—85

3-3-7- رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ28
3-3-8- جذب آب28
3-3-9- شمارش باکتری ساقه و محلول گلجای28

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

3-3-10- فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)28
3-3-11- فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز (SOD)29
3-4- تجزیه و تحلیل داده‌ها29
فصل چهارم: نتیجه گیری
4-1- عمر گلجایی31
4-2- کاهش وزن تازه گل32
4-3- درصد ماده خشک33
4-4- قطر گل34
4-5- کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS)35
4-6- میزان پروتئین گلبرگ36
4-7- میزان کاروتنوئید گلبرگ37
4-8- جذب آب38
4-9- جمعیت باکتریایی در ته ساقه39
4-10- جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌ها40
4-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز41
4-12- فعالیت آنزیم پراکسیداز42
فصل پنجم: بحث
5-1- بحث45
5-2- نتیجه‌گیری50
5-3- پیشنهادها50
منابع51

فهرست شکل‌ها
عنوانصفحه
شکل 1-1- گل ژربرا3
شکل 1-1-2- روند رشد و اثرات بروز پیری در مراحل نمو گل9
شکل 3-1- گل‌های شاخه بریده‌ی ژربرا در مرحله‌ی برداشت22
شکل 3-2- چیدمان طرح آزمایشی23
شکل 3-3- اندازه‌گیری وزن تر شاخه گل25
شکل 3-4- اندازه‌گیری قطر گل‌ها26
شکل 3-5- رفراکتومتر دستی (مدل N-1)27
شکل 3-6- اندازه‌گیری پروتئین گلبرگ27
شکل 3-7- اندازه‌گیری رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ28
شکل 4-1- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا31
شکل 4-2- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر کاهش وزن تر گل‌های شاخه بریده ژربرا32
شکل 4-3- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر وزن درصد ماده خشک گل‌های شاخه بریده ژربرا33
شکل 4-4- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا34
شکل 4-5- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر روی کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS) هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا35
شکل 4-6- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان پروتئین گلبرگ گل‌های شاخه بریده ژربرا36
شکل 4-7- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان کاروتنوئید گل‌های شاخه بریده ژربرا37
شکل 4-8- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان جذب آب گل‌های شاخه بریده ژربرا38
شکل 4-9- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در ته ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا39
شکل 4-10- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا40
شکل 4-11- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز گل‌های شاخه بریده ژربرا41
شکل 4-12- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل فعالیت آنزیم پراکسیداز گل‌های ساقه بریده ژربرا42

فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول 4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازه‌گیری شده در گل‌های‌شاخه‌بریده‌ژربرا43

چکیده
این مطالعه به منظور بررسی اثر نیکل بر عمر پس از برداشت گل ژربرا در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. گلهای سالم ژربرا ((Gerbera jamesonii cv. ‘Intense’ از یک تولید کننده تجاری خریداری گردید و فوراً به آزمایشگاه بخش باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد رشت منتقل شد. گلها روی ارتفاع 50 سانتیمتری باز برش شد و در گلدان پلاستیکی دو لیتری محتوی محلول های مختلف نیکل برای 24 ساعت قرار گرفت. تیمار پالس شامل محلول نیکل ( 10، 20 و 30 میلی گرم بر لیتر)، سولفات و نیترات نیکل (10، 30 و 50 میلی گرم بر لیتر) بود. برای شاهد از آب مقطر استفاده شد. بعد از این دوره محلول پالس با 500 میلی لیتر محلول 3% ساکارز به علاوه 200 میلی گرم در لیتر 8-هیدروکسی کینولین سولفات جایگزین گردید. عمر گلجایی، کاهش وزن تر، درصد وزن خشک، جذب آب، شمارش باکتری های ته ساقه و محلول نگه دارنده، ، کاهش درجه بریکس و قطر گل ها، پروتئین و کارتنوئید گلبرگ ها و فعالیت آنزیم های سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز اندازه گیری شد. نتایج نشان می دهد که نیترات نیکل سبب ایجاد بیشترین میزان از عمر گلجایی (11 روز)، پروتئین ( 14%)، فعالیت سوپر اکسید دسموتاز (21/135میکرومول بر گرم ‎وزن تر) و پراکسیداز (3/6میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) گردید. سولفات و نیترات نیکل به ویژه در غلظت‌های 30 و 50 میلی‌گرم بر لیتر اثرات مفید مشابه بر عمر پس از برداشت گل‌ها داشتند. بنابراین نیکل این پتانسیل را دارد که به عنوان یک عامل نگهدارنده عمر پس از برداشت عمل کند. مطالعات بیشتر می‌تواند به روشن‌تر شدن جنبه‌های مختلف این تأثیر کمک کند.
واژگان کلیدی: عمرگلجایی، ژریرا، نیکل، سولفات نیکل، نیترات نیکل (II)

فصل اول
کلیات

1-1- مقدمهژربرا (Gerbera jamesonii) از خانواده آستراسه یکی از معروف‌ترین گلهای شاخه بریده، در جهان محسوب می‌شود. ژربرا اولین بار توسط گیاه شناسی به نام روبرت جیمسن در سال 1884 در آفریقای جنوبی کشف گردید. جنس ژربرا در حدود 30 گونه وحشی دارد که در مناطق آفریقا، آمریکای جنوبی و قسمت‌های گرمسیری آسیا گسترده اند (بنایی و همکاران،2013). به طور کلی ژربرا گیاهی است حساس به سرما با ریشه هایی عمیق که چند ساله محسوب می‌شود. گل آذین ژربرا از سه نوع گلچه، گلچه‌های شعاعی (در قسمتهای حاشیهای گل)، گلچههای موجود در قسمت صفحه مرکزی و گلچههای حد واسط تشکیل شده است. این گلچه‌ها به صورت شعاعی و فشرده کنار یکدیگر قرار گرفتهاند (شکل1-1). امروزه بیشتر ارقام تجاری ژربرا از تلاقی مصنوعی گونه‌های G.jamesonii و G.viridifiolia بدست آمده‌اند که هر دوگونه بومی آفریقای جنوبی می باشند. شهرت این گل به علت تنوع رنگ گلبرگ‌هایش و اندازه بزرگ گل‌هایش (در واقع گل آذین) می‌باشد. در صنعت گل‌کاری به صورت تک‌شاخه بریده و یا به صورت دسته گل و هم به صورت گل خشک کاربرد و طرفدار دارد (نایر و همکاران 2003). بیشتر برنامه‌های بهنژادی این گل در کشور هلند انجام می‌شود (برمر، 1994).
1086817671167گل ژربرا در رنگ‌های مختلف; زرد، صورتی، نارنجی، قرمز، سفید، کرم و بنفش یافت میشود. قطر گل‌ها 5 تا 12 سانتی متر و طول ساقه حدود 25 تا 60 سانتی متر و دارای انواع کم پَر و پُر پَراست(کافی و قهساره، 1390).
شکل 1-1- گل ژربرا

1-1-1-تاریخچه ژربرازیستگاه گونههای مهم این گل محدود به قسمت‌های شرقی آمپومالانگا و بخش‌های ایالت لیمپوپو در آفریقای جنوبی است. ژربرا در سال 1878 نزدیک منطقه باربرتون کشف شد و به همین دلیل در زبان انگلیسی به آن مینای باربرتون یا مینای ترانسوال می گویند. روبرت جیمسون این گیاه را به باغ گیاه شناسی کمبریج در انگلستان فرستاد و فردی به نام لینچ آن را کشت کرد. بر اساس گزارشات موجود این گیاه ابتدا در باغ نورویچ و سپس در باغ کیو توسط آقای تیلت به گل نشست اما اولین کسی که در اروپا موفق به دورگه‌گیری این گیاه شد، لینچ بود او این گیاه را با; Gerbera virdifolia تلاقی داد در نتیجه این تلاقی اولین ژربرا فلوریست خلق شد، این ژربرا Gerbera cantabrigiensis نام گذاری شد، لینچ واریته Brilliant را از تلاقی Natal معروف به Sir Michael Forster و Gerbera jamesonii تولید کرد، البته دو رگه‌گیری این گونه تاریخچه ای طولانی دارد با این حال به دلیل ویژگی‌های هتروزیگوتی بالا هنوز بذرهای تثبیت شده‌ای از این گیاه به دست نیامده است. لینچ، آدنت و ویل مورین هریک به طور جداگانه توانستند تغییراتی در رنگ گلهای Gerbera jamesonii که به طور وحشی می‌رویید، ایجاد کند. طبق گزارشات هیبرید های رنگی اصلاح شده توسط لینچ نسبت به واریته های فرانسوی اصلاح شده توسط آدنت بذرهای بیشتری تولید می کرد. این دو محقق در سال 1891 اولین گواهی بذر پایه را از انجمن باغبانی سلطنتی انگلستان دریافت کرداند و در سال 1904 نمونه ای از واریته‌های تولیدی را در لندن عرضه نمودند. آدنت در ریویرای فرانسه تعداد زیادی رقم به دست آورد و لینچ نیز بذرها و گیاهان خود را با وی مبادله کرد قبل از این رویداد آدنت تقریبا کارهای اصلاحی خود را با Gerbera jamesonii آغاز کرده بود و گیاهانی به رنگ قرمز کم رنگ در آفریقا تولید کرده بود وی به نتایج تلاش‌های خود اطمینان داشت و کارهای اصلاحی خود را در ریویرا مشابه باربرتون زیستگاه ژربرا ادامه داد. دییم آلمانی به همراه آدنت عهده‌دار کارهای دو رگه‌گیری شد که موفقیت آمیز بود، تا سال 1909 تلاقی های اصلاحی توسط آدنت با بیش از 3000 بار گرده افشانی هیبریدهای انگلیسی و تلاقی با گونههای آفریقایی اصلاح شده انجام شد. این ادعا با معرفی گیاهان والد و ویژگی‌های آن‌ها قابل استناد است به این ترتیب تا بهار سال 1909 تحت شرایط سخت گزینش کشت 25000 هیبرید انتخاب شده بود، در این زمان آدنت امیدوار بود حداقل پس از چند نسل بذرهای پایداری تولید شود وی در همان زمان تاکید کرد که گیاهان به طور قابل ملاحظه‌ای از نظر رنگ و شکل متنوع هستند این ویژگی امروزه کاملا مستدل شده است، بنابراین به طور قابل توجهی مانع از تولید ژربرا از طریق کشت بذر می‌شود.
در سال 1909 والتر در نشریه جدیدترین ارقام آدنت را به صورت گلهایی با اختلاف بسیار زیاد در رنگ به قطر 13 سانتی متر و طول ساقه‌هایی به اندازه 50 تا 60 سانتی متر با ماندگاری شش تا هشت روز معرفی می‌کنند، طبق گزارشات دییم عملکرد قلمه بین 36 و 60 گل در گیاه با قابلیت نگه‌داری تقریبا دو هفته ارزیابی شده است. در سال 1906 برای اولین ژربرا به خودی خود از طریق جوانه زنی بذر تکثیر شد. جینک در سال 1897 فرصتی برای ازدیاد و اصلاح ژربرا در نیویورک یافت. در پاییز 1908 رقمی به نام Gigantea به بازار معرفی شد، این گل قطری به اندازه 12 سانتی متر به رنگ سرخ و ساقه‌هایی به طول یک متر داشت تناوب گلدهی در این رقم بسیار زیاد بود و برای اولین بار در سال 1909 موفق به دریافت گواهی بذر پایه شد در این دوره زمانی ژربرا همواره به دلیل دریافت جوایز ارزشمند ملی و بین المللی توسط انجمن‌های باغبانی برای مثال در سال 1904 در شهر دوسلدرف آلمان در همان سال و 1907 در لندن، 1909 در برلین و پاریس بسیار مورد توجه قرار گرفت بیشترین جوایز در تاریخ صنعت گل کاری به اصلاح این گل اختصاص داشته است (هانسن، 1999).
1-2- تکثیر
طریقه تکثیر گل ژربرا عمدتا به سه روش انجام می‌شود: تکثیر بوسیله بذر، تقسیم بوته و کشت بافت. تقسیم بوته در اواخر بهار یا پاییز صورت می‌گیرد. نکته مهم این است که قسمت مریستمی روی خاک قرار گیرد و زیر خاک مدفون نشود. افزایش با بذر هم امکان‌پذیر است. بذرها باید تازه باشند زیرا زیوایی بذرهای مانده کاهش می‌یابد. از آنجا که ژربرا بومی مناطق گرمسیری است و حساس به سرما، بذرها برای تندش نیاز به دمای حداقل 15 درجه سانتیگراد دارند. بذرها در طی دو هفته تندش می یابند. مشکل افزایش بذری تفرقه صفات و عدم یکنواختی گل‌های تولیدی است. امروزه یکی از پرکاربردترین روش‌های افزایش ژربرا از طریق کشت بافت است (راویانت، 2009). مشاهده شده که کاشت ژربرا از اواخر اردیبهشت تا اواخر تیر ماه، گل بریدهی زیادی تولید میکند اما محصول زمستانه خوبی میتواند از طریق کاشت از مهر تا اسفند در شرایط حفاظت شده حاصل شود. برای ارقام گل درشت تراکم کاشت بهینه هشت تا ده گیاه در مترمربع است. این تراکم، نور کافی را برای گیاهان فراهم میکند. اما کاشت متراکمتر بعد از دو سال باعث کاهش عملکرد، کاهش اندازه گل و طول ساقهی گل میشود. در زمان کاشت طوقه گیاه باید در سطح خاک و کمی بالای آن قرار گیرد چون ژربرا به مقدار زیادی در سطح خاک منشعب میشود. کاشت خیلی عمیق باعث بیماری قارچی و کاشت سطحی باعث سست شدن سیستم ریشهای میشود (رشیدی، 1389).
گلدهی گیاهچههای کشت بافتی 11 تا 16 هفته بعد از انتقال آن‌ها صورت می گیرد. اولین جوانه‌های گل هنگامی که 14- 10 برگ تشکیل شدند نمایان می‌شوند. القا و تمایزیابی گلها به میزان زیادی توسط شدت نور و دما تاثیر می‌پذیرند. تقریبا در تمام طول سال گل می دهند اما روز کوتاه طبفه بندی می‌شوند. دوره گلدهی این گیاه اواخر بهار تا اواخر پاییز و اوایل زمستان است (بروهولم و همکاران ، 2008).
1-3- عملکردمیانگین متوسط تولید در حدود 160- 130 گل به ازای هر متر مربع در سال است (شرایط سایه). در گلخانه تا 200 شاخه گل هم می‌توان تولید نمود اگر همه شرایط بهینه باشد. از هر بوته می‌توان 15- 10 شاخه گل در سال برداشت کرد (راویانات، 2009).1-4- نابسامانی های فیزیولوژیک1-4-1- خمیدگی و شکستن ساقه گل این نابسامانی نتیجه رشد و بلوغ ناکافی ساقه گل می‌باشد که نهایتاً سبب افتادن ساقه می‌شود. دلایل مختلفی می‌تواند سبب بروز این حالت گردد از جمله کمبود عناصر غذایی و نسبت نامناسب آن‌ها از جمله کلسیم گاهی اوقات کاهش آبیاری و تنش خشکی یا افزایش دما به ویژه با تابش آفتاب ممکن است سبب پژمردگی و شکستن ساقه شود. آبیاری بهینه، توجه به نیازهای تغذیه‌ای گل‌ها و دمای مناسب پرورش می‌تواند سبب بهبود این حالت و جلوگیری از آن گردد.
1-4-2- پژمردگی گل نابالغپژمردگی قبل از بلوغ گل در حالیکه شاخه هنوز به گیاه متصل است و اغلب درست زمانیکه بهطور کامل توسعه یافته است، اتفاق میافتد. دلیل این مشکل احتمالا، نبود کربوهیدراتهای لازم برای دستیابی به نمو سریع گل است. این عارضه اغلب پس از یک دوره از روزهای ابری با شدت پایین نور یک روز آفتابی اتفاق میافتد. در صورت امکان باید ارقام مقاوم به این عارضه غربالگری و کشت شود (هنسان، 1985).

1-5- آفات و بیماری‌ها لارو برخی حشرات که از برگ تازه تغذیه می‌کنند، کنه (Cyclamen mite و Spider mite)، حلزون و لیسه، تریپس و شته‌ها از جمله آفات این گیاه می باشند. بیماری‌های قارچی متداول مانند: بوتریتیس، سفیدک پودری، فایتوفتورا و ریزوکتونیا هم از جمله بیماری‌های مرسوم و تهدید کننده می‌باشند (رشیدی، 1389).1-6- بیان مسالهگل‌های شاخه بریده سهم مهمی از صنعت تولید و پرورش گل‌ها و گیاهان زینتی را تشکیل می‌دهند. آنچه در رابطه با این قسمت از صنعت گل‌کاری بسیار اهمیت دارد عمر گلجایی (Vase-life) است. هر چه این ویژگی طولانی تر باشد احتمال سود دهی تولید و پرورش آن گل بیشتر می‌شود. عمر گلجایی به عوامل متعددی در طول دوره کاشت، داشت و برداشت وابسته است. اما از دیدگاه پس از برداشت، در صورت بهینه بودن شرایط تولید و همچنین تأمین دما و رطوبت مناسب برای نگهداری گل‌های شاخه بریده عمر گلجایی آن‌ها به چند عامل از جمله وجود منابع در دسترس کربوهیدرات به میزان کافی، گاز اتیلن و جمعیت باکتریایی موجود در محلول نگهداری گل‌ها بستگی دارد (رید و جیانگ، 2012). اگرچه تمام گونه‌ها به صورت یکسان تحت تاثیر این عوامل قرار نمی‌گیرند اما تمامی آن‌ها از نقطه نظر پس از برداشت مهم اند. منابع کربوهیدرات از این نظر که منبع تامین انرژی گیاه اند چون گل‌های شاخه بریده، از گیاه مادری تامین کننده جدا شده اند، گاز اتیلن از این دیدگاه که محرک و تسریع‌کننده فرآیند پیری است اگرچه ژربرا حساسیت زیادی به آن ندارد و جمعیت باکتری‌های موجود در محلول نگهدارنده و ته ساقه گل‌ها، به این خاطر که می توانند سبب گرفتگی آوندها و مرگ زودرس سلول‌های گیاهی شوند (گوپینادهان و همکاران، 2008). از طرف دیگر عنصر نیکل اثر بازدارنده بر متابولیسم کربو هیدرات‌ها، ترکیبات نیتروژن‌دار، گاز اتیلن و پاتوژن‌ها دارد (وود و ریلی، 2007).
هدف از انجام این پژوهش این بود که اثر نمک‌های مختلف نیکل بر عمر گلجایی و شاخص‌های پس از برداشت گل‌های شاخه بریده ژربرا بررسی شود و بهترین نمک با بالاترین اثر تعیین گردد.
فصل دوم
بررسی منابع

2-1- استانداردها و عوامل موثر بر عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریدهپس از برداشت گل‌های شاخه بریده آنچه اهمیت حیاتی دارد حفظ کیفیت گل میباشد. برای عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده استانداردهایی موجود است که بین نقاط مختلف دنیا مثلا در آسیا یا در اروپا متفاوت است. به هر حال، رنگ، اندازه، عطر و ظاهر گلهای شاخه بریده این استانداردها را می‌سازند که آنها هم به شرایط کشت، زمان مناسب برداشت، شرایط حمل و نقل و نگهداری پس از برداشت وابستهاند. جذب آب به میزان مناسب توسط گل شاخه بریده، تبخیر و تعرق، هدایت هیدرولیکی در آوندها همگی بر عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریده موثراند. (سیلوا، 2003).
2-1-1- متابولیسم و مسیرهای متابولیکیمتابولیسم سلولی، مجموعه واکنشها و فعالیتهای شیمیایی است که در درون سلولها رخ میدهد جذب کربن و ذخیره انرژی (فتوسنتز) و استفاده از این انرژی ذخیره شده و سوختن آن (تنفس) دو فرآیند مرکزی هستند که به طور کلی در گیاهان متابولیسم را کنترل می‌کنند (سیلوا، 2003).
پیری و ریزش
(PCD)مرگ برنامه‌ریزی شده سلول
آغازش
مرگ
رشد
بلوغ
بلوغ فیزیولوژیکی
رسیدن
تخریب غشاء
نکروزه شدن وعلایم قابل مشاهده
(پژمردگی و چروکیدگی)
آسیب سرمازدگی
1)برفرایندهای متابولیک(تنفس، سنتز پروتئینها و ...
2)نشت یونها از طریق غشاء
3)جاری شدن پروتوپلاسم
تغییرات فیزیکی در لیپیدهای غشاء
تجزیه آنزیمها و پروتئینها
اثرات
پیامدها

شکل 1-1-2- روند رشد و اثرات بروز پیری در مراحل نموگل

2-1-2- پیری، ریزش و مرگ سلولیپیری و مرگ دو فرآیند مهم در چرخه زندگی یک موجود زنده محسوب می‌شوند؛ فرآیندهایی که در طی آن مواد و ساختارهای سلولی می‌شکنند و از درون بافت در حال پیری خارج و متابولیزه می‌شوند. پیری ارگآن‌هایی مثل برگ با مرگ برنامه ریزی شده سلولی متفاوت است. سلولها در ارگانهای پیر شونده یک سری تغییرات تدریجی منظم و فروپوشاننده را تجربه می‌کنند هستهها حداقل تا آخرین مراحل تغییرات ساختاری نشان نمی‌دهند (نودن، 1997). پیری کل گیاهی، پیچیدهترین نوع پیری است که اغلب به وسیله ساختارهای زایشی القا می‌شوند. هورمون‌ها به ویژه سایتوکنین در کنترل این نوع پیری بسیار موثراند. جبرلین کنترل کننده پیری در نوک مریستم است در حالی که اتیلن باعث پیری برگ و گلبرگ‌ها می‌شوند و نهایتا سبب خشک شدن گلبرگ‌ها، ریزش گلچهها، پژمردگی و تغییرات رنگ می‌شوند (دیویس،2002).
2-1-3- پیری گلبرگهادر گلبرگ، گلهای شاخه بریده که در حال پیر شدن هستند میزان پروتئین کاهش می یابد، فعالیت آنزیم شکننده پروتئین ها یعنی پروتئاز افزایش می یابد، سیالیت غشا تغییر پیدا می کند و شدت تنفس افزایش می‌یابد (ون دورن و استید، 1997). پیری گلبرگها همراه با کاهش کیفیت مرفولوژیک، بیوشیمیایی و بیوفیزیولوژیک است. گلهای میخک در حال پیری، یک افزایش فراز گرا در تولید اتیلن نشان می دهد و قرار دادن آنها در برابر اتیلن سبب پیچیده شدن گلبرگ‌ها، آغاز افزایش سنتز اتیلن و تغییرات فیزیکی و شیمیایی در چربیهای غشای سلولی گلبرگها می‌شود (بارتولی و همکاران، 1996). داوودی یک گونه نافرازگرا است، اتیلن نقش پر رنگی در پیری گل ندارد و سبب تغییرات جزیی در غلظت پروتئین و نسبت پلی پپتیدهای غالب می‌گردد، همین موضوع علت عمر پس از برداشت طولانی داوودی می‌باشد. واکنش گل ژربرا نیز مشابه داوودی است و اتیلن تاثیر شگرفی بر پیری آن ندارد. شرایطی که سبب جلوگیری از عمل اتیلن (مثلا: کاربرد نمک‌های نقره، بنزئات سدیم، اسید بوریک) و یا سنتز آن مثلا آمینوکسی استیک اسید (AoA) و نمک‌های نیکل گردد می تواند به طور بالقوه سبب افزایش عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریده و به ویژه گونههای فراز گرا گردد (سیلوا، 2003).
2-1-4- آب و نقش آن در عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریدهکیفیت آب، برای نگهداری گلهای شاخه بریده بسیار اهمیت دارد. تأمین دایمی آب، که در زمان برداشت گل منقطع می‌شود، برای نمو فیزیکی گل شاخه بریده موثر است. بخشی از نمو فیزیکی، به وسیله فشار تورژسانس مثبت میسر می گردد که سبب انبساط سلول و پشتیبانی آن‌ها می‌شود. پتانسیل آب از فشار تورژسانس و پتانسیل اسمزی تشکیل می‌شود. در گیاهان در شرایط عادی (در حال رشد روی ریشه‌های خود) آب موجود در آوند چوبی تحت تنش است به علت کشش حاصل از تبخیر و تعرق که آن هم حاصل افزایش دما و کاهش رطوبت نسبی می‌باشد. آب از آوند چوبی در اثر شیب اسمزی به درون سلول‌ها وارد می‌شود. اگر پتانسیل آب سلول از پتانسیل آب سلول‌های مجاور کمتر باشد از این سلول‌ها آب بیرون کشیده می‌شود که نتیجه آن چروکیدن و جمع شدن سلول است (سیلوا، 2003). در سطح مولکولی/ بیوشیمیایی پروتئین‌های آکواپورین که سبب جریان دو طرفه آب در غشای سلول بافت‌ها و حتی ارگان‌ها می‌شوند در عمر پس از برداشت گلها موثراند (تایرمن، 1999). آب تمیز و خالص از پیش نیازهای عمر پس از برداشت بهینه گلهای شاخه بریده است. کاهش کیفیت و عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده ممکن است به وسیله انسداد آوندهای چوبی رخ دهد. از دلایل آن موارد زیر می‌باشد: رشد میکروبی، رسوب موادی مثل ترکیبات موسیلاژی در حفرات دستجات آوند چوبی، ایجاد تیلوز (ساختاری شبیه بالون که به وسیله رشد سلول‌ها در مکانهای ارتباط سلول‌های آوندی ایجاد می‌شوند)، وجود حباب هوا درون سیستم آوندی، پاسخ‌های فیزیولوژیک ساقه به برش و مرگ برنامه‌ریزی شده سلول (ون دورن و کروز،2000).

2-1-5- میکرو ارگانیسم ها در محلول نگهداری گلها
آب خالصی که در گلدان نگهداری وجود دارد بعد از مدتی به وسیله باکتری‌ها یا قارچ‌ها که روی بافت گیاهی وجود دارد و تکثیر می‌شوند، آلوده می‌گردد. ارگانیسم‌ها سبب تولید یا القای ترکیباتی مثل تانن‌ها در آوندها می‌شود که همین موضوع سبب انسداد آوندی می گردد. برای جلوگیری از چنین پدیده‌ای، در پژوهشهای مختلف مواد متفاوتی آزمایش شدهاست. از جمله مواد تست شده که سبب بهبود عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده از جمله ژربرا میشوند شامل: تیوسولفات نقره، دیکلروفن، ترکیبات آمونیوم چهارظرفیتی، 8- هیدروکسی کینولین سیترات و ترکیبات کلاته کننده می‌باشد (ایشیمورا، 1999).
لیو و همکاران (2000) نشان دادند که کاربرد 2/0 میلی مولار از تیو سولفات نقره STS)) برای دو ساعت در حدود ده روز طول عمر گلهای شاخه بریده رز را افزایش داد. محمودی و همکاران (2012) نشان دادند که کاربرد کلرید کبالت در غلظت‌های 200، 300 و 400 میلی گرم بر لیتر می‌تواند سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای مریم شود آن‌ها نتیجه گرفتند که کاربرد کلرید کبالت در غلظت 300 میلی گرم بالاترین اثر را بر افزایش عمر پس از برداشت گلها، جذب آب و کاهش وزن تر داشت. منشی‌زاده و همکاران (2011) گزارش کرده‌اند که کلرید کبالت می‌تواند سبب کاهش زردی گلچههای گل مریم و پژمردگی آنها شود.
کاربرد نمک سیلیسیم (K2SiO3) با غلظت‌های 100، 150 و 200 میلی گرم بر لیتر سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده میخک گردید (جمالی و راحمی،2011 ). یکی از دلایل، شاید افزایش مقاومت غشای سلولی به وسیله ته نشین شدن سیلیسیم در آن باشد. این عنصر این توانایی را دارد که با ترکیبات آلی درون دیواره سلولی کمپلکس تشکیل بدهد و به این وسیله غشای سلولی در برابر آنزیم های تخریب کننده مقاومت بیشتری می‌یابند (سیندر و همکاران، 2007). کتسا و همکاران (1994) گزارش کردند که استفاده از نیترات نقره درمحلول نگه دارنده گل شاخه بریدهارکیده بهعنوان عامل ضد میکرب عمل میکند. اضافه نمودن نیترات کلسیم به محلولهای محافظ طول عمر دو رقم رز را یک تا سه روز افزایش داده و شکوفایی غنچهها را بهبود بخشید. همچنین محلول های حاوی دو میلی مول در لیتر کلسیم از هر دو منبع کلرید کلسیم و نیترات کلسیم باعث افزایش ماندگاری رز رقم ایلوانا گردید (ادریسی،1387). مقایسه اثر نمک های معدنی مختلف نشان داد که ترکیبات مس بویژه نیترات مس بیشترین تاثیر را روی کیفیت وماندگاری میخک دارد (ادریسی، 1384). استفاده از تیمارهای موقت سولفات مس، هیدروکسی کینولین سولفات و کلرید کبالت بیشترین تاثیر را بر کیفیت گل شاخه بریده میخک داشتند و تیمار کلرید کبالت بیشترین طول عمر را نیز به دنبال داشت (ادریسی و همکاران، 1382). کاظمی و همکاران (2012) تاثیر سیلیکون و نیکل و استیل استیک را بر عمرگلجایی رز بررسی کردند و نتیجه گرفتند که بر افزایش طول عمر گل شاخه بریده تاثیر مثبت دارد و باعث افزایش طول عمر می‌شود. مورالی و ردی، (1992) نشان دادند که کاربرد عناصر کبالت، کلسیم، روی و نیکل به همراه محلول ساکاروز دار سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده گلایول می‌گردد. تیمار کوتاه مدت جیبرلیک اسید با غلظت 50 میلیگرم بر لیتر به همراه محلول نگهدارنده اتانول 5/2 درصد و ساکارز سه درصد بیشترین تأثیر را بر خصوصیات کیفی و دوام عمر گل ژربرا داشت. همچنین، کاربرد مکرر اتانول نسبت به کاربرد اتانول فقط در ابتدای آزمایش، نتایج بهتری را درخصوص افزایش دوام عمر و خصوصیات کیفی گل ژربرا به همراه داشت (دانایی و همکاران، 1390). گلهای شاخه بریده مریم که در محلول ساکارز و کلرید نیکل قرار گرفته بودند عمر پس از برداشت طولانی تری نسبت به نمونه های کنترل داشتند (ردی و همکاران، 1997(.
2-2- نیکلحدود ششصد میلیون سال پیش، عناصر اصلی تشکیل‌دهنده اتمسفر کره زمین گازهای احیا کننده مانند هیدروژن، آمونیاک و متان بود. در این دوره، نیکل نقش مهمی در سوخت و ساز و موفقیت پروکاریوت‌های اولیه داشته است اما شرایط به آرامی به سمت ایجاد یک اتمسفر اکسنده تغییر یافت. این تغییر باعث جایگزین شدن عناصر روی، آهن، منگنز و مس به جای نیکل، وانادیوم و تیتانیوم گردید (وود و رایلی، 2007). در سال‌های اولیه قرن بیستم، نیکل به صورت جزئی از خاکستر گیاهی کشف گردید و شک و تردیدها در رابطه با این موضوع که نیکل نقشی در فرآیندهای متابولیکی گیاه دارد، به طور دائم وجود داشته است (بایی و همکاران، 2006). بین عناصر ضروری برای گیاهان، منحصر به فرد است به این دلیل که نقش‌های متابولیکی آن مدتی قبل از اثبات ضروری بودن این عنصر برای گیاهان مشخص شد (براون، 2007). احتمال ضروری بودن نیکل برای رشد گیاه زمانی مشخص گردید که در سال ١٩٧۵ پژوهشگران متوجه شدند که اوره آز، آنزیمی که به صورت عمومی درون گیاهان وجود دارد، برای فعال شدن نیازمند عنصر نیکل است. در واقع نیکل جزئی از آنزیم اوره آز است. به زودی مشخص شد که نیکل، برای حبوبات ضروری است (اسکیو و همکاران، 1984) و سپس برای برخی از غلات مناطق معتدله نیز ضروری بودن نیکل به اثبات رسید (براون و همکاران ، 1990). ضروریت این عنصر برای گیاهان عالی به وسیله براون و همکاران (1987) پیشنهاد شد. امروزه این عنصر به عنوان یکی از عناصر ضروری برای زندگی گیاهان شناخته می‌شود (مارشنر، 1999 ؛ سیرکو وبردزیک، 2000 ؛ گرداس و همکاران، 1999).
2-2-1- نقش نیکل در متابولیسم گیاه
در گذشته اوره آز تنها آنزیمی بود که برای نیکل، درون گیاه نقش یک عنصر "ضروری" را توجیه می‌کرد در حال حاضر هفت آنزیم نیکل‌دار مشخص شده است که دو عدد از این آنزیم‌ها (اوره آز و گلوسیلاز) فعالیت اکسایش/ احیا ندارند و پنج آنزیم دیگر در واکنش‌های اکسایش/احیا دخالت دارند شامل: متیل کوانزیم، ام ردوکتاز، نیکل سوپر اکسید دسموتاز، کربن مونو اکسید دهیدروژن، استیل کوانزیم آ سنتازو هیدروژناز (براون، 2007). این پیشنهاد که آنزیم‌های دیگری که حاوی نیکل هستند یا پروتئین‌های نیکل‌دار، درون گیاهان عالی وجود دارد با توجه به مشاهداتی بیان شده است که برخی از آنزیم‌های باکتریایی مشابه‌های موازی در گیاهان و حیوانات دارند، اما بر عکس علم آنزیم‌شناسی در باکتری‌ها، این شاخه علمی درون گیاهان هنوز در مراحل ابتدایی به سر می‌برد، پس به احتمال زیاد در آینده نزدیک آنزیم‌های دیگری درون گیاهان عالی کشف می‌شود که حاوی نیکل‌اند یا دست کم به نیکل نیازمند هستند.
2-2-1-1- یوروید
گیاهان عالی قسمت قابل توجهی از ترکیبات نیتروژن‌دار خود را به صورت یوروید یا آمید نقل و انتقال می‌دهند (شوبرت و بولوند، 1990). داده‌ها نشان می‌دهد که گونه‌های انتقال دهنده یوروید مانند گردوی آمریکایی نسبت به آنهایی که ترکیبات آمید انتقال می‌دهند نیاز به نیکل بالاتری دارند (وود ، 2006)، بنابراین این احتمال افزایش می‌یابد که گونه‌های انتقال دهنده یوروید ممکن است آنزیم‌های دیگری داشته باشند که نیازمند حضور نیکل باشد. حبوبات نواحی گرمسیری مانند سویا و همچنین گیاهانی مثل گردوی آمریکایی از جمله گیاهان انتقال دهنده یوروید هستند. اگرچه، اطلاعات چندانی در مورد کاتابولیسم و آنابولیسم یوروید درون گیاه موجود نیست (بایی و همکاران، 2006).
به نظر می‌رسد که متابولیسم یوروید در درجه اول درون تاج گیاه و میوه‌ها رخ می‌دهد (پیت و آتکینسن،1983). نتیجه نهایی کاتابولیسم یوروید تشکیل اوره و گلی اکسالیت است. پس با توجه به تولید این دو ماده، به نظر می‌رسد که حضور نیکل روی دسترسی گیاه به منابع نیتروژن ذخیره خود اثر گذار و حیاتی است. به طور کلی مسیر یوروید مهمترین مسیر برای حرکت نیتروژن از ریشه‌ها به نقاط رشد گیاه است پس نیکل برای تبدیل شکل ذخیره شده نیتروژن در دوران قبل از خفتگی ضروری است (بایی و همکاران ، 2006). مثال‌هایی از چندین جنس انتقال‌‌دهنده یورید: افرا ، توس، ممرز، گردوی امریکایی، ارغوان، چنار و بید.
2-2-2- افزایش شاخص‌های رشدپژوهش‌های ابتدایی برای مشخص کردن پاسخ‌های رشدی در گندم، سیب‌زمینی و باقلا با محلول پاشی برگی نیکل انجام گرفت که این تیمار اثرهای مثبت و افزایش‌دهنده‌ای بر فرآیندهای کلی رشد داشت (ولچ،1981 ؛ دوبرولیوبسکیو اسلاو ، 1957 ؛ روچ و بارکلی، 1946). بعد از کشف نیکل به عنوان جزئی از آنزیم اوره آز پژوهش‌های زیادی انجام شد که نشان‌دهنده نقش مثبت کاربرد نیکل بر رشد گیاه، افزایش سلامت غذایی، تندش بذر و عملکرد نهایی بوده است. موردی و آلی، (1999) در پژوهش خود نشان دادند که افزودن ٢۵ و ۵٠ میلی‌گرم نیکل به هر کیلوگرم خاک رس به صورت معناداری سبب افزایش عملکرد سبزی جعفری و کیفیت آن (سطح برگ٬ غلظت عناصر معدنی، عملکرد روغن و مزه) گردید و همچنین برگ‌ها برای مصرف توسط انسان سالم‌ترند زیرا غلظت نیترات و آمونیوم کمتری دارند. نیکل می‌تواند باعث افزایش عملکرد میوه و کیفیت آنها در گوجه فرنگی گردد (اوزو و همکاران ، 1999 ؛ پالاکویز و همکاران 1999، راو و شانتارون، 2000) نیکل اثر مثبتی بر افزایش وزن خشک گیاه گوجه فرنگی و غلظت آهن، روی و منگنز دارد.
گاد و همکاران (2007) نشان دادند که ٣٠ میلی‌گرم نیکل به ازای هر کیلوگرم خاک باعث افزایش عملکرد گوجه فرنگی می‌گردد، همچنین کیفیت ظاهری، در صد مواد جامد محلول و پارامترهای فیزیکی (طول، قطر،وزن، وزن خشک) را بهبود بخشید افزون بر این میوه‌ها میزان نیترات کمتری داشتند که باعث سلامت بیشتر میوه‌ها می‌گردد. شواهد موجود نشانگر اثر مثبت نیکل روی تندش بذرهاست؛ اندروود (1971) نشان داد که خیساندن بذرها پیش از کشت در محلول سولفات نیکل اثر معناداری بر افزایش تندش بذرهای نخود، لوبیا، گندم و کرچک دارد. ولف و برتراند (1973) نشان دادند که سولفات نیکل، اثرات مفیدی بر تندش بذر لوپن سفید دارد. غلظت‌های پایین نیکل می‌تواند تندش بذر ارقام جنس ارغوان را تحریک کنند و روی رشد دانهال حاصل از آن اثر مثبت دارد (سین، 1984). براون و همکاران، (1987) نشان دادند که بذرهای جو که در آنها نیکل حذف شده بود توانایی تندش را حتی در حضور منبع نیتروژنی به غیر از اوره نداشتند. تندش بذرهای تیموتی به وسیله غلظت‌های پایین نیترات نیکل تحریک می‌گردد (ویر، 1998). گزارش شده است که برگ گیاهان جنس آلیسوم که انباشتگر نیکل هستند هنگامی که خزان می‌کنند و می‌ریزند مانع از رشد گیاهان رقابت کننده می‌گردند (لان‌ژان و همکاران، 2007). مشاهده شده است که ٢ میلی‌گرم بر لیتراز نیترات نیکل یا سولفید نیکل باعث سرعت بخشیدن به تندش بذرهای گندم گردیده است (سنگار و همکاران، 2008).

2-2-3-تاثیر نیکل بر عمر پس از برداشتیون‌های نیکل اثر ممانعت کنندگی بر 1- آمینو سیکلوپروپان-1-کربوکسیلیک اسیداکسیداز (آ- سی-سی اکسیداز) دارد به این صورت که Ni2+ یک کمپلکس فلز- آنزیم می‌سازد (اسمیت و وودبرن، 1984). در یک مطالعه دیگر، محلول یک دهم درصد وزن در حجم از کلرید نیکل روی کاسه گل خرمالو رقم ‘Saijo’ دو مرتبه قبل از برداشت، محلول پاشی گردید. تیمار نیکل به گونه‌ای موثر جلوی نرم شدن میوه را گرفت و عمر انباری آن را افزایش داد که علت آن جلوگیری از تجمع ACC و تشکیل اتیلن بود (ژن و همکاران، 2006). اثر محدودکننده‌ای که نیکل بر تولید اتیلن درون گیاهان دارد، از این عنصر انتخابی مناسب برای بهبود عمر پس از برداشت محصولات باغبانی می‌سازد به ویژه در گل‌های بریدنی، که بدون نگرانی از تجمع این عنصر در غلظت‌های سمی می‌توان آن را به کار برد.
تیمار گل‌های میخک سولفات نیکل با غلظت 45 میلی گرم بر لیتر، توانست به گونه ای معنادار سبب بهبود عمر پس از برداشت آن‌ها در مقایسه با نمونه های شاهدگردید. بررسی ها نشان دادند که این گل‌ها به گونه ای معنادار اتیلن کمتری تولید کرده بودند و همین موضوع سبب بهبود عمر پس از برداشت آن‌ها گردید (جمالی و راحمی، 2011). همچنین کاظمی وعامری، (2012) گزارش کردند که کاربرد عنصر نیکل بر روی گلهای سوسن، سبب بهبود عمر پس از برداشت و شاخص‌هایی مثل نشت آنتوسیانین در آن‌ها گردید. از طرف دیگر عنصر نیکل اثر ممانعت کنندگی بر رشد پاتوژن ها دارد (کار و میشرا، 1974؛ گراهام و همکاران، 1985). پس به طور کلی نیکل با تاثیر گذاری بر عوامل مهمی مثل غلظت کربوهیدرات‌ها، تولید اتیلن و جمعیت پاتولوژی می تواند سبب بهبود عمر پس از برداشت گل‌ها شود.
2-2-4- علائم کمبود عنصرنیکل در گیاهان
بر اساس گونه، نیاز گیاه به نیکل جهت تکمیل چرخه رشد طبیعی در خاک‌های بدون آلودگی در حدود ٠۵/٠ تا ۵ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک گیاهی متغییر است (براون، 2007)، اما گیاهان انتقال دهنده یوروید نیاز بالاتری دارند تا حد ۵٠ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک (بایی و همکاران، 2006). در کمتر از این غلظت‌ها، نکروزه شدن نوک برگ‌ها به ویژه در خانواده لوبیا ممکن است رخ بدهد علت آن هم کاهش فعالیت آنزیم اوره آز و تجمع اوره در سطوح سمی در داخل گیاه است (اسکیو و همکاران، 1984). در برخی موارد، علائم کمبود می‌تواند شامل کاهش رشد ریشه و شاخساره باشد. کمبود نیکل می‌تواند باعث القای بیماری (گوش موشی) در درختان گردوی آمریکایی (پیکان) گردد، این بیماری یک نابسامانی فیزیولوژیکی است که در اثر کمبود نیکل در درختان گردوی آمریکایی ایجاد می‌شود. علائم این نابسامانی شامل تاخیر در باز شدن و کاهش سطح برگ، شکفتن جوانه‌ها به صورت ضعیف، زرد شدن برگ‌ها، ایجاد حالت کپه‌ای و بافت مردگی در نوک برگ‌ها. استفاده از کودهای حاوی نیکل در زمان مناسب (اواخر پاییز یا در اوایل بهار) با غلظت کافی سبب درمان این ناهنجاری و همچنین فرم شدید این بیماری که به نام بیماری واکاری باغ نامیده می‌شود می‌گردد (وود و همکاران، a2004). شیوع بیماری در نسل دوم باغ‌های جنوب شرق ایالات متحده افزایش یافته است، این بیماری هنگامی ظاهر می‌شود که نشاهای جوان در مکان‌هایی که قبلا باغ گردوی آمریکایی بوده است دوباره کشت می‌شوند. احتمال دارد وجود مقادیر زیادی عنصر روی و مس در خاک نیز سبب ایجاد این بیماری گردد. تجمع این فلزات در طی سال‌ها می‌تواند سبب از دسترس خارج شدن نیکل گردد و فرم شدید یا متداول این نابسامانی را سبب گردد. در حالت شدید، درخت دارای رشد بسیار کند، تاج کم پشت است و در نهایت مرگ درخت نیز ممکن است رخ دهد (وود و ریلی، 2007). همچنین از آن‌جا که نیکل اثر مستقیم یا غیر مستقیم روی متابولیت‌های ثانویه گیاه دارد، روشن است که احتمال حمله عوامل بیماری‌زا و آفت‌ها در کمبود نیکل گسترش می‌یابد. کمبود نیکل می‌تواند به صورت غیر مستقیم روی نقل و انتقال انرژی درون گیاهان موثر باشد (بایی و همکاران، 2006؛ وود و همکاران،b 2004).
2-2-5 - تجمع و سمیترشد بسیاری از گیاهان در غلظت‌های بیش از ۵٠ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک گیاهی نیکل صدمه می‌بیند. این اثرات در سطوح مرفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی بروز می‌کند و ممکن است به علت اثر مستقیم سمیت این عنصر باشد یا ممکن است ناشی از رقابت نیکل با سایر عناصر ضروری مانند کلسیم، منیزیم، آهن، و روی باشد و در نهایت موجب ایجاد کمبود مصنوعی و ثانویه آن‌ها گردد (اندرسون و همکاران، 1973). در مراحل ابتدایی سمیت نیکل نشانه‌های چشمگیر و روشن بروز نمی‌کند اما رشد ریشه و شاخساره ممکن است کند گردد (براون،2007). در حالت سمیت شدیدتر نیکل، زرد شدن برگ‌ها از گوشه‌ها که به سمت مرکز پیش می‌رود رخ می‌دهد که سپس قسمت‌های زرد نکروزه می‌شوند و در نهایت احتمال دارد گیاه از بین برود (براون، 2007). نیکل می‌تواند درون گیاهان تجمع یابد که در اغلب موارد کمتر از ١/٠ درصد وزن خشک گیاه است اگرچه گیاه Sepertia accuminata می‌تواند بیش از این میزان نیکل را تجمع بدهد (لی و همکاران، 1987).
در طی دوران رویشی، بیشتر نیکل به سمت برگ‌ها منتقل می‌شود و در آن‌ها تجمع می‌یابد اگرچه در زمانی که برگ‌ها به سمت پیری می‌روند بیشتر نیکل به علت خاصیت تحرک دوباره به سمت بذرها منتقل می‌شوند این مورد برای سویا (کاتاکلو و همکاران، 1987) و میمولوس (تیلستون و مکنیر، 1991) گزارش شده است. پراساد و همکاران، (1997) نشان دادند که نیکل درسنبل آبی قابلیت تجمع دارد. همچنین گیاه خردل هندی به عنوان یک گیاه انباشتگر مهم نیکل در نظر گرفته می‌شود (سین و همکاران، 2001). گیاهان دیگری نیز به عنوان تجمع‌دهنده نیکل در نظر گرفته می‌شوند مانند: گیاه سوییس وآلیسوم (کانینگهام و همکاران، 1995)، Sepertia acuminata (انسلس و همکاران، 1997) و سنبل آبی (سین و همکاران، 2001).
مرحله رشد و اندام در امر تجمع نیکل درون گیاهان موثراند. در درخت بلوط، در طی ٧٠ روز بعد از تندش بذر میزان نیکل به سرعت در طی ٣٠ روز اول افزایش یافت اما بعد از آن دچار کاهش آرام گردید (جم، 1968). دلیل دیگر این نوسان در تجمع نیکل، احتمالاً به علت فعالیت ریشه‌ها می‌باشد؛ سیستم جذب کننده نیکل و یا فعالیت متابولیکی بافت تجمع دهنده فلز درون بافت گیاهی نیز می‌توانند روی این امر تاثیرگذار باشد. در گیاه ذرت، برگ‌های جوان‌تر نسبت به برگ‌های پیرتر حاوی نیکل بالاتری هستند (مکلین و دکر، 1978). در گیاهان پامچال، شبدر سفید، الودیاو برگ عبائیعنصر نیکل در ابتدا در برگ‌ها و بعد در گل‌ها تجمع می‌یابد (راف و همکاران، 1991). تغییر فصلی در تجمع نیکل درون گیاه نیز گزارش شده است به عنوان مثال در گیاه پیچک نیلوفر (سنگارو همکاران، 2008).

فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- مواد گیاهیدر خرداد ماه سال 1392 گلهای شاخه بریدهی ژربرا که در مرحلهی تجاری (دارای دو ردیف گلچهی خارجی باز شده) برداشت شده بودند، از گلخانهای در تهران تهیه و بلافاصله برای انجام تیمار و ارزیابی صفات به آزمایشگاه پس از برداشت دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت منتقل شدند (شکل 3-1). گلها روی ارتفاع 50 سانتیمتری باز برش شده و هر چهار شاخهی گل در گلدانهای پلاستیکی به حجم دو لیتر قرارداده شدند، سپس به مقدار مورد نیاز تحت تیمار قرار گرفتند.

شکل 3-1- طریقه بسته‌بندی گلهای شاخه بریدهی ژربرا پس از برداشت
3-2- نوع طرح آزمایشیاین مطالعه بر پایه طرح کامل تصادفی با 10 تیمار شامل نیکل در سه سطح (10، 20 و 30 میلی گرم در لیتر)، سولفات نیکل و نیترات نیکل هر کدام در سه سطح (10، 30 و50 میلی گرم در لیتر) و شاهد (آب‌مقطر) با سه تکرار و در مجموع 30 پلات و در هر پلات 4 شاخه گل و در مجموع 120 شاخه گل انجام شد. تیمار به صورت پالس (به مدت 24 ساعت) و در شرایط فوتوپریود 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی بود که که توسط نور لامپهای فلورسنت سفید تامین میشد. شدت نور 12 میکرومول بر ثانیه متر مربع ، دمای 2±20 و رطوبت نسبی 60 تا 70 درصد بود و صفاتی از قبیل عمر گلجایی، کاهش وزن تر، درصد وزن خشک، جذب آب شمارش باکتریهای ته ساقه و محلول نگه دارنده، کاهش مواد جامد محلول در آب ((TSS و قطر گلها، پروتئین و کارتنوئید گلبرگ‌ها و فعالیت آنزیم های سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز اندازه‌گیری شد.
شکل3-2- چیدمان طرح آزمایشی
3-2-1- نحوه آمادهسازی گلها و انجام تیمارابتدا شاخه‌های ژربرا به طول 52 سانتی‌متر به صورت مورب در داخل آب 38 درجه سانتی‌گراد بریده شدند. گل‌ها با برچسب، کدگذاری شده و پس از توزین با ترازوی دیجیتال، در گلدان‌های پلاستیکی حاوی 250 میلی لیتر از تیمار های محلول نیکل با 3 سطح (10 و 20 و 30 میلی گرم در لیتر ) و نیترات نیکل در سه سطح (10 و 30 و 50 میلی گرم در لیتر) و سولفات نیکل در 3 سطح (10 و 30 و 50 میلی گرم در لیتر) به حالت پالس قرار گرفتند).برای تهیه محلول نیکل مقدار مورد نظر را در یک سی سی حلال اسید نیتریک غلیظ بر روی گرمکن با هم زدن مداوم حل شد. سه گلدان نیز به عنوان شاهد با 250 سی سی آب مقطر خالص در هر تکرار یکی قرار دادیم. پس از 24 ساعت گلها به گلدآن‌های محلول های تیمار مداوم حاوی 500 میلی لیتر محلول 3% ساکارز و 200 میلی گرم در لیتر هیدروکسی کینولین منتقل شدند .
در طول دوره آزمایش به منظور جلوگیری از انسداد آوندی هر سه روز یک بار عمل باز برش انتهای ساقه به اندازه یک سانتی‌متر درون آب 38 درجه سانتی‌گراد انجام شد.
3-2-2- معرفی تیمارهاده تیمار مورد استفاده به قرار زیر بودند:
شاهد یا (کنترل) : آب مقطر (10):Ni عنصر نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر N1
(20):Ni عنصر نیکل با غلظت 20 میلی گرم در لیتر N2
(30):Niعنصر نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر N3
(10)4:NiSOسولفات نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر SN1
(30)4:NiSO سولفات نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر SN2
(50)4:NiSOسولفات نیکل با غلظت 50 میلی گرم در لیتر SN3
(10)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر NN1
(30)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر NN2
(50)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 50 میلی گرم در لیتر NN3

3-3- اندازهگیری صفات3-3-1- طول عمر گلجاییبرای ارزیابی طول عمر گلجایی و پایان نگهداری گلهای بریده ژربرا، معیار اصلی پیچش گلبرگها و پژمردگی ظاهری گلها بود. بنابراین طول عمر هر یک از چهار شاخه گل موجود در محلول گلجا که طول عمرهای متفاوتی داشتند، اندازهگیری شده و از آنها میانگین گرفته شد. این عدد به عنوان طول عمر گلجایی آن تیمار در نظر گرفته شد.
3-3-2- کاهش وزن تر با توجه به میزان وزن تر اولیه گل‌ها، وزن تر نهایی گل‌ها، وزن باز برش‌ها و وزن ریزش‌گلبرگ‌ها، مقدار کاهش وزن تر بر حسب گرم به ازای هر شاخه گل طبق رابطه زیر محاسبه شد(شکل 3-2):
(وزن ریزش‌ها + وزن باز برش‌ها + وزن تر نهایی) – وزن تر اولیه = کاهش وزن تر

شکل 3-3- اندازه گیری وزن تر شاخه گل
3-3-3- درصد ماده خشکپس از پایان عمر گلجایی هر گل، وزن تر آن اندازه گیری شد و دو شاخه در آون در دمای 70 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. پس از اطمینان یافتن از خشک شدن، گل‌ها با ترازوی دیجیتال توزین شدند. درصد ماده خشک از رابطه زیر محاسبه شد:
100 × (وزن تر گل‌ها در روز آخر ÷ وزن خشک) = درصد ماده خشک
3-3-4- قطر گلها با کمک کولیس دیجیتال یک روز در میان اندازه گیری شد.
43561088265
شکل 3-4- اندازه گیری قطر گلها3-3-5-کاهش مواد جامد محلول در آب (TSS)برای اندازه گیری میزان مواد جامد محلول در آب از باز برش های انتهای ساقه استفاده شده است. یک یا دو قطره از عصاره باز برش‌ها روی صفحهی شیشهای رفراکتومتر دستی (مدل N-1α ساخت شرکت ATAGO کشور ژاپن) ریخته و میزان قند آن هر دو روز یک بار اندازه گیری شد. تفاضل بین اعداد به دست آمده از اندازه گیری میانگین درصد قند روز دوم و میانگین درصد قند روز آخر عمر گلجایی به عنوان میزان کاهش درصد قند در ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا در نظر گرفته شد.

شکل3-5- رفراکتومتر دستی (مدل N-1)3-3-6- محتوای پروتئین گلبرگ949960677545برای اندازه گیری میزان پروتئین در گلبرگ‌های گل شاخه بریده ژربرا در تیمارهای مختلف در روز پنجم آزمایش یک شاخه از هر پلات خارج شده و جهت استخراج پروتئین، از روش برادفورد ( 1976) استفاده شد.
شکل 3-6- اندازه گیری پروتئین گلبرگ3-3-7 - رنگیزه کاروتنوئید گلبرگدر روز پنجم آزمایش یک شاخه گل از هر پلات جهت اندازه گیری کاروتنوئید خارج شد. گلبرگ‌ها را خشک کرده و رنگیزه کاروتنوئید از روش مزومدار و مجومدار(2003) اندازه گیری شد.

شکل 3-7- اندازه گیری رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ3-3-8- جذب آب
با توجه به حجم اولیه محلول گلجای (500 میلیلیتر) و میزان تبخیر اتاق و کاهش حجم محلول گلجای، جذب آب از فرمول زیر میباشد:
(مقدار تبخیر اتاق در همان روز+ محلول باقیمانده در پایان عمر گلجایی) – 500 = جذب آب3-3-9- شمارش باکتری ساقه و محلول گلجاینمونهگیری از انتهای ساقه و محلول گلجایی 24 ساعت پس ازشروع آزمایش انجام و شمارش باکتری به روش لویی و همکاران (2009) انجام شد.
3-3-10- فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)برای سنجش فعالیت سینتیکی آنزیم POD از روش یین و همکاران (2007) استفاده گردید. 450 میکرولیتر محلول H2O2(225 میلیمولار) و 450 میکرولیتر محلول گایاکول (225 میلیمولار) با هم مخلوط گردید و به آن 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه و تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر دنبال شد. در محلول بلانک به جای عصاره آنزیمی، 100 میکرولیتر از بافر فسفات 50 میلی مولار (7pH=) استفاده شد.
3-3-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز (SOD)
فعالیت SOD به روش اسپکتروفتومتری و با استفاده از روش ژیا نوپلتیس و رایس(1977) و با کمی تغییر اندازه‌گیری شد. نمونه‌های بافت در داخل یک هاون و در حضور نیتروژن مایع آسیاب شد و به دمای 80- منتقل شد. مقدار 5/0 گرم از بافت منجمد شده‌ با یک میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 5/0 مول، 1/0 گرم پلی‌وینیل پولی‌پیرولیدین (PVPP) و pH 7 رقیق شد. پس از هموژنایز کردن، نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با دور 14000 در دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول رویی به آرامی برداشته شد و با ریختن در تیوب بلافاصله به دمای 80- تا اندازه‌گیری فعالیت منتقل شد.
محلول واکنش شامل EDTA 1/0 میلی مولار، بافر فسفات 50 میلی مولار، متیونین13 میلی مولار وNBT 75 میکرومولار و ریبوفلاوین دو میکرومولار (مجموعا به یک میلی‌لیتر) و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. تیوب‌های حاوی محلول واکنش به مدت 15 دقیقه درحالی‌که به آرامی شیکر می‌شدند در معرض نور فلورسانس (یک عدد لامپ فلورسانس حدود 400 لوکس) و دمای 22 درجه‌سانتی‌گراد قرار گرفتند. واکنش با انتقال تیوب‌ها به شرایط تاریکی متوقف شد و سپس جذب نمونه‌ها در طول موج 560 نانومتر قرائت شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم علاوه بر کووت‌های نمونه و بلانک از کووت شاهد نیز استفاده شد، که محتوای واکنشی نمونه بلانک و شاهد مشابه نمونه‌ی اصلی است با این تفاوت که هر دو نمونه مذکور فاقد آنزیم بودند. لازم به ذکر است که نمونه‌ی کنترل به همراه نمونه‌ها در معرض نور قرار می‌گیرد و نمونه‌ی بلانک در تاریکی قرار داده می‌شود. میزان جذب نمونه‌ها در طول موج 560 نانومتر خوانده شد.
3-4- تجزیه و تحلیل داده‌هاداده‌ها ابتدا در نرم افزار Excel ثبت شدند، سپس تجزیه و تحلیل آن‌ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و مقایسه میانگین‌ها بر اساس آزمون Tukey در سطح پنج درصد، انجام شد. رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel انجام گرفت.
فصل چهارم
نتایج

4-1- عمر گلجاییبررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارها اثر معناداری در سطح یک درصد برعمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول 4-1). نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌ها نشان می‌دهد که کاربرد عنصر نیکل به تنهایی نتوانست سبب افزایش معناداری در عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا گردد، در حالی که کاربرد سولفات نیکل و نیترات نیکل سبب بهبود عمر گلجایی و افزایش معنادار این شاخص نسبت به نمونه‌های شاهد گردید همان طور که ملاحظه می‌شود حداکثر عمر گلجایی (11 روز) در کاربرد نیترات نیکل به غلظت 50 میلی گرم در لیتر به دست آمد. اگر چه تیمار سولفات نیکل سبب افزایش معناداری در عمر گلجایی گل‌های ژربرا گردید اما تفاوت معناداری بین سطوح مختلف سولفات نیکل وجودنداشت (شکل 4-1).
7.61c
6.89c
7.05c
7.22c
9.72b
10b
10.32ab
10.5ab
11a
9.92b
عمر گلجایی(روز)
32385125095
تتیما
تیمارها
نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
شکل 4-1- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا
4-2-کاهش وزن تازه گل133352436495همان طور که در شکل 4-2 آمده است، سطوح مختلف تیمار نیکل به تنهایی سبب افزایش یا کاهش معناداری در تغییر وزن تازه در گل‌های ژربرا نگردیدند. اما به طور کلی براساس نتایج حاصل از تجزیه واریانس، تیمارها اثر معناداری در سطح یک درصد بر میزان کاهش وزن تازه گل‌های شاخه بریده ژربرا نسبت به شاهد داشته‌اند (جدول 4-1) سطوح مختلف تیمارهای سولفات و نیترات نیکل سبب کاهش کمتر در این شاخص گردیدند. یا به عبارت دیگر کاربرد هر یک از نمک‌های نامبرده سبب ثبات بالاتر وزن تازه گل‌ها شدند. بهترین نتیجه از کاربرد نیترات نیکل به غلظت 30 میلی‌گرم بر لیتر به دست آمد که حداقل کاهش وزن تازه گل را نشان می‌دهد (شکل 4-2).
2.482a
2.55a
2.485a
2.477a
2.176bc
2.231b
2.021d
1.772e
1.99d
2.035cd
کاهش وزن تازه گل (گرم)

تیمارها
شکل4-2- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر کاهش وزن تر گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-3- درصد ماده خشک
984252147570آنالیز واریانس نشان داد که تیمارهای مختلف درسطح یک درصد بردرصد ماده خشک موثر بوده‌اند(جدول4-1) نتایج مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که در گل‌های شاخه بریده ژربرا که تیمارهای نیترات و سولفات نیکل را دریافت کرده بودند، بیشینه وزن خشک را داشتند به گونه‌ای که حداکثر درصد ماده خشک (02/16%) هنگامی به دست آمد که گل‌ها با نیترات نیکل با غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر تیمار شدند. تیمارهای عنصر نیکل به تنهایی تاثیر معناداری بر این شاخص نداشتند (شکل 4-3).
12.73d
13.71cd
12.2d
13.16cd
15.71a
14.05bc
16.02a
15.57ab
15.91a
14c
ماده خشک (درصد)

تیمارها
شکل 4-3- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر وزن درصد ماده خشک گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-4- قطر گلها
1386512783785بررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارهای نیکل، سولفات و نیترات نیکل از نظر آماری اثر معناداری در سطح پنج درصد نسبت به شاهد (آب مقطر) بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول 4-1). نتایج حاصل از مقایسه میانگین ها نشان داد که قطر گل‌هایی که تیمار30 میلی گرم بر لیتر از عنصر نیکل را دریافت کرده بودند و همچنین در گل‌هایی که توسط نمک‌های سولفات و نیترات نیکل تیمار شده بودند به گونه معنادار بیشتر از نمونه‌های شاهد بودند. حداکثر قطر گل‌ها (39/111 میلی‌متر) در ژربراهایی که توسط نیترات نیکل با غلظت 50 میلی گرم بر لیتر تیمار شده بودند به دست آمد. تفاوت معناداری بین نمونه‌هایی که تیمار سولفات نیکل دریافت کرده بودند موجود نبود (شکل 4-4).
105.53e
107.61cde
106.43de
108.42bcd
109.07abc
110.17ab
109.92abc
110.31ab
111.39a
110.22ab
قطر گل (میلی‌متر)

تیمارها
شکل 4-4- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-5- کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS)
1847852084070بررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان می‌دهد که استفاده از نیکل، سولفات و نیترات نیکل در محلول نگهدارنده نسبت به شاهد (آب مقطر) اثر معناداری در سطح پنج درصد بر روی میزان قند (TSS) موجود در ساقه گل بریده ژربرا داشته است (جدول 4-1) مقایسه میانگین داده ها نشان داد که تیمارهای30 میلی‌گرم بر لیتر عنصر نیکل و نمک‌های سولفات و نیترات نیکل همگی سبب کمترین کاهش درصد قند (TSS) شده‌اند. بهترین پاسخ‌ها در بالاترین سطح کاربردی نیترات و سولفات نیکل (50 میلی گرم بر لیتر ) به دست آمد.
1.05a
0.97ab
0.95ab
0.9b
0.75c
0.61de
0.77c
0.45f
0.51ef
0.66cd
کاهش مواد جامد محلول(درصد)

تیمارها
شکل 4-5- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر روی کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (Tss) هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-6- پروتئین گلبرگ
نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان می‌دهد که تیمارهای استفاده شده در این آزمایش در ارتباط با حفظ میزان پروتئین در گلبرگ‌های شاخه بریده ژربرا نسبت به شاهد اثر مثبت و معناداری در سطح یک درصد داشته است جدول (4-1) نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده ها نشان داد که تیمارهای سولفات نیکل و تمام غلظت‌های نیترات نیکل سبب بهبود این پارامتر گردید به گونه‌ای که گل‌هایی که تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر از نیترات نیکل را دریافت کرده بودند بالاترین غلظت پروتئین را داشتند (14%) که در حدود سه درصد بالاتر نسبت به نمونه‌های شاهد بود شکل (4-6).
8001027368511e
11.05de
11.75cde
12.01bcde
12.53abcd
13.09abc
13.81a
13.61a
14a
13.21ab
پروتئین گلبرگ (درصد)

تیمارها
شکل 4-6- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان پروتئین گلبرگ گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-7- کاروتنوئید گلبرگ
همان‌طور که در جدول آنالیز واریانس مشاهده می‌شود، تیمارها عنصر نیکل و نیز سولفات و نیترات نیکل نسبت به شاهد اثر معناداری در سطح یک درصد بر روی میزان کاروتنوئید گلبرگ در گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند جدول (4-2). نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که غلظت30 میلی‌گرم بر لیتر از عنصر نیکل و تمام غلظت‌های دو نمک سولفات و نیترات نیکل سبب افزایش معنادار کاروتنوئید گلبرگ نسبت به نمونه‌های شاهد گردد. براساس نتایج که در شکل (4-7) آورده شده است، بیشینه کاروتنوئید (92/1میکروگرم در گرم وزن تر) از گل‌هایی به دست آمد که تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر سولفات نیکل را دریافت کرده بودند که بیش از سه برابر از نمونه شاهد بود.
222885121285
0.53f
0.71ef
0.61ef
0.95de
1.13cd
1.92a
1.37bc
1.56ab
1.77ab
1.56ab
کاروتنوئید گلبرگ (میکروگرم در گرم وزن تر)

تیمارها
شکل4-7- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میران کاروتنوئید گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-8- جذب آب
نتایج تجربه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارها اثر معناداری در سطح پنج درصد بر میزان جذب آب در گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول4-2) بررسی مقایسه میانگین داده‌ها نشان می‌دهد که غلظت30میلی گرم بر لیتر از عنصر نیکل به تنهایی و تمام غلظت‌های به کار رفته از نمک‌های سولفات و نیترات نیکل سبب بهبود و افزایش جذب آب نسبت به نمونه‌های شاهد گردید. بیشترین میزان جذب آب (61/95 میلی لیتر به ازای هر گل) از گل‌هایی به دست آمده که تیمار30 میلی‌گرم بر لیتر از نیترات نیکل را دریافت کرده بودند و کمینه جذب آب هم در نمونه‌های شاهد مشاهده گردیده است (شکل4-8).
127403174253
67.21f
70f
70.7f
77d
85.5c
89.26bc
91.74ab
95.61a
92.52ab
90.18b
جذب محلول (میلی‌لیتر)

تیمارها
شکل 4-8- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میران جذب آب گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-9-جمعیت باکتریایی در ته ساقه
2228852503170آنالیز واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارهای مختلف عنصر نیکل، سولفات و نیترات نیکل نسبت به شاهد از نظر آماری در سطح یک درصد برکاهش جمعیت باکتریایی در ته ساقه موثر بوده‌اند (جدول4-1). براساس مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که، کاربرد عنصر نیکل به تنهایی با غلظت‌های20 و30 میلی گرم بر لیتر و تمام غلظت‌های دو نمک سولفات و نیترات نیکل سبب کاهش معنی‌دار کلونی‌های باکتریایی حاصل از ته ساقه گل‌ها نسبت به شاهد (آب مقطر) گردیده است. کمترین تعداد کلونی باکتریایی از ته ساقه گل‌هایی به دست آمد که بالاترین سطح (50 میلی گرم بر لیتر) از دو نمک سولفات نیکل و نیترات نیکل را دریافت کرده بودند که تقریباً 50 درصد پایین تر از نمونه هایی شاهد بود.
110.11a
(log10CFU.ml-1)شمارش باکتری ساقه
105.81a
92.5b
88.5b
75.63c
61.4e
70.43cd
62.57e
57.53f
65.22de

تیمارها
شکل 4-9- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در ته ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-10- جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌ها
همان طور که در جدول (4-1) آنالیز واریانس دیده می‌شود، تیمارهای مختلف نیکل نسبت به شاهد (آب مقطر) اثر معناداری در سطح یک درصد بر این شاخص در هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند. تمام تیمارها سبب کاهش معنادار کلونی‌های باکتریایی گردیدند و بیشینه تعداد کلونی‌های از محلول نگهدارنده گل‌هایی به دست آمد که بالاترین سطح نمک‌های سولفات و نیترات نیکل (50 میلی گرم بر لیتر) را دریافت کرده بودند که در حدود 40 درصد پایین تر از نمونه‌های شاهد بود (شکل4-10).
125.88a
90.25b
95.27b
85.18bc
70.05de
60.82ef
75.11cd
61.05ef
58.03f
60.91ef
شاهد
N1
N2
N3
SN1
SN2
SN3
NN1
NN2
NN3
(log10CFU. ml-1)شمارش باکتری محلول نگهدارنده
28237154310
تیمارها
شکل 4-10- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسیددسموتاز
همان‌طور که در شکل (4-11) مشاهده میشود، تمام تیمارها سبب افزایش فعالیت این آنزیم نسبت به شاهد گردیدند به گونهای که کمینه فعالیت این آنزیم از نمونه های شاهد به دست آمده است (61/60 واحد در گرم وزن تر) همچنین آنالیز واریانس داده ها نشان میدهدکه اثر تیمارها از نظر آماری در سطح یک در صد بر این شاخص در گلهای شاخه بریده ژربرا معنی دار بوده است. کاربرد 30 و 50 میلی گرم سولفات نیکل و همچنین تمام غلظت‌های نیترات نیکل سبب افزایش بیش از دو برابر این آنزیم نسبت به نمونههای شاهد گردیده است. بالاترین سطح فعالیت آنزیم سوپر اکسیددسموتاز (21/135 واحد در گرم وزن تر) از گلهایی به دست آمد که بالاترین سطح نیترات نیکل را دریافت کرده بودند (50 میلی گرم در لیتر).
7048521590
60.61e
81.05d
88.56d
85.85d
100.01c
125.22ab
125.31ab
129.61ab
135.21ab
120.11b
فعالیت آنزیم SOD (IU/g.FW)

تیمارها
شکل 4-11- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-12- فعالیت آنزیم پراکسیداز
همان طور که در جدول آنالیز واریانس مشخص شده است تیمارها اثر معنی داری در سطح یک در صد بر فعالیت آنزیم پراکسیداز گلهای شاخه بریده ژربرا داشتهاند (جدول 4-1).تیمارهای عنصر نیکل به جز تیمار 30 میلی گرم بر لیتر سبب افزایش یا کاهش فعالیت این آنزیم نسبت به نمونه های شاهد نگردید اما کاربرد دو نمک دیگر یعنی سولفات نیکل و نیترات نیکل در تمام سطحوح سبب افزایش معنی دار فعالیت این آنزیم نسبت به نمونه های شاهد گردید. حداقل فعالیت (02/4 میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) از نمونه‌های شاهد به دست امد و حداکثر فعالیت در حدود(3/6 میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) از نمونه‌هایی به دست آمد که بیشینهسطح سولفات و نیترات نیکل یعنی50 میلیگرم برلیتر را دریافتکرده بودند (شکل4-12).
4.02e
4.24de
4.32de
4.53d
5.56c
6.37a
5.78bc
6.28ab
6.36a
6.17ab
فعالیت آنزیم POD(MoL/g.FW.min)
175260130810
تیمارها
شکل 4-12- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل فعالیت آنزیم پراکسیداز گل‌های ساخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10 mgl NN1=10 mgl-1
N2=20mgl-10 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50 mgl-1 NN3=50 mgl-1
جدول4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازهگیری شده در گل‌های شاخه بریده ژربراکاهش بریکس پروتئین
گلبرگ قطر گل‎ها وزن خشک کاهش وزن تازه گل عمر گلجایی درجه آزادی 0/40* **63 18/82* 15/48** 1/281** 6/73** 9 تیمار
0/028 3/ 63 13/88 3/ 78 0/ 301 1/17 20 خطا
- - - - - - 29 کل
33 43 35 40 27 35 ضریب تغییرات (درصد)
* معنا دار در سطح 5 درصد
** معنا دار در سطح 1 درصد
ns عدم معنا دار بودن
ادامه جدول4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازهگیری شده در گل‌های شاخه بریده ژربرا فعالیت
POD فعالیت
SOD تعداد باکتری محلول تعداد باکتری ته ساقه جذب آب کاروتنوئید درجه آزادی 921/09** 5058/99** 2638/98** 1245/32** 155/36* 1/53** 9 تیمار
26/01 168/63 168/30 83/86 36/73 0/28 20 خطا
- - - - - - 29 کل
33 33 40 27 37 29 ضریب تغییرات (درصد)
* معنا دار در سطح 5 درصد

—d1738

حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)
0/1
0/1 Glucose (W/V)
0/1 Cellobiose(W/V)
0/1 Maltose (w/V)
0/1 Xylose (W/V)
0/75 (V/V) %3 Cellolose Suspension
0/1 (W/V) % 1/0 Hemin Solution
0/2 Trypticase (W/V)
0/05 Yeast Extract (W/V)
0/45 VFA Mixture (V/V)
1/67 (V/V) %3 Cystein-HCL-Water
3/33 (V/V) %12 Sodium Carbonate Solution
0/0100 CO2 Gas Phase

جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S)محلول مواد معدنی شماره I15%

user8336

در روش جدیدی به نام Modified Brush Biopsy که نخستین بار در سال 2010 توسط متخصصین گروه بیماری های دهان دانشکده دندانپزشکی مشهد معرفی شد، از ترکیب Brush Biopsy و سیتولوژی بر پایه مایع (LBC) برای تعیین ارزش تشخیصی این روش در شناسایی ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم استفاده شد. در این مطالعه، از 26 بیمار مبتلا به ضایعات دهانی بدخیم یا پیش بدخیم، Brush Biopsy تهیه و در فرمول ساده LBC قرار گرفت و با استفاده از سانتریفیوژ، نمونه ای که معرف همه سلولهای ضایعه باشد، در دسترس قرار گرفت. سپس همه بیماران تحت بیوپسی روتین و بررسی هیستوپاتولوژی هم قرار گرفتند. این روش حساسیت 9/88% و اختصاصیت 100% نشان داد. بنابراین پیشنهاد شد می تواند به عنوان ابزار مؤثری برای غربالگری ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم مورد استفاده قرار گیرد(15).
گر چه در حال حاضر استاندارد طلایی تشخیص ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم تهیه بیوپسی بافتی و بررسی هیستوپاتولوژی است، اما به هر حال این روش نگرانی هایی از جهت خطاهای نمونه برداری و خطاهای تفسیر هیستوپاتولوژی و فقدان حساسیت کافی برای تعیین پیشرفت ضایعه را به همراه دارد. بنابراین نیاز به سیستم های دقیق تر برای پیش بینی پیشرفت ضایعات در مراحل اولیه، کاملأ منطقی به نظر می رسد (2).
بررسی مارکرهای سرمی در سرطان دهان
در حال حاضر تعدادی از مارکرهای سلولی و مولکولی برای کمک به شناسایی تغییرات اولیه در جهت کمک به شناسایی ضایعات دارای پتانسیل بدخیمی در مخاط دهان در حال بررسی هستند (2).
با پیشرفت دانش بشر از درک ژنتیک، تغییرات ژنتیکی ممکن است به عنوان چنین مارکری در نظر گرفته شود. به علاوه شواهدی وجود دارد که نشان می دهد مقادیر سیتوکین های بزاقی می تواند اطلاعات مفیدی از رفتار اپی تلیوم دهان و کارسینوژنر فراهم کرده و توانایی این مارکرها می تواند در آینده ای نزدیک، آنها را تبدیل به ابزاری برای غربالگری سرطان دهان نماید(2). ماتریکس متالوپروتئیناز و مهار کننده بافتی آن نقش مهمی در شروع و پیشرفت سرطان دهان ایفا می کنند(1). آغاز یا پیشرفت سرطان دهان می تواند با پلی مرفیسم ژن فاکتور رشد عروقی اندوتلیال (VEGF) مرتبط باشد(1). افزایش CDK2 و CDK4 در مدل های حیوانی، مرتبط با افزایش خطر ابتلا به SCC دهان و پوست عنوان شده است(9). آنتی بادی بر علیه پروتئین P53 ( یک پروتئین سرکوبگر تومور) در سرم بیماران مبتلا به SCC دهانی شناسایی شده است(16). بنابراین مطالعه بیشتر روی بافت های دهانی همچنین سلولها یا مایعات بدن از جمله سرم و بزاق به منظور کمک به درک بهتر پاتوژنز سرطان دهان و یافتن ابزاری مفید برای غربالگری سرطان دهان در مراحل اولیه، ادامه خواهد یافت (2).
جستجو برای یافتن روش هایی که امکان شناسایی سرطان دهان را در مراحل اولیه امکان پذیر نماید، محققان را به سوی تحقیقات جدی در این زمینه سوق داده است(16). در سالهای اخیر، توجه به بیومارکرهای موجود در سرم برای تشخیص زود هنگام سرطانهای مختلف از جمله سرطان دهان(به ویژه SCC) مورد علاقه بیشتر پژوهشگران قرار گرفته است(17). تغییرات ژنتیکی که در سلولهای سرطانی رخ می دهد، منجر به تغییر پاسخ سلول به محیط اطراف خود می شود که به صورت تغییر در بیان پروتئین های مسیرهای سیگنال دهنده سلولی تظاهر می کند و با مطالعات بررسی پروتئین ها در سرم، قابل ردیابی خواهد بود(17).
گلوتاتیون
یکی از بیومارکرهای قابل اندازه گیری در سرم مبتلایان به SCC گلوتاتیون است که پپتیدی داخل سلولی با اعمال متفاوتی از جمله سم زدایی، دفاع آنتی اکسیدانی و تعدیل نمودن پرولیفراسیون سلولی می باشد(18). فرمول شیمیایی این مولکول عبارتست از: C10H17N3O6S و تری پپتیدی با اتصال پپتیدی گاما بین گروه آمین سیستئین و گروه کربوکسیل گلوتامات است. دریافت گلوتاتیون به عنوان یک ریزمغذی در رژیم غذایی ضروری نیست، زیرا بدن می تواند از آمینواسیدهای سیستئین، گلوتامیک اسید و گلایسین، آن را تولید کند(19). گلوتاتیون در یک فرآیند دو مرحله ای وابسته به آدنوزین تری فسفات (ATP) ساخته می شود: - نخست گاماگلوماتیل سیستئین از گلوتامات و سیستئین با واسطه آنزیم گاماگلوتامیل سیستئین سنتتاز تولید می شود.
سپس، گلایسین به انتهای C - ترمینال گاماگلوتامیل سیستئین از طریق آنزیم گلوتاتیون سنتتاز، اضافه می شود(19).
برخی از ویژگی های مهم گلوتاتیون عبارتند از:
یک آنتی اکسیدان اندوژن(درون زاد) مهم است که توسط سلولها تولید می شود و در خنثی کردن مستقیم رادیکالهای آزاد و ترکیبات واکنشی اکسیژن شرکت می کند. همانگونه که آنتی اکسیدان های اگزوژن( برون زاد) مثل ویتامین C و E در فرم احیاء(که همان فرم فعال آنهاست)، عمل می کنند(20).
چرخه نیتریک اکساید را تنظیم می کند که برای حیات نقش بحرانی( Critical) دارد و در صورت عدم تنظیم، مشکل جدی ایجاد می کند(21).
در واکنش های متابولیک و بیوشیمیایی مثل سنتز و ترمیم DNA ، سنتز پروتئین، سنتز پروستاگلاندین، انتقال آمینو اسید و فعالیت آنزیمی، نیاز به گلوتاتیون وجود دارد. بنابراین هر سیستمی در بدن می تواند تحت تأثیر گلوتاتیون قرار گیرد، به ویژه سیستم ایمنی، سیستم عصبی، سیستم گوارشی و ریه ها (22).
گلوتاتیون نقشی حیاتی در متابولیسم آهن دارد. به طوریکه نشان داده شده سلول های yeast ( مخمر) عاری از آهن یا حاوی مقادیر اندک گلوتاتیون احیا (GSH)، دچار نقص آنزیمهای خارج میتوکندریایی و به دنبال آن مرگ می شود(21).
گلوتاتیون دارای دو فرم احیا یا همان GSH و اکسید یا همان GSSG می باشد. پدیده اکسیداسیون – احیا از خصائص ذاتی سلول بوده و گلوتاتیون در این امر نقش اساسی دارد(23). گلوتاتیون که بیشتر به فرم احیا شده وجود دارد، در واکنش با رادیکالهای آزاد و سموم به فرم اکسید خود یعنی GSSG تبدیل شده با حضور آنزیم گلوتاتیون رودکتاز فاکتور NADPH مجددأ به فرم احیاء خود بازمی گردد. کسر GSH /GSSG از فاکتورهای مهم در رابطه با تغییرات دائم رادیکال های آزاد اکسیژن می باشد. میزان این کسر در سلول های مختلف، متفاوت بوده، نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با فعالیت آن می باشد(23). در حالت عادی نسبت GSH /GSSG برابر 1/3 می باشد. استرس شدید اکسیداتیو سبب انباشتگی GSSG شده و مقدار کسر کاهش می یابد که کاهش مقاومت بدن برای مقابله با رادیکالهای آزاد را در پی دارد(23). منظور از استرس اکسیداتیو زمانی است که تعادل بین تولید مواد اکسیدان و آنتی اکسیدان در بدن به نفع اکسیدان ها دچار اختلال شود(24).

استرس اکسیداتیو
استرس اکسیداتیو منعکس کننده عدم تعادل بین تظاهرات سیستمیک گونه های اکسیژن واکنشی و توانایی سیستم یبولوژیک برای خنثی کردن واسطه های واکنشی یا ترمیم آسیب حاصله است. اختلال در حالت نرمال Redox (Reduction / Oxidation)، می تواند از طریق تولید پراکسیدها و رادیکالهای آزاد – که به اجزای سلولی از قبیل پروتئین ها، لیپیدها و DNA صدمه می زنند- اثرات سمی به دنبال داشته باشد(24). بنابراین استرس اکسیداتیو می تواند باعث قطع مکانیسم های نرمال انتقال پیام سلولی (cellular signaling) شود(24).
منظور از واکنش Redox (Reduction / Oxidation) تمام واکنش های شیمیایی است که شامل تغییر وضعیت اتم های بین حالت اکسیداسیون و احیاء می باشد. تعریف اکسیداسیون و احیاء به این شرح است:
اکسید (Oxidation): فقدان الکترون یا افزایش اکسیداسیون توسط یک مولکول، اتم یا یون.
احیا ( Reduction): به دست آوردن الکترون یا افزایش اکسیداسیون توسط یک مولکول، اتم یا یون(25).
به نظر می رسد استرس اکسیداتیو در انسان در پیشرفت بسیاری از بیماری ها یا تشدید علائم آنها نقش داشته باشد. این بیماریها شامل: سرطان(24)، پارکینسون و آلزایمر(26)، آترواسکلروز و نارسایی قلبی(27)، انفارکتوس میوکارد(28)،اسکیزوفرنی(29)، اختلال شخصیت دوقطبی(30)، بیماری سلولی داسی(31)، لیکن پلان(32) و ویتیلیگو(33) می باشد.
احتمال دخیل بودن استرس اکسیداتیو در پیشرفت وابسته به سن در سرطان وجود دارد. گونه های واکنشی تولید شده در استرس اکسیداتیو می توانند باعث آسیب مستقیم DNA و بنابراین اثرات موتاژنیک (جهش زایی) شوند. این فرآیند ممکن است آپوپتوز( مرگ برنامه ریزی شده سلولی) را سرکوب کرده و تکثیر و تهاجم و متاستاز تومور را پیش ببرد(24).

درمان
درمان سرطان دهان نیازمند همکاری یک تیم پزشکی است. هدف اولیه درمان، ریشه کنی سرطان، پیشگیری از عود و تا حد امکان بازیابی شکل و عملکرد نواحی تحت تأثیر قرار گرفته می باشد(34).
انتخاب روش درمان، بستگی به عوامل متعددی دارد از جمله: نوع سلول تومورال و میزان تمایز آن، محل و اندازه ضایعه، وضعیت درگیری استخوان و گره های لنفاوی، حضور یا عدم حضور متاستاز و شرایط کلی بیمار از قبیل: سن، وضعیت سلامت عمومی، وجود تاریخچه ای از SCC دهانی قبلی و عادات پر خطر(35).
روشهای درمانی متعددی برای درمان سرطان دهان وجود دارد که شامل: جراحی، رادیوتراپی، شیمی درمانی سیستمیک و مهار EGFR می باشند و می توانند هر یک به تنهایی یا به صورت ترکیبی به کار روند(36). جراحی درمان انتخابی ضایعات کوچک و قابل دسترسی است، اگر چه مراحل پیشرفته SCC معمولأ با ترکیب جراحی، رادیوتراپی و شیمی درمانی درمان می شوند(37).
در موارد عود SCC مهار کننده های EGFR در ترکیب با رادیوتراپی و شیمی درمانی، خط اول درمان خواهند بود(34).
درمان انتخابی درگیری گره های لنفاوی، جراحی است(1).
جراحی برداشت SCC دهان با حاشیه های ناکافی در حد کمتر از 5 میلی متر در 30 – 20 % موارد ممکن است عود و متاستاز دور دست را به همراه داشته باشد و در این شرایط معمولأ تجویز رادیوتراپی و شیمی درمانی بعد از جراحی، ضروری خواهد بود(38). توضیح احتمالی این است که برخی کراتینوسیتهای بدخیم ممکن است در حاشیه های زخم جراحی شده باقی مانده باشند اما به دلیل تعداد بسیار اندک، توسط آزمایشات هیستوپاتولوژی قابل شناسایی نباشند(3).
رادیوتراپی از طریق ایجاد رادیکال های آزاد و آسیب به DNA سلول، اثرات مخرب خود را اعمال می کند. سلول های تحت تابش ممکن است تخریب شوند یا قدرت تقسیم خود را از دست بدهند(1).
انواع SCC به اشعه حساس بوده و ضایعات اولیه به میزان زیادی با رادیوتراپی قابل درمان می باشند. به طور کلی هر چه تمایز تومور بیشتر باشد ( G--e هیستوپاتولوژی پایین تر )، سرعت پاسخ به رادیوتراپی کمتر خواهد بود. تومورهای اگزوفیتیک که اکسیژن رسانی کافی دارند، حساسیت بیشتری به اشعه دارند، در حالیکه تومورهای مهاجم بزرگ کمتر به اشعه پاسخ می دهند. SCC محدود به مخاط دهان با رادیوتراپی تا حد زیادی بهبود پذیرفته است، در حالیکه انتشار تومور به استخوان، احتمال موفقیت رادیوتراپی به تنهایی را کاهش می دهد و در این شرایط نیاز به ترکیب جراحی و رادیوتراپی وجود دارد(1).
شیمی درمانی به سه شکل در درمان سرطان به کار می رود:
به صورت القایی قبل از درمانهای موضعی با هدف تسریع در کاهش اولیه حجم تومور و درمان زود هنگام میکرومتاستازها.
به صورت استفاده همزمان با رادیوتراپی، این روش در حال حاضر برای مراحل پیشرفته بیماری ( مراحل 3 و 4 )
مورد استفاده قرار می گیرد.
شیمی درمانی کمکی ( adjuvant ) پس از درمان موضعی.(1).

پیش آگهی
مهمترین عامل در بقاء بیماران مبتلا به سرطان دهان، مرحله بیماری در هنگام تشخیص می باشد. متأسفانه بیشتر سرطان های دهان در مراحل پیشرفته، پس از علامت دار شدن تشخیص داده می شوند(1). در ایالات متحده میزان بقای 5 ساله در آمریکایی های آفریقایی تبار فقط یک، سوم بقای 5 ساله سفید پوستان که حدود 53% می باشد، گزارش شده است(1). این میزان بقا تحت تأثیر محیط فیزیکی و اجتماعی، کمبود اطلاعات بهداشتی، روش زندگی پر خطر و دسترسی محدود به مراقبت های بهداشتی می باشد(1).
کمیته مشارکتی سرطان آمریکا سیستم تومور، گره لنفاوی و متاستاز(TNM) را برای طبقه بندی سرطان ارائه داده است. T اندازه تومور اولیه، N درگیری گره های لنفاوی و M متاستاز دوردست را بیان می کند. انتشار موضعی یا ناحیه ای SCC دهانی شایع است و بر انتخاب درمان و پیش آگهی تاثیر می گذارد. متاستاز به گره های لنفاوی گردنی نیز شایع بوده ولی متاستاز دوردست به ناحیه زیر ترقوه نادر است. سرطان دهان در بخش خلفی حفره دهان، ناحیه حلق دهانی و کف دهان با پیش آگهی ضعیف تری همراه است، این امر با تشخیص بیماری در مرحله پیشرفته و میزان بیشتر انتشار آن به گره های لنفاوی در زمان تشخیص قابل توجیه می- باشد(1). عوامل موثر عمده ای که اثر منفی بر پیش آگهی سرطان دهان اعمال می کنند عبارتند از: درگیری دو یا تعداد بیشتری لنف نود ناحیه ای، گسترش درگیری لنف نود به خارج از کپسول و اعلام درگیر بودن مارژین های برداشته شده در جراحی تومور(2). معیارهای بافت شناسی مهم مرتبط با پروگنوز ضعیف شامل: افزایش ضخامت تومور و وجود تهاجم عروقی می باشد(2).
از آنجا که ضایعات اولیه اغلب بدون علامت بوده و بیماران در مراحل انتهایی شناسایی می شوند، تشخیص این سرطان در مراحل اولیه، تأثیر قابل توجهی در بهبود پیش آگهی آن دارد(2). جستجو برای یافتن روش هایی که امکان شناسایی سرطان دهان را در مراحل اولیه امکان پذیر نماید، محققان را به سوی تحقیقات جدی در این زمینه سوق داده است(16). در همین راستا، توجه به بیومارکرهای موجود در سرم برای تشخیص زود هنگام سرطان دهان در حال افزایش است.(17).

