—d1896

3-2. اصلاح شیمی سطح ژل34
3-3. چرخه فشار-دما در حین فرآیند خشک کردن فوق بحرانی36
3-4. شماتیکی از دستگاه خشک کن فوق بحرانی اتوکلاو36
فصل چهارم - سنتز و بررسی ویژگی‌های نانوکامپوزیت سیلیکا آئروژل/نانوذرات فریت کبالت
4-1. فازهای مجزا نمونه روی همزن52
4-2. نمونه‌های در قالب ریخته شده52
4-3. نمونه الکوژل53
4-4. نمونه آئروژل54
4-5. تصاویر FE-SEM نمونه‌ها الف) 10%، ب) 15%، ج) 20%.55
4-6. نمودار توزیع اندازه ذرات الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%56
4-7 . پراش XRD نمونه‌های الف) 10%، ب) 15%و ج) 20% پیش از عملیات حرارتی58
4-8. پراش XRD نمونه‌های الف) 10%، ب) 15%و ج) 20% در دمای 600 درجهی سانتیگراد59
4-9. پراش XRD نمونه‌های الف) 10%، ب) 15%و ج) 20% در دمای 800 درجهی سانتیگراد60
4-10. آنالیز نمونه‌های الف)10%، ب) 15%و ج) 20% حرارت داده شده در دمای 600 درجه‌ی سانتی ‌گراد61
4-11. آنالیز نمونه‌های الف)10%، ب) 15%و ج) 20% حرارت داده شده در دمای 800 درجه‌ی سانتی ‌گراد62
4-12. طیف‌های جذبی FT-IR الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%.65
4-13. تصویر TEM یکی از نمونه‌ها67
4-14. نمودارهای لانگمیر الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%69
4-15. نمودارهای BET الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%71
4-16. جذب و واجذب الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%.72
4-17. حلقه پسماند نمونه‌ها قبل از عملیات حرارتی الف) 10%، ب) 15%، ج) 20%.74
4-18. حلقه پسماند نمونه‌ها بعد از عملیات حرارتی الف) 10%، ب) 15%، ج) 20%.75

فهرست جداول
عنوان صفحه
فصل سوم - ساخت آئروژل و کاربردهای آن
3-1. کاربردهای مختلف آئروژل‌ها48
TOC o "1-3" h z u
فصل چهارم - سنتز و بررسی ویژگی‌های نانوکامپوزیت سیلیکا آئروژل/نانوذرات فریت کبالت
4-1. میزان گرم و لیتر مواد مورد نیاز51
4-2. نتایج حاصل از XRD63
لیست علایم و اختصارات
برونر، امت، تلر(Brunauer, Emmett, Teller) BET
پراش پرتو ایکس (X-Ray Diffraction) XRD
مغناطیسسنج نمونهی ارتعاشی (Vibrating Sample Magnetometer) VSM
میکروسکوپ الکترونی گسیل میدانی (Field Emission Scanning Electron Microscopy) FE-SEM
میکروسکوپ الکترونی عبوری (Transmission Electron Microscopy) TEM
آنگسترم (Angestrom) Å
اورستد (Oersted) Oe
نانومتر (Nanometer) nm
واحد مغناطیسی (Electromagnetic Units) emu
فصل اولمفاهیم اولیه1854668136024
مقدمهاز اواخر قرن بیستم دانشمندان تمرکز خود را بر فناوری نوینی معطوف کردند که به عقیده‌ی عده‌ای تحولی عظیم در زندگی بشر ایجاد می‌کند. این فناوری نوین که در رشته‌هایی همچون فیزیک، شیمی و مهندسی از اهمیت زیادی برخوردار است، نانوتکنولوژی نام دارد. می‌توان گفت که نانوفناوری رویکردی جدید در تمام علوم و رشته‌ها می‌باشد و این امکان را برای بشر به وجود آورده است تا با یک روش معین به مطالعه‌ی مواد در سطح اتمی و مولکولی و به سبک‌های مختلف به بازآرایی اتم‌ها و مولکول‌ها بپردازد.
در چند سال اخیر، چه در فیزیک تجربی و چه در فیزیک نظری، توجه قابل ملاحظه‌ای به مطالعه‌ی نانوساختارها با ابعاد کم شده است و از این ساختارها نه تنها برای درک مفاهیم پایه‌ای فیزیک بلکه برای طراحی تجهیزات و وسایلی در ابعاد نانومتر استفاده شدهاست. وقتی که ابعاد یک ماده از اندازه‌های بزرگ مانند متر و سانتیمتر به اندازه‌هایی در حدود یک دهم نانومتر یا کمتر کاهش می‌یابد، اثرات کوانتومی را می‌توان دید و این اثرات به مقدار زیاد خواص ماده را تحت الشعاع قرار می‌دهد. خواصی نظیر رنگ، استحکام، مقاومت، خوردگی یا ویژگی‌های نوری، مغناطیسی و الکتریکی ماده از جمله‌ی این خواص‌ می‌باشند [1].
1-1 شاخه‌های فناوری نانوتفاوت اصلی فناوری نانو با فناوری‌های دیگر در مقیاس مواد و ساختارهایی است که در این فناوری مورد استفاده قرار می‌گیرند. در حقیقت اگر بخواهیم تفاوت این فناوری را با فناوری‌های دیگر بیان نماییم، می‌توانیم وجود عناصر پایه را به عنوان یک معیار ذکر کنیم. اولین و مهمترین عنصر پایه نانو ذره است. نانوذره یک ذره‌ی میکروسکوپی است که حداقل طول یک بعد آن کمتر از ١٠٠ نانومتر است و میتوانند از مواد مختلفی تشکیل شوند، مانند نانوذرات فلزی، سرامیکی و نانوبلورها که زیر مجموعهای از نانوذرات هستند [ 3و 2]. دومین عنصر پایه نانوکپسول است که قطر آن در حد نانومتر می‌باشد. عنصر پایه‌ی بعدی نانولوله‌ها هستند که خواص الکتریکی مختلفی از خود نشان می‌دهند و شامل نانولوله‌های کربنی، نیترید بور و نانولوله‌های آلی می‌باشند [4].
1-2 روش‌های ساخت نانوساختارهاتولید و بهینهسازی مواد بسیار ریز، اساس بسیاری از تحقیقات و فناوری‌های امروزی است. دستورالعمل‌های مختلفی در خصوص تولید ذرات بسیار ریز در شرایط تعلیق وجود دارد ولی در خصوص انتشار و تشریح دقیق فرآیند رسوب‌گیری و روش‌های افزایش مقیاس این فرآیندها در مقیاس تجاری محدودیت وجود دارد. برای تولید این نوع مواد بسیار ریز از پدیده‌های فیزیکی یا شیمیایی یا به طور همزمان از هر دو استفاده می‌شود. برای تولید یک ذره با اندازه مشخص دو فرآیند اساسی وجود دارد، درهم شکستن) بالا به پایین) و دیگری ساخته شدن) پایین به بالا). معمولا روش‌های پائین به بالا ضایعاتی ندارند، هر چند الزاما این مسأله صادق نیست [6 و5]. مراحل مختلف تولید ذرات بسیار ریز عبارت است از، مرحله‌ی هسته‌زایی اولیه و مرحله‌ی هسته‌زایی و رشد خود به خودی. در ادامه به طور خلاصه روش‌های مختلف تولید نانوذرات را بیان می‌کنیم. به طور کلی روش‌های تولید نانوذرات عبارتند از:


 چگالش بخار
 سنتز شیمیایی
 فرآیندهای حالت جامد (خردایشی)
 استفاده از شاره‌ها فوق بحرانی به عنوان واسطه رشد نانوذرات فلزی
 استفاده از امواج ماکروویو و امواج مافوق صوت
 استفاده از باکتری‌هایی که میتوانند نانوذرات مغناطیسی و نقره‌ای تولید کنند
پس از تولید نانوذرات می‌توان با توجه به نوع کاربرد آن‌ها از روش‌های رایج زمینه‌ای مثل روکشدهی یا اصلاح شیمیایی نیز استفاده کرد [7].
1-3 کاربردهای نانوساختارهایکی از خواص نانوذرات نسبت سطح به حجم بالای این مواد است. با استفاده از این خاصیت می‌توان کاتالیزورهای قدرتمندی در ابعاد نانومتری تولید نمود. این نانوکاتالیزورها بازده واکنش‌های شیمیایی را به شدت افزایش داده و همچنین به میزان چشمگیری از تولید مواد زاید در واکنش‌ها جلوگیری خواهند نمود. به کارگیری نانو‌ذرات در تولید مواد دیگر استحکام آن‌ها را افزایش داده و یا وزن آن‌ها را کم می‌کند. همچنین مقاومت شیمیایی و حرارتی آن‌ها را بالا برده و واکنش آن‌ها در برابر نور وتشعشعات دیگر را تغییر می‌دهد.
با استفاده از نانوذرات نسبت استحکام به وزن مواد کامپوزیتی به شدت افزایش خواهد یافت. اخیرا در ساخت شیشه ضد آفتاب از نانوذرات اکسید روی استفاده شده است. استفاده از این ماده علاوه بر افزایش کارآیی این نوع شیشهها، عمر آن‌ها را نیز چندین برابر نمودهاست .از نانوذرات همچنین در ساخت انواع ساینده‌ها، رنگ‌ها، لایه‌های محافظتی جدید و بسیار مقاوم برای شیشه‌ها، عینک‌ها (ضدجوش و نشکن)، کاشی‌ها و در حفاظ‌های الکترومغناطیسی شیشه‌های اتومبیل و پنجره استفاده می‌شود. پوشش‌های ضد نوشته برای دیوارها و پوششهای سرامیکی برای افزایش استحکام سلول‌های خورشیدی نیز با استفاده از نانوذرات تولید شده‌اند.
وقتی اندازه ذرات به نانومتر می‌رسد یکی از ویژگی‌هایی که تحت تأثیر این کوچک شدن اندازه قرارمی‌گیرد تأثیرپذیری از نور و امواج الکترومغناطیسی است. با توجه به این موضوع اخیراً چسب‌هایی از نانوذرات تولید شده‌اند که کاربردهای مهمی در صنایع الکترونیکی دارند. نانولوله‌ها در موارد الکتریکی، مکانیکی و اپتیکی بسیار مورد توجه بوده‌اند. روش‌های تولید نانولوله‌ها نیز متفاوت می‌باشد، همانند تولید آن‌ها بر پایه محلول و فاز بخار یا روش رشد نانولوله‌ها در قالب که توسط مارتین مطرح شد. نانولایه‌ها در پوشش‌های حفاظتی با افزایش مقاومت در خوردگی و افزایش سختی در سطوح و فوتولیز و کاهش شیمیایی کاربرد دارند.
نانوذرات نیز به عنوان پیشماده یا اصلاح ساز در پدیده های فیزیکی و شیمیایی مورد توجه قرارگرفته‌اند. هاروتا و تامسون اثبات کردند که نانوذرات فعالیت کاتالیستی وسیعی دارند، مثل تبدیل مونواکسید کربن به دی اکسید کربن، هیدروژنه کردن استیرن به اتیل بنزن و هیدروژنه کردن ترکیبات اولفیتی در فشار بالا و فعالیت کاتالیستی نانوذرات مورد استفاده در حسگرها که مثل آنتن الکترونی بین الکترود و الکترولیت ارتباط برقرار می‌کنند [7].
1-4 مواد نانومتخلخلمواد نانو متخلخل دارای حفره‌هایی در ابعاد نانو هستند و حجم زیادی از ساختار آن‌ها را فضای خالی تشکیل می‌دهد. نسبت سطح به حجم (سطح ویژه) بسیار بالا، نفوذپذیری یا تراوایی زیاد، گزینشپذیری خوب و مقاومت گرمایی و صوتی از ویژگی‌های مهم آن‌ها می‌باشد. با توجه به ویژگی‎‌های ساختاری، این به عنوان تبادل‌گر یونی، جدا کننده، کاتالیزور، حس‌گر، غشا و مواد عایق استفاده می‌شود.
نسبت حجمی فضای خالی ماده‌ی متخلخل به حجم کل ماده‌ تخلخل نامیده میشود. به موادی که تخلخل آن‌ها بین 2/0 تا 95/0 باشد نیز مواد متخلخل می‌گویند. حفره‌ای که متصل به سطح آزاد ماده است حفره‌ی باز نام دارد که برای صاف کردن غشا، جداسازی و کاربردهای شیمیایی مثل کاتالیزور و کروماتوگرافی (جداسازی مواد با استفاده از رنگ آن‌ها) مناسب است. به حفره‌ای که دور از سطح آزاد ماده است حفره‌ی بسته می‌گویند که وجود آن‌ها تنها سبب افزایش مقاومت گرمایی و صوتی و کاهش وزن ماده شده و در کاربردهای شیمیایی سهمی ندارد. حفره‌ها دارای اشکال گوناگونی همچون کروی، استوانهای، شیاری، قیفی شکل و یا آرایش شش گوش هستند. همچنین تخلخل‌ها می‌توانند صاف یا خمیده یا همراه با چرخش و پیچش باشند [7].
بر اساس دستهبندی که توسط آیوپاک صورت گرفته است، ساختار محیط متخلخل با توجه به میانگین ابعاد حفره‌ها، مواد سازنده و نظم ساختار به سه گروه تقسیمبندی میشوند که در شکل 1-1 نشان داده شده است:
الف) دسته بندی بر اساس اندازهی حفره:
میکرومتخلخل: دارای حفرههایی با قطر کمتر از 2 نانومتر.
مزومتخلخل: دارای حفرههایی با قطر 2 تا 50 نانومتر.
right59626500ماکرومتخلخل: دارای حفرههایی با قطر بیش از 50 نانومتر.
center1720850شکل 1-1 انواع سیلیکا براساس اندازه حفره: الف) ماکرو متخلخل، ب) مزو متخلخل، ج) میکرو متخلخل [8].
0شکل 1-1 انواع سیلیکا براساس اندازه حفره: الف) ماکرو متخلخل، ب) مزو متخلخل، ج) میکرو متخلخل [8].

بر اساس شکل و موقعیت حفره‌ها نسبت به یکدیگر در داخل مواد متخلخل، حفره‌ها به چهار دسته تقسیم می‌شود: حفره‌های راه به راه، حفره‌های کور، حفره‌های بسته و حفره‌های متصل به هم که در شکل (2-1) به صورت شماتیک این حفره‌ها را نشان داده شده است.

شکل 1-2 نوع تخلخل‌ها بر اساس شکل و موقعیت [8].
بر اساس تعریف مصطلح نانوفناوری، دانشمندان شیمی در عمل نانو متخلخل را برای موادی که دارای حفرههایی با قطر کمتر از 100 نانومتر هستند به کار می‌برند که ابعاد رایجی برای مواد متخلخل در کاربردهای شیمیایی است.
ب) دستهبندی بر‌اساس مواد تشکیل دهنده:
مواد نانومتخلخل آلی
مواد نانومتخلخل معدنی
تقسیمبندی مواد نانومتخلخل آلی
1) مواد کربنی: کربن فعال، کربنی است که حفره‌های بسیار زیاد دارد و مهم‌ترین کربن از دسته مواد میکرومتخلخل است.
2) مواد بسپاری: مواد نانو متخلخل بسپاری به دلیل ساختار انعطاف‌پذیر خود، حفره‌های پایداری ندارند و تنها چند ترکیب محدود از این نوع وجود دارد [8].
تقسیم بندی مواد نانومتخلخل معدنی
1) مواد میکرومتخلخل
زئولیت‌ها: مهم‌ترین ترکیبات میکرومتخلخل بوده که دارای ساختار منظم بلوری و حفره‌دار با بار ذاتی منفی می‌باشند. در اکثر موارد ساختار زئولیتی از قطعات چهار وجهی با چهار اتم اکسیژن و یک اتم مرکزی مثل آلومینیوم، سیلیکون، گالیم یا فسفر تشکیل شده‌اند که با کاتیون‌ها خنثی می‌شوند [8].
چارچوب فلزی-آلی: از واحد‌های یونی فلزی یا خوشه‌ی معدنی و گروه‌های آلی به عنوان اتصالدهنده تشکیل شده است که اتصال آن‌ها به هم، حفره‌ای با شکلی معین مانند کره یا هشت وجهی به وجود می‌آورد. ویژگی بارز این ترکیبات، چگالی کم و سطح ویژه‌ی بالای آن‌هاست [9].
هیبرید‌های آلی-معدنی: از قطعاتی معدنی تشکیل شده‌اند که توسط واحد‌های آلی به هم متصل هستند [10].
2) مواد مزومتخلخل:
سیلیکا: ترکیبات MCM، معروف‌ترین سیلیکای مزومتخلخل هستند.
اکسید فلزات و سایر ترکیبات مزومتخلخل: اکسیدهای نانومتخلخل فلزات مثل تیتانیوم دی اکسید، روی اکسید، زیرکونیوم دی اکسید و آلومینا، فعالیتی بیشتر از حالت معمولی خود دارند. ترکیبات سولفید و نیترید هم میتوانند ساختار مزومتخلخل داشته باشند.
3) مواد ماکرومتخلخل:
بلور کلوییدی: از مجموعه کره‌هایی مانند سیلیکا ساخته می‌شود که فضای بین آن‌ها خالی است. در بلور کلوییدی معکوس کره‌ها توخالی و فضای بین آن‌ها پر است [10].
آئروژل‌ها مواد مزومتخلخل با سطح ویژه و حجم تخلخل بالا هستند که در فصل بعد به آن‌ها می‌پردازیم.
1-5 کامپوزیت‌هاکامپوزیت‌ها (مواد چند رسانهای یا کاهگل‌های عصر جدید) رده‌ای از مواد پیشرفته هستند که در آن‌ها از ترکیب مواد ساده به منظور ایجاد مواد جدیدی با خواص مکانیکی و فیزیکی برتر استفاده شده است. اجزای تشکیلدهنده ویژگی‌های خود را حفظ کرده، در یکدیگر حل نشده و با هم ترکیب نمی‌شوند.
استفاده از این مواد در طول تاریخ مرسوم بوده است. از اولین کامپوزیت‌ها یا چندسازه‌های ساخت بشر می‌توان به آجرهای گلی که در ساخت آن‌ها از کاه استفاده شده است اشاره کرد. هنگامی که این دو با هم مخلوط بشوند، در نهایت آجر پخته بهدست می‌آید که بسیار ماندگار‌تر و مقاوم‌تر از هر دو ماده اولیه، یعنی کاه و گل است. شاید هم اولین کامپوزیت‌ها را مصری‌ها ساخته باشند که در قایق‌هایشان به چوب بدنه قایق مقداری پارچه می‌آمیختند تا در اثر خیس شدن، آب توسط پارچه جذب شده و چوب باد نکند. قایق‌هایی که سرخپوستان با فیبر و بامبو می‌ساختند و تنورهایی که از گل، پودر شیشه و پشم ساخته می‌شدند از نخستین کامپوزیت‌ها هستند [11].
1-5-1 کامپوزیت یا مواد چندسازهچندسازه‌ها به موادی گفته می‌شود که از مخلوط دو یا چند عنصر با فازهای کاملا متمایز ساخته شده باشند. در مقیاس ماکروسکوپیک فازها غیر قابل تشخیص‌اند. اما در مقیاس‌های میکروسکوپیک فازها کاملا مجزا هستند و هر فاز خصوصیات عنصر خالص را نمایش می‌دهد. در چندسازه‌ها، نه تنها خواص هر یک از اجزاء باقی مانده بلکه در نتیجهی پیوستن آن‌ها به یکدیگر، خواص جدیدتر و بهتر بهدست می‌آید [11].
1-5-2 ویژگی‌های مواد کامپوزیتیمواد زیادی می‌توانند در دسته‌بندی مواد کامپوزیتی قرار بگیرند، در واقع موادی که در مقیاس میکروسکوپی قابل شناسایی بوده و دارای فازهای متفاوت و متمایز باشند در این دسته‌بندی قرار می‌گیرند. امروزه کامپوزیت‌ها به علت وزن کم و استحکام بالا در صنایع مختلف، به طور گستره‌ای مورد استفاده واقع می‌شوند. کامپوزیت‌ها با کاهش وزن و ویژگی‌های فیزیکی بسیار عالی، گزینه‌ای مناسب برای استفاده در تجهیزات ساختاری می‌باشند. علاوه بر ‌این، کامپوزیت‌ها جایگزین مناسب برای مواد سنتی در کاربردهای صنعتی، معماری، حمل و نقل و حتی در کاربردهای زیر بنایی می‌باشد [12].
یکی از ویژگی‌های بارز کامپوزیت‌ها، حضور فاز تقویـتکننده مجزا از فاز زمینه می‌باشد. ویژگی‌های اختصاصی این دو فاز، در ترکیب با یکدیگر، ویژگی‌های یکسانی را به کل کامپوزیت می‌بخشد. در یک دسته‌بندی ویژه، کامپوزیت‌ها همواره به دو فاز زمینه و تقویتکننده تقسیم می‌شوند. می‌توان گفت در واقع زمینه مانند چسبی است که تقویتکننده‌ها را به یکدیگر چسبانده و آن‌ها را از آثار محیطی حفظ می‌کند.
1-5-3 مواد زمینه کامپوزیتزمینه با محصور کردن فاز تقویت کننده، باعث افزایش توزیع بار بر روی کامپوزیت می‌گردد. در واقع زمینه، برای اتصال ذرات تقویتکننده، انتقال بارها به تقویتکننده، تهیه یک ساختار شبکه‌ای شکل از آن‌ها و حفظ تقویتکننده از آثار محیطی ناسازگار به کار گرفته می‌شود.
1-5-4 تقویتکننده‌هادسته‌ای از مواد معمولی که به عنوان فاز تقویت کننده به کار گرفته می‌شوند، عبارتند از شیشه‌ها، فلزات، پلیمرها و گرانیت. تقویتکننده‌ها در شکل‌های مختلفی از جمله فیبرهای پیوسته، فیبرهای کوتاه یا ویسکرها و ذرات تولید می‌شوند (شکل3-3). تقویت کننده‌ها باعث ایجاد ویژگی‌های مطلوبی از جمله استحکام و مدول بالا، وزن کم، مقاومت محیطی مناسب، کشیدگی خوب، هزینه کم، در دسترسپذیری مناسب و سادگی ساخت کامپوزیت می‌گردند [12].
1-5-5 نانو کامپوزیتنانو کامپوزیت‌ها مواد مرکبی هستند که ابعاد یکی از اجزای تشکیلدهنده آن‌ها در محدوده نانو‌متری باشد. نانوکامپوزیت‌ها هم، در دو فاز تشکیل می‌شود. در فاز اول، ساختار بلوری در ابعاد نانو ساخته می‌شود که زمینه کامپوزیت به شمار می‌رود. در فاز دوم هم ذراتی در مقیاس نانو به عنوان تقویت کننده برای بهبود ویژگی‌ها به فاز زمینه افزوده می‌شود. توزیع یکنواخت این فاز در ماده زمینه باعث می‌شود که فصل مشترک ماده تقویت کننده با ماده زمینه در واحد حجم، مساحت بالایی داشته باشد [13].

شکل 1-3 نمایشی از انواع مختلف تقویت کننده‌ها در کامپوزیت [12].
1-6 خلاصهدر این فصل به بیان بعضی مفاهیم اولیه پرداختهشد. خلاصه کوتاهی از فناوری نانو، نانوساختارها و روش‌های ساخت آن‌ها گفته شد. بعد از آن مواد متخلخل بررسی شد و در نهایت مختصری در مورد کامپوزیت‌ها، ویژگی‌ها و نانوکامپوزیت‌ها بیان شد.
فصل دومآئروژلها و مروری بر خواص مغناطیسی15418474142773
2-1 تاریخچهحوزهی پژوهشی آئروژل هر ساله به طور وسیعی افزایش می‌یابد به طوری که امروزه توجه بسیاری از دانشمندان جهان را به خود اختصاص دادهاست.
اولین بار ساموئل استفان کیستلر در سال 1931 با ایدهی جایگزینی فاز مایع با گاز در ژل همراه با انقباض کم، آئروژل را تولید کرد. در آن زمان سعی ایشان بر اثبات وجود شبکه‌های جامد در درون ساختار ژل بود. یک روش برای اثبات این نظریه، برداشتن فاز مایع از فاز مرطوب ژل بدون اینکه ساختار جامد از بین برود مطرح بود. برای این کار او با استفاده از یک اوتوکلاو، فاز مایع را از ژل خارجکرد که جامد باقی مانده چگالی بسیار پایینی داشت. او دما و فشار داخلی اوتوکلاو را به نقطه بحرانی مایع رساند تا بر کشش سطحی مایع غلبهکند و ساختار داخلی ژل را از فروپاشی برهاند. به این ترتیب او با موفقیت اولین آئروژل پایه سیلیکا را تولید کرد. ولی به دلیل سختی کار، برای حدود نیمقرن پژوهشی در این زمینه صورت نگرفت. اما از همان ابتدا برای دانشمندانی چون کیستلر، واضح بود که آئروژل ویژگی‌های برجسته‌ای مانند چگالی پایین و رسانایی گرمایی ناچیزی دارد [14].
در سال‌های اخیر، ساختن آئروژل به معنای رساندن الکل به فشار و دمای بخار شدنی و به طبع آن به‌دست‌آوردن نقطهی بحرانی است و باعث استخراج فوق بحرانی از ژل می‌شود. سپس، در سال 1970، دانشمند فرانسوی تایکنر و همکارانش برای بهبود فرآیند تولید دولت فرانسه، موفق شدند روش جدیدی به غیر از روش کیستلر برای تهیهی آئروژل کشف کنند و آن را روش سل-ژل نامیدند. در این روش آلکوکسی سیلان با سیلیکات سدیم، که به وسیله کیستلر استفاده می‌شد، جایگزین گردید. با ظهور روش ارائه شده به وسیله‌ی تایکنر پیشرفت‌های جدیدی در علم آئروژل و فناوری ساخت آن حاصل شد و پژوهش‌گران زیادی به مطالعه در این زمینه روی آوردند. به دلیل انجام مطالعات، تحقیقات و اقدامات صنعتی و نیمه صنعتی که در دهه 70 و 80 بر روی آئروژل‌ها صورت گرفت، این دوره را عصر رنسانس آئروژل نامیدند. [15].
این مواد جایگاه خود را به عنوان مواد جامدی با چگالی و رسانایی گرمایی پایین به‌دست آوردند. پایین‌ترین چگالی آئروژل تولید شده 1/0 میلیگرم بر سانتیمتر مکعب است، تا حدی که نمونه می‌تواند در هوا شناور بماند. گرچه برای ساخت جامد آئروژل مواد بسیاری می‌توانند استفاده شوند ولی آئروژل‌های 2SiO متداول‌ترند. البته می‌توان با واردکردن مواد مختلف در ساختار آئروژل در حین فرآیند ژل شدن، به بهبود ویژگی‌های نمونه‌های نتیجه شده کمک کرد [16].
آئروژل‌ها را می‌توان به عنوان یک ماده منحصر به فرد در زمینه فناوری سبز در نظر گرفت. هشدار جهانی، تهدید آیندهی محیط زیست توسط گاز‌های گلخانهای تولید شده بهدست بشر را تأیید می‌کند. آیندهی انرژی‌های قابل دسترس به خاطر کمشدن منابع نفتی و حتی افزایش تقاضا برای محصولات نفتی، در خطر است. آئروژل‌ها بارها و بارها به افزایش بازدهی برخی ماشین‌ها و سیستم‌ها و کمک به کاهش مصرف انرژی یاری رسانده‌اند. همچنین آئروژل‌ها می‌توانند آلاینده‌های آب را بیرون بکشند و با گرفتن ذرات مضر قبل از ورود به اکوسیستم، سبب تخریبنشدن محیط زیست شوند. دانشمندان دریافتند که این فناوری برای تجدید و حفاظت از انرژی به توسعهی بیشتری نیاز دارد [17].
2-2 شیمی سطح آئروژلسیلیکا آئروژل حاوی ذرات نانومتری هستند. این ترکیبات دارای نسبت سطح به حجم بالا و مساحت سطح ویژهی زیادی هستند. شیمی سطح داخلی در آئروژل‌ها نقش اساسی را در بروز رفتار‌های بی‌نظیر فیزیکی و شیمیایی آن‌ها، ایفا می‌کند. ماهیت سطح آئروژل‌ها تا حد زیادی به شرایط تهیهی آن‌ها بستگی دارد. انتخاب فرآیند مربوط به ترکیبات شیمیایی و ویژگی‌های مورد نظر مشخص برای نانوذرات وابسته است. دو روش پایه برای تولید نانوذرات استفاده می‌شود:
روش از بالا به پایین
اشاره به خردکردن مکانیکی مواد با استفاده از فرآیند آسیابکاری دارد. در این فرآیند مواد اولیه به بلوک‌های پایهی بیشتری شکسته می‌شوند.
روش پایین به بالا
اشاره به ساخت سیستم پیچیده به وسیله ترکیب اجزای سطح اتم دارد. در این فرآیند ساختارها به وسیله فرآیندهای شیمیایی ساخته می‌شوند.
روش پایین به بالا بر پایه ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی اتمی یا مولکولی خود تنظیم می‌شوند. این روش به دلیل ساختار پیچیده اتم یا مولکول، کنترل بهتر اندازه و شکل آن‌ها انتخاب شد. روش پایین به بالا شامل فرآیندهای آئروسل، واکنش‌های بارش و فرآیند سل-ژل است [18].
مرحله اول ساختن آئروژل تولید ژل خیس است که بهترین روش برای ساخت آن استفاده از پیشماده الکوکسید سیلیکون، مانند TEOS است. شیمی ساخت Si(OCH2CH3)TEOS است که با اضافه کردن آب، واکنش شیمیایی زیر صورت می‌گیرد [19] :
Si(OCH2CH3)4(liq)+2(H2O)(liq)→SiO2solid+4(HOCH2CH3)liq
اتم سلیکون به دلیل داشتن بار جزئی مثبت کاهشیافته (+) نسبت به دیگر انواع آئروژل بیشتر مورد مطالعه قرار گرفت. در Si(OEt)+ حدود 32/0 است. این بار مثبت جزئی کاهش یافته، روند ژل شدن پیشماده سیلیکا را آهسته می‌کند.
پیشمادهی الکوکسید M(OR) هستندکه اولین بار توسط امبلن برای سنتز سیلیکا آئروژل استفاده شد. در این ترکیب M نشان دهندهی گروه فلزی، OR گروه الکوکسید و R تعیینکنندهی گروه الکلی هستند. الکوکسیدها معمولا در محلول منبع الکلی خود موجود هستند و امکان خشک کردن این ژل‌ها را در چنین محلول‌هایی فراهم می‌کند [20].
اگر آئروژل از طریق خشک کردن به وسیله الکل تهیه گردد، گروه‌های آلکوکسی (OR) تشکیل دهنده سطح آن است و در این سطح آئروژل خاصیت آبگریزی پیدا می‌کند. اگر تهیه آئروژل از طریق فرآیند دی اکسید کربن باشد آنگاه سطح آئروژل را گروه‌های هیدروکسید (OH) فرا می‌گیرد و خاصیت آب‌دوست پیدا خواهدکرد و مستقیما می‌تواند رطوبت هوا را جذب نماید. البته با حرارت دادن می‌توان رطوبت جذب شده را از ساختار آئروژل حذف نمود. شکل 1-2 به خوبی خاصیت آب‌دوست و آبگریزی را در ساختار آئروژل‌های با گروه‌های عاملی مختلف نشان می‌دهد [21].

شکل 2-1 برهمکنش آب و ساختار آئروژل، الف) آئروژل آبگریز، ب) آئروژل آب‌دوست [18].
2-3 تئوری فیزیکیاتصال شبکه نانو مقیاس سیلیکای جامد آئروژل‌های پایه سیلیکا، ویژگی‌های منحصر به فردی را به آن‌ها می‌دهد. کسر یونی پیوند کووالانت قطبی برای اکسیدهای فلزی مختلف از رابطهی زیر نتیجه می‌شود:
Fionic=1-exp⁡(-0.25 XM-XO2)که XO و XM الکترون‌خواهی O و M را نشان می‌دهد. 2SiO مقدار Fionic 54/0 دارد که طیف مقدار زاویه Si-O-Si را گسترده کرده و شبکه تصادفی را می‌دهد. چهار اکسید دیگر زاویه یونی بزرگ‌تر و مقدار کوچک‌تر زاویه پیوند را سبب می‌شوند. به این معنی که پیوند تصادفی فقط روی ماکرومقیاس‌های بیشتر با ذرات کلوییدی بزرگ‌تر و متراکم‌تر اتفاق می‌افتد، در این صورت، ژل به جای شکلگرفتن شبکهی تصادفی اتصالات به صورت ذره تشکیل می‌شود [14]. شبکهی اتصالات سیلیکا برای وزن نسبی‌اش یک جامد محکم را ایجاد می‌کند.
2-4 خاصیت مغناطیسی مواد2-4-1 منشأ خاصیت مغناطیسی موادیکی از مهمترین ویژگی‌های مواد، خاصیت مغناطیسی آن‌هاست که از زمآن‌های نسبتا دور مورد توجه بوده و هم اکنون نیز در طیف وسیعی از کاربردهای صنعتی قرار گرفته است.
منشأ خاصیت مغناطیسی در جامدها، الکترون‌های متحرک می‌باشند. گرچه بعضی از هسته‌های اتمی دارای گشتاور دو قطبی مغناطیسی دائمی هستند ولی اثر آن‌ها چنان ضعیف است که نمی‌تواند آثار قابل ملاحظه‌ای داشته باشد؛ مگر در تحت شرایط خاص مانند اینکه نمونه در زیر دمای یک درجهی کلوین قرار گیرد یا وقتی که تحت میدان الکترومغناطیسی با بسامدی قرار گیرد که حرکت تقدیمی هسته را تشدید نماید. در بدو ظهور نظریات مغناطیس آزمایش‌های زیادی نشان داد که اندازه حرکت زاویهای کل یک الکترون و گشتاور مغناطیسی وابسته به آن بزرگ‎تر از مقداری است که به حرکت انتقالی آن نسبت داده می‌شد. بنابراین یک سهم اضافی که از خصوصیت ذاتی با یک درجه آزادی داخلی ناشی می‌شد، به الکترون نسبت داده شد و چون این خصوصیت دارای اثر مشابه چرخش الکترون حول محورش بود اسپین نامیده گردید [22].
2-4-2 فازهای مغناطیسیبه طورکلی مواد در میدان مغناطیسی خارجی رفتارهای متفاوتی از خود نشان می‌دهند و با توجه به جهت‌گیری مغناطش، به پنج گروه تقسیم می‌شوند که به بیان آن‌ها می‌پردازیم.
2-4-2-1 مواد دیامغناطیسدر این مواد الکترون‌ها به صورت جفت بوده و اتمها دارای گشتاور مغناطیسی دائمی نیستند و با قرارگرفتن در میدان مغناطیسی خارجی دارای گشتاور مغناطیسی القایی در خلاف جهت میدان خارجی می‌شوند و آن را تضعیف می‌کند. پذیرفتاری مغناطیسی χ چنین موادی منفی و خیلی کم است. خاصیت دیامغناطیس ظاهراً در تمام انواع مواد یافت می‌شود، اما اثر آن غالباً به وسیله‌ی آثار قویتر پارامغناطیس یا فرومغناطیس که می‌توانند با این خاصیت همراه باشند، مخفی می‌شود. خاصیت دیامغناطیسی خصوصاً در موادی بارز است که کلاً اتمها یا یونهایی با پوسته‌های بسته‌ی الکترونی تشکیل شده باشند، زیرا در این مواد تمام تأثیرات پارامغناطیسی حذف می‌شوند.
2-4-2-2 مواد پارامغناطیسمواد پارامغناطیس، موادی هستند که برخی از اتمها یا تمامی آن‌ها گشتاور دو قطبی دائمی دارند، به عبارت دیگر گشتاور دو قطبی در غیاب میدان مغناطیسی، غیرصفر است. این دو قطبیهای دائمی رفتاری مستقل از هم داشته که در نهایت جهت‌گیری تصادفی دارند و در میدان‌های کوچک رقابتی بین اثر هم‌خط‌سازی میدان و بی‌نظمی گرمایی وجود دارد، اما به طور متوسط تعداد گشتاورهای موازی با میدان بیشتر از گشتاورهای پادموازی با میدان است. پذیرفتاری در این مواد مثبت است و با افزایش دما، که در اثر آن بی‌نظمی گرمایی زیاد می‌شود، کاهش مییابد. منگنز، پلاتین، آلومینیوم، فلزخاکی قلیایی و قلیایی خاکی، اکسیژن و اکسید ازت از جمله مواد پارامغناطیس‌اند.
2-4-2-3 مواد فرومغناطیس
در برخی از مواد مغناطیسی، گشتاورهای مغناطیسی کوچک به طور خودبهخود با گشتاورهای مجاور خود هم‌خط می‌شوند. اینگونه مواد را فرومغناطیس می‌نامند. در عمل، همه‌ی حوزه‌های مغناطیسی در یک ماده‌ی مغناطیسی در یک راستا قرار ندارند، بلکه این مواد از حوزه‌های بسیار کوچکی با ابعاد خیلی کمتر از میلیمتر تشکیل شده‌اند، به طوری که گشتاورهای مغناطیسی هر حوزه با حوزه‌های مجاور آن تفاوت دارد.
ممکن است سمتگیری و اندازه‌ی حوزه‌های مغناطیسی در یک ماده‌ی فرو مغناطیس به گونه‌ای باشد که در کل اثر یکدیگر را خنثی کنند و ماده در مجموع فاقد مغناطش است. اعمال میدان مغناطیسی خارجی بر حوزه‌های مغناطیسی سبب می‌شود که گشتاورهای مغناطیسی هر حوزه تحت تأثیر میدان قرار گرفته و جهت آن‌ها در جهت میدان خارجی متمایل شود. علاوه بر این حوزههایی که با میدان همسویند، رشد میکنند، یعنی حجم آن‌ها زیاد می‌شود و در نتیجه، حوزه‌هایی که سمتگیری آن‌ها نسبت به میدان مناسب نیست کوچک می‌شوند، مرز بین این حوزه‌ها جابجا می‌شود و در نتیجه ماده در مجموع خاصیت مغناطیسی پیدا می‌کند . پذیرفتاری مغناطیسی این مواد مثبت است. آهن، کبالت، نیکل و چندین عنصر قلیایی خاکی جز فرومغناطیس‌ها می‌باشند [23].
مواد فرومغناطیس دارای چند مشخصه‌ی اصلی به صورت زیر می‌باشند:
الف) مغناطش خودبه‌خودی و مغناطش در حضور میدان
ب) حساسیت مغناطش به دما
ج) مغناطش اشباع
د) منحنی پسماند
2-4-2-4 مواد پادفرومغناطیس
در مواد پادفرومغناطیس گشتاورهای مغناطیسی مجاور به صورت موازی، برابر و غیرهم راستا جهتگیری
می‌کنند. این مواد در غیاب میدان مغناطیسی دارای گشتاور صفرند. کروم و اکسیدهای آن ، جز مواد پادفرومغناطیس می‌باشند. چنین موادی معمولاً در دماهای پایین پادفرومغناطیساند. با افزایش دما ساختار نواحی مغناطیسی شکسته شده و ماده پارامغناطیسی می‌شود. این رفتار در مواد فرومغناطیس نیز اتفاق می‌افتد به این ترتیب که در این مواد پذیرفتاری مغناطیسی مواد مغناطیسی با افزایش دما به تدریج کاهش می‌یابد تا زمانی که ماده پادفرومغناطیس شود .
پذیرفتاری مغناطیسی این مواد عدد مثبت بسیار کوچک و نزدیک به صفر است. به دمایی که در آن ماده از حالت پادفرومغناطیس به فرومغناطیس گذار می‌کند، دمای نیل می‌گویند.
χ= CT+TN
که C ثابت کوری و TN دمای نیل است.
2-4-2-5 مواد فریمغناطیس
فریمغناطیس شکل خاصی از پادفرومغناطیس است که در آن گشتاورهای مغناطیسی در جهت موازی و عکس یکدیگر قرار گرفته‌اند، اما با یکدیگر برابر نیستند و به صورت کامل یکدیگر را حذف نمی‌کنند. در مقیاس ماکروسکوپی، مواد فریمغناطیس همانند فرومغناطیس بوده و دارای مغناطش خودبه‌خودی در زیر دمای کوری بوده و دارای منحنی پسماند می‌باشند[23و24]. شکل 2-2 فازهای مغناطیسی را نشان می‌دهد.

شکل 2-2 فازهای مغناطیسی، الف) پارامغناطیس، ب) فرومغناطیس، ج) پادفرومغناطیس، د) فری مغناطیس [24].
دو خاصیت مهم و کلیدی مواد مغناطیسی دمای کوری و هیستروسیس مغناطیسی است. جفت شدگی ‏تبادلی و بنابراین انرژی تبادلی هیسنبرگ مستقیماً با دمای کوری ‏‎(Tc)‎‏ مواد فرو و فریمغناطیس در ‏ارتباط است. در کمتر از دمای ‏Tc، ممان مغناطیسی همان جهت بلوروگرافی ویژه‌ی محور صفر این ‏مواد است. این محور در ‏نتیجه‌ی جفت‌شدگی این اسپین الکترون و ممنتوم زاویهای اوربیتال الکترون ایجاد می‌شود.
‏از آنجایی که مواد فرومغناطیسی مواد جالبی بر حسب کاربردهایشان هستند، خواص آن‌ها باید به ‏طور کمی اندازه‌گیری شود و حلقهی پسماند خواص مغناطیسی جالبی را در این مواد آشکار ‏می‌کند. یک حلقه‌ی پسماند را می‌توان با قراردادن نمونه در یک مغناطیس‌سنج و پاسخ ماده ‏‎(M,)‎‏ ‏به میدان مغناطیسی اعمالی ‏‎(H)‎‏ اندازه‌گیری کرد. چندین کمیت ممکن است از روی حلقه‌ی پسماند ‏به‌دست آید. ‏
اشباع مغناطیسی ‏‎(Ms)‎‏ یا اشباع مغناطیسی ویژه (‏s‏) مواردی‌اند که مقدار مغناطیسشدگی را وقتی ‏که همه دوقطبی‌ها در جهت میدان مغناطیسی اعمالی مرتب شده‌اند نشان می‌دهد.‏
مغناطیس باقیمانده ‏‎(Mr)‎‏ مغناطیسشدگی نمونه در میدان مغناطیسی صفر است و نیروی ‏بازدارندگی ‏‎(Hc)‎، نیرویی از میدان مغناطیسی است که برای تغییر مغناطیسشدگی باقیمانده نیاز است. ‏تغییر بایاس میدان ‏‎(HE)‎، مقدار جابجایی از مرکز حلقهی پسماند را نشان می‌دهد.‏
2-4-5 حلقه پسماندوقتی به یک ماده مغناطیسی، میدان مغناطیسی اعمال شود، مغناطش محیط سریع افزایش می‌یابد، با افزایش مقدار میدان اعمالی، شتاب افزایش و مغناطش کاهش می‌یابد، این کاهش شتاب ادامه می‌یابد تا مغناطش به مقدار اشباع خود Ms برسد [25].
تغییرات مغناطش مواد مغناطیسی در هنگام کاهش میدان، از رفتار قبلی خود تبعیت نمی‌کند، بلکه به خاطر ناهمسانگردی مغناطیسی در محیط، مقداری انرژی را در خود ذخیره می‌کنند. بنابراین وقتی میدان اعمالی در محیط صفر شود، مغناطش در ماده صفر نشده و دارای مقدار خاصی است که به آن مغناطش پسماند Mr گفته می‌شود. با کاهش بیشتر میدان به سمت مقادیر منفی، خاصیت مغناطیسی القا شده به تدریج کاهش می‌یابد و با رسیدن شدت میدان به یک مقدار منفی خواص مغناطیسی ماده کاملا از بین می‌رود. این میدان مغناطیس‌زدا را با Hc نشان می‌دهند و به نیروی ضد پسماند یا وادارندگی مغناطیسی معروف است. پسماند یا نیروی وادارنده عبارتست از میدان معکوسی که برای کاهش مغناطش به صفر نیاز است. با کاهش بیشتر شدت میدان، القای مغناطیسی منفی می‌شود و در نهایت به مقادیر اشباع منفی خود می‌تواند برسد. افزایش مجدد شدت میدان به سمت مقادیر مثبت، حلقه پسماند را مطابق شکل 2-3 کامل می‌کند. مغناطیس‌های دائمی غالبا در ربع دوم حلقه پسماند خود، مورد استفاده قرار می‌گیرند [26].

شکل 23 حلقه پسماند ماده فرو مغناطیس [26].
مواد مغناطیسی از نظر رفتار آن‌ها در میدان مغناطیس دو گروه تقسیم می‌شوند:
الف) مواد مغناطیس نرم
مواد مغناطیسی نرم با اعمال میدان مغناطیسی کوچک به راحتی مغناطیده می‌شود و با قطع میدان سریعاً گشتاور مغناطیسی خود را از دست می‌دهند. به عبارتی این مواد دارای نیروی وادارندگی پایین، اشباع مغناطیسی بالا و گشتاور پسماند پایین هستند.
مواد مغناطیس نرم در جاهایی که به تغییر سریع گشتاور مغناطیسی با اعمال میدان مغناطیسی کوچک نیاز است مانند موتورها، حسگرها، القاگرها و فیلترهای صوتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
ب) مواد مغناطیس سخت
مواد مغناطیس سخت موادی‌اند که به راحتی مواد مغناطیس نرم، مغناطیده نمی‌شوند و به میدان مغناطیسی اعمالی بزرگ‌تری جهت مغناطیده کردن آن‌ها نیاز است. این مواد گشتاور مغناطیسی را تا مدت‌ها پس از قطع میدان حفظ می‌کنند. همچنین دارای اشباع مغناطیسی، گشتاور پسماند و نیروی وادارندگی بالایی هستند. ساخت یا پخت این مواد در میدان مغناطیسی، ناهمسانگردی مغناطیسی را در این مواد افزایش می‌دهد که حرکت دیواره حوزه‌ها را سخت‌تر می‌کند و نیروی وادارندگی را افزایش می‌دهد. این امر می‌تواند تولید مادهی سخت مغناطیسی بهتری را تضمین کند. کاربرد این مواد در آهن‌رباهای دائمی و حافظه‌های مغناطیسی است [26].

شکل 24 حلقه پسماند در مواد فرومغناطیس نرم و سخت[26].
2-5 فریتفریت به آن دسته از مواد مغناطیسی اطلاق می‌شود که جزء اصلی تشکیل دهندهی آن‌ها اکسید آهن است و دارای خاصیت فریمغناطیس می باشند (آرایشی از فرومغناطیس) و پارامترهای مغناطیسی مطلوبی نظیر ضریب نفوذپذیری مغناطیسی بالا از جمله اصلی‌ترین خصیصه‌های آن‌ها به شمار می‌رود. بدین جهت کاربردهای بسیار وسیعی را در زمینه صنایع برق، الکترونیک، مخابرات، کامپیوتر و… به خود اختصاص داده‌اند.
یکی از انواع فریت‌ها نوع اسپینلی آن است، فریت‌های اسپینلی با فرمول عمومی 2-o2+A3+B که در آن 2+A و 3+B به ترتیب کاتیون‌های دو و سه ظرفیتی می‌یاشند.
فریت‌ها دارای خاصیت فریمغناطیس می‌باشند نظم مغناطیسی موجود در فریمغناطیس‌ها ناشی از برهم‌کنش‌های دو قطبی‌های مغناطیسی نیست بلکه ناشی از برهم‌کنش تبادلی است در برهمکنش تبادلی هم‌پوشانی اوربیتال‌های اتمی مد نظر می‌باشد در فریت‌ها برهم‌کنش تبادلی ناشی از هم‌پوشانی الکترون‌های اوربیتال d3 یون‌های A و B و الکترون‌های اوربیتالP 2 یون‌‎های اکسیژن است. و قدرت این بر‌هم‌کنش تبادلی است که خاصیت مغناطیسی نمونه را رقم می‌زند.
2-6 خلاصهدر این فصل به شیمی آئروژل و دو روش بالا به پایین و پایین به بالای تولید نانوذرات اشاره شد. سپس خاصیت مغناطیسی مواد و فاز‌های مغناطیسی ممکن برای مواد مغناطیسی بررسی شد. پس از آن توضیح کوتاهی در مورد حلقهی پسماند و موارد قابل اندازه‌گیری از آن گفته شد و در نهایت مختصری از مواد فریتی بیان گردید.
فصل سومساخت آئروژل و کاربردهای آن19509215088990
مقدمهسیلیکا آئروژل‌ها به دلیل ویژگی‌های منحصر به فرد، هم در علم و هم در تکنولوژی توجه زیادی را به خود اختصاص داده‌اند. آئروژل‌ها از پیشماده مولکولی با روش‌های مختلف و تکنیک‌های خشک کردن متفاوت برای جایگزینی منافذ مایع با گاز همراه با حفظ شبکهی جامد، تهیه می‌شوند. [27]
علی‌رغم تمامی تلاش‌های قابل توجهی که در این زمینه صورت گرفته است، چالش‌های اصلی تحت کنترل عوامل یکنواختی(همگنی)، بارگذاری، اندازه و توزیع نانوذرات در شبکه‌ی میزبان آلی باقی ماندهاست، در عوض این شبکه‌ی میزبان به طور مستقیم ویژگی‌های الکتریکی، نوری، مغناطیسی و کاتالیزوری مواد نانوکامپوزیت را حفظ می‌کند.
3-1 سنتز آئروژل با فرآیند سل-ژلتفاوت در ویژگی‌های شیمیایی پیش‌ماده‌ها برای فاز نانو (معمولاً نمک فلزی) و برای ماتریس آلی (عموماً الکوکسید‌ها) موضوع مهمی هستند، چرا که پارامترهای فرآیند سل-ژل بر روی هیدرولیز و چگالش هر کدام از این پیشماده‌ها تأثیر متفاوتی دارد [28]. هر چند این موضوع مساله‌ی مهمی در طراحی هر نانوکامپوزیت سل-ژل است اما در رابطه با آئروژل‌ها حیاتی‌تر می‌باشد، زیرا نیازمند جایگزین شدن حلال موجود در ژل (معمولاً اتانول یا متانول در الکوژل و آب در آکوژل) با تغییر حلال و در نهایت حذف کردن به وسیلهی استخراج حلال فوق بحرانی است. مرحله خشک کردن فوق بحرانی، بسته به این که الکل یا کربن دی اکسید به صورت فوق بحرانی تخلیه شود (به ترتیب نیازمند حرارتی در حدود 350 و 40 درجهی سانتیگراد است). این مرحله مسائل دیگری درباره حلالیت پیشماده‌ها و پایداری حرارتی در شرایط خشک کردن فوق بحرانی را مطرح می‌کند [29]. استراتژی‌های مختلف اتخاذ شده برای سنتر نانوکامپوزیت‌های آئروژل، بسته به اینکه فاز نانو (یا پیش‌مادهی آن) در حین یا بعد از فرآیند سل-ژل اضافه شود، دو رویکرد کلی دارند.
روش اول شامل هیدرولیز و ژل شدن نانوذرات و ماتریس پیشماده و ژل شدن ماتریس پیش‌ماده به همراه شکل‌گیری نانوذرات است. مزیت این روش تولید موادی با بارگذاری نانوذرات قابل کنترل است. از طرفی، چندین اشکال در مورد آن مطرح است. برای بهدست آوردن ژل دارای چند ترکیب همگن شرایط سنتز باید به صورت دقیق انتخاب شود و پیشماده‌های نانوذرات و همچنین عوامل پوشش دهی موردنیاز در شکل‌گیری نانوذرات کلوئیدی ممکن است بر سنتز سل-ژل ماتریس تأثیر بگذارد.
روش دوم شامل روش‌های مبتنی بر اضافه کردن فاز نانو بعد از فرآیند سل-ژل است و باید ساختار متخلخل و مورفولوژی ماتریس را حفظ کند. این روش‌ها شامل تلقیح فاز نانو با اشباع، ته‌نشینی و روش رسوبگذاری بخار شیمیایی می‌باشد. طرح‌واره روش‌های مختلف برای شیمی سنتز نانوکامپوزیت آئروژل در شکل 3-1 نشان داده شده است.
هرچند این روشها نیز دارای دو اشکال عمده هستند: یکی همگنی ضعیف ترکیب نانوکامپوزیت تولیدشده، دیگری ترد و شکننده بودن آئروژل‌ها. اتصال فلز در یک ماتریس با گروه‌های هماهنگ اصلاح شده است و غوطه‌ور کردن الکوژل و آکوژل در محلول قبل از خشک کردن فوق بحرانی، به ترتیب به عنوان راهحلهایی برای غلبه بر کاستی‌های گفته شده است. رسوب نانوذرات از فاز بخار، بر خلاف روش‌های تلقیح مرطوب، ماتریس متخلخل را تغییر نمیدهد و تضمین میکند که فاز مهمان در سراسر ماتریس توزیع خواهد شد [30].

شکل 3-1 طرح‌واره‌ای از روش‌های مختلف برای شیمی سنتز نانوکامپوزیت [33].
3-2 شکل‌گیری ژل خیسژل‌های سیلیکا به طور عمومی با هیدرولیز و واکنش چگالش پیشماده سیلیکا به‌دست می‌آیند. ماتریس سیلیکای نهایی متخلخل است و حفره‌های ژل با حلال جانبی هیدرولیز و واکنش پلیمریزه شدن پر شده است. اگر ترکیب محلول بهتواند از ژل خیس بدون سقوط قابل ملاحظه ساختار خارج شود، آئروژل شکل می‌گیرد [31].
روش سل-ژل شامل یک یا چند پیشماده سیلیکون است که متداول‌ترین آن‌ها TEOS و TMOS می‌باشند و داراری چهار گروه الکوکسید شناخته شده در آرایش چهار وجهی در اطراف اتم سیلیکون مرکزی است. واکنش هیدرولیز در چهار جهت اتفاق می‌افتد و منجر به پیوند Si-O-Si می‌شود و یک مادهی کپهای که ترکیبی از 2SiO را می‌دهد. اگر یکی از شاخه‌های الکوکسید اتم سیلیکون توسط گروه عاملی مختلفی که قادر نیست تحت واکنش چگالش قرار گیرد، جایگزین شود گروه عاملی با پیوند کووالانسی به اتم سیلیکون درون ماتریس ژل باقی خواهد ماند. الکوکسیدهای فلزی به راحتی با آب واکنش می‌دهد و بر حسب میزان آب و حضور کاتالیست، عمل هیدرولیز ممکن است کامل انجام شود.
ملکول‌های شکلگرفته آلی-فلزی به مرور زمان بزرگ می‌شوند و به صورت یک ساختار پیوسته در داخل مایع در می‌آیند. این ساختار پیوسته که حالت الاستیک دارد، ژل گفته می‌شود [32].
به طور کلی شکل‌گیری محلول پایدار الکوکسید یا پیشماده‌های فلزی حل شده مرحله اول فرآیند تهیه آئروژل است. این محلول همگن به‌دست آمده در مرحله دوم به علت وجود آب هیدرولیز شده و سل یکنواختی را ایجاد می‌کند. در مرحله سوم واکنش بسپارش ادامه پیدا می‌کند تا سل به ژل تبدیل شود. این مرحله، پیرسازی نیز گفته می‌شود. پس از آن مرحلهی نهایی که خشک کردن است باقی می‌ماند.
3-3 خشک کردن آلکوژلبعد از شکل‌گیری ژل توسط هیدرولیز و واکنش چگالش، شبکه Si-O-Si شکل می‌گیرد. بخش پیرسازی به تشدید شبکه ژل اشاره دارد؛ ممکن است چگالش بیشتر، تجزیه، و ته‌نشینی ذرات سل یا تبدیل فاز داخل فاز جامد یا مایع صورت گیرد. این نتایج در یک جامد متخلخل که حلال در آن گیر افتاده است اتفاق می‌افتد. فرآیند حذف حلال اصلی از ژل (که معمولاً آب و الکل است) را خشککردن می‌گویند. در طول فرآیند خشککردن، ترکخوردگی اتفاق می‌افتد به این دلیل که نیروی مویینگی در گذار مایع-گاز در داخل منافذ ریز وجود دارد. معادله لاپلاس در اینجا به کار می‌رود، هر چه شعاع مویینگی کوچک‌تر باشد، ارتفاع مایع بیشتر و فشار هیدروستاتیک بالاتر خواهد بود. هنگامی که انرژی سطح باعث بالا رفتن ستون مایع داخل مویرگ‌ها می‌شود، مقدار فشار سطحی داخل مویرگ قابل محاسبه است.
قطر حفره در ژل از مرتبهی نانومتر است، به طوری که مایع ژل فشار هیدروستاتیک بالایی را باید اعمال کند. هلال داخل حفره‌ها و نیروهای کشش سطحی سعی می‌کند تا ذرات را به عنوان مایع در حفره‌ها تبخیر کند. این نیروها می‌توانند به گونه‌ای عمل کنند که باعث سقوط حفره و ساختار شوند. بنابراین ژل‌ها با حفره‌های ریز زیاد تمایل به انقباض و ترک خوردن دارند [33]. سل ژلهایی که شیمی سطح آن‌ها اصلاح نشده (شکل3-2) و در شرایط محیط خشک شدند به علت این فروپاشی منافذ تا حدود یک هشتم حجم اولیهی خود کوچک میشوند؛ ماده حاصل زیروژل نامیده میشود. اگر این فرآیند خشککردن به آرامی رخ دهد، زیروژل یکپارچه سالم میتواند تولید شود. اما برای تولید یک آئروژل، باید از عبور از مرز فاز بخار-مایع اجتناب کرد.

شکل 3-2 اصلاح شیمی سطح ژل [34].
روشهای کنونی برای پرهیز از فروپاشی منافذ درساخت آئروژل را میتوان در سه تکنیک کلی دستهبندی کرد. هرکدام از این تکنیکها طراحی شدهاند تا نیروهای مویینگی ناشی از اثرات کشش سطحی را کاسته و یا حذف نمایند. این تکنیکها الف) خشک کردن در شرایط محیط پس از اصلاح سطح، ب) خشک کردن انجمادی و ج) خشک کردن فوق بحرانی است [34]. توضیح کلی درباره هرکدام از این تکنیکها در ادامه آمده است.
3-3-1 فرآیند‌های خشککردن در شرایط محیطاین تکنیکهای خشک کردن طراحی شدهاند تا ژل خیس را در فشار محیط خشک کنند. این روشها نیازمند فرآیندهای شیمیایی با تعویض طولانی مدت حلال برای کاهش نیروهای مویینگی وارد بر نانوساختار یا برای افزایش توانایی نانوساختار در تحمل این نیروهاست (یا با قویتر کردن ساختار و یا با منعطف‌تر ساختن آن). تغییر شیمی سطح ژل خیس بر پایه TEOS برای ارتقاع انقباض قابل برگشت با استفاده از تبادل حلال با هگزان به وسیله اصلاح سطح با فرآیند کاهش گروه سیلانولی با TMCS [35و36]. همچنین استفاده از پیری ژل در محلول الکل یا الکوکسید برای سفت شدن میکرو ساختار به منظور جلوگیری از فروپاشی منافذ است [37]. به علاوه ترکیبکردن شاخه‌های متقاطع سیلیکا آئروژل است که می‌تواند نیروهای مویینگی در حین خشک کردن تحت فشار محیط را تحمل نماید [38].
3-3-2 خشککردن انجمادیخشککردن انجمادی یک ژل خیس منجر به تولید کریوژل میشود. خشککردن انجمادی باعث تولید پودر آئروژل کدر می‌شود [39]. این تکنیک حلال اضافی را با تصعید حذف میکند. ژل خیس منجمد میشود و سپس حلال در فشار پایین تصعید میشود [40]. میکروبلور‌های منجمد که حین فرآیند خشککردن انجمادی شکل می‌گیرند منجر به آئروژل‌های ماکروحفره‌تری در مقایسه با روش استخراج فوق بحرانی میشوند [41].
3-3-3 خشک کردن فوق بحرانیروشهای استخراج فوق بحرانی از مرز بین مایع و بخار با بردن حلال به بالاتر از نقطه فوق بحرانی آن اجتناب می‌کند و سپس از ماتریس سل-ژل به عنوان یک مایع فوق بحرانی حذف می‌شود. در این حالت هیچ مرز مایع-بخاری وجود ندارد، بنابراین هیچ فشار مویینگی دیده نمی‌شود. شکل 3-3 چرخه فشار-دما در طول فرآیند فوق بحرانی را نشان می‌دهد. در عمل انواع متعددی از روشهای استخراج فوق بحرانی وجود دارد که شامل تکنیک‌هایی با دمای بالا، دمای پایین و سریع است.

شکل 3-3 چرخه فشار-دما در حین فرآیند خشک کردن فوق بحرانی [42].
تکنیک‌های استخراج فوق بحرانی الکل دمای بالا، ژل خیس را به حالت فوق بحرانی حلال (معمولاً متانول یا اتانول) در یک اتوکلاو و یا هر مخزن فشار دیگری می‌برد. این مستلزم فشارهای بالا حدود Mpa 8 و دماهای بالا حدود 260 درجهی سانتیگراد می‌باشد [42]. شکل 3-4 شماتیکی از دستگاه خشککن فوق بحرانی اتوکلاو را نشان می‌دهد.

شکل 3-4 شماتیکی از دستگاه خشک کن فوق بحرانی اتوکلاو [42].
تکنیکهای استخراج فوق بحرانی دمای پایین بر اساس استخراج 2CO است که دمای نقطه بحرانی پایین‌تری نسبت به مخلوط الکل باقیمانده در منافذ سل-ژل بعد از پلیمریزاسیون دارد. این روش به تبادل حلال به طور سری نیازمند است، ابتدا حلال غیرقطبی و سپس با کربن دیاکسید مایع پیش از استخراج فوق بحرانی که می‌تواند در نقطه فوق بحرانی 2CO اتفاق بیافتد [43]. مزایای این تکنیک دمای بحرانی پایین‌تر و حلال پایدارتر است؛ هرچند مراحل اضافه شده به فرآیند سبب طولانی‌تر شدن زمان آمادهسازی آئروژل می‌شود. از آنجائیکه فشار بحرانی مورد نیاز نسبت به روشهای فوق بحرانی دما بالا تغییری چندانی ندارد (فشار بحرانی 2CO مشابه متانول و اتانول است)، این فرآیند نیز نیاز به استفاده از مخازن فشار دارد. به علاوه روند انتشار تبادل حلال وابسته به اندازهی ژل است.
تکنیکهای استخراج فوق بحرانی سریع از یک قالب محدود استفاده می‌کند، چه در مخزن فشار و چه در یک فشار داغ هیدرولیک قرار بگیرند. این تکنیکها فرآیندهای تک مرحله‌ای پیش‌ماده به آئروژل هستند و آئروژل را در کمتر از 3 ساعت بهدست می‌آورند. در این روش پیشماده‌های شیمیایی مایع و کاتالیست در یک قالب دو قسمتی ریخته می‌شوند سپس به سرعت گرم می‌شوند [44]. در ابتدا فشار با بستن دو بخش قالب با هم یا با اعمال فشار هیدروستاتیکی خارجی به جای مخازن فشار بزرگ‌تر یا با ترکیبی از این دو تنظیم می‌شود. زمانیکه نقطه فوق بحرانی الکل فرارسید، اجازه داده میشود تا مایع فوق بحرانی خارج شود [45]. برای مثال گوتیه و همکارانش [46] در روند انجام این فرآیند از یک فشار داغ هیدرولیکی برای مهروموم کردن و گرم کردن قالب حاوی مخلوط پیشماده آئروژل استفاده کردند. مخلوط مایع از پیشماده‌های آئروژل در یک قالب فلزی ریخته شد و سپس در فشار داغ قرار گرفت. در طول اجرا، فشار داغ برای مهروموم کردن ترکیب به جای قالب استفاده شد و یک نیروی باز دارندهی فشاری را فراهم کرد. سپس قالب و مخلوط به بالای دما و فشار فوق بحرانی متانول برده شد. در مدت زمان این فرآیند گرم کردن، پیشمادههای آئروژل واکنش نشان داده و یک ژل خیس نانوساختاری متخلخل را تشکیل داد. زمانیکه به حالت بحرانی رسید، فشار کاهش داده شد و مایع فوق بحرانی رها شد.
3-3-4 مقایسه روش‌هاهر یک از روش‌های ساخت آئروژل شرح داده شده در بالا، نقاط قوت و محدودیت‌هایی دارند. مقایسه مستقیم تکنیک‌های مختلف خشک کردن به علت دستورالعمل‌های پیشماده متفاوت، شرایط ژل شدن مختلف، و زمان پیر سازی، به خوبی روش‌های استخراج متفاوت هستند. برای مثال خشککردن فوق بحرانی دما پایین نیاز به زمان پیرسازی کافی دارد، به طوری که ژل‌ها می‌توانند از ظرف اولیه برای استخراج و تبادل حلال خارج شوند.
در فرآیند خشککردن سریع، عموما زمان پیرسازی کوتاه است؛ گرچه، دمای بالا در این فرآیند اثر مشخصی را روی روند واکنش چگالش دارد.
مزیت اصلی تکنیک‌های خشک کردن در فشار محیط، عدم نیاز به تجهیزات فشار بالا می باشد که گران قیمت و به طور بالقوه خطرناک است؛ اگرچه به مراحل پردازش چندگانه با تبادل حلال نیاز دارند. تا به حال مطالعات اندکی در رابطه با استفاده از روش‌های خشککردن انجمادی شده است. این تکنیک‌ها نیاز به تجهیزات خاصی برای رسیدن به دمای پایین لازم برای تصعید حلال و منجر شدن به پودر آئروژل، دارند.
محدودیت اصلی تکنیکهای فوق بحرانی دما بالا، رسیدن به دماهای بالای مورد نیاز برای دست یافتن به نقطه بحرانی حلال الکل و نیز ملاحظات ایمنی در بکار بردن مخزن فشار در این شرایط است.
روش استخراج دما پایین به طور گسترده در تولید آئروژل‌های یکپارچه کوچک تا بسیار بزرگ استفاده شده است، اگرچه می‌تواند روزها تا هفته‌ها تولید آن طول بکشد و مراحل چندگانه تبادل حلال مورد نیاز، آن را تبدیل به فرآیندی پیچیده کند و اتلاف قابل ملاحظه‌ای از حلال و 2CO ایجاد می‌کند. تکنیک‌های خشککردن سریع ساده‌تر و سریع‌تر است. تمامی فرآیند، بر خلاف مراحل چندگانه و مقیاس‌های زمانی در ابعاد روزها و ماهها در سایر روش‌ها، در یک مرحله انجام شده و می‌تواند در چند ساعت تکمیل شود. همچنین این روش‌ها اتلاف کمتری را به وجود می‌آورند. یک ایراد روش‌های خشککردن سریع، نیاز به دما و فشار بالاست [47].
3-4 مروری بر کارهای انجام شدهاگرچه میدانیم که این گزارش‌های جامعی از مقالات مرتبط با نانوکامپوزیت‌های آئروژل نیست، اما تأکید بر این مطلب است که چگونه ترکیب نانوذرات ممکن است احتمال استفاده از آئروژل‌ها را به عنوان مواد جدید افزایش دهد و چگونه مسیر آماده سازی مورد اطمینان برای به‌دست آوردن نانوکامپوزیت‌های آئروژل برای کاربرد خاص را انتخاب نماییم.
پس از آنکه کیستلر در سال 1931 برای اولین بار بدون درهم شکستن ساختار ژل، فاز مایع را از آن جدا کرد، در سال 1938 به مطالعه روی رسانایی گرمایی آئروژل و در سال 1943 درباره سطح ویژه آن‌ها به مطالعه پرداخت [48]. بعد از آن حدود نیمقرن دانشمندان علاقه‌ای به آئروژل‌ها نشان ندادند تا در اویل 1980 آئروژل به عرصه پژوهش بازگشت.
در سال 1992تیلسون و هاربش از TEOS به عنوان پیشمادهی سیلیکا ژل استفاده کردند و از میکروسکوپ الکترونی روبشی برای مشخصه‌یابی آن‌ها استفاده نمودند [49] و سپس هر ساله تحقیقات زیادی روی آئروژل‌ها صورت می‌گیرد.
در سال 2001 کاساس و همکارانش نانوکامپوزیت مغناطیسی را با ورود ذرات اکسید آهن در سیلیکا آئروژل میزبان سنتز کردند. این سنتز که به روش سل-ژل و با خشککردن فوق بحرانی متانول انجام شد، دو نمک آهن استفاده شد: O2H9.(3ON)Fe و O2H2.(EDTA)FeNa. در این پژوهش ارتباط واضحی بین پیشماده، آب و تخلخل و سطح ویژه آئروژل حاصل وجود داشت. استفاده از ترکیب EDTA به عنوان پیش‌مادهی نانوذرات، قطر میانگین حفره‌ها را افزایش داد، گرچه قابلیت حل پایین نمک EDTA در محلول یک مانع بزرگ برای رسیدن به آهن در این روش بود. مساحت سطح ویژه‌ی نمونه‌های کاساس بین /g2m 200 و /g2m 619 بهدست آمد و برخی نمونه‌ها رفتار پارامغناطیس و برخی دیگر رفتار مغناطیس نرم از خود نشان دادند [50].
در سال 2002 واگنر و همکارانش ذرات سیلیکا با هستهی مغناطیسی را با روش ته‌نشینی به‌دست آوردند [51]. و چند سال بعد در سال 2006 ژانگ و همکارانش ذرات پوسته‌ای هسته‌دار را با روش سل-ژل تهیه کردند. این ذرات شامل هستهی مغناطیسی فریت کبالت و پوستهی سیلیکا بودند که از TEOS به عنوان پیشمادهی سیلیکا استفاده کردند. پس از آنکه ژل‌ها به‌دست آمدند، در 110 درجهی سانتیگراد برای 4 ساعت در خلاء خشک شدند زیرا اگر در هوا خشک شوند احتمال ته‌نشینی بلور‌های اکسید وجود داشت. سپس به مدت 2 ساعت در دماهای مختلف برای به‌دست آوردن نانو بلور پراکنده در ماتریس سیلیکا حرارت داده شد. برای نمونه‌ی آن‌ها شکل‌گیری فاز فریت کبالت در دمای 800 درجهی سانتیگرادکامل شد و خوشه‌های فریت کبالت به سمت نانو بلوری شدن پیش رفتند، زمانی که برهم‌کنش بین خوشه‌های فریت کبالت با ماتریس سیلیکا شکسته شد پیوندهای Si-O-Fe ناپدید شدند. بر طبق گزارش آن‌ها اشباع مغناطیسی نانوکامپوزیت‌ها با افزایش غلظت بیشتر فریت در ماتریس افزایش یافت تا مقدار بیشینه emu/g 98/66 برای نمونه با نسبت مولی 1:1 (wt% 80 فریت کبالت) به‌دست آمد [52].
سیلوا و همکارانش در سال 2007 کامپوزیت ذرات فریت کبالت پخش شده در ماتریس سیلیکا را به روش سل-ژل تهیه کردند. آن‌ها از TEOS به عنوان پیشماده سیلیکا و از نیترات به عنوان پیش‌ماده فریت استفاده کردند. پس از گذشت زمان پیرسازی، نمونه برای 12 ساعت در 110 درجهی سانتیگراد خشک شدند و ذرات فریت کبالت در ماتریس سیلیکا شکل گرفتند. پس از آن عملیات حرارتی برای 2 ساعت در دماهای 300، 500، 700 و 900 درجهی سانتیگراد انجام شد که باعث افزایش در اندازهی ذرات شد. رسوب ذرات خوشه‌ای فریت در دیواره‌های منافذ زیروژل با افزایش دما بیشتر شد و در دماهای بالاتر از 700 درجهی سانتیگراد بلورهای بزرگ‌تر کبالت داخل منافذ ماتریس شکل گرفتند و افزایش در مغناطش اشباع و پسماند مغناطیسی را باعث شدند [53].
در همان سال فرناندز و همکارانش نانو کامپوزیت سیلیکا آئروژل/ آهن اکسید را با فرآیند سل-ژل و تبخیر فوق بحرانی حلال سنتز کردند. آن‌ها نمونه‌ها با پیشماده‌های TEOS و TMOS را با تبخیر فوق بحرانی اتانول و متانول خشک کردند. ذرات مغناطیسی با اندازهی متوسط nm 6 با TEOS و متانول سنتز شدند در حالی که فری‌هیدرات‌ها از TMOS و اتانول به‌دست آمدند. بعضی نمونه‌های آن‌ها رفتار ابر پارامغناطیس از خود نشان دادند [54].
دو سال بعد ژنفا زی و همکارانش نانوذرات فریت کبالت را به روش هم‌نهشت شیمیایی و خشک شدن در هوا در دمای80 درجهی سانتیگراد تهیه کردند. اندازهی قطر نانوذرات سنتز شده nm 20 تا nm 30 بود و دمای کوری در فرآیند افزایش دما کمتر از فرآیند کاهش دما بود. مقدار اشباع مغناطیسی این ذرات emu/g 77/61 بهدست آمد که نسبت که مقدار کپه آن کوچک‌تر بود. در این پژوهش مقدار پایین نیروی وادارندگی به دو دلیل اتفاق می‌افتد: ذرات فریت ممکن است ساختار چند دامنه داشته باشند. شکل‌گیری چند دامنه‌ها و حرکت دیوارهای دامنه می‌تواند کاهش دامنه را نتیجه دهد. همچنین اگر اندازهی بحرانی ذرات [55] بهدست آمده بزرگ‌تر از قطر میانگین ذرات باشد، رفتار تک دامنه را از خود نشان می‌دهند. آن‌ها گزارش کردند که کاهش وادارندگی نمونه‌ها به رفتار وابسته به اندازهی ذرات بستگی دارد [56].
بلازینسکی و همکارانش در پژوهشی که در سال 2013 انجام دادند، سیلیکا آئروژل را با روش سل-ژل و فرآیند فوق بحرانی تهیه کردند. آن‌ها دریافتند که روش خشک کردن فوق بحرانی مؤثرترین روش برای بهدست آوردن بهترین ویژگی این محصولات است. بدین منظور آن‌ها دستگاه خشک کن فوق بحرانی را برای خود ساختند که فشار و دما به طور دستی تنظیم می‌شد و مرحله مهم در آمادهسازی سیلیکا آئروژل‌ها بود. به این ترتیب آن‌ها سیلیکا آئروژل‌های شفاف با مساحت سطح ویژه بالا به‌دست آوردند [57].
در گزارشی دیگر در سال 2014 ساجیا و همکارانش پودر آمورف فریت کبالت را به روش سل-ژل تهیه کردند و این روش را بهترین روش تهیه نانوذرات عنوان کردند. آن‌ها دریافتند که عملیات حرارتی برای تجزیه کامل مقدار مواد آلی و نیترات حاضر در پودر آمورف لازم است. در این فرآیند برای جلوگیری از ته‌نشینی یا رسوبگذاری این واکنش اسید سیتریک به آن اضافه کردند و سپس مراحل خشک کردن و عملیات حرارتی انجام شد. پارامترهای عملیات حرارتی، مرحله نهایی در آماده‌سازی نانوذرات فریت کبالت بودند که بررسی شدند. ساختار اسپینل در همهی نمونه‌های آن‌ها شکل گرفته بود و هنگامی که ذرات شروع به رشد کردند ناخالصی‌ها حذف شد. ویژگی مغناطیسی مرتبط با رفتار فریمغناطیس این نمونه‌ها مقدار emu/g 62 برای اشباع مغناطیسی را نشان می‌دهد [58].
در جدیدترین پژوهشی که دربارهی آمادهسازی و ارزیابی نانوکامپوزیت سیلیکا آئروژل/فریت در سال 2014 صورت گرفته است، کاتاگر و همکارانش نانوذرات فریت را به روش ته‌نشینی آماده کردند و سپس TMOS را به آن اضافه نمودند. برای این کار آن‌ها O2H6. 2NiCl، O2H6. 3FeCl و 2ZnCl را با اضافه کردن آب مقطر حل کردند. PH محلول در رفلاکس 110 درجهی سانتیگراد به مدت 24 ساعت 13 تنظیم شده بود. با حذف NaOH که برای PH اضافه شده بود، و شستن مکرر با آب مقطر و اتانول نانوذرات نتیجه شدند. بعد از بهدست آمدن نانوذرات به طور مستقیم به TMOS اضافه شدند و 3NH و آب دیونیزه به عنوان کاتالیست برای تهیه سل همگن اضافه گردیدند. برای مرحله پیر سازی قالب‌های حاوی سل را در اتانول به مدت 2 ساعت و دمای 50 درجهی سانتیگراد پیرسازی کردند و در نهایت ژل خیس را با خشک کردن فوق بحرانی کربن دی اکسید بهدست آوردند. تحقیقات آن‌ها نشان داد که زمان ژل شدن با افزایش نسبت مولی اتانول/TMOS افزایش یافت. همچنین به دلیل کشش سطحی اتانول، نمونه‌ها منقبض می‌شوند یا ترک می‌خورند. نانوکامپوزیت به‌دست آمده ساختار اسکلت شبکه‌ی سه بعدی را حفظ کرد. مساحت سطح ویژه با افزایش مقدار فریت از /g2m 700 تا /g2m 300 تغییر کرد. به علاوه ویژگی مغناطیسی فریت در ساختار نانو کامپوزیت تغییر نکرد [59].
3-5 برخی از کاربردهای آئروژل3-5-1 آئروژل‌ها به عنوان کامپوزیتهمانطور که پیشمادهی الکوکسید سیلیکون برای شکل‌گیری شبکه‌ی ژل با اکسیدهای فلزی دیگر به اندازه‌ی کافی واکنشی است، مطالعات زیادی در زمینه سنتز سیلیکا آئروژل برای کاربردهای مختلف صورت گرفته است [1].
3-5-2 آئروژل‌ها به عنوان جاذبآئروژل‌های فوق آبگریز و انعطافپذیر برای در جذب حلال‌های معدنی و روغن‌ها سنتز شدند. ونکاتشوارا رائو و همکارانش چگالی جذب و واجذب سیلیکا آئروژل‌های فوق آبگریز را با استفاده از یازده حلال و سه روغن بررسی کردند [60].
3-5-3 آئروژل‌ها به عنوان حسگرآئروژل‌ها تخلخل بالا، حفره‌های در دسترس، و سطح در معرض بالا دارند. از این رو کاندیداهای خوبی برای استفاده به عنوان حسگر هستند.بر اساس مطالعه وانگ و همکارانش روی آئروژل لایه‌ی نازک نانوذرات سیلیکا آئروژل نشان داد که مقاومت الکتریکی به طور قابل ملاحظه‌ای با افزایش رطوبت کاهش یافت. زیروژل همان مواد حساسیت کم‌تری را نشان داد. آئروژل‌هایی که اصلاح سطح شدند در مقایسه با آئروژل‌های آب‌گریز کمتر تحت تأثیر رطوبت قرار گرفتند و می‌توانند به عنوان ضد زنگ و عوامل آب‌گریز مورد استفاده قرار بگیرند [61].
چن و همکارش آئروژل‌هایی را برای کاربرد حسگرهای زیستی مطالعه کردند. در مطالعه آن‌ها، آئروژل‌های مزوحفره به وسیله پلیمریزاسیون سل-ژل با یک مایع یونی به عنوان حلال تهیه کردند. نتایج نشان می‌دهدکه آئروژل آماده شده می‌تواند به عنوان یک بسترشناسایی برای اسید نوکلوئیدها به کار رود [62].
3-5-4 آئروژل به عنوان مواد با ثابت دی الکتریک پایینلایه نازک‌های آئروژل 2SiO توجه خاصی را به خود اختصاص داد، به دلیل ثابت دی الکتریک خیلی پایین، تخلخل و پایداری حرارتی بالا. پارک و همکارانش لایه نازک سیلیکا آئروژل را برای لایهی داخلی دی الکتریک مورد بررسی قرار دادند و ثابت دی الکتریک را تقریبا 9/1 اندازه‌گیری کردند. آن‌ها ثابت دی الکتریک بسیار پایین فیلم‌های آئروژل را برای لایهی داخلی مواد دی الکتریک تولید کردند. فیلم های سیلیکا آئروژل به ضخامت Å 9500، % 5/79 تخلخل، و ثابت دی الکتریک پایین 2 با روش فرآیند خشک کردن محیط با استفاده از n-هپتان به عنوان حلال خشک کن به‌دست آوردند [63].
3-5-5 آئروژل به عنوان کاتالیزورمساحت سطح ویژه‌ی بالای آئروژل‌ها منجر به کاربردهای زیادی می‌شود، از جمله جاذب شیمیایی برای پاکسازی نشتی. این ویژگی کاربرد زیادی را به عنوان کاتالیزور یا حامل کاتالیزور به همراه دارد. آئروژل‌ها در کاتالیست‌های همگن مناسب هستند، زمانی که واکنش‌دهنده‌ها هم در فاز مایع و هم در فاز گاز هستند [27].
3-5-6 آئروژل به عنوان ذخیره سازیتخلخل بالا و مساحت سطح زیاد سیلیکا آئروژل‌ها می‌تواند برای کاربردهایی مثل فیلترهای گازی، جذب رسانهای برای کنترل اتلاف، محصور سازی، ذخیره سوخت هیدروژن به کار رود. آئروژل‌ها می‌توانند در مقابل تنش گذار مایع/گاز مقاومت کنند زیرا بافت آنها در طول پخت تقویت شد به عنوان مثال در ذخیره سازی، انتقال مایعات چون سوخت موشک‌ها کار برد دارد. به علاوه وزن پایین آئروژل‌ها بزرگ‌ترین مزیت است که در سیستم حمل دارو به دلیل ویژگی زیست سازگار آن‌ها مورد استفاده است [64]. کربن آئروژل‌ها در ساخت الکتروشیمی ابر خازن دو لایه کوچک استفاده شد. ابر خازن‌های آئروژل مقاومت ظاهری پایینی در مقایسه با ابر خازن‌های معمولی دارد و می‌تواند جریان بالا را تولید یا جذب کند.
3-5-7 آئروژل‌ها به عنوان قالبفیلم‌های سیلیکا آئروژل برای سلول‌های خورشیدی رنگ حساس استفاده شدند. مساحت سطح ویژه‌ی فیلم‌های آئروژل روی فیلم‌های شیشه‌ای رسانا تهیه شدند. نشست لایه اتمی برای پوشش قالب آئروژل با ضخامت‌های مختلف 2TiO با دقت کمتر از نانومتر انجام شد. غشاء آئروژل پوشش داده شده با 2TiO در سلول خورشیدی رنگ حساس گنجانیده شد. طول نفوذ شارژ با افزایش ضخامت 2TiO افزایش یافت که منجر به افزایش جریان شد [65].
3-5-8 آئروژل به عنوان عایق گرماجدای از تخلخل بالا و چگالی پایین یکی از جذاب‌ترین ویژگی‌های آئروژل رسانندگی گرمایی پایین آن‌ها است، علاوه بر این، از یک شبکه‌ی سه بعدی با ذرات ریز متصل شده تشکیل شده‌اند. بنابراین انتقال گرما از میان بخش جامد آئروژل‌ها از طریق مسیر پر پیچ و خمی است. فضای اشغال نشده در یک جامد توسط آئروژل به طور معمول با هوا پر شده مگر آن که تحت خلاء مهروموم شده باشد. این گازها می‌توانند انرژی حرارتی را از طریق آئروژل انتقال دهند. حفره‌های آئروژل باز هستند و اجازه عبور گاز از میان مواد را می‌دهند [27].
3-5-9 آئروژل‌ها در کاربرد فضاییناسا از آئروژل‌ها برای به دام انداختن ذرات گرد و غبار روی فضاپیما استفاده کرد. ذرات در برخورد با جامد اسیر شده، گازها تبخیر می‌شوند و ذرات در آئروژل به دام می‌افتند [27].
جدول 3-1 کاربردهای مختلف آئروژل‌ها را به طور مختصر نشان می‌دهد.
3-6 خلاصهدر این فصل پس از مقدمه‌ی کوتاه، اندکی در مورد سنتز آئروژل با روش سل-ژل گفته شد. پس از آن فرآیند‌های لازم برای شکل‌گیری ژل بیان شد و سپس تکنیک‌های مختلف خشک کردن و شرایط لازم برای این کار با مختصری توضیح نوشته شد. بعد مروری کوتاه به برخی از تلاش‌های انجام شده در این زمینه داشتیم و در آخر برخی از کاربردهای مختلف آئروژل‌ها را با ذکر مثال درج شد.
جدول 3-1 کاربردهای مختلف آئروژل‌ها [27].
خاصیت ویژگی کاربرد
رسانایی الکتریکی بهترین جامد عایق
شفاف
مقاومت در برابر درجه حرارت بالا
سبک ساخت و ساز ساختمآن‌ها و عایقبندی لوازم خانگی
ذخیره سازی
ماشین، وسیله نقلیه فضایی
دستگاه‌های خورشیدی
چگالی/تخلخل سبک‌ترین جامد مصنوعی
سطح ویژه_ی بالا
کامپوزیت‌های چندگانه کاتالیزور
حسگر
ذخیرهی سوخت
تبادل یون
فیلترهای آلاینده‌های گازی
اهداف ICF
حامل رنگ‌دانه
قالب
اپتیکی شفافیت
شاخص بازتاب پایین
کامپوزیت‌های چندگانه اپتیک سبک وزن
آشکارسازهای چرنکوف
راهنماهای نوری
عایق صوتی سرعت صوت پایین اتاق‌های ضد صدا
تطبیق مقاومت ظاهری صوتی در التراسونیک
مکانیکی الاستیک
سبک جاذب انرژی
تله برای ذرات سرعت بالا
الکتریکی ثابت دی الکتریک پایین
قدرت دی الکتریک بالا
سطح ویژهی بالا دی الکتریک برای ICها
جدا کنندهی الکترودهای خلا
خازن
فصل چهارمسنتز و بررسی ویژگی‌های نانوکامپوزیت سیلیکا آئروژل/نانوذرات فریت کبالت21434265186580مقدمهآئروژل‌ها کاندیدا‌های ایدهآلی برای طراحی نانوکامپوزیت‌های کاربردی تقویت شده با نانوذرات فلزی یا اکسید فلزی هستند. مساحت سطح ویژهی بالا با ساختار حفره‌ای، آئروژل‌ها را قادر می‌سازد تا به طور موثری میزبان نانوذرات ریز پراکندهشده باشند و این اطمینان را می‌دهد که نانوذرات در دسترس هستند.
راه گسترش آئروژل‌های کاربردی برای تهیهی مواد کاربردی خلاق از طریق طراحی نانوکامپوزیت‌ها است، به طوری که نانوذرات فلز یا اکسید فلز به داخل ماتریس آئروژل الحاق می‌شوند. با توجه به گسترش محدوده و قابلیت زیستی آئروژل‌ها، تهیه این نانوکامپوزیت‌ها برای جلوگیری از تجمع نانوبلورها و رشد از طریق ذرات بستر برای یک کاربرد خاص را فراهم می‌کند.
4-1 مواد مورد استفاده در پژوهش آلکوکسیدهای فلزی یک دسته از خانواده‌ی ترکیبات آلی فلزی میبا شند که شامل یک بنیان آلی چسبیده به یک عنصر فلزی یا شبهفلزی میباشند. تترا اتیل اورتو سیلیکات (TEOS) که دارای نماد شیمیایی 4)5H2Si(OC می‌باشد از جمله الکوکسیدهایی است که به عنوان پیشماده در سنتز سیلیکا آئروژل به کار می‌رود. در این پژوهش از TEOS به عنوان پیشماده سیلیکا ژل با جرم مولی g/mol 33/208 استفاده شد. متداول‌ترین آئروژل‌ها با بسپارش سل-ژل سیلیکا الکوکسید سنتز شدند [66]. نیترات آهن(ΙΙΙ) 9 آبه و نیترات کبالت(ΙΙ) 6 آبه به ترتیب با جرم مولی‌های g/mol 404 و g/mol 04/291 برای تهیه نانوذرات فریت کبالت به کار رفت. متانول و آب دیونیزه به عنوان حلال نیاز بود.
4-2 روش تجربی و جزئیاتدر ابتدا برای سه درصد وزنی مورد نظر میزان گرم و لیتر مورد نیاز هر ماده محاسبه شد که در جدول 1 نشان داده شدهاست. در همهی درصد وزنی‌ها نسبت نیترات آهن(ΙΙΙ) 9 آبه به نیترات کبالت(ΙΙ) 6 آبه 2 به 1 باقی ماند.
جدول 4-1 میزان گرم و لیتر مواد مورد نیاز.
10% 15% 20% lit 0/20 lit 9/18 lit 8/17 TEOS
gr 4/2 gr 0/4 gr 8/4 نیترات آهن(ΙΙΙ) 9 آبه
gr 87/0 gr 4/1 gr 7/1 نیترات کبالت(ΙΙ) 6 آبه
پس از آن برای تهیه نانوذرات فریت کبالت ابتدا نیترات آهن(ΙΙΙ) 9 آبه در مقدار لازم آب دیونیزه روی همزن مغناطیسی بهخوبی حل شد و به طور همزمان نیترات کبالت(ΙΙ) 6 آبه در متانول حل گردید. پس از آنکه هرکدام از نیترات‌ها به مدت 30 دقیقه هم خوردند، محلول اول به محلول دوم اضافه شد و ترکیب حاصل 30 دقیقه دیگر روی همزن مغناطیسی باقی ماند. بعد TEOS به آرامی به آن اضافه شد.

شکل 4-1 فازهای مجزا نمونه روی همزن.
همانطور که در شکل 4-1 دیده می‌شود، در ابتدا فاز دو ترکیب مجزاست ولی بعد از گذشت مدت زمان حدود 15 الی 20 دقیقه سل یکنواختی حاصل شد که به مدت 1 ساعت روی همزن مغناطیسی ماند. پس از آن سل حاصل درون غالب ریخته شد تا عملیات هیدرولیز در دمای اتاق اتفاق بیافتد و الکوژل نهایی شکل بگیرد. هنگامی که نمونه‌ها در غالب ریخته شد، برای جلوگیری از در معرض هوا قرارگرفتن، با پوشش محکمی محافظت شد (شکل 4-2).

—d1926

In recent years studying genetic variation among population by determination of allele frequencies and genetic parameters became a new method that it has been done in different population all around the world. By using this method lots of similarities has been founded among population around the world. These similarities represent the same genetic pool and also it may show the same population in the past as well. So it seems that different population were one at the first and geographical situations or migrations were the reasons that caused its separation.
Studying short tandem repeats (STR) in genome is the best way to founding genetic variation in population. The aim of this study was to investigate the genetic variation of two population of Iran, Yazd and Kermanshah people.
For this purpose the genetic profile of 50 unrelated individual from each population prepared by using ABI kit. This kit contains fifteen str loci (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX, D18S51, D5S818 and FGA) and also amylogenin gene for sex determination. The result showed all the loci were in Hardy Weinberg equilibrium except two loci(D19s433 , D2s820) in Kermanshah and three loci (D19s433, D21s11 and VWA) in Yazd population. More over forensic parameters including PIC, PD, PE and MP have been calculated. After all the results have been compared with other population in neighbor countries.
This study revealed that these loci were the suitable loci for identification people and studying genetic population variation. Also the comparison showed that both of Yazd and Kermanshah people were similar to Turkish genetically, but were different from other countries. In addition Yazd has more homogeneous population than Kermanshah, that it could be due to pristine gene pool of this population in the past centuries.
Keywords: Short tandem repeats; Microsatellite markers; Population genetic
فصل اول
مقدمه
1-1 مقدمهدرگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به‌کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان‌گرهای ژنتیکی افراد است، که از مهم‌ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر‌کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین دلیل ازSTR ‏ها می‏توان در مطالعات جمعیتی و بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها سود جست [1].
علاوه بر مطالعات جمعیتی ازSTR ‏ها می‏توان در موارد تعیین هویت‏، تعیین ابویت، تست‏های پزشکی‏قانونی و سایر موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهایی که برای تعیین هویت و مطالعات ژنتیکی جمعیت به‌کار می‏روند، یکسان هستند و شامل پانزده جایگاه به نام‏های D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOXو TH01 می‏باشند [1].
هم‌چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).
1-2 نشان‌گر چیست؟
صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان‌گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان‌گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود‌فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان‌گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد‌:
1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)
2-به توارث برسد (2).
1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکینشان‌گرهای ژنتیکی عبارتند از:
1-نشان‌گرهای مورفولوژیک
2-نشان‌گرهای پروتئینی
3-نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA
1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک
کاربرد نشان‌گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان‌گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان‌گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل‌کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان‌گرها به شمار می‌آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).
معایب نشان‌گرهای مورفولوژیک
اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.
تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.
فراوانی و تنوع کمی دارند.
گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.
اساس ژنتیک بسیاری از نشان‌گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است‌(2).
1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی
در دهه‌ی 1950، نشان‌گرهای پروتئینی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین‏ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. برخی از تفاوت‏های موجود در ردیفDNA بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‏هایی با اندازه‏های مختلف تجلی کنند، که به روش‏های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می‏گردند. این قبیل نشان‌گرها را نشان‌گرهای مولکولی در سطح پروتئین می‏نامند که از آن جمله می‏توان به سیستم آیزوزایم/آلوزایم اشاره کرد. معمول‏ترین نوع نشان‌گرهای پروتئینی آیزوزایم‏ها هستند که فرم‏های مختلف یک آنزیم را نشان می‏دهند. آیزوزایم‏ها به‏ طور گسترده در بررسی تنوع ژنتیکی به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهای هم‌بارز نشان می‏دهند. اما این دسته از نشان‌گرها هم دارای معایبی هستند. برخی از معایب آن‏ها عبارت‌اند از:
محدود بودن فراوانی این نوع نشان‌گرها؛
تعداد آیزوزایم‏های قابل ثبت و مشاهده که می‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به یکصد عدد نمی‏رسد؛
محدود بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایم‏ها‌(نداشتن چند شکلی)؛
پیچیدگی فنوتیپ‏های الکتروفورزی آیزوزایم‏ها به دلیل دخیل بودن آنزیم‏های مرکب از چند پلی‌پپتید مستقل در ترکیب برخی از آیزوزایم‏ها‌(3).
اما پیشرفت‏هایی که در زمینه‏ی الکتروفورز دو‏بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده، تجزیه تحلیل هم‌زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوری پیشتاز در عرصه نشان‌گر‏های مولکولی مطرح شده‏اند. تاثیرپذیری نشان‌گرها از محیط که به‌طور معمول به‌عنوان یکی از محدودیت‏ها و نکات منفی نشان‌گرهای مولکولی یاد می‏شود، در مورد این نشان‌گر‏ها تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئومیکس‌(مطالعه سراسری کل پروتئین‏های موجود در یک سلول یا یک ارگانیسم) می‏تواند به‌طور هم‌زمان برای مطالعه بیان ژن و هم‌چنین برای شناسایی پروتئین‏های واکنش دهنده به شرایط محیطی مورد استفاده قرار گیرد(3).
1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA وRNA
دسته‌ای دیگر از تفاوت‏های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند. نه صفت خاصی را کنترل می‏کنند و نه در ردیف اسید‏های آمینه پروتئین‏ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‏ها را می‏توان با روش‏های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار داد. این نشان‌گر‏ها که تعدادشان تقریبا نا‏محدود است، فقط از راه تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند. بنابراین به آنها نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‏شود. نشان‌گرهای مولکولی فراوان و در هر موجود زنده‌ای می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. تاکنون تعداد زیادی از نشان‌گرهای DNA معرفی شده‌اند. این نشان‌گرها از نظر بسیاری از ویژگی‏ها مانند درجه‏ی چندشکلی، غالب یا هم‌بارز بودن، تعداد جایگاه‏های تجزیه شده در هر آزمایش DNA، توزیع در سطح کروموزوم، تکرار‌پذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‏یابی DNA الگو و هزینه‏ی مورد نیاز با همدیگر متفاوت‌اند. انتخاب بهترین نشان‌گر به هدف مطالعه (انگشت نگاری، تهیه نقشه پیوستگی، ژنتیک جمعیت و روابط تکاملی) و سطح پلوئیدی موجود مورد مطالعه بستگی دارد‌(4).
مزایای کاربرد نشان‌گرهای مولکولی
عدم تاثیرپذیری آنها از شرایط محیطی خارجی و داخلی موجود؛
امکان به‌کارگیری آنها در مراحل نخستین رشد جنینی حیوانات و مراحل نخستین رشد موجودات؛
فراهم نمودن امکان مطالعه موجودات در خارج از فصل و محیط کشت؛
دقت و قابلیت مطلوب تفسیر نتایج؛
هم‌بارز بودن بسیاری از این نشان‌گرها؛
امکان استفاده از آنها در مورد گونه‏های منقرض شده؛
سهولت تشخیص افراد ناخالص از خالص؛
سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل نتایج؛
دسترسی به برنامه‏های رایانه‏ای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر سریع نتایج‌(4)
انواع نشان‌گرهای مولکولی
نشان‌گرهای DNA گروه بزرگی از نشان‌گرها را تشکیل می‏دهند. این نشان‌گرها سیر تحول و تکامل خود را به پایان نرسانده‏اند و ابداع و معرفی روش‏های متنوع و جدیدتر ثبت و مشاهده‏ی تفاوت‏های ژنتیک بین موجودات از طریق مطالعه‏ی مستقیم تفاوت‏های موجود در بین ردیف‏های DNA هم‌چنان ادامه دارد. نشان‌گر‏های DNA در مدت یک دهه تکاملی شگرف و تحسین‌برانگیز داشته‏اند‌(5).
ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR یک روش سریع تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعه‌های مورد نظر DNA است. در واقع PCR روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون در کم‌تر از نیم‌روز امکان‌پذیر می‏سازد. اما این فرایند هنگامی امکان‌پذیر است که دست‌کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانندسازی DNAدر طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه‏ی مورد‌نظرDNA هستند، به‌عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‏گیرند تا واکنش آنزیمی همانندسازی DNA درون لوله‌ی آزمایش امکان‌پذیر شود. این همانند‏سازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‏های پلی‌مراز صورت می‏گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‏ها به صورت تجاری دردسترس هستند‌(6).
واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز (PCR) در سال 1983 توسط کری‌مولیس در حالیکه در یک نیمه شب تابستانی در حال رانندگی بود، ابداع گردید و سبب انقلاب عظیمی در زیست شناسی مولکولی شد(6).
همان‌گونه که در شکل 1-1 نشان داده شده است، نشان‌گرهای DNAبه دو دسته‏ی کلی طبقه‌بندی می‏شوند.
نشان‌گرهای DNAمبتنی بر PCR
نشان‌گرهای DNA غیر مبتنی PCR(6).

