های بافتی از دو سگ تهیه شد، در حالیکه به 5 سگ دیگر اجازه ترمیم در یک دوره ی یک ماهه و سه ماهه داده شد. در برش هائی که بلافاصله پس از نصب ایمپلنت تهیه شد، تماس بین سطح دیواره ی ایمپلنت و دیواره های ساکت مشاهده شد. لخته خون در نواحی فاقد مناطق تماس و همچنین در گپ های مارژین تشکیل شد. در برش های تهیه شده در هفته چهارم مشاهده شد که این حفره ها (مناطق فاقد تماس) که نواحی خشن ایمپلنت می باشد، با استخوان woven پر شده است. همچنین در هفته ی چهارم دیواره باکال و لینگوال دچار تحلیل گردیدند و ارتفاع دیواره ی سخت و نازک باکال، کاهش پیدا کرده است. در فاصله زمانی بین هفته 4 و 12 از ترمیم، کرست استخوان باکال به طور واضح به سمت آپیکال جابجا شده است. استخوان woven ای که در سمت باکال در هفته چهارم، تماس در نواحی گپ مارژین با ایمپلنت ایجاد کرده بود دچار رمدلینگ شده بود و تنها، تکه هایی از این استخوان باقی مانده بود. در پایان مطالعه (3 ماه) کرست استخوان باکال بیشتر از 2 میلیمتر پائین تر از بوردر سطح خشن ایمپلنت قرار گرفته بود. این یافته ها نشان داد که استخوان woven که در تماس با ایمپلنت در مرحله ی اولیه ایجاد شده بود، قسمتی از آن با آتروفی دیواره ی باکال استخوان از بین می رود. بنابراین واضح است که آلوئولار پروسس متعاقب کشیدن دندان، جهت احتیاجات فانکشنال آتروفی می گردد، و در این رابطه ایمپلنت نمی تواند جایگزین خوبی برای دندان باشد (6).
مشکل کلینیکی قرار دادن تایپ I ایمپلنت این است که تحلیل استخوان به طور متناوب باعث از دست رفتن پوشش بافت سخت باکال در ناحیه ی ایمپلنت می شود و قسمت فلزی آن ممکن اس از وراء یک غشاء نازک روی ایمپلنت دیده شود و مشکلات زیبائی ایجاد کند. سؤالی که مطرح می گردد این است که آیا می توان بر این مشکل غلبه کرد،؟ این سؤال توسط Lindhe و همکاران در سال 2006 بررسی شد. در این مطالعه ریشه ی دیستال سومین پرمولر فک پائین و همچنین ریشه ی دیستال اولین مولر فک پائین سگ کشیده شد و به جای آن ایمپلنت قرار داده شد. در طول دوره ی ترمیم تحلیل دیواره ی باکال رخ داد و همچنین بیشتر از 2 میلیمتر از مارژین ایمپلنت از وراء مخاط نمایان شد. گپ ایجاد شده بین ایمپلنت و دیواره ی ساکت در زمان قرار دادن ایمپلنت در ریشه ی دیستال مولر بیشتر از 1 میلیمتر بود. به همین دلیل ثبات ایمپلنت تنها از طریق گیر آپیکالی بدست آمد. در طول فاز اولیه ترمیم این گپ با استخوان woven در ناحیه ی مولر پر شد. در فاصله زمانی که استخوان باکال تحت آتروفی قرار گرفت استخوان تازه تشکیل شده در محل گپ، استئواینتگریشن را حفظ کرد و تمام سطوح ایمپلنت را پوشاند. این مطالعه نشان داد که آتروفی ریج بی دندانی به دنبال کشیدن دندان رخ می دهد و نمی توان با قرار دادن ایمپلنت در ساکت دندان تازه کشیده شده از این آتروفی جلوگیری کرد. تحلیل استخوان هم در جهت عمودی و هم در جهت افقی در استخوان باکال و لینگوال رخ می دهد که این تحلیل در دیواره ی باکال مشخص تر می باشد.
نتیجه ی دیگری که از این مطالعه به دست آمد نشان داد که در بعضی موارد می توان با قرار دادن ایمپلنت به طور عمیق تر در دیواره ی لینگوال یا پالاتال ساکت، تحلیل استخوان باکال را جبران کرد (7). به منظور جبران نقائص ترمیم که در بالا ذکر شد ممکن است پروسه های Regeneration استخوان به منظور افزایش حجم استخوان مخصوصاً در سطح باکال نیاز باشد.

مروری بر مقالات :
در بررسی استئواینتگریشن و بازسازی استخوان دو نوع ایمپلنت فوری HA و TPS توسط Gher و همکارانش در سال 1994، نتیجه گیری شد که تحلیل استخوان در قسمت تاجی کرست برای گروه تست 53/1- و برای گروه کنترل 59/1- بود و هیچ تفاوت معنی داری بین پارامترهای اندازه گیری شده در دو نوع ایمپلنت وجود نداشت. همچنین لازم به ذکر است که در گروه تست دو نوع ایمپلنت از DFDBA و ممبران برای پر کردن گپ موجود بین ایمپلنت و دیواره ساکت استفاده شد، در صورتی که در گروه کنترل از هیچ نوع ماده پیوندی استفاده نشده بود (8).
قرار دادن ایمپلنت های فوری در ساکت دندان تازه کشیده شده یک روش مطمئن و قابل پیش بینی می باشد، اگر توجهات خاص حین کار پیگیری شود. این نتیجه ای بود که از مطالعه Rosequist در سال 1996 حاصل شد که به بررسی درصد بقای ایمپلنت های فوری در یک بازه زمانی 67-1 ماه پردخته بود و پس از این بررسی، درصد بقای ایمپلنت ها را 6/93درصد گزارش کرد (9).
طبق تحقیقات Chaushn و همکارانش در سال 1997 که به follow up 95 ایمپلنت پرداختند، نتیجه گیری شد، که ایمپلنت های فوری دارای میزان بقای بالائی در حدود 100 تا 9/94درصد می باشند و همچنین در این مطالعه اتفاق نظری در مورد پر کردن گپ و بهترین ماده گرفت نبود (10).
ایمپلنت فوری بهتر است 5-3 میلیمتر، فراتر از آپکس قرا ربگیرد تا ثبات اولیه اش فراهم شود. همچنین تا جائی که امکان دارد نزدیک کرست استخوان قرار بگیرد. این نتایج حاصل مطالعه Schwartz و همکارانش در سال 1997 بود. همچنین در این مطالعه اجماع نظری راجع به نیاز به پر کردن گپ و اینکه چه ماده پیوندی بهترین است وجود نداشت (11).
بعد از قرار دادن ایمپلنت فوری تحلیل استخوان باعث جابجائی بافت سخت باکالی ایمپلنت می شود و به دلیل دیده شدن ناحیه فلزی ایمپلنت از پشت یک غشاء نازک می تواند مشکلات زیبائی ایجاد کد. این مطالعه را Grunder در سال 2000 انجام داد (12).
در تحقیق Rosequist که در سال 2000 بر روی 34 نفر انجام شد، برای سیل کردن ساکت از ممبران همولوگوس استخوانی استفاده کردند که این ممبران بعد از 4-2 هفته با پرولیفراسیون مخاط اطراف پوشیده شد. این مطالعه علیرغم اینکه نتایج زیبائی بسیار عالی و موفقیت 1/94درصد را دارا بود، اما نتوانست در مورد کیفیت استخوان و استئواینتگریشن گزارش تهیه کند(13).
در مقایسه هیستولوژکی ایمپلنت فوری و تأخیری بر روی سگ، نتیجه حاصله به این قرار شد که 76درصدسطوح ایمپلنت فوری با استخوان پوشیده شده و در ایمپلنت های تأخیری 81درصد سطوح ایمپلنت با استخوان پوشیده شده بود. این مطالعه را Schultes در سال 2001 انجام داد (14).
دو امتیاز ایمپلنت های فوری، کوتاه شدن دوره درمان و حفظ بافت سخت و نرم می باشد. این دو نتیجه تحقیقات Nawzari در سال 2001 می باشد (15).
حجم کافی استخوان و شکل مناسب آلوئولار ریج برای بدست آوردن فانکشن مناسب و پروتز زیبای ایمپلنت ضروری می باشد. شناسایی در روند ترمیم ساکت دندان تازه کشیده شده، شامل تغییراتی که به دنبال تحلیل استخوان و رمدلینگ ایجاد می شود ضروری است، از دست رفتن استخوان آلوئولار به دنبال کشیدن دندان به دلایلی هم چون بیماری پریودنتال، ضایعه پری اپیکال و یا تروما به دندان و استخوان ممکن است حادث شود. همچنین آسیب به استخوان در حین کشیدن دندان هم می تواند باعث از دست رفتن استخوان شود و به طور کلی آتروفی استخوان پس از کشیدن دندان یک پدیده کاملاً شناخته شده ای می باشد. در یک مطالعه که توسط Schropp و همکارانش در سال 2007 با هدف بررسی تغییرات کانتور استخوان پس از کشیدن دندان در یک دوره 12 ماهه، انجام شد به این نتیجه رسیدند که بیشترین تغییرات در ناحیه ساکت دندان تازه کشیده شده بعد از یکسال از کشیدن دندان بدست می آید (16).
قرار دادن ایمپلنت فوری باعث حفظ بافت استخوان ساکت و احاطه کننده فک می شود و همچنین از آتروفی استخوان فک جلوگیری می کند. این نتیجه طبق تحقیق Chen در سال 2004 بدست آمد و همچنین طبق این مطالعه، درصد بقا و فوائد کلینیکی ایمپلنت فوری و معمولی با یکدیگر مشابه می باشد (17).
بعد از 4 ماه از قرار دادن ایمپلنت، تمام گپ های مارژین از بین رفته و کاهش عرض تابل باکال حدود mm9/1 (56%) و لینگوال mm8/0 می باشد. این مطالعه که بر روی 21 دندان تازه کشیده شده انجام شد، نشان داد که ایمپلنت فوری در حقیقت از رمدلینگ ریج به طور کامل جلوگیری نمی کند و همچنین لازم به ذکر می باشد که برای پر کردن فضای بین استخوان و ایمپلنت از هیچ ماده پیوندی و غشائی استفاده نشده بود. این نتایج طبق تحقیقات Botticelli در سال 2004 بدست آمد (4).
رمدلینگ اولیه به طور فوری پس از کشیدن دندان شروع می شود و حتی پس از قرار دادن ایمپلنت تأخیری ادامه می یابد و درصد تفاوت رمدلینگ اطراف ایمپلنت های فوری و تأخیری می تواند دلیلی برای اهمیت زمان گذاشتن ایمپلنت در مناطقی که از نظر زیبائی اهمیت دارند، می باشند. این مطالعه که توسط Covani و همکارانش در سال 2004 در ایتالیا صورت گرفت، تغییرات عرض باکولینگوالی 2 ایمپلنت فوری و 5 ایمپلنت تأخیری را در دو مرحله اندازه گیری کردند که برای ایمپلنت فوری، این تغییر 9/1 میلیمتر بود و برای ایمپلنت تأخیری 3 میلیمتر گزارش شد (18).
استفاده از ایمپلنت فوری و جایگذاری آن در ساکت دندان تازه کشیده شده نشان داد که ایمپلنت فوری دارای مقاومت و ثبات بالائی با توجه به آنالیزهای Resouance Frequency می باشد؛ که این نتایج براساس گزارشات Beckerو همکارانش در سال 2005 بدست آمد (19).
قرار دادن ایمپلنت فوری نمی تواند از ریمادلینگ که در دیواره های ساکت اتفاق می افتد جلوگیری کند و تحلیل دیواره های ساکت که بعد از کشیدن دندان اتفاق می افتد باید در هنگام قرار دادن ایمپلنت فوری مورد توجه قرار گیرد. ارتفاع دیواره های باکال و لینگوال بعد از 3 ماه چه در نواحی بی دندانی و چه در نواحی که ایمپلنت فوری قرار گذاشته شده مشابه می باشند و حتی از دست رفتن عمودی استخوان ریج در باکال نسبت به لینگوال بیشتر می باشد. این یافته ها، نتایج مطالعه Maurico و همکارانش در سال 2005 می باشد (20).
ایمپلنت فوری توانائی جلوگیری از آتروفی ریج را بعد از کشیدن دندان ندارد و استخوان باکال و لینگوال هر دو دچار تحلیل می شوند و این تحلیل در قسمت باکال باعث از دست رفتن استئواینتگریشن مارژین می شود. این نتیجه گیری بود که از مطالعه Lindeh و همکارانش در سال 2006 بدست آمد (7).
در مطالعه ای که از سال های 2004-1998 بر روی 1925 ایمپلنت فوری صورت گرفت نتایجی به شرح زیر بدست آمد :
میزان شکست در ایمپلنت هایی که دندان های آنها به علت بیماری پریودنتال کشیده شده بودند3/2 برابر بیشتر بود.
میزان شکست قبل از گذاشتن رستوریشن 7/3 درصد و بعد از گذاشتن رستوریشن 3% بود.
میزان بقای کلی 96% بود.
مردان دارای 65/1 برابر شکست بیشتری بودند.
این یافته ها طبق نتیجه گیری بود که Wegenbergدر سال 2006 بدست آورد، باید هنگام طرح درمان ایمپلنت فوری دلایل کشیدن دندان و استفاده از آموکسی سیلین را مورد توجه قرار داد(21).
در بررسی که بر روی 351 پروژه - ریسرچصورت گرفت، میزان شکست ایمپلنت فوری را کم تر از 5درصد گزارش داد که اگر این ایمپلنت ها به طور فوری بارگذرای شوند، درصد آن ها بیشتر هم می شود. اما این مطالعه نتوانست به سؤالاتی در مورد سلامت پری ایمپلنت، ثبات پروتز و میزان تحلیل استخوان در مقایسه ایمپلنت فوری و تأخیری بپردازد. این مطالعه توسط Quirynen در سال 2007 صورت گرفت (22).
میزان بقا در ایمپلنت فوری در ناحیه قدام ماگزیلا 97درصد گزارش شده است و میزان تحلیل استخوان رادیوگرافیک در مزیال mm98/0، در دیستال 78/0 و تحلیل بافت نرم در mid facial ، mm53/0 و در Shrinkage پاپیلای mm41/0 و پاپیلای دیستال 31/0 و رضایت بیماران از نظر زیبائی 93/0 بود. این نتایج که توسط De Rouck و همکاران در سال 2008 بدست آمد میزان بقا پاسخ بافت سخت و نرم و نتایج زیبائی ایمپلنت فوری را در قسمت قدام ماگزیلا مورد بررسی قرار داد (23).
نیاز به تحقیقات مستمر و بیشتر در مورد تغییرات ابعادی کرست استخوان بعد از ایمپلنت فوری در مطالعه ای که Chen در سال 2009 برای بررسی تحلیل مارژین مخاط فاسیال در ایمپلنت های فوری انجام داد، نتیجه گیری شد (24).
اگر ایمپلنت های highly-polished و roughened به صورت فوری قرار داده شوند، اختلافی در میزان تحلیل استخوان اطراف ایمپلنت چه کلینیکی و چه رادیوگرافیک ندارند و بیشترین میزان تحلیل استخوان در مارژین دیستال کرست آلوئول اتفاق می افتد، این یافته از مطالعه Heinemann در سال 2009 در آلمان بدست آمد که تأثیر توپوگرافی سرویکال ایمپلنت را بر میزان تحلیل استخوان کرستال در ایمپلنت فوری مورد بررسی قرار دادند (25).
مطالعه ای که به مرور نتایج کلینیکی و زیبائی 91 مطالعه پرداخته بود، نشان داد استفاده از پیوند استخوان در جلوگیری از پیشرفت دیفکت در ایمپلنت فوری مؤثر می باشد و باعث پیشرفت استخوانی رژنراسیون شدن این دفکت می شود و در قرار دادن ایمپلنت type 1-2-3 نسبت به type 4 مؤثر می باشد و میزان بقا در این مطالعات 95% گزارش شد. همچنین این مطالعات نشان داد که تحلیل مارژین مخاط فاسیال در type 1 شایع تر می باشد. این بررسی متون توسط Buser و Chen در سال 2009 ارائه گردید (26).
در بررسی هیستولوژیک ترمیم اولیه بافت نرم روی سگ، گزارش شد که تنها بعد از یک هفته در اپی تلیوم جانکشنال و بافت همبند شل سلول های التهابی فراوان دیده می شود، ابعاد بافت نرم در هفته هشتم تقریباً mm5 بود که شامل mm5/3-3 اپی تلیال و mm5/1-1 بافت همبند بود. در این مطالعه نتیجه گیری شد که ترمیم بافت نرم اطراف ایمپلنت فوری ممکن است سطح اپی تلیال بیشتری نسبت به ایمپلنت تأخیری ایجاد کند. این مطالعه توسط Vignoletti در سال 2009 در کشور اسپانیا بدست آمد (27).
در مقایسه نتایج کلینیکی ایمپلنت های فوری Submerged و non-submerged ، نتیجه بدست آمده نشان داد که میزان بافت کراتنیزه در گروه submerged به طور متوسط mm3/1 و در گروه non-submerged، mm2/0 میلیمتر کاهش پیدا کرده بود و سایر نتایج کلینیکی دو گروه با هم مشابه بود و میزان تحلیل بافت نرم در هر دو گروه بعد از یکسال به طور متوسط mm1 گزارش شد. این حاصل مطالعه Cordaro و همکاران در سال 2009 می باشد (28).
در یک تحقیق که توسط Lindhe و همکاران در سال 2010 انجام شد به بررسی تغییرات ابعادی ریج، پس از نصب دو شکل متفاوت ایمپلنت فوری (سلیندری و مخروطی) پرداخت. نتیجه حاصله از این مطالعه تفاوت معنی داری را در تغییرات ابعادی ریج بین این دو گروه نشان نداد، اما تغییرات گپ عمودی و افقی در اطراف ایمپلنت های سیلندری بیشتر از ایمپلنت های مخروطی گزارش شد (29).
نتایج کلینیکی ایمپلنت های فوری و تأخیری قرار داده شده در بیماران دارای Severe Poriodontitis نشان داد که اختلاف آماری معنی داری در تحلیل استخوان آلوئولار بین این دو گروه وجود نداشته است و میزان بقا در ایمپلنت فوری در ماگزیلا 92درصد و در مندیبل 100درصد بود. میانگین تغییرات level استخوان بین زمان اولیه و 12 ماه بعد mm18/0 ± 12/1- بود و همچنین این مطالعه نشان داد که شکست ایمپلنت فوری در ماگزیلا در بیمارانsevere periodontitis بیشتر از مندیبل می باشد. این نتیجه گیری از مطالعه Deng در چین در سال 2010 حاصل شد (30).
استفاده از ممبران کلاژنی در ایمپلنت فوری در حفظ استخوان آلوئول باکال به میزان 23% مؤثر است. این نتیجه ای بود که از مطالعه Caneva در سال 2010 که به بررسی تأثیر این ممبران بر روی تغییرات بافت سخت و استئواینتگریشن در ایمپلنت فوری در سگ پرداخت، بدست آمد. ارزیابی هیستولوژیک نشان داد که هم در گروه تست و هم در گروه کنترل تحلیل استخوان اتفاق افتاد و همچنین میزان بیشترین تماس استخوان- ایمپلنت کرونالی بین دو گروه مشابه بود. در گروهی که از ممبران استفاده شده بود تحلیل استخوان باکال mm7/1 و در گروه کنترل mm2/2 بود (31).
در بررسی و ثبت ضخامت دیواره باکال و پالاتال 93 ساکت دندان تازه کشیده شده توسط Huynh و همکارانش در سال 2010 برای تخمین میزان مقاومت دیواره های باکال و پالاتال برای حفظ کانتور استخوان اطراف ایمپلنت، این نتیجه حاصل شد که نیاز به روش های پیوند استخوان برای دست یابی به کانتور کافی در اطراف ایمپلنت ضروری می باشد (32).
طبق تحقیقاتی که Esposito و همکارانش در سال 2010 در انگلیس انجام دادند نتجیه گیری کردند که :
ایمپلنت فوری ریسک بالاتری از ایمپلنت تأخیری برای شکست و عوارض ایمپلنت دارد.
در مواردیکه زیبائی اهمیت بیشتری دارد، ایمپلنت فوری ممکن است نتیجه بهتری دهد.
مدرک قابل اعتمادی برای حمایت و یا رد روش های پیوند استخوان هنگام گذاشتن ایمپلنت فوری وجود ندارد (33).
در مطالعه ای که Koh و همکاران در سال 2011 انجام دادند، تغییرات بافت نرم و سخت را در ایمپلنت های فوری بین گروه های با ایمپلنت کرستال و ساب کریستال مقایسه کردند. دندان های تک ریشه در دو گروه به صورت هم سطح با کرست پالاتال و یا یک میلیمتر زیر کرست پالاتال توسط ایمپلنت فوری جایگزین شدند. نتایج بدست آمده به این صورت بود که بین دو گروه تفاوت آماری معنی داری از سطح استخوان مارژینال دیده نشد (035/0P-value= ) . اگرچه گروه ساب کرستال دارای میزان معنی دار بیشتری از ضخامت بافت کراتینیزه بود، این مطالعه نتیجه گیری کرد که میزان بقای ایمپلنت فوری 96درصد می باشد و سطح قرار دادن ایمپلنت نمی تواند تأثیری بر روی تغییرات عرض و ارتفاع استخوان و بافت نرم داشته باشد و همینطور پیشنهاد شد که دیواره ضخیم فاسیال، گپ کوچکتر و نواحی پرمولرها دارای نتایج کلینیکی موفق تری برای ایمپلنت فوری هستند (34).
بیان مسئله و ضرورت انجام تحقیق:
 ایمپلنت فوری به عنوان روشی که جایگزین ایمپلنت معمولی شده است پیشنهاد گردیده است. مطالعات متعدد موفق بودن این روش را به اثبات رسانده است و معلوم شده است که اگر همزمان با کشیدن دندان عمل ایمپلنت گذاری نیز انجام شود. گپ بین استخوان میزبان و بدنه ایمپلنت ظرف چند ماه آینده پر خواهد شد و به شرط وجود ثبات اولیه در هنگام ایمپلنت گذاری، ایمپلنت در آینده به خوبی Osteointegration مناسبی پیدا خواهد کرد. البته علی رغم اینکه بسیاری از مؤلفین بیان نموده اند که انجام ایمپلنت فوری از تحلیل ناخواسته عرض ریج در اثر کشیده شدن دندان جلوگیری می کند معذالک برخی از محققین گزارش کرده اند که قدری تحلیل استخوان پس از انجام ایمپلنت فوری به وقوع خواهد پیوست.( Botticelli et al 2004 (4) )به علاوه در یک مطالعه مروری اخیر بوسیله( Quriynen, et al 2008 (22))این نتیجه حاصل شد که در مورد تغییرت ابعادی ریج در آینده هنگامی که عمل ایمپلنت فوری انجام می شود ، اطلاعات کافی در دست نیست لذا جا دارد که طی مطالعه ای میزان تغییرات ابعادی ریج از نظر باکولینگوالی و اکلوز و آپیکالی مشخص گردد.

اهداف و فرضیات
الف) هدف کلی:
تعیین تغییرات ابعادی ریج باقیمانده پس از قرار دادن ایمپلنت فوری در مقایسه با ساکت دندان تازه کشیده شده
ب) اهداف اختصاصی:
1- تعیین تغییرات عرض ریج در فاصله 1 میلی متری از کرست در ناحیه دندان Ext شده در هنگام ایمپلنت گذاری و پس از 4 ماه در زمان گذاشتن Healing
2- تعیین تغییرات عرض ریج در فاصله 1 میلی متری از کرست در ناحیه ساکت کشیده شده در هنگام خارج کردن دندان و پس از 4 ماه قبل از قرار دادن ایمپلنت.
3- تعیین تغییرات عرض ریج در فاصله 3 میلی متری از کرست در ناحیه دندان Ext شده در هنگام ایمپلنت گذاری و پس از 4 ماه در زمان گذاشتن Healing
4- تعیین تغییرات عرض ریج در فاصله 3 میلی متری از کرست در ناحیه ساکت کشیده شده در هنگام خارج کردن دندان و پس از 4 ماه قبل از قرار دادن ایمپلنت.
5- تعیین تغییرات عرض ریج در فاصله 7 میلی متری از کرست در ناحیه دندان Ext شده در هنگام ایمپلنت گذاری و پس از 4 ماه در زمان گذاشتن Healing
6- تعیین تغییرات عرض ریج در فاصله 7 میلی متری از کرست در ناحیه ساکت کشیده شده در هنگام خارج کردن دندان و پس از 4 ماه قبل از قرار دادن ایمپلنت.
7- کاهش ارتفاع لثه در ناحیه نسبت به خط واصل بین CEJ دو دندان مجاور در هنگام خارج کردن دندان و گذاشتن ایمپلنت و پس از 4 ماه قبل از قرار دادن Healing .
8- کاهش ارتفاع استخوان در ناحیه نسبت به خط واصل بین CEJ دو دندان مجاور در هنگام خارج کردن دندان و گذاشتن ایمپلنت و پس از 4 ماه قبل از قرار دادن Healing .
ج) اهداف کاربردی:
کسب اطلاع بیشتر در مورد قابلیت پیشگوئی و پیش بینی نتیجه درمان از لحاظ زیبایی در صورت انجام عمل ایمپلنت فوری
د) فرضیات یا سؤالات تحقیق:
1- تغییرات ابعادی باکولینگوالی در اثر عمل ایمپلنت فوری چه میزان است ؟
2- تغییرات ابعادی اکلوز آپیکالی ریج در اثر عمل ایمپلنت فوری چه میزان است؟
3- با توجه به تغییرات ابعادی استخوان پس از Ext دندان در فواصل 1 و 3 و 7 میلیمتر آیا گذاشتن ایمپلنت فوری در حفظ ریج برتری دارد یا خیر ؟
-312420-1009015
(2) فصل دوم
مواد و روش‌ها

مواد و روش کار :
این مطالعه بر روی 21 بیمار مراجعه کننده به دانشکده دندانپزشکی مشهد (13 زن و 8 مرد با میانگین سنی 39 سال) با دندان hopeless جهت گذاشتن ایمپلنت انجام شده است. روش نمونه گیری به صورت غیراحتمالی و مبتنی بر هدف صورت گرفته است.
پروتکل به تصویب شورای پژوهشی دانشگاه و کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی مشهد رسید.
معیارهای ورود به مطالعه شامل موارد زیر بود :


بیماران با دندان hopeless تک ریشه، نیازمند به درمان ایمپلنت باشند.
بیماران مشکل سیستمیک نداشته باشند.
کنترااندیکاسیون جهت درمان جراحی و ایمپلنت نداشته باشند.
اعلام موافقت کتبی و تکمیل فرم رضایت نامه با مطالعه کامل آن توسط بیمار انجام شد.
بعد از تکمیل پرونده و رضایت نامه کتبی قالب گیری از بیماران توسط Putty انجام و قالب گچی تهیه شد. بیماران طبق رضایت و میل به درمان immediate implantation به 2 گروه تست و کنترل (برای افرادی که مایل به گذاشتن ایمپلنت به صورت فوری نبودند)، به طوری تقسیم شدند که در هر گروه 12 ساکت دندانی قرار گرفت. 2 روز قبل ازعمل بیماران تحت رژیم آموکسی سیلین 500mg و دهانشویه کلرهگزیدین 2/0% قرار گرفتند و این رژیم به صورت 10 روز ادامه داشت.
در گروه کنترل پس از دادن بی حسی موضعی (لیدوکائین با اپی نفرین 100000/1) دندان آتروماتیک خارج شد و بعد باکولینگوالی استخوان (تصویر 2-4) در ناحیه 1، 3 و 7 میلیمتری از CEJ دو دندان مجاور توسط گیج ثبت گردید. به علاوه فاصله عمودی خط واصل بین CEJ دو دندان مجاور تا لبه کرست استخوان در 8 نقطه میدباکال، میدپالاتال، مزیال، دیستال، دیستوباکال، دیستوپالاتال، مزیوباکال، مزیوپالاتال توسط پروب مدرج اندازه گیری شد (تصویر 2-5) و ساکت ها برای طی کردن پروسه طبیعی ترمیم به حال خود گذاشته شدند.
در گروه تست، پس از انسیژن، کنار زدن فلپ و خارج کردن آتروماتیک دندان، اندازه گیری های فوق (مانند گروه کنترل) عیناً تکرار شد و سپس ایمپلنت (Biohorizone) در ساکت دندان تازه کشیده شده قرار داده شد. در صورتی که عرض گپ اطراف ایمپلنت از 2 میلیمتر بیشتر بود، ماده DFDBA ساخت شرکت همانند ساز بافت تولید ایران در ناحیه گپ قرار داده شد و در صورت نیاز ممبران قابل جذب در ناحیه قرار داده می شد. سپس فلپ به محل اولیه خود برگردانده شد، با نخ بخیه Silk شماره 0-3 بخیه گردید. جهت تسکین درد از ژلوفن mg400 استفاده شد، بعد از 10 روز بخیه ها کشیده شدند (تصاویر 2-1 الی 2-10).

تصویر 2-1 : CBCT بیمار قبل از شروع درمان

تصویر 2-2 : دندان Hopeless پیش از عمل

تصویر 2-3 : کشیدن دندان بدون تروما پس از فلپ زدن
1160071-4785
تصویر 2-4:اندازه گیری ابعاد باکولینگوالی استخوان ناحیه
112077527940
635991870تصویر 2-5 : اندازه گیری فاصله های عمودی از خط واصل بین دو CEJ تا لبه کرست استخوان
00تصویر 2-5 : اندازه گیری فاصله های عمودی از خط واصل بین دو CEJ تا لبه کرست استخوان

تصویر 2-6: قراردادن ایمپلنت BioHorizon داخل ساکت دندان تازه کشیده شده

تصویر 2-7 : گپ موجود بین ایمپلنت و تابل با کال

تصویر 2-8 : DFDBA های Cenobone ساخت شرکت همانند ساز بافت

تصویر2-9: قراردادن DFDBA در گپ بین ایمپلنت و تابل با کال

تصویر 2-10:بخیه کردن محل عمل با نخ بخیه سیلک شماره 0-3
برای اندازه گیری های بافت نرم در هر گروه، از کست ها استفاده شد که برای داشتن نقاط ثابتی جهت اندازه گیری بعد باکولینگوالی بافت نرم، نقطه میانی برای اندازه گیری فاصله عمودی، یک استنت آکریلی از آکریل Dura ساخته و در ناحیه 1، 3 و 7 میلیمتر از CEJ دو دندان مجاور نشانه گذاری شده بود. عرض باکولینگوالی بافت نرم در این نقاط و همچنین فاصله عمودی محل لثه تا خط واصل بین CEJ دو دندان مجاور نیز اندازه گیری و ثبت شد.

تصویر 2-11: استنت آکریلی جهت نقاط اندازه گیر ی ثابت قبل از عمل و نیز 4 ماه پس از آن هم در گروه تست و هم در گروه کنترل
4 ماه بعد در گروه کنترل، جهت گذاشتن ایمپلنت مجدداً قالب گیری توسط Putty و ساخت یک کست گچی و رادیوگرافی CBCT از ناحیه انجام شد، فلپ کنار زده شد و عرض ریج باقیمانده مجدداً در همان ناحیه در نقطه وسط میان خطی که CEJ دو دندان مجاور را بهم متصل می کند در فاصله 1، 3 و 7 میلیمتر از CEJ دو دندان و همچنین فاصله عمودی کرست استخوان در 8 نقطه میدباکال، میدپالاتال، مزیال، دیستال، دیستوباکال، دیستوپالاتال، مزیوباکال و مزیوپالاتال اندازه گیری شد.
اندازه گیری های بافت نرم نیز با استفاده از کست ها و استنت های ساخته شده، بعد باکولینگوالی را در سه نقطه 1، 3 و 7 از CEJ دو دندان مجاور و فاصله عمودی نقطه میانی محل لثه تا خط واصل بین CEJ دو دندان مجاور اندازه گیری و ثبت شد (تصاویر 2-11 الی 2-14 مربوط به گروه کنترل می باشد).

تصویر 2-12: گروه کنترل : چهار ماه پس از کشیدن دندان
808990190500
تصویر 2-13: گروه کنترل: تحلیل باکولینگوالی نسبت به خط واصل CEJ دو دندان مجاور 4 ماه پس از خارج کردن دندان

تصویر 2-14: گروه کنترل : قراردادن ایمپلنت
در گروه تست نیز، 4 ماه بعد از گذاشتن ایمپلنت، ابتدا قالب گیری توسط Putty انجام و کست گچی تهیه شد. سپس ناحیه ایمپلنت جهت گذاشتن Healing Abutment فلپ کنار زده شد و اندازه گیری های نسج سخت ماننده گروه کنترل انجام شد. (تصاویر 2-15 ا لی 2-18)

1287662144307
تصاویر 2-15: گروه تست : چهار ماه بعد از گذاشتن ایمپلنت

تصویر 2-16: گروه تست: اندازه گیری فاصله های عمودی از خط واصل بین دو CEJ تا لبه کرست استخوان
126639750859
تصویر 2-17 : گروه تست : اندازه گیری ابعاد با کولینگوالی

تصویر 2-18: قراردادن Healing
روش تجزیه و تحلیل داده ها و بررسی آماری :
نتایج ثبت شده تحت آنالیزهای آماری T-Test و ANOVA One-way قرار گرفتند.

-360680-982980
(3) فصل سوم
یافته‌ها

یافته ها :
اندازه گیری های عمودی و افقی در بافت سخت و نرم انجام گرفت، در بافت نرم عرض باکولینگوالی ناحیه در قسمت های 1، 3 و 7 میلیمتر از خط واصل CEJ دو دندان مجاور و همچنین فاصله عمودی8 نقطه بیان شد شامل : میدباکال، مزیوباکال، دیستوباکال، پالاتال، مزیوپالاتال، دیستوپالاتال، دیستال و مزیال تا خط فوق اندازه گیری و ثبت شد. در بافت سخت هم عرض باکولینگوالی ناحیه در فواصل1، 3 و 7 میلیمتر از CEJ دو دندان مجاور و فاصله عمودی خط واصل CEJ دو دندان مجاور تا کرست استخوان در 8 نقطه میدباکال، مزیوباکال، دیستوباکال، پالاتال، مزیوپالاتال، دیستوپالاتال و دیستال و مزیال انجام شد.

بررسی بافت نرم :
جدول 3-1 : تغییرات عمودی بافت نرم در نقاط باکال، مزیوباکال و دیستوباکال
میدباکال مزیوباکال دیستوباکال
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
گروه تست 71/0±04/1 1 72/0±79/0 5/0 52/0±75/0 5/0
گروه کنترل 74/0±22/1 25/1 74/0±32/1 25/1 75/0±32/1 25/1
P-value (NS)266/0 (S)033/0 (S)026/0
NS= Non Significant
با توجه به یافته های جدول (3-1) این گونه استنباط می شود که میانگین تغییرات عمودی بافت نرم در گروه کنترل در ناحیه میدباکال بیشتر می باشد اما معنی دار نیست، و در دو نقطه ی مزیوباکال و دیستوباکال این تغییرات معنی دار می باشد.

نمودار3-1: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه میدباکال در گروه تست و کنترل
جدول 3-2 : تغییرات عمودی بافت نرم در نقاط پالاتال، مزیوپالاتال و دیستوپالاتال
مید پالاتال مزیوپالاتال دیستوپالاتال
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
گروه تست 52/0±58/0 5/0 64/0±43/0 5/0 71/0±68/0 5/0
گروه کنترل 75/0±32/1 25/1 74/0±32/1 25/1 74/0±32/1 25/1
P-value (S)004/0 (S)002/0 (S)022/0
S= Significant
با توجه به داده های جدول (3-2) مشاهده می شود که تغییرات عمودی بافت نرم در ناحیه پالاتال، مزیوپالاتال و دیستوپالاتال بین دو گروه معنی دار بوده است. یعنی اینکه تغییرات عمودی بافت نرم در نقاط مذکور در گروه تست کمتر از گروه کنترل بوده است.

نمودار3-2: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه میدپالاتال در گروه تست و کنترل
جدول 3-3 : تغییرات عمودی بافت نرم در نقاط دیستال و مزیال
دیستال مزیال
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
گروه تست 19/1±79/0 5/0 02/1±78/0 5/0
گروه کنترل 75/0±32/1 25/1 74/0±32/1 25/1
P-value (S)016/0 (S)048/0
S= Significant
اطلاعات جدول (3-3) نشان می دهد که تغییرات عمودی بافت نرم در دو ناحیه ی دیستال و مزیال بین گروه تست و کنترل معنی دار بوده است.

نمودار3-3: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه دیستال در گروه تست و کنترل
756921169546
نمودار3-4: تغییرات عمودی بافت نرم در نقطه مزیال در گروه تست و کنترل
جدول 3-4 : تغییرات ابعادی افقی بافت نرم در 1، 3 و 7 میلیمتری از CEJ دو دندان مجاور
1 میلیمتر 3 میلیمتر 7 میلیمتر
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
گروه تست 01/4±55/3- 65/1- 7/1±5/1- 9/0- 24/1±42/1- 45/0-
گروه کنترل 20/3±75/4- 85/4- 24/4±58/3- 5/2- 62/2±22/2- 65/1-
P-value (NS) 502/0 (NS) 545/0 (S) 051/0
NS= Non Significant
5676901268730همانگونه که در جدول (3-4) مشاهده می شود، تغییرات افقی بافت نرم در 1 و 3 میلیمتری از CEJ دو دندان مجاور در دو گروه کنترل بیشتر از گروه تست می باشد که از نظر آماری معنی دار نیست (502/0 P-Value= و 545/0 P-Value=) ولی در نقطه 7 میلیمتری این تغییرات معنی دار می باشد.
نمودار 3-5: تغییرات افقی بافت نرم از 1 میلی متری خط واصل دو CEJ دندان مجاور
1291590-163830
نمودار 3-6: تغییرات افقی بافت نرم از 3 میلی متری خط واصل دو CEJ دندان مجاور
1300503260678
نمودار 3-7: تغییرات افقی بافت نرم از 7 میلی متری خط واصل دو CEJ دندان مجاور
بررسی بافت سخت :
جدول 3-5 : تغییرات عمودی بافت سخت در نقاط باکال، مزیوباکال و دیستوباکال از CEJ دو دندان مجاور
مید باکال مزیوباکال دیستوباکال
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
گروه تست 25/2±25/0 75/0 87/1±26/0 25/0 05/3±41/0 62/0
گروه کنترل 58/0±42/1 5/1 65/0±99/0 1 68/0±64/0 75/0
P-value (S) 046/0 (NS) 0703/0 (NS) 656/0
NS= Non Significant
-22639952306یافته های این جدول نشان می دهد که تغییرات عمودی بافت سخت در ناحیه ی میدباکال معنی دار می باشد، اما این تغییرات در دو ناحیه ی مزیوباکال و دیستوباکال در گروه کنترل بیشتر از گروه تست می باشد، اما از لحاظ آماری معنی دار نمی باشد.
2852420113665نمودار 3-6: تغییرات عمودی بافت سخت در نقطه مبدباکال
00نمودار 3-6: تغییرات عمودی بافت سخت در نقطه مبدباکال

جدول 3-6 : تغییرات عمودی بافت سخت در نقاط پالاتال،مزیوپالاتال و دیستوپالاتال از CEJدو دندان مجاور
مید پالاتال دیستوپالاتال مزیوپالاتال
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
گروه تست 54/3±12/0 25/0 75/2±08/1 5/0 25/4±08/0 0
گروه کنترل 73/0±3/1 1 56/0±95/0 1 49/0±03/1 1
P-value (S) 029/0 (NS) 209/0 (S) 026/0
NS= Non Significant
10189821083696همانطور که در جدول (3-6) مشاهده می شود تغییرات عمودی بافت سخت در نقاط پالاتال و مزیوپالاتال از لحاظ آمار معنی دار می باشد در صورتی که در ناحیه ی دیستوپالاتال از لحاظ آماری معنی دار نمی باشد.
نمودار 3-7: تغییرات عمودی بافت سخت در نقطه میدپالاتال
جدول 3-7 : تغییرات عمودی بافت سخت در نقاط دیستال و مزیال از CEJ دو دندان مجاور
دیستال مزیال
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
گروه تست 01/2±75/0 75/0 94/1±5/1 1
گروه کنترل 66/0±79/0 70/0 50/0±080/1 1
P-value (NS)761/0 (NS)741/0
NS= Non Significant
اطلاعات به دست آمده از این جدول نشان می دهد که تغییرات عمودی بافت سخت در 2 نقطه ی مزیال و دیستال در گروه تست بیشتر از گروه کنترل می باشد، اما این تغییرات از لحاظ آماری معنی دار نمی باشد.