مروری بر متون
در این قسمت به مرور مطالعات مرتبط با موضوع تحقیق می پردازیم که به ترتیب اهمیت و سال انتشار آورده شده اند.
Sobhakamuri A. و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای با عنوان « استعداد سلول های سرطانی سر و گردن در انسان به مهار ترکیبی متابولیسم گلوتاتیون و تیوردوکسین » با بیان این مطلب که افزایش متابولیسم گلوتاتیون (GSH) و تیوردوکسین (Trx) در مقاومت سلول های سرطانی به شیمی درمانی نقش گسترده ای دارد، به بررسی تأثیر همزمان مهار GSH و Trx در مرگ سلول های سرطانی سر و گردن با مکانیسم استرس اکسیداتیو پرداختند. نتایج حاکی از این بود که مهار همزمان GSH و Trx با القای استرس اکسیداتیو، در مرگ سلول های SCC سر و گردن نقش دارد و این استراتژی ممکن است در حساس کردن SCC سر و گردن به مهار کننده های EGFR به عنوان گامی در درمان SCCمفید باشد(39).
Dzian A . و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای با عنوان « آدنوکارسینوما و SCC ریه و ارتباط آن با پلی مرفیسم ژنتیکی گلوتاتیون S – ترانسفراز در جمعیت اسلوونی» با توجه به اینکه اسنیدانس سرطان ریه در جمعیت اسلوونی بالاست، پلی مرفیسم ژنهای گلوتاتیون S – ترانسفراز شامل: GSTT1 و GSTM1 و GST_ P1 را با تکنیک PCR بررسی کرده و نتیجه گرفتند فقدان ژنوتیپ GSTT1 مرتبط با افزایش ریسک آدنوکارسینومای ریه است. در حالیکه پلی مرفیسم این ژنها با SCC ریه، ارتباط معنی داری ندارد(40).
در مطالعه FU TY . و همکاران در سال 2011 با عنوان « منگناز سوپر اکسید دسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز به عنوان مارکرهای پیش آگهی SCC مخاط باکال » مشاهده شد که بروز بیشتر این مارکرها با بقای بهتر بیماران در ارتباط بوده و در نتیجه حضور این مارکرها بیانگر بقای بهتر SCC مخاط باکال می باشد(41).
Karaman E. و همکاران در سال 2010 در مطالعه ای با عنوان« فعالیت پارا اکسوناز سرم و آسیب اکسیداتیو DNA در بیماران مبتلا به SCC حنجره» با استفاده از روشهای اندازه گیری کالری متریک والایزا بر روی نمونه های سرمی بیماران و مقایسه آنها با گروه کنترل دریافتند تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در بیماران مبتلا به SCC حنجره به نفع اکسیداسیون لیپید و آسیب DNA مختل می شود(42).
Allameh A. و همکاران در سال 2009 در مطالعه ای با عنوان « آنالیز هیستوشیمی مارکرهای مولکولی خاص در ضایعات پیش سرطانی، آدنوکارسینوما و SCC مری در افراد ایرانی» با هدف بررسی تغییرات عوامل مؤثر در پیشرفت سرطان مری در جمعیت در معرض خطر در ایران انجام دادند. آنها نمونه های بیوپسی مری 87 بیمار مبتلا به متاپلازی بارت در مری، آدنوکارسینوما و SCC مری را با روش ایمنوهیستوشیمی از نظر بیان P53 و P21 و نیتروتیروزین و سیکلواکسیژناز 2 و گلوتاتیون S – ترانسفراز بررسی کردند. تغییرات پاتولوژیک در نمونه های آدنوکارسینوما و SCC مری به صورت افزایش نیتروتیروزین و سیکلواکسیژناز 2 بود که شاهدی بر درگیری این فاکتورهای اکتسابی در پیشرفت سرطان مری است. اما در مورد سایر فاکتورها، تغییر معنی داری
مشاهده نشد(43).
Looi ML. و همکاران در سال 2008 در مطالعه ای با عنوان « آسیب اکسیداتیو و وضعیت آنتی اکسیدان در بیماران مبتلا به نئوپلازی داخل اپی تلیالی سرویکال و کارسینوم سرویکس» انجام دادند. آنها برای بررسی وضعیت آسیب اکسیداتیو، مالون دی آلدهید (MDA) پلاسما و 8- هیدروکسی داکسی گوانوزین(HdG) ادرار و برای بررسی وضعیت آنتی اکسیدان مقادیر آنزیم های سوپر اکسید دسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز را در 80 بیمار مبتلا به نئوپلازی سرویکال و کاسینوم سرویکس بررسی و با گروه کنترل مقایسه کردند. نتایج نشان داد مقادیر HdG تغییر معنی داری در هیچکدام از بیماری های مورد مطالعه نسبت به گروه کنترل ندارد. MDA پلاسما و گلوتاتیون پراکسیداز در بیماران، نسبت به گروه کنترل افزایش داشتند، در حالیکه سوپر اکسید دسموتاز و کاتالاز در بیماران نسبت به گروه کنترل کاهش داشتند(44).
مطالعه Giannini P. و همکاران در سال 2008 با عنوان « فعالیت فانکشنال و توزیع ایمنوهیستو شیمیایی سلولی گلوتاتیون S – ترانسفراز در بافت دهانی سالم، دیسپلاستیک و SCC »، فعالیت بیشتر گلوتاتیون S – ترانسفراز در بافت SCC را در مقایسه با مخاط نرمال نشان داد و پیشنهاد شد uperegulation گلوتاتیون S – ترانسفراز حداقل در تعدادی از ضایعات دهانی پیش بدخیم و بدخیم رخ می دهد(45).
در مطالعه Richie JP. و همکاران در سال 2008 با عنوان « مقادیر گلوتاتیون، آهن و ریزمغذی ها و ریسک سرطان دهان» ارتباط ریسک سرطان دهان با مقادیر سرمی آهن، ویتامین های E و C و B2 و A و روی، تیامین و گلوتاتیون (GSH) تعیین شد. محققان با توجه به نتایج این مطالعه پیشنهاد کردند کمبود ضعیف آهن و مقادیر کم GSH که هر دو مرتبط با استرس اکسیداتیو افزایش یافته هستند، ریسک سرطان در حفره دهان را افزایش می دهند(46).
Sharifi R. و همکاران در سال 2008 در مطالعه ای با عنوان « ارتباط پلی مرفیسم ژنتیکی گلوتاتیون S – ترانسفراز P1 و تجمع پروتئین P53 در بیماران ایرانی مبتلا به SCC مری » هیچ ارتباطی بین پلی مرفیسم گلوتاتیون S – ترانسفراز P1 و تجمع پروتئین P53 در سلول های اپی تلیوم مری پیدا نکردند(47).
Prabhu K. و همکاران در سال 2007 با طراحی مطالعه ای با عنوان « مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز تام سرم در سرطان دهان » دریافتند که مقدار این مارکر در مبتلایان به stage چهار سرطان دهان افزایش قابل توجهی نسبت به stage دو و سه داشته و این امر نشان می دهد تغییر مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز تام سرم ممکن است با پیشرفت سرطان دهان ارتباط داشته باشد(48).
Walshe g . و همکاران در سال 2007 در مطالعه ای با عنوان « غیر فعال شدن گلوتاتیون پراکسیداز به عنوان عامل کمک کننده در ایجاد SCC القا شده توسط U.V » بیان کردند SCC مرتبط با اختلال در فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و مقادیر پراکسید است. بطوریکه مشاهده کردند چهار، پنجم SCC های پوستی مرتبط با کاهش فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و افزایش بار پراکسید است. گلوتاتیون پراکسیداز توسط یک مکانیسم پس از ترجمه غیرفعال می شود و افزایش مقادیر پراکسید داخل سلولی می تواند گلوتاتیون پراکسیداز را غیرفعال کند. نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند غیرفعال شدن گلوتاتیون پراکسیداز در پوست انسان ممکن است یک رویداد اولیه در ایجاد SCC القا شده توسط نور UV باشد(49).
Rasmi y. و همکاران در سال 2006 مطالعه ای با عنوان « مقایسه بیان گلوتاتیون S – ترانسفراز pi در سطح mRNA در مخاط مری با استفاده از RT_ PCR_ ELISA در افراد مبتلا به بیماری رفلاکس آدنوکارسینوما و SCC مری » طراحی کردند. آنها از 66 بیوپسی بافت مری که به عنوان بیماری رفلاکس غیر اروزیو (NERD)، بیماری رفلاکس معده ای – مری (GERD)، آدنوکارسینوما و SCC تشخیص داده شده بود، استفاده کردند. نتایج کاربرد تکنیک RT_ PCR_ ELISA نشان داد هیچ تفاوت معنی داری در بیان گلوتاتیون S – ترانسفراز pi (GST- pi) در نمونه های نرمال، NERD و GERD وجود ندارد. بیان بیش از حد GST- pi در بافت های بدخیم (آدنوکارسینوما و SCC ) قابل تشخیص بود. بنابراین محققان اعلام کردند بیان GST- pi در مری مبتلا به GERD و NERD تغییر نمی کند، در حالیکه در آدنوکارسینوما و SCC به شدت بیشتر از بافت نرمال و ملتهب است(50).
Fiaschi Al . و همکاران در سال 2005 در مطالعه ای با عنوان « گلوتاتیون ، آسکوربیک اسید و آنزیم های آنتی اکسیدانت در خون و بافت تومور بیماران SCC » تغییرات آنتی اکسیدانت ها را در این بیماران بررسی کردند. نتایج حاکی از افزایش قابل توجه مقادیر گلوتاتیون و آسکوربیک اسید و در مقابل کاهش قابل توجه فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت در بیماران SCC در مقایسه با افراد سالم بود(51).
مطالعه GUO GF . و همکاران در سال 2005 که « ارتباط بروز گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST- pi) و آنتی ژن هسته ای تکثیر سلول (PCNA) در پیش آگهی SCC پیشرفته سینوس ماگزیلا به روش ایمنوهیستوشیمی » را می سنجید، نشان داد افزایش بروز GST- pi یک فاکتور پیش آگهی مستقل در SCC پیشرفته سینوس ماگزیلاست. اما PCNA خیر، به طوریکه افزایش بروز GST- pi مشاهده شده در این بیماران کاملأ مرتبط با بهبود میزان بقای 5 ساله بود(52).
Geisler SA . و همکاران در سال 2005 در مطالعه ای با عنوان « پلی مرفیسم گلوتاتیون S – ترانسفراز و بقای سرطان سر و گردن » با هدف ارزیابی توانایی پروگنوستیک پلی مرفیسم سه ژن درگیر در مکانیسم کارسینوژنز تنباکو در 190 بیمار مبتلا به SCC سر و گردن، مشاهده کردند افرادی که ژنوتیپ فانکشنال GSTT1 داشتند، احتمال مرگ 3 برابر بیشتر ناشی از SCC نسبت به افراد مبتلا به SCC که فاقد این ژنوتیپ بودند، داشتند. آنها پیشنهاد کردند مارکرهای ژنومیک مکانیسم کارسینوژنز و ترمیم DNA می تواند به عنوان یک شاخص پروگنوستیک در عود بیماری و مرگ ناشی از آن باشد(53).
Rawal RM . و همکاران در سال 1999 در مطالعه ای با عنوان « ارزیابی گلوتاتیون S – ترانسفراز و گلوتاتیون رودکتاز در بیماران مبتلا به SCC با مخاط باکال » با اندازه گیری میزان فعالیت گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST) و گلوتاتیون رودکتاز (GR) به روش اسپکتروفتومتری به این نتیجه رسیدند مقادیر GST سرم در بیماران کاهش قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل دارد و در مقابل مقادیر سرمی GR در بیماران افزایش قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل نشان می دهد. کاهش مقادیر GST سرم ممکن است با افزایش استعداد به آسیب ناشی از کارسینوژن ها در ارتباط باشد(54).
Mulder TP. و همکاران در سال 1998 در مطالعه ای با عنوان « مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز از پلاسما در بیماران مبتلا به SCCسر و گردن » مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST) را در پلاسمای 230 بیمار با روش الایزا اندازه گیری کردند. نتایج افزایش GST پلاسما را فقط در 14% این بیماران نشان داد و پیشنهاد شد احتمالأ ارتباط معنی داری بین مقادیر GST پلاسما و مرحله بالینی تومور وجود ندارد(55).
بیان مسئله و ضرورت انجام تحقیق
SCC شایعترین بدخیمی حفره دهان است، به طوریکه 95 – 90 % همه بدخیمی های دهان را SCC تشکیل می دهد(56)، میزان وقوع آن به خصوص در افراد جوان رو به افزایش است و علی رغم تحقیقات فراوان، میزان مرگ و میر آن تغییر چندانی نکرده است(57). زیرا ضایعات اولیه اغلب بدون علامت بوده و بیماران در مراحل انتهایی شناسایی می شوند. لذا تشخیص این سرطان در مراحل اولیه، تأثیر قابل توجهی در بهبود پیش آگهی آن دارد(2). تا کنون تحقیقاتی بر روی بیومارکرهای مؤثر در پروگنوز SCC صورت گرفته است. سرم بیماران از جمله محیط های بیولوژیکی است که تغییرات میزان بیومارکرها را در خود منعکس می کند(58).یکی از بیومارکرهای قابل اندازه گیری در سرم مبتلایان به SCC ، گلوتاتیون است که پپتیدی داخل سلولی با اعمال متفاوتی از جمله: سم زدایی، دفاع آنتی اکسیدانی و تعدیل نمودن پرولیفراسیون سلولی می باشد(18). گلوتاتیون دارای دو فرم احیا یا همان GSHو اکسید یا همان GSSG می باشد. پدیده اکسیداسیون – احیا از خصائص ذاتی سلول بوده و گلوتاتیون در این امر نقش اساسی دارد(23). گلوتاتیون که خود یک ترکیب احیا شده است، در واکنش با رادیکال های آزاد و سموم به فرم اکسید خود (GSSG) تبدیل شده با حضور آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز و کوفاکتور NADPH مجددأ به فرم احیاء خود باز می گردد. کسر GSH /GSSG از فاکتورهای مهم در ارتباط با تغییرات دائم رادیکال های آزاد اکسیژن می باشد. میزان این کسر در سلول های مختلف، متفاوت بوده، نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با فعالیت آن می باشد(23). در حالت عادی نسبت GSH /GSSG در سرم برابر 1/3 می باشد(23). البته این میزان در داخل سلول می تواند تا 1/100 باشد(23). استرس شدید اکسیداتیو سبب انباشتگی GSSG شده و مقدار کسر کاهش می یابد که کاهش مقاومت بدن برای مقابله با رادیکال های آزاد را در پی دارد(23). منظور از استرس اکسیداتیو زمانی است که تعادل بین تولید مواد اکسیدان و آنتی اکسیدان در بدن به نفع اکسیدان ها دچار اختلال شود(24). اختلال در سنتز گلوتاتیون در آسیب شناسی بسیاری از بیماری ها از جمله سرطان نقش دارد. زیرا گلوتاتیون با اثر بر فاکتور نکروز دهنده تومور (TNF – α) در کاهش مرگ ومیر سلولی مؤثر می باشد، به طوریکه کاهش میزان گلوتاتیون در سلول های سرطانی دلیلی بر این ادعاست(59). در مطالعات مختلف نتایجی در مورد رابطه میزان گلوتاتیون سرم و گسترش SCC به دست آمده است. پیش از این افزایش مقادیر گلوتاتیون سرم در Stage سه و چهار نسبت به Stage یک و دو یافت شده است(48). همچنین در مطالعات ایمنوهیستوشیمی بر روی نمونه های بیوپسی SCC دهانی، میزان گلوتاتیون در بافت SCC اندازه گیری شده است(41). در مطالعه دیگری کاهش میزان گلوتاتیون سرم مرتبط با افزایش ریسک سرطان دهان عنوان شده است(46).
هیچ مطالعه ای که نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان را در سرم بیماران مبتلا به SCC سر و گردن با افراد سالم مقایسه کرده باشد، وجود ندارد. در این مطالعه قصد داریم سطح سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیا و نسبت GSH /GSSG و همچنین تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان را در سرم بیماران مبتلا به SCC سر و گردن اندازه گیری و با افراد سالم مقایسه نموده و ارتباط آن را با مرحله بالینی و درجه هیستوپاتولوژی تومور تعیین کنیم. مزیت این مطالعه بر مطالعات قبلی در بررسی نسبت GSH /GSSG می باشد که منعکس کننده برهم کنش سیستم اکسیدان و آنتی اکسیدان بوده و قدرت نظر دادن در مورد استرس اکسیداتیو را دارد نه اینکه صرفأ فعالیت یک آنزیم درگیر در این پروسه را نشان دهد. در صورت وجود ارتباط بین این موارد با مرحله بالینی و درجه هیستوپاتولوژی تومور و تفاوت معنی دار با افراد سالم، می توان پیشنهاد کرد در مطالعات بعدی از اندازه گیری نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در تشخیص زود هنگام SCC سر و گردن و کنترل بیماران در جلسات فالوآپ جهت بررسی عود بیماری استفاده شود.
اهداف و فرضیات
هدف کلی: تعیین میزان سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیا و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در مبتلایان به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن و مقایسه آن با افراد سالم
اهداف اختصاصی:
تعیین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم افراد سالم
مقایسه میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم
تعیین رابطه بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم و Stage کلینیکی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین رابطه بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم وG--e هیستوپاتولوژی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن
اهداف کاربردی:
در صورت وجود ارتباط بین نسبت سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در مبتلایان به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن با Stage و G--e بیماری، می توان پیشنهاد کرد در مطالعات بعدی از اندازه گیری نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در تشخیص زود هنگام SCC سر و گردن و کنترل بیماران در جلسات فلوآپ جهت بررسی عود بیماری استفاده شود.
فرضیات تحقیق:
میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم تفاوت دارد.
تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم تفاوت دارد.
بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم و Stage کلینیکی تومور در مبتلایان به SCC سر و گردن، ارتباط وجود دارد.
بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم وG--e هیستوپاتولوژی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن ارتباط وجود دارد.
نوع مطالعه
این مطالعه از نوع بررسی مقطعی (Cross Sectional) بود.
محل اجرای طرح
این تحقیق در دانشکده دندانپزشکی مشهد، دانشکده پزشکی مشهد و بیمارستان امید مشهد انجام شد.
جمعیت مورد مطالعه
بیماران مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هستیوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و گروه کنترل از افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392 انتخاب شدند.
روش نمونه گیری
نمونه ها به روش غیر احتمالی از نوع مبتنی بر هدف انتخاب شدند.
حجم نمونه
با توجه به اینکه مطالعه مشابه به این طرح تاکنون انجام نشده است، مطالعه حاضر به صورت پایلوت و با وارد کردن 20 نفر مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد و 20 نفر سالم داوطلب انجام شد.
روش اجرای طرح
برای انجام این طرح که بصورت پایلوت انجام شد، 20 نفر مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هیستوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و 20 نفر سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392که آگاهانه حاضر به شرکت در مطالعه بوده و فرم رضایت نامه را امضا کرده بودند( هر دو گروه بیمار و سالم)، انتخاب شدند. همکار متخصص گوش و حلق و بینی، از انجام رضایت مندانه نمونه گیری بیماران قبل از شروع درمان( جراحی یا رادیوتراپی یا شیمی درمانی) اطمینان حاصل نمودند. سپس 5 میلی لیتر خون از هر شخص گرفته شد. برای جمع آوری نمونه سرم، به خون جمع آوری شده در لوله ها، هیچ ماده ضدانعقادی مثل هپارین یا سیترات اضافه نکرده و اجازه داده می شد خون طی مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد بماند تا لخته تشکیل دهد. سپس خون با دور 2000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفوژ می شد و روی یخ قرار می گرفت و در این مرحله دپروتئینه می شد. با توجه به اینکه اندازه گیری در همان روز نمونه گیری انجام نمی شد( زیرا همه نمونه ها جمع آوری شده و سپس، کیت برای آزمایش مورد استفاده قرار می گرفت) باید سرم دپروتئینه شده در دمای منفی80 درجه سانتی گراد نگهداری می شد. در این صورت نمونه برای حداقل 6 ماه ثابت می ماند. برای اندازه گیری گلوتاتیون، نمونه های سرمی قبل از آزمایش نیازمند دپروتئینه شدن و به غلظت رسیدن هستند. در این آزمایش از سه ماده شیمیایی متافسفریک و تری اتانول آمین( برای دپروتئینه کردن سرم) و وینیل پیریدین( برای به غلظت رساندن گلوتاتیون) استفاده شد.
دپروتئینه شدن:
تقریبأ تمام نمونه های بیولوژیک مورد استفاده برای اندازه گیری GSH ، حاوی مقادیر زیادی پروتئین هستند. لازم است تا آنجا که امکان دارد مقادیر بیشتری پروتئین از نمونه برداشته شود تا از تداخلات ذرات ریز و گروه های سولفیدریل در آزمایش اجتناب شود.
نمونه هایی که کمتر از mg/ml 1 (یک میلی گرم در میلی لیتر) پروتئین داشته و عاری از ذرات ریز هستند، می توانند بی درنگ تحت آزمایش قرار گیرند. به منظور دپروتئینه کردن نمونه های سرم در این طرح به روش زیر عمل می شد:
5 گرم از متافسفریک اسید در 50 میلی لیتر آب حل می شود. این محلول در دمای 25 درجه سانتی گراد برای چهار ساعت با ثبات باقی می ماند.
حجم مساوی با حجم سرم از محلول بالا، به لوله حاوی سرم اضافه می شود.
ورتکس کردن لوله [ ورتکس: ناحیه ای در مایع که بیشترین چرخش و حرکت در آن قسمت وجود داشته و جزء مهمی از جریان گردبادی مایع می باشد.]
لوله حاوی نمونه در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه نگهداری می شود.
لوله در دستگاه سانتریفوژ با دور 3000 برای 5 دقیقه قرار می گیرد.
سوپرناتانت( ماده شناور ) حاصله با دقت جدا و به میکروتیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال می یابد.
در این مرحله سرم های دپروتئینه با محلول تری اتانول آمین مخلوط می شوند.
ماده حاصله در دمای منفی 80 درجه سانتی گراد فریز می شود.
نمونه ها درست قبل از انجام آزمایش توسط کیت مربوطه، طی فرآیند لیوفیلیزه شدن و با استفاده از وینیل پیریدین به غلظت می رسند.
لیوفیلیزه شدن (Lyophilization):
فرآیند خشک کردن یک نمونه ی در معرض نابودی به منظور ایجاد شرایط مناسب برای انتقال آن. در این فرآیند ماده، منجمد شده و سپس فشار احاطه کننده کاهش می یابد تا به آب منجمد موجود در ماده، اجازه تصعید مستقیم از حالت جامد به حالت گاز داده شود(60).
برای انجام آزمایشات این طرح، طبق پروتکل شرکت سازنده کیت آزمایش گلوتاتیون ( (Cayman Chemical Company به روش اسپکتروفتومتری عمل شد(61). در این آزمایش از گلوتاتیون ردوکتاز برای تعیین GSH (فرم احیاء گلوتاتیون) استفاده می شد. گروه سولفیدریل GSH با 5 و 5- دی تیو- بیس-2- نیتروبنزوئیک اسید (DTNB) واکنش داده و ماده زرد رنگ 5- تیو- 2- نیتروبنزوئیک اسید (TNB) را تولید می کند. دی سولفید مخلوط GSTNB (بین GSH و TNB) که به صورت همزمان تولید می شود، به وسیله گلوتاتیون روکتاز احیا شده تا چرخه مجدد GSH را برقرار نموده و TNB بیشتری تولید کند. میزان تولید TNB مستقیمأ به این واکنش چرخه مجدد بستگی دارد که در واقع باید گفت به غلظت GSH در نمونه بستگی دارد. اندازه گیری میزان جذب TNB در طول موج 405 تا 414 نانومتر، تخمین دقیق GSH در نمونه را فراهم می کند. GSH به آسانی به دایمر دی سولفید GSSG (فرم اکسید گلوتاتیون) اکسیده می شود. GSSG طی احیای هیدروپراکسیدها توسط گلوتاتیون پراکسیداز تولید می شود. GSSG توسط گلوتاتیون رودکتاز به GSH احیا می شود، یعنی همان فرمی که عمدتأ در سیستم های بیولوژیک وجود دارد. از آنجایی که گلوتاتیون رودکتاز در آزمایش Cayman Chemical Company مورد استفاده قرار می گیرد، هم GSH و هم GSSG اندازه گیری می شود.
چرخه ی GSH:

برای اندازه گیری تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان، باید مراحل زیر طبق پروتکل شرکت سازنده کیت آزمایش آنتی اکسیدان (Cayman Chemical Company) روی سرم های دپروتئینه و لیوفیلیزه شده انجام می شد:
1) درون هر چاهک ( محل نمونه ) 10 میکرولیتر از ماده مت میوگلوبین و 150 میکرولیتر ماده رنگزا (کروموژن) ریخته شود.
2) برای شروع واکنش میکرولیتر هیدروژن پراکساید به تمام چاهک ها اضافه شود.
3) پلیت با برچسب پوشیده شده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود.
برچسب برداشته شده و میزان جذب نوری نمونه ها در طول موج 450 نانومتر در دستگاه plate reader خوانده شود.

تصویر 2-1: کیت گلوتاتیونGlutathione Assay Kit (Cayman Chemical Company)

تصویر 2-2: کیت آنتی اکسیدان (Antioxidant Assay Kit (Cayman Chemical Company

تصویر 2-3: پلیت آماده شده قبل از قرار گرفتن در دستگاه plate reader

تصویر 2-4: پلیت آماده شده در دستگاه plate reader

تصویر 2-5: نمونه ای از قرائت جذب نوری توسط دستگاه plate reader
اطلاعات پس از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS نسخه 16 شده و آنالیز توصیفی با استفاده از جداول و نمودارها و آنالیز تحلیلی با استفاده از تست مقایسه دو میانگین مناسب انجام گرفت.
معیارهای ورود
بیماران مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هستیوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و گروه کنترل از افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392 که آگاهانه حاضر به شرکت در مطالعه بودند( هر دو گروه سالم و بیمار) انتخاب شدند.
معیارهای خروج
سوء مصرف روزانه الکل در زمان انجام مطالعه(62)
عملکرد کبدی یا کلیوی مختل( در صورت وجود علائم یا سابقه مشکوک بیماری کبدی یا کلیوی در تاریخچه، از مطالعه خارج می شوند) (62).
عدم رضایت از شرکت در مطالعه(62)
وجو هر گونه ضایعه دهانی در گروه کنترل در زمان انجام مطالعه(62)
شیوه گردآوری اطلاعات
اطلاعات به روش میدانی و آزمایشگاهی گردآوری شدند.
ابزار گردآوری اطلاعات
اطلاعات با استفاده از ابزارهای مشاهده و چک لیست گردآوری شدند.

جدول متغیرها
نام متغیر نقش نوع مقیاس تعریف کاربردی واحد اندازه گیری
گلوتاتیون احیا سرم
وابسته کمی پیوسته نسبتی تری پپتیدی با خواص آنتی اکسیدانی که در سرم قابل اندازه گیری است میکرومولار
گلوتاتیون اکسید سرم وابسته کمی پیوسته نسبتی فرمی از گلوتاتیون که در واکنش با اکسیدان ها تولید می شود و در سرم قابل اندازه گیری است میکرومولار
نسبت گلوتاتیون احیا به اکسید در سرم
وابسته کمی پیوسته نسبتی کسری که نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با محیط اطراف آن می باشد تعادل اکسیدان- آنتی اکسیدان در سرم وابسته کمی پیوسته نسبتی به وسیله کاتیون دار نمودن محلول تترا متیل بنزیدین توسط آنزیم پراکسیداز در سرم قابل اندازه گیری است ابتلا به SCC مستقل کیفی اسمی براساس تشخیص بافت شناسی Stage بیماری

وابسته کیفی گسسته رتبه ای I, II, III,IV G--e بیماری وابسته کیفی گسسته رتبه ای I, II, III سن زمینه ای کمی پیوسته نسبتی بر اساس سال شمسی
جنس زمینه ای کیفی اسمی زن/ مرد روش تجزیه و تحلیل داده ها و بررسی آماری
اطلاعات پس از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS نسخه 16 شد و آنالیز توصیفی با استفاده از جداول و نمودارها و آنالیز تحلیلی با استفاده از تست مقایسه دو میانگین مناسب ( بر اساس چگونگی توزیع داده ها که نرمال یا غیرنرمال باشند از تست T-test یا من ویتنی) و تست همبستگی اسپیرمن انجام گرفت که سطح معنی داری در تمام آزمون ها 05/0 بود.

ملاحظات اخلاقی
کلیه بیماران برای شرکت در این طرح به صورت آگاهانه فرم رضایت نامه ( ضمیمه1) را مطالعه و در صورت رضایت شخصی آن را امضا کردند.
کلیه اطلاعات پرونده بیماران محرمانه و گزارش آن به صورت کلی بود.
در این مطالعه هیچگونه مداخله درمانی انجام نگرفته و صرفأ یک مطالعه مقطعی بود. با توجه به اینکه افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون450 میلی لیتر خون اهدا می کنند، با کسب اجازه از بیماران 5میلی لیتر از خون آنها برای انجام آزمایشات به کار رفت. در مورد بیماران نیز 5میلی لیتر خون در صورت رضایت گرفته شد.
از میان کدهای 26 گانه اخلاقی، کد شماره 2 مرتبط با موضوع این پژوهش است.
الف. اطلاعات دموگرافیک و بالینی افراد مورد مطالعه
در این مطالعه 40 نفر شرکت داشته اند که 20 نفر آنها مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن و 20 نفر افراد سالم می باشند.
جنس: در کل افراد مورد مطالعه، 28 نفر مذکر و 12 نفر مونث بودند. در گروه سالم 19 نفر مذکر و 1 نفر مونث بودند. در گروه بیمار 9 نفر مذکر و 11 نفر مونث بودند (جدول3-1).
سن: میانگین سنی بیماران 5/60 سال و میانگین سنی افراد سالم 25/49 سال بود. حداقل و حداکثر سن 35 و 85 سال بود. میانگین سنی کل افراد مورد مطالعه44/11 ± 87/54 سال بود (نمودار3-1) .
محل ضایعه: در بیماران مورد مطالعه محل تومور در 2 نفر کف دهان، 6 نفر زبان، 6 نفر حنجره و 6 نفر سایر نواحی مخاط دهان بود.
مرحله بالینی تومور((stage : 5 نفر از این بیماران در مرحله I ، 7 نفر در مرحله II و 8 نفر در مرحله III بیماری بودند.
درجه هیستوپاتولوژی تومور(g--e) : 2 نفر از این بیماران درجه I ، 16 نفر درجه II و 2 نفردرجه III داشتند.
جدول3-1: توزیع فراوانی جنسیت در گروه های مورد مطالعه
جنسیت گروه های مورد مطالعه نتیجه آزمون
کای دو
سالم بیمار تعداد درصد تعداد درصد مذکر 19 0/95 9 0/45 001/0
مونث 1 0/5 11 0/55 کل 20 0/100 20 0/100 نتیجه آزمون کای دو نشان میدهد که ارتباط معنی داری بین جنسیت و گروه های مورد مطالعه وجود دارد
(001/0=P) و در گروه سالم 0/95 درصد مذکر بوده اند در حالی که این میزان در گروه بیمار 0/45 درصد بوده
است.

نمودار3-1: توزیع سن در گروه های مورد مطالعه
نتیجه آزمون t ی مستقل نشان میدهد که توزیع سن در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری دارند (001/0=P).

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

ب. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه به تفکیک گروه های بیمار و سالم
نتایج مطالعه نشان داد:
میزان گلوتاتیون توتال در گروه های بیمار(51/1 ± 75/6) و سالم(02/2 ± 92/8) تفاوت معنی داری دارد(001/0> P) (نمودار 3-2).

نمودار 3-2: میزان گلوتاتیون توتال در گروه های بیمار و سالم
.B میزان GSSG در گروه های بیمار(65/0 ± 10/5) و سالم(92/1 ± 22/5) تفاوت معنی داری ندارد
(796/0=P) (نمودار 3-3).

نمودار 3-3: میزان GSSG در گروه های بیمار و سالم
. C میزان GSH در گروه های بیمار(29/1 ± 064/1) و سالم(34/2 ± 069/3) تفاوت معنی داری دارد
(002/0=P) (نمودار 3-4).

نمودار 3-4: میزان GSH در گروه های بیمار و سالم
D . نسبت GSH/GSSG در گروه های بیمار(24/0 ± 322/0) و سالم(94/0 ± 920/0) تفاوت معنی داری
دارد (011/0=P) (نمودار 3-5).

نمودار 3-5: نسبت GSH/GSSG در گروه های بیمار و سالم
.E تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در گروه های بیمار(12/0 ± 11/1) و سالم(07/0 ± 07/1)
تفاوت معنی داری ندارد (266/0=P) (نمودار3-6).

نمودار 3-6: میزان تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در گروه های بیمار و سالم
جدول3-2: توزیع متغیرهای مورد مطالعه به تفکیک گروههای بیمار و سالم
متغیر ها
گروه های مورد مطالعه نتیجه آزمون
بیمار سالم میانگین ± انحراف استاندارد میانگین±انحراف استاندارد Total Glutathion 51/1 ± 75/6 02/2 ± 92/8 001/0> P
GSSG 65/0 ± 10/5 92/1 ± 22/5 796/0= P
GSH 29/1 ± 64/1 34/2 ± 69/3 002/0= P
GSH/GSSG 24/0 ± 322/0 94/0 ± 92/0 011/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 12/0 ± 11/1 07/0 ± 07/1 266/0= P
نتیجه آزمون t ی مستقل نشان میدهد که سطح GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری ندارند(796/0=P و 266/0=P). اما سطح Total Glutathion ، GSH و GSH/GSSG در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری دارند (001/0> P ، 002/0= P و 011/0=P ).
ج. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه در ارتباط با مرحله بالینی و درجه تومور
ارتباط متغیرهای مورد مطالعه و مرحله بالینی تومور(جدول 3-3)
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد:
در بیماران بین میزان گلوتاتیون توتال با مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد
(415/0=P).
در بیماران بین میزان GSSGو مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(077/0=P).
در بیماران بین میزان GSHو مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(907/0=P).
در بیماران بین نسبت GSH/GSSG و مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(994/0=P).
در بیماران بین تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان و مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(907/0=P).
جدول 3-3: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و مرحله بالینی تومور
متغیرهای مورد مطالعه مرحله بالینی سطح معنی داری
I II III میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 98/1 ± 44/7 88/0 ± 23/6 63/1 ± 77/6 415/0= P
GSSG 60/0 ± 58/5 28/0 ± 73/4 77/0 ± 13/5 077/0= P
GSH 85/1 ± 85/1 97/0 ± 50/1 31/1 ± 63/1 907/0= P
GSH/GSSG 32/0 ± 33/0 21/0 ± 32/0 25/0 ± 31/0 994/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 08/0 ± 12/1 14/0 ± 14/1 13/0 ± 07/1 593/0= P
ارتباط متغیرهای مورد مطالعه و درجه هیستوپاتولوژی تومور(جدول 3-4)
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد:
در بیماران بین میزان گلوتاتیون توتال با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(431/0=P).
در بیماران بین میزان GSSG با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(374/0=P).
در بیماران بین میزان GSH با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(302/0=P).
در بیماران بین نسبت GSH/GSSG با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(233/0=P).
در بیماران بین تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(558/0=P).
23812573660جدول 3-4: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و درجه تومور
00جدول 3-4: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و درجه تومور

متغیرهای مورد مطالعه درجه سطح معنی داری
I II III میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 09/1 ± 33/6 56/1 ± 63/6 11/1 ± 08/8 431/0= P
GSSG 18/0 ± 47/4 67/0 ± 18/5 76/0 ± 11/5 374/0= P
GSH 27/1 ± 85/1 31/1 ± 45/1 34/0 ± 96/2 302/0= P
GSH/GSSG 301/0 ± 42/0 24/0 ± 27/0 01/0 ± 58/0 233/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 04/0 ± 08/1 12/0 ± 10/1 19/0 ± 20/1 558/0= P
به جهت تایید نتایج آزمون آنالیز واریانس، آنالیز متغیرهای مورد مطالعه در ارتباط با مرحله بالینی و درجه تومور علاوه بر آنالیز واریانس توسط ضریب همبستگی اسپیرمن نیز انجام شد. نتیجه ضریب همبستگی اسپیرمن نشان می دهد که در گروه بیماران بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با مرحله بالینی و درجه تومور رابطه معنی داری وجود ندارد (جدول 3-5).
جدول 3-5: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه با مرحله بالینی و درجه تومور
متغیرهای مورد مطالعه مرحله بالینی درجه
ضریب همبستگی سطح معنی داری ضریب همبستگی سطح معنی داری
Total Glutathion 067/0- 778/0 291/0 213/0= P
GSSG 143/0- 547/0 272/0 247/0= P
GSH 070/0- 770/0 155/0 514/ 0= P
GSH/GSSG 019/0- 936/0 116/0 625/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 200/0- 398/0 165/0 487/0= P
در نمودار های 3-7 تا 3-16 سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در مقابل مرحله بالینی و درجه تومور رسم شده است که نمودارهای ذیل نیز نشان دهنده عدم وجود ارتباط بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با مرحله بالینی و درجه تومور میباشند.

نمودار3-7: توزیع سطح Total Glutathion بر حسب Stage

نمودار3-8: توزیع GSSG بر حسب Stage

نمودار3-9: توزیع GSH بر حسب Stage

نمودار3-10: توزیع GSH/GSSGبر حسب Stage

نمودار3-11: توزیع سطح تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان بر حسب Stage

نمودار3-12: توزیع سطح Total Glutathion بر حسب G--e

نمودار3-13: توزیع GSSG بر حسب G--e

نمودار3-14: توزیع GSH بر حسب G--e

نمودار3-15: توزیع GSH/GSSG بر حسب G--e

نمودار3-16: توزیع تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان بر حسب G--e
د. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه بر حسب محل تومور
در بیماران بین متغیرهای مورد مطالعه با محل تومور ارتباط معنی داری وجود نداشت (جدول 3-6).
جدول 3-6: توزیع متغیرهای مورد مطالعه بر حسب محل تومور
متغیرهای مورد مطالعه محل تومور نتیجه آزمون
کف دهان زبان حنجره مخاط سایر نواحی دهان میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 31/1 ± 15/6 12/2 ± 85/6 36/1 ± 15/6 907/0 ± 43/7 503/0= P
GSSG 815/0 ± 68/5 76/0 ± 05/5 45/0 ± 00/5 75/0 ± 07/5 669/0= P
GSH 50/0 ± 47/0 66/1 ± 80/1 13/1 ± 14/1 88/0 ± 36/2 220/0= P
GSH/GSSG 07/0 ± 077/0 28/0 ± 34/0 20/0 ± 22/0 19/0 ± 48/0 133/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 054/0 ± 26/1 07/0 ± 08/1 18/0 ± 15/1 057/0 ± 05/1 142/0= P
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان میدهد که بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با محل تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد (503/0=P و 669/0= P ،220/0=P ،133/0=P و 142/0=P).
ه. تعدیل اثر سن و جنس بر متغیرهای مورد مطالعه
با توجه به اینکه سن و جنس در دو گروه تفاوت معنی داری با یکدیگر دارند به منظور تعدیل اثر این متغیرها در بررسی ارتباط بین SCC و سطح اکسیدان-آنتی اکسیدان، GSSG، GSH و GSH/GSSG از مدلهای خطی عمومی استفاده کرده (جدول 3-7) و نتیجه آن نشان میدهد که با تعدیل اثر سن و جنس، ارتباط معنی داری بین SCC با سطح اکسیدان-آنتی اکسیدان، GSSG و GSH وجود ندارد(224/0= P و 084/0= P ،296/0=P). اما بین SCC و GSH/GSSG ارتباط معنی داری وجود دارد (042/0=P).
جدول 3-7: نتیجه مدلهای خطی عمومی به منظور تعدیل اثر متغیرهای سن و جنس در بررسی ارتباط بین SCC و سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان
متغیر وابسته متغیرهای مستقل ضریب مدل فاصله اطمینان 95% سطح معنی داری
Total Glutathion گروه(مورد) 49/2- (037/0-، 140/4- ) 004/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 033/1- (53/0، 59/2- ) 188/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 017/0- (044/0، 079/0- ) 566/0= P
GSSG گروه(مورد) 411/0- (958/0، 779/1- ) 546/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 453/0- (843/0، 749/1- ) 483/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 006/0 (057/0، 045/0- ) 816/0= P
GSH گروه(مورد) 079/2- (295/0-، 863/3- ) 024/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 58/0- (109/1، 270/2- ) 491/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 023/0- (043/0، 090/0- ) 478/0= P
GSH/GSSG گروه(مورد) 553/0- (104/0، 209/1-) 097/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 031/0- (591/0، 653/0- ) 920/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 006/0- (018/0 ، 030/0- ) 622/0= P

user8300

2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز 18
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم 19
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی 22
اهداف 23
فرضیه 23
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- ابزار 25
عنوان صفحه
3-2- مواد 26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی 26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL 26
3-2-2-1- سوش باکتری 26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون 26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی 26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز 26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE 27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز 27
3-2-4- نرم افزارها 27
3-3- روشها 28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی 28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید 28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات 28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب 29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli 29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli 29
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی 29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد 30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری 31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا 32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL 32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL 33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی 33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین 34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد 34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 34
عنوان صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) 35
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفور 35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز 36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات 38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی 39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا 39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف 39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 40
فصل چهارم: نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا 43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL 44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی 44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز 45
4-3- سنتز مایعات یونی 47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی 48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف 49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی 51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم 51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی 54
فصل پنجم: بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 57
عنوان صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی 61
فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات
6-1- نتیجهگیری 63
6-2- پیشنهادات 63
فهرست منابع 65
چکیده انگلیسی 75
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) 6
شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز 9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب 12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز 18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید 28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL 42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی 45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL 46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL 47
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی 48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون 52
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85 54
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] 55
فصل اول
مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که میتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده زمین لیپیدها هستند و آنزیمهای لیپولیتیک نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیمهای لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلولهای یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیمها مزایای زیادی در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها میتوان اختصاصیت بالای آنها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینهها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیمها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم درBOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).
آنزیمهای میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیمهای میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دستورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن میباشد)، پایداری بیشتر و تولید آسانتر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتریها و بنابراین آسانتر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آنها، باعث تسهیل فرآیندهایی همچون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دستیابی به بیشترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلولها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی میشوند. تنها حدود دو درصد از گونههای میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شدهاند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).
1-2- لیپازها
لیپازها اولین بار در سال 1901 در باکتریهای Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهای امروزی Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسایی شدند (Eijkman et al., 1901). باکتریهای گفته شده هماکنون بیشترین مطالعات لیپازی را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روی آنزیمهای هیدرولیز کننده تریگلیسریدها میگذرد و حدود 70 سال است که توانایی لیپازها در کاتالیز واکنشهای هیدرولیز و سنتز استرها تشخیص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولین آنزیم لیپاز را (آنزیم تجزیه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شیره پانکراس کشف کرد. انسانها در قدیم لیپاز را از پانکراس حیوانات به صورت خالص یا به صورت مخلوط با سایر آنزیمهای پانکراس میگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مینمودند. به دلیل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوری آنزیم از آن، دانشمندان به سراغ لیپازهای میکروبی رفتند. لیپازها از نظر نوع منشأ ( باکتری، قارچ یا پستاندار و غیره) و از نظر خصوصیات متفاوت هستند. این آنزیمها دارای توانایی کاتالیز واکنشهای مختلفی از جمله واکنشهای هیدرولیزی، یا سنتز کربوکسیلیکاسترهای مختلف و تبدیل آنها به اسیدهای آلی و گلیسرول هستند. همه لیپازها اختصاصیت بسیار بالایی برای سوبستراهای گلیسریدی دارند.
آنزیمهای لیپولایتیک به دلیل کاربرد فراوانی که در بیوتکنولوژی دارند ( به عنوان مهمترین گروه بیوکاتالیزورها در بیوتکنولوژی)، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). تولید انبوه لیپازهای میکروبی نیازمند بیان شدید و کارآ از ژنهای مربوطه و فهم دقیق مکانیسم ملکولی نحوه پیچش پروتئین و ترشح آن میباشد. از جمله کاربردهای جدید لیپازها در بیوتکنولوژی میتوان استفاده از این آنزیم در سنتز بیوپلیمر، بیودیزل، داروهای خالص انانتیومری، مواد شیمیایی مورد استفاده در کشاورزی ( مانند انواع آفت کش)، ترکیبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسیاری از مواد شیمیایی مهم صنعتی، به دست آمده از روغنها و چربیها طی فرآیندهای شیمیایی را میتوان به کمک لیپازها با سرعت بیشتر، اختصاصیت بهتر و در شرایط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزینی بالای لیپازها و اختصاصیت بالای شیمیایی و انانتیومری آنها توجه بسیاری از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
لیپازهای گرفته شده از منابع مختلف باکتری، قارچ، گیاه و حیوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصیت به موقعیت پیوند، اختصاصیت به اسیدچرب، پایداری دمایی و pH بهینه و غیره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههای متعددی از باکتریها، مخمرها و قارچهای رشتهای توانایی تولید لیپاز دارند (جدول1) سویه های نزدیک به هم (از نظر تاکسونومی) ممکن است انواع مختلفی از لیپاز ها را تولید کنند (Sharma et al., 2001).
جدول 1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز
منشأ جنس گونه
باکتری Bacillus B. megaterium
B. subtilis
B. thermoleovorans
B. thermocatenulatus
B. cereus
Pseudomonas P. putida 3SK
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. fragi
Staphylococcus S. canosus
S. hyicus
S. haemolyticus
S. aureus
S. warneri
S. xylosus
قارچ Penicillium P. cyclopium
P. simplicissimum
Aspergillus A. niger
A. oryzae
Rhizopus Rhizop. delemar
Rhizop. oryzae
Rhizop. arrhizus
Rhizop. nigricans
Rhizop. nodosus
مخمر Candida C. rugosa
C. tropicalis
C. antarctica
لیپازها را میتوان براساس اختصاصیت به سه گروه تقسیم کرد (Mukherjee et al., 1994). لیپازهای غیر اختصاصی ملکولهای آسیل گلیسرول را در موقعیتهای تصادفی میشکنند و اسیدچرب آزاد و گلیسرول و منوآسیل گلیسرول و دیآسیلگلیسرول را به عنوان حدواسطهای واکنش ایجاد میکنند. محصولات این واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتالیزورهای شیمیایی است. در واکنش آنزیمی محصول در اثر دما کمتر تجزیه میشود و این به دلیل پایینتر بودن دمای واکنش در کاتالیز زیستی است. لیپازهای اختصاصی به موقعیتهای 1و3، آزادسازی اسیدچرب از موقعیتهای 1و3 اسکلت گلیسرولی را کاتالیز میکنند. لیپازهای دارای اسیدچرب اختصاصی، تنها یک اسیدچرب خاص از ملکول آسیل گلیسرول آزاد میکنند (Macrae et al., 1983). لیپازها همچنین تفکیک انانتیومری ترکیبات کایرال و واکنشهای استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون، و اینتراستریفیکاسیون را کاتالیز میکنند. این تواناییهای متنوع کاتالیز، در شکست چربیها، اصلاح چربیها و روغنها، سنتز ترکیبات آلی، تأمین شویندهها و روشهای تجزیهای، کاربرد بسیاری پیدا کرده است (Macrae et al., 1985).
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن
این خصوصیت لیپازها که در سطح بین فضای آبدوست و آبگریز عمل میکنند، وجه تمایز لیپازها از استرازها میباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولی آنزیمهای لیپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون میباشد. این آنزیمها نیز شبیه سرینپروتئازها دارای مجموعه سه تایی کاتالیتیک باقیمانده نوکلئوفیل- باقیمانده هیستیدین- باقیمانده اسیدی هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرین- هیستیدین- آسپارتات یا به صورت مجموعه سه تایی سرین- هیستیدین- گلوتامات میباشد (Noble et al., 1993).
جایگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقیماندههای آبگریز احاطه میشود. یک ساختار مارپیچ پلیپپتیدی همانند یک درپوش مانع از قرارگیری جایگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال میشود. همچنین محافظت از آنزیم در برابر فعالیت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تایی کاتالیتیک پروتئاز ایجاد شود (B--y et al., 1990). سمتی از درپوش که روبروی جایگاه فعال است بیشتر از زنجیرههای جانبی آبگریز آلیفاتیک تشکیل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بیرون قرار گرفته است.
تغییر جهتگیری ساختار α- هلیکس درپوش همراه با افزایش آبگریزی سطوح نزدیک جایگاه فعال و روبروی آن، باعث پدیده "فعال شدن در فضای بینابینی" میشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزیم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهای آبگریز، اتصال زنجیرههای آلیفاتیک سوبسترا به سطح آبدوست آنزیم، به ویژه در حضور یک لایه آبپوشی، بسیار نامطلوب است. فضای بینابینی ایجاد شده در دهانه شیار فعال ممکن است به فراهم سازی یک لایه ناکامل آبپوشی در اطراف ملکول لیپاز و در نتیجه تسهیل پیچش زنجیرههای آلیفاتیک ملکول سوبسترا در سطح آنزیم کمک کند (Petersen et al., 1996). پایدارسازی بیشتر میتواند به کمک محدودههای الکتروستاتیک موضعی در سطح آنزیم و با ایجاد جاذبه دوقطبی به سمت پیوند C-H (با قطبیت ضعیف) زنجیرههای جانبی آلیفاتیک فراهم شود.