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی‌(10)
1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCRاین دسته از نشان‌گرهای DNA بدون استفاده از روشPCR تولید می‌شوند و مورد استفاده قرار می‌گیرند.
انواع نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر(RFLP)
پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)
ماهوارک‏ها
1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLPسرگروه نشان‌گرهای غیر‌مبتنی برPCR ، همان تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر یا RFLP است. از بین نشان‌گرهای مولکولی DNA، RFLP ها اولین نشان‌گرهایی بودند که برای نقشه‌یابی ژنوم انسان توسط بوتستین و همکاران در سال 1980 و پس از آن برای نقشه‌یابی ژنوم گیاهان توسط بر و همکاران در سال 1983 مورد استفاده قرار گرفتند. در اوایل دهه 1980 بوتستین و همکاران استفاده از تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم یا RFLP را برای مطالعه‏ی مستقیم DNA و یافتن نشان‌گر‏های ژنتیک جدید معرفی کردند. این تحول از پیامد‏های منطقی کشف آنزیم‏های محدودگر بود. این آنزیم‏ها که بسیار اختصاصی‏ هستند، ردیف‏های ویژه‏ای را روی مولکولDNA شناسایی کرده و آنها را از محل خاصی (نقطه‏ی برش) برش می‏دهند‌(7).
RFLP الزاما مختص ژن‏های خاص نیست، بلکه در کل ژنوم پراکنده است. ازاین رو، از نشان‌گرهای RFLP برای نقشه‌یابی تمام ژن‌ها در ژنوم انسان استفاده می‏شد(5). علاوه برRFLP که هنوز هم از قدرتمندترین و معتبرترین نشان‌گرهایDNA است، انواع مختلف نشان‌گرهایDNA با تفاوت‌های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه‌ی کاربرد، امتیاز‌بندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع ومعرفی شده‌اند‌(7).
مهم‌ترین مزایای RFLP
تکرارپذریری، دقت و قابلیت اعتماد این نشان‌گر فوق‌العاده زیاد است؛
این نشان‌گر هم‌بارز است و امکان تشخیص افراد خالص را از افراد ناخالص فراهم می‏آورد؛
فراوانی این نشان‌گر در حد بالایی است؛
RFLP تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد در صد ژنتیکی است(8).
برخی معایب RFLP
دشواری، پیچیدگی و وقت‌گیر بودن؛
RFLP ژنوم‌های بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روش‌های پیچیده‏تر و گران‏تر بیوشیمیایی است؛
RFLP نیازمند نگه‌داری میکروارگانیسم‌ها به‌منظور تهیه‏ی کاوشگر است که خود بر پیچیدگی این روش می‏افزاید؛
هزینه‏ی اولیه و نگه‏داری کاوشگر‏ها و کاربرد آنها بسیار زیاد است؛
نیازمندی به مقدار نسبتا زیاد DNA از محدودیت‏های دیگر روش RFLPاست به‌طوری که ده‏ها میکروگرم از DNAبرای هر فرد به منظور تجزیه‏ی ژنوم مورد نیاز است؛
از دیگر محدودیت‏های این نشان‌گر آن است که در گونه‏های بسیار نزدیک به یکدیگر این نوع نشان‌گر‏ها آلل‏های مشابهی را نشان می‏دهند(8).
1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)در سال1991، هاتادا و همکاران روشی را برای شناسایی و انگشت‌نگاری موجودات عالی ابداع و معرفی کردند. پیش از ابداع این روش که بر مبنای نشان‌دار کردن هم‌زمان انتهای هضم شده‏ی هزاران قطعه‌ی DNA است، ردیابی و ثبت موجودات عالی با روش نشان‌دار کردن انتهای هضم شده غیر ممکن می‌نمود. دو دلیل اصلی برای این تصور ذکر شده است:
ژنوم موجودات عالی بسیار بزرگ و پیچیده است برای مثال ژنوم انسان 109×3 جفت باز دارد و در نتیجه‏ی هضم آن با آنزیمی مانند EcoRI بیش از یک میلیون قطعه‌ی DNA به وجود می‌آید. تفکیک این تعداد مولکولDNA حتی با الکتروفورز دو بعدی نیز غیر ممکن است.
معمولا DNA ژنومی در هنگام استخراج به صورت تصادفی و غیر‌اختصاصی شکسته می‌شود و ایجاد مولکول‏هایی با انتهای تصادفی می‏کند. این امر سبب ایجاد پس‌زمینه‌ی ناشی از نشان‌دار شدن این انتهاها طی فرایند نشان‌دارکردن می‏شود‌(9).
برای رفع این دو نقص تدابیری پیش‏بینی شد و روش RLGS ابداع گردید. این روش جدید که برای تجزیه و تحلیلDNA ژنومی به‌کار می‌رود، بر مبنای این فرضیه است که نقاط برش اختصاصی آنزیم‏های محدودگر می‌توانند به‌عنوان نشانه و وجهه تمایز ارقام و افراد به کار گرفته‌شوند.
در این روش انتهای آزاد مولکول‌های DNA که در اثر صدمات مکانیکی در طی استخراج به وجود آمده‏اند، مسدود می‏شود. سپس برای کاهش پیچیدگی، DNA ژنومی توسط آنزیم‏های محدودگر، با محل برش نادر، هضم و نقاط برش به‌طور مستقیم با فسفر پرتوزا نشان‌دار می‏شوند. آنزیم‏های با محل برش نادر معمولا هزاران قطعه DNA به وجود می‏آورند. سپس با الکتروفورز دو‌بعدی، قطعه‏های هضم‌شده‏یDNA از هم جدا شده و خودپرتونگاری صورت می‏گیرد. این روش یک الگوی دو بعدی با هزاران نقطه‏ی پراکنده (قطعه‏های نشان‌دارDNA) ایجاد می‏کند که هر یک می‏توانند به عنوان یک نشان‌گر به کار گرفته شوند(10)
برخی از مزایای روشRLGS
در هر آزمایش هزاران نشان‌گر به‌دست می‌آید؛
مقدار کمی DNAمورد نیاز است؛
در صورت استفاده از آنزیم‌های محدودگر متفاوت، تفاوت‏های بیشتری ظاهر و ثبت خواهند شد[10].
برخی از معایب روش RLGS
DNA مورد نیاز برای این روش باید از کیفیت مطلوبی برخوردار باشد؛
هضم ناقص DNA توسط آنزیم‏های محدودگر نتایج تکرار ناپذیر و گمراه کننده‏ای خواهد داشت؛
این روش پیچیدگی فوق العاده‏ای داشته و تفسیر نتایج حاصل از آن دشوار است(10).
1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها
ماهوارک‏ها نخستین بار در سال 1985 توسط جفری و همکاران گزارش شدند. پس از آن در سال 1988 تکثیر جایگاه‏های ژنی خاص نواحی تکرارشونده، روی ماهوارک‏ها در ژنوم انسان انجام شد.
این دسته از نشان‌گرها از نظر تکنیکی مبتنی بر استفاده از کاوشگرهای مصنوعی و کاربرد مواد پرتوزا و روش ساترن هستند.
ماهوارک‌ها واحدهایی 10 تا 100 جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. آنها معمولا یک هسته مشترک 10 تا 15 جفت بازی دارند که احتمالا در تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها موثرند. ماهوارک‌ها بیش‌تر در نواحی یوکروماتین ژنوم پستانداران، قارچ‌ها و گیاهان متمرکز‌ند. تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها در حدی است که گاهی در انگشت‌نگاریDNA انسان مورد استفاده قرار می‏گیرند. از جمله‌ی ماهوارک‌ها می‏توان به تکرارهای پشت سر هم با فراوانی بالا (VNTR) اشاره کرد[11]. VNTR ها به دو دسته‌ی کلی تقسیم می‌شوند: VNTR تک مکانی و VNTR چند مکانی.
دسته‏ی نخست، تعداد متفاوت ردیف‌های تکراری در یک جایگاه ژنی و دسته‏ی دوم تعداد متفاوت ردیف‌های تکرار‌شونده در چندین جایگاه ژنی را نشان می‌دهند. الگوی بانددهی به‌دست آمده با استفاده از کاوشگر‌های VNTR تک مکانی ساده‏تر و قابل فهم‌تر است، زیرا هر فرد تعداد کمی باند واضح را نشان می‏دهد. در حالی‌که تعداد باندهای به دست آمده از کاوشگرهای مخصوص VNTRچند‌مکانی بیش‌تر است، به‌طوری که به‌طور هم‌زمان تا بیش از 30 باند به دست می‏آید(12).
در نخستین نشان‌گرهای مبتنی بر ماهوارک‌ها، از الیگونوکلئوتید‏های حاوی ریزماهواره به عنوان کاوشگر استفاده گردید و توسط علی و همکاران انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی نام‌گذاری شد.
از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی نشان‏دار‌شده مکمل با موتیف‌های کوتاه تکرار‌شونده در هیبریداسیون در ژل، با به کارگیری DNAژنومی برش داده شده با آنزیم‌های برشی خاص و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شده است. گوبتا و وارشنی در سال2000 طی تحقیقات خود مراحل زیر را برای انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی مطرح کردند:
جداسازیDNA ژنومی با وزن مولکولی زیاد
هضم DNAژنومی با یک آنزیم محدودگر مناسب
تفکیک قطعه‌های حاصل از هضم روی ژل آگارز
انتقال ساترن قطعه ها به غشا
دو ‏رگ‏گیری غشا با کاوشگر‏های(نشاندار با مواد پرتوزا یا غیر پرتوزا) الیگونوکلئوتیدی دربردارنده‏ی ردیف‌های دو یا سه تایی تکراری
خودپرتونگاری یا رنگ آمیزی برای مشاهده‏ی قطعه‌های دو رگ‌شده.
به‌کمک این روش می‌توان تنوع نواحی تکرار‌شونده‏ی مورد نظر را آشکار کرد. قطعه‌هایی از DNA که با الیگونوکلئوتیدها دو ‌رگ می‌شوند، در دامنه‌ای از اندازه‏ی چند صد جفت تا ده کیلو جفت باز قرار می‏گیرند. هم‌چنین گاهی بیش از یک نوع ماهواره در داخل یک قطعه‏ی برش داده شده قرار می‌گیرد. تفاوت‏هایی که این نوع نشان‌گرها نشان می‏دهند، به دلیل تفاوت در طول قطعه‌های برش داده‌شده‌ای است که در بردارنده‏ی ماهوارک‌ها هستند. از این روش برای شناسایی ژنوتیپ‌ها و همچنین در ژنتیک جمعیت استفاده می‌شود(12).
پس از مدتی، لیت و لوتی و سه گروه دیگر همین روش را برای ریزماهواره‏ها(عمدتا از نوع (CA)n) به‌کار بردند و دریافتند که ریز ماهواره‏ها به دو دلیل به مراتب آسانتر از ماهوارک‌ها با روش PCR تکثیر می‏شوند:
1-ریزماهواره‏ها کوچکتر از ماهوارک‏ها هستند؛
2-ردیف‌های تکرار‌شونده ریز ماهواره‏ای فراوانتر و توزیع آنها در کل ژنوم یکنواخت‌تر ازماهوارک‏هاست(13).
1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCRنشان‌گرهای مبتنی بر PCR نشان‌گرهایی هستند که از توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر برای تکثیر قطعه‏ی خاصی از DNA استفاده می‌کنند. روش‏های مختلف در این گروه، در طول و توالی آغازگرها، سختی شرایط PCR و روش‏های جداسازی و آشکار کردن قطعات با همدیگر فرق دارند.
انواع نشان‌گرهای مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر(AFLP)
DNA چند شکل تکثیر‌شده‏ی تصادفی(RAPD)
تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)
نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف (STS)
1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP)
در سال 1995 نشان‌گرهای جدیدی ابداع و معرفی شدند که به نظر می‌رسد بسیاری از محدودیت‌های نشان‌گر‌های پیشین را نداشته باشند. در این روش که AFLP نامیده می‏شود نشان‌گرهایی تولید می‏شوند که علاوه بر دارا بودن مزایایRFLP مانند دقت و تکرار‌پذیری ویژگی‌های مثبت روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز را نیز دارند. پایه‌ی این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‌ها از بین تمام قطعه‌های هضم شده‌ی DNA است و سه مرحله‌ی مجزا دارد:
هضمDNA با یه جفت آنزیم محدودگر و اتصال آنها به آداپتور‌های اولیگونوکلئوتیدی؛
طراحی، ساخت آغازگر و تکثیر انتخابی دسته‌ای از قطعه‌های حاصل از هضم .با استفاده از ردیف بازی آداپتور‌ها و نیز ردیف بازی نقاط برش، طراحی و ساخت آغازگر انجام می‌شود، اما برای تکثیر انتخابی قطعه‌های حاصل از هضم دو، سه یا چند نوکلئوتید به انتهای’3 ردیف آغازگر اضافه می‌شود که موجب می‌گردد فقط قطعه‌هایی تکثیر‌شوند که ردیف بلافصل آنها در مجاورت نقطه‌ی برش ،مکمل نوکلئوتیدهای یاد شده باشد؛
جداسازی قطعه‌های حاصل از تکثیر روی ژل‌های توالی‌یابی(پلی‌اکریل‌آمید) و خودپرتونگاری یا رنگ‌آمیزی نقره برای ثبت نتیجه‌ها.
با استفاده از این روش تعداد زیادی از قطعه‌های حاصل از هضم، تکثیر و قابل رویت می‌شوند. این در حالی است که نیازی به دانش اولیه در مورد توالی‌بازی قطعه‌هایی که تکثیر می‌شوند، وجود ندارند. هر یک از این قطعه‌هایی که به صورت باند روی ژل ظاهر می‌شوند، می‌توانند به عنوان یک نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرند.
تعداد قطعه‌هایی که با این روش تکثیر می‌شوند، به دقت و توانمندی روش‌های جداسازی (الکتروفورز)، ثبت نتایج و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولا در این روش بین پنجاه تا صد قطعه‌ی حاصل از هضم تکثیر و با استفاده از ژل‌های پلی‌اکریل‌امید واسرشت ساز ثبت می‏شوند(19)
مزایای AFLP
این روش در مقایسه یا سایر روش‌ها بیشترین تعدا نشان‌گر‌ها به ازای هر ژل را ایجاد می‌کند؛
در این روش نیازی به تهیه و تدارک و نگه‌داری کاوشگر نیست .دقت و تکرار‌پذیری این نشان‌گر به دلیل انتخاب دمای زیاد هم رشته‌سازی و اتصال آغازگر به DNA الگو بیشتر از RAPD است(20).
معایب AFLP
پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش‌های میتنی برPCR ؛
عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشان‌گر‌ها؛
غالب بودن این نشان‌گر موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می‏گردد؛
تکثیر قطعه‌های غیر‌واقعی در AFLP موجب کاهش قابلیت اعتماد این روش می‏گردد(20).
1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی(RAPD)در این روش از تک آغازگرهایی به طول هشت تا ده نوکلئوتید که ردیف بازی آن به طور قراردادی تعیین می‌گردد، استفاده می‏شود. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روی دو رشته‏ی DNA ژنومی می‌یابد و در آن نقاط به رشته‌های DNAمتصل می‌شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته‏ی مقابل به هم نزدیک باشند(فاصله‏ای که DNA قابل تکثیر باشد)، ردیف بین آن دو نقطه طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. فراورده‌های واکنش PCRروی ژل آگارز از هم جدا می‏شوند. تولید هر باند بیانگر وجود شباهت زیاد بین ردیف بازی آغازگرها و ردیف بازی محل اتصال درDNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را درDNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل های RAPD بیانگر جهش نقطه‌ای در محل اتصال آغازگرها و یا حذف یا (اضافه) شدن در ناحیه قابل تکثیر است. بنابراین چند شکلی در RAPDمعمولا به شکل حضور و غیاب یک باند پدیدار می‏شود. بدین معنی که نشان‌گرهای RAPD از نوع غالب‌اند و افرادی که دو نسخه از یک آلل دارند، به طور کمی از افرادی که یک نسخه از آن آلل را دارند، قابل تشخیص نیستند. تفاوت طول قطعه‏ها در RAPD از طریق تکثیر قطعه‌های DNA مکمل با ردیف‌های آغازگرهای اختیاری (ردیف مشخص ولی تصادفی) به‌دست می‌آیند. قطعه‏های تکثیر شده به صورت نوارهایی با وزن مولکولی متفاوت به‌طور مستقیم روی ژل قابل مشاهده‌اند (15).
مزایای RAPD
عدم نیاز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غیره؛
امکان بررسی هم زمان چندین جایگاه در ژنوم؛
عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ریف DNA برای ساخت آغازگر(16).
معایب RAPD
عدم تکرار پذیری؛
حساسیت بسیار به آلودگی؛
در صورت تغییر شرایط محیطی ظهور باندهای جدید؛
نامعلوم بودن جایگاه نشان‌گر RAPD روی نقشه‌ی ژنتیکی(16).
1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)تنوع‌ها و تفاوت‌هایی که به واسطه‏ی اختلاف در یک جایگاه نوکلئوتیدی(به علت جایگزینی، حذف یا ازدیاد) اتفاق می‌افتند، با عنوان تفاوت تک نوکلئوتیدی نامیده می‏شوند. این نوع از تنوع به‌وفور در ژنوم انسان اتفاق می‏افتد به طوری که مطالعات انجام گرفته توسط کاتانو-آنولز و گرس هوف (1998) در ژنوم انسان و اسب نشان می‏دهد که در فاصله‏ی هر دویست و پنجاه تا چهارصد نوکلئوتید یک SNP وجود دارد(17).
با اینکه‌SNP ها به وفور در ژنوم انسان یافت می‌شوند، ولی ایجاد و توسعه‌ی نشان‌گرهای SNP چندان آسان نیست. تهیه نشان‌گر‏های SNP شامل مراحل زیر است:


تعیین ردیف DNA اطراف SNP؛
تکثیر قطعه‌ای منحصر به فرد از DNA به کمک PCR به منظور غربال SNP؛
شناسایی SNP که شامل مشاهده‌ی دو آلل در افراد مختلف می‌باشد؛
مکان‌یابی نشان‌گر SNP و تعیین جایکاه خاص کروموزومی آن؛
تعیین فراوانی دو آلل در جمعیت؛
بررسی SNP در افراد و ژنوتیپ‌های مختلف(17).
برخی از معایب نشاگرهای SNP
SNPها به دلیل داشتن فقط دو آلل در یک جایگاه ژنی نسبت به نشان‌گر‌های چند آللی، اطلاعات کمتری را در نقشه‌های پیوستگی نشان می‌دهند؛
شناسایی نشان‌گرSNP بسیار پر‌هزینه و هم‌چنین زمان‌بر است(17).
1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف(STS)هر نشان‌گری که مبتنی بر واکنش PCR باشد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (معمولا بیش از بیست نوکلئوتید) ایجاد شود، یک نقطه‌ی نشانمند از ردیف نامیده می‏شود، زیرا پیش از طراحی آغازگر، بی‏شک در یک مرحله ردیف‌یابی صورت گرفته است. نشان‌گرهایی همچون تفاوت طول قطعه‌های قابل تکثیر (ALP) و ریزماهواره‏ها از آن جهت که مستلزم ردیف‏یابی برای طراحی آغازگر به منظور تکثیر DNA در یک نقطه‌ی خاص هستند، ذیل STS دسته‌بندی می‌شوند:
-تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
-ریز ماهواره‌ها (18).
1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
ALP یکی از ساده‏ترین و سریع‏ترین نشان‌گرهای مبتنی بر PCR است. اگر ردیف باز‏های قطعه‏ای از DNA در یک موجود مشخص باشد (یا دست کم بخشی از دو انتهای آن قطعه معلوم باشد)، براساس آن می‏توان به طراحی و ساخت مصنوعی آغازگرهایی به طول بیست تا سی نوکلئوتید اقدام کرد. چنان‌چه نمونه‏های مختلف DNA توسط این آغازگرها و از طریق واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز تکثیر و سپس روی ژل الکتروفورز از هم جدا شوند، در صورت وجود اختلاف در طول قطعه‏ی قابل تکثیر، باندهایی به اندازه‏های مختلف تولید خواهند شد که بیانگر وقوع پدیده‏ی حذف یا اضافه در بین نمونه‏های مورد مطالعه است. این تفاوت در اندازه‏ی قطعه‏های قابل تکثیر که جهش‏های ژنتیک را نشان می‏دهد به عنوان نشان‌گرهای ژنتیک مورد استفاده قرار می‏گیرد(14).
مزایای ALP
از نظر کاربردی در بین نشان‌گرهای DNA،یکی از سریع ترین و ارزان‌ترین‌ها است؛
به‌کاربرد مواد پرتوزا یا بیوشیمیایی پیچیده نیاز ندارد؛
به‌تدارک، نگهداری و کاربرد کاوشگرها نیاز ندارد؛
بسیار اختصاصی عمل می‌کند، تکرار پذیری آن خوب است و تا حد بسیار زیادی می‌توان به نتایج آن اعتماد داشت؛
به‌مقدار خیلی کمی از DNA نیاز است؛
هم‌بارز بودن این نشان‌گر امکان تشخیص افراد خالص از هر یک از انواع افراد ناخالص را فراهم می‌آورد(14).
معایب ALP
طراحی و ساخت آغازگرها، به اطلاعات اولیه در مورد ردیف DNAژنوم مورد مطالعه نیاز دارد که با توجه به اینکه ژنوم بسیاری از موجودات به طور کامل در دسترس نیست این روش استفاده بسیار کمی دارد؛
هزینه‌ی اولیه مورد نیاز به منظور تولید تعداد کافی نشان‌گر ژنتیک با توزیع مناسب در سرتاسر ژنوم بسیار زیاد و مستلزم صرف وقت است(14).
1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌هاریزماهواره‏ها شامل واحدهای یک الی شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت‏ها پراکنده‏شده‏اند. به طوری که در هر ده کیلو جفت باز از ردیف DNA دست کم یک ردیف ریزماهواره‏ای دیده می‏شود. طول ریز‌ماهواره‏ها معمولا کمتر از 100 جفت باز بوده و توسط دو ردیف منحصر به فرد در دو طرف محدود شده‏اند. ریزماهواره‏ها به سه گروه عمده‌ی تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولا توسط بازهای غیرتکرارشونده قطع می‌شوند) و تکرارهای مرکب(دو یا تعداد بیشتری از واحدهای مجاور یکدیگر) تقسیم می‏شوند. تعداد تکرارها در هر واحد بسیار متفاوت است. حداقل تعداد واحد تکرار‌شونده برای ریز ماهواره‏های دو نوکلئوتیدی به ترتیب ده و هفت بار تکرار تعیین شده است(21).
مزایای ریزماهواره‏ها
کاربرد آنها و تفسیر نتایج نسبتا ساده است؛
سیستم چند آللی(تا 11 آلل) از ویژگی‌های بارز این نوع نشان‌گر است؛
ریزماهواره‌ها بسیار متنوعند؛
به وفور در ژنوم یوکاریوت‏ها یافت می‏شوند؛
بیشتر ریزماهواره‏ها غیر‏عملکردی هستند؛
همبارز هستند [22].
1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنومریزماهواره‌ها بسیار فراوان بوده و در کل ژنوم موجودات به صورت تصادفی پراکنده اند. فراوانی ریزماهواره ها در بین موجودات زنده متفاوت است. برای مثال تخمین زده شده است که ژنوم انسان به طور میانگین ده برابر بیشتر از گیاهان ریزماهواره دارد. علاوه برDNA کروموزومی تعداد زیادی ریزماهواره در DNA کلروپلاست ها نیز گزارش شده است. به کمک روش‏هایی از قبیل دورگه‏گیری در ژل، نقشه‏یابی ژنتیکی و فیزیکی و هم چنین دورگه‏گیری در محل فلورسنت، ثابت شده است که ریزماهواره ها به طور یکنواخت در ژنوم پراکنده‏اند. اگرچه در برخی موارد می توانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند(12).
1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراریچنین فرض می‏شود که جهش در تعداد واحدهای تکرار شونده در هر یک ازDNA های تکرار شونده با یکی از دو سازوکار کراسینگ آور نامساوی(uco) یا جفت نشدن ناشی از سرخوردن در طول رشته (خطای همانندسازی DNA ) صورت می‏گیرد. بیشتر عقیده بر این است که ریزماهواره‏ها و ماهواره‏ها توسط سازوکار کراسینگ آور نامساوی ایجاد می‏شوند، ولی در مورد ریزماهواره‏ها برخی افراد یکی از دو سازوکار و برخی دیگر هر دو سازوکار را موثر می‏دانند(23).
1-5-1 کراسینگ اور نابرابرگاهی کراسینگ اور نابرابر در داخل تکرارهای ریزماهواره‏ای بین کروموزوم های مشابه یا خواهری اتفاق می‏افتد و سبب تغییر در تعداد واحدهای تکرار شونده می‏شود.(شکل 1-2).کراسینگ اور نابرابر می‏تواند هم در میوز و هم میتوز اتفاق بیفتد. چنین توجیه می‏شود که وجود نواحی تکرارشونده احتمالا مانع از ردیف شدن کامل در همولوگ یا کروموزوم‏های خواهری می‏شود. به نظرمی‏رسد که این نوترکیبی مکانیزم اصلی ایجاد تنوع مینی‏ستلایتی است(23).

شکل 1-2 کراسینگ آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف شدگی یا الحاق می‌شود(23.)
1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردن DNA در طول رشته(خطاهای همانند سازی)گاهی DNA پلی‌مراز در طول همانند سازی در نواحی تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای سر می‏خورد و موجب تغییر در تعداد واحد تکرار شونده می‏شود. در حقیقت سر خوردن پلی‌مراز در طول نواحی تکراری موجب عدم جفت شدن کامل دو رشته‏ی DNA شده و در نهایت حلقه‌هایی در رشته‌ی الگو یا رشته‏ی جدید ایجاد می‏شود(شکل1-3). این امر مکانیسم اصلی به وجود آورنده‏ی چندشکلی در میکروستلایت‌هاست(23).

شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد(23).اگر نتیجه‏ی همانند سازی ایجاد واحد های تکرار شونده‏ی اضافی باشد، حلقه در رشته ی جدید و اگر نتیجه‌ی همانند سازی کاهش در تعداد واحد‏های تکرار شونده باشد، حلقه در رشته‏ی الگو تشکیل خواهد شد(23).
گلدستین و شلوترر فرضیه‏ی عدم جفت شدن ناشی از سر‏خوردن در طول رشته را نسبت به فرضیه کراسینگ آور نامساوی به دلایل زیر به واقعیت نزدیکتر دانسته‏اند:
الف)‌در انسان بسیاری از تغییرات ریز ماهواره‏ای موجب تغییر در نشان‌گر های مجاور ناحیه ی ریز ماهواره‏ای نمی‌شود. بنابراین در ایجاد چنین تغییراتی نوترکیبی بی‏تاثیر است. از آنجا که جهش در فرضیه کراسینگ اور نامساوی، وابسته به نوترکیبی است، تغییرات ریز ماهواره ای و عدم تغییر نقاط مجاور با این فرضیه قابل توجیه نیست.
ب)‌نقصان در ژن‏هایی که در نوترکیبی نقش اساسی دارند تاثیری در پایداری ریز ماهواره‏ها ندارد.
ج)‌مطالعات انجام گرفته در ساکارومایسزسرویزیه نشان می‏دهد که پایداری ریز ماهواره‏ها در سلول‏هایی که تقسیم میوز را انجام می‏دهند مشابه با یاخته ها در تقسیم میتوز است. با توجه به اینکه نوترکیبی در میوز بیشتر از میتوز است، پس اگر فرضیه‏ی کراسینگ اور نامساوی صادق باشد، باید ریز ماهواره‏ها در میوز ناپایدارتر از میتوز باشد(23).
1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشوندهدو مدل متفاوت برای توصیف دامنه‏ی تنوع تعداد واحدهای تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای وجود دارد:
1.مدل جهش گام به گام
2. مدل آللی نا محدود
1-6-1 مدل جهش گام به گاماگر فرض کنیم در ریزماهواره‏ها یک گام معادل تغییر در یک واحد تکرار شونده باشد، بنابر این مدل ریز ماهواره‏ها از نظر اندازه فقط در تعداد محدودی گام تفاوت دارند، به‌طوری که هر گام از گام بعدی به وسیله‏ی یک واحد تکرار شونده جدا می‏شود. در این مدل چنین فرض می‏شود که بسیاری از جهش‏های با فراوانی زیاد، فقط ریزماهواره‏ها را در یک گام یا دو گام‌(در یک زمان) تغییر می‏دهند. طرفداران این نظریه معتقدند که در بیشتر آزمایش‏ها، بیشترین تغییر در ساختار ریزماهواره‏ها مربوط به افزایش یا کاهش در یک واحد تکرار شونده بوده است(10).
1-6-2 مدل آللی نا‏محدودبر اساس این مدل هیچگونه محدودیتی در اندازه‏ی پتانسیل ریزماهواره‏ها وجود ندارد. از این رو تعداد نا محدودی از انتخاب‏ها می‌توانند اتفاق بیفتند که تمامی آنها احتمال یکسان را داشته باشند.
بسیاری از پژوهشگران معتقدند که ترکیبی از این دو مدل(عموما تغییر در یک یا دو واحد تکرار شونده و به مقدار کمتر تغییرات بزرگتر) بهتر می‌تواند تغییرات جهشی در ریزماهواره‏ها را توضیح دهد(10).
1-7 مارکرهای STRتوالی‏های تکراری کوتاه پشت سر هم(STRS) ، توالی‏های تکرارشونده کوتاه با طول 1-13 نوکلئوتید هستند که به شکل سر به دم قرار می‏گیرند. در ژنوم انسان، معمول‏ترینSTR ، توالی دو نوکلئوتیدی [CA]n است،که در این فرمول n تعداد تکرارهاست که معمولا بین 5 تا 20 بار متغیر است(24).
1-8 کاربرد مارکرهای STRمارکرهایSTR کاربردهای فراوانی دارد که از مهمترین آنها تعیین هویت افراد است(25). تعیین هویت در موارد بسیاری کاربرد دارد که از جمله‏ی آنها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
1- مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی
2- شناسایی هویت قربانیان حوادث
3- تعیین هویت در موارد جنایی
4- ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی(26).
1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلیاز مارکرهایSTR می توان برای بررسی خویشاوندی دو یا چند نفر استفاده کرد. این نوع مطالعه را آنالیز فامیلی می‌گویند و کاربرد متداول آن در بررسی رابطه والدین ـ فرزندی است(27).
هرساله بیش از 300000 مورد تست ابویت به منظور تعیین رابطه پدر فرزندی در ایالات متحده انجام می‏شود. این تست‏ها معمولا شامل یک مادر، یک کودک و یک یا چند پدر مدعی است. همانطور که می‏دانیم هر فرد دارای دو سری آلل می‏باشد که یک سری آن را از پدر و سری دیگر را از مادر دریافت کرده است. بدین منظور آلل‏های پدر و فرزند برای یافتن تعدادی از جایگاه‏هایSTR مورد بررسی قرار می‏گیرند. اساس این تست بر این است که در فقدان جهش، آلل‏های کودک باید مطابقت کاملی با آلل‏های پدری و مادری داشته باشد(28-29-30).

شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد(26).علاوه بر این بسیاری از افراد برای شناسایی اقوام خود از مارکرهایSTR استفاده می‏کنند. برای مثال با آنالیز STR های کروموزومY می توان نسبت فامیلی میان مردان یک خانواده را مشخص کرد. زیرا همان‌طور که می‏دانید کروموزومY توارث پدری دارد و از پدر به تمام پسران به ارث می‌رسد. پس طبیعی است که تمام پسران خانواده در همه‏ی نسل‌هاSTR های یکسانی روی کروموزوم Y خود داشته باشند. آزمایشی که بدین منظور انجام می‏گیرد آزمایش Y-filer نامیده می‏شود. به کمک این آزمایش می‏توان روابط میان برادرها، عمو و برادرزاده و... را مشخص نمود(27-31).
1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادثفجایع بزرگ، طبیعی یا بدست بشر، می‌تواند جان افراد بسیاری را بگیرد، تست‏‏‏هایی که برای شناسایی قربانیان حادثه انجام می‏شود، تست تعیین هویت قربانیان حادثه نامیده می‏شود. از این تست در مواردی مانند سقوط هواپیما ،آتش سوزی‏های بزرگ و حوادث تروریستی استفاده می‏شود. در این قبیل حوادث با استفاده از اسامی افراد، خانواده‏های آنها شناسایی می‏شوند و پس از مراجعه‏ی خانواده‌ها، از اعضای خانواده شامل پدر، مادر، فرزند، خواهر و برادر نمونه‏ی DNA گرفته می‏شود و نواحی STR آنها بررسی می‏شود. پس از این مرحله با استفاده از DNAبه دست آمده از بقایای اجساد پروفایل ژنتیکی آنها تهیه می‏شود و در نهایت با مقایسه‏ی پروفایل‏های تهیه شده هویت قربانیان شناسایی می‏شود(32).
1-8-3 تعیین هویت در موارد جناییتعیین هویت در موارد جنایی شامل دو بخش می‏باشد:
شناسایی افراد مجهول الهویه
ردیابی مجرمین(25).
1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویههر ساله میلیون‏ها نفر در سراسر جهان تحت شرایط مشکوکی مفقود می‏شوند. بسیاری از این افراد قربانی فعالیت‏های مجرمانه از قبیل تجاوز و قتل می‏شوند و هویت آنها ناشناس باقی می‏ماند. در این موارد هم می‏توان از مارکرهای ژنتیکی موجود در DNA افراد برای تعیین هویت آنها استفاده کرد(33).
سه دسته نمونه در مورد افراد قربانی وجود دارد:
1-نمونه مستقیم از فرد قربانی
2-نمونه خانواده قربانی
3-نمونه‌های ناشناس باقی مانده از انسان در صحنه‏ی جرم
این نمونه‏ی باقی مانده می‏تواند استخوان، دندان، بافت، تار مو، لکه ی خون و یا هر چیز دیگری باشد(34).
1-8-3-2 ردیابی مجرمینعلاوه بر این می‏توان از آنالیز DNA برای ردیابی و شناسایی مجرمین استفاده کرد. این که فردی مرتکب جرم و جنایتی بشود و نمونه‌ای از DNA خود را به جا نگذارد، تقریبا غیرممکن است. مو، لکه‌های خون و حتی اثر انگشت، مقادیر بسیار جزئی از DNA را دارند که برای مطالعه با PCR کافی هستند. این بررسی‌ها لازم نیست که بلافاصله انجام شوند، زیرا در سال‌های اخیر، با آزمایش DNA روی مواد بایگانی شده، تعدادی از جنایات گذشته ـ با عنوان پرونده‌های مختومه ـ نیز روشن شده است(35).
باید به خاطر داشته باشیم که یک پروفایل DNA به تنهایی فاقد اعتبار است و کاربردی ندارد. همیشه برای بررسی یک پروفایل DNA نیاز است که یک مقایسه‏ای انجام شود:
1-نمونه ی مورد بررسی که با Q مشخص می شود
2-نمونه شناخته شده که با K نمایش داده می شود
در موارد جنایی، نمونه ی صحنه ی جرم (Q) با نمونه ی فرد مظنون (K) و یا مظانین (K1,K2,K3,K...) مقایسه می شود . در یک مورد بدون مظنون، نمونه ی صحنه ی جرم با نمونه هایی که در اطلاعات کامپیوتری از افراد سابقه دار وجود دارد، بررسی می شود . (K1,K….,KN)(34).

شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای STR(26).1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتیباستان شناسان با بررسی و مقایسه توالی DNA انسان‌های امروزی با افراد مرده، به کشف منشأ تکاملی انسان امروزی و مسیرهای استقرار انسان در کره زمین می‌پردازند. این زمینه تحقیقاتی آرکئوژنتیک نامیده می‌شود(35).
ردیابی مهاجرت انسانی در طول تاریخ با استفاده از آنالیز DNA روش نوینی است. هدف از این کار تخمین ارتباط میان جمعیت ها بر اساس شباهت‏ها و تفاوت‏هایDNA آنها است. به همین منظور پروژه‏ی عظیمی در سال2005 به منظور ردیابی تاریخ بشر انجام شد که در آن از ده ها هزار نفر از افراد در سراسر جهان آزمایش به عمل آمد. اساس کار بر این مطلب است که اگر تکامل ژنوم‏ها به دلیل انباشتگی جهش ها رخ داده باشد، بنابراین میزان اختلاف در توالی نوکلئوتید های دو ژنوم می تواند زمان حضور جد مشترک آنها را مشخص نماید. انتظار می رود دو ژنومی که اخیرا از یکدیگر جدا شده اند در مقایسه با دو ژنومی که جد مشترک آنها قدیمی‏تر است، اختلاف کمتری داشته باشند(36).
در مطالعه روی یافتن مبدا انسان‏های امروزی و الگوی جغرافیایی مهاجرت‏های بشر از مطالعه‏ی ژن‏ها در جمعیت‏ها می‏توان استفاده کرد. بدین منظور ژن‏های انتخابی جهت بررسی باید دارای گوناگونی باشند. در صورت فقدان گوناگونی ژن‏ها، اطلاعات فیلوژنتیکی بدست نمی‏آید، زیرا همه‏ی افراد حتی اگر به جمعیت‏های مجزایی تقسیم شده باشند که تنها به صورت متناوب با یکدیگر آمیزش داشته‏اند، همچنان دارای همانندی‏های بسیاری خواهند بود. بدین معنی که توالی DNA مورد استفاده در آنالیز فیلوژنتیکی باید از متنوع ترین توالی‏های متغیر باشد(36).
در انسان از سه نوع توالی استفاده می‏شود :
ژن های چند آللی مانند اعضای خانواده‏ی HLA، که اشکال بسیار متفاوتی دارند .
ریز ماهواره‏ها که STR ها نیز جز این گروه به حساب می‏آیند .
DNA میتوکندریایی که به دلیل فقدان سیستم‏های ترمیمی موجود در هسته‌های سلول انسان که نسبتا به سرعت دچار انباشتگی نوکلئوتیدی می‏شوند. انواع مختلف DNA میتوکندریایی موجود در یک گونه را هاپلوگروه می‏نامند(36).
باید توجه نمود که آلل‌ها و هاپلوگروه‌های مختلف به طور هم‌زمان در جمعیت‌ها وجود دارند. به این ترتیب این لوکوس‏ها چند شکلی بوده و به کمک مقایسه ترکیب آلل‌ها و یا هاپلوگروه‌های آنها می‌توان اطلاعات مربوط به وابستگی بین افراد مختلف را بدست آورد. به دلیل جهش‌های ایجاد شده در سلول‏های تولید مثلی هر یک از موجودات، آلل‏ها و هاپلوگروه‏های جدیدی در جمعیت ظاهر می‏شوند. هر یک از آلل‏ها، فراوانی آللی خود را دارند که در طول زمان به دلیل انتخاب طبیعی و تغییر ژنتیکی اتفاقی تغییر می‌کند. انتخاب طبیعی به دلیل تغییر در تناسب (توانائی یک موجود جهت بقا و تولید نسل) رخ می‌دهد و بنابر نظریه‌ی داروین منجر به حفظ انواع مناسب و از بین رفتن انواع زیان آور می‏گردد. به این ترتیب انتخاب طبیعی، فراوانی آلل‏های کاهنده‏ی تناسب را کم کرده و فراوانی آلل‏های افزاینده‌‌ی تناسب را افزایش می‏دهد. در حقیقت در یک جمعیت آلل‏های اندکی ایجاد می‏شوند که تاثیر قابل توجهی بر تناسب موجود داشته باشند، اما هم‌چنان فراوانی آنها به دلیل تغییر ژنتیکی اتفاقی که جز جدا نشدنی طبیعت تولد،تولید مثل و مرگ است در حال تغییر می‏باشد. به دلیل انتخاب طبیعی یا تغییر ژنتیکی اتفاقی ممکن است یک آلل در جمعیت غالب شده و فراوانی آن به صد در صد نیز برسد، به طوریکه این آلل در جمعیت تثبیت شود. اگر یک گونه به دو جمعیت تقسیم شود به طوریکه آمیزش‌های فراوانی بین دو جمعیت رخ ندهد، فراوانی آلل در دو جمعیت به طور مختلف تغییر می‌کند. بنابراین پس از چند ده نسل این دو جمعیت ویژگی‏های ژنتیکی مجزایی را کسب می‏کنند. سرانجام جایگزینی ژنی متفاوتی در این دو جمعیت اتفاق می‏افتد ولی حتی قبل از آن نیز می‏توان از روی اختلاف فراوانی آللی در دو جمعیت، آن دو را از هم باز شناخت(36).
محققان طی سال‏ها تحقیقات در سراسر جهان با استفاده از اصول تئوری اطلاعات، پارامترهای عمومی برای هر جمعیت را به منظور تعیین مقدار اطلاعاتی که مارکرهای STR در جمعیت‏ها به ما می‏دهند، تعریف کردند. در یک نمونه‏گیری از مارکرهای افراد از سراسر جهان، مارکرهایی که بیشترین چندشکلی را در میان جمعیت‏های مختلف داشتند و منحصر به جمعیت‏های خاص بودند، انتخاب شدند .امروزه از این مارکرها برای بررسی تنوع و تفاوت میان جمعیت‏ها استفاده می‏شود(37).
1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STRمارکرهای مختلف STR تحت عنوان کیت های تجاری مختلف در کنار تست‏های تعیین هویت کاربردهای گسترده‏ی دیگری دارند که از مهم ترین آنها می‏توان به موارد زیر اشاره کرد:
جمع آوری سلول های جنینی از خون مادر؛
بیماری های نقشه‏ی ژنومی؛
مشخص نمودن خطوط سلولی؛
تعیین هویت افراد استفاده کننده‏ی سرنگ مشترک؛
تشخیص کلون‏های موفق؛
بررسی و نظارت بر روی پیوند عضو؛
تشخیص کایمرهای ژنتیکی؛
تشخیص تومورهای سرطانی(26).
1-9-1 جمع آوری سلول های جنینی از خون مادرهنگامی که یک خانم باردار است تعدادی از سلول‌های جنینی می‏توانند از راه جفت وارد جریان خون مادر شوند. جمع‌آوری این سلول ها که تحت عنوان micro chimerism خوانده می‏شود و بررسی آنها با مارکرهای STR یک روش غیر تهاجمی برای تعیین رابطه‌ی پدر فرزندی است. همچنین با استفاده از این روش می‏توان جنسیت جنین را نیز تعیین نمود(26).
1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها
اسکن ژنوم انسان برای شناسایی نقشه ژنوم بیماری‏ها به طور معمول با استفاده از حدود چهارصد نشان‌گر STR در سراسر ژنوم در فواصل 10 سانتی مورگان انجام می‏شود. مرکز تحقیقات بیماری‏های ارثی در طول سال ها مطالعات و آزمایشات بسیاری را روی صدها نفر با استفاده از مارکرهای STR انجام داده است. هدف از این آزمایشات یافتن ارتباط میان فراوانی آللی در جمعیت های مختلف و بیماری های ژنتیکی بود. در پژوهش‌های صورت یافته ارتباط میان برخی مارکرها و بیماری‏ها مشخص شد. پس از آن از مارکر‏های مذکور می‏توان برای شناسایی تعیین دقیق محل ناشناخته‏ی ژن بیماری استفاده کرد(26).
1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترکیکی دیگر از کاربردهای مارکرهایSTR نشان دادن به اشتراک گذاری سرنگ در میان مصرف کنندگان مواد مخدر است. با این روش و با استفاده ازجایگاه D8 آزمایشگاه قادر به تشخیص هویت فرد و یا افرادی است که از یک سرنگ مشترک برای تزریق مواد مخدر استفاده کرده‏اند. با این روش می‏توان هویت شخصی را که منشا انتقال بیماری عفونی بوده و از سرنگ مشترک با سایر افراد استفاده می‏کرده تعیین نمود(26).
1-9-4 تشخیص کلون‏های موفقهنگامی که یک موجود کلون می‏شود ازSTR Typing برای آزمایش آن موجود استفاده می‏شود. برای مثال در کلون کردن موجوداتی مانند سگ و گربه. این روش برای آزمودن میزان موفقیت در کلون کردن به کار می‏رود. اگر یک پروفایل STR یکسان میان موجود کلون شده و سلول‎های مادری اولیه مشاهده نشود، در این صورت کلون کردن موفقیت آمیز نبوده(26).
1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضواز کاربردهای دیگر مارکرهای STR، نظارت پیوند سلول‏های پیوند شده بعد از پیوند مغز استخوان است، آزمایش STR از فردی که پیوند گرفته می‏تواند در تشخیص نارسایی پیوند مفید واقع شود(26).
1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکیChimerism حضور دو خط سلولی ژنتیکی متفاوت در یک ارگانیسم است که می‏تواند از طریق پیوند سلول‏های بنیادی خونی و یا انتقال خون و یا به طور ارثی در شخص اتفاق بیفتد. در سال 2004 آزمایشی روی افراد دهنده و گیرنده‏ی پیوند انجام شد که توانایی بالای 27 نشان‌گر STR به کار گرفته شده، ازجمله نشان‌گرهای CODIS در تشخیص کایمرها شگفت انگیز بود(26).
1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولیدر آزمایشگاه خطوط سلولی می‏توانند با سایر خطوط سلولی آلوده شوند. در نتیجه ممکن است با هم مخلوط و یا به یکدیگر تبدیل شوند احراز هویت خط سلولی انسان در حال حاضر به وسیله ی سازمانی در آمریکا انجام شده است. به کمک مارکرهای STR می‏توان آلودگی متقاطع بین خطوط سلولی مختلف را به سرعت کشف کرد و همچنین می‏توان برای مشخص کردن خطوط سلولی انسان به عنوان یک مرجع جهانی سود جست. در طول چند سال گذشته بیش از 500 خط سلولی از انسان به کمک این روش و با استفاده از 8 جایگاه STR بدست آمده است(26).
1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانیفقدان هتروزیگوسیتی (LOH) پدیده‏ای است که در آن حذف در یک ناحیه‏ی لوکوس منجر به عدم تکثیر در PCR می‏شود، به طوری که یک هتروزیگوت واقعی به عنوان یک هموزیگوت به نظر می رسد. این پدیده در بسیاری از افراد مبتلا به تومورهای سرطانی دیده می‏شود. بررسی روی بافت های سرطانی با بافت نرمال با استفاده از STR نشان می‏دهد که جایگاه های مختلف در بافت سالم ارتفاع بلندتری نسبت به بافت های سرطانی نشان می دهند؛چرا که LOH سبب حذف در آن ناحیه شده است(26).
1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولیدو روش کلی برای شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی عبارتند از:
اثر انگشت ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگر
تعیین الگوی DNA با PCR توالی‌های کوتاه تکراری(38).
1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگراولین روشی که در آنالیز DNA با هدف شناسایی افراد به کار رفت، روشی بود که در اواسط دهه 1980 توسط سر آلک جفری از دانشگاه لیستر ارائه شد . این روش براساس نوع دیگری از تنوع ژنوم انسان، موسوم به توالی تکراری بسیار متغیر پراکنده بود. همانگونه که از نام این توالی‌ها بر می‌آید، این توالی‌ها عبارتند از یک توالی تکراری که در جایگاه مختلفی‌(به‌طور پراکنده) از ژنوم انسان وجود دارد. نکته کلیدی این توالی‌ها این است که جایگاه ژنتیکی آنها متنوع است و در افراد مختلف در جایگاه‌های مختلفی از ژنوم قرار دارند(38).
توالی که در ابتدا برای انگشت‌نگاری ژنتیکی بکار رفت، توالی GGGCAGGANG (N: هریک از چهار نوکلئوتید) بود. برای تهیه اثر انگشت یک نمونه، DNA آن را با آنزیم محدودگر برش می‌دهند و قطعات حاصل را با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم تفکیک کرده و با آزمون ساترن بلات مورد بررسی قرار می‌دهند. هیبریداسیون با جستجوگری که دارای این توالی بود چند سری از نوارها را مشخص کرد. هریک از این نوارها مربوط به قطعه‌ای از DNA هضم شده بود که دارای این توالی تکراری بود. به دلیل تنوع جایگاه‌های این توالی اگر این آزمون با نمونه DNA فرد دیگری تکرار شود، نتیجه متفاوتی به دست می‌آید و می‌توان نتایج حاصل را انگشت‌نگاری ژنتیک این افراد محسوب نمود . در شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی نشان داده شده است(38).

شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی(38)
1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت نگاریاین روش در کارهای جنایی خود را بسیار ارزشمند نشان داد اما سه محدودیت داشت:
مقادیر بالایی از DNA برای انجام آزمون مورد نیاز است، زیرا این روش نیازمند آنالیز هیبریداسیون است. برای انگشت‌نگاری نمی‌توان از مقادیر اندک DNA موجود در مو و لکه‌های خون استفاده کرد.
بحث کردن در مورد الگوهای حاصل از انگشت‌نگاری مشکل است، زیرا نوارهای حاصل شدت و ضعف‌های متفاوتی دارند. از نظر قانونی، کوچک‌ترین اختلاف شدت در انگشت‌نگاری ژنتیکی یک متهم برای برائت او کافی است.
با وجود اینکه جایگاه‌های تکراری پراکنده بسیار متنوع هستند، اما اندک احتمالی نیز برای یکسان بودن یا حداقل تشابه الگوی حاصل از دو فرد وجود دارد. این موضوع می‌تواند منجر به برائت یک متهم شود(38).
1-10-2 روش پروفایلینگ
روش قدرتمند پروفایلینگ DNA چنین مشکلاتی را ندارد. در پروفایلینگ از توالی‌های معروف به توالی‌های چند شکلی STR استفاده می‌شود. در این روش، به وسیله PCR با پرایمرهایی که به توالی‌های جانبی STR می‌چسبند، به سرعت می‌توان مقادیر بسیار اندک DNA را افزایش داد. بعد از PCR، محصولات از نظر اندازه نوارها یا وجود نوارهایی که الل‌ یا آلل‌های موجود در نمونه DNAی مورد آزمون هستند، با الکتروفورز ژل آگارز بررسی می‌شوند. روش پروفایلینگ DNA، به دلیل استفاده از PCR بسیار حساس است و امکان انجام آزمون روی مو و دیگر نمونه‌هایی که مقادیر اندکی DNA دارند، فراهم می‌آورد. در نتایج حاصل نیز شکی وجود ندارد و مقایسه میان پروفایل‌های DNA معمولا به عنوان یک مدرک پذیرفته می‌شود. با استفاده از این روش امکان اینکه دو نفر، البته بجز دوقلوهای یکسان، دارای پروفایل‌ مشابهی باشند برابر یک در 1015 می‌باشد. با توجه به جمعیت کره زمین که حدود 109×6 می‌باشد، امکان تشابه آماری پروفایل مربوطه در دو نفر به قدری اندک است که می‌تواند غیرممکن تلقی گردد. نوع هر STR با PCR بوسیله پرایمرهایی که با فلورسنت نشاندار شده‌اند و به دو طرف نواحی تکرار شونده متصل می‌گردند، تعیین می‌شود. سپس الل‌های موجود در STRها با تعیین اندازه به وسیله ژل الکتروفورز موئینه‌ای مشخص می‌شوند. دو یا چند STR می‌تواند با PCR چندگانه مشخص گردد، مشروط به اینکه محصولات از لحاظ اندازه همپوشانی نداشته باشند یا هر جفت پرایمر با فلورسانت متفاوتی نشاندار شده باشند تا امکان تشخیص در ژل الکتروفورز موئینه را داشته باشند. در شکل 1-7 مراحل روش پروفایلینگ نشان داده شده است‌(38).

شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ ‌DNA(36).1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR
مارکرهای STRبرای اولین بار به عنوان ابزاری قوی در تست تعیین هویت انسانی در سال 1990 به‌کار گرفته شدند. دستگاه پزشکی قانونی ((FSS مطالعه برای شناسایی جایگاه‌های جدید و ارتباط جایگاه های شناخته شده با تنوع در جمعیت‏ها را آغاز کرد. پس از آن پلیس سلطنتی کانادا (RCMP) به همراه تعدادی از آزمایشگاه‌های اروپا تلاش‌های اولیه را در رابطه با جایگاه های STR آغاز کردند. اولین جایگاه‏های مورد استفاده شامل چهار جایگاه TH01،VWA ، FES/FPS و.F13A1 نسل دوم کیت‌ها ((SGM شامل جایگاه‌های TH01، VWA‌، FGA ،D8S1179 ،D18S51 و D21S11 بود. پایگاه داده‌های ملی DNA انگلستان ((NDNAD در سال 1995 جایگاه ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت) را به کیت SGM اضافه کرد. با توجه به تکنولوژی STR Typingو موفقیت‏هایی که در این زمینه در انگلستان به‌دست آمد، FBI درصدد برآمد که با استفاده از لوکوس‌های STR، بنیان CODIS را شکل دهد(41).
1-12 CODIS چیست؟سیستم شاخص اندیس‌دهی ترکیبی CODISشامل سیزده جایگاه STRاست. در شکل 1-8 محل قرارگیری این جایگاه‌ها روی کروموزوم‌های انسان نشان داده شده‌اند. نرم افزار CODIS در سال 1990 به عنوان نرم افزاری برای FBI تاسیس گردید. این نرم افزار در صورت اولیه برای آنالیز پروفایل‏های RFLP مورد استفاده قرار می‏گرفت که در بانک اطلاعاتی قابل جستجو بود. تکنولوژی DNA پزشکی قانونی و تکنولوژی کامپیوتری با یکدیگر ادغام گردیدند و باعث بهبود این نرم افزار شدند و این بهبود در جهت نیاز‌های پزشکی قانونی صورت گرفت. در سال 1997نرم افزار CODIS بر اساس مارکرهای STR طراحی شد. سیزده جایگاه STRکه امروزه تحت عنوان CODIS خوانده می‏شوند، عبارتند‌از:
D8S2179
D21S11
D7S820
CSF1PO
D3S1358
TH01
D13S317
D16S539
VWA
TPOX
D18S51
D5S818
FGA (42).

شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم های انسان(25).1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت
برای تعیین هویت از کیتAmp FI STR Identifiler PCR Amplification استفاده می‌شود، که حاوی 15 جایگاه تترانوکلئوتید STRبه همراه مارکر آمیلوژنین که برای تشخیص جنسیت به کار می‏رود می‏باشد. از این پانزده جایگاه، سیزده جایگاه، جایگاه‌های شناخته شده‏ی سیستم اندیس دهی ترکیبی‌(CODIS) هستند، اما علاوه بر آنها دو جایگاه دیگر هم در این کیت گنجانده شده است. جدول(۱-1) نشان دهنده‌ی نام جایگاه‏های موجود در CODIS، به همراه موقعیت کروموزومی هر یک از جایگاه‏ها و آلل‏های موجود در هر جایگاه است(43).
جدول 1-1 جایگاه‏های موجود در کیت ABIآلل‌های موجود در هر جایگاه موقعیت کروموزومی نام جایگاه
8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 8 D8S2179
24,24.2,25,26,27,28,28.2,29,29.2,
30,30.2,31,31.2,32,32.2,33,33.2,
34,34.2,35,35.2,36,37,38 21q11.2-q21 D21S11
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 7q11.21-22 D7S820
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 5q33.3-34 CSF1PO
12,13,14,15.16,17,18,19 3p D3S1358
4,5,6,7,8,9,9.3,10,11,13.3 11p15.5 TH01
8,9,10,11,12,13,14,15 13q22-31 D13S317
5,8,9,10,11,12,13,14,15 16q24-qter D16S539
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,
26,27,28 2q35-37.1 D2S1338
9,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15,
15.2,16,16.2,17,17.2 19q12-13.1 D19S433
11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,
22,23,24 12p12-pter VWA
6,7,8,9,10,11,12,13 2p23-2per TPOX
7,9,10,10.2,11,12,13,13.2,14,14.2,
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25
26,27 18q21.3 D18S51
X,Y Amelogenin
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 5q21-31 D5S818
17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,26.2
27,28,29,30,30.2,31.2,32.2,33.2,
42.2,43.2,44.2,45.2,46.2,47.2,48.2
50.2,51.2 4q28 FGA
1-14 معرفی استان‏ها1-14-1 استان کرمانشاه
کرمانشاه یکی از باستانی‌ترین شهرهای ایران است و بر اساس افسانه ها توسط طهمورث دیوبند - پادشاه افسانه‌ای پیشدادیان ساخته شده است. برخی از مورخین بنای آن را به بهرام پادشاه ساسانی نسبت می‌دهند. کرمانشاه در زمان قباد اول و انوشیروان ساسانی به اوج عظمت خود رسید. در اوایل حکومت شاه اسماعیل صفوی سلطان مراد آق قویونلو با 70 هزار نفر کرمانشاه و همدان را اشغال کرد. صفویه برای جلوگیری از تجاوز احتمالی امپراطوری عثمانی این شهر را مورد توجه قرار داد. در زمان شیخ علیخان زنگنه صدر اعظم صفوی به آبادانی و رونق کرمانشاه افزوده شد. تاورنیه، جهانگرد و بازرگان فرانسوی، درباره کرمانشاه چنین نوشته‌ است: ” هم زمان با حمله افغان و سقوط اصفهان که طومار فرمانروایی خاندان صفوی در نوردیده شد، کرمانشاه به جرم قرب جوار، با تهاجم عثمانی‌ها مواجه گردید و بار دیگر شهر رو به خرابی نهاد.“ نادر شاه به منظور آمادگی در مقابل تجاوز عثمانی‌ها، به این شهر توجهی خاص مبذول داشت. در زمان نادر شاه این شهر مورد هجوم عثمانی‌ها قرار گرفت. اما نادرشاه عثمانی‌ها را به عقب راند، ولی در اواخر زندگی نادرشاه، کرمانشاه با محاصره و تاراج عثمانی‌ها مواجه شد. کرمانشاه در عهد زندیه دستخوش آشوب فراوانی گردید. به طوری‌که درکتاب ”تحفه العالم“ عبدالصیف جزایری از کرمانشاه به عنوان خرابه نام برده شده است. در دوره قاجار تا حدی از حملات عثمانی‌ها به ناحیه کرمانشاه کاسته شد. در سال 1267ه.ق، امام قلی میرزا از طرف ناصرالدین شاه به سرحدداری کرمانشاه منصوب شد و مدت 25 سال در این شهر حکومت کرد و در همین دوره بناهایی را احداث و به یادگار گذاشت. این شهر در جنبش مشروطه سهمی به سزا داشت و در جنگ جهانی اول و دوم به تصرف قوای بیگانه درآمد و پس از پایان جنگ تخلیه شد. در نتیجه جنگ تحمیلی عراق علیه ایران، این شهر خسارات زیادی دید و پس از جنگ اقدامات مؤثری در جهت بازسازی آن صورت گرفت. در حال حاضر شهر کرمانشاه، مرکز استان کرمانشاه یکی از هفت کلانشهر کشور(تهران، مشهد، اصفهان، تبریز، شیراز، کرمانشاه و اهواز) است‌(44).
1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی
استان کرمانشاه در موقعیت ۳۴ درجه شرقی و ۴۷ درجه شمالی شمالی قرار دارد. از شمال به کردستان، از غرب به کشور عراق، از شرق به استان لرستان و همدان و از جنوب به استان ایلام محدود می گردد. شهرستان‌های این استان عبارت‌اند از: اسلام‌آباد غرب، سنقر، پاوه، صحنه، ثلاث باباجانی، قصر شیرین، جوانرود، دالاهو، روانسر، کرمانشاه، کنگاور، گیلان غرب، سر‌پل ذهاب، هرسین. در شکل1-13 استان کرمانشاه به همراه شهرستان‌های آن دیده می‌شود(44).

شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه)44.(1-14-2 استان یَزدیزد سرزمینی کهن با پیشینه‌ای در خور توجه، در تاریخ پر فراز و نشیب ایران است. نام یزد برای اولین بار در آثار دوره‌ی ماد‌ها (701 تا 550 قبل از میلاد) دیده می‌شود که گواهی بر قدمت سه هزار ساله‌ی این سرزمین است. در دوره‌های هخامنشی، اشکانی و ساسانی نیز در اسناد و کتیبه‌ها بار‌ها به نام یزد برمی‌خوریم(45).
حسن پیر‌نیا، در کتاب خود،"ایران باستان"،به نقل از تاریخ هرودوت، مورخ یونانی(484 تا 420 قبل از میلاد)، بر مبنای کتیبه‌های داریوش، یزد را بنا بر رسم یونانیان، به نام ایساتیس می‌خواند. وی می‌افزاید: یزد در عصر اشکانی در قلمرو حکومت مهرداد اول بود و در این شهر به نام او سکه ضرب می‌کردند. در دوره‌ی پادشاهی اردشیر بابکان، (241-224‌م) بنیان‌گذار سلسله‌ی ساسانی، یزد زیر نفوذ او بود. پس از ظهور اسلام و فروپاشی دولت ساسانی، در زمان خلافت عمر، و به روایت برخی، در دوران عثمان (دهه ی سوم هجری)، شهر یزد و نواحی آن فتح شد. از آن زمان تا پایان حکومت امویان، فرمانروایان عرب بر این ولایت حکم‌رانی می‌کردند. چنان‌که آمده است، در دوران خلافت حضرت علی(ع)، مسلم ابن زیاد، والی فارس، مالیات یزد را هم می‌گرفت. چنین بود تا هنگامی‌که به‌دست خود ایرانیان، حکومت های مستقل و نیمه مستقلی تشکیل شد و فرمانروایان ایرانی بر ولایت یزد حاکم شدند(45).
مرکز این استان، شهر یزد است. یزد منطقه‌ای خشک و بیابانی است. گروه بزرگی از زرتشتیان ایران در استان یزد و بویژه شهر یزد زندگی می‌کنند. زبان مردم استان یزد فارسی با لهجه یزدی است. آبادی نشینی در این منطقه از قدمت طولانی برخوردار است. این سرزمین از گذرگاه‌های مهم در ادوار تاریخی محسوب می‌شده‌ است. این ناحیه در دوره هخامنشیان از راه‌های معتبر موسسه‌های راهداری، مراکز پستی و چاپاری برخوردار بوده‌است. راهداری در یزد قدیم چنان اهمیتی داشت که خاندان آل مظفر از منصب راهداری ناحیه میبد به پادشاهی رسیدند. با این‌همه این استان از درگیری‌ها و جنگ‌های تاریخ کشور ایران تا حدودی ایمنی داشته‌است. سخت‌گذر بودن راه‌ها به همراه محدودیت منابع آبی مانع عمده تسخیر این منطقه توسط بعضی از حکومت های بزرگ و کوچک حاشیه و پیرامون این منطقه در طول تاریخ بوده‌است. همان طور که در شکل 1-14 دیده می شود استان یزد دارای شهرستان های ابرکوه، اردکان، بافق، بهاباد، تفت، خاتم، صدوق، طبس، مهریز، میبد و یزد می باشد که شهرستان های مهریز و تفت از آب و هوای خوبی برخوردار می باشد (45).
1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی
استان یزد در مرکز ایران در قلمرو سلسله جبال مرکزی ایران بین عرض های جغرافیایی 29 درجه و 48 دقیقه تا 33 درجه و 30 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 52 درجه و 45 دقیقه تا 56 درجه و 30 دقیقه شرقی از نصف النهار مبدا قرار گرفته است. استان یزد از سرزمین‌های تاریخی است که در میان ایالت های قدیمی و بزرگ پارس، اصفهان، کرمان و خراسان قرار داشته‌است(45).

شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد(45).1-15 هدف از تحقیق:آنچه که باعث استفاده از مارکرهای STR در جمعیت شناسی شده است، این واقعیت است که درجه فراوانی آللی هر مارکر STR در هر جمعیت منحصر به فرد است. در حقیقت طبق مطالعات انجام شده فراوانی آلل‏های STR در نژاد‏های مختلف و حتی در مناطق جغرافیایی خاص، تفاوت‏هایی را نشان داده است. بنابراین بررسی هر یک از لوکوس های STR در هر نژاد یا جمعیت خاص برای تفسیر صحت نتایج حاصل از انجام آزمایش های تعین الگوی ژنتیکی به کمکSTR و انجام محاسبات آماری مربوطه امری ضروری است. برای بهره گیری از فواید این فناوری نوپا در زمینه‏ی تشخیص افراد، ضروری است تا فراوانی آللی لوکوس‏هایSTR مختلف در جمعیت بومی کشور مورد بررسی قرار گیرند (45).
مطالعات گذشته روی جمعیت های ایرانی، حضور تعدادی از آلل‏ها را با پلی مورفیسم بالا نشان می‏دهد‌(37-46.)
هدف از این مطالعه به دست آوردن پارامترهای جمعیتی بر اساس فراوانی آللی به دست آمده از شانزده جایگاه STR، در جمعیت‏های کرمانشاه و یزد به منظور بررسی تفاوت ژنتیکی میان این دو جمعیت و سایر جمعیت‏ها می‏باشد.

فصل دوم
2-1 نمونه‌گیریبرای نمونه‌گیری از اقوام کرد و یزد از نمونه هایی که به آزمایشگاه ژنتیک پزشکی تهران رجوع می‌کردند، استفاده شد. پس ازکسب رضایت نامه 4 میلی لیتر خون محیطی از افراد غیر خویشاوند بر اساس محل تولد و اطلاعات مربوط به سه نسل گذشته (پدری و مادری) تهیه شد و در لوله‌های حاوی ماده ضد انعقاد (EDTA) ریخته شد برای تکمیل نمونه‌های یزدی از همکاری آزمایشگاهی در یزد استفاده گردید و برای نمونه‌های کرد به استان کرمانشاه رفته و از آزمایشگاه بیمارستان طالقانی نمونه‌گیری به عمل آمد.
2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباعاستخراج DNA با استفاده از روش استاندارد نمک اشباع طبق مراحل زیر انجام شد:
۱- ۳ میلی لیتر از نمونه‌ی خون محیطی حاوی ماده‌ی ضد انعقاد EDTA، داخل فالکون ۱۵ میلی لیتری ریخته شد و با استفاده از آب مقطر سرد به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس فالکون به شدت حرکت داده شد این کار جهت لیز بهتر گلبول‌های قرمز از طریق فرآیند تورژسانس می‌باشد. سپس نمونه را در دستگاه EBA 20 Hettich zentrifugen به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۵۰۰۰ سانتریفیوژ شد و محلول رویی خارج گردید و رسوب انتهایی فالکون نگه داشته شد.
۲- با افزودن آب مقطر سرد به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد و مجدداً با همان شرایط ذکر شده آن را سانتریفیوژ گردید و رسوب حاصل که حاوی گلبول‌های سفید است نگه داشته شد.
۳- پس از افزودن ml10 محلول I استخراج DNA به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس در شرایط ذکر شده آن را سانتریفوژ کرده و محلول رویی آن دور ریخته شد.
جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های قرمز)غلظت مواد
10 mM Tris-Hcl: pH:7.5
0.32 mM Sacarose
5 mM MgCl2
%1 Triton X-100
4-5/۱ میلی لیتر از محلول II استخراج DNA(از قبل تهیه شده به شرح زیر)، lμ ۲۵ سدیم دو دسیل سولفات ‌ SDS و lμ ۲۰ پروتئیناز K به رسوب سفید رنگ انتهای فالکون افزوده شد.
جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های سفید)غلظت مواد
10 mM Tris-HCl: pH:8.2
2mM EDTA: pH:8
0.45mM NaCl
۵- نمونه‌ها به مدت ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در دمایc° ۵۶ و یا به مدت یک شب در دمایc° ۳۷ در انکوباتور قرار داده شد تا رسوب حل شود.
۶- پس از افزودن lμ ۵۰۰ نمک اشباع به نمونه، به آرامی تکان داده شد و به مدت ۱۰ دقیقه در ۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی به یک فالکون حاوی ۲ میلی لیتر اتانول خالص (۱۰۰ درصد) انتقال یافت و به آرامی حرکت داده شد تا کلاف DNA شکل بگیرد.
۷- کلاف DNA توسط سمپلر به درون یک ویال حاوی ۱ میلی لیتر الکل ۷۰ درصد انتقال یافت تا الکل 100 خارج شود. در مرحله‌ی بعدی ویال را به مدت ۳ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دستگاه 20 Hettich zentrifugen Mikro سانتریفیوژ گشت.
۸- محلول رویی دور ریخته شد و ویال حاوی DNA به مدت ۵ دقیقه در انکوباتور قرار داده شد تا اتانول کاملاً تبخیر گردد.
۹- بر حسب میزان DNA بین ۵۰ تا ۳۰۰ ماکرولیتر TE به آن افزوده و به مدت یک شب در انکوباتور C°۳۷ قرار داده شد تا DNA به طور کامل حل شود.
جدول 2-3 ترکیبات TEغلظت محتویات
10mM Tris-Hcl, PH:7.6
1mM EDTA, PH:8
2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typingدر هر واکنش Multiplex PCR بهتر است از lμ ۵ نمونه‌ی DNA انسانی با غلظت ng ۱۰۰-50 استفاده شود. اگر‌چه حساسیت آنالیزی این روش در حد ng۵۰-20 از DNA می‌باشد. روش استخراج و نگهداری DNA می‌تواند روی نتایج PCR تأثیر گذار باشد. این روش نیاز به کیت خاصی برای استخراج DNA ندارد با این وجود توجه به این مسئله که در نمونه‌ها غلظت بالایی از آلودگی با نمک وجود نداشته باشد حائز اهمیت است. در این روش نباید از خون هپارینه استفاده شود زیرا هپارین می‌تواند ممانعت کننده‌ی مرحله‌ی PCR باشد. نمونه‌ی DNA را باید در TE حل کرد. pH نمونه‌ی DNA باید بین ۸ تا ۵/۸ باشد تا از دپوریناسیون در طی مرحله‌ی حرارت دادن اولیه جلوگیری شود. بهتر است در صورتی‌که قصد نگهداری طولانی مدت نمونه‌های DNA را داشته، نمونه را در دمای C°۲۰- نگهداری کرد. اگرچه DNA پس از حل شدن در TE به شدت پایدار است اما نگهداری طولانی مدت آن در دمای C °۴ ممکن است منجر به آلودگی آن با میکروارگانیسم‌ها شود .
۲-3-1 رسوب گذاری با اتانولبا توجه به این مسئله که نتایج مربوط به روش STR در نهایت با یکدیگر مقایسه می‌شوند، بهتر است نمونه‌های انتخاب شده از یک نوع بافت گرفته شوند و با روش یکسانی استخراج شوند. در مواردی که از نمونه‌های DNA قدیمی یا نمونه‌هایی با کیفیت نامناسب استفاده می‌شود و یا مواقعی که غلظت DNA مورد استفاده کمتر از ng/µl۴ است، روش‌های خالص سازی DNA مانند روش رسوب گذاری با اتانول، می‌تواند سبب بهبود کیفیت نمونه‌ها و ایجاد نتایج بهتر و مطمئن‌تری شود. استفاده از روش رسوب گذاری با اتانول آلودگی‌های ناشی از یون‌ها، نمک‌ها، اتانول و... را کاهش می‌دهد. غلظت نمک (NaCl)، نباید بیشتر از mM ۶۰ باشد تا دناتوراسیون به طور کامل انجام شود. هم‌چنین غلظت EDTA نباید بیش از mM۱ باشد زیرا EDTA به منیزیوم متصل شده و مانع انجام مرحله‌ی PCR می‌گردد. ناخالصی‌های یونی مانند آهن، اتانول و فنل نیز باعث کاهش فعالیت پلی‌مراز می‌گردند.
رسوب‌گذاری با اتانول به شیوه زیر بر روی نمونه‌ها انجام گرفت.
به میزان ۱/۰ حجم اولیه‌ی نمونه‌ی DNA استات سدیم M ۳ با 5/4:pH به نمونه‌ها اضافه شد.
به اندازه‌ی ۳ برابر حجم (پس از افزودن سدیم استات) به نمونه‌ها اتانول سرد خالص افزوده شد.
نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند و سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دور rpm14۰۰۰ سانتریفوژ گشتند.

user8290

4-5. تصاویر FE-SEM نمونه‌ها الف) 10%، ب) 15%، ج) 20%.55
4-6. نمودار توزیع اندازه ذرات الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%56
4-7 . پراش XRD نمونه‌های الف) 10%، ب) 15%و ج) 20% پیش از عملیات حرارتی58
4-8. پراش XRD نمونه‌های الف) 10%، ب) 15%و ج) 20% در دمای 600 درجهی سانتیگراد59
4-9. پراش XRD نمونه‌های الف) 10%، ب) 15%و ج) 20% در دمای 800 درجهی سانتیگراد60
4-10. آنالیز نمونه‌های الف)10%، ب) 15%و ج) 20% حرارت داده شده در دمای 600 درجه‌ی سانتی ‌گراد61
4-11. آنالیز نمونه‌های الف)10%، ب) 15%و ج) 20% حرارت داده شده در دمای 800 درجه‌ی سانتی ‌گراد62
4-12. طیف‌های جذبی FT-IR الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%.65
4-13. تصویر TEM یکی از نمونه‌ها67
4-14. نمودارهای لانگمیر الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%69
4-15. نمودارهای BET الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%71
4-16. جذب و واجذب الف) 10%، ب) 15% و ج) 20%.72
4-17. حلقه پسماند نمونه‌ها قبل از عملیات حرارتی الف) 10%، ب) 15%، ج) 20%.74
4-18. حلقه پسماند نمونه‌ها بعد از عملیات حرارتی الف) 10%، ب) 15%، ج) 20%.75

فهرست جداول
عنوان صفحه
فصل سوم - ساخت آئروژل و کاربردهای آن
3-1. کاربردهای مختلف آئروژل‌ها48
TOC o "1-3" h z u
فصل چهارم - سنتز و بررسی ویژگی‌های نانوکامپوزیت سیلیکا آئروژل/نانوذرات فریت کبالت
4-1. میزان گرم و لیتر مواد مورد نیاز51
4-2. نتایج حاصل از XRD63
لیست علایم و اختصارات
برونر، امت، تلر(Brunauer, Emmett, Teller) BET
پراش پرتو ایکس (X-Ray Diffraction) XRD
مغناطیسسنج نمونهی ارتعاشی (Vibrating Sample Magnetometer) VSM
میکروسکوپ الکترونی گسیل میدانی (Field Emission Scanning Electron Microscopy) FE-SEM
میکروسکوپ الکترونی عبوری (Transmission Electron Microscopy) TEM
آنگسترم (Angestrom) Å
اورستد (Oersted) Oe
نانومتر (Nanometer) nm
واحد مغناطیسی (Electromagnetic Units) emu
فصل اولمفاهیم اولیه1854668136024
مقدمهاز اواخر قرن بیستم دانشمندان تمرکز خود را بر فناوری نوینی معطوف کردند که به عقیده‌ی عده‌ای تحولی عظیم در زندگی بشر ایجاد می‌کند. این فناوری نوین که در رشته‌هایی همچون فیزیک، شیمی و مهندسی از اهمیت زیادی برخوردار است، نانوتکنولوژی نام دارد. می‌توان گفت که نانوفناوری رویکردی جدید در تمام علوم و رشته‌ها می‌باشد و این امکان را برای بشر به وجود آورده است تا با یک روش معین به مطالعه‌ی مواد در سطح اتمی و مولکولی و به سبک‌های مختلف به بازآرایی اتم‌ها و مولکول‌ها بپردازد.
در چند سال اخیر، چه در فیزیک تجربی و چه در فیزیک نظری، توجه قابل ملاحظه‌ای به مطالعه‌ی نانوساختارها با ابعاد کم شده است و از این ساختارها نه تنها برای درک مفاهیم پایه‌ای فیزیک بلکه برای طراحی تجهیزات و وسایلی در ابعاد نانومتر استفاده شدهاست. وقتی که ابعاد یک ماده از اندازه‌های بزرگ مانند متر و سانتیمتر به اندازه‌هایی در حدود یک دهم نانومتر یا کمتر کاهش می‌یابد، اثرات کوانتومی را می‌توان دید و این اثرات به مقدار زیاد خواص ماده را تحت الشعاع قرار می‌دهد. خواصی نظیر رنگ، استحکام، مقاومت، خوردگی یا ویژگی‌های نوری، مغناطیسی و الکتریکی ماده از جمله‌ی این خواص‌ می‌باشند [1].
1-1 شاخه‌های فناوری نانوتفاوت اصلی فناوری نانو با فناوری‌های دیگر در مقیاس مواد و ساختارهایی است که در این فناوری مورد استفاده قرار می‌گیرند. در حقیقت اگر بخواهیم تفاوت این فناوری را با فناوری‌های دیگر بیان نماییم، می‌توانیم وجود عناصر پایه را به عنوان یک معیار ذکر کنیم. اولین و مهمترین عنصر پایه نانو ذره است. نانوذره یک ذره‌ی میکروسکوپی است که حداقل طول یک بعد آن کمتر از ١٠٠ نانومتر است و میتوانند از مواد مختلفی تشکیل شوند، مانند نانوذرات فلزی، سرامیکی و نانوبلورها که زیر مجموعهای از نانوذرات هستند [ 3و 2]. دومین عنصر پایه نانوکپسول است که قطر آن در حد نانومتر می‌باشد. عنصر پایه‌ی بعدی نانولوله‌ها هستند که خواص الکتریکی مختلفی از خود نشان می‌دهند و شامل نانولوله‌های کربنی، نیترید بور و نانولوله‌های آلی می‌باشند [4].
1-2 روش‌های ساخت نانوساختارهاتولید و بهینهسازی مواد بسیار ریز، اساس بسیاری از تحقیقات و فناوری‌های امروزی است. دستورالعمل‌های مختلفی در خصوص تولید ذرات بسیار ریز در شرایط تعلیق وجود دارد ولی در خصوص انتشار و تشریح دقیق فرآیند رسوب‌گیری و روش‌های افزایش مقیاس این فرآیندها در مقیاس تجاری محدودیت وجود دارد. برای تولید این نوع مواد بسیار ریز از پدیده‌های فیزیکی یا شیمیایی یا به طور همزمان از هر دو استفاده می‌شود. برای تولید یک ذره با اندازه مشخص دو فرآیند اساسی وجود دارد، درهم شکستن) بالا به پایین) و دیگری ساخته شدن) پایین به بالا). معمولا روش‌های پائین به بالا ضایعاتی ندارند، هر چند الزاما این مسأله صادق نیست [6 و5]. مراحل مختلف تولید ذرات بسیار ریز عبارت است از، مرحله‌ی هسته‌زایی اولیه و مرحله‌ی هسته‌زایی و رشد خود به خودی. در ادامه به طور خلاصه روش‌های مختلف تولید نانوذرات را بیان می‌کنیم. به طور کلی روش‌های تولید نانوذرات عبارتند از:
 چگالش بخار
 سنتز شیمیایی
 فرآیندهای حالت جامد (خردایشی)
 استفاده از شاره‌ها فوق بحرانی به عنوان واسطه رشد نانوذرات فلزی
 استفاده از امواج ماکروویو و امواج مافوق صوت
 استفاده از باکتری‌هایی که میتوانند نانوذرات مغناطیسی و نقره‌ای تولید کنند
پس از تولید نانوذرات می‌توان با توجه به نوع کاربرد آن‌ها از روش‌های رایج زمینه‌ای مثل روکشدهی یا اصلاح شیمیایی نیز استفاده کرد [7].
1-3 کاربردهای نانوساختارهایکی از خواص نانوذرات نسبت سطح به حجم بالای این مواد است. با استفاده از این خاصیت می‌توان کاتالیزورهای قدرتمندی در ابعاد نانومتری تولید نمود. این نانوکاتالیزورها بازده واکنش‌های شیمیایی را به شدت افزایش داده و همچنین به میزان چشمگیری از تولید مواد زاید در واکنش‌ها جلوگیری خواهند نمود. به کارگیری نانو‌ذرات در تولید مواد دیگر استحکام آن‌ها را افزایش داده و یا وزن آن‌ها را کم می‌کند. همچنین مقاومت شیمیایی و حرارتی آن‌ها را بالا برده و واکنش آن‌ها در برابر نور وتشعشعات دیگر را تغییر می‌دهد.
با استفاده از نانوذرات نسبت استحکام به وزن مواد کامپوزیتی به شدت افزایش خواهد یافت. اخیرا در ساخت شیشه ضد آفتاب از نانوذرات اکسید روی استفاده شده است. استفاده از این ماده علاوه بر افزایش کارآیی این نوع شیشهها، عمر آن‌ها را نیز چندین برابر نمودهاست .از نانوذرات همچنین در ساخت انواع ساینده‌ها، رنگ‌ها، لایه‌های محافظتی جدید و بسیار مقاوم برای شیشه‌ها، عینک‌ها (ضدجوش و نشکن)، کاشی‌ها و در حفاظ‌های الکترومغناطیسی شیشه‌های اتومبیل و پنجره استفاده می‌شود. پوشش‌های ضد نوشته برای دیوارها و پوششهای سرامیکی برای افزایش استحکام سلول‌های خورشیدی نیز با استفاده از نانوذرات تولید شده‌اند.
وقتی اندازه ذرات به نانومتر می‌رسد یکی از ویژگی‌هایی که تحت تأثیر این کوچک شدن اندازه قرارمی‌گیرد تأثیرپذیری از نور و امواج الکترومغناطیسی است. با توجه به این موضوع اخیراً چسب‌هایی از نانوذرات تولید شده‌اند که کاربردهای مهمی در صنایع الکترونیکی دارند. نانولوله‌ها در موارد الکتریکی، مکانیکی و اپتیکی بسیار مورد توجه بوده‌اند. روش‌های تولید نانولوله‌ها نیز متفاوت می‌باشد، همانند تولید آن‌ها بر پایه محلول و فاز بخار یا روش رشد نانولوله‌ها در قالب که توسط مارتین مطرح شد. نانولایه‌ها در پوشش‌های حفاظتی با افزایش مقاومت در خوردگی و افزایش سختی در سطوح و فوتولیز و کاهش شیمیایی کاربرد دارند.
نانوذرات نیز به عنوان پیشماده یا اصلاح ساز در پدیده های فیزیکی و شیمیایی مورد توجه قرارگرفته‌اند. هاروتا و تامسون اثبات کردند که نانوذرات فعالیت کاتالیستی وسیعی دارند، مثل تبدیل مونواکسید کربن به دی اکسید کربن، هیدروژنه کردن استیرن به اتیل بنزن و هیدروژنه کردن ترکیبات اولفیتی در فشار بالا و فعالیت کاتالیستی نانوذرات مورد استفاده در حسگرها که مثل آنتن الکترونی بین الکترود و الکترولیت ارتباط برقرار می‌کنند [7].
1-4 مواد نانومتخلخلمواد نانو متخلخل دارای حفره‌هایی در ابعاد نانو هستند و حجم زیادی از ساختار آن‌ها را فضای خالی تشکیل می‌دهد. نسبت سطح به حجم (سطح ویژه) بسیار بالا، نفوذپذیری یا تراوایی زیاد، گزینشپذیری خوب و مقاومت گرمایی و صوتی از ویژگی‌های مهم آن‌ها می‌باشد. با توجه به ویژگی‎‌های ساختاری، این به عنوان تبادل‌گر یونی، جدا کننده، کاتالیزور، حس‌گر، غشا و مواد عایق استفاده می‌شود.
نسبت حجمی فضای خالی ماده‌ی متخلخل به حجم کل ماده‌ تخلخل نامیده میشود. به موادی که تخلخل آن‌ها بین 2/0 تا 95/0 باشد نیز مواد متخلخل می‌گویند. حفره‌ای که متصل به سطح آزاد ماده است حفره‌ی باز نام دارد که برای صاف کردن غشا، جداسازی و کاربردهای شیمیایی مثل کاتالیزور و کروماتوگرافی (جداسازی مواد با استفاده از رنگ آن‌ها) مناسب است. به حفره‌ای که دور از سطح آزاد ماده است حفره‌ی بسته می‌گویند که وجود آن‌ها تنها سبب افزایش مقاومت گرمایی و صوتی و کاهش وزن ماده شده و در کاربردهای شیمیایی سهمی ندارد. حفره‌ها دارای اشکال گوناگونی همچون کروی، استوانهای، شیاری، قیفی شکل و یا آرایش شش گوش هستند. همچنین تخلخل‌ها می‌توانند صاف یا خمیده یا همراه با چرخش و پیچش باشند [7].
بر اساس دستهبندی که توسط آیوپاک صورت گرفته است، ساختار محیط متخلخل با توجه به میانگین ابعاد حفره‌ها، مواد سازنده و نظم ساختار به سه گروه تقسیمبندی میشوند که در شکل 1-1 نشان داده شده است:
الف) دسته بندی بر اساس اندازهی حفره:
میکرومتخلخل: دارای حفرههایی با قطر کمتر از 2 نانومتر.
مزومتخلخل: دارای حفرههایی با قطر 2 تا 50 نانومتر.
right59626500ماکرومتخلخل: دارای حفرههایی با قطر بیش از 50 نانومتر.
center1720850شکل 1-1 انواع سیلیکا براساس اندازه حفره: الف) ماکرو متخلخل، ب) مزو متخلخل، ج) میکرو متخلخل [8].
0شکل 1-1 انواع سیلیکا براساس اندازه حفره: الف) ماکرو متخلخل، ب) مزو متخلخل، ج) میکرو متخلخل [8].

بر اساس شکل و موقعیت حفره‌ها نسبت به یکدیگر در داخل مواد متخلخل، حفره‌ها به چهار دسته تقسیم می‌شود: حفره‌های راه به راه، حفره‌های کور، حفره‌های بسته و حفره‌های متصل به هم که در شکل (2-1) به صورت شماتیک این حفره‌ها را نشان داده شده است.

شکل 1-2 نوع تخلخل‌ها بر اساس شکل و موقعیت [8].
بر اساس تعریف مصطلح نانوفناوری، دانشمندان شیمی در عمل نانو متخلخل را برای موادی که دارای حفرههایی با قطر کمتر از 100 نانومتر هستند به کار می‌برند که ابعاد رایجی برای مواد متخلخل در کاربردهای شیمیایی است.
ب) دستهبندی بر‌اساس مواد تشکیل دهنده:
مواد نانومتخلخل آلی
مواد نانومتخلخل معدنی
تقسیمبندی مواد نانومتخلخل آلی
1) مواد کربنی: کربن فعال، کربنی است که حفره‌های بسیار زیاد دارد و مهم‌ترین کربن از دسته مواد میکرومتخلخل است.
2) مواد بسپاری: مواد نانو متخلخل بسپاری به دلیل ساختار انعطاف‌پذیر خود، حفره‌های پایداری ندارند و تنها چند ترکیب محدود از این نوع وجود دارد [8].
تقسیم بندی مواد نانومتخلخل معدنی
1) مواد میکرومتخلخل
زئولیت‌ها: مهم‌ترین ترکیبات میکرومتخلخل بوده که دارای ساختار منظم بلوری و حفره‌دار با بار ذاتی منفی می‌باشند. در اکثر موارد ساختار زئولیتی از قطعات چهار وجهی با چهار اتم اکسیژن و یک اتم مرکزی مثل آلومینیوم، سیلیکون، گالیم یا فسفر تشکیل شده‌اند که با کاتیون‌ها خنثی می‌شوند [8].
چارچوب فلزی-آلی: از واحد‌های یونی فلزی یا خوشه‌ی معدنی و گروه‌های آلی به عنوان اتصالدهنده تشکیل شده است که اتصال آن‌ها به هم، حفره‌ای با شکلی معین مانند کره یا هشت وجهی به وجود می‌آورد. ویژگی بارز این ترکیبات، چگالی کم و سطح ویژه‌ی بالای آن‌هاست [9].
هیبرید‌های آلی-معدنی: از قطعاتی معدنی تشکیل شده‌اند که توسط واحد‌های آلی به هم متصل هستند [10].
2) مواد مزومتخلخل:
سیلیکا: ترکیبات MCM، معروف‌ترین سیلیکای مزومتخلخل هستند.
اکسید فلزات و سایر ترکیبات مزومتخلخل: اکسیدهای نانومتخلخل فلزات مثل تیتانیوم دی اکسید، روی اکسید، زیرکونیوم دی اکسید و آلومینا، فعالیتی بیشتر از حالت معمولی خود دارند. ترکیبات سولفید و نیترید هم میتوانند ساختار مزومتخلخل داشته باشند.
3) مواد ماکرومتخلخل:
بلور کلوییدی: از مجموعه کره‌هایی مانند سیلیکا ساخته می‌شود که فضای بین آن‌ها خالی است. در بلور کلوییدی معکوس کره‌ها توخالی و فضای بین آن‌ها پر است [10].
آئروژل‌ها مواد مزومتخلخل با سطح ویژه و حجم تخلخل بالا هستند که در فصل بعد به آن‌ها می‌پردازیم.
1-5 کامپوزیت‌هاکامپوزیت‌ها (مواد چند رسانهای یا کاهگل‌های عصر جدید) رده‌ای از مواد پیشرفته هستند که در آن‌ها از ترکیب مواد ساده به منظور ایجاد مواد جدیدی با خواص مکانیکی و فیزیکی برتر استفاده شده است. اجزای تشکیلدهنده ویژگی‌های خود را حفظ کرده، در یکدیگر حل نشده و با هم ترکیب نمی‌شوند.
استفاده از این مواد در طول تاریخ مرسوم بوده است. از اولین کامپوزیت‌ها یا چندسازه‌های ساخت بشر می‌توان به آجرهای گلی که در ساخت آن‌ها از کاه استفاده شده است اشاره کرد. هنگامی که این دو با هم مخلوط بشوند، در نهایت آجر پخته بهدست می‌آید که بسیار ماندگار‌تر و مقاوم‌تر از هر دو ماده اولیه، یعنی کاه و گل است. شاید هم اولین کامپوزیت‌ها را مصری‌ها ساخته باشند که در قایق‌هایشان به چوب بدنه قایق مقداری پارچه می‌آمیختند تا در اثر خیس شدن، آب توسط پارچه جذب شده و چوب باد نکند. قایق‌هایی که سرخپوستان با فیبر و بامبو می‌ساختند و تنورهایی که از گل، پودر شیشه و پشم ساخته می‌شدند از نخستین کامپوزیت‌ها هستند [11].
1-5-1 کامپوزیت یا مواد چندسازهچندسازه‌ها به موادی گفته می‌شود که از مخلوط دو یا چند عنصر با فازهای کاملا متمایز ساخته شده باشند. در مقیاس ماکروسکوپیک فازها غیر قابل تشخیص‌اند. اما در مقیاس‌های میکروسکوپیک فازها کاملا مجزا هستند و هر فاز خصوصیات عنصر خالص را نمایش می‌دهد. در چندسازه‌ها، نه تنها خواص هر یک از اجزاء باقی مانده بلکه در نتیجهی پیوستن آن‌ها به یکدیگر، خواص جدیدتر و بهتر بهدست می‌آید [11].
1-5-2 ویژگی‌های مواد کامپوزیتیمواد زیادی می‌توانند در دسته‌بندی مواد کامپوزیتی قرار بگیرند، در واقع موادی که در مقیاس میکروسکوپی قابل شناسایی بوده و دارای فازهای متفاوت و متمایز باشند در این دسته‌بندی قرار می‌گیرند. امروزه کامپوزیت‌ها به علت وزن کم و استحکام بالا در صنایع مختلف، به طور گستره‌ای مورد استفاده واقع می‌شوند. کامپوزیت‌ها با کاهش وزن و ویژگی‌های فیزیکی بسیار عالی، گزینه‌ای مناسب برای استفاده در تجهیزات ساختاری می‌باشند. علاوه بر ‌این، کامپوزیت‌ها جایگزین مناسب برای مواد سنتی در کاربردهای صنعتی، معماری، حمل و نقل و حتی در کاربردهای زیر بنایی می‌باشد [12].
یکی از ویژگی‌های بارز کامپوزیت‌ها، حضور فاز تقویـتکننده مجزا از فاز زمینه می‌باشد. ویژگی‌های اختصاصی این دو فاز، در ترکیب با یکدیگر، ویژگی‌های یکسانی را به کل کامپوزیت می‌بخشد. در یک دسته‌بندی ویژه، کامپوزیت‌ها همواره به دو فاز زمینه و تقویتکننده تقسیم می‌شوند. می‌توان گفت در واقع زمینه مانند چسبی است که تقویتکننده‌ها را به یکدیگر چسبانده و آن‌ها را از آثار محیطی حفظ می‌کند.
1-5-3 مواد زمینه کامپوزیتزمینه با محصور کردن فاز تقویت کننده، باعث افزایش توزیع بار بر روی کامپوزیت می‌گردد. در واقع زمینه، برای اتصال ذرات تقویتکننده، انتقال بارها به تقویتکننده، تهیه یک ساختار شبکه‌ای شکل از آن‌ها و حفظ تقویتکننده از آثار محیطی ناسازگار به کار گرفته می‌شود.
1-5-4 تقویتکننده‌هادسته‌ای از مواد معمولی که به عنوان فاز تقویت کننده به کار گرفته می‌شوند، عبارتند از شیشه‌ها، فلزات، پلیمرها و گرانیت. تقویتکننده‌ها در شکل‌های مختلفی از جمله فیبرهای پیوسته، فیبرهای کوتاه یا ویسکرها و ذرات تولید می‌شوند (شکل3-3). تقویت کننده‌ها باعث ایجاد ویژگی‌های مطلوبی از جمله استحکام و مدول بالا، وزن کم، مقاومت محیطی مناسب، کشیدگی خوب، هزینه کم، در دسترسپذیری مناسب و سادگی ساخت کامپوزیت می‌گردند [12].
1-5-5 نانو کامپوزیتنانو کامپوزیت‌ها مواد مرکبی هستند که ابعاد یکی از اجزای تشکیلدهنده آن‌ها در محدوده نانو‌متری باشد. نانوکامپوزیت‌ها هم، در دو فاز تشکیل می‌شود. در فاز اول، ساختار بلوری در ابعاد نانو ساخته می‌شود که زمینه کامپوزیت به شمار می‌رود. در فاز دوم هم ذراتی در مقیاس نانو به عنوان تقویت کننده برای بهبود ویژگی‌ها به فاز زمینه افزوده می‌شود. توزیع یکنواخت این فاز در ماده زمینه باعث می‌شود که فصل مشترک ماده تقویت کننده با ماده زمینه در واحد حجم، مساحت بالایی داشته باشد [13].