نمودار 3-8: تغییرات عمودی بافت سخت درنقطه دیستال
91561576007
نمودار3-9: تغییرات عمودی بافت سخت در نقطه مزیال
جدول 3-8 : تغییرات افقی بافت سخت در 1، 3 و 7 میلیمتری خطوط واصل CEJ دو دندان مجاور
1 میلیمتر 3 میلیمتر 7 میلیمتر
انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه انحراف معیار ± میانگین میانه
تست 0 0 57/3±71/0- 0 75/3±67/0- 55/0-
کنترل 25/3±81/2- 5/1- 92/2±89/2- 8/1- 26/1±97/1- 5/1-
P-value (S)005/0 (S)028/0 (NS)090/0
NS= Non Significant
یافته های به دست آمده از جدول شماره (3-8) نشان می دهد که تغییرات افقی بافت سخت در 1 و 3 میلیمتری از CEJ دو دندان مجاور از لحاظ آماری معنی دار می باشد، اما این تغییرات در نقطه ی7 میلیمتری با اینکه در گروه کنترل بیشتر از گروه تست می باشد اما از لحاظ آماری معنی دار نمی باشد.

نمودار 3-10: تغییرات افقی بافت سخت در 1 میلیمتری از خط واصل دو CEJ دندان مجاور
1016002287270نمودار 3-11: تغییرات افقی بافت سخت در 3 میلیمتری از خط واصل دو CEJ دندان مجاور
00نمودار 3-11: تغییرات افقی بافت سخت در 3 میلیمتری از خط واصل دو CEJ دندان مجاور

نمودار 3-12: تغییرات افقی بافت سخت در 7 میلیمتری از خط واصل دو CEJ دندان مجاور
توضیحات نمودارها: (در اندازه گیری تغییرات افقی : بعد باکولینگوالی استخوان در 1 و 3 و 7 میلیمتری از CEJ 2 دندان مجاور در مرحله دوم از مرحله اول کم شد .
در اندازه گیری تغییرات عمودی: فاصله لبه کرست تا خط واصل CEJ 2دندان مجاور در مرحله دوم از مرحله اول کم شد .
در نمودار تغییرات افقی هر چه دامنه تغییرات به سمت اعداد منفی برود نشان دهنده کلاپس بیشتر بعد باکولینگوالی استخوان می باشد و هر چه دامنه تغییرات به سمت اعداد مثبت برود نشان دهنده کلاپس کمتر بعد باکولینگوالی استخوان می باشد.
در نمودار تغییرات عمودی هر چه دامنه تغییرات به سمت اعداد منفی برود نشان دهنده تحلیل کمتر استخوان و یا gain استخوان می باشد و هر چه به سمت اعداد مثبت برود نشان دهنده تحلیل بیشتر استخوان می باشد .)

-224155-925830
(4)فصل چهارم
بحث

بحث :
در این مطالعه 21 بیمار با میانگین سنی 39 سال که دارای دندان تک ریشه Hope less بودند مورد بررسی قرار گرفتند. بیماران به گونه ای تقسیم شدند که در هر گروه 12 ساکت دندانی قرار گرفت. در گروه تست پس از خارج کردن دندان ایمپلنت قرار داده شد و در گروه کنترل ساکت جهت ترمیم طبیعی رها شد.
ترمیم ساکت دندان های خارج شده همیشه همراه با از دست رفتن عرض و ارتفاع ریج آلوئل می باشد. برای فائق آمدن بر این مشکل روش های مختلفی برای حفاظت از ریج یا ساکت پس از خارج کردن دندان مورد آزمایش قرار گرفته و همگی در جلوگیری از کاهش عرض و ارتفاع ریج کم و بیش مؤثر بوده اند.
با ورود ایمپلنت ها به دنیای دندانپزشکی تصور می شود که قرار دادن ایملپلنت در یک Fresh socket می تواند تغییرات متعاقب کشیدن دندان را جلوگیری نماید(35).
قرار دادن ایمپلنت بطور فوری پس از کشیدن دندان دارای مزایایی از قبیل کاهش تعداد دفعات جراحی، کاهش طول دوره درمان و مقدار استخوان مطلوب باقیمانده در زمان جراحی است.
سؤالی که در این مطالعه به دنبال پاسخ آن بودیم این بود که آیا قرار دادن فوری ایمپلنت متعاقب EXT دندان می تواند باعث جلوگیری از تحلیل دیواره های ساکت گردد؟ برای پاسخ به این سؤال مطالعات مختلفی انجام گردیده است. ولی نتایج متفاوتی در این بررسی ها ارائه گردیده است، لذا انجام مطالعه جهت درک بهتر از این موضوع ضروری به نظر می رسد.
بررسی تغییرات عمودی بافت نرم در مطالعه حاضر نشان دادکه در گروه تست (ایمپلنت) در تمام سطوح باکال و لینگوال کاهش بافت نرم نسبت به گروه کنترل (ترمیم طبیعی ساکت) به میزان معنی داری کمتر است. فقط در ناحیه میدباکال علی رغم اختلاف این مقدار معنی دار نبود که علت این است که معمولاً ضخامت plate باکال پس از Ext کم است. بنابراین انتظار تحلیل کرست و تحلیل متعاقب آن می رود.
نتایج این مطالعه با تحقیق De Rouk (23) همخوانی دارد. در مطالعات مشابهی دیگر که انجام شده بود بررسی بافت نرم انجام نگردیده بود (5و6).
بررسی دیگری که در مطالعه ما انجام شد بررسی تغییرات ابعاد افقی بافت نرم بودند. اندازه گیری های باکولینگوالی در فواصل 1 و 3 و 7 میلیمتری از CEJ دو دندان مجاور انجام گرفت و مشخص گردید که در تمام این مناطق تغییرات در گروه کنترل بیشتر از گروه تست بوده است. مطالعه مشابه دیگری که چنین اندازه گیری را ثبت نماید در دسترس نبود.
بررسی تغییرات بافت سخت در مطالعه ما در دو سطح عمودی و افقی مورد بررسی قرا رگرفت. بررسی تغییرات عمودی بافت سخت که در هر مورد در 8 نقطه انجام گرفت (میدباکال، مزیوباکال، دیستوباکال، پالاتال، مزیوپالاتال، دیستوپالاتال، مزیال و دیستال) نشان داد که در تمام این نقاط میزان تغییرات در گروه تست نسبت به گروه کنترل کمتر بوده است. البته تغییرات عمودی در سطوح دیستال و مزیال علی رغم داشتن اختلاف معنی دار نبوده است که علت آن وجود حجم استخوان کافی در این نواحی بوده و طبیعی است که وقتی مقدار استخوان مناسب باشد انتظار تحلیل کمتری را نیز داریم. نتایج مطالعه ما مشابه یافته مطالعه Chen (17)، Wagenberg (21 ) بود. ولی با مطالعه Botticelli (4) و Covani (18) و Lindhe (7) همخوانی ندارد. علت این عدم هماهنگی را شاید بتوان اینگونه توجیه نمود که اولاً در مطالعه ما تغییرات استخوانی در 8 نقطه مورد بررسی قرار گرفته است. به علاوه در مطالعه ما در نواحی که بین ایمپلنت و کرست استخوان Gap بیش از 2 میلیمتر وجود داشت ناحیه Gap با DFDBA پر می شد که این مسئله می تواند از تحلیل بیشتر کرست جلوگیری کند.
بررسی تغییرات افقی بافت سخت نشان داد که تغییرات در 1 و 3 میلیمتری بین دو گروه معنی دار است، ولی در 7 میلیمتری این میزان معنی دار نیست. در نواحی 1 و 3 میلیمتری ضخامت تابلیت های استخوانی کم است بنابراین احتمال تحلیل بیشتر است. در حالیکه در ارتفاع 7 میلمیتری در هر 2 گروه ضخامت تابلت های استخوانی زیاد بوده بنابراین میزان تحلیل کمتر خواهد بود.
مطالعات دیگری نیز نتایج مشابه با مطالعه ما ارائه داده اند. مانند مطالعه Nowzari در سال 2001(15)، Chen در سال 2004 (17)که گزارش کردند ایمپلنت فوری از آتروفی استخوان جلوگیری کرده و به احتمال زیاد به نگهداری بافت استخوان ساکت و احاطه کننده فک کمک می کند.
نکته ای که در مورد قرار دادن ایمپلنت فوری باید توجه داشت خارج کردن آتروفیک ریشه دندان است که در مطالعه حاضر سعی گردید دندان ها با کمترین میزان تروما خارج گردند.
ضخامت تابلت باکال آلوئولار در میزان آینده تحلیل نقش اساسی دارد که باید به آن توجه کرد. به همین دلیل در این مطالعه و موارد مشابه بیشترین میزان تحلیل در نواحی میدباکال اتفاق می افتد.

-205105-954405
(5) فصل پنجم
نتیجه گیری و پیشنهادات

نتیجه گیری :
بررسی نتایج مطالعه حاضر نشان داد که قرار دادن فوری ایمپلنت در ساکت کشیده شده دندان می تواند از تحلیل عمودی و افقی استخوان آلوئل جلوگیری نماید. همچنین تحلیل نسج نرم لثه متعاقب ایمپلنت فوری در مقایسه با ترمیم طبیعی ساکت کمتر است.
پیشنهادات :
پیشنهاد می گردد مطالعاتی با حجم بیشتر بیماران و نیز زمان Follow up طولانی مدت تر و نیز مطالعات هیستولوژیک جهت روشن تر شدن پروسه ترمیم بعد از ایمپلنت فوری انجام گیرد.
References :
Arauj M, Lindeh J. The edentolous alveolar ridge. In : Lindhe J, Lang NP, Karring T. Clinical periodontology and implant dentistry, 5th ed. : Black Well; 2008. P: 62-5.
Klokvold RP. Localized bone Augmentation and Implant Site Development.In: Newman MG, Takel HH, Klokkevold PR. Caranza's clinical periodontology, 10th ed. Philadelphia: W.B Saunders; 2008. P: 1141-45.
Hanmerle CH, Araujo M, Lindhe J. Timing of Implant placement.In: Lindhe J, Lang NP, Karring TH. Clinical periodontology and implant dentistry, 5th ed. :Black Well; 2008. P. 1054-61.
Botticelli D, Breglundh T, Lindhe J. Hard tissue alterations following immediate implant placement in extraction sites. J Clin Periodontol. 2004; 31(10): 820-8.
Araujo MG, Lindhe J. Dimensional ridge alteration following tooth extraction. An experimental study in dog. J Clin Periodontol. 2005; 32(2): 212-8.
Araujo M, Wennstrom J, Lindhe J. Modeling of buccal and bone walls of fresh extraction sites following implant in stallation. Journal Clinical Oral Implant Restorative. 2006; 17(4): 606-14.
Lindhe J, Araujo M, Wennstrom J. Modeling of the buccal and lingual bone walls of fresh extraction sites. Clin Oral Implantes. 2006; 17(6): 606-14.
Gher ME, Quintero G, Assad D, Manaco E, Richardson AC. Bone grafing and guided bone regeneration for immediate dental implants. J Periodontol. 1994; 65(9): 881-91.
Rosenquist B, Grenthe B. Immediate placement into extraction sockets : implant survial. Int J Oral Maxillo Fac. 1994; 11(2): 205-9.
Chaushn G, Schwartz-A-- D. The ways and where fores of immediate placement of implants into fresh extraction sites : a literature review. J Periodontal. 1997; 68(10): 915-23.
Schwartz-Ard D. Chaushn G. Placement of implants into fresh extraction sites : 4 to 7 years retrospective evaluation of 95 immediate implant. J Periodontol. 1997; 68(11): 1110-6.
Grunder V. Stability of the mucosal topography aroud single-tooth implants and adjacent teeth. Int J Periodontal Restorative Dent. 2000; 20(1): 11-17.
Rosenquist B, Ahmed M. The immediate replacement of teeth by dental implants using homologus bone membrans to seal the sockets : Clinical and --iographic findings. Clin Oral Implant Res. 2000; 11(6): 57-82.
Schultes G, Gagol A. Histologic evaluation of immediate versus delayed placement of implant after tooth extraction. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radio Endodo. 2001; 92(1): 17-22.
Nowzari H, Schincoglla GP. Surgical treatment planning for the single-unit implant in easthetic areas. J Periodontol 2000-2001; 27(4): 162-82.
Schropp L, Wenzel, Kostopoulos L, Karring. Bone healing and soft tissue contour changes following single-tooth extraction: A Clinical and Radiographic 12-month prospective study. Int J Periodontal Restorative Dent. 2003; 33: 313-23.
Chen ST, Wilson TG, Hammerle CH. Immediate or early placement of implants following tooth extraction. Review of biologic basic, clinical procedures and outcomes. Int J Oral Maxillo Fac Implant. 2004; 19 suppl: 12-25.
Covani U, Bortolaia C, Barone A, Sbordone L. Bucco-lingual crestal bone changes after immediate and delayed implant placement. J Periodontol. 2004; 75(12): 1605-12.
Becker W, Sennerby L, Bedrossian E, Becker BE, Lucchini JP. Implant stability measurements for implants placed at the time of extraction : a cohort, prospective clinical trial. J Periodontol. 2005; 76(3): 391-7.
Maurico G, Lang J, Lindhe J. Ridge alterations following implant placement in fresh extraction sockets : An experimental study in the dog. J Clin Periodontol. 2005; 32(6): 654-52.
Wegenberg B, Froum SJ. Aretrospective study of 1925 consecutively placed immediate implants from 1988 to 2004. Int J Oral Maxillo fac Implants. 2006; 21(1): 71-80.
Quirynen M, Van Assache N, Botticelli D, Berglundh T. How does the timing of implant placement to extraction affect outcome. Int J Oral Maxillo Fac Implants. 2008; 23(1): 59-60.
De Rouck T, Colly K, Cosyn J. Immediate single-tooth implants in the anterior maxilla : a 1-year case cohort study on hard and soft tissue response. J Clin Periodontol. 2008; 35(7): 649-57.
Chen ST, Daby IB, Reynolds EC, Clement JG. Immediate implant placement post extraction without flap elevation. J Periodontol. 2009; 80(1): 163-72.
Heinemann F, Baurauel C, Hasan L, Gedrango T. Influence of the implant cervical topography on the crestal bone resorption and immediate implant survival. J Physiol Pharmacol. 2009; 60 suppl: 99-105.
Chen ST, Buser D. Clinical and easthetic out comes of implants placed in postextraotion sites. Int J Oral Maxillo Fac Implants. 2009; 24(Suppl): 186-217.
Vignoletti F, De Sanctis M, Berglundh T, Abrahamsoon L, Sanz M. Early healing of implants placed into fresh extraction sockets. An experimental study in the beagle dog. J Clin Periodontol. 2009; 36(12): 1059-66.
Cordaro L, Torsello F, Ro Ccuzzo M. Clinical out come of submerged implants placed in fresh extraction sockets. Clin Oral Implants Res. 2009; 20(12): 1307-13.
Lindhe J, Tomasi C, Sanz M, Cecchinato D. Bone dimensional variations at implant placed fresh extraction sockets : A multilevel multivariate analysis. Clin Oral Impalnt Research. 2010; 21(1):30-6.
Deng F, Zhang H, Shao H, He Q,, Zhang P. A comparsion of clinical out comes for implants placed in fresh extraction sockets versus heald sites in periodontally compromised patients : A 1-year follow up report : Int J Oral Maxillo Fac Implants. 2010; 25(5): 1036-40.
Caneva M, Botticelli D, Salata LA, Scombatti SL, et al. Collagen membranes at immediate implants : a histomorphometric study in dogs. CLin Oral Implants Res. 2010; 21(9): 89-17.
Huynh Ba G, Pietursson BE, Sanz M, Cechinato D, Ferrus J, et al. Analysis of the socket bone wall dimensions in upper maxilla in relation to immediate implant placement. Clin Oral Implant Res. 2010; 21(1): 37-42.
Esposito M, Grusovin MG, Polyzos IP, Felice P, Worthington HV. Timing of implant placement after tooth extraction : immediate, immediate-delayed or delayed implants? A cochrane sys--eic review. Eur J Oral Implantol. 2010; 3(3): 186-205.
Koh Ru, Oh TJ, Rudeck I, Neiva GF, Misch CE, et al. Hard and soft tissue changes following crestal and subcrestal immediate implant placement. J Periodontol. 2011; 2(6): 87-96.
Paolantonio M, Dolci M, Scarano A, Archivio D, Placido G, Tumini V, et al.Immediate implantation in fresh extraction sockets.A controlled clinical and histological study in man. J Periodontol. 2001 vov ; 72 (11): 156-71
Abstract :
Introduction :
Immediate implantation in single-root teeth posses some benefits, specially bone preservation. The aim of this study was to evaluate the ridge changes after immediate implantation in comparison with tooth extraction and natural dental socket healing.
Method and Material :
For this study 21 patient with hopeless single- root tooth were selected. After impression and cast making, the patients were divided into 2 goups; test group and contral group.
12 dental socket were in each groups. In tooth groups the extraction was atroumatic. Measurments include horizontal (Bucco-lingual dimention at 1mm, 3mm and 7mm at mid portion from the line connecting two adjacent cejs) and vertical dimentions (vertical distance from the line connecting two adjacent cejs at 8 paints : mid-buccal, mid-palatal, Mieial, Distal, Disto buccal, Disto palatal, Mesio buccal and Mesiopalatal). In test group, dental socket were left for natural heading.
4 mouths after the operation, in both of them the flap was reflected and like the first, the measuments were done. Soft tissue measurmends were similar to hard tissue measumends and by using the cast and stents, were done and recorded.
Results :
Vertical changes of soft tisues were measured in all the points. These changes in test group were less than control group and this difference head significant relationship in all points exept in mid-Buccal point.
2604770206375000Horizontal dimention changes of soft tissue in 1,3 and 7mm at mid portion from the line connecting two adjacent cejs, in test group, also were less than control group. Vertical changes of hard tissue measured in all the points, in test group were less than control group. These changes were significant in mid-Buccal and mid-Palatal points.
Horizontal changes of hard tissue in 1,3 and 7mm at mid portion from the line connecting two adjacent CEJ , in test group also were less than control group, however in point of 7mm this change was not significant.
Conclusion :
According to the results of this study, we can conclude thatn immediate implantation in the socket of early extracted tooth, is effective for reducing the actual vertical and horizontal bone changes and horizontal and vertical of soft tissue.
Key words :
Immediate implant- tooth extraction- dimensional changes of Alveolar ridge.
2147570480822000

–248

3-4بررسی روابط فیلوژنی بر اساس صفات مولکولی 40
3-4-1استخراج DNAاز برگ 40
3-4-2تکثیر قطعات مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمر از 42
3-4-3الکتروفورزژل آگارز 43
3-4-4تعیین توالی مناطق تکثیر شده 45
3-5آنالیز فیلوژنی 45
3-5-1روش ماکزیمم پارسیمونی 46
3-5-2روش Bayesian 46
3-5-3مقایسه دو روش آنالیزی ماکزیمم پارسیمونی و Bayesian 47
فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری49
4-1 انالیز ماکزیمم پارسیمونی 50
4-2 انالیز Bayesian 52
4-3 فیلوژنی قبیله Cynoglosseae 54
4-4 روابط فیلوژنی جنس Rindera 55
منابع 61
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1 7
شکل 1-2 8
شکل 1-3 25
شکل 1-4 28
شکل 1-5 39
شکل 1-6 44
شکل 1-7 44
شکل 1-8 45
شکل 1-9 45
شکل1-10 51
شکل1-11 53
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1 گزارش عدد پایه کروموزومی تعدادی از گونه های Boraginaceae در ایران 24
جدول 1-2 مقایسه دریچه دانه گرده بین قبیله های Boraginaceae s.str 26
جدول 1-3 تاکسون های مورد استفاده برای تکثیر قطعه - جدول nrDNA ITS 40
جدول 1-4 توالی آغازگر های مورد استفاده برای تکثیر قطعه - جدولnrDNA ITS 42
جدول1-5 ترکیبات مورد استفاده برای مخلوط کلیpcr 42
جدول 1-6 برنامه مورد استفاده برای واکنش PCR قطعه ITS nrDNA 43
چکیده
تیره گاوزبان دارای 100 جنس و 1600 گونه بوده و دارای پراکنش جهانی می باشد. این تیره هم اکنون در گروه EuasteridsI واقع شده ودر بین راسته های این گروه جایگاهی ندارد. از مهمترین قبیله های تیره
s. str Boraginaceae در ایران، می توان قبیله هایBoragineae, Lithospermeae, Cynoglosseae, Echiochileae, Echieae, را نام برد در تحقیق حاضر 5گونه با استفاده از توالی nrDNAITS، به روش بیشنه صرفه جویی (mp: Parsimony Maximum) تعبیه شده در نرم افزار PAUP*4.0b10 و همچنین با روش Bayesian با نرم افزارVersion3.12 Mr Bayes آنالیز شدند. توالی همردیف سازی شده nrDNAITS دارای 658 جایگاه نوکلئوتیدی می باشد. که از این توالی ITS نشان داد جایگاه 146 جایگاه برای توالی nrDNAITS اطلاعاتی می باشد آنالیز انجام شده بر اساس داده های توالی ITS نشان داد،، قبیله Cynoglosseae تک تبار نمی باشداز این قبیله 5 گونه از جنس Rinderaو 3 گونه از جنس Cynoglossum آنالیز شدند و دو گونه از قبیله Lithospermeae مورد آنالیز قرار گرفتند .
و دو گونه HeliotropiumBacciferum, TournefortiaRubicunda به عنوان برون گروه قرار گرفتند قبیله Cynoglesseae دارای فندقه های خاردار است که در سطح پشتی – شکمی تخت و گاهی در حاشیه بالدارند در آنالیز انجام شده نشان داده شد که بین گونه های جنس Rindera روابط حل نشده است وبا جنس Cynoglossum در یک کلاد با حمایت قوی قرار گرفته اند
کلمات کلیدی: توالی هسته ای nrDNA ITSفیلوژنی مولکولی، Cynoglesseae ،Rindera ، تیره گاوزبان
534670108585فصل اول
مقدمه
00فصل اول
مقدمه

1-1تیره گاو زبان (Boraginaceae)
تیره Boraginaceae یا گاوزبانیان یکی از تیره های بزرگ گیاهان و دولپه های حقیقی است. جنس معروف آن Borago است که ازکلمات لاتین Bor و ago به معنای من محرک قلبم مشتق شده و از این نظر که گیاهان این تیره دارای اثر درمانی روی قلب می باشند، تیره را به این نام نامیده اند (خوش سخن، 1388)
تیره Boraginaceae در کلاد Euastrid I (Lamiids) قرار می گیرد که در حال حاضر در میان هیچ یک از راسته های این کلاد جای نگرفته است (APG III 2009) تیره Boraginaceae (subfamily Boraginaceae) دارای 100 سرده و حدود 1600 گونه در دنیا با مراکز پراکنش در اوراسیا می باشد (Weigend et al., 2010)
در فلور ایران Boraginaceae s.I دارای 41 سرده و 218 گونه و Boraginaceae s.str دارای 36 سرده و حدود 180 گونه است. (Khatamsaz, 2002)
در تیره Boraginaceae s.i دو جنس Onosma و Heliotropium بیشترین گونه ها را دارند. تقریبا درتمامی مناطق کشور و در رویشگاه های مختلف پراکنده شده اند. در مناطق کویری و کوهستانی دیده می شوند و گونه هایی از آنها نیز به صورت علف های هرز مزارع و یا در مجاورت مناطق مسکونی و زمین های مخروبه می رویند (kazempour Osaloo,1993)
تیره Boraginaceae s.str شامل یک سری گونه های علفی دو جنسی، ندرتا درختی و درختچه ای اغلب با پوششی از کرک یا موهای زبر، برگ ها معمولا ساده و بدون گوشواره، گل آذین گرزن دم عقربی ساده یا مرکب یا خوشه ای، کاسه گل 5 قسمتی، اغلب بعد از گلدهی وسیع شده، جام گل 5 لبه، منظم یا به ندرت نامنظم، معمولا با لوله مشخص، محل اتصال لب ها به لوله جام اغلب زائده دار، پرچم ها 5 عدد، متصل به سطح بیرونی جام، تخمدان فوقانی، 2 برچه و 4 خانه، خامه منفرد، 2-1 کلاله، جفت بندی قاعده ای، میوه شیزوکارپ معمولا با 4 فندقه می باشند.
این تیره دامنه تنوع وسیعی را به ویژه در ویژگی های میوه وگل نشان می دهد. به همین دلیل تا به حال به صورمختلف رده بندی شده است.
اهداف تحقیق
1.تعیین حدود گونه ای این جنس با استفاده ازتوالیDNA
2.مقایسه نتیجه حاصله با داده ی مورفولوژی
3.بازسازی مولکولی وتعیین حدود جنس Rinderaبااستفاده ازتوالی DNA
687070133350فصل دوم
مرور بر منابع
00فصل دوم
مرور بر منابع

2-1موقعیت تاکسونومیکی تیره Boraginaceae
این تیره در طبقه بندی های دالگرن (Dahlgren,1989) و تختاجان (Takhtajan,1997) در راسته Boraginales براساس نظر کوانکوئیست (Cronquist,1988) در راسته Lamiales و برطبق رده بندی تورن (Thorne,1983) در راسته Solanales قرار می گیرد.
اکنون تیره گاوزبان براساس بررسی های مولکولی در گروه Euasterids I قراردارد و فعلا در میان راسته های گیاهی موجود جایگاهی ندارد (APG III 2009) شکل (1-1)
Euastrids I یک نام غیر رسمی است که برای یک گروه تک تبار شامل چهار راسته به کار می رود Solananles,Gentianales,Lamiales,Garyales به اضافه تعدادی تیره که در راسته های این گروه جایی ندارند. مثل (APG III 2009)Boraginaceae شکل (1-1)
گورکه (Gurke, 1897) جانسون (Jahnston, 1951) و کرانکوئیست (Cronquist, 1981) تیره مذکور را براساس ویژگی های میوه به عنوان یک واحد طبیعی از گروه های خویشاوند مشتمل بر چهار زیر تیره
Heliotropioideae ,Ehretioideae ,Cordioideae ,Boragionideae در نظرگرفتند.
هم اکنون تیره گاو زبان با 4 زیر تیره ذکر شده، به عنوان Boraginaceae sensu lato در نظرگرفته می شود.
Boraginaceae sensu stricto فقط شامل زیر تیره Boraginoideae می باشد و زیر تیره های دیگر به عنوان تیره های مجزا معرفی شده اند و شامل Heliotropaceaee,Cordiaceae,Ehreticeae می باشند(Simpson, 2006). (تصاویر تعدادی از گونه های این تیره در شکل 1-2 آمده است.)
در فلور ایرانیکا Boraginaceae s.I به 4 زیر خانواده، Heliotropioideae,Cordioideae, Ehretioideae، (Boraginaceae s.str) Boraginoideae تقسیم بندی می شود و Boraginaceae s.str شامل قبیله های
Eritrichieae,Myosotideae,Trichodesmeae,Cynoglosseae,Lithospermeae,Boragineae
است.

شکل 1-1) درخت فیلوژنی نشان دهنده روابط بین راسته های نهاندانگان در APG III، موقعیت تیره Boraginoideae در کلاد Lamiids مشخص شده است. (APG III 2009).

شکل 1-2) برخی از گونه های تیره Boraginaceae
A:Onosma longilobum
B: Anchusa italica
C:Onosma dichroantum
D:Paracaryum
E:Nonea lutea
F:Borago officinalis
G:Echium italicum
H:Symphytum officinale
I:Cynoglossum germanicum
J:Maharanga emodi
2-1-1ویژگی های قبیله Cynoglosseae
قبیله Cynoglesseae دارای فندقه های خاردار است که در سطح پشتی – شکمی تخت و گاهی در حاشیه بالدارند (Hilger ,1985). قبیله Cynoglosseae در ایران با داشتن 11 جنس
Heliocarya,Rindera,Trachelanthus,Lindelofia,Omphalodes,Solenanthus,
Cynoglossum,Paracaryum,Microparacaryum,Caccinia,Trichodesma
سومین قبیله بزرگ تیره گاوزبان به شمار می رود که به طورگسترده در نواحی گرمسیری و معتدله پراکنش دارند. دانه گرده در گیاهان این قبیله به صورت 6 شیار ناجور دیده می شود که 3 شیار مرکب و 3 شیار ساده به طور متناوب قرار گرفته اند و عدد پایه کروموزومی در این قبیله عموماx=12 می باشد. این ها گیاهانی با پایه خامه (ژینوباز) مخروطی، هرمی یا به ندرت استوانه ای کوتاه هستند. در این گروه فندقه ها معمولا 4 عدد، و از تمام طول به پایه خامه متصل اند و یا فقط در قسمت انتهایی متصل می باشند و راس فندقه ها در بالاترین نقطه اتصال غیر برآمده می باشد. این قبیله در فلور ایران شامل 11 جنس و 53 گونه می باشد (khatamsaz, 2002)
2-1-2 ویژگی کلی جنسPall Rindera
گیاهی علفی، چند ساله، بدون کرک یا با کرک، ساقه افراشته، اغلب غیر منشعب، برگ ها تخم مرغی تا نواری، برگ های قاعده ای با دمبرگ طویل، گل آذین خوشه مرکب، خوشه ها مجتمع یا به صورت گرزن یک سویه، دمگل در حالت میوه وسیع شده، کاسه قسمتی تا قاعده شکافته شده، دندانه های کاسه باریک و غیر قابل تغییر، در حالت گل افراشته و در حالت میوه برگشته، جام گل لوله ای، با زایده بین لبه های جام، منقسم شده به 5 لبه کوتاه یا بلند، پرچم ها 5 عدد، بساک نواری – استوانه ای در قاعده تیرکمانی، یا بیضوی. خامه رشته ای شکل، معمولا خارج از جام گل و به ندرت داخل جام گل، کلاله سرسان و همیشه بدون چین خوردگی، فندقه ها چسبیده به خامه، بادکرده و با حاشیه غشایی وسیع شده و به صورت بال درآمده
1:R.Regia
حاشیه بال فندقه یک لبه. پرچم ها حداکثر تا لبه جام گل. زایده بزرگ و در انتهای جام گل، برگ ها مستطیلی نیزه ای یا نواری
حاشیه بال فندقه دولبه، پرچم ها بلندتر از جام گل، زایده در قسمت قاعده ای جام گل و تقریبا ً کوچک. برگ ها نیزه ای – نواری

Rindera regia
2:R.Lanata
گل آذین چتری، گل ها ارغوانی
گل آذین خوشه ای، گل ها قرمز، آبی یا سفید

Rindera lantana
3:R.Cyclodonta
گیاه پوشیده از کرک های پشمی، کاسبرگ ها پوشیده از کرک های پشمی زایده بین لبه های جام باد کرده و مربع شکل.
گیاه نسبتا بدون کرک ,کاسبرگها با کرک های انبوه. زایده بین لب ها کوچک وغیر باد کرده.

Rindera cyclodonta
4 :R.Albida
لب های جام گل طویل، جام گل فقط کمی بلندتر از کاسه، لب های جام گل کوتاهتر از لوله. جام گل 2 تا 3 برابر کاسه

Rindera albida
5 :R.Bungei
لبه داخلی بال میوه کاملا خم شده به داخل
لبه داخلی بال میوه کمی خم شده به داخل