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL).
آمینواسیدهای اصلی جایگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.
1-3- آنزیمها در محیط آلی
کلیبانو با انجام تعدادی آزمایش ابتدایی و ساده نشان داد که میتوان از آنزیمها در حلالهای آلی آبگریز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنین محیطهایی سرعت واکنش به شدت پایین میآید (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسیاری از لیپازها و همچنین برخی از پروتئازها و آسیلازها بسیار پایدار هستند، به طوری که حتی در حلالهای آلی بدونآب نیز فعالیت خود را حفظ میکنند. این خصوصیت اساس استفاده موفقیتآمیز از این آنزیمهای هیدرولاز در واکنشهای غیرهیدرولازی است. از جمله این واکنشهای غیرهیدرولازی میتوان آسیلاسیون الکلها و آمینها با اختصاصیت انانتیومری را نام برد که در صنعت کاربرد زیادی دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محیط آلی، که شامل مایعات یونی نیز میشود، با فعالیت آنزیم غالبا از جنبه حذف آب ضروری آنزیم مورد بررسی قرار میگیرد. بسیاری از آنزیمها برای فعال بودن به یک پوشش آبی کامل نیاز دارند، اما تعداد زیادی استثناء نیز وجود دارد مانند لیپاز B کاندیدا آنتراکتیکا (CALB) که فعالیت خود را حتی پس از خشک شدن با پنتوکسید فسفر حفظ میکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتیسیلین که برای فعال ماندن تنها نیاز به تعداد اندکی ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزیم دارد (Dolman et al., 1997). بررسی منابع علمی نشان میدهد که بیان نیاز آنزیم به آب در قالب فعالیت آبی (aW ) مرسومتر از بیان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهای غیرهیدرولازی با آنزیمهای لیپاز یا پروتئاز ممکن است باعث حفظ یا افزایش فعالیت آنزیمی شود. هرچند چنین محیطهایی همیشه باعث افزایش واکنشهای جانبی هیدرولازی میشوند. همچنین اسید حاصل از این واکنشها ممکن است باعث کاهش pH و از دست رفتن فعالیت آنزیمی شود.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

حلالهایی که به خوبی توسط این آنزیمها تحمل میشوند – هیدروکربنهای آروماتیک و آلیفاتیک، اترها، و الکلها (بجز متانول)- فقط به صورت ضعیفی با آنزیم برهمکنش میدهند و میتوان حدس زد که این حلالها کم و بیش فقط برای آنزیم یک فضای خالی ایجاد میکنند. تنها الکلها که تشکیل دهنده پیوند هیدروژنی هستند میتوانند لیپازها را غیرفعال کنند. حلالهایی که برهمکنش بسیار قوی با پروتئینها میدهند، مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) و دی متیل فرمآمید (DMF) نیز باعث غیرفعال شدن برگشتناپذیر آنزیمها میشوند. بنابراین آنزیمها برهمکنشهای قوی با هیچ مادهای به جز آب را نمیتوانند تحمل کنند (Van Rantwijk, 2007).
نامشخص بودن pH در محیط بدون آب یک عامل پیچیده در آنزیمشناسی است. آنزیم توزیع بار الکتریکی (pH ظاهری) را مطابق با آخرین محلول آبی، مثلا بافر لیوفیلیز، حفظ میکند (Zaks and Klibanov 1985). البته pH بهینه ظاهری تحت تأثیر نوع حلال و aW تغییر میکند (Yang et al., 1993). چنین اثرات مشابهی در محیط مایعات یونی نیز قابل انتظار است.
در حقیقت بیشترین اطلاعات درباره رفتار آنزیم در محیط غیرآبی، حاصل از مطالعات آنزیمها در حلالهای آلی است. اما حلال های آلی برای طبیعت زیان آور هستند بنابراین در سالهای اخیر تلاش زیادی در جهت یافتن جایگزین پاکتری برای محیطهای واکنش انجام شده است.از جمله محلولهای دوستدار محیط زیست مایعات یونی را میتوان نام برد که میتوانند جایگزین حلالهای آلی شوند.
علاقه عمومی برای افزایش سرعت واکنشهای آنزیمی در حلالهای آلی نیز عامل پیشبرنده دیگر به سمت مایعات یونی بوده است. یکی از دلایل کاهش فعالیت آنزیمی در حلالآلی (در مقایسه با محیط آبی) پایدارسازی مواد واکنش دهنده در حلال است (Klibanov et al., 1997). این اثر که در واقع همان افزایش حلالیت (افزایش Km) است، با به کارگیری غلظتهای بالاتری از ماده واکنشدهنده قابل جبران است (Halling et al., 2004). بقیه کاهش فعالیت، در حد 1 تا 2 برابر، مربوط به اثر مجموعهای از عوامل شامل ناپایدار شدن حالت گذار واکنش (Clark et al., 2004)، تغییرات کنفورماسیون و از دست دادن انعطافپذیری میباشد (Halling et al., 2004, Clark et al., 2004 ). ثابت دیالکتریک پایین محیطهای آلی معمولی باعث افزایش انرژی حالت گذار شدیدا قطبیده در مقایسه با آب میشود و بنابراین ناپایدار شدن حالت گذار را در پی خواهد داشت (Clark et al., 2004).
1-4- مایعات یونی
از میان مایعات مختلفی که میتوان بهعنوان حلال به کار برد تنها تعداد اندکی به طور عمومی مورد استفاده قرار میگیرند. با معرفی تکنولوژیهای سبز یک نگرانی اصلی، ایجاد جایگزینهای مناسب برای حلالهای مخرب است که در صدر جدول مواد شیمیایی زیانآور هستند. زیرا این حلالها در مقادیر بالا استفاده میشوند و به طور معمول مایعات فراری هستند. نمکهای مرکب مایعاتی هستند که فقط یون دارند (مایعات یونی). در صورت انتخاب مواد اولیه مناسب میتوان مایعات یونی ساخت که در دمای اتاق و در دمای پایینتر از دمای اتاق مایع هستند. مایعات یونی مواد جدیدی نیستند. بسیاری از آنها سالهای زیادی است که شناخته شدهاند. برای مثال میتوان [EtNH3][NO3] را نام برد که دمای ذوب 12 درجه سانتیگراد دارد و در سال 1914 معرفی شد. از همان زمان پیشنهاد شد که از مایعات یونی در سنتز شیمیایی به جای حلال استفاده شود. البته تنها در سالهای اخیر تعداد زیادی مقالات در این زمینه به چاپ رسیده است. برخی خصوصیات فیزیکی ساده مایعات یونی که آنها را به عنوان حلالهای بالقوه برای سنتز جالب توجه کرده است توسط ولتون بیان گردیده است (Welton et al., 1999):حلالهای خوبی برای طیف وسیعی از مواد آلی و غیر آلی هستند.
معمولا شامل یونهای نامتناسبی هستند که امکان قطبیت بالا در آنها را ایجاد میکند.
طبق مقیاس قطبیت نرمال شده که در آن تترامتیل سیلان صفر و آب 0/1 در نظر گرفته شده، قطبیت مایعات یونی مرسوم، به طور معمول در محدوده 6/0-7/0 قرار میگیرد ( مانند فرمامید و الکلهای محلول در آب )
(van Rantwijk et al., 2003). همچنین کاهش طول زنجیره آلکیلی متصل به حلقه ایمیدازولیوم و اندازه آنیون در مایعات یونی دارای کاتیون ایمیدازولیومی، با افزایش قطبیت مایع یونی در ارتباط است (Carmichael and Seddon, 2000). مقدار قطبیت مایع یونی گاهی به دما و حضور آب حساس است (Baker et al., 2002). مایعات یونی به دلیل قطبیت بالایی که دارند محیط خوبی برای واکنشهای شیمیایی و بیوشیمیایی ایجاد میکنند. زیرا میتوانند سوبستراهای مختلفی شامل ترکیبات آلی قطبی و غیرقطبی و ترکیبات آلی و غیر آلی و پلیمری را در خود حل کنند.
با تعدادی از حلالهای آلی غیر قابل امتزاج هستند و بنابراین یک جایگزین قطبی غیرآبی برای سیستمهای دو فازی میباشند. همچنین مایعات یونی آبگریز را میتوان به عنوان فاز قطبی غیر قابل امتزاج همراه با آب استفاده کرد (Welton et al., 1999).
مایعات یونی فرار نیستند و این به دلیل یونی بودن ماهیت آنها است که فشار بخار ناچیزی دارند. بنابراین میتوان از آنها بدون ایجاد آلودگی در سیستمهایی با مکش قوی استفاده کرد (Welton et al., 1999).
بنابراین مایعات یونی دارای پایداری دمایی بوده و فاقد فشار بخار میباشند (Gordon et al., 2001, Brennecke et al., 2001). به علاوه داری خصوصیات استثنائی به عنوان حلال هستند و میتوانند هر ماده شیمیایی را در خود حل کنند. با جایگزین کردن کاتیون، آنیون و اجزای متصل به آنها، میتوان خصوصیات این حلالها را تغییر داد و به این صورت مایع یونی مناسب برای واکنش خاصی را ایجاد نمود (Brennecke and Maginn, 2001) (شکل 1-3). گرچه هنوز مشخص نیست که مایع یونی چگونه خصوصیات کاتالایتیک آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهد، آنزیمها در مایعات یونی مانند [C4MIM][PF6] فعال و به شدت پایدار هستند (Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000, Laszlo et al., 2001).

شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز.
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی
دلیل تمایل به انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی در واقع میل به جایگزین کردن مایعات یونی غیرفرار به جای حلالهای آلی فرار بوده است. هرچند این واکنشها در محیط طبیعی آنزیم یعنی محیط آبی قابل انجام است اما حلالهای آلی به طور وسیعی همراه با آنزیمها مورد استفاده قرار گرفتهاند تا از این طریق میزان حلالیت واکنشگرهای آبگریز را بیشتر کرده و تعادل واکنش را از سمت هیدرولیز به سمت سنتز تغییر جهت دهند. همچنین خصوصیات غیرمرسوم مایعات یونی به عنوان حلال، باعث گسترش روشهای متعدد جدید و بسیار کارآ شده است (Van Rantwijk et al., 2007).1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی- آب
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. سری هافمیستر نوعی دستهبندی یونها است که به ترتیب توانایی آنها در حل کردن و رسوبدهی پروتئینها ایجاد شده است.
اخیرا در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. مایعات یونی را به خوبی میتوان براساس موقعیت قرارگیری یونها، در سری هافمیستر به گونهای مرتب نمود که ترتیبی از پایدارکنندهترین تا ناپایدارکنندهترین (کاسموتروپ تا کائوتروپ) ایجاد شود.
نمک های سری هافمیستر با ویژگی های کاسموتروپیک و کائوتروپیک یونها مرتبط هستند. یونهایی که به شدت آب پوشی میشوند به کاسموتروپ ها معروفند و آن دسته از یون هایی که به صورت ضعیف هیدراته می شوند، کائوتروپ خوانده می شوند (Lo Nostro et al., 2005). یونهای حاصل از نمکهای سری هافمیستر به دو گروه تقسیم می شوند: Salting- out و Salting- in (Kunz et al., 2004). یون های out-Salting (آنیون های کاسموتروپ مثل فسفات، سولفات وکاتیون های کائوتروپیک مثل کاتیون های آمونیوم) پروتئین ها را پایدارکرده و نیز باعث رسوب آنها می شوند. در مقابل یون های Salting- in (آنیونهای کائوتروپ مثل آنیون های پرکلرات، برماید و کاتیونهای کاسموتروپ مثل کاتیون لیتیم) پروتئین ها را ناپایدار میکنند (Kunz et al., 2004). درغلظت های پایین نمک (تا سقف 01/0 مولار) یون ها غالبا از طریق برهمکنش های الکترواستاتیک روی آنزیم ها تاثیر می گذارند. هنگامی که در غلظت های زیاد نمک نیروهای انتشار یا پراکندگی یونی بر پتانسیل الکترواستاتیک پیروز میشوند، اثر یونهای هافمیستری اهمیت پیدا میکنند (Lo Nostro et al., 2005).
بسیاری از آنزیمها به خوبی در طیف وسیعی از مایعات یونی در محیط آبی عمل میکنند. به سختی میتوان مایع یونی پیدا کرد که به هیچ عنوان با هیچ آنزیمی سازگاری نداشته باشد. در رابطه با پیشبینی سازگاری آنزیم و مایعات یونی آبی به نظر میرسد که کائوتروپی و کاسموتروپی نمیتوانند به عنوان تنها عوامل پیشبینی کننده استفاده شوند. همچنین بعید به نظر میرسد که بتوان سازگاری آنزیم با مایعات یونی را با در نظر گرفتن تعداد محدودی پارامتر همچون قطبیت یا logP تفسیر نمود. این موضوع در مورد حلالهای ملکولی محلول در آب نیز صدق میکند (Van Rantwijk et al., 2007).
اساس پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی آبی را میتوان این گونه بیان کرد که پروتئین زمانی پایداری خود را از دست میدهد که یونها یا ملکول های حلال اطراف آن با فرم بازشده آنزیم برهمکنش قویتری نسبت به فرم طبیعی آنزیم داشته باشند (Baldwin et al.,1996). چنین برهمکنشهای ناپایدارکنندهای میتوانند حاصل از "Salting in" یونهای دوگانه دوست روی گروههای آبگریز فرو رفته درون ساختار پروتئین یا حاصل از برهمکنشهای قوی آنها با پیوندهای پپتیدی باشد (Kaar et al., 2003, Lou et al., 2006). از جمله مباحث مهمتری که باید به خصوص در مورد آنزیمهای حساس مد نظر قرار داد میتوان تغییرات pH ایجاد شده توسط یونهای اسیدی یا قلیایی برونشتد و فعالیت آبی ترمودینامیکی را نام برد.
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001) و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای MeSO4- (Schofer et al., 2001)، NO3- (Kaar et al., 2003)، AcO-یا lactate- (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است (شکل 1-4). آب نیز چنین عملکردی دارد؛ اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
به نظر میرسد که مایعات یونی بدون آب با روشی مشابه حلالهای آلی مرسوم، آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهند؛ زیرا بسیاری از آنها به خوبی تحمل میشوند اما برخی از آنها نیز سازگاری بسیار کمی دارند که البته این موضوع به نوع آنزیم نیز بسیار وابسته است. برای مثال مایعات یونی حاوی یونهای AcO- و NO3- که به صورت مخلوطهای آبی سازگاری بسیار خوبی دارند، در حالت بدون آب آنزیم بسیار مقاوم CALB را غیر فعال میکنند. بر اساس اطلاعات فعلی، مایعات یونی با آنیونهای BF4- و PF6-، و آنیون مقاوم به هیدرولیز NTf2- و آنیونهای زنجیر متوسط آلکیل سولفات به همراه کاتیونهای دیآلکیلایمیدازولیوم و آلکیلپیریدینیوم گزینههای ایمنتری به نظر میرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون یک اساس نظری برای پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی بیآب ایجاد نشده است. هرچند تعدادی از عوامل سهیم احتمالی مانند قابلیت کاتیون برای ایجاد پیوند هیدروژنی (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکیل نانوساختارهای متصل به هیدروژن، و گرانروی حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر میرسد که میزان هسته دوستی آنیون (Kaar et al., 2003) یا قابلیت پذیرش پیوند هیدروژنی توسط آن (Sheldon et al., 2002) نیز، حداقل در حالتی که میل کاتیون برای تشکیل پیوند هیدروژنی کم است، میتواند یکی از عوامل کنترل کننده باشد. در این مورد یک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنیون H2PO4- است که بدون دناتوره کردن میتواند Cyt C را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء دیگر [HOPMIM][glycolate] است که با داشتن کاتیون و آنیونی با قابلیت بالا در ایجاد پیوند هیدروژنی، آنزیمهای احیاکننده را در فرم فعال در خود حل میکند (Walker and Bruce, 2004).

شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب. الف) شکل شماتیک از نحوه برهمکنش مایع یونی با بخشهای باردار و غیرقطبی آنزیم، ب) ساختار شبیه سازی شده آنزیم CALB در محیط مایع یونی DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقی از سطح آنزیم را نشان میدهد که زنجیرههای آلیفاتیک حضور دارند و رنگ نارنجی نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزیم هستند (Klahn et al., 2011).
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب
پایداری (دمایی) آنزیمها (فعالیت در طی زمان) معمولا در محیطهای آلی به خصوص با فعالیت آبی کم، نسبت به محیطهای آبی، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مایعات یونی نیز میتوانند چنین اثری داشته باشند. پایداری آنزیمی تعریف واضحی ندارد و روشهای متنوعی برای سنجش آن وجود دارد. برای بررسی پایداری در ذخیره سازی، آنزیم در مایع یونی در یک دمای خاص انکوبه شده و میزان فعالیت باقیمانده در نمونهها که با آب رقیق شدهاند بررسی میشود. بازیابی فعالیت بالایی از آنزیم در چنین روشی نشان دهنده این است که تغییرات ایجاد شده در ساختار آنزیم در این چنین محیط ذخیرهسازی برگشت پذیر است. پایداری آنزیم را میتوان با انکوبه کردن آنزیم در مایع یونی در بازههای زمانی مختلف و سنجش فعالیت در همان محیط بررسی نمود. همچنین میتوان ساختار آنزیم را با روشهای اسپکتروسکوپی در محیط مورد نظر بررسی نمود. برای مثال دمای بازشدن ساختار پروتئین شیرین مونولین از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزایش یافت (Baker et al., 2004). نوع دیگر پایداری که میتوان مورد بررسی قرار داد پایداری در شرایط واکنش است.
بهطور کلی آنزیمها در مایعات یونی فعالیت و ساختار خود را در مدت زمان طولانیتر و در دماهای بالاتری نسبت به حلالهای آلی ملکولی حفظ میکنند. دلیل احتمالی این امر گرانروی بالای مایعات یونی است که باعث کند شدن حرکت دمینهای پروتئین از موقعیت خود در فرم فعال پروتئین به موقعیتهای جدید ایجاد کننده فرم غیرفعال میشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت
پیوندهای هیدروژنی عامل پیوستگی ساختار آنزیمهای آبپوشی شده و بدون آب هستند. هر تغییر ساختاری مستلزم فروپاشی تعداد قابل توجهی از پیوندهای هیدروژنی به طور همزمان میباشد؛ این امر سهم قابل توجهی در پایداری آنزیم دارد و گویای اثرات حافظه آبپوشی و اثرات پسماند است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند این است که تعداد ملکولهای آب متصل به آنزیم تنها وابسته به میزان فعالیت آبی نیست، بلکه به حافظه آبپوشی نیز مربوط میباشد.
پژوهشهای مختلفی نشان داده اند حلالهایی که در شرایط آبی یا غیرآبی با آنزیم سازگارند، مانند استونیتریل یا ترت- بوتیل الکل، در غلظتهای پایین باعث غیرفعال شدن آنزیم میشوند (Griebenow et al., 1996). چنین نتایجی را میتوان در پژوهشهای انجام شده در مایعات یونی نیز مشاهده کرد. دلیل این امر کاهش اثر آبگریزی در حضور حلال است. در نتیجه پایداری آنزیم کاهش مییابد تا اینکه در یک غلظت مشخص آنزیم غیرفعال میشود.
پیوندهای هیدروژنی میتوانند توضیح مناسبی برای پایداری آنزیم در مایعات یونی بدون آب باشند. مایعات یونی، بهخصوص آنیون آنها که پیوندهای هیدروژنی قوی ایجاد میکنند، ممکن است باعث از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی شوند که عامل یکپارچگی ساختار α- هلیکسها و صفحات β بودهاند و بنابراین باعث باز شدن کل پروتئین یا بخشی از آن شوند. برای مثال یون لاکتات به راحتی میتواند با اسکلت پلیپپتیدی پیوند هیدروژنی برقرار کند. اندازه یون نیز میتواند مهم باشد زیرا یونهای با اندازه بزرگ برای ایجاد تعداد اندکی پیوند هیدروژنی بین خود و آنزیم، نیاز دارند که تعداد زیادی پیوند هیدروژنی را بشکنند، بنابراین نمیتوانند به سادگی پایداری آنزیم را مختل کنند. در آنزیمهایی که به صورت برگشتپذیر غیرفعال شدهاند احتمالا پیوندهای هیدروژنی توانستهاند کانفورماسیون را حفظ کنند و در ادامه برای بازیابی ساختار آنزیم لازم است این پیوندها فروپاشند و پیوندهای طبیعی دوباره ایجاد شوند. رقیق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مایع یونی دناتوره کننده، میتواند باعث تشکیل دوباره پیوندها شود احتمالا چنین ترکیباتی که پیوند هیدروژنی قوی تشکیل میدهند با تشکیل پیوندهای هیدروژنی ناپایدار، تشکیل دوباره پیوندها را تسهیل میکنند.
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها
کاربرد لیپازها در بیوترانسفورماسیون شامل طیف وسیعی از واکنشهای سالوولایتیک( نوعی از واکنشهای جانشینی هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفیل عمل کرده و جانشین یک اتم یا گروه در ملکول سوبسترا میشود) مربوط به گروه کربوکسیل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله این واکنشها میتوان استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون (الکلولیز)، پرهیدرولیز، و آمینولیز (سنتز آمید) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهای ترانساستریفیکاسیون و سنتز آمید ترجیحا در محیط بیآب و در حضور زئولیت فعال، جهت متوقف ساختن واکنشهای هیدرولازی ناخواسته، انجام میشود. در این واکنشها اغلب از آنزیمهایی همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده میشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتی چنین شرایطی را تحمل میکنند.
جهت دستیابی به بهینهترین حالت تشخیص انانتیومرها لازم است که محیط واکنش، مایع یونی یا محیطهای سنتی، با توجه به نوع ماده واکنش دهنده و نوع آنزیم بهینهسازی شود. در واقع نمیتوان یک مایع یونی را به عنوان بهترین گزینه برای انجام واکنشهای تفکیک مخلوطهای راسمیک نام برد، همانطور که یک حلال آلی را نمیتوان به طور کلی بهترین دانست. با ظهور مایعات یونی، گزینههای حلال انتخابی و بنابراین شانس یافتن محیط مناسب به میزان زیادی افزایش یافته است.
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس
ملکول پروتئین طی فرآیندهای غیرفعال شدن چند فاز مختلف را طی میکند. این پدیده نشاندهنده یک سری وقایع درون ملکولی در کنفورماسیونهای گذرای پروتئین است (De Diego et al., 2004). از روشهای مختلفی جهت بررسی ساختار پروتئین استفاده میشود که از آن جمله میتوان روشهای DSC ، NMR، CD، FTIR، اسپکتروفتومتری UV، کریستالوگرافی اشعه X و اسپکتروسکوپی فلورسانس را نام برد. فلورسانس یک روش در دسترس است که میتوان از آن جهت بررسی ساختار سوم پروتئین استفاده کرد.
در پروتئینهایی که دارای آمینواسیدهای فلوروفور هستند (مثل تریپتوفان، تیروزین یا فنیلآلانین) تغییر در IMax فلورسانس و شیفت قرمز در λMax فرآیند دناتوره شدن پروتئین را نشان میدهند و هر دوی این تغییرات به دلیل افزایش قطبیت باقیماندههای تریپتوفان پروتئین با قرارگیری آن در معرض حلال است. مکانیسم ملکولی پایدار شدن آنزیم در مایعات یونی (در بیوکاتالیز کاربردی) همچنان نامعلوم است و نیاز به بررسیهای بیشتر وجود دارد (De Diego et al., 2004).
پروتئینها پس از برانگیختگی در طول موج nm 280 (مربوط به همگی فلوروفورهای پروتئین) یا nm 295 (بیشتر مربوط به باقیماندههای تریپتوفان)، به طور معمول نور را بین طول موج nm 300 و nm 350 منتشر میکنند. شدت فلورسانس در واقع جمع نور منتشر شده توسط هر کدام از باقیماندههای فلوروفور پروتئین میباشد. باز شدن نسبی ساختار پروتئین باعث افزایش برهمکنش باقیماندههای آمینواسیدی پروتئین با حلال (به طور معمول آب) میشود. همچنین ممکن است حلقه اندولی تریپتوفان با دیگر آمینواسیدهای موجود در ساختار پروتئین وارد برهمکنش شود. هر دوی این پدیدهها سبب کاهش شدت فلورسانس و گاهی سبب ایجاد یک شیفت قرمز در پیک نشر فلورسانس (کاهش λMax) میشود که این پدیده را نشانهای از باز شدن پروتئین در محیط آبی میدانند (Bekhouche et al., 2011).
با ورود مایعات یونی به محیط پروتئینها به عنوان حلالهای جدید، مشکلاتی در بررسی ساختار توسط روشهای مختلف ایجاد میشود. از جمله این مشکلات تداخلهای ایجاد شده در طیفهای CD و فلورسانس را میتوان نام برد که در گزارشات مختلفی به آنها اشاره شده است (Shu et al., 2011, Bekhouche et al., 2011, Attri and Venkatesu, 2013). با این وجود شاید بتوان ساختار پروتئین را بیشتر بر اساس شیفتهای λMax و مقایسه شدت فلورسانس در حالتهای دمادهی مختلف در یک مایع یونی با غلظت مشخص، مورد بررسی قرار داد.
به طور کلی میتوان گفت که طیف وسیعی از آنزیمها میتوانند مخلوطهای آبی مایعات یونی را به عنوان محیط واکنش تحمل کنند. به سختی میتوان مایع یونی را یافت که هیچ آنزیمی نتواند با آن سازگار باشد. عقیده بر این است که مایعات یونی در غلظتهای بالاتری، نسبت به حلالهای ملکولی قابل امتزاج با آب، میتوانند توسط آنزیمها تحمل شوند.
بسیاری از هیدرولازها به خصوص آنهایی که توانایی تحمل حلالهای ملکولی را دارند به میزان قابل توجهی میتوانند واکنشهای غیرهیدرولازی را در مایعات یونی کاتالیز کنند. میزان فعالیت آنزیمها در مایعات یونی در حد فعالیت آنها در حلالهای آلی و یا حتی بالاتر نیز میباشد. به علاوه در بسیاری از موارد افزایش پایداری دمایی و عملکردی و افزایش اختصاصیت انانتیو و ریجیو نیز دیده شده است.
مایعات یونی سازگار با آنزیمها به طور معمول برهمکنش قوی با آنزیم نمیدهند و باعث حل شدن آنزیم نمیشوند. تاکنون اساس نظری برای پیشبینی سازگار بودن یا نبودن مایع یونی با آنزیم ایجاد نشده است هرچند با توجه به علاقه زیادی که در این موضوع وجود دارد انتظار میرود که به زودی یک اساس نظری در این زمینه مطرح گردد.
مایعات یونی قابلیت بالایی در کاربرد به عنوان حلال در واکنشهای بیوترانسفورماسیون مربوط به واکنشدهندههای بسیار قطبی مانند پلیساکاریدها دارند؛ زیرا چنین واکنشهایی به دلیل محدودیتهای تعادل واکنش در آب قابل انجام نیستند. چنین جایگزینی یک محیط فرار با محیط غیرفرار مایعات یونی بدون شک ادامه خواهد یافت و به تدریج توسط صنایع شیمیایی پذیرفته خواهد شد و سهم بزرگی در ایجاد کارآیی بالای واکنشهای مختلف خواهد داشت. توسعه مایعات یونی ارزانتر نیز باعث افزایش استفاده از آنها در بیوترانسفورماسیونهای صنعتی خواهد شد. به علاوه باید این موضوع را در نظر داشت که سیستمهای حلالی که بر پایه مایعات یونی هستند قابلیت بالایی در انجام ترانسفورماسیونهای چند کاتالیزوری دارند. برای دستیابی به این اهداف تلاشهای جدیدی انجام گرفته است.
بدون شک انتظار میرود که مایعات یونی سبز و زیست سازگار به زودی در دسترس باشند؛ زیرا به کارگیری مایعات یونی در ایجاد صنایع شیمیایی سبزتر، امری کاملا ضروری است. اینگونه به نظر میرسد که انجام بیوترانسفورماسیون در مایعات یونی بسیار امید بخش است.
فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز
اولین گزارش از بیوکاتالیز در محیط مایعات یونی مربوط به سال 2000 است (Cull et al., 2000). اولین کارهای انجام شده در این زمینه شامل مایعات یونی متشکل از کاتیونهای 1و3- دی آلکیل ایمیدازولیوم یا N- آلکیل پیریدینیوم و یک آنیون ضعیف کئوردینه کننده بود (شکل2-1و جدول 2-1). این نوع مایعات یونی هنوز نقش اصلی را در واکنشهای آنزیمی ایفا میکنند. هرچند که تحقیقات در حال حاضر بیشتر به سمت مایعات یونی با ساختارهای جدید گرایش یافته است. تاکنون مقالات مروری خوبی در زمینه بیوکاتالیز در مایعات یونی منتشر شده است که از آن جمله پروژه - ریسرچمروری ون رنتویجک و شلدون و مقالات مروری منیرالزمان را میتوان نام برد (Van Rantwijk and Sheldon, 2007, Moniruzzaman, 2010 a& b).

شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی که به طور مرسوم در بیوکاتالیز استفاده میشوند
(Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونیفرمول ساختاری علامت اختصاری نام آنیون
BF4- BF4- Tetrafluoroborate
PF6- PF6- Hexafluorophosphate
(CF3SO2)2N- Tf2N Bis(trifluoromethylsulfonyl)amide
CF3SO3- TfO Trifluoromethanesulfonate
CF3COO- TFA Trifluoroacetate
CH3SO3- MeSO3 Methylsulfite
n-C7H15SO3- HpSO3 Hydrogenthiophosphate
TsO- TsO Toluenesulfonate
CH3OSO3- MeSO4 Methylsulfate
C2H5OSO3- EtSO4 Ethylsulfate
n-C8H17OSO3- OctSO4 Octylsulfate
(HO)2PO2- H2PO4 Dihydrogenphosphate
(CH3O)2PO2- Me2PO4 Dimethyl phosphate
C2H5O(CH2)2OSO13- EtOEtSO4 Ethoxyethylsulfate
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. یک مطالعه اولیه روی آنزیم آلکالین فسفاتاز مربوط به باکتری اشرشیا کلای در مخلوط آبی [EtNH3][NO3] (قدیمیترین مایع یونی (Walden, 1914 )) نشان داد که این مایع یونی در غلظتهای پایین روی آنزیم اثر فعال کننده داشته است و بیشترین اثر گذاری آن (10 درصد افزایش فعالیت) در غلظت 1/1 مولار دیده شده است. با افزایش غلظت مایع یونی تا قبل از غلظت 80 درصد فعالیت آنزیم به طور برگشت پذیر کاهش یافت و پس از آن آنزیم به طور برگشت ناپذیری غیر فعال گردید (Magnuson et al., 1984).
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم
در سالهای اخیر در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. به تازگی آنیونهای α-آمینواسیدها در مایعات یونی مورد استفاده قرار گرفتهاند. این آنیونها کاسموتروپ هستند (Zhao, 2006). مایعات یونی تشکیل شده از α-آمینواسیدهای D و L و ω- آمینوکربوکسیلاتها و کاتیون [C2MIM] در غلظت 5/0 مولار اثر بسیار کمی بر فعالیت آنزیم سوبتیلیسین داشتند. در حالی که [C2MIM][D-GluO] در غلظت 1 مولار سرعت واکنش را بیش از 60 درصد کاهش داد و [C2MIM][L-GluO] باعث کاهش 80 درصدی سرعت شد (Zhao, 2006). مایع یونی [C4MIM][Cl] در غلظتهای کمتر از 20 درصد اثر کمی بر آنزیم پراکسیداز ترب سیاه (HRP) گذاشت در حالیکه در غلظتهای 25 و 30 درصد کاهش شدید فعالیت و پایداری دمایی آنزیم را نشان داد (Machado and Saraiva, 2005).
آنیون نیترات یک آنیون بی ضرر و بی اثر است با این وجود مایعات یونی حاوی این آنیون زیاد مورد مطالعه قرار نگرفتهاند. از معدود مطالعات انجام شده در این زمینه میتوان پژوهشی روی آنزیم پاپائین را نام برد که در حضور 15 درصد [C4MIM][NO3] 50 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. در گزارشی توسط کفتزیک و همکاران دو آنزیم CbFDH و β-گالاکتوزیداز مربوط به باسیلوس سیرکولانس در حضور 25 درصد [PrNH3][NO3] کاملا غیرفعال شدند (Kaftzik et al., 2002). دلیل این غیرفعال شدن را اسیدی شدن pH احتمال دادند.
مایعات یونی حاوی یون [BF4] بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. این آنیون به شدت کائوتروپ است و نسبت به آنیونهایی که قبل از این گفته شد قدرت کمتری در تشکیل پیوند هیدروژنی دارد. اثر [C4MIM][BF4] بر فعالیت HRP توسط ماکادو و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. در غلظتهای کمتر از 20 درصد [C4MIM][BF4] کمترین کاهش فعالیت دیده شد و در غلظت 25 درصد آن 30 درصد کاهش فعالیت دیده شد. ماکادو و همکاران همچنین تغییرات پایداری دمایی HRP را در [C4MIM][BF4] بررسی کردند. در غلظت 10 درصدی مایع یونی، آنزیم HRP با تأخیر بیشتری نسبت به محیط آبی در اثر دمادهی غیرفعال شد. در حالی که در غلظت 25 درصد مایع یونی، پایداری آنزیم به شدت کاهش یافت (Machado and Saraiva, 2005).
اولین بیوترانسفورماسیون موفق در یک محیط مایع یونی حاوی 5 درصد آب مربوط به یک مایع یون آبگریز بود. ترمولایزین، یک آنزیم بسیار پایدار، واکنش سنتز Z- آسپارتام را در محیط [C4MIM][BF4] اشباع از بافر کاتالیز کرد؛ سرعت واکنش در این حالت نسبت به سرعت واکنش در محیط اتیل استات 40 درصد بود (Erbeldinger et al., 2000).
لیپازها به عنوان آنزیمهای مقاوم به حلالهای آلی مسلما اولین گزینه انتخابی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی بودند. در حقیقت لیپازهای میکروبی پایدار مانند CALB (Madeira Lau et al., 2000 , Schofer et al., 2001) و لیپاز سودوموناس کاپاسیا (PCL) (Park and Kazlauskas. 2001, Nara et al., 2002) در مایعات یونی از خانواده 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم، در ترکیب با آنیونهای BF4- ، PF6-، TfO- و NTf2- دارای فعالیت کاتالیتیک هستند. نتایج اولیه در این قبیل کارها معمولا تکرارپذیر نبود و این به دلیل حضور ناخالصی باقی مانده طی فرآیند تهیه مایعات یونی بود. لیپازها واکنشهای ترانساستریفیکاسیون را در این مایعات یونی با بازده قابل مقایسه با واکنشهای انجام شده در ترت- بوتیل الکل (Madeira Lau et al., 2000)، دیاکسان (Nara et al., 2002)، یا تولوئن (Park and Kazlauskas 2001) را کاتالیز کردند.
لیپاز A کاندیدا آنتراکتیکا (CALA) به عنوان یک استثناء در محیط مایعات یونی [C4MPy][BF4] و [C4MIM][NTf2] 10 برابر فعالتر از محیط دیایزوپروپیلاتر (DIPE) (Schofer et al., 2001) بود. مایعات یونی خارج از خانوادههای 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم به ندرت در فرآیند بیوکاتالیز مورد استفاده قرار گرفتهاند.
لیپازهای مختلفی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی مورد بررسی قرار گرفته اند که از این میان میتوان آنزیمهای لیپاز CALB (Lozano et al., 2003)،PCL (Itoh et al., 2003)، ASL (Schofer et al., 2001)، CALA، RML و TLL (Schofer et al., 2001) را نام برد. برای مثال دو آنزیم RML و TLL فعالیت خود را در مایع یونی [C4MIM][NTf2] حفظ کردند در حالی که در دو مایع یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] غیرفعال شدند (Schofer et al., 2001).
لیپاز CRL به طور معمول در محیطهای بدون آب فعالیت کمی دارد. بر اساس مطالعات انجام شده در رابطه با کاتالیز واکنشهای مختلف، این آنزیم در مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] فعالیت خود را حفظ میکند (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003). CRL در [C4MIM][PF6] بهترین فعالیت خود را در حضور حداکثر 4/0 مولار آب (یا 5/0=aw براساس سایر گزارشات (Ulbert et al., 2004) نشان میدهد. همچنین گزارش شده است که CRL واکنش استریفیکاسیون را در محیط بدون آب [C4MIM][PF6] بهتر از محیط ایزواکتان کاتالیز میکند (Yu et al., 2005).
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003)و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای [MeSO4] (Schofer et al., 2001)، [NO3] (Kaar et al., 2003)، [AcO] یا [lactate] (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است. آب نیز چنین عملکردی دارد اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند، و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کوئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی
در گزارشی از لیو و همکاران فعالیت و ساختار آنزیم لیپاز CRL انکوبه شده در 17 نوع مایع یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که انتخاب نوع آنیون اثر مهمتری بر فعالیت آنزیم در واکنش استریفیکاسیون داشته است و مایعات یونی محلول در آب اثر منفی بر فعالیت آنزیمی داشتهاند. مطالعات ساختاری این گروه با روش FTIR تا حدودی تغییرات ساختاری مرتبط با تغییرات فعالیت آنزیم را نشان داد. هرچند افزایش فعالیت دیده شده در برخی موارد را نمیتوان با دادههای تجربی حاصل از بررسی ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسی ساختاری آنزیم لاکاز در مخلوط آبی مایعات یونی [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهای CD و فلورسانس اثر مثبت مایع یونی [C4MA][TfO] بر پایداری ساختاری آنزیم نسبت به دو نوع دیگر نشان داده شد. در این مطالعه نتایج مطالعات ساختاری با نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاری دیگری به کمک فلورسانس و FTIR اثر مایعات یونی ایمیدازولیومی محلول در آب بر ساختار دو آنزیم α- آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس و آمیلولیکوئی فاسینس مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی نشان داد که آنزیم α- آمیلاز در محیط بافری و محلول آبی مایع یونی [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره میشود. در حالیکه محلول آبی مایع یونی [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهای مانع از دناتوره شدن آنزیم میشود (Dabirmanesh et al., 2011).
اهداف
بررسی اثر مایعات یونی مختلف روی پایداری و فعالیت آنزیمهای لیپاز تا حدودی انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهای مختلف زنجیره کاتیونی مایعات یونی روی آنزیم و بررسی چگونگی تغییر ساختار آنزیم و اثر آن بر فعالیت آنزیمی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنین با توجه به اثرات متفاوت مایعات یونی بر روی آنزیمهای مختلف، در این پژوهش اثر مایعات یونی روی آنزیم لیپاز TTL، یک آنزیم گرمادوست با پتانسیل کاربردهای صنعتی، مورد بررسی قرار میگیرد. بنابراین اهداف این پژوهش عبارتند از:
بررسی اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
بررسی اثر مایعات یونی با کاتیون و آنیونهای مختلف بر پایداری دمایی آنزیم TTL
مطالعه پایداری دمایی بر اساس تغییر در ساختار سوم آنزیم TTL در حضور و عدم حضور مایعات یونی
فرضیه
با استفاده از مایع یونی مناسب به عنوان محیط واکنش میتوان به پایداری بیشتر و فعالیت بهتری از آنزیم دست یافت.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- ابزار
انواع ظروف و لوازم آزمایشگاهی (ارلن، بشر، پلیت، بورت، کندانسور و غیره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کیسه دیالیز
استیرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پدیده نوژن پارس)
بن ماری (ریحان طب)
آون خلاء
سیستم تغلیظ پروتئین و فیلتر مربوطه (Amicon)
هود لامینار (ژال تجهیز)
انکوباتور (ریحان طب)
شیکر انکوباتور (Vision)
سانتریفوژ (Sigma 16-P)
سانیکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ریحان طب)
پمپ پریستالتیک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)
3-2- مواد
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی
آلکیل هالید ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متیل ایمیدازولیوم (Merck)
آمونیوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دی اتیل اتر (Panreac)
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL
3-2-2-1- سوش باکتری
باکتریxL1blue E.coli (جهت تکثیر پلازمید حاوی ژن لیپاز)
باکتری E.coli BL21 (جهت بیان پروتئین)
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون
پلازمید حاوی ژن لیپاز درون سلولی TTL (pQE-TTL)
KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استریل
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی
تریپتون، عصاره مخمر، نمک سدیم کلرید (Merck) (جهت تهیه محیط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتی بیوتیک آمپی سیلین
ایزوپروپیل β-D- تیوگالاکتوزید (IPTG) (سیناژن)
آنزیم لیزوزیم (CinnaGen)
بافر تریس (Merck)
سدیم فسفات (Merck)
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز
رزین Q- Sepharose
رزین Gel filtration
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE
رنگ کوماسی بلو G-250 و R-250
فسفریک اسید و استیک اسید گلاسیال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکریل آمید و بیس آکریل آمید (Merck)
TEMED(N,N,N,N'-tetramethylenediamine)
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) (Merck)
آمونیوم پرسولفات (APS)
2- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومین سرم گاو (BSA)
بافر تریس و گلایسین (Merck)
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز
سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (Sigma)
استونیتریل (Merck)
بافر تریس (Merck)
3-2-4- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طیف های فلورسانس)
3-3- روشها
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید
در این پژوهش جهت تهیه مایعات یونی از میزان مول برابر از آلکیل هالید و متیل ایمیدازولیوم استفاده شد. در این روش متیل ایمیدازولیوم قطره قطره در فواصل زمانی مساوی به آلکیل هالید که در حال بهم خوردن شدید بود اضافه شد و محلول نهایی در حال بهم خوردن شدید به مدت 24 ساعت در دمای °C 50 رفلاکس شد (شکل3-1). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دی اتیل اتر شستشو داده شد تا مواد آلی واکنشگر باقیمانده حذف شود. مرحله شستشو 10 تا 15 بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دی اتیل اتر به مایع یونی و بهم زدن شدید آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مایع یونی و دی اتیل اتر از هم جدا شوند. سپس مایع یونی شسته شده به مدت 24 ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دی اتیل اتر آن کاملا تبخیر شود.

شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات
در این مرحله میزان مول مساوی از نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات در مقداری آب حل شد و سپس محلول نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبی مایع یونی دارای آنیون برومید در حال بهم خوردن شدید اضافه گردید. سپس به مدت 24 ساعت در دمای اتاق محلول روی استیرر بهم خورد تا واکنش جایگزینی آنیون به خوبی انجام شود. در مرحله بعد شستشوی مایع یونی جدید با آب جهت جداسازی آنیون برومید انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نیترات نقره نبود یون برمید را در مایع یونی PF6- دار تایید کرد. سپس مایع یونی PF6- دار بدست آمده به مدت 24 ساعت برای حذف آب موجود در محیط در آون خلاء در دمای °C 70 قرار داده شد. مایع یونی ساخته شده در ظرف درب دار نگهداری شد.
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli
در این پژوهش از محیط کشت Luria Bertani (LB) برای رشد سویههای اشرشیاکلی به صورت مایع و جامد (حاوی آگار) استفاده گردید. همچنین در محیط کشت سوشهای حامل ساختار پلاسمید از آنتیبیوتیک آمپیسیلین با غلظت نهایی µg/ml 100 استفاده شد. جدول 3-1 نشان دهنده ترکیبات محیط کشت Luria Bertani است. شایان ذکر است که آنتی بیوتیک پس از استریل شدن محیط کشت توسط اتوکلاو و رسیدن دمای محیط کشت به حدود C° 50 اضافه میگردد.
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani
ترکیب غلظت
عصاره مخمر 5/0 درصد
تریپتون 1 درصد
NaCl 1 درصد
آگار (محیط کشت جامد) 2 درصد
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی:به منظور تهیه سلولهای مستعد برای عمل ترانسفورماسیون (انتقال پلاسمید به داخل سلول)، ابتدا یک کشت خطی از سلولهای ذخیره شده مورد نظر در ازت مایع بر روی پلیت LB تهیه و یک شب در گرمخانه Cº 37 قرار داده میشود. سپس یک کلنی از روی پلیت برداشته و در شرایط استریل به 25 میلی لیتر محیط کشت مایع LB افزوده و به مدت 4 الی 6 ساعت در دمای cº37 با حرکت دورانی rpm180رشد داده میشود تا تراکم سلولها در محیط کشت به جذبی ما بین 4/0 تا 6/0 در طول موج 600 نانومتر برسد. سلولها را در دمای ºC 4 به مدت 10 دقیقه در g4000 سانتریفوژ کرده و آنها را در5/2 میلیلیتر محیط خاص مناسب برای تهیه ی این نوع سلولها به نام محیط TSB که طبق جدول3-2 تهیه گردید، به صورت معلق در میآوریم. لازم به ذکر است که در این حالت غلظت سلولی به میزان 10 برابر افزایش داده میشود. سپس سلولهای معلق شده را به مدت 10 الی 60 دقیقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروی یخ قرار میدهیم. محصول سلولی حاصل را در مقادیر 200-100 میکرولیتری در لولههای اپندروف استریل تقسیم کرده و بلافاصله در ازت مایع قرار میدهیم. این سلولها را میتوان در فریزر cº80- نگهداری کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الی دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها یک بار میتوان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد :بین 1 تا 10 میکرولیتر بسته به غلظت محلولDNA موجود (معادل 1-1/0 میکروگرم) پلاسمید، در شرایط استریل در یک لوله اپندروف ریخته وبه آن پنج میکرولیتر از بافر KCM 5X که طبق جدول3-3 تهیه گردید، افزوده و با آب مقطر استریل به حجم lµ25 میرسانیم. مخلوط در یخ نگهداری میشود. حال سلول مستعد را از فریزر ºC80- خارج و اجازه میدهیم تا ذوب شود . 25 میکرولیتر از سلول مستعد را به محلول حاوی پلاسمید افزوده و به مدت 15 الی 20 دقیقه در دمای ºC4 قرار میدهیم. سپس در دمای ºC 42 به مدت 105 ثانیه گرمادهی شده که در این مرحله، ملکولهای DNA بر روی سطح سلول ها رونشینی شده و به درون سلول منتقل خواهند شد . بلافاصله سلولها را به درون یخ منتقل کرده و به آنها 100 میکرولیتر محیط LB سرد استریل و بدون آنتیبیوتیک،اضافه و به مدت یک ساعت در دمای Cº37 و حرکت دورانی مناسب قرار میدهیم. در نهایت 150 میکرولیتر محیط حاصل را بر روی پلیت حاوی محیط کشت انتخابی برده و با استفاده از لوپ شیشهای استریل به آرامی بر روی تمامی سطح پلیت بطور کامل و یکنواخت پخش میگردد . پس از جذب سلولها بر روی سطح پلیت، پلیتها به صورت وارونه در گرمخانه cº37 به مدت 16 ساعت قرار داده میشوند.
لازم به ذکر است که این پلیتها، حاوی آنتیبیوتیک خاصی است که ژن مقاومت مربوطه بر روی پلاسمید مورد نظر وجود دارد و در نتیجه تنها سلولهایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند قادر به رشد بر روی محیط انتخابی هستند.
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSBترکیبات مورد نیاز مقدار
Luria Bertani 75 (ml) 2X
DMSO 5/7 (ml)
PEG 400 3/13 (ml)
MgSo4 5/1 (ml)
MgCl2 5/1 (ml)
ddH2O 3/51 (ml)
Total valume 150 (ml)
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCMغلظت مناسب برای تهیه محلول 5X ترکیبات مورد استفاده
(M) 5/0 KCl
(M) 15/0 CaCl2
(M) 25/0 MgCl2
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری
برای تهیه استوک از باکتریهای حاوی ساختار پلاسمید، ابتدا از باکتری مورد نظر کشت یک شبه گذاشته شد. سلولها به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند و سوپ رویی دور ریخته شد. سپس به نسبت 1:1 گلیسرول استریل 50% به محیط کشت LB اضافه شد. آنگاه رسوب سلولها در 15 حجم اولیه محیط کشت، از این محلول حل شدند. در آخر آمپیسیلین با غلظت نهایی μg/ml 100 به سلولها اضافه شد و در C°20- ذخیره گردید.
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب
کلنی مورد نظر از بین باکتریهای ترانسفورم شده انتخاب شد و به محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک آمپیسیلین (μg/ml100) انتقال یافت. پس از رشد باکتری به مدت 16 ساعت در دمای °C 37، کشت 1 درصد تلقیح از نمونه باکتری رشد کرده، در حجم ml 20 محیط LB با آمپی سیلین ایجاد شد. پس از گذشت 4 ساعت از کشت اولیه باکتری ها در دمای °C 37، زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، با افزودن IPTG (با غلظت نهایی mM 1) به محیط های کشت بیان پروتئین نوترکیب القا شد و با کاهش دمای انکوباتور به °C 30 شرایط برای تولید آنزیم نوترکیب توسط باکتریها فراهم شد. پس از گذشت 5 ساعت از زمان القا، سلول های باکتری به کمک سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در 110 حجم اولیه، در بافر تریس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت 16 ساعت در °C 20- فریز شدند.
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
در این بخش بهینهسازی بیان پروتئین نوترکیب ابتدا با انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان TTL بر اساس میزان فعالیت آنزیمی عصاره سلولی و سپس بهینه سازی زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
ساختار پلاسمید حاوی ژن آنزیم TTL به روش گفته شده در بخش 3-3-2-2 به درون باکتری منتقل شد. سپس با لیز باکتریها پروتئینهای درون سلول جدا شدند (بخش 3-3-2-5) و سنجش فعالیت آنزیمی در مورد هرکدام از نمونهها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش 3-3-6). از بین 6 کلنی ترانسفورم شده بر اساس میزان توانایی تولید آنزیم 1 کلنی انتخاب شد و به صورت غلیظ شده در دمای°C 20- ذخیره گردید و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمانهای مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئینهای محلول درون سلول و میزان پروتئینهای موجود دراجسام نامحلول و پروتئینهای در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمانهای مختلف پس از القا، میتوان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپیسیلین، 1% تلقیح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتریها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، ابتدا ml1 از باکتریها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونهبرداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداری شد.
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتریها با استفاده از دستگاه سانیکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی 1 دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت 4 دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفوردمواد مورد نیاز مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250 1/0 گرم
اتانول 95% 50 میلیلیتر
فسفریک اسید 85% 100 میلیلیتر
در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیلآلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد میشود که شدت این رنگ در غلظتهای کم پروتئین نزدیک به قهوهای و در غلظتهای بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در 595 نانومتر خوانده میشود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازهگیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههای حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی 100 میکرولیتر، رقتهایی تهیه کرده و یک میلیلیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گردید. طی مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS(SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئینها و پپتیدها بکار میرود. قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلیاکریل آمید در غربال پروتئینهای مختلف است. در این روش پروتئینها بر اساس اندازه از هم جدا میشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرایط احیا، این ملکولها خطی شده و SDS به آنها بار منفی میدهد، که میزان بار منفی بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئینها به این صورت بر اساس اندازهشان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعتهای متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا میشوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفورزمحلول استوک اکریل آمید (8/30 %): 30 گرم اکریل آمید و 8/0 گرم بیس اکریل آمید در حدود 50 میلیلیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به 100 میلیلیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده): این بافر دارای غلظت 5/1 مولار تریس با 8/8~pH است. برای تهیه آن 2/18 گرم تریس- باز در حدود 70 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/8 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده): این بافر دارای غلظت 5/0 مولار تریس با 8/6~pH است. برای تهیه آن 1/6 گرم تریس باز در حدود 50 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/6 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تریس- باز، 2/7 گرم گلیسین و 5/0 گرم SDS در 500 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهیه گردید.
محلول رنگآمیزی: 05/0 گرم کوماسی آبی 250-R در 40 میلیلیتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 50 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول 05/0% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری میشود.
محلول رنگبر: 15 میلیلیتر متانول، 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 75 میلیلیتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگبری را تسریع میکند. با این حال باید توجه داشت که اگر ژل مدت طولانی در محلولهایی با درصد بالای متانول قرار گیرد، باندهای پروتئینی نیز بیرنگ میشوند).
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورزیک قالب شیشهای به کمک صفحات شیشهای کاملاً تمیز و فاصلهاندازها که با توجه به ضخامت مورد نیاز ژل انتخاب شده اند، ایجاد شد و با چند گیره محکم گردید. به انتهای صفحات شیشهای به اندازه 2/0 سانتیمتر آگار مذاب 5/0% اضافه شد.

user8251

TOC h z t "فهرست اشکال,1" شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان PAGEREF _Toc142952501 h 4شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای PAGEREF _Toc142952502 h 8شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis L PAGEREF _Toc142952503 h 15شکل 1-4- گیاه گلپر PAGEREF _Toc142952504 h 19شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifolia PAGEREF _Toc142952505 h 22شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium polium PAGEREF _Toc142952506 h 24شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare L PAGEREF _Toc142952507 h 25

فهرست جداول
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست جداول;1" جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalis PAGEREF _Toc369168412 h 17جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A) PAGEREF _Toc369168413 h 34جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C) PAGEREF _Toc369168414 h 35جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B) PAGEREF _Toc369168415 h 35جدول 2-4- محلول ریزازورین PAGEREF _Toc369168416 h 35جدول 2-5- محلول احیاء کننده PAGEREF _Toc369168417 h 35جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc369168418 h 36جدول 2-7 PAGEREF _Toc369168419 h 45جدول 2-8 PAGEREF _Toc369168420 h 45جدول 2-9 PAGEREF _Toc369168421 h 45جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه PAGEREF _Toc369168422 h 46جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S) PAGEREF _Toc369168423 h 47جدول 3-1 گاز حاصل از تخمیر جیره و عصاره‌های گیاهان دارویی پس از 96 ساعت انکوباسیون PAGEREF _Toc369168424 h 51جدول 3-2- اثر سطوح مختلف پنج عصاره بر فراسنجه‌های تولید گاز PAGEREF _Toc369168425 h 52جدول 3-3- تعداد کل باکتری‌ها در هر میلی لیتر مایع شکمبه بعد از تاثیر عصاره‌ها PAGEREF _Toc369168426 h 56
فصل اولمقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1- مقدمهدر بین حیوانات اهلی گیاهخوار، نشخوارکنندگان سهم بزرگی را در تامین خوراک و سلامت بشر دارند. از طرفی تغذیه نقش اصلی را در بازده اقتصادی و عملکردی این دام‌ها داشته به طوری که تقریبا دوسوم از کل هزینه تولیدات دامی در واحدهای مختلف پرورش دام به هزینه‌های خوراک اختصاص داشته و از طرفی با توجه به مسئله کمبود پروتئین حیوانی و افزایش تولید با منابع علوفه‌ای موجود، لازم است تا از ارزش تغذیه‌ای منابع خوراکی قابل دسترس و مکمل‌های قابل استفاده به منظور افزایش راندمان تولید اطلاع کافی وجود داشته باشد (امیرخانی، 1386). از این رو اهمیت تغذیه مناسب نشخوارکنندگان ایجاب می‌نماید که ارزش غذایی هر یک از مواد خوراکی و اجزای تشکیل دهنده آنها طبق روش‌های صحیح و استاندارد تعیین گردد (قورچی، 1374).
معده حیوانات نشخوارکننده از چهار بخش شکمبه، نگاری، هزارلا و شیردان تشکیل گردیده است (آلاوونگ و همکاران، 2010). سه بخش اول فاقد هر گونه غده بوده و پیش معده نامیده شده و دو بخش آخر جایی است که هضم میکروبی یا تخمیر در آن صورت می‌پذیرد (منصوری و همکاران، 1381). شکمبه دارای انواع باکتری، پروتوزوآ و قارچ است اما باکتری در تمام جنبه‌های تخمیر شکمبه‌ای نقش غالب را بازی می‌کند (راسل و همکاران، 2002).
حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)

–413

1-7-1-رده بندی علمی30
فصل دوم: سابقه ی تحقیق
2- سابقه ی تحقیق32
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-مکان و زمان انجام تحقیق41
3-2-مکان پرورش42
3-3-ذخیره سازی ، سازگاری و تقسیم بچه ماهیان43
3-4-پروبیوتیک مورد آزمایشLactobacillus plantarum44
3-5-نحوه ی آماده سازی جیره غذایی44
3-6-زیست سنجی45
3-7-نحوه ی غذادهی45
3-8-بررسی عوامل فیزیکی و شیمیایی آب46
3-9-بررسی پارامترهای خون شناسی46
3-9-1-خون گیری و تهیه سرم46
3-9-2-شاخص های خونی47
3-9-2-1-شمارش گلبول های قرمز و سفید47
3-9-2-2-اندازه گیری هماتوکریت48
3-9-2-3-اندازه گیری هموگلوبین49
3-9-2-4-شاخص های گلبول قرمز49
3-9-2-5-تشخیص افتراقی گلبول های سفید50
3-10-فاکتورهای ایمنی51
3-10-1-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی اختصاصی51
3-10-1-1-اندازه گیری ایمنو گلوبولینM (IgM)51
3-10-2-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی غیر اختصاصی51
3-10-2-1-اندازه گیری فعلیت لیزوزیم51
3-10-2-2-پروتئین کل سرم52
3-11-روش انجام آزمایشات فلور باکتریایی روده در آزمایشگاه52
3-11-1-روش آماده سازی محیط های کشت52
3-11-2-روش آماده سازی رقت های محلول روده و کشت اولیه53
3-11-3-روش شمارش کلنی ها و تقسیم بندی آنها54
3-12-روش محاسبه شاخص های رشد54
3-12-1-اندازه گیری طول و وزن54
3-12-2-شاخص وضعیت55
3-12-3-درصد افزایش وزن55
3-12-4-ضریب تبدیل غذایی55
3-12-5-ضریب رشد ویژه55
3-12-6-میانگین رشد روزانه55
3-12-7-شاخص کبدی56
3-13-آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی 56
3-14-تجزیه و تحلیل آماری56
فصل چهارم: نتایج
4-نتایج58
4-1-نتایج حاصل از اندازه گیری عوامل محیطی58
4-1-1-دمای آب58
4-1-2-اکسیژن محلول آب58
4-1-3-pH آب محیط پرورش58
4-2-نتایج حاصل از عملکرد رشد بچه ماهیان قزل آلا تحت تاثیر سطوح مختلف پروبیوتیک59
4-2-1-اثر بر وزن نهایی59
4-2-2-اثر بر طول نهایی59
4-2-3-اثر بر ضریب تبدیل غذایی60
4-2-4-ضریب رشد ویژه60
4-2-5-درصد افزایش وزن61
4-2-6-میانگین رشد روزانه61
4-2-7-میزان ضریب چاقی62
4-3-فلور باکتریایی روده ماهیان تیمار و شاهد62
4-3-1-میزان باکتریL.p در فلور روده قزل آلا در محیط کشت MRS62
4-3-2-توتال کانت باکتریایی روده ماهی قزل آلای رنگین کمان در محیط کشتTSA 62
4-4-نتایج حاصل از فاکتورهای خونی63
4-4-1-تعداد گلبول های سفید خون63
4-4-2-تعداد گلبول های قرمز خون64
4-4-3-غلظت هموگلوبین خون64
4-4-4-درصد هماتوکریت خون65
4-4-5-متوسط حجم گلبول قرمز65
4-4-6-متوسط غلظت هموگلوبین سلولی66
4-4-7-متوسط هموگلوبین گلبول قرمز66
4-4-8-درصد لنفوسیت67
4-4-9-مقادیر نوتروفیل67
4-4-10-درصد منوسیت68
4-4-11-درصد ائوزینوفیل68
4-5-نتایج فاکتورهای سرم68
4-5-1-میزان توتال ایمنوگلوبولین سرم خون69
4-5-2-میزان IgM69
4-5-3-میزان لیزوزیم سرم خون70
4-6-نتایج آنالیز لاشه70
4-6-1-درصد رطوبت لاشه70
4-6-2-درصد پروتئین لاشه71
4-6-3-درصد چربی لاشه71
4-6-4-درصد خاکستر لاشه72
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-بحث74
5-1-عملکرد رشد74
5-2-فلور باکتریایی روده77
5-3-شاخص های خونی78
5-4-شاخص های ایمنی خون81
5-4-1-لیزوزیم81
5-4-2-ایمنوگلوبین IgM83
5-5-آنالیز لاشه84
5-6-جمع بندی86
پیشنهادات 87
منابع88
پیوست107
چکیده انگلیسی121
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1: آنالیز تقریبی خوراک استفاده شده در تغذیه بچه ماهیان مورد آزمون44
جدول4-1: میانگین دما، اکسیژن محلول و pH آب در مقاطع زمانی مشخص در طول دوره بررسی58
جدول 4-2- میانگین وزن نهایی (گرم) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-3- میانگین طول نهایی (سانتیمتر) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-4- میانگین ضریب تبدیل غذایی بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-5- میانگین ضریب رشد ویژه بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-6- میانگین درصد افزایش وزن بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف61
جدول 4-7- میانگین رشد روزانه بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف61
جدول 4-8- میانگین میزان ضریب چاقی بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف62
جدول 4-9-میزان پروبیوتیک (لاکتوباسیلوس) در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت MRS62
جدول4-10-شمارش کلی فلور باکتریایی در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت TSA63
جدول 4-11-تعدادگلبول های سفید خونی قزل آلا در تیمارهای شاهد وآزمایشی در پایان60روز63
جدول 4-12-تعدادگلبول های قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60روز64
جدول 4-13- غلظت هموگلوبین g/dl)) خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60
روز64
جدول 4-14- درصد هماتوکریت % خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز65
جدول 4-15- متوسط حجم گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز65
جدول 4-16- متوسط غلظت هموگلوبین سلولی خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول 4-17- متوسط هموگلوبین گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول4-18- درصد لنفوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-19-درصد نوتروفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-20-درصد منوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-21-درصد ائوزینوفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-22-توتال ایمنوگلوبولین سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز69
جدول4-23-میزان IgM سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز69
جدول4-24-میزان لیزوزیم سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-25-درصد رطوبت لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-26-درصد پروتئین لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71
جدول4-27-درصد چربی لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

جدول4-28-درصد خاکستر لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز72
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل( 1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"13
شکل (1-2) رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش29
شکل (3-1) موقعیت جغرافیایی گارگاه پرورش ماهی سردابی(قزل آلا) اشکرآب سیاهکل41
شکل (3-2) نمایی از کارگاه پرورش ماهی سردابی اشکراب سیاهکل42
شکل (3-3) نمایی از کانال های بتونی پرورش و تیمار و تکرارها43
شکل(3-4) پودر اولیه حاوی1011-101244
شکل(3-5) رقت های مختلف از106-101044
شکل(3-6) غذای آماده و غنی شده با پروبیوتیک45
شکل (3-7) غذادهی روزانه بر اساس محاسبات روزانه46
شکل (3-8) خونگیری از سیاهرگ در محل ساقه دمی46
شکل (3-9) دستگاه سانتریفوژ و نحوه ی جداسازی سرم خون47
شکل (3-10) دستگاه سانتریفیوژ هماتوکریت48
شکل (3-11) دستگاه اسپکتروفتو متر نور مرئی و UV49
شکل(3-12): دستگاه اسپکتروفتومتر مدل 2100-VIS شرکت Unico آمریکا51
شکل(3-13)دستگاه Auto Analyzer مدلBT- 150052
شکل (3-14) نحوه ی آماده سازی محیط کشت TSA و MRS آگار53
شکل (3-15) برداشت روده و تهیه رقت های مختلف و کشت در پلت های TSAو MRS54
شکل (3-16) نگهداری پلت ها در انکوباتور و شمارش باکتری ها54
شکل (3-17) آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی56
چکیده
تحقیق حاضر به منظور ارزیابی تاثیر باکتری اسید لاکتیک Lactobacillu plantarum (KC426951) جداسازی شده از روده قزل آلای رنگین کمان بر فاکتورهای رشد ، فلور باکتریایی روده ،فاکتورهای خونی و ایمنی بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) در بهار و تابستان سال 1392انجام شد. بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن 24/2±56/3 به مدت 2 هفته با شرایط پرورشی محیطی در یک مرکز پرورش خصوصی ماهیان سردآبی (اشکرآب سیاهکل) در استان گیلان قبل از شروع آزمایش سازگار شدند . ماهیان در قالب یک طرح کاملا تصادفی به شش گروه شامل 540 قطعه بچه ماهی تقسیم شدند . پارامترهای کیفی آب شامل درجه حرارت ، مقدار اکسیژن محلول و pH به ترتیب 3/0±3/17 درجه سانتی گراد ،43/0±5/8 میلی گرم و 26/0±4/7 اندازه گیری شد .پنج گروه از ماهیان ( هر گروه شامل 90 ماهی) با جیره حاوی 106 (تیمار1) ، 107 (تیمار2) ، 108 (تیمار3) ، 109 (تیمار4) و1010 (تیمار5) cfu g-1 لاکتو باسیلوس پلانتاروم و گروه کنترل (شاهد) بدون جیره حاوی پروبیوتیک به مدت 60 روز تغذیه شدند . تغذیه ماهیان بر اساس 3 درصد بیوماس وزن بدن بصورت روزانه و برابر صورت پذیرفت. نتایج نشان داد که میزان وزن نهایی ، طول نهایی، ضریب رشد ، درصد افزایش وزن و میانگین رشد روزانه در تیمار 2 بیشترین و در تیمار 5 کمترین مقدار و میزان ضریب تبدیل غذایی در تیمار 2 کمترین و در تیمار 5 بیشترین را به خود اختصاص داده بودند(05/0> P). همچنین بالاترین میزان توتال لاکتیک اسید روده ماهیان قزل آلا در تیمار4 و در حالیکه کمترین مقدار مربوط به تیمار شاهد و بالاترین توتال کانت مربوط به تیمار 2 و کمترین تیمار 5 بدست آمد(05/0> P). فاکتورهای خونی: بالاترین سطوح گلبول های قرمز در تیمار 5 (3/10408±3/898333) ، گلبولهای سفید در تیمار4 (4/702±3/10833) ، حجم گلبول های قرمز در تیمار 1(8/3±7/508) ، غلظت هموگلوبین در تیمار 5 (15/0±2/11) ، هماتوکریت در تیمار 5 (2±42) ،فراوانی لنفوسیت ها در گروه شاهد (53/1±67/69) ، فراوانی نوتروفیل ها در تیمار 5 (1±39) ، بدست آمد (05/0> P).
فاکتورهای ایمنی: بالاترین سطوح توتال ایمنوگلوبولین در تیمار 4 (15/1±33/20) ، IgM در تیمار4 (65/2±39) و لیزوزیم در تیمار4(08/2±67/40) حاصل گردید(05/0> P) .حداکثر رطوبت لاشه مربوط به تیمار 3 ، درصد پروتئین مربوط به تیمار 4 ، و کمترین درصد چربی مربوط به تیمار شاهد می باشد (05/0> P). با توجه به نتایج بدست آمده در خصوص بکارگیری Lactobacillus plantarum می توان از آن به عنوان یک فاکتور مثبت جهت بهبود فلور باکتریایی روده ، عملکرد رشد ، شاخص های خونی ، ایمنی و ترکیب لاشه استفاده نمود.
کلمات کلیدی: قزل آلای رنگین کمان،باکتری اسید لاکتیک ، Lactobacillus plantarum ، رشد ، فلور باکتریایی، شاخص خونی، ایمنی ، لاشه
فصل اول
کلیات

مقدمه
رشد فزاینده و روز افزون جمعیت جهان، تامین غذا و دستیابی به منابع جدید غذایی را به یکی از مهمترین دغدغه های دولت ها مبدل ساخته و موجب شده است تا تاًمین مواد پروتئینی به سمت سایر منابع از جمله آبزیان سوق یابد. در این میان ارزش بالای پروتئین آبزیان باعث گردید که صنعت ماهیگیری و آبزی پروری به صنعتی مهم و شایان توجه تبدیل شود. پرورش آبزیان یک فعالیت با گستره جهانی است که در بهبود تغذیه و کمک به توسعه اقتصادی کشورها موثر است.
صنعت آبزی پروری علیرغم این رشد قابل توجه، همواره با مشکلاتی روبرو بوده است که از عمده مشکلات را می توان ابتلا به بیماری های مختلف ذکر نمود . بیماریها در آبزیان به سه سه عامل مهم بستگی دارد وضعیت ماهی (میزبان) از نظر سلامت و تناسب اندام ظاهری و دارا بودن صفات مقاومتی و ایمنی در مقابل اجرام بیماریزا ، عوامل محیطی اهم از شرایط فیزیکی و شیمیایی نظیر اوضاع جوی ، تغییرات حرارتی ، تابش خورشید ، بارندگی و ... و عوامل پاتوژن یا بیماریزا را می توان نام برد ( آذری تاکامی، 1376). اغلب آبزیان پرورشی تحت تأثیر عفونت های باکتریایی قرار می گیرند که سیستم ایمنی شان توسط شرایط استرس زا به خطر می افتد. یکی از معمول ترین روش های درمان این عفونت ها، استفاده از آنتی بیوتیک ها می باشد این در حالی است که استفاده بیش از حد از این داروها باعث بروز مقاومت باکتریایی در این حیوانات می شود (Teuber, 2001). لذا بکارگیری آنتی بیوتیک ها جهت درمان بیماری های آبزیان پرورشی به طور گسترده مورد انتقاد قرار گرفته است، که دلائل آن علاوه بر افزودن هزینه ها عبارتند از: افزایش توانایی مقاومت باکتری ها در برابر آنتی بیوتیک ها، از بین بردن فلور میکروبی محیط زیست، هزینه بالای این داروها و عوارض جانبی این داروها بر ماهی و میگومی باشد . ثابت شده که برخی از آنتی بیوتیک ها سیستم ایمنی را سرکوب می کنند و موجودات آبزی را بیشتر مستعد پذیرش بیماری های باکتریایی ، ویروسی و انگلی می نمایند.افزایش نگرانی های ناشی از بکارگیری آنتی بیوتیک ها منجر به کاهش استفاده از آنها در صنعت آبزی پروری آمریکا و اروپا گردیده است.
آنتی بیوتیکها به تعادل باکتریهای موجود در روده آسیب وارد می کنند و اکثر باکتریهای مفید را از بین برده و منجر به پیدایش باکتریهای مقاوم به دارو می گردند و همچنین فقط 20 تا 30 درصد آنتی بیوتیک ها بوسیله ماهی هضم می شوند و بقیه وارد محیط زیست می شوند.
مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی علاوه بر ایجاد مقاومت در میکرو ارگانیسمها سبب نفوذ این مواد به خاک و آب گردیده و محیط زیست مجاور مزارع پرورش آبزیان را به شدت آلوده نموده است تثبیت داروها و مواد شیمیایی در بافتهای ماهی و آبزیان بهداشت انسانی را نیز به خاطر ایجاد حساسیتهای مختلف، مقاومت باکتریایی و عوارض کلیوی و کبدی به مخاطره می اندازد(آذری تاکامی، 1376).
در حال حاضر، استفاده از پروبیوتیک ها و سین بیوتیک ها به عنوان جایگزین استفاده از آنتی بیوتیکها در پرورش آبزیان مطرح هستند. آبزیان در مراحل اولیه تکثیر و پرورش از سطح ایمنی کافی برخوردار نبوده و نیازمند تدابیر لازم در خصوص پیشگیری و درمان می باشند و بهره گیری از پروبیوتیک ها نیز می تواند به عنوان یکی از ابزارهای موثر در پیشگیری از بیماریها و همچنین محرک رشد مد نظر قرار گیرد.
استفاده از پروبیوتیک ها بعنوان جایگزینی برای روشهای سابق به نظر می رسد می تواند بسیاری از مشکلات را مرتفع سازد. استفاده از پروبیوتیک ها در واقع تکنولوژی جدید آبزی پروری همگام با محیط زیست به شمار می رود. با استفاده از این مواد هم می توان تولید را افزایش داد، هم کیفیت آب را اصلاح کرد و هم اینکه آنها را به عنوان مبارزه بیولوژیک مد نظر قرار داد (حسینی فر، 1386).
تأثیر پروبیوتیک ها در تغذیه، مقاومت در برابر بیماریها و دیگر فعالیت های مفید به اثبات رسیده که از
جمله اثرات مفیدی که بر سلامتی دارند تأثیر بر روی سیستم ایمنی و تحریک سیستم ایمنی است(کامکار، 1390).
استفاده از زیست یارهای حیاتی (پروبیوتیک ها) به عنوان یک مکمل غذایی که قادر به بهبود دفاع و ایجاد
مقاومت در برابر عوامل بیماری زا در زمان بروز استرس های متفاوت طی دوره پرورش ماهی باشند، مورد
توجه هستند.پروبیوتیک ها بطور سودمندی با بهبود تعادل فلور میکروبی روده به میزبان سود می رسانند Fuller,1989)).پروبیوتیک ها نه تنها اثرات منفی آنتی بیوتیک ها را ندارند بلکه نقش مهمی در افزایش بهره وری ، تولید و کاهش درصد تلفات ماهی و میگو دارا می باشند.
تا کنون سویه های زیادی جهت استفاده در تغذیّه دام، طیور و آبزیان به عنوان پروبیوتیک معرفی شده است و با بهره گیری از مهندسی ژنتیک و دانش بیوتکنولوژی، سویه های مؤثرتر و بهتری نیز تولید خواهد شد. ولی به طور کلی پروبیوتیک ها از لحاظ نوع سویه میکروبی مؤثرشان به سه گروه تقسیم می شوند، پروبیوتیکهای 1- باکتریایی2- قارچی 3- مخمری.
پروبیوتیکهای باکتریایی عمده ترین پروبیوتیک هایی هستند که تاکنون در آبزی پروری استفاده شده اند. استفاده از پروبیوتیکهای حاوی باکتریهای اسید لاکتیک به افزایش میزان زنده مانی میزبان در مواجه با عوامل بیماریزا منجر میشوند که این عملکرد از طرق زیر صورت میگیرد ( Gatesoupe, 1999)
آثار آنتاگونیستی بر ضد عوامل بیماریزا از طریق ترشح مواد باکتری ُکش همانند باکتریوسینها
محدود کردن عوامل بیماریزا از طریق افزایش محل اتصال یا استفاده از ماده و انرژی در دسترس
افزایش سد دفاعی بدن از طریق افزایش سطوح ایمنی
همچنین مشاهده شده است برخی پروبیوتیکها اشتها را افزایش می دهند، سلامتی را بهبود می بخشند و افزایشی کلی را در وزن به وجود می آورند که احتما ً لا به دلیل افزایش قابلیت هضم مواد غذایی است (Gatesoupe and Ringo,1998)
توانایی باکتریهای اسید لاکتیک در تقویت ایمنی غیر اختصاصی ماهی قزل آلای رنگین کمان توسط مطالعات برخی از محققین ثابت شده است. به خصوص تجویز خوراکی بعضی از سویه های باکتری اسید
لاکتیک موجب افزایش پاسخ ایمنی سلولی مثل فعالیت فاگوسیتوز، انفجار تنفسی فاگوسیت ها، تکثیر لنفوسیتها و سنتز سیتوکنین ها می شود. (Austin &Irianto, 2002; Nikoskelainen et al., 2001; Balcazar et al., 2006; Panigrahi et al., 2010)
دفتر مواد غذایی و مطالعه دارویی آمریکا و انجمن رسمی کنترل مواد غذایی، برای متمایز نمودن میکرو ارگانیسم های مفید و مضر، لیست گونه هایی از میکرو ارگانیسم را ارائه نموده است که می توان آنها را با مواد غذایی مصرف نمود. از جمله این مواد می توان به لاکتوباسیلوس پلانتاروم Lactobacillus plantarum اشاره نمود.
در این تحقیق باکتری توسط دکترشناور ماسوله در سال 1391 از فلور باکتریایی روده برداشت و با روش مولکول 16S rRNA مورد شناسایی و در NCBI مورد ثبت قرار گرفت (KC426951) و برای اولین بار در ایران جهت تغذیه بچه ماهی قزل آلا بصورت in vivo مورد مصرف قرار گرفت.
تحقیقات و استفاده های گسترده ای از باکتری های اسید لاکتیک شده است که از آنها می توان به لاکتو باسیلوس اشاره کرد (Kesarcodi-Watson . et al .,2008)
در خصوص تاثیر انواع پروبیوتیکها بر رشد و بازماندگی ماهیان تحقیقات فراوانی بعمل آمده است ولی در زمینه اثرات ایمنی زایی آن در ماهیان اطلاعات بسیار محدودی در دسترس می باشد. لذا در این مطالعه بررسی ایمنی زایی این ترکیب در ماهی قزل آلای رنگین کمان مدنظر می باشد
قزل آلای رنگین کمان نخستین گونه از خانواده آزادماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش یافت. این ماهی از اواخر قرن نوزدهم میلادی به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار پرورش داده شده است. در حال حاضر، ماهی قزل آلا اساس صنعتی را تشکیل می دهد که در حال توسعه است و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند در حال افزایش است.
لذا با توجه به مطالب ذکر شده در نوشتار بالا که بیانگر نقش و اهمیت بسیار زیاد پرورش گونه قزل آلا
در تامین پروتئین جامعه می باشد و مشکلات پیش رو حاصل از تغییر شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط پرورش این گونه با ارزش که منجر به انواع بیماریها و تلفات قابل توجه و در نهایت از دست رفتن سرمایه پرورش دهندگان می گردد و با هدف کاهش مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی در مبارزه با بیماریها ی این آبزی که در نهایت به نحوی وارد چرخه مواد بدن انسان و اثرات سو می شود مطالعه جایگزینی مناسب نظیر پروبیوتیک ها از جمله باکتری لاکتو باسیلوس پلانتاروم بعنوان اولین زیست یار حیاتی ضروری به نظر میرسد لذا مطالعه ای در خصوص تاثیر مقادیر مختلف زیست یار حیاتیباکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم در جیره غذایی قزل آلای رنگین کمان بر رشد ، فلورباکتریایی روده، شاخصهای خونی و ایمنی این گونه مورد مطالعه قرار گرفت که به ضرورت انجام این تحقیق ، فرضیات و اهداف آن در ذیل اشاره شده است.
تاکنون در زمینه افزودن باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم به جیره غذایی قزل آلا، بویژه در سن رشد (بچه ماهی) جهت پرورش آنها در مزارع پرورش، مطالعه علمی و عملی و نیز بررسی اثر غذای حاوی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم روی فلور باکتریایی روده، عوامل خونی و ایمنی خون قزل آلای رنگین کمان به انجام نرسیده است. هرگونه تغییر در شرایط زیستی، تغذیه ای و ... می تواند روی فلور باکتریایی، شاخص های خونی و ایمنی اثر گذار باشد. برآورد این تغییرات جهت دست یابی به وضعیت ایمنی ماهیان تغذیه شده با پروبیوتیک مذکور از روی شاخص های خونی و بیوشیمیایی، از بررسی های علمی نوین در ایران می باشد.
تحقیق حاضر جهت بررسی سطوح مختلف باکتری Lactobacillus plantarum در جیره غذایی روی برخی فاکتورهای خونی ، ایمنی ماهی و فلور باکتریایی و رشد قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) طی60 روز مورد بررسی قرار گرفت. از آنجا که پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان در جهان بسیار رونق دارد، نتایج این تحقیق می تواند در سطوح بین المللی نیز حایز اهمیت بوده و مورد بهره برداری کارگاهها و مراکز دولتی و خصوصی پرورش ماهیان سرد آبی قرار گیرد.
سوالات تحقیق
1-یا مقادیرمختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتور رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
2- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
3- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
فرضیه تحقیق
1-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت ندارد.
2-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum برفاکتورهای رشد و فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت دارد.
3-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum ، شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان(Oncorhynchus mykiss) را بهبود می بخشد.
اهداف تحقیق
1-تعیین مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum یر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
2-تعیین تاثیر مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum بر فلور باکتریایی روده ی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
3-تعیین مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص های خونی و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
در مقایسه با تیمار شاهد.
1-1- مشخصات آزاد ماهیان (Salmonidae)
اکثر آزاد ماهیان گونه هایی با ارزش تجاری بالا هستند. هیچ یک از گونه های این خانواده کاملاً دریایی نیستند. یعنی به صورت آنادرموس ((Andromouse در دریا زندگی کرده و جهت تخم ریزی به آب شیرین مهاجرت می کنند. از مشخصات عمده این خانواده وجود باله چربی ( Fine Adipose) می باشد. این باله فاقد شعاع است و حد فاصل باله پشتی و دمی است. وجود دندان از مشخصات آزاد ماهیان است و در برخی گونه ها دندان ها در تمام محفظه دهان گسترش یافته است و وجه تمایز جنس های نر و ماده در زمان تخم ریزی می باشد. آزاد ماهیان گونه هایی گوشتخوار هستند (Maitland,2000).
به طور کلی آزادماهیان از نژادها و جمعیت های مختلفی برخوردار بوده و در نقاط مختلف جهان پراکنش گسترده ای دارند. این ماهیان در زمره ماهیان سردآبی قرار دارند و اغلب متعلق به مناطق سردسیری و معتدله جهان می باشند. در بین خانواده آزاد ماهیان، گونه های قزل آلای رنگین کمان، قزل آلای خال قرمز، آزاد ماهی دریای خزر و میزان محدودی ماهی آزاد زیبا و ماهی آزاد کتا در آب های ایران یافت میشود. این گونه ها از ارزش اقتصادی و زیستی بسیار بالایی برخوردارند و بایستی مورد توجه جدی تری قرار گیرند (فرزانفر، 1384)
1-1-1- رده بندی ماهی قزلآلا
این ماهیان از راسته آزادماهی شکلان(Salmoniforms) و مشتمل بر شش خانواده که عبارتند از: آزاد ماهیان (Salmonidae)، سفید ماهیان(Coregonidae)، بلند باله ماهیان(Thymalidae) ، نازک فلس ماهیان(Osmeridae) ، اردک ماهیان(Esocidae) و سگ ماهیان(Umberidae) که در این مجموعه تنها خانواده نخست، بطورمختصرتشریح می‌گردد.
از جنس‌های معروف این خانواده می‌توان به جنس Salmo، Hucho، Oncorhynchus ، Salmothymus ، Salvelinus و Stenodus اشاره نمود (فرزانفر، 1384).
در بین خانواده های راسته آزادماهی شکلان بجز خانواده های اردک ماهیان و سگ ماهیان مابقی دارای یک باله چربی کوچک هستند که در حدواسط بین باله پشتی و دمی آنها قرار دارد و فاقد شعاع های استخوانی سخت و نرم می باشند (وثوقی و مستجیر، 1379). در گذشته ماهی قزل آلای رنگین کمان را متعلق به جنس Salmo و Salvelinus قلمداد می کردند، در حالی که ماهی آزاد را مربوط به جنس Oncorhynchus می دانستند. اما در سال 1989 ماهی قزل آلای رنگین کمان را که قبلاً تحت عنوان علمی Salmo gairdneri معروف بود، جزو جنس Oncorhynchus طبقه بندی نمودند. امروزه قزل آلای رنگین کمان با نام علمی O. mykiss معروف است و از لحاظ علمی این ماهی جزو گونه های آزاد ماهیان محسوب می گردد (Stickney, 1991)
1-1-2- برخی ویژگی های مورفولوژیک و بیولوژیک ماهی قزل آلا ی رنگین کمان
این ماهی دارای یک نوار پهن بصورت رنگین کمان در هر طرف بدن بوده، بر روی سر، بدن، پشت، باله چربی و باله دمی آن لکه های تیره رنگی مشاهده می شود (شکل1-1). حداکثر طول این ماهی 70 سانتی متر و وزن آن به 7 کیلوگرم نیز بالغ می گردد. این ماهی را متعلق به گروه ماهیان رودرو((Anadromous Fishes ، میدانند. یعنی کلیه مهاجرت های تولید مثلی خود را درآب شیرین انجام می دهد (وثوقی و مستجیر،1379)این ماهی بطور طبیعی در ایران، در دریاچه های با آب سرد، نهرها و رودخانه های با بستر قلوه سنگی و سنگلاخی به سر می برد. زیستگاه این ماهی تا حدی مشابه قزل آلای خال قرمز (گونه بومی ایران) می باشد. در اغلب رودخانه های حوزه جنوبی دریای خزر بوسیله انسان معرفی شده است (نادری و عبدلی، 1383) این ماهی قابلیت بسیار خوبی برای پذیرش غذای دستی و پرورش مصنوعی را داشته، از سرعت رشد قابل قبولی برخوردار است.
1-1-2-1- دستگاه گوارش و اندام های مرتبط
آزاد ماهیان ، جانورانی گوشتخوار بوده ، دارای سیستم گوارشی کوتاهی می باشند ، دندان های این جانوران به شکلی بوده که قابلیت شکار را بخوبی برای آنها میسر می سازد. دهان در این ماهیان از قسمت های مختلفی مانند فک میانی ، فک فوقانی ، فک تحتانی ، استخوان تیغه ایی Vomer و زبان تشکیل شده است.
در این ماهیان علاوه بر فکین ، دندان ها بر روی سقف دهان و قاعده زبان نیز یافت می شوند (فرزانفر ، 1384). در محوطه معده واکنش های وابسته بع ترشح اسیدمعده ، آنزیم ها و همچنین حرکات معده می تواند موجب له شدن مواد غذایی شده، مراحلی از هضم صورت پذیرد.در بخش انتهایی معده و در محل اتصال به روده حدود 30 الی 80 زوائد انگشتی بنام زوائد باب المعده ای Pyloric caeca قرار گرفته اند که در هضم می توانندنقش موثری داشته باشند. مواد غذایی از سوی معده از طریق یک دریچه یک طرفه به نام پیلور وارد روده شده تا به کمک آنزیم های آن هضم بیشتری بر روی مواد غذایی انجام پذیرد. بعلاوه آب ، املاح و ویتامین ها نیز از طریق جداره روده جذب می گردند. بقیه مواد باقیمانده سپس بصورت مدفوع از مخرج ماهی دفع می شود(Ali,2000) .
غدد گوارشی مانند ، کبد ، کیسه صفرا و پانکراس نقش بسزایی در هضم مواد غذایی دارند. کبد بعلت داشتن اندازه بزرگ و همچنین بافتی نرم براحتی قابل شناسایی می باشد. رنگ این غده از قرمز تیره تا قهوه ایی روشن متفاوت است. در کنار کبد، کیسه صفرا قرار گرفته است که مایع سبز رنگی به نام صفرا را تولید می نماید. عمل اصلی این مایع ، تاثیر بر روی مواد چربی و شکستن مولکول های چربی می باشد. پانکراس در آزاد ماهیان بصورت غدد پراکنده در میان زوائد باب المعده ای ظاهر می گردد . پانکراس با تولید آنزیم های گوناگون به هضم مواد غذایی کمک کرده ، بعلاوه با ترشح هورمون انسولین در کنترل قند خون نقش موثری دارد (Pannell and barton , 1996) .
1-1-3- برخی ویژگی های ماهی قزلآلایرنگینکمان "Oncorhynchus mykiss"
قزل آلای رنگین کمان جز ماهیان پرورشی است که از اواخر قرن نوزدهم میلادی اهلی شد و به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار، پرورش داده شده است. اکنون ماهی قزل آلا اساس یک صنعت در حال توسعه را تشکیل می دهد و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند، در حال افزایش است. این ماهی نخستین ماهی (گونه) از خانواده آزاد ماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش داده شد. در حال حاضر، این ماهی سهم با ارزشی در تامین غذای انسان دارد. علت این امر فقط به دلیل ارزش غذایی بالای این ماهی و کمیاب و گران شدن ماهیان وحشی که از طبیعت صید می شوند، نیست. بلکه بخاطر وجود چربی های اشباع نشده ای هستند که در این ماهی یافت می شوند (فرزانفر، 1384).
جنسهای این خانواده در آب های سرد با اکسیژن فراوان زندگی می کنند که توسط انسان به اقصی نقاط
دنیا برده شد. به خاطر خاصیت سازگاری زیاد آن، هماکنون در بیشتر آب های شیرین که دارای دمای مناسب جهت رشد این گونه هستند، حضور دارد و گونه پرورشی بیشتر مزارع پرورش ماهیان سردآبی دنیا و تقریباً صددرصد مزارع پرورش ماهیان سردآبی ایران را به خود اختصاص میدهد (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-4- پراکنش ماهی قزل آلا در جهان و ایران
محدوده زیستگاه اصلی ماهی قزل آلای رنگین کمان شمال غرب آمریکاست و از رودخانه Kuskokwim در آلاسکا آغاز شده و به سمت جنوب ادامه می یابد و با عبور از بخش British Clombia به منطقه Baja در کالیفرنیا می رسد. در سواحل شرقی انشعاب اصلی در رودخانه Peace در ایالت British Clombia و Athabasca (در آلبرتا) نیز وجود دارد. جمعیتی از این ماهی نیز به صورت بومی در استان Chihuahua در کشور مکزیک وجود دارند. سرعت رشد نژاد مهاجر پولادسر (که به دریا مهاجرت میکند) بیشتر است. ماهیان نژاد مهاجر عموماً از نژاد غیر مهاجر که تمام دوره زندگی خود را در رودخانه سپری می کنند بزرگترند؛ اما بزرگترین ماهیان قزل آلای رنگین کمان را می توان در دریاچه های آب شیرین یافت (مشائی، 1386)این ماهی
در حوضه خزر، دجله ،کارون، نمک، کویر، زاینده رود، تجن (خراسان) و کرمان پراکنش دارد (هدایتی فرد،1382). همچنین در رودخانه پارک ملی گلستان در مناطقی با دمای کمتر از 20 درجه سانتی گراد مشاهده می گردد (عبدلی،1389).قدمت پرورش آن در ایران نیز به چند دهه قبل، یعنی سال 1338 هجری شمسی مربوط می شود (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-5- بررسی آماری تولیدات پرورشی ماهی قزل آلا
براساس سالنامه آماری سازمان خواربار جهانی ملل متحد (FAO) که در سال 2012 منتشر نمود، میزان کل تولید آبزیان پرورشی در سال 2010، بالغ بر 6/63 میلیون تن بوده است.
نرخ رشد صنعت پرورش آبزیان طی سالهای 1960 الی 2009 برابر 2/3 درصد بود در حالیکه طی مدت مشابه نرخ رشد افزایش جمعیت معادل 7/1 درصد بوده است . میزان تولید ماهیان خانواده آزاد ماهیان در سال 2001 برابر 1785121 تن گزارش شده است که این گونه ها در سال 2010 به مقدار 2411136 تن افزایش یافت. بر اساس گزارش در همین منبع میزان پرورش آبزیان در ایران در سال 2010 برابر 220034 تن می باشد که رتبه 14پرورش آبزیان را بین کشورهای جهان دارا می باشد .
آمار ارائه شده در آمارنامه سازمان شیلات ایران میزان تولیدحاصل از آبزی پروری را در سال 1389 معادل 251374 تن و در سال 1379 معادل 66000 تن گزارش نموده است .طی ده سال اخیر، روند صعودی میزان تولید ماهی قزل‌آلای رنگین کمان در ایران پیشرفت بسیار قابل توجهی داشته است. بطوریکه میزان تولید سالانه این ماهی در سال 1379، از مقـدار 9000 تـن، به مـرز 91519 تـن در سـال 1389 رسـیده است. که معادل 8/3 درصد تولیدات ماهیان سردآبی جهان است (FAO,2012).