شکل 1-3 نمایشی از انواع مختلف تقویت کننده‌ها در کامپوزیت [12].
1-6 خلاصهدر این فصل به بیان بعضی مفاهیم اولیه پرداختهشد. خلاصه کوتاهی از فناوری نانو، نانوساختارها و روش‌های ساخت آن‌ها گفته شد. بعد از آن مواد متخلخل بررسی شد و در نهایت مختصری در مورد کامپوزیت‌ها، ویژگی‌ها و نانوکامپوزیت‌ها بیان شد.
فصل دومآئروژلها و مروری بر خواص مغناطیسی15418474142773
2-1 تاریخچهحوزهی پژوهشی آئروژل هر ساله به طور وسیعی افزایش می‌یابد به طوری که امروزه توجه بسیاری از دانشمندان جهان را به خود اختصاص دادهاست.
اولین بار ساموئل استفان کیستلر در سال 1931 با ایدهی جایگزینی فاز مایع با گاز در ژل همراه با انقباض کم، آئروژل را تولید کرد. در آن زمان سعی ایشان بر اثبات وجود شبکه‌های جامد در درون ساختار ژل بود. یک روش برای اثبات این نظریه، برداشتن فاز مایع از فاز مرطوب ژل بدون اینکه ساختار جامد از بین برود مطرح بود. برای این کار او با استفاده از یک اوتوکلاو، فاز مایع را از ژل خارجکرد که جامد باقی مانده چگالی بسیار پایینی داشت. او دما و فشار داخلی اوتوکلاو را به نقطه بحرانی مایع رساند تا بر کشش سطحی مایع غلبهکند و ساختار داخلی ژل را از فروپاشی برهاند. به این ترتیب او با موفقیت اولین آئروژل پایه سیلیکا را تولید کرد. ولی به دلیل سختی کار، برای حدود نیمقرن پژوهشی در این زمینه صورت نگرفت. اما از همان ابتدا برای دانشمندانی چون کیستلر، واضح بود که آئروژل ویژگی‌های برجسته‌ای مانند چگالی پایین و رسانایی گرمایی ناچیزی دارد [14].
در سال‌های اخیر، ساختن آئروژل به معنای رساندن الکل به فشار و دمای بخار شدنی و به طبع آن به‌دست‌آوردن نقطهی بحرانی است و باعث استخراج فوق بحرانی از ژل می‌شود. سپس، در سال 1970، دانشمند فرانسوی تایکنر و همکارانش برای بهبود فرآیند تولید دولت فرانسه، موفق شدند روش جدیدی به غیر از روش کیستلر برای تهیهی آئروژل کشف کنند و آن را روش سل-ژل نامیدند. در این روش آلکوکسی سیلان با سیلیکات سدیم، که به وسیله کیستلر استفاده می‌شد، جایگزین گردید. با ظهور روش ارائه شده به وسیله‌ی تایکنر پیشرفت‌های جدیدی در علم آئروژل و فناوری ساخت آن حاصل شد و پژوهش‌گران زیادی به مطالعه در این زمینه روی آوردند. به دلیل انجام مطالعات، تحقیقات و اقدامات صنعتی و نیمه صنعتی که در دهه 70 و 80 بر روی آئروژل‌ها صورت گرفت، این دوره را عصر رنسانس آئروژل نامیدند. [15].
این مواد جایگاه خود را به عنوان مواد جامدی با چگالی و رسانایی گرمایی پایین به‌دست آوردند. پایین‌ترین چگالی آئروژل تولید شده 1/0 میلیگرم بر سانتیمتر مکعب است، تا حدی که نمونه می‌تواند در هوا شناور بماند. گرچه برای ساخت جامد آئروژل مواد بسیاری می‌توانند استفاده شوند ولی آئروژل‌های 2SiO متداول‌ترند. البته می‌توان با واردکردن مواد مختلف در ساختار آئروژل در حین فرآیند ژل شدن، به بهبود ویژگی‌های نمونه‌های نتیجه شده کمک کرد [16].
آئروژل‌ها را می‌توان به عنوان یک ماده منحصر به فرد در زمینه فناوری سبز در نظر گرفت. هشدار جهانی، تهدید آیندهی محیط زیست توسط گاز‌های گلخانهای تولید شده بهدست بشر را تأیید می‌کند. آیندهی انرژی‌های قابل دسترس به خاطر کمشدن منابع نفتی و حتی افزایش تقاضا برای محصولات نفتی، در خطر است. آئروژل‌ها بارها و بارها به افزایش بازدهی برخی ماشین‌ها و سیستم‌ها و کمک به کاهش مصرف انرژی یاری رسانده‌اند. همچنین آئروژل‌ها می‌توانند آلاینده‌های آب را بیرون بکشند و با گرفتن ذرات مضر قبل از ورود به اکوسیستم، سبب تخریبنشدن محیط زیست شوند. دانشمندان دریافتند که این فناوری برای تجدید و حفاظت از انرژی به توسعهی بیشتری نیاز دارد [17].
2-2 شیمی سطح آئروژلسیلیکا آئروژل حاوی ذرات نانومتری هستند. این ترکیبات دارای نسبت سطح به حجم بالا و مساحت سطح ویژهی زیادی هستند. شیمی سطح داخلی در آئروژل‌ها نقش اساسی را در بروز رفتار‌های بی‌نظیر فیزیکی و شیمیایی آن‌ها، ایفا می‌کند. ماهیت سطح آئروژل‌ها تا حد زیادی به شرایط تهیهی آن‌ها بستگی دارد. انتخاب فرآیند مربوط به ترکیبات شیمیایی و ویژگی‌های مورد نظر مشخص برای نانوذرات وابسته است. دو روش پایه برای تولید نانوذرات استفاده می‌شود:
روش از بالا به پایین
اشاره به خردکردن مکانیکی مواد با استفاده از فرآیند آسیابکاری دارد. در این فرآیند مواد اولیه به بلوک‌های پایهی بیشتری شکسته می‌شوند.
روش پایین به بالا
اشاره به ساخت سیستم پیچیده به وسیله ترکیب اجزای سطح اتم دارد. در این فرآیند ساختارها به وسیله فرآیندهای شیمیایی ساخته می‌شوند.
روش پایین به بالا بر پایه ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی اتمی یا مولکولی خود تنظیم می‌شوند. این روش به دلیل ساختار پیچیده اتم یا مولکول، کنترل بهتر اندازه و شکل آن‌ها انتخاب شد. روش پایین به بالا شامل فرآیندهای آئروسل، واکنش‌های بارش و فرآیند سل-ژل است [18].
مرحله اول ساختن آئروژل تولید ژل خیس است که بهترین روش برای ساخت آن استفاده از پیشماده الکوکسید سیلیکون، مانند TEOS است. شیمی ساخت Si(OCH2CH3)TEOS است که با اضافه کردن آب، واکنش شیمیایی زیر صورت می‌گیرد [19] :
Si(OCH2CH3)4(liq)+2(H2O)(liq)→SiO2solid+4(HOCH2CH3)liq
اتم سلیکون به دلیل داشتن بار جزئی مثبت کاهشیافته (+) نسبت به دیگر انواع آئروژل بیشتر مورد مطالعه قرار گرفت. در Si(OEt)+ حدود 32/0 است. این بار مثبت جزئی کاهش یافته، روند ژل شدن پیشماده سیلیکا را آهسته می‌کند.
پیشمادهی الکوکسید M(OR) هستندکه اولین بار توسط امبلن برای سنتز سیلیکا آئروژل استفاده شد. در این ترکیب M نشان دهندهی گروه فلزی، OR گروه الکوکسید و R تعیینکنندهی گروه الکلی هستند. الکوکسیدها معمولا در محلول منبع الکلی خود موجود هستند و امکان خشک کردن این ژل‌ها را در چنین محلول‌هایی فراهم می‌کند [20].
اگر آئروژل از طریق خشک کردن به وسیله الکل تهیه گردد، گروه‌های آلکوکسی (OR) تشکیل دهنده سطح آن است و در این سطح آئروژل خاصیت آبگریزی پیدا می‌کند. اگر تهیه آئروژل از طریق فرآیند دی اکسید کربن باشد آنگاه سطح آئروژل را گروه‌های هیدروکسید (OH) فرا می‌گیرد و خاصیت آب‌دوست پیدا خواهدکرد و مستقیما می‌تواند رطوبت هوا را جذب نماید. البته با حرارت دادن می‌توان رطوبت جذب شده را از ساختار آئروژل حذف نمود. شکل 1-2 به خوبی خاصیت آب‌دوست و آبگریزی را در ساختار آئروژل‌های با گروه‌های عاملی مختلف نشان می‌دهد [21].

شکل 2-1 برهمکنش آب و ساختار آئروژل، الف) آئروژل آبگریز، ب) آئروژل آب‌دوست [18].
2-3 تئوری فیزیکیاتصال شبکه نانو مقیاس سیلیکای جامد آئروژل‌های پایه سیلیکا، ویژگی‌های منحصر به فردی را به آن‌ها می‌دهد. کسر یونی پیوند کووالانت قطبی برای اکسیدهای فلزی مختلف از رابطهی زیر نتیجه می‌شود:
Fionic=1-exp⁡(-0.25 XM-XO2)که XO و XM الکترون‌خواهی O و M را نشان می‌دهد. 2SiO مقدار Fionic 54/0 دارد که طیف مقدار زاویه Si-O-Si را گسترده کرده و شبکه تصادفی را می‌دهد. چهار اکسید دیگر زاویه یونی بزرگ‌تر و مقدار کوچک‌تر زاویه پیوند را سبب می‌شوند. به این معنی که پیوند تصادفی فقط روی ماکرومقیاس‌های بیشتر با ذرات کلوییدی بزرگ‌تر و متراکم‌تر اتفاق می‌افتد، در این صورت، ژل به جای شکلگرفتن شبکهی تصادفی اتصالات به صورت ذره تشکیل می‌شود [14]. شبکهی اتصالات سیلیکا برای وزن نسبی‌اش یک جامد محکم را ایجاد می‌کند.
2-4 خاصیت مغناطیسی مواد2-4-1 منشأ خاصیت مغناطیسی موادیکی از مهمترین ویژگی‌های مواد، خاصیت مغناطیسی آن‌هاست که از زمآن‌های نسبتا دور مورد توجه بوده و هم اکنون نیز در طیف وسیعی از کاربردهای صنعتی قرار گرفته است.
منشأ خاصیت مغناطیسی در جامدها، الکترون‌های متحرک می‌باشند. گرچه بعضی از هسته‌های اتمی دارای گشتاور دو قطبی مغناطیسی دائمی هستند ولی اثر آن‌ها چنان ضعیف است که نمی‌تواند آثار قابل ملاحظه‌ای داشته باشد؛ مگر در تحت شرایط خاص مانند اینکه نمونه در زیر دمای یک درجهی کلوین قرار گیرد یا وقتی که تحت میدان الکترومغناطیسی با بسامدی قرار گیرد که حرکت تقدیمی هسته را تشدید نماید. در بدو ظهور نظریات مغناطیس آزمایش‌های زیادی نشان داد که اندازه حرکت زاویهای کل یک الکترون و گشتاور مغناطیسی وابسته به آن بزرگ‎تر از مقداری است که به حرکت انتقالی آن نسبت داده می‌شد. بنابراین یک سهم اضافی که از خصوصیت ذاتی با یک درجه آزادی داخلی ناشی می‌شد، به الکترون نسبت داده شد و چون این خصوصیت دارای اثر مشابه چرخش الکترون حول محورش بود اسپین نامیده گردید [22].
2-4-2 فازهای مغناطیسیبه طورکلی مواد در میدان مغناطیسی خارجی رفتارهای متفاوتی از خود نشان می‌دهند و با توجه به جهت‌گیری مغناطش، به پنج گروه تقسیم می‌شوند که به بیان آن‌ها می‌پردازیم.
2-4-2-1 مواد دیامغناطیسدر این مواد الکترون‌ها به صورت جفت بوده و اتمها دارای گشتاور مغناطیسی دائمی نیستند و با قرارگرفتن در میدان مغناطیسی خارجی دارای گشتاور مغناطیسی القایی در خلاف جهت میدان خارجی می‌شوند و آن را تضعیف می‌کند. پذیرفتاری مغناطیسی χ چنین موادی منفی و خیلی کم است. خاصیت دیامغناطیس ظاهراً در تمام انواع مواد یافت می‌شود، اما اثر آن غالباً به وسیله‌ی آثار قویتر پارامغناطیس یا فرومغناطیس که می‌توانند با این خاصیت همراه باشند، مخفی می‌شود. خاصیت دیامغناطیسی خصوصاً در موادی بارز است که کلاً اتمها یا یونهایی با پوسته‌های بسته‌ی الکترونی تشکیل شده باشند، زیرا در این مواد تمام تأثیرات پارامغناطیسی حذف می‌شوند.
2-4-2-2 مواد پارامغناطیسمواد پارامغناطیس، موادی هستند که برخی از اتمها یا تمامی آن‌ها گشتاور دو قطبی دائمی دارند، به عبارت دیگر گشتاور دو قطبی در غیاب میدان مغناطیسی، غیرصفر است. این دو قطبیهای دائمی رفتاری مستقل از هم داشته که در نهایت جهت‌گیری تصادفی دارند و در میدان‌های کوچک رقابتی بین اثر هم‌خط‌سازی میدان و بی‌نظمی گرمایی وجود دارد، اما به طور متوسط تعداد گشتاورهای موازی با میدان بیشتر از گشتاورهای پادموازی با میدان است. پذیرفتاری در این مواد مثبت است و با افزایش دما، که در اثر آن بی‌نظمی گرمایی زیاد می‌شود، کاهش مییابد. منگنز، پلاتین، آلومینیوم، فلزخاکی قلیایی و قلیایی خاکی، اکسیژن و اکسید ازت از جمله مواد پارامغناطیس‌اند.
2-4-2-3 مواد فرومغناطیس
در برخی از مواد مغناطیسی، گشتاورهای مغناطیسی کوچک به طور خودبهخود با گشتاورهای مجاور خود هم‌خط می‌شوند. اینگونه مواد را فرومغناطیس می‌نامند. در عمل، همه‌ی حوزه‌های مغناطیسی در یک ماده‌ی مغناطیسی در یک راستا قرار ندارند، بلکه این مواد از حوزه‌های بسیار کوچکی با ابعاد خیلی کمتر از میلیمتر تشکیل شده‌اند، به طوری که گشتاورهای مغناطیسی هر حوزه با حوزه‌های مجاور آن تفاوت دارد.
ممکن است سمتگیری و اندازه‌ی حوزه‌های مغناطیسی در یک ماده‌ی فرو مغناطیس به گونه‌ای باشد که در کل اثر یکدیگر را خنثی کنند و ماده در مجموع فاقد مغناطش است. اعمال میدان مغناطیسی خارجی بر حوزه‌های مغناطیسی سبب می‌شود که گشتاورهای مغناطیسی هر حوزه تحت تأثیر میدان قرار گرفته و جهت آن‌ها در جهت میدان خارجی متمایل شود. علاوه بر این حوزههایی که با میدان همسویند، رشد میکنند، یعنی حجم آن‌ها زیاد می‌شود و در نتیجه، حوزه‌هایی که سمتگیری آن‌ها نسبت به میدان مناسب نیست کوچک می‌شوند، مرز بین این حوزه‌ها جابجا می‌شود و در نتیجه ماده در مجموع خاصیت مغناطیسی پیدا می‌کند . پذیرفتاری مغناطیسی این مواد مثبت است. آهن، کبالت، نیکل و چندین عنصر قلیایی خاکی جز فرومغناطیس‌ها می‌باشند [23].
مواد فرومغناطیس دارای چند مشخصه‌ی اصلی به صورت زیر می‌باشند:
الف) مغناطش خودبه‌خودی و مغناطش در حضور میدان
ب) حساسیت مغناطش به دما
ج) مغناطش اشباع
د) منحنی پسماند
2-4-2-4 مواد پادفرومغناطیس
در مواد پادفرومغناطیس گشتاورهای مغناطیسی مجاور به صورت موازی، برابر و غیرهم راستا جهتگیری
می‌کنند. این مواد در غیاب میدان مغناطیسی دارای گشتاور صفرند. کروم و اکسیدهای آن ، جز مواد پادفرومغناطیس می‌باشند. چنین موادی معمولاً در دماهای پایین پادفرومغناطیساند. با افزایش دما ساختار نواحی مغناطیسی شکسته شده و ماده پارامغناطیسی می‌شود. این رفتار در مواد فرومغناطیس نیز اتفاق می‌افتد به این ترتیب که در این مواد پذیرفتاری مغناطیسی مواد مغناطیسی با افزایش دما به تدریج کاهش می‌یابد تا زمانی که ماده پادفرومغناطیس شود .
پذیرفتاری مغناطیسی این مواد عدد مثبت بسیار کوچک و نزدیک به صفر است. به دمایی که در آن ماده از حالت پادفرومغناطیس به فرومغناطیس گذار می‌کند، دمای نیل می‌گویند.
χ= CT+TN
که C ثابت کوری و TN دمای نیل است.
2-4-2-5 مواد فریمغناطیس
فریمغناطیس شکل خاصی از پادفرومغناطیس است که در آن گشتاورهای مغناطیسی در جهت موازی و عکس یکدیگر قرار گرفته‌اند، اما با یکدیگر برابر نیستند و به صورت کامل یکدیگر را حذف نمی‌کنند. در مقیاس ماکروسکوپی، مواد فریمغناطیس همانند فرومغناطیس بوده و دارای مغناطش خودبه‌خودی در زیر دمای کوری بوده و دارای منحنی پسماند می‌باشند[23و24]. شکل 2-2 فازهای مغناطیسی را نشان می‌دهد.

شکل 2-2 فازهای مغناطیسی، الف) پارامغناطیس، ب) فرومغناطیس، ج) پادفرومغناطیس، د) فری مغناطیس [24].
دو خاصیت مهم و کلیدی مواد مغناطیسی دمای کوری و هیستروسیس مغناطیسی است. جفت شدگی ‏تبادلی و بنابراین انرژی تبادلی هیسنبرگ مستقیماً با دمای کوری ‏‎(Tc)‎‏ مواد فرو و فریمغناطیس در ‏ارتباط است. در کمتر از دمای ‏Tc، ممان مغناطیسی همان جهت بلوروگرافی ویژه‌ی محور صفر این ‏مواد است. این محور در ‏نتیجه‌ی جفت‌شدگی این اسپین الکترون و ممنتوم زاویهای اوربیتال الکترون ایجاد می‌شود.
‏از آنجایی که مواد فرومغناطیسی مواد جالبی بر حسب کاربردهایشان هستند، خواص آن‌ها باید به ‏طور کمی اندازه‌گیری شود و حلقهی پسماند خواص مغناطیسی جالبی را در این مواد آشکار ‏می‌کند. یک حلقه‌ی پسماند را می‌توان با قراردادن نمونه در یک مغناطیس‌سنج و پاسخ ماده ‏‎(M,)‎‏ ‏به میدان مغناطیسی اعمالی ‏‎(H)‎‏ اندازه‌گیری کرد. چندین کمیت ممکن است از روی حلقه‌ی پسماند ‏به‌دست آید. ‏
اشباع مغناطیسی ‏‎(Ms)‎‏ یا اشباع مغناطیسی ویژه (‏s‏) مواردی‌اند که مقدار مغناطیسشدگی را وقتی ‏که همه دوقطبی‌ها در جهت میدان مغناطیسی اعمالی مرتب شده‌اند نشان می‌دهد.‏
مغناطیس باقیمانده ‏‎(Mr)‎‏ مغناطیسشدگی نمونه در میدان مغناطیسی صفر است و نیروی ‏بازدارندگی ‏‎(Hc)‎، نیرویی از میدان مغناطیسی است که برای تغییر مغناطیسشدگی باقیمانده نیاز است. ‏تغییر بایاس میدان ‏‎(HE)‎، مقدار جابجایی از مرکز حلقهی پسماند را نشان می‌دهد.‏
2-4-5 حلقه پسماندوقتی به یک ماده مغناطیسی، میدان مغناطیسی اعمال شود، مغناطش محیط سریع افزایش می‌یابد، با افزایش مقدار میدان اعمالی، شتاب افزایش و مغناطش کاهش می‌یابد، این کاهش شتاب ادامه می‌یابد تا مغناطش به مقدار اشباع خود Ms برسد [25].
تغییرات مغناطش مواد مغناطیسی در هنگام کاهش میدان، از رفتار قبلی خود تبعیت نمی‌کند، بلکه به خاطر ناهمسانگردی مغناطیسی در محیط، مقداری انرژی را در خود ذخیره می‌کنند. بنابراین وقتی میدان اعمالی در محیط صفر شود، مغناطش در ماده صفر نشده و دارای مقدار خاصی است که به آن مغناطش پسماند Mr گفته می‌شود. با کاهش بیشتر میدان به سمت مقادیر منفی، خاصیت مغناطیسی القا شده به تدریج کاهش می‌یابد و با رسیدن شدت میدان به یک مقدار منفی خواص مغناطیسی ماده کاملا از بین می‌رود. این میدان مغناطیس‌زدا را با Hc نشان می‌دهند و به نیروی ضد پسماند یا وادارندگی مغناطیسی معروف است. پسماند یا نیروی وادارنده عبارتست از میدان معکوسی که برای کاهش مغناطش به صفر نیاز است. با کاهش بیشتر شدت میدان، القای مغناطیسی منفی می‌شود و در نهایت به مقادیر اشباع منفی خود می‌تواند برسد. افزایش مجدد شدت میدان به سمت مقادیر مثبت، حلقه پسماند را مطابق شکل 2-3 کامل می‌کند. مغناطیس‌های دائمی غالبا در ربع دوم حلقه پسماند خود، مورد استفاده قرار می‌گیرند [26].

شکل 23 حلقه پسماند ماده فرو مغناطیس [26].
مواد مغناطیسی از نظر رفتار آن‌ها در میدان مغناطیس دو گروه تقسیم می‌شوند:
الف) مواد مغناطیس نرم


مواد مغناطیسی نرم با اعمال میدان مغناطیسی کوچک به راحتی مغناطیده می‌شود و با قطع میدان سریعاً گشتاور مغناطیسی خود را از دست می‌دهند. به عبارتی این مواد دارای نیروی وادارندگی پایین، اشباع مغناطیسی بالا و گشتاور پسماند پایین هستند.
مواد مغناطیس نرم در جاهایی که به تغییر سریع گشتاور مغناطیسی با اعمال میدان مغناطیسی کوچک نیاز است مانند موتورها، حسگرها، القاگرها و فیلترهای صوتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
ب) مواد مغناطیس سخت
مواد مغناطیس سخت موادی‌اند که به راحتی مواد مغناطیس نرم، مغناطیده نمی‌شوند و به میدان مغناطیسی اعمالی بزرگ‌تری جهت مغناطیده کردن آن‌ها نیاز است. این مواد گشتاور مغناطیسی را تا مدت‌ها پس از قطع میدان حفظ می‌کنند. همچنین دارای اشباع مغناطیسی، گشتاور پسماند و نیروی وادارندگی بالایی هستند. ساخت یا پخت این مواد در میدان مغناطیسی، ناهمسانگردی مغناطیسی را در این مواد افزایش می‌دهد که حرکت دیواره حوزه‌ها را سخت‌تر می‌کند و نیروی وادارندگی را افزایش می‌دهد. این امر می‌تواند تولید مادهی سخت مغناطیسی بهتری را تضمین کند. کاربرد این مواد در آهن‌رباهای دائمی و حافظه‌های مغناطیسی است [26].

شکل 24 حلقه پسماند در مواد فرومغناطیس نرم و سخت[26].
2-5 فریتفریت به آن دسته از مواد مغناطیسی اطلاق می‌شود که جزء اصلی تشکیل دهندهی آن‌ها اکسید آهن است و دارای خاصیت فریمغناطیس می باشند (آرایشی از فرومغناطیس) و پارامترهای مغناطیسی مطلوبی نظیر ضریب نفوذپذیری مغناطیسی بالا از جمله اصلی‌ترین خصیصه‌های آن‌ها به شمار می‌رود. بدین جهت کاربردهای بسیار وسیعی را در زمینه صنایع برق، الکترونیک، مخابرات، کامپیوتر و… به خود اختصاص داده‌اند.
یکی از انواع فریت‌ها نوع اسپینلی آن است، فریت‌های اسپینلی با فرمول عمومی 2-o2+A3+B که در آن 2+A و 3+B به ترتیب کاتیون‌های دو و سه ظرفیتی می‌یاشند.
فریت‌ها دارای خاصیت فریمغناطیس می‌باشند نظم مغناطیسی موجود در فریمغناطیس‌ها ناشی از برهم‌کنش‌های دو قطبی‌های مغناطیسی نیست بلکه ناشی از برهم‌کنش تبادلی است در برهمکنش تبادلی هم‌پوشانی اوربیتال‌های اتمی مد نظر می‌باشد در فریت‌ها برهم‌کنش تبادلی ناشی از هم‌پوشانی الکترون‌های اوربیتال d3 یون‌های A و B و الکترون‌های اوربیتالP 2 یون‌‎های اکسیژن است. و قدرت این بر‌هم‌کنش تبادلی است که خاصیت مغناطیسی نمونه را رقم می‌زند.
2-6 خلاصهدر این فصل به شیمی آئروژل و دو روش بالا به پایین و پایین به بالای تولید نانوذرات اشاره شد. سپس خاصیت مغناطیسی مواد و فاز‌های مغناطیسی ممکن برای مواد مغناطیسی بررسی شد. پس از آن توضیح کوتاهی در مورد حلقهی پسماند و موارد قابل اندازه‌گیری از آن گفته شد و در نهایت مختصری از مواد فریتی بیان گردید.
فصل سومساخت آئروژل و کاربردهای آن19509215088990
مقدمهسیلیکا آئروژل‌ها به دلیل ویژگی‌های منحصر به فرد، هم در علم و هم در تکنولوژی توجه زیادی را به خود اختصاص داده‌اند. آئروژل‌ها از پیشماده مولکولی با روش‌های مختلف و تکنیک‌های خشک کردن متفاوت برای جایگزینی منافذ مایع با گاز همراه با حفظ شبکهی جامد، تهیه می‌شوند. [27]
علی‌رغم تمامی تلاش‌های قابل توجهی که در این زمینه صورت گرفته است، چالش‌های اصلی تحت کنترل عوامل یکنواختی(همگنی)، بارگذاری، اندازه و توزیع نانوذرات در شبکه‌ی میزبان آلی باقی ماندهاست، در عوض این شبکه‌ی میزبان به طور مستقیم ویژگی‌های الکتریکی، نوری، مغناطیسی و کاتالیزوری مواد نانوکامپوزیت را حفظ می‌کند.
3-1 سنتز آئروژل با فرآیند سل-ژلتفاوت در ویژگی‌های شیمیایی پیش‌ماده‌ها برای فاز نانو (معمولاً نمک فلزی) و برای ماتریس آلی (عموماً الکوکسید‌ها) موضوع مهمی هستند، چرا که پارامترهای فرآیند سل-ژل بر روی هیدرولیز و چگالش هر کدام از این پیشماده‌ها تأثیر متفاوتی دارد [28]. هر چند این موضوع مساله‌ی مهمی در طراحی هر نانوکامپوزیت سل-ژل است اما در رابطه با آئروژل‌ها حیاتی‌تر می‌باشد، زیرا نیازمند جایگزین شدن حلال موجود در ژل (معمولاً اتانول یا متانول در الکوژل و آب در آکوژل) با تغییر حلال و در نهایت حذف کردن به وسیلهی استخراج حلال فوق بحرانی است. مرحله خشک کردن فوق بحرانی، بسته به این که الکل یا کربن دی اکسید به صورت فوق بحرانی تخلیه شود (به ترتیب نیازمند حرارتی در حدود 350 و 40 درجهی سانتیگراد است). این مرحله مسائل دیگری درباره حلالیت پیشماده‌ها و پایداری حرارتی در شرایط خشک کردن فوق بحرانی را مطرح می‌کند [29]. استراتژی‌های مختلف اتخاذ شده برای سنتر نانوکامپوزیت‌های آئروژل، بسته به اینکه فاز نانو (یا پیش‌مادهی آن) در حین یا بعد از فرآیند سل-ژل اضافه شود، دو رویکرد کلی دارند.
روش اول شامل هیدرولیز و ژل شدن نانوذرات و ماتریس پیشماده و ژل شدن ماتریس پیش‌ماده به همراه شکل‌گیری نانوذرات است. مزیت این روش تولید موادی با بارگذاری نانوذرات قابل کنترل است. از طرفی، چندین اشکال در مورد آن مطرح است. برای بهدست آوردن ژل دارای چند ترکیب همگن شرایط سنتز باید به صورت دقیق انتخاب شود و پیشماده‌های نانوذرات و همچنین عوامل پوشش دهی موردنیاز در شکل‌گیری نانوذرات کلوئیدی ممکن است بر سنتز سل-ژل ماتریس تأثیر بگذارد.
روش دوم شامل روش‌های مبتنی بر اضافه کردن فاز نانو بعد از فرآیند سل-ژل است و باید ساختار متخلخل و مورفولوژی ماتریس را حفظ کند. این روش‌ها شامل تلقیح فاز نانو با اشباع، ته‌نشینی و روش رسوبگذاری بخار شیمیایی می‌باشد. طرح‌واره روش‌های مختلف برای شیمی سنتز نانوکامپوزیت آئروژل در شکل 3-1 نشان داده شده است.
هرچند این روشها نیز دارای دو اشکال عمده هستند: یکی همگنی ضعیف ترکیب نانوکامپوزیت تولیدشده، دیگری ترد و شکننده بودن آئروژل‌ها. اتصال فلز در یک ماتریس با گروه‌های هماهنگ اصلاح شده است و غوطه‌ور کردن الکوژل و آکوژل در محلول قبل از خشک کردن فوق بحرانی، به ترتیب به عنوان راهحلهایی برای غلبه بر کاستی‌های گفته شده است. رسوب نانوذرات از فاز بخار، بر خلاف روش‌های تلقیح مرطوب، ماتریس متخلخل را تغییر نمیدهد و تضمین میکند که فاز مهمان در سراسر ماتریس توزیع خواهد شد [30].

شکل 3-1 طرح‌واره‌ای از روش‌های مختلف برای شیمی سنتز نانوکامپوزیت [33].
3-2 شکل‌گیری ژل خیسژل‌های سیلیکا به طور عمومی با هیدرولیز و واکنش چگالش پیشماده سیلیکا به‌دست می‌آیند. ماتریس سیلیکای نهایی متخلخل است و حفره‌های ژل با حلال جانبی هیدرولیز و واکنش پلیمریزه شدن پر شده است. اگر ترکیب محلول بهتواند از ژل خیس بدون سقوط قابل ملاحظه ساختار خارج شود، آئروژل شکل می‌گیرد [31].
روش سل-ژل شامل یک یا چند پیشماده سیلیکون است که متداول‌ترین آن‌ها TEOS و TMOS می‌باشند و داراری چهار گروه الکوکسید شناخته شده در آرایش چهار وجهی در اطراف اتم سیلیکون مرکزی است. واکنش هیدرولیز در چهار جهت اتفاق می‌افتد و منجر به پیوند Si-O-Si می‌شود و یک مادهی کپهای که ترکیبی از 2SiO را می‌دهد. اگر یکی از شاخه‌های الکوکسید اتم سیلیکون توسط گروه عاملی مختلفی که قادر نیست تحت واکنش چگالش قرار گیرد، جایگزین شود گروه عاملی با پیوند کووالانسی به اتم سیلیکون درون ماتریس ژل باقی خواهد ماند. الکوکسیدهای فلزی به راحتی با آب واکنش می‌دهد و بر حسب میزان آب و حضور کاتالیست، عمل هیدرولیز ممکن است کامل انجام شود.
ملکول‌های شکلگرفته آلی-فلزی به مرور زمان بزرگ می‌شوند و به صورت یک ساختار پیوسته در داخل مایع در می‌آیند. این ساختار پیوسته که حالت الاستیک دارد، ژل گفته می‌شود [32].
به طور کلی شکل‌گیری محلول پایدار الکوکسید یا پیشماده‌های فلزی حل شده مرحله اول فرآیند تهیه آئروژل است. این محلول همگن به‌دست آمده در مرحله دوم به علت وجود آب هیدرولیز شده و سل یکنواختی را ایجاد می‌کند. در مرحله سوم واکنش بسپارش ادامه پیدا می‌کند تا سل به ژل تبدیل شود. این مرحله، پیرسازی نیز گفته می‌شود. پس از آن مرحلهی نهایی که خشک کردن است باقی می‌ماند.
3-3 خشک کردن آلکوژلبعد از شکل‌گیری ژل توسط هیدرولیز و واکنش چگالش، شبکه Si-O-Si شکل می‌گیرد. بخش پیرسازی به تشدید شبکه ژل اشاره دارد؛ ممکن است چگالش بیشتر، تجزیه، و ته‌نشینی ذرات سل یا تبدیل فاز داخل فاز جامد یا مایع صورت گیرد. این نتایج در یک جامد متخلخل که حلال در آن گیر افتاده است اتفاق می‌افتد. فرآیند حذف حلال اصلی از ژل (که معمولاً آب و الکل است) را خشککردن می‌گویند. در طول فرآیند خشککردن، ترکخوردگی اتفاق می‌افتد به این دلیل که نیروی مویینگی در گذار مایع-گاز در داخل منافذ ریز وجود دارد. معادله لاپلاس در اینجا به کار می‌رود، هر چه شعاع مویینگی کوچک‌تر باشد، ارتفاع مایع بیشتر و فشار هیدروستاتیک بالاتر خواهد بود. هنگامی که انرژی سطح باعث بالا رفتن ستون مایع داخل مویرگ‌ها می‌شود، مقدار فشار سطحی داخل مویرگ قابل محاسبه است.
قطر حفره در ژل از مرتبهی نانومتر است، به طوری که مایع ژل فشار هیدروستاتیک بالایی را باید اعمال کند. هلال داخل حفره‌ها و نیروهای کشش سطحی سعی می‌کند تا ذرات را به عنوان مایع در حفره‌ها تبخیر کند. این نیروها می‌توانند به گونه‌ای عمل کنند که باعث سقوط حفره و ساختار شوند. بنابراین ژل‌ها با حفره‌های ریز زیاد تمایل به انقباض و ترک خوردن دارند [33]. سل ژلهایی که شیمی سطح آن‌ها اصلاح نشده (شکل3-2) و در شرایط محیط خشک شدند به علت این فروپاشی منافذ تا حدود یک هشتم حجم اولیهی خود کوچک میشوند؛ ماده حاصل زیروژل نامیده میشود. اگر این فرآیند خشککردن به آرامی رخ دهد، زیروژل یکپارچه سالم میتواند تولید شود. اما برای تولید یک آئروژل، باید از عبور از مرز فاز بخار-مایع اجتناب کرد.

شکل 3-2 اصلاح شیمی سطح ژل [34].
روشهای کنونی برای پرهیز از فروپاشی منافذ درساخت آئروژل را میتوان در سه تکنیک کلی دستهبندی کرد. هرکدام از این تکنیکها طراحی شدهاند تا نیروهای مویینگی ناشی از اثرات کشش سطحی را کاسته و یا حذف نمایند. این تکنیکها الف) خشک کردن در شرایط محیط پس از اصلاح سطح، ب) خشک کردن انجمادی و ج) خشک کردن فوق بحرانی است [34]. توضیح کلی درباره هرکدام از این تکنیکها در ادامه آمده است.
3-3-1 فرآیند‌های خشککردن در شرایط محیطاین تکنیکهای خشک کردن طراحی شدهاند تا ژل خیس را در فشار محیط خشک کنند. این روشها نیازمند فرآیندهای شیمیایی با تعویض طولانی مدت حلال برای کاهش نیروهای مویینگی وارد بر نانوساختار یا برای افزایش توانایی نانوساختار در تحمل این نیروهاست (یا با قویتر کردن ساختار و یا با منعطف‌تر ساختن آن). تغییر شیمی سطح ژل خیس بر پایه TEOS برای ارتقاع انقباض قابل برگشت با استفاده از تبادل حلال با هگزان به وسیله اصلاح سطح با فرآیند کاهش گروه سیلانولی با TMCS [35و36]. همچنین استفاده از پیری ژل در محلول الکل یا الکوکسید برای سفت شدن میکرو ساختار به منظور جلوگیری از فروپاشی منافذ است [37]. به علاوه ترکیبکردن شاخه‌های متقاطع سیلیکا آئروژل است که می‌تواند نیروهای مویینگی در حین خشک کردن تحت فشار محیط را تحمل نماید [38].
3-3-2 خشککردن انجمادیخشککردن انجمادی یک ژل خیس منجر به تولید کریوژل میشود. خشککردن انجمادی باعث تولید پودر آئروژل کدر می‌شود [39]. این تکنیک حلال اضافی را با تصعید حذف میکند. ژل خیس منجمد میشود و سپس حلال در فشار پایین تصعید میشود [40]. میکروبلور‌های منجمد که حین فرآیند خشککردن انجمادی شکل می‌گیرند منجر به آئروژل‌های ماکروحفره‌تری در مقایسه با روش استخراج فوق بحرانی میشوند [41].
3-3-3 خشک کردن فوق بحرانیروشهای استخراج فوق بحرانی از مرز بین مایع و بخار با بردن حلال به بالاتر از نقطه فوق بحرانی آن اجتناب می‌کند و سپس از ماتریس سل-ژل به عنوان یک مایع فوق بحرانی حذف می‌شود. در این حالت هیچ مرز مایع-بخاری وجود ندارد، بنابراین هیچ فشار مویینگی دیده نمی‌شود. شکل 3-3 چرخه فشار-دما در طول فرآیند فوق بحرانی را نشان می‌دهد. در عمل انواع متعددی از روشهای استخراج فوق بحرانی وجود دارد که شامل تکنیک‌هایی با دمای بالا، دمای پایین و سریع است.

شکل 3-3 چرخه فشار-دما در حین فرآیند خشک کردن فوق بحرانی [42].
تکنیک‌های استخراج فوق بحرانی الکل دمای بالا، ژل خیس را به حالت فوق بحرانی حلال (معمولاً متانول یا اتانول) در یک اتوکلاو و یا هر مخزن فشار دیگری می‌برد. این مستلزم فشارهای بالا حدود Mpa 8 و دماهای بالا حدود 260 درجهی سانتیگراد می‌باشد [42]. شکل 3-4 شماتیکی از دستگاه خشککن فوق بحرانی اتوکلاو را نشان می‌دهد.

شکل 3-4 شماتیکی از دستگاه خشک کن فوق بحرانی اتوکلاو [42].
تکنیکهای استخراج فوق بحرانی دمای پایین بر اساس استخراج 2CO است که دمای نقطه بحرانی پایین‌تری نسبت به مخلوط الکل باقیمانده در منافذ سل-ژل بعد از پلیمریزاسیون دارد. این روش به تبادل حلال به طور سری نیازمند است، ابتدا حلال غیرقطبی و سپس با کربن دیاکسید مایع پیش از استخراج فوق بحرانی که می‌تواند در نقطه فوق بحرانی 2CO اتفاق بیافتد [43]. مزایای این تکنیک دمای بحرانی پایین‌تر و حلال پایدارتر است؛ هرچند مراحل اضافه شده به فرآیند سبب طولانی‌تر شدن زمان آمادهسازی آئروژل می‌شود. از آنجائیکه فشار بحرانی مورد نیاز نسبت به روشهای فوق بحرانی دما بالا تغییری چندانی ندارد (فشار بحرانی 2CO مشابه متانول و اتانول است)، این فرآیند نیز نیاز به استفاده از مخازن فشار دارد. به علاوه روند انتشار تبادل حلال وابسته به اندازهی ژل است.
تکنیکهای استخراج فوق بحرانی سریع از یک قالب محدود استفاده می‌کند، چه در مخزن فشار و چه در یک فشار داغ هیدرولیک قرار بگیرند. این تکنیکها فرآیندهای تک مرحله‌ای پیش‌ماده به آئروژل هستند و آئروژل را در کمتر از 3 ساعت بهدست می‌آورند. در این روش پیشماده‌های شیمیایی مایع و کاتالیست در یک قالب دو قسمتی ریخته می‌شوند سپس به سرعت گرم می‌شوند [44]. در ابتدا فشار با بستن دو بخش قالب با هم یا با اعمال فشار هیدروستاتیکی خارجی به جای مخازن فشار بزرگ‌تر یا با ترکیبی از این دو تنظیم می‌شود. زمانیکه نقطه فوق بحرانی الکل فرارسید، اجازه داده میشود تا مایع فوق بحرانی خارج شود [45]. برای مثال گوتیه و همکارانش [46] در روند انجام این فرآیند از یک فشار داغ هیدرولیکی برای مهروموم کردن و گرم کردن قالب حاوی مخلوط پیشماده آئروژل استفاده کردند. مخلوط مایع از پیشماده‌های آئروژل در یک قالب فلزی ریخته شد و سپس در فشار داغ قرار گرفت. در طول اجرا، فشار داغ برای مهروموم کردن ترکیب به جای قالب استفاده شد و یک نیروی باز دارندهی فشاری را فراهم کرد. سپس قالب و مخلوط به بالای دما و فشار فوق بحرانی متانول برده شد. در مدت زمان این فرآیند گرم کردن، پیشمادههای آئروژل واکنش نشان داده و یک ژل خیس نانوساختاری متخلخل را تشکیل داد. زمانیکه به حالت بحرانی رسید، فشار کاهش داده شد و مایع فوق بحرانی رها شد.
3-3-4 مقایسه روش‌هاهر یک از روش‌های ساخت آئروژل شرح داده شده در بالا، نقاط قوت و محدودیت‌هایی دارند. مقایسه مستقیم تکنیک‌های مختلف خشک کردن به علت دستورالعمل‌های پیشماده متفاوت، شرایط ژل شدن مختلف، و زمان پیر سازی، به خوبی روش‌های استخراج متفاوت هستند. برای مثال خشککردن فوق بحرانی دما پایین نیاز به زمان پیرسازی کافی دارد، به طوری که ژل‌ها می‌توانند از ظرف اولیه برای استخراج و تبادل حلال خارج شوند.
در فرآیند خشککردن سریع، عموما زمان پیرسازی کوتاه است؛ گرچه، دمای بالا در این فرآیند اثر مشخصی را روی روند واکنش چگالش دارد.
مزیت اصلی تکنیک‌های خشک کردن در فشار محیط، عدم نیاز به تجهیزات فشار بالا می باشد که گران قیمت و به طور بالقوه خطرناک است؛ اگرچه به مراحل پردازش چندگانه با تبادل حلال نیاز دارند. تا به حال مطالعات اندکی در رابطه با استفاده از روش‌های خشککردن انجمادی شده است. این تکنیک‌ها نیاز به تجهیزات خاصی برای رسیدن به دمای پایین لازم برای تصعید حلال و منجر شدن به پودر آئروژل، دارند.
محدودیت اصلی تکنیکهای فوق بحرانی دما بالا، رسیدن به دماهای بالای مورد نیاز برای دست یافتن به نقطه بحرانی حلال الکل و نیز ملاحظات ایمنی در بکار بردن مخزن فشار در این شرایط است.
روش استخراج دما پایین به طور گسترده در تولید آئروژل‌های یکپارچه کوچک تا بسیار بزرگ استفاده شده است، اگرچه می‌تواند روزها تا هفته‌ها تولید آن طول بکشد و مراحل چندگانه تبادل حلال مورد نیاز، آن را تبدیل به فرآیندی پیچیده کند و اتلاف قابل ملاحظه‌ای از حلال و 2CO ایجاد می‌کند. تکنیک‌های خشککردن سریع ساده‌تر و سریع‌تر است. تمامی فرآیند، بر خلاف مراحل چندگانه و مقیاس‌های زمانی در ابعاد روزها و ماهها در سایر روش‌ها، در یک مرحله انجام شده و می‌تواند در چند ساعت تکمیل شود. همچنین این روش‌ها اتلاف کمتری را به وجود می‌آورند. یک ایراد روش‌های خشککردن سریع، نیاز به دما و فشار بالاست [47].
3-4 مروری بر کارهای انجام شدهاگرچه میدانیم که این گزارش‌های جامعی از مقالات مرتبط با نانوکامپوزیت‌های آئروژل نیست، اما تأکید بر این مطلب است که چگونه ترکیب نانوذرات ممکن است احتمال استفاده از آئروژل‌ها را به عنوان مواد جدید افزایش دهد و چگونه مسیر آماده سازی مورد اطمینان برای به‌دست آوردن نانوکامپوزیت‌های آئروژل برای کاربرد خاص را انتخاب نماییم.
پس از آنکه کیستلر در سال 1931 برای اولین بار بدون درهم شکستن ساختار ژل، فاز مایع را از آن جدا کرد، در سال 1938 به مطالعه روی رسانایی گرمایی آئروژل و در سال 1943 درباره سطح ویژه آن‌ها به مطالعه پرداخت [48]. بعد از آن حدود نیمقرن دانشمندان علاقه‌ای به آئروژل‌ها نشان ندادند تا در اویل 1980 آئروژل به عرصه پژوهش بازگشت.
در سال 1992تیلسون و هاربش از TEOS به عنوان پیشمادهی سیلیکا ژل استفاده کردند و از میکروسکوپ الکترونی روبشی برای مشخصه‌یابی آن‌ها استفاده نمودند [49] و سپس هر ساله تحقیقات زیادی روی آئروژل‌ها صورت می‌گیرد.
در سال 2001 کاساس و همکارانش نانوکامپوزیت مغناطیسی را با ورود ذرات اکسید آهن در سیلیکا آئروژل میزبان سنتز کردند. این سنتز که به روش سل-ژل و با خشککردن فوق بحرانی متانول انجام شد، دو نمک آهن استفاده شد: O2H9.(3ON)Fe و O2H2.(EDTA)FeNa. در این پژوهش ارتباط واضحی بین پیشماده، آب و تخلخل و سطح ویژه آئروژل حاصل وجود داشت. استفاده از ترکیب EDTA به عنوان پیش‌مادهی نانوذرات، قطر میانگین حفره‌ها را افزایش داد، گرچه قابلیت حل پایین نمک EDTA در محلول یک مانع بزرگ برای رسیدن به آهن در این روش بود. مساحت سطح ویژه‌ی نمونه‌های کاساس بین /g2m 200 و /g2m 619 بهدست آمد و برخی نمونه‌ها رفتار پارامغناطیس و برخی دیگر رفتار مغناطیس نرم از خود نشان دادند [50].
در سال 2002 واگنر و همکارانش ذرات سیلیکا با هستهی مغناطیسی را با روش ته‌نشینی به‌دست آوردند [51]. و چند سال بعد در سال 2006 ژانگ و همکارانش ذرات پوسته‌ای هسته‌دار را با روش سل-ژل تهیه کردند. این ذرات شامل هستهی مغناطیسی فریت کبالت و پوستهی سیلیکا بودند که از TEOS به عنوان پیشمادهی سیلیکا استفاده کردند. پس از آنکه ژل‌ها به‌دست آمدند، در 110 درجهی سانتیگراد برای 4 ساعت در خلاء خشک شدند زیرا اگر در هوا خشک شوند احتمال ته‌نشینی بلور‌های اکسید وجود داشت. سپس به مدت 2 ساعت در دماهای مختلف برای به‌دست آوردن نانو بلور پراکنده در ماتریس سیلیکا حرارت داده شد. برای نمونه‌ی آن‌ها شکل‌گیری فاز فریت کبالت در دمای 800 درجهی سانتیگرادکامل شد و خوشه‌های فریت کبالت به سمت نانو بلوری شدن پیش رفتند، زمانی که برهم‌کنش بین خوشه‌های فریت کبالت با ماتریس سیلیکا شکسته شد پیوندهای Si-O-Fe ناپدید شدند. بر طبق گزارش آن‌ها اشباع مغناطیسی نانوکامپوزیت‌ها با افزایش غلظت بیشتر فریت در ماتریس افزایش یافت تا مقدار بیشینه emu/g 98/66 برای نمونه با نسبت مولی 1:1 (wt% 80 فریت کبالت) به‌دست آمد [52].
سیلوا و همکارانش در سال 2007 کامپوزیت ذرات فریت کبالت پخش شده در ماتریس سیلیکا را به روش سل-ژل تهیه کردند. آن‌ها از TEOS به عنوان پیشماده سیلیکا و از نیترات به عنوان پیش‌ماده فریت استفاده کردند. پس از گذشت زمان پیرسازی، نمونه برای 12 ساعت در 110 درجهی سانتیگراد خشک شدند و ذرات فریت کبالت در ماتریس سیلیکا شکل گرفتند. پس از آن عملیات حرارتی برای 2 ساعت در دماهای 300، 500، 700 و 900 درجهی سانتیگراد انجام شد که باعث افزایش در اندازهی ذرات شد. رسوب ذرات خوشه‌ای فریت در دیواره‌های منافذ زیروژل با افزایش دما بیشتر شد و در دماهای بالاتر از 700 درجهی سانتیگراد بلورهای بزرگ‌تر کبالت داخل منافذ ماتریس شکل گرفتند و افزایش در مغناطش اشباع و پسماند مغناطیسی را باعث شدند [53].
در همان سال فرناندز و همکارانش نانو کامپوزیت سیلیکا آئروژل/ آهن اکسید را با فرآیند سل-ژل و تبخیر فوق بحرانی حلال سنتز کردند. آن‌ها نمونه‌ها با پیشماده‌های TEOS و TMOS را با تبخیر فوق بحرانی اتانول و متانول خشک کردند. ذرات مغناطیسی با اندازهی متوسط nm 6 با TEOS و متانول سنتز شدند در حالی که فری‌هیدرات‌ها از TMOS و اتانول به‌دست آمدند. بعضی نمونه‌های آن‌ها رفتار ابر پارامغناطیس از خود نشان دادند [54].
دو سال بعد ژنفا زی و همکارانش نانوذرات فریت کبالت را به روش هم‌نهشت شیمیایی و خشک شدن در هوا در دمای80 درجهی سانتیگراد تهیه کردند. اندازهی قطر نانوذرات سنتز شده nm 20 تا nm 30 بود و دمای کوری در فرآیند افزایش دما کمتر از فرآیند کاهش دما بود. مقدار اشباع مغناطیسی این ذرات emu/g 77/61 بهدست آمد که نسبت که مقدار کپه آن کوچک‌تر بود. در این پژوهش مقدار پایین نیروی وادارندگی به دو دلیل اتفاق می‌افتد: ذرات فریت ممکن است ساختار چند دامنه داشته باشند. شکل‌گیری چند دامنه‌ها و حرکت دیوارهای دامنه می‌تواند کاهش دامنه را نتیجه دهد. همچنین اگر اندازهی بحرانی ذرات [55] بهدست آمده بزرگ‌تر از قطر میانگین ذرات باشد، رفتار تک دامنه را از خود نشان می‌دهند. آن‌ها گزارش کردند که کاهش وادارندگی نمونه‌ها به رفتار وابسته به اندازهی ذرات بستگی دارد [56].
بلازینسکی و همکارانش در پژوهشی که در سال 2013 انجام دادند، سیلیکا آئروژل را با روش سل-ژل و فرآیند فوق بحرانی تهیه کردند. آن‌ها دریافتند که روش خشک کردن فوق بحرانی مؤثرترین روش برای بهدست آوردن بهترین ویژگی این محصولات است. بدین منظور آن‌ها دستگاه خشک کن فوق بحرانی را برای خود ساختند که فشار و دما به طور دستی تنظیم می‌شد و مرحله مهم در آمادهسازی سیلیکا آئروژل‌ها بود. به این ترتیب آن‌ها سیلیکا آئروژل‌های شفاف با مساحت سطح ویژه بالا به‌دست آوردند [57].
در گزارشی دیگر در سال 2014 ساجیا و همکارانش پودر آمورف فریت کبالت را به روش سل-ژل تهیه کردند و این روش را بهترین روش تهیه نانوذرات عنوان کردند. آن‌ها دریافتند که عملیات حرارتی برای تجزیه کامل مقدار مواد آلی و نیترات حاضر در پودر آمورف لازم است. در این فرآیند برای جلوگیری از ته‌نشینی یا رسوبگذاری این واکنش اسید سیتریک به آن اضافه کردند و سپس مراحل خشک کردن و عملیات حرارتی انجام شد. پارامترهای عملیات حرارتی، مرحله نهایی در آماده‌سازی نانوذرات فریت کبالت بودند که بررسی شدند. ساختار اسپینل در همهی نمونه‌های آن‌ها شکل گرفته بود و هنگامی که ذرات شروع به رشد کردند ناخالصی‌ها حذف شد. ویژگی مغناطیسی مرتبط با رفتار فریمغناطیس این نمونه‌ها مقدار emu/g 62 برای اشباع مغناطیسی را نشان می‌دهد [58].
در جدیدترین پژوهشی که دربارهی آمادهسازی و ارزیابی نانوکامپوزیت سیلیکا آئروژل/فریت در سال 2014 صورت گرفته است، کاتاگر و همکارانش نانوذرات فریت را به روش ته‌نشینی آماده کردند و سپس TMOS را به آن اضافه نمودند. برای این کار آن‌ها O2H6. 2NiCl، O2H6. 3FeCl و 2ZnCl را با اضافه کردن آب مقطر حل کردند. PH محلول در رفلاکس 110 درجهی سانتیگراد به مدت 24 ساعت 13 تنظیم شده بود. با حذف NaOH که برای PH اضافه شده بود، و شستن مکرر با آب مقطر و اتانول نانوذرات نتیجه شدند. بعد از بهدست آمدن نانوذرات به طور مستقیم به TMOS اضافه شدند و 3NH و آب دیونیزه به عنوان کاتالیست برای تهیه سل همگن اضافه گردیدند. برای مرحله پیر سازی قالب‌های حاوی سل را در اتانول به مدت 2 ساعت و دمای 50 درجهی سانتیگراد پیرسازی کردند و در نهایت ژل خیس را با خشک کردن فوق بحرانی کربن دی اکسید بهدست آوردند. تحقیقات آن‌ها نشان داد که زمان ژل شدن با افزایش نسبت مولی اتانول/TMOS افزایش یافت. همچنین به دلیل کشش سطحی اتانول، نمونه‌ها منقبض می‌شوند یا ترک می‌خورند. نانوکامپوزیت به‌دست آمده ساختار اسکلت شبکه‌ی سه بعدی را حفظ کرد. مساحت سطح ویژه با افزایش مقدار فریت از /g2m 700 تا /g2m 300 تغییر کرد. به علاوه ویژگی مغناطیسی فریت در ساختار نانو کامپوزیت تغییر نکرد [59].
3-5 برخی از کاربردهای آئروژل3-5-1 آئروژل‌ها به عنوان کامپوزیتهمانطور که پیشمادهی الکوکسید سیلیکون برای شکل‌گیری شبکه‌ی ژل با اکسیدهای فلزی دیگر به اندازه‌ی کافی واکنشی است، مطالعات زیادی در زمینه سنتز سیلیکا آئروژل برای کاربردهای مختلف صورت گرفته است [1].
3-5-2 آئروژل‌ها به عنوان جاذبآئروژل‌های فوق آبگریز و انعطافپذیر برای در جذب حلال‌های معدنی و روغن‌ها سنتز شدند. ونکاتشوارا رائو و همکارانش چگالی جذب و واجذب سیلیکا آئروژل‌های فوق آبگریز را با استفاده از یازده حلال و سه روغن بررسی کردند [60].
3-5-3 آئروژل‌ها به عنوان حسگرآئروژل‌ها تخلخل بالا، حفره‌های در دسترس، و سطح در معرض بالا دارند. از این رو کاندیداهای خوبی برای استفاده به عنوان حسگر هستند.بر اساس مطالعه وانگ و همکارانش روی آئروژل لایه‌ی نازک نانوذرات سیلیکا آئروژل نشان داد که مقاومت الکتریکی به طور قابل ملاحظه‌ای با افزایش رطوبت کاهش یافت. زیروژل همان مواد حساسیت کم‌تری را نشان داد. آئروژل‌هایی که اصلاح سطح شدند در مقایسه با آئروژل‌های آب‌گریز کمتر تحت تأثیر رطوبت قرار گرفتند و می‌توانند به عنوان ضد زنگ و عوامل آب‌گریز مورد استفاده قرار بگیرند [61].
چن و همکارش آئروژل‌هایی را برای کاربرد حسگرهای زیستی مطالعه کردند. در مطالعه آن‌ها، آئروژل‌های مزوحفره به وسیله پلیمریزاسیون سل-ژل با یک مایع یونی به عنوان حلال تهیه کردند. نتایج نشان می‌دهدکه آئروژل آماده شده می‌تواند به عنوان یک بسترشناسایی برای اسید نوکلوئیدها به کار رود [62].
3-5-4 آئروژل به عنوان مواد با ثابت دی الکتریک پایینلایه نازک‌های آئروژل 2SiO توجه خاصی را به خود اختصاص داد، به دلیل ثابت دی الکتریک خیلی پایین، تخلخل و پایداری حرارتی بالا. پارک و همکارانش لایه نازک سیلیکا آئروژل را برای لایهی داخلی دی الکتریک مورد بررسی قرار دادند و ثابت دی الکتریک را تقریبا 9/1 اندازه‌گیری کردند. آن‌ها ثابت دی الکتریک بسیار پایین فیلم‌های آئروژل را برای لایهی داخلی مواد دی الکتریک تولید کردند. فیلم های سیلیکا آئروژل به ضخامت Å 9500، % 5/79 تخلخل، و ثابت دی الکتریک پایین 2 با روش فرآیند خشک کردن محیط با استفاده از n-هپتان به عنوان حلال خشک کن به‌دست آوردند [63].
3-5-5 آئروژل به عنوان کاتالیزورمساحت سطح ویژه‌ی بالای آئروژل‌ها منجر به کاربردهای زیادی می‌شود، از جمله جاذب شیمیایی برای پاکسازی نشتی. این ویژگی کاربرد زیادی را به عنوان کاتالیزور یا حامل کاتالیزور به همراه دارد. آئروژل‌ها در کاتالیست‌های همگن مناسب هستند، زمانی که واکنش‌دهنده‌ها هم در فاز مایع و هم در فاز گاز هستند [27].
3-5-6 آئروژل به عنوان ذخیره سازیتخلخل بالا و مساحت سطح زیاد سیلیکا آئروژل‌ها می‌تواند برای کاربردهایی مثل فیلترهای گازی، جذب رسانهای برای کنترل اتلاف، محصور سازی، ذخیره سوخت هیدروژن به کار رود. آئروژل‌ها می‌توانند در مقابل تنش گذار مایع/گاز مقاومت کنند زیرا بافت آنها در طول پخت تقویت شد به عنوان مثال در ذخیره سازی، انتقال مایعات چون سوخت موشک‌ها کار برد دارد. به علاوه وزن پایین آئروژل‌ها بزرگ‌ترین مزیت است که در سیستم حمل دارو به دلیل ویژگی زیست سازگار آن‌ها مورد استفاده است [64]. کربن آئروژل‌ها در ساخت الکتروشیمی ابر خازن دو لایه کوچک استفاده شد. ابر خازن‌های آئروژل مقاومت ظاهری پایینی در مقایسه با ابر خازن‌های معمولی دارد و می‌تواند جریان بالا را تولید یا جذب کند.
3-5-7 آئروژل‌ها به عنوان قالبفیلم‌های سیلیکا آئروژل برای سلول‌های خورشیدی رنگ حساس استفاده شدند. مساحت سطح ویژه‌ی فیلم‌های آئروژل روی فیلم‌های شیشه‌ای رسانا تهیه شدند. نشست لایه اتمی برای پوشش قالب آئروژل با ضخامت‌های مختلف 2TiO با دقت کمتر از نانومتر انجام شد. غشاء آئروژل پوشش داده شده با 2TiO در سلول خورشیدی رنگ حساس گنجانیده شد. طول نفوذ شارژ با افزایش ضخامت 2TiO افزایش یافت که منجر به افزایش جریان شد [65].
3-5-8 آئروژل به عنوان عایق گرماجدای از تخلخل بالا و چگالی پایین یکی از جذاب‌ترین ویژگی‌های آئروژل رسانندگی گرمایی پایین آن‌ها است، علاوه بر این، از یک شبکه‌ی سه بعدی با ذرات ریز متصل شده تشکیل شده‌اند. بنابراین انتقال گرما از میان بخش جامد آئروژل‌ها از طریق مسیر پر پیچ و خمی است. فضای اشغال نشده در یک جامد توسط آئروژل به طور معمول با هوا پر شده مگر آن که تحت خلاء مهروموم شده باشد. این گازها می‌توانند انرژی حرارتی را از طریق آئروژل انتقال دهند. حفره‌های آئروژل باز هستند و اجازه عبور گاز از میان مواد را می‌دهند [27].
3-5-9 آئروژل‌ها در کاربرد فضاییناسا از آئروژل‌ها برای به دام انداختن ذرات گرد و غبار روی فضاپیما استفاده کرد. ذرات در برخورد با جامد اسیر شده، گازها تبخیر می‌شوند و ذرات در آئروژل به دام می‌افتند [27].
جدول 3-1 کاربردهای مختلف آئروژل‌ها را به طور مختصر نشان می‌دهد.
3-6 خلاصهدر این فصل پس از مقدمه‌ی کوتاه، اندکی در مورد سنتز آئروژل با روش سل-ژل گفته شد. پس از آن فرآیند‌های لازم برای شکل‌گیری ژل بیان شد و سپس تکنیک‌های مختلف خشک کردن و شرایط لازم برای این کار با مختصری توضیح نوشته شد. بعد مروری کوتاه به برخی از تلاش‌های انجام شده در این زمینه داشتیم و در آخر برخی از کاربردهای مختلف آئروژل‌ها را با ذکر مثال درج شد.
جدول 3-1 کاربردهای مختلف آئروژل‌ها [27].
خاصیت ویژگی کاربرد
رسانایی الکتریکی بهترین جامد عایق
شفاف
مقاومت در برابر درجه حرارت بالا
سبک ساخت و ساز ساختمآن‌ها و عایقبندی لوازم خانگی
ذخیره سازی
ماشین، وسیله نقلیه فضایی
دستگاه‌های خورشیدی
چگالی/تخلخل سبک‌ترین جامد مصنوعی
سطح ویژه_ی بالا
کامپوزیت‌های چندگانه کاتالیزور
حسگر
ذخیرهی سوخت
تبادل یون
فیلترهای آلاینده‌های گازی
اهداف ICF
حامل رنگ‌دانه
قالب
اپتیکی شفافیت
شاخص بازتاب پایین
کامپوزیت‌های چندگانه اپتیک سبک وزن
آشکارسازهای چرنکوف
راهنماهای نوری
عایق صوتی سرعت صوت پایین اتاق‌های ضد صدا
تطبیق مقاومت ظاهری صوتی در التراسونیک
مکانیکی الاستیک
سبک جاذب انرژی
تله برای ذرات سرعت بالا
الکتریکی ثابت دی الکتریک پایین
قدرت دی الکتریک بالا
سطح ویژهی بالا دی الکتریک برای ICها
جدا کنندهی الکترودهای خلا
خازن
فصل چهارمسنتز و بررسی ویژگی‌های نانوکامپوزیت سیلیکا آئروژل/نانوذرات فریت کبالت21434265186580مقدمهآئروژل‌ها کاندیدا‌های ایدهآلی برای طراحی نانوکامپوزیت‌های کاربردی تقویت شده با نانوذرات فلزی یا اکسید فلزی هستند. مساحت سطح ویژهی بالا با ساختار حفره‌ای، آئروژل‌ها را قادر می‌سازد تا به طور موثری میزبان نانوذرات ریز پراکندهشده باشند و این اطمینان را می‌دهد که نانوذرات در دسترس هستند.
راه گسترش آئروژل‌های کاربردی برای تهیهی مواد کاربردی خلاق از طریق طراحی نانوکامپوزیت‌ها است، به طوری که نانوذرات فلز یا اکسید فلز به داخل ماتریس آئروژل الحاق می‌شوند. با توجه به گسترش محدوده و قابلیت زیستی آئروژل‌ها، تهیه این نانوکامپوزیت‌ها برای جلوگیری از تجمع نانوبلورها و رشد از طریق ذرات بستر برای یک کاربرد خاص را فراهم می‌کند.
4-1 مواد مورد استفاده در پژوهش آلکوکسیدهای فلزی یک دسته از خانواده‌ی ترکیبات آلی فلزی میبا شند که شامل یک بنیان آلی چسبیده به یک عنصر فلزی یا شبهفلزی میباشند. تترا اتیل اورتو سیلیکات (TEOS) که دارای نماد شیمیایی 4)5H2Si(OC می‌باشد از جمله الکوکسیدهایی است که به عنوان پیشماده در سنتز سیلیکا آئروژل به کار می‌رود. در این پژوهش از TEOS به عنوان پیشماده سیلیکا ژل با جرم مولی g/mol 33/208 استفاده شد. متداول‌ترین آئروژل‌ها با بسپارش سل-ژل سیلیکا الکوکسید سنتز شدند [66]. نیترات آهن(ΙΙΙ) 9 آبه و نیترات کبالت(ΙΙ) 6 آبه به ترتیب با جرم مولی‌های g/mol 404 و g/mol 04/291 برای تهیه نانوذرات فریت کبالت به کار رفت. متانول و آب دیونیزه به عنوان حلال نیاز بود.
4-2 روش تجربی و جزئیاتدر ابتدا برای سه درصد وزنی مورد نظر میزان گرم و لیتر مورد نیاز هر ماده محاسبه شد که در جدول 1 نشان داده شدهاست. در همهی درصد وزنی‌ها نسبت نیترات آهن(ΙΙΙ) 9 آبه به نیترات کبالت(ΙΙ) 6 آبه 2 به 1 باقی ماند.

user8300

3-2-4- نرم افزارها 27
3-3- روشها 28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی 28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید 28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات 28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب 29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli 29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli 29
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی 29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد 30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری 31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا 32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL 32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL 33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی 33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین 34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد 34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 34
عنوان صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) 35
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفور 35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز 36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات 38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی 39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا 39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف 39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 40
فصل چهارم: نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا 43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL 44


4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی 44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز 45
4-3- سنتز مایعات یونی 47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی 48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف 49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی 51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم 51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی 54
فصل پنجم: بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 57
عنوان صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی 61
فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات
6-1- نتیجهگیری 63
6-2- پیشنهادات 63
فهرست منابع 65
چکیده انگلیسی 75
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) 6
شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز 9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب 12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز 18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید 28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL 42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی 45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL 46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL 47
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی 48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون 52
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85 54
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] 55
فصل اول
مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که میتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده زمین لیپیدها هستند و آنزیمهای لیپولیتیک نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیمهای لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلولهای یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیمها مزایای زیادی در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها میتوان اختصاصیت بالای آنها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینهها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیمها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم درBOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).
آنزیمهای میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیمهای میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دستورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن میباشد)، پایداری بیشتر و تولید آسانتر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتریها و بنابراین آسانتر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آنها، باعث تسهیل فرآیندهایی همچون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دستیابی به بیشترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلولها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی میشوند. تنها حدود دو درصد از گونههای میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شدهاند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).
1-2- لیپازها
لیپازها اولین بار در سال 1901 در باکتریهای Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهای امروزی Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسایی شدند (Eijkman et al., 1901). باکتریهای گفته شده هماکنون بیشترین مطالعات لیپازی را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روی آنزیمهای هیدرولیز کننده تریگلیسریدها میگذرد و حدود 70 سال است که توانایی لیپازها در کاتالیز واکنشهای هیدرولیز و سنتز استرها تشخیص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولین آنزیم لیپاز را (آنزیم تجزیه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شیره پانکراس کشف کرد. انسانها در قدیم لیپاز را از پانکراس حیوانات به صورت خالص یا به صورت مخلوط با سایر آنزیمهای پانکراس میگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مینمودند. به دلیل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوری آنزیم از آن، دانشمندان به سراغ لیپازهای میکروبی رفتند. لیپازها از نظر نوع منشأ ( باکتری، قارچ یا پستاندار و غیره) و از نظر خصوصیات متفاوت هستند. این آنزیمها دارای توانایی کاتالیز واکنشهای مختلفی از جمله واکنشهای هیدرولیزی، یا سنتز کربوکسیلیکاسترهای مختلف و تبدیل آنها به اسیدهای آلی و گلیسرول هستند. همه لیپازها اختصاصیت بسیار بالایی برای سوبستراهای گلیسریدی دارند.
آنزیمهای لیپولایتیک به دلیل کاربرد فراوانی که در بیوتکنولوژی دارند ( به عنوان مهمترین گروه بیوکاتالیزورها در بیوتکنولوژی)، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). تولید انبوه لیپازهای میکروبی نیازمند بیان شدید و کارآ از ژنهای مربوطه و فهم دقیق مکانیسم ملکولی نحوه پیچش پروتئین و ترشح آن میباشد. از جمله کاربردهای جدید لیپازها در بیوتکنولوژی میتوان استفاده از این آنزیم در سنتز بیوپلیمر، بیودیزل، داروهای خالص انانتیومری، مواد شیمیایی مورد استفاده در کشاورزی ( مانند انواع آفت کش)، ترکیبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسیاری از مواد شیمیایی مهم صنعتی، به دست آمده از روغنها و چربیها طی فرآیندهای شیمیایی را میتوان به کمک لیپازها با سرعت بیشتر، اختصاصیت بهتر و در شرایط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزینی بالای لیپازها و اختصاصیت بالای شیمیایی و انانتیومری آنها توجه بسیاری از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
لیپازهای گرفته شده از منابع مختلف باکتری، قارچ، گیاه و حیوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصیت به موقعیت پیوند، اختصاصیت به اسیدچرب، پایداری دمایی و pH بهینه و غیره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههای متعددی از باکتریها، مخمرها و قارچهای رشتهای توانایی تولید لیپاز دارند (جدول1) سویه های نزدیک به هم (از نظر تاکسونومی) ممکن است انواع مختلفی از لیپاز ها را تولید کنند (Sharma et al., 2001).
جدول 1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز
منشأ جنس گونه
باکتری Bacillus B. megaterium
B. subtilis
B. thermoleovorans
B. thermocatenulatus
B. cereus
Pseudomonas P. putida 3SK
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. fragi
Staphylococcus S. canosus
S. hyicus
S. haemolyticus
S. aureus
S. warneri
S. xylosus
قارچ Penicillium P. cyclopium
P. simplicissimum
Aspergillus A. niger
A. oryzae
Rhizopus Rhizop. delemar
Rhizop. oryzae
Rhizop. arrhizus
Rhizop. nigricans
Rhizop. nodosus
مخمر Candida C. rugosa
C. tropicalis
C. antarctica
لیپازها را میتوان براساس اختصاصیت به سه گروه تقسیم کرد (Mukherjee et al., 1994). لیپازهای غیر اختصاصی ملکولهای آسیل گلیسرول را در موقعیتهای تصادفی میشکنند و اسیدچرب آزاد و گلیسرول و منوآسیل گلیسرول و دیآسیلگلیسرول را به عنوان حدواسطهای واکنش ایجاد میکنند. محصولات این واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتالیزورهای شیمیایی است. در واکنش آنزیمی محصول در اثر دما کمتر تجزیه میشود و این به دلیل پایینتر بودن دمای واکنش در کاتالیز زیستی است. لیپازهای اختصاصی به موقعیتهای 1و3، آزادسازی اسیدچرب از موقعیتهای 1و3 اسکلت گلیسرولی را کاتالیز میکنند. لیپازهای دارای اسیدچرب اختصاصی، تنها یک اسیدچرب خاص از ملکول آسیل گلیسرول آزاد میکنند (Macrae et al., 1983). لیپازها همچنین تفکیک انانتیومری ترکیبات کایرال و واکنشهای استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون، و اینتراستریفیکاسیون را کاتالیز میکنند. این تواناییهای متنوع کاتالیز، در شکست چربیها، اصلاح چربیها و روغنها، سنتز ترکیبات آلی، تأمین شویندهها و روشهای تجزیهای، کاربرد بسیاری پیدا کرده است (Macrae et al., 1985).
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن
این خصوصیت لیپازها که در سطح بین فضای آبدوست و آبگریز عمل میکنند، وجه تمایز لیپازها از استرازها میباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولی آنزیمهای لیپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون میباشد. این آنزیمها نیز شبیه سرینپروتئازها دارای مجموعه سه تایی کاتالیتیک باقیمانده نوکلئوفیل- باقیمانده هیستیدین- باقیمانده اسیدی هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرین- هیستیدین- آسپارتات یا به صورت مجموعه سه تایی سرین- هیستیدین- گلوتامات میباشد (Noble et al., 1993).
جایگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقیماندههای آبگریز احاطه میشود. یک ساختار مارپیچ پلیپپتیدی همانند یک درپوش مانع از قرارگیری جایگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال میشود. همچنین محافظت از آنزیم در برابر فعالیت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تایی کاتالیتیک پروتئاز ایجاد شود (B--y et al., 1990). سمتی از درپوش که روبروی جایگاه فعال است بیشتر از زنجیرههای جانبی آبگریز آلیفاتیک تشکیل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بیرون قرار گرفته است.
تغییر جهتگیری ساختار α- هلیکس درپوش همراه با افزایش آبگریزی سطوح نزدیک جایگاه فعال و روبروی آن، باعث پدیده "فعال شدن در فضای بینابینی" میشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزیم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهای آبگریز، اتصال زنجیرههای آلیفاتیک سوبسترا به سطح آبدوست آنزیم، به ویژه در حضور یک لایه آبپوشی، بسیار نامطلوب است. فضای بینابینی ایجاد شده در دهانه شیار فعال ممکن است به فراهم سازی یک لایه ناکامل آبپوشی در اطراف ملکول لیپاز و در نتیجه تسهیل پیچش زنجیرههای آلیفاتیک ملکول سوبسترا در سطح آنزیم کمک کند (Petersen et al., 1996). پایدارسازی بیشتر میتواند به کمک محدودههای الکتروستاتیک موضعی در سطح آنزیم و با ایجاد جاذبه دوقطبی به سمت پیوند C-H (با قطبیت ضعیف) زنجیرههای جانبی آلیفاتیک فراهم شود.

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL).
آمینواسیدهای اصلی جایگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.
1-3- آنزیمها در محیط آلی
کلیبانو با انجام تعدادی آزمایش ابتدایی و ساده نشان داد که میتوان از آنزیمها در حلالهای آلی آبگریز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنین محیطهایی سرعت واکنش به شدت پایین میآید (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسیاری از لیپازها و همچنین برخی از پروتئازها و آسیلازها بسیار پایدار هستند، به طوری که حتی در حلالهای آلی بدونآب نیز فعالیت خود را حفظ میکنند. این خصوصیت اساس استفاده موفقیتآمیز از این آنزیمهای هیدرولاز در واکنشهای غیرهیدرولازی است. از جمله این واکنشهای غیرهیدرولازی میتوان آسیلاسیون الکلها و آمینها با اختصاصیت انانتیومری را نام برد که در صنعت کاربرد زیادی دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محیط آلی، که شامل مایعات یونی نیز میشود، با فعالیت آنزیم غالبا از جنبه حذف آب ضروری آنزیم مورد بررسی قرار میگیرد. بسیاری از آنزیمها برای فعال بودن به یک پوشش آبی کامل نیاز دارند، اما تعداد زیادی استثناء نیز وجود دارد مانند لیپاز B کاندیدا آنتراکتیکا (CALB) که فعالیت خود را حتی پس از خشک شدن با پنتوکسید فسفر حفظ میکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتیسیلین که برای فعال ماندن تنها نیاز به تعداد اندکی ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزیم دارد (Dolman et al., 1997). بررسی منابع علمی نشان میدهد که بیان نیاز آنزیم به آب در قالب فعالیت آبی (aW ) مرسومتر از بیان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهای غیرهیدرولازی با آنزیمهای لیپاز یا پروتئاز ممکن است باعث حفظ یا افزایش فعالیت آنزیمی شود. هرچند چنین محیطهایی همیشه باعث افزایش واکنشهای جانبی هیدرولازی میشوند. همچنین اسید حاصل از این واکنشها ممکن است باعث کاهش pH و از دست رفتن فعالیت آنزیمی شود.
حلالهایی که به خوبی توسط این آنزیمها تحمل میشوند – هیدروکربنهای آروماتیک و آلیفاتیک، اترها، و الکلها (بجز متانول)- فقط به صورت ضعیفی با آنزیم برهمکنش میدهند و میتوان حدس زد که این حلالها کم و بیش فقط برای آنزیم یک فضای خالی ایجاد میکنند. تنها الکلها که تشکیل دهنده پیوند هیدروژنی هستند میتوانند لیپازها را غیرفعال کنند. حلالهایی که برهمکنش بسیار قوی با پروتئینها میدهند، مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) و دی متیل فرمآمید (DMF) نیز باعث غیرفعال شدن برگشتناپذیر آنزیمها میشوند. بنابراین آنزیمها برهمکنشهای قوی با هیچ مادهای به جز آب را نمیتوانند تحمل کنند (Van Rantwijk, 2007).
نامشخص بودن pH در محیط بدون آب یک عامل پیچیده در آنزیمشناسی است. آنزیم توزیع بار الکتریکی (pH ظاهری) را مطابق با آخرین محلول آبی، مثلا بافر لیوفیلیز، حفظ میکند (Zaks and Klibanov 1985). البته pH بهینه ظاهری تحت تأثیر نوع حلال و aW تغییر میکند (Yang et al., 1993). چنین اثرات مشابهی در محیط مایعات یونی نیز قابل انتظار است.
در حقیقت بیشترین اطلاعات درباره رفتار آنزیم در محیط غیرآبی، حاصل از مطالعات آنزیمها در حلالهای آلی است. اما حلال های آلی برای طبیعت زیان آور هستند بنابراین در سالهای اخیر تلاش زیادی در جهت یافتن جایگزین پاکتری برای محیطهای واکنش انجام شده است.از جمله محلولهای دوستدار محیط زیست مایعات یونی را میتوان نام برد که میتوانند جایگزین حلالهای آلی شوند.
علاقه عمومی برای افزایش سرعت واکنشهای آنزیمی در حلالهای آلی نیز عامل پیشبرنده دیگر به سمت مایعات یونی بوده است. یکی از دلایل کاهش فعالیت آنزیمی در حلالآلی (در مقایسه با محیط آبی) پایدارسازی مواد واکنش دهنده در حلال است (Klibanov et al., 1997). این اثر که در واقع همان افزایش حلالیت (افزایش Km) است، با به کارگیری غلظتهای بالاتری از ماده واکنشدهنده قابل جبران است (Halling et al., 2004). بقیه کاهش فعالیت، در حد 1 تا 2 برابر، مربوط به اثر مجموعهای از عوامل شامل ناپایدار شدن حالت گذار واکنش (Clark et al., 2004)، تغییرات کنفورماسیون و از دست دادن انعطافپذیری میباشد (Halling et al., 2004, Clark et al., 2004 ). ثابت دیالکتریک پایین محیطهای آلی معمولی باعث افزایش انرژی حالت گذار شدیدا قطبیده در مقایسه با آب میشود و بنابراین ناپایدار شدن حالت گذار را در پی خواهد داشت (Clark et al., 2004).
1-4- مایعات یونی
از میان مایعات مختلفی که میتوان بهعنوان حلال به کار برد تنها تعداد اندکی به طور عمومی مورد استفاده قرار میگیرند. با معرفی تکنولوژیهای سبز یک نگرانی اصلی، ایجاد جایگزینهای مناسب برای حلالهای مخرب است که در صدر جدول مواد شیمیایی زیانآور هستند. زیرا این حلالها در مقادیر بالا استفاده میشوند و به طور معمول مایعات فراری هستند. نمکهای مرکب مایعاتی هستند که فقط یون دارند (مایعات یونی). در صورت انتخاب مواد اولیه مناسب میتوان مایعات یونی ساخت که در دمای اتاق و در دمای پایینتر از دمای اتاق مایع هستند. مایعات یونی مواد جدیدی نیستند. بسیاری از آنها سالهای زیادی است که شناخته شدهاند. برای مثال میتوان [EtNH3][NO3] را نام برد که دمای ذوب 12 درجه سانتیگراد دارد و در سال 1914 معرفی شد. از همان زمان پیشنهاد شد که از مایعات یونی در سنتز شیمیایی به جای حلال استفاده شود. البته تنها در سالهای اخیر تعداد زیادی مقالات در این زمینه به چاپ رسیده است. برخی خصوصیات فیزیکی ساده مایعات یونی که آنها را به عنوان حلالهای بالقوه برای سنتز جالب توجه کرده است توسط ولتون بیان گردیده است (Welton et al., 1999):حلالهای خوبی برای طیف وسیعی از مواد آلی و غیر آلی هستند.
معمولا شامل یونهای نامتناسبی هستند که امکان قطبیت بالا در آنها را ایجاد میکند.
طبق مقیاس قطبیت نرمال شده که در آن تترامتیل سیلان صفر و آب 0/1 در نظر گرفته شده، قطبیت مایعات یونی مرسوم، به طور معمول در محدوده 6/0-7/0 قرار میگیرد ( مانند فرمامید و الکلهای محلول در آب )
(van Rantwijk et al., 2003). همچنین کاهش طول زنجیره آلکیلی متصل به حلقه ایمیدازولیوم و اندازه آنیون در مایعات یونی دارای کاتیون ایمیدازولیومی، با افزایش قطبیت مایع یونی در ارتباط است (Carmichael and Seddon, 2000). مقدار قطبیت مایع یونی گاهی به دما و حضور آب حساس است (Baker et al., 2002). مایعات یونی به دلیل قطبیت بالایی که دارند محیط خوبی برای واکنشهای شیمیایی و بیوشیمیایی ایجاد میکنند. زیرا میتوانند سوبستراهای مختلفی شامل ترکیبات آلی قطبی و غیرقطبی و ترکیبات آلی و غیر آلی و پلیمری را در خود حل کنند.
با تعدادی از حلالهای آلی غیر قابل امتزاج هستند و بنابراین یک جایگزین قطبی غیرآبی برای سیستمهای دو فازی میباشند. همچنین مایعات یونی آبگریز را میتوان به عنوان فاز قطبی غیر قابل امتزاج همراه با آب استفاده کرد (Welton et al., 1999).
مایعات یونی فرار نیستند و این به دلیل یونی بودن ماهیت آنها است که فشار بخار ناچیزی دارند. بنابراین میتوان از آنها بدون ایجاد آلودگی در سیستمهایی با مکش قوی استفاده کرد (Welton et al., 1999).
بنابراین مایعات یونی دارای پایداری دمایی بوده و فاقد فشار بخار میباشند (Gordon et al., 2001, Brennecke et al., 2001). به علاوه داری خصوصیات استثنائی به عنوان حلال هستند و میتوانند هر ماده شیمیایی را در خود حل کنند. با جایگزین کردن کاتیون، آنیون و اجزای متصل به آنها، میتوان خصوصیات این حلالها را تغییر داد و به این صورت مایع یونی مناسب برای واکنش خاصی را ایجاد نمود (Brennecke and Maginn, 2001) (شکل 1-3). گرچه هنوز مشخص نیست که مایع یونی چگونه خصوصیات کاتالایتیک آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهد، آنزیمها در مایعات یونی مانند [C4MIM][PF6] فعال و به شدت پایدار هستند (Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000, Laszlo et al., 2001).

شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز.
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی
دلیل تمایل به انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی در واقع میل به جایگزین کردن مایعات یونی غیرفرار به جای حلالهای آلی فرار بوده است. هرچند این واکنشها در محیط طبیعی آنزیم یعنی محیط آبی قابل انجام است اما حلالهای آلی به طور وسیعی همراه با آنزیمها مورد استفاده قرار گرفتهاند تا از این طریق میزان حلالیت واکنشگرهای آبگریز را بیشتر کرده و تعادل واکنش را از سمت هیدرولیز به سمت سنتز تغییر جهت دهند. همچنین خصوصیات غیرمرسوم مایعات یونی به عنوان حلال، باعث گسترش روشهای متعدد جدید و بسیار کارآ شده است (Van Rantwijk et al., 2007).1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی- آب
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. سری هافمیستر نوعی دستهبندی یونها است که به ترتیب توانایی آنها در حل کردن و رسوبدهی پروتئینها ایجاد شده است.
اخیرا در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. مایعات یونی را به خوبی میتوان براساس موقعیت قرارگیری یونها، در سری هافمیستر به گونهای مرتب نمود که ترتیبی از پایدارکنندهترین تا ناپایدارکنندهترین (کاسموتروپ تا کائوتروپ) ایجاد شود.
نمک های سری هافمیستر با ویژگی های کاسموتروپیک و کائوتروپیک یونها مرتبط هستند. یونهایی که به شدت آب پوشی میشوند به کاسموتروپ ها معروفند و آن دسته از یون هایی که به صورت ضعیف هیدراته می شوند، کائوتروپ خوانده می شوند (Lo Nostro et al., 2005). یونهای حاصل از نمکهای سری هافمیستر به دو گروه تقسیم می شوند: Salting- out و Salting- in (Kunz et al., 2004). یون های out-Salting (آنیون های کاسموتروپ مثل فسفات، سولفات وکاتیون های کائوتروپیک مثل کاتیون های آمونیوم) پروتئین ها را پایدارکرده و نیز باعث رسوب آنها می شوند. در مقابل یون های Salting- in (آنیونهای کائوتروپ مثل آنیون های پرکلرات، برماید و کاتیونهای کاسموتروپ مثل کاتیون لیتیم) پروتئین ها را ناپایدار میکنند (Kunz et al., 2004). درغلظت های پایین نمک (تا سقف 01/0 مولار) یون ها غالبا از طریق برهمکنش های الکترواستاتیک روی آنزیم ها تاثیر می گذارند. هنگامی که در غلظت های زیاد نمک نیروهای انتشار یا پراکندگی یونی بر پتانسیل الکترواستاتیک پیروز میشوند، اثر یونهای هافمیستری اهمیت پیدا میکنند (Lo Nostro et al., 2005).
بسیاری از آنزیمها به خوبی در طیف وسیعی از مایعات یونی در محیط آبی عمل میکنند. به سختی میتوان مایع یونی پیدا کرد که به هیچ عنوان با هیچ آنزیمی سازگاری نداشته باشد. در رابطه با پیشبینی سازگاری آنزیم و مایعات یونی آبی به نظر میرسد که کائوتروپی و کاسموتروپی نمیتوانند به عنوان تنها عوامل پیشبینی کننده استفاده شوند. همچنین بعید به نظر میرسد که بتوان سازگاری آنزیم با مایعات یونی را با در نظر گرفتن تعداد محدودی پارامتر همچون قطبیت یا logP تفسیر نمود. این موضوع در مورد حلالهای ملکولی محلول در آب نیز صدق میکند (Van Rantwijk et al., 2007).
اساس پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی آبی را میتوان این گونه بیان کرد که پروتئین زمانی پایداری خود را از دست میدهد که یونها یا ملکول های حلال اطراف آن با فرم بازشده آنزیم برهمکنش قویتری نسبت به فرم طبیعی آنزیم داشته باشند (Baldwin et al.,1996). چنین برهمکنشهای ناپایدارکنندهای میتوانند حاصل از "Salting in" یونهای دوگانه دوست روی گروههای آبگریز فرو رفته درون ساختار پروتئین یا حاصل از برهمکنشهای قوی آنها با پیوندهای پپتیدی باشد (Kaar et al., 2003, Lou et al., 2006). از جمله مباحث مهمتری که باید به خصوص در مورد آنزیمهای حساس مد نظر قرار داد میتوان تغییرات pH ایجاد شده توسط یونهای اسیدی یا قلیایی برونشتد و فعالیت آبی ترمودینامیکی را نام برد.
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001) و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای MeSO4- (Schofer et al., 2001)، NO3- (Kaar et al., 2003)، AcO-یا lactate- (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است (شکل 1-4). آب نیز چنین عملکردی دارد؛ اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
به نظر میرسد که مایعات یونی بدون آب با روشی مشابه حلالهای آلی مرسوم، آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهند؛ زیرا بسیاری از آنها به خوبی تحمل میشوند اما برخی از آنها نیز سازگاری بسیار کمی دارند که البته این موضوع به نوع آنزیم نیز بسیار وابسته است. برای مثال مایعات یونی حاوی یونهای AcO- و NO3- که به صورت مخلوطهای آبی سازگاری بسیار خوبی دارند، در حالت بدون آب آنزیم بسیار مقاوم CALB را غیر فعال میکنند. بر اساس اطلاعات فعلی، مایعات یونی با آنیونهای BF4- و PF6-، و آنیون مقاوم به هیدرولیز NTf2- و آنیونهای زنجیر متوسط آلکیل سولفات به همراه کاتیونهای دیآلکیلایمیدازولیوم و آلکیلپیریدینیوم گزینههای ایمنتری به نظر میرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون یک اساس نظری برای پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی بیآب ایجاد نشده است. هرچند تعدادی از عوامل سهیم احتمالی مانند قابلیت کاتیون برای ایجاد پیوند هیدروژنی (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکیل نانوساختارهای متصل به هیدروژن، و گرانروی حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر میرسد که میزان هسته دوستی آنیون (Kaar et al., 2003) یا قابلیت پذیرش پیوند هیدروژنی توسط آن (Sheldon et al., 2002) نیز، حداقل در حالتی که میل کاتیون برای تشکیل پیوند هیدروژنی کم است، میتواند یکی از عوامل کنترل کننده باشد. در این مورد یک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنیون H2PO4- است که بدون دناتوره کردن میتواند Cyt C را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء دیگر [HOPMIM][glycolate] است که با داشتن کاتیون و آنیونی با قابلیت بالا در ایجاد پیوند هیدروژنی، آنزیمهای احیاکننده را در فرم فعال در خود حل میکند (Walker and Bruce, 2004).

شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب. الف) شکل شماتیک از نحوه برهمکنش مایع یونی با بخشهای باردار و غیرقطبی آنزیم، ب) ساختار شبیه سازی شده آنزیم CALB در محیط مایع یونی DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقی از سطح آنزیم را نشان میدهد که زنجیرههای آلیفاتیک حضور دارند و رنگ نارنجی نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزیم هستند (Klahn et al., 2011).
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب
پایداری (دمایی) آنزیمها (فعالیت در طی زمان) معمولا در محیطهای آلی به خصوص با فعالیت آبی کم، نسبت به محیطهای آبی، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مایعات یونی نیز میتوانند چنین اثری داشته باشند. پایداری آنزیمی تعریف واضحی ندارد و روشهای متنوعی برای سنجش آن وجود دارد. برای بررسی پایداری در ذخیره سازی، آنزیم در مایع یونی در یک دمای خاص انکوبه شده و میزان فعالیت باقیمانده در نمونهها که با آب رقیق شدهاند بررسی میشود. بازیابی فعالیت بالایی از آنزیم در چنین روشی نشان دهنده این است که تغییرات ایجاد شده در ساختار آنزیم در این چنین محیط ذخیرهسازی برگشت پذیر است. پایداری آنزیم را میتوان با انکوبه کردن آنزیم در مایع یونی در بازههای زمانی مختلف و سنجش فعالیت در همان محیط بررسی نمود. همچنین میتوان ساختار آنزیم را با روشهای اسپکتروسکوپی در محیط مورد نظر بررسی نمود. برای مثال دمای بازشدن ساختار پروتئین شیرین مونولین از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزایش یافت (Baker et al., 2004). نوع دیگر پایداری که میتوان مورد بررسی قرار داد پایداری در شرایط واکنش است.
بهطور کلی آنزیمها در مایعات یونی فعالیت و ساختار خود را در مدت زمان طولانیتر و در دماهای بالاتری نسبت به حلالهای آلی ملکولی حفظ میکنند. دلیل احتمالی این امر گرانروی بالای مایعات یونی است که باعث کند شدن حرکت دمینهای پروتئین از موقعیت خود در فرم فعال پروتئین به موقعیتهای جدید ایجاد کننده فرم غیرفعال میشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت
پیوندهای هیدروژنی عامل پیوستگی ساختار آنزیمهای آبپوشی شده و بدون آب هستند. هر تغییر ساختاری مستلزم فروپاشی تعداد قابل توجهی از پیوندهای هیدروژنی به طور همزمان میباشد؛ این امر سهم قابل توجهی در پایداری آنزیم دارد و گویای اثرات حافظه آبپوشی و اثرات پسماند است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند این است که تعداد ملکولهای آب متصل به آنزیم تنها وابسته به میزان فعالیت آبی نیست، بلکه به حافظه آبپوشی نیز مربوط میباشد.
پژوهشهای مختلفی نشان داده اند حلالهایی که در شرایط آبی یا غیرآبی با آنزیم سازگارند، مانند استونیتریل یا ترت- بوتیل الکل، در غلظتهای پایین باعث غیرفعال شدن آنزیم میشوند (Griebenow et al., 1996). چنین نتایجی را میتوان در پژوهشهای انجام شده در مایعات یونی نیز مشاهده کرد. دلیل این امر کاهش اثر آبگریزی در حضور حلال است. در نتیجه پایداری آنزیم کاهش مییابد تا اینکه در یک غلظت مشخص آنزیم غیرفعال میشود.
پیوندهای هیدروژنی میتوانند توضیح مناسبی برای پایداری آنزیم در مایعات یونی بدون آب باشند. مایعات یونی، بهخصوص آنیون آنها که پیوندهای هیدروژنی قوی ایجاد میکنند، ممکن است باعث از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی شوند که عامل یکپارچگی ساختار α- هلیکسها و صفحات β بودهاند و بنابراین باعث باز شدن کل پروتئین یا بخشی از آن شوند. برای مثال یون لاکتات به راحتی میتواند با اسکلت پلیپپتیدی پیوند هیدروژنی برقرار کند. اندازه یون نیز میتواند مهم باشد زیرا یونهای با اندازه بزرگ برای ایجاد تعداد اندکی پیوند هیدروژنی بین خود و آنزیم، نیاز دارند که تعداد زیادی پیوند هیدروژنی را بشکنند، بنابراین نمیتوانند به سادگی پایداری آنزیم را مختل کنند. در آنزیمهایی که به صورت برگشتپذیر غیرفعال شدهاند احتمالا پیوندهای هیدروژنی توانستهاند کانفورماسیون را حفظ کنند و در ادامه برای بازیابی ساختار آنزیم لازم است این پیوندها فروپاشند و پیوندهای طبیعی دوباره ایجاد شوند. رقیق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مایع یونی دناتوره کننده، میتواند باعث تشکیل دوباره پیوندها شود احتمالا چنین ترکیباتی که پیوند هیدروژنی قوی تشکیل میدهند با تشکیل پیوندهای هیدروژنی ناپایدار، تشکیل دوباره پیوندها را تسهیل میکنند.
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها
کاربرد لیپازها در بیوترانسفورماسیون شامل طیف وسیعی از واکنشهای سالوولایتیک( نوعی از واکنشهای جانشینی هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفیل عمل کرده و جانشین یک اتم یا گروه در ملکول سوبسترا میشود) مربوط به گروه کربوکسیل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله این واکنشها میتوان استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون (الکلولیز)، پرهیدرولیز، و آمینولیز (سنتز آمید) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهای ترانساستریفیکاسیون و سنتز آمید ترجیحا در محیط بیآب و در حضور زئولیت فعال، جهت متوقف ساختن واکنشهای هیدرولازی ناخواسته، انجام میشود. در این واکنشها اغلب از آنزیمهایی همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده میشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتی چنین شرایطی را تحمل میکنند.
جهت دستیابی به بهینهترین حالت تشخیص انانتیومرها لازم است که محیط واکنش، مایع یونی یا محیطهای سنتی، با توجه به نوع ماده واکنش دهنده و نوع آنزیم بهینهسازی شود. در واقع نمیتوان یک مایع یونی را به عنوان بهترین گزینه برای انجام واکنشهای تفکیک مخلوطهای راسمیک نام برد، همانطور که یک حلال آلی را نمیتوان به طور کلی بهترین دانست. با ظهور مایعات یونی، گزینههای حلال انتخابی و بنابراین شانس یافتن محیط مناسب به میزان زیادی افزایش یافته است.
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس
ملکول پروتئین طی فرآیندهای غیرفعال شدن چند فاز مختلف را طی میکند. این پدیده نشاندهنده یک سری وقایع درون ملکولی در کنفورماسیونهای گذرای پروتئین است (De Diego et al., 2004). از روشهای مختلفی جهت بررسی ساختار پروتئین استفاده میشود که از آن جمله میتوان روشهای DSC ، NMR، CD، FTIR، اسپکتروفتومتری UV، کریستالوگرافی اشعه X و اسپکتروسکوپی فلورسانس را نام برد. فلورسانس یک روش در دسترس است که میتوان از آن جهت بررسی ساختار سوم پروتئین استفاده کرد.
در پروتئینهایی که دارای آمینواسیدهای فلوروفور هستند (مثل تریپتوفان، تیروزین یا فنیلآلانین) تغییر در IMax فلورسانس و شیفت قرمز در λMax فرآیند دناتوره شدن پروتئین را نشان میدهند و هر دوی این تغییرات به دلیل افزایش قطبیت باقیماندههای تریپتوفان پروتئین با قرارگیری آن در معرض حلال است. مکانیسم ملکولی پایدار شدن آنزیم در مایعات یونی (در بیوکاتالیز کاربردی) همچنان نامعلوم است و نیاز به بررسیهای بیشتر وجود دارد (De Diego et al., 2004).
پروتئینها پس از برانگیختگی در طول موج nm 280 (مربوط به همگی فلوروفورهای پروتئین) یا nm 295 (بیشتر مربوط به باقیماندههای تریپتوفان)، به طور معمول نور را بین طول موج nm 300 و nm 350 منتشر میکنند. شدت فلورسانس در واقع جمع نور منتشر شده توسط هر کدام از باقیماندههای فلوروفور پروتئین میباشد. باز شدن نسبی ساختار پروتئین باعث افزایش برهمکنش باقیماندههای آمینواسیدی پروتئین با حلال (به طور معمول آب) میشود. همچنین ممکن است حلقه اندولی تریپتوفان با دیگر آمینواسیدهای موجود در ساختار پروتئین وارد برهمکنش شود. هر دوی این پدیدهها سبب کاهش شدت فلورسانس و گاهی سبب ایجاد یک شیفت قرمز در پیک نشر فلورسانس (کاهش λMax) میشود که این پدیده را نشانهای از باز شدن پروتئین در محیط آبی میدانند (Bekhouche et al., 2011).
با ورود مایعات یونی به محیط پروتئینها به عنوان حلالهای جدید، مشکلاتی در بررسی ساختار توسط روشهای مختلف ایجاد میشود. از جمله این مشکلات تداخلهای ایجاد شده در طیفهای CD و فلورسانس را میتوان نام برد که در گزارشات مختلفی به آنها اشاره شده است (Shu et al., 2011, Bekhouche et al., 2011, Attri and Venkatesu, 2013). با این وجود شاید بتوان ساختار پروتئین را بیشتر بر اساس شیفتهای λMax و مقایسه شدت فلورسانس در حالتهای دمادهی مختلف در یک مایع یونی با غلظت مشخص، مورد بررسی قرار داد.
به طور کلی میتوان گفت که طیف وسیعی از آنزیمها میتوانند مخلوطهای آبی مایعات یونی را به عنوان محیط واکنش تحمل کنند. به سختی میتوان مایع یونی را یافت که هیچ آنزیمی نتواند با آن سازگار باشد. عقیده بر این است که مایعات یونی در غلظتهای بالاتری، نسبت به حلالهای ملکولی قابل امتزاج با آب، میتوانند توسط آنزیمها تحمل شوند.
بسیاری از هیدرولازها به خصوص آنهایی که توانایی تحمل حلالهای ملکولی را دارند به میزان قابل توجهی میتوانند واکنشهای غیرهیدرولازی را در مایعات یونی کاتالیز کنند. میزان فعالیت آنزیمها در مایعات یونی در حد فعالیت آنها در حلالهای آلی و یا حتی بالاتر نیز میباشد. به علاوه در بسیاری از موارد افزایش پایداری دمایی و عملکردی و افزایش اختصاصیت انانتیو و ریجیو نیز دیده شده است.
مایعات یونی سازگار با آنزیمها به طور معمول برهمکنش قوی با آنزیم نمیدهند و باعث حل شدن آنزیم نمیشوند. تاکنون اساس نظری برای پیشبینی سازگار بودن یا نبودن مایع یونی با آنزیم ایجاد نشده است هرچند با توجه به علاقه زیادی که در این موضوع وجود دارد انتظار میرود که به زودی یک اساس نظری در این زمینه مطرح گردد.
مایعات یونی قابلیت بالایی در کاربرد به عنوان حلال در واکنشهای بیوترانسفورماسیون مربوط به واکنشدهندههای بسیار قطبی مانند پلیساکاریدها دارند؛ زیرا چنین واکنشهایی به دلیل محدودیتهای تعادل واکنش در آب قابل انجام نیستند. چنین جایگزینی یک محیط فرار با محیط غیرفرار مایعات یونی بدون شک ادامه خواهد یافت و به تدریج توسط صنایع شیمیایی پذیرفته خواهد شد و سهم بزرگی در ایجاد کارآیی بالای واکنشهای مختلف خواهد داشت. توسعه مایعات یونی ارزانتر نیز باعث افزایش استفاده از آنها در بیوترانسفورماسیونهای صنعتی خواهد شد. به علاوه باید این موضوع را در نظر داشت که سیستمهای حلالی که بر پایه مایعات یونی هستند قابلیت بالایی در انجام ترانسفورماسیونهای چند کاتالیزوری دارند. برای دستیابی به این اهداف تلاشهای جدیدی انجام گرفته است.
بدون شک انتظار میرود که مایعات یونی سبز و زیست سازگار به زودی در دسترس باشند؛ زیرا به کارگیری مایعات یونی در ایجاد صنایع شیمیایی سبزتر، امری کاملا ضروری است. اینگونه به نظر میرسد که انجام بیوترانسفورماسیون در مایعات یونی بسیار امید بخش است.
فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز
اولین گزارش از بیوکاتالیز در محیط مایعات یونی مربوط به سال 2000 است (Cull et al., 2000). اولین کارهای انجام شده در این زمینه شامل مایعات یونی متشکل از کاتیونهای 1و3- دی آلکیل ایمیدازولیوم یا N- آلکیل پیریدینیوم و یک آنیون ضعیف کئوردینه کننده بود (شکل2-1و جدول 2-1). این نوع مایعات یونی هنوز نقش اصلی را در واکنشهای آنزیمی ایفا میکنند. هرچند که تحقیقات در حال حاضر بیشتر به سمت مایعات یونی با ساختارهای جدید گرایش یافته است. تاکنون مقالات مروری خوبی در زمینه بیوکاتالیز در مایعات یونی منتشر شده است که از آن جمله پروژه - ریسرچمروری ون رنتویجک و شلدون و مقالات مروری منیرالزمان را میتوان نام برد (Van Rantwijk and Sheldon, 2007, Moniruzzaman, 2010 a& b).

شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی که به طور مرسوم در بیوکاتالیز استفاده میشوند
(Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونیفرمول ساختاری علامت اختصاری نام آنیون
BF4- BF4- Tetrafluoroborate
PF6- PF6- Hexafluorophosphate
(CF3SO2)2N- Tf2N Bis(trifluoromethylsulfonyl)amide
CF3SO3- TfO Trifluoromethanesulfonate
CF3COO- TFA Trifluoroacetate
CH3SO3- MeSO3 Methylsulfite
n-C7H15SO3- HpSO3 Hydrogenthiophosphate
TsO- TsO Toluenesulfonate
CH3OSO3- MeSO4 Methylsulfate
C2H5OSO3- EtSO4 Ethylsulfate
n-C8H17OSO3- OctSO4 Octylsulfate
(HO)2PO2- H2PO4 Dihydrogenphosphate
(CH3O)2PO2- Me2PO4 Dimethyl phosphate
C2H5O(CH2)2OSO13- EtOEtSO4 Ethoxyethylsulfate
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. یک مطالعه اولیه روی آنزیم آلکالین فسفاتاز مربوط به باکتری اشرشیا کلای در مخلوط آبی [EtNH3][NO3] (قدیمیترین مایع یونی (Walden, 1914 )) نشان داد که این مایع یونی در غلظتهای پایین روی آنزیم اثر فعال کننده داشته است و بیشترین اثر گذاری آن (10 درصد افزایش فعالیت) در غلظت 1/1 مولار دیده شده است. با افزایش غلظت مایع یونی تا قبل از غلظت 80 درصد فعالیت آنزیم به طور برگشت پذیر کاهش یافت و پس از آن آنزیم به طور برگشت ناپذیری غیر فعال گردید (Magnuson et al., 1984).
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم
در سالهای اخیر در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. به تازگی آنیونهای α-آمینواسیدها در مایعات یونی مورد استفاده قرار گرفتهاند. این آنیونها کاسموتروپ هستند (Zhao, 2006). مایعات یونی تشکیل شده از α-آمینواسیدهای D و L و ω- آمینوکربوکسیلاتها و کاتیون [C2MIM] در غلظت 5/0 مولار اثر بسیار کمی بر فعالیت آنزیم سوبتیلیسین داشتند. در حالی که [C2MIM][D-GluO] در غلظت 1 مولار سرعت واکنش را بیش از 60 درصد کاهش داد و [C2MIM][L-GluO] باعث کاهش 80 درصدی سرعت شد (Zhao, 2006). مایع یونی [C4MIM][Cl] در غلظتهای کمتر از 20 درصد اثر کمی بر آنزیم پراکسیداز ترب سیاه (HRP) گذاشت در حالیکه در غلظتهای 25 و 30 درصد کاهش شدید فعالیت و پایداری دمایی آنزیم را نشان داد (Machado and Saraiva, 2005).
آنیون نیترات یک آنیون بی ضرر و بی اثر است با این وجود مایعات یونی حاوی این آنیون زیاد مورد مطالعه قرار نگرفتهاند. از معدود مطالعات انجام شده در این زمینه میتوان پژوهشی روی آنزیم پاپائین را نام برد که در حضور 15 درصد [C4MIM][NO3] 50 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. در گزارشی توسط کفتزیک و همکاران دو آنزیم CbFDH و β-گالاکتوزیداز مربوط به باسیلوس سیرکولانس در حضور 25 درصد [PrNH3][NO3] کاملا غیرفعال شدند (Kaftzik et al., 2002). دلیل این غیرفعال شدن را اسیدی شدن pH احتمال دادند.
مایعات یونی حاوی یون [BF4] بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. این آنیون به شدت کائوتروپ است و نسبت به آنیونهایی که قبل از این گفته شد قدرت کمتری در تشکیل پیوند هیدروژنی دارد. اثر [C4MIM][BF4] بر فعالیت HRP توسط ماکادو و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. در غلظتهای کمتر از 20 درصد [C4MIM][BF4] کمترین کاهش فعالیت دیده شد و در غلظت 25 درصد آن 30 درصد کاهش فعالیت دیده شد. ماکادو و همکاران همچنین تغییرات پایداری دمایی HRP را در [C4MIM][BF4] بررسی کردند. در غلظت 10 درصدی مایع یونی، آنزیم HRP با تأخیر بیشتری نسبت به محیط آبی در اثر دمادهی غیرفعال شد. در حالی که در غلظت 25 درصد مایع یونی، پایداری آنزیم به شدت کاهش یافت (Machado and Saraiva, 2005).
اولین بیوترانسفورماسیون موفق در یک محیط مایع یونی حاوی 5 درصد آب مربوط به یک مایع یون آبگریز بود. ترمولایزین، یک آنزیم بسیار پایدار، واکنش سنتز Z- آسپارتام را در محیط [C4MIM][BF4] اشباع از بافر کاتالیز کرد؛ سرعت واکنش در این حالت نسبت به سرعت واکنش در محیط اتیل استات 40 درصد بود (Erbeldinger et al., 2000).
لیپازها به عنوان آنزیمهای مقاوم به حلالهای آلی مسلما اولین گزینه انتخابی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی بودند. در حقیقت لیپازهای میکروبی پایدار مانند CALB (Madeira Lau et al., 2000 , Schofer et al., 2001) و لیپاز سودوموناس کاپاسیا (PCL) (Park and Kazlauskas. 2001, Nara et al., 2002) در مایعات یونی از خانواده 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم، در ترکیب با آنیونهای BF4- ، PF6-، TfO- و NTf2- دارای فعالیت کاتالیتیک هستند. نتایج اولیه در این قبیل کارها معمولا تکرارپذیر نبود و این به دلیل حضور ناخالصی باقی مانده طی فرآیند تهیه مایعات یونی بود. لیپازها واکنشهای ترانساستریفیکاسیون را در این مایعات یونی با بازده قابل مقایسه با واکنشهای انجام شده در ترت- بوتیل الکل (Madeira Lau et al., 2000)، دیاکسان (Nara et al., 2002)، یا تولوئن (Park and Kazlauskas 2001) را کاتالیز کردند.
لیپاز A کاندیدا آنتراکتیکا (CALA) به عنوان یک استثناء در محیط مایعات یونی [C4MPy][BF4] و [C4MIM][NTf2] 10 برابر فعالتر از محیط دیایزوپروپیلاتر (DIPE) (Schofer et al., 2001) بود. مایعات یونی خارج از خانوادههای 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم به ندرت در فرآیند بیوکاتالیز مورد استفاده قرار گرفتهاند.
لیپازهای مختلفی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی مورد بررسی قرار گرفته اند که از این میان میتوان آنزیمهای لیپاز CALB (Lozano et al., 2003)،PCL (Itoh et al., 2003)، ASL (Schofer et al., 2001)، CALA، RML و TLL (Schofer et al., 2001) را نام برد. برای مثال دو آنزیم RML و TLL فعالیت خود را در مایع یونی [C4MIM][NTf2] حفظ کردند در حالی که در دو مایع یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] غیرفعال شدند (Schofer et al., 2001).
لیپاز CRL به طور معمول در محیطهای بدون آب فعالیت کمی دارد. بر اساس مطالعات انجام شده در رابطه با کاتالیز واکنشهای مختلف، این آنزیم در مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] فعالیت خود را حفظ میکند (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003). CRL در [C4MIM][PF6] بهترین فعالیت خود را در حضور حداکثر 4/0 مولار آب (یا 5/0=aw براساس سایر گزارشات (Ulbert et al., 2004) نشان میدهد. همچنین گزارش شده است که CRL واکنش استریفیکاسیون را در محیط بدون آب [C4MIM][PF6] بهتر از محیط ایزواکتان کاتالیز میکند (Yu et al., 2005).
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003)و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای [MeSO4] (Schofer et al., 2001)، [NO3] (Kaar et al., 2003)، [AcO] یا [lactate] (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است. آب نیز چنین عملکردی دارد اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند، و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کوئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی
در گزارشی از لیو و همکاران فعالیت و ساختار آنزیم لیپاز CRL انکوبه شده در 17 نوع مایع یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که انتخاب نوع آنیون اثر مهمتری بر فعالیت آنزیم در واکنش استریفیکاسیون داشته است و مایعات یونی محلول در آب اثر منفی بر فعالیت آنزیمی داشتهاند. مطالعات ساختاری این گروه با روش FTIR تا حدودی تغییرات ساختاری مرتبط با تغییرات فعالیت آنزیم را نشان داد. هرچند افزایش فعالیت دیده شده در برخی موارد را نمیتوان با دادههای تجربی حاصل از بررسی ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسی ساختاری آنزیم لاکاز در مخلوط آبی مایعات یونی [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهای CD و فلورسانس اثر مثبت مایع یونی [C4MA][TfO] بر پایداری ساختاری آنزیم نسبت به دو نوع دیگر نشان داده شد. در این مطالعه نتایج مطالعات ساختاری با نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاری دیگری به کمک فلورسانس و FTIR اثر مایعات یونی ایمیدازولیومی محلول در آب بر ساختار دو آنزیم α- آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس و آمیلولیکوئی فاسینس مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی نشان داد که آنزیم α- آمیلاز در محیط بافری و محلول آبی مایع یونی [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره میشود. در حالیکه محلول آبی مایع یونی [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهای مانع از دناتوره شدن آنزیم میشود (Dabirmanesh et al., 2011).
اهداف
بررسی اثر مایعات یونی مختلف روی پایداری و فعالیت آنزیمهای لیپاز تا حدودی انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهای مختلف زنجیره کاتیونی مایعات یونی روی آنزیم و بررسی چگونگی تغییر ساختار آنزیم و اثر آن بر فعالیت آنزیمی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنین با توجه به اثرات متفاوت مایعات یونی بر روی آنزیمهای مختلف، در این پژوهش اثر مایعات یونی روی آنزیم لیپاز TTL، یک آنزیم گرمادوست با پتانسیل کاربردهای صنعتی، مورد بررسی قرار میگیرد. بنابراین اهداف این پژوهش عبارتند از:
بررسی اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
بررسی اثر مایعات یونی با کاتیون و آنیونهای مختلف بر پایداری دمایی آنزیم TTL
مطالعه پایداری دمایی بر اساس تغییر در ساختار سوم آنزیم TTL در حضور و عدم حضور مایعات یونی
فرضیه
با استفاده از مایع یونی مناسب به عنوان محیط واکنش میتوان به پایداری بیشتر و فعالیت بهتری از آنزیم دست یافت.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- ابزار
انواع ظروف و لوازم آزمایشگاهی (ارلن، بشر، پلیت، بورت، کندانسور و غیره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کیسه دیالیز
استیرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پدیده نوژن پارس)
بن ماری (ریحان طب)
آون خلاء
سیستم تغلیظ پروتئین و فیلتر مربوطه (Amicon)
هود لامینار (ژال تجهیز)
انکوباتور (ریحان طب)
شیکر انکوباتور (Vision)
سانتریفوژ (Sigma 16-P)
سانیکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ریحان طب)
پمپ پریستالتیک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)
3-2- مواد
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی
آلکیل هالید ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متیل ایمیدازولیوم (Merck)
آمونیوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دی اتیل اتر (Panreac)
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL
3-2-2-1- سوش باکتری
باکتریxL1blue E.coli (جهت تکثیر پلازمید حاوی ژن لیپاز)
باکتری E.coli BL21 (جهت بیان پروتئین)
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون
پلازمید حاوی ژن لیپاز درون سلولی TTL (pQE-TTL)
KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استریل
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی
تریپتون، عصاره مخمر، نمک سدیم کلرید (Merck) (جهت تهیه محیط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتی بیوتیک آمپی سیلین
ایزوپروپیل β-D- تیوگالاکتوزید (IPTG) (سیناژن)
آنزیم لیزوزیم (CinnaGen)
بافر تریس (Merck)
سدیم فسفات (Merck)
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز
رزین Q- Sepharose
رزین Gel filtration
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE
رنگ کوماسی بلو G-250 و R-250
فسفریک اسید و استیک اسید گلاسیال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکریل آمید و بیس آکریل آمید (Merck)
TEMED(N,N,N,N'-tetramethylenediamine)
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) (Merck)
آمونیوم پرسولفات (APS)
2- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومین سرم گاو (BSA)
بافر تریس و گلایسین (Merck)
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز
سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (Sigma)
استونیتریل (Merck)
بافر تریس (Merck)
3-2-4- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طیف های فلورسانس)
3-3- روشها
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید
در این پژوهش جهت تهیه مایعات یونی از میزان مول برابر از آلکیل هالید و متیل ایمیدازولیوم استفاده شد. در این روش متیل ایمیدازولیوم قطره قطره در فواصل زمانی مساوی به آلکیل هالید که در حال بهم خوردن شدید بود اضافه شد و محلول نهایی در حال بهم خوردن شدید به مدت 24 ساعت در دمای °C 50 رفلاکس شد (شکل3-1). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دی اتیل اتر شستشو داده شد تا مواد آلی واکنشگر باقیمانده حذف شود. مرحله شستشو 10 تا 15 بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دی اتیل اتر به مایع یونی و بهم زدن شدید آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مایع یونی و دی اتیل اتر از هم جدا شوند. سپس مایع یونی شسته شده به مدت 24 ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دی اتیل اتر آن کاملا تبخیر شود.

شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات
در این مرحله میزان مول مساوی از نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات در مقداری آب حل شد و سپس محلول نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبی مایع یونی دارای آنیون برومید در حال بهم خوردن شدید اضافه گردید. سپس به مدت 24 ساعت در دمای اتاق محلول روی استیرر بهم خورد تا واکنش جایگزینی آنیون به خوبی انجام شود. در مرحله بعد شستشوی مایع یونی جدید با آب جهت جداسازی آنیون برومید انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نیترات نقره نبود یون برمید را در مایع یونی PF6- دار تایید کرد. سپس مایع یونی PF6- دار بدست آمده به مدت 24 ساعت برای حذف آب موجود در محیط در آون خلاء در دمای °C 70 قرار داده شد. مایع یونی ساخته شده در ظرف درب دار نگهداری شد.
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli
در این پژوهش از محیط کشت Luria Bertani (LB) برای رشد سویههای اشرشیاکلی به صورت مایع و جامد (حاوی آگار) استفاده گردید. همچنین در محیط کشت سوشهای حامل ساختار پلاسمید از آنتیبیوتیک آمپیسیلین با غلظت نهایی µg/ml 100 استفاده شد. جدول 3-1 نشان دهنده ترکیبات محیط کشت Luria Bertani است. شایان ذکر است که آنتی بیوتیک پس از استریل شدن محیط کشت توسط اتوکلاو و رسیدن دمای محیط کشت به حدود C° 50 اضافه میگردد.
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani
ترکیب غلظت
عصاره مخمر 5/0 درصد
تریپتون 1 درصد
NaCl 1 درصد
آگار (محیط کشت جامد) 2 درصد
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی:به منظور تهیه سلولهای مستعد برای عمل ترانسفورماسیون (انتقال پلاسمید به داخل سلول)، ابتدا یک کشت خطی از سلولهای ذخیره شده مورد نظر در ازت مایع بر روی پلیت LB تهیه و یک شب در گرمخانه Cº 37 قرار داده میشود. سپس یک کلنی از روی پلیت برداشته و در شرایط استریل به 25 میلی لیتر محیط کشت مایع LB افزوده و به مدت 4 الی 6 ساعت در دمای cº37 با حرکت دورانی rpm180رشد داده میشود تا تراکم سلولها در محیط کشت به جذبی ما بین 4/0 تا 6/0 در طول موج 600 نانومتر برسد. سلولها را در دمای ºC 4 به مدت 10 دقیقه در g4000 سانتریفوژ کرده و آنها را در5/2 میلیلیتر محیط خاص مناسب برای تهیه ی این نوع سلولها به نام محیط TSB که طبق جدول3-2 تهیه گردید، به صورت معلق در میآوریم. لازم به ذکر است که در این حالت غلظت سلولی به میزان 10 برابر افزایش داده میشود. سپس سلولهای معلق شده را به مدت 10 الی 60 دقیقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروی یخ قرار میدهیم. محصول سلولی حاصل را در مقادیر 200-100 میکرولیتری در لولههای اپندروف استریل تقسیم کرده و بلافاصله در ازت مایع قرار میدهیم. این سلولها را میتوان در فریزر cº80- نگهداری کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الی دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها یک بار میتوان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد :بین 1 تا 10 میکرولیتر بسته به غلظت محلولDNA موجود (معادل 1-1/0 میکروگرم) پلاسمید، در شرایط استریل در یک لوله اپندروف ریخته وبه آن پنج میکرولیتر از بافر KCM 5X که طبق جدول3-3 تهیه گردید، افزوده و با آب مقطر استریل به حجم lµ25 میرسانیم. مخلوط در یخ نگهداری میشود. حال سلول مستعد را از فریزر ºC80- خارج و اجازه میدهیم تا ذوب شود . 25 میکرولیتر از سلول مستعد را به محلول حاوی پلاسمید افزوده و به مدت 15 الی 20 دقیقه در دمای ºC4 قرار میدهیم. سپس در دمای ºC 42 به مدت 105 ثانیه گرمادهی شده که در این مرحله، ملکولهای DNA بر روی سطح سلول ها رونشینی شده و به درون سلول منتقل خواهند شد . بلافاصله سلولها را به درون یخ منتقل کرده و به آنها 100 میکرولیتر محیط LB سرد استریل و بدون آنتیبیوتیک،اضافه و به مدت یک ساعت در دمای Cº37 و حرکت دورانی مناسب قرار میدهیم. در نهایت 150 میکرولیتر محیط حاصل را بر روی پلیت حاوی محیط کشت انتخابی برده و با استفاده از لوپ شیشهای استریل به آرامی بر روی تمامی سطح پلیت بطور کامل و یکنواخت پخش میگردد . پس از جذب سلولها بر روی سطح پلیت، پلیتها به صورت وارونه در گرمخانه cº37 به مدت 16 ساعت قرار داده میشوند.
لازم به ذکر است که این پلیتها، حاوی آنتیبیوتیک خاصی است که ژن مقاومت مربوطه بر روی پلاسمید مورد نظر وجود دارد و در نتیجه تنها سلولهایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند قادر به رشد بر روی محیط انتخابی هستند.
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSBترکیبات مورد نیاز مقدار
Luria Bertani 75 (ml) 2X
DMSO 5/7 (ml)
PEG 400 3/13 (ml)
MgSo4 5/1 (ml)
MgCl2 5/1 (ml)
ddH2O 3/51 (ml)
Total valume 150 (ml)
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCMغلظت مناسب برای تهیه محلول 5X ترکیبات مورد استفاده
(M) 5/0 KCl
(M) 15/0 CaCl2
(M) 25/0 MgCl2
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری
برای تهیه استوک از باکتریهای حاوی ساختار پلاسمید، ابتدا از باکتری مورد نظر کشت یک شبه گذاشته شد. سلولها به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند و سوپ رویی دور ریخته شد. سپس به نسبت 1:1 گلیسرول استریل 50% به محیط کشت LB اضافه شد. آنگاه رسوب سلولها در 15 حجم اولیه محیط کشت، از این محلول حل شدند. در آخر آمپیسیلین با غلظت نهایی μg/ml 100 به سلولها اضافه شد و در C°20- ذخیره گردید.
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب
کلنی مورد نظر از بین باکتریهای ترانسفورم شده انتخاب شد و به محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک آمپیسیلین (μg/ml100) انتقال یافت. پس از رشد باکتری به مدت 16 ساعت در دمای °C 37، کشت 1 درصد تلقیح از نمونه باکتری رشد کرده، در حجم ml 20 محیط LB با آمپی سیلین ایجاد شد. پس از گذشت 4 ساعت از کشت اولیه باکتری ها در دمای °C 37، زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، با افزودن IPTG (با غلظت نهایی mM 1) به محیط های کشت بیان پروتئین نوترکیب القا شد و با کاهش دمای انکوباتور به °C 30 شرایط برای تولید آنزیم نوترکیب توسط باکتریها فراهم شد. پس از گذشت 5 ساعت از زمان القا، سلول های باکتری به کمک سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در 110 حجم اولیه، در بافر تریس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت 16 ساعت در °C 20- فریز شدند.
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
در این بخش بهینهسازی بیان پروتئین نوترکیب ابتدا با انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان TTL بر اساس میزان فعالیت آنزیمی عصاره سلولی و سپس بهینه سازی زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
ساختار پلاسمید حاوی ژن آنزیم TTL به روش گفته شده در بخش 3-3-2-2 به درون باکتری منتقل شد. سپس با لیز باکتریها پروتئینهای درون سلول جدا شدند (بخش 3-3-2-5) و سنجش فعالیت آنزیمی در مورد هرکدام از نمونهها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش 3-3-6). از بین 6 کلنی ترانسفورم شده بر اساس میزان توانایی تولید آنزیم 1 کلنی انتخاب شد و به صورت غلیظ شده در دمای°C 20- ذخیره گردید و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمانهای مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئینهای محلول درون سلول و میزان پروتئینهای موجود دراجسام نامحلول و پروتئینهای در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمانهای مختلف پس از القا، میتوان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپیسیلین، 1% تلقیح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتریها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، ابتدا ml1 از باکتریها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونهبرداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداری شد.
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتریها با استفاده از دستگاه سانیکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی 1 دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت 4 دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفوردمواد مورد نیاز مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250 1/0 گرم
اتانول 95% 50 میلیلیتر
فسفریک اسید 85% 100 میلیلیتر
در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیلآلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد میشود که شدت این رنگ در غلظتهای کم پروتئین نزدیک به قهوهای و در غلظتهای بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در 595 نانومتر خوانده میشود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازهگیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههای حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی 100 میکرولیتر، رقتهایی تهیه کرده و یک میلیلیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گردید. طی مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS(SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئینها و پپتیدها بکار میرود. قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلیاکریل آمید در غربال پروتئینهای مختلف است. در این روش پروتئینها بر اساس اندازه از هم جدا میشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرایط احیا، این ملکولها خطی شده و SDS به آنها بار منفی میدهد، که میزان بار منفی بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئینها به این صورت بر اساس اندازهشان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعتهای متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا میشوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفورزمحلول استوک اکریل آمید (8/30 %): 30 گرم اکریل آمید و 8/0 گرم بیس اکریل آمید در حدود 50 میلیلیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به 100 میلیلیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده): این بافر دارای غلظت 5/1 مولار تریس با 8/8~pH است. برای تهیه آن 2/18 گرم تریس- باز در حدود 70 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/8 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده): این بافر دارای غلظت 5/0 مولار تریس با 8/6~pH است. برای تهیه آن 1/6 گرم تریس باز در حدود 50 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/6 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تریس- باز، 2/7 گرم گلیسین و 5/0 گرم SDS در 500 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهیه گردید.
محلول رنگآمیزی: 05/0 گرم کوماسی آبی 250-R در 40 میلیلیتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 50 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول 05/0% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری میشود.
محلول رنگبر: 15 میلیلیتر متانول، 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 75 میلیلیتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگبری را تسریع میکند. با این حال باید توجه داشت که اگر ژل مدت طولانی در محلولهایی با درصد بالای متانول قرار گیرد، باندهای پروتئینی نیز بیرنگ میشوند).
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورزیک قالب شیشهای به کمک صفحات شیشهای کاملاً تمیز و فاصلهاندازها که با توجه به ضخامت مورد نیاز ژل انتخاب شده اند، ایجاد شد و با چند گیره محکم گردید. به انتهای صفحات شیشهای به اندازه 2/0 سانتیمتر آگار مذاب 5/0% اضافه شد.
محلول ژل پایین (ژل جدا کننده): مقادیر مورد نیاز برای تهیه ژل با درصد مشخص در جدول 3-6 آورده شده است. پس از افزودن مواد، محلول را به سرعت بهم زده و با دقت در قالب شیشهای تا ارتفاع مناسبی ریخته شد، به طوریکه حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل بالا باقی ماند. سپس به آرامی از کناره شیشه روی سطح ژل اتانول اضافه گردید (این کار به منظور صاف شدن ژل و جلوگیری از چین خوردن در اثر خشک شدن به دلیل تماس هوا با آن است). انعقاد ژل پایین معمولاً 45-15 دقیقه طول میکشد.
محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده) طبق جدول 3-6 تهیه شد ، بعد از انعقاد ژل پایین، اتانول روی ژل پایین کاملاً خالی شد و پس از تهیه محلول ژل بالا و هم زدن آن، سریعاً تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین ریخته شد. سپس شانه در ژل بالا قرار گرفت، به صورتی که حدود 5/1 سانتیمتر از سطح ژل پایین فاصله داشت. انعقاد ژل بالا حدود 45-60 دقیقه طول میکشد.
پس از خارج ساختن فاصلهانداز پایین از حد فاصل شیشهها، قالب شیشهای با چند گیره به تانک الکتروفورز متصل گردید و مخازن بالا و پایین تانک با بافر الکتروفورز پر شد (به وسیلهی یک سرنگ حبابهای هوا در حد فاصل شیشهها خارج شد)، سپس شانه به آرامی خارج و درون چاهکها با تزریق بافر الکتروفورز تمیز گردید.
برای آماده سازی نمونههای پروتئینی، یک حجم بافر نمونه به 3 حجم نمونهی پروتئین حاوی 6 تا 20 میکروگرم پروتئین اضافه شد (بافر نمونه 4x) و به مدت 5 دقیقه در دمای ˚C 100 قرار داده شد. سپس حجم مناسبی از آن (حداکثر 40 میکرولیتر) به کمک سمپلر وارد چاهک شد.
کابلها به الکترودهای مربوطه وصل گردید. برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان 30-20 میلیآمپر برای یک مینی ژل مناسب است. در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، ولتاژ 150-100 ولت مناسب میباشد. جریان برق قبل از رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع شد (حدود 5/2-5/1 ساعت).
بعد از قطع جریان، قالب شیشهای از تانک جدا گردید و با فرو بردن یک فاصلهانداز به حد فاصل شیشهها و حرکت آرام آن، شیشهی بالا برداشته شد و سپس ژل درون یک ظرف مناسب قرار گرفت.
حجم کافی از محلول رنگ (100 میلیلیتر) به ژل اضافه شد.
محلول رنگ تخلیه و سپس ژل را شسته و حجم مناسبی از محلول رنگبر (100 میلیلیتر) به آن اضافه گردید. اگر زمینهی ژل تیره بود تا شفاف شدن آن از محلول رنگبر تازه استفاده میشد تا باندهای پروتئینی به وضوح دیده شوند.
ژل در محلول آبی 7% اسید استیک قرار داده شد که ژل در این حالت برای مدتهای طولانی قابل نگهداری است.
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4Xماده مقدار
SDS (mg) 750
تریس- HCl (mg) 380
گلیسرول (ml) 5/2

user834

1-2 نشان‌گر چیست؟
صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان‌گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان‌گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود‌فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان‌گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد‌:
1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)
2-به توارث برسد (2).
1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکینشان‌گرهای ژنتیکی عبارتند از:
1-نشان‌گرهای مورفولوژیک
2-نشان‌گرهای پروتئینی
3-نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA
1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک
کاربرد نشان‌گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان‌گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان‌گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل‌کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان‌گرها به شمار می‌آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).
معایب نشان‌گرهای مورفولوژیک
اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.
تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.
فراوانی و تنوع کمی دارند.
گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.
اساس ژنتیک بسیاری از نشان‌گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است‌(2).
1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی
در دهه‌ی 1950، نشان‌گرهای پروتئینی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین‏ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. برخی از تفاوت‏های موجود در ردیفDNA بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‏هایی با اندازه‏های مختلف تجلی کنند، که به روش‏های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می‏گردند. این قبیل نشان‌گرها را نشان‌گرهای مولکولی در سطح پروتئین می‏نامند که از آن جمله می‏توان به سیستم آیزوزایم/آلوزایم اشاره کرد. معمول‏ترین نوع نشان‌گرهای پروتئینی آیزوزایم‏ها هستند که فرم‏های مختلف یک آنزیم را نشان می‏دهند. آیزوزایم‏ها به‏ طور گسترده در بررسی تنوع ژنتیکی به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهای هم‌بارز نشان می‏دهند. اما این دسته از نشان‌گرها هم دارای معایبی هستند. برخی از معایب آن‏ها عبارت‌اند از:
محدود بودن فراوانی این نوع نشان‌گرها؛
تعداد آیزوزایم‏های قابل ثبت و مشاهده که می‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به یکصد عدد نمی‏رسد؛
محدود بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایم‏ها‌(نداشتن چند شکلی)؛
پیچیدگی فنوتیپ‏های الکتروفورزی آیزوزایم‏ها به دلیل دخیل بودن آنزیم‏های مرکب از چند پلی‌پپتید مستقل در ترکیب برخی از آیزوزایم‏ها‌(3).
اما پیشرفت‏هایی که در زمینه‏ی الکتروفورز دو‏بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده، تجزیه تحلیل هم‌زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوری پیشتاز در عرصه نشان‌گر‏های مولکولی مطرح شده‏اند. تاثیرپذیری نشان‌گرها از محیط که به‌طور معمول به‌عنوان یکی از محدودیت‏ها و نکات منفی نشان‌گرهای مولکولی یاد می‏شود، در مورد این نشان‌گر‏ها تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئومیکس‌(مطالعه سراسری کل پروتئین‏های موجود در یک سلول یا یک ارگانیسم) می‏تواند به‌طور هم‌زمان برای مطالعه بیان ژن و هم‌چنین برای شناسایی پروتئین‏های واکنش دهنده به شرایط محیطی مورد استفاده قرار گیرد(3).
1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA وRNA
دسته‌ای دیگر از تفاوت‏های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند. نه صفت خاصی را کنترل می‏کنند و نه در ردیف اسید‏های آمینه پروتئین‏ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‏ها را می‏توان با روش‏های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار داد. این نشان‌گر‏ها که تعدادشان تقریبا نا‏محدود است، فقط از راه تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند. بنابراین به آنها نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‏شود. نشان‌گرهای مولکولی فراوان و در هر موجود زنده‌ای می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. تاکنون تعداد زیادی از نشان‌گرهای DNA معرفی شده‌اند. این نشان‌گرها از نظر بسیاری از ویژگی‏ها مانند درجه‏ی چندشکلی، غالب یا هم‌بارز بودن، تعداد جایگاه‏های تجزیه شده در هر آزمایش DNA، توزیع در سطح کروموزوم، تکرار‌پذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‏یابی DNA الگو و هزینه‏ی مورد نیاز با همدیگر متفاوت‌اند. انتخاب بهترین نشان‌گر به هدف مطالعه (انگشت نگاری، تهیه نقشه پیوستگی، ژنتیک جمعیت و روابط تکاملی) و سطح پلوئیدی موجود مورد مطالعه بستگی دارد‌(4).
مزایای کاربرد نشان‌گرهای مولکولی
عدم تاثیرپذیری آنها از شرایط محیطی خارجی و داخلی موجود؛
امکان به‌کارگیری آنها در مراحل نخستین رشد جنینی حیوانات و مراحل نخستین رشد موجودات؛
فراهم نمودن امکان مطالعه موجودات در خارج از فصل و محیط کشت؛
دقت و قابلیت مطلوب تفسیر نتایج؛
هم‌بارز بودن بسیاری از این نشان‌گرها؛
امکان استفاده از آنها در مورد گونه‏های منقرض شده؛
سهولت تشخیص افراد ناخالص از خالص؛
سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل نتایج؛
دسترسی به برنامه‏های رایانه‏ای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر سریع نتایج‌(4)
انواع نشان‌گرهای مولکولی
نشان‌گرهای DNA گروه بزرگی از نشان‌گرها را تشکیل می‏دهند. این نشان‌گرها سیر تحول و تکامل خود را به پایان نرسانده‏اند و ابداع و معرفی روش‏های متنوع و جدیدتر ثبت و مشاهده‏ی تفاوت‏های ژنتیک بین موجودات از طریق مطالعه‏ی مستقیم تفاوت‏های موجود در بین ردیف‏های DNA هم‌چنان ادامه دارد. نشان‌گر‏های DNA در مدت یک دهه تکاملی شگرف و تحسین‌برانگیز داشته‏اند‌(5).
ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR یک روش سریع تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعه‌های مورد نظر DNA است. در واقع PCR روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون در کم‌تر از نیم‌روز امکان‌پذیر می‏سازد. اما این فرایند هنگامی امکان‌پذیر است که دست‌کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانندسازی DNAدر طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه‏ی مورد‌نظرDNA هستند، به‌عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‏گیرند تا واکنش آنزیمی همانندسازی DNA درون لوله‌ی آزمایش امکان‌پذیر شود. این همانند‏سازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‏های پلی‌مراز صورت می‏گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‏ها به صورت تجاری دردسترس هستند‌(6).
واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز (PCR) در سال 1983 توسط کری‌مولیس در حالیکه در یک نیمه شب تابستانی در حال رانندگی بود، ابداع گردید و سبب انقلاب عظیمی در زیست شناسی مولکولی شد(6).
همان‌گونه که در شکل 1-1 نشان داده شده است، نشان‌گرهای DNAبه دو دسته‏ی کلی طبقه‌بندی می‏شوند.
نشان‌گرهای DNAمبتنی بر PCR
نشان‌گرهای DNA غیر مبتنی PCR(6).

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی‌(10)
1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCRاین دسته از نشان‌گرهای DNA بدون استفاده از روشPCR تولید می‌شوند و مورد استفاده قرار می‌گیرند.
انواع نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر(RFLP)
پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)
ماهوارک‏ها
1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLPسرگروه نشان‌گرهای غیر‌مبتنی برPCR ، همان تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر یا RFLP است. از بین نشان‌گرهای مولکولی DNA، RFLP ها اولین نشان‌گرهایی بودند که برای نقشه‌یابی ژنوم انسان توسط بوتستین و همکاران در سال 1980 و پس از آن برای نقشه‌یابی ژنوم گیاهان توسط بر و همکاران در سال 1983 مورد استفاده قرار گرفتند. در اوایل دهه 1980 بوتستین و همکاران استفاده از تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم یا RFLP را برای مطالعه‏ی مستقیم DNA و یافتن نشان‌گر‏های ژنتیک جدید معرفی کردند. این تحول از پیامد‏های منطقی کشف آنزیم‏های محدودگر بود. این آنزیم‏ها که بسیار اختصاصی‏ هستند، ردیف‏های ویژه‏ای را روی مولکولDNA شناسایی کرده و آنها را از محل خاصی (نقطه‏ی برش) برش می‏دهند‌(7).
RFLP الزاما مختص ژن‏های خاص نیست، بلکه در کل ژنوم پراکنده است. ازاین رو، از نشان‌گرهای RFLP برای نقشه‌یابی تمام ژن‌ها در ژنوم انسان استفاده می‏شد(5). علاوه برRFLP که هنوز هم از قدرتمندترین و معتبرترین نشان‌گرهایDNA است، انواع مختلف نشان‌گرهایDNA با تفاوت‌های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه‌ی کاربرد، امتیاز‌بندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع ومعرفی شده‌اند‌(7).
مهم‌ترین مزایای RFLP
تکرارپذریری، دقت و قابلیت اعتماد این نشان‌گر فوق‌العاده زیاد است؛
این نشان‌گر هم‌بارز است و امکان تشخیص افراد خالص را از افراد ناخالص فراهم می‏آورد؛
فراوانی این نشان‌گر در حد بالایی است؛
RFLP تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد در صد ژنتیکی است(8).
برخی معایب RFLP
دشواری، پیچیدگی و وقت‌گیر بودن؛
RFLP ژنوم‌های بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روش‌های پیچیده‏تر و گران‏تر بیوشیمیایی است؛
RFLP نیازمند نگه‌داری میکروارگانیسم‌ها به‌منظور تهیه‏ی کاوشگر است که خود بر پیچیدگی این روش می‏افزاید؛
هزینه‏ی اولیه و نگه‏داری کاوشگر‏ها و کاربرد آنها بسیار زیاد است؛
نیازمندی به مقدار نسبتا زیاد DNA از محدودیت‏های دیگر روش RFLPاست به‌طوری که ده‏ها میکروگرم از DNAبرای هر فرد به منظور تجزیه‏ی ژنوم مورد نیاز است؛
از دیگر محدودیت‏های این نشان‌گر آن است که در گونه‏های بسیار نزدیک به یکدیگر این نوع نشان‌گر‏ها آلل‏های مشابهی را نشان می‏دهند(8).
1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)در سال1991، هاتادا و همکاران روشی را برای شناسایی و انگشت‌نگاری موجودات عالی ابداع و معرفی کردند. پیش از ابداع این روش که بر مبنای نشان‌دار کردن هم‌زمان انتهای هضم شده‏ی هزاران قطعه‌ی DNA است، ردیابی و ثبت موجودات عالی با روش نشان‌دار کردن انتهای هضم شده غیر ممکن می‌نمود. دو دلیل اصلی برای این تصور ذکر شده است:
ژنوم موجودات عالی بسیار بزرگ و پیچیده است برای مثال ژنوم انسان 109×3 جفت باز دارد و در نتیجه‏ی هضم آن با آنزیمی مانند EcoRI بیش از یک میلیون قطعه‌ی DNA به وجود می‌آید. تفکیک این تعداد مولکولDNA حتی با الکتروفورز دو بعدی نیز غیر ممکن است.
معمولا DNA ژنومی در هنگام استخراج به صورت تصادفی و غیر‌اختصاصی شکسته می‌شود و ایجاد مولکول‏هایی با انتهای تصادفی می‏کند. این امر سبب ایجاد پس‌زمینه‌ی ناشی از نشان‌دار شدن این انتهاها طی فرایند نشان‌دارکردن می‏شود‌(9).
برای رفع این دو نقص تدابیری پیش‏بینی شد و روش RLGS ابداع گردید. این روش جدید که برای تجزیه و تحلیلDNA ژنومی به‌کار می‌رود، بر مبنای این فرضیه است که نقاط برش اختصاصی آنزیم‏های محدودگر می‌توانند به‌عنوان نشانه و وجهه تمایز ارقام و افراد به کار گرفته‌شوند.
در این روش انتهای آزاد مولکول‌های DNA که در اثر صدمات مکانیکی در طی استخراج به وجود آمده‏اند، مسدود می‏شود. سپس برای کاهش پیچیدگی، DNA ژنومی توسط آنزیم‏های محدودگر، با محل برش نادر، هضم و نقاط برش به‌طور مستقیم با فسفر پرتوزا نشان‌دار می‏شوند. آنزیم‏های با محل برش نادر معمولا هزاران قطعه DNA به وجود می‏آورند. سپس با الکتروفورز دو‌بعدی، قطعه‏های هضم‌شده‏یDNA از هم جدا شده و خودپرتونگاری صورت می‏گیرد. این روش یک الگوی دو بعدی با هزاران نقطه‏ی پراکنده (قطعه‏های نشان‌دارDNA) ایجاد می‏کند که هر یک می‏توانند به عنوان یک نشان‌گر به کار گرفته شوند(10)
برخی از مزایای روشRLGS
در هر آزمایش هزاران نشان‌گر به‌دست می‌آید؛
مقدار کمی DNAمورد نیاز است؛
در صورت استفاده از آنزیم‌های محدودگر متفاوت، تفاوت‏های بیشتری ظاهر و ثبت خواهند شد[10].
برخی از معایب روش RLGS
DNA مورد نیاز برای این روش باید از کیفیت مطلوبی برخوردار باشد؛
هضم ناقص DNA توسط آنزیم‏های محدودگر نتایج تکرار ناپذیر و گمراه کننده‏ای خواهد داشت؛
این روش پیچیدگی فوق العاده‏ای داشته و تفسیر نتایج حاصل از آن دشوار است(10).
1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها
ماهوارک‏ها نخستین بار در سال 1985 توسط جفری و همکاران گزارش شدند. پس از آن در سال 1988 تکثیر جایگاه‏های ژنی خاص نواحی تکرارشونده، روی ماهوارک‏ها در ژنوم انسان انجام شد.
این دسته از نشان‌گرها از نظر تکنیکی مبتنی بر استفاده از کاوشگرهای مصنوعی و کاربرد مواد پرتوزا و روش ساترن هستند.
ماهوارک‌ها واحدهایی 10 تا 100 جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. آنها معمولا یک هسته مشترک 10 تا 15 جفت بازی دارند که احتمالا در تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها موثرند. ماهوارک‌ها بیش‌تر در نواحی یوکروماتین ژنوم پستانداران، قارچ‌ها و گیاهان متمرکز‌ند. تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها در حدی است که گاهی در انگشت‌نگاریDNA انسان مورد استفاده قرار می‏گیرند. از جمله‌ی ماهوارک‌ها می‏توان به تکرارهای پشت سر هم با فراوانی بالا (VNTR) اشاره کرد[11]. VNTR ها به دو دسته‌ی کلی تقسیم می‌شوند: VNTR تک مکانی و VNTR چند مکانی.
دسته‏ی نخست، تعداد متفاوت ردیف‌های تکراری در یک جایگاه ژنی و دسته‏ی دوم تعداد متفاوت ردیف‌های تکرار‌شونده در چندین جایگاه ژنی را نشان می‌دهند. الگوی بانددهی به‌دست آمده با استفاده از کاوشگر‌های VNTR تک مکانی ساده‏تر و قابل فهم‌تر است، زیرا هر فرد تعداد کمی باند واضح را نشان می‏دهد. در حالی‌که تعداد باندهای به دست آمده از کاوشگرهای مخصوص VNTRچند‌مکانی بیش‌تر است، به‌طوری که به‌طور هم‌زمان تا بیش از 30 باند به دست می‏آید(12).
در نخستین نشان‌گرهای مبتنی بر ماهوارک‌ها، از الیگونوکلئوتید‏های حاوی ریزماهواره به عنوان کاوشگر استفاده گردید و توسط علی و همکاران انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی نام‌گذاری شد.
از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی نشان‏دار‌شده مکمل با موتیف‌های کوتاه تکرار‌شونده در هیبریداسیون در ژل، با به کارگیری DNAژنومی برش داده شده با آنزیم‌های برشی خاص و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شده است. گوبتا و وارشنی در سال2000 طی تحقیقات خود مراحل زیر را برای انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی مطرح کردند:
جداسازیDNA ژنومی با وزن مولکولی زیاد
هضم DNAژنومی با یک آنزیم محدودگر مناسب
تفکیک قطعه‌های حاصل از هضم روی ژل آگارز
انتقال ساترن قطعه ها به غشا
دو ‏رگ‏گیری غشا با کاوشگر‏های(نشاندار با مواد پرتوزا یا غیر پرتوزا) الیگونوکلئوتیدی دربردارنده‏ی ردیف‌های دو یا سه تایی تکراری
خودپرتونگاری یا رنگ آمیزی برای مشاهده‏ی قطعه‌های دو رگ‌شده.
به‌کمک این روش می‌توان تنوع نواحی تکرار‌شونده‏ی مورد نظر را آشکار کرد. قطعه‌هایی از DNA که با الیگونوکلئوتیدها دو ‌رگ می‌شوند، در دامنه‌ای از اندازه‏ی چند صد جفت تا ده کیلو جفت باز قرار می‏گیرند. هم‌چنین گاهی بیش از یک نوع ماهواره در داخل یک قطعه‏ی برش داده شده قرار می‌گیرد. تفاوت‏هایی که این نوع نشان‌گرها نشان می‏دهند، به دلیل تفاوت در طول قطعه‌های برش داده‌شده‌ای است که در بردارنده‏ی ماهوارک‌ها هستند. از این روش برای شناسایی ژنوتیپ‌ها و همچنین در ژنتیک جمعیت استفاده می‌شود(12).
پس از مدتی، لیت و لوتی و سه گروه دیگر همین روش را برای ریزماهواره‏ها(عمدتا از نوع (CA)n) به‌کار بردند و دریافتند که ریز ماهواره‏ها به دو دلیل به مراتب آسانتر از ماهوارک‌ها با روش PCR تکثیر می‏شوند:
1-ریزماهواره‏ها کوچکتر از ماهوارک‏ها هستند؛
2-ردیف‌های تکرار‌شونده ریز ماهواره‏ای فراوانتر و توزیع آنها در کل ژنوم یکنواخت‌تر ازماهوارک‏هاست(13).
1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCRنشان‌گرهای مبتنی بر PCR نشان‌گرهایی هستند که از توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر برای تکثیر قطعه‏ی خاصی از DNA استفاده می‌کنند. روش‏های مختلف در این گروه، در طول و توالی آغازگرها، سختی شرایط PCR و روش‏های جداسازی و آشکار کردن قطعات با همدیگر فرق دارند.
انواع نشان‌گرهای مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر(AFLP)
DNA چند شکل تکثیر‌شده‏ی تصادفی(RAPD)
تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)
نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف (STS)
1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP)
در سال 1995 نشان‌گرهای جدیدی ابداع و معرفی شدند که به نظر می‌رسد بسیاری از محدودیت‌های نشان‌گر‌های پیشین را نداشته باشند. در این روش که AFLP نامیده می‏شود نشان‌گرهایی تولید می‏شوند که علاوه بر دارا بودن مزایایRFLP مانند دقت و تکرار‌پذیری ویژگی‌های مثبت روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز را نیز دارند. پایه‌ی این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‌ها از بین تمام قطعه‌های هضم شده‌ی DNA است و سه مرحله‌ی مجزا دارد:
هضمDNA با یه جفت آنزیم محدودگر و اتصال آنها به آداپتور‌های اولیگونوکلئوتیدی؛
طراحی، ساخت آغازگر و تکثیر انتخابی دسته‌ای از قطعه‌های حاصل از هضم .با استفاده از ردیف بازی آداپتور‌ها و نیز ردیف بازی نقاط برش، طراحی و ساخت آغازگر انجام می‌شود، اما برای تکثیر انتخابی قطعه‌های حاصل از هضم دو، سه یا چند نوکلئوتید به انتهای’3 ردیف آغازگر اضافه می‌شود که موجب می‌گردد فقط قطعه‌هایی تکثیر‌شوند که ردیف بلافصل آنها در مجاورت نقطه‌ی برش ،مکمل نوکلئوتیدهای یاد شده باشد؛
جداسازی قطعه‌های حاصل از تکثیر روی ژل‌های توالی‌یابی(پلی‌اکریل‌آمید) و خودپرتونگاری یا رنگ‌آمیزی نقره برای ثبت نتیجه‌ها.
با استفاده از این روش تعداد زیادی از قطعه‌های حاصل از هضم، تکثیر و قابل رویت می‌شوند. این در حالی است که نیازی به دانش اولیه در مورد توالی‌بازی قطعه‌هایی که تکثیر می‌شوند، وجود ندارند. هر یک از این قطعه‌هایی که به صورت باند روی ژل ظاهر می‌شوند، می‌توانند به عنوان یک نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرند.
تعداد قطعه‌هایی که با این روش تکثیر می‌شوند، به دقت و توانمندی روش‌های جداسازی (الکتروفورز)، ثبت نتایج و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولا در این روش بین پنجاه تا صد قطعه‌ی حاصل از هضم تکثیر و با استفاده از ژل‌های پلی‌اکریل‌امید واسرشت ساز ثبت می‏شوند(19)
مزایای AFLP
این روش در مقایسه یا سایر روش‌ها بیشترین تعدا نشان‌گر‌ها به ازای هر ژل را ایجاد می‌کند؛
در این روش نیازی به تهیه و تدارک و نگه‌داری کاوشگر نیست .دقت و تکرار‌پذیری این نشان‌گر به دلیل انتخاب دمای زیاد هم رشته‌سازی و اتصال آغازگر به DNA الگو بیشتر از RAPD است(20).
معایب AFLP
پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش‌های میتنی برPCR ؛
عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشان‌گر‌ها؛
غالب بودن این نشان‌گر موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می‏گردد؛
تکثیر قطعه‌های غیر‌واقعی در AFLP موجب کاهش قابلیت اعتماد این روش می‏گردد(20).
1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی(RAPD)در این روش از تک آغازگرهایی به طول هشت تا ده نوکلئوتید که ردیف بازی آن به طور قراردادی تعیین می‌گردد، استفاده می‏شود. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روی دو رشته‏ی DNA ژنومی می‌یابد و در آن نقاط به رشته‌های DNAمتصل می‌شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته‏ی مقابل به هم نزدیک باشند(فاصله‏ای که DNA قابل تکثیر باشد)، ردیف بین آن دو نقطه طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. فراورده‌های واکنش PCRروی ژل آگارز از هم جدا می‏شوند. تولید هر باند بیانگر وجود شباهت زیاد بین ردیف بازی آغازگرها و ردیف بازی محل اتصال درDNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را درDNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل های RAPD بیانگر جهش نقطه‌ای در محل اتصال آغازگرها و یا حذف یا (اضافه) شدن در ناحیه قابل تکثیر است. بنابراین چند شکلی در RAPDمعمولا به شکل حضور و غیاب یک باند پدیدار می‏شود. بدین معنی که نشان‌گرهای RAPD از نوع غالب‌اند و افرادی که دو نسخه از یک آلل دارند، به طور کمی از افرادی که یک نسخه از آن آلل را دارند، قابل تشخیص نیستند. تفاوت طول قطعه‏ها در RAPD از طریق تکثیر قطعه‌های DNA مکمل با ردیف‌های آغازگرهای اختیاری (ردیف مشخص ولی تصادفی) به‌دست می‌آیند. قطعه‏های تکثیر شده به صورت نوارهایی با وزن مولکولی متفاوت به‌طور مستقیم روی ژل قابل مشاهده‌اند (15).
مزایای RAPD
عدم نیاز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غیره؛
امکان بررسی هم زمان چندین جایگاه در ژنوم؛
عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ریف DNA برای ساخت آغازگر(16).
معایب RAPD
عدم تکرار پذیری؛
حساسیت بسیار به آلودگی؛
در صورت تغییر شرایط محیطی ظهور باندهای جدید؛
نامعلوم بودن جایگاه نشان‌گر RAPD روی نقشه‌ی ژنتیکی(16).
1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)تنوع‌ها و تفاوت‌هایی که به واسطه‏ی اختلاف در یک جایگاه نوکلئوتیدی(به علت جایگزینی، حذف یا ازدیاد) اتفاق می‌افتند، با عنوان تفاوت تک نوکلئوتیدی نامیده می‏شوند. این نوع از تنوع به‌وفور در ژنوم انسان اتفاق می‏افتد به طوری که مطالعات انجام گرفته توسط کاتانو-آنولز و گرس هوف (1998) در ژنوم انسان و اسب نشان می‏دهد که در فاصله‏ی هر دویست و پنجاه تا چهارصد نوکلئوتید یک SNP وجود دارد(17).
با اینکه‌SNP ها به وفور در ژنوم انسان یافت می‌شوند، ولی ایجاد و توسعه‌ی نشان‌گرهای SNP چندان آسان نیست. تهیه نشان‌گر‏های SNP شامل مراحل زیر است:
تعیین ردیف DNA اطراف SNP؛
تکثیر قطعه‌ای منحصر به فرد از DNA به کمک PCR به منظور غربال SNP؛
شناسایی SNP که شامل مشاهده‌ی دو آلل در افراد مختلف می‌باشد؛
مکان‌یابی نشان‌گر SNP و تعیین جایکاه خاص کروموزومی آن؛
تعیین فراوانی دو آلل در جمعیت؛
بررسی SNP در افراد و ژنوتیپ‌های مختلف(17).
برخی از معایب نشاگرهای SNP
SNPها به دلیل داشتن فقط دو آلل در یک جایگاه ژنی نسبت به نشان‌گر‌های چند آللی، اطلاعات کمتری را در نقشه‌های پیوستگی نشان می‌دهند؛
شناسایی نشان‌گرSNP بسیار پر‌هزینه و هم‌چنین زمان‌بر است(17).
1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف(STS)هر نشان‌گری که مبتنی بر واکنش PCR باشد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (معمولا بیش از بیست نوکلئوتید) ایجاد شود، یک نقطه‌ی نشانمند از ردیف نامیده می‏شود، زیرا پیش از طراحی آغازگر، بی‏شک در یک مرحله ردیف‌یابی صورت گرفته است. نشان‌گرهایی همچون تفاوت طول قطعه‌های قابل تکثیر (ALP) و ریزماهواره‏ها از آن جهت که مستلزم ردیف‏یابی برای طراحی آغازگر به منظور تکثیر DNA در یک نقطه‌ی خاص هستند، ذیل STS دسته‌بندی می‌شوند:
-تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
-ریز ماهواره‌ها (18).
1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
ALP یکی از ساده‏ترین و سریع‏ترین نشان‌گرهای مبتنی بر PCR است. اگر ردیف باز‏های قطعه‏ای از DNA در یک موجود مشخص باشد (یا دست کم بخشی از دو انتهای آن قطعه معلوم باشد)، براساس آن می‏توان به طراحی و ساخت مصنوعی آغازگرهایی به طول بیست تا سی نوکلئوتید اقدام کرد. چنان‌چه نمونه‏های مختلف DNA توسط این آغازگرها و از طریق واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز تکثیر و سپس روی ژل الکتروفورز از هم جدا شوند، در صورت وجود اختلاف در طول قطعه‏ی قابل تکثیر، باندهایی به اندازه‏های مختلف تولید خواهند شد که بیانگر وقوع پدیده‏ی حذف یا اضافه در بین نمونه‏های مورد مطالعه است. این تفاوت در اندازه‏ی قطعه‏های قابل تکثیر که جهش‏های ژنتیک را نشان می‏دهد به عنوان نشان‌گرهای ژنتیک مورد استفاده قرار می‏گیرد(14).
مزایای ALP
از نظر کاربردی در بین نشان‌گرهای DNA،یکی از سریع ترین و ارزان‌ترین‌ها است؛
به‌کاربرد مواد پرتوزا یا بیوشیمیایی پیچیده نیاز ندارد؛
به‌تدارک، نگهداری و کاربرد کاوشگرها نیاز ندارد؛
بسیار اختصاصی عمل می‌کند، تکرار پذیری آن خوب است و تا حد بسیار زیادی می‌توان به نتایج آن اعتماد داشت؛
به‌مقدار خیلی کمی از DNA نیاز است؛
هم‌بارز بودن این نشان‌گر امکان تشخیص افراد خالص از هر یک از انواع افراد ناخالص را فراهم می‌آورد(14).
معایب ALP
طراحی و ساخت آغازگرها، به اطلاعات اولیه در مورد ردیف DNAژنوم مورد مطالعه نیاز دارد که با توجه به اینکه ژنوم بسیاری از موجودات به طور کامل در دسترس نیست این روش استفاده بسیار کمی دارد؛
هزینه‌ی اولیه مورد نیاز به منظور تولید تعداد کافی نشان‌گر ژنتیک با توزیع مناسب در سرتاسر ژنوم بسیار زیاد و مستلزم صرف وقت است(14).
1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌هاریزماهواره‏ها شامل واحدهای یک الی شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت‏ها پراکنده‏شده‏اند. به طوری که در هر ده کیلو جفت باز از ردیف DNA دست کم یک ردیف ریزماهواره‏ای دیده می‏شود. طول ریز‌ماهواره‏ها معمولا کمتر از 100 جفت باز بوده و توسط دو ردیف منحصر به فرد در دو طرف محدود شده‏اند. ریزماهواره‏ها به سه گروه عمده‌ی تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولا توسط بازهای غیرتکرارشونده قطع می‌شوند) و تکرارهای مرکب(دو یا تعداد بیشتری از واحدهای مجاور یکدیگر) تقسیم می‏شوند. تعداد تکرارها در هر واحد بسیار متفاوت است. حداقل تعداد واحد تکرار‌شونده برای ریز ماهواره‏های دو نوکلئوتیدی به ترتیب ده و هفت بار تکرار تعیین شده است(21).
مزایای ریزماهواره‏ها
کاربرد آنها و تفسیر نتایج نسبتا ساده است؛
سیستم چند آللی(تا 11 آلل) از ویژگی‌های بارز این نوع نشان‌گر است؛
ریزماهواره‌ها بسیار متنوعند؛
به وفور در ژنوم یوکاریوت‏ها یافت می‏شوند؛
بیشتر ریزماهواره‏ها غیر‏عملکردی هستند؛
همبارز هستند [22].
1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنومریزماهواره‌ها بسیار فراوان بوده و در کل ژنوم موجودات به صورت تصادفی پراکنده اند. فراوانی ریزماهواره ها در بین موجودات زنده متفاوت است. برای مثال تخمین زده شده است که ژنوم انسان به طور میانگین ده برابر بیشتر از گیاهان ریزماهواره دارد. علاوه برDNA کروموزومی تعداد زیادی ریزماهواره در DNA کلروپلاست ها نیز گزارش شده است. به کمک روش‏هایی از قبیل دورگه‏گیری در ژل، نقشه‏یابی ژنتیکی و فیزیکی و هم چنین دورگه‏گیری در محل فلورسنت، ثابت شده است که ریزماهواره ها به طور یکنواخت در ژنوم پراکنده‏اند. اگرچه در برخی موارد می توانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند(12).
1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراریچنین فرض می‏شود که جهش در تعداد واحدهای تکرار شونده در هر یک ازDNA های تکرار شونده با یکی از دو سازوکار کراسینگ آور نامساوی(uco) یا جفت نشدن ناشی از سرخوردن در طول رشته (خطای همانندسازی DNA ) صورت می‏گیرد. بیشتر عقیده بر این است که ریزماهواره‏ها و ماهواره‏ها توسط سازوکار کراسینگ آور نامساوی ایجاد می‏شوند، ولی در مورد ریزماهواره‏ها برخی افراد یکی از دو سازوکار و برخی دیگر هر دو سازوکار را موثر می‏دانند(23).
1-5-1 کراسینگ اور نابرابرگاهی کراسینگ اور نابرابر در داخل تکرارهای ریزماهواره‏ای بین کروموزوم های مشابه یا خواهری اتفاق می‏افتد و سبب تغییر در تعداد واحدهای تکرار شونده می‏شود.(شکل 1-2).کراسینگ اور نابرابر می‏تواند هم در میوز و هم میتوز اتفاق بیفتد. چنین توجیه می‏شود که وجود نواحی تکرارشونده احتمالا مانع از ردیف شدن کامل در همولوگ یا کروموزوم‏های خواهری می‏شود. به نظرمی‏رسد که این نوترکیبی مکانیزم اصلی ایجاد تنوع مینی‏ستلایتی است(23).

شکل 1-2 کراسینگ آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف شدگی یا الحاق می‌شود(23.)
1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردن DNA در طول رشته(خطاهای همانند سازی)گاهی DNA پلی‌مراز در طول همانند سازی در نواحی تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای سر می‏خورد و موجب تغییر در تعداد واحد تکرار شونده می‏شود. در حقیقت سر خوردن پلی‌مراز در طول نواحی تکراری موجب عدم جفت شدن کامل دو رشته‏ی DNA شده و در نهایت حلقه‌هایی در رشته‌ی الگو یا رشته‏ی جدید ایجاد می‏شود(شکل1-3). این امر مکانیسم اصلی به وجود آورنده‏ی چندشکلی در میکروستلایت‌هاست(23).

شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد(23).اگر نتیجه‏ی همانند سازی ایجاد واحد های تکرار شونده‏ی اضافی باشد، حلقه در رشته ی جدید و اگر نتیجه‌ی همانند سازی کاهش در تعداد واحد‏های تکرار شونده باشد، حلقه در رشته‏ی الگو تشکیل خواهد شد(23).
گلدستین و شلوترر فرضیه‏ی عدم جفت شدن ناشی از سر‏خوردن در طول رشته را نسبت به فرضیه کراسینگ آور نامساوی به دلایل زیر به واقعیت نزدیکتر دانسته‏اند:
الف)‌در انسان بسیاری از تغییرات ریز ماهواره‏ای موجب تغییر در نشان‌گر های مجاور ناحیه ی ریز ماهواره‏ای نمی‌شود. بنابراین در ایجاد چنین تغییراتی نوترکیبی بی‏تاثیر است. از آنجا که جهش در فرضیه کراسینگ اور نامساوی، وابسته به نوترکیبی است، تغییرات ریز ماهواره ای و عدم تغییر نقاط مجاور با این فرضیه قابل توجیه نیست.
ب)‌نقصان در ژن‏هایی که در نوترکیبی نقش اساسی دارند تاثیری در پایداری ریز ماهواره‏ها ندارد.
ج)‌مطالعات انجام گرفته در ساکارومایسزسرویزیه نشان می‏دهد که پایداری ریز ماهواره‏ها در سلول‏هایی که تقسیم میوز را انجام می‏دهند مشابه با یاخته ها در تقسیم میتوز است. با توجه به اینکه نوترکیبی در میوز بیشتر از میتوز است، پس اگر فرضیه‏ی کراسینگ اور نامساوی صادق باشد، باید ریز ماهواره‏ها در میوز ناپایدارتر از میتوز باشد(23).
1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشوندهدو مدل متفاوت برای توصیف دامنه‏ی تنوع تعداد واحدهای تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای وجود دارد:
1.مدل جهش گام به گام
2. مدل آللی نا محدود
1-6-1 مدل جهش گام به گاماگر فرض کنیم در ریزماهواره‏ها یک گام معادل تغییر در یک واحد تکرار شونده باشد، بنابر این مدل ریز ماهواره‏ها از نظر اندازه فقط در تعداد محدودی گام تفاوت دارند، به‌طوری که هر گام از گام بعدی به وسیله‏ی یک واحد تکرار شونده جدا می‏شود. در این مدل چنین فرض می‏شود که بسیاری از جهش‏های با فراوانی زیاد، فقط ریزماهواره‏ها را در یک گام یا دو گام‌(در یک زمان) تغییر می‏دهند. طرفداران این نظریه معتقدند که در بیشتر آزمایش‏ها، بیشترین تغییر در ساختار ریزماهواره‏ها مربوط به افزایش یا کاهش در یک واحد تکرار شونده بوده است(10).
1-6-2 مدل آللی نا‏محدودبر اساس این مدل هیچگونه محدودیتی در اندازه‏ی پتانسیل ریزماهواره‏ها وجود ندارد. از این رو تعداد نا محدودی از انتخاب‏ها می‌توانند اتفاق بیفتند که تمامی آنها احتمال یکسان را داشته باشند.
بسیاری از پژوهشگران معتقدند که ترکیبی از این دو مدل(عموما تغییر در یک یا دو واحد تکرار شونده و به مقدار کمتر تغییرات بزرگتر) بهتر می‌تواند تغییرات جهشی در ریزماهواره‏ها را توضیح دهد(10).
1-7 مارکرهای STRتوالی‏های تکراری کوتاه پشت سر هم(STRS) ، توالی‏های تکرارشونده کوتاه با طول 1-13 نوکلئوتید هستند که به شکل سر به دم قرار می‏گیرند. در ژنوم انسان، معمول‏ترینSTR ، توالی دو نوکلئوتیدی [CA]n است،که در این فرمول n تعداد تکرارهاست که معمولا بین 5 تا 20 بار متغیر است(24).
1-8 کاربرد مارکرهای STRمارکرهایSTR کاربردهای فراوانی دارد که از مهمترین آنها تعیین هویت افراد است(25). تعیین هویت در موارد بسیاری کاربرد دارد که از جمله‏ی آنها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
1- مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی
2- شناسایی هویت قربانیان حوادث
3- تعیین هویت در موارد جنایی
4- ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی(26).
1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلیاز مارکرهایSTR می توان برای بررسی خویشاوندی دو یا چند نفر استفاده کرد. این نوع مطالعه را آنالیز فامیلی می‌گویند و کاربرد متداول آن در بررسی رابطه والدین ـ فرزندی است(27).
هرساله بیش از 300000 مورد تست ابویت به منظور تعیین رابطه پدر فرزندی در ایالات متحده انجام می‏شود. این تست‏ها معمولا شامل یک مادر، یک کودک و یک یا چند پدر مدعی است. همانطور که می‏دانیم هر فرد دارای دو سری آلل می‏باشد که یک سری آن را از پدر و سری دیگر را از مادر دریافت کرده است. بدین منظور آلل‏های پدر و فرزند برای یافتن تعدادی از جایگاه‏هایSTR مورد بررسی قرار می‏گیرند. اساس این تست بر این است که در فقدان جهش، آلل‏های کودک باید مطابقت کاملی با آلل‏های پدری و مادری داشته باشد(28-29-30).

شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد(26).علاوه بر این بسیاری از افراد برای شناسایی اقوام خود از مارکرهایSTR استفاده می‏کنند. برای مثال با آنالیز STR های کروموزومY می توان نسبت فامیلی میان مردان یک خانواده را مشخص کرد. زیرا همان‌طور که می‏دانید کروموزومY توارث پدری دارد و از پدر به تمام پسران به ارث می‌رسد. پس طبیعی است که تمام پسران خانواده در همه‏ی نسل‌هاSTR های یکسانی روی کروموزوم Y خود داشته باشند. آزمایشی که بدین منظور انجام می‏گیرد آزمایش Y-filer نامیده می‏شود. به کمک این آزمایش می‏توان روابط میان برادرها، عمو و برادرزاده و... را مشخص نمود(27-31).
1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادثفجایع بزرگ، طبیعی یا بدست بشر، می‌تواند جان افراد بسیاری را بگیرد، تست‏‏‏هایی که برای شناسایی قربانیان حادثه انجام می‏شود، تست تعیین هویت قربانیان حادثه نامیده می‏شود. از این تست در مواردی مانند سقوط هواپیما ،آتش سوزی‏های بزرگ و حوادث تروریستی استفاده می‏شود. در این قبیل حوادث با استفاده از اسامی افراد، خانواده‏های آنها شناسایی می‏شوند و پس از مراجعه‏ی خانواده‌ها، از اعضای خانواده شامل پدر، مادر، فرزند، خواهر و برادر نمونه‏ی DNA گرفته می‏شود و نواحی STR آنها بررسی می‏شود. پس از این مرحله با استفاده از DNAبه دست آمده از بقایای اجساد پروفایل ژنتیکی آنها تهیه می‏شود و در نهایت با مقایسه‏ی پروفایل‏های تهیه شده هویت قربانیان شناسایی می‏شود(32).
1-8-3 تعیین هویت در موارد جناییتعیین هویت در موارد جنایی شامل دو بخش می‏باشد:
شناسایی افراد مجهول الهویه
ردیابی مجرمین(25).
1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویههر ساله میلیون‏ها نفر در سراسر جهان تحت شرایط مشکوکی مفقود می‏شوند. بسیاری از این افراد قربانی فعالیت‏های مجرمانه از قبیل تجاوز و قتل می‏شوند و هویت آنها ناشناس باقی می‏ماند. در این موارد هم می‏توان از مارکرهای ژنتیکی موجود در DNA افراد برای تعیین هویت آنها استفاده کرد(33).
سه دسته نمونه در مورد افراد قربانی وجود دارد:
1-نمونه مستقیم از فرد قربانی
2-نمونه خانواده قربانی
3-نمونه‌های ناشناس باقی مانده از انسان در صحنه‏ی جرم
این نمونه‏ی باقی مانده می‏تواند استخوان، دندان، بافت، تار مو، لکه ی خون و یا هر چیز دیگری باشد(34).
1-8-3-2 ردیابی مجرمینعلاوه بر این می‏توان از آنالیز DNA برای ردیابی و شناسایی مجرمین استفاده کرد. این که فردی مرتکب جرم و جنایتی بشود و نمونه‌ای از DNA خود را به جا نگذارد، تقریبا غیرممکن است. مو، لکه‌های خون و حتی اثر انگشت، مقادیر بسیار جزئی از DNA را دارند که برای مطالعه با PCR کافی هستند. این بررسی‌ها لازم نیست که بلافاصله انجام شوند، زیرا در سال‌های اخیر، با آزمایش DNA روی مواد بایگانی شده، تعدادی از جنایات گذشته ـ با عنوان پرونده‌های مختومه ـ نیز روشن شده است(35).
باید به خاطر داشته باشیم که یک پروفایل DNA به تنهایی فاقد اعتبار است و کاربردی ندارد. همیشه برای بررسی یک پروفایل DNA نیاز است که یک مقایسه‏ای انجام شود:
1-نمونه ی مورد بررسی که با Q مشخص می شود
2-نمونه شناخته شده که با K نمایش داده می شود
در موارد جنایی، نمونه ی صحنه ی جرم (Q) با نمونه ی فرد مظنون (K) و یا مظانین (K1,K2,K3,K...) مقایسه می شود . در یک مورد بدون مظنون، نمونه ی صحنه ی جرم با نمونه هایی که در اطلاعات کامپیوتری از افراد سابقه دار وجود دارد، بررسی می شود . (K1,K….,KN)(34).

شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای STR(26).1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتیباستان شناسان با بررسی و مقایسه توالی DNA انسان‌های امروزی با افراد مرده، به کشف منشأ تکاملی انسان امروزی و مسیرهای استقرار انسان در کره زمین می‌پردازند. این زمینه تحقیقاتی آرکئوژنتیک نامیده می‌شود(35).
ردیابی مهاجرت انسانی در طول تاریخ با استفاده از آنالیز DNA روش نوینی است. هدف از این کار تخمین ارتباط میان جمعیت ها بر اساس شباهت‏ها و تفاوت‏هایDNA آنها است. به همین منظور پروژه‏ی عظیمی در سال2005 به منظور ردیابی تاریخ بشر انجام شد که در آن از ده ها هزار نفر از افراد در سراسر جهان آزمایش به عمل آمد. اساس کار بر این مطلب است که اگر تکامل ژنوم‏ها به دلیل انباشتگی جهش ها رخ داده باشد، بنابراین میزان اختلاف در توالی نوکلئوتید های دو ژنوم می تواند زمان حضور جد مشترک آنها را مشخص نماید. انتظار می رود دو ژنومی که اخیرا از یکدیگر جدا شده اند در مقایسه با دو ژنومی که جد مشترک آنها قدیمی‏تر است، اختلاف کمتری داشته باشند(36).


در مطالعه روی یافتن مبدا انسان‏های امروزی و الگوی جغرافیایی مهاجرت‏های بشر از مطالعه‏ی ژن‏ها در جمعیت‏ها می‏توان استفاده کرد. بدین منظور ژن‏های انتخابی جهت بررسی باید دارای گوناگونی باشند. در صورت فقدان گوناگونی ژن‏ها، اطلاعات فیلوژنتیکی بدست نمی‏آید، زیرا همه‏ی افراد حتی اگر به جمعیت‏های مجزایی تقسیم شده باشند که تنها به صورت متناوب با یکدیگر آمیزش داشته‏اند، همچنان دارای همانندی‏های بسیاری خواهند بود. بدین معنی که توالی DNA مورد استفاده در آنالیز فیلوژنتیکی باید از متنوع ترین توالی‏های متغیر باشد(36).
در انسان از سه نوع توالی استفاده می‏شود :
ژن های چند آللی مانند اعضای خانواده‏ی HLA، که اشکال بسیار متفاوتی دارند .
ریز ماهواره‏ها که STR ها نیز جز این گروه به حساب می‏آیند .
DNA میتوکندریایی که به دلیل فقدان سیستم‏های ترمیمی موجود در هسته‌های سلول انسان که نسبتا به سرعت دچار انباشتگی نوکلئوتیدی می‏شوند. انواع مختلف DNA میتوکندریایی موجود در یک گونه را هاپلوگروه می‏نامند(36).
باید توجه نمود که آلل‌ها و هاپلوگروه‌های مختلف به طور هم‌زمان در جمعیت‌ها وجود دارند. به این ترتیب این لوکوس‏ها چند شکلی بوده و به کمک مقایسه ترکیب آلل‌ها و یا هاپلوگروه‌های آنها می‌توان اطلاعات مربوط به وابستگی بین افراد مختلف را بدست آورد. به دلیل جهش‌های ایجاد شده در سلول‏های تولید مثلی هر یک از موجودات، آلل‏ها و هاپلوگروه‏های جدیدی در جمعیت ظاهر می‏شوند. هر یک از آلل‏ها، فراوانی آللی خود را دارند که در طول زمان به دلیل انتخاب طبیعی و تغییر ژنتیکی اتفاقی تغییر می‌کند. انتخاب طبیعی به دلیل تغییر در تناسب (توانائی یک موجود جهت بقا و تولید نسل) رخ می‌دهد و بنابر نظریه‌ی داروین منجر به حفظ انواع مناسب و از بین رفتن انواع زیان آور می‏گردد. به این ترتیب انتخاب طبیعی، فراوانی آلل‏های کاهنده‏ی تناسب را کم کرده و فراوانی آلل‏های افزاینده‌‌ی تناسب را افزایش می‏دهد. در حقیقت در یک جمعیت آلل‏های اندکی ایجاد می‏شوند که تاثیر قابل توجهی بر تناسب موجود داشته باشند، اما هم‌چنان فراوانی آنها به دلیل تغییر ژنتیکی اتفاقی که جز جدا نشدنی طبیعت تولد،تولید مثل و مرگ است در حال تغییر می‏باشد. به دلیل انتخاب طبیعی یا تغییر ژنتیکی اتفاقی ممکن است یک آلل در جمعیت غالب شده و فراوانی آن به صد در صد نیز برسد، به طوریکه این آلل در جمعیت تثبیت شود. اگر یک گونه به دو جمعیت تقسیم شود به طوریکه آمیزش‌های فراوانی بین دو جمعیت رخ ندهد، فراوانی آلل در دو جمعیت به طور مختلف تغییر می‌کند. بنابراین پس از چند ده نسل این دو جمعیت ویژگی‏های ژنتیکی مجزایی را کسب می‏کنند. سرانجام جایگزینی ژنی متفاوتی در این دو جمعیت اتفاق می‏افتد ولی حتی قبل از آن نیز می‏توان از روی اختلاف فراوانی آللی در دو جمعیت، آن دو را از هم باز شناخت(36).
محققان طی سال‏ها تحقیقات در سراسر جهان با استفاده از اصول تئوری اطلاعات، پارامترهای عمومی برای هر جمعیت را به منظور تعیین مقدار اطلاعاتی که مارکرهای STR در جمعیت‏ها به ما می‏دهند، تعریف کردند. در یک نمونه‏گیری از مارکرهای افراد از سراسر جهان، مارکرهایی که بیشترین چندشکلی را در میان جمعیت‏های مختلف داشتند و منحصر به جمعیت‏های خاص بودند، انتخاب شدند .امروزه از این مارکرها برای بررسی تنوع و تفاوت میان جمعیت‏ها استفاده می‏شود(37).
1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STRمارکرهای مختلف STR تحت عنوان کیت های تجاری مختلف در کنار تست‏های تعیین هویت کاربردهای گسترده‏ی دیگری دارند که از مهم ترین آنها می‏توان به موارد زیر اشاره کرد:
جمع آوری سلول های جنینی از خون مادر؛
بیماری های نقشه‏ی ژنومی؛
مشخص نمودن خطوط سلولی؛
تعیین هویت افراد استفاده کننده‏ی سرنگ مشترک؛
تشخیص کلون‏های موفق؛
بررسی و نظارت بر روی پیوند عضو؛
تشخیص کایمرهای ژنتیکی؛
تشخیص تومورهای سرطانی(26).
1-9-1 جمع آوری سلول های جنینی از خون مادرهنگامی که یک خانم باردار است تعدادی از سلول‌های جنینی می‏توانند از راه جفت وارد جریان خون مادر شوند. جمع‌آوری این سلول ها که تحت عنوان micro chimerism خوانده می‏شود و بررسی آنها با مارکرهای STR یک روش غیر تهاجمی برای تعیین رابطه‌ی پدر فرزندی است. همچنین با استفاده از این روش می‏توان جنسیت جنین را نیز تعیین نمود(26).
1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها
اسکن ژنوم انسان برای شناسایی نقشه ژنوم بیماری‏ها به طور معمول با استفاده از حدود چهارصد نشان‌گر STR در سراسر ژنوم در فواصل 10 سانتی مورگان انجام می‏شود. مرکز تحقیقات بیماری‏های ارثی در طول سال ها مطالعات و آزمایشات بسیاری را روی صدها نفر با استفاده از مارکرهای STR انجام داده است. هدف از این آزمایشات یافتن ارتباط میان فراوانی آللی در جمعیت های مختلف و بیماری های ژنتیکی بود. در پژوهش‌های صورت یافته ارتباط میان برخی مارکرها و بیماری‏ها مشخص شد. پس از آن از مارکر‏های مذکور می‏توان برای شناسایی تعیین دقیق محل ناشناخته‏ی ژن بیماری استفاده کرد(26).
1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترکیکی دیگر از کاربردهای مارکرهایSTR نشان دادن به اشتراک گذاری سرنگ در میان مصرف کنندگان مواد مخدر است. با این روش و با استفاده ازجایگاه D8 آزمایشگاه قادر به تشخیص هویت فرد و یا افرادی است که از یک سرنگ مشترک برای تزریق مواد مخدر استفاده کرده‏اند. با این روش می‏توان هویت شخصی را که منشا انتقال بیماری عفونی بوده و از سرنگ مشترک با سایر افراد استفاده می‏کرده تعیین نمود(26).
1-9-4 تشخیص کلون‏های موفقهنگامی که یک موجود کلون می‏شود ازSTR Typing برای آزمایش آن موجود استفاده می‏شود. برای مثال در کلون کردن موجوداتی مانند سگ و گربه. این روش برای آزمودن میزان موفقیت در کلون کردن به کار می‏رود. اگر یک پروفایل STR یکسان میان موجود کلون شده و سلول‎های مادری اولیه مشاهده نشود، در این صورت کلون کردن موفقیت آمیز نبوده(26).
1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضواز کاربردهای دیگر مارکرهای STR، نظارت پیوند سلول‏های پیوند شده بعد از پیوند مغز استخوان است، آزمایش STR از فردی که پیوند گرفته می‏تواند در تشخیص نارسایی پیوند مفید واقع شود(26).
1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکیChimerism حضور دو خط سلولی ژنتیکی متفاوت در یک ارگانیسم است که می‏تواند از طریق پیوند سلول‏های بنیادی خونی و یا انتقال خون و یا به طور ارثی در شخص اتفاق بیفتد. در سال 2004 آزمایشی روی افراد دهنده و گیرنده‏ی پیوند انجام شد که توانایی بالای 27 نشان‌گر STR به کار گرفته شده، ازجمله نشان‌گرهای CODIS در تشخیص کایمرها شگفت انگیز بود(26).
1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولیدر آزمایشگاه خطوط سلولی می‏توانند با سایر خطوط سلولی آلوده شوند. در نتیجه ممکن است با هم مخلوط و یا به یکدیگر تبدیل شوند احراز هویت خط سلولی انسان در حال حاضر به وسیله ی سازمانی در آمریکا انجام شده است. به کمک مارکرهای STR می‏توان آلودگی متقاطع بین خطوط سلولی مختلف را به سرعت کشف کرد و همچنین می‏توان برای مشخص کردن خطوط سلولی انسان به عنوان یک مرجع جهانی سود جست. در طول چند سال گذشته بیش از 500 خط سلولی از انسان به کمک این روش و با استفاده از 8 جایگاه STR بدست آمده است(26).
1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانیفقدان هتروزیگوسیتی (LOH) پدیده‏ای است که در آن حذف در یک ناحیه‏ی لوکوس منجر به عدم تکثیر در PCR می‏شود، به طوری که یک هتروزیگوت واقعی به عنوان یک هموزیگوت به نظر می رسد. این پدیده در بسیاری از افراد مبتلا به تومورهای سرطانی دیده می‏شود. بررسی روی بافت های سرطانی با بافت نرمال با استفاده از STR نشان می‏دهد که جایگاه های مختلف در بافت سالم ارتفاع بلندتری نسبت به بافت های سرطانی نشان می دهند؛چرا که LOH سبب حذف در آن ناحیه شده است(26).
1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولیدو روش کلی برای شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی عبارتند از:
اثر انگشت ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگر
تعیین الگوی DNA با PCR توالی‌های کوتاه تکراری(38).
1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگراولین روشی که در آنالیز DNA با هدف شناسایی افراد به کار رفت، روشی بود که در اواسط دهه 1980 توسط سر آلک جفری از دانشگاه لیستر ارائه شد . این روش براساس نوع دیگری از تنوع ژنوم انسان، موسوم به توالی تکراری بسیار متغیر پراکنده بود. همانگونه که از نام این توالی‌ها بر می‌آید، این توالی‌ها عبارتند از یک توالی تکراری که در جایگاه مختلفی‌(به‌طور پراکنده) از ژنوم انسان وجود دارد. نکته کلیدی این توالی‌ها این است که جایگاه ژنتیکی آنها متنوع است و در افراد مختلف در جایگاه‌های مختلفی از ژنوم قرار دارند(38).
توالی که در ابتدا برای انگشت‌نگاری ژنتیکی بکار رفت، توالی GGGCAGGANG (N: هریک از چهار نوکلئوتید) بود. برای تهیه اثر انگشت یک نمونه، DNA آن را با آنزیم محدودگر برش می‌دهند و قطعات حاصل را با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم تفکیک کرده و با آزمون ساترن بلات مورد بررسی قرار می‌دهند. هیبریداسیون با جستجوگری که دارای این توالی بود چند سری از نوارها را مشخص کرد. هریک از این نوارها مربوط به قطعه‌ای از DNA هضم شده بود که دارای این توالی تکراری بود. به دلیل تنوع جایگاه‌های این توالی اگر این آزمون با نمونه DNA فرد دیگری تکرار شود، نتیجه متفاوتی به دست می‌آید و می‌توان نتایج حاصل را انگشت‌نگاری ژنتیک این افراد محسوب نمود . در شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی نشان داده شده است(38).

شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی(38)
1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت نگاریاین روش در کارهای جنایی خود را بسیار ارزشمند نشان داد اما سه محدودیت داشت:
مقادیر بالایی از DNA برای انجام آزمون مورد نیاز است، زیرا این روش نیازمند آنالیز هیبریداسیون است. برای انگشت‌نگاری نمی‌توان از مقادیر اندک DNA موجود در مو و لکه‌های خون استفاده کرد.
بحث کردن در مورد الگوهای حاصل از انگشت‌نگاری مشکل است، زیرا نوارهای حاصل شدت و ضعف‌های متفاوتی دارند. از نظر قانونی، کوچک‌ترین اختلاف شدت در انگشت‌نگاری ژنتیکی یک متهم برای برائت او کافی است.
با وجود اینکه جایگاه‌های تکراری پراکنده بسیار متنوع هستند، اما اندک احتمالی نیز برای یکسان بودن یا حداقل تشابه الگوی حاصل از دو فرد وجود دارد. این موضوع می‌تواند منجر به برائت یک متهم شود(38).
1-10-2 روش پروفایلینگ
روش قدرتمند پروفایلینگ DNA چنین مشکلاتی را ندارد. در پروفایلینگ از توالی‌های معروف به توالی‌های چند شکلی STR استفاده می‌شود. در این روش، به وسیله PCR با پرایمرهایی که به توالی‌های جانبی STR می‌چسبند، به سرعت می‌توان مقادیر بسیار اندک DNA را افزایش داد. بعد از PCR، محصولات از نظر اندازه نوارها یا وجود نوارهایی که الل‌ یا آلل‌های موجود در نمونه DNAی مورد آزمون هستند، با الکتروفورز ژل آگارز بررسی می‌شوند. روش پروفایلینگ DNA، به دلیل استفاده از PCR بسیار حساس است و امکان انجام آزمون روی مو و دیگر نمونه‌هایی که مقادیر اندکی DNA دارند، فراهم می‌آورد. در نتایج حاصل نیز شکی وجود ندارد و مقایسه میان پروفایل‌های DNA معمولا به عنوان یک مدرک پذیرفته می‌شود. با استفاده از این روش امکان اینکه دو نفر، البته بجز دوقلوهای یکسان، دارای پروفایل‌ مشابهی باشند برابر یک در 1015 می‌باشد. با توجه به جمعیت کره زمین که حدود 109×6 می‌باشد، امکان تشابه آماری پروفایل مربوطه در دو نفر به قدری اندک است که می‌تواند غیرممکن تلقی گردد. نوع هر STR با PCR بوسیله پرایمرهایی که با فلورسنت نشاندار شده‌اند و به دو طرف نواحی تکرار شونده متصل می‌گردند، تعیین می‌شود. سپس الل‌های موجود در STRها با تعیین اندازه به وسیله ژل الکتروفورز موئینه‌ای مشخص می‌شوند. دو یا چند STR می‌تواند با PCR چندگانه مشخص گردد، مشروط به اینکه محصولات از لحاظ اندازه همپوشانی نداشته باشند یا هر جفت پرایمر با فلورسانت متفاوتی نشاندار شده باشند تا امکان تشخیص در ژل الکتروفورز موئینه را داشته باشند. در شکل 1-7 مراحل روش پروفایلینگ نشان داده شده است‌(38).

شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ ‌DNA(36).1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR
مارکرهای STRبرای اولین بار به عنوان ابزاری قوی در تست تعیین هویت انسانی در سال 1990 به‌کار گرفته شدند. دستگاه پزشکی قانونی ((FSS مطالعه برای شناسایی جایگاه‌های جدید و ارتباط جایگاه های شناخته شده با تنوع در جمعیت‏ها را آغاز کرد. پس از آن پلیس سلطنتی کانادا (RCMP) به همراه تعدادی از آزمایشگاه‌های اروپا تلاش‌های اولیه را در رابطه با جایگاه های STR آغاز کردند. اولین جایگاه‏های مورد استفاده شامل چهار جایگاه TH01،VWA ، FES/FPS و.F13A1 نسل دوم کیت‌ها ((SGM شامل جایگاه‌های TH01، VWA‌، FGA ،D8S1179 ،D18S51 و D21S11 بود. پایگاه داده‌های ملی DNA انگلستان ((NDNAD در سال 1995 جایگاه ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت) را به کیت SGM اضافه کرد. با توجه به تکنولوژی STR Typingو موفقیت‏هایی که در این زمینه در انگلستان به‌دست آمد، FBI درصدد برآمد که با استفاده از لوکوس‌های STR، بنیان CODIS را شکل دهد(41).
1-12 CODIS چیست؟سیستم شاخص اندیس‌دهی ترکیبی CODISشامل سیزده جایگاه STRاست. در شکل 1-8 محل قرارگیری این جایگاه‌ها روی کروموزوم‌های انسان نشان داده شده‌اند. نرم افزار CODIS در سال 1990 به عنوان نرم افزاری برای FBI تاسیس گردید. این نرم افزار در صورت اولیه برای آنالیز پروفایل‏های RFLP مورد استفاده قرار می‏گرفت که در بانک اطلاعاتی قابل جستجو بود. تکنولوژی DNA پزشکی قانونی و تکنولوژی کامپیوتری با یکدیگر ادغام گردیدند و باعث بهبود این نرم افزار شدند و این بهبود در جهت نیاز‌های پزشکی قانونی صورت گرفت. در سال 1997نرم افزار CODIS بر اساس مارکرهای STR طراحی شد. سیزده جایگاه STRکه امروزه تحت عنوان CODIS خوانده می‏شوند، عبارتند‌از:
D8S2179
D21S11
D7S820
CSF1PO
D3S1358
TH01
D13S317
D16S539
VWA
TPOX
D18S51
D5S818
FGA (42).

شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم های انسان(25).1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت
برای تعیین هویت از کیتAmp FI STR Identifiler PCR Amplification استفاده می‌شود، که حاوی 15 جایگاه تترانوکلئوتید STRبه همراه مارکر آمیلوژنین که برای تشخیص جنسیت به کار می‏رود می‏باشد. از این پانزده جایگاه، سیزده جایگاه، جایگاه‌های شناخته شده‏ی سیستم اندیس دهی ترکیبی‌(CODIS) هستند، اما علاوه بر آنها دو جایگاه دیگر هم در این کیت گنجانده شده است. جدول(۱-1) نشان دهنده‌ی نام جایگاه‏های موجود در CODIS، به همراه موقعیت کروموزومی هر یک از جایگاه‏ها و آلل‏های موجود در هر جایگاه است(43).
جدول 1-1 جایگاه‏های موجود در کیت ABIآلل‌های موجود در هر جایگاه موقعیت کروموزومی نام جایگاه
8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 8 D8S2179
24,24.2,25,26,27,28,28.2,29,29.2,
30,30.2,31,31.2,32,32.2,33,33.2,
34,34.2,35,35.2,36,37,38 21q11.2-q21 D21S11
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 7q11.21-22 D7S820
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 5q33.3-34 CSF1PO
12,13,14,15.16,17,18,19 3p D3S1358
4,5,6,7,8,9,9.3,10,11,13.3 11p15.5 TH01
8,9,10,11,12,13,14,15 13q22-31 D13S317
5,8,9,10,11,12,13,14,15 16q24-qter D16S539
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,
26,27,28 2q35-37.1 D2S1338
9,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15,
15.2,16,16.2,17,17.2 19q12-13.1 D19S433
11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,
22,23,24 12p12-pter VWA
6,7,8,9,10,11,12,13 2p23-2per TPOX
7,9,10,10.2,11,12,13,13.2,14,14.2,
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25
26,27 18q21.3 D18S51
X,Y Amelogenin
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 5q21-31 D5S818
17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,26.2
27,28,29,30,30.2,31.2,32.2,33.2,
42.2,43.2,44.2,45.2,46.2,47.2,48.2
50.2,51.2 4q28 FGA
1-14 معرفی استان‏ها1-14-1 استان کرمانشاه
کرمانشاه یکی از باستانی‌ترین شهرهای ایران است و بر اساس افسانه ها توسط طهمورث دیوبند - پادشاه افسانه‌ای پیشدادیان ساخته شده است. برخی از مورخین بنای آن را به بهرام پادشاه ساسانی نسبت می‌دهند. کرمانشاه در زمان قباد اول و انوشیروان ساسانی به اوج عظمت خود رسید. در اوایل حکومت شاه اسماعیل صفوی سلطان مراد آق قویونلو با 70 هزار نفر کرمانشاه و همدان را اشغال کرد. صفویه برای جلوگیری از تجاوز احتمالی امپراطوری عثمانی این شهر را مورد توجه قرار داد. در زمان شیخ علیخان زنگنه صدر اعظم صفوی به آبادانی و رونق کرمانشاه افزوده شد. تاورنیه، جهانگرد و بازرگان فرانسوی، درباره کرمانشاه چنین نوشته‌ است: ” هم زمان با حمله افغان و سقوط اصفهان که طومار فرمانروایی خاندان صفوی در نوردیده شد، کرمانشاه به جرم قرب جوار، با تهاجم عثمانی‌ها مواجه گردید و بار دیگر شهر رو به خرابی نهاد.“ نادر شاه به منظور آمادگی در مقابل تجاوز عثمانی‌ها، به این شهر توجهی خاص مبذول داشت. در زمان نادر شاه این شهر مورد هجوم عثمانی‌ها قرار گرفت. اما نادرشاه عثمانی‌ها را به عقب راند، ولی در اواخر زندگی نادرشاه، کرمانشاه با محاصره و تاراج عثمانی‌ها مواجه شد. کرمانشاه در عهد زندیه دستخوش آشوب فراوانی گردید. به طوری‌که درکتاب ”تحفه العالم“ عبدالصیف جزایری از کرمانشاه به عنوان خرابه نام برده شده است. در دوره قاجار تا حدی از حملات عثمانی‌ها به ناحیه کرمانشاه کاسته شد. در سال 1267ه.ق، امام قلی میرزا از طرف ناصرالدین شاه به سرحدداری کرمانشاه منصوب شد و مدت 25 سال در این شهر حکومت کرد و در همین دوره بناهایی را احداث و به یادگار گذاشت. این شهر در جنبش مشروطه سهمی به سزا داشت و در جنگ جهانی اول و دوم به تصرف قوای بیگانه درآمد و پس از پایان جنگ تخلیه شد. در نتیجه جنگ تحمیلی عراق علیه ایران، این شهر خسارات زیادی دید و پس از جنگ اقدامات مؤثری در جهت بازسازی آن صورت گرفت. در حال حاضر شهر کرمانشاه، مرکز استان کرمانشاه یکی از هفت کلانشهر کشور(تهران، مشهد، اصفهان، تبریز، شیراز، کرمانشاه و اهواز) است‌(44).
1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی
استان کرمانشاه در موقعیت ۳۴ درجه شرقی و ۴۷ درجه شمالی شمالی قرار دارد. از شمال به کردستان، از غرب به کشور عراق، از شرق به استان لرستان و همدان و از جنوب به استان ایلام محدود می گردد. شهرستان‌های این استان عبارت‌اند از: اسلام‌آباد غرب، سنقر، پاوه، صحنه، ثلاث باباجانی، قصر شیرین، جوانرود، دالاهو، روانسر، کرمانشاه، کنگاور، گیلان غرب، سر‌پل ذهاب، هرسین. در شکل1-13 استان کرمانشاه به همراه شهرستان‌های آن دیده می‌شود(44).

شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه)44.(1-14-2 استان یَزدیزد سرزمینی کهن با پیشینه‌ای در خور توجه، در تاریخ پر فراز و نشیب ایران است. نام یزد برای اولین بار در آثار دوره‌ی ماد‌ها (701 تا 550 قبل از میلاد) دیده می‌شود که گواهی بر قدمت سه هزار ساله‌ی این سرزمین است. در دوره‌های هخامنشی، اشکانی و ساسانی نیز در اسناد و کتیبه‌ها بار‌ها به نام یزد برمی‌خوریم(45).
حسن پیر‌نیا، در کتاب خود،"ایران باستان"،به نقل از تاریخ هرودوت، مورخ یونانی(484 تا 420 قبل از میلاد)، بر مبنای کتیبه‌های داریوش، یزد را بنا بر رسم یونانیان، به نام ایساتیس می‌خواند. وی می‌افزاید: یزد در عصر اشکانی در قلمرو حکومت مهرداد اول بود و در این شهر به نام او سکه ضرب می‌کردند. در دوره‌ی پادشاهی اردشیر بابکان، (241-224‌م) بنیان‌گذار سلسله‌ی ساسانی، یزد زیر نفوذ او بود. پس از ظهور اسلام و فروپاشی دولت ساسانی، در زمان خلافت عمر، و به روایت برخی، در دوران عثمان (دهه ی سوم هجری)، شهر یزد و نواحی آن فتح شد. از آن زمان تا پایان حکومت امویان، فرمانروایان عرب بر این ولایت حکم‌رانی می‌کردند. چنان‌که آمده است، در دوران خلافت حضرت علی(ع)، مسلم ابن زیاد، والی فارس، مالیات یزد را هم می‌گرفت. چنین بود تا هنگامی‌که به‌دست خود ایرانیان، حکومت های مستقل و نیمه مستقلی تشکیل شد و فرمانروایان ایرانی بر ولایت یزد حاکم شدند(45).
مرکز این استان، شهر یزد است. یزد منطقه‌ای خشک و بیابانی است. گروه بزرگی از زرتشتیان ایران در استان یزد و بویژه شهر یزد زندگی می‌کنند. زبان مردم استان یزد فارسی با لهجه یزدی است. آبادی نشینی در این منطقه از قدمت طولانی برخوردار است. این سرزمین از گذرگاه‌های مهم در ادوار تاریخی محسوب می‌شده‌ است. این ناحیه در دوره هخامنشیان از راه‌های معتبر موسسه‌های راهداری، مراکز پستی و چاپاری برخوردار بوده‌است. راهداری در یزد قدیم چنان اهمیتی داشت که خاندان آل مظفر از منصب راهداری ناحیه میبد به پادشاهی رسیدند. با این‌همه این استان از درگیری‌ها و جنگ‌های تاریخ کشور ایران تا حدودی ایمنی داشته‌است. سخت‌گذر بودن راه‌ها به همراه محدودیت منابع آبی مانع عمده تسخیر این منطقه توسط بعضی از حکومت های بزرگ و کوچک حاشیه و پیرامون این منطقه در طول تاریخ بوده‌است. همان طور که در شکل 1-14 دیده می شود استان یزد دارای شهرستان های ابرکوه، اردکان، بافق، بهاباد، تفت، خاتم، صدوق، طبس، مهریز، میبد و یزد می باشد که شهرستان های مهریز و تفت از آب و هوای خوبی برخوردار می باشد (45).
1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی
استان یزد در مرکز ایران در قلمرو سلسله جبال مرکزی ایران بین عرض های جغرافیایی 29 درجه و 48 دقیقه تا 33 درجه و 30 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 52 درجه و 45 دقیقه تا 56 درجه و 30 دقیقه شرقی از نصف النهار مبدا قرار گرفته است. استان یزد از سرزمین‌های تاریخی است که در میان ایالت های قدیمی و بزرگ پارس، اصفهان، کرمان و خراسان قرار داشته‌است(45).

شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد(45).1-15 هدف از تحقیق:آنچه که باعث استفاده از مارکرهای STR در جمعیت شناسی شده است، این واقعیت است که درجه فراوانی آللی هر مارکر STR در هر جمعیت منحصر به فرد است. در حقیقت طبق مطالعات انجام شده فراوانی آلل‏های STR در نژاد‏های مختلف و حتی در مناطق جغرافیایی خاص، تفاوت‏هایی را نشان داده است. بنابراین بررسی هر یک از لوکوس های STR در هر نژاد یا جمعیت خاص برای تفسیر صحت نتایج حاصل از انجام آزمایش های تعین الگوی ژنتیکی به کمکSTR و انجام محاسبات آماری مربوطه امری ضروری است. برای بهره گیری از فواید این فناوری نوپا در زمینه‏ی تشخیص افراد، ضروری است تا فراوانی آللی لوکوس‏هایSTR مختلف در جمعیت بومی کشور مورد بررسی قرار گیرند (45).
مطالعات گذشته روی جمعیت های ایرانی، حضور تعدادی از آلل‏ها را با پلی مورفیسم بالا نشان می‏دهد‌(37-46.)
هدف از این مطالعه به دست آوردن پارامترهای جمعیتی بر اساس فراوانی آللی به دست آمده از شانزده جایگاه STR، در جمعیت‏های کرمانشاه و یزد به منظور بررسی تفاوت ژنتیکی میان این دو جمعیت و سایر جمعیت‏ها می‏باشد.

فصل دوم
2-1 نمونه‌گیریبرای نمونه‌گیری از اقوام کرد و یزد از نمونه هایی که به آزمایشگاه ژنتیک پزشکی تهران رجوع می‌کردند، استفاده شد. پس ازکسب رضایت نامه 4 میلی لیتر خون محیطی از افراد غیر خویشاوند بر اساس محل تولد و اطلاعات مربوط به سه نسل گذشته (پدری و مادری) تهیه شد و در لوله‌های حاوی ماده ضد انعقاد (EDTA) ریخته شد برای تکمیل نمونه‌های یزدی از همکاری آزمایشگاهی در یزد استفاده گردید و برای نمونه‌های کرد به استان کرمانشاه رفته و از آزمایشگاه بیمارستان طالقانی نمونه‌گیری به عمل آمد.
2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباعاستخراج DNA با استفاده از روش استاندارد نمک اشباع طبق مراحل زیر انجام شد:
۱- ۳ میلی لیتر از نمونه‌ی خون محیطی حاوی ماده‌ی ضد انعقاد EDTA، داخل فالکون ۱۵ میلی لیتری ریخته شد و با استفاده از آب مقطر سرد به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس فالکون به شدت حرکت داده شد این کار جهت لیز بهتر گلبول‌های قرمز از طریق فرآیند تورژسانس می‌باشد. سپس نمونه را در دستگاه EBA 20 Hettich zentrifugen به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۵۰۰۰ سانتریفیوژ شد و محلول رویی خارج گردید و رسوب انتهایی فالکون نگه داشته شد.
۲- با افزودن آب مقطر سرد به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد و مجدداً با همان شرایط ذکر شده آن را سانتریفیوژ گردید و رسوب حاصل که حاوی گلبول‌های سفید است نگه داشته شد.
۳- پس از افزودن ml10 محلول I استخراج DNA به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس در شرایط ذکر شده آن را سانتریفوژ کرده و محلول رویی آن دور ریخته شد.
جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های قرمز)غلظت مواد
10 mM Tris-Hcl: pH:7.5
0.32 mM Sacarose
5 mM MgCl2
%1 Triton X-100
4-5/۱ میلی لیتر از محلول II استخراج DNA(از قبل تهیه شده به شرح زیر)، lμ ۲۵ سدیم دو دسیل سولفات ‌ SDS و lμ ۲۰ پروتئیناز K به رسوب سفید رنگ انتهای فالکون افزوده شد.
جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های سفید)غلظت مواد
10 mM Tris-HCl: pH:8.2
2mM EDTA: pH:8
0.45mM NaCl
۵- نمونه‌ها به مدت ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در دمایc° ۵۶ و یا به مدت یک شب در دمایc° ۳۷ در انکوباتور قرار داده شد تا رسوب حل شود.
۶- پس از افزودن lμ ۵۰۰ نمک اشباع به نمونه، به آرامی تکان داده شد و به مدت ۱۰ دقیقه در ۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی به یک فالکون حاوی ۲ میلی لیتر اتانول خالص (۱۰۰ درصد) انتقال یافت و به آرامی حرکت داده شد تا کلاف DNA شکل بگیرد.
۷- کلاف DNA توسط سمپلر به درون یک ویال حاوی ۱ میلی لیتر الکل ۷۰ درصد انتقال یافت تا الکل 100 خارج شود. در مرحله‌ی بعدی ویال را به مدت ۳ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دستگاه 20 Hettich zentrifugen Mikro سانتریفیوژ گشت.
۸- محلول رویی دور ریخته شد و ویال حاوی DNA به مدت ۵ دقیقه در انکوباتور قرار داده شد تا اتانول کاملاً تبخیر گردد.
۹- بر حسب میزان DNA بین ۵۰ تا ۳۰۰ ماکرولیتر TE به آن افزوده و به مدت یک شب در انکوباتور C°۳۷ قرار داده شد تا DNA به طور کامل حل شود.
جدول 2-3 ترکیبات TEغلظت محتویات
10mM Tris-Hcl, PH:7.6
1mM EDTA, PH:8
2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typingدر هر واکنش Multiplex PCR بهتر است از lμ ۵ نمونه‌ی DNA انسانی با غلظت ng ۱۰۰-50 استفاده شود. اگر‌چه حساسیت آنالیزی این روش در حد ng۵۰-20 از DNA می‌باشد. روش استخراج و نگهداری DNA می‌تواند روی نتایج PCR تأثیر گذار باشد. این روش نیاز به کیت خاصی برای استخراج DNA ندارد با این وجود توجه به این مسئله که در نمونه‌ها غلظت بالایی از آلودگی با نمک وجود نداشته باشد حائز اهمیت است. در این روش نباید از خون هپارینه استفاده شود زیرا هپارین می‌تواند ممانعت کننده‌ی مرحله‌ی PCR باشد. نمونه‌ی DNA را باید در TE حل کرد. pH نمونه‌ی DNA باید بین ۸ تا ۵/۸ باشد تا از دپوریناسیون در طی مرحله‌ی حرارت دادن اولیه جلوگیری شود. بهتر است در صورتی‌که قصد نگهداری طولانی مدت نمونه‌های DNA را داشته، نمونه را در دمای C°۲۰- نگهداری کرد. اگرچه DNA پس از حل شدن در TE به شدت پایدار است اما نگهداری طولانی مدت آن در دمای C °۴ ممکن است منجر به آلودگی آن با میکروارگانیسم‌ها شود .
۲-3-1 رسوب گذاری با اتانولبا توجه به این مسئله که نتایج مربوط به روش STR در نهایت با یکدیگر مقایسه می‌شوند، بهتر است نمونه‌های انتخاب شده از یک نوع بافت گرفته شوند و با روش یکسانی استخراج شوند. در مواردی که از نمونه‌های DNA قدیمی یا نمونه‌هایی با کیفیت نامناسب استفاده می‌شود و یا مواقعی که غلظت DNA مورد استفاده کمتر از ng/µl۴ است، روش‌های خالص سازی DNA مانند روش رسوب گذاری با اتانول، می‌تواند سبب بهبود کیفیت نمونه‌ها و ایجاد نتایج بهتر و مطمئن‌تری شود. استفاده از روش رسوب گذاری با اتانول آلودگی‌های ناشی از یون‌ها، نمک‌ها، اتانول و... را کاهش می‌دهد. غلظت نمک (NaCl)، نباید بیشتر از mM ۶۰ باشد تا دناتوراسیون به طور کامل انجام شود. هم‌چنین غلظت EDTA نباید بیش از mM۱ باشد زیرا EDTA به منیزیوم متصل شده و مانع انجام مرحله‌ی PCR می‌گردد. ناخالصی‌های یونی مانند آهن، اتانول و فنل نیز باعث کاهش فعالیت پلی‌مراز می‌گردند.
رسوب‌گذاری با اتانول به شیوه زیر بر روی نمونه‌ها انجام گرفت.
به میزان ۱/۰ حجم اولیه‌ی نمونه‌ی DNA استات سدیم M ۳ با 5/4:pH به نمونه‌ها اضافه شد.
به اندازه‌ی ۳ برابر حجم (پس از افزودن سدیم استات) به نمونه‌ها اتانول سرد خالص افزوده شد.
نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند و سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دور rpm14۰۰۰ سانتریفوژ گشتند.
محلول رویی به آرامی خارج شد و به رسوب DNA نصف حجم اتانول اولیه،اتانول ۷۰ درصد افزوده شد.
نمونه‌ها به مدت ۱۵ دقیقه در دور ۱4۰۰۰ سانتریفیوژ شدند.
محلول رویی خارج شد و پس از اینکه اتانول کاملاً تبخیر شد رسوب در مقدار مناسبی از TE حل گردید.

user6-712

هورمون رشد مستقیما انتقال اسیدهای آمینه یا شاید بیشتر اسیدهای آمینه را از غشاء سلول به درون سلول تقویت می‌کند. غلظت اسیدهای آمینه درون سلول را زیاد می‌کند و تصور بر این است که حداقل تا حدی مسئول افزایش پروتئین سازی است. این تنظیم اسیدهای آمینه شبیه اثر انسولین بر انتقال گلوکز از غشاء است (سپهری، 1385).
2-5-4-2 افزایش رونویسی هسته‌ای DNA برای ساخت RNAهورمون رشد طی دوره‌های طولانی‌تر (24 تا 48 ساعت) رونویسی DNA درون هسته را هم تحریک می‌کند و موجب ساخت مقادیر بیشتری RNA می‌شود. به این ترتیب، اگر انرژی، اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و سایر عوامل رشد کافی در دسترس باشند، پروتئین سازی افزایش می‌یابد و رشد به میزان بیشتری صورت می‌گیرد، این کار احتمالا مهم‌ترین عمل هورمون در بلند مدت است. خلاصه اینکه هورمون رشد تقریبا تمام جنبه‌های دریافت اسیدآمینه و ساخت پروتئین در سلول را تقویت می‌کند و در عین حال تجزیه پروتئین‌ها را کاهش می‌دهد (سپهری، 1385).
2-5-4-3 افزایش میزان چربی‌ها برای تولید انرژیهورمون رشد اثر ویژه‌ای در آزاد سازی اسیدهای چرب دارد و به این ترتیب غلظت اسیدهای چرب را در مایعات بدن افزایش می‌دهد. به علاوه هورمون رشد تبدیل اسیدهای چرب استیل 36 COA و مصرف بعدی آن برای تولید انرژِی را در بافت‌های سراسر بدن تقویت می‌کند. بنابراین، تحت تاثیر هورمون رشد، چربی مقدم بر کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها انرژی مصرف می‌شود (سپهری، 1385).
2-5-4-4 کاهش مصرف کربوهیدرات‌هاهورمون رشد اعمال متعددی دارد که بر متابولیسم کربوهیدرات‌ها اثر می‌گذارند، از جمله:
کاهش برداشت گلوکز در بافت‌ها مثل عضله اسکلتی و بافت چربی.
افزایش تولید گلوکز در کبد.
افزایش ترشح انسولین.
همه این تغییرات، «نتیجه مقاومت به انسولین» ناشی از هورمون رشد است که اثرات انسولین در تحریک برداشت و مصرف گلوکز در عضله اسکلتی و بافت چربی و مهار گلوکونئوژنز در کبد را تضعیف می‌کند. مکانیسم مقاومت به انسولین و کاهش مصرف گلوکز توسط سلول‌ها، بر اثر هورمون رشد هنوز معلوم نیست. به هر حال، هورمون رشد با افزایش غلظت اسیدهای چرب در خون ممکن است سبب اختلال در اثر انسولین بر مصرف گلوکز در بافت‌ها شود (سپهری، 1385).
2-6 ژن هورمون رشداین ژن به طور مستقیم و غیر مستقیم نقش مهمی در فرایندهای رشد سلول‌های بدنی، رشد اسکلت و تقسیم سلولی و سنتز پروتئین بعد از تولد را دارا می‌باشد، علاوه بر آن هورمون رشد میزان اکسیداسیون چربی و نقل و انتقال گلوکز به بافت پیرامونی و تنظیم فعالیت ترجمه ریبوزومی که در سنتز پروتئین مرتبط است دخالت دارد (دی سانتیس و جری، 2007). مطالعاتی که روی حیوانات انجام شد دلالت بر این دارد که ژن هورمون رشد می‌تواند یک ژن کاندید باشد که برای صفات تولیدی همانند رشد (تامباسو و همکاران،2003) مقاومت در برابر بیماری و تولید تخم (دان کانمینگ، 1997) میزان چربی (کنور و همکاران،2003) اثر به سزایی داشته باشد. پروتئین اصلی این هورمون از تحول تدریجی در طی زمان و تکامل محفوظ مانده است و اطلاعات بسیار ارزشمندی را در زمینه تغییرات پروتئینی و عملکرد هورمون رشد به ما می‌دهد (دین و همکاران، 2008).
بر اساس مطالعاتی که روی ژن هورمون رشد در ماهیان صورت گرفته مشخص شد که ژن هورمون رشد در ماهیان به صورت محافظت شده نمی‌باشد. به عنوان مثال ژن هورمون رشد کپور ماهیان همانند پستانداران دارای 4 اینترون و 5 اگزون می‌باشد (هو،1991) ولی در اکثر ماهیان دیگر دارای یک اگزون اضافی (6 اگزون و 5 اینترون) می‌باشد (آگلون و همکاران، 1988 و بر و دانیال، 1993) اندازه اگزون‌ها در همه ماهیان تقریبا برابر است به جزء اگزون 5 که در طول تکامل به دو قسمت تبدیل شده است (آلمولی و همکاران،2000). فرض بر این است که اضافه شدن اینترون 5 به اگزون 5 و تبدیل اگزون 5 به دو قسمت منجر به واگرایی بین کپور ماهی شکلان و دیگر ماهیان استخوانی شده باشد.
با بررسی تکامل اینترون 5، ماهیان را به سه گروه متفاوت تقسیم بندی کرده‌اند. گروه اول ماهیانی که فاقد اینترون 5 می‌باشند و ساختار این ژن مانند پستانداران و پرندگان می‌باشد مانند کپورماهیان و گربه ماهیان. گروه دوم ماهیانی که اینترون 5 آن‌ها به طول 100-70 جفت باز است مانند تیلاپیا، کفشک ماهی و جراح ماهی دم زرد و گروه سوم که طول اینترون 5 در ژن هورمون رشد 200 تا 600 جفت باز می‌باشد که در برگیرنده خانواده آزادماهیان می‌باشد (یانگ و همکاران، 1997). محققین بر این باورند که دو نسخه‌ای شدن کل ژنوم ماهیان در طول دوره تکامل ماهیان استخوانی اتفاق افتاده است (کریستوفل و همکاران، 2004). اما فقط در آزاد ماهیان و کپور معمولی و تیلاپیا ژن هورمون رشد به صورت دو نسخه‌ای تا به حال گزارش شده است (آگلون و همکاران، 1988). که ماهی سفید و کپور معمولی دارای دو ژن هورمون رشد GH-1 و GH-2 می‌باشد.
2-7 نشانگرهای ژنتیکیهر آنچه که در میان افراد، لاین‌ها، جمعیت‌ها، گونه‌ها، نژادها و یا سویه‌های مختلف به لحاظ ژنتیکی تفاوت داشته و سبب تمایز آن‌ها از یکدیگر گردد به عنوان نشانگر ژنتیکی شناخته می‌شود (بنابازی، 1381). چند شکلی بودن و توارث پذیری از جمله شرایط لازم برای یک نشانگر ژنتیکی می‌باشند.
از مهم‌ترین ویژگی‌های یک نشانگر برتر می‌توان به این موارد اشاره نمود (نقوی، 1388) :
تشخیص آسان همه فنوتیپ‌های ممکن (افراد هتروزیگوت و افراد هموزیگوت).
نداشتن تاثیر روی آلل های موجود در سایر جایگاه‌های ژنی نشانگر (نداشتن اپیستازی).
تظاهر در مراحل اولیه نمو.
حداقل بودن یا عدم اثر متقابل با نشانگرهای دیگری که می‌توانند به طور هم زمان در یک جمعیت در حال تفرق مورد استفاده قرار گیرند.
پیوستگی بسیار نزدیک با ژن‌های مورد نظر.
توارث پذیری کامل.
آسان بودن اندازه گیری.
2-7-1 نشانگرهای ریخت شناسیبه علائمی گفته می‌شوند که به طور مستقیم در فنوتیپ فرد قابل تشخیص بوده و توارث پذیرند، مانند تعداد فلس‌ها روی خط جانبی، اتولیت ها و شکل زوائد پیلوریک و از این دست پارامترها که به راحتی قابل ردیابی هستند. این نشانگرها غالبا تحت تاثیر محیط قرار داشته و متاثر از سن هستند. اگرچه نشانگرهای ریخت شناسی در علوم زیستی مورد استفاده قرار گرفته‌اند، ولی دارای محدودیت‌های اساسی هستند و به همین دلیل توجه محققین به انواع دیگری از نشانگرها جلب شده است (مردانی، 1372).
2-7-2 نشانگرهای فیزیولوژیکیمطالعات مربوط به تولید شیر نشان می‌دهند که افزایش تولید شیر با افزایش سطح برخی از هورمون‌ها در پلاسما همراه است. پس میزان این هورمون‌ها می‌تواند به عنوان یک نشانگر فیزیولوژیک محسوب شود. اشکال نشانگرهای فیزیولوژیک این است که این نشانگرها (از جمله سطح هورمون‌ها در پلاسمای خون) علاوه بر ژن‌ها به شدت تحت تاثیر محیط داخلی، سن و جنس حیوان هستند (مردانی، 1372).
2-7-3 نشانگرهای سیتوژنتیکیدر بسیاری از موجودات زنده تفاوت‌های گسترده کروموزمی مشاهده می‌شوند که می‌توانند به عنوان نشانگر به کار روند. تلوسنتریک ها، ایزوکروموزوم ها، جابجائی ها و الگوهای نواربندی از جمله این نشانگرها می‌باشند (مردانی، 1372).
2-7-4 نشانگرهای پروتئینی برآورد شده است که 20 تا 50 درصد ژن‌های یک موجود حاوی اطلاعات کدکننده پروتئین‌ها می‌باشند. تنوع و گوناگونی یک پروتئین معین حاصل جابجایی و یا جایگزینی اسیدهای آمینه زنجیره پلی پپتیدی است. این تفاوت‌ها بار الکتریکی و در نتیجه حرکت پروتئین بر حسب نوع و تعداد اسیدهای آمینه جابه جا شده را تغییر می‌دهند. وجود پروتئین‌های چند شکل یا تغییر در اسید آمینه یک پروتئین نشان دهنده جابجایی و یا جایگزینی نوکلئوتیدها در زنجیره DNA بر اثر جهش می‌باشد. این تغییر در اسیدهای آمینه پروتئین و نوکلئوتیدهای یک ژن، نقش اساسی فرآورده ژن را تغییر نمی‌دهد بلکه محصولی را به وجود می‌آورد که با محصول ژن جهش نیافته متفاوت نبوده و این تغییر نشان دهنده جهش در زنجیره DNA است. از معایب نشانگرهای پروتئینی این است که تعداد نشانگرهای پروتئینی محدود است. چند شکلی در این نشانگرها چندان زیاد نیست. فنوتیپ‌های الکتروفورزی در آن‌ها پیچیده است (بنابازی، 1381). تحت تاثیر تغییرات پس از ترجمه هستند و تظاهر کمی، برخی از آنزیم‌ها و پروتئین‌ها تحت تاثیر مرحله رشد قرار می‌گیرد (نقوی، 1388).
2-7-5 نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولیبا مقایسه ردیف بازهای مولکول DNA در کروموزوم‌های دو فرد هم گونه در می‌یابیم که اکثر جفت بازها یکسان می‌باشند. مناطق معینی که تفاوت‌های ردیفی در آنها به وقوع می‌پیوندند را تحت عنوان نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولی می‌شناسیم. به عبارت دیگر این نوع تغییرات انعکاس دهنده مستقیم تنوع در ساختار ژنتیکی (ساختمان DNA) هستند. وقتی تغییرات DNA در درون ژن‌ها رخ می‌دهند، توانایی تاثیر روی عمل ژن‌ها و در نتیجه فنوتیپ فرد را دارا می‌باشند ولی اکثر نشانگرهای مولکولی با یک فنوتیپ قابل مشاهده همراه نیستند و بایستی این تغییرات را از طریق آنالیز مستقیم DNA مطالعه نمود (امتیازی و کریمی، 1384).
نشانگرهای مولکولی به دو دسته تقسیم می‌شوند:نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR.نشانگرهای مولکولی غیرمبتنی بر PCR.
2-8 نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمرازواکنش زنجیره‌ای پلیمراز که معمولا به طور اختصار PCR خوانده می‌شود روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در کمتر از نیم روز امکان پذیر می‌کند. اما این فرایند هنگامی امکان پذیر است که دست کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه دی. ان. ای مورد نظر معلوم باشد (نقوی، 1388). در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانند سازی دی. ان. ای در طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه مورد نظر DNA هستند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‌گیرند تا واکنش آنزیمی همانند سازی دی. ان. ای در درون لوله آزمایش امکان پذیر شود. این همانندسازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‌های پلیمراز صورت می‌گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‌ها به صورت تجاری در دسترساند (نقوی، 1388).
این واکنش از آن روی ارزشمند است که عمل آن بسیار اختصاصی است و به سادگی ماشینی شده و قادر است عمل تکثیر را از مقادیر فوق العاده کم DNA الگو آغاز کند. به کمک این روش می‌توان نزدیک به 5 کیلو باز از ژنوم را بدون هیچ مشکلی تکثیر نمود. از روش PCR بیشتر در نقشه یابی DNA، انتخاب به کمک شناساگرها و همچنین در فیلوژنیک مولکولی استفاده می‌شود. همچنین از PCR می‌توان برای تکثیر DNA‌های به وجود آمده از RNA ها نیز استفاده نمود. نشانگرهای DNA تفاوت قابل ملاحظه‌ای با نشانگرهای پروتئینی و مورفولوژیک داشته و دارای مزایای به شرح زیر می‌باشد:
دقت و سهولت تعقیب آن‌ها.
امکان به کارگیری آن‌ها در مراحل اولیه زندگی.
فراوانی فوق العاده این نشانگرها.
امکان استفاده برنامه‌های کامپیوتری برای تجزیه و تحلیل نتایج.
عدم تاثیرپذیری از شرایط داخلی و خارجی موجود (نقوی، 1388).
2-9 واکنش رنجیره ای پلیمراز (PCR)بی تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. این تکنیک در سال 1985 به وسیله کری مولیس و همکارانش ابداع شد و اکنون کاربردهای نامحدودی در تمامی حوزه‌ها یافته است (امتیازی و کریمی، 1384). این تکنیک ساده امکان ایجاد رونوشت‌هایی نامحدود از قطعات خاصی از DNA را فراهم می‌نماید. DNA ی الگو که PCR روی آن انجام می‌گیرد، می‌تواند DNA ی ژنومی (که از گلبول‌های سفید خون یا نمونه‌ای از طحال یا هر بافت دیگری استخراج گردیده است) و یا قطعه‌ای از DNA (از هر منبعی) باشد. PCR تقریبا یک میلیون رونوشت از قطعه‌ای کوچک از DNA ی الگو ایجاد می‌نماید که این مقدار برای استفاده در هر نوع مطالعه ژنتیکی (ردیف یابی، انتقال ژن، هضم آنزیمی و غیره) کافی است. قبل از انجام PCR لازم است ردیف قطعه‌ای که باید تکثیر شود و یا حداقل ردیف هر دو انتهای آن شناسایی گردد. با استفاده از این ردیف‌ها دو قطعه چند نوکلئوتیدی که هر یک حدود 20 باز طول دارند، طراحی و ساخته می‌شود که یکی از آن‌ها مکمل پایانه '3 یکی از رشته‌های قطعه‌ای است که تکثیر خواهد شد و دیگری نیز مکمل پایانه '3 رشته دیگر می‌باشد. وجود این دو قطعه چند نوکلئوتیدی برای شروع سنتز رشته‌های جدید DNA لازم است و آن‌ها را آغازگر می‌نامند. DNA الگو، آغازگرها، مقداری دئوکسی نوکلئوتیدها شامل گوانین (G)، سیتوزین (C)، تیمین (T) و آدنین (A) در داخل تیوپ کوچکی ریخته می‌شود برای اینکه DNA الگو واسرشته شود، مخلوط واکنش را در دمای 95  درجه سانتی گراد قرار می‌دهند. آنزیم DNA پلیمراز می‌تواند دمای بالا را تحمل کند. شکل رایج این آنزیم، Taq پلیمراز است که از باکتری گرمادوست به دست می‌آید. پس از مرحله واسرشته سازی، دما به حدود 60-50 درجه سانتی گراد کاهش پیدا می‌کند تا آغازگرها به ردیف‌های مکمل مربوطه متصل شوند. این مرحله را جفت شدن می‌گویند. به محض اتصال آغازگرها، دما به حدود 70 درجه سانتی گراد افزایش می‌یابد. این دما برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز مناسب است. این مرحله بسط نامیده می‌شود. آنزیم از انتهای '3 هر آغازگر ساخت و بسط رشته جدید را آغاز می‌نماید. پس از طی زمان کافی برای ساخت رشته‌های جدید، مجددا دما به 95 درجه سانتی گراد افزایش می‌یابد و به‌این‌ترتیب چرخه‌ای جدید از واکنش آغاز می‌گردد و سه مرحله قبلی این بار روی DNA دو رشته‌ای جدید صورت می‌گیرد و این رشته‌ها خود به عنوان الگو برای چرخه‌های بعدی عمل خواهند کرد (امتیازی و کریمی، 1384). طول هر چرخه تکثیر حدود 5 دقیقه است (15 ثانیه برای واسرشته سازی، 30 ثانیه برای جفت شدن و 90 ثانیه برای بسط به علاوه حداقل زمان مورد نیاز برای تغییر دماها در بین مراحل که حدود 30 تا 60 ثانیه برای هر تغییر لازم است) (امتیازی و کریمی، 1384).
چرخه‌های تکثیر معمولا در ماشین‌های PCR که از نظر طول و دمای هر مرحله در هر چرخه دقیقا قابل برنامه ریزی و کنترل هستند، انجام می‌گردد. تعداد چرخه‌ها 30 تا 35 بار می‌باشد. نتیجه این تعداد چرخه بین 230 تا 235 رونوشت از قطعه مورد نظر است که معادل حدود یک میلیون قطعه مشابه می‌باشد (این مقدار فراورده PCR نامیده می‌شود). در عمل، این تکثیر نمایی کامل نیست ولی احتمال رسیدن به حداقل یک میلیون بار تکثیر و در نتیجه به دست آوردن یک میکروگرم فراورده PCR بسیار زیاد است (امتیازی و کریمی، 1384).
2-9-1 بافر RCRاین بافر معمولا شامل Tris با 8/8-3/8 pH = و یک نمک مثل کلرید پتاسیم (KCl) یا سولفات آمونیوم می‌باشد. این بافر می‌تواند حاوی افزودنی‌هایی مانند Tween 20، Triton X-100، DMSO (دی متیل سولفوکساید) و ژلاتین باشد که کارایی RCP را افزایش می‌دهند (فرسون و همکاران، 2000 ). این بافر معمولا به صورت 10x تهیه و همراه با آنزیم نک پلیمراز ارائه می‌گردد. غلظت مناسب آن در واکنش معمولا 1X می‌باشد. KCl به اتصال آغازگر به DNA الگو کمک می‌کند اگرچه در غلظت‌های بالا این عمل ممکن است بیش از حد مطلوب گردد و باعث پایداری اتصال غیر اختصاصی آغازگر به DNA الگو و ایجاد محصولات ناخواسته شود (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-2 کلرید منیزیم (Mgcl2)از اجزا به سیر مهم PCR است و غلظت بهینه آن در کارایی واکنش نقش مهمی دارد. با افزایش غلظت یون منیزیم (Mg+2) قدرت اتصال آغازگرها افزایش می‌یابد و به دمای اتصال بالاتری نیاز است و احتمال تشکیل پرایمر-دایمر اقزایش می‌یابد و این امر موجب اتصال آغازگرها به صورت دوتایی با یکدیگر یا به صورت حلقوی با خودشان شده و در اثر تکثیر غیر اختصاصی آن‌ها، تجمعی از قطعات کوچک به وجود می‌آید. مقداری از آغازگرها نیز بدین ترتیب از واکنش خارج می‌شوند. افزایش غلظت یون منیزیم موجب افزایش دمای مرحله واسرشته سازی و افزایش فعالیت پلیمرازی آنزیم تک پلیمراز (این آنزیم برای فعالیت پلیمرازی خود به یون آزاد Mg+ نیاز دارد) می‌شود. همچنین یون منیزیم با نوکلئوتیدها ترکیب می‌شود و کمپلکس محلولی را به وجود می‌آورد که برای ورود و جایگزین شدن آن‌ها در زنجیره DNA بسیار لازم است. در صورتی که در غلظت‌های بسیار پایین بازده واکنش کم خواهد شد. غلظت منیزیوم آزاد تحت تاثیر غلظت dNTP ها، پیروفسفات آزاد (PPi) و EDTA می‌باشد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-3 دی اکسی نوکلئوتیدها (dNTPs)نوکلئوتیدها واحدهای سازنده DNA هستند و از مواد مهم مورد نیاز واکنش PCR می‌باشند. آنزیم‌های DNA پلیمراز ساخت زنجیره پلی نوکلئوتیدی را از این مونومرها یا واحدها کاتالیز می‌کنند. در واکنش PCR نیز همانند سنتز طبیعی DNA از چهار نوع نوکلئوتید به فرم دی اکسی (dTTP، dGTP، dCTP، dATP) استفاده می‌شود. این نوکلئوتیدها معمولا به طور جداگانه یا مخلوط به صورت تجاری در دسترس هستند. باید از غلظت برابر نوکلئوتیدها استفاده شود در غیر این صورت اشتباه جایگزینی رخ می‌دهد و ممکن است باعث تفاوت توالی فرآورده PCR با توالی الگو شود. کیفیت و مقدار dNTP مورد استفاده در کارایی و اختصاصی بودن PCR موثر است. چنانچه مقدار dNTP بیشتر از نیاز واکنش باشد امکان تشکیل نقاط آغازین اشتباه و تشکیل قطعات غیر اختصاصی وجود دارد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-4 آنزیم تک پلیمرازاین آنزیم به شکل طبیعی یا نوترکیب تولید می‌شود و از سایر انواع DNA پلیمرازها معروف‌تر است و بیشتر از آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آنزیم با شناسایی انتهای آزاد هیدروکسیل '3 آغازگر، نوکلئوتیدها را به ترتیب ارائه شده از روی زنجیره مکمل به آن متصل می‌کنند و یک رشته DNA مکمل رشته الگو می‌سازد. سرعت اتصال نوکلئوتیدها و حرکت آنزیم پلیمراز در انواع مختلف این آنزیم متفاوت بوده و بین 5 الی 80 نوکلئوتید در ثانیه می‌باشد. اگر غلظت آنزیم زیاد باشد قطعات غیراختصاصی در فراورده PCR دیده خواهد شد که گاهی به صورت کشیدگی مشاهده می‌شود و در صورتی که مقدار آنزیم کمتر از حد مورد نیاز واکنش باشد، فرآورده مورد نظر به اندازه کافی تولید نمی‌شود و به ویژه در موارد تشخیصی نتایج منفی کاذب را به وجود می‌آورد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-5 آغازگرهادر طی واکنش PCR، آغازگرها به دو طرف توالی هدف اتصال یافته و امکان آغاز فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می‌آورند. مهم‌ترین ویژگی آغازگر، توالی صحیح آن برای مکان مورد تکثیر می‌باشد. با در اختیار داشتن توالی هدف امکان تعیین توالی آغازگرها به وجود می‌آید. طول آغازگر نیز مهم است و طول مناسب از اتصال آغازگر به مناطق غیر هدف می‌کاهد. طویل بودن پرایمر (پرایمرهای با بیش از 30 جفت باز) امکان اتصال آن‌ها به خود و به یکدیگر را تشدید می‌کند و زمان اتصال را نیز افزایش می‌دهد. در طراحی آغازگرها نکات متعددی مانند طول آغازگر، ترکیب نوکلئوتیدی (محتوای GC)، دمای ذوب (Tm) و غیره را باید در نظر داشت (فرسون و همکاران، 2000 ). برای طراحی آغازگرها نرم افزارهای متعددی وجود دارد که می‌توان به DNA MAN، DNASIS و Oligo tech اشاره نمود.
2-10 چند شکلی فضایی رشته‌های منفردSSCP) )این روش در سال 1989 ابداع شد. در الکتروفورز SSCP، ابتدا از یک ماده واسرشته ساز مانند اوره استفاده می‌شود تا DNA ی دو رشته به DNA ی تک رشته‌ای تبدیل شود. به هنگام راندن DNA ی تک رشته‌ای روی ژل اثرات متقابل درون مولکولی روی می‌دهد. به عبارت دیگر بین بخش‌هایی از این DNA پیوند ایجاد می‌شود و ساختمان ثانویه‌ای تشکیل می‌دهد. بنابراین حرکت مولکول‌های DNA در این حالت به جای اینکه تابع اندازه مولکول باشد به ساختمان ثانویه DNA ی تک رشته‌ای بستگی دارد. در طی الکتروفورز، این ساختمان‌ها که به توالی رشته مورد نظر بستگی دارد به وسیله برودت حفظ می‌شود. اگر در این توالی جهشی رخ داده باشد، نوع پیوندهایی که تشکیل می‌شوند متفاوت بوده و باند مربوطه روی ژل نیز متفاوت خواهد بود. در صورتی که چند شکلی در قسمت ابتدائی محصول PCR باشد، تشخیص آن از طریق SSCP آسان‌تر است. عواملی مثل دمای ژل (نباید بالا باشد)، درصد ژل اکریل آمید (5 تا 6 درصد مناسب است) و اندازه قطعه DNA مورد بررسی (معمولا بین 100 تا 250 جفت باز و ایده آل 155 جفت باز) در موفقیت SSCP نقش دارد (رضوانی، 1997).
2-11 مروری بر برخی پژوهش‌های انجام شده:طبق مطالعات انجام شده مشخص شد که ساختار ژن هورمون رشد در بین ماهیان استخوانی یکسان نیست. به طور مثال، در کپور ماهیان همانند پستانداران، این ژن دارای پنج اگزون و چهار اینترون است اما در دیگر ماهیان متفاوت بوده و دارای یک اگزون اضافی است (اهکوبو و همکاران، 1996). جهش‌های موجود در نواحی مختلف ژن‌ها همواره مورد توجه بسیاری از متخصصان علم اصلاح نژاد بوده است. ارتباط چند شکلی این ژن‌ها با خصوصات فنوتیپی برای مثال رشد به طور وسیعی در دیگر حیوانات مورد بررسی قرار گرفته و مطالعاتی محدود نیز در مورد ماهی انجام شده است (گروس و نیلسون، 1999).
طبق پژوهش‌های گروس و نیلسون (1999) تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان مورد بررسی قرار گرفت. تعداد نمونه‌های مورد بررسی در این پژوهش 579 ماهی از 22 جمعیت مختلف بود که از شمال اروپا تهیه و به روش PCR-RFLP و با استفاده از 10 نوع آنزیم تنوع این ژن مورد مطالعه قرار گرفت که سه نوع هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد.
اندازه‌های چهار اگزون در طول دوره تکامل بدون تغییر باقی مانده‌اند به جز اگزون 5 که به دو قسمت تبدیل شده است به طوری که دو نوع ساختار ژن هورمون رشد را در ماهیان استخوانی به وجود آورده است. برای مثال، خانواده کپور ماهیان دارای پنج اگزون و گونه‌های دیگر همانند آزاد ماهیان و سوف ماهیان دارای شش اگزون می‌باشند (آلمولی و همکاران، 2000). در ضمن، در ماهیان دو نوع متفاوت از ژن هورمون رشد شامل GH-1 و GH-2 برای مثال در ماهیانی نظیر آزاد اطلس نیز گزارش شده است (تائو و بولدینگ، 2003).
این ژن به صورت موفقیت آمیزی در گونه سیم دریایی (کالدوچ گینر و همکاران، 2003) و ماهی تیلاپیا (کاجیمورا و همکاران، 2004) و چندین گونه دیگر کلون شده است. ولی در خصوص چندشکلی این ژن و ارتباط آن با میزان رشد در ماهیان گزارشی مشاهده نشده است. در حیوانات دیگر پژوهش‌های زیادی به عمل آمده است که ارتباط بسیار زیاد این ژن با میزان رشد فنوتیپی را نشان می‌دهد.
پریمر و رینانن (2004) در پژوهشی تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان را به روش PCR-RFLP بررسی و SNP را شناسایی کردند. از تعداد 9 جمعیت مختلف شامل 2 جمعیت از شمال آمریکا و 7 جمعیت در اروپا نمونه برداری شده بود. چند شکلی مشاهده شده در مناطق بالا دست و پایین دست ژن هورمون رشد، اینترون 3 و اینترون 4 نشان دهنده اختلاف بین جمعیت‌های آمریکای شمالی و اروپا بود.
مو و همکاران (2004) در هفت جمعیت کپور وحشی، هفت نوع الگو (A، B، C، D، E، F و G) در ناحیه اینترون 2 ژن GH-1 به روش PCR-SSCP شناسایی کردند که طول آن‌ها به ترتیب 189، 196، 204، 205، 206، 207 و bp 209 بود.
کوخر و کهلمن (2011) چندشکلی‌های ژن هورمون رشد در لای ماهی از خانواده کپور ماهیان را بررسی کردند. پژوهش‌های آن‌ها نشان داد این ماهی مانند همه کپور ماهیان دارای چهار اینترون و پنج اگزون می‌باشد و با دو روش PCR-RFLP و تعیین توالی، اختلاف موجود در ساختار ژنتیکی ژن هورمون رشد در تعداد 17 نمونه از دو جمعیت مختلف مورد بررسی قرار دادند. از 14 چندشکلی مشاهده شده از 12 جایگاه در منطقه اینترون و 2 جایگاه در منطقه اگزون، در مجموع 13 هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد که کل جمعیت را به دو کلاس اروپای شرقی و اروپای غربی تقسیم نمود.
نی و همکاران (2012) در یک جمعیت از ماهی کراکر زرد، نتایج PCR-SSCP دو هاپلوتیپ از اینترون 1 را به نام ژنوتیپ های AA و AB نشان دادند. در AB، یک چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) در موقعیت 196 (G→A) مشاهده شد که با وزن بدن همبستگی منفی و با طول/ ارتفاع استاندارد بدن همبستگی مثبت داشت. در جمعیت دیگر، دو ژنوتیپ مختلف CC و CD در اینترون 2 شناسایی شدند که در CD یک SNP در موقعیت 692 (T→C) مشخص شد. ژنوتیپ CD همبستگی مثبت قابل توجهی با وزن کل و طول بدن داشت.
تیان و همکاران (2014) چندشکلی ژن GH و ارتباط آن با صفات رشد را در 282 نمونه ماهی سوف چینی مورد بررسی قرار دادند. با استفاده از توالی‌یابی، چهار SNP در ژن GH شناسایی شد که دو جهش در اینترون 4، یک جهش در اگزون 5 و یک جهش در اینترون 5 رخ داده بود که سه جهش از آن‌ها ارتباط مثبت معنی داری را با رشد نشان دادند.

فصل سوممواد و روش‌ها3-1 نمونه بردارینمونه برداری از 150 قطعه ماهی سفید از کارگاه شهید رجایی و 150 قطعه ماهی کپور معمولی از کارگاه پرورش ماهی نصر ساری انجام شد. ماهی سفید از دوره هچری به سالن تکثیر منتقل و تا 3 ماهگی نگهداری شدند. سپس از آن‌ها نمونه گیری شد و تمامی آن‌ها در سن 3 ماهگی بودند ولی در ماهی کپور 84 قطعه از آن‌ها در سن 4 ماهگی، 54 قطعه در سن 12 ماهگی، 5 قطعه ماهی در سن 24 ماهگی و 7 قطعه ماهی در سن 6 ماهگی بودند. نمونه گیری به میزان 3-2 گرم از بافت باله دمی ماهی سفید و کپور معمولی انجام شد. نمونه‌های باله دمی در الکل 96 درصد فیکس شده و سپس تا زمان استخراج DNA در دمای 20- درجه سانتیگراد قرار داده شدند. نمونه‌های جمع آوری شده به آزمایشگاه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی دام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل شده و DNA ژنومی استخراج گردید.
3-2 بررسی فاکتور وضعیتیکی از شاخص‌های رشد فاکتور وضعیت است که ضریب چاقی نیز نامیده می‌شود. برای به دست آوردن آن طول کل که فاصله پوزه تا انتهای باله دمی است؛ بر حسب سانتی متر اندازه گیری شد. وزن ماهی نیز به وسیله ترازو دیجیتالی بر حسب گرم اندازه گیری شد. فاکتور وضعیت یا ضریب چاقی برابر است با:
CF= W/L3 *100
W: وزن و L: طول بدن می‌باشد.
3-3 استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافتهاستخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته (میلر و همکاران، 1988) انجام شد. قبل از شروع استخراج تمام بافرها تهیه و مواد و وسایل مورد نیاز برای استخراج آماده و جهت ضدعفونی اتوکلاو شد.
3-3-1 طرز تهیه بافرهای استخراج DNA برای تهیه بافر STE 7/0 گرم تریس، 2/0 گرم نمک 07/0 مولار را با cc50 آب مقطر حل کرده، سپس 100 میکرولیتر محلول EDTA 5/0 مولار به آن اضافه می‌شود. برای تهیه EDTA 5/0 مولار، 3/9 گرم پودر EDTA را با cc50 آب مقطر حل کرده و pH آن به 8 می‌رسد، برای تنظیم pH از دستگاه pH متر، برای کاهش pH از HCl و برای افزایش pH از NaoH استفاده می‌شود. برای تهیه SDS و استات آمونیوم 10% بایستی به نسبت 1 به 10 پودر آن با آب مقطر حل شود. برای تهیه استات سدیم 3 مولار، بایستی 3/12 گرم پودر آن با cc 50 آب حل شود.
سی میلی گرم از باله را جدا کرده و در محیط بیرون قرار داده تا الکل آن تبخیر شود، سپس آن را خرد نموده و در تیوپ‌های 5/1 میلی لیتری ریخته و به آن 500 میکرولیتر بافر STE برای انفجار سلولی، 50 میکرولیتر بافر SDS 10% برای هضم چربی‌های موجود در بافت و 6-5 میکرولیتر پروتئیناز K برای هضم پروتئین‌ها اضافه شد. سپس نمونه‌ها را به خوبی ورتکس کرده و به مدت یک ساعت روی دستگاه شیکر با سرعت 90 قرار داده تا این مواد به طور کامل با هم مخلوط گردد و در نهایت به مدت 16 ساعت در بن ماری با دمای 58 درجه سانتی گراد گذاشته تا بافرها بهتر عمل کرده و عمل لیز شدن و هضم آنزیمی به خوبی انجام شود. پس از بیرون آوردن آن‌ها از بن ماری 160 میکرولیتر استات آمونیوم 10% به نمونه‌ها اضافه نموده و به مدت یک ساعت روی شیکر با سرعت 90 قرار داده شد تا خوب مخلوط شود و بعد به مدت 10 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. پس از پایان سانتریفیوژ دو فاز درون تیوپ تشکیل می‌شود، فاز زیرین حاوی بافت خرد شده باله و چربی و پروتئین بافت است و فاز بالایی حاوی DNA می‌باشد. به آرامی فاز بالایی را جدا کرده و درون تیوپ‌های جدید ریخته شد. به مایع درون تیوپ‌های جدید 600 میکرولیتر الکل ایزوپروپانول یا الکل مطلق سرد و 30 میکرولیتر استات سدیم اضافه شده (در این حالت کلاف شفافی در تیوپ قابل مشاهده است که همان DNA می‌باشد). سپس نمونه‌ها به مدت 40-30 دقیقه در یخچال C°20- نگهداری شده، بعد به مدت چند دقیقه از یخچال بیرون آورده تا یخ آن آب شود. نمونه‌ها را به مدت 15 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ کرده، سپس محلول را دور ریخته و تیوپ حاوی DNA را با 100 میکرولیتر الکل 70% شستشو داده و به مدت 2 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. مجددا محلول رویی را دور ریخته و تیوپ‌ها در دمای آزمایشگاه کاملا خشک شده و سپس 50 میکرولیتر آب مقطر یا بافر TE به تیوپ حاوی DNA اضافه نموده و در یخچال C°20- تا زمان ازمایش نگهداری شدند.
3-4 تعیین ویژگی‌های کمی و کیفی DNA استخراج شده:به منظور تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده دو روش استفاده می‌شود:
الف) ژل آگارز.
ب) دستگاه اسپکتروفتومتر.
در این پژوهش به منظور بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از ژل آگارز استفاده شد.
3-4-1 ژل آگارز آگارز یک پلیمر خطی است و از زیر واحدهای L ,D گالاکتوز که با پیوندهای گلیکوزیدی 3→1α و 4→1β به یکدیگر پیوسته‌اند، درست شده است. برخی از آگارزها دارای اندکی ناخالصی آنیونی همچون سولفات و پیروات هستند. هر چه ناخالصی ژل کمتر باشد توان آن برای جداسازی DNA بیشتر می‌شود. اندازه روزنه‌ها در زمینه ژل به غلظت آگارز وابسته است. به گونه‌ای که در غلظت زیاد آگارز، روزنه‌ها کوچک می‌شوند. با توجه به غلظت‌های آگارز می‌توان تکه‌هایی از 5/0 تا 50 کیلو باز جدا سازی کرد. اندازه مولکول‌های DNA، غلظت آگارز، ساختار فضایی DNA، ولتاژ بکار رفته شده، نوع آگارز و توان یونی بافر الکتروفورزی که به کار گرفته می‌شود، از سازه‌های کارآمد برای جدا سازی DNA در ژل آگارز هستند (لی و همکاران، 2012).
شکل 3-1 دستگاه الکتروفورز افقی3-4-2 رنگ آمیزی ژل آگارز در این پژوهش رنگ آمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید انجام پذیرفت. اتیدیوم بروماید یک رنگ فلورسانت است که دارای یک گروه سه حلقه‌ای بوده که می‌تواند در بین بازهای DNA جای گیرد. روش کار به‌این گونه است که پرتو فرابنفش به وسیله اسید نوکلئیک گرفته شده و به اتیدیوم بروماید می‌رسد. این پرتو در طول موج 302 تا 366 نانومتر به وسیله اتیدیوم بروماید پیوسته به اسیدنوکلئیک دریافت شده و دوباره به وسیله اتیدیوم بروماید در طول موج 590 نانومتر بازتاب می‌یابد. این طول موج در گستره روشنایی سرخ نارنجی پرتویی آشکار می‌باشد که می‌توان آن را دید. برای انجام این کار مقدار 3 میکرو لیتر دیانای و 2 میکرولیتر بافر بارگذاری را روی کاغذ پارافیلم با هم مخلوط کرده و داخل چاهک ژل آگارز قرار داده شد. بعد از بار گذاری تانک الکتروفورز را به یک منبع الکتریکی وصل کرده و ولتاژ دستگاه را روی 85 ولت تنظیم شد. نمونه‌ها به مدت 60 تا 90 دقیقه درون ژل آگارز موجود در تانک در حرکت بودند. سپس ژل را از داخل تانک الکتروفورز برداشته و به مدت 5 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و جهت مشاهده باندها و تعیین کیفیت دیانای، از دستگاه ژل داک استفاده شد. اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری در جدول 3-1 نشان داده شد (لی و همکاران، 2012).
جدول 3-1 اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاریمواد استفاده شده مقدار مواد (میکرولیتر)
گلیسرول
برموفنول آبی (10 درصد)
فرمامید
EDTA(5/0 مولار) 190
10
800
2
3-5 تعیین غلظت DNA استخراج شده با استفاده از اسپکتوفتومتربرای بررسی غلظت DNA استخراج شده از دستگاه اسپکتوفتومتر استفاده شد. برای این منظور ابتدا میزان رقت DNA مشخص شد (مثلاً 100 برابر یا بیشتر). دستگاه برای دو طول موج 260 و 280 نانومتر تنظیم و به تعداد نمونه لوله استریل در آماده شد. با توجه به حجم کووت دستگاه و میزان رقت در لوله‌ها از بافر TE یا آب مقطر استفاده و DNA مورد نیاز به لوله‌ها اضافه شد (با توجه به ضریب رقت). ابتدا دستگاه با بافر TE یا آب مقطر کالیبره شد. لوله حاوی DNA رقیق شده چند بار وارونه شد. کووت دستگاه که برای بررسی غلظت DNA از آن استفاده می‌شود با بافر TE یا آب مقطر شسته می‌شود. DNA رقیق شده موجود در لوله را در کووت دستگاه قرار داده و OD های 260 و 280 نانومتر به اضافه نسبت دو طول موج یاداشت شد (OD260 مربوط به جذب DNA و OD280 مربوط به جذب پروتئین می‌باشد). اگر این نسبت کمتر از 8/1 باشد نشان دهنده آلودگی با پروتئین و یا دیگر ناخالصی‌ها می‌باشد و اگر این نسبت بیشتر از 2 باشد نشان دهنده آلودگی DNA با RNA است. برای به‌دست آوردن غلظت DNA مورد نظر از فرمول زیر استفاده شد.
ضریب رقت
*عدد بدست آمده غلظت DNA استخراج شده بر حسب نانو گرم بر میکرو لیتر می‌باشد که بسته به مقدار نیاز در واکنش PCR از آن استفاده می‌شود.
3-6 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)3-6-1 پروتکل و مواد استفاده شده در PCR
مواد مورد نیاز برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلی مراز برای نشانگر استفاده شده در این تحقیق در جدول 3-2 نشان داده شد:
جدول 3-2 مواد استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمرازمواد غلظت مواد مقدار در حجم 20 میکرولیتر
دیانای الگو
آغازگر (*F)
آغازگر (**R)
مستر میکس***
آب مقطر 120 نانوگرم
20 پیکومول
20 پیکومول
-


- 5/1
1
1
10
5/6
*Forward **Backward ***Master Mix
3-6-2 مراحل PCRقبل از انجام پی سی آر، آغازگرها با توجه به دستور العمل شرکت سازنده آن‌ها با میزان آب مقطر مشخص شده بر حسب میکرولیتر رقیق شدند تا غلظت آن‌ها به 100 پیکومول برسد. سپس به مدت 24 ساعت در شرایط یخچال نگهداری شدند تا کاملا حل شوند. سپس تیوب‌های مورد استفاده بعد از استریل کردن، شماره خورده و به منظور جلوگیری از پاک شدن شماره‌ها برچسب نصب شدند. تمام اجزای واکنش (به غیر از DNA که در تیوپ‌های جداگانه ریخته شدند) با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده برای پی سی آر به صورت مخلوط در تیوب جدا گانه ریخته شدند. لازم به ذکر است که در تهیه مخلوط اصلی واکنش، با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده در پی سی آر یک ضریب خطا در نظر گرفته شد. بعد از تهیه مخلوط اصلی، مقدار 5/18 میکرولیتر از آن، به هر یک از تیوپ‌های حاوی 5/1 میکرو لیتر DNA افزوده شده تا حجم کل مخلوط واکنش در هر تیوب به 20 میکرو لیتر برسد. به منظور مخلوط شدن اجزای تشکیل دهنده واکنش، تیوب‌ها به مدت 15 ثانیه و با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. بعد از سانتریفوژ تیوپ‌ها برای انجام پی سی آر در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شدند.

شکل 3-2 دستگاه ترموسایکلر3-6-3 تنظیم سیکل‌های حرارتی PCR
همانند سازی و تکثیر توالی مورد نظر در پی سی آر در طی سه مرحله انجام می‌پذیرد:3-6-3-1 واسرشته سازی قطعه الگو
پیوندهای هیدروژنی که در واقع اتصال دهنده دو رشته DNA هستند در دمای 95-93 درجه سانتی‌گراد تخریب می‌شوند بنابراین در این حرارت دو رشته DNA الگو از هم جدا می‌شوند. پس از تک رشته‌ای شدن DNA الگو، آغازگر و سایر مواد شرکت کننده در واکنش، فعالیت خود را آغاز می‌کنند.

–371

1-5-1-5- نسبت هیدروکسی به سیلیس در ژل...............................................................................25
1-5-1-6 منبع سیلیس ...................................................................................................................25
1-5-2- تاثیر پارامترهای مختلف بر مورفولوژی زئولیت...................................................................26
1-5-3-سنتز ZSM-5 در حضور آمین ..........................................................................................26
1-5-4- سنتز زئولیت ZSM-5 در حضور الکل .............................................................................27
1-6-طیف بینی جذب مادون قرمز ...............................................................28
1-6-1- ناحیه مادون قرمز .............................................................................................................29
1-6-2- طیف بینی مادون قرمز تبدیل فوریه....................................................................................31
1-6-3- نمونه گذاری در طیف سنجی مادون قرمز.........................................................................32
1-7- طیف سنجی انعکاسی پخشی...............................................................33
1-8- طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته NMR.......................................34
1-8-1- طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته ای تبدیل فوریه تپشی ..............................................37
1-8-2- قاعده شکاف اسپین- اسپین...............................................................................................37
1-8-2-1- هسته کربن -13 .........................................................................................................38
1-8-2-2- تغییرات مکانی کربن -13...........................................................................................38
1-9 شیمی سنجی ......................................................................................39
1-9-1- طراحی ازمایش...............................................................................................................40
1-9-1-1- تعریف فرایند .............................................................................................................40
1-9-1-2- غربال کردن................................................................................................................40
1-9-1-3- انواعی از روش های طراحی فاکتورها ........................................................................41
1-9-1-4- بهینه سازی..................................................................................................................41
1-9-1-5- کاهش زمان بری......................................................................................................... 41
1-9-1-6- مدل سازی کمی ..........................................................................................................42
1-9-1-7-روش سطح پاسخ..........................................................................................................42
1-9-2- پردازش های چند متغیره....................................................................................................43
1-9-2-1- آنالیز فاکتوری............................................................................................................. 44
1-9-2-2- آنالیز فاکتوری تکاملی (EFA) .....................................................................................44
1-9-2-3- روش های انالیز نرم.......................................................................................................45
1-9-2-4- تکنیک منحنی چند متغیره –حداقل مربعات متناوب MCR-ALS..................................45
1-9-2-5- الگوریتم اجرای تکنیک MCR-ALS...........................................................................47
فصل دوم : بخش تجربی
2-1 مواد مورد استفاده .........................................................................................49
2-1-1- مواد مورد استفاده برای سنتز سورفکتنت متقارن و نامتقارن.................................................49
2-1-2- مواد مورد استفاده برای سنتز نانو شیت زئولیت ZSM-5....................................................49
2-1-3- مواد مورد استفاده برای اصلاح نانو شیت زئولیت با نافلزی نظیر فسفر ................................50
2-3-نرم افزارها .........................................................................................................................................51
2-4- سنتز سورفکتنت نامتقارن..............................................................................52
2-5- سنتز سورفکتنت متقارن...........................................................................................53
2--6 سنتز نانو شیت ZSM-5.................................................................................54
2-7- اصلاح نانوشیت ZSM-5 با فسفر ...................................................................58
2-8- روش های خصوصیت سنجی نانو شیت های سنتز شده ................................61
2-8-1-تجزیه و تحلیل به وسیله پراش پرتو -X.............................................................................61
2-8 -2-میکروسکوپ الکترونی روبشی .......................................................................................62
2-8-3- میکروسکوپ الکترونی عبوری........................................................................................63
2-8-4- انالیز ساختارتخلخل ها و اندازه گیری مساحت سطح از طریق جذب گاز N2 ...................64
2-8-5-خصوصیت سنجی با طیف سنجی مادون قرمز ...................................................................64
فصل سوم : نتایج و بحث
3-1- نتایج CNMR13 سورفکتنت های سنتز شده ............................................65
3-2- نتایج انالیز XRD وSEM برای نانو شیت سنتز شده با سورفکتنت متقارن و نامتقارن...................69
3-3- نتایج خصوصیت سنجی نانو شیت زئولیت با میکروسکوپ الکترونی روبشی ...........................71
3-4 نتایج خصوصیت سنجی نانو شیت زئولیت با میکروسکوپ الکترونی عبوری ..............................76
3-5 نتایج خصوصیت سنجی با پراش پرتو -X.............................................................................77
3-6- نتایج طراحی آزمایش .......................................................................................................82
3-6-1- آنالیز واریانس ...........................................................................................................................82
3-6-2- نمودار پارتو ..............................................................................................................................83
3-6-3- تاثیر فاکتورهای اصلی ...............................................................................................................84
3-6-4- ضریب رگرسیون بر اورد شده ..................................................................................................85
3-6-5- پاسخ بهینه ..................................................................................................................................87
3-7- نتایج انالیز نانو شیت سنتز شده با شرایط بهینه ............................................................92
3-8- نتایج جذب فسفر .....................................................................................................95
3-9- استفاده از طیف سنجی IR و روش تفکیک منحنی چند متغیره با کمترین مربعات تناوبی برای تحلیل روند سنتز نانو شیت زئولت ZSM-5................................................................96
3-10-نتیجه گیری ...........................................................................................................100
3-11-پیشنهادها ...............................................................................................................101
فهرست منابع و ماخذ.................................................................................................................................103
فهرست جدوال ها
عنوانصفحه
جدول 1-1: مثال های نانو مواد و اندازه ی آن ها ......................................................................5
جدول 2-1: مقدار بیشینه و کمینه فاکتورهایدر طراحی آزمایش................................................56
جدول 2-2: نتایج طراحی آزمایش ..........................................................................................57
جدول 3-1: نتایج ضخامت لایه های بدست امده به روش نرم افزاری .......................................76
جدول 3-2:آنالیز واریانس برای پاسخ.......................................................................................83
جدول 3-3 : ضریب رگرسیون براورد شده برای پاسخ ..............................................................86
جدول 3-4: شرایط بهینه محاسبه شده توسط نرم افزار.................................................................91
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
1-1: انواع سیلیکا بر اساس اندازه .................................................................................................8
1-2: دسته بندی آیوپاک بر اساس اندازه حفره ............................................................................8
1-3: نوع تخلخل ها براساس شکل و موقعیت ..............................................................................9
1-4:نانو حفره های تولید شده در الومینا ......................................................................................10
1-5: محصولات قابل تولید با فرایند سل ژل................................................................................11
1-6: شمایی از سنتز هیدروترمال ................................................................................................13
1-7: سنتز زئولیت ZSM-5 به روش فضای محبوس ...................................................................15
1-8: شمایی از روند سنتز نانو ذرات با استفاده از روش میکرو امولسیون ......................................16
1-9: برخی از زئولیت های رایج ................................................................................................18
1-10: ساختار کانالی زئولیت ZSM-5.......................................................................................20
1-11: مکانیسم هسته زایی زئولیت ZSM-5 ..............................................................................21
1-12: طرز قرار گرفتن سورفکتنت در کانال های زئولیت ..........................................................23
1-13:مکانیسم عمومی سنتز زئولیت ..........................................................................................28
1-14: شمایی از یک طیف مادون قرمز .....................................................................................30
1-15: تصویر طیف سنجی تبدیل فوریه ....................................................................................31
1-16: شمایی از بازتابش ها در مادون قرمز ...............................................................................33
1-17: مکانیسم ایجاد بازتابش انعکاسی – پخشی .......................................................................34
1-18: حالت های اسپین انرژی..................................................................................................35
1-19:شمایی از یک میدان مغناطیسی ثانویه در اتم ....................................................................36
1-20: نمونه ای از شکاف اسپین –اسپین ...................................................................................37
1-21: تغییرات مکان شیمیایی کربن ..........................................................................................38
2-1: مکانیسم سنتز سورفکتنت نامتقارن ................................................................................... 53
2-2:مکانیسم سنتز سورفکتنت متقارن .......................................................................................54
2-3: نحوه ی تبادل سورفکتنت با سطح زئولیت .........................................................................60


2-4: نمونه ای از طیف XRD برای نانو شیت زئولیت ZSM-5....................................................62
2-5 : برهمکنش پرتوی الکترونی و نمونه...................................................................................63
3-1: ساختار دابکو ....................................................................................................................65
3-2: ساختار C6-D ...................................................................................................................66
3-3: ساختار سورفکتنت نامتقارن ..............................................................................................66
3-4: طیف CNMRبرای سورفکتنت نامتقارن ...........................................................................67
3-5: ساختار سورفکتنت متقارن ................................................................................................68
3-6: طیف CNMRبرای سورفکتنت متقارن .............................................................................69
3-7: الگوی پراش X برای نانو شیت زئولیت با استفاده از سورفکتنت نامتقارن ............................69
3-8: تصویر SEM برای سورفکتنت نامتقارن ............................................................................70
3-9: الگوی پراش X برای نانو شیت زئولیت با استفاده از سورفکتنت متقارن...............................70
3-10: تصویر SEM برای سورفکتنت متقارن.............................................................................71
3-11: تصویر SEM برای Run1...............................................................................................72
3-12: تصویر SEMبرای Run2...............................................................................................72
3-13: تصویر SEMبرای Run3...............................................................................................73
3-14: تصویر SEM برای Run5...............................................................................................73
3-15: تصویر SEMبرای Run6...............................................................................................74
3-16: تصویر SEMبرای Run7...............................................................................................74
3-17: تصویر SEMبرای Run9...............................................................................................75
3-18: تصویر SEMبرای Run14............................................................................................75
3-19: تصویر MET برای Run1.............................................................................................76
3-20:الگوی پراش پرتو Xاستاندارد...........................................................................................77
3-21:الگوی XRDبرای Run1.................................................................................................78
3-22:الگوی XRDبرای Run2.................................................................................................78
3-23:الگوی XRDبرای Run3.................................................................................................79
3-24:الگوی XRD برای Run5.................................................................................................79
3-25:الگوی XRDبرای Run6.................................................................................................80
3-26:الگوی XRD برای Run7.................................................................................................80
3-27:الگوی XRDبرای Run9................................................................................................81
3-28:الگوی XRDبرای Run14..............................................................................................81
3-29:تصویر SEMبرای نانو شیت سنتز شده با شرایط اصلاح شده .............................................92
3-30: تصویرTEM برای نانو شیت زئولیت سنتز شده با شرایط اصلاح شده................................93
3-31:نمودار جذب فسفر ................................................................................................ ........96
3-32: شمای از مکانیسم زئولیت ZSM-5................................................................ ..............97
3-33: طیف IRنانو شیت زئولیت ZSM-5..............................................................................98
3-34: پروفایل طیفی و غلظتی به دست آمده از روش MCR-ALS.......................................99
نمودار ها
عنوان صفحه
نمودار 1-1: تاثیر الومینیوم موجود در ژل سنتزی بر کریستال شدن ZSM-5 ................................22
نمودار 3-1 : نمودار پارتو .......................................................................................................... 84
نمودار 3-2:نمودار فاکتور های اصلی برای پاسخ ....................................................................................85
نمودار3-3: نمودار باقی مانده برای پاسخ .....................................................................................87
نمودار 3-4: نمودار سطح مربوط به متغیر های --plate/SiO2 و SiO2/Al2O3....................88
نمودار 3-5: نمودار سطح مربوط به متغیر های --plate/SiO2 و H2O/SiO2.......................88
نمودار 3-6: نمودار سطح مربوط به متغیر های --plate/SiO2 و زمان (aging time)...........89
نمودار 3-7: نمودار سطح مربوط به متغیر های SiO2/Al2O3و H2O/SiO2...............................89
نمودار 3-8: نمودار سطح مربوط به متغیر های SiO2/Al2O3و زمان واکنش........................ .....90
نمودار 3-9: نمودار سطح مربوط به متغیر های H2O/SiO2 و زمان واکنش.................... ...........90
نمودار3-10: نمودار BET .........................................................................................................94
نمودار3-11: نمودار جذب N2 که از انالیز BETبدست امده ............................................ ..........94
نمودار3-12: نمودار BJHاز انالیز BETبدست امده ...................................................................95
این پایان نامه را ضمن تشکر و سپاس بیکران و در کمال افتخار و امتنان تقدیم می نمایم به:
محضر ارزشمند پدر و مادر عزیزم به خاطر همه ی تلاشهای محبت آمیز ی که در دوران مختلف زندگی ام انجام داده اند و بامهربانی چگونه زیستن را به من آموخته اند.
به همسر مهربانم که در تمام طول تحصیل همراه و همگام من بوده است.

به استادان فرزانه و فرهیخته ای که در راه کسب علم و معرفت مرا یاری نمودند.

به آنان که در راه کسب دانش راهنمایم بودند .
به آنان که نفس خیرشان و دعای روح پرورشان بدرقه ی راهم بود.
الها به من کمک کن تا بتوانم ادای دین کنم و به خواسته ی آنان جامه ی عمل بپوشانم .
پروردگارا حسن عاقبت ، سلامت و سعادت را برای آنان مقدر نما .
نخستین سپاس و ستایش از آن خداوندی است که بنده کوچکش را در دریای بیکران اندیشه، قطره ای ساخت تا وسعت آن را از دریچه اندیشه های ناب آموزگارانی بزرگ به تماشا نشیند. لذا اکنون که در سایه سار بنده نوازی هایش پایان نامه حاضر به انجام رسیده است، بر خود لازم می دانم تا مراتب سپاس را از بزرگوارانی به جا آورم که اگر دست یاریگرشان نبود، هرگز این پایان نامه به انجام نمی رسید.
ابتد ا از استاد گرانقدرم آقای دکتر امیر باقری گرمارودی که زحمت راهنمایی این پایان نامه را بر عهده داشتند، کمال سپاس را دارم.
از استاد عالی قد رم جناب آقا ی دکتر محمد رضا خانمحمدی خرمی که زحمت مشاوره این پایان نامه را متحمل شدند، صمیمانه تشکر می کنم.
سپاس آخر را به مهربانترین همراهان زندگیم، به پدر، مادر و همسر عزیزم تقدیم می کنم که حضورشان در فضای زندگیم مصداق بی ریای سخاوت بوده است
s
فصل اول
مروری بر منابع
1-1-نانو مواد
هنگامی که گروهی از اتم ها تجمع کرده و چند خوشه نانو متری را تشکیل دهند‍، زمینه تشکیل ذرات نانو فراهم شده و از هم پیوستن چند خوشه نانو متری ذرات نانو تشکیل می گردند. مقیاس نانو به هر ماده ای با اندازه مشخص گفته شده، که در علم نانو و فناوری نانو استفاده می شود. چشم غیر مسلح قادر به دیدن اجسام نانو متری نمی باشد؛ بنابراین به فناوری خاصی برای مشاهده این اجسام نیاز است. پیشوند نانو در اصل کلمه ای یونانی است. معادل لاتین این کلمه دوارف است که به معنی کوتوله و کوتاه قد است. قطر تار موی انسان تقریبا 75000نانو متر است، اگر 10 اتم هیدروژن به دنبال هم قرار گیرند،برابر یک نانو متر می شود.در طول سال های 1996تا 1998موسسه بین المللی تحقیقات فناوری2 حمایت از مطالعات و تحقیقات گسترده ای را در باره نانو ذرات و مواد نانو ساختار و نانو دستگاه ها به عهده گرفت. نتایج این تحقیقات و مطالعات نشان داد که پیشرفت در سه زمینه علمی و تکنولوژی، نانو را به زمینه تحقیقاتی منسجمی تبدیل کرده است این سه زمینه عبارتند از:
1- روش های سنتز جدید و پیشرفته که امکان کنترل اندازه و دستکاری واحدهای ساختاری نانومتری را ایجاد می کند.
2- ابزار شناسایی جدید و پیشرفته که امکان مطالعه در مقیاس نانو را ایجاد می کند.
3- بررسی و درک ارتباط بین نانو ساختارها و خواص آن ها و چگونگی مدیریت برآن.
جدول 1-1 مثال های نانو مواد و اندازه آن ها
نانو مواد اندازه
نانو بلورها و کلاسترها(نقاط کوانتومی) قطرnm 10-1 فلزات، نیمه هادی ها، مواد مغناطیسی
نانو ذرات دیگر قطر nm 100-1 اکسیدهای سرامیکی
نانو سیم ها قطر nm 10-5/0 اکسیدها،سولفیدها،نیتریدها
نانو لوله ها قطرnm 100-1 کربن،کالکوژنیدهای لایه ای
فلزات
نانو پروس های های جامد قطر منفذ nm10-5/0 زئولیت ها، فسفات ها و غیره
آرایه های دو بعدی (از نانو ذرات) µm 2 – nm2 فلزات،نیمه هادی ها،مواد مغناطیسی
سطح ها و فیلم های نازک ضخامت nm1000 -1 تعداد زیادی از مواد
1-2-انواع مواد نانو
1-2-1-نانو ذرات
نانو ذرات رایج ترین مواد در فناوری نانو می باشند. از آنجا که دارای ابعادی کمتر از طول موج مرئی اند، شفافند. افزایش نسبت سطح موثر به حجم این ذرات باعث می شود، تا زمانی که به عنوان کاتالیزور استفاده می شوند، موثر واقع شوند؛ چرا که سطح برخوردشان افزایش می یابد. خواص جالب نانو ذرات باعث شده تا کاربردهای زیادی در زمینه های زیست پزشکی، دارویی، صنایع شیمیایی، الکترونیک و صفحات خورشیدی، صیقل دهنده ها و رنگ ها داشته باشند، همچنین در شیشه های اتومبیل و پنجره ها استفاده می شوند.خواص خود تمیز شوندگی نانو اکسیدهای فلزی خاصی نظیر تیتانیوم اکسید، روی، آلومینیوم و آهن سیلیکات موجب استفاده آن ها در روکش های دیوارها و سرامیک ها می شوند. با توجه به رویه که این پژوهش مبتنی بر مطالعه نانو شیت های زئولیت، صرفا در این بخش نانو ذرات مرتبط با این مقوله بررسی می شوند.
1-2-2-مواد نانومتخلخل
مواد نانومتخلخل دارای حفره هایی در ابعاد نانو هستند و حجم زیادی از ساختار آن ها را فضای خالی تشکیل می دهد. نسبت سطح به حجم (سطح ویژه) بسیار بالا، نفوذپذیری یا تراواییزیاد، گزینش پذیری خوب و مقاومت گرمایی و صوتی از ویژگی های مهم آن ها می باشد.
با توجه به ویژگی های ساختاری، این مواد به عنوان تبادلگر یونی, جداکننده 2، کاتالیزور، حس گر، غشا 3و مواد عایق استفاده می شوند. به موادی که تخلخل آنها بین 2/0 تا 95/0 نانومتر باشد نیز مواد متخلخل4می گویند. حفره ای که متصل به سطح آزاد ماده است حفره ی باز نام دارد که برای صاف کردن 5 غشا، جداسازی و کاربردهای شیمیایی مثل کاتالیزور و کروماتوگرافی (جداسازی مواد ) با استفاده از رنگ آن ها مناسب است. به حفره ای که دور از سطح آزاد ماده است حفره ی بسته  می گویند که وجود آن تنها سبب افزایش مقاومت گرمایی و صوتی و کاهش وزن ماده شده و در کاربردهای شیمیایی سهمی ندارد. حفره ها دارای اشکال گوناگونی همچون کروی، استوانه ای، شیاری، قیفی شکل و یا آرایش شش گوش 6هستند. هم چنین تخلخل ها می توانند صاف یا خمیده یا همراه با چرخش و پیچش باشند [1[
مواد نانومتخلخل بر اساس اندازه ی حفره ها، مواد سازنده  و نظم ساختار به سه گروه تقسیم بندی می شوند: 1-2-2-1-دسته بندی بر اساس اندازه ی حفره1- میکرومتخلخل7: دارای حفره هایی با قطر کم تر از 2 نانومتر.2- مزومتخلخل 8: دارای حفره هایی با قطر 2 تا 50 نانومتر.3- ماکرومتخلخل9 :دارای حفره هایی با قطر بیش تر از 50 نانومتر.
بر اساس تعریف نانوفناوری، دانشمندان شیمی در عمل عبارت نانومتخلخلرا برای موادی که دارای دارای حفره هایی با قطر کم تر از 100 نانومتر هستند به کار می برند که ابعاد رایجی برای مواد متخلخل در کاربردهای شیمیایی است.

(1-1)-انواع سیلیکا بر اساس اندازه ی حفره: الف: ماکرومتخلخل، ب: مزومتخلخل، ج: میکرومتخلخل [2]

(1-2)-دسته بندی آیوپاک بر اساس اندازه حفره
1-2-2-2-نوع تخلخل
بر اساس شکل و موقعیت حفره ها نسبت به یکدیگر در داخل مواد متخلخل، حفره ها به چهار دسته زیر تقسیم می شوند:
حفره های راه به در2
حفره های کور3
حفره های بسته
حفره های متصل به هم 2

(1-3)-نوع تخلخلها بر اساس شکل و موقعیت
1-2-3-نانوبلورها
در یک بلور، با کوچک تر شدن ذره، نسبت اتم های موجود در سطح به اتم های داخلی، افزایش می یابد. اتم های موجود در سطح رفتار متفاوتی از خود بروز و رفتار ماده را تحت تاثیر قرار می دهند. در فلزات این تغییر رفتار موجب افزایش استحکام، مقاومت الکتریکی و ظرفیت حرارتی ویژه و کاهش رسانایی حرارتی می شود.فلرات نانو بلوری در صنایع خودرو سازی، هوا فضا و صنایع ساختمانی کاربردهای متفاوتی دارند.
1-2-4-نانو حفره ها
این ذرات حفراتی کوچک تر از 100 نانومتر دارند. زئولیت ها دسته ای طبیعی از نانو حفره هاست. سطح ویژه این مواد بالاست( در حد چند صد مترمربع بر گرم)، به همین دلیل با قرار گرفتن مواد در حفره آن ها، خصلت کاتالیزوری آن ها به دلیل افزایش مساحت سطح، افزایش می یابد. خصلت جالب توجه این ذرات، انتخاب پذیری آن هاست که به دلیل اندازه ثابت حفره، اجازه عبور را تنها به برخی از مواد می دهند. از روش های ساخت آن ها، می توان به روش سل ژل و سوزاندن میسل های آلی درون دیواره های معدنی اشاره کرد. فیلتر کردن آب، خالص سازی آنزیم ها و داروها و تولید نیمه هادی ها، از جمله کاربردهای آن هاست.

(1-4)-نانوحفره‌های تولید شده در آلومینا، به روش آندایز خود نظم یافته
1-3-روش های تولید نانو ذرات
به طور کلی واکنش های شیمیایی برای تولید مواد می تواند در هر یک از حالت های جامد، مایع و گاز صورت گیرند. در اینجا به طور خلاصه به انواع روش های متداول سنتز نانو مواد زئولیت پرداخته میشود [3].
1-3-1-سل ژل
روش سل- ژل برای تولید ذرات سرامیکی و اکسیدهای فلزی همگن با خلوص بالا به کارمی رود. این روش شامل تشکیل یک سوسپانسیون کلوئیدی (سل) است که به ژل های ویسکوز با مواد جامد تبدیل می گردد. پراکنده شدن ذرات با اندازه های کمتر از 100 نانو متر در داخل زمینه سیال را در اصطلاح سل یا کلوئید می گویند. روش سل- ژل فقط برای تولید اکسیدهای فلزی مفید است. این امر به دلیل وجود پیوندهای فلز- اکسیژن در پیش ماده های آلکوکسید است و ژل های تولیدی هیدروکسید یا اکسید خواهد بود. این فرآیند نسبت به
دیگر روش های تولید نانو ذرات اکسید فلزی، مزیت های ممتازی دارند که عبارتند از تولید پودرهای فوق العاده خالص به علت مخلوط شدن همگن مواد خام در مقیاس مولکولی و حجم تولید صنعتی نانو ذرات. از عیب های این روش، هزینه بالای پیش سازهای آلکوکسید و سمی بودن مواد اولیه مورد نیاز است [4و5].

(1-5)-محصولات قابل تولید با فرایند سل ژل
1-3-2-فرایندهای شیمیایی مرطوب
فرآیندهای تولید نانو ذرات برپایه ی محلول شامل رسوب جامد از یک محلول اشباع، تبدیل و احیای شیمیایی فاز مایع و تجزیه پیش سازهای شیمیایی به کمک انجام ماورای صوت است. این عملیات به دلیل سادگی، تنوع و تطبیق پذیری و قابلیت استفاده با مواد پیش ساز ارزان قیمت مورد توجه می باشند. احیای نمک، یکی از روش
های مورد تایید برای تولید ذرات کلوئیدی فلزی است. این فرآیند شامل تجزیه نمک های فلزی در محیط های آبی یا غیر آبی و احیای کاتیون های فلزی است.
1-3-3-فرآیند هیدروترمال
فناوری هیدروترمال می تواند در زمینه سنتز، رشد، دگرگونی و تبدیل مواد شیمیایی کاربرد داشته باشد. همچنین بسیاری از فرآیندهای دهیدراسیون، تخریب شیمیایی، استخراج و فرآیند های سونوشیمیایی و الکتروشیمیایی، و … می توانند با روش هیدرو ترمال صورت بگیرند. تقریبا سنتز تمامی ترکیبات معدنی با ساختارهای عنصری، اکسید، سیلیکات، ژرمانات، فسفات، کلکوژناید، نیترید، کربنات و … می توانند تحت روش های هیدروترمال صورت پذیرند. در زمینه سنتز مواد پیشرفته، بزرگترین ترکیبات تک بلوری کوارتز و زئولیت3 تاکنون بصورت مصنوعی با تکنولوژی هیدروترمال ساخته شده اند. روش هیدروترمال می تواند برای سنتز مواد کاربردی نظیر مواد مغناطیسی، اپتیکی پیزوالکتریک، سرامیک و .. در مقیاس بالا (تجاری) به صورت تک بلوری و چند بلوری به کار گرفته شود. تک بلورهای ایجاد شده با این روش بسیار خالص، بزرگ و فاقد نقص های بلوری (خصوصا نقص های جابجایی)هستند. پودرهای تهیه شده با فرآیند هیدروترمال دارای مزایای مقابل هستند: دارای ذرات مجزا، خلوص بسیار بالا (فاقد آلودگی)، غیرکلوخه ای، و با ریخت شناسی و ترکیب بلوری مشخص (معمولا تک بلوری) و بصورت تک پخش می باشند و به راحتی در حلال بازپخش می شوند. فرآیند هیدروترمال می تواند به صورت سازگار با محیط زیست در زمینه تخریب ضایعات و همچنین مونومریزاسیون بسیاری از ترکیبات پایدارو آلاینده طبیعت، جایگزین روش های ناکارآمد حاضر باشد. تمامی این کاربردها فناوری هیدروترمال را به یک رویکرد اساسی و کارا در زمینه های آزمایشگاهی، صنایع شیمیایی نوین و تولید مواد پیشرفته مبدل ساخته اند. از مزایای این روش می توان به تولید مواد پیشرفته با خلوص بالا، تجهیزات نسبتا ارزان قیمت، دمای پایین فرآیند، مصرف پایین انرژی و سازگاری کامل با محیط زیست اشاره نمود [6و7]. همچنین از ماکروویو نیز می توان استفاده کرد در هیدروترمال این روش برای سنتز مواد نانومتخلخل، ژل آبی شامل مواد اولیه و
مواد کمکی واکنش مانند عامل های هدایت ساختار ، محیط واکنش را تشکیل داده و گرمای واکنش توسط امواج ریزموج تأمین می شود [6].

(1-6)-سنتز هیدروترمال زئولیت
1-3-4-سنتز به روش محلول شفاف
معمولا نانوزئولیتها از یک محلول آبی قلیایی حاوی منابع Si و Al و یونهای فلزات قلیایی (سدیم یا پتاسیم ) تهیه میشوند . در سنتز برخی از انواع زئولیت، یک "عامل هدایت کننده ی ساختاری آلی3" نظیر کاتیونهای آلکیل آمونیوم برای تشکیل ساختارهای ثانویه ی زئولیت نیاز است .این محلول شفاف اولیه میتواند تحت شرایط هیدروترمال قرار داده شود یا در فرآیند سل- ژل به کار گرفته شود. همانطور که گفته شد، محلولهای پیشران شفاف با یک مقدار اضافی از طاق سازهای آلی معمولابرای تهیه زئولیتهای
در سایز نانو استفاده میشوند. این سیستمها در طول فرآیند کریستاله شدن به هسته زایی سریع با کمترین میزان تجمع ذرات نیاز دارند. وابسته به ساختار زئولیت، تجمع ذرات میتواند با کاهش محتوای کاتیونهای قلیایی در سیستم پیشران یا با جایگزینی کامل باز معدنی به وسیله ی هدایت کننده ی ساختاری آلی نظیر تتراآلکیل-آمونیومها، بازداری شود. برای تهیه کریستالهای نانوزئولیت، سیستم پیشران باید درجه ی بالایی از فوق اشباعیت داشته باشد، زیرا فوق اشباعیت باعث افزایش سرعت هسته زایی، افزایش تعداد هسته ها و اندازه ی ذرات کوچکتر میشود. در ژلهای آلومینا سیلیکات، فوق اشباعیت به شدت تحت تاثیرHp است. علاوه براین Hp بالا باعث کاهش دمای سنتز میشود [8و9].
1-3-5-سنتز به روش بازدارنده ی رشد
در این روش، یک افزودنی آلی غیر از هدایت کننده های ساختاری وارد سیستم میشود. این افزودنی با بازداری کردن از فرآیند رشد کریستالها منجر به تشکیل کریستالهای کوچکتر میشود. واکنش پذیری ماده ی بازدارنده و مقدار آن در مخلوط آغازین دو عامل تاثیرگذار میباشند. ماده ی افزودنی باید توانایی جذب سطحی و واکنش با سطح ذرات سیلیکات را داشته باشد تا از تراکم اضافی جلوگیری کند. غلظت بالای ماده ی بازدارنده باعث می شود اجزای آزاد آلومیناسیلیکات به میزان کافی برای تشکیل ساختار زئولیت در سیستم وجود نداشته باشد و در نتیجه کریستالی به دست نمی آید. از طرفی غلظت بسیار پایین بازدارنده اثر بازدارندگی کافی را نخواهد داشت [10].
1-3-6-سنتز به روش فضای محبوس2
اولین مورد از چنین سنتزی توسط ژاکوبسین و مادس 3 برای سنتز نانوکریستالهای زئولیتZSM-5 گزارش شده است. آنها در سال 1999 یک روش جدید برای سنتز زئولیت با توزیع اندازه ی کریستالهای کنترل شده تشریح نمودند. اصول سنتز به روش فضای محبوس این است که کریستالها در داخل فضاهای نیمه
متخلخل یک ماتریکس بی اثر سنتز میشوند. اندازه یحداکثر کریستالها توسط قطر خلل و فرج محدود میشود. بخش دشوار این روش نیاز به یک ماتریکس بی اثر و پایدار در طول شرایط انجام واکنش و نیاز
به توزیع سایز خلل و فرج مشخص در ماتریکس، برای داشتن توزیع سایز کریستال های همسان می باشد [10].

(1-7)-سنتز زئولیت ZSM-5 به روش فضای محبوس
1-3-7-سنتز به روش میکروامولسیون
استفاده از میکروامولسیون‌ها و خصوصا مایسل‌معکوس یکی از راه‌های سنتز کنترل شده نانوذرات است. بسیاری از نانوذرات در نانوراکتورهای مایسلی و تحت واکنش‌هایی نظیر فرآیندهای رسوبی، کاهش و هیدرولیز سنتز می‌شوند. روش‌های تولید نانومواد به‌صورت تک‌پخش 2 و با پخش اندازه 3 محدود منجر به افزایش کیفیت محصول می شوند. یکی‌ از راه‌کارهای سنتزی جهت نیل به این هدف، استفاده از نانوراکتورها جهت سنتز نانوذرات می‌باشد. از جمله ساده‌ترین نانوراکتورهای مولکولی مایسل ها هستند. این اجتماعات مولکولی حاصل خود آرایی مولکول‌های سورفکتنت در حدفاصل فاز آبی و آلی است. میکروامولسیون‌ها مخلوط‌های همگن و تک پخش از مایسل‌ها هستند که از مخلوط کردن فاز آلی
(روغنی)، فاز آبی و پایدار کننده ها (سورفکتانت‌ها) با نسبت مشخصی تهیه می‌شوند. به طور عمومی سنتز نانوذرات در ساختارهای مایسلی به دو روش صورت می پذیرد. روش اول شامل مخلوط کردن دومحصول با ساختار مایسل معکوس اما حاوی واکنش‌گرهای مختلف است. واکنش با برخورد نانورآکتورها به یکدیگر، تلفیق آن ها و تبادل مواد بین دو مایسل صورت می‌پذیرد. در روش دوم، تنها از یک محلول مایسل معکوس استفاده می‌شود. در این حالت واکنش بین واکنش‌گر حل شده در مایسل و واکنشگر حل شده در حلال آلی اتفاق می‌افتد [11].

(1-8)-شمایی از روند سنتز نانوذرات با استفاده از روش میکروامولسیون
1-4-زئولیت
نخستین بار در سال 1756 بلورهای خاصی که در زیر شکاف های صخره ها تشکیل شده بودند توسط یک معدن شناس سوئدی به نام الکس فرودریک کرونستدت کشف شد او مشاهده کرد هنگام گرما دادن به بلورها مقدار زیادی آب به صورت بخار از آن خارج می شود بنابراین با توجه به دو لغت یونانی زین به معنای جوشیدن و لیتوس به معنای سنگ این بلور زئولیت (سنگ جوشان ) نامگذاری شد. خواصی از زئولیت ها مانند دهیدراسیون بدون تخریب ساختمان کریستال زئولیت ها، عبور نکردن برخی از مایعات مانند بنزین، الکل، کلروفرم و جیوه از زئولیت های دهیدراته، جذب سطحی گازهای هیدروژن، آمونیاک، سولفید هیدروژن و هوا
روی زئولیت و جذب سطحی مولکول های الی کوچک و دفع مواد آلی بزرگتر توسط زئولیت های دهیدراته محققان را بسوی این علم جذب نمود، زئولیت ها به طور کلی به دو دسته تقسیم میشوند .
1-4-1-زئولیت های طبیعی
حدود 40 نوع زئولیت در طبیعت شناخته شده است که برخی از آن ها استفاده صنعتی دارند. زئولیت های طبیعی نتیجه غیر مستقیم فعالیت های آتشفشانی بوده و از طریق دگرگونی هیدروترمال بازالت، خاکستر اتشفشانی و سنگ پا تولید میشوند. اکثر زئولیت های طبیعی دارای نسبت Si/Alکم می باشند. زئولیت های با تخلخل زیاد مانند FAU که نمونه ی مصنوعی آن XوY میباشد در طبیعت بسیار کمیاب هستند دو نوع زئولیت طبیعی با ارزش ،کلینوپتیلولیت (HEU)2 و موردینت ها (MOR)3برای تعویض یون رادیو اکتیو ،کاربردهای کشاورزی و جاذب استفاده می شوند. فعالیت کاتالیستی زئولیت ها ی طبیعی بدلیل خلوص و سطح تماس کم آنها محدود می باشد .
1-4-2-زئولیت های مصنوعی
زئو لیت های مصنوعی در مقایسه با زئولیت های طبیعی از خلوص بالایی برخوردا بوده و دارای دامنه ی کاربردی وسیع تری می باشند محققین پیش ازسال 1950جهت تولید زئولیت ها درصدد ساخت ژئوکانی های طبیعی شناخته شده بودند و تصور می کردند که تشکیل زئولیت ها مستلزم درجه حرارتی در حدود 200تا400 درجه سانتیگراد و ده ها فشار اتمسفری می باشد ولی در سال 1975موفق شدند زئولیت ها را در دمایی پایین تر (100>) در مقیاس صنعتی تهیه نمایند از لحاظ منبع Si و نسبت Si/Al زئولیت ها به سه دسته زیر تقسیم بندی میشوند :
1-زئولیت ها با مقدار کم سیلیکا
2-زئولیت ها با مقدار متوسط سیلیکا
3 -زئو لیت ها با مقدار زیاد سیلیکا
از مهم ترین و پر کابردترین زئولیت ها ی مصنوعی می توان به CHA3 ,MFI ,MEL2 ,FER و AFI4 اشاره نمود که زئولیت MFI که کاربرد صنعت فراوان دارند.