Rindera bungei
6:R.Media
1-R.Regia
گیاهی چند ساله با ریزوم ضخیم، ساقه منفرد، افراشته، پوشیده از کرک های بلند پشمی سفید، برگ های قاعده ای نیزه ای با قاعده کشیده بردمبرگ، به طول 15 تا 20 و عرض 5/0 تا 2 سانتی متر، هردو سطح برگ پوشیده از کرک های بلند پشمی سفید، نوک تیز، در قاعده باریک شونده، برگ های ساقه ای نیزه ای، نواری، برگ های قاعده ساقه پهن تر و طویل تر و برگ های انتهایی باریک ترو کوچک تر، گل آذین متشکل از چندین گرزن که به صورت چتر درآمده اند. کاسه گل به طول 4 تا 6 میلی متر. جام گل ارغوانی، کمی طویل تر و کاسه، لب ها تخم مرغی کشیده، پرچم ها تا دهانه جام گل، با میله کوتاه، بساک تیر کمانی، خامه ارغوانی و طویل.
2-R.Lanata
گیاهی چند ساله، علفی، پوشیده از کرک های پشمی تا با کرک های اندک پشمی، در بعضی مواقع کرک ها ریزان و فقط قاعده آنها باقی می ماند. ساقه افراشته، منفرد یا منقسم، به ارتفاع 15 تا 65 سانتی متر. برگ های قاعده ای با دمبرگ طویل، مستطیلی – نواری یا مستطیلی، به طول 5 تا 15 و عرض یا تا 5/2 سانتی متر، با پوشش کرکی متراکم یا تقریبا بدون کرک، برگ های ساقه ای تخم مرغی تا نواری، بدون دمبرگ وبرگ های انتهایی تقریبا ساقه آغوش، گل آذین خوشه مرکب، متشکل از چندین گرزن، دمگل ها طویل تر از کاسه. کاسه گل استکانی، به طول 4 تا 7 میلی متر، پوشیده از کرک های پشمی سفید، جام گل قرمز، آبی یا سفید متمایل به زرد، بلندتر از کاسه، لب ها تخم مرغی کشیده، زایده بین لب ها مربع شکل و باد کرده، پرچم ها تا دهانه جام گل، میله کوتاه، بساک تیرکمانی، خامه طویل، فندقه دایره ای، به قطر 15 تا 22 میلی متر، حاشیه با بال غشایی ساده یا چین خورده.
زمان گل دهی تابستان، گیاه خاص مراتع و حاشیه جنگل ها و ارتفاعات خزری و ایران و تورانی.
3-R.Cyclodonta
گیاهی علفی، چند ساله، نسبتا بدون کرک، ساقه منفرد، انباشته به ارتفاع 15 تا 60 سانتی متر. برگ های قاعده ای با دمبرگ طویل، به طول 15 تا 25 و عرض 2 تا 6 سانتی متر، تخم مرغی، نوک کوچک.
برگ های ساقه ای تخم مرغی و بدون دمبرگ. برگ های انتهایی ساقه آغوش، هر دو سطح برگ بدون کرک و گاهی با غده های سفید. گل آذین خوشه مرکب، انتهایی، دمگل در حالت میوه طویل، کاسه گل استکانی، به طول 6 تا 8 میلی متر، جام گل استوانه ایی به طول 60 تا 13 میلی متر، آبی، زایده بین لبه ها کوچک و فرورفته (غیر باد کرده) پرچم ها تا لبه جام، بساک نواری، تیرکمانی، خامه نسبتا کوتاه فندقه دایره ای، به قطر حدود 15 میلی متر، با حاشیه غشایی و بال مانند.
4-R.Albida
گیاهی علفی، چند ساله پوشیده از کرک های سفید، کپه ای، ساقه ها افراشته و در انتها منشعب، به ارتفاع 10 تا 40 سانتی متر، برگ های قاعده ای نیزه ای یا نواری، قاشقی باریک یا نواری به طول 7 تا 10 و عرض 3/0 تا 5/0 سانتی متر، با دمبرگ کوتاه، برگ های ساقه ای کوچک و بدون دمبرگ، هر دو سطح برگ پوشیده از کرک های سفید انبوه، گل آذین خوشه مرکب.
دمگل در زمان میوه دهی طویل، کاسه گل استکانی، به طول 4 تا 5 میلی متر، پوشیده از کرک های متراکم، جام گل قرمز ارغوانی، استکانی – استوانه ای، 2 تا 3 برابر کاسه گل، زایده در قسمت قاعده ای جام گل، کوچک لب های جام گل کوچکتر از لوله جام. پرچم ها بلندتر از جام گل، بساک بیضوی، خامه طویل، به طول 12 تا 14 میلی متر، فندقه دایره ای، به قطر حدود 15 میلی متر، حاشیه غشایی، بال دو لبه، لبه ها ساده یا چین خورده و دندانه دار.
5-R.Bungei
گیاهی علفی، چند ساله، کپه ای، کوچک، پوشیده از کرک های زرد رنگ، ساقه افراشته به ارتفاع 5 تا 15 سانتی متر. برگ های قاعده ای نواری، با دمبرگ کوتاه، به طول 4 تا 10 و عرض 4/0 تا 6/0 سانتی متر. برگ های ساقه ای کوچکتر، بدون دمبرگ. گل آذین خوشه مرکب، دمگل در حالت میوه طویل، کاسه گل استکانی به طول 5 تا 7 میلی متر، پوشیده از کرک های انبوه، جام گل استوانه ای، کمی بلندتر از کاسه، لب های جام گل طویل، زایده در قسمت قاعده ای لوله جام گل و نسبتا کوچک. پرچم ها بلندتر از جام گل، بساک بیضوی، میله پرچم ها طویل، فندقه دایره ای، به قطر 5 تا 7 میلی متر. با حاشیه غشایی و با دولبه، لبه داخلی با بال میوه کاملا به داخل خم شده و لبه خارجی دندانه دار تاموج دار.
زمان گل دهی و میوه دهی: تابستان، گیاه خاص منطقه ایران وتورانی
6- R.Media
گیاهی علفی, چند ساله, کپه ای کوچک, پوشیده از کرک. ساقه افراشته به ارتفاع 5تا20سانتی متر.
برگهای قاعده ای نیزه ای –نواری ,به طول 3تا 10وعرض3/0تا 5/0سانتی متر, هر دو سطح برگ پوشیده از کرکهای انبوه. برگهای ساقه ای کم ,نواری نیزه ای.گل اذین خوشه مرکب ,انتهایی. دمگل طویل تر از کاسه. کاسه گل استکانی,پوشیده از کرک.جام گل خط کمی طویل تر از کاسه,لب های جام طویل, با زایده بین لب ها کوچک. پرچم ها طویل تر از جام گل ,بساک بیضوی.خامه طویل تر از جام گل.
فندقه دایره ای به قطر 5تا7میلی متر, حاشیه غشایی و با دو لبه ,لبه داخلی بال کمی به داخل خم شده.(خاتم ساز،2002)
Rindera pallus
علفی های چند ساله، ساقه ها معمولاً ساده، کرکی نرم(به ندرت بدون کرک)، برگ ها بیضوی تا خطی، دمگل بلند. گل آذین به فرم دیهیم،. پرانکل ها در میوه به هم می چسبند. کاسه گل 5 قسمتی، لوب ها کشیده بیضوی یا نوک تیز هستند. جام گل استوانه ای،
2- 12 1برابر کاسه گل بوده و شاخه های زیرین کوتاهتر یا بلندتر از لوله گل هستند. ضمائم حلقوی بیضوی - قلبی شکل یا مثلثی شکل، متمایز، تحلیل رفته، میله های پرچم برآمده، بساک ها کشیده هستند. خامه از کاسه گل بیرون، معمولا برآمده از جام گل هستند، فندقه چسبیده به خامه، مسطح، همراه با یک بال غشایی خارجی پهن و همچنین به ندرت یک بال داخلی باریکتر و خمیده هستند.
1.Caespitosa
لوله کاسه گل بلند تر یا مساوی با اندام زیرین ضمائم حلقوی به شکل تا خورده،0.1-0.3 mm هستند.
لوله کاسه گل کوتاهتر از اندام زیرین، ضمائم حلقوی مشخص 0.9 mm یا بیشتر
2.Lanata
2 -لوله کاسه گل 18 - 14 برابر طول اندام زیرین، بساک ها فندقه با یک بال پهن
3.Albida
3 -لوله کاسه گل 23 - 12 برابر طول اندام زیرین، بساک ها برآمده فندقه همراه با دو بال، بال درونی باریک و خمیده.
R.caespitosa
چند ساله های با کرک های نقره ای، خاکستری، ساقه های ساده، 5-10-30 cm، برگدار متراکم، برگ ها خطی – نوک تیز هستند. گل آذین انتهایی به فرم دیهیم، لوب های کاسه گل 5.5-6.5 mm، نوک تیز – بیضوی، به صورت گرد، تک رشته ای هستند. کاسه گل قرمز مایل به بنفش، 8-11.5 mm، لوله گل مساوی یا اندکی بلندتر از اندام های زیرین می باشد. ضمائم حلقوی بسیار کوچک، به صورت تاخورده.
R.Lanata
چند ساله های علفی قائم با ریشه های اصلی باریک محکم هستند. ساقه ها ساده و به ندرت در قسمت پایین منشعب، 15-55cm، کرک دار ، (پراکنده، کم پشت) یا بدون کرک هستند. برگ ها دارای دمگل بلند، بیضوی، دوک مانند یا خطی، با پهنک 20-150 2-25 mm، نوک تیز تا با زاویه منفرجه، برگچه نازک، کرکدار، بدون کرک های برآمده، یا بدون مو همراه با تعداد زیادی برجستگی آهکی، ساقه پایین شیاردار یا خطی، در انتها نازک، ساقه های بالاتر عموماً بیضوی، نوک تیز، توسعه یافته است.
تعداد زیادی سنبله، تشکیل یک گل آذین انتهایی بسیار بزرگ را می دهند. پرانکل ها تا حد زیادی در میوه توسعه می یابند. کاسه گل 3.5 -8 mm، لوب ها بیضوی، بسیار متراکم، سفید پشمی است. جام گل صورتی، 7-12 mm، زنگوله ای – استوانه ای، لوله گل 14 - 18 برابر اندام زیرین است. ضمائم حلقوی،رأس آن نا منظم است. پرچم ها در بردارنده میله هایی که با هم برابر (مساوی و اندازه)،
23 - 12 1 برابر طول بساک است. خامه 7-16 mm و معمولاً برآمده است. فندقه (اغلب 2 تا عقیم اند) مدور، 15 - 23 mm 14-26 ×، صاف، برگ ها با حاشیه ی صاف یا موج دار و اغلب آبی و بدون خار هستند.
برگ های پایه کشیده، بیضوی یا تخم مرغی 5-25 mm 25- 140× است (var. lantana)
برگ های پایه خطی یا خطی – نوک تیز، 20 -130 -2 – 12 mm است. (var.canescens)
R.albida
ساقه ها ساده، 25-4 cm، پر برگ، خاکستری – پشمی نسبتاً ضخیم هستند. برگ های پایه نوک تیز یا خطی نوک تیز، پهنک 4-11 mm 40-130× و برگ 20-40mm، ساقه خطی، نوک تیز، 1-8 mm 10-70 × است. کاسه گل 5-9 mm، لوب ها نوک تیز – بیضوی، با زاویه تند، کرک دار سفید نسبتاً ضخیم هستند. جام گل مایل به قرمز – بنفش، آبی محو، خشک شونده سیاه – بنفش، 7-12 mm، اندام زیرین به 12 تقسیم شده است. ضمائم حلقوی کشیده – نوک تیز، با زاویه تند، قلبی شکل هستند. پرچم ها و خامه معمولاً اندکی برآمده هستند. فندقه ها10.5-15 mm 9 -15×، با دوبال، بال بیرونی با عرض 4mm، با حاشیه موج دار، بال داخلی با عرض 1.8 mm خمیده به سمت داخل با حاشیه دندانه دار، و کاملاً بدون خار هستند. (Davis P.H ,1978)
جنس Rindera pall
کاسه گل تقریباً در قسمت پایه به لوب باریک عوض نشده، خمیده در میوه و قائم در گل تقسیم شدند. جام گل لوله ای شکل، با طول 8-14mm، اندکی یا دو برابر طول کاسه گل، متمایل به زرد، اغلب همراه با رنگ آنتوسیانین – بنفش روی دندانه یا لوله، به ندرت صاف، اغلب با چین های چروکیده متقاطع یا فلس، به ندرت فلس ها در قسمت میانی یا یک سوم پایینی لوله هستند، با لوب های قائم یا اندکی رو به زوال (و سپس اندام های زیرین اندکی قیف مانند اند)، اغلب نوک تیز، کشیده، تقریبا به بلندی لوله گل، به ندرت کوتاه و گرد شده – گوشه باز هستند.
میله ها (پرچم) کوتاه، به ندرت متصل (به زیر) گلوگاه هستند. بساک ها خطی – کشیده، با طول 2-4 mm، در پایین به صورت سهمی یا مطابق معمول، راس اغلب گوشه باز (منفرجه) یا دندانه دار، به ندرت نوک تیز و هممیشه برآمده از لوب های جام گل نیست.
خامه به صورت رشته ای، معمولاً از کاسه گل برآمده و به ندرت در آن مانده است، کلاله در یک نقطه یا اندکی رأسی و همیشه یکپارچه است. فندقه ها نسبتاً بزرگ، بالدار، بال از این سو به آن سو 10-20 mm، با پشتی صاف (Flat back) به صورت دیسک هستند.
برآمدگی اندک تیغه میانی به صورت یک خط به نظر می رسد که در کناره های چین دار پایین متورم می باشد.، فندقه ها صاف، درخشان، یا صیقلی و یا پوشیده در امتداد یک دیسک، به ندرت در کناره ها با چرخش به دور خود و با سر لنگر مانند یا یک ردیف با چرخش های لنگر مانند بزرگ و مسطح در طول تیغه هستند. بال های فندقه ها عریض، کما بیش مسطح، حاشیه خارجی اغلب به رنگ آبی است. حاشیه به ندرت صاف و اغلب به خوبی دندانه دار هستند. چند ساله ها، به ندرت ارتفاع 60-100 cm دارند، بدون کرک یا علف های بدون کرک با ریشه های کوتاه یا کم وبیش تیره نازک که در مناطق باستانی مدیترانه ای (تا یونان در غرب) رشد می کنند.
R.lanata
چند ساله ای ،ریشه عمودی اصلی به سمت پایین باریک و تیره می شود، ارتفاع ساقه ها 20-50 cm، به تعداد 1-2، افراشته، تراش دار، کرک دار، با شاخه زایی خوشه ای (به صورت پانیکول)، مولد گل و گاهی اوقات شاخه های دراز شده، برگ ها کما بیش پرزدار بوده و خاکستری، برگ های ریشه چه ای نوک تیز تا کشیده یا sublinear، با زاویه ای تنگ که به تدریج به صورت یک دمبرگ بلند باریک می شود که طول آن به 8-10 cm(و تا 30cm) می رسد و عرض آن1-2 (تا 6cm) است. برگ های ساقه ای اغلب پر پشت، بی پایه، که به تدریج به طرف بالا در اندازه کاهش می یابند،. گل آذین پانیکول (خوشه ایی دارای گل های افشان) در بالا دیهیم دو فرمی می شود، براکته ایی شده، پرانکل ها به آرامی (اغلب به طور قابل ملاحظه ای) از کاسه گل بلند تر می شود، خاکستری – پرزدار، کاسه گل کرک دار با طول 4-6 mm، با لوب های کشیده است، طول جام گل 10-11mm، صورتی، در حال تبدیل نشدن به آبی، لوب های آن قائم نوک تیز – خطی، و طول آن به اندازه لوله گل، فلس ها تقریباً برابر، پرچم ها در وسط لوله ی جام گل هستند، طول خامه 9-12 mm و برآمده هستند، فندقه ها (با بال) تخم مرغی شکل و از این سو تا آن سویش 17-22 mm، صفحه آنها صاف است، طول تخمدان 9mmبوده
R.cyclodonta
چند ساله ای، ریشه ضخیم، تیره، 1-3 ساقه، با ارتفاع در حدود 30 mm، در بالا به صورت پشمی، تراش دار، شاخه دهی در گل آذین، برگ های اندکی کرکی در حال تبدیل شدن به بدون کرک، خطی – نوک تیز، نوک تیز یا کشیده – نوک تیز، ریشه چه کما بیش و به تدریج در حال باریک شدن و تبدیل به دمبرگ، با طول 20cm، و گاهی با عرض 7cm و اغلب باریک تر و کوتاهتر 100 cm طول و 105 cm عرض.
جام گل بنفش، لوله ای، لوب های آن نوک تیز، افراشته (قائم)، تقریباً از نظر طول هم اندازه یا 23 طول لوله را دارد. کاسه گل کرکدار، لوب های آن خطی، تقریباً هم اندازه (از نظر طول) لوله کاسه گل،
گل آذین کوچک بلند، فقط بالایی ها کوتاهتر از کاسه گل هستند، مودار – پشمی، فلس ها به عنوان چین خوردگی های متقاطع تقریباً در گلوگاه توسعه یافتند. طول بساک ها 2-3 mm، کشیده، به صورت سهمی در پایین، گرد، دو تا سه برابر طویل تر از میله های عریض تر کوتاه هستند. میوه گرد، با بال های پهن، صفحه ی صاف، اغلب حاشیه ی بال با دندانه های مشخص می شوند.
Lipskil)) به درستی از که هیچ تفاوت اساسی بین این گونه و گونه ی پیشین نیست، تفاوت ها صرفاً قراردادی و فن آن ها را به دلیل عرف حفظ کردم. این صحیح تر خواهد بود که گونه ها ادغام شوند. در آسیای مرکزی آن ها یک چرخه ی پیچیده تر فرم ها را ایجاد می کنند که تفاوت های بین R.tetraspis مناسب و R.cyclodonta مناسب حذف می شوند، به هر حال تعداد زیادی فرم های محلی وجود دارند. یک نژاد منحصر به فرد در صحرای Mujunkum رشد می کند، یک نژاد دیگر با برگ های بسیار باریک از Kara Tau شمال، زندگی می کند، فرم های جنوبی از جنوب Dzhizak به R.baldshuanica نزدیک هستند. R.tetraspis یک نژاد از این گونه چند ریختی است. فرم های باستانی (اجدادی) به ویژه در E Tien shan فراوان هستند.(Popov M.G ,1953)
R.Karabaghensis با یک نژاد مشخص با بال های از Paropamisus(اشتباهاً توسط Brand به عنوان Bukhara"" توصیف شده است) و به علاوه در منطقه ی Eeast Dagh رشد می کند. (shamli, 1948 , Blinovskii).
2-2ترکیبات اسیدهای چرب
مثل لینولنیک اسید و انواع توکوفرول ها مثل a، δ،γ توکوفرول در این تیره ارزش تاکسونومیکی بالقوه دارند (Velasco & Goffman, 1999) مطالعات نشان داده است که آلفا لینولنیک اسید، لینولئیک اسید و اولئیک اسید به عنوان اسیدهای چرب معمول و گاما لینولنیک اسید و استئاریدونیک اسید از اسیدهای چرب غیرمعمول و تا حدی نیز توکومانول ها در دانه های روغنی این تیره ارزش تاکسونومیک دارند. به طور خاص وجود یا عدم وجود زنجیره طویل اوریک اسید و وجود یا عدم وجود استخلاف 6-متیلن در پلی انوئیک اسیدهایی مثل گاما لینولنیک اسید و استئاریدونیک اسید به عنوان شاخصی از طبقه بندی شناخته شده است Aitzetmuller & Altan2008, Bagci,Brueh,2008.) عمده اسیدهای چرب اشباع نشده در اعضای تیره گاوزبان آلفا لینولنیک اسید، لینولئیک اسید و اولئیک اسید می باشند. اما گاما لینولنی اسید و استئاریک اسید سطح قابل ملاحظه ای را در این گیاهان به خود اختصاص داده اند. درصد و نسبت اسیدهای چرب اشباع شده و اشباع نشده به عنوان شاخص های تاکسونومیک در این تیره محسوب می شوند (Ozcan, 2009)
گل و اعضای مختلف گیاه Borago officinalis دارای لعاب نسبتا فراوان مواد معدنی و مقدار کمی آلانتوئین می باشند. ریشه و ریزوم گیاه Cymphytum officinalis دارای موسیلاژ، اسید گالیک، آلانتوئین و آلکالوئیدی به نام کونسولیدین می باشد. ریشه گیاه Cymphytum officinalis حاوی کولین، مواد رزینی وآلکالوئیدهایی مثل سینوگلوسین و سینوگلوسئین است. قشر سطحی دانه Lithospermum officinale دارای کربنات کلسیم و سیلیکات کلسیم است. (زرگری، 1368).
2-3 فیزیولوژی
اعضای این تیره با فیزیولوژی C3 و C4 وجود دارند. فیزیولوژی C3 در،
Lappula,Lithospermum,Moltakiopsis,Onosmodium,Trichodesma,Arnebia,Heliotropoium و فیزیولوژی C4 در Heliotropium گزارش شده است(Watson & Dallwits,2011)
.
2-4میکرومورفولوژی


این تیره از حیث گرده شناسی بسیار متنوع است و گستره وسیعی از اشکال دریچه و آراستار را نشان می دهد. از 3 شیار، روزن (Tricolporate) یا 3 روزن (Triporate) گرفته تا چند شیاری (Polycolpate) و یا چند شیار – روزن (Polycolporate) و گاهی 6 شیار ناجور (Hetrocolpate) دیده می شود که به طور متناوب یکی دارای روزن و دیگری بدون روزن می باشد (Simpson ,2006).
تعداد دریچه های دانه گرده بین 3 تا 20 متغیر است دانه گرده آن ها 3 و یا به ندرت 2 هسته ای است. دانه گرده دو هسته ای در Cordia,Helitortopium,Coldenia دیده می شود و در اکثر جنس ها سه هسته ای است (Watson & Dallwits,2011)
2- 5 بررسی کروموزومی Boraginaceae s.str
تغییرات کروموزومی اولین محرک گونه زایی در تکامل گیاهان گلدار محسوب می شوند، به طوری که این تغییرات می تواند زیست شناختی موجود راتحت تاثیر قرار دهد و یا باعث جدایی جمعیتی با ایجاد جدایی های تولید مثلی شود.
Boraginaceae s.str دارای تنوع کروموزومی قابل توجهی است مطالعه مشخصات کروموزومی آن به درک بهتر مسیر تکاملی این تیره کمک می کند. ارزش خصوصیات کروموزومی در سیستماتیک این تیره بعد از مطالعات Britton(1951),strey(1931),smith(1932) مشخص شد که نشان داد این تیره دارای تنوع در سطوح پلوئیدی، عدد پایه کروموزومی و سایز و ریخت شناسی کروموزوم است (Selvi et al ,2006).
قبیله های Boraginaeae، Lithospermeae تنوع زیادی در عدد پایه کروموزومی نشان می دهند به طوری که x=6,7,8,9,10,15 از آنها گزارش شده است. قبیله Cynoglosseae کمترین تنوع در عدد پایه کروموزومی را نشان می دهد ودر اکثرسرده ها x=12 کمترین تنوع در عدد پایه کروموزومی را نشان می دهد و در اکثر سرده ها x=12 گزارش شده است. از قبیله Eritrichieae اعداد x=10,11,12 گزارش شده است عدد پایه نسبتا بالا و سایز کوچک کروموزوم ها در این قبیله قرابت آن را با قبیله Cynoglosseae نشان می دهد. (Coppi et al,2006)
مطالعات کروموزومی Onosma بزرگترین سرده تیره Boraginaceae s.str نشان دهنده نقش مهم پلوئیدی در تاریخچه تکاملی و غالبیت X=6,7 در این سرده است، همچنین نوعی کروموزوم غیر طبیعی به نام B-chromosome نیز در گونه های از سرده Onosma مشاهده شده است (Martonfi et al, 2008).
کمترین عدد کروموزومی گزارش شده از Boraginaceae s.str مربوط به گونه Amsinckia lunaris 2n=8 و بیشترین عدد گزارش شده مربوط به گونه 2n=144 symphytum tuberrosum است
(Coppi et al,2006)
جدول 1-1) گزارش عدد پایه کروموزومی تعدادی از گونه های Boraginaceae در ایران (Ghaffari, 1996)
Lavel of ploidy N Taxonon
Tetra ploid 14 Alkanna bracteosa
Diploid 8 Echium amoneom
Diploid 11 Arnebia decumbens
Diploid 14 Moltkia cearulea
Diploid 16 Anchea caspice
Diploid 14 Nonnea caspica
Tetra ploid 12 Lappula microcarpa
Diploid 24 Heterocayum macrocarpum
Tetra ploid 12 Caccinia strigose
Diploid 12 Paracaryum rugulosome
Diploid 12 Solenanthus stamineous
Diploid 12 Trichodesma incanum
Diploid 8 Onosma microcarpa
Diploid 22 Onosma albo-rosea
Tetra ploid 16 Onosuma sericea
2- 6 بررسی گرده شناسی Boraginaceae s.str
تیره مزبور از حیث گرده شناسی بسیار متنوع است به طوری که گستره وسیعی از اشکال، دریچه آراستار و غیره را نشان می دهد. دانه گرده دراین تیره منفرد و از نوع
Subprolate,prolate,isopolar,zonocolporate است تعداد دریچه ها از 13-4 عدد متفاوت است، در برخی از سرده های این تیره دریچه درونی با کمربند استوایی ادغام شده و endocingulum نامیده می شود hatgtove. L et al,2003))
قبیله Cynoglosseae دارای دانه گرده 6 ناجور شیار قبیله Erithrichieae دارای گرده های کوچک 10 و 8 و 6 ناجور شیار، بیضوی یا مستطیلی در نمای استوایی و شش ضلعی در نمای راس است قبیله Boragineae دارای 15 نوع گرده متفاوت در بین سرده ها و یا حتی گونه ها است قبیله Lithospremeae دارای متنوع ترین خصوصیات ریخت شناسی دانه گرده و دریچه است.
(S.Ovchinnikova,2009)
شکل 1-3) دانه گرده برخی گونه های Boraginaceae s.str
Rindera tetraspis Anchusa. arvensis
Nonea lutea
جدول 1-2) مقایسه دریچه دانه گرده بین قبیله های Boraginaceae s.str
Comparis on of the pollen apertures among the tribes the subfamily boraginioiseae
Types of pollen apertures Tribes
3-Colporate 3-syncolporate ,4-8-colporate.
4-6-syncolpate ,6-7-colpate Lithospermeae
3-colporate,4-colporate,5-colporate or more Boragineae
3-Colporate,3-pseudocolpate Trigonotideae
3-Colporate,3-pseudocolpate Eritichieae
3-Colporate,3-pseudocolpate Cynoglosseae
3-Colporate,3-pseudocolpate Myosotideae
2- 7 تقسیمات تاکسونومیکی زیر تیره Boraginoideae (Boraginaceae s.str)
گیاه شناسان متعدد این زیر تیره را به چهار الی هفت قبیله تقسیم کرده اند که با اقتباس از Mabberley 1990 پنج قبیله در زیر ارائه می شود:
Cynoglosseae (گل ها منظم، پایه خامه کم و بیش مخروطی، رئوس فندقه ها در بالاترین نقطه اتصال برآمده نیست)
Eritrichieae (گل ها منظم، پایه خام کم و بیش مخروطی، رئوس فندقه ها در بالاترین نقطه اتصال برآمده است).
Boragineae (گل ها منظم، پایه خامه مسطح و یاکمی محدب، فندقه ها با سطح اتصال مقعر).
Lithospermeae (گل ها منظم، پایه خامه مسطح، فندقه ها نیز با سطح اتصال مسطح).
Echieae (گل ها نامنظم)
2-8 مطالعات مولکولی DNA
مطالعات مولکولی انجام شده به صورت نمونه برداری های پراکنده با استفاده از مارکرهای مولکولی مختلف (matk,atpB,nrDNA ITS) انجام شده است. در مهم ترین مطالعه انجام شده بر روی تیره گاوزبان Langstrom & chase,2002 با استفاده از توالی DNAکلروپلاستی atp B روابط فیلوژنتیکی قبیله های موجود در زیر تیره Boraginoiseae را با تعداد معدودی جنس و گونه از هر قبیله بازسازی کردند. اخیرا فیلوژنی مولکولی قبیله Eritrichieae با استفاده از توالی DNA هسته ای ITS و توالی DNA کلروپلاستی trnL-F انجام شده است (2008 khoshsokhan et al.2010 khoshsokhan & kezempour osoloo) است اما طبق آخرین مطالعات مولکولی weigend و همکاران (2010) با نمونه برداری های کم نشان دادند که 3 قبیله
Trigonotideae,Myosotideae,Eritrichieae جزئی از قبیله Cynoglosseae sensu lato هستند.
اولین مطالعه مولکولی انجام شده پراکندگی سرده Echium L را در Macronesia توصیف می کنند 0 Bohle et al, 1996 ,Hilger, H. H. Bohle, 2000)، مطالعه مولکولی دیگر وسیعترین مطالعه از نظر تاکسون های نمونه گیری شده از قبیله Lithospermeae با تاکید بر سرده مدیترانه ی Lithodora Thomas et,2008 al بوده است. (Hacioglu & Erik2011) همچنین گزارشی از فیلوژنی سرده symphtum ارائه داده اند.
2- 9 تولید مثل و گرده افشانی
اعضای تیره گاوزبان اغلب گیاهانی تک پایه اند اما گاهی گیاهان دوپایه درگونه هایی از heliotropium دیده شده است. گرده افشانی این گیاهان از طریق حشرات و عمدتا توسط پروانه ها صورت می گیرد.
(waton & dallwits,2011)
روابط فیلوژنی درون قبیله Lithospermeae به عنوان بزرگترین زیرگروه Boraginaceae S.Str بسیار پیچیده است. در محدوده تاکسونومیکی (Johnston ,1954) و (seibert, 1978) قبیله Lithospermeae حاوی 450 گونه و حدود 22 تا 28 سرده می باشد که سرده اورسیایی Onosma L یک سوم گونه ها را تشکیل می دهد. گونه ها و سرده های این قبیله ازنظر محدوده فیلوژنتیکی بسیار مسئله دار است و تنها داده های محدودی درباره این قبیله منتشر شده است (Weigend et al, 2009).

پراکنش تیره Boraginaceae s.str
تیره Boraginaceae s.str در قلمروهای Antractic,Australian,Cape,Neotropic,Halorctic پراکنده شده است. در نواحی گرمسیری رشد می کنند، جهان شمول و در موارد نادری در نواحی سردسیری دیده شده اند (WWW.mobot.com).
برای این تیره در جنوب غرب آمریکا 113 تاکسون با مرکز پراکنش در ایالت های آریزونا و نیومکزیکو همچنین نواحی بیابانی جنوب شرقی کالیفورنیا تشخیص داده شده است. (Higgins, 1997)
شکل 1-4 نقشه پراکنش تیره (www.mobot.com)Boraginaceae
2-10مطالعات پیشین تیره Boraginaceae s.str
در گذشته مطالعاتی چند از حیث ریخت شناسی (,zarinkamar,2006,Hilger,1984,kazmpour osaloo,1993) گرده شناسی (khatamsaz, 2001,Kazempour Osaloo & Khatamsaz, 1994, 1984 Ahn & Lee ,1986 kazempour Osaloo, 1993,Clarke, 1977,Diez) سیتولوژی (Ghaffari 1996,selvi et al., 2006 ,luque,1900,Luque & Valdes,1984) مولکولی(Winkworth et al.,2002,Khoshsokhan et al.,2008) بر روی تعدادی از تاکسون های تیره انجام شده است. مطالعات مولکولی انجام شده به صورت نمونه برداری های پراکنده با استفاده از نشانگرهای مولکولی مختلف (trnL-F,mark,atpB,nrDNAITS) در خارج و داخل کشور انجام شده است. از مطالعات انجام شده روی قبیله Lithospermeae می توان کار
(Langstrom & Chase 2002,James et al.,2009,chosen et al., 2009,cecchi et al.,2009,weinged et al., 2009,2010,Liu et al., 2010 ,2008) را نام برد.
در مطالعات (2009,2010،.Weinged etal نمونه برداری های محدود از سرده های Lithospermum,Buglossoides,Echium,Cerinthe,Brunnera,podonosma,Arnebia,MoltkIA,echiochilon,Alkana,Symphytum انجام شده است و روابط تا حدودی حل شده اند. همچنین (.،Kolarcik et al 2010) در مطالعه خود تعدادی از گونه های اروپایی sec Asterotricha از سرده Onosma را مورد بررسی های جمعیتی و تکاملی قرار دادند.
ولی بسیاری از گونه های سرده های Onosma همچنین سرده های Suchtelenia,Hormozakia بررسی نشده اند.
2-11اختصاصات بیوشیمیایی و شیمیایی تیره
غالبا این گیاهان آلکالوئیدهای گروه پیرولیزیدین و یک نفتاکیننون قرمز به نام آلکانین تولید می کنند وفاقد ترکیبات ایریدوئیدند. فقط به ندرت ترکیبات سیانوژنیک و ساپونین دار ونه تانن دار به وجود می آورند. معمولا فاقد اسید الاژیک و پروآنتوسیانین ها هستند. غالبا فروکتوزان ها (عمدتا ایزوهپتوز و ایزوکتوز) را به عنوان کربوهیدرات های ذخیره ای و آلانتوئین (یک امید) را به عنوان ماده غذایی ارائه انباشته می کنند (Cronquist ,1981).
2-12کاربرد اقتصادی تیره
بسیاری از اعضای این تیره خواص دارویی دارند و به عنوان یک داروی سنتی برای درمان زخم ها، بیماری های پوستی، قلب و درد سینه و... استفاده می شوند.تعدادی از نمونه های دارویی این تیره در زیر ذکرمی شود:
Borago officinalis: گل واعضای مختلف گیاه دارای لعاب نسبتا فراوان مواد معدنی و مقدار کمی آلانتوئین می باشند. گل و برگ این گیاه اثر نرم کننده، معرق و مدر، آرام کننده و تصفیه کننده خون است.
Symphytum officinalis: ریشه و ریزوم گیاه دارای موسیلاژ، اسیدگالیک، آلانتوئین و آلکالوئیدی به نام کونسولیدین می باشد. از ریشه گیاه به عنوان نرم کننده تسکین دهنده آرام کننده درد و التیام دهنده استفاده می شود.
Cynoglossum officinale: ریشه گیاه دارای کولین، مواد رزینی و آلکالوئیدهایی مثل سینوگلوسین، سینوگلوسئین است. گل آن آرام کننده سرفه و دارای اثر مخدر به صورت خفیف است. ریشه آن اثر قابض ملایم وبرگ آن اثر ملین دارد. ریشه و برگ گیاه هم در رفع اسهال، سرفه های خشک و عصبی، اسپاسم های روده و خونریزی های داخلی مصرف می شود.
Lithospermum officinale: قشر سطحی دانه دارای کربنات کلسیم و سیلیکات کلسیم است. پوشش ریشه آن دارای ماده ای قرمز به نام لیتوسپرمین است که در رنگ کردن مواد غذایی استفاده می شود دانه این گیاه طعم ملایم لعابی و اثر مدر دارد.
Heliotropium europium: از ریشه و دانه آن آلکائیدی به نام سینوگلوسین به دست آمده است که اثر صفرابر و تب بر است.
از نمونه های دارویی دیگر نیز
cerinthe major,africanum,trichodesma,onosma,echium,vulgare
,anchusa italic,myxa cordial,alkanna tinctoria,pulmonaria officinalis رامی توان نام برد (زرگری، 1368).
در آخرین گزارش (Wiegend et. al.,2010) زیر تیره Boraginoideae را براساس توالی کلروپلاستی trnL-F به 4 قبیله Cynoglosseae,Echiochileae,Lthospermeae,Boragineae، S.L تقلیل داده است.
2-13مصارف اقتصادی و دارویی
بعضی از گیاهان این تیره به صورت گلدانی و برای مصارف زینتی استفاده می شوند. از ترکیبات رنگی این گیاهان در رنگ آمیزی چوب و سنگ استفاده می شود. در تهیه انواع داروها، شراب و لوازم آرایشی کاربرد دارند. و در عین حال از گیاهان مهم در تولید عسل به شمار می روند (2011 Dallwits &Watson., پوست ریشه Lithospermum officinale دارای ماده ی قرمز به نام لیتوسپرمین است که در رنگ کردن موادغذایی استفاده می شود (زرگری .،1368).
میوه بعضی از گونه های این تیره مصرف خوراکی دارد. در جنوب آفریقا از برگ، ساقه و میوه خشک شده
Ehretia rigida subsp.nevifolia چای تهیه می کنند ریشه خشک شده angufolia trichodesma مخلوط با آب سرد در درمان اسهال مورد استفاده قرار می گیرد. برگ گیاه Lobos--on سرخ شده در روغن بادام شیرین از داروهای قدیمی در درمان عفونت های قارچی انواع زخم ها و سوختگی ها است.
در سراسر اروپا، شمال آفریقا و آمریکا از شاخه، برگ و گل گیاه borago afficinalis در سالاد و نیز به عنوان ادویه استفاده می شود. این گیاه در طب سنتی هم کاربرد دارد. در اروپا از گل و ریشه cynolossum officinale در طب سنتی و برای درمان جراحات استفاده می شود. lithospermum officinale در طب سنتی اروپا در درمان نقرس مورد استفاده است (Retief, 2004).
گل و برگ گیاه Borago officinalis اثر نرم کننده، معرق، مدر، آرام کننده دارد و همچنین تصفیه کننده خون است. ریشه گیاه symphytum officinalis اثر نرم کننده، تسکین دهنده و آرام کننده درد و التیام دهنده دارد. گل cynoglossum officinale آرام کننده سرفه و دارای اثر مخدر خفیفی است. ریشه آن قابض و برگ آن اثر ملین دارد. ریشه و برگ گیاه هم در رفع اسهال، سرفه های خشک و عصبی، اسپاسم های روده و خونریزی های داخلی مصرف می شود. دانه گیاه Lithospermum officinale اثر مدر دارد. از ریشه ودانهheliotropium europium آلکالوئیدی به نام سینوگلوسین به دست امده که صفرابر و تب بر است (زرگری،1368).
2-14 برخی از توالی های ژنی مورد استفاده در سیستماتیک مولکولی
2-14-1 توالی های DNA هستهای
از متداولترین توالیهای هستهای مورد استفاده در سیستماتیک internal transcribed spacer nr DNAITS یا فاصلهگر رونویسی شونده درونی میباشد. ITS مربوط به توالی ریبوزومی هستهای است که ناحیه بین اگزون S 18 و S 26 واقع شده است و شامل ناحیه ITS1 و S 5.8 و ITS2 میباشد (شکل 2-1) فاصلهگرهای بین ژنی دارای سیگنالهای مورد نیاز برای پردازش و رونویسی rRNA است وغالبا برای فیلوژنی استنباطی شده واکثرا برای حل روابط در سطح زیر تیره یا پایینتر استفاده میشود برای سطوح بالاتر ITS آن قدر تنوع دارد که هم ردیف سازی توالی بسیار مشکل است (Alvarez and Wendel, 2003).
از فواید ITS برای بازسازی فیلوژنی میتوان موارد زیر را نام برد:
توارث دو والدی ITS: این ویژگی ITS را برای آشکار کردن شبکه سازیها، گونهزایی هیبدریدی و نشان دادن پلی پلوئیدی ارزشمند میسازد.
عمومی (جامع) بودن ITS: این ویژگی باعث میشود که توالی ITS در بعد وسیعی از موجودات (قارچ ها و اکثر گیاهان) کاربرد داشته باشد.
سادگی (simplicity): ژنهای ریبوزوم هستهای از تکرارهای 265 –S 5.8 –S 18 تشکیل شدهاند که این تکرارها Kbp10 در اندازه متفاوت اند. چون صدها تا هزاران تکرار از آنهاد وجود دارد، پس نسبت به لوکوسهای هستهای یا کپی کمتر، راحتتر خالص می شوند. در آنژیوسپرمها توالی ITS از 700-500 جفت باز و در ژیمنوسپرم ها تا 3700-1500 جفت باز متغیر است.
یکنواختی در ITS: معمولا در تیره های چند ژنی تکامل همزمان وجود دارد تکامل همزمان زمانی رخ می دهد که اختلافات توالی ها (حاصل از تجمع موتاسیون ها) در میان کپی های تکرار شونده در یک ژنوم توسط مکانیسم های مثل کراسینگ اورنا برابر و واژگونی ژنی، یکنواخت و هم شکل شده و توالی یکسانی ایجاد می شود.
تنوع بین ژنومی ITS: تنوع توالی ITS جهت استنباط فیلوزنتیکی در سطوح گونه جنس و تیره مناسب است. همچنین تنوع در سطوح سلسله مراتبی به عواملی مثل پلی مورفیسمهای نوکلئوتیدی نسبت داده میشود.Alvarez and Wendel, 2003
2- 15 PCR اساس مارکرها
PCR، به طور آنزیماتیک تکثیر یک منطقه تعریف شده از DNA الگو است. تکثیر قطعهی DNA وابسته به آغازگر بوده که آغازگرها توالی DNA مکمل موجود در DNA دو رشتهی را تشخیص می دهند و با آن پیوند برقرار میکند.
برای به دست آوردن محصولات PCR باید:
الف- دو آغازگر که هر دو دارای ردیفهای واحدی هستند به رشتههای مخالف بچسبند.
ب- دو آغازگر باید در جهت عکس هم آرایش یابند(انتهای ́3 آنها مجاور ناحیهای باشد که قرار است تکثیر شود)
پ- دو آغازگر باید با فاصلهای کوتاه نسبت به یکدیگر (به طور معمول کمتر از 4 جفت کیلوباز) به DNA الگو متصل شوند. دلیل این امر این است که پلی مراز Taq فقط در این فاصله میتواند فعال باشد و رشتهی دوم را سنتز کند. در حقیقت ساخته شدن رشتهی مکمل DNA به این دلیل است که پلیمراز Taq سبب طویل شدن آغازگر از انتهای́3 با اضافه کردنdNTPها میگردد. بعد از چند چرخه PCR، قطعههای سنتز شده جدید نسبت به قطعهی اولیه ژنومی غالب میشوند و از نظر تئوری به صورت توالی تکثیر خواهند شد.
2-15-1 اجزای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR)
این روش در اواســـــط دهــــه 1980 به وسیـــــله کری مولیس معرفی شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مبتنی بر همانند‌سازی نیمه حفاظت شده DNA می‌باشد. در این واکنش قطعه‌ای از DNA بین دو ناحیه با توالی شناخته شده تکثیر می‌شود. تکثیر به وسیله دو توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر که به دو رشته DNA و در ناحیه مکمل خود متصل می‌شوند صورت می‌گیرد (Chawla, 2002). اجزای تشکیل دهنده این واکنش به شرح زیر است.
2-15-2آغازگر
آغازگرهای PCR، الیگووکلئوتیدهایی هستند که بر روی رشته الگو به توالی‌های مکمل خود متصل می‌شوند و حدود محصولات تکثیر را مشخص می‌کنند. هنگام طراحی آغازگرها عوامل متعددی مانند پرهیز از مکمل بودن توالیهای درون یک آغازگر و یا بین آغازگرها، محتوی GC آغازگر، طول آغازگرها و دمای ذوب (Tm) آغازگر مورد توجه قرار می‌گیرد. دمای ذوب، درجه حرارتی است که در آن نیمی از آغازگرها به جایگاه هدف اتصال پیدا کرده باشند. دمای ذوب آغازگر در انتخاب دمای اتصال اهمیت دارد و معمولاً دمای اتصال چند درجه کمتر از دمای ذوب انتخاب می‌شود (Dawson, 1998).
2-15-3 آنزیم
مهم‌ترین ویژگی آنزیم مورد استفاده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، مقاومت به حرارت می‌باشد. آنزیمی که به طور معمول در PCR استفاده می‌شود، آنزیم تـــــک DNA پلیمراز می‌باشد که از باکتری گرمادوست Thermus aquaticus استخراج می‌شود. این آنزیم فاقد فعالیت اگزونوکلئازی َ3 به َ5 بوده و قادر به تصحیح بازهای اشتباه نمی‌باشد. آنــزیم اضافه در واکنش سبب تکثیر توالی‌های غیرهدف می گردد Mcpherson M. and S. G. Moller2000))
2-15-4الگو
نمونه مورد استفاده جهت تکثیر در PCR ممکن است DNA تک رشته و یا دو رشتهای حیوانات، گیاهان و حتی باکتریها باشد. مولکول های RNA شامل RNA کل، و یا tRNA نیز می توانند بعد از اینکه توسط آنزیم ترانس‌کریپتاز معکوس بهDNA مکمل(cDNA) تبدیل شدند، به عنوان الگو برای تکثیر مورد استفاده قرار گیرند Dawson , M.T.,A.Powell and F ,1998).)
2-15-5 دزاکسی ریبونوکلئوزید تری‌فسفات‌ها
در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مرسوم، هرچهار نوع دزاکسی ریبونوکلئوزید تری‌فسفات با غلظت‌های مساوی به کار برده می‌شوند. غلظت مناسب dNTPs به عوامل متعددی مانند طول رشته مورد نظر، غلظت آغازگر، غلظت MgCl2 و تعداد سیکل‌های تکثیر بستگی دارد. جهت بهینه‌سازی یک واکنش ضروری است که بهترین غلظت به صورت عملی تعیین شود.
2-15-6کلرید منیزیم
کلرید منیزیم (MgCl2) یک عنصر اساسی برای تکثیر DNA در واکنش PCR می باشد زیرا یون Mg2+ با dNTPs کمپلکسی تشکیل می دهد که برای وارد کردن dNTP در رشته ضروری است. به علاوه، این یون از طریق تحریک فعالیت پلیمرازی، واکنش متقابل آغازگر – الگو را افزایش می‌دهد. غلظت MgCl2 باید برای هر جفت الگو– آغازگر بهینه شود. معمولاً غلظت پایین یون Mg2+ باعث کاهش محصولات PCRو غلظت زیاد آن منجر به تجمع محصولات غیراختصاصی می‌شود.
2-15-7 بافر
بافر موردنیاز برای فعالیت آنزیم تک‌ پلیمراز در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل 50 mM KCl، Tris-HCL 10 mM و Gelatin 1% pH 8.3 می‌باشد. قابل ذکر است که در صورت استفاده از سایر آنزیم‌های پلیمراز مقاوم به حرارت، ترکیبات بافر متفاوت خواهد بود (McPherson, 2000).
2-15-8 مراحل تکثیردر هر چرخه واکنش ابتدا توسط حرارت پیوندهای هیدروژنی دو رشته DNA شکسته شده و رشته‌ها از هم باز می‌شوند. جداشدن رشته‌ها معمولاً در دمای oC94 صورت می‌گیرد و واسرشته‌سازی نام دارد. سپس مخلوط واکنش سرد می‌شود تا آغازگرها به نواحی مکمل خود متصل شوند. این مرحله که به طور معمول در دمای oC65-35 انجام می‌گیرد، مرحله اتصال نامیده می‌شود. در مرحله سوم که دما حدود oC72 بوده و بسط نام دارد آنزیم پلیمراز از روی DNA الگو همانند سازی کرده و بسط یک ناحیه از DNA صورت می‌گیرد. نکته مهم در این چرخه، دمای واکنش در مرحله اتصال آغازگر است. دما برای اتصال تدریجی باید به حد کافی پائین باشد تا امکان دورگه‌گیری بین آغازگر و الگو وجود داشته باشد و از طرفی به حد کافی بالا باشد تا از تشکیل دورگه‌های اشتباه جلوگیری کند (Chawla, 2000).
2-16 درخت فیلوژنتیکبررسی فیلوژنتیکی یک خانواده بر اساس ترادف اسید نوکلئیک یا پروتئین تعیین میکند که چه طور یک خانواده در مسیر تکاملی خویش از اجداد اولیه خود مشتق شدهاند. ارتباطات تکاملی در میان ترادفها توسط مکان یا رتبه ترادفها که به عنوان شاخههای بیرونی یک درخت میباشند نمایش داده میشود. ارتباطات بین شاخهای در بخش داخلی درخت منعکس کننده درجهای است که ترادفهای متفاوت را که با هم ارتباط دارند را نمایش میدهد. دو ترادف که همانندی خیلی زیادی با هم دارند به صورت شاخههای بیرونی مجاور واقع خواهند شد و به یک شاخه مشترک (معمولی) که در زیر آنها واقع شده متصل میشوند. هدف از بررسی فیلوژنتیکی پیدا کردن ارتباطات بین شاخههای درخت و طول شاخهها می باشد. بررسی فیلوژنتیکی ترادفهای پروتئین و اسید نوکلئیک در حال حاضر وجود دارد و به صورت ناحیه مهمی از آنالیز ترادفی ادامه خواهد یافت. وقتی یک ژن خانوادگی در یک موجود زنده کشف شود، ارتباطات فیلوژنتیکی در میان ژنها میتواند به پیشگویی این که یکی از آنها ممکن است یک عملکرد مشابه داشته باشد کمک کند. که این پیشگوییهای کاربردی میتواند به وسیله آزمایشات ژنتیکی بررسی شوند. بررسی فیلوژنتیکی در دنبال کردن تغییراتی که به وقوع میپیوندند در گونههایی که به سرعت تغییر میکنند، مانند یک ویروس میتوانند استفاده شوند.
برنامههای بررسی فیلوژنتیکی زیادی در دسترس میباشند که هزینه کمی دارند و یا هزینهای ندارند. از مهم ترین این برنامهها که مورد استفاده قرار میگیرد برنامههای PHYLIP و PAUP میباشند. نسخههای جدید از این برنامهها 3 روش اصلی را برای بررسی فیلوژنتیکی شامل Parsimony, Distance, Maximum likelihood را فراهم کرد و همچنین تعداد زیادی از مدلهای تکاملی را برای درجه تنوع ترادف را شامل میشود. برنامه دیگر MacClade میباشدکه برای آنالیزهای با جزئیات بیشتر مفید است.
534670-576580فصل سوم
مواد و روش ها
00فصل سوم
مواد و روش ها