شکل(1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"
1-2- پروبیوتیک چیست؟
واژه پروبیوتیک، واژه ای یونانی و به معنای "برای زندگی" می باشد (Chukeatirote, 2003). پروبیوتیک نخستین بار توسط Lilly & Stillwell (1965) برای برخی مواد مترشحه بوسیله میکروارگانیسم ها بکار گرفته شد که موجب تحریک رشد سایر میکروارگانیسم ها می شوند. بنابر این، ترکیبات اخیر از لحاظ تاثیر می توانند کاملاً در برابر آنتی بیوتیک ها یا مواد پاد زیست، قرار گیرند. با این وجود، بکارگیری این واژه بدین شکل تداوم نیافت و Sperti (1971) از این واژه تحت عنوان عصاره ی بافتی که موجب تحریک رشد میکروبی می شوند، یاد نمود.
تحقیق Metchinkoff (1907) در آغاز قرن بیستم را می توان نخستین تحقیق انجام شده در زمینه پروبیوتیک ها دانست. وی تاثیر مصرف ماست را مورد بررسی قرار داد و متوجه تأثیر این ماده غذایی روی طول عمر کشاورزان بلغاری شد. در واقع او اصول دستکاری میکروفلور روده را درک نموده بود و این موضوع را این گونه شرح داد: "میکروب هایی که با هدف بهبود سلامتی خورده می شوند". همین تعریف، بعدها توسط Parker (1974) اینگونه اصلاح شد: "موجودات و موادی که در تعادل میکروبی روده تأثیرگذارند".
Fuller (1989) نیز تعریف Parker را اینگونه اصلاح نمود: "مکمل های غذایی حاوی میکروب های زنده که از طریق تعادل میکروفلور روده اثرات مفیدی بر سلامت میزبان می گذارد"، این تعریف امروزه بیشتر متعارف است. اجزای اصلی این تعریف منعکس کننده لزوم زنده بودن میکروارگانیسم و استفاده آن به صورت مکمل غذایی برای میزبان است و ابهامی را که با بکاربردن اصطلاح "مواد" ایجاد می شد را از بین می برد. "اثر بر روی تعادل میکروبی روده" که در تعریف اخیر اشاره شد، در تحقیقات انجام شده کمتر مورد توجه قرار گرفته است. Tannock(1997) به این نکته توجه نمود و این تعریف را به این صورت پیشنهاد کرد: "سلول های میکروبی زنده که با هدف بهبود سلامتی، به صورت مکمل های غذایی بکار می روند".
بسیاری از محققین تعریف Fuller را مورد تجزیه و تحلیل بیشتری قرار داده و تعاریف کامل تری را ارئه نمودند. بعنوان نمونه، Gatesoupe (1999) پروبیوتیک ها را اینگونه تعریف نمود: "سلول های میکروبی که به طریقی وارد دستگاه گوارش می شوند و زنده می مانند تا سلامتی را در میزبان ایجاد نمایند". Gram و همکاران (1999) نیز پیشنهاد کردند که "پروبیوتیک هر نوع مکمل میکروبی زنده است که از طریق بهبود تعادل میکروبی بر میزبان تأثیر مثبت می گذارد". همچنین، Salminen و همکاران (1999) تعریف پروبیوتیک را این گونه ارائه کردند: "پروبیوتیک ها فرآورده هایی از سلول های میکروبی یا اجزایی از سلول های میکروبی هستند که اثرات مفیدی روی سلامت میزبان دارند". در این تعریف لزوم زنده بودن سلول های مرتبط با تغذیه نادیده گرفته شد.
روشن است که اختلافات زیادی در درک واقعی اصطلاح "پروبیوتیک" وجود دارد. از آنجا که پروبیوتیک ها در آبزی پروری هم استفاده می شوند، تعاریف بایستی اصلاح شوند. در جانوران آبزی نه تنها دستگاه گوارش مهم است، بلکه آب محیط پرورش هم دارای اهمیت می باشد (Gomez-Gil et al., 2000).
به طور خلاصه می توان پروبیوتیک را اینگونه تعریف نمود: "پروبیوتیک ها باکتری های بی ضرری هستند که به سلامت جانور میزبان کمک می کنند و بطور مستقیم یا غیر مستقیم، میزبان را در بر ابر عوامل بیماریزای باکتریایی محافظت می نمایند" ( Irianto et al.,2000).
1-2-1- ضرورت استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری
در سیستم های متراکم تولید تخم و لارو، آب با روش های گوناگونی مانند فیلتر کردن تصفیه می شود و با این کار عده ای از باکتری ها از سیستم خارج می شوند که این عمل ممکن است تعادل بین جمعیت میکروب ها را از بین ببرد یا سبب تکثیر باکتری های فرصت طلب گردد و یا باعث توسعه جمعیت باکتری های پیش بینی نشده شود. بنابراین برای کنترل میکروبی سیستم، روش های بهتری مورد نیاز است (Olafsen, 1998).
در طی دوره انکوباسیون یا پرورش لارو، میان کنش های متفاوتی بین باکتری ها و سطوح روده جاندار ممکن است رخ دهد که احتمالاً منجر به تشکیل میکروفلور بومی در موجود می گردد و یا زمینه ساز بروز عفونت می گردد. از این رو برای موفقیت در تولید متراکم و انبوه استفاده از روش هایی برای تقویت سیستم های دفاع طبیعی جاندار ضروری بنظر می رسد ( Olafsen, 1998). از دیگر کاربردهای پروبیوتیک بهبود تعادل میکروبی روده و در نتیجه بهبود جذب غذا می باشد (Parker, 1974 ; Fuller, 1989).
در سیستم های آبزی پروری، میکروب ها از اهمیت ویژه ای برخوردار بوده و بر عملکرد رشد اثرات ویژه ای نشان می دهند. علت این امر تا حدی مربوط به ارتباط مستقیم بیماری ها و کیفیت آب، با عوامل میکروبی است. اخیراً در آبزی پروری بمنظور حفظ شرایط اکولوژیک، از پروبیوتیک به جای آنتی بیوتیک استفاده می شود و تکنیک انتقال باکتری به لارو ضروری است (Skjermo & Vadstein, 1999). احتمالاً در فرایند . بمنظور استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، در نظر گرفتن الزاماتی نظیر وجود باکتری با کیفیت مناسب بعنوان پروبیوتیک هاضمه دوکفه ای ها، باکتری ها آنزیم های خارج سلولی همانند پروتئاز و لیپاز تولید کرده و فاکتورهای لازم را برای رشد فراهم می آورند. همچنین احتمالاً باکتری ها در تغذیه بی مهرگان دریایی و ماهی ها نیز نقش دارند (Olafsen, 1998). این گونه باکتری ها با تولید مواد سلولی یا میکرونوترینت هایی شبیه اسیدهای چرب ضروری (Ringo et al.,1995)، ویتامین ها ( Sugita et al.,1998)، مواد معدنی یا حتی آنزیم ها به تغذیه کمک می نمایند.
حضور باکتری های اسید لاکتیک در دستگاه گوارش دلیلی بر وجود تخمیر در روده می باشد، این باکتری ها روی هیدرات های کربن پیچیده همچون نشاسته و سلولز تاثیر گذاشته و آنها را به ترکیبات ساده تر تبدیل می کنند تا جذب و سنتز ویتامین های خانواده B و ویتامین K در لوله گوارش صورت گیرد (Hansen & Olafsen, 1999). در اکوسیستم های آبی ارتباط بین میکروارگانیسم ها و دیگر واحدهای زنده و همچنین جریان مداوم آب، میان دستگاه گوارش ماهیان و بی مهرگان، همه بر روی میکروفلور بومی تاثیر می گذارد(Olafsen, 1998). ایجاد کلنی های پروبیوتیک در امعا و احشا احتمالاً در اثر مصرف آن از محیط آبی اطراف می باشد که سبب تعدیل فلور امعا و احشا میشود و باعث بهبود رشد و بقای لاروها میگردد.
این امکان وجود دارد که پروبیوتیک ها همانند یک ماده فعال کننده مکانیسم های دفاعی عمل نمایند ( Raa, 1996). باکتری های پروبیوتیک هوازی با مصرف اکسیژن، شرایط لوله گوارش را برای عوامل بیماریزا هوازی سخت می نمایند و برای آنها محدودیت ایجاد می نمایند و از رشد آنها جلوگیری می کنند. همچنین از لحاظ فضا و غذا نیز با آنها رقابت می کنند. در این میان تعدادی از پروبیوتیک ها اجباراً از بین میروند.
در واقع استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، باعث کاهش سطح ترکیبات آنتی میکروبیال (بویژه آنتی بیوتیک ها) بکار رفته، افزایش میزان اشتها و یا مقدار رشد گونه های پرورش یافته می شود)
Irianto & Austin, 2002)). شاید بتوان مهمترین ویژگی پروبیوتیک ها را در این دانست که ضمن کاهش بیماری و بهبود ضریب تبدیل غذایی در دام و طیور، هیچ باقیمانده ای در بافت ها نداشته و بر خلاف پادزیست ها مقاومت میکروبی ایجاد نمی نمایند. مطمئناً، پروبیوتیک ها نبایستی برای میزبان ضرر داشته باشند (Salminen et al., 1999) و آنها غیر بیماریزا و غیر سمی بوده و می توانند موجب پیشگیری از بروز اثرات جانبی نامناسب باشند. آنها بایستی در یک محدوده دمائی و دامنه شوری مشخصی مؤثر باشند ((Fuller, 1989 .
1-2-2- خطرات مصرف آنتی بیوتیک ها
امروزه درمان با مداخله میکروارگانیسم ها به چند دلیل مورد توجه می باشد (رنجبرو میرنژاد، 1380; Rengpipat et al., 1998):
درمان با آنتی بیوتیک بطور موفقیت آمیزی برای کل عوامل عفونی مثمر ثمر واقع نشده است، اگرچه بدون شک بعضی از مسائل را حل نموده ولی بعضاً خود مساله ساز بوده است.
درمان با آنتی بیوتیک وضعیت فلور معمولی محافظت کننده بدن را بر هم می زند و موجود را نسبت به سایر عفونت های فرصت طلب مستعد می نماید و موجب افزایش نگرانی و ترس از ایجاد سویه های میکروبی مقاوم به آنتی بیوتیک در اثر استعمال گسترده آن شده است. با استفاده از آنتی بیوتیک های مشابه، سویه های میکروبی نسبت به آنها مقاومت پیدا می کنند و به سرعت رشد یافته و تکامل می یابند.
1-2-3- نحوه عمل پروبیوتیک ها
1-2-3-1- تولید ترکیبات ممانعت کننده (Inhibitory Component)
باکتری های پروبیوتیکی ترکیبات شیمیایی مختلفی تولید می کنند، که موجب از بین رفتن سایر باکتری ها و یا توقف فعالیت آنها می گردد (Verschuere et al., 1999). به نظر می رسد تولید مواد ممانعت کننده می تواند در داخل و یا سطح روده و حتی در محیط پرورشی، به عنوان سدی موجب جلوگیری از رشد و نمو عوامل بیماری های فرصت طلب گردد. معمولاً اثر ضد باکتریایی باکتری ها می تواند بعلت تولید برخی از عوامل زیر به تنهایی و یا بصورت ترکیبی باشد: تولید آنتی بیوتیک ها ) Williams & Vickers, 1986)، باکتریوسین ها (Bruno & Montville, 1993 و Boyd et al., 1984)، سیدروفورها ( Pybus et al., 1994،
Yoshida et al., 2002 و Braun, & Braun, 2002)، لیزوزیم ها، پروتئازها، هیدروژن پراکساید ها و یا تغییر میزان pH از طریق تولید اسیدهای آلی (Sugita et al., 1997 و Ringo & Gatesoupe, 1998)، دی اکسید کربن (Gill, 2003). تعدادی ازمحققین ترکیباتی کشف و مشاهده نموده اند. بعنوان نمونه، Nair و همکاران (1985) نشان دادند که تعداد قابل توجهی از باکتری های دریایی، آنزیم های باکتریولیتیک علیه باکتری Vibrio parahaemolyticus تولید می کنند. همچنین،Imad و همکاران (1985)، Alteromonas SB-10-31 را از نواحی نزدیک ساحل دریای ژاپن جداسازی نمودند. آنها نشان دادند که این باکتری قادر است یک پروتئاز آلکالینی ممانعت کننده که موناستاتین نامیده می شود، تولید کند. در آزمایش فعالیت ممانعت کنندگی موناستاتین علیه پروتئاز بدست آمده از Aeromonas hydrophila و پروتئاز تیول بدست آمده از Vibrio anguillarum، به اثبات رسید (هر دو باکتری مذکور عوامل بیماریزای ماهی هستند) (Verschuere et al., 1999).
1-2-3-2- رقابت بر سر مکان های اتصال
موجودات پروبیوتیکی برای مکان های اتصال و غذا در سطح مخاطی روده رقابت می کنند و در نتیجه از تشکیل کلونی باکتری های بیماریزا پیشگیری می کنند ( Vanbelle et al., 1990). قدرت اتصال باکتری های پروبیوتیکی ظاهراً طی مرحله سکون رشد بیشتر از مرحله رشد لگاریتمی است (Vine et al., 2004). اتصال ممکن است غیراختصاصی، بر پایه فاکتورهای فیزیکوشیمیایی و یا اختصاصی باشد. محل اتصال می تواند در بر گیرنده مولکول های چسبیده به سطح باکتری های متصل به روده و یا مولکول های گیرنده روی سطح سلول های مخاطی روده باشد (Salminen 1996). توانایی پروبیوتیک ها برای چسبیدن به موکوس روده احتمالاً می تواند ایجاد عفونت روده را توسط برخی از عوامل بیماریزا متوقف می کند. البته اتصال پروبیوتیک ها به دیواره روده یا سایر بافت ها لزوماً نشان دهنده رقابت بر سر مکان های اتصال به عنوان تنها روش عملی اثر پروبیوتیک ها نیست. این نکته که باکتری ها قادر به تشکیل کلونی، مثلاً در دیواره روده ماهی، هستند و نقش حفاظتی شان از طریق ترشح ترکیبات ممانعت کننده اعمال می نمایند، کاملاً پذیرفته شده است (Verschuere et al., 2000). توانایی اتصال و رشد در سطح روده یا درون موکوس خارجی در شرایط آزمایشگاهی در مورد برخی عوامل بیماریزا در ماهی از قبیلV. anguillarum وA. hydrophila ( Krovacek et al., 1987 ; Garcýa de la Banda et al., 1992) و همچنین برای پروبیوتیک های مانند Carnobacterium SK1 و بسیاری از پروبیوتیک های تخلیص شده نشان داده شده است. همچنین نقش ممانعت کنندگی برایV. anguillarum ( Olsson et al., 1992) نیز به اثبات رسیده است. در یکی از این مطالعات، هدف ارزیابی توانایی سویه های پروبیوتیکی در اتصال یا رشد در موکوس روده ای در شرایط آزمایشگاهی بوده تا پتانسیل آنها در تشکیل کلونی در توربوت پرورشی، به عنوان روشی برای پیشگیری از عفونت میزبان باV. anguillarum بررسی گردد (Olsson et al., 1992).
1-2-3-3- رقابت جهت جذب و مصرف مواد مغذی
پروبیوتیک ها از مواد مغذی که توسط میکروب های بیماریزا مصرف می شوند، استفاده می کنند و در نتیجه محیط را از مواد غذایی مورد نیاز برای سایر میکروارگانیسم ها تهیه می نمایند و موجب بروز مشکلاتی برای رشد آنها می شوند .در تئوری، رقابت بر سر مواد مغذی می تواند نقش مهمی در ترکیب توده زنده میکروبی روده یا محیط زیست موجودات آبزی پرورشی، ایفا نماید.(Ringo & Gatesoupe, 1998). اما تاکنون مطالعات جامعی در این زمینه انجام نگرفته است. از اینرو بکارگیری صحیح و بجای اصل رقابت بر سر مواد مغذی در شرایط طبیعی کاری آسان نبوده و وظیفه اصلی اکولوژیست های میکروبی است (Verschuere et al., 1999).
Verschuere و همکاران (1999) سویه های مختلف باکتریایی را که اثر مثبتی بر روی بقاء و رشد آرتمیای جوان داشتند، انتخاب نمودند. آزمایش های آنتاگونیستی در شرایط in vitro و آزمایشات فیلتری نشان داد که هیچ ترکیب ممانعت کننده خارج سلولی در عمل حفاظتی این سویه ها علیهVibrio  proteolytics CW8T2 شرکت نداشته اند. اما سلول های زنده این سویه در حفاظت آرتمیا در برابر عامل بیماریزا ضروری بنظر می رسند یافته های اخیر بر این نکته اشاره دارند که باکتری های انتخاب شده عمل حفاظتی شان را از طریق رقابت با عامل بیماریزا بر سر دسترسی به مواد مغذی و انرژی اعمال می کنند.
1-2-4- معیارها و روشهای انتخاب پروبیوتیک
نخستین و مهمترین هدف ازکاربرد پروبیوتیک ها، حفظ یا ایجاد مجدد رابطه مطلوب بین میکروارگانیسم های بیماریزا و مفید است که فلور موکوس پوست و روده ماهی را تشکیل می دهند. بنابراین یک پروبیوتیک مناسب بایستی برخی خصوصیات خاصی که اثر مثبت آن را تأیید نماید، داشته باشد( Ali, 2000).
اکثر مطالعات انجام گرفته در زمینه اثر پروبیوتیک ها بر جانوران آبزی پرورشی بر کاهش مرگ و میر و بالعکس، افزایش بقاء (Moriarty, 1998 ; Skjermo & Vadstein, 1999 Chang & Liu, 2002 ; ; Irianto & Austin, 2002)، افزایش مقاومت در برابر بیماری (Gatesoupe, 1994)، توانایی چسبندگی و تشکیل کلونی در روده ( Joborn et al., 1997)، توانایی کاهش تعداد سلول های باکتریایی در کلیه، تولید پلی آمین ها و فعالیت آنزیم های گوارشی (Tovar et al., 2002) و تکامل سیستم ایمنی غیر اختصاصی توسط سیستم های داخل سلولی، مثلاً افزایش فاگوسیتوز و فعالیت های لیزوزیمی ( ;Irianto, & Austin, Panigrahi et al., 2004 ; Gullian et al., 2004) بوده است. اثر مثبت پروبیوتیک ها برمیزبان نظیر، سم زدایی از ترکیبات مضر موجود در غذا و بهبود مواد مغذی آن، تجزیه کردن اجزای غیر قابل هضم موجود در جیره غذایی توسط آنزیم های هیدرولیتیک من جمله آمیلاز و پروتئاز، تولید ویتامین ها مثل بیوتین و B12، تولید ترکیباتی که آنتاگونیست عوامل بیماریزا هستند و در نهایت تحریک سیستم ایمنی میزبان تاکنون گزارش شده اند. روشن است که یک پروبیوتیک مفروض می تواند بیش از یک پاسخ حفاظتی را در میزبان القا نماید. همچنین پروبیوتیک های مختلف می توانند اثرات جداگانه و مشخصی را بر میزبان بگذارندIrianto, 2002) Austin &). دوام پروبیوتیک ها در دستگاه گوارش می تواند منعکس کننده شرایط سن و بهداشت و سلامتی ماهی باشد. مثلاً تجویز پروبیوتیک ها درماهیان جوان، در هنگام انجام اولین مراحل تغذیه و در ماهیان بزرگتر پس از مصرف آنتی بیوتیک ممکن است منجر به تشکیل کلونی بلندمدت از باکتری های پروبیوتیکی در دستگاه گوارش گردد. روش های انتخاب باکتری پروبیوتیکی برای استفاده در پرورش موجودات آبزی شامل مراحل زیر می باشد (Gomez-Gil et al., 2000):
1-2-4-1- جمع آوری اطلاعات زمینه ای
پیش از انجام فعالیت های تحقیقاتی در زمینه توسعه پروبیوتیک ها، در مورد فعالیت های پرورشی و توسعه اقتصادی مزارع پرورشی هم باید بررسی شود. مروری بر مقالات علمی در دسترس و اطلاعات گسترده مربوط به نحوه پرورش در مزارع پرورشی هم باید انجام شود تا تعیین گردد که آیا استفاده از پروبیوتیک میسر است یا خیر؟ وضعیت محیط زنده و غیر زنده اشغال شده توسط موجودات پرورشی با تأکید بر میکروب های موجود و ارتباط بین میکروب های محیط و ظرفیت نگهداری میکروب نیز از جمله مواردی است که بایستی مورد بررسی واقع گردد (Verschuere et al. 2000).
1-2-4-2- تهیه پروبیوتیک
تهیه یک پروبیوتیک مناسب از اهمیت ویژه ای بر خوردار است. ضروریست برای سویه های به کار گرفته شده در فرآورده های پروبیوتیک با مصرف خوراکی ، مقاومت در برابر آنزیم های دستگاه گوارش و دهان از مهمترین معیارهای انتخاب و گزینش می باشد ( مطلبی و همکاران ، 1389).
1-2-4-3- ارزیابی توان پروبیوتیک در جهت خارج سازی سویه های بیماریزا
با استفاده از آزمایش های in vitro توانایی سویه های جداسازی شده را می توان ارزیابی نمود(Gram et al.,2001).
1-2-4-4- ارزیابی امکان بیماریزایی پروبیوتیک
پیش از استفاده از یک باکتری به عنوان پروبیوتیک، لازم است که عدم بیماریزایی آن در میزبان تأیید شود. بنابراین موجودات پرورشی بایستی به همراه پروبیوتیک انتخاب شده، تحت شرایط نرمال و استرس مورد آزمایش قرار گیرند. این کار را می توان با تزریق یا غوطه وری میزبان در سوسپانسیون پروبیوتیک انتخاب شده، یا افزودن پروبیوتیک به محیط پرورشی، انجام داد (Gomez-Gil et al., 2000).
1-2-4-5- ارزیابی اثر پروبیوتیک بر میزبان
اثر پروبیوتیک انتخاب شده بایستی به صورت in vivo هم آزمایش شود. وقتی اثر پروبیوتیک به صورت مصرف در غذا در نظر گرفته شود، پروبیوتیک های انتخاب شده را می توان به محیط پرورش گونه آبزی مورد نظر افزوده و اثرشان را بر رشد و باز ماندگی ارزیابی نمود. اگرچه هنگامیکه کنترل زیستی توده میکروبی مورد نظر است، به نظر می رسد آزمایش های in vivo ابزاری مناسب جهت ارزیابی اثر بالقوه پروبیوتیک انتخاب شده بر میزبان باشد(Kesarcodi-Watson et al., 2008).
پروبیوتیک را می توان به روش های مختلف به میزبان یا محیط اطرافش اضافه نمود:
-اضافه کردن به جیره غذایی (Irianto & Austin, 2002)
-افزودن به آب پرورش (Verschuere et al., 2000)
-غوطه وری ( Austin et al. 1995)
-اضافه کردن از طریق غذای زنده (Gomez-Gil et al. 1998 ;Dhert et al. 1990 ; Robles et al. 1998)
1-2-4-6- تولید انبوه، ارزیابی سود اقتصادی
این مرحله، آخرین مرحله انتخاب پروبیوتیک است. آزمایشات اولیه بایستی در محیط یک سالن تفریخ در مزارع پرورشی انجام شود تا اثرات اقتصادی کاربرد پروبیوتیک مورد ارزیابی واقع گردد. فاکتور مهم در ارزیابی اقتصادی، امکان تولید انبوه یک پروبیوتیک است. همچنین، ممکن است قوانین محدودکننده ای در مورد کاربرد آنها در یک کشور وضع شده باشد. از اینرو بایستی پیش از آنکه کاربردهای تجاری در این خصوص آغاز شود، به آنها توجه بیشتری معطوف گردد. در پایان بایستی تعیین شود که آیا پروبیوتیک ها را می توان در عمل بکار برد یا خیر؟ بر اساس تعریف Fuller (1987)، یک پروبیوتیک بایستی برای میزبان سودمند باشد، قادر باشد در دستگاه گوارش باقی بماند، قابلیت تولید به صورت تجاری را داشته باشد، یعنی در سطح وسیع رشد کند و تولید آن اقتصادی بوده و در شرایط طولانی مدت در انبار و مزرعه، پایدار و مؤثر بماند.
به طور خلاصه، انتخاب باکتری های پروبیوتیکی یک فرایند تجربی مبتنی بر شواهد علمی محدود بوده است. بسیاری از تجارب ناموفق در زﻣﻴﻨﺔ تحقیقات در خصوص پروبیوتیک ها را می توان به انتخاب میکروارگانیسم های نامناسب نسبت داد. توسعه پروبیوتیک های قابل استفاده در کاربردهای تجاری در آبزی پروری یک فرایند چند جانبه و چند مرحله ای است، که نیازمند تحقیقات بنیادی و تجربی بوده و نیز مستلزم انجام آزمایشات در مقیاس وسیع و ارزیابی اقتصادی کاربرد آن است. لازم است که مراحل انتخاب برای میزبان های مختلف و محیط های متفاوت تغییر و اصلاح گردند((Verschuere, et al., 2000
1-3- سیستم ایمنی در ماهیان
اختلاف عمده موجود در سیستم ایمنی از نظر تشریحی بین ماهی و پستانداران، فقدان مغز استخوان و گره های لنفاوی در ماهیان است. تیموس، کلیه و طحال بافت های اصلی لنفوییدی در ماهیان استخوانی حقیقی اند. در حالی که تیموس در ماهی یک اندام لنفوییدی اولیه به حساب می آید ، اندام های لنفوییدی ثانویه تنوع قابل توجهی را نشان می دهند. بافت های لنفوییدی اغلب در اندام هایی تشکیل می شوند که جریان سینوزوییدی داشته و سلول های لنفوییدی در آنها جمع شده و به حضور آنتی ژن ها پاسخ دهند. این اندام ها در ماهیان عبارت اند از : کلیه و طحال. کبد پوست و روده نیز از اجزا مهم سیستم های دفاعی ماهیان هستند. کلیه ، طحال و کبد اندام های اصلی و پاکسازی کننده محسوب می شوند ، بطوریکه سلول های اندوتلیال و ماکروفاژها آنها به شدت نسبت به مواد خودی و غیر خودی که باید از گردش خون حذف شوند ، خاصیت آندوسیتوز دارند (سلطانی، 1387).
مهم ترین اندام ها و بافت های سیستم ایمنی ماهیان شامل تیموس، آبشش ها، پوست، کلیه اندام اپی گونال، خون، طحال، بافت مننژی، فلس ها، کبد، اجسام غاری شکل، قلب گره های لنفاوی یا اندام لیدیگ دیواره مری، مجرای گوارشی و ترشحات موکوسی و صفراوی می باشد. ایمنی در ماهیان به دو صورت اختصاصی و غیر اختصاصی تظاهر می یابد (سلطانی، 1387).
1-3-1- ایمنی غیر اختصاصی
سیستم ایمنی غیر اختصاصی، ماهی را به طیف وسیعی از عوامل بیماریزا مصون می سازد و علت مقاومت
یک فرد به یک عامل خاص بیماریزا نیز همین سیستم دفاعی می باشد (جلالی جعفری، 1377). امروزه تحقیقات در زمینه نحوه عملکرد سیستم ایمنی غیر اختصاصی ماهیان و تولید جمعیت های مقاوم به انواع عوامل بیماریزا متمرکز شده است (Galindo-Villegas & Hosokawa, 2004). دفاع غیر اختصاصی بر پایه گیرنده هایی است که الگوهای مولکولی خاصی را شناسایی می کنند. این مولکول ها در سلول های میکروبی (باکتری ها، قارچ ها و ویروس ها) وجود دارند. اما در خود میزبان دیده می شوند و هر مولکول نا آشنایی که باعث بیان ژن گیرنده خود شود محکوم به مرگ خواهد بود. سیستم ایمنی غیر اختصاصی پاسخ های سازشی را سبب شده و در حفظ هموستازی بدن شرکت می کند (Magnadottir, 2006). علاوه بر این، در القا سیستم ایمنی اکتسابی نیز شرکت دارد که از طریق تولید واسطه های خاصی در سلول ها مواجه شده با عامل خارجی صورت می گیرد (Jones, et al., 1993).
مهم ترین اجزا و سیستم ایمنی غیر اختصاصی شامل موارد زیر می باشند (جلالی جعفری،1377 و Magnadottir, 2006):
عوامل فیزیکی: شامل فلس ها، موکوس و پوست است. موکوس علاوه بر به دام اندازی و ریزش و تجدید شدن، واجد لستین، پنتراکسین، لیزوزیم، پروتئین های خنثی کننده و ایمونوگلبولین ها نیز می باشد.
عوامل سلولی: نظیر سلول های فاگوسیتوزی (گرانولوسیت ها، مونوسیت ها و ماکروفاژها) هستند. که به دو دسته ثابت (مثل سلول های موجود در بافت لنفوئیدی دستگاه گوارش) و متحرک (ماکروفاژها، نوتروفیل ها،...) تقسیم می شوند.
عوامل خونی: این تقسیم بندی به دلیل ویژگی های شناسایی عوامل نا آشنا یا نحوه عملکرد آنها می باشد. ترانسفرین از طریق رقابت برای آهن (جذب سطحی) مانع رشد باکتری ها می گردد. انترفرون نیز پروتئین ضد ویروسی است. آنزیم های پروتئازی ممانعت کننده نیز در مایعات بدنی ماهیان شناسایی شده اند.
1-3-1-1- ایمنی غیر اختصاصی ( ترکیبات مایع)
ساز و کارهای ایمنی مایعات بدن در ماهیان نقش مهمی در همه مراحل رفع یک عفونت دارند. دفاع غیر اختصاصی مایعات بدن ماهی شامل پروتئازها ، لیزین ها و آگلوتینین های موجود در ترشحات موکوسی ، به عنوان اولین خط دفاعی عمل می کنند. در حالی که سلول های پوشش مخاطی دومین سد دفاعی در برابر تهاجم میکروارگانیسم ها محسوب می شوند.
مواد گوناگون ضد میکروبی مانند تریپسین، لیزوزیم، آگلوتینین ها، عامل مکمل، پروتئین فاز حاد و دیگر عوامل لیز کننده در سرم و در موکوس پوست، آبشش ها و روده از جمله عواملی بوده که به عنوان اولین خط دفاعی در ماهی عمل کرده و مانع از چسبیدن و تثبیت میکروارگانیسم ها بر سطوح پوششی خارجی (پوست و آبشش ها) و داخلی (مجرای گوارشی) می شوند. این مواد به طور غیر اختصاصی از رشد و تکثیر عوامل عفونی بیماریزا مثل باکتری ها، قارچ ها، انگل ها و ویروس ها جلوگیری می کنند. این ترکیبات اغلب از نوع پروتئینی یا گلیکوپروتئین بوده و ترکیبات مشابه آنها و یا پیش ساز آنها نیز در همولنف بی مهرگان وجود دارد (سلطانی ، 1387).
1-3-1-1-1- لیزوزیم
لیزوزیم نقش مهمی برای مواجهه با عوامل بیماریزای عفونی در ماهیان ایفا می کند.در ماهیان لیزوزیم اغلب در بافت های غنی از گلبول های سفید مانند قسمت قدامی کلیه و بافت های پوست ، آبشش و دستگاه گوارش یافت می شود (سلطانی، 1387).لیزوزیم یک نوع واکنش ایمنی غیر اختصاصی است که توسط گلبول های سفید منتشر و در بافت های مختلف و خون ترشح می شود. (سلطانی، 1387؛ Sakai, 1999).
1-3-1-1-2- سیستم عامل مکمل (کمپلمان) در ماهیان
کمپلمان به صورت یک سیستم پروتئینی سرمی است، که عمل همولیز با واسطه ایمنی را انجام میدهد، و فعالیتهای بیولوژیکی متنوعی را نیز انجام میدهد( سلطانی، 1387).
سیستم کمپلمان نقش کلیدی در ایمنی ذاتی و اکتسابی و هشدار دادن به سیستم ایمنی میزبان در رابطه با حضور عوامل بیماریزا و برداشتن ان مانع (عامل بیماریزا) بازی می کند (Boshra and Sunyer, 2006 ; Sunyer and Lambris, 1999; Gasque, 2004 ).
1-3-1-2- ایمنی غیر اختصاصی (سلولی)
واکنش های التهابی و واکنش های ناشی از فعالیت گرانولوسیت ها ، مونوسیت ها و لنفوسیت ها ساز و کارهای دفاع غیر اختصاصی سلولی را در ماهیان تشکیل می دهند که در پاسخ به شرایط مختلفی مانند عفونت های باکتریایی ، ویروسی ، قارچی ، تک یاخته ای و انگلی به وقوع می پیوندند. (سلطانی، 1387).
سلول های فاگوسیت کننده ماهیان شامل نوتروفیل ها ، ماکروفاژها ، لنفوسیت ها ، منوسیت ها، ترومبوسیت ها ، بازوفیل ها و ائوزینوفیل ها می باشند که بیشترین نقش را ماکروفاژها و بعد نوتروفیل ها بر عهده دارند(سلطانی، 1387).
1-3-1-2-1- لنفوسیت ها
این سلول ها از سلول های مهم ایمنی می باشند و عبارت اند از : سلول های B که در اندام های مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید در کبد و سلول های T در تیموس تمایز می یابند (سلطانی ، 1387).معمولاً تعداد لنفوسیت ها در خون ماهی ، به استثنای گلبول های قرمز از سایر سلول ها بیشتر و در حالات مختلف ماهی و به خصوص در هنگام بیماری ها تفاوت دارد (ستاری، 1381).
1-3-1-2-2- نوتروفیل ها
اکثر ماهیان دارای این نوع سلول می باشند. این نوع سلول ها در ماهیان بیشترین گلبول های سفید چند هسته ای را تشکیل می دهند. (Stoskopf, 1993).
وظیفه نوتروفیل ها دفاع علیه عفونت های باکتریایی است. در اثر تحریکات تورمی به جریان خون مهاجرت
و در مرحله حاد تورمی به نواحی صدمه دیده تورمی نفوذ می کنند. این سلول ها به باکتری به صورت بیگانه خوار حمله نموده توسط فاگوزوم های داخلی آنها کشته و هضم می گردند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-1-2-3- ائوزینوفیل ها
ائوزینوفیل ها از نظر اندازه مشابه نوتروفیل ها یا به مقدار جزئی کوچکتر از آنها هستند. (Stoskopf, 1993). گرانول ها به صورت پراکنده در سلول وجود دارند و اندازه و شکل آنها در گونه های مختلف و گاهی در بین سویه های مختلف یک گونه نیز متغیر است. قدرت بیگانه خواری آنها در مقایسه با نوتروفیل ها محدود تر است (Stoskopf, 1993).
1-3-1-2-4- مونوسیت ها
کمترین تعداد گلبول های سفید متعلق به مونوسیت ها می باشد و تعداد آنها حداکثر 2 درصد در ماهیان گزارش شده است (Kumar and Tembhre, 1998). در ماهیان مونوسیت های خونی عمل ماکروفاژی دارند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994). مواد خارجی که توسط این سلولها گرفته می شوند، با آنزیم های هیدرولیتیک لیزوزیم های آنها کشته شده و سپس هضم می شوند. این سلول ها به عنوان سلول های خنثی کننده آنتی ژن نیز عمل می کنند (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-2- ایمنی اختصاصی
بطور کلی اساس سیستم ایمنی اختصاصی بر این است که ماهیان را بطور انفرادی قادر به بقاء و حفظ تعادل داخلی خودشان در محیط می نماید. اندام هایی که در ایجاد واکنش دفاع اختصاصی نقش دارند شامل بخش قدامی کلیه، طحال و تیموس است (جلالی جعفری، 1377). سیستم ایمنی اختصاصی از نظر سرعت عمل کند بوده و در مراحل ابتدایی زندگی موجود فعال نمی باشد ولی باعث ایجاد ایمنی برای دفعات بعدی مجاورت با عامل بیماریزا می گردد (Magnadottir, 2006). پاسخ های ایمنی اختصاصی بر اساس اجزاء شرکت کننده در پاسخ به دو گروه زیر تقسیم بندی می شوند (عسگری و همکاران، 1386 و Rotllant et al., 1997):
الف - پاسخ های ایمنی همورال: با واسطه ملکول هایی در خون شکل می گیرند که مسئول شناسایی اختصاصی آنتی ژن ها و انهدام آنها می باشند و همانگونه که قبلاً نیز اشاره شد آنتی بادی نام دارند؛ بروز این پاسخ ها با واسطه لنفوسیت های B انجام می گردد.
ب- پاسخ های ایمنی سلولار: با واسطه سلولی که با واسطه لنفوسیت های T ایجاد می گردد.
ایمنی ذاتی که به عنوان ایمنی طبیعی نیز در ماهیان شناخته می شود دارای دو جزئ اصلی ن شامل عوامل طبیعی و سلول های فاگوسیت کننده (ماکروفاژها) می باشند. از این میان عوامل بازدارنده فیزیکی و شیمیایی لیزوزیم ها، از اهمیت و جایگاه ویژه ای برخوردار بوده و به عنوان یکی از شاخص های استرس محسوب می گردند (Fast, et al., 2002).
1-3-2-1- ایمنی هومورال
1-3-2-1-1- ایمونوگلوبولین M(IgM)
ایمونوگلوبولین ها در ماهیان همگی جزو ماکروگلوبولین ها هستند. ماهیان ایمونوگلوبولین مشابه IgG جانوران عالی را نداشته یا کمی از آن را دارند. در ماهیان فاقد فک ایمونوگلوبولین تنها به میزان کمی وجود دارد و به خوبی شناسایی نشده اند. در ماهیان فکدار ایمونوگلوبولین از نوع IgM و دارای یک زنجیره سنگین مشابه μ پستانداران است. هر مولکول ایمونوگلوبولین در ماهیان استخوانی از نظر ساختمانی تترامر بوده و شامل دو ناحیه اتصال به آنتی ژن یعنی انتهای آمینی و ناحیه تاثیر گذار انتهایی کربوکسی است که در مجموع 4 زیر واحد مونومری را تشکیل می دهد (سلطانی، 1387).
ایمونوگلوبولین ها دارای وظایف و عملکرد های مهمی هستند که از آن جمله می توان به موارد ذیل اشاره نمود:
1.خنثی سازی2. رسوب و آگلوتیناسیون و 3.خاصیت اپسونیزاسیون (فعالیت عامل مکمل در طی فاگوسیتوز توسط نوتروفیل ها و ماکروفاژها)فعال کردن عامل مکمل (سلطانی، 1387).
1-3-2-2- ایمنی با واسطه سلولی
لنفوسیت ها به طور واضح مسئول هر دو نوع پاسخ ایمنی اختصاصی هومورال و با واسطه سلولی اند. دو نوع از لنفوسیت ها عبارت اند از : سلول های T که در تیموس تمایز می یابند و مسئول ایمنی با واسطه سلولی اند و سلول های B که در اندام های غیر از تیموس مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید کبد تولید و تمایز می یابند (سلطانی، 1387).
1-4- اهمیت مطالعات خون شناسی در ماهیان
شناخت فاکتورهای خونی علاوه بر شناخت فیزیولوژی آبزی شاخص مهم و منحصر به فرد هر گونه است که آن را از سایر ماهیان متمایز میکند. اهمیت این شناخت نه تنها در تشخیص گونه مهم است بلکه از نظر اقتصادی نیز می تواند در شناسایی بیماری ها و تعیین شرایط بهداشتی و سلامت ماهی مفید باشد (Bahmani et al., 2001; Abdel-Tawwab et al., 2005).
بافت خون شاخص مهمی برای وضعیت فیزیولوژیک اندام های بدن در تشخیص سلامت یا بیماری و کنترل روند زیستی موجودات زنده بوده و تجزیه وتحلیل شاخص های خونی راهنمای ارزشمندی در سنجش وضعیت زیستی آبزیان می باشد (بهمنی، 1377).
1-4-1- شاخص های خونی
1-4-1-1- گلبول های سفید(White Blood Cells = WBC) (لکوسیت)
تعداد این سلول ها بسیار کمتر از گلبول های قرمز است (مشایی،1386). گلبول های سفید در خون ماهیان به دو دسته تقسیم می شوند:
-گرانولوسیت (دانه دار بوده و هسته چند قسمتی دارند) شامل نوتروفیل یا هتروفیل، ائوزینوفیل و بازوفیل
-آگرانولوسیت (فاقد دانه بوده و هسته تک قسمتی دارند) شامل لنفوسیت و مونوسیت (ستاری، 1381).
هر یک اعمال حیاتی متنوعی را بر عهده دارند. گلبول های سفید در برابر عوامل گوناگون بیماریزا در بدن ماهی مقاومت ایجاد می‌کنند و پاسخ های ایمنی مختلفی بوجود می‌آورند. وظیفه اصلی این سلول ها تولید پادتن می‌باشد. مونوسیت‌ها، ماکروفاژها و گرانوسیت‌ها، وظیفه بیگانه خواری دارند، بعلاوه گرانولوسیت ها موادی برای از بین بردن باکتری ها ترشح می‌نمایند.
1-4-1-2- گلبول های قرمز (Red Blood Cells = RBC) (اریتروسیت، هموسیت)
سلولهای گلبول قرمز بیضی شکل بوده و در ماهیان مانند دوزیستان، خزندگان و پرندگان هسته دار هستند. جمعیت گلبول های قرمز در خون محیطی ماهیان را عمدتاً گلبول های قرمز بالغ تشکیل می دهد(تاکاشیما و هایبیا، 1994). تعداد آنها با افزایش سن کمتر و در فصل جفتگیری دوباره افزایش می یابد (وثوقی و مستجیر، 1388). گلبول های قرمز یا اریتروسیت ها بیشترین فراوانی را در بین سلول های خونی دارند (ستاری، 1381).
1-4-1-3- شاخص های گلبول قرمز یا اندیس های خونی
مهم ترین این شاخص ها عبارت اند از: متوسط حجم گلبول قرمز (MCV)، متوسط هموگلوبین گلبول قرمز (MCH) و متوسط غلظت هموگلوبین سلولی (MCHC) که از طریق روابط ریاضی ذیل محاسبه می شوند (Houston, 1990).
1-4-1-4- هماتوکریت
هنگامی که خون کامل دارای ماده ضد انعقاد، سانتریفوژ می شود، فضایی که توسط گلبول های قرمز فشرده شده اشغال می شود را هماتوکریت می گویند که به صورت درصد گلبول های قرمز خون نسبت به خون کامل بیان می شود. (عامری مهابادی، 1378).در صورت وجود عوامل بیماریزا در بدن یا بهم خوردن تعادل تراکم مواد معدنی در خون یا هر دو، میزان هماتوکریت متغیر خواهد بود. بعلاوه، حجم بسیار زیاد هماتوکریت نیز خود می‌تواند بیانگر احتمال وجود شرایط محیطی نامساعد همراه با استرس باشد (Parker, 1974).
1-4-1-5- هموگلوبین
هموگلوبین کروموپروتئینی است که جز اصلی گلبول قرمز را تشکیل می دهد. هر گرم هموگلوبین هنگامی که کاملاً اشباع شده باشد، 34/1 میلی لیتر اکسیژن حمل می کند (عامری مهابادی، 1378).
چندین نوع هموگلوبین مختلف ممکن است در یک ماهی وجود داشته باشد که احتمالاً برای سازگاری سیستم حمل گاز با شرایط متغیر است (کیوانی،1384).
1-5- شاخصهای بیوشیمیایی
1-5-1- پروتئین کل پلاسما و آلبومین
تقریبا بین 5 الی 10 درصد پلاسمای خون را پروتئین های خون تشکیل می دهند. اغلب پروتئین ها توسط کبد و برخی نیز مانند آنتی بادیها توسط سیستم ایمنی ساخته می شوند. اگر چه تغییر در میزان پروتئین کل پلاسمای خون به عنوان یک شاخص اختصاصی مطرح نمی باشد ولی می تواند بیانگر یک تغییر متابولیک و یا آسیب شناسی باشد( کاظمی و همکاران، 1389). آلبومین سرم فراوان ترین پروتئین پلاسما می باشد. آلبومین ها اساساً در کبد ساخته شده و از خارج شدن خون از رگهای خونی جلوگیری می کنند. (دانیال زاده و همکاران، 1385).توتال پروتئین شامل آلبومین و گلوبولین های سرمی است. این ترکیب مانند آلبومین در بیماریهای حاد و مزمن کبدی و کلیوی کاهش می یابد (Densmore, 2001). در ماهیان واجد عفونت این فاکتور نیز بصورت معنی داری نسبت به ماهیان فاقد عفونت کاهش داشته است (Austin, 1993)
1-5-2- گلوکز
گلوکز می تواند به عنوان یکی از شاخصهای مهم در تعیین وضعیت فیزیولوژیک ماهی بکار رود.با افزایش مصرف گلوکز ومتابولیت های دیگر در بعضی گونه ها ذخایر گلیکوژن چربی ها کاهش می یابد و احتمالا پروتئین ها برای تامین انرژی شکسته می شوند ( کاظمی و همکاران، 1389).
1-5-3- گلوتامیک پیرویک ترانس آمیناز (SGPT)=ALT
گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز (SGOT)AST=
دو آنزیم گلوتامیک پیرویت ترانس آمیناز) آلاتین آمینو ترانسقراز یا ALT) و گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز(آسپارات آمینو ترانسفراز یا AST)، نقش بسیار مهمی در خنثی سازی عوامل سمی و نیز فعالیتهای متابولیکی کبد داشته و دو آنزیم کلیدی برای تعیین عملکرد کبد می باشند در عفونتهایی که آسیب کبدی را با خود به همراه دارند مقدار این آنزیم کاهش می یابد(Shariffi et a.l, 2001).
1-6- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارشی
در اکثر موارد، زمانی که صحبت از میکروارگانیسمها میشود، آنها موجوداتی مضر و زیانبار تصور میشوند. چنین تصوری نمیتواند صحیح باشد، چرا که تعداد باکتریهای غیربیماریزا بمراتب بیش از باکتریهای بیماریزا است و بسیاری از گونههای غیربیماریزای باکتریها نه تنها مفیدند، بلکه برای ادامه حیات ضروری هستند. یک دسته از این باکتریها سودمند، آنهایی هستند که در دستگاه گوارش حیوانات زندگی میکنند. این میکروارگانیسمها تحتتأثیر عوامل مختلفی قرار میگیرند (شکل 1-2).
تنشهای محیطی، نوع جیره غذایی، داروها، سموم شیمیایی و همچنین شرایط آب و هوایی از جمله عواملی هستند که بر رشد میکروفلور روده تأثیرگذارند (فولر، 1380).