(1-9)- برخی از زئولیت های رایج
1-3-4-ساختار و خواص زئولیت ها
زئولیت ها آلومینو سیلیکات های کریستاله با خلل و فرج های ریز شامل واحدهای چهار وجهی سازنده ی ساختار اسکلت می باشند که سیستمی از خلل وفرج و حفرات در اندازه ی مولکول تولید می کنند [12] . ساختار آن ها آنیونی بوده و شامل کانال ها و حفراتی است [13]. زئولیت ها از چهاروجهی AlO4 و SiO4که از اتصال اتم اکسیژن تشکیل می شوند .برای یک ساختار کامل سیلیسی ، واحدهای SiO4گرایش به سمت
تشکیل SiO2با چهار بار منفی دارند با مشارکت آلومینیوم در ساختار سیلیکا وجود سه بار مثبت Al کل ساختار دارای یک بار منفی می شود و برای اینکه از لحاظ بار الکتریکی خنثی باشد نیازمند یک ساختار کاتیونی آلی- معدنی می باشد . ترکیب شیمیایی زئولیت که تعیین کننده ی خواص آن می باشد را می توان به صورت زیر بیان کرد
My/mm+. [(SiO2) x. (AlO2-) y] .zH2O
در فرمول M نشانگر کاتیون اضافه شده با بار m است این کاتیون توسط پیوند الکترواستاتیکی به ساختار متصل شده و در شبکه ی کریستال سیار می باشد ، xوy اعداد صحیح هستند و z تعداد مولکول آب را نشان می دهد. ساختار زئولیت ها توسط واحدهای سازنده ،چیدمان ،اندازه و شکل هندسی حفرات تعیین میشود. ساختار بدنه ای زئولیت می تواند با رشد منظم واحدهای ساختاری بلوک های چهار وجهی TO4 که (T=Si ,Al) ساخته شوند در ساختار زئولیت ها پیوند Si-O-Al و Si-O-Siشبکه و چیدمان سه بعدی چهار وجهی های که واحده های سازنده ی پایه UBB است را تشکیل میدهند. در برخی موارد زئولیت ها از ترکیب واحد های سازنده ی مرکب (CBU) و (BBU) ها تشکیل می شود. این CBU ها می توانند حلقه های تک یا زنجیره های تک باشند و یا ساختارهای پیچیده تر مانند زنجیره های شاخه دار یا ساختارهای چندوجهی بسازند.برای اکثر زئولیت ها اندازه ی حفره یک ویژگی کلیدی به شمار می آید. محدوده ی دهانه ی کانال ها یا حفره ها از 3/0 تا ۱ نانو متر بسته به ساختار زئولیت متغیر می باشد[14]
1-5-زئولیت ZSM_5
یکی از انواع زئولیت ها،ZSM-5 می باشد که به عنوان کاتالیست کاربرد وسیعی در صنعت و محیطی دارد. طراحی کاتالیست زئولیت نقش معنی داری در توسعه فرایندهای جدید و پیشـرفته تکنولـوژی در آینده خواهد داشت. به دلیل کاربردهای کاتالیتیکی زئولیـتZSM-5، در تعـداد زیـادی از فراینـدهای شیمیایی و پتروشیمی، این نوع زئولیت ماده ای بسیار مفید در صـنعت مـی باشـد. زئولیت MFI در سال۱۹۷۰ توسط شرکت تحقیقاتی موبایل کشف شد. استفاده از زئولیت ZSM-5) MFI و سـیلیکات) در فرایندهای جداسازی گازها و مایعات، فرایندهای غـشایی و کاتالیـستی گـزارش شـده اسـت. این زئولیت با مقدار زیاد سیلیکا در بـیش از ۵۰ فراینـد بـه عنـوان جـزء اصـلی کاتالیـست اسـتفاده می شود. این زئولیت بعد از زئولیتY، پرکاربردترین زئولیـت کاتالیـستی مـی باشـد. غـشاهای ZSM-5) MFI و سیلیکات) در میان غشاها به دلیل پایداری حرارتی، شیمیایی و مکانیکی بالا، ویژگـی آب گریـزی، عمـر دراز مدت، و ظرفیت جذب سطحی بالا بسیار مورد توجه می باشد. مقالات بسیاری برای سنتز آن هـا بـر روی انـواع پایه های متخلخل، و اثر دما و فشار بر روی سنتز آنها ارئه شده است. این زئولیـت از حلقـه هـای ۵ عضوی تشکیل شده و به یکدیگر متصل می شـوند. ایـن سـاختار کاملا انعطاف پذیر بوده و تقارن دقیق کریستالوگرافی آن به ترکیب، دما، و مولکول های جـذب شـده بـستگی دارد. زئولیت MFI از دو نوع کانال مختلف با روزنه حلقـو ی۱۰ عـضوی تـشکیل شـده اسـت. یـک کانـال مستقیم با دهانه دایره ای با قطر ۰٫۵۴ نانومتر و یک کانال سینوسی بـا دهانـه بیـضوی بـا قطـر ۰۵۱× ۰٫۵۵دارند . این کانال ها بـا نـسبت متغیـر در MFI افزایش مـی یابـد و زئو لیت با نسبت Si/Al از ۵ به بالا قابل تهیه می باشد. با افزایش میزان Al ویژگی آب دوستی سیلیکات (فرم سیلیسی خالص) کاهش یافته و پایـداری حرارتـی بـالایی مشاهده می شود. زئولیـت MFI ظرفیت بالایی در جذب دی اکسیدکربن در مخلوط های مختلف گازی حتی با وجود بخار آب دارد [15-18].

(1-10)-الف:ساختار کانالی زئو لیت MFI ب: ساختار اسکلنی زئولیت MFIنشان دهنده حفرات سینوسی و مستقیم ,تقاطع انها یک نما ازساختار کامل در گوشه پایین سمت چپ دیده می شود[18].
1-5-1-عوامل مؤثر بر تبلور ساختار MFI
در این قسمت تأثیر غلظت اجزای سازنده مختلف موجود در فرایند در سنتز زئولیتهای ZSM-5 را بررسی می کنیم . عامل های زیر می تواند بر سرعتهای هسته زایی و رشد بلور تأثیر بگذارند:
مقدار آلومینیم ژل یا نسبت SiO2/Al2O3 آن ؛
درجه رقت ( نسبت H2O /SiO2 ) :
خصلت قلیایی محیط (نسبتهای OH/SiO2 / , TPA /SiO2, Na/Si2 )؛
طبیعت منبع سیلیسی با درجه بسپارش آن .
حال باید دید که این عاملها چگونه در شرایطی که فاز خالص به دست می آید ، سرعت بلوری شدن را تحت تأثیر قرار می دهند.

(1-11)-مکانیسم هسته زایی ZSM-5 را به صورت شماتیک نشان می دهد [18].
1-5-1-1- نسبت SiO2/Al2O3 در ژل
می توان انتظار داشت که غلظت آلومینادر ژل ، سرعت تبلور ZSM-5 از ژل را تغییر دهد. از این رو، Al/(Al +Si) بهتر از نسبت مولی Si/Al2 به عنوان عامل فیزیکی با مفهوم تری می تواند مورد استفاده قرار گیرد . برخی از پژوهشگران تأثیر مقدار آلومینیم در ژل را بر سرعت تبلور ZSM-5، با ثابت نگه داشتن سایر عاملها، بررسی کرده اند. نمودار زیر تاثیر Alموجود در ژل سنتزی برکریستال شدن ZSM-5 را نمایش میدهد. : a برای ژل سنتزی 2O) 1(Na2O) 1(SiO2)18(H2O) 270(TPA)), b: 2O) 1(Na2O) 3(SiO2)5(H2O) 200(TPA))
c: 2O)1(Na2O)0.2(SiO2)7(H2O)250(TPA)).

نمودار1-1 تاثیر Alموجود در ژل سنتزی بر کریستال شدن ZSM-5را نمایش می دهد.
کلیه داده ها نشان داد که سرعت تبلور ZSM-5 وقتی سریع تر می شود که با ثابت نگه داشتن تمام عاملهای دیگر مقدار آلومینیم ژل پایین تر باشد. وضیعت بر خلاف عملکرد هیدروترمال طبیعی یک چنین سیستمهایی است: نسبتهای si/Al بالاتر، سیستمی با گرانروی بالاتر و سرعت واکنش پایین تری می دهند. نمودار 1-1 نشان می دهد که شرکت آلومینیم در نوع ساختار MFI، ماهیتی از هم گسیخته است و هنگامی که سیستم آلومینیم بیشتری داشته باشد مشکل فزونی می گیرد [19و20] .
1-5-1-2-نسبت --plate/SiO2 در ژل
معلوم شده است که کاتیونهای قادرند با سیلیکات یا گونه های آلومینیم سیلیکات تشکیل کمپلکس دهند و با یونهای Na+ برای جبران بار گونه های سیلیکات و آلومینوسیلیکات رقابت کنند. این کاتیونها می تواند تشکیل واحدهای فرعی معین را پایدار کنند و آنگاه همتاسازی این واحدهای ساختمانی اولیه را از طریق پیوند هیدروژنی فضا ویژه بین یون تمپلت و آنیونهای اکسیژن موجب شوند از این رو، حضور تمپلت می تواند برای تشکیل ساختاری خاص ضروری باشد یا ممکن است جهت دهنده ساختاری باشد. این اثر اینک به عنوان اثر طاق ساز در سنتز زئولیت شناخته شده است[21]. واقعیتهای زیر مؤید چنین اثری در جریان سنتز زئولیت ZSM-5 هستند :
سرعت تبلور با افزایش نسبت --plate /SiO2، دست کم تا مقدارهای معینی افزایش می یابد .
دیده شده است که افزایش سرعت وقتی مقدار --plate /SiO2 به حد معینی برسد به حالت سیر شدگی می رسد[22-24].

(1-12)-طرز قرار گرفتن سورفاکتنت TPA و HDA در کانال های مستقیم و سینوسی در زئولیت ZSM_5 Si- 48 Si-ZSM_[18]
1-5-1-3- درجه رقت یا نسبت H2O/SiO2
نسبت H2O /SiO2 در مخلوط سنتزی ZSM-5‌ تأثیر ناچیزی بر سرعت تبلور دارد [25].
1-5-1-4-نسبت M/SiO2
طبق اظهارات رولمن و والیوسیک [25] ، نسبت M/SiO2 نیز هیچ عملکرد تعیین کننده سرعتی در سنتز ZSM-5 ندارد و ساختار نوع MFI‌ در گستره وسیعی از مقدارهای این نسبت (از 07/0 تا 18/1 ) به دست می آید . لکن شواهد نشان می دهد افزایش کاتیون فلز قلیایی دوم یا فلز قلیایی خاکی و به کارگیری منبع دیگرفلز قلیایی سرعتهای هسته زایی و تبلور را به طور قاطع تحت تأثیر قرار می دهد. در مقابل، نباید فراموش کرد که افزایش قلیا قدرت بازی سیستم را افزایش می دهد و در نتیجه اثرهای پارامترهای مختلف همیشه به آسانی قابل تفکیک نیست. نقشهای کاتیونهای فلز قلیایی در ژل شامل ‌آلومینوسیلیکات چنین پیشنهاد شده است :
در مقدارهای کم، کاتیونهای فلز قلیایی ممکن است تبلور ZSM-5 را کاتالیز کنند ( با روشی که بیش از این آشکار نشد ) .
در غلظت ثابت OH-، اولین نتیجه افزایش کاتیونهای عریان فلز قلیایی، که در کره ای ثابت آبپوش می شوند، آن است که درجه اَبَر سیر شدگی افزایش می یابد و هسته زایی سریع تر می شود.
کاتیونهای فلز قلیایی آبپوش شده با ذرات سُل آلومینو سیلیکات آبگریز بر هم کنش می کنند، در نتیجه، پایداری آنها کاهش می یابد و آنها انباشته می شوند و به صورت ژل رسوب می کنند. که اثر نمک زدایی نامیده می شود. بازده آن به چگالی بار و در نتیجه به ماهیت فلز قلیایی وابسته است.
کاتیونهای فلز قلیایی بسته به اندازه شان قابلیت طاق سازی یا شکل دهی ساختاری (Na, Li) یا اثر شکست ساختاری (Cs , Rb , K و همچنین NH4 ) را دارند. در واقع، کاتیونهای بزرگ با قدرت کمتری آبپوش می شوند و احتمالاً ساختار آب را با شکستن پیوندهای هیدروژنی از هم می گسلند .
کاتیونهای فلز قلیایی بسته به پتانسیل الکتروستاتیکی شان (متناسب با 1/r )) قادر خواهند بود با کارایی کمتر یا بیشتری با بارهای نقطه ای بر هم کنش کنند و با یکدیگر و با TPA‌ برای جبران بار آنیونهای آلومینوسیلیکات رقابت کنند [27-28].
1-5-1-5-نسبت OH/Sio2
تأثیر خصلت قلیایی بر سرعت هسته زایی ZSM-5 به دفعات مطالعه شده است. بارر [32] در حالت کلی تأکید می کند که یک افزایش غلظت OH-، درجه ابر سیرشدگی را افزایش می دهد و رشد بلور را تسریع می کند. افزایش غلظت OH- همچنین حلالیت زئولیتها را در مادر آب آنها افزایش می دهد. از این تحلیل ها کلی چنین نتیجه می شود که برای اینکه زئولیتی معین، در دوره زمانی کوتاهی به صورت فاز واحد هسته زایی شود ، غلظت بهینه OH- یا نسبت بهینه OH/SiO2 باید وجود داشته باشد. این نسبت بهینه OH/SiO2 برای سنتز ZSM-5 , برای یک نسبت SiO2/Al2O3 برابر 90، یک نسبت H2O/SiO2 برابر 40، نسبت Na/SiO2 برابر 59/0 و یک نسبت Template/SiO2 برابر 1/0، نسبت بهینه OH/SiO2 برابر 05/0 است . خصلت قلیایی برای نگهداری کانی گونه های هیدروکسی سیلیکات و آلومینات حل شده باید بالا باشد ولی نه آن قدر بالا که از هسته زایی و رشد این گونه ها جلوگیری کند .
1-5-1-6- ماهیت منبع سیلیسی
هم اکنون مستندات پژوهشی وجود دارد که به روشنی نشان می دهد که ماهیت منبع سیلیسی نیز در بین عوامل دیگر بلوری شدن ZSM-5 از ژل متداول وجود دارد. منابع سیلیسی که ذاتاً محتوی مقدارهای بالایی از تکپار سیلیکات، سریع تر از ژلهایی که در آنها سیلیکات در حالت بسپاری بالاتری وجود دارد متبلور می شوند . بنابراین می توان نتیجه گرفت که سرعت انحلال یا وابسپارش سیلیسی که معلوم شده آهسته است در مرحله تعیین کننده سرعت در هسته زایی ZSM-5 دخالت دارد. چون رشد بلور نیز به همین روش تحت تاثیر قرار دارد ، این امر نشان می دهد که سرعت آن نیز با غلظت سیلیکات تکپاری تعیین می شود. بنابراین، لازم به یادآوری است که تغییر منبع سیلسی ( به عنوان مثال ، به کارگیری سُل سیلیسی به جای سدیم سیلیکات ممکن است گرانروی ژل را تغییر دهد. با سدیم سیلیکات، معمولاً ژلهای بسیار سفت به دست می آیند که به منظور رسیدن به تبلور نسبتاً سریع لازم است خیلی رقیق شوند. بنابراین در گرانرویهای یکسان، ژل حاصل از سُل سیلیسی شامل جامدهای بیشتری است و در همان مدت زمان تبلور، بهره بیشتری به دست می آید . در
نسبتهای H2O/SiO2 یکسان، سرعت تبلور ژل با استفاده از سُل به عنوان منبع سیلیسی دو مرتبه سریع تر از هنگامی است که ژل با سدیم سیلیکات ساخته می شود .
1-5-2-تأثیر پارامترهای مختلف بر مورفولوژی زئولیتی
هنگامی که یونهای با خاصیت شکست ساختاری به ژل افزوده می شود، اندازه های بلوری درشت تر به دست می آیند، که ریخت آنها از توده های کروی تا بلورهای منشوری تک یا دو قلو تغییر می یابد . این اثر با ماهیت کاتیون به ترتیب زیر افزایش می یابد : Li<Na<K<Rb<Cs<Ba<Sr .
غلظتهای بالای تمپلت به طور طبیعی بلورهای ریز می دهد. در حالی که در حضور مقدارهای پایین تمپلت تک بلورهای تمپلت‌ به طور طبیعی بلورهای ریز می دهد. در حالی که در حضور مقدارهای پایین تمپلت تک بلورهای درشت به آسانی به دست می آیند.
از بیشتر ژلهای پرسیلیس، بلورهای درشت تر به دست می آیند هنگامی که در یک مخلوط معین، آلومینیم کمپلکس شده باشد باز هم افزایش در اندازه بلور مشاهده می شود.
افزایش نمکها (آنیونها با کاتیونها )، مخلوط سنتز را به تشکیل بلورهای غالباً درشت تر هدایت می کند، که ریخت آن با ماهیت یون خارجی تغییر می کند. در حال حاضر، با داده های موجود مشکل می توان استدلال منطقی کرد و نسبت دادن ایجاد ریختی ویژه به خصلت خاص یون امکان پذیر نیست .
ماهیت و درجه بسپارش منبع سیلیس، ریخت را تعیین می کند و همان طوری که انتظار می رود، منابع سیلیس تکپار بلورهای ریزتر یا توده های آنها را می دهد، در حالی که از منبع سیلیسی بسپاری بلورهای درشت به دست می آید .
نسبت OH/SiO2 ( یا خصلت قلیایی سیستم ) اندازه و درجه انباشتگی را تحت تأثیر قرار می دهد در قدرت بازی بالا، بلورهای ریز اما پخش شده به دست می آید، در حالی که در نسبتهای OH/SiO2 پایین (01/0 ) بلورهای درشت کاملاً مشخص به دست می آیند .
1-5-3- سنتز ZSM-5 در حضور آمینها
آمینهای افزوده شده به یک مخلوط سنتز قلیایی در اختلاف با یونهای آمونیوم نوع چهارم، می تواند اثرهای متعددی داشته باشند :
مخلوط واکنش را بافر می کنند به طوری که افزایش pH طی سنتز کاهش می یابد [29] .اگر مقدارکافی آمین در فاز بلوری زئولیت جذب شده باشد مواد آلی باقیمانده در ژل یا محلول، موجب افزایش ضعیف pH طی تبلور خواهد شد.
موجب خالی شدن Na ، محصول نهایی می شوند.
در مخلوط آبی سنتزی، آمین به طور جزئی پروتون دار می شود :
(1-1)
(2-1)
غلظت نهایی آمین (A) در مخلوط واکنش به صورت زیر خواهد بود [25]:
(3-1) |A|=|RNH3+|+|RNH2|
(4-1) |A|=|RNH3+|.(1+ka|H+|-1)
و در نتیجه، pH بسیار پایین تر از سیستم بدون آمین وابسته خواهد بود بنابراین موجب افزایش بهره تبلور خواهد شد.
1-5-4-سنتز زئولیت ZSM-5 در حضور الکلها
اگر الکلها به عنوان طاق دهنده در سنتز ZSM-5 استفاده شوند و اگر قدرت بازی محلول ابر سیر شده با منبع کانی فلز قلیایی فراهم شده باشد، لازم است سنتز زئولیت بر حسب الگوی پرکننده حفره تفسیر شود .
در استفاده از الکل برای سنتز ZSM-5 نکات زیر حائز اهمیت است :
قدرت بازی لازم برای رسیدن به اَبَر سیر شدگی با بازهای کانی فراهم شود .
وقتی NH4OH به عنوان باز کانی همراه با الکل مورد استفاده قرار می گیرد ، در نهایت زئولیتی به دست می آید که می تواند بدون حرارت دادن نمونه عاری از هر گونه ترکیب آلی یا باز باشد که برای کاربردهای اسیدی با دمای پایین اهمیت فراوانی دارد .
با بعضی الکلها (مثلاً پینانوکول ) ، ZSM-5 فاز نیم پایداری است که با قرار گرفتن طولانی در معرض هوا به کنیاییت تبدیل می شود؛ به نظر می رسد مقدارهای زیاد از دیول عملاً مانع تشکیل کنیاییت می شود.

(1-13)-مکانیسم عمومی سنتز زئولیت [30]
1-6-طیف بینی جذب مادون قرمز
فرکانس تشعشع الکترومغناطیس در ناحیه مادون قرمز (IR) مطابق با فرکانس ارتعاش طبیعی اتم‌های یک پیوند است و پس از جذب امواج مادون قرمز در یک مولکول، باعث ایجاد یک سری حرکات ارتعاشی در آن می‌شود که اساس و مبنای طیف‌سنجی مادون قرمز را تشکیل می‌دهد. ساده‌ترین نوع حرکات ارتعاشی در یک مولکول، حرکات خمشی و کششی است. تقریبا تمامی ترکیباتی که پیوند کوالانسی دارند، اعم از آلی یا معدنی، فرکانس‌های متفاوتی از اشعه الکترومغناطیس را در ناحیه مادون قرمز جذب می‌کنند. ناحیه مادون قرمز، ناحیه‌ای از طیف الکترومغناطیس است که طول موجی بلندتر از نور مرئی (۴۰۰ تا ۸۰۰ نانومتر) و کوتاه‌تر از امواج مایکرو ویو (طول موج بلندتر ازmm۱) دارد. طیف بینی مادون قرمز معمولا در سه ناحیه طیفی بررسی میشود:
ناحیه مادون قرمز نزدیک 2 (NIR) :که ازcm-1 4000 - 12500 بوده و در برگیرنده باندهای ارتعاشی ترکیبی و اورتون می باشد.
ناحیه مادون قرمز میانی(RIM): که ازcm-1 400-4000 بوده و شامل باندهای ارتعاشی اصلی است
ناحیه مادون قرمز دورcm-1 :(FIR)2 30-400 که در برگیرنده ی باندهای ارتعاشی مربوط به شبکه و برهم کنش است.
این طیف بینی به صورت یک ابزارمهمی برای اندازه گیری روزمره ی اجزای تشکیل دهنده جامدات به نرمی پودر شده، درآمده است. گسترده ترن زمینه استفاده از این فن در اندازه گیری پروتئین، رطوبت، نشاسته، روغن، لیپیدهاو سلولزدر محصولات کشاورزی مانند غلات و دانه های روغنی است.
1-6-1-ناحیه مادون قرمز میانی :
پرکاربردترین محدوده ی طیفی زیر قرمز برای آنالیزهای شیمیایی، ناحیه ی مادون قرمز میانی (MIR) میباشد. این ناحیه محدوده ی فرکانسی را cm-1 400-4000 پوشش می دهد. این ناحیه میتواند به دو زیر ناحیه تقسیم شود:
الف) ناحیه ی فرکانس گروهی 4000-1300 cm-1
ب ( ناحیه ی اثر انگشتی 1300-500 cm -1
در ناحیه ی فرکانس گروهی باندهای جذبی عمدتا به حالتهای ارتعاشی گروههای عاملی نسبت داده میشود. وجود و عدم وجود این باندهای فرکانس گروهی میتواند برای تشخیص ساختار مولکولی مفید باشد. باندهای جذبی در ناحیه ی اثر انگشتی، برای هر ترکیب کاملا منحصر به فرد است اما شلوغ بودن زیاد این ناحیه، تفسیر و بررسی آن را مشکل میساز. ولی مجموعه ی الگوی این ناحیه وقتی با الگوهای مرجع تطبیق داده میشود، برای شناسایی ماده، منحصر به فرد، تکرار پذیر و مفید می باشد.

(1-14)-شمای از یک طیف ریز قرمز میانی
1-6-2- طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه :
درسیستم دستگاهیFTIR با شکافتن تابش منبع به دو باریکه، طول مسیر آن متناوباً تغییر کرده و الگوهای تداخل متفاوت را سبب میگردد. در واقع، طیف سنجی تبدیل فوریه بر اساس تداخل دو پرتو با استفاده از یک تداخل سنج پایه گذاری شده است و در آن یک سیگنال وابسته به تغییر طول مسیر بین دو پرتو حاصل میشود. دو حوزه ی مسافت و سیگنال توسط روشهای ریاضی تبدیل فوریه به یکدیگر تبدیل میشوند.تابش از منبع به تداخل سنج وارد می شود و قبل از اینکه به آشکارساز 2 برسد وارد نمونه میشود. پس از تقویت سیگنال، که در آن ترکیباتی با فرکانس بالا توسط یک فیلتر حذف میشوند، داده ها توسط یک مبدل آنالوگ به دیجیتال، به فرم دیجیتال تبدیل میشوند و به کامپیوتر برای تبدیل فوریه، انتقال می یابند.[31] مهمترین مزایای طیف سنجی تبدیل فوریه سرعت و حساسیت بالاتر (مزیت فلگت3),افزایش میزان عملکرد نوری دستگاه (مزیت جکوئینوت4)، بالا رفتن قدرت تفکیک( مزیت کانز5) , طراحی ساده تر، زمان اسکن کمتر و عدم تأثیر نور هرز و تابش حاصل از نشر نمونه میباشد.

(1-15)-تصویر طیف سنج تبدیل فوریه
1-6-3-نمونه گذاری در طیف سنجی مادون قرمز:
طیف سنجی زیر قرمز یکی از تکنیک هایی است که برای شناسایی تمامی حالات (ماده جامد، مایع وگاز)کاربرد دارد. تکنیک های نمونه گذاری به هدف آنالیز )تشخیص کیفی یا اندازه گیری کمی آنالیت) سایز نمونه و ترکیب نمونه بستگی دارد. به طور عمده میتوان روشهای نمونه گذاری در طیف سنجی زیر قرمز را به دو دسته ی عبوری (جذبی)و انعکاسی تقسیم بندی کرد، که هریک از این روشها نیز خود به چندین شاخه تفکیک می شوند.از تکنیکهای عبوری نمونه گذاری میتوان به روش قرص KBr, روش mull روشهای مخصوص مایعات و محلول ها و سل های گازی اشاره کرد. نمونه های ضخیم، جامدات کدر، الیاف، پوشش ها، پلیمرها و نمونه های محلول آبی را نمیتوان با استفاده از تکنیک های عبوری آنالیز کرد، در این زمان از تکنیک های انعکاسی استفاده میشود. به طور کلی اندازه گیریهای انعکاسی به سه دسته تقسیم می شوند.
انعکاس خارجی: این تکنیک انعکاسی شامل دو نوع بازتابش است : بازتابش مسطح یا آینه ای و انعکاس– جذب2
انعکاس درونی: که نوعی از آن بازتابش کلی کاهش یافته 3 است.
بازتابش انعکاس-پخش4

(1-16)-الف(بازتابش آینه ای، نوعی از انعکاس خارجی ب( بازتابش انعکاس-پخش ج( بازتابش کلی کاه شیافته، نوعی از بازتابش درونی
1-7-طیف سنجی انعکاس-پخش:
زمانی که پرتو تابشی به نمونه برخورد می نماید، مقداری از پرتو انعکاس آینه ای می دهد، مقداری از پرتوی تابشی توسط نمونه جذب شده ومقدار باقی مانده ی پرتو تابشی از نمونه عبور می نماید و فقط قسمتی از پرتو تابشی از نمونه به تمام جهات باز تابیده و پخش میشود که این انرژی، توسط لوازم جانبی جمع شده و به سمت آشکارساز هدایت میشود. تکنیک طیف سنجی تبدیل فوریه زیر قرمز انعکاس پخشی ، برای یک سطح غیر آینه ای و کدر و سطوح رنگی و پودرها که پرتو برخوردی در تمام جهات انعکاس مییابد و سطح ناهموار دارند، هم در ناحیه ی طیفی RIN وهم MIRمناسب میباشد. در این روش پرتوی تابیده شده به نمونه ی پودری در تمام جهات بازتابیده و پخش میشود. طیف سنجی انعکاس- پخش با
موفقیت برای تحلیل کمی نمونه های پودری بکارمی رود. در حالت ایده آل پرتو به اندازه ی mμ100 به درون نمونه نفوذ میکند و نور بازتابش شده درزوایای زیادی از نمونه پراکنده می شود، سپس این پرتوهای پراکنده شده با استفاده از آینه های بزرگ جمع میشوند. در این طیف سنجی باندهای کوچکتر بطور قابل ملاحظه ای نسبت به باندهای قویتر رشد می کنند. در اغلب موارد نمونه با یک ماتریکس غیر جذبی مانند پتاسیم برماید مخلوط میشود. نسبت نمونه به ماتریکس 1 تا 5 در صد وزنی می باشد. این رقیق سازی نفوذ عمیق پرتوی برخوردی را به داخل نمونه تضمین مینماید، که موجب افزایش سهم پراکنش در طیف میشود و سهم انعکاس آینه ای را به حداقل مقدار می رساند. انعکاس آینه ای ترکیب شده در طیف انعکاس– پخش در برخی موارد موجب تغییرات در شکل باند و شدت نسبی آنها میگردد.[ 33-35].

(1-17)-مکانیسم ایجاد بازتابش انعکاس-پخش از سطوح پودری و ناهموار
1-8-طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته :
رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR)یک روش طیف سنجی است که برای شیمیدانان آلی از اهمیتی والا نسبت به طیف سنجی مادون قرمز برخوردار است . بسیاری از هسته ها را می توان با فنون NMR مطالعه کرد ، ولی هیدروژن و کربن بطور معمول مورد استفاده قرار می گیرند . بسیاری از هسته های اتمها دارای خصلتی هستند که اسپین خوانده می شود : هسته ها به گونه ای رفتار می کنند که گویی در حال چرخش هستند . در
حقیقت اتمهایی که عدد جرمی فرد ، عدد اتمی فرد یا هر دو را دارند ، دارای گشتاور زاویه اسپین کوانتایی و گشتاور مغناطیسی هستند .شاخص ترین هسته هایی که دارای اسپین هستند ، عبارتند :

در یک میدان مغناطیسی ، حالات اسپین انرژی یکسانی را نخواهند داشت ، زیرا یک هسته ذره ای باردار بوده و هر ذره باردار متحرک خود تولید میدان مغناطیسی می کند . بنابراین ، یک هسته دارای گشتاور مغناطیسی ( μ ) است که به وسیله بار و اسپین آن تولید می شود . یک هسته هیدروژن می تواند اسپینی موافق جهت عقربه های ساعت (2/1+)یا مخالف جهت عقربه های ساعت (2/1-)داشته باشد و در این دو حالت ̦گشتاورهای مغناطیسی خود را یا در جهت میدان و یا در خلاف جهت آن قرار می دهند.

(1-18) حالت های اسپین انرژی
-314960710565هنگامی که یک میدان مغناطیسی خارجی به کار برده شود ، حالت اسپین دژنره به دو حالت ، با ترازهای انرژی نابرابر شکافته می شوند.
اهمیت رزونانس مغناطیسی هسته ای از آن جا آشکار می شود که در یک مولکول ، تمام پروتون ها در یک
فرکانس رزونانس نمی کنند . این بدین دلیل است که پروتون های مولکول توسط الکترونها احاطه شده و محیط الکترونی هر یک از پروتونها بطور جزیی با دیگر پروتونها فرق می کند . به عبارت دیگر ، پروتونها توسط الکترونهایی که آنها را احاطه کرده اند پوشیده یا محافظت می شوند . در یک میدان معناطیسی ، الکترونهای ظرفیتی پروتونها می چرخند . این چرخش که جریان دیامغناطیس محلی خوانده می شود ، تولید میدان مغناطیسی متضادی می کند که در جهت مخالف میدان مغناطیسی اعمال شده عمل می نماید . این اثر که مانع دیامغناطیسی یا آنیزوتروپی دیا مغناطیسی نامیده میشود. در یک اتم ، جریان مغناطیسی محلی تولید یک میدان مغناطیسی ثانویه می نماید که دارای جهتی مخالف میدان مغناطیسی اعمال شده است . در نتیجه آنیزوتروپی دیا مغناطیس ، پروتون در مولکول بسته به دانسیته الکترونی اطراف آن از جانب میدان مغناطیسی اعمال شده محافظت می شود . هر قدر دانسیته الکترونی اطراف یک هسته بیشتر باشد میدان مغناطیسی تولید شده توسط الکترونها ، که در جهت عکس میدان اعمال شده است ، بیشتر خواهد بود.

(1-19) شمای از یک میدان مغناطیسی ثانویه در یک اتم
1-8-1- طیف سنج رزونانس مغناطیسی هسته ای تبدیل فوریه تپشی
این روش استفاده از یک انفجار انرژی قدرتمند ولی کوتاه به نام تپ است که کلیه هسته های مغناطیسی در مولکول را بطور همزمان تهییج می کند . وقتی تپ متوقف شد ، در آن صورت هسته های تهییج شده شروع به از دست دادن انرژی تهییج خود می کنند و به حالت اسپینی اولیه خود باز می گردند . آنگاه که هسته برانگیخته شده آسایش می کند ، شروع به تابش اشعه الکترومغناطیس می نماید . چون مولکول حاوی هسته های مختلف بسیار است لذا ، فرکانسهای گوناگون بسیاری از اشعه الکترومغناطیسی بطور همزمان تابش خواهند نمود . این تابش را زوال القای آزاد (FID) می نامند .
1-8-2-قاعده (N+1) شکاف اسپین – اسپین
طبق این قاعده هر نوع ، پروتون تعداد پروتونهای معادل (n) بر روی اتم (اتمهای ) کربن مجاور آن کربنی که خود به آن متصل است را احساس کرده و قله رزونانس آن به (n+1) جزء تقسیم می شود.

(1-20)-نمونه ی از شکاف اسپین –اسپین دی کلرو اتان
1-8-2-1-هسته کربن -13
مطالعه هسته های کربن از طریق طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ، تکنیک مهمی برای تعیین ساختمانهای مولکولهای آلی است . استفاده از آن به همراه NMR پروتون و نیز طیف سنجی مادون قرمز ، شیمیدانان آلی را قادر می سازد تا به تعیین ساختمان کامل یک ترکیب مجهول بپردازند ، بدون اینکه دستهای خود را در آزمایشگاه آلوده کنند . دستگاههای جدید NMR تبدیل فوریه (FT-NMR) امکان بدست آوردن طیفهای کربن را آسان می کند.
1-8-2-2-تغییرات مکان شیمیایی کربن –13
پارامتر مهم در طیفهای کربن -13 ، تغییر مکان شیمیایی است . به دلیل محدوده بسیار وسیع مقادیر تغییر مکان شیمیایی ، تقریبا هر اتم کربن نامعادل در یک مولکول آلی ، یک قله با تغییر مکان شیمیایی متفاوت می دهد .
جدول ارتباطی به چهار بخش تقسیم شده است . اتمهای کربن اشباع شده در بالاترین میدان و نزدیک به TMSظاهر می شوند ( 8- 60ppm) . قسمت دوم تاثیر اتمهای الکترونگاتیو را نشان می دهد ( 40-70ppm) . سومین بخش شامل اتمهای کربن آلکن و حلقه آروماتیک است . ( 100-150ppm ). چهارمین بخش جدول حاوی کربنهای کربونیل است که در پایین ترین میدان ظاهر می شوند ( 155-200ppm) .

(1-21)-تغییرات مکان شیمیایی کربن
1-9-مقدمه ای بر کمومتریکس
توسعه ی کمومتریکس مربوط به استفاده ی کامپیوترها در شیمی می باشد . واژه ی کمومتریکس اولین بار در سال 1972 به وسیله ی وُلد2 و کوالسکی3 معرفی شد . اولین انجمن بین المللی کمومتریکس4 (ICS) در سال 1974 تشکیل شد و به دنبال آن ها یک سری سمینارها و کنفرانس هایی تحت عناوین مختلف مانند کاربردهای کامپیوتر در شیمی تجزیه ، شیمی تجزیه بر پایه ی کامپیوتر و یا کمومتریکس در شیمی تجزیه برگزار گردید . برخی از مجلات بخشی از مقالات خود را کمومتریکس اختصاص دادند . سپس مجلات کمومتریکس شروع به کار کردند . روش های کمومتریکس ، در هر مرحله ای از انالیز ، از طراحی یک آزمایش گرفته تا زمانی که داده ها رو به زوال می روند ( بسته به نوع سیستم ) قابل کاربرد است . اولین تعریفی که به صورت جامع از کمومتریکس بیان شد توسط کوالسکی و فرانک5 ارائه گردید . بر این اساس کمومتریکس را شاخه ای از علم شیمی معرفی کردند که در ان با بکارگیری آمار و ریاضی و کامپیوتر می توان روش هایی را ارائه داد که از طریق آن بتوان حداکثر اطلاعات مفید را از یک سیستم شیمیایی استخراج نمود.
1-9-1-طراحی ازمایش6:
روش تعریف و بررسی تمامی شرایط ممکن در یک آزمایش شامل چند فاکتور”طراحی آزمایش ها نامیده می شود. این روش در بعضی نشریات طراحی فاکتوریلی نامیده می شود. در طراحی فاکتوریلی تعداد کامل آزمایشات ممکن N عبارتست از: N=Lm که در آن L تعداد سطوح انتخاب شده در هر فاکتور و m تعداد فاکتورهای تحت بررسی است. در اینگونه آزمایشات دقت آزمایش با استفاده از تحلیل آماری ( ANOVA ) تعیین می شود.طراحی آزمایشها یکی از قوی ترین فنون بهبود کیفیت و افزایش بهره وری است. در این شیوه از طریق انجام برخی آزمایش ها ، آگاهانه تغییراتی در فرایند یا سیستم اعمال می شود تا تاثیر آنها در ویژگی های عملکردی یا پاسخ فرایند یا سیستم به آنها، مورد بررسی قرار گیرد.طراحی آزمایش ها ، دستکاری سیستماتیک تعدادی از متغیرهاست که در آن، تاثیر این دستکاری ها ارزیابی می گردند و از
روی آنها نتیجه گیری شده، نتایج بدست آمده پیاده سازی می شوند.همچنین DOE یکی از ابزارهای بهبود کیفیت در تولید ناب  Lean Production است. دانشمندان آزمایشات زیادی را انجام می دهند تا بتوانند به نتایج دلخواه خود برسند که این آزمایشات مستلزم هزینه و زمان بسیاری است در واقع DOE نوعی روش انجام آزمایش است که به صورت کاملا سیستماتیک عمل می کند و با صرف کمترین منابع ،هزینه و زمان ،بیشترین اطلاعات را از نتایج آزمایش استخراج می کند.
1075690165735
1-9-1-1-تعریف فرایند مورد مطالعه
طراحی آزمایش ها ابزاری مناسب برای درک صحیح فرآیندها و عوامل مؤثر بر آنها چندین را وجود دارد که یک شیمیدان بتواند با دانستن پایه طراحی ازمایش های شیمیایی کارایی بهتری داشته باشد این مسیر شامل ،غربال کردن ،بهینه سازی کردن ،کاهش زمان بری و مدل سازی کمی است.
1-9-1-2-غربال کردن
در این مرحله باید بررسی کرد که کدامیک از فاکتور ها برای موفقیت فرایند از اهمیت بیشتر ی برخوردار است کدام فاکتور ها را می توان حذف کرد و کدامیک باید با جزئیات مطالعه شوند برای چنین بررسی هایی می توان از مسیر های مانند طراحی فاکتور ها 2و طراحی پلاکت بورمن 3استفاده نمودد.
1-9-1-3-انواعی از روش های طراحی فاکتورها:
طرح فاکتوریل کامل4
در این طرح ها، هر سطح از هر عامل با تمام سطوح عوامل دیگر در اجرا ظاهر می شود.
طرح فاکتوریل دو سطحی1
طرح فاکتوریل با سطوح مرکب2
در این طرح ها، عوامل دارای سطوح متفاوتی هستند.
طرح فاکتوریل جزیی3
1-9-1-4-بهینه سازی 4
بهینه سازی یکی از پرکاربردترین روش های طراحی آزمایش در شیمی است .مسیر هایی مانند طراحی مخلوط5و طراحی ترکیب مرکزی 6 می تواند برای بهینه سازی مورد استفاده قرار گیرد .
1-9-1-5- کاهش زمان بری 7
درصنعت پرکابردترین شاخه ی طرحی آزمایش کاهش زمان بری می باشد در برخی مواد میان ساختار مواد و خواص ان ها یک ارتباط کمی وجود دارد برای مثال با بررسی داده ی ساختاری (مانند طول پیوند ،قطبیت ،خواص فضایی ،گروه های عاملی ،واکنش پذیری و...)چند مولکول محدود و یافتن یک ارتباط کمی بین این داده ها و خواص مشاهده شده در ان می توان این ارتباط را به دسته ی بزرگی از مولکول ها تعمیم داد و از این رو کاهش چشمگیری در زمان بری انجام واکنش ها با دسته گسترده ای از مولکول ها ایجاد نمود برای چنین بررسی هایی از مسیرهای مانند تاگوچیو طراحی پلاکت بورمن می توان بهره برد .
1-9-1-6-مدل سازی کمی
در طراحی آزمایش، اغلب آزمون ها، از کالیبراسیون خطی ساده در شیمی تجزیه گرفته تا پروسه های فیزیکی پیچیده ،نیازمند مدل سازی ریاضی هستند برای مدل سازی ریاضی روش های مختلف طراحی ترکیب مرکزی و همچنین طراحی کالیبراسیون 2 می توانند مفید واقع شوند .
1-9-1-7-روش سطح پاسخ 3
این روش شامل گروهی از تکنیک های ریاضی و آماری است که بین تابع پاسخ و یک تعداد از متغیرهای کنترل شده رابطه برقرار می کند طراحی های سطح پاسخ برای بدست اوردن اطلاعات دقیق در مورد اثرات فاکتور شامل بزرگی و جهت ان ها استفاده می شوند تعداد فاکتورها نوعا بین 2یا 6 می باشدکه طراحی 3سطحی دارند و به ما اجازه می دهند اثرات خطی ،غیر خطی و برهمکنش دو فاکتور مورد مطالعه را تخمین بزنیم. این طراحی پیش بینی دقیقی از پاسخ در ناحیه ازمایش ها فراهم می کند و در تشخیص شرایط بهینه مفید می باشد اولین مرحله در استفاده از این روش اندازه گیری رابطه ریاضی بین متغیر پاسخ و متغیرهای مستقل می باشد که با رابطه زیر نشان داده می شود .
Y=f(x) β+ε
x : متغیرها
F(x): تابع پاسخ که کمی بوده و تمام محدوده ی ازمایشات را می پوشاند و شامل برهمکنش ها ی احتمالی می باشد
β : بردار ضریب ناشناخته مربوط به پارامترها
ε: خطای تصادفی آزمایش که انتظار می رود میانگین صفر داشته باشد
مدل های ریاضی می توانند برای محاسبه یک یا همه فاکتورها و اثرات آن ها در گستره آزمایش استفاده شوند. مدل های رگرسیون درجه 1و2 می توانند برای آنالیز پاسخ به عنوان تابعی از متغیرهای مستقل استفاده شوند اگر رابطه پیچیده ای بین متغیر پاسخ و متغیرهای مستقل وجود داشته باشد مدل های درجه 1 قادر نیستند به خوبی پاسخ را پیش بینی کنند اما روابط درجه 2از نظر ریاضی پیچیده تر بوده و در یک ناحیه نسبتا کوچک بسیار قابل انعطاف می باشد و می توانند به گستره متفاوتی از اشکال توابع بپردازند یک معادله درجه بالاتر به صورت زیر نشان داده شده است.
Y= β0 + β1 X1+β2 X2+….+β k X k +β11X21 +….+β k k X2k + β12X1X2 +β13X1 X3+…. + βk-1, X k-1Xk+ ε
Yپاسخ است و β0 ثابت معادله است و β1 و β2ضریب فاکتور های اصلی X1 و X2 وβ12 و β13ضریب برهمکنش های دوتایی است. X12 درجه دوم X1 است.ε خطای تصادفی می باشد.
اهداف مدل ریاضی فراهم شده با پاسخ سطح عبارتنداز:
تعیین ویژگی آماری تمام فاکتورها که سطح آن ها با X1,X2,…,Xk نشان داده می شود.
تعیین یک رابطه بین y و متغیرها که می تواند برای پیش بینی مقادیر پاسخ برای یک سری از متغیرها استفاده می شود
تعیین بهینه ترین مجموعه متغیر ها که منجر به پاسخ بیشترین (یا کمترین) در یک محدوده موردنظر بوسیله بهینه سازی همزمان متغیرهای پاسخ انتخاب شده می شود و اطلاعاتی در مورد جهت و بزرگی تاثیر فاکتورها و اثرات ترکیب آن ها بر روی خصوصیات فرایند می دهد.
1-9-2-پردازش داده های چند متغیره
1-9-2-1- آنالیز فاکتوری
آنالیز فاکتوری یکی از کارآمدترین روش های کمومتریکس است که از طریق آن می توان بردارهایی را که فاقد مفاهیم فیزیکی یا شیمیایی بوده و برای ما نامفهوم می باشند را به مفاهیم ی چون غلظت یا طیف تبدیل نمود .
1-9-2-2- آنالیز فاکتوری تکاملی2 (EFA)
هنگامی که پارامتری با یک فرآیند منظم و منطقی تغییر می کند ، دارای فرآیند تکاملی است . تیتراسیون pH متری اسید – باز که توسط روش های اسپکتروفتومتری اندازه گیری می شود مثال خوبی از فرآیندهای تکاملی است . مثلاً در تیتراسیون اسید دو عاملی H2A ، با افزایش pH گونه های HA- , A2- ظاهر می شوند ، یعنی پارامتر دارای تغییرات منظم pH می باشد . EFA از روش های آنالیز فاکتوری و یک ابزار مفید شیمی سنجی برای کنترل فرآیندهای شیمیایی است که توسط میدر3 و همکارانش ارائه شده است. در این روش آنالیز مرتبه به عنوان تابعی از پارامتر با تغییرات منظم (pH ، زمان و ....) صورت می گیرد . این روش به ترتیب از بالا به پایین ماتریس داده (EFA به سمت جلو ) و از پایین به بالا ( EFA به سمت عقب ) برای بررسی ظهور و زوال گونه ها در فرایند بکار می روند . نمودارهای به سمت جلو و عقب EFA با رسم مقادیر ویژه (یا لگاریتم مقادیر ویژه ) بر حسب تابعی از متغیر تکاملی به دست آید . بدین ترتیب با آنالیز متوالی داده های ماتریس می توان ظهور و زوال گونه ها را در فرآیند تکاملی تشخیص داده و تخمینی از پروفایل های غلظتی گونه ها به دست آورد . در آنالیز فاکتوری تکاملی اگر سیستم مورد مطالعه دارای نقصان مرتبه باشد از آنالیز فاکتوری تکاملی برای جبران نقص مرتبه5 (EFARD) استفاده می شود . یک ماتریس زمانی دارای نقص – مرتبه است که تعداد سهم های معنی دار برای واریانس داده ها ، که به وسیله ی SVD 6یا تکنیک های آنالیز فاکتوری مرتبط دیگری تخمین زده می شوند ، کمتر از تعداد واقعی اجزای شیمیایی موجود در سیستم باشند .
یک چنین حالتی غالباً اتفاق می افتد ، برای مثال ، در شروع یک واکنش شیمیایی یا یک فرآیند شیمیایی که بیش از یک گونه حضور دارد ، به جای تعیین تمام اجزای موجود در شروع واکنش ، تنها یکی از آن ها به
طور ریاضی مشتق شده و بقیه ترکیب خطی از آن باشند . تفکیک کامل چنین ماتریس نقص – مرتبه ای به طور کامل انجام نمی شود .
1-9-2-3-روش های آنالیز نرم
در این روش ها نیازی به داشتن اطلاعاتی درباره ی مدل شیمیایی سیستم نبوده و نیازی نیست که مدل سیستم در این روش ها شناخته شده باشد . حُسن این روش ها در این است که می توان حضور گونه هایی که در فرآیند مورد نظر شرکت ندارند ولی در سیستم مورد بررسی سیگنال دارند را شناسایی و پروفایل طیفی و غلظتی آنها را مدل نمود . همچنین خطای ناشی از فرض مدل غلط برای سیستم در این روش ها وجود ندارد و عیب این روش ها این است که معمولاً همراه با ابهامات شدتی یا چرخشی می باشند .
1-8-2-1-تفکیک منحنی چند متغیره – حداقل مربعات متناوب (MCR-ALS) 2
این روش اولین بار در سال 1993 توسط تالر3 و همکارانش ارائه شد. این روش جزو روش های آنالیز نرم می باشد که در آن فرآیندهای شیمیایی بدون نیاز به اطلاعاتی درباره ی مدل شیمیایی سیستم توصیف می شوند . این تکنیک از جمله تکنیک های مدل نرم است که بدون نیاز به اطلاعات زیاد از سیستم قادر است پروفایل های غلظتی و طیفی مورد نظر را از ماتریس داده ها استخراج نماید . با استفاده از روش نرم جهت آنالیز داده ها ، ماتریس داده به صورت حاصلضرب دو ماتریس طیف ST و غلظت C تبدیل می شود . E ماتریس باقیمانده هاست که مدل نتوانسته آنها را شناسایی کند و باید آن ها را جزو خطاهای آزمایشی به حساب آورد:
(1-5) Dm×n = C(m×r)ST(r×n)+E(m×n)
روش های زیادی برای تفکیک ماتریس D به ماتریس غلظت و طیف خالص اجزا وجود دارد که SVD یکی از این تکنیک هاست . اما همانطور که گفته شد تفکیک ماتریس داده ها با ابهامات شدتی و چرخشی همراه
است که باعث می شوند تعداد زیادی جفت ماتریس S*,C* از تفکیک ماتریس داده ی D بوجود آیند که S,C مد نظر نیستند . لذا باید از این تعداد زیاد زوج های s*,C* ، بتوان S,C واقعی را جدا کرد .
ابهام چرخشی ، از چرخش ماتریس های S,C توسط تبدیل T ایجاد می شود که همان ترکیب خطی ماتریس های S,C است :
(1-6) D(m×n)=C(m×r)T(r×r)-1ST(r×n)=C*S*T
(1-7)C*=CT
(1-8) S*T=T-1ST
این ابهام سبب ایجاد بردارهایی با شکل های متفاوت از حالت های مورد انتظار می شود ، لذا تشخیص این ابهام آسانتر است .
ابهام شدتی ، این ابهام در اثر ضرب یک اسکالر در ماتریس های S,C بوجود می آید . در نتیجه ی این ابهام ممکن است بردارهایی با شکل هایی دقیقاً یکسان ایجاد شوند بدون اینکه بردارهای واقعی باشند ، لذا تشخیص این ابهام به ظرافت بیشتری نیاز دارد .
(1-9)
(1-10)
(1-11) S*T = kST
1-9-2-5- الگوریتم اجرای تکنیک MCR-ALS
1) تشخیص تعداد گونه های موجود در ماتریس داده و بازسازی داده ها با استفاده از تعداد فاکتورهای معنی دار در سیستم .
(1-12)
2) محاسبه ی تخمین اولیه ، که می تواند غلظت یا طیف باشد .
3) محاسبه ی ماتریس طیف ( با فرض تخمین اولیه غلظتی ) و اعمال محدودیت بر روی آن.
(1-13)
4) محاسبه ی ماتریس غلظت و اعمال محدودیت بر روی آن
(1-14)
5) بازسازی ماتریس داده ی () با ضرب کردن ماتریس طیف و غلظت به دست آمده به ترتیب در مرحله ی 3 و 4

–229

1-3-1-3) غلافهای بیضهبیضه توسط سه غلاف پوشیده می شود که از خارج به داخل شامل: تونیکا واژینالیس، تونیکا آلبوژینه و تونیکا واسکولوزا می باشد(حسن زاده، 1391).
1-3-1-4) تونیکا واژینالیسیک غلاف صفاقی دو لایه است که دارای یک لایه ی احشایی و یک لایه ی جداری می باشد. لایه ی جداری آن به فاسیای اسپرماتیک داخلی که داخلی ترین لایه ی اسکروتوم است، متصل شده و لایه ی احشایی آن به تونیکا آلبوژینه می چسبد. کنار خلفی بیضه و اپی دیدیم توسط تونیکا واژینالیس پوشیده نشده اند. در این محل لایه های جداری و احشایی تونیکا واژینالیس در امتداد یکدیگر قرار می گیرند. لایه ی احشایی این غلاف، وارد فضای بین اپی دیدیم و سطح خارجی بیضه شده و سینوس اپی دیدیم را می سازد. تونیکا واژینالیس، انتهای دیستال پروسسوس واژینالیس است. پروسسوس واژینالیس، یک استطاله ی صفاقی است که در هنگام نزول بیضه در دوران جنینی آن را همراهی می کند و پس از ورود بیضه به کیسه بیضه، مسدود می شود. این استطاله ممکن است کاملاً از بین برود و یا بصورت یک نوار لیفی در ضخامت طناب اسپرماتیک باقی بماند(حسن زاده، 1391).
1-3-1-5) تونیکا آلبوژینایک غلاف سفید مایل به آبی است که از جنس بافت همبند متراکم می باشد. این غلاف در طول کنار خلفی بیضه ضخیم تر شده، مدیاستینوم بیضه را بوجود می آورد. عروق و اعصاب بیضه از طریق این ناحیه وارد بیضه می شوند. تعدادی تیغه بنام تیغه های بیضه از مدیاستینوم بیضه وارد بیضه شده وآن را به حدود 250 لبول ناقص تقسیم می کنند. هر لبول بیضه دارای یک تا سه مجرای اسپرم ساز پیچ در پیچ می باشد. مجاری اسپرم ساز به مجاری مستقیمی ختم می شوند که در مدیاستینوم بیضه یک شبکه بنام شبکه ی بیضه تشکیل داده اند. شبکه ی بیضه با مجاری افرنت ارتباط داشته و از این طریق با سر اپی دیدیم مرتبط می شوند(حسن زاده، 1391).
1-3-1-6) تونیکا واسکولوزااز جنس بافت همبند سست بوده و حاوی عروق خونی فراوان می باشد. این غلاف سطح داخلی غلاف آلبوژینه را پوشانده و همراه با تیغه های آن وارد بیضه می شود(حسن زاده، 1391).
1-3-1-7) عصب گیری بیضه
اعصاب بیضه و اپی دیدیم همراه با شریان بیضه نزول می کنند. این اعصاب از شبکه های کلیوی و آئورتیک مشتق می شوند. الیاف سمپاتیک آن از دهمین و یازدهمین سگمان نخاع سینه ای می باشند. دردهای بیضه در قسمت تحتانی جدار شکم حس می شوند.
1-3-2) مجرای دفران مجرایی است به طول 40 تا 50 سانتی متر که از دم اپی دیدیم شروع می شود. این لوله ابتدا در مجاورت کنار خلفی بیضه، در داخل اپی دیدیم صعود می کند. در مجاورت انتهای فوقانی بیضه، مجرای دفران در قسمت خلفی طناب اسپرماتیک قرار گرفته و در ضخامت آن صعود می کند. همراه با طناب اسپرماتیک از کانال اینگوینال عبور کرده و در سوراخ عمقی اینگوینال، طناب را ترک می کند. سپس شریان اپی گاستریک تحتانی را از خارج دور زده و در جلوی شریان ایلیاک خارجی صعود می کند. پس از آن، بطور مایل بطرف عقب و پایین می آید و بعد از تقاطع با عروق ایلیاک خارجی، وارد لگن کوچک می شود. این مجرا در حالیکه نسبت به شریان مسدود شده ی نافی، عروق و عصب ابتراتور و عروق مثانه ای در داخل قرار گرفته، از بین جدار خارجی لگن و صفاق بطرف عقب می رود. سپس با حالب تقاطع کرده و در سطح خلفی مثانه قرار می گیرد. در سطح خلفی مثانه، در حالی که نسبت به سمینال وزیکول در داخل قرار گرفته نزول می کند و بتدریج در مجاورت مجرای طرف مقابل قرار می گیرد. در قاعده ی پروستات مجرای دفران با مجرای سمینال وزیکول پیوند شده، مجرای انزالی ایجاد می شود. مجرای دفران در خلف مثانه متسع و پیچ دار می شود. این قسمت از مجرای دفران را آمپول می نامند. با توجه به اینکه جدار مجرای دفران ضخیم است و مجرای داخلی آن کوچک می باشد، در هنگام لمس این مجرا به شکل طناب است(حسن زاده، 1391).
1-3-2-1) ساختمان مجرای دفرانمجرای دفران شامل سه طبقه ی مخاطی، عضلانی و همبندی است. مخاط آن دارای چینهای طولی بوده و اپی تلیوم آن از نوع مطبق کاذب است که سلولهای منشوری آن فاقد مژه می باشند. طبقه ی عضلانی ضخیم بوده و از دو لایه طولی داخلی و خارجی تشکیل شد ه است که یک لایه حلقوی در بین آن ها قرار می گیرد.
1-3-2-2) عصب گیریمجرای دفران از شبکه هیپوگاستریک عصب گیری می کند.
1-3-3) مجاری ابرنتیک مجرای باریک و بن بست به نام مجرای ابرنت دمی به قسمت دمی اپی دیدیم یا ابتدای مجرای دفران متصل می شود. این مجرا 5 تا 35 سانتی متر طول دارد و فاقد پیچ و خم است.
یک مجرای ابرنت سری نیز بر روی سر اپی دیدیم دیده می شود که با شبکه بیضه ارتباط دارد. مجاری ابرنت از مجاری مزونفریک مشتق می شوند.
1-3-4) پارادیدیممجموعه ی کوچکی از مجاری پیچ و خم دار است که در جلوی طناب اسپرماتیک در بالای سر اپی دیدیم قرار دارند. این مجاری بقایای مزونفروس هستند.
1-3-5) طناب اسپرماتیکطناب اسپرماتیک از سوراخ عمقی کانال اینگوینال تا بیضه امتداد می یابد. این طناب شامل مجرای دفران، شریان مجرای دفران، عروق و اعصاب بیضه می باشد. عناصر فوق توسط سه لایه احاطه شده اند که این سه لایه در اطراف بیضه نیز قرار می گیرند و عبارتند از: فاسیای اسپرماتیک داخلی، فاسیای کرماستریک و فاسیای اسپرماتیک خارجی. در دوران جنینی، هنگامی که بیضه نزول می کند، از داخل کانال اینگوینال عبور کرده، وارد اسکروتوم می شود. در این مرحله عناصری که همراه بیضه هستند (مجرای دفران، عروق مجرای دفران و بیضه و اعصاب بیضه )، لایه هایی از جدار شکم را با خود به طرف اسکروتوم می برند. فاسیای اسپرماتیک داخلی، یک لایه ی نازک و سست است که از فاسیای عرضی شکم مشتق می شود. فاسیای کرماستریک شامل الیاف عضلانی و مقداری بافت همبند سست است که در امتداد عضله مایل داخل شکم قرار می گیرد. فاسیای اسپرماتیک خارجی یک لایه ی متراکم است که در امتداد نیام عضله ی مایل خارجی شکم می باشد. بنابراین مشخص می شود که در داخل کانال اینگوینال، فاسیای اسپرماتیک خارجی وجود ندارد. طناب اسپرماتیک چپ کمی طویل تر از طناب اسپرماتیک راست می باشد. به همین دلیل بیضه ی چپ پایین تر از بیضه ی راست قرار می گیرد. طناب اسپرماتیک در بین سوراخ سطحی کانال اینگوینال و بیضه از جلوی تندون عضله ی آدوکتورلونگوس عبور می کند. شریان پودندال خارجی سطحی از جلو و شریان پودندال خارجی عمقی از عقب با طناب تقاطع می کنند. عناصری که درون طناب اسپرماتیک قرار دارند، عبارتند از: مجرای دفران، شریان بیضه، شریان مجرای دفران، شریان کرماستریک ( شاخه ای از شریان اپی گاستریک تحتانی)، شبکه ی پیچک مانند و وریدهای بیضه، عروق لنفاوی بیضه، شاخه ی ژنیتال عصب ژنیتوفمورال (L2 ) و اعصاب بیضه. در لابلای عناصر فوق مقداری بافت همبند سست قرار می گیرد .
1-3-6) اسکروتوم یا کیسه بیضهکیسه ای است که در پایین سمفیزیس پوبیس، در بین سطوح قدامی داخلی رانها قرار دارد. بیضه ها، اپی دیدیمها و قسمت های تحتانی طنابهای اسپرماتیک درون این کیسه قرار می گیرند. اسکروتوم از دو نیمه ی راست و چپ تشکیل شده است که توسط یک سجاف پوستی به یکدیگر متصل می شوند. این سجاف پوستی در جلو در سطح تحتانی پنیس ودر عقب در خط میانی پرینه تا مقعد امتداد می یابد و بیانگر مبدأ دو طرفه ی اسکروتوم از برجستگیهای لبیواسکروتال است. اسکروتوم در افراد پیر و در هنگام گرما، صاف و آویزان شده ولی در افراد جوان و در هنگام سرما کوتاه و چین خورده است. لایه های کیسه بیضه عبارتند از: پوست، عضله ی دارتوس، فاسیای اسپرماتیک خارجی، فاسیای کرماستیک و فاسیای اسپرماتیک داخلی. پوست اسکروتوم نازک، قابل کشش وتیره رنگ است. این پوست دارای چین های عرضی است که از سجاف میانی به طرف خارج می روند. عضله ی دارتوس یک لایه ی نازک از الیاف عضلانی صاف است که در امتداد لایه ی سطحی فاسیای سطحی شکم قرار می گیرند. عضله ی دارتوس در تشکیل تیغه ی اسکروتال که دو بیضه را از یکدیگر جدا می کند، شرکت می نماید. اتصال عضله ی دارتوس به پوست بسیار محکم ولی به لایه های زیرین سست است. یک نوار لیفی عضلانی بنام رباط اسکروتال از عضله ی دارتوس به انتهای تحتانی بیضه متصل می شود که در تنظیم درجه حرارت بیضه نقش دارد. فاسیای اسپرماتیک داخلی که فاسیای اینفاندیبولیفورم نیز نامیده می شود به سستی به لایه ی جداری تونیکا واژینالیس متصل م
ی گردد(حسن زاده، 1391).
1-3-6-1) عصب گیری
13 قدامی اسکروتوم از طریق عصب ایلیواینگوینال و شاخه ی ژنیتال عصب ژنیتوفمورال از اولین عصب نخاعی کمری (L1) عصب گیری می کند. 23 خلفی اسکروتوم از طریق شاخه های اسکروتال خلفی عصب پودندال و شاخه های پرینه آل عصب جلدی رانی خلفی از سومین عصب نخاعی خاجی (S3) عصب گیری می کند. عضله ی دارتوس از الیاف سمپاتیک همراه با شاخه های ژنیتال عصب ژنیتوفمورال عصب گیری می کند(حسن زاده، 1391).
1-3-7) سمینال وزیکولهاهر سمینال وزیکول لوله ی بن بستی است که به دور خود پیچ خورده و حالت لوبولی دارد. طول این عضو هرمی شکل 5 سانتی متر است و قاعده اش متوجه بالا، عقب و خارج می باشد. سطح قدامی سمینال وزیکول با قاعده ی مثانه مجاورت دارد و سطح خلفی آن به واسطه ی فاسیای رکتووزیکال ( فاسیای دنون ویلیه) از رکتوم جدا می شود. رأس این عضو در پایین، بصورت یک لوله ی مستقیم است که به آن آمپول مجرای دفران متصل شده و در تشکیل مجرای انزالی شرکت می کند. هر سمینال وزیکول در داخل با آمپول مجرای دفران، در خارج با وریدهای شبکه ی پروستاتیک که به ورید ایلیاک داخلی تخلیه می شوند ودر پایین با پروستات مجاورت دارد(Snell ,2008).
1-3-7-1) ساختمان سمینال وزیکولجدار سمینال وزیکول از سه لایه تشکیل می شود: طبقه ی مخاطی، طبقه عضلانی و طبقه آدوانتیس. مخاط دارای چین های متعدد بوده و اپی تلیوم آن مطبق کاذب یا منشوری ساده است. طبقه ی عضلانی نازکتر از طبقه ی عضلانی مجرای دفران می باشد و از یک لایه طولی خارجی و یک لایه حلقوی داخلی تشکیل شده است. بافت همبند آدوانتیس دارای تعدادی الیاف الاستیک می باشد . 70 درصد مایع منی توسط سمینال وزیکولها ترشح می شود(Snell ,2008).
1-3-7-2) عصب گیری
سمینال وزیکول ها از شبکه های لگنی، عصب گیری می کنند. الیاف سمپاتیک که از اولین گانگلیون کمری خارج می شوند، به عنوان عصب حرکتی عضلات جدار سمینال وزیکولها عمل می کنند و تحریک آنها باعث تخلیه ترشحات این عضو می گردد(Snell ,2008)..
1-3-8) مجرای انزالیهر مجرای انزالی، لوله ای است به طول 2 سانتیمتر که از اتصال مجرای دفران به مجرای سمینال وزیکول ایجاد می شود. این مجرا از قاعده ی پروستات شروع شده، از بین لوب میانی و لوب های راست و چپ پروستات به طرف پایین و جلو آمده و در روی کولیکولوس سمینالیس باز می شود. دو مجرای انزالی در ضخامت پروستات به یکدیگر نزدیک شده و در طرفین اوتریکول پروستاتی به کولیکولوس سمینالیس می رسند(Snell ,2008).
1-3-8-1) ساختمان
مخاط مجاری انزالی مشابه مجاری دفران است ولی این ساختمان فاقد لایه ی عضلانی می باشد. مجرای انزالی از خارج توسط بافت همبند احاطه می شود که با استرومای پروستات یکی می شود(Snell ,2008)..
1-3-9) پروستات
عضوی مخروطی شکل یا مشابه شاه بلوط است که در زیر گردن مثانه قرار گرفته، قاعده آن در بالا و رأس آن در پایین می باشد. این عضو، پیشابراه پروستاتی را در بر می گیرد. پروستات دارای یک سطح قدامی، یک سطح خلفی و دو سطح تحتانی خارجی می باشد. قطر عرضی قاعده ی این عضو تقریباً 4 سانتی وقطر قدامی خلفی آن تقریباً 2 سانتی متر است. ارتفاع پروستات تقریبا ً3 سانتیمتر و. وزن این عضو تقریباً 8 گرم می باشد. قاعده پروستات با گردن مثانه مجاورت داشته و پیشابراه از این سطح وارد پروستات می گردد. رأس این عضو در پایین ترین قسمت قرار گرفته و پیشابراه پروستاتی از جلوی آن خارج می شود. سطح قدامی باریک و محدب است و تقریباً 2 سانتی متر عقب تر از سمفیزیس پوبیس قرار می گیرد. پیشابراه از پایین ترین قسمت این سطح، در مجاورت رأس، خارج می شود. سطح خلفی به طور عرضی مسطح و بطور عمودی محدب است و توسط فاسیای رکتووزیکال (فاسیاید نون ویلیه) از رکتوم جدا می شود. مجاری انزالی درست در زیر مثانه وارد این سطح می شوند. سطوح تحتانی خارجی با بخشهای قدامی عضلات لواتورآنی مجاورت دارند(حسن زاده، 1391)..
1-3-9-1) ساختمان پروستات
پروستات از 30 تا 50 غده ی لوله ای حبابی تشکیل شده است و توسط یک کپسول همبندی سرشار از الیاف عضلانی صاف احاطه می شود. آلوئلهای ترشحی و مجاری بسیار نامنظم هستند و اپی تلیوم آنها از نوع منشوری ساده یا مطبق کاذب است. نزدیک به 30 درصد مایع منی توسط پروستات ترشح می شود که این ترشحات به سینوس های پروستات در پیشابراه پروستاتی می ریزند. غالباً در مجرای پروستات اجسام مدور کوچکی از جنس گلیکوپروتئین دیده می شود که به آنها اجسام آمیلاسه می گویند. با افزایش سن بر تعداد اجسام آمیلاسه افزوده می شود(حسن زاده، 1391)..
1-3-9-2) لوب های پروستاتبطور قراردادی پروستات را به 5 لوب تقسیم می کنند که عبارتند از: لوب قدامی، لوب میانی، لوب خلفی و دو لوب خارجی البته بایستی توجه داشت که مرز کاملاً مشخصی بین این لوبها وجود ندارد. لوب قدامی ناحیه ی کوچکی در جلوی پیشابراه است که از نظر ترشحی اهمیت زیادی ندارد. لوب میانی در اطراف پیشابراه پروستاتی قرار داشته و ممکن است در سنین بالای 50 سال دچار هیپرتروفی خوش خیم گردد. بقیه غده مجموعه ای از لوب های خارجی و خلفی می باشد که برای راحتی بیان تحت عنوان لوب های چپ و راست نامگذاری می گردد. اهمیت لوب های چپ و راست از آن جهت است که بیشترین تغییرات سرطانی در این نواحی مشاهده می شود (حسن زاده، 1391).
1-3-9-3) عصب گیری
عصب گیری این عضو از شبکه ی هیپوگاستریک تحتانی می باشد. الیاف سمپاتیک باعث انقباض الیاف عضلانی و تخلیه غده در هنگام انزال می شوند. الیاف پاراسمپاتیک از اعصاب احشایی لگنی می باشند(حسن زاده، 1391).
1-3-10)غدد بولبواورترالغدد بولبواورترال یا غدد کوپر، یک جفت عضو مدور، کوچک و زرد رنگ هستند که تقریباً یک سانتی متر قطر داشته و در طرفین پیشابراه غشایی قرار می گیرند. این غدد در سنین بالا کوچکتر می شوند. مجرای خروجی هر غده تقریباً 3 سانتی متر طول دارد و در خارج مخاط پیشابراه غشایی بطور مایل بطرف جلو می رود. این مجرا پس از سوراخ کردن فاسیای دیافراگماتیک تحتانی (غشاء پرینه آل ) در کف پیشابراه اسفنجی باز می شود. سوراخ مجرای فوق، 5/2 سانتی متر پایین تر از غشاء پرینه آل قرار می گیرد(حسن زاده، 1391)..
1-3-10-1) ساختمان
غدد بولبواورترال از نوع غدد لوله ای – حبابی با اپی تلیوم مکعبی ساده هستند. در جدار این غدد الیاف عضلانی صاف و مخطط دیده می شود. ترشحات موکوسی غدد بولبواورترال به عنوان نرم کننده ی مجرا عمل می کنند(حسن زاده، 1391)..
1-4) سلول های سری اسپرماتوژنزسلول های سری اسپرماتوژنز، سلول های متفاوتی از بافت پوششی لوله های منی ساز هستند که در 4 تا 8 لایه در کنار یکدیگر قرار گرفته و فضای بین لایه قاعده ای تا مجرای لوله را اشغال می کنند. این سلول ها به ترتیب در برگیرنده چند نسل سلول های اسپرماتوگونی با عنوان گروه A وB روی غشای پایه وسپس یک نسل اسپرماتوسیت اولیه، یک نسل اسپرماتوسیت ثانویه، یک نسل اسپرماتید ویک نسل اسپرماتوزوئید است(Eurell and Frappier, 2006).
1-5) سلولهای پشتیبان یا سرتولیسلول های سرتولی، سلولهای هرمی شکل هستند که قاعده آنها به لایه بازال میچسبد، در حالی که انتهای رأسی آنها معمولاً تا مجرای لوله منی ساز امتداد می یابد. این زوائد به عنوان مجراهایی هستند که سلولهای زایا در مراحل مختلف رشد و تکامل دربین آنها قرار داشته و به سمت مجرا حرکت می کنند. بعد از بلوغ اسپرماتوسیت ها، اتصالات محکم جدیدی بین زوائد سلولهای سرتولی در پشت آنها پدید می آید و اتصالات قدیمی جلوی آنها باز می شود و به این ترتیب بدون درهم ریختن جامعیت سد خونی- بیضوی که توسط سیتوپلاسم سلولهای سرتولی ایجاد شده است، اسپرماتوسیتها از بخش قاعده ای به بخش مجرائی عبور میکند. سیتوپلاسم این سلولها به عنوان فیلتر عمل کرده و تنها به مواد خاصی اجازه عبور می دهند(بیگدلی، 1383). این سد در حفظ سلولهای زایای جنس مذکّر در مقابل مواد مضر موجود در خون دارای اهمیت است. در زیر این اتصالات، اسپرماتوگونی ها در یک محوطه قاعده ای قرار می گیرند و در نتیجه به راحتی به مواد درون خون دسترسی می یابند. هنگام اسپرماتوژنز، سلولهای اسپرماتوسیت لپتوتن نهایی و زیگوتن، از این اتصالات گذشته و در محوطه جنب مجرایی قرار می گیرند. از اینجا به بعد، مراحل پیشرفته تر اسپرماتوژنز به کمک سد خونی- بیضوی از دسترس مواد موجود در خون حفظ می شوند. سلول های سرتولی بوسیله اتصالات شکافدار نیز به هم متصل شده اند که خود سبب ایجاد ارتباط یونی و شیمیایی بین سلولها می شود. چنانچه در انسان و حیوانات دیگر شرایط نامطلوبی مانند عفونت، سوء تغذیه و تشعشع اشعه X به سلول های سرتولی آسیب برساند، باعث اختلال سریع در فرایند اسپرماتوژنز می شود و در صورت مرگ سلولهای سرتولی، نا باروری دائمی رخ خواهد داد (Junqueira , 2005).
سلولهای سرتولی با همکاری سد خونی- بیضوی اعمالی همچون؛ پشتیبانی، حفاظت و تغذیه اسپرماتوزوئیدهای درحال تکامل، فاگوسیتوز در حین اسپرمیوژنز را انجام می دهند. سیتوپلاسم باقیمانده اسپرماتیدها به صورت اجسام باقیمانده از آنها جدا گشته و توسط سلولهای سرتولی فاگوسیته و توسط لیزوزوم آنها تجزیه می گردند، علاوه براین چنانچه ذرات خارجی و باکتریها بدینجا رسیده باشند توسط سلولهای سرتولی بیگانه خواری می شوند (جلوگیری از واکنشهای اتوایمن) ترشح سلولهای سرتولی به طور مداوم مایعی به درون لوله های منی ساز ترشّح می کنند که در جهت مجاری تناسلی جریان یافته و برای حمل اسپرم به کار می رود. با کنترل هورمونFSH، یک پروتئین متصل شونده به آندروژن (ABP) ترشح می کند که مسئول تغلیظ تستوسترون در درون لوله های منی ساز می باشد(رجحان، 1376). سلولهای سرتولی قادر به تبدیل تستوسترون به استرادیول هستند. این سلول ها پپتیدی به نام اینهیبین نیز ترشح می کنند که ساخت و آزاد شدن FSH در بخش قدامی غده هیپوفیز را مهار می کند. همچنین تولید هورمون آنتی مولرین، که یک گلیکوپروتئین است و در دوره جنینی، تحلیل مجاری مولر را در جنین مذکر تحریک می کند (Junqueira, 2005).

1-6) اسپرماتوژنزفرآیند تولید اسپرماتوزوئیدها را اسپرماتوژنز می گویند. اسپرماتوژنز در توبول های سمینیفر به طور معمول از ۱۳ سالگی و در نتیجه تحریک هورمون های گنادوتروپیک هیپوفیز قدامی شروع میشود و تا پایان زندگی ادامه مییابد (Guyton and Hall, 2006). تولید اسپرم بطور پیوسته در سرتاسر دوره زندگی تولیدمثلی مرد انجام میشود، تقریبأ ۲۰۰-۱۰۰ میلیون اسپرم روزانه تولید میشود. برای تولید این مقدار انبوه، نیاز است که اسپرماتوگونی ها با تقسیمات سلولی طی چرخه اسپرماتوژنز خود را تجدید کنند (Junqueira, 2005). چرخه اسپرماتوژنز در همه جانوران الگوی یکسان دارد و از سه مرحله مجزا تشکیل میشود:
1-6-1) اسپرماتوسیتوژنزاین فرآیند از یک سلول زایای اولیه (اسپرماتوگونی) که مجاورلایه قاعده ای قرار گرفته است، آغاز میشود. به هنگام بلوغ جنسی، این سلول دستخوش یک سری تقسیم میتوز شده و سلولهایی که تازه تشکیل شدهاند، یکی از این دو راه را انتخاب میکنند: این سلولها ممکن است بعد از یک یا چند تقسیم میتوزی باز به تقسیم ادامه داده و به صورت سلولهای بنیادی تمایز نیافته به نام اسپرماتوگونی نوع A درآیند و یا در حین چرخههای پیش رونده میتوزی به اسپرماتوگونی نوع B تمایز حاصل کنند. اسپرماتوگونی نوع B نیز به نوبت به اسپرماتوسیتهای اولیه تبدیل میشود Junqueira, 2005)).


1-6-2) میوزاسپرماتوسیتهای اولیه، کمی پس از تشکیل در اولین تقسیم میوزی وارد پروفاز میشوند. در این هنگام اسپرماتوسیت دارای ۴۶ کروموزوم وn۴،DNA میباشد. سلول در طی پروفاز یک، از چهار مرحله عبور میکند- لپتوتن، زیگوتن، پاکیتن و دیپلوتن و وارد مرحله دیاکینز میشود که در این مرحله کروموزومها از یکدیگر جدا میشوند. در طی این مراحل از تقسیم میوز، تقاطع ژنهای ۱۶ کروموزومی با یکدیگر صورت میگیرد. پس از آن سلول وارد مرحله متافاز میشود و کروموزومها در مرحله آنافاز به سمت قطبها حرکت میکنند. از آنجائیکه مرحله پروفاز در این تقسیم در حدود ۲۲ روز به طول میانجامد، بیشتر سلولهایی که در مقاطع بافت شناسی مشاهده میشوند، در این مرحله قرار دارند. اسپرماتوسیت های اولیه بزرگترین سلولهای دودمان اسپرماتوژن هستند. از تقسیم اول میوز سلولهای کوچکتری به نام اسپرماتوسیت های ثانویه که تنها دارای ۲۳ کروموزوم (X+۲۲،Y+۲۲) هستند، حاصل میشوند. این کاهش تعداد کروموزوم از ۴۶ به ۲۳ همراه با کاهش مقدار DNA از n۴ به n۲ در هر سلول می باشد. مشاهده اسپرماتوسیتهای ثانویه در برشهای بافتی مشکل است. چون این سلولها دارای عمر کوتاه بوده و مدت زمان بسیار کوتاهی در مرحله اینترفاز باقی مانده (۲ تا ۳ روز) سریعأ وارد دومین مرحله تقسیم میوزی میگردند. از تقسیم اسپرماتوسیتهای ثانویه، اسپرماتیدها به وجود میآیند که دارای ۲۳ کروموزوم هستند. چون مرحله S یعنی مرحله سنتز DNA بین تقسیمات اول و دوم میوزی اسپرماتوسیتها وجود ندارند، لذا مقدار DNA موجود در اسپرماتیدها به نصف مقدار DNA اسپرماتوسیتهای ثانویه تقلیل یافته و شامل n ۱ کروموزوم میشود. بنابراین،فرآیند میوز سبب تشکیل سلولهایی با تعداد کروموزومهای هاپلوئید (n۱) میشود. در هنگام لقاح سلولهای جنسی، این تعداد مجددأ به تعداد دیپلوئید طبیعی میرسد. در واقع فرآیند میوز وجود تعداد ثابتی از کروموزومها را در هرگونه از جانوران تضمین میکند(Junqueira, 2005).
1-6-3) اسپرمیوژنزاسپرماتیدها سلولهایی هستند که در نتیجه تقسیم ثانویه اسپرماتوسیتها به وجود میآیند. این سلولها را میتوان به کمک اندازه کوچک آنها، هسته دارای کروماتین متراکم و قرارگیری در نزدیکی مجرای لوله های منی ساز تشخیص داد. اسپرماتیدها دستخوش یک فرآیند پیچیده تمایز، موسوم به اسپرمیوژنز میشوند که بطور خلاصه شامل مراحل زیر است: تشکیل آکروزوم، متراکم و طویل شدن هسته، تشکیل تاژک و دفع مقدار زیادی از سیتوپلاسم به صورت اجسام باقیمانده نتیجه نهایی این فرآیند تولید اسپرماتوزوئید بالغ است که به واسطه فرآیندی موسوم به اسپرمیاسیون به درون مجرای لولههای منی ساز آزاد میشود. در تقسیم سلولهای اسپرماتوگونیا، عمل سیتوکینزیز غیر کامل است، یعنی سیتوپلاسم آنها از هم جدا نمیشود. حاصل تقسیم یک اسپرماتوگونیا، تعداد زیادی اسپرماتوسیت اولیه، ثانویه و اسپرماتید متصل بهم حاصل می باشد که سیتوپلاسم آنها بوسیله پلی بهم متصل بوده و بصورت سین سی تیوم هستند و بعد از تکامل اسپرماتوزونها، اجسام باقیمانده از آنها جدا شده و هر اسپرم منفردا از زنجیره سین سی تیوم جدا میشود (رجحان، 1376).
1-7) مورفولوژی اسپرماسپرم از لحاظ ساختمانی به دو بخش سر و دم تقسیم میشود. سر اسپرم در بیشتر گونهها از جمله پستانداران عمدتأ به شکل پهن و بیضی شکل است و در جوندگان سر اسپرم داسی شکل می باشند (ضمیری، 1385).
1-7-1) سر اسپرم
ساختار سر اسپرم از دو جزء هسته و آکروزوم تشکیل گشته است:
الف- هسته سر اسپرم واجد کروموزوم هاپلوئیدی است که در هنگام لقاح با هسته n کروموزومی تخمک ادغام گشته و موجب تشکیل تخم 2n کروموزومی میگردد. ویژگیهای هسته اسپرم n کروموزومی بودن و داشتن کروماتین بسیار متراکم و یکنواخت می باشد (Eddy et al, 2004). مهمترین عاملی که باعث این فشردگی شدید شده است، جایگزینی پروتئینهای پروتامین به جای پروتئینهای DNA که هیستونها هستند میباشد. این تراکم و فشردگی باعث محافظت DNA در برابر صدمات فیزیکی و شیمیایی میشود (Knobi and Neills, 2006).
ب- آکروزوم: قسمت قدامی هسته توسط آکروزوم پوشیده شده که واجد دو غشاء داخلی و خارجی است، که این دو غشا در انتهای خلفی به همدیگر متصل میشوند. کلاهک آکروزومی مقادیر متنابهی از آنزیم های هیدرولیتیک و پروتئولیتیک دارد. زمانی که پدیده ظرفیت گیری اسپرماتوزوآ در لوله رحمی صورت می پذیرد، این انزیم ها آزاد شده و برای ایجاد نفوذ پذیری در پرده شفاف اووسیت ها، وارد عمل می شوند. ناحیه خلفی آکروزوم جایی است که کلاهک نازک شده و مواد درون آن متراکم تر می شوند. این ناحیه بخش استوایی آکروزوم اطلاق می شود (Eurell and Frappier, 2006). ازجمله آنزیم های هیدرولیتیک آکروزوم آنزیم هیالورونیداز است که اسپرم توسط این آنزیم اتصالات بین سلول های کومولوس را از بین می برد و خود را به تخمک می رساند. آنزیم مهم دیگر آکروزین است که اسپرم توسط آن زوناپلوسیدا را تجزیه می کند(ضمیری، 1385).
1-7-2) دم اسپرمدم ساختاری تاژک مانند است که موجبات حرکت اسپرم را بوجود آورده و نیروی لازم جهت حرکت اسپرم را نیز فراهم میکند (ضمیری، 1385) و از ۴ قسمت گردن، قطعه میانی- اصلی و انتهایی تشکیل شده است.

تصویر 1-1. ساختمان طبیعی اسپرم انسان (Parsiteb, 2013)1-7-3) اسپرم های غیر طبیعیبین ظاهر طبیعی اسپرم و تحرک آن، رابطه ی مستقیمی وجود دارد. در تمام انزالها، تعدادی اسپرم غیرطبیعی حضور دارد. ارزیابی مورفولوژی اسپرم پس از رنگ آمیزی با ائوزین- نگروزین انجام میگیرد. اسپرمهای غیرطبیعی به ۵ گروه زیر تقسیم میشوند:
الف- بدون دم
ب- سر غیر طبیعی
ج- ساختارهای غیر طبیعی دم
د- ساختارهای غیر طبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پیشین
ه- ساختارهای غیر طبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پسین (Hafez, 2000)

تصویر 2-1 انواع شکل های اسپرم(blogfa, 2013)1-8) سرنوشت و اعمال آندروژن ها1-8-1) آندروژن های داخل بیضه ایتستوسترون حاصل از سلولهای لایدیگ چندین عملکرد و سرنوشت در پیش دارد. به دلیل نزدیکی سلولهای لایدیگ- لوله های سمینیفر مقادیر زیادی از تستوسترون به لوله های سمینیفر انتشار می یابند و در جزء ادولومینال به واسطهABP تغلیط می شوند. سطوح تستوسترون در لوله های سمینیفری در مقایسه با غلظت گردش خون 100 برابر بیشتر است، زیرا برای اسپرماتوژنز طبیعی نیاز مطلق به تستوسترون وجود دارد. سلولهای سرتولی آنزیمی به نام CYP19(آروماتاز) بیان میکنند که مقادیر اندکی تستوسترون را به استروژن بسیار قوی به نام استرادیول 17- بتا تبدیل میکند. سلولهای اسپرم انسان حداقل یک گیرنده استروژن را بیان می کنند (Bern et al, 2010).
1-8-2) تبدیل محیطی استروژندر چندین بافت به ویژه در بافت چربی، تستوسترون به استروژن تبدیل می شود.استروژن محیطی نقشی مهم در بلوغ سازی استخوان و زیست شناسی مردان، پیش برد حساسیت انسولینی، بهبود پروفایل های لیپوپروتئینی(یعنی افزایش HDL، کاهش LDL و تری گلیسرید) و اعمال فیدبک منفی بر گنادوتروپین های هیپوفیز ایفا می کند(Bern et al, 2010).
1-8-3)تبدیل محیطی دی هیدروتستوسترونتستوسترون از طریق آنزیم 5- آلفا- ردوکتاز به آندروژن غیر قابل آرومانیز به نام 5- آلفا- دی هیدروتستوسترون (DHT) تبدیل می شود. دو ایزوفرم برای آنزیم 5-آلفا-ردوکتاز وجود دارد.به نام های 5-آلفا-ردوکتاز نوع 1 و 5-آلفا-ردوکتاز نوع 2. جایگاههای اصلی بیان 5-آلفا-ردوکتاز نوع2 مجرای تناسلی مرد، پوست تناسلی، فولیکول مو وکبد می باشد. 5- آلفا- ردوکتاز نوع 2 هورمون DHT را تولید میکند که برای عضلانی سازی اندام تناسلی خارجی در رحم و برای بروز بسیاری از تغییرات مرتبط با بلوغ از جمله رشد و فعالیت غده پروستات، رشد آلت تناسلی، کدر شدن و چین خوردگی های اسکروتوم، رشد مو در بدن و صورت و افزایش توده عضلانی فرد لازم است. بیان 5-آلفا-ردوکتاز نوع 1 با بلوغ جنسی اتفاق می افتد. این ایزوفرم در پوست بیان شده و در فعالیت غده سباسیوس و بروز آکنه در هنگام بلوغ دخالت دارد (Bern et al, 2010).
1-8-4) اعمال محیطی تستوسترونتستوسترون عملکرد سلولهای سرتولی را تنظیم میکند. این هورمون پیدایش مجرای تناسلی مرد از مجرای مزونفریک را در غیاب آنزیم 5-آلفا-ردوکتاز انجام می دهد.تستوسترون چندین اثر متابولیک شامل افزایش لیپوپروتئین دانسیته پایین LDL را داراست. در مقابل، این هورمون HDL را کاهش می دهد و موجب پیش برد رسوب بافت چربی در ناحیه شکم، افزایش تولید گلبول قرمز خون، پیشروی رشد و سلامت استخوان و اعمال اثر آنابولیک پروتئین در عضله می شود. تستوسترون برای حفظ عملکرد لیبیدو کافی است(Bern et al, 2010).
1-8-5) مکانیسم عمل آندروژنتستوسترون و دی هیدرو تستوسترون از طریق گیرنده آندروژن (AR) عمل میکنند. AR در سیتوپلاسم به صورت متصل به پروتئین های مراقب در غیاب لیگاند قرار دارد. اتصال تستوسترون-AR یا اتصال DHT- AR باعث تفکیک پروتئین های مراقب می شود به دنبال آن کمپلکس AR-آندروژن تشکیل می شود، آنگاه دیمریزاسیون رخ می دهد و در نهایت این مجموعه به هسته می رود و به عنصر پاسخی آندروژن (ARE) متصل می شود و موجب بسیج پروتئین های فعال کننده همراه و فاکتورهای نسخه برداری عمومی برای بسیاری از پروموتورهای خاص ژنی میگردد. این موضوع هنوز ناشناخته باقی مانده است که چگونه تستوسترون و DHT و توانایی آنها برای فعال سازی AR در بین انواع سلول های مختلف تفاوت قائل می شوند، هر چند حضور پروتئین های فعال کننده همراه مختلف احتمالاًًً در انواع سلول های متفاوت درگیر می باشد(Bern et al, 2010).
1-8-6) انتقال و متابولیسم آندروژن هابه مجرد این که تستوسترون وارد گردش خون محیطی می شود، به پروتئین های سرمی متصل می شوند و به سرعت با آنها به تعادل می رسند حدود 60% تستوسترون گردش خونی متصل به گلبولین اتصالی- هورمون جنسی (SHBG)، 38% متصل به آلبومین و حدود 2% به صورت هورمون آزاد هستند. تستوسترون و متابولیت های آن اصولا در ادرار دفع می شوند. تقریبا 50% آندروژن های دفعی به صورت 17- کتواستروئید های ادراری یافت میشوند. بخش اعظم باقیمانده به صورت آندروژن های کونژوگه یا مشتقات دی ال و تری ال هستند. تنهاحدود 30 % سولفات موجود در کبد کونژوگه می شوند و استروئید های کونژوگه در ادرار دفع می شوند(Bern et al, 2010).
1-8-7) محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- بیضهتستوسترون توسط محور اندوکرینی درگیر با نورون های پاروی سلولی هورمون آزاد کننده گنادوتروپین (GnRH) و گنادوتروف های هیپوفیزی که هورمون لوتنینگ (LH)، و محرک فولیکولی (FSH) تولید می کنند تنظیم می شوند(Bern et al, 2010).

تصویر1-3: محور هیپوتالاموسی- هیپوفیزی- بیضه ای (Bern et al, 2010)1-9) بلئومایسین بلئومایسین(N1-[3-(dimethylsulphonio)propyl]bleomycin-amide) آنتی بیوتیکی کموتراپیک است که توسط باکتری Streptomyces Verticillus تولید میگردد (Sánchez et al, 2000). بلئومایسین‌ در درمان‌ سرطان‌ بیضه، سلولهای‌ سنگفرشی‌ سر و گردن‌، گلو، سرویکس‌، پوست و کلیه‌ کاربرد دارد. همچنین‌ این‌ دارو ممکن‌است‌ در افوزیونهای‌ بدخیم‌ پریتونال‌ و پلورال‌ و در درمان‌ لنفوم‌ هوچکینی‌ وغیرهوچکینی‌ موثر باشد(Lewis et al, 2006). این دارو به صورت پودر در ویال های 15و 30 میلی گرمی موجود بوده و به آسانی در آب مقطر به صورت محلول در می آید. بلئومایسین به طرق مختلف؛ عضلانی، داخل وریدی و یا زیر جلدی تزریق می گردد. فرمول مولکولی آن C55H84N17O21S3 • XH2SO4 بوده و وزن مولکولی محاسبه شده 1414 می باشد (Polovich et al, 2005).
1-9-1) تاریخچه و ساختمان شیمیایی بلئومایسینبلئومایسین برای اولین بار در سال 1966 توسط دانشمند ژاپنی به نام Hamao Umezawa کشف شد. وی در طی غربالگری باکتری S. verticillus به خاصیت ضدسرطانی این ماده پی برد . Umezawa در سال1966 اقدام به انتشارکشف خود نمود. Nippon Kayaku اولین فردی بود که در سال 1969 بلئومایسین را مورد استفاده قرار داد. در جولای 1969 تاییده ی FDA به داروی بلئومایسین داده شد و تحت عنوان تجاری Blenoxane توسط Myers در آزمایشگاه بریستول ایالات متحده ساخته و به بازار عرضه گردید. (Umenzawa et al, 1966 ). بلئومایسین خاصیت ضد سرطانی داشته و به صورت آمپولهای 15 واحدی موجود است. مصرف این دارو در دوران حاملگی غیرمجاز است. مگر اینکه در شرایط ویژه و حداقل استفاده گردد بلئومایسین بر روی کروماتین اسپرم و همچنین پروتئین های سر اسپرم تاثیرات قابل توجهی ایجاد میکند. همچنین ممکن است یک تاثیر منفی بر عملکرد باروری ، باروری و همچنین فرزندان افراد تحت درمان داشته باشد(Lambert and Eriksson, 1979).