3-1مطالعه منابع
ابتدا به مطالعه منابع موجود در اینترنت و کتب مرجع جهت مطالعه مقالات بررسی تحقیقاتی که اخیراً صورت گرفته و تعیین چارچوب کاری پرداخته شد از فلور ایران Khatamsaz,2002)) و به عنوان شناسایی نمونه های هر بار یومی و بررسی صفات کیفی و کمی ریخت شناسی استفاده گردید.
نمونه برداری از آنجایی که محدوده پراکنش گونه ها وسیع بود و همچنین به علت عدم وجود امکانات و زمان کافی برای جمع آوری به موقع گیاهان بخش عمده بر روی نمونه های هر بار یومی انجام گرفت.
.
3-2مطالعه هر بار یومی
استفاده ازDNA در سیستماتیک مولکولی داده های مولکولی مخصوصاً توالی DNA برای بازسازی روابط فیلوژنی نسبت به سایر روشهای دیگر از صحت بیشتری برخوردار است به همین دلیل امروزه به خصوص از زمان پیدایش واکنش زنجیره ای پلیمراز این روش با استقبال محققین مواجهه شده است (Chase et al. ,1993).
3-3استفاده از DNA در سیستماتیک مولکولی
در گیاهان 3 نوع اصلی از توالی های DNAدر دسترس است که عبارتند از:توالی های هسته ای (nr DNA)، توالی های کلروپلاستی (cp DNA) و توالی میتوکندر یایی. توالی میتوکندر یایی به علت سرعت تکاملی پایین کمتر در بررسی روابط خویشاوندی گیاهان مورد استفاده قرار می گیرند.
اما توالی های کلروپلاستی و هسته ای در ابعاد وسیعی بدین منظور به کار می روند (معین، 1389).
(Internal Transcribed spacer) ITS یا ناحیه فاصله گذار رونویسی شونده درونی بخش از ریبوزومی هسته می باشد (شکل1-5) درون این ناحیه، نواحی کد گذار بسیار حفاظت شده
, 26snrDNA) (18nrDNA,5,8 snrDNAبه همراه نواحی غیر کد گذار (ETS و ITS)قرار دارند. نواحی ITS1 و 2 ITS در بالغ شدن و پردازش ریبوزوم نقش مهمی را ایفا می کنند اما ناحیهITS پس از پردازش ریبوزوم ترجمه نمی شود و به همین علت کمتر تحت فشار عملکردی است. و سرعت بالای تکاملی، این ناحیه را برای بررسی روابط فیلوژنتیکی مناسب کرده است (Baldwin et al. ,1995,Alvarez &vendel ,2003)
شکل 1-5 ساختار ناحیه - شکل 2 nrDNA ITS برگرفته از Baldwin et al.,1995 با اندکی تغییر

دهه اخیر از داده های توالی ITS به عنوان ابزاری برای تعیین روابط فیلوژنتیکی در سطح پائین تاکسونومی و مخصوصاً جنس های نزدیک استفاده شده است (2008،. Soltis et al)
دلایل استفاده از این ناحیه در بازسازی روابط فیلوژنی را می توان به صورت زیر بیان کرد:
1-دارای کپی های فراوان که به صورت تکرار های در یک یا چند لوکوس کروموزومی ژنوم هسته ای قرار گرفتند که سبب سهولت در تکثیر کلونینگ و توالی یابی آن می شود.
2-یکی از مهمترین ویژگی های این ناحیه برای بازسازی روابط فیلوژنی وجود تکامل هماهنگ در این منطقه از طریق کراسیگ اوور نابرابر و برابر می باشد.
3- اندازه کوچک این ناحیه (کمتر از 700 جفت باز در نهاندانگان) و حضور توالی های بسیار حفاظت شده در مجاورت آن، سبب سهولت در تکثیر این ناحیه حتی از نمونه های هر بار یومی می شود.
White و همکاران (1990) پرایمرهای همگانی برای تکثیر این قطعه در موجودات یوکاریوت طراحی کردند.
4- برتری این ناحیه نسبت به ژنوم کلروپلاستی در به ارث رسیدن از دو والد است که این ویژگی سبب می شود تا درصد هیبرید ها و پلی پلوئیدی ها را نیز تشخیص داد (Baldwin et al. ,1995).
عمومیت این ژن در تمامی نهاندانگان، مزیت آن برای استفاده از گیاهان انگل است که بخشی یا تمامی کلروپلاست خود را از دست داده اند (معین، 1389).
3-4بررسی روابط فیلوژنی بر اساس صفات مولکولی
به منظور بررسی و بازرسانی تاریخچه تکاملی قبیله Cynoglosseae از توالیهای هسته ای
nrDNAITS (Nuclear Ribosomal DNA Internal Tran cribed spacer)
استفاده شد تاکسونهای مورد بررسی در این مطالعه در جدول آورده شده است
1-3 تاکسون های مورد استفاده برای تکثیر قطعه - جدول nrDNA ITS
نام تاکسون محل جمع اوری محل نگهداری وشماره هرباریومی
Rindera regia موسسه جنگل هاو مراتع
Rindera lanata موسسه جنگل هاو مراتع
Rindera cyclodonta موسسه جنگل هاو مراتع
Rindera albida موسسه جنگل هاو مراتع
Rindera bungei موسسه جنگل هاو مراتع
Rindera media 3-4-1استخراج DNAاز برگ
استخراج DNA کل از سلولهای برگ نمونه های هربایومی صورت گرفت استخراج به روشCTAB
(Doyle,1987& Doyle) انجام گرفت گیاهان این تیره حاوی مقادیر قابل توجهی از متابولیت های ثانویه هستند. به منظوربالا رفتن کیفیت کار بافر استخراج هر روز درست و استفاده می شد.
مراحل استخراج DNA به شرح زیر است:
1-یک تکه برگ خشک را در هاون اتو کلاو شده می سابیم تا کاملاً پودر شود. (باید توجه داشت که از برگهای زرد، قهوه ای و بیمار استفاده نشود)
2-به پودر حاصل به نسبت برگ به کار رفته محلول CTAB اضافه می کنیم تا جاییکه محلول یکدست و به رنگ سبز روشن در آید.
3-700میکرولیتر از محلول فوق را درون میکروتیوبهای 2 میلی لیتری اتو کلاو شده می ریزیم.
4- زیر هود به هر میکروتیوب 20 میکرولیتر مر کاپتواتانول می افزائیم.
5- میکروتیوبها را به مدت 1 الی 2 ساعت در بن ماری 65 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و هر 5 دقیقه یکبار به دلیل ته نشین شدن مر کاپتواتانول میکروتیوبها را تکان می دهیم.
6- 800 میکرو لیتر کلروفرم – ایزو آمیل الکل با نسبت 1: 24 به میکروتیوبها اضافه کردیم و سپس آنها را به مدت 20 دقیقه با دست تکان دادیم.
7- میکروتیوبها را به مدت 15 دقیقه با سرعت 11000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
8- در این مرحله 3 فاز تشکیل می شود فاز بالایی حاوی DNA است برای اینکه با فاز پائینی مخلوط نشودDNAرا برداشته و به میکروتیوب استریل دیگری منتقل می کنیم.
9-و باز دوباره کلروفرم و ایزوآمیل الکل به حجم 800 میکرو لیتر به آن اضافه می کنیم و باز دوباره میکروتیوبها را به مدت 10 الی 20 دقیقه با دست تکان می دهیم باز سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه با سرعت 11000 دور.
10- میکروتیوبها از سانتریفیوژ خارج کرده و 200 میکرو لیتر از فاز بالایی می کشیم و به میکروتیوبهای جدید انتقال می دهیم.
11- 700 میکرو لیتر ایزوپروپانول اضافه می کنیم و در دمای منفی 20 درجه به مدت2 الی 24 ساعت می گذاریم.
12- میکروتیوبها را از یخچال در آورده و با سرعت 8000 دور در 15 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم.
13 –بلافاصله محلول رویی را دور ریخته و اتانول 70% سرد را به مقدار 200 میکرولیتر به رسوب DNA اضافه می کنیم.
14- میکروتیوبها را به مدت 5 دقیقه با سرعت 8000سانتریفیوژ می کنیم.
15- میکروتیوب ها را از دستگاه سانتریفیوژ خارج می کنیم و بلافاصله محلول رویی را دور ریخته و میکروتیوب های حاوی رسوب DNA را در دمای آزمایشگاه قرار می دهیم تا کاملاً خشک شود و اتانول تبخیر گردد.
16- به هر میکروتیوب با توجه به مقدار رسوب DNA حدود 20تا 40 میکرولیتر آب دیونیزه اضافه می کنیم.
17- میکروتیوبها را در دمای 20 درجه نگه داری می کنیم تا در صورت نیاز از DNA استفاده کنیم.
3-4-2تکثیر قطعات مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمر از (PCR =Polymerase chaine Reaction).
به منظور تکثیر توالیهای nrDNA ITS از آغازگر های ITS1F و ITS4 (White et al.1990) استفاده گردید.
توالیهای آغازگرهای مورد استفاده در جدول 1-4آمده است.
جدول 1-4 توالی آغازگر های مورد استفاده برای تکثیر قطعه - جدولnrDNA ITS
توالی آغازگر جهت حرکت آغازگر نام آغاز گر
5-AAGGTTTCCGTAGGTGAACC-3 آغازگر رفت ITS1F
5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 آغازگر برگشت ITS4
جهت انجام واکنش PCR ابتدا مخلوط کلی طبق جدول پایین تهیه گردید.
جدول1-5 ترکیبات مورد استفاده برای مخلوط کلیpcr
مقدار مورد استفاده غلظت نام ماده
7 میکرو لیتر برای تکثیر قطعه هسته nrDNA ITS - آب دیونیزه
10میکرو لیتر 2X PCRmaster Mix
1میکرو لیتر 10PmoL /ML آغاز گر رفت
1میکرو لیتر 10PmoL/ML آغاز گر برگشت
1میکرو لیتر 20-25ng/ML DNA الگو

مراحل اصلی در یک واکنش PCR به ترتیب زیر است:
واسرشتگی اولیه: مخلوط تا 95 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود این دما پیوندهای هیدروژنی بین 2 رشته DNA را می شکند و باعث واسر شتگی دو رشته DNA می گردد.
واسر شتگی ثانویه: مرحله اول مجدداً تکرار می شود تا اطمینان حاصل گردد که دو رشته DNA کاملاً از یکدیگر جدا شده اند.
اتصال: مخلوط تا دمای 64-60 درجه سانتیگراد خنک می شود در این دما آغازگرها به محل های ویژه ای از DNA متصل می شوند.
بسط اولیه: دما تا 72 درجه سانتیگراد افزایش می یابد. این دما برای عملکرد آنزیم Taq پلیمر از مناسب است تا رشته جدیدی از DNA ساخته شود.
بسط نهایی: مرحله قبل مجدداً تکرار می شود تا قطعاتی که هنوز تکثیرشان کامل نشده تکمیل گردند
در هر واکنش PCR مراحل 2تا 4 بسته به نمونه های مختلف 25تا 30 مرتبه تکرار می گردد.
جدول1-6 برنامه مورد استفاده برای واکنش PCR قطعه ITS nrDNA
زمان دما چرخه
5 ثانیه 950C واسرشتگی اولیه 25-30
1دقیقه 950C  واسرشتگی ثانویه 45ثانیه 0C 64-60 اتصال آغازگر 1دقیقه 720C بسط اولیه 7دقیقه 720C بسط نهایی 3-4-3الکتروفورزژل آگارز
الکتروفورز روشی است که در آن مولکول های DNA با بار منفی در میدان الکتریکی قرار می گیرند.
مولکول های DNA از میان شبکه ژل آگارز به سمت قطب مثبت حرکت می کنند که سرعت حرکت مولکول ها وابسته به اندازه قطعات DNA می باشد.
به منظور حصول اطمینان از تکثیر ناحیه مورد نظر در DNA، پس از انجام فرایند PCR محصولات در ژل آگارز 1 % الکتروفورز شدند.
بدین ترتیب 6 % آگارز وزن شد و در 60 میلی لیتر TBE IX به کمک حرارت حل شد 5/1 میکرو لیتر اتیدیوم برو ماید اضافه می کنیم. بعد از خنک شدن، محلول حاصل در سینی مخصوص که شانه در آن قرار داده شده بود ریخته شد. پس ژل برای بسته شدن درون یخچال قرار گرفت. بعد از قرار دادن ژل درون دستگاه الکتروفورز 3 میکرولیتر از محصولات PCR درون چاهک های افقی ژل تزریق شد. همچنین درون یکی از چاهک ها Ladder تزریق شد.
دستگاه الکتروفورز افقی (GeL XL Ultrauk) که با TBE IX برشده است به مدت 1 ساعت بر روی 75 ولتاژ تنظیم شد.
بعد از اتمام کار برای مشاهده ژل از دستگاه UV Light استفاده شد. باید توجه داشت که وجود باند در ستون کنترل منفی نشان دهنده آلودگی در محلول PCR و یا حین کار است.
براساس نوارهای وزنی Ladder بر روی ژل می توان به طول قطعه تکثیر شده پی برد.
تصویر ژل آماده شود.

شکل 1-6 nrDNA IT’S حاصل از تکثیر DNAژل الکتروفورز محصول

به طور کلی آغازگرهای PCR، براساس نواحی بسیار حفاظت شده ای طراحی می شوند که در دو سوی نواحی بسیار متغیر قرار دارند. مثلا آغازگر trn-c مورد استفاده در این مطالعه دارای ژن trnF (GAA) می باشند که ضمن انجام فرآیند PCRمطابق شکل1-7 به جایگاه های مربوطه متصل شده و ناحیه مورد نظر را تکثیر می کنند.

شکل 1-7 ناحیه فاصله گر رونویسی شونده داخلی (nrDNAITS)، زیر واحد ها، جهت و موقعیت آغاز گرها نشان داده شده است (برگرفته از Soltis et al., 1998).

شکل 1-8. ناحیه توالی DNA کلروپلاستی دو منطقه ی غیر کد شونده: اینترون trnL و فاصله گر بین ژنی trnL-F، جهت و موقعیت آغازگرها نشان داده شده است (برگرفته از (Quanddt et al., 2004.
3-4-4تعیین توالی مناطق تکثیر شده
محصولات PCRتک باند قوی و بدون کشیدگی ، جهت تعیین توالی از طریق شرکت ژن فن آوران به کشور کره فرستاده شد. برای تعیین توالی نمونه های مربوط به nrDNAITS از آغازگرهای ITS5 یا ITS5m وI4 یا AB101F و AB101R استفاده گردید
3-5آنالیز فیلوژنی
برای آنالیز داده های مولکولی، کروماتوگرام های حاصل از تعیین توالی نمونه ها با استفاده از نرم افزار Bioedit ویرایش و به text تبدیل شد و سپس به دو طریق دستی و با استفاده از نرم افزار ClustalW (Thompson et al., 1994) هم ردیف سازی گردید. با روش بیشینه ی صرفه جویی (Maximum parsimony) با استفاده از نرم افزار PAUP*4.0bl0 (Sowfford, 2002) و همچنین با روش Bayesian با نرم افزارversion 3.12) MrBayes Ronquist & Huelsenbeck, 2003) آنالیز شدند.

شکل 1-9 کروماتوگرام حاصل از تعیین توالی قطعه - شکل nrDNA ITS
3-5-1روش ماکزیمم پارسیمونی
بر اساس روش پارسیمونی مناسب ترین درخت، درختی است که به حداقل تعداد تغییرات برای توضیح داده ها (توالی های نوکلئوتیدی) نیاز داشته باشد و بنابراین بهترین درخت، کمترین تغییرات را در مسیر تکامل طی کرده و کمترین میزان هموپلازی ناشی از همگرایی یا برگشت را دارد و کوتاهترین درخت است.
در آنالیز پارسیمونی ممکن است چند کوتاهترین درخت به دست آید، در این صورت درخت توافقی (strict consensus tree) آنها را نشان می دهند که در این درخت کلادهای مشترک بین آن درختان نشان داده می شود ولی روابط ناسازگار بین آنها به صورت پلی تومی دیده می شود (Hall, 2001, Soltis & Soltis ,2003).
برای آنالیز داده های nrDNAITS، cpDNAtrnL-F و ترکیب ایندو، از جست و جوی ابتکاری (Heuristic search) و روش تبادل شاخه ای (Swapping)، دو نیمه سازی درخت و اتصال مجدد شاخه
هاTree Bisection Reconnection (TBR) و گزینه چندین درخت (MULTrees) با 100 تکرار از Random addition sequences و MaxTrees = 20000 (بیشینه درختان ذخیره شده) استفاده گردید.
برای تعیین حدود اطمینان کلاد ها در درخت مطلق مرکزی (Strict Consensus) حاصل از هر یک از آنالیز های مذکور، آنالیـز (Felsenstein 1985) Bootstrap با روش جستجوی ابتـکاری و انتخاب گزیـنه های Simple addition sequences و TBR و با انتخاب گزینه off برای MULTREES، انجام شد. تعداد تکرارها در تمامی آنالیزهای Bootstrapping، 20000 تکرار در نظر گرفته شد. بیشینه ی درختان ذخیره شده به ازای هر تکرار در تمامی موارد 100 درخت انتخاب شد.
3-5-2روش Bayesian
آنالیز Bayesian بر اساس قاعده آماری Bayes بنا نهاده شده است. در این قاعده برآمد نهایی آزمایش به انچه در مراحل قبلی رخ می دهند، بستگی دارد.
روش استنباطی Bayesian اخیرا به فیلوژنی راه یافته و یک ابزار قوی برای پاسخ به سوالات پیچیده در بیولوژی تکاملی است. Bayesian در فیلوژنی بر اساس کمیتی است که احتمال ثانویه نام دارد. در واقع تئوری Bayes، ترکیب احتمال اولیه (prior probability) از فیلوژنی(pr [Tree]) با احتمال (pr [Data / Tree])، برای ایجاد یک احتمال ثانویه (posterior probability) بر درخت (pr [Tree / Data)
است (Hall ,2001, Soltis & Soltis, 2003, Huelsenbeck et al., 2001).
این روش بر مدل های تکاملی متمرکز می شود و تمامی مکان های جانشینی را بررسی می کند. برای آنالیز داده های nrDNAITS، cpDNAtrnL-F و ترکیب ایندو، مدلهای تکاملی با استفاده از برنامه MrModeltest version 2.3 (Nylander, 2004)، اجرا شده در MrMTgui (Nuin 2005) بر اساس معیار اطلاعاتیAkaike (AIC) (Posada & Buckley 2004) انتخاب شدند. برطبق این آنالیز، مجموعه داده ها با استفاده از مدلهای K81uf + I + G و SYM +I + G، به ترتیب برای داده های cpDNAtrnL-F و nrDNAITS آنالیز شدند. مجموعه داده های ترکیبی در دو بخش با استفاده از ترکیب مدلهای مشابه یا به عنوان یک بخش با مدل GTR + I + G آنالیز شدند. برنامه MrBayes version 3.12 (Ronquist & Huelsenbeck 2003) برای آنالیز های فیلوژنتیکی Bayesian استفاده شد. برای آنالیز بخش بندی شده (partitioned analysis) و غیر بخش بندی ((nonpartitioned data، اجازه داده شد تخمین های جانشینی ها و طول شاخه ها به طور مستقل در هر بخش متغیر باشد. احتمالات ثانویه بر روی پارامترهای مدل از داده ها با استفاده از پیش فرض های اولیه برآورد شدند. آنالیز های ترکیبی و جدا از هم در 2 میلیون نسل تکرار شدند. 4 زنجیره مارکوف مونته کارلو (MCMC) در یک زمان از یک درخت به طور تصادفی شروع به کار کرد. یک درخت را در هر 100 نسل نمونه برداری کرد. درختان نمونه برداری شده بعد از رسیدن به فاز خطی (بعد از 500000 نسل یا 5000 نمونه) جمع آوری شدند و برای ایجاد یک درخت توافقی با بیشینه 50%، همراه با ارزشهای احتمال ثانویه با استفاده ازTreeview (Page 1996) استفاده شدند.
3-5-3مقایسه دو روش آنالیزی ماکزیمم پارسیمونی و Bayesian
در روش ماکزیمم پارسیمونی، بهترین تفسیر از درخت، ساده ترین تفسیر است. در این روش، درختانی انتخاب می شوند که حداقل تعداد تغییرات را داشته باشند. مزایای این روش این است که انتخاب درخت با کوتاهترین طول، تعداد جانشینی های نوکلئوتیدی و هموپلازی ناشی از تکامل موازی و برگشت را نیز به حداقل می رساند. این روش آنالیزی به آسانی در برنامه PAUP* قابل اجراست و می تواند جایگاه های اطلاعاتی و مشکلدار را شناسایی کند. همچنین این روش قادر است به حالت های اجدادی نیز پی ببرد. از معایب این روش این است که ممکنست بر اساس توالی های وارد شده، نتایج متفاوت ناشی از چندین جستجو به دست آید. همچنین این آنالیز با مجموعه داده های بزرگ نسبتا کند انجام می شود. روش Bayesian از یک سری فنون جستجوی بسیار کارآمد استفاده می کند. این روش با در نظر گرفتن احتمال اولیه قبل از آنالیز و بر اساس احتمال ثانویه، نتیجه تولید می کند. از مزایای این روش بر ماکزیمم پارسیمونی اینست که از بسیاری از امکانات آماری و مدلهای تکاملی استفاده می کند در حالیکه روش پارسیمونی فقط بر اساس صفات بنا نهاده شده است. روش Bayesian می تواند مجموعه داده های نسبتا بزرگ را آنالیز کند و همچنین ارزشهای حمایتی بالایی دارد (Soltis & Soltis, 2003).
8394701098550فصل چهارم
بحث و نتیجه گیری
00فصل چهارم
بحث و نتیجه گیری

4-1 آنالیز ماکزیمم پارسیمونی
طول این ناحیه هسته ای برای 5 تاکسونی که مورد مطالعه قرار گرفت. 658 جفت باز میباشد. ماتریکس توالی های nrDND ITS شامل 13 تاکسون درون گروه و2 تاکسون برون گروه می باشد. صفات اطلاعاتی 146 وصفات غیراطلاعاتی 512 میباشد. انالیز دادهای nrDNA ITS با روشMPتعداد کوتاهترین درخت با337 گام میباشد. با شاخص پایداری یا ثبات CI 671/0،شاخص گروه پذیری یا ابقا RI 613/0ایجاد کرد.
در این آنالیز دو نمونهTournefortia Rubicunda,Heliotropium Bacciferum به عنوان
برون گروه انتخاب شدند.بعد از برون گروه کلادوگرام شامل 8 زیرکلاد میباشد اولین زیر کلاد با حمایت 100به دو زیر کلاد تقسیم می شود که یک کلاد تک تبار شامل Echiochilon persicumوکلاد بعدیEchiochilon Fruticosum میباشد که این دو با حمایت 100میباشد زیر کلاد بعدی با حمایت 100شامل گونه Solenanthus circinatusمیباشد وزیرشاخه بعدی به گونه هایی از جنس Rinderaکه یک کلاد با حمایت 54 که کمترین حمایت میباشد شامل یک گونه R.lanataو شاخه بعدی گونه R.Bungei می باشد زیر کلاد بعدی با حمایت 100 به یک کلاد تقسیم میشود. که شامل گونه incerpicua Lepechiniella میباشد و کلاد بعدی شامل گونه paracaryum میباشد. همچنین زیر کلاد بعدی با حمایت 58به یک شاخه که شامل گونه R.Cyclodonta میباشد. زیر کلاد بعدی نیز به یک گونه Cynoglossum creticum میباشد و یک زیر کلاد نیز با حمایت 86 به 2 شاخه که شامل گونه های Lindelofialongiflora,cynoglossum officinalis
تقسیم می شود که این 3 گونه با R.Cyclodontaخواهران متوالی اند.

شکل 1-10فیلوگرام حاصل از آنالیز داده های nrDNAITS با روش ماکزیمم پارسیمونی. اعداد روی شاخه ها، نشانگرحدود اطمینان شاخه هاست.
4-2 آنالیز Bayesian
در این فیلو گرام 2 گونهHeliotropium BacciferumوToumefortia Rubicundaبه عنوان برون گروه میباشند.فیلوگرام به 2 شاخه تقسیم می شود که این شاخه خود به 2 زیر کلاد با حمایت 00/1 می باشد زیر کلاد اولی به 2 شاخه تقسیم شده با حمایت 00/1 که 2 گونه Echiochilon persicum وEchiochilon fruticosumمیباشد که به عنوان کلاد خواهری هستند ومونوفیلند و شاخه بعدی به 2زیر کلاد تقسیم میشود که یک کلاد گونه Solenanthus circinatus وهستش وهمچنین گونه های جنس RinderaوSolenenthus با حمایت 90/0گروه تک تبار را تشکیل میدهند و گونهRindera bungieوR.Lanataبا حمایت 99/0 کلاد خواهری را تشکیل میدهند.شاخه بعدی که با حمایت 90/0 خارج شده خود به 2 زیر کلاد تقسیم شده که زیر کلاد اولی به گونه Paracaryum spوشاخه بعدی با حمایت 78/0 که گونه
incerpicua Lepechiniella را شامل میشود و زیر شاخه بعدی به 2 شاخه تقسیم میشود که شامل گونه
R. cyclodontaبا حمایت 60/0 میباشد و شاخه بعدی با حمایت 86/0به 2شاخه که شامل 3 گونه که اولی cynoglossum certicumبا حمایت 99/0 و زیر شاخه بعدی شامل lindelofialongiflora وcynoglossum officinaleبا حمایت 97/0 کلاد خواهری را تشکیل میدهند.
که گونهParacaryumو incerpicua Lepechiniella و R.Cyclodontaوcynoglossum certicum
و lindelofialongiflora وcynoglossum officinale پیرا تبار میباشد.
-579755-200025CynoglossumOfficinale
Lindelofialongiflora
0.97
CynoglossumCreticum
0.99
R.cyclodonata
0.86
Lepechiniella incerpicua
0.60
ParacaryumSP
0.70
R.lanata
R.bungei
0.99
R.albida
R.regia
Solenanthuscircinatus
0.98
EchiochilonPersicumIRan
EchiochilonFruticosum
1.00
1.00
TournefortiaRubicunda
HeliotropiumBacciferum
0.1
00CynoglossumOfficinale
Lindelofialongiflora
0.97
CynoglossumCreticum
0.99
R.cyclodonata
0.86
Lepechiniella incerpicua
0.60
ParacaryumSP
0.70
R.lanata
R.bungei
0.99
R.albida
R.regia
Solenanthuscircinatus
0.98
EchiochilonPersicumIRan
EchiochilonFruticosum
1.00
1.00
TournefortiaRubicunda
HeliotropiumBacciferum
0.1

شکل 1-11درخت فیلوژنی حاصل از آنالیز nrDNAITS با استفاده از روش Bayesian. اعداد نشان داده شده، حمایت آماری کلادها را نمایش میدهد.
4-3 فیلوژنی قبیله Cynoglosseae
همان گونه که درفیلوگرام نمایش داده شده در آنالیز ماکزیمم پارسیمونی حاصل از داده های ITSنمایش داده شده است گونه متعلق به جنس Echiochilon یک کلاد با حمایت 100 را با گونه های Echiochilon persicum و E. fruticosum و به عنوان اولین کلاد از درخت خارج می شوند را تشکیل داده اند.این 2گونه در تبارEchiochileaeقرار دارندکه بر اساس مطالعات لنگستروم (2002) به این قبیله معرفی شد.
گونه R.cyclodonta نیز دور از سایر گونه های جنس Rindera قرار گرفته است.بنابرابن جنس Rindera تک تبار نمی باشد.
اعضای قبیله Cynoglosseae دارای خامه ای با تقسیماتی در راس با 2 تا 4 کلاله، همچنین با فندقه های دارای اثر اتصال قاعده ای وسیع مشخص می شوند. از نظر کروموزومی عدد پایه کروموزومی 8 دارند. (Lugue & valdes ,1984)
قبیله Echiochileae با دو گونه آنالیز شده(Fruticosum E.percicum, Echiochilon)
تک تبار می باشد و این قبیله معمولا در قاعده درخت قرار گرفته است. اعضای این قبیله فرم چوبی دارند. در حالیکه بقیه اعضای زیرتیره علفی اند. از نظر گرده شناسی گونه های Echiochilon شبیه به گونه های Heliotropium، 3 شیاره (3- colpate) هستند.
(Kazempour osaloo& khatam saz ,1994, Diez& valdes 1986)
گروهی از گیاهشناسان (De candolle ,1846) Echiochilon را در قبیله Echieae و عده ای دیگر Al shehbaz, 1991 آن را در قبیله Eritrichieae قرار داده بودند.
khatamsaz,2002, Riedl ,1997 نیز این جنس را متعلق به قبیله Lithospermeae می دانستند.
در توضیح قبیله Cynoglosseae.s.L می توان گفت که پهنای قبیله Cynoglosseae در یک کلاد با حمایت بالا قرار می گیرد و تک تبار نیست. (سعادتی، 1390).
گونه های جنس Rindera همراه با گونه Solenanthus circinatus یک کلاد با حمایت بالا (pp=100) را تشکیل داده اند، این 2 جنس در داشتن برگهای قاعده ای با دمبرگ طویل. گل آذین خوشه مرکب، جام گل لوله ای پرچم ها 5 عدد، کلاله سرسان مشترک هستند. صفت نامساوی بودن شکل برگها – تعداد فندقه و شکل بساک میان سایر اعضای این قبیله صرفاً مختص به این دو جنس می باشد.
گونه های جنس Rindera در کلادی با حمایت 100 قرار گرفته اند. اعضای این کلاد، یک کلاد خواهری Solenanthus circinatus تشکیل داده اند این دو جنس در داشتن برگهای قاعده ای با دمبرگ طویل هستند. بنابراین ویژگی برگهای قاعده ای یک صفت طبیعی برای طبقه بندی اعضای این قبیله محسوب می شود. و موید قرابت این دو جنس است.
در پلی تومی 4 شاخه ای که در میانه فیلوگرام شکل گرفته، گونه های جنس Solenanthus در یک کلاد با حمایت 100 قرار گرفته که دال بر تک تبار بودن این جنس است (اسماعیل بگی کرماتی ،1391)
اعضای جنس ها Cynoglossum و lindelofia در فیلوگرام نیز در یک کلاد با حمایت 86 قرار گرفته اند. اعضای این دو جنس هیچ کلادتک تباری را تشکیل نداده اند. اما مجموعه ی کلادی با حمایت 86 ایجاد کرده اند. این دو جنس ظاهراً تک تبار نیستند اما خویشاوند نزدیک یکدیگر به شمار می روند. جنس های Cynoglossum و lindelofia در داشتن گل آذین انتهایی بدون براکته، زائده مستطیلی شکل بین لب ها در دهانه جام و فندقه های خاردار مشابه هستند.
گونه های جنس Rindera در دو زیر کلاد نزدیک به هم قرار دارند و به همراه جنس Lepechiniella incerpicua و یک گونه از جنس paracaryum پارافیلتیک را تشکیل داده اند. براساس نتایج حاصل از این مطالعه جنس Rindera تک تبار نمی باشد.
4-4 روابط فیلوژنی جنس Rindera
جنس Rindera 5 گونه از (R. Regia, R.Albida, R.Bungei, R.lanata, R.Cyclodanta)این جنس با استفاده از توالی هسته ای ITSآنالیز شده که درخت حاصل از آن نشان داد که این جنس تک تبار نمی باشد. آنالیز نیز نشان داد R.Cyclodontaبه عنوان گروه خواهری با کلادی متشکل از گونه های جنس, Lepechiniella ,paracaryum, cynoglossum creticum,lindelofialong, cynogolossum officinale) قرار می گیرد. و در آنالیز انجام شده با استفاده از توالی هسته ای ITSگونه های Rindera در کنارparararyum, Lepechiniella incerpicua قرار گرفته اند و نشان می دهد این گونه ها به هم نزدیکند.
خصوصیات مشترک جنس Rinderaعلفی، کپه ای کوچک، پوشیده از کرک،ساقه افراشته،کاسه گل استکانی هستند.. (خاتم ساز1381)
علفی،ساقه ها معمولا ساده، کرکی نرم،(به ندرت بدون کرک)برگها بیضوی،دمگل بلند،گل اذین به فرم دیهم،کاسه گل 5قسمتی (Davis P.H ,1978))
کاسه گل تقریبا در قسمت پایه به لوب باریک،در میوه خمیده،در گل قایم تقسیم میشود.جام گل لوله ای شکل(Popov M.G ,1953)
در جنس Rinderaدر فیلوگرام نمایش داده شده گونه Cyclodonta.Rدور از گونه های دیگر قرار گرفته
زیرا از لحاظ مورفولوژیکی به دلیل داشتن برگهای نسبتا بدون کرک،برگهای قاعده ای با دمبرگ طویل،
برگهای ساقه ای تخم مرغی و خامه نسبتا کوتاه از سایر جنس ها دور افتاده اند

–278

سنتز ژن gcsf...................................................................................................................................29
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf....................................................................................................30
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.................................................................................31
هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf.......................................................................................................32
هضم آنزیمی وکتوربیانی pHan......................................................................................................33
کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan.................................................................................33
بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf...........................................................................................34
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf......................................................................................................35
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.....................................................35
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین..............................................................................35
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy..........................................................37
بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo.........................................................................................38
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf......................................................39
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo..............................................................................39
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf.........40
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................41
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا...................................................................................42
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین.............................43
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا......................................................................................44
کشت سلولهای مخمری....................................................................................................................44
بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE........................................................................44
تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش.....................................................................................................45
ایمونوبلاتینگ...................................................................................................................................46
فصل سوم نتایج
سنتز ژن gcsf...................................................................................................................................49
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf...................................................................................................49
طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf...........................................................................................49
بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf...........................................................................................50
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.................................................................................51
هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan.......................................................51
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf.............................................................................................52
بررسی کلونها به روش سریع...........................................................................................................52
انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf............................................................52
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf......................................................................................53
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.....................................................54
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble).............................................................54
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy..........................................................55
تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin.......................................................................................55
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................55
هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII.....................................................................56
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf......................................................57
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin..............................................................................57
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................57
بررسی کلونها به روش Colony-PCR.............................................................................................58
برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo.................................................................................58
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................59
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا........................................59
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین..............................................59
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا.....................................................................................60
تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting.......................................................61
فصل چهارم :بحث و پیشنهادات
رویکرد کلی پژوهش........................................................................................................................63
فصل پنجم : منابع و پیوست
فهرست منابع و مواخذ......................................................................................................................66
پیوست‌ها..........................................................................................................................................75
مقدمه
تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.
هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.
مواد و روش ها
cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده مربوط به هانسونلا پلی مورفا که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.
نتایج
ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با استفاده از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.
بحث
پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.
کلید واژه ها
هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک
فصل اول : مقدمه
در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:
رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،
تحمل دماهای بالا (توانایی رشد در دمای °C49)،
تبادل آسان محتوای ژنتیکی بین سلولهای هاپلوئید و دیپلوئید ( (Teunisson, 1960.
1-1میکروبیولوژی هانسونلا
این مخمر برای اولین بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوی 50% قند در فلوریدای آمریکا جداسازی شد.
سلولهای هانسونلا به هر دو صورت سلولهای دیپلوئیدی و هاپلوئیدی رشد می کنند. کلنی ها بر روی محیط کشت جامد دارای طیف رنگی صورتی هستند که به علت آسکوسپورها می باشد. کلنی سلولهای هاپلوئیدی و دیپلوئیدی از نظر رنگ، اندازه، چیدمان سلولی و سایر ویژگیها با یکدیگر متفاوت می باشند.
تاکنون اطلاعاتی در مورد توانایی هانسونلا پلی مورفا در تشکیل میسلیوم کاذب پیدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).

شکل 1-1 مخمر H. polymorpha
هانسونلا پلی مورفا میتواند در دمای بالا و در °C42 رشد کند. به نظر می رسد در این مخمر سنتز تره هالوز قسمتی از پاسخ به قحطی منبع کربن و شوک حرارتی است و پیشنهاد شده که این ترکیب، فاکتور مهمی در مقاومت دمایی است (Reinders, 1999).
مطالعات انجام شده بر روی هانسونلا پلی مورفا به طور عمده به بررسی پروتئین های سلولی، ساختار سلولهای مخمر در حال رشد و یا بررسی متابولیسم مخمر پرداخته اند.
در سویه هایی از این مخمر که از متانول به عنوان منبع انرژی استفاده می کنند، آنزیمهای متانول اکسیداز و کاتالاز، به فرم کریستالی درون اندامکی به نام پراکسی زوم قرار گرفته اند (Van Dijken, 1975).
هانسونلا پلی مورفا بعنوان یک ارگانیسم متیلوتروف، یک مدل مطلوب برای تحقیق در مورد عملکرد پراکسی زم ها و تکامل حیات می باشد. همچنین به منظور بررسی ژنتیکی جنبه های مختلف متابولیسم سلولی از جمله متابولیسم متانول، جذب نیترات و مقاومت به فلزات سنگین مورد مطالعه قرار می گیرد ( (Mannazzu, 2000.
با وجود این ویژگیها، هنوز قابلیت های ژنتیکی و طبیعی سویه های مورد استفاده از این مخمر کاملاً مشخص نیست و کنترل ژنتیکی فرایندهای سلولی پایه از جمله کنترل تقسیم سلولی، تولید مثل و اسپورزایی هنوز با سؤالات زیادی مواجه می باشد.
با اینحال هانسونلا پلی مورفا به عنوان یک میزبان برای تولید پروتئین های خارجی(ترشحی به خارج از سلول) توجه زیادی را به خود جلب کرده است ( (Gellissen, 2000.
1-2مطالعات ژنتیکی
تحقیقات ژنتیکی تاکنون تنها بر روی سه سویه از این مخمر انجام شده است که شامل سویه های DL-1، CBS 4732 و NCYC 495 می باشند.
پیدایش سویه های هانسونلا پلی مورفا از سویه های جهش یافته اکسوتروف شروع شده است.این موتانت ها از سویه هایی که در بالا نام برده شد با استفاده از ترکیب شیمیایی N-متیل-N-نیترونیتروزو گوانیدین یا اتیل متان سولفونات به دنبال یک مرحله غنی سازی با نیستاتین به دست آمده اند.
از طرف دیگر اشعه ماوراء بنفش نیز یک موتاژن بسیار قوی است که طیف موتانت های ایجاد شده بوسیله آن در مقایسه با موتانت های حاصل از مواد شیمیایی متفاوت و گسترده تر می باشد (Roggenkamp, 1986).
بطور کلی فرایندهای جهش زایی متعددی در این مخمر انجام شده است که یکی از این فرایندها، جهش های ژنتیکی است که منجر به سنتز اسیدآمینه های آروماتیک می شود که به مخمر اجازه رشد در محیط غنی YPD را نمی دهند (Krappmann, 2000).
از جمله انواع جهش یافته های اکسوتروف میتوان به موارد زیر اشاره نمود:
سویه هانسونلا پلی مورفای جهش یافته ای که برای رشد بر روی محیط های معدنی الزاماً به ریبوفلاوین نیاز دارد و محدود نمودن منبع ریبوفلاوین تأثیر شدیدی بر روی سنتز مجموعه الکل اکسیداز و تکثیر پروکسی زومهای سلولی دارد (Evers, 1994).
نوع دوم جهشهای ایجاد شده در ژن FAD1 است که اسید چرب دلتا را کد می کند. کاربرد این سلولهای جهش یافته در بررسی ژنتیکی سنتز اسیدهای چرب غیراشباع می باشد ( (Anamnart, 1998.
تحقیقات اخیر نشان داده است که هانسونلا پلی مورفا میتواند برای بررسی مقاومت به فلزات سنگین مورد استفاده قرار گیرد چراکه توانایی رشد در حضور تجمع فلزات سنگین متفاوت را که برای سایر موجودات سمی است دارا می باشد (Mannazzu, 1997).
در طی رشد در محیط حاوی vanadate، سلول ها افزایش قابل توجهی از پلی فسفات های واکوئلی پیدا میکنند. احتمالاً نقش این واکوئل ها در فعال کردن مکانیسم های اتوفاژی است که شاید برای جبران کمبود مواد مغذی و یا حذف ساختارهای سلولی ناهنجار القاء شده توسط این یون فلزی لازم باشند (Mannazzu, 1998).
سلول های هانسونلا پلی مورفا در مقایسه با S. cerevisiae به یون های کادمیوم(cd2+) بسیار مقاومند )این مقاومت به شدت به ماهیت منبع کربن استفاده شده بستگی دارد. سلول ها اغلب زمانیکه بر روی محیط حاوی گلوکز رشد میکنند به کادمیم مقاومتراند اما در طی رشد بر روی محیط حاوی متانول، به عنوان منبع کربن و انرژی، به این یون بسیار حساس می باشند. سویه های جهش یافته مقاوم به کادمیوم به سه گروه cds1، cds2 و cds3 تقسیم میشوند ( (Lahtchev, unpublished data.
جهش در ژنهای کدکننده آنزیم های پراکسی زومی یا سیتوپلاسمی درگیر در متابولیسم متانول
ژن AOX1 (MOX)، کدکننده آنزیم الکل اکسیداز (AO) موجود در ماتریکس پروکسی زوم است و یکی از بهترین ژن های هانسونلا پلی مورفا در تحقیقات می باشد (Ledeboer, 1985). الکل اکسیداز یک آنزیم فلاووهومواکتامری است که اولین مرحله در متابولیسم متانول را کاتالیز میکند. مونومر این آنزیم در سیتوپلاسم سنتز شده و به صورت هومواکتامر فعال، تجمع یافته و در داخل پراکسی زوم قرار میگیرد. حدود 210 نوع جهش یافته از ژن AO وجود دارد ( (Titorenko, 1995. بیان این ژن در مرحله رونویسی تنظیم میشود.