شکل 1-2- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش (فولر، 1380)
طی سالهای اخیر با استفاده از مواد افزودنی در خوراک دام و طیور بشدت مورد توجه متخصصین تغذیه و دام واقع شده است، یکی از مهمترین افزودنیها محصولاتی است که به طور زنده مستقیم در جیره به مصرف میرسند و در تجارت به نام پروبیوتیک شناخته شدهاند.
1-7- با کتری های اسید لاکتیک (LAB)
باکتریهای اسید لاکتیک به باکتریهایی اطلاق می شود که قادرند از تخمیر قند تولید اسید لاکتیک کنند . پرو بیو تیکها یا باکتریهای سلامت بخش جزو همین نوع باکتری هستند. استفاده از باکتریهای اسید لاکتیک در تولید فرآورده های غذایی تخمیری به حدود 4000 سال پیش بر می گردد . به طوریکه عملا آنها در تولید فرآورده هایی چون ماست و پنیر بکار می رفته اند. تحقیقات نشان می دهد علاوه بر نقش مهار کننده بر باکتریهای غیر مفید روده ، در متابولیسم لاکتوز، کاهش مصرف آنتی بیوتیک، افزایش جذب عناصر و ویتامینها و افزایش رشد و ایمنی نقش دارند(کاظمی و قدس، 1389)

user6-712

کاهش برداشت گلوکز در بافت‌ها مثل عضله اسکلتی و بافت چربی.
افزایش تولید گلوکز در کبد.
افزایش ترشح انسولین.
همه این تغییرات، «نتیجه مقاومت به انسولین» ناشی از هورمون رشد است که اثرات انسولین در تحریک برداشت و مصرف گلوکز در عضله اسکلتی و بافت چربی و مهار گلوکونئوژنز در کبد را تضعیف می‌کند. مکانیسم مقاومت به انسولین و کاهش مصرف گلوکز توسط سلول‌ها، بر اثر هورمون رشد هنوز معلوم نیست. به هر حال، هورمون رشد با افزایش غلظت اسیدهای چرب در خون ممکن است سبب اختلال در اثر انسولین بر مصرف گلوکز در بافت‌ها شود (سپهری، 1385).
2-6 ژن هورمون رشداین ژن به طور مستقیم و غیر مستقیم نقش مهمی در فرایندهای رشد سلول‌های بدنی، رشد اسکلت و تقسیم سلولی و سنتز پروتئین بعد از تولد را دارا می‌باشد، علاوه بر آن هورمون رشد میزان اکسیداسیون چربی و نقل و انتقال گلوکز به بافت پیرامونی و تنظیم فعالیت ترجمه ریبوزومی که در سنتز پروتئین مرتبط است دخالت دارد (دی سانتیس و جری، 2007). مطالعاتی که روی حیوانات انجام شد دلالت بر این دارد که ژن هورمون رشد می‌تواند یک ژن کاندید باشد که برای صفات تولیدی همانند رشد (تامباسو و همکاران،2003) مقاومت در برابر بیماری و تولید تخم (دان کانمینگ، 1997) میزان چربی (کنور و همکاران،2003) اثر به سزایی داشته باشد. پروتئین اصلی این هورمون از تحول تدریجی در طی زمان و تکامل محفوظ مانده است و اطلاعات بسیار ارزشمندی را در زمینه تغییرات پروتئینی و عملکرد هورمون رشد به ما می‌دهد (دین و همکاران، 2008).
بر اساس مطالعاتی که روی ژن هورمون رشد در ماهیان صورت گرفته مشخص شد که ژن هورمون رشد در ماهیان به صورت محافظت شده نمی‌باشد. به عنوان مثال ژن هورمون رشد کپور ماهیان همانند پستانداران دارای 4 اینترون و 5 اگزون می‌باشد (هو،1991) ولی در اکثر ماهیان دیگر دارای یک اگزون اضافی (6 اگزون و 5 اینترون) می‌باشد (آگلون و همکاران، 1988 و بر و دانیال، 1993) اندازه اگزون‌ها در همه ماهیان تقریبا برابر است به جزء اگزون 5 که در طول تکامل به دو قسمت تبدیل شده است (آلمولی و همکاران،2000). فرض بر این است که اضافه شدن اینترون 5 به اگزون 5 و تبدیل اگزون 5 به دو قسمت منجر به واگرایی بین کپور ماهی شکلان و دیگر ماهیان استخوانی شده باشد.
با بررسی تکامل اینترون 5، ماهیان را به سه گروه متفاوت تقسیم بندی کرده‌اند. گروه اول ماهیانی که فاقد اینترون 5 می‌باشند و ساختار این ژن مانند پستانداران و پرندگان می‌باشد مانند کپورماهیان و گربه ماهیان. گروه دوم ماهیانی که اینترون 5 آن‌ها به طول 100-70 جفت باز است مانند تیلاپیا، کفشک ماهی و جراح ماهی دم زرد و گروه سوم که طول اینترون 5 در ژن هورمون رشد 200 تا 600 جفت باز می‌باشد که در برگیرنده خانواده آزادماهیان می‌باشد (یانگ و همکاران، 1997). محققین بر این باورند که دو نسخه‌ای شدن کل ژنوم ماهیان در طول دوره تکامل ماهیان استخوانی اتفاق افتاده است (کریستوفل و همکاران، 2004). اما فقط در آزاد ماهیان و کپور معمولی و تیلاپیا ژن هورمون رشد به صورت دو نسخه‌ای تا به حال گزارش شده است (آگلون و همکاران، 1988). که ماهی سفید و کپور معمولی دارای دو ژن هورمون رشد GH-1 و GH-2 می‌باشد.
2-7 نشانگرهای ژنتیکیهر آنچه که در میان افراد، لاین‌ها، جمعیت‌ها، گونه‌ها، نژادها و یا سویه‌های مختلف به لحاظ ژنتیکی تفاوت داشته و سبب تمایز آن‌ها از یکدیگر گردد به عنوان نشانگر ژنتیکی شناخته می‌شود (بنابازی، 1381). چند شکلی بودن و توارث پذیری از جمله شرایط لازم برای یک نشانگر ژنتیکی می‌باشند.
از مهم‌ترین ویژگی‌های یک نشانگر برتر می‌توان به این موارد اشاره نمود (نقوی، 1388) :
تشخیص آسان همه فنوتیپ‌های ممکن (افراد هتروزیگوت و افراد هموزیگوت).
نداشتن تاثیر روی آلل های موجود در سایر جایگاه‌های ژنی نشانگر (نداشتن اپیستازی).
تظاهر در مراحل اولیه نمو.
حداقل بودن یا عدم اثر متقابل با نشانگرهای دیگری که می‌توانند به طور هم زمان در یک جمعیت در حال تفرق مورد استفاده قرار گیرند.
پیوستگی بسیار نزدیک با ژن‌های مورد نظر.
توارث پذیری کامل.
آسان بودن اندازه گیری.
2-7-1 نشانگرهای ریخت شناسیبه علائمی گفته می‌شوند که به طور مستقیم در فنوتیپ فرد قابل تشخیص بوده و توارث پذیرند، مانند تعداد فلس‌ها روی خط جانبی، اتولیت ها و شکل زوائد پیلوریک و از این دست پارامترها که به راحتی قابل ردیابی هستند. این نشانگرها غالبا تحت تاثیر محیط قرار داشته و متاثر از سن هستند. اگرچه نشانگرهای ریخت شناسی در علوم زیستی مورد استفاده قرار گرفته‌اند، ولی دارای محدودیت‌های اساسی هستند و به همین دلیل توجه محققین به انواع دیگری از نشانگرها جلب شده است (مردانی، 1372).
2-7-2 نشانگرهای فیزیولوژیکیمطالعات مربوط به تولید شیر نشان می‌دهند که افزایش تولید شیر با افزایش سطح برخی از هورمون‌ها در پلاسما همراه است. پس میزان این هورمون‌ها می‌تواند به عنوان یک نشانگر فیزیولوژیک محسوب شود. اشکال نشانگرهای فیزیولوژیک این است که این نشانگرها (از جمله سطح هورمون‌ها در پلاسمای خون) علاوه بر ژن‌ها به شدت تحت تاثیر محیط داخلی، سن و جنس حیوان هستند (مردانی، 1372).
2-7-3 نشانگرهای سیتوژنتیکیدر بسیاری از موجودات زنده تفاوت‌های گسترده کروموزمی مشاهده می‌شوند که می‌توانند به عنوان نشانگر به کار روند. تلوسنتریک ها، ایزوکروموزوم ها، جابجائی ها و الگوهای نواربندی از جمله این نشانگرها می‌باشند (مردانی، 1372).
2-7-4 نشانگرهای پروتئینی برآورد شده است که 20 تا 50 درصد ژن‌های یک موجود حاوی اطلاعات کدکننده پروتئین‌ها می‌باشند. تنوع و گوناگونی یک پروتئین معین حاصل جابجایی و یا جایگزینی اسیدهای آمینه زنجیره پلی پپتیدی است. این تفاوت‌ها بار الکتریکی و در نتیجه حرکت پروتئین بر حسب نوع و تعداد اسیدهای آمینه جابه جا شده را تغییر می‌دهند. وجود پروتئین‌های چند شکل یا تغییر در اسید آمینه یک پروتئین نشان دهنده جابجایی و یا جایگزینی نوکلئوتیدها در زنجیره DNA بر اثر جهش می‌باشد. این تغییر در اسیدهای آمینه پروتئین و نوکلئوتیدهای یک ژن، نقش اساسی فرآورده ژن را تغییر نمی‌دهد بلکه محصولی را به وجود می‌آورد که با محصول ژن جهش نیافته متفاوت نبوده و این تغییر نشان دهنده جهش در زنجیره DNA است. از معایب نشانگرهای پروتئینی این است که تعداد نشانگرهای پروتئینی محدود است. چند شکلی در این نشانگرها چندان زیاد نیست. فنوتیپ‌های الکتروفورزی در آن‌ها پیچیده است (بنابازی، 1381). تحت تاثیر تغییرات پس از ترجمه هستند و تظاهر کمی، برخی از آنزیم‌ها و پروتئین‌ها تحت تاثیر مرحله رشد قرار می‌گیرد (نقوی، 1388).
2-7-5 نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولیبا مقایسه ردیف بازهای مولکول DNA در کروموزوم‌های دو فرد هم گونه در می‌یابیم که اکثر جفت بازها یکسان می‌باشند. مناطق معینی که تفاوت‌های ردیفی در آنها به وقوع می‌پیوندند را تحت عنوان نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولی می‌شناسیم. به عبارت دیگر این نوع تغییرات انعکاس دهنده مستقیم تنوع در ساختار ژنتیکی (ساختمان DNA) هستند. وقتی تغییرات DNA در درون ژن‌ها رخ می‌دهند، توانایی تاثیر روی عمل ژن‌ها و در نتیجه فنوتیپ فرد را دارا می‌باشند ولی اکثر نشانگرهای مولکولی با یک فنوتیپ قابل مشاهده همراه نیستند و بایستی این تغییرات را از طریق آنالیز مستقیم DNA مطالعه نمود (امتیازی و کریمی، 1384).
نشانگرهای مولکولی به دو دسته تقسیم می‌شوند:نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR.نشانگرهای مولکولی غیرمبتنی بر PCR.
2-8 نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمرازواکنش زنجیره‌ای پلیمراز که معمولا به طور اختصار PCR خوانده می‌شود روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در کمتر از نیم روز امکان پذیر می‌کند. اما این فرایند هنگامی امکان پذیر است که دست کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه دی. ان. ای مورد نظر معلوم باشد (نقوی، 1388). در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانند سازی دی. ان. ای در طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه مورد نظر DNA هستند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‌گیرند تا واکنش آنزیمی همانند سازی دی. ان. ای در درون لوله آزمایش امکان پذیر شود. این همانندسازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‌های پلیمراز صورت می‌گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‌ها به صورت تجاری در دسترساند (نقوی، 1388).
این واکنش از آن روی ارزشمند است که عمل آن بسیار اختصاصی است و به سادگی ماشینی شده و قادر است عمل تکثیر را از مقادیر فوق العاده کم DNA الگو آغاز کند. به کمک این روش می‌توان نزدیک به 5 کیلو باز از ژنوم را بدون هیچ مشکلی تکثیر نمود. از روش PCR بیشتر در نقشه یابی DNA، انتخاب به کمک شناساگرها و همچنین در فیلوژنیک مولکولی استفاده می‌شود. همچنین از PCR می‌توان برای تکثیر DNA‌های به وجود آمده از RNA ها نیز استفاده نمود. نشانگرهای DNA تفاوت قابل ملاحظه‌ای با نشانگرهای پروتئینی و مورفولوژیک داشته و دارای مزایای به شرح زیر می‌باشد:
دقت و سهولت تعقیب آن‌ها.
امکان به کارگیری آن‌ها در مراحل اولیه زندگی.
فراوانی فوق العاده این نشانگرها.
امکان استفاده برنامه‌های کامپیوتری برای تجزیه و تحلیل نتایج.
عدم تاثیرپذیری از شرایط داخلی و خارجی موجود (نقوی، 1388).
2-9 واکنش رنجیره ای پلیمراز (PCR)بی تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. این تکنیک در سال 1985 به وسیله کری مولیس و همکارانش ابداع شد و اکنون کاربردهای نامحدودی در تمامی حوزه‌ها یافته است (امتیازی و کریمی، 1384). این تکنیک ساده امکان ایجاد رونوشت‌هایی نامحدود از قطعات خاصی از DNA را فراهم می‌نماید. DNA ی الگو که PCR روی آن انجام می‌گیرد، می‌تواند DNA ی ژنومی (که از گلبول‌های سفید خون یا نمونه‌ای از طحال یا هر بافت دیگری استخراج گردیده است) و یا قطعه‌ای از DNA (از هر منبعی) باشد. PCR تقریبا یک میلیون رونوشت از قطعه‌ای کوچک از DNA ی الگو ایجاد می‌نماید که این مقدار برای استفاده در هر نوع مطالعه ژنتیکی (ردیف یابی، انتقال ژن، هضم آنزیمی و غیره) کافی است. قبل از انجام PCR لازم است ردیف قطعه‌ای که باید تکثیر شود و یا حداقل ردیف هر دو انتهای آن شناسایی گردد. با استفاده از این ردیف‌ها دو قطعه چند نوکلئوتیدی که هر یک حدود 20 باز طول دارند، طراحی و ساخته می‌شود که یکی از آن‌ها مکمل پایانه '3 یکی از رشته‌های قطعه‌ای است که تکثیر خواهد شد و دیگری نیز مکمل پایانه '3 رشته دیگر می‌باشد. وجود این دو قطعه چند نوکلئوتیدی برای شروع سنتز رشته‌های جدید DNA لازم است و آن‌ها را آغازگر می‌نامند. DNA الگو، آغازگرها، مقداری دئوکسی نوکلئوتیدها شامل گوانین (G)، سیتوزین (C)، تیمین (T) و آدنین (A) در داخل تیوپ کوچکی ریخته می‌شود برای اینکه DNA الگو واسرشته شود، مخلوط واکنش را در دمای 95  درجه سانتی گراد قرار می‌دهند. آنزیم DNA پلیمراز می‌تواند دمای بالا را تحمل کند. شکل رایج این آنزیم، Taq پلیمراز است که از باکتری گرمادوست به دست می‌آید. پس از مرحله واسرشته سازی، دما به حدود 60-50 درجه سانتی گراد کاهش پیدا می‌کند تا آغازگرها به ردیف‌های مکمل مربوطه متصل شوند. این مرحله را جفت شدن می‌گویند. به محض اتصال آغازگرها، دما به حدود 70 درجه سانتی گراد افزایش می‌یابد. این دما برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز مناسب است. این مرحله بسط نامیده می‌شود. آنزیم از انتهای '3 هر آغازگر ساخت و بسط رشته جدید را آغاز می‌نماید. پس از طی زمان کافی برای ساخت رشته‌های جدید، مجددا دما به 95 درجه سانتی گراد افزایش می‌یابد و به‌این‌ترتیب چرخه‌ای جدید از واکنش آغاز می‌گردد و سه مرحله قبلی این بار روی DNA دو رشته‌ای جدید صورت می‌گیرد و این رشته‌ها خود به عنوان الگو برای چرخه‌های بعدی عمل خواهند کرد (امتیازی و کریمی، 1384). طول هر چرخه تکثیر حدود 5 دقیقه است (15 ثانیه برای واسرشته سازی، 30 ثانیه برای جفت شدن و 90 ثانیه برای بسط به علاوه حداقل زمان مورد نیاز برای تغییر دماها در بین مراحل که حدود 30 تا 60 ثانیه برای هر تغییر لازم است) (امتیازی و کریمی، 1384).
چرخه‌های تکثیر معمولا در ماشین‌های PCR که از نظر طول و دمای هر مرحله در هر چرخه دقیقا قابل برنامه ریزی و کنترل هستند، انجام می‌گردد. تعداد چرخه‌ها 30 تا 35 بار می‌باشد. نتیجه این تعداد چرخه بین 230 تا 235 رونوشت از قطعه مورد نظر است که معادل حدود یک میلیون قطعه مشابه می‌باشد (این مقدار فراورده PCR نامیده می‌شود). در عمل، این تکثیر نمایی کامل نیست ولی احتمال رسیدن به حداقل یک میلیون بار تکثیر و در نتیجه به دست آوردن یک میکروگرم فراورده PCR بسیار زیاد است (امتیازی و کریمی، 1384).
2-9-1 بافر RCRاین بافر معمولا شامل Tris با 8/8-3/8 pH = و یک نمک مثل کلرید پتاسیم (KCl) یا سولفات آمونیوم می‌باشد. این بافر می‌تواند حاوی افزودنی‌هایی مانند Tween 20، Triton X-100، DMSO (دی متیل سولفوکساید) و ژلاتین باشد که کارایی RCP را افزایش می‌دهند (فرسون و همکاران، 2000 ). این بافر معمولا به صورت 10x تهیه و همراه با آنزیم نک پلیمراز ارائه می‌گردد. غلظت مناسب آن در واکنش معمولا 1X می‌باشد. KCl به اتصال آغازگر به DNA الگو کمک می‌کند اگرچه در غلظت‌های بالا این عمل ممکن است بیش از حد مطلوب گردد و باعث پایداری اتصال غیر اختصاصی آغازگر به DNA الگو و ایجاد محصولات ناخواسته شود (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-2 کلرید منیزیم (Mgcl2)از اجزا به سیر مهم PCR است و غلظت بهینه آن در کارایی واکنش نقش مهمی دارد. با افزایش غلظت یون منیزیم (Mg+2) قدرت اتصال آغازگرها افزایش می‌یابد و به دمای اتصال بالاتری نیاز است و احتمال تشکیل پرایمر-دایمر اقزایش می‌یابد و این امر موجب اتصال آغازگرها به صورت دوتایی با یکدیگر یا به صورت حلقوی با خودشان شده و در اثر تکثیر غیر اختصاصی آن‌ها، تجمعی از قطعات کوچک به وجود می‌آید. مقداری از آغازگرها نیز بدین ترتیب از واکنش خارج می‌شوند. افزایش غلظت یون منیزیم موجب افزایش دمای مرحله واسرشته سازی و افزایش فعالیت پلیمرازی آنزیم تک پلیمراز (این آنزیم برای فعالیت پلیمرازی خود به یون آزاد Mg+ نیاز دارد) می‌شود. همچنین یون منیزیم با نوکلئوتیدها ترکیب می‌شود و کمپلکس محلولی را به وجود می‌آورد که برای ورود و جایگزین شدن آن‌ها در زنجیره DNA بسیار لازم است. در صورتی که در غلظت‌های بسیار پایین بازده واکنش کم خواهد شد. غلظت منیزیوم آزاد تحت تاثیر غلظت dNTP ها، پیروفسفات آزاد (PPi) و EDTA می‌باشد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-3 دی اکسی نوکلئوتیدها (dNTPs)نوکلئوتیدها واحدهای سازنده DNA هستند و از مواد مهم مورد نیاز واکنش PCR می‌باشند. آنزیم‌های DNA پلیمراز ساخت زنجیره پلی نوکلئوتیدی را از این مونومرها یا واحدها کاتالیز می‌کنند. در واکنش PCR نیز همانند سنتز طبیعی DNA از چهار نوع نوکلئوتید به فرم دی اکسی (dTTP، dGTP، dCTP، dATP) استفاده می‌شود. این نوکلئوتیدها معمولا به طور جداگانه یا مخلوط به صورت تجاری در دسترس هستند. باید از غلظت برابر نوکلئوتیدها استفاده شود در غیر این صورت اشتباه جایگزینی رخ می‌دهد و ممکن است باعث تفاوت توالی فرآورده PCR با توالی الگو شود. کیفیت و مقدار dNTP مورد استفاده در کارایی و اختصاصی بودن PCR موثر است. چنانچه مقدار dNTP بیشتر از نیاز واکنش باشد امکان تشکیل نقاط آغازین اشتباه و تشکیل قطعات غیر اختصاصی وجود دارد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-4 آنزیم تک پلیمرازاین آنزیم به شکل طبیعی یا نوترکیب تولید می‌شود و از سایر انواع DNA پلیمرازها معروف‌تر است و بیشتر از آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آنزیم با شناسایی انتهای آزاد هیدروکسیل '3 آغازگر، نوکلئوتیدها را به ترتیب ارائه شده از روی زنجیره مکمل به آن متصل می‌کنند و یک رشته DNA مکمل رشته الگو می‌سازد. سرعت اتصال نوکلئوتیدها و حرکت آنزیم پلیمراز در انواع مختلف این آنزیم متفاوت بوده و بین 5 الی 80 نوکلئوتید در ثانیه می‌باشد. اگر غلظت آنزیم زیاد باشد قطعات غیراختصاصی در فراورده PCR دیده خواهد شد که گاهی به صورت کشیدگی مشاهده می‌شود و در صورتی که مقدار آنزیم کمتر از حد مورد نیاز واکنش باشد، فرآورده مورد نظر به اندازه کافی تولید نمی‌شود و به ویژه در موارد تشخیصی نتایج منفی کاذب را به وجود می‌آورد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-5 آغازگرهادر طی واکنش PCR، آغازگرها به دو طرف توالی هدف اتصال یافته و امکان آغاز فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می‌آورند. مهم‌ترین ویژگی آغازگر، توالی صحیح آن برای مکان مورد تکثیر می‌باشد. با در اختیار داشتن توالی هدف امکان تعیین توالی آغازگرها به وجود می‌آید. طول آغازگر نیز مهم است و طول مناسب از اتصال آغازگر به مناطق غیر هدف می‌کاهد. طویل بودن پرایمر (پرایمرهای با بیش از 30 جفت باز) امکان اتصال آن‌ها به خود و به یکدیگر را تشدید می‌کند و زمان اتصال را نیز افزایش می‌دهد. در طراحی آغازگرها نکات متعددی مانند طول آغازگر، ترکیب نوکلئوتیدی (محتوای GC)، دمای ذوب (Tm) و غیره را باید در نظر داشت (فرسون و همکاران، 2000 ). برای طراحی آغازگرها نرم افزارهای متعددی وجود دارد که می‌توان به DNA MAN، DNASIS و Oligo tech اشاره نمود.
2-10 چند شکلی فضایی رشته‌های منفردSSCP) )این روش در سال 1989 ابداع شد. در الکتروفورز SSCP، ابتدا از یک ماده واسرشته ساز مانند اوره استفاده می‌شود تا DNA ی دو رشته به DNA ی تک رشته‌ای تبدیل شود. به هنگام راندن DNA ی تک رشته‌ای روی ژل اثرات متقابل درون مولکولی روی می‌دهد. به عبارت دیگر بین بخش‌هایی از این DNA پیوند ایجاد می‌شود و ساختمان ثانویه‌ای تشکیل می‌دهد. بنابراین حرکت مولکول‌های DNA در این حالت به جای اینکه تابع اندازه مولکول باشد به ساختمان ثانویه DNA ی تک رشته‌ای بستگی دارد. در طی الکتروفورز، این ساختمان‌ها که به توالی رشته مورد نظر بستگی دارد به وسیله برودت حفظ می‌شود. اگر در این توالی جهشی رخ داده باشد، نوع پیوندهایی که تشکیل می‌شوند متفاوت بوده و باند مربوطه روی ژل نیز متفاوت خواهد بود. در صورتی که چند شکلی در قسمت ابتدائی محصول PCR باشد، تشخیص آن از طریق SSCP آسان‌تر است. عواملی مثل دمای ژل (نباید بالا باشد)، درصد ژل اکریل آمید (5 تا 6 درصد مناسب است) و اندازه قطعه DNA مورد بررسی (معمولا بین 100 تا 250 جفت باز و ایده آل 155 جفت باز) در موفقیت SSCP نقش دارد (رضوانی، 1997).
2-11 مروری بر برخی پژوهش‌های انجام شده:طبق مطالعات انجام شده مشخص شد که ساختار ژن هورمون رشد در بین ماهیان استخوانی یکسان نیست. به طور مثال، در کپور ماهیان همانند پستانداران، این ژن دارای پنج اگزون و چهار اینترون است اما در دیگر ماهیان متفاوت بوده و دارای یک اگزون اضافی است (اهکوبو و همکاران، 1996). جهش‌های موجود در نواحی مختلف ژن‌ها همواره مورد توجه بسیاری از متخصصان علم اصلاح نژاد بوده است. ارتباط چند شکلی این ژن‌ها با خصوصات فنوتیپی برای مثال رشد به طور وسیعی در دیگر حیوانات مورد بررسی قرار گرفته و مطالعاتی محدود نیز در مورد ماهی انجام شده است (گروس و نیلسون، 1999).
طبق پژوهش‌های گروس و نیلسون (1999) تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان مورد بررسی قرار گرفت. تعداد نمونه‌های مورد بررسی در این پژوهش 579 ماهی از 22 جمعیت مختلف بود که از شمال اروپا تهیه و به روش PCR-RFLP و با استفاده از 10 نوع آنزیم تنوع این ژن مورد مطالعه قرار گرفت که سه نوع هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد.
اندازه‌های چهار اگزون در طول دوره تکامل بدون تغییر باقی مانده‌اند به جز اگزون 5 که به دو قسمت تبدیل شده است به طوری که دو نوع ساختار ژن هورمون رشد را در ماهیان استخوانی به وجود آورده است. برای مثال، خانواده کپور ماهیان دارای پنج اگزون و گونه‌های دیگر همانند آزاد ماهیان و سوف ماهیان دارای شش اگزون می‌باشند (آلمولی و همکاران، 2000). در ضمن، در ماهیان دو نوع متفاوت از ژن هورمون رشد شامل GH-1 و GH-2 برای مثال در ماهیانی نظیر آزاد اطلس نیز گزارش شده است (تائو و بولدینگ، 2003).
این ژن به صورت موفقیت آمیزی در گونه سیم دریایی (کالدوچ گینر و همکاران، 2003) و ماهی تیلاپیا (کاجیمورا و همکاران، 2004) و چندین گونه دیگر کلون شده است. ولی در خصوص چندشکلی این ژن و ارتباط آن با میزان رشد در ماهیان گزارشی مشاهده نشده است. در حیوانات دیگر پژوهش‌های زیادی به عمل آمده است که ارتباط بسیار زیاد این ژن با میزان رشد فنوتیپی را نشان می‌دهد.
پریمر و رینانن (2004) در پژوهشی تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان را به روش PCR-RFLP بررسی و SNP را شناسایی کردند. از تعداد 9 جمعیت مختلف شامل 2 جمعیت از شمال آمریکا و 7 جمعیت در اروپا نمونه برداری شده بود. چند شکلی مشاهده شده در مناطق بالا دست و پایین دست ژن هورمون رشد، اینترون 3 و اینترون 4 نشان دهنده اختلاف بین جمعیت‌های آمریکای شمالی و اروپا بود.
مو و همکاران (2004) در هفت جمعیت کپور وحشی، هفت نوع الگو (A، B، C، D، E، F و G) در ناحیه اینترون 2 ژن GH-1 به روش PCR-SSCP شناسایی کردند که طول آن‌ها به ترتیب 189، 196، 204، 205، 206، 207 و bp 209 بود.
کوخر و کهلمن (2011) چندشکلی‌های ژن هورمون رشد در لای ماهی از خانواده کپور ماهیان را بررسی کردند. پژوهش‌های آن‌ها نشان داد این ماهی مانند همه کپور ماهیان دارای چهار اینترون و پنج اگزون می‌باشد و با دو روش PCR-RFLP و تعیین توالی، اختلاف موجود در ساختار ژنتیکی ژن هورمون رشد در تعداد 17 نمونه از دو جمعیت مختلف مورد بررسی قرار دادند. از 14 چندشکلی مشاهده شده از 12 جایگاه در منطقه اینترون و 2 جایگاه در منطقه اگزون، در مجموع 13 هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد که کل جمعیت را به دو کلاس اروپای شرقی و اروپای غربی تقسیم نمود.
نی و همکاران (2012) در یک جمعیت از ماهی کراکر زرد، نتایج PCR-SSCP دو هاپلوتیپ از اینترون 1 را به نام ژنوتیپ های AA و AB نشان دادند. در AB، یک چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) در موقعیت 196 (G→A) مشاهده شد که با وزن بدن همبستگی منفی و با طول/ ارتفاع استاندارد بدن همبستگی مثبت داشت. در جمعیت دیگر، دو ژنوتیپ مختلف CC و CD در اینترون 2 شناسایی شدند که در CD یک SNP در موقعیت 692 (T→C) مشخص شد. ژنوتیپ CD همبستگی مثبت قابل توجهی با وزن کل و طول بدن داشت.
تیان و همکاران (2014) چندشکلی ژن GH و ارتباط آن با صفات رشد را در 282 نمونه ماهی سوف چینی مورد بررسی قرار دادند. با استفاده از توالی‌یابی، چهار SNP در ژن GH شناسایی شد که دو جهش در اینترون 4، یک جهش در اگزون 5 و یک جهش در اینترون 5 رخ داده بود که سه جهش از آن‌ها ارتباط مثبت معنی داری را با رشد نشان دادند.

فصل سوممواد و روش‌ها3-1 نمونه بردارینمونه برداری از 150 قطعه ماهی سفید از کارگاه شهید رجایی و 150 قطعه ماهی کپور معمولی از کارگاه پرورش ماهی نصر ساری انجام شد. ماهی سفید از دوره هچری به سالن تکثیر منتقل و تا 3 ماهگی نگهداری شدند. سپس از آن‌ها نمونه گیری شد و تمامی آن‌ها در سن 3 ماهگی بودند ولی در ماهی کپور 84 قطعه از آن‌ها در سن 4 ماهگی، 54 قطعه در سن 12 ماهگی، 5 قطعه ماهی در سن 24 ماهگی و 7 قطعه ماهی در سن 6 ماهگی بودند. نمونه گیری به میزان 3-2 گرم از بافت باله دمی ماهی سفید و کپور معمولی انجام شد. نمونه‌های باله دمی در الکل 96 درصد فیکس شده و سپس تا زمان استخراج DNA در دمای 20- درجه سانتیگراد قرار داده شدند. نمونه‌های جمع آوری شده به آزمایشگاه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی دام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل شده و DNA ژنومی استخراج گردید.
3-2 بررسی فاکتور وضعیتیکی از شاخص‌های رشد فاکتور وضعیت است که ضریب چاقی نیز نامیده می‌شود. برای به دست آوردن آن طول کل که فاصله پوزه تا انتهای باله دمی است؛ بر حسب سانتی متر اندازه گیری شد. وزن ماهی نیز به وسیله ترازو دیجیتالی بر حسب گرم اندازه گیری شد. فاکتور وضعیت یا ضریب چاقی برابر است با:
CF= W/L3 *100
W: وزن و L: طول بدن می‌باشد.
3-3 استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافتهاستخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته (میلر و همکاران، 1988) انجام شد. قبل از شروع استخراج تمام بافرها تهیه و مواد و وسایل مورد نیاز برای استخراج آماده و جهت ضدعفونی اتوکلاو شد.
3-3-1 طرز تهیه بافرهای استخراج DNA برای تهیه بافر STE 7/0 گرم تریس، 2/0 گرم نمک 07/0 مولار را با cc50 آب مقطر حل کرده، سپس 100 میکرولیتر محلول EDTA 5/0 مولار به آن اضافه می‌شود. برای تهیه EDTA 5/0 مولار، 3/9 گرم پودر EDTA را با cc50 آب مقطر حل کرده و pH آن به 8 می‌رسد، برای تنظیم pH از دستگاه pH متر، برای کاهش pH از HCl و برای افزایش pH از NaoH استفاده می‌شود. برای تهیه SDS و استات آمونیوم 10% بایستی به نسبت 1 به 10 پودر آن با آب مقطر حل شود. برای تهیه استات سدیم 3 مولار، بایستی 3/12 گرم پودر آن با cc 50 آب حل شود.
سی میلی گرم از باله را جدا کرده و در محیط بیرون قرار داده تا الکل آن تبخیر شود، سپس آن را خرد نموده و در تیوپ‌های 5/1 میلی لیتری ریخته و به آن 500 میکرولیتر بافر STE برای انفجار سلولی، 50 میکرولیتر بافر SDS 10% برای هضم چربی‌های موجود در بافت و 6-5 میکرولیتر پروتئیناز K برای هضم پروتئین‌ها اضافه شد. سپس نمونه‌ها را به خوبی ورتکس کرده و به مدت یک ساعت روی دستگاه شیکر با سرعت 90 قرار داده تا این مواد به طور کامل با هم مخلوط گردد و در نهایت به مدت 16 ساعت در بن ماری با دمای 58 درجه سانتی گراد گذاشته تا بافرها بهتر عمل کرده و عمل لیز شدن و هضم آنزیمی به خوبی انجام شود. پس از بیرون آوردن آن‌ها از بن ماری 160 میکرولیتر استات آمونیوم 10% به نمونه‌ها اضافه نموده و به مدت یک ساعت روی شیکر با سرعت 90 قرار داده شد تا خوب مخلوط شود و بعد به مدت 10 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. پس از پایان سانتریفیوژ دو فاز درون تیوپ تشکیل می‌شود، فاز زیرین حاوی بافت خرد شده باله و چربی و پروتئین بافت است و فاز بالایی حاوی DNA می‌باشد. به آرامی فاز بالایی را جدا کرده و درون تیوپ‌های جدید ریخته شد. به مایع درون تیوپ‌های جدید 600 میکرولیتر الکل ایزوپروپانول یا الکل مطلق سرد و 30 میکرولیتر استات سدیم اضافه شده (در این حالت کلاف شفافی در تیوپ قابل مشاهده است که همان DNA می‌باشد). سپس نمونه‌ها به مدت 40-30 دقیقه در یخچال C°20- نگهداری شده، بعد به مدت چند دقیقه از یخچال بیرون آورده تا یخ آن آب شود. نمونه‌ها را به مدت 15 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ کرده، سپس محلول را دور ریخته و تیوپ حاوی DNA را با 100 میکرولیتر الکل 70% شستشو داده و به مدت 2 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. مجددا محلول رویی را دور ریخته و تیوپ‌ها در دمای آزمایشگاه کاملا خشک شده و سپس 50 میکرولیتر آب مقطر یا بافر TE به تیوپ حاوی DNA اضافه نموده و در یخچال C°20- تا زمان ازمایش نگهداری شدند.
3-4 تعیین ویژگی‌های کمی و کیفی DNA استخراج شده:به منظور تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده دو روش استفاده می‌شود:
الف) ژل آگارز.
ب) دستگاه اسپکتروفتومتر.
در این پژوهش به منظور بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از ژل آگارز استفاده شد.
3-4-1 ژل آگارز آگارز یک پلیمر خطی است و از زیر واحدهای L ,D گالاکتوز که با پیوندهای گلیکوزیدی 3→1α و 4→1β به یکدیگر پیوسته‌اند، درست شده است. برخی از آگارزها دارای اندکی ناخالصی آنیونی همچون سولفات و پیروات هستند. هر چه ناخالصی ژل کمتر باشد توان آن برای جداسازی DNA بیشتر می‌شود. اندازه روزنه‌ها در زمینه ژل به غلظت آگارز وابسته است. به گونه‌ای که در غلظت زیاد آگارز، روزنه‌ها کوچک می‌شوند. با توجه به غلظت‌های آگارز می‌توان تکه‌هایی از 5/0 تا 50 کیلو باز جدا سازی کرد. اندازه مولکول‌های DNA، غلظت آگارز، ساختار فضایی DNA، ولتاژ بکار رفته شده، نوع آگارز و توان یونی بافر الکتروفورزی که به کار گرفته می‌شود، از سازه‌های کارآمد برای جدا سازی DNA در ژل آگارز هستند (لی و همکاران، 2012).
شکل 3-1 دستگاه الکتروفورز افقی3-4-2 رنگ آمیزی ژل آگارز در این پژوهش رنگ آمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید انجام پذیرفت. اتیدیوم بروماید یک رنگ فلورسانت است که دارای یک گروه سه حلقه‌ای بوده که می‌تواند در بین بازهای DNA جای گیرد. روش کار به‌این گونه است که پرتو فرابنفش به وسیله اسید نوکلئیک گرفته شده و به اتیدیوم بروماید می‌رسد. این پرتو در طول موج 302 تا 366 نانومتر به وسیله اتیدیوم بروماید پیوسته به اسیدنوکلئیک دریافت شده و دوباره به وسیله اتیدیوم بروماید در طول موج 590 نانومتر بازتاب می‌یابد. این طول موج در گستره روشنایی سرخ نارنجی پرتویی آشکار می‌باشد که می‌توان آن را دید. برای انجام این کار مقدار 3 میکرو لیتر دیانای و 2 میکرولیتر بافر بارگذاری را روی کاغذ پارافیلم با هم مخلوط کرده و داخل چاهک ژل آگارز قرار داده شد. بعد از بار گذاری تانک الکتروفورز را به یک منبع الکتریکی وصل کرده و ولتاژ دستگاه را روی 85 ولت تنظیم شد. نمونه‌ها به مدت 60 تا 90 دقیقه درون ژل آگارز موجود در تانک در حرکت بودند. سپس ژل را از داخل تانک الکتروفورز برداشته و به مدت 5 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و جهت مشاهده باندها و تعیین کیفیت دیانای، از دستگاه ژل داک استفاده شد. اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری در جدول 3-1 نشان داده شد (لی و همکاران، 2012).
جدول 3-1 اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاریمواد استفاده شده مقدار مواد (میکرولیتر)
گلیسرول
برموفنول آبی (10 درصد)
فرمامید
EDTA(5/0 مولار) 190
10
800
2
3-5 تعیین غلظت DNA استخراج شده با استفاده از اسپکتوفتومتربرای بررسی غلظت DNA استخراج شده از دستگاه اسپکتوفتومتر استفاده شد. برای این منظور ابتدا میزان رقت DNA مشخص شد (مثلاً 100 برابر یا بیشتر). دستگاه برای دو طول موج 260 و 280 نانومتر تنظیم و به تعداد نمونه لوله استریل در آماده شد. با توجه به حجم کووت دستگاه و میزان رقت در لوله‌ها از بافر TE یا آب مقطر استفاده و DNA مورد نیاز به لوله‌ها اضافه شد (با توجه به ضریب رقت). ابتدا دستگاه با بافر TE یا آب مقطر کالیبره شد. لوله حاوی DNA رقیق شده چند بار وارونه شد. کووت دستگاه که برای بررسی غلظت DNA از آن استفاده می‌شود با بافر TE یا آب مقطر شسته می‌شود. DNA رقیق شده موجود در لوله را در کووت دستگاه قرار داده و OD های 260 و 280 نانومتر به اضافه نسبت دو طول موج یاداشت شد (OD260 مربوط به جذب DNA و OD280 مربوط به جذب پروتئین می‌باشد). اگر این نسبت کمتر از 8/1 باشد نشان دهنده آلودگی با پروتئین و یا دیگر ناخالصی‌ها می‌باشد و اگر این نسبت بیشتر از 2 باشد نشان دهنده آلودگی DNA با RNA است. برای به‌دست آوردن غلظت DNA مورد نظر از فرمول زیر استفاده شد.
ضریب رقت
*عدد بدست آمده غلظت DNA استخراج شده بر حسب نانو گرم بر میکرو لیتر می‌باشد که بسته به مقدار نیاز در واکنش PCR از آن استفاده می‌شود.
3-6 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)3-6-1 پروتکل و مواد استفاده شده در PCR
مواد مورد نیاز برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلی مراز برای نشانگر استفاده شده در این تحقیق در جدول 3-2 نشان داده شد:
جدول 3-2 مواد استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمرازمواد غلظت مواد مقدار در حجم 20 میکرولیتر
دیانای الگو
آغازگر (*F)
آغازگر (**R)
مستر میکس***
آب مقطر 120 نانوگرم
20 پیکومول

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

20 پیکومول
-
- 5/1
1
1
10
5/6
*Forward **Backward ***Master Mix
3-6-2 مراحل PCRقبل از انجام پی سی آر، آغازگرها با توجه به دستور العمل شرکت سازنده آن‌ها با میزان آب مقطر مشخص شده بر حسب میکرولیتر رقیق شدند تا غلظت آن‌ها به 100 پیکومول برسد. سپس به مدت 24 ساعت در شرایط یخچال نگهداری شدند تا کاملا حل شوند. سپس تیوب‌های مورد استفاده بعد از استریل کردن، شماره خورده و به منظور جلوگیری از پاک شدن شماره‌ها برچسب نصب شدند. تمام اجزای واکنش (به غیر از DNA که در تیوپ‌های جداگانه ریخته شدند) با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده برای پی سی آر به صورت مخلوط در تیوب جدا گانه ریخته شدند. لازم به ذکر است که در تهیه مخلوط اصلی واکنش، با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده در پی سی آر یک ضریب خطا در نظر گرفته شد. بعد از تهیه مخلوط اصلی، مقدار 5/18 میکرولیتر از آن، به هر یک از تیوپ‌های حاوی 5/1 میکرو لیتر DNA افزوده شده تا حجم کل مخلوط واکنش در هر تیوب به 20 میکرو لیتر برسد. به منظور مخلوط شدن اجزای تشکیل دهنده واکنش، تیوب‌ها به مدت 15 ثانیه و با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. بعد از سانتریفوژ تیوپ‌ها برای انجام پی سی آر در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شدند.