تصویر 1-4: ساختمان شیمیایی بلئومایسین(Umenzawa et al, 1966 ).1-9-2) مکانیسم اثر بلئومایسین:بلئومایسین‌ آنتی‌بیوتیکی ‌است‌ که‌ اثر خود را هم‌ بر روی‌ سلولهای ‌قابل‌ تقسیم‌ و هم‌ سلولهایی‌ که‌ در حال‌ رشد نیستند، می‌گذارد. مکانیسم‌ احتمالی‌ آن ‌تداخل‌ در فاز2 Gتقسیم‌ سلولی‌ وجلوگیری‌ از رشد سلول‌ سرطانی‌ است‌. در واقع این دارو باعث مهار چرخه سلولی در مرحله 2 Gو سبب قطعه قطعه شدن DNA و تجزیه RNA شده و با پیدایش رادﻳﻜﺎل ﻫﺎی آزاد ﺳـﺒﺐ ﻣـﺮگ و ﺗﺨﺮﻳـﺐ ﺳﻠﻮلﻫﺎی ﺗﻮﻣﻮرال و در ﺣﺎل ﺗﻜﺜﻴﺮ ﻣﻲ ﺷﻮد. (Yamamoto, 2006)

تصویر 1-5: مکانسم عمل بلئومایسین(Nature, 2013)با فعال شدن بلئومایسین، گیرنده های آسیب در دو رشته DNA فعال می شوند، تا کنون همه گیرنده های مستقیم آسیب DNA شناخته نشده اند ولی به احتمال زیاد این سنسورها بسته به نوع آسیب متفاوت هستند. در هر صورت این گیرنده ها سبب فعالسازی انتقال دهنده سیگنال مرکزی(ATM) میشوند.
ATM یک شبه فسفوتیدیل اینوزیتول 3 کیناز می باشد که چندین پروتئین درون سلولی را فسفریله میکند. به طور مثال با فسفریله نمودن NBS1 در کمپلکس نوکلئاز NBS1- MRE11- RAD50 سبب فعالسازی آن شده که در نتیجه انتهاهای تک رشته ای مورد نیاز در مسیر ترمیم نوترکیبی همولوگ تولید می شوند. علاوه بر این ATM با فعالسازی CHK2 که یک عامل کلیدی در تنظیم چرخه سلولی است سبب فعال شدن P53 میشود. P53 یک سرکوب کننده تومور و جز اصلی توقف چرخه سلولی و آپوپتوز می باشد. توقف چرخه سلولی قبل و یا در حین فرایند میتوز در پاسخ به آسیب دورشته ای DNA منجر به مرگ سلول میتوزی و شکست هسته ای و زیر واحدهای کاتالیزی DNA پروتئین کیناز میشود.
1-9-3) کاربردهای بالینی
در طی 50 سال اخیر به منظور پیشگیری از بیماری هایی همچون سرطان از روشهای شیمی درمانی بهره گرفته میشود. دراین روش داروهایی مورد استفاده قرار میگیرند که رشد سلول های سرطانی را متوقف یا آهسته نمایند. شیمی درمانی با تأثیر روی توانایی سلول هایی که رشد بالایی دارند (مثل سلول های سرطانی) مانع از تقسیم یا تولید آن ها می گردد. گرچه مصرف این داروها باعث بقای عمر بیمار و بهبودی بیماری میگردد اما همراه با عوارض جانبی خطرناکی همراه است. این عوارض میتوانند عملکرد طبیعی بدن را دستخوش تغییرات ناخوشایندی نماید. بلئومایسین، دارویی است که بطور گسترده در درمان سرطان بیضه و نئوپلاسم بدخیم در دوران نوجوانی و جوانی استفاده میگردد. تجویز همزمان بلئومایسین، اتوپوزید و سیس پلاتین (BEP) عمر مبتلایان به این سرطان را تا 5 سال افزایش میدهد(Robinson et al, 2007).
1-9-4) عوارض جانبی 
بلئومایسین
بر روی کروماتین اسپرم، پروتئین های سر اسپرم، عملکرد باروری ، باروری و همچنین فرزندان متولد شده افراد تحت درمان تاثیرات نامطلوب قابل توجهی ایجاد نماید(Lambert and Eriksson ,1979). با مصرف طولانی مدت بلئومایسین ایدیوسنکرازی و سمیت ریوی بروز می‎‏نماید. مهمترین عارضه این دارو، ایجاد سوختگی و زخم در محل تزریق است. سندرم رینود نیز در بعضی موارد دیده می‏شود. از دیگر عوارض این دارو میتوان به ایجاد دانه های پوستی، راش، تب و لرز، آثار پوستی بر روی لثه و زبان و فیبروز ریه بویژه در افراد سالمند، خستگی، ریزش مو، حالت تهوع و استفراغ، آسیب به کلیه، آسیب به اعصاب، آسیب به عروق خونیِ قلب ، افزایش احتمال بیماری قلبی عروقی، آسیب ریوی و بروز سرطان ثانویه در جایی جدید، مثل خون (لوکمی)، ریه، رودۀ بزرگ، پانکراس، مثانه، معده یا سایر ارگان ها اشاره نمود (Amato et al, 2004).
1-10) استرس اکسیداتیودر حقیقت استرس اکسیداتیو همان پیروزی رادیکال های آزاد بر دفاع آنتی اکسیدانی بدن موجود زنده می باشد و به نوعی به حمله های بیولوژیک علیه ارگانیزم بدن اطلاق می شود. رادیکال های اکسیژن بطور مداوم در همه ارگانیزم های زنده تولید می شوند و با اثرات مخرب خود، منجر به آسیب سلولی و مرگ می گردند. تولید گونه های اکسیدان در شرایط فیزیولوزیک دارای سرعت کنترل شده ای است اما این تولید در شرایط اکسیداتیو افزایش می یابد. قرار گرفتن در معرض سیستم های بیولوژیک در مقابل زنوبیوتیک ها و یا ایجاد شرایط پاتولوژیک منجر به استرس اکسیداتیو ودرنتیجه افزایش تولید اکسی رادیکال ها می شود(Aitken, 1994; Warren et al, 1987 ).
1-10-1) گونه های فعال اکسیژن(ROS):(ROS) شامل ملکولهای بسیار فعال واجد اکسیژن از جمله رادیکال های آزاد میباشد((Warren et al, 1987. رادیکال هیدروکسیل، رادیکال آنیون سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، اکسیژن تک، رادیکال NO ،رادیکال هیپوکلریت ولیپید پراکسید های مختلف (Aitken et al, 1994) از جمله گونه های فعال اکسیژن هستند. همه این عوامل قادرند با لیپید های غشا، اسید نوکلئیک پروتئین ها ، آنزیم ها و سایر ملکولهای کوچک واکنش داده ومنجر به آسیب سلولی شوند.
1-10-2) پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر:گونه های اکسیژن فعال (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H2O2)، آنیون سوپر اکسید (O2-U)، مولکول و یا رادیکال هیدروکسیل (UOH) برهر دو گامت نر و ماده تاثیر می گذارند(Agarwal et al, 2008). ROS تولید شده توسط اسپرم نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیک مانند ظرفیت یابی اسپرم، واکنش آکروزومی، همجوشی با تخمک و ثبات کپسول میتوکندری در اواسط قطعه بازی می کند(Aitken et al, 2007; Agarwal et al, 2008(a); de Lamirande et al, 2008). تولید (ROS) در دستگاه تولید مثلی نر به دلیل اثرات توکسیک شدید آنها بر روی کیفیت و عملکرد اسپرم، به موضوعی حائز اهمیت در آندرولوژی تبدیل شده است (Saleh and Agarwal, 2002). مطالعات صورت گرفته نشان داده اند که 45 - 25% مردان نابارور دارای سطوح بالایی از ROS در نمونه های مایع منی خود بودها ند (Agarwal et al., 2004). اما با این وجود باید خاطر نشان کرد که وجود مقادیر اندک ROS برای اسپرم جهت لقاح، واکنش آکروزومی، تحرک و ظرفیت یابی لازم است (Agarwal et al.,2004). واژه استرس اکسیداتیو زمانی به کار میرود که میزان اکسیدانتها از آنتی اکسیدانت ها پیشی بگیرد (Sies , 1993). در واقع این رویداد بیانگر نوعی عدم تعادل بین توالی ROS و مکانیسمهای مهاری آن است (Sikka, 2001). اسپرمها حساسیت ویژهای نسبت به آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو دارند چرا که غشای پلاسمای آنها دارای مقادیر بالایی اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (PUFAs) بوده و در سیتوپلاسم آنها میزان اندکی آنزیم مهاری وجود دارد (Sharma and Agarwal, 1996). علاوه بر این، آنزیم های آنتی اکسیدانت داخل سلولی قادر به محافظت از غشای پلاسمایی احاطه کننده آکروزوم و دم اسپرم نیستند، از این روی اسپرمها جهت تقویت سیستم دفاع آنتیاکسیدانتی داخلی محدود خود از مکانیسمهای دفاعی پلاسمایی منی بهره می جویند (Zini et al, 1993). مطالعات متعدد نشان داده اند که از میان انواع سلول های مختلف موجود در مایع منی، اسپرم های غیرطبیعی و نابالغ و لکوسیتها منابع اصلی تولیدROS را تشکیل میدهند
(Aitken and West, 1990; Kessopolou et al, 1992; Garrido et al, 2004).

تصویر 1-6: پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر(Clevelandclinic, 2013)بررسیها نشان داده است که بین کیفیت پایین اسپرم و افزایش تولید ROS ارتباط مستقیمی وجود دارد. در واقع بقایای سیتوپلاسمی اسپرم، حلقه گمشده ارتباطی بین این دو فرایند میباشند (Gomez et al, 1998). در مواردی که اسپرماتوژنز دچار اختلال می شود، مکانیسم های بیرون راندن سیتوپلاسم دچار نقص شده و اسپرم به همراه بقایای سیتوپلاسمی از اپیتلیوم زایا جدا میشود. اسپرمی که تحت این شرایط آزاد میشود، نابالغ بوده و دارای نقص عملکردی میباشد (Huszar et al, 1997). باقی ماندن این قطرات سیتوپلاسمی در اسپرم وابستگی مستقیمی با تولید ROS از طریق مکانیسم هایی دارد که به نظر میرسد به واسطه آنزیم سیتوزولی گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز صورت می گیرد (Aitken, 1999). از سوی دیگر، اسپرمها به سبب نیاز مداوم به انرژی جهت حرکت، دارای میتوکندریهای فراوانی میباشند. از این روی، اختلال در عملکرد میتوکندریها میتواند به افزایش تولید ROS منجر گردد که این امر به نوبه خود مجدداً میتوکندریها را تحت تأثیر قرار میدهد، چرا که ROS موجب آسیب غشای میتوکندریها شده و این غشاهای آسیب دیده موجبات افزایش میزان ROS را فراهم میآورند (Evenson et al, 1982).
از سوی دیگر، کاهش کیفیت اسپرم و نیز نقص عملکردی آنها با افزایش میزان لکوسیتها در مایع منی در ارتباط است. لکوسیتهای پراکسیداز مثبت که یکی از منابع اصلی تولید ROS در مایع منی محسوب میگردند، لکوسیتهای هستند که هسته چند شکلی دارند و 60-50% لکوسیتهای مایع منی را تشکیل می دهند. غده پروستات و کیسههای منی منابع اصلی این لکوسیتهای پراکسیداز مثبت میباشند (Wolff, 1995). لکوسیتها در پاسخ به محرکهای مختلفی نظیر عفونت و آماس، فعال شده و این لکوسیتهای فعال قادر خواهند بود 100 برابر لکوسیتهای غیر فعال ROS تولید نمایند (Plante et al, 1994). این مکانیسم به واسطه افزایش تولید NADPH از مسیر هگزوز منو فسفات صورت میپذیرد که فعال سازی سیستم میلو پراکسیداز لکوسیتهای دارای هسته چند شکلی و ماکروفاژ را در پی داشته، نهایتاً به انفجار تنفسی و تولید مقادیر بالای ROS میانجامد. بنابراین، افزایش غیرطبیعی میزان لکوسیتهای مایع منی و یا جداسازی اسپرم از پلاسمای منی جهت انجام کارهای آزمایشگاهی، میتواند به آسیب دیدن اسپرمها توسط ROS تولیدی لکوسیتها منجر گردد (Shekarriz et al, 1995).
تمامی ترکیبات سلولی نظیر لیپیدها، پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و قندها، اهداف بالقوه استرس اکسیداتیو میباشند. میزان آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو به ماهیت و میزان ROS ، مدت زمان قرار گرفتن در معرض ROS و فاکتورهای خارج سلولی مانند دما و اجزاء محیط ( یونها، پروتئین ها و آنتی اکسیدانت ها ) بستگی دارد(Makker et al, 2009). ROS به اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (PUFAs) که در غشاء سلولی حضور دارند حمله کرده و مجموعهای از واکنش های شیمیایی را که در مجموع پراکسیداسیون لیپیدی نامیده میشود، موجب میگردد (Aitken, 1995; Kodama et al, 1996).
این فرآیند با واکنش رادیکالهای آزاد با زنجیره های اسیدچرب و آزادسازی رادیکالهای آزاد لیپیدی آغاز میگردد. این رادیکالهای آزاد لیپیدی متعاقباً با اکسیژن مولکولی وارد واکنش شده و رادیکالهای پروکسیل لیپیدی را شکل میدهند. رادیکالهای پروکسیل نیز میتوانند با اسیدهای چرب واکنش داده ، رادیکالهای آزاد لیپیدی تولید کنند که این امر موجب تداوم چرخه واکنشها میگردد (Alvares and Storey, 1995). یکی از محصولات جانبی پراکسیداسیون لیپیدی، مالون دی آلدئید میباشد. این محصول جانبی در ارزیابیهای بیوشیمیایی متعددی جهت برآورد میزان آسیب پراکسیداتیو کاربرد دارد (Aitken et al, 1995).
1-11) آنتی اکسیدانت ها و نقش حفاظتی آنها در برابر استرس اکسیداتیو:خوشبختانه تولید رادیکالهای آزاد بوسیله آنتی اکسیدانت ها کنترل می شود. هنگامی که دسترسی به آنتی اکسیدانت ها محدود شود آسیب افزایش یافته و بدن ناتوان میگردد. آنتی اکسیدانت ها قادرند عوامل اکسیدان را قبل از حمله به سلولها پایدار ،غیر فعال ویا بلع کنند. بنابراین آنتی اکسیدانت ها برای نگهداری بدن در حالت سلامت وبهبودی کاملا ضروری هستند. عملکرد آنتی اکسیدانت ها شامل ظرفیت بلع رادیکال های آزاد ،ممانعت از پراکسیداسیون لیپید ها، توانایی غیر فعال نمودن یونهای فلزی وظرفیت احیا کنندگی آنهاست (Jha et al, 1995). به طورکلی آنتی اکسیدانت ها از نظر شکل، خصوصیات فیزیکی وشیمیایی وجایگاه عملشان با هم فرق دارند.
1-آنتی اکسیدانت های آنزیمی: آنزیم هایی هستند نظیر گلوتاتیون احیا، SOD ، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز.این عوامل، تولید گونه های فعال اکسیژن را بوسیله حذف ظرفیت اکسیدانی یا تغییر شکل آنها (ROS&RNS)به اجزا پایدار تقلیل می دهند( Davies, 1995).
2-ساختارهای با وزن ملکولی بالا (پروتئین ها) شامل آلبومین ، سرولوپلاسمین، ترانسفرین، هاپتوگلوبولین که با جایگاه فعال فلزات باند میشوند وتولید فلزات کاتالیز کننده رادیکالهای آزاد را محدود می کنند(Chaudiere et al, 1999)..
3-ساختارهای با وزن ملکولی پائین، شامل دو دسته آنتی اکسیدانت های محلول در چربی (توکوفرول، کاروتنوئید، کوئینین و برخی پلی فنل ها) و آنتی اکسیدانت های محلول در آب (اسکوربیک اسید، اسید اوریک وبرخی پلی فنل ها). (Chaudiere et al, 1999)
4-مینرال ها (سلنیوم، منگنز، مس و روی) آنتی اکسیدانت های همه کاره (Chaudiere et al, 1999)
5-ویتامین ها.(Jha et al, 1995)
6-آنتی اکسیدانت های گیاهی(Jha et al, 1995)
1-11-1) سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در بدن
مطالعات نشان داده اند که آنتی اکسیدانت ها دارای اثرات گسترده ای در آندرولوژی بوده و قادرند از اسپرم ها در برابر ناهنجاری های ناشی از ROS محافظت نمایند. این ترکیبات همچنین موجب مهار ROS تولید شده توسط لکوسیت ها و بهبود کیفیت مایع منی شده و از قطعه قطعه شدن DNA و بلوغ نا بهنگام اسپرم ها جلوگیری می کنند. سه سیستم آنتی اکسیدانتی متفاوت و وابسته به هم که نقش کلیدی در کاهش استرس اکسیداتیو در جنس نر ایفا می کنند عبارتند از: آنتی اکسیدانت های رژیم غذایی، آنتی اکسیدانت های اندروژن و پروتئین های غیرفعال کننده یون های فلزی ( Hughes et al, 1998; Agarwal et al, 2004).
آنتی اکسیدانتهای موجود در پلاسمای منی و اسپرم در گروه آنتی اکسیدانتهای اندروژن قرار میگیرند. پلاسمای منی دارای سه آنتی اکسیدانت آنزیمی اصلی سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز/گلوتاتیون ردوکتاز (GPX/GRD) در کنار طیف وسیعی از آنتی اکسیدانتهای غیرآنزیمی مانند آسکوربات، اورات، ویتامینE، ویتامین A، پیروات، گلوتاتیون، آلبومین، یوبی کوئیتول، تائورین و هایپوتائورین میباشد. اسپرمها علاوه بر SOD که عمده ترین آنتی اکسیدانت موجود در آنها را تشکیل میدهد، دارای آنتی اکسیدانتهای آنزیمی اولیه نیز میباشند. آنتی اکسیدانت های رژیم غذایی غالباً به شکل ویتامین C، ویتامین E، بتاکاروتنها، کاروتنوئیدها و فلاونوئیدها میباشند. پروتئین های غیرفعال کننده یونهای فلزی نظیر آلبومین، سرولوپلاسمین، متالوتیونئین، ترانسفرین، فریتین و میوگلوبولین ، به واسطه غیرفعال کردن انتقال یونهای فلزی که تولید رادیکالهای آزاد را کاتالیز میکنند، عمل میکنند (Sies, 1993; Tarin et al, 1998; Greco et al, 2005a) این ترکیبات همچنین پراکسیداسیون لیپیدی غشاء پلاسمایی اسپرم را کنترل می کنند و موجب حفظ یکپارچگی آن میگردند (Wroblewski et al, 2003).
بررسیهای آزمایشگاهی صورت گرفته نیز نقش آنتیاکسیدانتها را در کاهش تولید ROS توسط اسپرم و بهبود توانایی تکاملی جنین مورد تأیید قرار داده است (Ta--oto et al, 2001; Ali et al, 2003; Esfandiari et al, 2005). در همین راستا ، گزارشات دیگری نیز بر نقش آنتی اکسیدانتها در کاهش آسیب DNA و آپوپتوز در اسپرمها و نیز افزایش میزان بارداری و لانه گزینی بالینی صحهگذاردهاند (Hughes et al, 1998; Greco et al, 2005b). از این روی با توجه به کاربرد روز افزون تکنیک های آزمایشگاهی نظیرIVF، ارزیابی سطوح ROS و وضعیت استرس اکسیداتیو در نمونههای اسپرم پیش از IVF و نیز استفاده از آنتی اکسیدانتهای مؤثر و کارا میتوانند ما را به نتایج بهینه رهنمون سازد . همچنان که تحقیقات صورت گرفته نشان داده است که این ترکیبات قادرند اثرات سمی پراکسید هیدروژن بر روی جنین را به نحو مطلوبی کاهش دهند (Zhang et al, 2005).
1-12) سنجش استرس اکسیداتیو1-12-1) مالون دی آلدئید (MDA)
مالون دی آلدئید (MDA) یکی از محصولات نهایی در پروسه پراکسیداسیون لیپید هاست. پر اکسیداسیون لیپیدها یک روند اتولیزی است که نتیجه معمول مرگ سلولی است. این پروسه می تواند منجر به آسیب پراکسیداتیو بافتها در التهاب ،سرطان ومسمومیت با زنوبیوتیک ها و افزایش سن شود(Oranje and Roundas, 1999). MDA در خلال دژنراسیون اکسیداتیو بعنوان یکی از محصولات حاصل از رادیکالهای آزاد اکسیژن شکل می گیرد و به عنوان شاخصی از پراکسیداسیون لیپیدها پذیرفته می شود(Yagi, 1998).
1-12-2) گلوتاتیون احیا (GSH)
ماده ایست که بطور طبیعی در بسیاری از موجودات زنده و به فراوانی یافت می شود. نقص در مسیر گلوتاتیون در ارگانیزم های زنده می تواند منجر به اختلالات بافتی و آسیب شود. گلوتاتیون یک احیا کننده داخل سلولی است ونقش مهمی در کاتالیزه کردن متابولیسم دارد. گلوتاتیون سلول ها را علیه رادیکال های آزاد ،پراکسید ها وسایر اجزا سمی محافظت می کند. به نطر می رسد که GSH سیستم دفاعی اصلی غیر آنزیمی بر علیه ROS در جنین باشد(Takahashi et al, 1993)
1-12-3) آنزیم کاتالازکاتالاز یک پروتئین واجد آهن است که از چهار واحد پروتئینی تشکیل شده است، هرکدام ازین واحدها شامل یک گروه هم میباشند(Nasr-Esfahani, 1991) و به طور عمده در پراکسی زوم و در مقادیر کمتر در سیتوزول و شکستگی های میکرومازول سلولی گسترش می یابد (Smith et al, 2006). این آنزیم تجزیه H2O2 را به آب و اکسیژن کاتالیز می کند که در نتیجه سلولها را ازآسیب اکسیداتیو ناشی از H2O2 و OH حفظ می کند. در واقع این آنزیم قادر است پراکسید هیدروژن را کاهش دهد. از آنجا که پراکسید هیدروژن هیچ الکترون غیر جفت شده ای در اوربیتال خارج اتمی یا مولکولی-اش وجود ندارد، رادیکال آزاد نیست اما پیش ساز رادیکال هیدروکسیل است که سمی ترین شکل نمونه ی اکسیژن واکنشی می باشد. سمیت بالای رادیکال هیدروکسیل، به خاطر واکنشی بودن بالای آن با تقریبا هر نوع مولکول در سیستم زنده میباشد. (Nasr-Esfahani, 1991 ; Blondin et al, 1997 ; Guérin et al, 2001)
1-13) ژل رویال 
عسل مهمترین محصول زنبور عسل است که توسط زنبورهای کارگر تولید می شود، اما فعالیت زنبورهای کارگر منحصر به تولید عسل نبوده و محصولاتی همچون ژل رویال، موم، بره موم را نیز تولید می کنند.ژل رویال مایعی غلیظ، شیری رنگ وبسیار مغذی از ترشحات زنبور عسل است که به آن شاه انگبین ، شیر زنبور عسل، شهد شاهانه و (royal jelly) غذای ملکه هم می گویند. این ماده بسیار مغذی و نیرو بخش است در واقع به عنوان غنی ترین ماده مغذی بیولوژیک شناخته شده و از گذشته ای دور به عنوان اکسیر جوانی و مایه حیات در طب باستان استفاده می شده و اکنون نیز در کشورهای پیشرفته جهان استفاده طبی از آن بر پایه تحقیقات دانشمندان در دانشگاه ها و موسسه های تحقیقاتی معتبر رایج است.
1-13-1) تولید ژل رویالاین ماده از غدد آرواره ای و زیر حلقی( hypopharyngeal & mandibular)  موجود در طرف سر زنبوران کارگر جوان(6-12 روزه) ترشح می شود و با بزاق دهان آنها مخلوط می گردد(Rosmilah et al, 2008)0. این ژل ،خمیری شکل با رنگ تقریبا سفید تا زرد کمرنگ و طعمی تند و زننده است.این ماده مغذی تا سه روز مورد استفاده همه لاروها قرار میگیرد ولی زنبور ملکه به طور دائم از این ماده تغذیه می شود. بدون ژله رویال هیچ لاروی قادر به رشد نیست و این ماده، ملکه را قادر می سازد که در روزهای تخم ریزی در شبانه روز بیش از 2500 تخم بگذارد که وزن این مقدار بیش از وزن خود ملکه است. همچنین ملکه زنبور عسل به واسطه استفاده از این ماده مغذی حدود 5 تا 6 سال عمر می کند در حالی که زنبور های کارگر در فصول فعالیت خود(بهار و تابستان) حدودا کمتر از 14 تا 24 روز از فعالیت خود میمیرند.(Hassan, 2009)
1-13-2) طریقه نگهداری
ژل رویال باید در دمای زیر صفر درجه ( داخل فریزر یا جایخی یخچال) و دور از تابش مستقیم نور خورشید نگه داری گردد.
1-13-3) خواص فیزیکی ژل رویالژل رویال ماده ایست ژلاتینی سفید مایل به زرد روشن ،کلوئیدی و چسبناک با بوی خاص که هنگام حل شدن کمی کف تولید می کند.PH آن اسیدی بوده و چگالی مخصوص آن g/ml1/1 است(Ramadan et al, 2012).ترکیبات موجود در ژل رویالتجزیه شیمیایی ژل رویال حضور مواد زیر را درآن اثبات کرده است:- آب (بشترین مقدار)- کلاژن(Hassan, 2009).- کربوهیدرات

–266

اگر تنها یکی از ابعاد نانوساختارسه بعدی در محدوده ی نانو باشد، آن را“Quantum well“ می نامند. “ Quantum wire “ ساختاری است که دو بعد آن در محدوده ی نانو است، در حالی که “Quantum dot“ دارای سه بعد نانو متری است.
مثال هایی از نانوساختارها
1)ساختارهای صفر بعدی، باکی بال ها هستند که معروف ترین آنها C60 است. مولکول C60 شامل 60 اتم کربن است و این اتم ها مانند یک توپ فوتبال که از 12 پنج ضلعی و 20 شش ضلعی تشکیل شده در کنار هم قرار گرفته اند. این ساختار توپی شکل در شکل 1-1 نمایش داده شده است. این ساختارها در هر سه بعد، نانویی بوده و مولکول C60 دارای قطری در مرتبه 7/0 نانومتر است.

شکل(1-1) انواع فولرین ها
2)ساختاریک بعدی، نانولوله های کربنی که در دو راستا، دارای قطر نانومتری بوده و در راستای محور لوله، میکرونی هستند و نسبت طول به قطر نانولوله ها در حدود 1000 بوده و نانولوله ها تماماً از پیوند sp2 تشکیل شده اند (شکل 1-2).

شکل(1-2) نانولوله های کربنی
3)ساختارهای دو بعدی گرافن که در یک راستا نانومقیاس بوده و دارای ضخامت از مرتبه آنگستروم هستند. گرافن (به انگلیسی: Graphene) نام یکی از آلوتروپ‌های کربن است. و برای نخستین بار در سال 1947 فیلیپ والاس درباره گرافن نوشت و سپس از آن زمان تلاش‌های زیادی برای ساخت آن صورت گرفته بود اما قضیه‌ای به نام قضیه مرمین-واگنر در مکانیک آماری و نظریه میدان‌های کوانتومی وجود داشت که ساخت یک ماده دوبعدی را غیرممکن و چنین ماده‌ای را غیرپایدار می‌دانست. اما به هر حال در سال ۲۰۰۴، آندره گایم و کنستانتین نووسلف، از دانشگاه منچستر موفق به ساخت این ماده شده و نشان دادند که قضیه مرمین-واگنر نمی‌تواند کاملاً درست باشد. جایزه نوبل فیزیک ۲۰۱۰ نیز به خاطر ساخت ماده‌ای دوبعدی به این دو دانشمند تعلق گرفت (شکل 1-3).

شکل(1-3) گرافن
4) ساختارهایی سه بعدی گرافیتی که سالیان بسیار زیادی است بشر آن را می شناسد. گرافیت یکی از آلوتروپ های کربن است که ساختار لایه-لایه داشته و به رنگ سیاه است واز قرار گرفتن ۶ اتم کربن به صورت ۶ ضلعی منظم پدید آمده است. هیبریداسیون اتمهای آن از نوع sp2 است و این اتم‌ها با پیوند کووالانسی به هم متصلند و نمی توانند با کربنی خارج از این لایه پیوند کوالانسی دهند بنابراین یک لایه گرافیت از طریق پیوند واندر والس -که پیوند ضعیفی است- به لایه‌های زیرین متصل است این خاصیت سبب می‌شود لایه‌های گرافیت به راحتی به روی هم بلغزند. به همین دلیل از این ترکیب برای «روان کاری» و «روغن کاری» استفاده می شود. از گرافیت به عنوان الکترودهای کوره، روان کننده، ماده نسوز، قطعات الکتریکی، رنگ‌ها، فولادهای پرکربن، چدن‌ها، مداد گرافیتی و … استفاده می‌شود. نوک مدادهای زغالی از جنس گرافیت هستند که ساختار سه بعدی ساخته شده از ورقه هایی از شبکه های شش ضلعی دارد (شکل1-4).

شکل(1-4) گرافیت
5)آلوتروپ دیگر کربن الماس است که برعکس گرافیت هیبریداسیون sp3 داشته و رسانای جریان الکتریکی نیست و سختی بالایی دارد (شکل 1-5).

شکل(1-5) الماس
1-4-6- کاربردهای فناوری نانو
بکارگیری نانوفناوری در علوم مختلف باعث پیشرفت شگرفی در آنها شده و بسیاری از علوم مختلف را تحت تأثیر قرار داده است. در اینجا بخشی از تأثیرات و کاربردهای نانوفناوری در علوم مختلف را بیان می کنیم.
1-4-6-1-کاربرد فناوری نانو در صنعت
نانوفناوری در زمینه های پیچیده تر و صنعتی تری نیز ایفای نقش می کند. صنایع رباتیک، هوافضا و نظامی از این دست هستند که هریک به نوبه خود با زندگی مردم در ارتباط هستند.
1)صنایع رباتیک
مهمترین تأثیری که فناوری نانو در رباتیک می تواند بگذارد ساخت نانوربات هاست.
این نانوربات ها می توانند با توجه به اندازه بسیار بسیار کوچک خود، خود را به مناطق آسیب دیده رسانده و پس از تزریق مستقیم دارو به محل و بررسی هایی که انجام می دهند بیماری را درمان کنند.
2)صنایع نظامی
به کارگیری فناوری نانو در صنایع نظامی به خصوص در زمینه امنیتی – دفاعی در دهه اخیر مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است. استفاده از این فناوری در تجهیزات دفاعی راه هایی به سوی بهبود اسلحه ها، ابتکار در ساخت مواد با وزن سبک و مقاوم به دمای بالا برای هواپیماها، راکت ها و ایستگاه های فضایی را هموار نموده است. تسلط اطلاعاتی از طریق نانو الکترونیک پیشرفته، به عنوان یک توانایی مهم نظامی، کارایی بالاتر در تجهیزات نظامی و استفاده از ربات های پیشرفته به جای استفاده از نیروی انسانی نظامی، پیشرفت در امر شناسایی و در نتیجه مراقبت از عوامل شیمیایی، کاهش خطر برای سربازان و بهبود کارایی خودروهای نظامی از دیگر قابلیت های این فناوری نوین در حوزه نظامی – دفاعی و امنیتی است.
3)صنایع هوافضا
با پیشرفت فناوری و ورود آن به عرصه فضا، سفرهای فضایی، ساخت کاوشگرها، مدارگردها و سفینه های فضایی ساده تر و مقرون به صرفه تر خواهد شد. ربات های فضانورد با قیمتی ارزان تولید و به منظور شناسایی و انجام آزمایشات روی کرات دیگر به فضا و سایر کرات فرستاده خواهند شد.
اندازه ماهواره های ارسالی به فضا کاهش خواهد یافت و دیگر نیازی به استفاده از موشک های غول پیکر جهت فرستادن ماهواره ای چند تنی به فضا و قرار دادن آنها در مدار نخواهد بود و به این ترتیب از هزینه های گزاف پرتاب موشک های غول پیکر کاسته خواهد شد.
نانو حسگرها، یا سامانه های پیشران بسیار کارآمد، نمونه های دیگری از کاربرد فناوری نانو هستند. حفاظت در برابر تابش های کیهانی از کاربردهای دیگر و اساسی نانوفناوری در سفرهای فضایی است. به گفته دانشمندان، خطر قرار گرفتن در معرض تابش های فضایی مهمترین عامل محدودکننده طول مدت سفرهای فضایی و اقامت انسان در فضا است و لذا هم اکنون تحقیقات فراوانی به طور خاص در این زمینه در حال انجام است.
طراحان سفینه های فضایی به این منظور و نیز به منظور رفع مشکلاتی مانند دوام ساختار روکش حفاظتی سفینه های فضایی، درجستجوی موادی هستند که قادر باشد به آنها در توسعه و ساخت روکش چند کاره بدنه سفینه های فضایی کمک نماید. منظور نانوحسگری است که بتواند حفاظت مؤثری در برابر تابشهای فضایی ایجاد کند و در عین حال ذخیره انرژی خوبی هم داشته باشد و همچنین قادر باشد در صورت صدمه دیدن بخشی از پوشش حفاظتی فضاپیما و نیاز به انجام تعمیرات خود به ترمیم خود بپردازد.
از نانو همچنین در ساخت لباس فضانوردان استفاده خواهد شد. لباس فضانوردان در عین داشتن مقاومت بالا در مقابل پرتوهای پرانرژی کیهانی باید سبک و راحت باشد به گونه ای که در حرکات فیزیکی فضانوردان اختلال و یا محدودیتی ایجاد نکند و فضانوردان قادر باشند با آرامش و آزادی عمل بیشتری به انجام تحقیقات در فضا و یا روی سطح کرات دیگر بپردازند.
1-4-6-2- کاربردهای فن‌آوری نانو در صنایع غذایی
حوزه‌های کاربردی فن‌آوری نانو درصنایع غذایی را می‌توان به صورت شکل زیر خلاصه کرد.
حوزه‌های مختلف کاربردی فن‌آوری نانو در غذا و صنایع غذایی به شش دسته نگهداری غذا، بهبود طعم و رنگ، سلامت غذا، بسته‌بندی، تولید غذا و فرآیندهای غذایی تقسیم‌بندی می‌شوند. شکل زیر این تقسیم‌بندی همراه با زیرگروه‌های هریک را نشان می‌دهد. در ادامه به تشریح هر قسمت و نمونه‌های کاربردی مربوطه که تا به حال وجود داشته است، پرداخته می‌شود.
1)نگهداری
فن‌آوری نانو از سه طریق می‌تواند در نگهداری موادغذایی مؤثر واقع شود:
ضدعفونی و ضد میکروب کردن سطوح: فن‌آوری نانو با جابه‌جا کردن سطح پوشش مواد می‌تواند تقریباً از ورود هر میکروارگانزیم یا میکروب به غذا جلوگیری کند. میکروب‌کش‌ها با نانو ذرات و نانو قطراتی مانند روغن‌های گیاهی و الک‌ها، دوستدار محیط زیست بوده و برای سلامت انسان بی‌ضرر هستند.
حفاظت آنتی‌اکسیدان‌ها: نگهداری آنتی‌اکسیدان‌های حساس مانند ویتامین‌های K/E/D/A ، اسید چرب امگا 3 و ر -کاروتن همواره یک عامل کلیدی در حفظ غذا بوده است. استفاده از نانو حفره‌ها می‌تواند از خراب شدن چنین مواد بی‌ثباتی در طول فرآیند و در زمان انبارداری جلوگیری کند.
دست‌ورزی و کنترل فعالیت آنزیم‌ها: فن‌آوری نانو در شناسایی و طراحی ساختمان آنزیم‌ها کاربرد مهمی دارد. فن‌آوری نانو توانایی کنترل متابولیسم آنزیم‌ها توسط تغییر در ساختمان و افزودن دیگر ذرات فعال را دارد. بنابراین می‌توان فعالیت‌های آنزیم‌ها را از این طریق تحت کنترل درآورد.
2)تولید
کاربرد فن‌آوری نانو در زمینه تولید غذا می‌تواند از یک سو در صنعت کشاورزی و از سوی دیگر در ابداع راه‌های جدید برای تولید غذاهای غیروابسته به شرایط طبیعی، مورد اهمیت قرار گیرد. عمده این کاربردها عبارتند از:
آنالیز و شناسایی محصولات کشاورزی: چیپ‌ها یا نانوسنسورها می‌توانند آفت، آنتی‌بیوتیک‌ها و ژن‌های مختلف را دقیقاً تشخیص دهند.
تولید غذاهای GM : باکی‌بال‌های قالب‌ریزی شده با اطلاعات ژنتیکی می‌توانند ژن‌ها و عناصر را به نقاط مطلوب حمل کنند.
تولید آفت‌کش/دارو و حمل آن‌ها: مانند زمینه دارویی در انسان، ‌نانو ذرات و نانوکپسول‌ها در بهبود اثر دارو کمک خواهند کرد و اثرات جانبی را کاهش می‌دهند.
سنتز و تولید غذا: آرایش بسیار ریز افزودنی‌های غذایی می‌تواند گروه‌های جدید غذایی را با سنتز مواد تغذیه‌ای مورد نیاز، طعم دهی ترکیبات و پیوند آنزیم‌ها با هم تولید کند. این روش باعث کاهش زیاد وابستگی صنایع غذایی به محیط زیست طبیعی شده و به عنوان یک ایده متفاوت در این زمینه ‌بدون نیاز به ملزومات غذای طبیعی استفاده می‌شود.
3)بسته‌بندی و سلامت موادغذایی
چشم‌اندازهای مالی فن‌آوری‌نانو، صنایع بسته‌بندی را پررونق نشان می‌دهد. سهم بازار این صنعت در حال حاضر حدود 1/1 میلیارد دلار است و پیش‌بینی‌ می‌شود تا سال 2010 به 3/7 میلیارد دلار آمریکا برسد.
در این قسمت به منظور اطلاع از محصولات تجاری و تحقیقاتی که در این حوزه صورت گرفته مثال‌هایی آورده می‌شود :
شرکت Bayer Polymer کیسه‌ای پلاستیکی با نام Durethan KU تولید کرده است که از محصولات موجود در بازار سبک‌تر و محکم‌تر است، همچنین مقاومت بیش‌تری در برابر گرما از خود نشان می‌دهد. هدف اولیه از تولید پلاستیک‌های بسته‌بندی موادغذایی، جلوگیری از خشک شدن محتویات آن‌ها و محافظت در مقابل رطوبت و اکسیژن است. پوشش جدید غنی از نانوذرات سیلیکات است. این نانوذرات تا حد زیادی از نفوذ اکسیژن، گازهای دیگر و رطوبت جلوگیری می‌کنند و فساد موادغذایی را به تأخیر ‌می‌اندازند.
سازمان‌های دیگر به کمک فن‌آوری ‌نانو در حال یافتن راهی برای تشخیص فساد موادغذایی هستند. به عنوان مثال شرکت AgroMicron ، افشانه تشخیص دهنده نانوبیولومینسانس را ساخته که شامل پروتیین لومینسانت است. در این طرح، افشانه سطح میکروب‌هایی مانند Salmonella و E.coli را ‌پوشانده و از خود نوری ساطع می‌کند و در نتیجه فساد موادغذایی تشخیص داده می‌شود. این شرکت در نظر دارد محصول مورد نظر را با نام BioMark وارد بازار کند. در حال حاضر این شرکت در حال ساخت افشانه‌هایی با روش‌‌های جدید است تا بتواند از آن‌ها در حمل و نقل دریایی استفاده کند.
در راهبرد مشابه، برای اطمینان از سلامت موادغذایی، محققان اتحادیه اروپا در پروژه Good Food از نانوحسگرهای قابل حمل برای یافتن مواد شیمیایی مضر، پاتوژن‌ها و سم‌‌ها در موادغذایی استفاده می‌کنند.
با این عمل، دیگر نیازی به فرستادن نمونه‌های موادغذایی به آزمایشگاه برای تشخیص سلامت و کیفیت محصولات در کشتزارها و کشتارگاه‌ها نیست. همچنین این پروژه، در حال توسعه به کارگیری زیست‌تراشه‌های DNA برای کشف پاتوژن‌هاست. این روش می‌تواند در تشخیص باکتری‌های مضر و متفاوت موجود در گوشت یا ماهی و یا قارچ‌های میوه مؤثر باشد. این پروژه در نظر دارد با گسترش میکروحسگرهای رشته‌ا‌ی، بتواند آفت‌کش‌های میوه و سبزیجات را به همان خوبی که شرایط محیطی کشتزارها را کنترل می‌کند تشخیص دهد. این نوآوری به نام حسگرهای Good Food نامیده می‌شود.
1-4-6-3- کاربرد فناوری نانو در صنعت پزشکی
درمان و پیشگیری بیماری‌ها از قابلیت‌های خوب فناوری نانو به شمار می‌رود. این فناوری با استفاده از نانوابزارها و نانوساختارهای مهندسی‌شده، اعمال ساخت، کنترل، دیدن و ترمیم سیستم زیستی انسان در مقیاس مولکولی را انجام می‌دهد.
مثال‌هایی از کاربرد نانوفناوری در پزشکی
1- هدف‌گیری و ارسال دارو به نقاط غیر قابل دسترس بدن با تجهیزات نانومتری
2- تولید بافت‌های مصنوعی سازگار با بدن
3- تولید سیستم‌های هوشمند برای شناسایی بیماری‌های در حال ایجاد در بدن
4- درمان برخی از بیماری‌های صعب‌العلاج مانند سرطان، ایدز و هپاتیت
5- مراقبت بهداشتی بهتر با استفاده از تجهیزات نانومتری در داخل بدن
1-4-6-4- کاربرد فناوری نانو در مخابرات
یکی از روش های بکارگیری فناوری نانو در مخابرات، بهبود اتصالات فیبرهای نوری است تا انتقال اطلاعات بهتر انجام گیرد]3[ و ]4[.
فصل دوم
مروری بر متون
2-1- نانو کامپوزیت ها
نانو کامپوزیت ها مواد مرکبی هستند که حداقل یکی از اجزای تشکیل دهنده آن ها دارای ایجاد محدوده 1 تا 100 نانومتر می باشد در واقع ترکیبات متشکل از ذراتی در مقیاس نانو بوده که در یک فاز زمینه پراکنده شده اند نانو کامپوزیت ها را می توان ساختارهای جامدی در نظر گرفت که در ابعاد نانومتری دارای فواصل تکراری بین فازهای مختلف به وجود آورنده ترکیب خود می باشد .
علت اینکه این مواد نسبت به کامپوزیت های متداول خواص ویژه و مطلوب تری را از خود نشان می دهند این است که نیروهای بین سطح مشترک تقویت کننده در یک کامپوزیت معمولی قوی تر می باشد.
کامپوزیت ها دو فاز دارند : اصلی زمینه و تقویت کننده های نانو متری
انواع تقویت کننده ها:
1)نانو ذرات
2)نانو لوله ها
3)نانو صفحات
4)نانو الیاف
کامپوزیت های اصلی زمینه:
1)نانو کامپوزیت های زمینه پلیمری :
خواص بی نظیر (مکانیکی ، شیمیایی ، فیزیکی) , خاصیت نفوذ پذیری , پایداری حرارتی بالا , استحکام بالا , وزن کم .
با افزودن درصد کمی از مواد نانو به یک پلیمر خالص , استحکام تنشی و کششی افزایش چشم گیری می یابد.
2)نانو کامپوزیت های زمینه فلزی :
کم وزن و سبک و استحکام بالا مقامومت و پایداری حرارتی مناسب.
3)نانو کامپوزیت های زمینه سرامیکی :
به مواد جامدی که بخش عمده تشکیل دهنده آن ها غیر آلی و غیر فلزی باشد.
ساختمان به شکلی است که معمولا یک فاز نسبت به فاز دیگر دارای دانه بندی کوچکتری است و معمولا یک فاز در ابعاد نانو متری و فاز دیگر در ابعاد میکرونی.
سرامیکهای مهندسی به دو گروه اکسیدی و غیر اکسیدی تقسیم می شوند.
اکسیدی : TiO2تیتانیا ،AL2O3آلومینا ، ZrO2 زیرکومینا
غیر اکسیدی: SiC ,TiN
سختی بالا و مقاومت فشاری و پیچشی بالاتر ، مقاومت حرارتی عالی ، رسانایی الکتریکی و حرارتی پایین ، مقاومت سایشی بالاتر و چگالی پایین تر.
مهمترین مشکل شکنندگی بالای آنها به دلیل پیوندهای یونی و کوالانسی و برای حل آن اضافه کردن و جاسازی الیاف و ذرات با ابعاد نانومتری]5[.
2-1-1-خاصیت فتوکاتالیستی :
اگر یک نیمه رسانا در معرض تابش قرار گیرد به صورت یک کاتالیست عمل می کند.
براساس شتابدهی واکنش های نوری در حضور کاتالیست.
فرایند فوتو کاتالیکی به جفت شدن نور فرابنفش با انرژی کم با ذرات کاتالیستی.
این فرایند شبیه فوتوسنتز است و فوتو کاتالیست به مانند کلروفیل نور خورشید را به دام می اندازد و باعث تبدیل ترکیب به CO₂ و آب می شود.
فرایند سل_ژل شدن عبارت است از:
1)مخلوط پیش ماده 2)شکل دهی 3)ژل شدن 4)پیر شدن 5)خشک شدن 6)آب زدایی یا تثبیت شیمیایی 7)متراکم کردن و سنتز شدن]6[.
2-1-2-مکانیسم فتو کاتالیست (فرآیند) :
فعالسازی توسط تابش با طول موج لازم برای تشکیل جفت حفره الکترون.
TiO₂ e⁻ + h⁺
جذب سطحی آب ، ترکیب آلی و رادیکال هیدرواکسیل بر روی سطح کاتالیست.
O⁻² + Ti⁺⁴ +H₂O H⁻ + Ti⁺⁴ - OH
ترکیب مجدد حفره و الکترون.
Ti⁺⁴ +H₂O Ti⁺⁴ - H₂O
Site+R(i) R(I,ads)
OH +Ti⁺⁴ Ti⁺⁴ /OH
ترکیب مجدد حفره و الکترون و تولید انرژی حرارتی.
e⁻ + h⁺ heat
Ti⁺⁴ -OH⁻ +h⁺, TI⁺⁴ / OH°
به دام افتادن الکترون و حفره.
R(I,ads) +h⁺ R⁺(A,ads)
Ti⁺⁴ +e⁻ Ti⁺³
Ti⁺³ +O₂ Ti⁺⁴ - O⁻₂
حمله رادیکال هیدروکسیل تحت شرایط مختلف.
Ti⁺⁴ /OH° + R° (I,ads) Ti⁺⁴+ R (J,ads)
OH°+ R (I,ads) R (J,ads)
Ti⁺⁴ /OH° +R(i) Ti⁺⁴ + R(j)
OH° +R(i) R(j)
2-1-3-اثر O₂ و H₂O₂ :
در حضور این عوامل سرعت و بازده تجزیه نوری افزایش می یابد , نقش اصلی اکسیژن مولکولی جلوگیری از ترکیب مجدد الکترون-حفره است ، زیرا به عنوان دام الکترونهای نوار رسانش عمل می کند در اثر این عمل یون رادیکال سوپراکسید تشکیل می شود که شدیداّ فعال است و به ترتیب خنثی ، رادیکال و یون-رادیکال جذب شده بر سطح کاتالیزور حمله می کند. علاوه بر این کار O₂ باعث تولید H₂O₂ می شود که خود این عامل به عنوان الکترون پذیر با الکترون های رسانا وارد عمل شده و رادیکالهای هیدروکسیل تولید می کنند]7[.
H₂O₂ + e⁻ OH° + OH⁻
2-2- نانو کاتالیست‌ و نانوذرات کاتالیستی
کاتالیست، گونه‌ای است که سرعت واکنش را افزایش می دهد. هدف شیمی دانان، تولید کاتالیستی با فعالیت و بازده بالا، گزینش پذیری کامل، قابلیت جداسازی و بازیابی از مخلوط واکنش، مصرف انرژی کم و عمر بالا است. عملکرد کاتالیست با کنترل متغییرهایی همچون اندازه، ساختار، توزیع فضایی و الکترونی، ترکیب سطح، پایداری گرمایی و شیمیایی می تواند تعیین شود. بازده  بالا، صرفه ی اقتصادی، هدر رفت کم مواد شیمیایی ، مصرف گرما و انرژی پایین، ایمنی بالا و استفاده ی بهینه از مواد شیمیایی اولیه، از مزایای نانوکاتالیست است. برای صرفه جویی اقتصادی و استفاده ی بهینه از نانوکاتالیست، معمولا آن را به صورت کامپوزیت می سازند و سطح آن را مورد اصلاح شیمیایی قرار می دهند. تحقیقات در حوزه ی نانوکاتالیست، همواره یکی از بحث های جذاب در نانوشیمی و شیمی سبز بوده است. شیمی سبز به واکنش های شیمیایی سالم با محصولات بی خطر و با حداکثر بازده (حداقل مصرف ماده و انرژی) می‌پردازد و نانوکاتالیست می‌تواند ما را به سوی این آرمان  سوق  دهد.
کاتالیست، گونه‌ای است که انرژی فعال سازی واکنش (انرژی اولیه برای انجام واکنش) را کاهش داده و در نتیجه سرعت واکنش را افزایش می دهد. فلزات واسطه‌ی جدول تناوبی عناصر، رایج ترین کاتالیست ها هستند.کاتالیست ها به دو دسته ی همگن (Homogeneous) و ناهمگن (Heterogeneous) تقسیم می شوند. کاتالیست همگن، تک اتم، یون یا مولکول است و با واکنش دهنده ها هم فاز می باشد. به بیان دیگر، ذرات کاتالیست همگن می توانند به راحتی در مخلوط واکنش حل شوند. کاتالیست همگن در واکنش مصرف شده و مجددا تولید و بازیابی می‌شود. فعالیت بسیار بالا، گزینش پذیری و بازده خوب ، از محاسن این گونه از کاتالیست می باشد. بهبود در عملکرد کاتالیست های همگن می تواند با اتصال گروه های متفاوت آلی و معدنی به ذره اصلی فراهم شود. مشکل اصلی در فناوری کاتالیست های همگن در آنجاست که پس از اتمام واکنش، جداسازی کاتالیست حل شده از مخلوط نهایی کار ساده ای نیست. این مشکل به ویژه در زمانی که کاتالیست در مقادیر کم مصرف می شود، خود یک چالش بزرگ است]8[ و ]9[.
کاتالیست ناهمگن، با واکنش دهنده ها در یک فاز نیست. اندازه و خصوصیت ذرات کاتالیست ناهمگن به صورتی است که به راحتی در محیط واکنش حل نمی شود؛ از این رو فعالیت آن محدود می گردد (بازده کل واکنش کاهش می یابد). برخلاف کاتالیست های همگن، کاتالیست های ناهمگن به راحتی (با صرف هزینه، زمان و مواد کمتر) از مخلوط واکنش جدا می شوند و موجب ناخالصی محصولات نمی گردند. برای آنکه کمبود سطح فعال در این گونه ترکیبات جبران شود، استفاده از یک بستر در نقش تکیه گاه کاتالیست، ضروری است. بستر معمولا یک ساختار متخلخل با سطح فعال بالاست.
کاتالیست مناسب، باید سطح فعال زیاد داشته و قابل جداسازی باشد. فناوری نانو، می تواند سطح فعال بسیار زیادی را برای کاتالیست فراهم آورد. با آنکه سطح فعال نانوکاتالیست ها بسیار بالاتر از کاتالیست های معمولی است، سطح فعال یک نانوکاتالیست همواره از یک کاتالیزور همگن پایین تر است (کاتالیزور همگن با انحلال خود در تماس کامل با محتویات واکنش قرار دارد). در مقابل، نانوذرات کاتالیستی به دلیل ابعاد بزرگ تر نسبت به ذرات کاتالیست همگن، در محلول واکنش حل نشده و به سادگی قابل جداسازی هستند. سطح فعال زیاد به همراه قابلیت جداسازی کاتالیست در پایان واکنش، از نانوکاتالیست ها پلی میان کاتالیست های همگن و ناهمگن ساخته است. ممکن است فرآیند پیچیده تولید برخی از نانوکاتالیست ها هزینه بر به حساب بیاید، اما از آنجا که فناوری نانو مقدار کاتالیست، انرژی و زمان مورد نیاز برای انجام واکنش را تقلیل می دهد، این مورد قابل چشم پوشی است]10[.

شکل(2-1) نانوکاتالیست همگن و ناهمگن

شکل(2-2) ویژگیهای اصلی نانوکاتالیست
2-2-1- انواع نانوکاتالیست
دسته بندی نانوکاتالیست ها را براساس نوع نانوماده ی به کار رفته در جدول زیر می بینید:
جدول(2-1) دسته بندی نانوکاتالیست‌ها

نانوذرات و خصوصا نانوذرات فلزی و اکسید فلزی از اصلی ترین و پرکاربردترین کاتالیست های نانوساختار هستند. لذا این ترکیبات محور این پروژه - ریسرچرا تشکیل می دهند و بحث بیش تر بر آن ها متمرکز است]11[.

شکل(2-3) برخی از نانوذرات اکسید فلزی به عنوان نانوکاتالیست
نوع دیگر دسته بندی نانوکاتالیست ها، براساس رفتار آن ها است که بر این اسا به دو دسته-ی همگن و ناهمگن تقسیم می شوند:
نانوکاتالیست با رفتار همگن:
در رویکرد نانوکاتالیست همگن، نانوذرات تهیه شده از فلزات واسطه را به صورت کلوئید (ذرات معلق) در مخلوط واکنش پخش می کنند. معمولا برای پیشگیری از تجمع نانوذرات، از یک ماده پایدارکننده استفاده می شود. یک پایدار کننده خوب، نه تنها نانوکاتالیست را در فرایند کاتالیتیکی (واکنش کاتالیستی) حفظ کرده، در عین حال فعالیت آن را کاهش نمی دهد. در پایان نیز می توان نانوذرات را از محصول نهایی واکنش جداسازی نمود. روش کاهش یا همان احیاء فلزات - یعنی الکترون گرفتن کاتیون فلزی و تبدیل آن به اتم فلز خنثی - روشی معمول برای سنتز کنترل شده ی نانوذرات به صورت کلویید در محلول است. فرآیند کاهش به دو صورت شیمیایی و الکتروشیمیایی اجرا می‌شود:
1) کاهش شیمیایی: معمول ترین روش کاهش است که در آن، نمک فلز مورد نظر در محلول با عوامل کاهنده مثل الکل ها و سدیم بوروهیدرید به اتم فلزی کاهش یافته و تبدیل به نانوذره ی فلزی می شود.2) کاهش الکتروشیمیایی: در این روش در ازای یک عامل کاهنده شیمیایی، از الکترون های انباشته شده بر سطح الکترود استفاده می شود. در فرآیند کاهش الکتروشیمیایی از یک پیل متشکل از آند (محل اکسایش)، کاتد (محل کاهش) و الکترولیت (محلول نمکی دارای هدایت الکتریکی) استفاده می شود.
نانوکاتالیست با رفتار ناهمگن:
کاتالیست ناهمگن به بستر نیاز دارد؛ در نانوکاتالیست ها، بستر و کاتالیست، با هم تشکیل یک نانوکامپوزیت می دهند که برای رسیدن به بهترین عملکرد مناسب است. به عنوان مثال می توان به قرار گرفتن کاتالیست طلا بر سطح بستر دی اکسید تیتانیوم یا اکسید آهن اشاره کرد. این نانوکاتالیست ها به ترتیب به صورت Au/TiO2 و Au/Fe2O3 نشان داده می شوند. این ها کاتالیست های بسیار خوبی برای اکسایش منوکسید کربن (آلاینده‌ای بسیار مضر و خطرناک) به دی اکسید کربن هستند. از آنجا که دی اکسید کربن خطر کم تری دارد، استفاده از این نانوکاتالیست می تواند خطرات زیست محیطی مونواکسید کربن را کاهش می دهد]12[.
2-2-2- ویژگی های نانوکاتالیست
1)حداکثر سطح فعال به ازای واحد جرم و حجم: هر چه سطح فعال (سطح در دسترس برای انجام واکنش) به خصوص برای یک کاتالیست ناهمگن بیشتر باشد، جایگاه های فعال واکنش پذیر افزایش یافته و بازده  کاتالیست بالا می‌رود. با فراهم آوردن سطح بیشتر برای یک ساختار کاتالیستی، در مقدار مصرفی نانوکاتالیست صرفه جویی  شده و با افزایش واکنش دهنده های درگیرشونده در واکنش، سرعت واکنش نیز بیش تر می شود.

شکل(2-4) بیشینه  فعالیت شیمیایی کاتالیست ناهمگن، در ابعاد نانو است
2)شکل و اندازه ی قابل کنترل: برای رسیدن به بیشینه ی ماکزیمم فعالیت، باید بهترین و مناسب ترین اندازه ی نانوذره مشخص شود؛ در روش های تولید نانوذرات، راه های زیادی برای کنترل ابعاد وجود دارد. براساس محاسبات رایانه ای و شبیه سازی می‌توان به اندازه  مناسب برای یک نانوذره  با بیش ترین فعالیت و در عین حال بیشترین پایداری دست یافت. بهترین کاتالیست ها از فلزات گران بها مثل پلاتین (Pt)، طلا (Au) و پالادیوم (Pd) تشکیل یافته اند. تخمین دقیق تر بهترین اندازه ی این نانوذرات در جهت دستیابی به بالاترین فعالیت کاتالیستی، به صرفه‌جویی در مصرف این ترکیبات کمک زیادی می کند.
3)قابلیت جداسازی از مخلوط واکنش: نانوکاتالیست ها، چه همگن و چه ناهمگن، می‌توانند به راحتی از محصولات و باقی مانده‌ی اضافی واکنش گرها جدا شوند. همان گونه که ذکر شد، به دلیل بزرگی نانوذرات در مقایسه با اتم ها و مولکول ها، این ترکیبات در محیط واکنش قابل حل نبوده و معلق می مانند. به عنوان مثال، نانوذرات مغناطیسی کاربرد بسیار زیادی در حوزه‌ی کاتالیست دارند. زمانی که نانوذرات مغناطیسی به عنوان کاتالیست در واکنش به کار می روند، در پایان می توانند توسط اعمال یک میدان مغناطیسی مناسب از محیط جداسازی و بازیابی شوند.
4)گزینش پذیری و بازده ی بالا: یک نانوکاتالیست، واکنش را در یک مسیر خاص و با گزینش مواد اولیه پیش می برد. این به آن معنی است که ترکیبات ناخواسته کمتر واکنش های فرعی را باعث می شوند و از تولید محصولات جانبی در طول فرایند جلوگیری می شود. همچنین نانوکاتالیست با سطح فعال بسیار بالای خود، بازده واکنش را در مسیر اصلی خود افزایش می دهد. به عبارت دیگر می توان گفت که حجم بالاتری از مواد اولیه به محصول نهایی تبدیل می شوند. مخلوط نهایی واکنش در این حالت بیشتر متشکل از محصول اصلی است و در صد کمی از محصولات جانبی و واکنشگرهای باقی مانده (آن هایی که در واکنش شرکت نکرده اند) وجود دارد. این فرآیند، روند خالص سازی و استخراج محصول (برای مثال یک دارو) را آسان و کم هزینه می کند.
5) استعداد کلوخه ای شدن: نانوذرات در پایدارترین حالت ساختاری خود نیستند، فعالیت سطحی بسیار بالا داشته و از این رو مستعد به هم چسبیدن، کلوخه ای شدن و در نتیجه از دست دادن ابعاد نانو می باشند. اگر فرآیند کلوخه ای شدن برای یک نانوکاتالیست اتفاق بیفتد، فعالیت آن کاهش چشم گیری پیدا می کند و به اصطلاح، غیرفعال می‌شود.
6) تنوع بالا و قابلیت اصلاح شیمیایی: به علت فعالیت سطحی بالا، گروه های مختلف آلی می توانند به سطح نانوکاتالیست ها متصل شوند. ازجهتی فعالیت سطحی بالا باعث می شود تا نانوکاتالیست ها با مواد معدنی نیز کامپوزیت تشکیل دهند. اصلاح شیمیایی نانوکاتالیست ها با اتصال گروه های مختلف تنوع زیادی را در عملکرد آن ها به وجود می آورد.
7) منبع تهیه: نانوکاتالیست های طبیعی در طبیعت وجود دارند و در دسترس هستند. از این دسته می توان به نانوذرات خاک رس و نانوزئولیت ها اشاره کرد. دسته دیگر نانوکاتالیست های سنتزی هستند که توسط بشر تولید می شوند و تنوع زیادی دارند؛ برای مثال نانوذرات اکسید فلزی از این دست هستند]13[.
جدول(2-2) مزایا و معایب نانوکاتالیست
2-2-3- روش های استفاده از نانوکاتالیست فلزی
همانگونه که در بالا ذکر شد، مواد فعال کاتالیستی معمولا ترکیبات نادر و گران بهایی هستند. فلزات گروه پلاتین که به PGM معروفند، شش فلز اوسمیوم (Os)، ایریدیوم (Ir)، رودیوم (Rh)، روتنیوم (Ru)، پالادیوم (Pd) و پلاتین (Pt) را شامل می شود. فلزات PGM گران بها بوده و معروفترین عناصر کاتالیستی هستند. از این رو ارائه روش هایی برای صرفه جویی اقتصادی مناسب همراه با بهبود عملکرد برای چنین کاتالیست هایی ضروری است. روش های زیر در برگیرنده چنین رویکردهایی هستند:
1)ساختارهای پوسته-هسته: در یک نانوساختار، این اتم ها ی سطح هستند که نقش اصلی را بازی می کنند. معمولا اتم هایی که در مرکز یک نانوتوده قرار می گیرند، نقش عملکردی خاصی ندارند. در طراحی یک نانوساختار پوسته-هسته، فلز کاتالیستی گران بها نقش پوسته را بازی کرده و از یک ماده ارزان همچون سیلیکا در هسته استفاده می شود. همچنین می توان از نانوذرات مغناطیسی به عنوان هسته استفاده نمود. در روش پوسته-هسته نه تنها فعالیت کاتالیست تا حد زیادی حفظ می شود، بلکه در مصرف فلزات پرقیمت نیز تا حد زیادی صرفه جویی می‌گردد.
2)استفاده از مواد متخلخل به عنوان بستر: از مواد متخلخلی مثل سیلیکا یا سیلیکاژل (آیروژل سیلیکا که از روش سل ژل به دست می آید)، آلومینا (Alumina) و زئولیت (Zeolite) به عنوان بستر کاتالیست ها استفاده می‌شود. نانوذرات فلزی به صورت یکنواخت روی بستر متخلخل نشانده می شوند تا سطح فعال افزایش یابد. کاتالیست Pt/SiO2 از این دسته است.
3)نانوذرات دوفلزی: در این رویکرد، نانوکاتالیست به صورت آلیاژی از فلز گران  به همراه فلز ارزان قیمت مورد استفاده قرار می گیرد. یکی از موارد پرکاربرد در این زمینه نانوذرات PtFe آلیاژ آهن و پلاتین است.
4)نانوخوشه های دوفلزی: در نانوخوشه هایی دوفلزی، فلز ارزان در مرکز و فلز گران قیمت کاتالیستی بر سطح وجود دارد. برای مثال نانوخوشه  با مرکز Ni و سطح Pt یه عنوان یک نانوخوشه دوفلزی مطرح است.
5) استفاده از بستر اکسید فلزی: یکی از معمول تر ین اکسید های فلزی که به عنوان بستر برای کاتالیست های گران بها مورد استفاده قرار می گیرد دی اکسید تیتانیوم است. کاتالیست Au/TiO2 نمونه ای از این دست است. اگر اکسیدهایی از فلزات با ساختاری شبکه ای فلوریت مثل CeO2، ZrO2 و ThO2 با ناخالصی هایی از جنس اکسید فلزات قلیایی یا قلیایی خاکی بهبود یابند، به عنوان بستر کاتالیست مورد استفاده قرار می گیرند. در ساختار فلوریت، آنیون ها در گوشه های یک مکعب کوچک داخل یک مکعب بزرگ از کاتیون ها هستند که کاتیون ها در گوشه ها و وسط وجه های مکعب بزرگ قرار دارند.
6) استفاده از گروه های آلی: ترکیبات آلی می توانند همچون پل، یک نانوذره ی مغناطیسی را به یک نانوذره کاتالیست نادر متصل کنند. این ساختار ترکیبی (کاتالیست مغناطیسی) می تواند پس از انجام واکنش به راحتی با اعمال میدان مغناطیسی خارجی جداسازی شود. برای مثال ترکیب آلی دوپامین که یک ماده شیمیایی طبیعی در سامانه عصبی است، اتم های پالادیوم (کاتالیست) را به نانوذره ی مگنتیت (Fe3O4) متصل می کند.
7)استفاده از ترکیبات کمپلکس: بسیاری از فلزات در یک عدد اکسایش خاص (به صورت یون) دارای فعالیت کاتالیستی می باشند. از آن جهت که یون ها به تنهایی در محیط واکنش ناپایدار می باشند، برای ایجاد پایداری ویا حفظ عملکرد، آن ها را به یک ترکیب کمپلکس تبدیل می کنند. ترکیب کمپلکس، یک ترکیب شیمیایی است که در آن ترکیبات آلی الکترون دهنده به نام لیگاند به مراکز فلزی (دارای کمبود و پذیرنده الکترون) الکترون می‌دهند. لیگاندها معمولا حاوی اتم های الکترون دهنده و یا اتم های دارای زوج الکترون تنها (غیر‌پیوندی) هستند و از این رو می توانند الکترون های خود را در اختیار یون یا اتم های فلزی (که دارای کمبود الکترون هستند) قرار دهند و آن ها را پایدار نمایند. ترکیبات کمپلکس نیز معمولا همچون یون فلزی در محیط واکنش محلول بوده و بسیاری از کاتالیست های همگن ساختار کمپلکسی دارند.از جهت دیگر نانوذرات مغناطیسی می توانند به اتم های آزاد لیگاند متصل شوند. از این رو ترکیبات کمپلکس از یک یون فلزی کاتالیستی می توانند بر سطح یک نانوذره مغناطیسی قرار گیرند. در این صورت کاتالیست کمپلکس شده می‌تواند با اعمال یک میدان مغناطیسی همچون یک کاتالیست ناهمگن در انتهای واکنش جداسازی شود. برای مثال اتصال کمپلکسی از فلز کاتالیستی و گران بهای روتنیوم (Ru) توسط اکسیژن های لیگاند آن به نانوذره‌ی فریت (Fe2O3).
8)جایگزینی فلزات کم بها: مطالعات متعدد در زمینه جایگزینی فلزات گران بها (PGM) با ترکیباتی ارزان تر مثل نانوذرات دی سولفید مولیبدن (MoS2) یا نانوذراتی با زمینه ی آهن در این راستا صورت گرفته است.
9)استفاده از درخت سان: درخت سان ها، ترکیباتی شبه پلیمری هستند که از یک مرکز منشعب شده و ساختار شاخه  ای دارند. پرکاربردترین آن‌ها، پلی-آمیدوآمین (PAMAM) است. نانوذرات کاتالیستی می توانند در داخل حفره های یک درختسان جای گیرند. این کار معمولا برای حفظ فعالیت و به صورت همزمان پایداری نانوذرات کاتالیستی در شرایط واکنش صورت می پذیرد.
10)استفاده از نانوساختارهای متفاوت: برای دستیابی به کاتالیست فعال تر می توان از اشکال مختلف نانوساختاری دیگر مثل نانومیله ها، نانولوله هاو ... نیز استفاده نمود. نانومیله های Co3O4 که سطح فعال بالا و پایداری گرمایی و شیمیایی خوبی دارند به عنوان مثال معرفی می شوند]14[.
2-3- دی اکسید تیتانیوم
تیتانیوم‌دی‌اکسید به عنوان یک فوتوکاتالیزور هتروژن به دلیل ارزانی و فعال بودن از نظر شیمیایی و تولید حفرات اکسنده و همچنین پایداری نسبتا بک فوتوکاتالیزور ایده آل محسوب می شود و ضمن آنکه غیر سمی است و به وسیله سانتریفیوژ یا صاف کردن بازیافت می شود و پس از انجام تصفیه ، آلاینده دیگری بر جای نمی گذارد . اما به هر حال کاربردهای آن در فاز آبی به علت اینکه تیتانیوم اکساید سطح قطبی دارد و در نتیجه جاذب خوبی جهت مولکولهای آلی غیر قطبی نمیباشد محدود می شود . یک راه حل جهت حذف این محدودیت نشاندن آن بر روی بسترهای مناسب است که موجب بهبود خواص کاتالیزوری آن میشود . علاوه بر آن هنگامی که بر روی یک بستر تثبیت شود فعالیت خود را برای مدت طولانی حفظ می کند . از طرف دیگر در سالهای اخیر مطالعات گسترده ای بر روی کاربرد مواد در حالیکه با فوتوکاتالیزور تیتانیم اکساید مخلوط یا پوشش داده شده اند متمرکز شده است. این پوشش ها گاه به عنوان حذف آلاینده های گوناگون موجود در هوا و گاه جهت فوتوکاتایز آلاینده های آلی موجود در آب و فاضلاب به کار می روند]15[.
با گذر از میکروذرات به نانو ذرات ، با تغییر برخی از خواص فیزیکی روبرو می شویم که دو مورد مهم آنها عبارت از : افزایش نسبت مساحت سطحی به حجم و ورود اندازه ذره به قلمرو اثرات کوانتومی.
افزایش نسبت مساحت سطحی به حجم که به تدریج با کاهش اندازه ذره رخ میدهد باعث غلبه یافتن رفتار اتم‌های واقع در سطح ذره به رفتار اتم های درونی می شود این پدیده بر خصوصیات ذره به صورت جدا و بر تعاملات آن با دیگر مواد اثر می گذارد . کوچکتر شدن ابعاد نانو ذرات از طول موج بحرانی نور آن را نامرئی و شفاف می کند . این خاصیت باعث شده است تا نانو ذرات برای مصارف بسته بندی ، مواد آرایشی و روکش ها مناسب باشند.
نانو ذرات در حال حاضر از طیف وسیعی از مواد ساخته می شوند معمول‌ترین آن ها نانو ذرات سرامیکی نظیر دی‌اکسید‌تیتانیوم ، اکسید‌روی و اکسید‌آهن می باشد.
دی‌اکسید‌تیتانیوم (TiO₂) یک محصول شیمیایی است که در حجم بالا به طور صنعتی تولید و یکی از مواد معدنی است که سالانه بیش از 3.5 میلیون تن در سراسر جهان مورد استفاده قرار میگیرد.
دی اکسید تیتانیوم در گروه نیمه رسانا می باشد و خاصیت فتوکاتالیستی و فوق آبدوستی دارد.
TiO2 در فیلترها ، در پیل های خورشیدی ، به عنوان پایه کاتالیست ، در تولید غشا های غیر آلی ، به عنوان پرکن ها در کاغذ و پلاستیک ، در مواد آرایشی جهت جذب نور خورشید ، به عنوان رنگدانه در رنگها جهت براق کردن آن ها کارایی دارد]16[.
2-3-1-کاربردهای دی اکسید تیتانیوم
در صنایع پوششی، رنگ، پلاستیک، کاغذ مورد استفاده قرار می‌گیرد.
کاربردهای نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم از جمله آنها در زمینه حذف آلاینده ها از محیط زیست می‌باشد.
کاربرد دیگر(TiO₂) استفاده از آن در حس گرهای گاز است.
کاربرد حسگرهای گاز، برای اصلاح کنترل ایمنی و محیطی گازها می باشد و همچنین برای بهینه کردن واکنش های سوخت در کاربردهای صنعتی نیاز به این نوع حسگرها است.
حسگرهای گازی از نوع نیمه رسانا نظیر (TiO₂)(SnO₂)(ZnO) مزایای زیادی نسبت به سایر حسگرها دارند چون کاربرد ساده و هزینه کم و قابل اعتماد می‌باشند.
از دیگر کاربردهای TiO₂ استفاده از آن در حسگرهای اکسیژن است.
برای تهیه نانو ذرات TiO₂ از روشهای سل-ژل ، میکروامولسیون ، هیدروترمال , هیدرولیز، شعله، احتراق، چگالش بخارات شیمیایی استفاده می‌شود.
نانو ذرات به دست آمده با استفاده از روشهای مختلف با توجه به شرایط تهیه آنها دارای ویژگی هایی چون اندازه ذرات ، تبلورو دانه بندی می‌باشند.
دی‌اکسید‌تیتانیوم (TiO₂) یک اکسید فلزی نیمه رسانا از نوع (n-type) با باند انرژی حدوداّ سه الکترون ولت می‌باشد.
دی‌اکسید‌تیتانیوم دارای سه فاز کریستالی Anatase، Rutile ،Brookite می باشد که آناتایز و روتایل چهار وجهی و بروکیت هشت وجهی می‌باشد.
آنالیز (TiO₂) نیمه پایدار است به طوری که در دمای بالا به فاز روتایل که پایدار است تبدیل می‌شود .فاز برکیت فقط در دمای خیلی پایین پایدار است.
دی‌اکسید‌تیتانیوم نیمه رسانایی است که علاوه بر خاصیت رسانایی اش دارای خواص فتوکاتالیستی و فوق آبدوستی نیز می باشد که متمایز از نیمه رساناهای دیگر است]17[ و ]18[.
2-3-2-روشهای سنتز دی اکسید تیتانیوم
تولید نانو ذرات در فاز مایع
تولید نانو ذرات در فاز بخار
روشهای تولید نانو ذرات (TiO₂) در فاز مایع :
1)روش سل-ژل
2)روش میکروامولوسیون
3)روش هیدروترمال
4)روش رسوبی
روش های سنتز نانو ذرات(TiO₂) در فاز بخار: بر پایه پیش ماده می باشد.
الف) اگر پیش ماده به کار گرفته در آن جامد باشد:
1)روش تراکم در گاز خنثی
2)روش تخیله جرقه ای
3)روش برون پاشی یونی
ب)اگر پیش ماده به کار رفته در آن مایع یا بخار باشد :
1)روش شعله
2)روش چگالی بخارات شیمیایی
در روش شعله از ایزوپروپوکساید تیتانیوم و یا از تتراکلرید تیتانیوم (TiCl4) به عنوان پیش ماده استفاده می‌شود]19[.
2-3-3-روش سل-ژل
در روش سل-ژل که در این فرآیند یک شبکه غیر آلی به صورت یک سوسپانسیون کلوئیدی (سل) تهیه شده و در نهایت طی فرآیند تشکیل ژل ، فاز مایع از آن خارج می‌شود. به طور کلی در این روش نانو ذرات درون شبکه یک ژل تشکیل و این امر مانع از رشد بلورها می‌شود در نتیجه بلورها در اندازه نانو باقی می‌مانند.
در این روش از آلکو اکسیدهای فلزی حل شده در محیط الکلی استفاده می‌شود که در مرحله اول سل حاصل طی فرآیند هیدرولیز , که سبب جانشینی گروهای OH به جای گروهای OR می شود , به صورت ژل در می‌آید.
جهت تولید نانو ذرات دی‌اکسید‌تیتانیوم به روش سل_ژل ابتدا واکنش هیدرولیز و پلی کندانسیون آلکواکسیدهای تیتانیوم Ti(OR)n جهت تشکیل اکسو پلیمرها انجام می شود و سپس به یک شبکه اکسیدی تبدیل می‌شود.
کندانسون در مرحله ژله ای شدن و مرحله تکلیس انجام می‌شود.
کندانسیون ذرات ژل را به سمت یکدیگر می کشاند و در نتیجه یک جرم فشرده ای را به وجود می‌آورد و بلور اکسید فلزی به این ترتیب شکل می‌گیرد.
تکلیس نیز سبب خارج کردن مولکولهای آلی از محصول و کاملتر کردن تبلور می‌شود.
تمام این مراحل و موادی که در تهیه نانو ذرات از روش سل_ژل استفاده می شوند بر روی ساختار نهایی، ماهیت کریستالی، مورفولوژی، شکل و اندازه ذرات تاثیر می گذارند.
مواد اولیه ای که جهت سنتز نانو ذرات از طریق این روش مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از : محلول پیش ماده(آلکوکسیدهای تیتانیوم) در یک الکل (ایزوپروپانول یا اتانول) به علاوه اسید یا باز جهت تغییر PH محیط (اسید نیتریک، اسید هیدروکلریک) و آب دیونیزه شده جهت هیدرولیز پیش ماده.
در برخی موارد آب همراه الکل به پیش ماده اضافه و اسید به طور جداگانه در یک مرحله دیگر به بقیه مواد اضافه می شود و در بعضی مواقع دیگر محلول از آب و اسید تهیه شده و به پیش ماده اضافه می شود.
علت استفاده از اسید یا باز در هنگام سنتز این است که یون H⁺ در محیط های اسیدی و یا یون OH¯ در محیط بازی روی سطح ذرات جذب شیمیایی می‌شوند]20[.
بطور مثال:
8356602598600TiO₂+nH⁺ TiO₂ Hⁿ⁺
9158665216700TiO₂+nOH⁻ TiO₂ (OH)ⁿ⁻
همین امر باعث ایجاد یک نیروی رانش قوی بین ذرات باردار شده و در نتیجه از تجمع ذرات جلوگیری می‌شود. بنابراین سل های پایدار در محیط های اسیدی یا بازی می توانند شکل بگیرند.
طبق مشاهدات اندازه ذرات دی‌اکسید‌تیتانیوم در 5/3PH< و 9PH> مقادیر پایین تری نسبت به محدوده 5 الی 8 دارند.
به طوری که در این محدوده PH ، بزرگترین ذرات حاصل شده‌اند که در واقع این محدوده همان نقطه ایزوالکتریک دی‌اکسید‌تیتانیوم می‌باشد و در این محدوده سل ها به رنگ سفید شیری هستند در حالی که برای 5/3PH< و 9PH> سل ها شفاف هستند و اندازه ذرات دی‌اکسید‌تیتانیوم درحد نانومتر می‌باشد. عوامل تاثیر گذار روی ژل : نوع پیش ماده ، مقدار آب به کار رفته , سرعتی که آب اضافه می‌شود ، زمان دادن به محلول که همان زمان بین تشکیل ژل و حذف حلال است.
از معایب روش سل_ژل می توان به چند مرحله ای این روش اشاره کرد که مستلزم وقت و هزینه می شود.
از معایب دیگر آن تنوع زیاد مواد اولیه به کار رفته در این روش میباشد به طوری که تغییر هر کدام از این مواد تاثیر زیادی بر روی محصول نهایی می‌گذارد.
از مزایای روش سل_ژل سادگی آن نسبت به بسیاری از روشهای تولید می‌باشد و به راحتی با کنترل دقیق شرایط سنتز , می توان نانو ذراتی با اندازه زیر 10 نانومتر تولید کرد]21[.
2-3-4-پراش اشعه ایکس (XRD) :
با استفاده از XRD می توان اطلاعاتی راجع به فازهای کریستالی موجود در نمونه سنتز شده و میزان خلوص فازها به دست آورد. همچنین این روش تخمینی از اندازه ذرات را نیز به ما می‌دهد . که با استفاده از معادله شرر(scherrer) می توان این مقدار را اندازه گرفت.
بنابر این رابطه , هر چه پیک ها تیزتر باشند نشان دهنده ذرات بزرگتر می باشند.
جهت بهبود ماهیت کریستالی ذرات تولید شده عملیات حرارتی انجام می‌شود.طی این عملیات با افزایش دما ، ساختار آمورف نمونه تهیه شده به کریستال تبدیل می شود که از طریق طیف XRD به این تبدیل ساختار پی می‌بریم و متوجه می‌شویم که در چه دمایی تبدیل آمورف به کریستال رخ می‌دهد.
همچنین با استفاده از XRD می‌توان دمایی که در آن تبدیل آناتایز به روتایل رخ می‌دهد را مشخص کرد که این تبدیل فاز معمولا در محدوده دمایی °500 تا °700 که بر حسب نمونه و شرایط آن رخ می‌دهد.
با افزایش دما پیک ها تیز می‌شوند که این نشانگر افزایش اندازه ذرات می‌باشد و همچنین پیک های فاز روتایل بزرگتر از فاز آناتایز می باشد که این نشانگر آن است که اندازه ذرات روتایل بزرگتر از ذرات آناتایز می‌باشد]22[.


2-4- علف کش بنتازون
بنتارون که با نام تجاری بازاگران توسط کمپانی بی آ اس اف به فروش مى‌رسد، علف‌کشى است که به‌صورت پس از سبز شدن براى کنترل علف‌هاى هرز برگ‌پهن و جنگل‌ها در میان برگ‌باریک‌هاى مهم و حبوبات دانه‌درشت استفاده مى‌شود. این علف‌کش براى کنترل برگ‌پهن‌هاى سخت مزارع و سایر محصولات به‌کار مى‌رود. علف هرز توق حساسیت ویژه‌اى به بنتازون داشته و زمانى‌که ارتفاع آن ۳۰ الى ۴۵ سانتى‌متر باشد، به راحتى توسط آن کنترل مى‌شود. براى کنترل علف‌هاى هرز برگ‌پهن سویا و گیاهان دیگر که به سختى کنترل مى‌شوند از بنتازون استفاده مى‌شود. پس از گذشت ۲ تا ۷ روز از کاربرد بنتازون، علایم بافت‌مردگى و مرگ گیاهان مشاهده مى‌شود. علت عمده مرگ آن ممانعت از فتوسنتز است. به‌نظر مى‌رسد که حرکت علف‌کش در گیاه محدود بوده و براى اینکه گیاه کاملاً بمیرد بایستى به‌طور کامل توسط علف‌کش پوشیده شود، در غیر این‌صورت معمولاً جوانه‌هاى جدید شروع به رشد مى‌کنند. براى اینکه توسط آن بتوان طیف وسیعى از برگ‌پهن‌ها را از بین برد، آن را در مخزن با 2و4 دی آکیفلورفن مخلوط میکنند.
2-4-1-حرکت و نحوه عمل علف کش در گیاهان
بنتازون علف‌کشى است تماسى که به‌صورت پس از سبز شدن براى کنترل انتخابى بسیارى از برگ‌پهن‌ها و جنگل‌ها در غلات و حبوبات دانه‌درشت استفاده مى‌شود. کنترل مطلوب زمانى به‌دست مى‌آید که علف‌هاى هرز کوچک بوده (در مرحله دو تا ده برگی) و در حال رشد سریع باشد. به‌منظور افزایش کنترل معمولاً به آن مواد خیس‌کننده یا مواد روغنى اضافه مى‌کنند. یک تا دو هفته پس از مصرف علایم اثر آن آشکار مى‌شود. مقاومت گیاهان زراعى معمولاً بسیار بالا است. با وجود این بر روى سویا، لوبیا و بادام زمینى برگ‌سوختگى رخ مى‌دهد، اندام‌هاى جدید تولید شده پس از مصرف سم طبیعى بوده و پتانسیل تولیدى گیاهان کاهش نمى‌یابد.
2-4-2-واکنش در خاک
بنتازون در مقادیر پس از سبز شدن در خاک فعالیتى ندارد. این علف‌کش به‌وسیله میکروب‌هاى خاک تجزیه شده و ظرف ۶ هفته به میزان غیر قابل شناسائى مى‌رسد.
2-4-3-گیاهان حساس به علف‌کش
برگ‌پهن‌ها و جنگل‌ها به بنتازون حساس هستند.علف‌هاى هرز برگ‌پهن یک‌ساله که توسط بنتازون کنترل مى‌شوند عبارتند از: آنودا، دودندان، توق، تاتوره، سلمه،کنف وحشی، انواع پیچک، خردل وحشی، تاجریزى خرفه، زلف پیر، زلف پیر بزرگ، سزبانیا، کیسه کشیش، علف هفت‌بند، آفتابگردان وحشى و گاوپنبه.
علف‌هاى هرز چندساله‌اى که توسط بنتازون کنترل یا تضعیف مى‌شوند عبارتند از: تیرکمان آبی، سولیداگو، اویارسلام زرد، بارهنگ،الوکاریس و خارلته.
2-4-4-مصارف اصلی
پس از سبز شدن در سویا، ذرت مرغ، بادام زمینی، لوبیا، نخود زراعی، نعناع و پونه تثبیت شده، استفاده مى‌شود.
پس از سبز شدن در گیاهان چمنى تثبیت شده (چمن بوآ، چمن فستوک، آگروستیس، پنجه مرغی، پاسپالوم، علف چاودار، علف سنت‌آگوستین) براى کنترل اویارسلام زرد استفاده مى‌شود. براى کنترل خارلته و اویارسلام در گیاهان زراعى ذکر شده (به‌استثناء برنج)، مقدار توصیه شده را دو قسمت کرده و با فاصله زمانى ۷ تا ۱۰ روز در گیاهانى که در قسمت الف آمده استفاده مى‌کنیم.
براى کنترل توق در مراحل انتهائى رشد سویا، ذرت و بادام زمینى استفاده مى‌شود. در گیاهان بلند ساقه (تا ارتفاع ۶۰ سانتى‌متر) توق ممکن است به‌طور نسبى کنترل شود.
2-4-5-ساختمان شیمیایی

فصل سوم
مواد و روشها
3-1- دستگاه‌ها
فتورآکتور : (رآکتور طراحی شده سیستم بسته با دو لامپ UV شش وات و تنگستن بیست وات با طول موج بیش از 330 نانومتر)
هم زن مغناطیسی : JENWAY-1000
دستگاه رفلاکس
آون : MEMMERT بامحدوده دمایی 200 درجه سانتیگراد
PH متر : METROHM-744
کوره : EXCITON با محدوده دمایی 1400 درجه سانتیگراد
ترازوی دیجیتالی : SARTOUIOS با دقت 0001/0 گرم
کروزه , هاون چینی
سرنگ فیلتر نانو : Membran.2micron
دستگاه آنالیز FT-IR
دستگاه آنالیز XRD
دستگاه SEM
دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis
3-2- مواد
تمامی مواد شیمیایی مورد استفاده در این کار تحقیقاتی ساخت کارخانه مرک میباشند.
آب دو بار تقطیر دیونیزه شده
آمونیاک با جرم مولکولی g/mol 03/17 , چگالی kg/L91/0 و خلوص 99%
اسید نیتریک با جرم مولکولی g/mol01/63 , چگالی kg/L40/1 و خلوص 65%
تیتانیوم تتراکلرید با جرم مولکولی g/mol71/189 , چگالی kg/L73/1 وخلوص 99%
تترااتیل اورتوسیلیکات با جرم مولکولی g/mol33/208 , چگالی kg/L93/0 وخلوص 98%
ماده زیر ماده مورد آنالیز این کار تحقیقی میباشد که از شرکت گلسم گرگان واقع در استان گلستان تهیه شده است که شرکت گلسم این ماده را از کمپانی BASF آلمان وارد میکند .
علف کش بنتازون با خلوص 97%
3-2-1-تتراکلرید تیتانیوم
تتراکلرید تیتانیم ترکیب معدنی با فرمول TiCl4 است. مهم ترین کاربرد این ماده در تولید فلز تیتانیوم و رنگدانه های دی اکسید تیتانیوم می باشد TiCl4 یک عضو غیر معمول از متال هالید است که بسیار فرار است. به محض تماس با هوای مرطوب، آن را به شکل ابرهای مات از دی اکسید تیتانیوم و کلرید هیدروژن دیده می شود.در سال حدود 7 میلیون تن فلز تیتانیم تولید می شود که 4 میلیون تن آن از طریق تتراکلرید تیتانیم تولید می شود . با تر کیب تتراکلرید تیتانیم با فلز منیزیم، فلز تیتانیوم و کلرید منیزیم تولید می شود :
2(Mg)+TiCl4 2(MgCl2)+Ti
به جای منیزیم، سدیم مایع به عنوان عامل کاهنده نیز استفاده می شود.
در حدود 90 درصد از تولید سالیانه تتراکلرید تیتانیم صرف تولید رنگدانه های دی اکسید تیتانیوم می شود. واکنش حاصل از هیدرولیز کردن TiCl4 است که موجب تولید کلرید هیدروژن و دی اکسید تیتانیوم میشود:
TiCl4+2(H2O) TiO2+4(HCl)
در برخی موارد TiCl4 به طور مستقیم با اکسیژن اکسید میشود:
TiCl4+O2 TiO2+2(Cl2)
در ساخت کاتالیست پلی‌اولفین‌ها، روکش محصولات سرامیکی، آلیاژسازی آلومینیوم و ... استفاده می‌شود]23[.

3-2-2-تترا اتیل اورتو سیلیکات (TEOS)
تترااتیل اورتوسیلیکات به انگلیسی Tetraethyl orthosilicate با فرمول شیمیایی SiC8H20O4 یک ترکیب‌شیمیایی است. که جرم مولی آن 33/208 می‌باشد. شکل ظاهری این ترکیب، مایع بی‌رنگ است]24[.

3-3- روشها
3-3-1- تهیه نانوکاتالیست TiO2/SiO2
در ابتدا محلول آمونیاک را به صورت قطره قطره به تیتانیوم تتراکلرید اضافه میکنیم تا زمانی که 7PH= شود حجم مصرفی300 میلی لیتر شده است، رسوب سفید رنگی به دست می‌آید که این رسوب را صاف میکنیم و با آب دیونیزه شستشو میدهیم، سپس سوسپانسیونی به حجم500 میلی لیترکه تشکیل شده از رسوب و آب به علاوه اسید نیتریک با نسبت مولی5/0 را در دمای 70 درجه سانتی‌گراد وتحت هم زدن شدید به مدت 24 ساعت در درون دستگاه رفلاکس قرار میدهیم . بعد از گذراندن عملیات فوق یک سل نیمه شفاف حاصل میشود، که در مرحله بعد مقدار مناسبی از تترا اتیل اورتوسیلیکات را به سل حاصل اضافه میکنیم و آن را در دمای70 درجه سانتی‌گراد تحت بهم زدن شدید قرار میدهیم و این کار را در مدت زمان یک ساعت انجام میدهیم، محلول در ابتدا کم کم به حالت ژله‌ای مایل به جامد در می‌آید، سپس ماده نیمه جامد را به درون آون منتقل کرده و در دمای60 درجه سانتی‌گراد خشک میکنیم، در نهایت پودر به دست آمده که به صورت کریستالهای شیشه ای میباشد را در دماهای 400 , 500 , 600 , 800 , 1100 درجه سانتیگراد درون کوره کلسینه میکنیم. اندازه ذرات و فعالیت فوتوکاتالیستی نانوکاتالیستهای تولید شده با استفاده از FT-IR و XRD (طیف سنجی پراش اشعه ایکس) و SEM مورد بررسی قرار دادیم . با استفاده از معادله شرر نانوکامپوزیت ساخته شده در حدود 5/9 نانومتر تخمین زده شده است.
3-3-2- تهیه و طراحی فتورآکتور
در این مرحله, مطابق با شکل (3-1) دستگاهی طراحی کرده ایم که در این فتورآکتور اساس کار سادگی و ایجاد بازدهی بالا خواهد بود.
این دستگاه با طول 50 سانتی متر، عرض 35 سانتی متر، ارتفاع 35 سانتی متر و حاوی هیتر مگنت دار و دارای اتصال حاوی لامپ UV که می تواند دارای ولت های متفاوت بوده و این دستگاه توسط لامپ های تنگستن نیز قرار خواهد گرفت که می تواند ولتاژ های متفاوتی باشد و قابل آزمایش خواهد بود. دیواره های این ظرف از شیشه ای قرارگرفته است که بازتاب نور تابیده شده در ابعاد خواهد بود.

شکل(3-1) فتورآکتور مورد استفاده برای حذف علف کش بنتازون طی فرآیند UV- TiO2/SiO2
3-3-3- حذف سم با استفاده از فتورآکتور
در این مرحله سوسپانسیونی به حجم 100 میلی لیترکه حاوی 200 میلی‌گرم بر لیتر نانوکاتالیست TiO2/SiO2 و 20 میلی‌گرم سم علف کش بنتازون است را تهیه میکنیم. نمونه تهیه شده به داخل فتورآکتور منتقل می‌شود و به مدت نیم‌ساعت به وسیله هم زن مغناطیسی بهم زده می‌شود تا به تعادل برسد . سپس لامپ UV روشن می‌گردد تا نمونه تحت تابش نور UV قرار گیرد . در زمانهای مختلف از سوسپانسیون مورد آزمایش به وسیله فیلتر سرنگی نانویی نمونه برداری کرده و برای تعیین غلظت علف کش بنتازون باقیمانده جذب آن به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 335 نانومتر اندازه‌گیری می‌شود. سپس لامپ فتورآکتور را به لامپ تنگستن تغییر می‌دهیم و سوسپانسیون دیگری به روش بالا تهیه می‌کنیم و همانند روش قبل نمونه دوم را نیز مورد آنالیز قرار می‌دهیم . در این پروژه به منظور اندازه گیری غلظت علف کش بنتازون از طیف UV-Vis این ترکیب استفاده شده است.
فصل چهارم
نتایج
4-1- بحث و نتایج سنتز کاتالیزور TiO2/SiO2 در اندازه نانو
ناحیه پرتو x در طیف الکترومغناطیس در محدوده بین پرتو γ وپرتو فرابنفش قرار دارد. با استفاده از این ناحیه طیفی می‌توان اطلاعاتی در خصوص ساختار , جنس ماده و نیز تعیین مقادیر عناصر بدست آورد. از این رو روشهای پرتو x در شیمی, کاربرد زیادی دارند.
شکل (4-1) طیف XRD نانوکاتالیست سنتز شده را نشان می‌دهد که نشانگر تشکیل فاز آناتاز دی‌اکسید‌تیتانیوم بر روی سیلیس آمورف است.
پیکهای مشاهده شده در زاویه های پراش o21/25 , o05/38 , o05/48 مربوط به فاز آناتاز دی‌اکسید‌تیتانیوم و پیک پهن مشاهده در زاویه پراش o21 مربوط به سیلیس آمورف است. (مطابقت با پیوست 1)
داده‌های XRD در جدول (4-1) آورده شده‌اند.
جدول(4-1) داده‌های XRD نمونه سنتز شده
1,2,3(o)β d(Ao) 2θ1,2,3(o)
0.7872 3.53168 25.2174
0.9446 2.36479 38.0532
0.9600 1.89173 48.0572
اندازه بلورها با استفاده رابطه Scheerer معادله(4-1) حدود 9.5 نانومتر محاسبه شده است.
(1-4) D=KλβcosθD : اندازه نانوذرات = nm 5/9
K : ثابت = 9/0
λ : طول موج اشعه ایکس = AO54/1 = nm154/0
β : پهنای پیک با بیشترین شدت در نصف ارتفاع پیک
θ : زاویه پراش
محاسبات:
β=β02+βi2i=0.001745 oβ
β1=0.013740 --
β2=0.016488 --
β3=0.016756 --
نکته: β برحسب واحد درجه میباشد که برای جایگزاری در معادله شرر باید آن را به واحد رادیان تبدیل کرد.که یک واحد رادیان برابر با 57.29 درجه میباشد.
Cosθ=Cos2θ2D1=10.336128
D2=8.891858
D3=9.056002
با توجه به معادله Scheerer (4-1) خواهیم داشت:
D=D1+D2+D33 → D=9.428 nm
شکل(4-1) طیف XRD نمونه سنتز شده TiO2/SiO2
شکل (4-2) تصویر SEM کاتالیزور TiO2/SiO2 را نشان می‌دهد. همانطور که از شکل مشاهده شده است، ذرات زاویه‌دار بوده است و در اندازه های مختلف تشکیل شده‌اند, شکل(4-3) تصویر SEM یک ذره نسبتا بزرگ و شکل(4-4) تصویر SEM سطح همین ذره را نشان میدهد. همانطور که از این تصاویر مشخص است در سطح ذرات بزرگ, ذرات کوچکتری وجود دارند. آنالیز عنصری این ذرات با استفاده از SEM انجام شده است و نشانگر این است که تمامی ذرات مخلوطی از TiO2 و SiO2 هستند. به عبارت دیگر نانوکاتالیست TiO2/SiO2 در اندازه نانو به صورت خالص تشکیل شده است و فاز ناخالصی در آن دیده نشده است. در تمامی ذرات میانگین نسبت مولی TiO2/SiO2 تقریبا 80/20 و میانگین نسبت وزنیTiO2/SiO2 تقریبا 70/30 است.

شکل(4-2) تصویر SEM نمونه TiO2/SiO2

شکل(4-3) تصویر SEM یک ذره نسبتا بزرگ

شکل(4-4) تصویر SEM سطح ذره نسبتا بزرگ
4-2- طیف FT-IR نمونه سنتزی

شکل(4-5) طیف FT-IR نمونه سنتز شده TiO2/SiO2
پیک مربوط به C-O (کششی)در cm-1 5/1082 مشاهده گردید.
پیک مربوط به C-H(خمشی خارج از صفحه ای)در cm-1 4/585 مشاهده گردید.
پیک مربوط به Si-OC2H5 (کششی) دو نوار با شدت متوسط در cm-19/1620 , 7/1639 مشاهده گردیده است.
پیک مربوط به Ti-Cl(کششی) یک نوار نسبتا قوی در cm-12/2918 مشاهده گردیده است.
4-3- نتایج حاصل از بکارگیری لامپ UV در حذف علف کش بنتازون
شکل‌های (4-6),(4-7),(4-8),(4-9) تغییرات طیفی سم بنتازون را که به مدت 10 ساعت تحت فرآیند فتوکاتالیزی ناهمگن به همراه نانوکاتالیست TiO2/SiO2 با غلطت 1 گرم بر لیتر تحت اشعه لامپ UV قرار گرفته است, نشان می‌دهد.
پیکی که در طول موج حدود 370 نانومتر در هر چهار طیف ظاهر شده است مربوط به انتقالات الکترونی π→π* حلقه‌های آروماتیک در ساختار سم بنتازون می‌باشد و به دلیل رزونانس و مزدوج شدن با گروه کربنیل, شدت جذب افزایش پیدا کرده است.
طیف ظاهر شده در شکل (4-6) با مقدار جذب ماکزیمم) (2.00 ε مربوط به محلول مادر بنتازون با غلظت ppm 10 می‌باشد, که در این مرحله نانوکاتالیست اضافه نشده است و همچنین لامپ UV خاموش می‌باشد.
شکل(4-6) طیف UV-Vis محلول بنتازون با غلظت 1 گرم بر لیتر
پیک ظاهر شده در شکل (4-7) با مقدار جذب ماکزیمم) (1.75 ε مربوط به محلول بنتازون همراه نانوکاتالیست TiO2/SiO2 که به مدت 2 ساعت تابش دهی نور لامپ UV قرار گرفته است.

شکل(4-7) طیف UV-Vis محلول بنتازون پس از 2 ساعت فتوکاتالیز
با غلظت 1 گرم بر لیتر TiO2/SiO2
پیک ظاهر شده در شکل (4-8) با مقدار جذب ماکزیمم) (1.60 ε مربوط به محلول بنتازون همراه نانوکاتالیست TiO2/SiO2 که به مدت 5 ساعت تابش دهی نور لامپ UV قرار گرفته است.

شکل(4-8) طیف UV-Vis محلول بنتازون پس از 5 ساعت فتوکاتالیز
با غلظت 1 گرم بر لیتر TiO2/SiO2
پیک ظاهر شده در شکل (4-9) با مقدار جذب ماکزیمم) (1.10 ε مربوط به محلول بنتازون همراه نانوکاتالیست TiO2/SiO2 که به مدت 10 ساعت تابش دهی نور لامپ UV قرار گرفته است.