شکل 1-2 مورفولوژی سلولهای H. polymorpha جهش یافته
در هانسونلا پلی مورفا وقایع مربوط به مهار و القاء ژنهای کد کننده آنزیم های اختصاصی متانول و یا آنزیمهای پراکسی زومی به شدت کنترل می شوند. تنظیم در سطح رونویسی با مکانیسم های کنترلی قابل ملاحظه ای انجام میشود. عناصر تنظیمی به فرم سیس در بالادست ژنهای DAS، CAT و FMD با نقش مهاری برای گلوکز شناسایی شده اند.
1-3 نقشه ژنتیکی
آنالیز تتراد در هانسونلا پلی مورفا امکان پذیر است اما اندازه کوچک اسپورها روند این آنالیز را کند می نماید. در کشت سلول های دیپلوئیدی تفکیک مندلی نرمال در مورد بیشتر مارکرهای ژنتیکی مشاهده شده است.
الکتروفورز DNA کروموزومی هانسونلا پلی مورفا به روش pulse field، 3 تا 7 باند را نشان داده است که به نوع سویه وابسته است (Mari, 1993)اما بطور کلی مشخص شده است که هانسونلا پلی مورفا حداقل 7 کروموزوم دارد که بعضی از آنها مضاعف (دو تایی) هستند (Naumov, 1992).
1-4 تولیدمثل و اسپورزایی
فاکتورهایی در تولیدمثل و اسپورزایی هانسونلا پلی مورفا درگیرند که هنوز بطور کامل شناسایی نشده اند. از القاء کننده های قوی تولیدمثل جنسی میتوان به مالتوز، گلیسرول و سوربیتول اشاره کرد (Lahtchev, unpublished data).
سلول های هاپلوئید بر اساس نوع فنوتیپشان به چهار گروه تقسیم میشوند:
سویه های گروه 1 و 2 میتوانند هیبریداسیون متقاطع داشته باشند. این سویه ها سریع الرشد و تهاجمی بوده و پس از گذشت یک روز در محیط انتخابی، دیپلوئیدی می شوند. سویه های گروه 3 توانایی جفتگیری با اعضای گروه 1 و 2 را دارند و سویه های مثبت (+) نامگذاری می شوند. سویه های گروه 4 تنها میتوانند با گروه مثبت جفتگیری کنند و گروه منفی (-) را تشکیل دهند.
1-4-1 اسپورزایی
در هانسونلا پلی مورفا سلولهای هاپلوئیدی توانایی اسپورزایی دارند. اسپورزایی هاپلوئیدها بعد از گذشت 8 روز در محیط حاوی 3% مالتوز در دماهای پائین قابل تشخیص است. اسپورزایی با ظاهر شدن کلنی های دیپلوئیدی به رنگ صورتی روشن همراه می باشد.
در اواخر دهه 1960 کشف شد که مخمرها توانایی رشد بر روی محیط حاوی متانول به عنوان منبع کربن و انرژی را دارند (Ogata, 1969). اخیراً در تحقیقات پایه، متیلوتروف ها به عنوان منبع پروتئین های تک سلولی (SCP) ((Cooney and Levine, 1976) و آنزیم های غیرمعمول و متابولیت ها توجه بسیاری را به خود جلب کرده اند. با استفاده از روشهای جدید کلونینگ، ژن های کد کننده آنزیم های کلیدی در متابولیسم متانول شناسایی شده اند (Wegner, 1990).
پروموترهای MOX و FMD بعد از القاء، بسیار قوی عمل می نمایند. این مطلب با مشاهده میزان بالای بیان محصولات تحت تأثیر این پروموترها قابل انتظار است.
این یافته ها استفاده از هانسونلا پلی مورفا، به عنوان یک میزبان مناسب برای بیان به میزان زیاد ژنهای هترولوگ با استفاده از این پروموترها، به عنوان اجزاء کنترل کننده بیان، را قابل قبول نماید (Roggenkamp, 1984; Hollenberg and Janowicz, 1988).
سیستم بیانی شامل هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 و پلاسمیدهای حاوی توالی های URA3و HARS1 است که به دنبال هم قرار گرفته اند. استفاده از پروموترهای FMD یا MOX و ترمیناتور MOX همراه با جایگاههای برش آنزیمی کوتاه مربوط به کلونینگ (MSC) بین این دو واحد، کلونینگ و بیان ORFهای هترولوگ را ممکن ساخته است.
آنالیز سویه های بیانی، پایداری میتوزی قابل توجه پلاسمید های الحاق شده به درون ژنوم را نشان می دهد که در بعضی موارد بیانگر سرعت بیان بالای ORF هترولوگ می باشد.
از طرف دیگر، سویه RB11، اغلب دستکاری های ژنتیکی به صورت نوترکیبی را به راحتی نمی پذیرد که شاید ناشی از پایداری میتوزی فوق باشد. به نظر می رسد سویه DL-1 نسبت به سویه RB11 توانایی پذیرش بیشتری را دارد (Gellissen, 1992).
1-6 پروموترهای مورد استفاده در سیستم های بیانی هانسونلا پلی مورفا RB11
یکی از پروموترهای مورد استفاده برای تولید پروتئینهای هترولوگ در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11، پروموتر ژن MOX می باشد که طول آن بیش از 5/1 کیلوباز بوده و در حضور منبع کربن تنظیم می شود. به این صورت که در حضور گلوکز، پروموتر MOX مهار می شود ولی در حضور متانول، القاء می گردد.
پروموتر سایر ژن های کدکننده آنزیم های کلیدی در کاتابولیسم متانول از جمله FMD، DAS و CAT نیز مشابه با پروموتر ژن MOX کنترل می شوند اما سطح تنظیمی بعضی از آنها همچون CAT مشخص نیست (Veenhuis, 1983).
اگرچه پروموترهای FMD و MOX به طور واضحی مقایسه نشده اند اما بعضی مقایسه ها نشان داده است که مزایای پروموتر FMD از پروموتر MOX بیشتر است. بعنوان مثال، هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 بیان کننده ژن فیتاز تحت کنترل پروموتر FMD، بازده زیادی در تخمیر در شرایط قحطی گلوکز دارد.
1-6-1 HARS1
پلاسمیدهای بیانی مورد استفاده در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 دارای عنصر HARS1 به طول تقریبی 5/0 کیلوباز می باشند. این قطعه ژنی در سالهای اخیر در طراحی وکتورهای مناسب برای انتقال به هانسونلا پلی مورفا مورد توجه قرار گرفته است Roggenkamp, 1986)). پلاسمیدهای حامل توالی HARS1 در 30-20 نسل ابتدایی رشد سلولها به صورت اپی زومال باقی می مانند اما پس از آن در ژنوم سلول مزبان به صورت تکرارهای متوالی به تعداد زیاد الحاق می شوند. این در حالی است که ناحیه ای که این پلاسمیدها دقیقاً در ژنوم ادغام می شوند هنوز مشخص نیست Gellissen, 1990)). چهار عنصر دیگر از خانواده قطعه ژنی HARS در سویه های DL-1 به دست آمده است اما تعداد کپی آنها از تعداد عناصر HARS1 در سویه RB11 کمتر است.
جزئیات مکانیسم ادغام شدن پلاسمیدهای حاوی توالی HARS1 در ژنوم این مخمر هنوز مشخص نیست. تنها ویژگی شناخته شده، توانایی ادغام شدن به صورت توالیی تکراری و غیرتصادفی است که قسمت خاصی از ژنوم را انتخاب می کند (Sohn, 1996).

شکل 1-3 تصویر پلاسمید بیانی مخمر H. polymorpha
1-7 بیان همزمان:
با چنین سیستم هایی، مجموعه های پروتئینی هترومری تولید می شود. یک مثال قابل توجه از این نوع بیان، بیان همزمان آنتی ژن های S و Lویروس هپاتیت B است.
از دیگر موارد بیان همزمان میتوان به بیان ژن های کد کننده گلیکولات اکسیداز (GO) اسفناج و کاتالاز (CTT1) T ساکارومیسس سرویزیه در هانسونلا پلی مورفا اشاره نمود.
بیان، پردازش، تغییر و تبدیل و یا ترشح مؤثر پروتئینهای نوترکیب خاص در هانسونلا پلی مورفا ممکن است دچار تغییر شود. این محدودیت می تواند با بیان همزمان ژن مورد نظر با یک ژن دوم (یا بیش از یک ژن دیگر) برطرف شود به همراه می آورد. به عنوان مثال فرآیند پردازش نادرست اینترفرون آلفا 2a، می تواند با بیان همزمان ژن KEX2 ساکارومیسس سرویزیه بهبود یابد.
1-8 ترشح پروتئین های هترولوگ الیگومری و فعال
هانسونلا پلی مورفا مقدار کمی پروتئین درونی (خودی) ترشح می کند و در نتیجه این ویژگی، پروتئین های هترولوگ ترشح شده به محیط کشت، عموماً خالص هستند. بنابراین استفاده از این میزبان بیانی، روش مناسبی جهت تولید پروتئین های نوترکیب خارجی به فرم محلول می باشد. ترشح پروتئین ها توسط توالیهای نشانه (سیگنال) قابل جداسازی انجام می شود. اگرچه گاهاً مستقل از سیگنال ترشحی، در مواردی ترشح خودبخودی پروتئین هترولوگ نیز مشاهده شده است (Gellissen, 2000).
برای درک توانایی هانسونلا پلی مورفا در تولید و ترشح پروتئین های هترولوگ، سویه هایی از این مخمر به منظور ترشح الکل اکسیداز (AOX) مهندسی گردیدند. الکل اکسیداز، یک پروتئین هومواکتامر کوفاکتوری است که هر زیرواحد آن دارای یک مولکول FAD می باشد (van der Klei et al, 1991). زمانیکه هانسونلا پلی مورفا بر روی محیط حاوی متانول رشد می کند فعالیت پروتئین AOX در ماتریکس پراکسی زومی، جائیکه اکثر پروتئین های اصلی وجود دارند، محدود می شود.
از طرف دیگر، برای فهم چگونگی ترشح الکل اکسیداز، سویه هایی از هانسونلا پلی مورفا مهندسی گردید که ژن اندوژن AOX با ژن AOX به دنبال سیگنال ترشحی در انتهای N، جایگزین شد. به دنبال کشت این سویه در محیط کشت حاوی متانول، حضور AOX فعال شناسایی گردید که این بیان نشان می دهد هانسونلا پلی مورفا قادر به تولید و ترشح کمپلکسهای پروتئینی دارای کوفاکتور و ساختارهای الیگومری می باشد (van der Heide and Veenhuis, Unpublished results).
1-9 تولید واکسن نوترکیب
در بسیاری از کشورها واکسن های علیه هپاتیت در اوایل دهه 1980 در دسترس عموم قرار گرفت. این واکسن ها با جداسازی آنتی ژن HBs از سرم افراد ناقل تولید شده بود که اگرچه مؤثر بودند اما به دلیل مشتق شدن از سرم، گران بوده و مدت زمان کوتاهی به سیستم ایمنی عرضه می شوند. به همین دلیل، تولید آنتی ژن HBS هترولوگ در سیستم های بیانی مختلف از جمله مخمر، باکتری، سلولهای گیاهی یا جانوری و نیز حیوانات تراریخته توسعه پیدا نمود. (Billman-Jacobe, 1996, Makrides, 1996).
1-10 مخمرها به عنوان میکروارگانیسم های تولیدی
سیستم های مخمری دارای مزایایی از جمله توانایی دستکاری ژنتیکی آسان، فرآیند های پس از ترجمه یوکاریوتی با میزان بالای تولید محصول و فرآیندهای تخمیری ارزان قیمت هستند. بنابراین تعجب آور نیست که ساکارومیسس سرویزیه به عنوان یکی از میزبانهای مطلوب در تولید پروتئین های هترولوگ شناخته شده است (Hinnen et al, 1995; Barr et al, 2000).
تاکنون دو روش در سیستم بیانی هانسونلا پلی مورفا به منظور تولید زیرواحدهای adw2 و adr از آنتی ژن HBs ابداع شده است که یکی از آنها توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) تأیید شده است (Gregg et al, 1985; Gregg and Madden, 1987).
1-10 ساخت سویه هانسونلا پلی مورفا بیان کننده آنتی ژن HBs
به طور کلی تولید سویه های هانسونلا پلی مورفا نوترکیب نیازمند دنبال کردن پروتکل استاندارد زیر است:
تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
انتقال وکتور طراحی شده به سلول هانسونلا پلی مورفا
جداسازی سویه های نوترکیب
1-10-1 تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
تولید سویه H415 بیان کننده آنتی ژن HBs بوسیله گروهی از محققین یک مثال از این فرآیند است. توالی کدکننده آنتی ژن به طول 683 نوکلئوتید از پلاسمید pRIT10616 جدا گردید (Harford et al, 1987) و قطعه پروموتریMOX به عنوان سیگنال برای رونویسی از ژن MOX هانسونلا پلی مورفا مشتق شد (Ledeboer et al, 1985; Eckart 1988). این سه عنصر ترکیب شده و قطعه MOX promoter-HBsAg gene-MOX terminator را تشکیل می دهند که اساس کاست بیانی می باشند (Stinchcomb et al, 1980). سپس این کاست دارای عملکرد بیانی درون وکتور پلاسمیدی حاوی عناصر زیر قرار داده شد. ژن مقاومت به کلرامفنیکل به منظور تکثیر در باکتری E. coli، توالی همانند سازی هانسونلا پلی مورفا (HARS1) و ژن URA3 از ساکارومیسس سرویزیه به عنوان مارکر انتخابی در بررسی انتقال پلاسمید به هانسونلا پلی مورفا می باشند.
پلاسمیدهای دارای توالی HARS1 توانایی بالایی برای ادغام در ژنوم میزبان دارند. امروزه سویه هایی شناسایی شده که دارای بیش از 60 کپی از کاست بیانی خارجی اند که این مطلب به دلیل وجود این توالی می باشد.
1-11 انتقال (ترانسفرم) وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا
1-11-1 روش پلی اتیلن گلیکول
پلاسمیدpRBS-269 با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول به سویه RB10 انتقال یافت و برای مشخص شدن ادغام پلاسمید به درون ژنوم، غربالگری صورت گرفت (Gregg et al, 1985).
تاکنون چندین سویه ترانسفرم شده با کاست های بیانی الحاقی بطور پایدار تولید شده است و سویه H415 یکی از این سویه هاست که برای بیان آنتی ژن HBs تحت شرایط خاص مورد آزمایش قرار گرفته است (Janowicz et al, 1991).
1-12 جداسازی سویه های نوترکیب
تشخیص بیان پروتئین با رشد سویه های ترنسفورم شده بر روی محیط های تقریباً مغذی حاوی گلوکز، گلیسرول و یا متانول بررسی می شود. در این راستا، مقدار آنتی ژنHBs تولید شده در این سیستم بیانی در مقایسه با مقدار استاندارد آنتی ژن خالص با روش ایمونوبلاتینگ کمی اندازه گیری شد. میزان تولید د ر سویه H415 در محیط کشت حاوی متانول mg100 بود. زمانیکه سلول ها در محیط حاوی گلیسرول قرار گرفتند سنتز آنتی ژن HBs 70% کاهش پیدا کرد و زمانیکه سلول ها به محیط حاوی گلوکز منتقل شدند آنتی ژنی تولید نگردید که این مطلب نشان دهنده تولید این آنتی ژن به طور طبیعی تحت کنترل ژن MOX میباشد (Rutgers et al, 1988).
1-13 تنظیم متابولیسم متانول
تنظیم آنزیم های احیاکننده به روش مهاری و نه القاء صورت می پذیرد. در طی فرایند رشد، در شرایط کمبود گلوکز این آنزیم ها افزایش پیدا می کنند (Egli, 1980). تجزیه و تحلیل منطقه پروموتر ژن کد کننده AOD نشان داده است که در H. polymorpha بیان ژن MOX نیز توسط یک مکانیسم مهاری تنظیم می شود (Roggenkamp, 1984; Sakai and Tani, 1992).
1-14 فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (G-CSF)
در دهه 60 میلادی، دو گروه به طور همزمان روش هایی را برای توسعه و بهبود رشد کلنی های گرانولوسیتی و مونوسیتی مغز استخوان موش و یا سلول های طحال بر روی آگار نیمه جامد مورد بررسی قرار دادند. رشد کلنی این سلولها به حضور فاکتورهایی بستگی دارد که اصطلاحاً آنها را فاکتورهای محرک رشد کلنی(CSF) می نامند. تلاش برای شناخت بیولوژیکی و بیوشیمیایی این محرکها آزمایشگاههای زیادی را تا اواسط دهه 80 میلادی درگیر کرده بود (Metcalf, 2010). این تحقیقات نشان دادند که CSF ها عملکردی اختصاصی و مجزا ندارند بلکه چهار CSF که از نظر بیوشیمیایی کاملاً متفاوت هستند با هم همکاری می کنند. این چهار CSF با توجه به نوع فعالیت شان بر روی کلنی های متفاوت، نامگذاری شدند. به طور مثال GM-CSF که محرک رشد کلنی ماکروفاژها و گرانولوسیت ها می باشد.M-CSF محرک تولید کلنی ماکروفاژها و G-CSF محرک رشد کلنی گرانولوسیتی می باشد.
1-15 ژن gcsf
این ژن بر روی کروموزوم 17 قرار گرفته و دارای 4 اینترون است. دو نوع پلی پپتید متفاوت در نتیجه پردازش های مختلف از این ژن ایجاد می شود. تفاوت این دو پلی پپتید در وجود و یا عدم وجود 3 اسید آمینه می باشد. مطالعات انجام گرفته بر روی بیان این دو نشان می دهد که هر دوی آنها دارای فعالیت های مربوط به GCSF می باشند.
1-16 پروتئین GCSF
فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF)که فاکتور محرک کلنی3 هم نامیده می شود، یک سیتوکین وهورمون محرک رشد و دارای 175 اسید آمینه می باشد. گلیکوپروتئین های طبیعی انسانی در دو فرم وجود دارند. 174 آمینو اسیدی و 180 آمینو اسیدی که پروتئینی طویل با وزن مولکولی 19600 دالتون می باشد. فرم 174 آمینو اسیدی بیشترین فعالیت را دارد که در محصولات دارویی به کمک تکنولوژی DNA نوترکیب ساخته می شود. این فاکتور در بافت های مختلف اثربخشی خود را از طریق تحریک مغز استخوان برای ساخت گرانولوسیت و سلولهای بنیادی انجام می دهد.GCSF همچنین توسط اندوتلیوم، ماکروفاژها و تعدادی از سلولهای ایمنی تولید می شود.

شکل 1-4 ساختار کریستالی از 3 مولکول G-CSF انسانی
1-17 عملکرد پروتئین GCSF
G-CSF مغز استخوان را برای انتشار گرانولوسیت و سلولهای بنیادی در خون تحریک می کند. این پروتئین همچنین باعث تحریک بقاء، تکثیر، تمایز و عملکرد پیش سازه های نوتروفیلی و نوتروفیل های بالغ می شود که تنظیم این واکنش ها از طریق Janus kinase (JAK)، مبدل سیگنال و فعال کننده رونویسی STAT، پروتئین کیناز میتوژنی فعال (MAPK) و فسفاتیدیل اینوزیتول-3-کیناز انجام میشود.
شکل 1-5 مکانیسم عملکرد GCSF
گیرنده های GCSF بر روی سلول های پیش ساز مغز استخوان قرار دارند و در پاسخ به GCSF تحریک می شوند و این باعث رشد و تمایز این سلول ها به گرانولوسیت بالغ می شود. این پروتئین همچنین یک القاء کننده قوی برای انتقال سلول های بنیادی خون ساز هماتوپویتیک از مغز استخوان به درون خون می باشد (Wonganu, 2008).
GCSF همچنین محرک تولید گلبولهای سفید خون نیز می باشد و در انکولوژی و هماتولوژی، در بعضی سرطان های خاص برای افزایش سرعت بهبودی افراد نوتروپنی بعد از شیمی درمانی از شکل نوترکیب آن استفاده می شود. شیمی درمانی سبب تولید سطح غیر قابل قبول (کم) سلولهای سفید خون می شود که این مورد بیماران را در مقابل حملات میکروبی و عفونت ها حساس می نماید.
به نظر میرسدGCSF برای یک بارداری امن در طی مرحله لانه گزینی مؤثر باشد که این امر در بارداری های دوم و سوم بیشتر می شود (Strife, 2013).
در کنار تاثیر بر روی سیستم خون سازی، GCSF همچنین می تواند بر روی سلول های عصبی به عنوان مثال فاکتور نوتروفیک تأثیر بگذارد. در واقع گیرنده های این گلیکوپروتئین بر روی نورون های مغز و نخاع ظاهر می شوند (Cooper, 2011).
همچنین از GCSF برای درمان تخریب بافت قلب از طریق تزریق در خون محیطی به همراهSDF stromal) (cell-derived factor استفاده می شود (Anderlini, 2005) .
امروزهGCSF نوترکیب انسانی در سیستم بیانی باکتری E. coli تولید می شود که با نام فیلگراستیم شناخته شده است. فیلگراستیم از لحاظ ساختاری تفاوت کمی با گلیکوپروتئین طبیعی GCSF دارد. فیلگراستیم (Neupogen) و فیلگراستیم پگیله شده (Neulasta) (PEG-filgrastim) دو نوع تجاری متداول فرم نوترکیب GCSF انسانی rhG-CSF هستند. فرم پگیله، نیمه عمر طولانی تری دارد و این موضوع سبب کاهش ضرورت تزریق روزانه این دارو می شود.
شکل دیگر GCSF نوترکیب انسانی در سلولهای تخمدان هامستر چینی (CHO cells) ساخته می شود که با نام لنوگراستیم شناخته می شود. از آنجا که این سیستم بیانی در سلول پستانداران می باشد، لنوگراستیم تولیدی تفاوت بسیار کمی (غیر قابل تشخیص) در 174 آمینو اسید با GCSF طبیعی انسان دارد.
برای اولین بار در سال 1999 در آکادمی بیوتکنیک چین، ژنوم انسان به عنوان رشته الگو برای کلونینگ و بیان GCSF در غدد پستانی موش استفاده شد و قطعه ای به طول 5/1 کیلوباز با PCR بدست آمد(Lu, 1999).
در سال 2009 محققین به بیان پروتئین نوترکیب GCSF در مخمرPichia Pastoris پرداختند که نتیجه این تلاش بیان این پروتئین تحت پروموتور AOX1 بوده که در نتیجه القاء با متانول میزان پروتئین شده به 2 میلی گرم در لیتر رسید (Apte-Deshpande, 2009).
در سال 1387 محققین ایرانی به جهش زایی هدفمند در فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیت انسانی و کلونینگ و بیان آن در باکتری E. coli پرداختند و نتایج آنها نشان داد که پروتئین نوترکیب مورد نظر با موفقیت در سیستم پروکاریوتی کلون و بیان شده است (حامد ناقوسی، 1387).
به دلیل اهمیت بالینی بالا و نیز نیاز گسترده به GCSF در مراقبت های بهداشتی، تلاش های زیادی به منظور تولید مولکولهای مشابه با فرم طبیعی انسانی آن که دارای عملکرد باشند در حال انجام است.
در سالهای گذشته محققین ایرانی سعی در بیان آن در کاهوی تراریخته داشتنه اند چراکه در این سالها گیاهان تراریخته برای تولید انواع داروی نوترکیب و واکسن ها مورد استفاده قرار گرفته اند (مهدی شریفی تبار،1392).
فصل دوم مواد و روش ها
2-1 میکروارگانیسم های مورد استفاده
از باکتری E. coli سویه ' TOP10F به منظور کلونینگ و تکثیر پلاسمیدها و از مخمر Hansenula polymorpha سویه RB11 به عنوان میزبان بیانی مخمری استفاده شد.
2-2 محیط های کشت مورد نیاز
جهت رشد باکتری‌ E. coli از محیط کشت LB جامد یا مایع و جهت رشد مخمر از محیطهای کشت YPD جامد یا مایع، BMMY و BMGY استفاده شد (پیوست 1).
پس از آماده نمودن محیط¬های کشت میکروبی مورد نیاز، این محیط ها در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه در فشار یک اتمسفر اتوکلاو گردیدند. محلول‌های قندی یا محلولهای حساس به اتوکلاو با استفاده از فیلترهای 22/0 میکرون استریل شدند.
2-3 پلاسمیدهای مورد استفاده
وکتور کلونینگ pGH برای کلون نمودن ژن سنتز شده gcsf توسط شرکت مربوطه مورد استفاده قرار گرفت (شکل 3-1). وکتور بیانی مورد نیاز برای سلولهای مخمری به صورت سنتتیک و با درج عناصر ضروری جهت بیان پروتئین های هترولوگ در این سلولها با استفاده از وکتور کلونینگ pGH به عنوان وکتور اولیه ساخته شده است.

شکل 3-1. وکتور کلونینگ pGH
2-4 آنزیم ها و کیت‌ها
آنزیم Taq DNA polymerase، آنزیم های محدودالأثر، RNaseA و آنزیم T4 DNA ligase از شرکت Fermentas تهیه شدند.
کیت استخراج محصول PCR یا DNA از ژل آگارز از شرکت Roche تهیه گردید.
2-5 آنتی بیوتیکها
آنتی بیوتیک ها (آمپی سیلین، تتراسایکلین و زئوسین) با غلظت مناسب (پیوست 2) تهیه و در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2-6 روش های عمومی
2-6-1 الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز
به منظور بررسی نتایج PCR و یا کیفیت هرنوع مولکول DNA، از ژل آگارز استفاده می شود. به همین جهت ابتدا ژل آگارز با غلظت متناسب با سایز مولکول مورد بررسی تهیه می شود. با توجه به ظرفیت کاست ژل، ابتدا پودر آگارز وزن شده و سپس در حجم مشخصی از بافر TAE (پیوست 3) با رقت X1 حل می گردد. این مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق باقی مانده و سپس مخلوط به مدت 1 دقیقه جوشانده می شود تا به خوبی حل شده و محلول یکنواختی حاصل شود. پس از کاهش دمای محلول تا حدود °C40، به میزان لازم از محلول رنگی DNA Safety Stain به آن اضافه کرده و به آرامی به درون کاست ژل ریخته شده و شانه روی آن قرار داده می شود. پس از چند دقیقه و پس از بستن کامل ژل، شانه به آرامی و به صورت عمودی از داخل آن خارج ‌شده و ژل به همراه کاست در داخل تانک الکتروفورز افقی حاوی بافر TAE (X1) قرار داده می شود. در ادامه نمونه های DNA همراه با حجم مشخصی از بافر بارگذاری ، با ترتیب مشخص به آرامی به درون چاهک ها ریخته می شود. سپس الکترودهای تانک به منبع تغذیه متصل می شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص با توجه به اندازه قطعه، جریان برق قطع گشته و ژل از درون کاست خارج می گردد. ژل را در معرض نور فرابنفش قرار داده و باندها را مشاهده می نماییم.
نکته: در صورتی که قرار است DNA از ژل تخلیص شود، به هیچ‌وجه نمی‌بایست به مدت طولانی در معرض اشعه فرابنفش قرار گیرد زیرا این اشعه طول موج پایینی داشته و قادر است در توالی DNA جهش ایجاد کند.
2-6-2 تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز
جهت انجام کلونینگ، تخلیص محصول هضمهای آنزیمی فوق با استفاده از کیت تخلیص از ژل (Roche) و بر اساس پروتوکل موجود در کیت به شرح زیر انجام ‌شد:
1.به ازای هر mg100 ژل آگارز بریده شده ، µl300 بافر 1 (Binding buffer) به هر تیوب اضافه گردید.
2.تیوب ها به مدت 30-15 ثانیه ورتکس شده و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای C°56 گرماگذاری شدند.
3.در این مرحله به ازای هر mg100 ژل اولیه، µl150 ایزوپروپانول به تیوب ها اضافه شده وسپس ورتکس گردیدند.
4.محتویات هر تیوب به یکی از ستون های کیت افزوده شده و این مجموعه را با بالاترین سرعت (rpm13000) به مدت 30-60 ثانیه سانتریفوژ نمودیم.
5.مایع زیرین دور ریخته شده و سپس µl500 بافر شستشو به هر ستون اضافه گردید.
6.پس از سانتریفوژ در بالاترین سرعت به مدت 1 دقیقه، مایع زیرین دور ریخته شده و در این مرحله µl250 بافر شستشو مجدداً اضافه گردید.
7.پس از سانتریفوژ به مدت 1 دقیقه (در بالاترین سرعت)، هریک از ستون ها را به تیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال داده و µl35 آب دیونیزه به فیلتر ستون ها اضافه کرده و پس از انکوباسیون 5 دقیقه ای در دمای اتاق، هریک از تیوبها را مشابه با مراحل قبلی سانتریفیوژ نمودیم.
2-6-3 واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده
واکنش لیگاسیون پس از تعیین غلظت وکتور و قطعه الحاقی تخلیص شده از ژل آگارز، بر طبق واکنش مندرج در جداول مربوطه انجام گرفت. در نمونه کنترل منفی، وکتور خطی شده به تنهایی در یک واکنش لیگاسیون وارد گردید. به عبارت دیگر، در این واکنش به جای قطعه DNA، آب دیونیزه به مخلوط واکنش اضافه گردید. تمامی تیوب ها به مدت 16 ساعت (ON) در دمای °C4 گرماگذاری شدند. این دما کمک می‌کند تا تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین انتهاهای چسبنده آسان‌تر و با پایداری بیشتری انجام شود و آنزیم لیگاز نیز زمان کافی برای تشکیل پیوند فسفودی‌استری را خواهد داشت.
2-6-4 تهیه سلول‌ های مستعد 'E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم
باکتری مستعد، سلولی است که توانایی لازم برای وارد نمودن پلاسمید به درون خود را پیدا کرده است.
1.یک کلنی از باکتری مورد نظر به مدت 3-2 ساعت در حضور تتراسایکلین در محیط LB مایع و در دمای °C37 بر روی شیکر با سرعت rpm 150 کشت داده شد تا جذب نوری محیط کشت در طول موج nm600 (OD600nm) به 6/0-4/0 رسید.
2.محیط کشت در شرایط استریل (در کنار شعله) به میکروتیوپ استریل منتقل شده و با سرعت rpm9000 به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شد.
3.محیط کشت دور ریخته شده و رسوب سلولی در µl720 کلرید سدیم mM100 سرد استریل، حل شده و به مدت 20 دقیقه در یخ گذاشته شد.
4.پس از گذشت این مدت، سوسپانسیون باکتریایی با دور rpm9000 و به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شده و مراحل 3 و 4 تکرار شدند.
5.رسوب باکتریایی حاصل در µl300 محلول کلرید کلسیم حل گردید.
2-6-5 انتقال پلاسمید به سلول های مستعد (ترانسفورماسیون)
1.µl100 از سوسپانسیون سلول های مستعد به تیوپ استریل انتقال داده شد.
2.حجم مشخصی از پلاسمید و یا محصول لیگاسیون به سوسپانسیون باکتریایی اضافه شده و تیوب ها به مدت 30 دقیقه درون یخ قرار داده می شوند.
3.بلافاصله تیوب ها به حمام آبی دمای °C42 منتقل شده و به مدت 90 ثانیه گرماگذاری شدند. پس از اتمام این زمان سریعاً تیوب ها را به ظرف یخ منتقل نمودیم.
4.ml 1 محیط کشت مایع LB به محتویات هر یک از تیوبها اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در °C37 گرماگذاری گردیدند.
5.100 تا 150 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی بر روی محیط کشت LB جامد حاوی آنتی بیوتیک های مناسب (آمپی سیلین، تتراسایکلین یا زئوسین) کشت داده شد و پلیت ها به مدت 16 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری شدند.
6.پس از گذشت این مدت، از کلنی های تشکیل شده بر روی محیط کشت جامد، ماتریکس سلولی تهیه گردید.
2-6-6 بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع
1.مقدار µl50 از محلول EDTA(10 میلی مولار) به تیوبها اضافه کرده و حدود 70% از ماتریکس باکتریایی را در آن حل نموده و سوسپانسیون را ورتکس نمودیم.
2.مقدارµl 50 از محلول NSS (پیوست 4) را به هر تیوب افزوده و به مدت 30 ثانیه ورتکس نمودیم.
3.تیوب ها را به مدت 5 دقیقه در حمام آبی°C 70 گرماگذاری نمودیم.
4.مقدار µl 5/1 از محلول KCl (4 مولار) به تیوب ها اضافه کرده و هر تیوب به مدت 30 ثانیه ورتکس گردیده و سپس به مدت 5 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد.
5.محتویات هر سلول در دمای 4 درجه به مدت 3 دقیقه در g3000 سانتریفوژ گردید.
6.مایع رویی هر تیوب به تیوب جدید منتقل شد و میزان µl25 از آن بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
2-6-7 PCR بر روی کلنی های باکتریایی/ مخمری
با رعایت شرایط استریل، از کلنی های رشد یافته بر روی پلیت ماتریکس، مقداری باکتری برداشته و در مقداری آب دیونیزه استریل حل نموده و به مدت 5 دقیقه در بن ماری در حال جوش (100 درجه سانتی گراد) جوشانده و سپس از این محلول بعنوان الگوی DNA برای انجام PCR بر اساس پروتوکل مندرج در قسمت مربوطه استفاده می شود.

2-6-8 استخراج پلاسمید در مقیاس کم
1.باکتری E. coli حاوی پلاسمید مورد نظر را به لوله ml5 محیط کشت LB مایع حاوی آنتی بیوتیک مناسب تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) درون شیکر انکوباتور در دمای C°37 با دور 140 rpm قرار می دهیم.
2.سلولهای باکتریایی را با سرعت rpm10000 به مدت 3 دقیقه جمع آوری می نماییم.
3.در این مرحله رسوب باکتریایی را می توان در دمای °C20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصله از مرحله 3 را در µl100 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5. µl200 از محلول شماره 2 (پیوست 5) را به محلول حاصل از مرحله قبل اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.µl150 استات سدیم به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون ظرف یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول فوق را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
8.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
9.هم حجم مایع بدست آمده از مرحله قبل به آن مخلوط فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل به نسبت 25، 24، 1 اضافه می کنیم.
10.محلول را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
11.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
12.به میزان ml1 اتانول 96% سرد به مایع رویی اضافه کرده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C20- نگهداری می نماییم.
13.نمونه را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
14.به میزان µl750 اتانول 70% سرد به رسوب مرحله قبل اضافه کرده و مشابه با مرحله قبل سانتریفوژ می نماییم.
15.رسوب بدست آمده را در µl30-20 آب دیونیزه استریل حل می نماییم.
2-6-9 استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد
برای این کار از روش لیز قلیایی استفاده شد. مراحل انجام این روش به شرح زیر می باشد:
1.میزان µl450 از محلول آنتی بیوتیکی تتراسایکلین (غلظت نهاییml / µg15) را به ml300 محیط کشت مایع LB اضافه نموده و سپس سلول E. coli TOP10F' حاوی پلاسمید مورد نظر را به این محیط تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) بر روی شیکر انکوباتور C°37 قرار می دهیم.
2.محیط کشت به لوله های 50 میلی لیتری منتقل شده و با سرعت rpm10000 به مدت 4 دقیقه سانتریفوژ می گردد.
3.پس از انجام سانتریفوژ، محیط کشت رویی تخلیه شده و رسوب سلولی جمع آوری می گردد. در این مرحله می توان رسوب سلولی را در دمای °C 20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصل از مرحله 3 را در ml6 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5.به مقدار ml12 از محلول شماره 2 (پیوست 5) به تیوب فوق اضافه نموده و 10 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.سی میلی لیتر از محلول استات سدیم M3 (2/5pH) به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه درون یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول را به مدت 15 دقیقه در rpm12000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ می نماییم.
8.مایع رویی را از گاز استریل عبور داده و به محلول فیلتر شده، ml16 ایزوپروپانول اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری می کنیم. سپس این محلول را در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ نموده، مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک می کنیم.
9.رسوب خشک شده را در ml1 آب دیونیزه استریل حل کرده و به آن µl40 از محلول RNaseA (mg/ml10) اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری می نماییم.
10. به محلول فوق به نسبت 1:1 از فنل و کلروفرم اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ می نماییم.
11.فاز رویی (فاز آبی) را به تیوپ جدید منتقل کرده و دو برابر حجم این فاز، به آن اتانول 96% سرد اضافه نموده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C 20- قرار داده و سپس به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژمی نماییم.
12.مایع رویی را دور ریخته و به رسوب حاصل ml1 اتانول 70% سرد اضافه نموده و مجدداً سانتریفوژ می نماییم.
13.مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک نموده و سپس در µl150-100 آب دیونیزه حل می کنیم.
2-6-10 الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید (SDS-PAGE)
مقدمه
الکتروفورز در واقع همان حرکت ذرات باردار تحت تأثیر میدان الکتریکی، می باشد. خصوصیات مولکول ها (اندازه، شکل، میزان بار الکتریکی)، شرایط محیطی (قدرت یونی، pH، درجه حرارت و نوع ژل) و فاکتورهای الکتریکی (اختلاف پتانسیل، شدت جریان و ولتاژ) میتوانند در این فرایند مؤثر باشند. از متداول ترین محیط های نیمه جامد برای الکتروفورز پروتئین ها پلی اکریل آمید می باشد که پروتئین ها را در محدوده وزنی 500 تا 250000 دالتون از هم جدا می کند. این ماتریکس، پلیمری از مولکول های خطی اکریل آمید و N و N- متیلن بیس اکریل آمید می باشد. مولکول های بیس اکریل آمید پل های عرضی را بین مولکول های خطی اکریل آمید ایجاد می کنند و تشکیل یک شبکه رشته ای را می دهند که قادرند پروتئین ها را از هم جدا کنند. پلیمریزاسیون این ترکیبات در حضور آمونیوم پرسولفات آغاز می شود و به دلیل سرعت کم این واکنش، از ماده TEMED بعنوان کاتالیزور واکنش پلیمریزاسیون استفاده می شود. عامل اصلی حرکت مولکول های باردار در الکتروفورز، اختلاف پتانسیل (V) بین قطب های مثبت و منفی می باشد. در روش SDS-PAGE پروتئین ها در حضور شوینده یونی SDS، الکتروفورز می شوند. این ماده به اسید های آمینه هیدروفوب پروتئین ها متصل شده و ساختمان طبیعی پروتئین ها را واسرشته کرده و به ازای طول زنجیره پپتیدی بار منفی ثابتی به آن ها اضافه می کند. بنابر این در این نوع الکتروفورز، به دلیل خنثی شدن اثر بار پروتئین ها توسط SDS، پروتئین ها تنها بر اساس اندازه و شکل از هم جدا می شوند(Sambrook, 2001).
مواد لازم
-اکریل آمید
-N,N متیلن بیس اکریل آمید
-سدیم دو دسیل سولفات (SDS)
-تریس بازی
-TEMED
-آمونیوم پرسولفات (APS)
-آب مقطر
-رنگ کوماس بلو (شامل کوماسی بریلینت بلو G250، متانول، اسید استیک گلاسیال می باشد)
-بافر نمونه x6 ( شامل تریس بازی، گلیسرول، SDS، برومو فنل بلو و 2-مرکاپتو اتانول (2-ME) می باشد)
-بافر تانک X1 (شامل تریس، گلایسین،SDS و آب مقطر می باشد، پیوست 6).
-الکل 96%
وسایل لازم
•سیستم الکتروفورز (منبع تغذیه، تانک، شیشه ها، فضا سازها و شانه )
•سرنگ هامیلتون
روش انجام کار
روش تهیه ژل تحتانی یا جدا کننده (پیوست 6)
•ژل تحتانی بر اساس جدول (3-1) تهیه می شود. درصد ژل بستگی به وزن مولکولی پروتئین دارد. هر چه وزن مولکولی نمونه، بیشتر باشد از درصد پائین تر ژل استفاده می شود تا پروتئین بهتر بتواند در ژل حرکت کند.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه نموده و خوب مخلوط نمایید.
2-6-10-1روش تهیه ژل فوقانی (پیوست 6)
•از این ژل به منظور متراکم کردن نمونه پروتئینی استفاده می شود و عموماً از ژل 4% استفاده می شود. این ژل بر اساس مقادیر جدول(3-1) تهیه می گردد.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه و به خوبی مخلوط نمایید.
•صفحات شیشه ای را با آب و الکل 70% کاملاً تمیز کرده و دو فضا ساز بین صفحات شیشه ای قرار دهید و با گیره محکم کنید. در ظرفی جداگانه به 1 تا 2 میلی لیتر از محلول ژل تحتانی کل TEMED لازم برای ژل تحتانی را اضافه کرده وتوسط آن سریعاً اطراف قالب شیشه ای و به ویژه انتهای ژل را پوشانده تا از نشت احتمالی جلوگیری شود. قالب شیشه ای بطور عمودی روی سطح صاف قرار داده شود.
•پس از تهیه ژل تحتانی، TEMED را به آن اضافه کرده و پس از اینکه کاملاً مخلوط شد، داخل قالب شیشه ای تا ارتفاعی که حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل فوقانی باقی بماند، بریزید.
• سپس مقداری اتانول 96% را به گونه ای که سطح ژل بهم نخورد، به آرامی در بالای ژل ریخته و صبر کنید تا ژل ببندد.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل تحتانی، الکل روی ژل را خالی و سطح ژل را چند بار با آب مقطر شستشو دهید.
•شانه را بین دو شیشه در بالای ژل قرار دهید و سپس به ژل فوقانی تهیه شده، TEMED را اضافه نموده و پس از خوب مخلوط کردن بر روی ژل تحتانی بریزید.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل فوقانی، شانه را به آرامی خارج و داخل چاهک ها را چندین بار با آب مقطر شستشو دهید. قالب شیشه ای را با گیره به سیستم الکتروفورز وصل کرده و محفظه بالا و پائین سیستم را با بافر تانک پرکنید.