شکل(4-9) طیف UV-Vis محلول بنتازون پس از 10 ساعت فتوکاتالیز
با غلظت 1 گرم بر لیتر TiO2/SiO2
جدول(4-2) تغییرات صورت گرفته روی سم بنتازون
درصد مقدار کاهش جذب مقدار جذب ماکزیمم نمونه
0 2.00 محلول مادر
30 1.75 محلول پس از 2 ساعت فتوکاتالیز
60 1.60 محلول پس از 5 ساعت فتوکاتالیز
95 1.10 محلول پس از 10 ساعت فتوکاتالیز
با توجه به جدول (4-2) همانطور که مشخص است در ساعات مختلف طی تابش دهی نور لامپ UV و همراهی نانوکاتالیست TiO2/SiO2 غلظت سم بنتازون کاهش می‌یابد.
4-4- نتایج حاصل از بکارگیری لامپ تنگستن در حذف علف کش بنتازون
شکل‌های (4-10),(4-11),(4-12), تغییرات طیفی سم بنتازون را که به مدت 10 ساعت تحت فرآیند فتوکاتالیزی ناهمگن به همراه نانوکاتالیست TiO2/SiO2 با غلطت 1 گرم بر لیتر تحت اشعه لامپ تنگستن قرار گرفته است, نشان می‌دهد.
طیف ظاهر شده در شکل (4-10) با مقدار جذب ماکزیمم) (1.75 ε مربوط به محلول مادر بنتازون با غلظت ppm 10 می‌باشد, که در این مرحله نانوکاتالیست اضافه نشده است و همچنین لامپ تنگستن خاموش می‌باشد.

–277

فصل سوم
مواد و روش‌ها PAGEREF _Toc336514316 h 40
3-1- جمع آوری نمونه‌ها PAGEREF _Toc336514317 h 41
3-2- استخراج DNA زنبور عسل PAGEREF _Toc336514318 h 43
3-3- تعیین کیفیت DNA استخراج شده PAGEREF _Toc336514319 h 45
3-3-1- الکتروفورز DNA در ژل آگارز 1 درصد PAGEREF _Toc336514320 h 45
3-3-2- بررسی غلظت DNA استخراج شده PAGEREF _Toc336514321 h 46
3-3-3- رقیق سازی DNA استخراجی برای دستیابی به غلظت ng/µl25 PAGEREF _Toc336514322 h 47
3-4- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PAGEREF _Toc336514323 h 47
3-5- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز PAGEREF _Toc336514324 h 49
3-6- نمره دهی باندهای مشاهده شده روی آگارز نشانگر غالب ISSR PAGEREF _Toc336514325 h 50
3-7- ورود داده‌های حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل PAGEREF _Toc336514326 h 51
3-8- اندازه گیری فواصل و تشابه‌های ژنتیکی PAGEREF _Toc336514327 h 54
3-9- روش های گروهبندی داده ها PAGEREF _Toc336514328 h 55
3-10- تجزیه خوشه ای PAGEREF _Toc336514329 h 56
3-11- نیکویی برازش خوشه بندی یا ضریب کوفنتیک PAGEREF _Toc336514330 h 56
3-12- تجزیه به مولفه های اصلی PAGEREF _Toc336514331 h 57
3-13- آنالیز داده‌های مولکولی PAGEREF _Toc336514332 h 58
3-14- بررسی‌های مورفولوژیکی PAGEREF _Toc336514333 h 58
3-15- تجزیه به مؤلفه اصلی PAGEREF _Toc336514334 h 60
3-16- آنالیز داده‌های مورفولوژیکی PAGEREF _Toc336514335 h 61
فصل چهارم
نتایج PAGEREF _Toc336514337 h 62
بررسی تنوع مرفولوژیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه PAGEREF _Toc336514338 h 63
4-2- نتایج مربوط به هفت صفت ظاهری اندازه‌گیری شده روی زنبوران عسل پنج استان ایران PAGEREF _Toc336514339 h 63
4-3- همبستگی خصوصیات ظاهری زنبور عسل پنج استان ایران PAGEREF _Toc336514340 h 64
4-4- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران PAGEREF _Toc336514341 h 65
4-5- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مرفومتریک PAGEREF _Toc336514342 h 66
4-6- بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه PAGEREF _Toc336514343 h 67
4-7- تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه PAGEREF _Toc336514344 h 72
4-8- تعداد باندهای تولیدی در هر نژاد زنبور عسل PAGEREF _Toc336514345 h 72
4-9- تعداد باندهای تولید هر آغازگر و کارایی آنها در تکثیر PAGEREF _Toc336514346 h 73
4-10- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران PAGEREF _Toc336514347 h 74
4-11- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مولکولی PAGEREF _Toc336514348 h 74
4-12- بررسی شاخص نشانگری و قدرت تمایز آغازگرهای مورد مطالعه روی زنبور عسل PAGEREF _Toc336514349 h 76
4-13- تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی چندشکل در زنبورهای مورد مطالعه PAGEREF _Toc336514350 h 77
4-14- دندوگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفومتریک PAGEREF _Toc336514351 h 78
فصل پنجم
بحث و نتیجه‌گیری PAGEREF _Toc336514353 h 79
چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل PAGEREF _Toc336514354 h 81
بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه PAGEREF _Toc336514355 h 87
پیشنهادات: PAGEREF _Toc336514356 h 90
منابع PAGEREF _Toc336514357 h 91

فهرست جداول
TOC h z t "Jadavel,1" جدول 2-1: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR PAGEREF _Toc336519789 h 31جدول3-1: مکان‌ و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسل PAGEREF _Toc336519790 h 42جدول 3-2 مواد واکنش، ‌حجم و غلظت نهایی اجزای واکنش زنجیره پلیمراز PAGEREF _Toc336519791 h 48جدول3-3: صفات مرفولوژیک اندازه‌گیری شده PAGEREF _Toc336519792 h 59جدول 4-1: میانگین هفت صفت مرفولوژیک زنبوران کارگر مورد مطالعه PAGEREF _Toc336519793 h 63جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژیک زنبور عسل پنج استان ایران PAGEREF _Toc336519794 h 64جدول 4-3: همبستگی بین صفات ظاهری اندازه‌گیری شده در زنبور عسل PAGEREF _Toc336519795 h 65جدول 4-4: ضریب فاصله مرفولوژیکی و تشابه مرفولوژیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل PAGEREF _Toc336519796 h 65جدول 4-5: لیست آغازگرها، توالی آنها و چند شکلی مشاهده شده در نژادهای زنبور عسل PAGEREF _Toc336519797 h 68جدول 4-6: تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه PAGEREF _Toc336519798 h 72جدول 4-7: ضریب تشابه ژنتیکی و فاصله ژنتیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل بر اساس نشانگر ISSR PAGEREF _Toc336519799 h 74جدول 4-8: میزان برخی شاخص‌های آغازگرهای مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل PAGEREF _Toc336519800 h 76
فهرست اشکال
TOC h z t "Ashkal,1" شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا PAGEREF _Toc336519870 h 6شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی PAGEREF _Toc336519871 h 17شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل PAGEREF _Toc336519872 h 41شکل3-2: نمایی از مکان‌های جمع آوری نمونه‌های زنبور عسل PAGEREF _Toc336519873 h 42شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات PAGEREF _Toc336519874 h 43شکل 3-4: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده در این آزمایشات PAGEREF _Toc336519875 h 44شکل 3-5: بررسی کیفیت DNA استخراج شده ژنومی روی ژل آگارز 1 درصد PAGEREF _Toc336519876 h 46شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعیین غلظت DNA PAGEREF _Toc336519877 h 47شکل 3-7: برنامه واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PAGEREF _Toc336519878 h 49شکل 3-8: دستگاه‌های PCR مورد استفاده در این آزمایشات PAGEREF _Toc336519879 h 49شکل 3-9: تانک‌ الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در این آزمایشات PAGEREF _Toc336519880 h 50شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سیستم تصویربرداری از ژل آگارز PAGEREF _Toc336519881 h 50شکل 3-11: باندهای موجود و نمره‌دهی لوکوس‌های موجود حاصل از تصویربرداری ژل‌های آگارز نشانگر ISSR PAGEREF _Toc336519882 h 51شکل 3-12: ورود داده‌های حاصل از نمره‌دهی ژل‌های آگارز به نرم افزار اکسل جهت آنالیز PAGEREF _Toc336519883 h 51شکل 3-13: نمایی از بال جلویی زنبور عسل و صفات اندازه‌گیری شده PAGEREF _Toc336519884 h 60شکل 3-14: دستگاه استریومیکروسکوپ مجهز به دوربین مورد استفاده در آزمایشات PAGEREF _Toc336519885 h 60شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr PAGEREF _Toc336519886 h 66شکل 4-2: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با استفاده از روش تجزیه به مولفه‌های اصلی PAGEREF _Toc336519887 h 67شکل 4-3: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1 با استفاده از مارکر bp 50 PAGEREF _Toc336519888 h 69شکل 4-4: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با استفاده از مارکر bp 50 PAGEREF _Toc336519889 h 70شکل 4-5: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با استفاده از مارکر bp 50 PAGEREF _Toc336519890 h 70شکل 4-6: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با استفاده از مارکر bp 50 PAGEREF _Toc336519891 h 71شکل 4-7: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با استفاده از مارکر bp 50 PAGEREF _Toc336519892 h 71شکل 4-8: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل PAGEREF _Toc336519893 h 73شکل 4-9: تعداد باندهای تولیدی آغازگرهای مورد استفاده PAGEREF _Toc336519894 h 73شکل 4-10: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابه Jaccard PAGEREF _Toc336519895 h 75شکل 4-11: پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی به‌روش ماتریس تشابه Jaccard PAGEREF _Toc336519896 h 75شکل 4-12: تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی چندشکل PAGEREF _Toc336519897 h 77شکل 4-13: دندروگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی PAGEREF _Toc336519898 h 78
فهرست معادلات
TOC h z t "Moadele,1" معادله 3-1: محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگر PAGEREF _Toc336520013 h 52معادله 3-2: میزان چندشکلی نشانگر PAGEREF _Toc336520014 h 52معادله 3-3: ارزشمندی باندها PAGEREF _Toc336520015 h 53معادله 3-4: قدرت حل هر آغازگر PAGEREF _Toc336520016 h 53معادله 3-5: میانگین قدرت حل هر آغازگر PAGEREF _Toc336520017 h 53معادله 3-6: نسبت چندگانه موثر PAGEREF _Toc336520018 h 53معادله 3-7: شاخص نشانگری PAGEREF _Toc336520019 h 54معادله 3-8: ضریب تشابه جاکارد PAGEREF _Toc336520020 h 55
چکیدهنشانگر مولکولی ISSR به منظور جداسازی نژادهای زنبور عسل Apis mellifera پنچ استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان و فارس مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA از زنبورهای کارگر با استفاده از روش بهینه نمکی صورت گرفت و پس از سنجش کمی و کیفی DNA استخراج شده و رقیق سازی آن، مقادیر حاصل از باندهای بدست آمده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد نمره‌دهی و آنالیز صورت گرفت. نتایج نشان داد که باندهای آغازگرهای مورد مطالعه شده در محدوده‌‌ی 150 جفت باز تا 1000 جفت باز قرار دارند و بیشترین تعداد باند مشاهده شده مربوط به آغازگر 1 و کمترین آنها مربوط به آغازگر 3 و 4 بوده است. آنالیز خوشه‌ای نژاد‌های مورد مطالعه آنها را در دو گروه اصلی قرار داد. در گروه اول فارس و در گروه دیگر که به دو زیر گروه تقسیم شده یکی شامل اصفهان و دیگری شامل مرکزی، خوزستان و کردستان، دو استان کردستان و خوزستان دارای بیشترین شباهت بودند. به نظر می‌رسد نشانگر ISSR بتواند به خوبی نژاد‌های زنبور عسل با منشاء مختلف را از هم جدا سازد.

واژه‌های کلیدی: نشانگر مولکولی، زنبور عسل، بهینه نمکی، تنوع ژنتیکی
فصل اولمقدمهمقدمه
براساس آمار سازمان خواربار جهانی بیش از هفتاد میلیون کلنی زنبور عسل در جهان وجود دارد که محصولات تولیدی آنها در راستای تامین نیازهای غذایی، دارویی و بهداشتی مورد استفاده قرار می‌گیرد. بعلاوه زنبور عسل با گرده افشانی گیاهان زراعی و باغی نقش بسیار مهمی در افزایش محصولات کشاورزی و پایداری محیط زیست ایفا می‌کند. در بین حشرات گرده افشان زنبور عسل بدلیل حمایت بشر، جمعیت بیشتر کلنی و جابجایی کلنی‌ها برای تولید محصول بیشتر و دامنه فعالیت وسیع‌تر، خصوصیات بیولوژیکی، رفتاری و مرفولوزیک خاص بهترین نقش را ایفا می‌کند و از اهمیت بالاتری برخوردار است. منطقه‌ی انتشار طبیعی زنبور عسل در جهان محدوده‌ی وسیعی است که از شمال به جنوب کشور های اسکاندیناوی، از غرب به داکار، از جنوب به دماغه امیدنیک و از شرق به کوه‌های اورال، مشهد و عمان محدود می‌شود، البته این حشره توسط انسان به سایر نقاط جهان نیز منتقل شده است (طهماسبی و همکاران، 1378). از زمان آشنایی بشر با زنبور عسل تولیدات آن بویژه عسل همواره به عنوان یک ماده‌ی غذایی ایده‌آل مورد توجه بوده است. عسل در فرهنگ عامه به عنوان یکی از شفابخش‌ترین فراورده‌های غذایی مطرح است. بررسی‌ها نشان می‌دهد که محصولات کندو و از جمله عسل علاوه بر مغذی بودن‌، دارای اثرات درمانی نیز می‌باشد (توپچی و علمی، 1388). برای تولید بیشتر عسل نیاز به جمعیت‌های قوی می‌باشد و تولید جمعیت‌های قوی نیز در سایه‌ی مدیریت صحیح بر پایه‌ی دانش علمی ممکن می‌باشد. یکی از مسائلی که ممکن است باعث اثرات نامطلوب و در نتیجه تضعیف کلنی‌ها گردد، پدیده‌ی تلاقی‌های خویشاوندی می‌باشد که منجرب به افزایش هم‌خونی یا هموزیگوتی آلل‌های جنسی می‌گردد (Mayer, 1996).
تعیین وضعیت ژنتیکی موجودات زنده زیربنای اصلاح نژاد آنها در هر منطقه است برای تعیین این وضعیت و تفکیک توده‌های مختلف زنبور عسل در یک منطقه از روشهای مرفولوژیکی، تنوع پروتئین‌ها و DNA نگاری استفاده می‌شود (طهماسبی و همکاران، 1376). برخی از تفاوت‌های موجود در ردیف DNAبین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‌هایی با اندازه‌های مختلف تجلی کنند که بروش‌های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و رویت و مطالعه می‌گردند. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای مولکولی در سطح پروتئین می‌نامند‌ که از آن جمله می‌توان به سیستم آیزوزایم/ آللوزیم اشاره کرد. اما دسته‌ی دیگر از تفاوت‌های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل می‌کنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه پروتئین‌ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‌ها را می‌توان با روش‌های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد. این نشانگرها که تقریباً تعدادشان نامحدود است فقط از راه تجزیه وتحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند و بنابراین به آنها نشانگرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‌شود. طی سالیان اخیر شناسایی و بررسی تنوع ژنتیک در بین گونه‌های حشرات بر اساس نشانگر‌های مولکولی و روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR بسیار متداول گشته است. ولی در کشور ما بررسی تنوع مولکولی در زمینه حشره شناسی بسیار کم انجام گرفته است. امروزه میکروساتلیت‌ها نقش مهمی در تعیین تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی جانوران و گیاهان و مخصوصاً حشرات ایفا می‌کنند. استفاده از نشانگر ISSR بیشتر جهت تنوع ژنتیکی گیاهان استفاده شده و در جهان حشرات هم اکنون استفاده از این نشانگر جهت بررسی تنوع ژنتیکی راسته بالپولکداران به ویژه دو خانواده Noctuidae و Bombycidae ، راسته دوبالان و بال غشائیان در کانون توجه مجامع علمی قرار گرفته است(Luque, et al., 2002; Hundsdoerfer, et al., 2005; Radjab, et al., 2012).اهداف کلی در این تحقیق عبارتند از :
بهینه سازی کاربرد نشانگر ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی زنبور عسل.
ارزیابی میزان خویشاوندی نژادهای زنبور عسل ایران نسبت به یکدیگر.
بررسی کارایی نشانگر ISSR در جداسازی و دسته بندی روابط خویشاوندی زنبور عسل ایران.
بررسی تفاوت و تشابه نتایج بدست آمده از مطالعه نشانگر ISSR و نتایج بدست آمده از خصوصیات مورفولوژیک زنبور عسل.
فصل دومبررسی و مرور منابع2-1- تاریخچه زنبور عسل و پرورش آن در جهان و ایران
قدیمی‌ترین زنبور عسل حفظ شده در کهربا در منطقه‌ای از میانمار برمه کشف شده است که عمر این فسیل به 100 میلیون سال پیش در دوره‌ی ‌کرتاسه باز می‌گردد که دوره‌ی زندگی دایناسورها بوده است، بنابراین قدمت زنبورها از قاره‌ی استرالیا نیز بیشتر است، البته این زنبورهای کشف شده دارای زندگی اجتماعی نبوده‌اند. نگهداری عسل توسط زنبورهای اجتماعی در دوره‌‌‌ی میوسن در حدود 20-10 میلیون سال قبل گسترش یافته است (Campbell and Campbell, 2007)و کهن‌ترین نمونه زنبور عسل در موزه‌‌ی تاریخ طبیعی نیویورک مربوط به 20 میلیون سال پیش است (سعادتمند، 1389).
نقاشی‌هایی بروی غاری در والنسیای اسپانیا کشف شده که در آنها برای رسیدن به لانه از نردبان و ظروفی برای نگه داشتن عسل به تصویر کشیده شده‌اند (شکل2-1).

شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیااولین تصویر از پرورش زنبور عسل مربوط به 2400 سال قبل از میلاد بدست آمده است که در آن تصویر زنبورها دارای 4 پا و 2 بال هستند و اینک در موزه‌‌ی لوور پاریس نگهداری می‌شود. مصریان باستان عسل را در مراسم مذهبی، تغذیه حیوانات مقدس و در بسیاری از تشریفات دیگر و حتی حفظ اجساد، مورد استفاده قرار می‌دادند(Crane, 2004) . دست نوشته‌هایی از مصریان باستان مربوط به 3000 سال قبل وجود دارد که فعالیت‌های پرورش زنبور عسل در آن به ثبت رسیده است (Campbell and Campbell, 2007).
در کتاب‌های فارسی و هندی از جمله کتاب ابن‌سینا و کتاب مقدس هندو به نام ودا که 3-2 هزار سال قبل از میلاد مسیح به زبان سانسکریت نوشته شده است، از زنبور عسل با احترام یاد می‌شود. شینو به اعتقاد پیروان مکتب هندو، به عنوان حامی و محافظ پرقدرت خدای دو، از خدایان سه گانه هندوئیسم بوده که به شکل زنبور عسل آبی رنگ در یک گل نیلوفر آبی مجسم می‌شود. خدای عسل بومیان هند شرقی به نام کاما است، که کمانی در دست دارد و زه این کمان متشکل از زنبورهای بسیار و درهم تنیده است (سعادتمند، 1389). در نسخه‌های خطی اروپائیان عسل به عنوان غذا، دارو، نوشیدنی و اهداف مختلف نگهداری مواد و همچنین در مراسم‌های مذهبی توصیف شده است. در بسیاری از فرهنگ‌‌ها عسل خوردنی نیست، اما یک نوشیدنی الکلی با استفاده از تخمیر قند عسل می‌سازند و مصرف می‌‌کنند.
تا حدود سال 1500میلادی زنبورها طی فرایند جمع آوری عسل در مکان زندگی خود کشته می‌شدند، پس از آن زمان اروپائیان تکنیک‌‌های زنبورداری را گسترش دادند.
زنبورداری در ایران سابقه‌ای دیرینه داشته و یکی از حرفه‌های اصیل و قدیمی ایرانی‌ها است، دشنه مفرغی منقش به شکل زنبور عسل متعلق به ‌800 سال قبل از میلاد که در لرستان بدست آمده است وهم اکنون در موزه‌ی شهر بروکسل نگهداری می‌شود، معرف قدمت آشنایی ایرانی‌ها با این حشره‌ی مفید است. با جستجوی کلمه عسل و احتمالاً زنبور عسل در اشعار به خصوص شعرهای قدیمی می‌توانیم از قدمت و آشنایی ایرانی‌ها با زنبور عسل پی‌برد (آقایی نراقی، 1388).
ابن مقیصه از پیامبر اکرم(ص) نقل می‌کند که عسل درمان هر بیماری است و قران درمان تمام بیماری‌های ذهن است، بنابراین من به شما توصیه هر دو درمان عسل و قران را دارم (Campbell and Campbell, 2007).
2-2- ارزش اقتصادی زنبور عسلآلبرت چی کاکس می‌نویسد: که هیچ جاندار دیگری به اندازه‌ی زنبور عسل به طرق مختلف به انسان خدمت نمی‌کند. زنبور عسل نقش بسیار مهمی در گرده افشانی بیش از 90 گیاه (Al-Otaibi, 2008) در نتیجه بقا، گونه و همچنین افزایش کمی و کیفی محصولات آنها دارد، علاوه بر این زنبور عسل خود دارای تولیدات متنوعی مانند عسل، موم، بره موم، ژله، رویال و زهره نیز می‌باشد. تولید عسل مهمترین صفت اقتصادی زنبور عسل می‌باشد (مستاجران، 1379). امروزه نقش عظیم زنبور عسل در گرده افشانی گیاهان زراعی و باغی و احیای مراتع و بهبود محیط زیست به حدی شناخته شده و آشکار می‌باشد که تولیدات آن یعنی عسل و غیره را تحت شعاع قرار می‌‌دهد. اساساً نباتات از نظر گرده افشانی وابسته به حشرات هستند که در رأس آنها زنبور عسل قرار دارد، به عبارت دیگر گرده افشانی 47 درصد از محصولات کشاورزی وابسته به زنبور عسل است، به همین دلیل ارزش اقتصادی زنبور عسل در دنیا 100-25 برابر ارزش عسل تولید شده در سال محاسبه می‌شود. به گفته‌ی Mc. Gregor پژوهشگر امریکایی در سال 1973، زارعین امریکا بیش از 40 میلیارد دلار سود از افزایش محصولات زراعی در رابطه با گرده افشانی نباتات دگرگشن داشته‌اند که نقش مهمی از این آزمایش به عهده‌ی زنبور عسل است. زنبور عسل جز گرده افشان‌های اصلی گیاهان روغنی خصوصاً آفتابگردان می‌باشد، نتیجه‌ی یک طر ح تحقیقاتی در همین رابطه در کشور امریکا که استقرار 2 کندو به ازای هر هکتار آفتابگردان سبب افزایش چشمگیر محصول شده، به طوری که محصول بدست آمده در مزرعه تحت آزمایش 50-20 درصد بیشتر از مزارع شاهد بوده است (میراب‌زاده، 1372).در ایران نزدیک به 6/4 میلیون کندوی مدرن با تولید متوسط 38/9 کیلوگرم عسل به ازای هر کندو در سال وجود دارد به این ارقام می‌بایست 380 هزار کندوی بومی با تولید 04/4 کیلوگرم عسل برای هر کندو در سال افزود. بنابراین تولید عسل سالیانه کشور را در حدود 45 هزار تن محاسبه نموده و ارزش ریالی آن را حدود 800 میلیارد می‌دانند. حال چنانچه ارزش گرده افشانی را به آن بیافزائیم ارزش اقتصادی واقعی زنبور عسل بالغ بر 20 تریلیون ریال خواهد بود (آمارنامه وزارت جهاد کشاورزی، 1389).
2-3- جایگاه سیستماتیک زنبور عسلزنبور عسل به رده‌ی حشرات، راسته‌ی بال غشائیان و خانواده‌ی Apidae، جنس Apis و گونه A. mellifera تعلق دارد. راسته‌ی بال غشائیان که زنبور عسل به این راسته تعلق دارد، بزرگترین راسته پس از راسته سخت بال پوشان است. این راسته دارای مفیدترین حشرات برای انسان‌ است، دارای گونه‌هایی است که از نظر انگلی، شکارچی و گرده افشانی نقش مهمی دارد.Kingdom: Animalia
Phylum: Arthropoda
Sub Class: Insecta
Order: Hymenoptera
Super family: Apoidea
Family: Apidae
Genus: Apis
Species: Apis mellifera L.
چها گونه اصلی زنبور عسل براساس جثه عبارتند از A. dorsata، A. mellifera، A. cerena، A.florea که کشور ایران میزبان دوگونه A. mellifera، A.florea می‌باشد. گونه‌ی A. mellifera تنها گونه‌ای می‌باشد که بیشترین قدرت سازگاری را برخوردار می‌باشد. زیر گونه‌ها با نژادهای این گونه 24 عدد می‌باشند، نژاد زنبور عسل ایرانی با نام A. mellifera medaمی‌باشد. تنها 4 نژاد از این نژادها متعلق به نژادهای اقتصادی می‌باشندکه در اغلب برنامه‌های اصلاح نژادی جهان از این نژادهای برتر استفاده می‌گردد (بصیری، 1386) که عبارتند از: زنبور عسل معمولی سیاهA. mellifera mellifera ، زنبور عسل معمولی ایتالیایی A. mellifera ligustica، زنبور عسل معمولی قفقازی A. mellifera caucasina، زنبور عسل معمولی اروپایی A. mellifera carnica. این نژادها و هیبریدها در طول این سال‌ها با نژاد بومی ایران آمیخته شده و می‌توان گفت تقریباً در تمام مناطق زنبورداری ایران جایگزین شده‌‌اند (عبادی، 1366).
2-4- اصلاح نژاد در زنبور عسلمعمولاً هدف اصلی اجرای برنامه‌‌های اصلاح نژاد زنبور عسل، افزایش تولید محصولاتی مانند عسل، گرده، رویال و غیره است در ضمن آرام بودن و تمایل به بچه دادن، از ویژگی‌های یک کلنی زنبور عسل است. مقدار عسل به جمعیت و فعالیت کلنی بستگی دارد، جمعیت کلنی نیز به ظرفیت تخم گذاری ملکه، قابلیت زنده ماندن نوزادان و طول عمر زنبورهای کارگر وابسته است، برای نیل به چنین هدفی باید با آگاهی از نحوه‌ی توارث صفات، وراثت پذیری و همبستگی ژنوتیپی و فنوتیپی بین آنها برای انتخاب و آمیزش برنامه‌ریزی شود (بصیری، 1386). اصلاح نژاد زنبور عسل بدلیل ویژگی‌های خاص این موجود، دارای پیچیدگی‌‌های خاصی در مقایسه با سایر حیوانات است (Woyke, 1986).
یکی از این ویژگی‌ها مکانیسم ژنتیکی تعیین جنسیت در زنبور عسل می‌باشد که محدودیت‌های شدیدی را در سیستم‌های اصلاح نژادی ایجاد می‌کند (Woyke, 1988; Page et al., 1982). تعیین جنسیت در اکثر موجودات زنده بویژه پستانداران به وسیله کروموزوم‌های جنسی صورت می‌پذیرد، به طوریکه از اجتماع دو کروموزوم جنسی X جنس ماده (XX) و از دو کروموزوم جنسی X و Y جنس نر (XY) بوجود می‌آید. ولی در زنبور عسل برخلاف اکثر موجودات زنده، تعیین جنسیت به وسیله آلل‌های جنسی چندگانه در زنبور عسل انجام می‌پذیرد (Woyke, 1986; Ruttner, 1988). تعداد این ژن‌ها یا آلل‌های جنسی در جوامع مختلف متفاوت است و در بررسی‌های متعدد آنها بین 20-6 آلل براورد شده است (Woyke, 1986) (سپهری و همکاران، 1386). ولی باید توجه داشت که زنبوران کارگر و ملکه فقط حامل یک جفت و زنبوران نر هاپلوئید تنها حامل یک نوع از آلل‌های جنسی چندگانه هستند (میرزایی و همکاران، 1384).بنابراین تعیین جنسیت در زنبور عسل به وسیله‌ی آلل‌های جنسی به یکی از سه حالت زیر اتفاق می‌افتد: الف) اگر در تخم‌های لقاح یافته دو آلل جنسی مختلف aو b در یک مکان ژنی به صورت هتروزیگوت قرار گیرند. از این تخم‌ها زنبوران ماده (ملکه یا کارگر) تکامل می‌یابند، که از نظر ژنتیکی دیپلوئید بوده و تخم آنها توسط ملکه کلنی در سلول‌های کارگر گذاشته می‌شوند(Woyke, 1976, 1986) .
ب) اگر در تخم‌های لقاح نیافته تنها یک نوع آلل جنسی مثل a در یک مکان ژنی به صورت همیزیگوت باشد، از این تخم‌ها براثر پدیده بکرزایی، زنبوران نر هاپلوئید بوجود می‌آیند. چنین تخم هایی توسط ملکه کلنی در سلول‌های نر تخم‌‌ریزی می‌شوند(Woyke, 1976, 1986) .ج) در مورد آمیزش‌های خویشاوندی، اگر در تخم‌های لقاح یافته دو آلل جنسی مشابه مثل aو a در یک مکان ژنی به صورت هموزیگوت قرار گیرند، از این تخم‌ها نرهای دیپلوئید بوجود می‌آیند. ملکه تخم نرهای دیپلوئید را در سلول‌های کارگر تخمگذاری می‌کند. البته نرهای دیپلوئید به طور طبیعی قادر به ادامه حیاط نیستند چرا که لارو نرهای دیپلوئید فاقد فرمون ترشح شده توسط نوزادان طبیعی هستند به همین دلیل حدود 6 ساعت بعد از تفریخ از تخم، توسط زنبوران کارگر از بین می‌روند(Woyke, 1976, 1986) .
تولید جمعیت قوی زنبور عسل برای تولید بیشتر در سایه‌ی مدیریت صحیح بر پایه‌ی دانش علمی ممکن می‌باشد (اسعدی دیزجی و همکاران، 1387). یکی از مسائلی که ممکن است باعث اثرات نامطلوب و در نتیجه تضعیف کلنی‌ها گردد، پدیده‌ی تلاقی‌های خویشاوندی می‌باشد که منجرب به افزایش هم‌خونی یا هموزیگوتی آلل‌های جنسی می‌گردد (Mayer, 1996). این مسئله به طور کلی باعث کاهش قدرت زنده‌مانی نوزادان، حساسیت به بیماری‌ها، کاهش بازده و عملکرد، بروز صفات و رفتارهای نامطلوب و عوارض متعدد دیگری می‌گردد (Ruttner, 1988; Mirsha and Kumar, 1992) (میرزایی و همکاران، 1384).
برای برنامه ریزی اصولی اصلاح نژادی، اولین قدم مشخص کردن وضعیت ژنتیکی زنبور عسل در کشور است. این کار به روش‌‌های مختلفی در دنیا صورت می‌گیرد، که در بین آنها می‌توان به استفاده از خصوصیات ظاهری، تنوع پروتئین‌ها و خصوصیات DNA اشاره نمود (طهماسبی و همکاران 1378). بررسی‌ها نشان می‌دهد که تاکنون در ایران، فعالیت چندانی در مورد اصلاح نژاد زنبور عسل صورت نگرفته است، اما به سبب وارد کردن ملکه‌های خارجی بدون کنترل صحیح در دهه‌های گذشته اجرای برنامه‌های اصلاح نژادی برای زنبور عسل امری ضروری است (بصیری، 1386).
2-5- ژنوم زنبور عسلپروژه تعیین توالی ژنوم زنبور عسل با حمایت مالی اولیه موسسه ملی بهداشت و درمان ژنوم انسانی با کمک وزارت کشاورزی ایالات متحده، در دسامبر 2002 آغاز شد. نتایج حاصل از این تلاش به رهبری کالج بیلور مرکز پزشکی تعیین توالی ژنوم بشر و با مشارکت بیش از 100 آزمایشگاه تحقیقاتی از 16 کشور، در بیش از 50 پروژه - ریسرچدر بسیاری از مجلات برجسته علمی منتشر شد. براین اساس ژنوم زنبور عسل در مجموع دارای حدود 250 میلیون پایگاه‌های DNA است. براساس برنامه‌های کامپیوتری ژن تاکنون بیش از 10هزار مکان ژنی تشخیص داده شده است، که این کمتر از 13 هزار ژن‌های شناسایی شده از ژنوم مگس میوه که یکی از فشرده‌ترین ژنوم مورد مطالعه در زیست شناسی بوده است. انتظار می‌رود که تعداد ژن‌های شناسایی شده در ژنوم زنبور عسل در آینده افزایش یابد. ژنوم زنبور عسل شامل میزان بیشتری از نوکلئوتید آدنین و تیمین نسبت به ژنوم مگس میوه است. این وضعیت دقیقاً در مقابل ژنوم انسان، که ژنوم آن حاوی نسبت‌های بیشتری از نوکلئوتید گوانین و سیتوزین است قرار می‌گیرد.
2-6- تعریف نشانگراستفاده از نشانگرهای ژنتیکی قدمتی برابر با تاریخ بشر دارد. انسان‌های نخستین، حتی آنهایی که هنوز کشاورزی را فرا نگرفته بودند و برای ادامه زندگی مجبور به جمع آوری بذر و میوه گیاهان بودند، بدون اینکه خود بدانند از نشانگرهای مرفولوژیک برای شناختن و تمایز انواع بذر و میوه وجانوران وحشی استفاده می‌کردند و برخی را به دیگری ترجیح می‌دادند اما به صورت مدون و دانش‌مدار، شاید مندل نخستین کسی بود که از نشانگرهای مرفولوژیک یا نشانگرهای مبتنی بر فنوتیپ برای مطالعات چگونگی توارث صفات در نخود فرنگی استفاده کرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود بین ردیف‌های DNA کروموزوم‌های آنها است که به نتایج نیز منتقل می‌شود، حتی صفاتی که تحت تاثیر شرایط محیط نیز به صورت متفاوت بروز می‌کنند (تفاوت در بین افراد در شرایط محیطی یکسان)، بازتاب‌ تفاوت‌های موجود در ردیف‌های DNA هستند. این تفاوت‌ها می‌توانند به عنوان نشانه یا نشانگر ژنتیکی به کار گرفته شوند (نقوی و همکاران، 1388).2-6-1- نشانگرهای مرفولوژیکاین تفاوت‌ها ممکن است به طرق مختلفی تظاهر یابند، برخی از این تفاوت‌ها در صفات قابل رویتی مانند رنگ گل، وجود یا عدم وجود ریشک در گلچه غلات، صاف یا چروک بودن سطح دانه‌ی نخود فرنگی در آزمایش‌های مندل تجلی می‌کنند. این گونه‌‌ نشانه‌ها را نشانگرهای مرفولوژیک می‌نامند (نقوی و همکاران، 1388).
2-6-1-1- نشانگرهای مرفولوژیک و زنبور عسلبررسی‌های روتنر و همکاران روی نژادهای زنبور عسل جهان، با استفاده از خصوصیات ظاهری متعدد و با استفاده از روش آماری تجزیه به مولفه‌ی اصلی، نژادهای مختلف را به خوبی از یکدیگر متمایز کرد. در مطالعات وی نژادهای اروپایی (مانند کارنیولان و قفقازی) با جثه‌های بزرگتر در سمت راست محور ترسیم شده و نژادهای آفریقایی (مانند یمنی و مصری) در سمت چپ محور قرار می‌گیرد. در این بررسی نژاد ایرانی در وسط این محور قرار گرفته است (Ruttner et al., 1978).
مطالعات عبدالطیف و همکاران روی توده زنبور عسل عراق، با استفاده از دوازده صفت ظاهری، نشان داد که زنبور عسل موجود در عراق جمعیتی از نژاد زنبور عسل سوری است (Abdellatif et al., 1977).
داتون و همکاران در بررسی‌های خود روی توده‌های زنبور عسل عمان نتیجه گرفتند که اولاً دو جمعیت کاملاً مجزا در شمال و جنوب این کشور وجود دارد و ثانیاً توده موجود در عمان به نژادهای آفریقایی از جمله نژاد یمنی شباهت زیادی داشته و با نژادهای آسیایی فاصله بیشتری دارد (Dutton et al., 1981).
عطاا... و همکاران در مقایسه نژاد مصری با کارنیولان و ایتالیایی نتیجه گرفتند که کارگران نژاد مصری در یازده صفت و نرها در 3 صفت با دو نژاد اروپایی تفاوت معنی داری دارند ولی ملکه ‌های سه نژاد فاقد تفاوت معنی‌دار هستند (Atallah et al., 1988).
میکسنر و همکاران در بررسی‌های مرفولوژیک خود روی توده‌های زنبور عسل موجود در کنیا به این نتیجه رسیدند که در ارتفاعات بالای 2000 متر، نژاد مونتی‌کولا و در ارتفاعات زیر 2000 متر نژاد اسکوتلاتا و در منطقه حد واسط مخلوطی از دو نژاد زندگی می‌کنند (Meixner et al., 1994).
در بررسی‌های دالی و همکاران مشخص شد که ارتفاع محل زیست روی صفات مربوط به اندازه بدن مثل طول بال، اندازه زوایای بال، طول رگبال‌ها و اندازه غدد موم‌ساز تأثیر می‌گذارد (Daly et al., 1991). بطوریکه در ارتفاعات پایین‌تر و هوای خشک و گرم اندازه صفات مذکور کاهش می‌یابد. همچنین در بررسی‌های میکسنر و روتنر مشخص شد که شرایط اقلیمی و ارتفاع روی صفات ظاهری تأثیر می‌گذارد و با افزایش ارتفاع محل زیست زنبورها، طول بدن و طول موهای روی بدن آنها افزایش می‌یابد (Mixner, 1992; Ruttner et al., 1978).
در بررسی‌های طهماسبی و همکاران مشخص شد که زمان و فصل روی صفات طول و عرض بال جلو، ایندکس کوبیتال، زاویه A4، طول خرطوم، طول پای عقب، طول نیم حلقه سوم و چهارم شکمی، رنگ سپرچه، رنگ نیم حلقه سوم و چهارم شکمی تأثیر می‌گذارد ولی روی زوایای D7 و G18 تأثیر نداشته است. در ایران واردات ملکه‌های خارجی از سال 1340 باعث آمیخته شدن توده بومی با نژادهای خارجی شده است. از سوی دیگر به علت قطع واردات در دهه‌های اخیر، انتظار می‌رود تثبیت ژنتیکی نسبی در توده موجود صورت گرفته باشد. طهماسبی و همکاران دریافتند که به دلیل پایداری نژاد ایرانی، این نژاد هویت خود را از دست نداده و حتی در سال‌های اخیر ویژگی‌های نژاد ایرانی بیشتر تثبیت گردیده است.
علاوه بر شرایط محیطی، عوامل دیگری که می‌تواند باعث این تفاوت‌ها شود اختلافات اقلیمی حاصل از تغییرات فصل است. تفاوت‌های نوع دوم می‌تواند باعث خطا در برآوردهای مربوط به تفاوت‌های حاصل از شرایط محیطی شود. تحقیقات انجام شده در کشورهای دیگر نشان دهنده این است که شرایط فصلی روی صفات مورفولوژیک بال جلویی زنبور عسل تأثیر می‌گذارد که میزان تحت تاثیر قرار گرفتن صفات و تنوع ایجاد شده در صفات مختلف بال جلویی بین 29-3 درصد بوده است (Nazzi, 1992). مطالعه انجام شده دیگر نیز نشان می‌دهد که آلودگی به کنه واروا در فصول مختلف روی بال جلویی زنبور عسل تاثیر می‌گذارد. به طوری که در آلودگی‌های مربوط به 5-4 کنه در هر سلول یا بیشتر همبستگی منفی بین تعداد کنه و اندازه مربوط به بال جلو وجود دارد که دلیل آن می‌تواند کاهش پروتئین ذخیره و تاثیر آن روی اسکلت خارجی باشد (Daly et al., 1988).
2-6-2- نشانگرهای مولکولیبرخی از تفاوت‌های موجود در ردیف DNAبین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‌هایی با اندازه‌های مختلف تجلی کنند که بروش‌های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و رویت و مطالعه می‌گردند. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای مولکولی در سطح پروتئین می‌نامند‌ که از آن جمله می‌توان به سیستم آیزوزایم/ آللوزیم اشاره کرد. اما دسته‌ی دیگر از تفاوت‌های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل می‌کنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه پروتئین‌ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‌ها را می‌توان با روش‌های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد. این نشانگرها که تقریباً تعدادشان نامحدود است فقط از راه تجزیه وتحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند و بنابراین به آنها نشانگرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‌شود (نقوی و همکاران، 1388).
پس به صور کلی برای اینکه صفتی به عنوان نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد باید حداقل دو ویژگی زیر را داشته باشد: الف) در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی نشان دهد). ب) به توارث برسد.

شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی2-7- نشانگرهای مولکولی و حشراتحشرات بزرگترین ترکیب گونه‌‌ها در کل سلسله جانوران را تشکیل می‌دهند و دارای تنوع ژنتیکی گسترده‌ای هستند که می‌توان با استفاده از تکنیک‌های مارکر مولکولی کشف و استخر ژن به کاوش در آنها پرداخت (Behura, 2006). روند کنونی استفاده از تکنیک‌های مارکر DNA در حوزه‌های گوناگون از مطالعات زیست محیطی حشرات نشان می‌دهد که نشانگرهای DNA میتوکندری، میکروستلایت، DNA چند شکل تکثیر شده تصادفی، ابراز برچسب دنباله و طول قطعات حاصل از تکثیر به میزان قابل توجهی برای پیشرفت در جهت درک اساس ژنتیکی تنوع حشرات، جایگاه صفت کمی در حشرات و نقشه برداری ژن‌ها در پزشکی و کشاورزی دخالت داشته‌اند (Behura, 2006). جدای از این سیستم نشانگرهای پرمصرف، روش جدید دیگر از جمله توالی خاص پلی مورفیسم تکثیر و نشانگرهای مرتبط با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به عنوان سیستم نشانگرهای جایگزین در مطالعات شناسایی حشرات شناخته شده‌اند.
طی سالیان اخیر شناسایی و بررسی تنوع ژنتیک در بین گونه‌های حشرات بر اساس نشانگر‌های مولکولی و روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بسیار متداول گشته است. ولی در کشور ما بررسی تنوع مولکولی در زمینه حشره شناسی بسیار کم انجام گرفته است. امروزه میکروساتلیت‌ها نقش مهمی در تعیین تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی جانوران و گیاهان و مخصوصاً حشرات ایفا می‌کنند. استفاده از نشانگر‌ها بیشتر جهت تنوع ژنتیکی گیاهان استفاده شده و در جهان حشرات هم اکنون استفاده از این نشانگر جهت بررسی تنوع ژنتیکی راسته بالپولکداران به ویژه دو خانواده Noctuidae و Bombycidae در کانون توجه مجامع علمی قرار گرفته است(Radjabi et al., 2012). نشانگرهای مولکولی در مقایسه با نشانگرهای فنوتیپیک سنتی چندین مزیت دارد که از آن جمله می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
عدم تاثیرپذیری بوسیله محیط
قابل یافت شدن در تمام مراحل نموی
در برگیرنده کل ژنوم
2-8- کاربرد اصلی نشانگرهای مولکولی در مطالعات اکولوژیکی حشراتبررسی‌های اکولوژیکی روی گونه‌های مختلف موجودات مانند حشرات، اطلاعات بسیار با ارزشی را در زمینه‌های ساختار جمعیتی، گونه‌زایی، جریان ژنی و تنوع ژنتیکی فراهم می‌آورد. این بررسی‌ها همچنین اطلاعات لازم جهت توجیه ایجاد تنوع در حشرات در اثر تاثیرات متقابل با فاکتورهای محیطی را فراهم می‌آورد. در بسیاری از موارد وقتی که هیچ راه دقیقی جهت تشخیص گونه‌های مختلف وجود ندارد، استفاده از داده‌های نشانگرهای مولکولی بسیار راه‌گشا خواهد بود. نشانگرهای مولکولی کاربردهای بیشماری در زمینه‌های مختلف اکولوژیکی حشرات ایفا می‌کنند که به برخی از آنها اشاره می‌شود (حسینی، 1389).
2-8-1- برهم‌کنش حشرات و گیاهان میزبانیکی از کاربردهای نشانگرهای مولکولی در مطالعات مربوط به حشرات، بررسی روابط متقابل گیاهان و حشرات است (حسینی، 1389). Alpha
نشانگرهای DNA ابزاری برای نقشه برداری ژن در گیاهان زراعی مهم است که مقاوم به حشرات آفت هستند، همچنین این نشانگرها در توصیف ژن‌های غیر بیماریزا در حشرات متعامل با گیاهان میزبان مفید هستند(Harris et al., 2003). اطلاعات مولکولی ژنتیک بدست آمده از داده‌های نشانگرها برای توصیف توانایی‌های فنوتیپی حمله حشرات به انواع گیاه خاص استفاده شده است (Behura, 2006). یکی از مثال‌ها در این مورد حشره‌ی گالزا از آفات مهم برنج و گندم است. حشره Orseolia oryzae آفتی بسیار مهم در کشورهای کشت کننده برنج در جنوب و جنوب شرقی آسیاست. این آفت سبب خسارت غیرقابل پیش بینی در تولید برنج می‌گردد. شبیه به این آفت گونه گالزای دیگری بنام Mayetiola destructor سبب خسارت‌های اقتصادی بسیار سنگینی در محصول گندم می‌شود (Behura, 2006). نکته قابل توجه این است که علی رغم استفاده از 32 ژن مقاوم در گندم جهت مقابله با خسارت ناشی از این آفت در آمریکای شمالی استرین‌های مقاومی در مقابل ژن‌های مقاومت تکامل یافته‌اند. این مسئله سبب گردید تا آفت مذکور طغیان نموده و به طور میانگین خسارتی حدود 100 میلیون دلار در سال وارد نماید (حسینی، 1389). بدین منظور وقتی نشانگر RAPD را با مجموعه‌ای از DNA استرین‌های مختلف این آفت استفاده نمودند (Behura, 2006)، نتیجه جالب توجه شناسایی چندین مکان ژنی خاص در افراد مختلفی در استرین‌‌ها بود. سپس با تائید آن با روش ساترن بلات و متعاقباً توالی‌یابی این نقاط، نشانگرهای SCAR تهیه گردید. با استفاده از این نشانگرها آلل‌های خاص را که چنین نشانگرهایی تشخیص می‌دادند تکثیر شدند. چنین روشی سبب شد تا روابط متقابل بین ژنوتیپ و فنوتیپ‌های مشاهده شده در این بیوتیپ‌ها تعیین گردید (حسینی، 1389).
مثال دیگر در شته‌های زیرخانواده‌ی Aphidinae است که دو تیپ بالدار و بدون بال دارد. افرادی که به میزبان اصلی خود حمله می‌کنند افراد نر و ماده بالدار هستند. این ماده‌های بالدار بکرزا هستند که به میزبان ثانویه (گیاهان علفی) برمی‌گردند. در چنین شرایطی نشانگرهای مولکولی DNA اطلاعات بسیار مفیدی را در جهت فهم اساس ژنتیکی چند تیپی در این شته‌ها فراهم آوردند. با استفاده از نشانگر RAPD کشف گردید که در بین فنوتیپ بالدار و فنوتیپ بدون بال اختلافات ژنتیکی عمده‌ای وجود دارد(Lushai et al., 1997). جمعیت‌های‌‌‌‌ طبیعی شته Sitobion avenae دارای میزبان‌های مختلف علفی و همچنین غلات است (Lushai et al., 2002). استفاده از نشانگر RAPD نشان داد که بین الگوی باندهای تشکیل شده بوسیله‌ی این نشانگرها و سازش به یک گیاه میزبان رابطه‌ای وجود دارد. از چنین پروفایل‌هایی می‌توان ژنوتیپ‌های تخصصی را که روی علف هرز خاص یافت می‌شوند از کل ژنوتیپ‌هایی که روی گیاهان کشت شده و علف‌های هرز یافت می‌شوند تشخیص داد (حسینی، 1389). اساس ژنتیکی گیاهانی که میزبان شته ریشه کاهو هستند توسط نشانگرهای SSR مطالعه شده است(Miller et al., 2005). در تحقیق دیگری درجه خسارت‌زایی کلنی‌هایی از شته نخود در پاسخ به مقاومت طبیعی در یونجه بوسیله نشانگرهای RAPD مطالعه شده است(Bournoville et al., 2000). مطالعه برهم کنش بین موجودات گیاهخوار همانند حشرات و گیاهان میزبان از اساسی‌ترین موضوعات بررسی روابط تکامل متقابل می‌باشد. معمولاً مطالعه و بررسی چنین موضوعاتی بسیار دشوار است. از جمله مشکل‌ترین برهم کنش‌های اکولوژیکی مطالعه رفتارهای تغذیه‌ای حشرات است. حشره‌شناسان برای شناسایی غذای حشرات شکارگر از روش‌های بیوشیمیایی و مولکولی استفاده نموده‌اند. از چنین تکنیک‌هایی می‌توان در تعیین روابط گیاهخوار و گیاه نیز استفاده کرد (حسینی، 1389). محققین از روش مولکولی برای شناسایی DNA گونه‌های گیاهان میزبان در محتویات معده حشرات استفاده نمودند. این محققین ابتدا 23 گونه‌ی گیاهی مختلفی را که در ناحیه مورد تحقیق خود یافت می‌شدند را جمع آوری و زیرواحد بزرگ ژن ریبولوز بیس‌فسفات‌کبوکسیلاز از ژن‌های کلروپلاست را برای تمامی گونه‌های جمع آوری شده مورد بررسی و توالی‌یابی قرار دادند. از طرفی هشت خانواده مختلف از حشراتی که در همان محل روی گیاهان ذکر شده فعالیت داشتند را نیز جمع آوری نمودند. پس از بررسی‌های ژنتیکی، نتایج توالی‌یابی نشان داد که تمامی 23 گیاه جمع آوری شده از طریق قطعه ژن 157 جفت بازی rbcL2 کلروپلاست قابل شناسایی هستند. نتایج همچنین نشان دادDNA گیاهان میزبانی که در محتویات معده حشرات گیاهخوار نیز وجود داشتند به راحتی با این روش قابل ردیابی و شناسایی است (حسینی، 1389). در بررسی‌های دیگر مشخص شد که با توالی‌یابی قطعه‌ای از ژنtrnL کلروپلاست می‌توان گیاهانی که به عنوان میزبان سوسک‌های برگخوار بودند را از مخلوط DNA استخراج شده از حشرات، ردیابی و شناسایی کرد. به علاوه نتایج نشان داد که روش مذکور قادر به تعیین ترجیح غذایی سوسک‌های برگخوار است (حسینی، 1389).
2-8-2- برهم کنش حشرات و پاتوژن‌هانشانگرهای مولکولی ابزارهای مناسبی جهت فهم برهم کنش‌های ژنتیکی بین پاتوژن‌های عامل بیماری و حشرات ناقل انتشار دهنده آنها می‌باشند (Behura, 2006; Crampton et al., 1997). بعضی از گونه‌های سن‌های خانواده‌ی Reduviidae از ناقلین بیماری شاگاس در بسیاری از کشورهای آمریکای جنوبی هستند. همچنین بعضی از پشه‌های آنوفل ناقل بیماری مالاریا می‌باشند. از نشانگرهای مولکولی مانند RAPD جهت بررسی توانایی ناقل بودن در این حشرات استفاده شده است (Bosio et al., 2000; Pinto et al., 1998). در زمینه‌های کشاورزی نیز نشانگرهای مولکولی جهت بررسی روابط پاتوژن و حشره ناقل استفاده شده است. به عنوان مثال توانایی انتقال بیماری ویروسی تریستیزای مرکبات توسط شته مرکبات بررسی شده است (حسینی، 1389).
محققین با استفاده از روش Real-time PCR نمایه‌دار قادر به شناسایی و ردیابی ویروس لکه پژمردگی گوجه فرنگی در حشرات ناقل آن یعنی تریپس شدند. از آنجایی که گونه‌های متعددی از تریپس‌ها ناقل ویروس این بیماری هستند، روش فوق قادر به پایش گونه‌ها و جمعیت‌های ناقل ویروس بیماریزا در مزرعه گردید. همچنین محققین با استفاده از روش مذکور قادر به ارزیابی کمیت ویروس نواری برنج در گیاه برنج و ناقل آن یعنی زنجرک Leodelphax striatellus شدند (حسینی، 1389). مطالعات دیگری از جمله شناسایی پاتوژن‌های مفید و غربال کردن آنها به وسیله‌ی نشانگرهای مولکولی جهت کنترل حشرات آفت توسط محققین در حال انجام است (Hodge et al., 1995; Castrillo et al., 2004).
2-8-3- مقاوت به حشره‌کش‌ها
یکی از مهم‌ترین حوضه‌های تحقیق در حشره‌شناسی که از اهمیت پزشکی و کشاورزی برخوردار است، مطالعه مقاومت به حشره‌کش‌ها است. از نشانگرهای مولکولی به منظور شناسایی و مکان‌یابی ژن‌های مقاومت در حشرات علیه حشره‌کش‌ها استفاده شده است. از نشانگر SSR در تعیین فنوتیپ‌های مقاوم به د. د. ت. در Anophels gambiae استفاده گردید. نشانگرهای RFLP نیز علت مقاومت مگس خانگی به د. د. ت. را تعیین نمو (Knipple et al., 1994). بررسی مقاومت Rhyzoptera dominica به فسفین نیز بوسیله نشانگرهای RAPD میسر گردید. بررسی مکان‌های ژنتیکی مقاومت در سوسک سیب‌زمینی نسبت به پایریتروئیدها (حسینی، 1389) و پروانه پشت الماسی نسبت به باسیلوس تروژینسیس توسط نشانگرهای RFLP انجام گردید (Heckel et al., 1999). با استفاده از روش ژنوتاپینگ DNA، جهش‌های موضعی مرتبط با مقاومت به حشره‌کش‌های آزینفوس متیل و پرمترین را بررسی نمودند (Clark et al., 2001).
در بررسی و ردیابی مقاومت به حشره‌کش‌ها، محققین در گونهHypothenemus hampei مقاومت به حشره‌کش اندوسولفان را به روش مولکولی ردیابی نمودند. از آنجایی که گونه مذکور به شدت نسبت به حشره‌کش آندوسولفان و سایر سیکلودین‌ها مقاوم شده بود و در سال‌های طغیانی 90% میوه‌های قهوه به آن آلوده شده بودند محققین بر آن شدند تا علت مقاومت را بررسی نمایند. آنها با استفاده از آغازگرهای انتخابی PCR بخشی از ژن Rd1 تکثیر نمودند. این ژن کد کننده گاما آمینو بوتریک اسید در ناحیه‌ی کانال یون کلراید است. با توال‌یابی ناحیه‌ی ذکر شده آنها ثابت کردن که استرین‌های مقاوم H. hampei در اسیدهای آمینه خود دچار تغییراتی شده‌اند که همانند تغییزات مشاهده شده در استرین‌های مقاوم Drosophia melanogaster است. این تغییر در اسید آمینه شامل جایگزینی اسید آمینه آلانین به سرین می‌باشد. چنین روشی ثابت نمود که می‌توان افراد مقاوم یا حساس را در مراحل تخم، لارو و یا بالغ ردیابی نمود و از آن در پایش جمعیت‌های حشرات در مزرعه استفاده کرد(Ffrench- Constant et al., 1994) .
2-8-4- روابط شکار- شکارگر- پارازیتوئیدنشانگرهای مولکولی در فهم بهتر روابط غذایی شکار- شکارگر- پارازیتوئید در حشرات نقش بسیار مهمی را ایفا نموده‌اند. بررسی و مطالعه روابط غذایی شکار- شکارگر در شرایط مزرعه امری دشوار و در بسیاری از موارد غیر ممکن است زیرا شکارگر جثه‌ای کوچک و رفتاری اختفاگرایی داشته و مشاهده رفتار تغذیه‌ای آن ناممکن است، اما بوسیله‌ی نشانگرهای مولکولی شناسایی یک یا چندین نوع شکار در محتویات معده حشرات شکارگر امکان‌پذیر شده است. به عنوان مثال با نشانگرهای اختصاصی تهیه شده SCAR بر پایه‌ی PCR از مکان‌های ژنی خاصی که توسط نشانگرهای RAPD ایجاد شده بود. محققین توانستند بقایای دو نوع شکار (Trialeurodes vaporariorum, Helicoverpa armigera) را در محتویات معده سن شکارگر Dicyphus tamaninii ردیابی کنند (Agusti et al., 1999).
علاوه بر شناسایی، نشانگرهای مولکولی همچنین برای تعیین کمیت و درصد پارازیتیسم نیز در حشرات مورد استفاده قرار گرفته‌اند. محققان با ساختن نشانگر اختصاصی Lysiphlebus testacipes توانستند این زنبور را در شته‌های مختلف ردیابی کرده و درصد پارازیتیسم را در شته‌ها تخمین بزنند. تناسب تناوب میزان ردیابی پارازیتوئیدها بوسیله داده‌های مولکولی این مسئله را عنوان می‌کند که کاربرد نشانگرهای مولکولی قادر به تخمین صحیحی از میزان پارازیتیسم خواهد بود (Walton et al., 1990).
2-8-5- سیستماتیک مولکولیمطالعه انواع مختلف موجودات و روابط بین آنها علم سیستماتیک نامیده می‌شود. این بخش از علوم زیستی شامل مطالعه و بررسی طبقه‌بندی و تاکسونومی موجودات است. بطور سنتی اساس این علم بر پایه‌ی شباهت‌ها و تفاوت‌های مرفولوژیک در بین موجودات بنا گذاشته شده است، اما به بدلیل پیشرفت‌های شگرف دهه اخیر تغییرات قابل ملاحظه‌ای در این علم صورت گرفته است. از مهمترین این دلایل ورود تکنیک‌های جدید مولکولی از جمله آنالیز ایزوآنزیم‌ها، سیتوژنتیک مولکولی، ایمونولوژی، هیبریداسیون DNA- DNA و غیره به این عرصه از علم می‌باشد. در واقع در سیستماتیک مولکولی از ساختمان مولکولی موجودات به عنوان منبع اطلاعات سود جسته و از آن در بررسی روابط تکاملی آنها استفاده می‌نمایند. از مهم‌ترین این تکنیک‌ها روش‌های مبتنی بر DNA است که زمینه تشخیص‌های دقیق و تفکیک گونه‌ها را میسر ساخته است. فیلوژنی مولکولی از چنین داده‌هایی در جهت ترسیم درخت روابط تکاملی موجودات استفاده می‌کنند.
از مهمترین موضوعات مورد استفاده در شناسایی شباهت‌ها و تفاوت‌ها، مقایسه توالی‌های بین ژن‌ها با تکنیک ردیف سازی توالی‌ها است. از کاربردهای دیگر فیلوژنی مولکولی، DNA barcoding است. در این روش گونه‌های مختلف یک موجود زنده با استفاده از بخش کوچکی از توالی DNA میتوکندری و یا ژن دیگری شناسایی می‌شوند. از کاربردهای دیگر این علم در ژنتیک انسانی است. با این روش‌ها می‌توان هویت بچه‌ای را که پدر و مادر آن مورد شک هستند تعیین نمود. همچنین از این روش‌ها در علوم جنایی برای تعیین هویت اجساد و یا متهمین استفاده می‌شود. این روش معروف به انگشت نگاری DNA است.
همه‌ی موجودات زنده دارای ماده‌ی ژنتیکی DNA، RNA و پروتئین هستند. این فاکتورها اساس مطالعات تکاملی را تشکیل می‌دهند. از آنجا که اساس مواد ژنتیکی نیز بر پایه‌ی توالی بازها یا نوکلئوتیدها بنا نهاده شده است. بنابراین موجوداتی که از لحاظ خویشاوندی به یکدیگر نزدیک باشند در ساختمان مولکولی‌شان شباهت‌های بسیار بالایی وجود دارد. این در حالی است که موجودات غیر خویشاوند از نظر این نوع ترکیبات با همدیگر متفاوتند. در حال حاضر توالی‌یابی تمام ژنوم یک موجود اوری بسیار گران قیمت است و این کار فقط برای تنها چند گونه صورت پذیرفته است. به هر حال تعیین توالی قسمت‌های معینی از کروموزوم‌های خاص امکان‌پذیر است. بطور کلی برای تجزیه و تحلیل سیستماتیک مولکولی گونه‌ها، توالی حدود 1000 جفت باز احتیاج است. در بررسی و مقایسه هر بخش از یک توالی در گونه‌های مختلف ممکن است اختلافاتی در بازها وجود داشته باشد و گونه‌هایی که به یکدیگر شبیه هستند اختلاف کمتری در نوکلئوتیدها داشته و توالی شبیه به هم خواهند داشت (حسینی، 1389).
2-8-6- حشرات تراریخته
حشرات تراریخته حشراتی هستند که DNA موجودات دیگر را بطور مصنوعی به ژنوم آنها وارد نموده‌اند. مهندسی ژنتیک و اصلاحات انجام شده در اطلاعات ژنتیکی حشرات و کنه‌ها، برنامه‌های کنترل تلفیقی آفات را در آینده تحت تأثیر قرار خواهد داد. یکی از این اهداف شامل تغییر ژنتیکی در پشه‌ها و سایر حشرات ناقل بیماری در گیاهان، انسان و حیوانات است که قابلیت انتقال پاتوژن‌ها بیماریزا را به میزبان نداشته باشند. روش‌های تراریخته قادر به ارتقاء برنامه‌های کنترل ژنتیکی نیز خواهند شد. به عنوان مثال با ایجاد تغییرات ژنتیکی در جمعیت یک گونه فقط افراد نر بطور انبوه پرورش یابند و سپس با تابانیدن پرتوهای رادیواکتیو عقیم گردند. افراد عقیم شده پس از رهاسازی در طبیعت با افراد ماده وحشی در طبیعت جفت‌گیری نموده و نتیجه آن تخم‌های غیربارور خواهد بود. فقط تولید افراد نر عقیم یا فقط افراد ماده بوسیله روش‌های تراریخته، تأثیر و کارایی چنین برنامه‌هایی را ارتقاء خواهد داد. سایر اهدافی که توسط گروه‌های مختلف تحقیقاتی در حال انجام است تولید زنبوران عسل و کرم ابریشم مقاوم در برابر بیماری با داشتن ویژگی‌های اقتصادی مورد نظر می‌باشد. دشمنان طبیعی مورد استفاده در برنامه‌های کنترل بیولوژیکی جهت افزایش کارایی و تأثیرشان با روش‌های تراریخته قابل اصلاح هستند. از جمله این تغییرات می‌توان به اصلاح در نسبت جنسی، میزان تحمل نسبت به دما و رطوبت محیط و دیاپوز اشاره کرد (حسینی، 1389).
2-9- میکروستلایت‌ها یا توالی‌های ساده تکرار شونده
میکروستلایت‌ها یا ریزماهواره‌ها که به طور خلاصه SSR نامیده می‌شوند قطعاتی از DNA هستند که 6-1 باز متوالی تکرار می‌شود. به عنوان مثال توالی ریزماهواره‌ای که دو باز CA در آن 12 بار تکرار می‌شود بصورت CACACACACACACACACACACACA است که در چنین حالتی توالی مکمل آن (GT)12 خواهد بود. ریزماهواره‌ها در ژنوم هسته و کلروپلاست و همچنین ژنوم میتوکندری بعضی از گونه‌ها یافت شده‌اند. تاکنون یافتن نشانگرهای ریز‌ماهواره‌ای کاری بسیار زمان‌بر و پر هزینه بوده اما امروزه استفاده از این نشانگرها بخاطر وجود اطلاعات توالی‌های متعدد در بانک‌های اطلاعاتی DNA نسبتاً کم هزینه‌تر شده است. روش عمومی مورد استفاده در جستجوی این نوع نشانگرها کلون کردن قسمت‌هایی از DNA بصورت کتابخانه ژنتیکی و سپس غربال نمودن این اطلاعات با کاوش‌های ریزماهواره است. کلون‌هایی که حاوی ریز‌ماهواره هستند سپس جدا و نهایتاً توالی یابی می‌شوند. آغازگرهایی که ناحیه ریز‌ماهواره را تکثیر می‌نمایند از روی بخش‌های غیر تکرار شونده توالی ریزماهواره طراحی می‌گردند. توالی‌هایی که این ریزماهواره‌ها را در بر می‌گیرد اغلب در بین گونه‌های نزدیک به هم ثابت است. این بدان معنی است که می‌توان از آغازگرهای ریزماهواره‌‌ها برای چندین گونه استفاده نمود. ریزماهواره‌ها به مراتب سریع‌تر از انواع دیگری از توالی‌ها جهش می‌یابند. میزان بالای پلی‌مورفیسم در ریزماهواره‌ها آنها را جهت بررسی‌های تنوع ژنتیکی افراد و جمعیت‌ها مناسب می‌سازد (حسینی، 1389).نشانگرهای ژنتیکی مبتنی بر میکروساتلیت‌ها در تمام نواحی ژنوم در هر دو بخش نواحی کد کننده و نواحی غیرکد کننده یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌ها پراکنده شده است و واجد تمام شرایط مناسب یک نشانگر می‌باشد. میکروساتلیت‌ها توالی‌های کوتاه تکراری مونو، دی، تری، تترا، پنتا و هگزا نوکلئوتیدی همچون (A)n، (CA)n، (GA)n، (GTA)n، (ATT)n، (GATA)n، (ATTTT)n، (ACGTCG)n می‌‌باشند.
ریزماهوارهها در ژنوم تمام یوکاریوتها وجود دارند. این نشانگرها به دلیل فراوانی زیاد، برای مکان‌یابی ژنتیکی و مطالعه جمعیتها، نشانگرهای ایدهآلی هستند. در موجودات عالی (نظیر گیاهان) قسمت زیادی از ماده وراثتی DNA قابل نسخه برداری نیست. زیرا دارای آغازگر، محل اتصال ریبوزومی و پایانگر نیست. بنابراین این قطعات توسط آنزیمهای نسخهبردار، رونوشت برداری نمیشوند. برای این قسمتها وظیفه‌ای شناخته نشده است، گرچه برخی محققین وظایف بسیار مهمی برای آنها قائل هستند. گاهی این قسمتها حاوی توالیهای تکرار شوندهای هستند که چند صد جفت باز دارند. این توالیها که معمولاً در نواحی سانترومری کروموزومها دیده می‌شوند، ماهواره نامیده می‌شوند. در موارد دیگر یک توالی مرکزی 60-10 جفت بازی چند صد بار تکرار میشود. به این توالیها ماهوارک گفته میشود. ریزماهوارهها شامل واحدهای 6-1 تایی هستند که به دفعات تکرار میشوند. ریزماهوارهها یا همان توالیهای تکراری ساده در سراسر ژنوم پراکنده هستند. تعداد تکرار هر واحد تکرار شونده متفاوت است، ولی حداقل تکرار آن در ریزماهوارههای با هسته دو نوکلئوتیدی10 بار و در ریزماهوارهای با هسته سه نوکلئوتیدی7 بار برآورد شده است.
بر اساس توالی‌های تکرار شونده ریزماهواره‌ها به 3 دسته تقسیم می‌شوند:
الف) ریزماهواره‌های کامل: در این نوع ریزماهوارهها یک واحد ریزماهواره کامل و پشت سر هم مانند GTGTGTGTGTGT بدون هیچ گونه تداخلی دیده میشوند.
ب) ریز ماهواره‌های ناقص: در این نوع ریزماهوارهها در درون واحدهای ریزماهواره‌ای یک یا دو نوکلئوتید غیر ریزماهوارهای مشاهده می‌شود که در ساختمان ریزماهواره تداخل ایجاد می‌کند مانند GTGTGTCGTGTGT.
ج) ریز ماهواره مرکب: در این نوع ریزماهوارهها دو ساختار ریزماهوارهای پشت سر هم قرار داشته و یا یکی درون دیگری قرار می‌گیرد مانند GTGTGTGTGCGCGCGC.
این تنوع در تعداد توالی‌های ریزماهواره، به کمک PCR و الکتروفورز روی ژل پلی‌اکریلامید به خوبی قابل بررسی است. علل مختلفی برای تنوع زیاد تعداد ریزماهوارهها در افراد مختلف یک جمعیت ذکر شده است. در یکی از نظریه‌های بسیار مهم چنین گفته میشود. که تغییر در توالی‌های ریزماهواره‌ای بیشتر به علت خطاهای ناشی از همانندسازی آنزیم پلیمراز است. نکته بسیار مهم و اساسی در مورد ریزماهواره‌ها این است که این توالی‌ها دارای دو توالی منحصر به فرد در دو سمت خود هستند که معمولاً ثابت و حفاظت شده میباشند ولی تعداد تکرار واحدها درون محدوده این دو توالی بسیار متغیر است.
این توالیها در گونههای خویشاوند ثابت مانده و تغییراتی را متحمل نمیشوند. بنابراین اگر بتوان توالی دو طرف ریزماهواره را شناسایی نمود میتوان بر اساس آن آغازگرهایی را طراحی کرد و به کمک PCR قطعه ریزماهواره را تکثیر نمود. البته سختترین و پرهزینهترین قسمت کار نشانگرها تعیین توالی قسمتهای دو طرف ریزماهوارهها میباشد. این مطالعات درگیاهان مختلف و با صرف وقت و هزینههای زیاد انجام میپذیرد. ریزماهوارهها تنوع زیادی دارند و به طور مناسبی در ژنوم گیاهان پخش شدهاند و تعداد آنها نیز در ژنوم گیاهان نسبتاً زیاد است. کارکردن با ریزماهوارهها نسبتاً ساده است و میتوان به راحتی نتایج حاصله را تفسیر نمود، مخصوصاً امروزه نرم‌افزارهای مختلف رایانهای کمکهای شایانی به محققین نموده است. نشانگرهای ریزماهواره از دسته نشانگرهایی هستند که میتوانند به راحتی تفاوت بین افراد هموزیگوت و هتروزیگوت را نشان دهند و به کمک آنها میتوان آللهای مختلف را شناسایی نمود. با توجه به این خصوصیت مهم و چند شکلی بالا، امرزه از این نشانگرها به وفور استفاده میشود. نشانگرهای ریزماهواره بر اساس نحوه طراحی آغازگرها تقسیم بندی میشوند. در یک دسته آغازگرها به نحوی طراحی میشوند که ریزماهوارهها ازدیاد شوند ولی در دستههای دیگر نواحی بین ریزماهوارهای ازدیاد میشود. امروزه روش‌های زیادی برای شناسایی چند شکلی جایگاههای ریزماهوارهای و همچنین جایگاههای میان ریزماهوارهها وجود دارد. در یکی از اولین روش‌ها که به نام PCR تکرارهای کوتاه پیاپی مشهور است، از نواحی مجاور ریزماهواره که معمولاً حالت ثابت دارند، جهت طراحی آغازگر استفاده میشود. تکرارهای کوتاه پیاپی قطعاتی چند نوکلئوتیدی هستند که به طور پیاپی تکرار میشوند و نمونه بارز آن، ریزماهوارهها هستند. بنابراین پس از انجام واکنش PCR، ناحیه وسط این دو آغازگر که در واقع یک توالی تکراری ساده است ازدیاد می‌شود. بسته به تعداد تکرارهای انجام شده، چند شکلی متفاوتی روی ژلهای پلی‌اکریلامید مشخص می‌شود و میتوان آللهای متفاوتی را مشاهده نمود. چنین فرض می‌شود که جهش در تعداد واحدهای تکرار شونده و ایجاد چند شکلی بالا در ریزماهوارهها با یکی از دو مکانیزم کراسینک‌اور نامساوی یا جفت نشدن ناشی از سر خوردن در طول رشته (خطاهای همانندسازی DNA) انجام می‌گیرد.
ریزماهوارهها اغلب چند شکلی بالایی دارند. آنها تک لوکوس بوده و دارای سیستم چندآللی و توارث همبارز هستند. در ژنوم یوکاریوتها به وفور یافت میشوند. چون مقدار بسیار اندک DNA برای بررسی ریزماهوارهها کفایت میکند بنابراین نمونهگیری از موجودات بدون از بین رفتن آنها امکان پذیر میشود. قابلیت تکرار پذیری بالا، امتیازدهی آسان و دقیق، تبادل آسان دادهها در بین آزمایشگاهها و گزینش بدون ابهام آللها از مزایای دیگر ریزماهوارهها هستند.
از معایب ریزماهوارهها میتوان به صرف وقت و هزینه زیاد در مرحله ایجاد و شناسایی، استفاده از مواد خطرناک (مثل اکریل امید و مواد رادیو اکتیو)، دانش اندک در مورد نحوه جهش و لزوم ایجاد روش‌های جدید برای تجزیه و تحلیل دادهها اشاره کرد. دیگر این که شناسایی ریزماهوارهها نیاز به کلون‌سازی و تهیه کتابخانه ژنومی دارد.
2-10- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری ISSR نشانگر DNA مبتنی بر PCR برای تحقیق در روابط ژنتیکی بسیاری از جمعیت‌ها و کالتیوارهای گیاهی و جانوری استفاده شده است (Zietkiewics et al., 1994; Prevost and Wilkinson, 1990; Tsumura et al., 1996; Deshpande et al., 2001; Bornet et al., 2002). در روش ISSR تکثیر قطعه DNA بین دو ناحیه تکراری ریزماهواره مشابه، در دو جهت مختلف صورت می‌گیرد. این تکنیک ریزماهواره‌هایی با طول 16 الی 25 جفت باز را به عنوان آغازگر در واکنش PCR تک آغازگره استفاده و چندین جایگاه ژنی عمدتاً توالی‌های بینابینی با اندازه‌های مختلف را تکثیر می‌کند. توالی‌های ریزماهواره‌های مورد استفاده به عنوان آغازگر می توانند دی نوکلئوتید، تری نوکلئوتید، تترا و پنتا نوکلئوتید می‌باشند (Gupta et al., 1994; Meyer et al., 1993).
آغازگرها ممکن است در یکی از دو انتهای 3َ یا 5َ با 1 تا 4 باز دژنره شده انکورد شوند. این تکنیک بیشتر مزایای آنالیز ریزماهواره‌ها و AFLP را همراه با آغازگرهای اختیاری RAPD ترکیب می‌کند. ISSR به دلیل کاربرد آغازگرهای طولانی‌تر (16 تا 25 مری) از نشانگر RAPD (با آغازگر 10 مری) تکرار پذیری بیشتری دارد و کاربرد دمای بالای اتصال آغازگر به نمونه DNA در مقایسه با نشانگر RAPD به قدرت باندی بالاتری منجرب شده است.
مطالعه روی تکرار پذیری نشان داد که تنها باندهای کمرنگ‌تر تکرار پذیرند. حدود 92 تا 95 درصد قطعات نمره داده شده در یک نمونه DNA در یک کالتیوار با PCR جدا در روی ژل اکریلامید تکرار می‌شوند (Fang and Roose., 1997; Fang et al., 1997; Moreno et al., 1998).
10 نانوگرم نمونه DNA همان کارایی را در مورد فراورده‌های تکثیر شده نشان داد که نمونه‌های 25 و 50 نانوگرمی در مخلوط واکنش 20 میکرولیتری از خود نشان دادند. دمای اتصال آغازگز به محتوای بازهای G+C بستگی دارد و در مورد آغازگرهای ISSR بین 45 تا 65 درجه سلیسیوس متغیر است.
ISSR نشانگر غالب بوده و از قوانین ساده مندل تبعیت می‌کند (Gupta et al., 1994; Tsumura et al., 1996; Ratnaparkhe et al., 1998; Wang et al., 1998) با وجود این در برخی موارد هم بارز نشان داده شده است که می‌تواند هوموزیگوزیتی را از هتروزیگوزیتی متمایز سازد (Akagi et al., 1996; Wang et al., 1998; Sankar and Moore, 2001). این نشانگر با واژه‌های مختلف توسط محققین مختلف معرفی شده است (جدول 2-1)
جدول 2-1: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCRاصطلاح استفاده شده منبع
MP-PCR, Microsatellite primed PCR (refers to unanchored primer) Meyer et al. (1993)
SSR-anchored PCR, Inter-SSR amplification Zietkiewicz et al. (1994)
SPAR (single primer amplification reaction) Gupta et al. (1994)
RAMPs (random amplified microsatellite polymorphisms) Wu et al. (1994)
RAMs (randomly amplified microsatellites) Hantula et al. (1996)
AMP-PCR (anchored microsatellite primed PCR) Weising et al. (1998)
ASSR (anchored simple sequence repeats) Wang et al. (1998)
2-11- منابع تغییرات و چند شکلیتغییر نرخ تکاملی درون ریزماهواره‌ها به طور قابل توجهی بیشتر از انواع دیگر DNA می‌باشد از این رو احتمال چندشکلی در این توالی‌ها بیشتر است منبع تغییرات در باندهای بدست آمده از نشانگر ISSR می‌تواند به یکی از دلایل زیر یا ترکیبی از آنها نسبت داده شود:
2-11-1- نمونه DNAسرایش آنزیم DNAپلیمراز در طول رونویسی DNA و شکست در تعمیر mismatch به عنوان مکانیسم برای ایجاد تفاوت در توالی‌های تکراری ساده یا SSR قلمداد می‌شود. جهش در نقطه اتصال آغازگر همچون RAPD سبب تشکیل یا عدم تشکیل باند و نمرات 0 و 1 می‌شود. حذف و قرارگرفتن درون نواحی تکراری ساده به غیبت باند یا چندشکلی طویل بسته به تشکیل اندازه قطعه قابل تکثیر منجر می‌شود. تفاوت در تعداد نوکلئوتیدها درون تکرارهای ریزماهواره‌ها به چند شکلی طویل منجر خواهد شد وقتی از آغازگر انکورد شده در انتهای 5َ استفاده شود.
2-11-2- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:سطح چند شکلی به انکورد شدن یا نشدن، انکورد شدن در انتهای 3َ یا 5َ و توالی آغازگر مورد استفاده بستگی دارد. زمانی که از آغازگرهای انکورد نشده استفاده می‌شود باندهای واضح و تمیز به دلیل تمایل آغازگر به سرایش بین واحدهای تکراری در حین تکثیر جای خود را به باندهای ضعیف می‌دهند. وقتی آغازگر در انتهای َ5 انکورد می‌شود فراورده‌های چند شکل بیشتری تکثیر شده می‌شود. معمولاً آغازگرهای دی نوکلئوتید انکورد شده در دو انتهای َ3 و 5َ چند شکلی بیشتری نشان می‌دهند (Joshi et al., 2000; Nagaoka and Ogihara, 1997). آغازگرهای انکورد شده در انتهای 3َ در مقایسه با آغازگرهای انکورد شده در انتهای 5َ باندهای شفاف‌تری تولید می‌کنند (Tsumura et al., 1996; Nagaoka and Ogihara, 1997). چون آغازگرها توالی‌های ساده تکراری با توزیع و فراوانی متفاوت در ژنوم هستند بر تولید باند در گونه‌های مختلف تاثیر می‌گذارند. با در نظر گرفتن دی و تری نوکلئوتیدها در کنار هم یک توالی ساده تکراری یا ISSR در هر 33 کیلو باز از توالی DNA هسته‌ای در مقایسه با 423 کیلوباز از توالی DNA اندامی وجود دارد (Wang et al., 1994). در کل آغازگرهایی با توالی(CA)، (AC)، (TC)، (CT)، (GA)، (AG) چند شکلی بیشتری در مقایسه با دی، تری و تترانوکلئوتیدها از خود نشان می‌دهند. توالی A+T فراوان‌ترین دی‌نوکلئوتید در گیاهان هست. تری و تترانوکلئوتیدها فراوانی کمتری در مقایسه با دی‌نوکلئوتیدها داشته و کمتر در مطالعات استفاده می‌شوند.
توالی‌های AG و GA باندهای شفافی در مطالعه برنج و نخود تولید می‌کنند (Joshi et al., 2000;Reddy et al., 2000; Sarla et al., 2000; Ratnaparkhe et al., 1998) در حالی که آغازگرهای مبتنی بر AC در سیب زمینی و گندم کارایی بهتری دارند (Nagaoka and Ogihara, 1997; Kojima et al., 1998;).
قدرت حل (Rp) شاخصیست که برای مقایسه ارزش آغازگرهای مختلف از لحاظ باندهای اطلاعات دهنده بدست آمده از سری بانک ژن توسعه یافت (Provest and Wilkinson, 1999).
2-11-3- روش کشفسطح چند شکلی کشف شده، نشان داده شده که با روش کشف مورد استفاده متفاوت است. الکتروفورز روی ژل اکریلامید در ترکیب با رادیواکتیویته حساس‌ترین است و در جایگاه دوم ژل اکریلامید رنگ‌آمیزی شده با نیترات نقره قرار دارد. ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید در جایگاه سوم قرار می‌گیرد. کاربرد ژل اکریلامید تعداد باندهای به مراتب بیشتری را در مقایسه با آگارز نشان داد (Moreno et al., 1998). در مطالعه نارنگی سه برگه رنگ آمیزی نیترات نقره همه باندهای کشف شده با اتورادیوگرافی را نشان داد (Fang et al., 1997). با وجود این سطح بالای چند شکلی کشف شده حتی وقتی که فراورده‌های تکثیر ISSR روی ژل آگارز بدون نشاندار شدن استفاده شد مشاهده گردید. بنابراین نیاز به رادیواکتیویته می‌تواند اجتناب شود وقتی که نمونه‌های بسیاری از بانک ژن مطالعه می‌شوند. ISSR-PCR تکنیک موثره سریع، ساده با تکرارپذیری بالاست که در آن کاربرد رادیواکتیویته لازم نیست. آغازگرهای اختصاصی آن به راحتی سنتز می‌شوند و تفاوت در طول و توالی آن امکان‌پذیر است. فراورده‌های تکثیر شده معمولاً 2000-200 جفت باز طول دارند و بوسیله الکتروفورز آگارز و اکریلامید نتیجه مناسب را ارایه می‌دهند.
2-12- کاربردهای تکنیک ISSR2-12-1- انگشت‌نگاری ژنتیکیانگشت‌نگاری DNA ابزار مهمی برای دسته بندی بانک ژن و استقرار شباهت در میان واریته‌ها، هیبریدها و منابع والدینی در مدیریت بانک ژن و برنامه‌های اصلاح نژاد می‌باشد. آغازگرهای دی‌نوکلئوتید ISSR انکورد شده در یکی از دو انتهای َ3 یا 5َ در مطالعه انگشت‌نگاری با تکرارپذیری بالا برای حفظ مجموعه گیاه کاکائو استفاده شده است (Charters and Wilkinson, 2000). تکنیک ISSR چند شکلی مناسبی برای تمایز واریته‌های مختلف گل داوودی نشان داد ((Wolf et al., 1998.
2-12-2- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکیتکنیک ISSR به طور موفقیت آمیزی برای تخمین تنوع ژنتیکی در سطح درون و بین گونه‌ای طیف وسیعی از گونه‌های گیاهی همچون برنج (Joshi et al., 2000)، گندم (Nagaoka and Ogihara, 1997)، سیب زمینی، بارهنگ (Wolf and Morgan-Richards, 1998) و ارزن انگشتی ((Salimath et al., 1995 و گونه‌های جانوری استفاده شد. آغازگرهای توالی‌های ساده تکراری انکورد شده مفیدتر و تکرارپذیرتر از ایزوزایم‌ها، RAPD و RFLP در تجزیه تنوع بانک ژن پرتقال سه برگه معرفی شد (Fang et al., 1997). ISSR برای تجزیه تنوع در جنس Elusine به لحاظ کمی و کیفی نسبت به نشانگرهای RAPD و RFLP برتری داشت (Salimath et al., 1995). به طور معنی‌داری تکنیک ISSR در سطح گونه کارایی مناسبی برای تمایز واریته‌ها از خود نشان داد برای مثال 5 آغازگر انکورد شده در انتهای 5 توانستند 20 کالتیوار Brassica napus را از یکدیگر متمایز سازند (Charters et al., 1996).
2-12-3- نقشه‌یابی ژنتیکیاکثر مطالعات نقشه‌یابی ژنتیکی بروی گیاهان استوار است، با استفاده از تکنیک‌های ISSR، RAPD و Isozyme موفق به کشف نقشه ژنی شاه‌بلوط شدند (Casasoli et al., 2000) و همچنین کاربرد نشانگرهای RFLP، RAPD و ISSR برای نقشه یابی کاج سیاه ژاپنی و اروپایی (Arcade et al., 2000)، مشخص کرد که نشانگرهای ISSR و RAPD به لحاظ کیفی نسبت به Isozyme برتری دارند(Casasoli et al., 2000) .
2-12-4- تعیین فراوانی توالی‌های ساده تکراری (SSR)ISSR دیدگاه مناسبی جهت سازماندهی، فراوانی و سطح چند شکلی توالی‌های تکراری ساده متفاوت در ژنوم‌های گیاهی و جانوری ارایه می‌دهد. در گندم و برنج توالی‌های ساده تکراری دی‌‌نوکلئوتیدی به عنوان آغازگر استفاده و تعداد زیادی باند تولید کرد بنابراین نسبت به تکرارهایی با توالی ساده با واحدهای بزرگتر، عمومی‌تر هستند (Nagaoka and Ogihara, 1997). آغازگرهای GA انکورد شده در انتهای َ3 پنج مرتبه باندهای بیشتری نسبت به توالی GT تولید می‌کنند که نشان دهنده فراوانی کم یا فقدان توالی GT می‌باشد. نشان داده شده است که توالی‌های تترانوکلئوتیدی در طول ژنوم یوکاریوت‌ها فراوانند (Gupta et al.,1994) و تترامر AGAC و GACA در ژنوم علف‌ها پخش شده‌اند (Pasakinskiene et al., 2000). توالی‌های تترانوکلئوتیدی در تمایز درون گونه‌ای مگس‌های Simuliidae عملکرد مناسبی داشتند (Dusinsky et al., 2006).
2-12-5- مطالعه جمعیت‌های طبیعی و گونه‌زایینشانگر ISSR l معرفی شده تا در سیستماتیک و آزمایش فرضیه‌های گونه‌زایی مفید باشد (Wolf et al.,1998). منشا گونه Pens--on clevelandi با کاربرد تنها 8 نشانگر ISSR شناسایی شد. کاربرد این تکنیک مولکولی در اکولوژی طیف زیادی از خانواده‌های گیاهی استفاده شده است که عبارتند از: Brassicacea، Orchidaceae، Poaceae، Violaceae، Hippocastanaceae، Scrophulariaceae و Asteraceae تفاوت‌های درون و بین جمعیتی را می‌توان با نشانگر چند جایگاه ژنی ISSR شناسایی کرد. نشان داده شده است میزان تفاوت بین جمعیت‌های O. granulate از نواحی مختلف (2/49 درصد) بیشتر از تفاوت‌های جمعیتی درون یک ناحیه (38 درصد) یا درون یک جمعیت (12 درصد) با استفاده از نشانگر ISSR است (Qian et al., 2001).
2-13- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولینیاز به تنوع گونه‌های گیاهی و جانوری جهت توسعه و بهبود آن در اصلاح نژاد آینده بسیار با اهمیت بوده و نشانگر مولکولی ISSR بی‌شک نقش مهمی در این زمینه ایفا می‌کند زیرا این نشانگر قادر به تشخیص چندشکلی زیاد در گونه‌ها و واریته‌های نزدیک به هم بوده و در تمایز آنها کارایی خوبی دارد و می‌تواند در مقایسه با نشانگرهای دیگر ارزان‌تر و مفیدتر باشد ( Gupta et al., 1994; Salimath et al., 1995; Virk et al., 2000). در بسیاری از مطالعات به منظور تعیین چندشکلی و مقایسه سیستم‌های مولکولی برای مثال در گروه SSR از تری و تترانوکلئوتیدها استفاده می‌شود. چنین توالی‌هایی در مقایسه با دی‌نوکلئوتیدها نه تنها فراوان نیستند بلکه نمی‌توانند در دسته‌بندی واریته‌ها و گونه‌ها مفید باشند. داده‌های بسیاری با کاربرد توالی‌های SSR بدست می‌آید که در محدوده وسیع‌تری از ژنوم انتشار داشته باشند. با کاربرد ISSR با نشانگر RAPD میزان بیشتری چند شکلی قابل اکتشاف می‌باشد ((Joshi et al., 2000; Becker and Heun, 1995.تکنیک ISSR بدون محدودیت نمی‌باشد برای مثال همچون RAPD ممکن است قطعات هم حرکت از نواحی غیر هومولوگ منشا و با هم حرکت کنند که ممکن است سبب ایراداتی در تخمین شباهت ژنتیکی گردد (Sanchez et al., 1996). طبیعت مولکولی چند شکلی تنها در صورتی شناخته می‌شود که قطعه استخراج شده از ژل توالی‌یابی شود. نشانگر ISSR متصل به صفات مهمی زراعی توالی‌یابی شد و در نشانگر STS برای انتخاب مارکر مناسب مورد استفاده قرار گرفت. یکی از مزایای ISSR در پیوستگی آنها با جایگاه‌های ژنی SSR می‌باشد. اگر چه ریزماهواره‌ها احتمالاً خودشان به طور انتخابی خنثی و بدون عمل می‌باشند پی برده شده که به نواحی کدکننده متصل هستند به همین دلیل ISSR احتمالاً نشان دهنده نواحی قوی ژنی می‌باشند (Kojima et al., 1998).
2-14- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسیمطالعات محدودی از کاربرد نشانگر ISSR در حشره‌شناسی چاپ شده است و عمده این مطالعات روی دو راسته بالپولکداران و دوبالان متمرکز بوده و دو مطالعه روی زنجره‌ها و شته‌ها از راسته جوربالان، دو مطالعه روی زنبور عسل از بال‌غشائیان، مطالعه‌ای روی سوسک کرگدنی از سخت بالپوشان صورت گرفته است. مطالعات صورت گرفته به شرح زیر می‌باشند:
مطالعه تنوع ژنتیکی زنجره Sogatella furcifera در چین (Liu et al., 2010).
مطالعه کاربرد نشانگر ISSR در تعیین تفاوت فردی و جمعیتی دو گونه شته Pemphigus obesinymphae و Acythosiphum pisum و یک گونه مگس موسکوئیت Aedes aegypti در آمریکا (Abbot, 2001).
بررسی چندشکلی 3 جمعیت زنجرک جنس Homalodisca از خانواده Cicadellidae با نشانگر ISSR در آمریکا (De Leon and Walker, 2004).
مطالعه تنوع ژنتیکی دو گونه از مگس‌های جنس Mayetiola از خانواده Cecidomyiidae در تونس (Mezghani Khemakhem et al., 2005).
بررسی کاربرد نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی درون و بین گونه ای مگس‌های خانواده Simuliidae (Dusinsky et al., 2006).
کاربرد نشانگر ISSR در بررسی چندشکلی پروانه‌های خانواده Noctuidae (Hundsdoerfer and Wink., 2005).
کاربرد ISSR-PCR در فیلوژنیHyles euphorbiaecomplex از پروانه‌های خانواده Sphingidae (Hundsdoerfer et al., 2005).
مطالعه ساختار جمعیت‌های وحشی و نیمه اهلی کرم ابریشم Antherae mylitta با نشانگر ISSR (Kar et al., 2005; Liu et al., 2010).
تنوع ژنتیکی آفت سوسک کرگدنی خرما Oryctes rhinocerus از خانواده Scarabaeidae با نشانگر ISSR (Manjeri et al., 2011).
بررسی تنوع ژنتیکی کرم ابریشم دارای دیاپوز و فاقد دیاپوز با نشانگر ISSR و همراهی آن با برخی صفات اقتصادی در هند (Reddy et al., 1999; Velu et al., 2008; Chatterjee and Mohandas, 2003; Liu et al., 2010; Awashti et al., 2008).
ارزیابی ژنتیکی کرم ابریشم اری Samia Cynthia ricini و ردیابی جایگاه‌های مرتبط با کمیت و موقعیت جغرافیایی در هند (P--eep et al., 2010; Liu et al., 2010).
بررسی نژادهای مختلف زنبور عسل مقاوم و حساس به کنه Varroa در امارات (Al-OItaibi, 2008; Paplauskiene et al., 2006).
در بخش کنه‌شناسی نیز مطالعات محدودی صورت گرفته است:
کاربرد نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی کنه Tyrophagus putrescentiae از خانواده Acaridae (Zhu et al., 2010)
آنالیز ژنتیکی زنبور Bombus hypocrita با بهینه کردن نشانگر ISSR (Geng et al., 2009)
2-15- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمرازواکنش زنجیره‌ای پلیمراز یک روش سریع، آسان و نامحدود (Powledge, 2004) سنتز آنزیمی DNA در محیط بی‌جان است که در برگیرنده‌ی فرایندی از سیکل‌های تکراری با مرحله‌های مشخص و تعریف شده در هر سیکل است (معتمدی، 1385).


در این فرایند که تقلیدی از فراین همانند سازی DNA در طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده‌‌ی دو انتهای قطعه مورد نظر DNA هستند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‌گیرند تا واکنش آنزیمی همانند سازی DNA در درون لوله‌ آزمایش امکان‌پذیر شود. این همانند سازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‌های پلیمراز صورت می‌گیرد (نقوی و همکاران، 1388).
فصل سوممواد و روش‌ها3-1- جمع آوری نمونه‌هابرای انجام بررسی‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی توده‌های زنبور عسل برخی از نواحی ایران، از پنج استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان، فارس (شکل 3-1 و جدول3-1)، از بین زنبوردارانی که کوچ خارج از استان نداشته، دارای بیش 50 کلنی و حدود سه سال یا بیشتر سابقه زنبورداری داشتند به صورت تصادفی از 5-3 کلنی، زنبور کارگر نمونه‌ برداری انجام شد. نمونه برداری در فروردین و اردیبهشت 1391 انجام شد. از هر کلنی 50 زنبور کارگر به صورت تصادفی توسط اسپیراتور جمع آوری شده و نمونه‌ها به ظرف حاوی یخ منتقل و تا زمان انتقال به آزمایشگاه نگهداری شدند (شکل 3-2).

شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل:1- خوزستان 2- کردستان 3- مرکزی 4- اصفهان 5- فارسجدول3-1: مکان‌ و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسلمکان زنبورستان شماره 1 زنبورستان شماره 2 زنبورستان شماره 3
استان خوزستان شوش، ایستگاه راه آهن شوش، ایستگاه راه آهن شوش، روستای جریه
استان کردستان روستای نشور (احمد کر) روستای قلیان منطقه کتوش (پدیسار) روستای برازان(نباتی)
استان مرکزی نظم اباد(مختاری) جاده فراهان، پارک جنگلی (رفیعی) سنجان، شهرک نبئی (تقوایی‌نژاد)
استان اصفهان نجف اباد، جاده پولادشهر (شاطری) نجف اباد، جاده پولادشهر (بی نام) نجف اباد، جاده پولادشهر (بی نام)
استان فارس کفترک، بونک اول (حکمت روستا) کفترک، بونک اول (زارع) جاده سروستان روستای مهارلو (کاووس روستا)

شکل3-2: نمایی از مکان‌های جمع آوری نمونه‌های زنبور عسل3-2- استخراج DNA زنبور عسلروزانه از 10 نمونه حشره کامل به صورت زیر DNA استخراج شد:
1- جداسازی بال حشرات و خرد کردن بدن کامل یک حشره کامل ماده درون ازت مایع و انتقال آن به میکروتیوب 7/1 میلی‌لیتری.
2- اضافه کردن 400 میکرولیتر بافر استخراج و 40میکرولیترSDS 20 درصد و قرار دادن در حمام آب گرم (شکل 3-3) 65 درجه سلیسیوس به مدت 2 ساعت با تکان‌های چند دقیقه ای در طول 2 ساعت.

شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات بافر استخراج حاوی موارد زیر است:
Tris-HCl…..10mM
EDTA…...….2mM
NaCl…...…0.4mM