جدول 2-1 نحوه تهیه درصدهای مختلف ژل های فوقانی و تحتانی در SDS-PAGE

2-6-10-2 آماده سازی نمونه
•بر اساس نوع و غلظت نمونه، از بافر نمونه به آن اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار دهید.
•نمونه ها را با استفاده از سرنگ هامیلتون در داخل چاهک ها بریزید. مقدار نمونه قرار داده شده در هر چاهک بستگی به اندازه چاهک، میزان خلوص نمونه، روش رنگ آمیزی و نوع بافر نمونه (X2و X6) دارد.
•سیستم الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل نمایید و در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، هنگامیکه نمونه داخل ژل فوقانی است از ولتاژ V60 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل تحتانی ولتاژ به V130 رسانده شود.
•پس از اتمام الکتروفورز (رسیدن رنگ نشانه به انتهای ژل)، منبع تغذیه را خاموش کنید. قالب شیشه ای را خارج کرده و فضا سازها بیرون آورده شود. با قرار دادن یکی از فضا سازها بین دو صفحه شیشه ای، شیشه بالایی را جدا نمایید.
• سپس ژل رنگ آمیزی گردد.
2-6-10-3 رنگ آمیزی ژل SDS-PAGE
به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، لازم است ژل را رنگ آمیزی نمود. روشهای مختلفی برای رنگ آمیزی ژل های SDS-PAGE وجود دارد که متداولترین آنها روش رنگ آمیزی با کوماسی بلو و یا نیترات نقره می باشد. عموماً از روش کوماسی بلو استفاده می شود زیرا که یک روش سریع و ارزان بوده و ثبات رنگ طولانی است.
استفاده از کوماسی بلو
مواد لازم
-رنگ کوماسی بلو
-الکل 96% (برای رنگ بری)
-آب مقطر
روش انجام رنگ آمیزی
•ژل را در داخل ظرف رنگ آمیزی قرار می دهیم و مقداری رنگ به آن اضافه و به مدت10 دقیقه بر روی شیکر می گذاریم.
•رنگ را خالی کرده و ژل را داخل محلول رنگ بر (آب مقطر حاوی اتانول) بر روی شیکر قرار می دهیم تا زمینه ژل شفاف شده و باندهای پروتئینی آبی رنگ نمایان شوند.
2-6-10-4 رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (پیوست 7)
•قرار دادن ژل در بافر فیکساسیون به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر.
•دور ریختن بافر فیکساسیون و اضافه نمودن بافر شستشو سه بار و هر بار به مدت 20 دقیقه.
•اضافه کردن بافر sensitizing به مدت 2 دقیقه.
•دور ریختن بافر sensitizing و شستشو با آب مقطر سه بار و هر بار 5 دقیقه.
•اضافه کردن بافر رنگزا به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر.
•شستشوی ژل در آب مقطر و اضافه کردن بافرdeveloping تا ظهور باندهای پروتئینی.
•اضافه کردن بافر متوقف کننده به مدت 15 دقیقه.
•شستشوی ژل در آب مقطر.

2-7 روشهای اختصاصی
2-7-1 سنتز ژن gcsf
توالی cDNA کد کننده پروتئین GCSF به طول bp 615 از بانک ژنومی (شماره 172219.1) استخراج و به منظور سنتز به یکی از شرکتهای فعال در این زمینه سفارش داده شد. این توالی به منظور بیان در سلولهای مخمری از نظر کدونهای مورد استفاده در سنتز پروتئین، بهینه سازی شده و پس از بررسی های نهایی از نظر جایگاه های برش آنزیم های محدودالأثر، ساخته شده و در وکتور کلونینگ pGH کلون گردید. در دو انتهای این ژن، دو جایگاه برش آنزیمی برای آنزیمهای محدودالأثر HpaI و BamHI در نظر گرفته شد تا برای جدا نمودن این قطعه و کلون کردن آن در وکتور بیانی مخمر استفاده شوند. لازم به ذکر است که جایگاه برش این آنزیم ها بر روی قطعه ژنی سنتز شده، وکتور pGH و وکتور بیانی هانسونلا وجود ندارد.
2-7-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
2-7-1-1-1 طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
به منظور انجام PCR بر روی ژن gcsf در وکتورهای بدست آمده در مراحل مختلف، پرایمرهای اختصاصی این ژن با استفاده از برنامه genrunnr سنتز گردید (جدول 2-2).

پرایمر F 'gtagatcttgcggatccccc-3-'5
پرایمر R 'gtagatcttggtctccagcttgc-3-'5
جدول 2-2: توالی پرایمرهای ژن gcsf
2-7-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
با انجام گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها به منظور بهینه سازی شرایط این واکنش مشخص گردید. این واکنش بر اساس مواد ذکر شده در جدول2-3 و بر طبق برنامه مندرج در جدول 2-4 انجام شد.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-3 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش gcsf PCR
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-4 برنامه PCR گرادیان مربوط به ژن gcsf

2-7-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
به منظور کلون نمودن قطعه ژنی gcsf، این قطعه با برش آنزیمی از وکتور کلونینگ حامل قطعه (pGH-gcsf) جدا شده و در وکتور بیانی برش خورده با همان آنزیمها وارد گردید.
2-7-2-1 هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
با توجه به جایگاههای برشی که در دو انتهای این قطعه (ژن gcsf) در نظر گرفته شد (جایگاه برش BamHI در انتهای ´5 و جایگاه‌ برش HpaI در انتهای ´۳)، این قطعه از وکتور مورد نظر (pGH-gcsf) بر اساس واکنش مندرج در جدول 2-5 در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 5 ساعت مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)


DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-5 واکنش هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
2-7-2-2 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan
وکتور pHan نیز با آنزیمهای BamHI و HpaI بر طبق جدول 2-6 مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-6 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan
2-7-2-3 کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan
واکنش لیگاسیون قطعات هضم و تخلیص شده پس از تعیین غلظت، بر طبق واکنش مندرج در جدول 2-7 انجام گرفت. تیوب ها به مدت 16 ساعت در یخچال قرار گرفته و پس از آماده سازی سلولهای مستعد از E. coli TOP10F'، به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های حاوی آمپی سیلین و تتراسایکلین کشت داده شدند.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan خطی شده (ng/µl100) 1 1
قطعه gcsf (ng/µl15) 16 -
بافر T4 DNA ligase (10X) 2 2
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 17
جدول 2-7 واکنش لیگاسیون ژن gcsf در وکتور بیانی pHan

کلنی های ظاهر شده بر روی پلیت ها، به صورت ماتریکس کشت داده شده و به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند.
2-7-2-4 بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf
•بررسی کلون ها به روش سریع
مقداری از هر کلنی بر اساس پروتوکل موجود (2-6-6) آماده سازی شده و بر روی ژل آگارز برده شد. وکتورهای سنگین تر از وکتور بیانی pHan (بدون ژن الحاقی)، به عنوان وکتورهای مشکوک گزارش گردید.
•استخراج پلاسمید در مقیاس کم
از کلنی هایی که gcsf PCR آنها مثبت گردید، بر اساس پروتوکل2-6-8 به لوله های ml5 حاوی محیط LB مایع کشت داده و پس از گرماگذاری در °C37 به مدت 16 ساعت، استخراج پلاسمید در مقیاس کم انجام گردید.
•gcsf PCR بر روی پلاسمیدهای استخراج شده pHan-gcsf
پلاسمیدهای استخراج شده در واکنش PCR ژن gcsf بر اساس پروتوکل 2-7-1-1 وارد شده و محصول PCR بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
•هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf
پلاسمید تأیید شده در مراحل قبل، مورد هضم آنزیمی با آنزیم های محدودالأثر BamHI، EcoRI و HpaI بر طبق جدول2-8 قرار گرفته و پس از گرماگذاری در C °37 به مدت 3 ساعت، محصول واکنشها بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 2
بافر آنزیمی (10X) 2
آنزیم محدودالأثر (units/µl10) 75/0
آب دیونیزه 25/15
جدول 2-8 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf
•استخراج پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf در مقیاس زیاد
پلاسمید تأیید شده با تست های فوق، بر اساس پروتوکل های2-6-9 منظور استفاده در مراحل بعدی، به مقیاس انبوه استخراج گردید.
2-7-3 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-3-1 PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)
در این تحقیق، به منظور غربالگری کلونهای هانسونلا بر آن شدیم تا ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble) را در وکتور بیانی pHan که حاوی ژن gcsf می باشد کلون نماییم. برای این منظور، توالی این ژن در وکتور pPICZα (Invitrogen, USA) موجود در بخش بیوتکنولوژی بررسی گردید و پرایمرهای لازم جهت تکثیر این ژن طراحی گردید (جدول 2-9) و جهت سنتز سفارش داده شد. پس از دریافت پرایمرها، دمای بهینه برای تکثیر این ژن، به روش PCR گرادیان، در محدوده 65-50 درجه سانتی گراد (جدول2-10) بر طبق جدول 2-11 انجام شد.
پرایمر F 5'-gtagatcttgcggatccccc-3'
پرایمر R 5'-gtagatcttggtctccagcttgc-3'
جدول 2-9 پرایمرهای طراحی شده جهت تکثیر ژن zeocin
تعداد چرخه مدت زمان (دقیقه) دما (°C)
واسرشتی اولیه 1 '5 ˚94
واسرشتی
اتصال پرایمرها
طویل شدن 35 '1
"30
"30 ˚94
60-50
˚72
طویل شدن نهایی 1 '5 ˚72
جدول 2-10 برنامه PCR گرادیان ژن zeocin
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (پلاسمید pPICZα) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-11 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش zeocin PCR
2-7-3-2 کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy
قطعه تکثیر شده zeocin با استفاده از کیت از ژل آگارز بر اساس پروتوکل 2-6-2 استخراج شده و پس از تعیین غلظت،واکنش لیگاسیون آن در وکتور کلونینگ pGEM بر طبق جدول 2-12 صورت گرفت.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pGEM-T Easy خطی (ng/µl50) 1 1
ژن zeocin (ng/µl50) 2 -
بافر T4 DNA ligase (X4) 5 5
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه 11 13
جدول 2-12 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور pGEM-T Easy

واکنشهای فوق به صورت ON در دمایC ˚4 قرار داده شدند و پس از تهیه سلولهای مستعد از سلولهای ' E. coli TOP10F ، به این سلول ها منتقل شده و بر روی محیط LB آگار با غلظت پایین NaCl (پیوست 1) و حاوی زئوسین، تتراسایکلین، IPTG و X-gal (پیوست 5) کشت داده شد. پس از گرماگذاری در 37 درجه به مدت 16 ساعت، کلنی های سفید تشکیل شده، بر روی پلیت ماتریکس حاوی ترکیبات فوق کشت داده شدند.
2-7-3-3 بررسی کلونهای نوترکیب pGEM-Zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
70% هر یک از کلنی های سفید به روش quick check (پروتوکل 2-6-6) مورد بررسی قرار گرفت.
•استخراج پلاسمید pGEM-Zeo در مقیاس کم
از کلون نوترکیب تأیید شده با دو روش قبل، استخراج پلاسمید در مقیاس کم (2-6-8) انجام گردید.
•هضم آنزیمی وکتور pGEM-Zeo
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده از مراحل قبل با آنزیم BglII به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد بر اساس جدول 2-13 صورت گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pGEM-Zeo 2
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/15
جدول 2-13 واکنش هضم آنزیمی pGEM-Zeo با BglII
2-7-4 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-4-1 هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo
برای کلون نمودن قطعه ژنی مقاومت به زئوسین در وکتور pHan-gcsf، این دو وکتور با آنزیم BglII که جایگاه برش آن در دو انتهای قطعه ژنی زئوسین و نیز بر روی وکتور pHan-gcsf در نظر گرفته شده بود، مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند (جدول 2-14).
مواد مقدار (µl)
پلاسمید 20
بافر آنزیمی (X10) 20
BglII (units/µl10) 5
آب دیونیزه 155
جدول 2-14 واکنش هضم آنزیمی pGEM-zeo و pHan-gcsf با BglII
وکتور pHan-gcsf هضم و تخلیص شده، بر اساس جدول 2-15 به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی گراد تحت تیمار با آلکالین فسفاتاز قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 60
بافر آنزیمی (X10) 8
آنزیم آلکالین فسفاتاز (units/µl10) 2
آب دیونیزه -
جدول 2-15 تیمار وکتور هضم شده pHan-gcsf با آلکالین فسفاتاز
2-7-4-2 کلون نمودن قطعه ژنی zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
پس از هضم آنزیمی، قطعه مورد نظر (ژن مقاومت به زئوسین، حدوداً bp1100( از روی ژل جدا شده و پس از تخلیص با کیت، بر طبق واکنشهای لیگاسیون جدول 2-16 در درون وکتور بیانی pHan-gcsf تیمار شده با آلکالین فسفاتاز کلون گردید.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan-gcsf خطی شده (ng/µl100) 5/1 5/1
قطعه zeocin (ng/µl15) 25 -
بافر T4 DNA ligase (X2) 3 3
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 5/24
جدول 2-16 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
واکنش‌های فوق به صورتON در دمای C˚4 قرار داده شدند و روز بعد پس از تهیه سلولهای مستعد از E. coli TOP10F' به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های LB آگار با غلظت پایین NaCl و حاوی زئوسین با غلظت µg/ml25 کشت داده شدند. پس از گذشت 16 ساعت در دمای C˚37، از کلنی های رشد یافته، پلیت ماتریکس تهیه گردید.
2-7-4-3 بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
کلونهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی زئوسین به منظور بررسی الحاق قطعه ژنی مقاومت به زئوسین بر روی ژل آگارز برده شدند.
•بررسی کلونها به روش Colony-PCR
کلونهایی که با روش سریع سنگینتر تشخیص داده شدند، برای انجام PCR اختصاصی ژن زئوسین مورد استفاده قرار گرفتند.
•برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
به منظور تأیید نهایی وکتور نوترکیب فوق، با توجه به سایت‌های برشی موجود، وکتور بر اساس جدول 2-17 با آنزیم BglII برش داده شد. مخلوط این واکنش به مدت 3 ساعت در دمای C˚37 گرماگذاری شد و سپس بر روی ژل 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 3
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/14
جدول 2-17 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با BglII
2-7-5 انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا
2-7-5-1 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin
پس از اطمینان از قرار گرفتن ژنهای مورد نظر در پلاسمید هانسونلا، انتقال این پلاسمید به درون میزبان مخمری (هانسونلا پلی مورفا) با روش الکتروپوریشن صورت گرفت. برای این منظور، به مولکول DNA خطی شده با غلظت بالا نیاز می باشد. برای تهیه DNA خطی، وکتور نوترکیب تأیید شده در مراحل قبل با آنزیم EcoRI بر طبق جدول 2-18 مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و پس از استخراج از ژل، در پروسه الکتروپوریشن مورد استفاده قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 15
بافر آنزیمی (X1) 20
EcoRI (units/µl10) 5
آب دیونیزه 160
جدول 2-18 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با EcoRI
2-7-5-2 الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا
1.ابتدا میزان مناسبی از کلنی تازه رشد یافته مخمر را به درون ml200 محیط کشت مایع YPD تلقیح نموده و محیط را بر روی شیکر در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری میکنیم تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر (OD600nm) به 2/1-8/0 برسد.
2.محیط کشت فوق را در rpm5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نموده و به میزان 2/0 برابر، بافر فسفات پتاسیم mM50 ولرم (C°37( با 5/7pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهایی mM25 به آن اضافه نمایید.
3.سلولها را به مدت 15 دقیقه در دمای C°37 قرار می دهیم.
4.سلول ها را با سانتریفوژ در rpm5000 به مدت 5 دقیقه جمع آوری نموده و دو بار با بافر STM (پیوست 7) درحالیکه سلولها بر روی یخ قرار دارند شستشو می دهیم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اولیه).
5.رسوب سلولی نهایی را در 005/0 حجم اولیه از بافر STM حل کرده و این سوسپانسیون سلولی مستعد را در حجم های کم در دمای C°70- نگهداری میکنیم.
6.به منظور ترانسفورم نمودن سلولهای مستعد، سوسپانسیون های سلولی (حجم µl60) را بر روی یخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطی شده را به آن اضافه میکنیم.
7.سپس سلولها به کووت الکتروپوریشن 2 میلی متری سرد منتقل می شوند.
8.بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوریشن قرار داده و به آن پالسی با مشخصات 2 کیلوولت، 25 میکروفاراد و 200 اهم وارد مینماییم.
9.بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محیط کشت YPD به تیوب حاوی سلولها اضافه کرده و به مدت 1ساعت در دمای °C 37 در شیکر انکوباتور قرار می دهیم.
10.محیط را سانتریفوژ نموده (rpm5000, 5دقیقه( و سلولها را بر روی محیط کشت YPD جامد حاوی زئوسین با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت 5-3 روز در دمای °C37 قرار میدهیم.
11.سلولهای رشد یافته در غلظت بالای زئوسین (µg/ml400)، به صورت ماتریکس بر روی پلیت حاوی 800 و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.
12.پس از گذشت مدت زمان لازم (3 روز) از کلونهای رشد یافته برای انجام PCR اختصاصی ژنهای کلون شده در وکتور بیانی استفاده گردید.
2-7-5-3 تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین
PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلونهای نوترکیب رشد یافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل 2-7-3-1 و جدول 2-13 انجام گردید.
2-7-6 بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
2-7-6-1 کشت سلولهای مخمری
1.سلول مخمری تأیید شده با PCR ژن زئوسین و نیز سلول مخمری فاقد پلاسمید در ml5 محیط کشت BMGY (پیوست 1) کشت داده شده و بر روی شیکر در دمای С °30 با دور rpm200 قرار داده شد تا OD600 محیط به 6-2 برسد (حدود 18-16 ساعت).
2.محیط کشت فوق را در g3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نمودیم.
3.رسوب سلولی را در 30 میلی لیتر محیط BMMY (پیوست 1)، اختصاصی جهت بیان پروتئین های نوترکیب با اتانول حل نموده و مجدداً برای ادامه رشد در انکوباتور قرار دادیم.
4.پس از گذشت 24 ساعت، از متانول 100% به غلظت نهایی 5/0% به محیط اضافه نمودیم تا بیان پروتئین القاء گردد.
5.پس از گذشت مدت زمان 96 ساعت از شروع کشت، محیط بیانی را در دور rpm6000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوز مینماییم.
6.محلول رویی را به تیوب جدید منتقل نموده و پس از اندازه گیری غلظت پروتئینی در 280 نانومتر، اقدام به تغلیظ این محلول به منظور بررسی با SDS-PAGE می نماییم.
7.محلول فوق را با عبور از فیلترهای Centriprep YM50 بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده تغلیظ می نماییم.
2-7-6-2 بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE
•ژل SDS-PAGE 15% بر اساس روش ذکر شده در بخش2-6-10 تهیه گردید.
•پس از انجام الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل، میزان بیان پروتئین نوترکیب با روش کوماسی بلو بر اساس شدت باند حاصله مورد بررسی قرار گرفت.
2-7-7 تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش
تولید آنتی بادی پلی کلونال به روشهایی برای معرفی یک ایمونوژن به حیوان و خونگیری برای سنجش میزان آنتی بادی نیاز دارد. انتخاب حیوان بستگی به امکانات موجود در نگهداری حیوان، میزان آنتی سرم مورد نیاز و میزان ایمونوژن موجود، دارد. پاسخ ایمنی بهتر، عموماً زمانی بدست می آید که از یک ادجوان مناسب در اولین ایمنی زایی استفاده گردد. برای این منظور، ایمونوژن بصورت یک امولسیون آب و روغن آماده می شود که حاوی میکوباکتریوم کشته شده با حرارت می باشد که تحت عنوان آدجوان کامل فروند معرفی می گردد. استفاده از این امولسیون فرد را مطمئن می کند که آنتی ژن به آرامی در جریان خون حیوان آزاد می شود و از طرفی باکتریهای کشته شده میکوباکتریوم، سیستم ایمنی حیوان را تحریک می کنند. ایمن سازی های بعدی، برای افزایش سطح آنتی بادی لازم اند و در بافر فسفات سالین (PBS) یا در امولسیون روغنی (ادجوان ناقص فروند ) مصرف می شوند (Johnstone, 1996).
روشهای مختلفی برای تزریق ایمونوژن وجود دارد (Johnstone, 1996) که عبارتند از :
1)درون ماهیچه ای (i.m=Intra muscular)
2)درون رگی (i.v = Intra venous)
3)درون پوستی (i.d = Intra dermal)
4)درون صفاقی (i.p = Intra peritoneal)
5)زیر پوستی (s.c = Sub cutaneous)
ایمن سازی درون پوستی یک روش مؤثر در ایجاد پاسخ اولیه است. روشهای i.m و i.d و یا s.c بهتر است در چندین محل مختلف صورت گیرند.
در مورد خرگوشها، در اولین ایمن سازی به μg200-50 پروتئین در FCA نیاز است که باید به صورت درون پوستی به 8-6 جای مختلف از پشت حیوان تزریق گردد. تزریقهای بعدی با فاصله 28 روز یا بیشتر، با 200-50 میکروگرم پروتئین آماده شده در PBS یا FIA به فرم i.m یا i.v یا s.c صورت می گیرد (Johnstone, 1996).
1) اولین تزریق:
•براساس غلظت نمونه پروتئینی مورد نظر (پروتئین GCSF نوترکیب موجود در بازار دارویی (ساخت شرکت پویش دارو)، l85 از ویال (200 میکروگرم) را برداشته و با l415 از PBS استریل مخلوط کرده و آن را با μl500 ادجوان کامل فروند مخلوط کرده و با emulsifier آنقدر این دو ماده را مخلوط کردیم تا شیری رنگ و سفت شد.
•قبل از اولین تزریق،ml 1 خون از حیوان گرفته شد تا به عنوان کنترل منفی (قبل از تزریق) از آن استفاده شود.
•این نمونه در rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید و سرم از گلبول های قرمز جدا گردید. سرم را در تیوب جدید ریخته و در 20- درجه سانتیگراد نگهداشتیم.
•محلول آماده شده از آنتی ژن در FCA به 8 جای مختلف از پشت خرگوش به صورت درون پوستی تزریق گردید.
2) دومین تزریق:
•سی روز پس از اولین تزریق، دومین تزریق به خرگوش باμl 85 از نمونه پروتئینی (200 میکروگرم) در μl415 PBS استریل با μl 500 ادجوان ناقص فروند مجدداً به صورت درون پوستی صورت گرفت.
•30 روز بعد، ml1 خون از حیوان گرفته شد تا از نظر ایمنی زایی تزریقهای فوق با روش ایمونوبلاتینگ، مورد بررسی قرار بگیرد.
2-7-8 ایمونوبلاتینگ
برای شناسایی پروتئین های اختصاصی از طریق آنتی بادی های پلی کلونال یا مونو کلونال، از لکه گذاری ایمنی استفاده می شود. در روش لکه گذاری ایمنی نمونه های پروتئینی در حضور ماده SDS و عوامل احیاء کننده (مانند 2- مرکاپتواتانول) الکتروفورز شده و سپس از روی ژل به غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی منتقل می گردند و با استفاده از آنتی بادی های نشاندار شده شناسایی می شوند. برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء از روش هایی مانند روش تانک و یا روش نیمه خشک استفاده می شود. در روش انتقال با تانک، از بافر حاوی تریس -گلایسین و متانول استفاده می شود که متانول علاوه بر اینکه از تورم ژل جلوگیری می کند، باعث جدا شدن SDS از پروتئین ها شده و بازده اتصال پروتئین به غشاء را افزایش می دهد. در روش انتقال نیمه خشک، ساندویچ انتقال پس از خیس شدن در بافر انتقال، بین دو الکترود بزرگ گرانیتی قرار گرفته و عمل انتقال انجام می گیرد (Sambrook, 2001).
در اینجا روش انتقال با روش نیمه خشک توضیح داده می شود.
مواد لازم
-غشاء نیتروسلولز با منافذ 45/0 میکرومتری
-کاغذ واتمن
-بافر انتقال (شامل تریس بازی، گلایسین، متانول و آب مقطر می باشد، پیوست 8).
-دستگاه Semidry
-رنگ پانسوS
روش انجام کار
•نمونه پروتئینی در مجاورت مارکر پروتئینی با روش SDS-PAGE، الکتروفورز شد.
•به مدت 30 دقیقه ژل در بافر انتقال قرار داده شد تا از تغییر حجم ژل در هنگام انتقال جلوگیری شود.
•غشای نیترو سلولزی را به اندازه ژل برش زده و در بافر انتقال قرار می دهیم.
•چندین لایه کاغذ واتمن (هم اندازه با ژل) را در ظرف حاوی بافر انتقال، مرطوب کرده و سپس کاغذ ها روی صفحه گرانیتی دستگاه بلاتینگ با سیستم نیمه خشک گذاشته شد ( با غلتاندن یک میله شیشه ای حباب های احتمالی بین کاغذها خارج گردید).
•غشای نیترو سلولز خیس شده به آرامی به گونه ای که حبابی تشکیل نگردد بر روی کاغذ های واتمن قرار داده شد. سپس ژل مورد نظر را را به گونه ای که حباب تشکیل نگردد به آرامی روی کاغذ قرار دادیم.
•مجدداً چند لایه کاغذ واتمن خیس شده در بافر انتقال، روی ژل قرار داده شد و با غلتاندن میله شیشه ای، حباب های احتمالی را خارج نمودیم.
•درب دستگاه را بسته و دستگاه را به جریان برق متصل نمودیم و با توجه به اندازه پروتئین، ولتاژ ثابت و زمان انتقال دستگاه تنظیم شد.
•پس از اتمام زمان انتقال، کاغذ نیتروسلولز با رنگ پانسوS رنگ آمیزی شد تا باندهای پروتئینی ظاهر گردند. از طرفی باندهای مارکر پروتئینی نیز علامت گذاری گردیدند. سپس غشاء با آب مقطر شسته شد تا رنگ پانسوS آن از بین برود.
•غشاء نیتروسلولز به مدت 1 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر در بافر بلوکه کننده قرار گرفت. سپس به مدت 16 ساعت در 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
نکته: به منظور بلوکه کردن غشاء در نواحی که فاقد پروتئین است می توان از شیر خشک بدون چربی و یا آلبومین سرم گاوی (BSA) محلول در بافر PBS دارای توئین20 استفاده کرد.
•آنتی بادی اولیه، سرم خرگوشی رقیق شده به نسبت 1 به 500 در PBS بود. این آنتی بادی به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•غشاء 5 بار 10 دقیقه ای در TTBS بر روی شیکر شسته شد.
•آنتی بادی دوم، Goat anti Rabbit IgG کونژوگه با HRP بود که به نسبت 1 به 1000 در PBS رقیق شده بود. این آنتی بادی به مدت 1 ساعت بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•بعد از اتمام زمان انکوباسیون در آنتی بادی ثانویه، کاغذ پنج بار 10 دقیقه ای با PBS حاوی 05/0% توئین 20 شستشو داده شد.
•کاغذ به مدت 10 دقیقه با بافر PBS بدون توئین شستشو داده شد.
•کاغذ نیتروسلولز در محلول سوبسترای آنزیم نشاندار (DAB) گذاشته شد تا باندهای مورد نظر نمایان گردند.
•پس از نمایان شدن باندها، کاغذ با آب مقطر چند بار شستشو داده شد و سپس کاغذ را خشک کرده و در جای تاریک نگهداری گردید.
فصل سوم نتایج
3-1 سنتز ژن gcsf
cDNA کد کننده پروتئین GCSF پس از بهینه سازی کدونها برای بیان در سلول مخمری به یکی از شرکت های مرتبط سفارش داده شد و توالی سنتز شده در وکتور کلونینگ pGH به گروه تحویل داده شد (شکل 3-1).

شکل 3-1 طرح شماتیک وکتور کلونینگ حاوی ژن gcsf
3-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
3-1-1-1طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
با توجه به این که جایگاه برش آنزیم‌های BamHΙ و HpaI در توالی ژن هدف، gcsf، و نیز وکتور بیانی طراحی شده وجود ندارد، این دو جایگاه بر روی توالی پرایمرهای F و R تعبیه شدند. طراحی پرایمرها با بررسی نکات کلیدی در زمینه عدم تشکیل فرم سنجاق سری ، دایمرهای پرایمری و سایر ساختارهای ثانویه با استفاده از نرم‌افزار genrunnr انجام شد. نتایج حاصل از بررسی پرایمرها در این نرم‌افزار در شکل‌های 3-2 الف و ب آورده شده است.

(الف) (ب)
شکل3-2 بررسی توالی پرایمرهای F (الف) و R (ب) ژن gcsf.
3-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها و تکثیر ژن gcsf را 60 درجه سانتی گراد نشان داد (شکل 3-3).
17856203187708 7 6 5 4 3 2 1
008 7 6 5 4 3 2 1

شکل 3-3 PCR گرادیان ژن مقاومت به gcsf
چاهک 7-1: محصول PCR در دماهای 50 تا 60 درجه سانتی گراد
چاهک 5: مارکر DNA (kb1)
چاهک 8: کنترل منفی PCR
3-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
3-2-1 هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan
به دنبال هضم آنزیمی این وکتورها با آنزیمهای BamHI و HpaI، در مورد وکتور کلونینگ، بر روی ژل آگارز قطعه ژنی gcsf به طول تقریبی bp615 و وکتور کلونینگ pGH به طول تقریبی bp2900 مشاهده شد در حالیکه در مورد وکتور بیانی، وکتور خطی شده ای به طول حدوداً 6500 نوکلئوتید بر روی ژل ظاهر گردید (شکل 3-4).
191262065405 5 4 3 2 1
00 5 4 3 2 1

شکل 3-4 هضم آنزیمی وکتورهای pGH-gcsf و pHan با آنزیم های HpaI و BamHI

aslinezhad project

فصل دوم: تقریبی برای طراحی و بکار بستن کوپلر خط شاخهای
تک بانده و دو بانده πو T شکل28
(1-2مدار خط شاخهای اندازه فشرده T شکل29
(2-2طراحی و بکار بستن مدار T شکل و رسم منحنی مشخصه آن33
(3-2 کوپلر خط شاخهای36
(4-2 فرموله کردن با استفاده از ماتریس خطوط انتقال37
۶
(5-2 نتایج شبیهسازی مدار π شکل بدون استفاده از استاب41
(6-2 تحقق جهت دو بانده کردن مدار43
(1 -6-2 استفاده از استاب مدار باز ( ربع طول موج)43
λ
(2-6-2 استفاده از مدار اتصال کوتاه ( طول 44( 2

(7-2 آنالیز(تحلیل) مدار π شکل خط شاخهای دوبانده و مشاهده نتایج شبیهسازی46
فصل سوم: طراحی مدار میکرواستریپ فشردهT شکل دوبانده با
اندازه کاهش یافته.50
(1-3 دوبانده کردن مدار T شکل خط شاخهای کوچک شده با توجه به روند ارائه شده در
دو بانده کردن کوپلرπ شکل ( 900MHz و 51(2400MHz
(2-3 استفاده از برنامه کامپیوتری ساده جهت بدست آوردن پارامترهای مدار دو بانده52
(3-3 آنالیز(تحلیل) مدار T شکل دو بانده در چند محیط ( نرم افزار) مختلف و مشاهده
نتایج53
فصل چهارم: بررسی انواع مختلف DGS و اثرات آن بر روی
خطوط میکرواستریپ59
DGS (1-4 چیست60
( 2 – 4 مشخصات کلی 60 .DGS
( 3 – 4 کاربردهای 61DGS
٧
( 4 – 4 ویژگیهای 61DGS
( 5 – 4 اثر DGS دمبلی شکل بر روی خطوط میکرواستریپ....61
( 1 – 5 – 4 الگوی .DGSدمبلی شکل و ویژگی شکاف باند63
DGS ( 2 – 5 – 4 دمبلی پریودیک قویتر64
( 3 – 5 – 4 اندازهگیریهای مربوط به DGS دمبلی شکل..66
( 6 – 4 بررسی اثرات DGSهای هلزونی در تقسیم کننده توان بر روی هارمونیکها68
-7-4مدل مداری و هندسه DGS هلزونی غیرمتقارن70
( 8 – 4 حذفهارمونیکهادر مدار مقسم توان73
( 9 – 4 مشاهده اثرات DGS برروی کوپلر T شکل در یک باندفرکانسی78
( 10 – 4 مشاهده اثرات DGS برروی مدار دو بانده طراحی شده80
فصل پنجم:چگونگی استفاده از کوپلر بدست آمده در طراحی
سیرکولاتور82
(1-5طراحی سیرکولاتور83
(2-5مدار معادل برای سیرکولاتور با استفاده از یک ژیراتور و دو کوپلر83
فصل ششم:نتیجه گیری وپیشنهادات86
(1-6نتیجه گیری87
(2-6پیشنهادات88
٨
پیوست ها................................................................................................................................... 89
٩
فهرست مطالب
عنوان مطالبشماره صفحه

منابع و ماخذ. 93
سایتهای اطلاع رسانی97.
چکیده انگلیسی98
١٠
فهرست جدول ها
عنوانشماره صفحه

:(1-2)مشخصات الکتریکی وفیزیکی مدار در دو باند..47
(1-3) دو بازه فرکانسی و دو هدف مورد نظر پروژه..55
(2-3.) بازه بالا و پایین جهت optimom هدف.56
(1–4)مقایسه اثر DGSهای واحد و پریودیک با توزیع نمایی..66
١١
فهرست شکل ها
عنوانشماره صفحه

(a) ( 1 – 1) خط انتقال مرسوم (b) خط انتقال معادل با سری شدن یک خط و
استاب (c) مدل معادل المانهای فشرده برای محاسبه فرکانس قطع23
(a) ( 2 – 1) سرس خطوط انتقال کوچک شده با چندین استاب
باز (b) بزرگی پاسخ.25
( 3 – 1) نمایی از نرم افزار Serenade. RTL جهت بدست آورن طول
فیزیکی و پنهای خطوط.26
( 1-2 ) ساختار T شکل خط انتقال ربع طول موج30
( 2-2 ) منحنی رسم شده حاصل از برنامه کامپیوتری θ1)بر حسب32.(θ3
( 3-2 ) مدار چاپی خط شانهای T شکل34
S11 (a) ( 4-2)،S12،S13،(b) S14 پاسخ فازی مدار Tخط شاخهای35
(5-2) ساختار کوپلر خط شاخه ای یک بانده مرسوم.38
(a) ( 6 – 2) ساختار معادل پیشنهادی (b) خط شاخهای 38. λ4

S11 ( 7-2 )،S12،S13وS14 از کوپلر بدون استاب42
( 8-2 ) پاسخ زاویهS12وS14 برای مدار بدون استاب42
( 9-2 ) ساختار کوپلر پیشنهادی با استاب مدار باز44
١٢
( 10-2 ) ساختار کوپلر پشنهادی با استاب اتصال کوتاه ........................................................ 45
11-2 ) ) نتایج شبیه سازی .................................................................................. ...(S11) 47
12-2 ) ) نتایج شبیه سازی(S12و............................................................................ .(S13 48
( ( 13-2 نتایج شبیه سازی .................................................................................... .(S14) 48
14-2 ) )نتایج شبیه سازی (پاسخ فاز مدار با استاب باز) ................................................... 49
( (a) ( 1-3 شماتیک (b) مدار چاپی ................................ (designer, hfss) ansoft 55
( S11(a) ( 2-3،S12،S13وS14 مدار شبیه سازی شده در .....................................................................ADS (c) serenade (b) ansoft (a) 57
( 3-3 ) پاسخ فازی مدار دو بانده. ....................................................................................... 58
1-4 ) ) شمای مختلف H (a) DGS شکل T ( b)شکل (c)هلزونی شکل (d) دمبلی شکل. ......................................................................................................... 60
( 2-4 ) خط میکرواستریپ با εr = 15 و ................... ................................ h = 1/575 62
( 3-4 ) پارامترهای S مدار دوپورته.. ................................................................................ 62
( 4-4 ) مدار با DGS دمبلی شکل .. ............................................................................... 63
( 5-4 ) پارامترهای S مدار با DGS دمبلی شکل ............................................................ 63
( 6-4 (a) ( نوع (b) 1 نوع (c) 24 نوع DGS 3 دمبلی شکل ...................................... 65
( 7-4 ) پارامترهای S برای DGS دمبلی با انواع مختلف سایز. ....................................... 66
( 8-4 ) مقایسه پارامترهای S مدارهای (a) DGS نوع (b) نوع (c) 2 نوع 67 ............. ..3
١٣
( 9-4 ) خط میکرواستریپ با DGS هلزونی نامتقارن برروی زمین. ............................... 70
( 10-4 ) پارامترهای انتقال خط با DGS متقارن ( A = A' = B' = 3mm و نامتقارن A = 3/4m) و ............................................................................(B = 2/6 mm 71
11-4 ) ) فرکانس روزنانس ناشی از بر هم زدگی سمت چپ و راست خط بر حسب تابعی از ...................................................................................................................... .B/A 71
12-4 ) ) مدار معادل بخش DGS هلزونی نامتقارن ........................................................ 73
13-4 ) DGS (a) ( هلزونی نامتقارن برای حذف هارمونیک دوم و سوم (b) مدار معادل ساختار این ......................................................................................DGS 74
( 14-4 ) پارامترهای S مدار با DGS هلزونی بصورت EM و شبیه سازی شماتیک ........ 75
15-4 ) ) هندسیای از (a) مقسم توان ویل کنیسن معمولی (b) مقسم توان با DGS نامتقارن....................................................................................................................... 76
( 16-4 ) نتایج شبیه سازی (a) پارامتر S مقسم توان معمولی S (b) برای مقسم توان با ....................................................................................................................... ..DGS 77
17-4 ) ) مقسم توان willkinson با DGS هلزونی نامتقارن (a) روی مدار (b) پشت مدار...................................................................................................................... 77
( 18-4 ) نتیجه شبیه سازی مقسم توان با DGS هلزونی نامتقارن(.......... S12 ( b) S11 (a 78
( 19-4 ) مدار T شکل با استفاده از DGS هلزونی (a) یک بعدی (b) سه بعدی.......... 79
20-4 ) (a) ( نتیجه پاسخ شبیه سازی کوپلر با استفاده از اعمال (b) DGS بدون ١۴
استفاده از 80DGS
( 21-4 ) مدار چهار پورتی T شکل دوبانده با اعمال DGS دمبلی شکل در
شاخه خطوط..81
( 22-4) پارامترهای S حاصل از بکار بستن 81DGS
(1-5)نماد ژیراتور83
( 2-5)سیرکولاتور 4 پورته متشکل از دو مدار هیبریدی و زیراتور83
(3-5) سیرکولاتور ساخته شده با استفاده از دو کوپلر و یک ژیراتور84
(a)(4-5)،((b،((cو(:(dنتایج شبیه سازی سیرکولاتور85
(1-6)شبکه دو قطبی خطی. 91
١۵
چکیده:
در این پروژه سیرکولاتور دو بانده با ابعاد کوچک ارائه شـده اسـت. در طراحـی سـیرکولاتور مـورد نظـر از
کوپلر شاخه ای (BLC)1 میکرواستریپی دو بانده کوچک شده استفاده شده است . لذا در این پـروژه بیـشتر
بر روی چگونگی کوچک سازی و دو بانده کردن کوپلر شاخه ای میکرواستریپی با اسـتفاده از مـدارات T و
همچنین DGS2 متمرکز شده ایم . در کوپلر شاخه ای پیشنهادی از مدارات T در هر شاخه که دارای طـول
الکتریکی ±90 درجه در دو بانده می باشند ، استفاده شده است. از طرفی در صفحه زمـین در زیـر خطـوط
این کوپلر DGS هایی قرار دارند که با استفاده از این DGSها ، طول الکتریکی خطوط کاهش یافته و ابعاد
کوچکتر می گردند. کوپلر دو بانده کوچک شده توسط نرم افزارهایSerenadeوADS3وAnsoft تحلیـل
شده و نتایج شبیه سازی در این پروژه آورده شده اند. سپس با استفاده از کوپلرهای دو بانده کوچک شـده ،
سیرکولاتور مورد نظر طراحی گردیده است.

Branch line coupler١ Defected ground structure٢ Advance designe sys--٣
١۶
مقدمه:
امروزه تقاضا برای استفاده از عناصر دو بانده در صنعت مخابرات رو به افزایش است . سیستمهای مخابرات
با آنتن های دو بانده کاربرد زیادی دارند. سیرکولاتور یکی از عناصر اصلی در چنین سیستم هایی اسـت. بـا
استفاده از سیرکولاتور دو بانده می توان از یک تغذیه بین آنتن و سیستم مخـابراتی اسـتفاده نمـود. یکـی از
اجزای اصلی در ساخت سیرکولاتورهای چهار پورتی ، کوپلرهای هایبریدی و کوپلرهای شاخه ای((BLC
می باشند.
(BLC) از چهار خط انتقال به طول ربع طول موج مؤثر در فرکانس اصلی و هارمونیک هایی کار می کنـد.
.[1] ,[2]
معمولا این کوپلرها بزرگ هستند و سطح و فضای اشغال شده توسط آن ها زیاد است. در اکثـر کاربردهـای
امروز به خصوص در بردهای صفحه ای و میکرواستریپی ، این عیب محسوب می شود. لذا ، امـروزه روش
های مختلفی برای کوچک سازی و افزایش پهنای باند]٣[7- این کوپلرها ارائه شده است.
در مخابرات مدرن امروزی نیاز به اجزاء دو بانده بالاخص کوپلر BLC دو بانده ، می باشد تا مقدار عناصـر
مورد استفاده ،کاهش یابد.
] Hsiang٨[ از خطوط چپگرد برای دو بانده کردن کوپلر استفاده کرده است.BLC شامل خطـوط متـصل
شده به یک جفت المان موازی]١١[ گزارش شده است.
در این پروژه با استفاده از روشـهای کوچـک سـازیBLC و ترکیـب آن هـا بـا روشـهای دو بانـده سـازی
ابتداBLC با ابعاد کوچک در دو بانده 900Mhzو2400Mhz طراحی شده است سپس برای کاهش بیـشتر
سطحBLCصفحه ای ازDGS ها استفاده شده است.
١٧
گزارش ارائه شده از نمونه طراحی سیرکولاتور مورد نظر شامل قسمت های زیر می باشد:
در فصل اول کلیاتی در مورد مراحل انجام پروژه ،هدف از انجام مراحل کار ، پیشینه تحقیقهای انجـام شـده
در مورد مدارمورد نظر و روش کمی کار مورد بررسی قرار گرفته است.
در فصل دوم ابتدا نحوه افزایش پهنای باند کوپلرها ، کوچک سازی با استفاده از مدارT و استفاده از مـدارπ
بــرای دو بانــده کــردن کوپلربررســی شــده اســت. ســپس بــا اســتفاده از نــرم افزارهــای تخصــصی
مانندSerenadeوAnsoft مدارات ذکر شده تحلیل گشته و نتایج شبیه سازی آورده شده اند.
در ادامه کوپلر کوچک شده با استفاده از مدارT ، با توجه به روند ارائـه شـده در دو بانـده کـردن کـوپلر بـا
مدارπ ، در فصل سوم دو بانده شده و روابط حاصل برای دو بانده کردن آن به دست آمده است.
کوپلر به دست آمده با استفاده از نـرم افـزار ADSوSerenadeوAnsoft تحلیـل و بهینـه گـشته اسـت و
منحنی های مربوط به آن در این فصل آورده شده اند.
در فصل چهارم DGS به عنوان ابزاری برای کوچک سازی مدارات صفحه ای شرح داده شده و از آن برای
کوچکتر کردن ابعاد کوپلر دو بانده استفاده شده است . نتایج شبیه سـازی کـوپلر حاصـل ، نـشان داده شـده
است. چگونگی استفاده از کوپلر به دست آمده در طراحی سیرکولاتور در فصل پنجم شرح داده شده اسـت
و در آخر در فصل ششم نتیجه گیری و پیشنهاداتی برای ادامه کار آورده شده است.
١٨
فصل اول:
کلیات
١٩
(1-1 هدف
کوپلرهای شاخهای با بکار بستن استابها ( مدارباز – مدار کوتاه) نیزو با Cascade شدن یک سـری شـاخه
برکاستن حجم و بالا رفتن پهنای باند نقش بسازیی را دارند. همچنین المانهای فشرده به ما امکـان کـوچکتر
کردن مدار را میدهند و با عث افزایش باند میگردند منتهی برای ساخت مدار نهایی با کـاهش سـایز کلـی و
افزایش پهنای باند و بکار بردن کوپلینگ مناسب در سرهای مدار و ایزوله کردن پورتها از همدیگر مـیتـوان
از روش مناسب بکار بردن DGS و نتیجتاً افزایش اندوکتانس خطوط و در نتیجه اهداف مطلوب دسترسـی
پیدا کرد.
در این پروژه هدف کلی رسیدن به ساختار فشرده و نیز استفاده از مدار میکرواستریپی در دو بانـد فرکانـسی
دلخواه و نیز افزایش هر یک از باندهای فرکانسی می باشد. و عـلاوه بـر ایـن بـا بکـار بـستن ( defected
ground structure) DGS بر روی زمین مدار شاهد اثرات مثبت آن برروی دستیابی باند فرکانسی مورد
نظر و نتیجتاً کاهش سایز مدار و خواهیم بود.
(2-1 پیشینه تحقیق
با توجه به ساختار مدار این پروژه و هدف مورد نظـر تحقیقهـایی مـورد نظـر بـودهانـد کـه بیـشتر در بـاره
Compact و فشرده سازی المانها، افزایش پهنـای بانـد، از بـین بـردن هارمونیکهـای اضـافی و اسـتفاده از
DGS میباشد.
در[1] افزایش پهنای باند مدارهای هایبرید با استفاده از اتصال خطوط شاخهای و استفاده از اسـتابهای مـدار
λ
باز در دو انتهای خط میکرواستریپ و معادل قرار داده خط با خط انتقال 4 جهت کاهش ابعاد مورد بررسی

قرار گرفته است.
٢٠
فعالیتهای گستردهای در جهت طراحی و بکاربردن کوپلرها و سـیرکولاتورهای صـفحهای فـشرده دردو بانـد
مورد دلخواه بعنوان مثال در پروژه - ریسرچ[2]انجام گردیده است که در فصل دوم نتایج حاصل از شـبیه سـازی ایـن
گونه کوپلرها و استفاده از ماترسیهای انتقال و نوشتن برنامه کامپیوتری جهت استفاده در دو فرکانس دلخـواه
مورد بررسی خواهند گرفت.
در مورد کاهش بیشتر سایز کوپلرها در حدود 45% مقدار کوپلرهـای مرسـوم خـط شـاخه ای و بـا مـدل T
شکل فعالیتهایی در مقالات گوناگون [3] تنها در یک باند فرکانسی مطرح گردیده است که در فصل بعدی
نیز این پروژه - ریسرچو نتایج شبیه سازی آن با نرمافزارهای گوناگون مورد بررسی قرار می گیرند.
یکی از مسائل مهم در چند قطبیهای میکرواستریپ مسئله کاهش اندازه بـوده کـه بـا توجـه بـه اسـتفاده از
المانهای باند و کاهش حجم مدار نیز استفاده از (defected ground structure) DGS مـیباشـد. ایـن
کار باعث از بین بردن هارمونیکهای اضافی و نتیجتاً کاهش اندوکتانس مدار و بالا بردن پهنای باند و کاهش
سایز مدار با کم کردن المانهـای مـوازی مـیگـردد. در ایـن زمینـه نیـز فعالیـتهـای گـسترده و اسـتفاده از
DGSهای مختلف صورت گرفته است [2]و[4]و[21]و .[22]
که اثرات تک DGS و نیـز DGS دمبلـی پریـود یـک را بـر روی پارامترهـای اسـکترینگ یـک خـط
میکرواستریپ دو پورتی ،بررسی شده است.
همچنین در[21] کاربرد DGS برروی خطوط یک کوپلر و تأثیر آن برروی پاسخ شبیه سـازی بـرروی ایـن
مدار در نرمافزار Ansoft بررسی گردیده است.
علاوه[23] نیز اثرات DGS هلزونی برروی حذف هارمونیکها و پهنای باند در یک تقسیم کننده توان ویـل
کینسن را مورد بررسی قرار داده است که در این پروژه در انتهای از این نوع DGS در زیـر خطـوط کـوپلر
خط شاخه ای تک بانده استفاده گردیده و نتایج آن آورده شده است.
٢١
و اثرات شکلهای گوناگون [21]DGSو[22]و[23]و مدل کردن مداری آنها بـرروی کـوپلر، سـیرکولاتور و
تقسیم کنندههای توان و به طور کلی خطوط میکرواستریپ را بررسی میکنند که در فصلهای بعـدی در ایـن
مورد به طور مفصل توضیح داده شده و نتایج حاصل از شبیه سازی نیز آورده شده است.
( 3 – 1 روش کار و تحقیق
در این پروژه روش کار و تحقیقهای انجام شده جهت رسیدن به هدف مورد نظر یعنـی اسـتفاده از دو بانـد
فرکانسی دلخواه کاهش حجم مدار بالابردن ضریب کوپلینگ نیز بـه صـورت اسـتفاده از مراجـع و منـابع و
مشاهده نتایج حاصله از این کارها بوده و بعد از برقراری لینک مورد نظر این منبع مـورد بررسـی بـا هـدف
نهایی به آیتم بعدی پروژه - ریسرچمربوط به مرجعهای اولیه پرداخته شده است. در بخشهای بعدی این مراحل عنوان
میگردند.
( 1 – 3 – 1 بررسی هایبرید خط شاخهای فشرده باند پهن:
در این مرحله نیز خط میکرواسـتریپ Zc4 بـا طـول الکتریکـی θ نیـز کـه در شـکل (1 – 1) (a) مـشاهده
میگردد به صورت یک خط انتقال مرسوم با المانهای توزیع شده فشرده معادل آن نیز مدل گردیده است[9]
و با بکار بردن فرمول ماتریس ABCD5 مدار معادل مشاهده شده در شکل (1 – 1) ( b) میتوانـد اسـتنباط
گردد. با معادلات ماتریس ABCD در شکل (1 – 1) به نتایج زیر دسترسی پیدا میکنیم.
(1 – 1)
JB01  J tan θ01 / Z 01

امپدانس خط معادل
ماتریس انتقال خط
٢٢
که B01 امپدانس ورودی استاب مدار باز است و٠١θ طول الکتریکی استاب مدار باز است.
و با در دست داشتن ادمیتانس ورودی استاب مدار باز شکل (b ) ( 1 – 1) به معادلات زیر میرسیم
(2 – 1) cosθs −cosθ B01  Z c sin θ (3 – 1) Zc sinθ Zs  sinθs که ≤θs≤θ≤1٠ می باشد و همانطوری که در شکل((1-1 دیـده میـشود θs طـول خـط بـین دو اسـتاب در
مدارπ است.

شکل (a ) (1 – 1) خط انتقال مرسوم (b) خط انتقال معادل با سری شدن یک خط و استاب (c) مدل معادل المانهای فشرده برای محاسبه فرکانس قطع
٢٣
ما همچنین میتوانیم فرکانس قطع برای ساختار فیلتر مانند شکل (b ) ( 1 – 1) و مـدار معـادل آن در شـکل
(c) (1-1) به صورت زیر بدست آوریم:
(4 – 1)
1 Wc  Leq Ceq
(5 – 1)
1  Wc )ZsSinθs tan(θs / 2)  Cosθs − Cosθ 2( W0 Zs Zc Sinθ
که در Wc فرکانس قطع مدار معادل نشان داده شده شکل (b ) ( 1 – 1) و Wo فرکانس کار مرکـزی مـدار
مورد نظر با المانهای فشرده معادل 7Ceq, Leq6 میباشند.
حال در اینجا برای بالا رفتن پهنای باند و عریض کردن باند فرکانسی دلخواه، با استاب مدار بـاز بـه خـوبی
طول واحد خطوط سری با یکدیگر بوده و مدل کردن خط میکرواستریپ با خطوط معـادل بـا اسـتابهـای
مدار باز سری همانطور که در شکل (2 – 1) نشان داده شده باعث کم شدن امپدانس استاب بـاز و افـزایش
فرکانس قطع (fc) میگردد.

۶ سلف ٧خازن معادل
٢۴

شکل((a) ( 2 – 1 سری خطوط انتقال کوچک شده با چندین استاب باز (b) بزرگی پاسخ
با مشاهده پارامترهای S این مدار در شکل (b ) (2 – 1) از این مدارات میتوان جهت بالا بردن باند فرکانس
و نیز استفاده مدار دو باند فرکانسی دلخواه،اسنفاده گردد.
( 2 – 3 – 1 بررسی کوپلر خط شاخهای دو بانده(:(2000/900
در اینجا نیز با ایده گرفتن از کار قبلی و استفاده از ماتریسهای ABCD که در فصل بعدی آورده شده زمینه
جهت استفاده از کوپلر خط شاخهای Tشکل با حجم کم و باند فرکانسی دو بانده کـه در فـصل سـوم آمـده
فراهم میگردد.
٢۵
( 3 – 3 – 1 شبیه سازی کوپلر دو بانده خط شاخهای T شکل
در این قسمت با ایده گرفتن از روشهای قبلـی کـه در فـصلهای بعـد توضـیح داده مـیشـود از ماتریـسهای
ABCD استفاده شده و بعد از نوشتن برنامه کامپیوتری زمینه جهت استفاده از المانهای فـشرده در دو بانـد
فرکانسی دلخواه فراهم گردیده است. از بدست آوردن مقادیر Z و θ که امپدانس مشخصه خطـوط و طـول
الکتریکی آنها هستند با استفاده از فرمولهای موجود در بازههای مختلف که در منابع مختلـف هـم آمـدهانـد
طول و پنهای خطوط چند پورتی مورد نظر بدست میآید که در این پروژه از serenade استفاده شده است
و این مقادیر با دادن فرکانس کار، مشخصه دی الکتریک مورد نظر و امپدانس و طول الکتریکی خط نیـز بـه
سادگی بدست میآیند. در شکل (3 – 1) شمای کلی این نرم افزار آمده است.

شکل :(3 – 1) شمایی از نرمافزار serenade جهت بدست آوردن طول و پنهای خطوط
٢۶
با بستن مدار فوق در نرم افزارهای مختلف نتـایج شـبیهسـازی را مـشاده و در صـورت عـدم نتیجـهگیـری
همانطور که در فصل سوم آمده آنرا optimum میکنیم. در نهایت با ایده گرفتن از کارهای انجـام شـده در
مقالات مختلف DGS های گوناگون را بکار گرفته و نتایج حاصل از آن را آوردهایم.
٢٧
فصل دوم:
تقریبی برای طراحی و بکار بستن کوپلر خط شاخهای
تک بانده و دو بانده وTشکل
٢٨
(1-2 مدار خط شاخهای اندازه فشردهT شکل
دراینجا هدف طراحی کوپلر و در نهایت سیرکولاتور خط شاخهای بهم پیوسـته بـدون اسـتفاده از المانهـای
توده میباشد. اندازه کـوپلر پیـشنهادی تنهـا 45درصـد کوپلرهـای خـط شـاخهای مرسـوم در فرکـانس 2/4
گیگاهرتز میباشد.
اندازه المانهای این نوع کوپلر میتوانند به راحتی با استفاده از عمل قلم زنـی بـرد مـدار چـاپی بـه صـورت
واقعی کشیده شده و برای سیستمهای ارتباطی بیسیم بسیار مفید و پرکاربردند. چرا که اخیراً سیستم ارتبـاط
بیسیم در جهت اهداف کوچک کردن و پائین آوردن هزینه بـه قطعـات کـوچکتری نیـاز دارنـد. از ایـن رو
کاهش اندازه از اهداف قابل توجه در بکاربستن این طراحی میباشد. در پایینترین باند فرکانس مایکروویو،
اندازه کوپلر خط شاخهای مرسوم جهت استفاده عملی بسیار پیچیده و بزرگ است. تکنیکهای زیادی جهـت
کاهش سایز این گونه کوپلرها گزارش شده است. ترکیب خط انتقال با امپدانس بالا و خازنهای فشرده شنت
شده به آنها نیز مورد بررسی قرار گرفته اند.در این موارد خازنها با عایقهایی خاص، مورد نیاز مدارهای شنت
میباشند که در بحث بعدی جهت دو بانده کردن کوپلرهای خط شاخهای πشکل توضیح داده میشود.
مرجع[11] کوپلر خط شاخهای درخطوط میکرو استریپ تک لایه از فلز بدون هیچ گونه المان فـشرده شـده
واضافی ̦ سیمهای اتصال را پیشنهاد می کند.اندازه این گونه کوپلرها حدود 63درصـدطراحی هـای مرسـوم
میباشد. هرچند که قسمتهایی که ناپیوستگی در داخل کوپلر بوجود میآورند نیز همان ناپیوستگیهای ناشی
از اتصال مدارهای استاب شنت مدار باز یا کوتاه میباشند کـه باعـث بوجـود آمـدن مـشکل (over lap)8
میگردند. بنابراین ما در فصل بعدی روی طراحی یک کوپلر خط شـاخهای T شـکل جمـع و جـور جدیـد

٨هم پوشانی
٢٩
متمرکز خواهیم شد و در قسمت بعدی آنها را در کوپلرهای واقعی بکار برده و به تحلیـل و بهینـهسـازی آن
میپردازیم.
این نوع کوپلرها بدون استفاده از هیچ گونه المان فشرده، سـیم و قطعـه ای، مـیتواننـد بـه سـادگی بـرروی
سابستریتها ساخته شوند و در مقایسه با مدارات مرسوم طراحی شده اطلاعات را بخـوبی آشـکار مـیکننـد،
همچنین هماهنگی نزدیک و خوبی ما بین نتایج شبیهسازی و اندازه گیری شده مشاهده می گردد.
روش مرسوم ومعمولی جهت آنالیز کوپلر T شکل خط شاخهای بر روی استفاده از آنالیز مد نرمال است کـه
در اینجا ما از آن استفاده کردیم و این بدلیل ساختار هندسی آن نیز میباشد.
هر چند که خط با سایز کاهش یافته با طولی کمتر از λ / 4 اندوکتانس و ظرفیت پائینتـری را دارد، منتهـی
جبران اندوکتانس بوسیله افزایش امپدانس مشخصه خط و جبران ظرفیت نیـز بوسـیله اضـافه کـردن خـازن
شنت متصل شده [15] C میباشد. در این پـروژه خـازن C نیـز بوسـیله یـک خـط اسـتاب مـدار بـاز [9]
جایگزین گردیدهاست و معادل آنرا در مدار T شکل قرار دادهایم.

شکل(:(1-2ساختار T شکل خط انتقال ربع طول موج
ساختار T شکل معادل معمولی از یک خط کاهش یافته در شکل (1-2)نـشان داده شـده اسـت کـه در ایـن
شکل Z1،Z2،Z3وθ1،θ2وθ3 امپدانس مشخصه خطوط و همچنین طول الکتریکی آنها را نـشان مـیدهنـد.
لزومی ندارد که جایگاه خط با طول الکتریکـی((θ2 مـدارباز در وسـط خـط کـاهش انـدازه یافتـه مـا بـین
٣٠
Z1وZ2قرار داشته باشد. روابط ما بین این عناصر یعنی امپدانس مشخصه و طولهای الکتریکی را مـیتـوانیم
بوسیله ماتریس ABCD آنها تخمین بزنیم.
با استفاده از روابط قبلی برای طراحی یک کوپلر خط شاخهای πشکل مرسوم در اینجا با معـادل قـرار دادن
ماتریس آن با امپدانس مشخصه خط با طول θ = ±90° و ±ZT داریم:
3 Sinθ 3 JZ 3 Cosθ 1 0 Sinθ JZ Cosθ A B (1-2) j 1 1 1 j Cosθ3 Sinθ3 1 JB Cosθ1 Sinθ1 D  C Z3 2 Z1 (1-2) jB2  jTanθ2 / Z 2 (3-2) N Z1 Z3 (4-2) K Z1 Z 2 (5-2) M Z1 ZT از طرفی با معادل قرار دادن ماتریس فوق با ماتریس خط 90° داریم.
JZT
0(6-2)

0 JZT Sinθ j  Cosθ Z T


Cosθ B A Sinθ j  D C T Z و پس ساده سازی چهار معادله به صورت زیر خواهیم داشت:
(7-2) Cosθ1Cosθ3 − KTanθ2 Sinθ1Cosθ3 − NSinθ1 Sinθ3  0 (8-2) N Cosθ1Sinθ3 − KTanθ2Sinθ1Sinθ3  NSinθ1Cosθ3  M ٣١
(9-2) Tanθ2Cosθ1Sinθ3  Cosθ1Cosθ3  0 K Sinθ1Sinθ3 − 1 − N N (10-2) Sinθ1Cosθ3  KTanθ2Cosθ1Cosθ3  NCosθ1Sinθ3  M با ساده سازی روابط فوق دو معادله زیر را خواهیم داشت:
N 2 M 2 2 − N M 3  Tanθ Tanθ Tanθ N) ,Cotθ ) Tanθ Cotθ 2(11-2) M N N 1 3 1 3 1 (12-2) ( 2 − N 2 M 3 ( Tanθ 2  ) Tanθ 2 − N 2 M 3 ( 3  Sinθ Tanθ2Cosθ K KN MN M معادلات (11-2) و (12-2) نیز مقادیر θ1 و θ2 وθ3 را تحت شرایطی که M و N را داشـته باشـیم بـه مـا
میدهند. برای سادگی کار در اینجا Z1 را برابر Z3 در نظر میگیریم. طـول الکتریکـی θ1 بـر حـسب طـول
الکتریکی θ3 برحسب مقادیر مختلف M رسم گردیده است که در شکل (2-3) نیز آمـده اسـت. در اینجـا
نیز برنامه سادهای با نرم افزار مطلب نوشـته شـده(پیوسـت الـف-(1 و بـه ازای مقـادیر مختلـف N و M
میتوان به ازای θ1 های مختلف مقادیر θ2 و θ3 را بدست آورد.
١θ

٣θ
شکل θ1:(2-2) بر حسبθ3
٣٢
واضح است که طول الکتریکی کل خط کوچک شده( (θ= θ1 + θ3 با افزایش مقدار M نیز کاهش مییابد.
جایگاه خط استاب مدار باز شده در داخل کوپلر خط شاخهای تحـت شـرایط خـاص نیـز تحمیـل گردیـده
است. مقدار طول الکتریکی (θ2) ما بین مقادیر θ2 و θ میباشد. جهت جلـوگیری از مـشکل هـم پوشـانی

(Over lab) خط استاب باز را به انتهای خط اتصال کوتاه وصل میکنیم. θ1 و θ3 به ازای مقادیر شناخته
شده M به یکدیگر تبدیل شده در حالیکه حالت معادله (12-2) تحت N = 1 بدون نغییر باقی میماند. ایـن
نتایج به توانایی دو رابطه بدست آمده اشاره دارد. با بدست آوردن مقـادیر θ1 و θ3 و بـا داشـتن معادلـه
(12-2) مقادیر θ2 وZ2 محاسبه میگردند.
(2-2 طراحی و بکار بستن مدار T شکل و رسم منحنی مشخصه آن
با روشی که در بالا توضیح داده شد به سادگی میتوان انـدازه کـوپلر خـط شـاخهای مرسـوم را کـاهش داد
سابستریت مدار فوق دارای ویژگیهای زیر میباشند:
metal thickness =0 .02mm و h = 0.8mm و Tanδ  0.022 و εr  4.7
امپدانس مشخصه کوپلر خط شاخهای مرسوم 35 اهم در خط اصلی و در شاخه عمودی 50 اهم میباشند.
جهت کاهش دادن اثر افت هادی، افت تشعـشعی و جلـوگیری از مـدهای مـزاحم انتـشار نیـز پهنـای خـط
میکرواستریپ محدود شده و این امر با محدود کردن مقدار امپدانس مشخصه موثر واقع میگردد.
در ابتدا پارامترهای خط کوتاه شده اصلی ( افقی) را بـرای M=1/7 و بـا درنظـر گـرفتنθm1=17° بدسـت
میآوریم که از شکل θm3 = 48 °(2-2) حاصل میگردد. با قراردادن اطلاعات فـوق در رابطـه (12-2) و
٣٣
در نظر گرفتن k=2/6 مقدار θm2=39° (طول الکتریکی استاب باز خط اصـلی) بدسـت مـیآیـد. بـه طـور
مشابه پارامترهای خط شاخهای کاهش یافته را هم بدست میآوریم.
θb2=31 ْ θb3=58 ْ M=1/5 k=3/3 θb1=16
با در دست داشتن مقادیر فوق از نرمافزار Serenade جهت بدست آوردن ابعـاد مـدار چـاپی ) W پهنـای
خطوط) و ) L طول خطوط) اسـتفاده مـیکنـیم. بعـد از بدسـت آوردن ابعـاد فـوق، مـدار را بـا نـرمافـزار
Ansoft designer ترسیم نموده و بعد از تحلیل مدار فوق نیز نتایج اندازهگیری شده را بدست میآوریـم.
مدار چاپی آن در شکل (3-2) نشان داده شده است. و نتایج شبیهسازی در شکلهای (a) (4-2) و (b) نشان
داده شده است.

شکل :(3-2)مدار چاپی خط شانهای T شکل
٣۴

(a)

(b)
شکل S11:(a)(4-2)،S12،S13وS14 و(:(bپاسخ فازی کوپلر خط شاخه ای
مشاهده می شود S11 وS14 در فرکانس مرکزی کمتر از -20dB وS12 وS13 حدود -3dB میباشند.
حال با توجه به نتایج شبیه سازی اندازه گیری شده مستقیم و توان کوپل، افت بـالا بوسـیله سـاختار فلـزی و
افت تشعشعی دیده نمیشود . حوزه مدار کاهش یافته در مقایسه با کوپلر خط شاخهای مرسوم بـشتر از 55
درصد میباشد.
٣۵
مادر بخشهای بعدی مدار فوق را با اسـتفاده از بکـار بـستن (Defected ground structure)
DGS نیز مورد بررسی قرار خواهیم داد و اثرات DGS بر روی نتایج شبیهسازی مورد بررسی قرار خواهند
گرفت.
٢( 3 – کوپلر خط شاخهای π شکل
طراحی یک کوپلر خط شاخهای جدیدی که میتواند در دو فرکانس دلخـواه کـار کنـد از ویژگیهـای مـدار
پیشنهادی اندازه فشرده و ساختار شاخهای میباشد. فرمولهای طراحی روشن و واضـحی از ایـن مـدار بیـان
گردیده، چرا که موضوع مجهولات آن از قیبل امپدانس شاخههای خط مشخص گردیده اند.
فعالیتهایی جهت بررسی و رسیدگی نتایج شبیهسـازی شـده و انـدازه گیـری شـده از عملکـرد کـوپلر خـط
شاخهای میکرواستریپ در فرکانسهای 0/9 الی 2 گیگا هرتز انجام شده است.
کوپلرهای خط شاخهای از معروفترین مدارات پسیو استفاده شده در کاربردهای موج میلیمتری و میکرویـو
میباشند.
هایبریدهای λ / 4 طول موج [10] ,[9] مثالهای خوبی هستند که در باند فرکانسی مناسب دامنـه مـساوی و
فاز 90° در خروجی ایجادی میکنند. آنها عموماً در تقویت کنندههای بالانس شده و میکسرها برای بدسـت
آوردن یک افت برگشتی خوب استفاده شده و در جهت حذف سیگنالهای ناخواسته بوده، اگرچه بـه خـاطر
طبیعت ذاتی باند باریک ، طرح مرسوم بر روی خط انتقال λ / 4 بنا نهـاده شـده، کـاربردش در سیـستمهای
چند بانده و باند وسیع محدود گردیده است.
در سالهای اخیر، گزارشهای متفاوتی در رابطه با افزایش و بالا بردن پهنـای بانـد[11] و تکنیکهـای مـوثر در
کاهش سایز [14] ,[12] در مقالات مختلف عنوان گردیده اسـت. طراحـی کـوپلر خـط شـاخهای بـر روی
٣۶
المانهای توزیع شده فشرده بنا گردیده و همچنین برای کاربردهایی در دو باندفرکانسی نیز پیـشنهاد گردیـده
است. در [16] مولف یک ساختار صفحهای جدید را برای طراحی کوپلرهای خط شـاخهای دو بانـد عنـوان
کرده است هرچند مدار پیشنهاد شده از اشکالات زیر برخوردار می باشد:
-1 پهنای باند محدود ( کمتر از (10MHz
-2 افت داخلی و برگشتی بهینه نشده
-3 فضای اشغالی سابستریت آن خیلی بیشتر از کوپلرهای مرسوم بوده ( برخی از خطوط شاخهای، طولی به
اندازه 0/5λ را دارند)
درطرح پیشنهادی، تمام خطوط شاخهای تنها دارای طول λ / 4 بوده ( اندازه فشرده) و در فرکانس میـانی دو
تا باند فرکانسی بکار بسته شده، همچنین در مقایسه با طرح ذکر شده قبلی پهنای باند عملکرد وسیعتـری را
( > 100MHz ) ایجاد میکند، همچنین ایزولاسیون بین پورتهای بهتر و افت داخلی و برگشتی بهینـه تـری
را دارد ( بخش بعدی).
در قسمت بعد جهت آنالیزکردن، فرمولهای یک کوپلر خط شاخهای با فرمولهای واضح و روشـن نـشان داده
شده، در نهایت جهت رسیدگی و تحقیق، نتایج اندازهگیری و شبیهسازی شده ساختار کوپلر خـط شـاخهای
درباند فرکانسی (900/2000)Mhzکه با تکنولوژی میکرواستریپ ساخته شده آورده شده است.
( 4 – 2 فرموله کردن با استفاده از ماتریس خطوط انتقال
٣٧
شکل (5-2) طرح یک کوپلر خط شاخهای تک باند مرسوم توسط بخشهای خطوط انتقال بـا طـول λ / 4 را
نشان میدهد. در شکل (6-2) مدار معادل برای یـک خـط انتقـال λ / 4 پیـشنهاد شـده کـه شـامل خطـوط
شاخهای به طول الکتریکی θ و امپدانس مشخصه ZA بوده و به جفت المان موازی (jY)9 متصل گردیده.

شکل(:(5-2ساختار کوپلر خط شاخه ای یک بانده مرسوم

(a)

(b)
شکل((a):(6-2ساختار معادل پیشنهادی (b).خط شاخه ای λ / 4

٩ مقدار ادمیتانس خط
٣٨
حال جهت تحلیل ساختار پیشنهادی با در نظر گرفتن عدم افت و بکار بردن فرمـول ماتریـسها، پارامترهـای
ABCD ساختار پیشنهادی نشان داده شده در شکل((a)(6-2 بصورت زیر بیان میگردد.
(13-2) 0 jZ A Sinθ 1 0 Cosθ 1 Cosθ 1 jY 1 jYA Sinθ jY که این ماتریس در نتیجه به ذیل منتج می گردد.
jZASinθ Cosθ −ZAYSinθ (14-2) Cosθ −ZAYSinθ 2ZAYCotθ) 2 2 (1−ZA Y jYASinθ و نیز ماتریس بالا به صورت زیر خلاصه میگردد.
±jZT 0 jZASinθ 0 (15-2) 0 ±j  1 0 j Z T A Z Sinθ با معادل قرار دادن ماتریسهای بالا داریم:
Z A Sinθ ±ZT(16-2)
Cotθ
Y(17-2)
Z A
معادله (15-2) نشان میدهد که ساختار پیشنهاد شده معادل با بخشی از خط انتقـال بـا امپـدانس مشخـصه
ZT± و طول الکتریکی θ = ± 90° میباشد. مطابق با عملکرد یک مدار دو بانده (Dual – band) شـرایط
لازم ممکن است به صورت زیر داده شود.
٣٩
(18-2) Z A Sinθ1 ±ZT
(19-2) Z ASinθ2 ±ZT
کهθ1 و θ2 طولهای الکتریکی معادل شده خط شاخهای در باند فرکانسی مرکزی f1 و f2 میباشد.
روش معمولی حل معادلات (18-2) و (19-2) به صورت زیر میباشد:
3.......و2وn=1
(20-2) θ2  nπ −θ1 (21-2) f1  θ1 f2 θ2 (22-2) (1 −δ) nπ θ1  2 (23-2) (1 δ) nπ θ2  2 (24-2) f2 − f1 δ  f 2 f 1 در نتیجه طول الکتریکی خط شاخهای معادل شده در فرکانس مرکزی (θo)به صورت زیر تعیین میگردد
(θ0 ) = θ1 2θ2  n2π(25-2)

با قرار دادن معادلات (22-2) و (23-2) در معادلات (16-2) و (17-2) خواهیم داشت:
(26-2) ZT Z A  ( nδπ Cos( 2 ۴٠
nδπ ( tan( 2 f1 , f  Z A (27-2) y  nπδ ( − tan( 2 f2  , f Z A برای مقادیر 5.....و3وn=1 (28-2) ZT Z A  ( nδπ Sin( 2 nδπ ( −Cot( 2 f1  , f ZA (29-2) y  nπδ ( Cot( 2 f2 , f  ZA برای مقادیر..... 6و4وn=2 در معادلات بالا مقادیر مدار معادل داده شده بـرای دو بانـد فرکانـسی دلخـواه f1 وf2 کـه همـان y و ZA
هستند به دست میآیند.
(5-2 نتایج شبیهسازی مدار π شکل بدون استفاده از استاب
با در نظر گرفتن امپدانس خطوط عمودی zo=50Ω وخطوط افقی35 و طول الکتریکی 90درجه و نیـز قـرار
دادن آنها در serenade مقادیر طول(( L و پهنای خطوط (w) را بدست آورده و بادر نظـر گـرفتنf=1/45
و بستن مدار در قسمت شماتیک نتایج حاصل را می بینـیم.در شـکلهای((7-2 الـی (8-2) نتـایج حاصـل از
شبیه سازی کوپلر بدون استفاده از المانهای شنت در فرکانس مرکزی نشان داده شده است.
۴١

شکل(S13 ̦S12 ̦ S11:(7-2 وS 14 کوپلر بدون استاب
مشاهده می کنیم مادیرS11و S12 در فرکانس مرکزی کمتر از -20dB بوده یعنی پورت 1 از 4 ایزوله است
وS13وS12 حدوداً dB٣- می باشد .

شکل(:(8-2زاویهS 12 و S14 برای مدار بدون استاب
۴٢
(6-2 تحقق جهت دوبانده کردن مدار
دربخش قبل روش مشخصی برای طراحی یک کوپلر دو بانده (dual – band) به صورت فرمـولی تحلیـل
و تجزیه گردید. نتایج نشان میدهند روشهایی جهت انتخاب مقدار n و همچنین راههای مختلف در بدسـت
آوردن مقادیر المان شنت با ادمتیانس ورودی (Y) که در معادلات (27-2) و (29-2) توضیح داده شده بودند
وجود دارد.جهت معادل سـازی و نـشان داد ن توپولـوژی دو تـا مـدار در اینجـا مقـدار n را یـک در نظـر
میگیریم.
(1 -6-2 استفاده از استاب مدار باز ( ربع طول موج)
با استفاده از معادلات (22-2) و (23-2) ادمیتانس ورودی یک استاب مدار باز بـه صـورت زیـر مـیتوانـد
باشد.
δπ ( Cot( f1 , f  2 ZΒ (30-2) yoc  ( δπ −Cot( f2 , f 2 ZΒ که در اینجا ZB نیز امپدانس مشخصه استاب مدار باز میباشد . از ایـن رو بـا ترکیـب معـادلات (27-2) و
(30-2) مقدار ZB به صورت زیر بدست میآید: (31-2) Z T ZB  δπ δπ ( )Tan( Sin( 2 2 ۴٣

شکل (9-2) ساختار کوپلر پیشنهادی با استاب مدار باز
در شکل (9-2) ساختار نهایی ( با ساده سازی بوسیله ادغام استابهای شنت موازی شده ) از یـک کـوپلر دو
بانده (dual – band) با تمام خطوط شاخهای جایگزین شده بوسیله مدار پیشنهاد شده شکل (6-2) نـشان
داده شده است و نتیجتاً مقادیر Z3, Z2, Z1 بوسیله معادلات زیر تعیین میگردند.
(32-2) 1 . Z0 Z1  ( δπ Cos( 2 2 (33-2) 1 Z2  Z0. ( δπ Cos( 2 (34-2) 1 . 0 Z Z3  δπ δπ 2 1  ( )Tan( Sin( 2 2
(2-6-2 استفاده از مدار اتصال کوتاه ( طول ( λ2

به طور مشابه ادمیتانس ورودی یک استاب اتصال کوتاه میتواند به صورت زیر بیان گردد:
۴۴
f1 , f Cotδπ Z B (35-2) ysc  Cotδπ − f2  , f Z B شکل (10-2) (مدار چاپی) Layout یک کوپلر اصلاح شده با اتصالات شنت کوتاه شده نشان میدهد کـه
امپدانس مشخصه استاب شنت به صورت زیر محاسبه میگردد.
(36-2) 1 . 0 Z Z3  δπ 2 1  )Tanδπ Sin( 2
شکل (10-2) ساختار کوپلر پیشنهادی با استاب اتصال کوتاه
در تئوری نیز کوپلر پیشنهاد شده میتواند در هر دو باند فرکانسی دلخواه عمل کرده، اما در عمل تعیین رنـج
امپدانسی ساختار کوپلر میتواند مقداری حقیقی پاشد.
۴۵
واضح است که با انتخاب مناسبی از شکل مدار برای رنجهای متفاوتی از کـسر پنهـای بانـد ( 0/2 تـا 0/3 و
همچنین 0/3 تا ( 0/5 کوپلر پیشنهاد شده ممکن است امپدانس خطوط که تنها 30 الی 90 اهم تغییر میکنـد
در آنها بکار برده شود.
( 7- 2 آنالیز(تحلیل) مدار π شکل خط شاخهای دو باند و مشاهده نتایج شبیهسازی :
جهت اثبات و تأیید عملکرد، یک کـوپلر خـط شـاخهای میکرواسـتریپ دو بانـده در فرکانـسهای 0/9 و 2
گیگاهرتز طراحی و شبیهسازی شده و روی کسری از پهنای باند محاسبه شده((δ= 0/38 بنا نهاده شدهاست.
ساختار فشرده یک استاب مدار باز با طول λ / 4 جهت بکار بستن نیز مورد استفاده قـرار گرفتـه اسـت . از
معادلات (32-2) الی (35-2) مقادیر Z3, Z2, Z1 حدود 42/7 و 60/6 و 54/4 اهم نیز بدست آمـده اسـت.
جهت بهتر کردن دقت کار، پاسخ فرکانسی ساختار کامل شـامل ناپیوسـتگی و اثـر زیـر لایـه (Substrate)
بهینه شده با استفاده از یک مدار شبیه سازی شده اشکال (11-2) الی (14-2) پاسـخ فرکانـسی شـبیهسـازی
شده مدار نهایی از یک کوپلر دو بانده را نشان میدهند. مطابق با اثر یـک اسـتاب شـنت تلفـات داخلـی در
فرکانس مرکزی (1.45GHz) صفر گردیده که به حذف هر سیگنال مداخله کننده کمک میکند. کوپلر فوق
سابستریتی با ثابت اللکتریک εr = 3/38 و ضخامت h = 0/81mm میباشد. حال با اسـتفاده از نـرم افـزار
Serenade ابتـدا مقـادیر خطـوط یعنـی پهنـای خطـوط W1 ،W2،W3و طـول آنهـا L1،L2،L 3 را در
فرکــانس مرکــز 1/45 بدســت مــیآوریــم و بــا بــستن مــدار در ایــن فــرمافــزار مقــادیر پارامترهــای
S11،S12،S13وS14را برای باند فرکانسی دوبل شبیهسازی کردهایم.
۴۶
جدول(:(1-2مشخصات الکتریکی وفیزیکی مدار در دو باند امپدانس طول الکتریکی پهنای خط طول خط Z1=42.7 θ1=90 W1=2.38mm L1=31.25mm Z2=60.4 θ2=90 W2=1.36mm L2=31.95mm Z3=54.4 θ3=90 W3=1.63mm L3=31.73mm
شکل(:(11-2نتایج شبیه سازی(افت برگشتی(S11
۴٧

شکل(:(12-2نتایج شبیه سازی(S12و(S13

شکل(:(13-2نتایج شبیه سازی((S14
پارامترهای تشعشتی در این شبکه آنالایزر روی رنج فرکانسی از 0/1 الی 4 گیگاهرتز انجام میگردد.
۴٨

شکل(:(14-2نتایج شبیه سازی(پاسخ فازمدار با استاب)
شکلهای (11-2) الی (14-2) پاسخ اندازهگیری شده کوپلر در فرکانـسهای مرکـز دو تـا بانـد عملکـرد کـه
0/9GHz و 2GHz میباشد نشان میدهند..افت برگشتی و ایزولاسیون پورت بهتر از -20dB در فرکانسی
مرکزی دو باند بدست آمده است هر چنـد تـضعیف سـیگنال بـالا تـر از 50dB جـذب شـده در فرکـانس
1/41GHz نیز میباشد.
درمقایسه با طراحی یک کوپلر تک بانده، افت داخلی اندازهگیری شده دردو پـورت خروجـی تنهـا 0/4dB
بالاتر از مقدار واقعی آن((-3db میباشدو این بـاور وجـود دارد کـه ایـن اخـتلاف اساسـاً ناشـی از وجـود
ناپیوستگیهای اتصالات و اثر انتهای باز نشان داده شده در شبیه سازی میباشد.
طراحی و بکار بستن کوپلر خط شاخهای فشرده صفحهای بالا نیز درطراحی کـوپلری بـا دو بانـد فرکانـسی
کوچک و بزرگ بکار میرود.
۴٩
فصل سوم:
طراحی مدار میکرواستریپ فشردهT شکل با اندازه کاهش
یافته در دو باند فرکانسی
۵٠
(1-3 دوبانده کردن مدار T شکل خط شاخهای کوچک شده با توجه بـه رونـد
ارائه شده در دو بانده کردن کوپلرπ شکل ( 900MHz و (2400MHz
در این بخش ابتدا با روش دستی و استفاده از ماتریسهای ABCD کوپلرخط شاخهای و معـادل قـرار دادن
آن با ماتریس ABCD یک خط ±90°، طول الکتریکی و امپدانس مشخصه کوپلر خط شـاخهای بـا تبـدیل
θ به ' θ θ) f 2  ' (θ بوده را در حالت دو بانده معادل ساخته و در نهایت بوسیله برنامه ساده کامپیوتر که f1 بر اساس اطلاعات موجود نوشته شده، خطای موجود را در بدست آوردن θ و امپدانس مشخصههـایی کـه
برای هـر دو فرکـانس دلخـواه بـالا و پـائین 0/9GHz)و(2/4GHzصـدق کنـد بـا کمتـرین درصـد خطـا
0/4)درصد) درنظر میگیریم و با شرایط در نظر گرفته شده مقادیر θ و Z را بدست میآرویم.
همانطور که در بخش قبل نیز گفتیم با معادل سازی مدل T شکل خطوط استاب شنت متـصل شـده از نـوع
مدار باز بوده و این استاب خود باعث کاهش طول خط می گردد.
3 Sinθ' 3 jZ 3 Cosθ' 0 1 Sinθ' jZ Cosθ' A B (1-3) j − 1 1 1 j 3 Cosθ' 3 Sinθ' 1 jβ'2 Cosθ' Sinθ'  Z3 1 1 Z1 C D در بخش قبل مقادیر β2 و Z1 و Z1 ، Z1 بـا مقـادیر معـادل آن آورده شـده انـد و در اینجـا θ f2 θ' Z Z Z f 3 2 T 1 میباشد.
با معدل قرار دادن ماتریس فوق با خط -90 درجه داریم:
− jZ 0 Sinθ' jZ Cosθ' B A (2-3) T − j  T j 0 Cosθ' Sinθ'  ZT ZT C D ۵١
وبا ساده سازی روابط فوق داریم:
(3-3) Cosθ'1Cosθ'3 −kTanθ'2 Sinθ'1 Cosθ'3 −NSinθ'1 Sinθ'3  0 (4-3) N Cosθ'1 Sinθ'3 −kTanθ'2 Sinθ'1 Sinθ'3 NSinθ'1 Cosθ'3  − M (5-3) K 1 Cosθ'1 Sinθ'3 Cosθ'1 Cosθ'3  0 Tanθ'2 Sinθ'1 Sinθ'3 − − N N (6-3) Sinθ'1 Cosθ'3 KTanθ'2 Cosθ'1 Cosθ'3 NCosθ'1 Sinθ'3  −M در روابط بالا f2  θ'3 f2  θ'2 f2  θ'1 f 3 θ f 2 θ f θ 1 1 1 1 مقادیرf1 =900MHz و f2 =2400MHz می باشند. با ساده سازی روابط (3-3) و (4-3) به معادلا ت زیر میرسیم. (7-3) Cosθ'3 '1  − Sinθ M (8-3) Sinθ'3 − M Cosθ'1  N (2-3 استفاده از برنامه کامپیوتری ساده جهت بدسـت آوردن پارامترهـای مـدار دو
بانده
حال نیز برنامه ای با نرم افزار مطلب نوشتهایم و میخواهیم طولهـای الکتریکـی و امپـدانس مشخـصههـای
کوپلر و درنهایت سیرکولاتور موردنظر را در شرایطی بدست آوریم که خطاهای زیر حـاکم باشـند یعنـی در
آن واحد شرایط برای فرکانسهای بالا و همچنین پائین (استفاده از دو باند فرکانسی) موجود باشد.
۵٢
(9-3) N f 2 θ1 )Tan( f 2 Tan( 0.4 θ3 ) − M 2 f1 f1 (10-3) 0.4 θ3 ) f2 Tan( 2 − N 2 M θ2 ) − f2 Tan( f1 kN f1 (11-3) 0.4 θ3 ) f 2 Sin( M θ1 )  f 2 Cos( f1 N f1 برنامه نوشته شده در نرم افزار مطلب در پیوست الف ارئه شده است.
طول الکتریکی و امپدانس مشخصههایی که در شرایط خطای بالا بر قرار باشند جوابها میباشند کـه شـرایط
برای استفاده درحالت دو باند فرکانسی را دارند. θ1و θ2 وθ3 وZ1وZ2وZ3 در شرایط فـوق را مطـابق بـا
برنامهای که آورده شده بدست میآیند.
(3-3 آنالیز(تحلیل) مدار T شکل دو بانده در چند محـیط ( نـرم افـزار) مختلـف و
مشاهده نتایج حاصل
با قرار دادن مقادیر بدست آمده از برنامه نوشته شده که برای استفاده در دو باند فرکانـسی دلخـواه در نظـر
گرفته شده در روابط زیر و یا با استفاده از محیط serenade طولهای Lm1و)Wm1پهنا وطول خط شاخه
اصلی)Lm3و)Wm3پهنا وطول خط متصل به Zm1 در خط اصلی)Lm2و)Wm2پهنا وطول استاب مـدار
بــاز در خــط اصــلی)Lb1 و )Wb1پهنــا وطــول خــط متــصل بــهZm2در خــط عمــودی)وLb1
،Wb1،Lb2وWb2را بدست میآوریم.
۵٣
(12-3) 4 π εr −1 1 Z 0 2(εr 1) 1 (1/ εr )Ln π )  2 (εr 1)(Ln 2  119.9  H (13-3) −1 1 1 exp H W ( − ( 4 exp H 1 8 h (14-3) −2 4 Ln 1  π )(Ln 1 εr − 1 − 1 εr  ε eff  ) ) 1 π εr 2 1 εr  2H ' 2
با در دست داشتن مقادیر فوق مدار را در نرم افزارهـای Serenade و Advance designer (ADS)
sys-- ترسیم و نتایج شبیهسازی راعلاوه در ansoft مشاهده میکنیم منتهی در نهایت مقدار پهنـای بانـد
را حدوداً در Optimom 10% کرده و نتایج حاصل در زیر آورده شده اند.
h = 0/762mmεr =3/55 Tanδ  0. 022
در شکلهای((1-3و((2-3و((3-3 شماتیک ومدارچاپی و پاسخ مـدار شـبیه سـازی شـده در نـرم افزارهـای
مختلفی نشان داده شده است.

(a)
۵۴

(b)
شکل((a ) 🙁 1-3شماتیک (b)مدارچاپی (designer,hfss)ansoft
در جدول((1-3و(2-3 )با در دست داشتن مقادیر ابتدایی از المانهای مدار که توسط روابـط((12-3 الـی(-3
(14بدست آمده اند بازهای جهت حد بالا وپایین المان ها در نظر گرفته شده است و به سمت اهدافی که در
جدول((2-3 امده optimom انجام می گردد
.جدول(:(1-3دو بازه فرکانسی ودو هدف مورد نظر پروژه 905mhz 895mhz Frange1 باند فرکانس اول
2.45ghz 2.35ghz Frange2 باند فرکانس دوم
-20db lt ms12=-3.5db w=3 ms13=-3.5db w=3 ms14 -20db lt ms11 Goals1 هدف اول
-20db lt ms12=-3.7db w=3 ms13=-3.7db w=3 ms14 -20db lt ms11 Goals2 هدف اول
۵۵
جدول(:(2-3بازه بالا وپایین جهت optimom هدف بازه بالا مقدار اپتیمم شده بازه پایین نام المان
7MM? 5.69180mm ?5mm lb1
12.5MM? 11.35000mm ?10mm lb2
41MM? 39.57900mm ?37mm lb3
11.5MM? 10.77600mm ?9.5mm lm1
16.5MM? 15.36700mm ?14.5mm lm2
40MM? 38.67200mm ?37mm lm3
0.8MM? 0.16152mm ?.08mm wb1
1.2MM? 0.95112mm ?0.6mm wb2
2.5mm? 1.45870mm ?0.8mm wb3
2.1MM? 1.65260mm ?1mm wm1
0.5MM? 0.20507mm ?0.1mm wm2
3.5MM? 2.70090mm ?2mm wm3
2.5MM? 0.20010MM ?0.1mm wp

(a)
۵۶

(b)

(c)
شکل(S 11 :(2-3، S12،S13و S14 مدار شبیه سازی شده در ADS(c) SERANADE(b) ANSOFT(a)
۵٧

شکل(:(3-3پاسخ فازی مدار 2بانده
مشاهده میگردد که مقدار پارامترهای تضعیف در 0/9 و 2/4 گیگاهرتز -3dBو -20dbمیباشند.
در بخش بعدی در مورد اثرات DGS و مشاهده تاثیرات آن بروی این کوپلر بحث میکنیم.
۵٨
فصل چهارم:
بررسی انواع مختلف DGS و اثرات آن بر روی خطوط
میکرواستریپ
۵٩
DGS (1-4 چیست؟
DGS نیز شبکهبندی قلم زده شده ای است با شکل اختیاری که بر روی صفحه زمین قـرار مـیگیـرد و در
شکلهای T ، H ،دمبلی و حلزونی و...بکار میروند.
در شکل (1-4) انواع مختلف DGS نشان داده شده است.

شکل(H(a) :(1-4 شکل T(b) شکل (c) هلزونی شکل (d) دمبلی شکل
(2-4مشخصات کلی DGS
در ساختار DGS مشخصه های زیر رامی توان عنوان کرد:
-1 تغییر اندازه شکاف باند نوری . (PBG)10
-2 دارا بودن ساختارهای پریودیک وغیر پریودیک.
-3 به سادگی نیز مدار معادل LC را میسازد.

10 Photonic band gap
۶٠
(3-4 کاربردهای DGS
-1 در تشدید کنندههای صفحهای
-2 بالا بردن امپدانس مشخصهخط انتقال
-3 استفاده در فیلتر ،کوپلر و سیرکولاتور، اسیلاتور، آنتن و تقویت کنندهها
(4-4 ویژگیهای DGS
-1 پوشش میدان روی صفحه زمین را مختل میکند.
-2 بالا بردن ضریب گذردهی موثر.
-3 بالابردن ظرفیت موثر و اندوکتانس خط انتقال
-4 از بین بردن هارمونیکهای اضافی با تک قطب کردن ویژگی ) LPF11 فرکانس قطع و تشدید)
(5-4اثر DGS دمبلی شکل بر روی خطوط میکرواستریپ
DGS نیز بوسیله الگوی کـم کـردن قلـم زنـی، در صـفحه زمـین مـدار ایجـاد مـی گـردد.. در ابتـدا خـط
میکرواستریپی با الگوی DGS از نوع دمبلی شکل نشان داده شده است و تـأثیر شـکاف بانـد خـوبی را در
بعضی ار فرکانسهای معین نیز ایجاد می کند .[21]
DGS در طراحی مدارات امواج میلیمتری و مایکرویو خیلی زیاد بکار میرود . اخیراً DGSهای متوالی بـا
کاستن الگوهای مربعی از مدارات صفحهای کـه ویژگیهـای Slow wave و stop band بـسیار خـوبی را

11 Low pass filter
۶١
تولید میکنند مورد بررسی قرار گرفته که در تقویت کنندهها و اسیلاتورها بیشتر مورد استفاده قرار گرفتهانـد
.[23] [ ,22]
در مقایسه با DGS پریودیک قبلی [21] و [22] یک نـوع DGS پریودیـک بهتـر و قـویتـر نیـز پیـشنهاد
1
گردیده که ابعاد مربعات کاسته شده متناسب با توزیع دامنه تابع نمـایی ) e n کـه n عـدد صـحیح اسـت)

میباشد.
در شکل((2-4مدار دو پورتی بدون DGS نشان داده و پارامترهـایS حاصـل از آن بـا ansoft در شـکل
(3-4) آمده است.

شکل(:(2-4خط میکرواستریپ دو پورته باεr=10 وh=1.575

شکل(:(3-4پارامترهایSمدار شکل((2-4
۶٢
به منظور بررسی این اثرات توسط DGS پریودیک نیز یک عدد مدار DGS پریودیک متحدالـشکل و دو
تا مدار DGS پریودیک قوی شده نیز در اینجا طراحی و اندازهگیری شدهاند. اندازهها نـشان مـیدهنـد کـه
نمایشهای اخیر اجرای نقش دقیقی توسط متوقف شدن رپیل و بزرگ کردن پهنـای بانـد را ایفـا مـیکنـد.در
شکل((4-4 دو پورتی با DGS دمبلی شکل نشان داده شده و نتیجه شبیه سازی شده این خـط بـا ansoft
در شکل((5-4رسم گردیده است.

شکل(:(4-4مدا با DGS دمبلی شکل

شکل(:(5-4پارامترهایS مدار باDGS دمبلی شکل
در بالا می بینیم فرکانس قطع ومقدار تضعیف کاهش می یابند.
( 1 – 5 – 4 الگویDGSدمبلی شکل و ویژگی شکاف باند
۶٣
نمای شماتیک مدار دمبل شکی DGS در شکل (4-4) نشان داده شده است .خـط میکرواسـتریپ رو قـرار
گرفته و DGS نیز در زیر صفحه فلزی زمین قلم زده شده است. طرح DGS توسط خطوط دش مـشخص
شدهاند. پهنای خط نیز برای امپدانس مشخصه 50 اهم تعیین گردیده است. ضـخامت سابـستریت زیـر لایـه
1/575 میلیمتر و ثابت دی الکتریک εr = 10 میباشد. در [20] آمده که شـکاف قلـم زده شـده و کاسـتن
مربعی قلم زده شده با ظرفیت موثر خط و اندوکتانس خط نیز متناسب میباشد و وقتی ناحیه قلـم زده شـده
کاسته شده مربع شکل کاهش می یابد و فاصله شکاف نیز 0/6 میلیمتر نـشان داده شـده اسـت، انـدوکتانس
موثر کاهش یافته و این کاهش اندوکتانس نیز فرکانس قطع (fc) را بالا میبرد که این قضیه در شکل (7-4)
نشان داده شده است. در اینجا ما نیز این کار را با Ansoft انجام دادهایم.
( 2 – 5 – 4 ایجاد DGS دمبلی پریودیک قویتر
نمایش شماتیک DGS پریودیک با الگوهای مربعـی واحـد بـرای مـدارات صـفحهای [21] نـوع 1 نامیـده
میشود که در شکل (6-4)(a) آمده است.مدار ما در اینجا نیز خـط میکرواسـتریپ 50 اهمـی و نیـز5 عـدد
الگوهای مربع متحدالشکل با دوره یکسان d = 5mm میباشند.پهنای طرفین مربعها و فاصله شکاف هـوایی
ما بین آنها 4/5 (g) میلیمتر و 0/6 میلیمتر میباشند.
براساس نوع 1 ، متحدالشکل بودن توزیع پنج عدد الگوی مربعی توسط یک شکل غیر واحد توزیع میگردد.
حوزه المانهای مربعی نیز متناسب با توزیع دامنه تابع نمایی e1/ n میباشد.در اینجا دامنه سـوم از پـنج المـان
مربعی شکل نیز 4/5mm میباشد.پس نوع دوم بوده و دامنه المـان توزیـع شـده بـر اسـاس زیـر مـشخص
میگردند.
2/3mm2/7mm4/5mm(1-4)
۶۴

شکل (a) :(6-4) نوع1 ، (b) نوع2، (c) نوع3
استفاده از توزیع ارتفاع غیر واحد DGSهای پریودیک، نوع دوم را تشکیل می دهند که در شکل (6-4)(b)
نشان داده شده است. براساس نوع دوم، دیگر مدار DGS پریودیک قوی شـده، یـک خـط میکرواسـتریپ
جبرانی را دارد که نوع سوم نامیده میشود. در شکل (6-4)(c) آمده است.خط میکرواستریپ جبرانی شـامل
۶۵
یک خط 50 اهمی و یک خط عریض میباشد. همچنین بزرگی المانهای DGS توسط رابطه سوم مشخص
گردیده است. المانهای الگوی مربعی غیر هم شکل نیز دارای دوره مساوی d=5mm بوده و فاصـله هـوایی
ثابت d = 0/6mm دارند که در شکل (6-4) نوع دوم و سوم خطوط میکرواستریپ رو قـرار دارد و DGS
ها نیز در صفحه زمین فلزی کنده شده و توسط خطوط دش مشخص شدهاند.
(3-5-4اندازهگیریهای مربوط به DGS دمبلی شکل
سه نوع مدار DGS پریودیک که ذکر شدند مورد بررسی و اندازهگیری قرار گرفتهاند، نتایج اندازهگیری نیـز
در شکل (8-4)((a)-(c)) نشان داده شده هستند . این نتایج به طور خلاصه در جدول (1-4) آمده است.
جدول(:(1-4مقایسه DGS های واحد وپریودیک وتوزیع نمایی

شکل(:(7-4پارامترهایS برای DGS دمبلی شکل
۶۶

(a)

(b)

(c)
شکل(:(8-4 مقایسه پارامترهای S مدارهای (a) DGSنوع(b) 1نوع(c) 2 نوع3
۶٧
سابستریت این مدارات دارای h = 1/575 و εr = 10 هستند. این اندازه گیـریهـا توسـط Ansoft انجـام
شده و نشان داده شدهاند.
همان طوری که در جدول آمده، 20dB ایزولاسیون پهنای باند برای انواع 1و 2و 3 نیز در فرکانسهای 3/05
و 4/18 و 4/26 گیگاهرتز میّاشند.
مدارهای DGS پریودیک پیشنهاد شده نوع 2و 3 پهنـای بانـد ایزولاسـیون 20dB را بهتـر 37% و (39/7%
میکند.در ناحیه پائین گذر، اولین افت برگـشتی و پیـک افـت برگـشتی بـرای نـوع 3، مقـادیر -46/7dB و
-30/9dB بوده و در صورتیکه این مقادیر در نوع 1 نیز -10/8dB و -4/9dB هستند.اولین افت برگشتی و
ماکزیمم افت برگشتی نیز در 4 بار (لحظه) بهتر شده و بنابراین ر پیلها به صورت موثری از بـین رفتـهانـد و
پهنای باند موثر برای نوع سوم افزایش و فرکانس قطع 3dB به صورت مختصر و کم تغییر پیدا میکند.
(6 – 4بررسی اثرات DGS های هلزونی بر روی هارمونیکهای تقسیم کننده توان
در اینجا نشان خواهیم داد تکنیکهای موثری از حذف هارمونیک دوم و سوم برای یـک تقـسیم کننـده تـوان
ویل کینسون (WILLKINSON)با استفاده از DGS هلزونی شکل را، که ما در مدار کـوپلر از ایـن نـوع
DGS استفاده کردهایم.
شکاف باند الکترومغناطیسی و برهم زدن ساختار زمین اخیـراً نیـز کـار بردهـای متفـاوتی را در مـایکرویوو
فرکانس موج میلیمتری با شکلهای مختلف دارند [22] و [24] و DGS خط میکرواستریپ نیـز بـا بـر هـم
زدن مصنوعی صفحهای زمین در ویژگی رزونانس مشخـصه انتقـال تغیراتـی ایجـاد مـیکنـد. در یـک خـط
میکرواستریپ مطابق با اندازه DGS یا بر هم زدگی که روی صفحه زمین ایجاد میگردد، حذف باند بیـشتر
۶٨
در فرکانس رزونانس صورت میگیرد. همچنین DGS باعث بوجود آمدن اندوکتانس موثر اضـافی در خـط
انتقال میگردد. افزایش اندوکتانس موثر از ایجاد DGS باعث افزایش طول الکتریکی خط انتقال نـسبت بـه
یک خط متداول میگردد که خود نیز باعث کاهش اندازه مدارات موج میلی متر و مایکرویو میگـردد. [21]
، در طراحی فیلترها ،تقسیم کنندههای توان و تقویت کنندهها، ویژگی حذف باند و اثر موج آهـسته (Slow
wave) توسط DGS نیز بسیار مورد نظر می باشد [22]و [23]
هارمونیک های ناخواسته تولید شده با ویژگی غیر خطی مدارات اکتیو نیاز به حذف کردن دارند. در مدارات
مایکرویو و فرکانس بالا ویژگی حذف باند توسط DGS میتوانـد در متوقـف کـردن هارمونیکهـای مـورد
استفاده قرار گیرد [22] و .[23] با یـک DGS هلزونـی شـکل متقـارن، (یـک تـک ( DGS حـذف تـک
هارمونیک را خواهیم داشت، وDGS پریودیک در جهت حـذف هارمونیـک دوم و سـوم بکـار مـی رونـد.
DGS های آبشاری و پشت سرهم باعث افزایش افت داخلـی شـده و بهمـین دلیـل در مـدارات بـا انـدازه
کوچک نیز استفاده از ان محدود گردیده است. در اینجا ساختار DGS هلزونی شکل غیر متقارن نیز جهـت
حذف هارمونیکهای دوم و سوم بطور همزمان پیشنهاد گردیدهاند. به طور مـوثر یـک تـک DGS هلزونـی
غیرمتقارن باعث از بین بردن باند فرکانس دوم میگردد و نیاز به ناحیه کوچکی هم جهت نقش بـستن دارد.
تقسیم کننده توان ویل کینسن با بکار بستن یک DGS هلزونی غیـر متقـارن در خطـوط λ4 باعـث حـذف

هارمونیک دوم شده و اندازه آن نیز با اثر موج آهسته کاهش مییابد. مشاهده میگردد به دلیل ذکـر شـده در
این پروژه ما از این گونه DGS استفاده ننمودهایم. تقسیم کننده Willkinson پیشنهاد شده به خـوبی یـک
تقیسم کننده توان مرسوم، در فرکانس کار خواهد بود.
۶٩
(7-4مدل مداری و هندسه DGS هلزونی نا متقارن
در شکل (9-4) هندسه DGS هلزونی روی صفحه زمین خط میکرواستریپ که ابعـاد کنـده شـده هلزونـی
شکل در سمت راست و چپ متفاوت از یکدیگر هستند آمده است. برای هندسه این DGS نامتقارن مطابق
با کنده شدهگی سمت چپ و کندهشدگی سمت راست دوتا فرکانس عملکرد متفاوت وجود دارد. مشخـصه
انتقال خط میکرواستریپ با هندسه DGS نامتقارن ویژگی حذف باند در فرکانس تشدید را دارد.

شکل (9-4) هندسه DGS هلزونی روی صفحه زمین خط میکرواستریپ
فرکانس تشدید ممکن است با تغییر کردن ابعاد DGS عوض گردد. مقایسه مشخصه انتقال DGS هلزونـی
با ابعاد مختلف متقارن و غیرمتقارن در شکل (10-4) آمدهاست. امپدانس مشخصه خط 50 اهـم مـیباشـد.
برای هندسه هلزونی متقارون ( A=A'= 3mm و (B=B' = 3mm تنها یـک فرکـانس تـشدید (
(f=2/93GHz وجود دارد در صورتی که در یک DGS غیر متقارن فرکانس تشدید به دو فرکانس مختلـف
تبدیل میگردد. برای یک DGS نامتقارن با A = A' = 3/5mm و B = B' = 2/6mm همان طوری که در
شکل (10-4) مشاهده میگردد دو فرکانس تشدید مختلف دیده میشـودf=2/56GHz وf=4/22GHz کـه
این نتایج نشان میدهند DGS هلزونی نا متقارن با اندازههای متفاوت روی صفحه زمین در دو طرف خـط،
٧٠
فرکانسهای رزونانس مختلف را میتوانند ایجاد کنند.در هندسه نا متقارن DGS نیز میخواهیم بدانیم که بـه
چه صورتی فرکانس تشدید مطابق با بر هم زدگی چپ و راست خط با تغییـر انـدازه بـر هـم زدگـی رفتـار
میکند.

شکل(:(10-4پارامترهای انتقال خط با DGS متقارن( ( A = A' = B' = 3mm ونامتقارن A = 3/4m) و (B = 2/6 mm

شکل(:( 11-4 فرکانس روزنانس ناشی از بر هم زدگی سمت چپ و راست خط بر حسب تابعی از B/A
٧١
فرکانس تشدید ناشی از بر هم زدگی سمت چپ خط و سمت راست خط در شکل (11-4) بعنوان تابعی از
اندازه بر هم زدگی سمت راست وقتی که اندازه سمت چپ ثابت باشد (A = A' = 2mm) رسم گردیـده
است. اندازه این آشفتگی هلزونی به صورت یک مربع در نظر گرفته شده (B = B' , A = A') .وقتـی کـه
اندازه برهم زدگی سمت راست از مقدار سـمت چـپ کـوچکتر اسـت (B/A<1)، فرکـانس رزونـانس در
سمت راست نیز بزرگتر از مقدار سمت چپ خواهد بود. هنگامیکه مقدار A با B برابر گردد دو تا فرکـانس
رزونانس ازهم پاشیده شده و به یک فرکانس تبدیل میگردد DGS) متقارن). باز وقتی کـه بـر هـم زدگـی
سمت راست افزایش پیدا کند B/A) زیاد شود)، فرکانس تشدید ناشی از بر هم زدگـی سـمت راسـت نیـز
کاهش مییابد. از این رو اندازه سمت چپ ثابت شده و مشاهده میگردد که فرکانس رزونانس ناشـی از بـر
هم زدگی سمت چپ تغییرات آهستهای خواهد داشت تا وقتی که B/A مقدار واحد شود.
مشخصه فرکانسی یک DGS متقارن با مدار رزوناتور RLC موازی میتواند مدل گردد. پارامترهای مـداری
معادل نیز از مشخصه انتقال شبیهسازی شده میتواند گرفته شود.
DGS نا متقارن نیز میتواند با دو تا رزوناتور RLC موازی که به صورت سدی متصل شدهاند مدل گـردد.
شکل((12-4، به همین جهـت مشخـصه انتقـال آن دو تـا فرکـانس تـشدید متفـاوت دارد. در مـدار معـادل
پارامترهای مدار اولین رزوناتور از مشخصه فرکانسی رزونانس بر هم زدگی سمت چپ گرفتـه مـیشـود در
حالیکه رزوناتور دوم بوسیله مشخصه رزونانس بر هم زدگی سمت راست مشخص می گردد. از نتـایج شـبیه
سازی پارامترهای اسکترینگ، پارامترهای مدار رزوناتور برای بر هم زدگی سمت چپ و راست بـه صـورت
زیر مشخص میگردند.
(۴-٢) C L,R W CL,R  ( 2 −W 2 (W 0 2Z C L,R 0 L,R ٧٢
(۴-٣) 1 LL,R  4π2 f02 L,R CL,R (۴-۴) 2zo RL,R  1 1 ))2 −1 − (2Z0 (W0 L,R CL,R − W0 L,R LL,R S11 (W0 L,R )2
شکل( 🙁 12-4 مدار معادل بخش DGS هلزونی نامتقارن
در اینجا اندیس R, L نیز پارامترهای برهم زدگی سمت چپ و راست را بیان می کنند. W0 فرکانس تشدید
و WC فرکانس قطع -3db را مشخص میکنند. Z0 امپدانس مشخصه خط انتقال می باشد.
(8-4حذف هارمونیکها در مدار مقسم توان
مقسم توان کاربردهای گوناگونی از قبیل توزیع توان سیگنال ورودی از آنتن و تقویت کنندههای توان بـالای
مایکرویو دارد. با قرار دادن فیلتر حذف هارمونیک در داخل مقسم توان ناحیه خروجـی فیلتـر کـاهش پیـدا
میکند .[23] جهت حذف هارمونیک نیز میتوان از استاب مدار باز در مرکز شاخههای بـا طـول λ4 مقـسم

توان استفاده نمود.
اگر DGS را بعنوان فیلتر هارمونیک اضافی استفاده کنیم میتوانیم با در نظر گرفتن کاهش سایز مقسم تـوان
که منجر به اثر (Slow – wave) میگردد نیز هارمونیک را حـذف نمـود. از ایـن رو یـک DGS متقـارن
٧٣
میتواند تنها یک سیگنال هارمونیک را حذف کند. ما نیاز به قرار دادن دو تا DGS به صـورت آبـشاری در
λ
هر شاخه ( ( 4 داریم تا هارمونیک دوم و سوم را حذف کنیم. هر چند ناحیه مقسم توان جهت گذشتن دو تا

DGS به صورت پریودیک در هر شاخه مقسم توان نیز محدود میگردد. DGS غیر متقارن هم، سـاختاری
موثر در جهت حذف هارمونیک دوم و سوم به صورت همزمان می باشد. [22]
شکل (13-4) (a) هندسه یک DGS هنرونی نامتقارن جهت حذف هارمونیـکهـای سـوم و دوم را نـشان
میدهد. در اینجا فرکانس عملکرد مقسم توان نیز 1/5 گیگاهرتز میباشد.

شکل(DGS (a): (13-4 هلزونی نامتقارن برای حذف هارمونیک دوم و سوم (b) مدار معادل ساختار این DGS
ناحیه بر هم زده شـده سـمت چـپ و راسـت رزونـانس هارمونیـک دوم و سـوم طراحـی شـدهانـد. 3) و
4.5گیگاهرتز). ابعاد طراحی شده این سـاختار D=2/4mm و A = 3 mm D' = S = G = 0/2mm و
A' = 3/2 mm، B = 2/4 mm و B' = 2/6 mm و امپدانس مشخصه خـط نیـز 70/7 Ω مـیباشـد.
٧۴
شکل (13-4) (b) مدار معادل DGS نامتقارن در شکل (13-4) (a) را نشان مـیدهـد. پارامترهـای مـدار
بوسیله پارامترهای اسکترینگ سیموله شده بوسیله روابط (2-4) تا (4-4) محاسبه میگردند.
شکل (14-4) نیز پارامترهای S محاسبه شده بوسیله شبیه سازی (EM) بـرای DGS نامتقـارن شـکل (a)
.(13-4) و محاسبه شده مدار معادل شکل (13-4)(b) را نشان میدهند. در هر دو تا شـبیه سـازی مـشاهده
میگردد که بوسیله DGS نامتقارن واحد، هارمونیکهای دوم و سـوم در فرکانـسهای 4. 5 , 3 گیگـا هرتـز
حذف میگردند.

شکل( ( 14- 4 پارامترهای S مدار با DGS هلزونی به صورت EM و شبیه سازی شماتیک
مشاهده میگردد که S12 موافق رنج فرکانسی پهن و S11 نیز در جهت حذف هارمونیک مقسم تـوان اصـلی
بکار میرود. یک مقسم توان معمولی در شکل (15-4)(a) مشاهده میگردد و نیز مقسم توان پیـشنهاد شـده
با DGS غیر متقارن در شکل (15-4)(b) آمده است. در اثر موج آهـسته (slow – wave) بـودن DGS
نیز اندازه مقسم توان پیشنهادی کاهش یافته است. اندازه L' = 17/3 mm در مقایسه L = 19mm حـدود
9/1 % کاهش یافته است.
٧۵
پارامترهای S شبیه سازی شده مقسم توان معمولی و پیشنهادی در شکل (16-4) آمده است.

شکل( ( 15- 4 هندسیای از (a) مقسم توان ویل کنیسن معمولی (b) مقسم توان با DGS نامتقارن
در (16-4) (b)، فرو نشاندن حدود18 dB برای هارمونیک دوم و سـوم بـا وارد کـردن DGS نامتقـارن در
خط انتقال ( ( λ4 مقسم توان مشاهده میگردد. افـت برگـشتی بـرای فرکـانس 1/5 GHZ در هـر دو مـشابه

یکدیگر می باشند، حتی با وارد کردن DGS نامتقارن در مدار.
شکل (17-4) نیز قسمت رو و زیر از یک مقسم توان ویل کینسن با وارد DGS هلزونی نامتقـارن را نـشان
میدهد. در شکل (a) (18-4)، S11 اندازهگیری شـده را نـشان مـیدهـد. افـت برگـشتی در فرکـانس 1/5
گیگاهرتز – 40dB بوده. S21 نیـز در شـکل (18-4)(b) بعنـوان تـابعی از فرکـانس آمـده اسـت. توقیـف
هارمونیک دوم (3 GHZ) نیز 18dB و هارمونیک سوم در فرکانس (4/5 GH) نیز 15dB میباشد.
٧۶

شکل ( ( 16- 4 نتایج شبیه سازی (a) پارامتر S مقسم توان معمولی S (b) برای مقسم توان با DGS

شکل( ( 17-4 مقسم توان willkinson با DGS هلزونی نامتقارن (a) روی مدار (b) پشت مدار
٧٧

شکل( ( 18- 4 نتیجه شبیه سازی مقسم توان با DGS هلزونی نامتقارن(S12(b)S11(a
( 9 – 4 مشاهده اثرات DGS برروی کوپلر T شکل در یک باندفرکانسی
ابتدا مدار شکل (3-2) را با اسـتفاده از DGS هلزونـی شـکل نیـز آنـالیز و نتـایج آن را در شـکل((19-4
مشاهده میکنیم
٧٨

شکل(:(19-4مدار بااستفاده از (a) DGSیک بعدی((bدو بعدی
در شکل (a)(20-4)و((b نتایج شبیه سازی حاصل از مدار قلم زده شده DGS و بدون استفاده از آن را
نشان میدهند.
٧٩

شکل((a):(20-4نتیجه شبیه سازی کوپلر با استفاده ار (b) DGSبدون استفاده از ((a)(3-2)) DGS
با مشاهده نتایج بالا به پایین آمدن فرکانس قطع و slow wave شدن پاسخ نیز پی می بریم.
(10-4مشاهده اثرات DGS روی مدار طراحی شده در این پروژه
در شکل (21-4) نوع DGS استفاده شده در این کوپلر آورده شده است.ونتیجـه ansoft در شـکل((22-4
مشاهده میگردد.
٨٠

شکل(:(21-4کوپلر باH DGS شکل در شاخه خطوط

شکل(:(22-4پارامتهای Sحاصل از به کار بستن DGS
٨١
فصل پنجم
چگونگی استفاده از کوپلر بدست آمده در طراحی سیرکولاتور
٨٢
(1-5 طراحی سیرکولاتور
یک سیرکولاتور 4 پورته فشرده نیز می تواند به وسیله یک کوپلر خط شاخه ای و شیفت دهنده فاز( پیوست
پ) نیز ساخته شود.این شیفت دهنده فازی همراه با ورودی و خروجی خط همواره مچینگ امپدانسی داشته
و دارای تضعیف صفر می باشد.در اینجا ما از زیراتور به عنوان شیفت دهنده فازی استفاده کرده ایمر .[26]
یکی از ترکیبات نا متقابل استاندارد ژیراتورها هستند که دارای 2 پورت بوده وشیفت فاز تفاضلی 180 درجه
ایجاد می کنند.نماد شماتیک برای یک ژیراتور در شکل (1-5)آمده است و ماتریس اسکترینگ برای یک
ژیراتور واقعی در زیر آمده است.
(1-5)

π
شکل(:(1-5نماد ژیراتور
که این ماتریس نشانه عدم افت ،مچ شده ونا متقابل بودن آن است.

s−0 11 0
(2-5مدار معادل برای سیرکولاتور با استفاده از یک ژیراتور و دو کوپلر

۴ ١
٢ π ٣
شکل(:(2-5سیرکولاتور 4پورته متشکل از دو مدار هایبریدی و ژیراتور
٨٣
استفاده ژیراتور به عنوان بنا ساخت در ترکیب با مقسم دو طرفه و کوپلرها میتواند منجر به ایجاد مدارات
مفید همچون سیرکولاتور گردد .در شکل (2-5) مدار معادل سیرکولاتور 4 پورته متشکل از دو مدار
هایبریدی و درشکل (4-5) سیرکولاتور ساخته شده با استفاده از یک ژیراتور ودو کوپلر را نشان میدهد.

شکل(-5٣):سیرکولاتور ساخته شده با استفاده از دو کوپلر و یک ژیراتور
مدار پیشنهادی با ایجاد شیفت فاز 180 درجه باعث عبور از پورت 1به2،2 به3،3به4و4به1 می گردد. در
شکل (4-5) نتایج شبیه سازی مدار طراحی شده آمده است.

(a)
٨۴

(b)

(c)

(d)