شکل 3-2 دستگاه ترموسایکلر3-6-3 تنظیم سیکل‌های حرارتی PCR
همانند سازی و تکثیر توالی مورد نظر در پی سی آر در طی سه مرحله انجام می‌پذیرد:3-6-3-1 واسرشته سازی قطعه الگو
پیوندهای هیدروژنی که در واقع اتصال دهنده دو رشته DNA هستند در دمای 95-93 درجه سانتی‌گراد تخریب می‌شوند بنابراین در این حرارت دو رشته DNA الگو از هم جدا می‌شوند. پس از تک رشته‌ای شدن DNA الگو، آغازگر و سایر مواد شرکت کننده در واکنش، فعالیت خود را آغاز می‌کنند.
3-6-3-2 اتصال آغازگرها: در این مرحله آغازگرها به رشته DNA الگو می‌چسبند. دمای اتصال با توجه به دمای ذوب آغازگرها تنظیم می‌شود که معمولا بین 50 تا 65 درجه سانتی گراد می‌باشد. آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش برای ژن هورمون رشد در بر گیرنده قسمتی از اگزون 4 و اینترون 4 و اگزون 5 به طور کامل هستند (گروس و همکاران،1996).
جدول 3-3 توالی آغازگر اختصاصی برای جایگاه GHمنبع نام جایگاه توالی نوع پرایمر
گروس و همکاران
،1996 GH 5'-GGAAGCTTAACCCCAACCAGCTCACTGAGAA-3' رفت
5'-CTACAGGGTGCAGTTGGAATCCAG-3' برگشت

–313

بررسی اثر نانو دی اکسید تیتانیوم بر خواص فیزیکوشیمیایی فیلم نشاسته تاپیوکا
1-6- پرسشهای تحقیقآیا دی اکسید تیتانیوم به صورت نانو ذرات میتواند خواص مکانیکی را در فیلمهای نشاسته تاپیوکا را افزایش دهد؟
آیا نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم بر خواص ممانعتی فیلمهای نشاسته تاپیوکا تاثیر دارند؟
آیا نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم بر خواص فیزیکوشیمیایی فیلمهای نشاسته تاپیوکا تاثیر دارند؟
آیا استفاده از نانو دی اکسید تیتانیوم بر پارامترهای رشد میکروبی اشرشیا کلی فیلمهای خوراکی نشاسته تاپیوکا را تاثیر دارند؟
1-7- محدودیتهای تحقیقدر این پژوهش حداکثر غلظت ترکیب نانو به عنوان یک محدود کننده مطرح میگردد. بیشتر از 5% ترکیب نانو باعث هتروژن نمودن فیلم میشد.
1-8- نمودار تحقیقشکل 1-1 نمودار تحقیق را برای این پژوهش نشان می دهد.

شکل 1- SEQ شکل_1- * ARABIC 1: نمودار فرآیند تحقیقفصل دوممروری بر پژوهشهای پیشین2-1- معرفی نشاسته و نشاسته تاپیوکا2-1-1- ترکیب و ساختار نشاستهنشاسته یک جزء غذایی عمده است و یک کربوهیدرات تجزیه پذیر که از هزاران واحد گلوکز ساخته شده است. نشاسته دربرگیرنده زنجیرههای خطی و شاخهدار مولکولهای گلوکز است که آمیلوز و آمیلو پکتین نامیده میشوند. آمیلوز که یک حالت خطی نشاسته است مسئول شکل گیری فیلمهای قوی است. پیوندهای فیزیکی در شبکه ماکرو مولکولی نشاسته بیشتر براساس آمیلوز هستند و بر خصوصیات مکانیکی فیلمها تاثیر میگذارند از سوی دیگر، ساختار شاخهدار آمیلو پکتین عموماً باعث ایجاد فیلمهایی میشود که شکننده هستند ] 36[.
نشاسته ترکیبی از دو پلیمر است آمیلوز، یک اتصال خطی (4→ 1 ) از glucan – D – α و آمیلوپکتین، یک مولکول پرشاخه که از شاخه های کوچک (4 → 1 ) glucan – D – α و پیوند α (6 → 1) در اتصالات تشکیل شده است. طول زنجیره آمیلوز حدود 6000 واحد D - گلوکو پیرانوز، با وزن مولکولی بین 600000 – 150000 دالتون است. آمیلو پکتین، بر عکس بسیار پر شاخه است به طور میانگین 26- 17 شاخه، با واحدهای D- گلوکوزیل جداشده از پیوندهای (6 → 1 ) α است. اندازهی مولکولی آمیلو پکتین بزرگتر از آن است که به طور دقیق مشخص شود ولی مطالعات پراکنش نور حدود 106 D – گلوکوزیل در هر مولکول را نشان داد که آمیلو پکتین را یکی از بزرگترین ماکرو مولکولهای موجود در طبیعت میکنند. همهی نشاستهها از این دو ترکیب ساخته شدهاند. نسبت آنها در نمونههای نشاسته معمولا 20 به 80 آمیلوز به آمیلو پکتین است ]6 و 8[.

شکل 2- SEQ شکل_2- * ARABIC 1: ساختمان شیمیایی نشاسته نشاسته که به وفور در طبیعت یافت میشود، به دلیل قیمت پائین، قابلیت تجدید شوندگی و بازیافت زیستی، یکی از مواد خام جذاب و مورد علاقه برای استفاده در بسته بندیهای خوراکی محسوب میگردد. علاوه بر این حساسیت زا نبوده و به دلیل دارا بودن ویژگیهای مکانیکی و مقاومت در برابر نفوذ گازها، امکان به کارگیری و استفاده از آن در صنایع غذایی وجود دارد ]1 و 3[.
نشاسته به دلیل ماهیت پلیمری قابلیت فیلم سازی دارد به علاوه، به دلیل قیمت مناسب و در دسترس بودن توجه زیادی به آن میشود یکی از معایب فیلمهای نشاسته، مقاومت پایین آنها به رطوبت است برای حل این مشکل میتوان از چربیها یا پلیمرهای زیست تخریب پذیر مقاوم به رطوبت استفاده کرد، برای بهبود ویژگیهای فیلمهای نشاسته به ویژه خصوصیات کششی آنها میتوان از هیدروکلوئیدها در ترکیب آنها استفاده کرد ]4[.
2-1-2- نشاسته تاپیوکاکاساوا مانیهوت اسکولنتا Manihot esculenta، یوکا یا مانیوت هم نامیده میشود گیاهی است چوبی از تیره فرفیون (خانواده فرفیون) بومی آمریکای جنوبی است که به طور گسترده به عنوان یک محصول هر ساله در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری برای  ریشه غده ای نشاسته ای آن کشت شده است که عمده ترین منبع کربوهیدرات هستند. آرد تولید شده از ریشه تاپیوکا نامیده میشود. کاساوا سومین منبع بزرگ کربوهیدرتها برای غذای انسان در جهان است. و محصولی کم هزینه برای جمعیت ساکن در مناطق مرطوب استوایی میباشد. شواهد مستقیم نشان می دهد که 1400 سال پیش کشت  کاساوا در السالوادور صورت گرفته است. نشاسته تاپیوکا نشات گرفته از منبع متفاوتی نسبت به نشاستههای رایج مانند غلات (برنج، ذرت)، غده ای (سیب زمینی )، ریشهای (تاپیوکا ) و (نخود و لوبیا) است نام مگذاری این گیاه تا حدی زیادی بستگی به منطقه ای که در آن رشد میکند دارد مانند ( آمریکای مرکزی (yucca anioca M یاMadioca در برزیل و Tapioca در هند و مالزی و در آفریقا و آسیای جنوبی Cassada یا Cassava) ]68 و 71[.
1120140204470
شکل 2- SEQ شکل_2- * ARABIC 2: ریشه کاساواجدول 2- SEQ جدول_2- * ARABIC 1: گیاه شناسی گیاه کاساواطبقه بندی علمی
رده دولپه ایها
راسته مالپیگیالس
خانواده تیره فرفیون
زیرخانواده کروتنوییده
نژاد مانیهوته
گونه اسکولنتا
نام علمی مانیهوت اسکولنتاکرانتز
2-1-2-1- مرفولوژی گیاه کاساوابوته کاساوا چوبی و چند ساله است که تا ارتفاع 2 تا 4 متر رشد می کند برگ ها به صورت توده ای در تاج درخت شبیه به برگ نخل گسترده و روی دمبرگ بلند و باریکی شامل 5 تا 9 پهنه به وجود می آیند آن ها فقط به سوی انتهای شاخه رشد می کنند. وقتی گیاه درحال رشد است.ساقه اصلی به سه شاخه تقسیم شده وبعد به همین ترتیب شاخه ها ی دیگری بر روی آن ها تشکیل می شود ریشه یا غده ها نیز در زیرسطح زمین توسعه می یابند. گل نر و ماده به صورت مجزا مرتب شده و به روی همان بوته تشکیل می شوند. شکل میوه سه گوش و حاوی سه دانه است که قابل دوام بوده و برای انتشار گیاه مورد استفاده قرار می گیرد. تعداد ریشه ها ی غده ای و ابعاد آن ها و تا حد زیاد ی در میان گونه های مختلف متفاوت است. ریشه ی کاساوا مخروطی وطویل است و با گوشت سفت همگن در پوسته ای قابل تفکیک که حدود یک میلی متر ضخامت دارد و با رنگ قهوه ای و درقسمت خارجی زبر می باشد گوشت غده می تواند سفید گچی یا زرد باشد. ممکن است اندازه ی طول ریشه از 30 تا 120 سانتی متر و قطر آن 4 تا 15 سانتی متر و وزن 1 تا 8 کیلوگرم یا بیشتر برسد. ترکیب شیمیایی ریشه های کاساوا متفاوت است مطالعهی 30گونه در مکزیک نتایجی به شرح ذیل در بر داشته است ریشه های آن بسیار غنی از نشاسته است و حاوی مقادیر قابل توجهی از کلسیم،فسفر و ویتامین ‏c‏ می باشد.ولی فقیر از پروتئین است. دربرگ این نوع گیاهان،منبع خوبی از پروتئین لیزین،اما کمبود اسید امینه احتمالا متیونین و تریپتوفان است ]22[.
جدول 2- SEQ جدول_2- * ARABIC 2: آنالیز ریشه کاساوا و سیب زمینی ] 68[.
درصد کاساوا سیب زمینی
رطوبت 7/25 75/80
مواد نشاستهای 21/45 19/90
قندها 5/13 0/40
پروتئین 1/12 2/80
چربیها 0/41 0/20
فیبر 1/11 1/10
خاکستر 0/54 0/92
2-1-2-2- فرآوری و تبدیل کاساواعمر مفید کاساوا چند روز است و خواص ویژه خود را از دست می دهد اگر برگ های کاساوا دو هفته قبل از برداشت حذف شوند عمر مفید آن دو هفته طولانی تر می شود.قرار دادن ریشه در پارافین یا موم یا ذخیره کردن آن در کیسه پلاستیکی خطرات آن را کاهش داده و عمر مفید آن را به 3 تا 4 هفته افزایش می دهد ریشه پوست گیری شده را می توان منجمد کرد.روش سنتی عبارتست از بسته بتدی ریشه در مالچ مرطوب برای تمدید عمر مفید آن می باشد .ریشه های خشک را می توان کوبید و به آرد تبدیل کرد در خلال فرآیند کوبیدن ریشه،ذرت را می توان اضافه کرد تا پروتئین آرد افزوده شود. آرد کاساوا دارای ظرفیت نگهداری آب زیادی میباشد و از آن در تهیه پخت نان،کیک،کراکر و پودینگ استفاده میشود. بعضا آرد کاساوا با مشتقات جزیی ممکن است به عنوان جانشین آرد گندم در تهیه نان استفاده شود. نانی که بطور کامل از آرد کاساوا تهیه شده در امریکا به بازار عرضه شده و نیاز افراد دارای آلرژی به آرد گندم را برآورده کرده است. ریشه های تازه را میتوان به صورت قطعه های نازک کاملا سرخ کرده و محصولی مشابه چیپس سیب زمینی تهیه کرد.ریشه ها را میتوان پوست گیری رنده کرده و با آب شستشو داده و نشاسته را استخراج نمود و همچنین پروتئین برگ را میتوان به خوراک دام اضافه کرد. در افریقا فرآوری ریشه به چند روش مختلف صورت میگیرد. آن ها ممکن است برای اولین بار در آب تخمیر شده سپس آن ها را بوسیله آفتاب خشک کرده برای ذخیره سازی یا رنده نمودن آن سپس خمیر تهیه می نمایند و می پزند. نوشیدنی های الکلی را نیز میتوان از ریشه کاساوا تهیه نمود. برگهای جوان حساس می تواند به عنوان سبزیهای معطر خوراکی مورد استفاده قرار گیرد که حاوی سطوح بالایی از پروتئین می باشد. استفاده های صنعتی از کاساوا و فرآیند تبدیل آن در کارخانجات و تولید محصولاتی شامل کاغذسازی، پارچه،چسب، شربت فروکتوز، سوخت زیستی، خوراک دام وکیسه های زیست تخریب پذیر میباشد ]22 و 68[.

2-2- نانو تکنولوژی
علم نانو و علوم مرتبط با آن جدید نیستند چرا که صدها سال است شیمیدانان از تکنیک‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های علم نانو در کار خود استفاده می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌کنند. از پنجره های رنگارنگ کلیساهای قرون وسطی گرفته تا شمشیرهای یافت شده در حفاری های سرزمین های مسلمان همگی گویای این مطلب هستند که بشر مدت هاست که از برخی شگردهای این فناوری در بهینه کردن فرایندها و ساخت باکیفیت تر اشیاء بهره می برده است اما تنها به دلیل پیشرفت کم فناوری و نبود امکانات امروزی نتوانسته حوزه مشخصی برای این فناوری تعیین کند. اولین بار ریچارد فیمن در سال 1959 طی سخنرانی خود با بیان امکان به راه اندازی فرآیندی برای دستکاری اتمها و مولکولها با استفاده از ابزارهای دقیق سبب شده تا افکار به سمت توسعه چنین امکانی متمایل شوند. در سال 1974، پروفسور نوریو تانیگوشی، مدرس دانشگاه علوم توکیو، نخستین بار واژه "فناوری نانو" را بکار گرفت. او در پروژه - ریسرچای با نام "مفهوم اساسی فناوری نانو" اشاره می کند که فناوری نانو اساسا مجموعه ای از فرایندهای تفکیک، ادغام و تشکیل مواد در حد یک اتم یا یک مولکول است. در دهه 1980 این تعریف به طور وسیع تر توسط دکتر درکسلر (نویسنده کتاب های موتور خلقت) مورد بررسی قرار گرفت. فناوری نانو و نانوعلوم در اوایل دهه 1980 با تولد علم کلاستر آغاز به کار کرد. این توسعه سبب کشف فلورین در سال 1986 و نانولوله های کربنی در مدت چند سال بعد شد. مقیاس نانو، ابعادی کمتر ازnm 100 (معمولا nm 1/0 تا nm 100) را شامل می شود، که شامل موادی یا سطوح خارجی بسیار زیاد و ناهمگونی کم که پدیدههای کوانتومی بروز میدهند میباشد. علم نانو، مطالعه پدیدهها و خواص نوین مواد، در این مقیاس (در حد اتم ها و مولکولها ) میباشد. فناوری نانو، کاربرد دانش ، مهندسی و فناوری در مقیاس نانو در جهت تولید مواد و سیستمهایی است که وظایف خاص الکتریکی، مکانیکی، بیولوژیکی، شیمیایی یا محاسباتی را انجام میدهند. نانو تکنولوژی بر اساس ارائه خواص و عملکردهای نوینی از نانو ساختارها، دستگاه ها و سیستم ها به علت ساختار بسیار کوچک آنهاست. این دستگاه ها عموما کاربردهای بیولوژیکی و پزشکی دارند به طور کلی نانوتکنولوژی، فن آوری تغییر در خواص مولکولهای تشکیل دهنده مواد است. و به همین دلیل مقیاس نانو بهترین تعریف برای تکنولوژی میباشد ]88[.
2-3- بایو نانو تکنولوژی
نانو بایو تکنولوژی حوزه نوظهور علمی و فنی است که گرایش چند رشته ای از علوم (شیمی ، زیست شناسی، فیزیک، علم مواد) است. این حوزه از یک سو، به فعالیتهای همگام علم مواد و بیولوژی اشاره دارد و از سوی دیگر حد فاصل علم فیزیک و بیولوژی است. نانو بایوتکنولوژی با سیستمهایی در مقیاس نانو که با راهکار بالا به پائین ساخته شدهاند(خرد کردن واحدهای بزرگتر به اجزای کوچکتر ) یا از روش پائین به بالا برای سامان دادن اجزا بهره میبرند، سر کار دارند. نانو بایو تکنولوژی بیش از آنکه شاخه ای از بایوتکنولوژی باشد شاخه ای از نانو تکنولوژی است. بایوتکنولوژی از سازوارههای زنده در کاربردهای صنعتی مختلف است، ولی نانو بایوتکنولوژی استفاده از قابلیتهای نانوتکنولوژی در کاربردهای زیستی است. بنابراین واژه نانو بایوتکنولوژی نیز مانند واژههایی چون بیومکانیک و بیومتریال به استفاده از تکنولوژیهای مختلف، در کاربردهای زیستی اشاره دارد و نه به استفاده از قابلیتهای ارگانیزمهای حیاتی در کاربردهای مختلف صنعتی. نانو کامپوزیتها جایگزین خوبی برای بطریهای پلاستیکی نوشیدنیها هستند استفاده از پلاستیک برای ساخت بطری باعث فساد و تغییر طعم نوشیدنی میشوند، نانوکامپوزیتها میتوانند به عنوان مواد بسته بندی جدید استفاده شوند، یک مثال نانوکامپوزیتهای تشکیل شده از نشاسته سیب زمینی و کلسیم کربنات است، این فوم مقاومت خوبی به حرارت دارد، سبک و زیست تخریب پذیر است و میتواند برای بسته بندی مواد غذایی به کار رود. افزودن 5-3% از نانو خاک رس به ماده پلاستیک آن را سبک تر، قویتر و مقاومتر به حرارت می کند و خواص ممانعت کنندگی بهتر در برابر اکسیژن، دی اکسید کربن، رطوبت و مواد فرار دارد ]81[.
2-4- کامپوزیترشد فزاینده تکنولوژی در سال‌های اخیر باعث شد تا موادی که در دسترس بشر بود برای جامه حقیقت پوشاندن بر رویاهای مدرن کافی نباشد و از این رو تلاش برای رسیدن به مواد جدید آغاز شد. امروزه در بیشتر کاربردهای مهندسی، اغلب به تلفیق خواص مواد نیاز داریم. موادی که ضمن داشتن استحکام بالا، سبک باشند، مقاومت سایشی وجذب UV1خوبی داشته باشند که از جمله آن انواع کامپوزیت ها را می توان نام برد.
کامپوزیتها، ترکیبات ساخته شده از پلیمر و پر کننده آلی یا غیر آلی هستند. استفاده از پر کنندهای غیرآلی در ماتریکس پلیمر، استحکام و سفتی پلیمر را افزایش میدهد و تولید آنها به صورت بالقوه میتواند باعث بهبود ویژگیهای مکانیکی مواد بسته بندی و ظروف نشاستهای گردد.
کامپوزیت‌ها از دیدگاه زیستی به دو دسته کامپوزیت‌های طبیعی. مانند استخوان، ماهیچه، چوب و ...و کامپوزیت‌های مصنوعی(مهندسی) تقسیم میشود.کامپوزیت‌های سبز(کامپوزیت‌های زیست‌تجزیه‌پذیر)در اینگونه کامپوزیت‌ها، فاز زمینه و تقویت کننده، از موادی که در طبیعت تجزیه می‌شوند، ساخته می‌شوند. در کامپوزیت‌های سبز، معمولاً فاز زمینه از پلیمرهای سنتزی قابل جذب بیولوژیکی و تقویت کننده‌ها از فیبرهای گیاهی ساخته می‌شوند ] 88[.
2-5- تعریف نانو کامپوزیتفناوری نانو به دلیل تعامل نزدیکی که با سایر رشتههای علوم دارد به سرعت در حال گسترش است و در این علم پلیمر را نیز از مزایای خود بی بهره نگذاشته است. استفاده از فناوری نانو در زمینهی علم پلیمر به تولید پلیمرهای نانوکامپوزیت منجر شده است. نانوکامپوزیتها پلیمرهایی هستند که در آنها از ترکیبات آلی یا غیرآلی مختلفی که دارای اشکال مختلف صفحه ای، کروی و یا به صورت ذرات ریز بوده و اندازه ای در حد ابعاد نانو دارند به عنوان فیلر یا پرکننده استفاده میشود. فیلمهای حاصل از ترکیب نانو مواد و بیوپلیمرها و یا به اصطلاح نانو کامپوزیتهای بیوپلیمری خواص کاربردی مطلوبتری از خود نشان میدهند که مهمترین آنها افزایش مقاومت مکانیکی و کاهش نفوذپذیری نسبت به بخار آب میباشد. افزایش بازدارندگی در برابر نفوذ گازها، افزایش کارایی فیلم در استفاده به عنوان بسته بندی فعال، افزایش مقاومت حرارتی ماده بسته بندی و ایجاد شفافیت و بهبود خواص ظاهری فیلم از دیگر مزایای نانوکامپوزیتهای بیوپلیمری است ]6[.
2-6- تعریف بایو نانو کامپوزیتدر طول چند سال اخیر "بایونانوکامپوزیت" تبدیل به یک اصطلاح رایج برای تعیین نانوکامپوزیت ها که شامل پلیمرهای طبیعی در ترکیب با مواد معدنی هستند و نشان دهنده حداقل یک بعد در مقیاس نانومتر است ] 31 و 61[. که ویژگی های آنها در مقایسه با نانوکامپوزیت های مشتق شده از پلیمرهای سنتزی بسیار مطلوب تر است. علاوه بر این بایونانوکامپوزیت ها مزیت قابل توجه ای از زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری و بهبود ویژگی های عملکردی به وسیله ارائه بایولوژی یا بخش معدنی نشان دادند. موجودات زنده تولید کننده نانوکامپوزیت های طبیعی هستند که آرایش ترکیبی از ترکیبات آلی و معدنی در مقیاس نانو نشان میدهد ]32[.
در واقع بایونانوکامپوزیت ها نسل جدیدی از نانوکامپوزیتها هستند که شامل ترکیبی از بیوپلیمرها و مواد معدنی هستند که حداقل یکی از ابعاد آنها در مقیاس نانومتری باشد ] 63[. علاوه بر این، مواد بیوپلیمر به عنوان یک فن آوری سبز شناخته شده ]73[. و در صنایع دارویی، بسته بندی مواد غذایی و تکنولوژی های کشاورزی قابلیت تجزیه بیولوژیک و زیست سازگاری از خود نشان داده اند ]84[.
2-7- فلز تیتانیومبسیاری از مهندسین و طراحان هنوز تیتانیوم را فلزی گران و ناشناخته قلمداد می کنند اما پیشرفت های اخیری که در زمینه تولید این فلز صورت گرفته است نشان می دهد که تیتانیوم ماده ای بسیار فوق العاده برای استفاده های مهندسی است. تیتانیوم با عدد اتمی 22 و نماد Ti از عناصر گروه فلزات واسطه می باشد. نقطه ذوب 1668درجه سانتیگراد، نقطه جوش 3287 درجه سانتیگراد و وزن اتمی 88/47 دارد. یکی از ویژگی های مهم تیتانیوم چگالی پایین آن 506/4 گرم بر سانتیمتر مکعب می باشد. این ویژگی همراه با استحکام و مقاومت بالا در برابر خراشیدگی تیتانیوم را به فلزی ایده آل تبدیل کرده است. تیتانیوم عمدتاً در صنایع هوا فضا و همینطور در کارخانه ها و تجهیزات صنایع شیمیایی مورد استفاده قرار می گیرد. این فلز همچنین در ساخت عینک ها، مهندسی کنترل و فناوری پزشکی خصوصاً مواردی که حد تحمل بیولوژیک از اهمیت زیادی برخوردار است مورد استفاده قرار می گیرد. تیانیوم ماده ای غیر سمی حتی در مقادیر بالا می باشد. همچنین این ماده هیچ نقشی در سیستم طبیعی بدن انسان ایفا نمی کند. بطور تخمینی روزانه 8 میلی گرم تیتانیوم وارد بدن انسان می شود. اگر چه تقریباً بدون جذب شدن از بدن دفع میگردد ]2[.
2-7-1- نانو دی اکسید تیتانیومدی اکسید تیتانیوم در اندازه نانومتری یک فوتو کاتالیست ایده آل است که مهم ترین دلیل وجود این خاصیت در این ماده قابلیت جذب اشعه فرابنفش است. فوتون های فرابنفش بسیار پرانرژی هستند و در بیشتر موارد می توانند به سادگی باعث تخریب اجسام گردند. دی اکسید تیتانیوم با جذب اشعه فرابنفش و به واسطه خاصیت فوتوکاتالیستی خود می تواند پوششی ضد باکتری روی سطوح ایجاد کند و هم چنین مانع از عبور اشعه گردد. وجود همین خواص ویژه، نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم را تبدیل به گزینه ای مناسب برای استفاده در کرم های ضدآفتاب نموده است. حذف بوی نامطبوع و تجزیه سموم آلی و معدنی و میکروارگانیسم های مضر و بیماری زای موجود در آب و فاضلاب کاربرد عمده دیگر این ماده است. نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم خاصیت آب دوستی بالایی دارند ]2[.
2-8- فیلم های خوراکیتولید فیلمهای خوراکی از پلیمرهای طبیعی مورد توجه زیادی قرار گرفته است که به علت قابلیت خوراکی بودن و سازگاری زیستی این فیلمها است. آماده سازی این فیلمها شامل استفاده از دست کم یک عامل شکل دهنده فیلم، یک محلول و یک واسط میشود. ماکرو مولکولهای مورد استفاده عبارتند از پلی ساکاریدها، پروتئینها و لیپیدها هستند. بسیاری از منابع پلی ساکارید برای آماده سازی فیلمهای خوراکی همچون ریشه و نشاسته غلات و پکین وجود دارند. با این حال، نشاستهها بیشتر در مواد خام بهکار برده میشوند زیرا منابعی تجدیدپذیر هستند و ارزان هم هستند. نشاسته یک جزء غذایی عمده است و یک کربوهیدرات تجزیهپذیر که از هزاران واحد گلوکز ساخته شده است. نشاسته دربرگیرنده زنجیرههای خطی و شاخهدار مولکولهای گلوکز است که آمیلوز و آمیلوپکین نامیده میشوند. آمیلوز که یک حالت خطی نشاسته است مسئول شکلگیری فیلمهای قوی است. پیوندهای فیزیکی در شبکه ماکرومولکولی نشاسته بیشتر براساس آمیلوز هستند و بر خصوصیات مکانیکی فیلمها تاثیر میگذارند از سوی دیگر، ساختار شاخهدار آمیلو پکتین عموماً باعث ایجاد فیلمهایی میشود که شکننده هستند .فیلمهای بر پایه نشاسته خصوصیات فیزیکی شبیه پلیمرهای سنتزی دارند از جمله شفاف بودن، بدون بو، بدون مزه و نیمه نفوذپذیر به علاوه، آنها خصوصیات مانعی خوبی دارند ]51[.
2-9- پوشش ها و فیلم های خوراکیپوششهای خوراکی لایه نازکی از یک ماده خوراکی هستند که بر روی سطح ماده غذایی به عنوان پوشش و یا در لابلای اجزای تشکیلدهنده ماده غذایی از طریق پیچیدن، فروبری، برسزدن یا اسپری کردن قرار داده می‌شود تا مانعی در برابر عوامل مخرب از قبیل حضور گازهایی مانند اکسیژن و دی اکسید کربن، رطوبت و مواد معطر باشد تا به این ترتیب زمان ماندگاری ماده غذایی افزایش یابد. این مواد می‌توانند به صورت پوشش کامل محصول باشند و یا به عنوان یک جزء غذایی همراه غذا مصرف گردند. فیلمهای خوراکی از نظر نحوه تولید متفاوت از پوششهای خوراکی هستند. آنها قبل از کاربرد در بستهبندی مواد غذایی به صورت لایهای نازک تولید میشوند و سپس مانند پلیمرهای سنتزی برای بندی بکار میروند. کاربرد فیلمها و پوششهای خوراکی بدینمعنی نمیباشد که میتوانند برای افزایش زمان انبارمانی مواد غذایی جایگزین مواد بستهبندی غیرخوراکی و ساختگی گردند. پوششهای خوراکی در واقع ظرفیت افزایش کیفیت و ماندگاری غذا و بهبود بازده اقتصادی مواد را به عنوان یک ماده کمکی بستهبندی دارا میباشند ]47[.
فیلمهای حاصل از نانو مواد و بیوپلیمر ها یا به اصطلاح نانو کامپوزیت های بیوپلیمری خواص کاربردی مطلوب تری نشان می دهند که مهم ترین آنها افزایش مقاومت مکانیکی و کاهش نفوذ پذیری به بخار آب، افزایش بازدارندگی در برابر نفوذ گازها، افزایش کارائی فیلم به عنوان بسته بندی فعال، افزایش مقاومت گرمایی ماده بسته بندی و بهبود خواص ظاهری فیلم از دیگر مزایای نانوکامپوزیت های بیوپلیمری می باشد ]51[.
پوشش محصولات غذایی با فیلمهای خوراکی و پوششهای خوراکی، آنها را از مزایای گونا گون از نقطه نظر جنبههای سلامت بخش، حسی و اقتصادی برخوردار می سازد .برخی از مهمترین این مزایا به شرح زیر هستند: به سبب زیست کافت بودن، بر خلاف فیلم های سنتزی باعث آلودگی محیط زیست نمی شوند] 35[ ؛ خود، از ارزش تغذیه ای نیز برخوردار هستند ]21و 41[. ؛ مانع فساد و آلو دگی میکروبی می شوند ]77[. فساد و پلاسیدگی 2میوه ها و سبزی ها را طی انبارداری به تعویق می اندازند]62 و 26[. ظاهر یا جلوه غذا را به نحو مطلوب حفظ می کنند ]23و 96[ و مانع جذب رطوبت یا آبگیری مواد غذایی با رطوبت کم و تبعات منفی ناشی از آن همچون بدبافتی حاصل از تبلور قندها در فرآورده، بدرنگی وجلوگیری از کلوخه شدن پودرها می شوند ]61[ مانع ازدست رفتن رایحه غذا می شوند ]86[. مانع قهوه ای شدن آنزیمی و غیرآنزیمی مواد غذایی می شوند]26 و 39[. براستحکام و یکپارچگی بافت مواد غذایی می افزایند و از افت ترکیبات مغذی در اثر واکنش های ناخواسته همچون اکسایش و واکنش های قهوه ای شدن جلوگیری می کنند ] 39[. بدطعمی و بدرنگی و آثار سوء ناشی از آن ها را کاهش می دهند ]19، 26 و 95 [. مانع چکیدن یا تراو ش، درگوشت می شوند ] 39[. به عنوان حامل مواد افزودنی نظیر ترکیبات پادمیکروبی، پاداکسنده ها، مواد طعم دهنده ورنگ ها عمل می کنند]86[. مانع سبز شدن سطحی سیب زمینی در برابر نور می شوند ] 39[.و جذب بیش از حد روغن به بافت محصول و خروج بیش از حد آب از آن را طی سرخ کردن به طور چشمگیر کاهش می دهند ] 21 و 98[. زیست -کافت بودن (تجزیه پذیر بودن زیستی)، خوراکی بودن و کارآمد بودن فیلم های خوراکی سبب شده است که این فیلم ها به عنوان جایگزین های فیلم های سنتزی به طور وسیع مورد مطالعه، پژوهش و کاربرد قرار گیرند. کارآیی فیلم های خوراکی به شاخص های کیفی آن ها مربوط می شود. این شاخص ها نیز به نوبه خود از جنس فیلم و روش تولید آن اثر میپذیرند.
کاربرد فیلم های خوراکی در محصولات غذایی به سال های بسیار دور برمی گردد. چینی ها در قرن دوازدهم و سیزدهم میلادی مرکبات را با موم پوشش می دادند تا از افت وزن و کاهش رطوبت آنها جلوگیری شود. در قرن شانزدهم میلادی گوشت را با چربی پوشش می دادند تا از چروکیدگی آن جلوگیری شود. در همان زمان برای نگهداری گوشت گوشت و سایر مواد غذایی آنها را با فیلم های ژلاتین پوشش می دادند. یوبانوعی فیلم ترکیبی از چربی و پروتئین خوراکی است که از قرن پانزدهم در شرق آسیا به طور سنتی از شیر سویا تهیه می شده است. در قرن نوزدهم فندق و بادام را با ساکاروز پوشش می دادند تا از اکسید شدن و تندی آنها جلوگیری شود. از دهه 1930 تا کنون سطح میوه ها را با موم ها و امولسیون روغن در آب پوشش می دهند. طی 40 سال گذشته تحقیقات متعدی در زمینه تهیه، کاربرد و ویژگی های فیلم ها و پوشش های خوراکی انجام شده است. یکی از روش های تولید فیلم های تجزیه پذیر استفاده از بایو پلیمرهایی بر پایه نشاسته، پروتئین و سلولز است. ]53[.
2-10- بسته بندی فعال
تکنولوژی جدید در بسته بندی مواد غذایی در پاسخ به نیازهای مشتریان یا در راستای تولید صنعتی محصولات غذایی محافظت شده با روش های ملایم تر، تازه، لذیذ و راحت با عمر انباری زیاد و کیفیت کنترل شده توسعه می یابند. علاوه بر این تغییرات در نحوه توزیع(مثل جهانی سازی بازاردر نتیجه توزیع غذا در مسافت های طولانی) یا روش زندگی مصرف کنندگان ( بدلیل صرف زمان کمتر برای خرید غذای تازه از بازارو پخت و پز) مهمترین چالش ها در زمینه صنعت بسته بندی می باشد و به عنوان نیروی پیش برنده در جهت توسعه مفاهیم جدید بسته بندی و بهبود یافته می باشند که میزان مدت زمان نگهداری را افزایش داده در حالیکه موجب حفظ ایمنی و کیفیت مواد غذایی شده و آن را تحت نظارت دارد. در بسته بندی فعال به بسته بندی اجازه داده می شود تا با غذا و محیط اطرافش واکنش متقابل داشته باشد و نقش دینامیکی در نگهداری ماده غذایی بازی نماید.
بسته بندی فعال به صورت زیر تعریف می شود:
"در بسته بندی فعال شرایط حاکم بر غذای بسته بندی شده را به نحوی تغییر می دهد تا مدت زمان نگهداری آن را افزایش داده و ایمنی و خصوصیات حسی غذا را بهبود بخشیده در حالیکه کیفیت غذای بسته بندی شده را حفظ می نماید"یا" بسته بندی فعال به عنوان زیر مجموعه ای از بسته بندی هوشمند طبقه بندی می شود و به شرکت افزودنی های خاص در فیلم های بسته بندی یا در داخل بسته با فرض نگهداری و افزایش عمر انبار مانی اطلاق میشود".
بسته بندی فعال می تواند نقش های متعددی را داشته باشد که در بسته بندی های رایج وجود ندارد. این نقش ها عبارتنداز: فالیت ضدمیکروبی، گرفتن اکسیژن، رطوبت و اتیلن (ویژگی اسکاونجری)، رهاکردن مواد طعمی و یا اتانول ] 2[.
2-11- بسته بندی نانو
یکی از کاربردهای تجاری نانوتکنولوژی در بخش غذایی بسته بندی است. پیشگوئی شده است که در 25% بسته بندی های غذایی در دهه آینده از نانوتکنولوژی استفاده میشود. هدف اصلی در بسته بندی نانو افزایش عمر ماندگاری به وسیله بهبود عملکرد مانع در کاهش گاز، تبادل رطوبت و پرتو نور UV است. بالغ بر 90 درصد بسته بندی نانو بر اساس نانو کامپوزیت است که بهبود دهنده عوامل حامل در لفاف های پلاستیکی برای مواد غذایی و بطری های پلاستیکی برای نوشیدنی های غیر الکلی و آبمیوه است.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

بسته بندی نانو می تواند خصوصیات ضدمیکروبی، آنتی اکسیدانی و گسترش مدت ماندگاری و غیره داشته باشد.
به طور کلی کاربردهای فناوری نانو در بسته بندی و حفاظت از محصولات را می توان به صورت زیر خلاصه کرد:
-نانوکامپوزیت های مغناطیسی مورد استفاده در حسگرهای برچسبی.
-نانوکامپوزیت های پلیمری کلی(خاک رس) برای بهبود ویژگی های عایقی.
-پلاستیک های جدید برای استفاده در بطری ها با خواص عایق در برابراشعه UVو نفوذ گازها.
-برچسب های RFID .
-نفوذ ذرات پرکننده پلیمرها.
-نانو بارکدها و برچسب ها جهت بسته بندی و محافظت مقادیر کم.
-ارتقای دوام و قابلیت استفاده و بسته بندی پلاستیک ها.
-روکش های با نانو کامپوزیت های پلیمری و نانو الیافی.
-نانومواد افزودنی برای بهبود عملکرد (استحکام، مقاوم به آب، جذب، رسانایی و ...).
-کاغذ و یا پلاستیک های با قابلیت حسگرها.
-نانوکدهای ساخته شده از مواد کاغذی و یا پلاستیکها برای شناسایی و تأیید اهداف بسته بندی هوشمند ]88[.
2-12- بسته بندی ضد میکروبیسیستم بستهبندی است که قادر به بازداری از فساد و جلوگیری از رشد میکرو ارگانیسمهای بیماریزایی که آلودهکننده مواد غذایی هستند، میباشد. میتوان از طریق افزودن مواد ضدمیکروبی در سیستم بستهبندی و یا به کارگیری پلیمرهای ضدمیکروبی که نیازمندیهای بستهبندی مورد رضایت مصرف کننده را تامین کند، به عملکرد ضدمیکروبی جدیدی دست یافت. هنگامیکه سیستم بستهبندی فعالیت ضدمیکروبی را القا میکند، سیستم بستهبندی یا مواد بسته بندی بوسیله افزایش دوره تاخیری و کاهش سرعت رشد و یا کاهش تعداد میکرو ارگانیسمهای زنده، رشد میکروبی را محدود میکند و یا از رشد میکروبی جلوگیری میکند ]7[.
2-12-1- انواع بسته بندی های ضد میکروبی
بسته بندیهای ضد میکروبی را میتوان به انواع زیر طبقهبندی کرد :
قرار دادن کیسههای کوچک (ساچت) حاوی مواد ضدمیکروبی فرار در داخل بستهبندی
وارد کردن مستقیم مواد ضد میکروبی و غیر فرّار در داخل پلیمر بستهبندی
پوششدادن یا جذب سطحی ماده ضدمیکروبی بر روی سطح پلیمر بستهبندی
بی تحرککردن مواد ضد میکروبی بر روی پلیمر توسط پیوندهای کووالانسی
استفاده از پلیمرهایی که به صورت ذاتی ویژگی ضدمیکروبی دارند ]5[.
2-12-2- مزایای استفاده از بسته بندی های ضد میکروبیدر بستهبندیهای ضد میکروبی انتشار مواد ضد میکروبی از ماتریکس پلیمر به سطح ماده غذایی به صورت آهسته و در زمان طولانی انجام میگیرد و در نتیجه برای مدت طولانی غلظت زیادی از ماده ضدمیکروب در سطح فرآورده وجود خواهد داشت. مواد ضدمیکروبی از طریق کاهش سرعت رشد و طولانی کردن فاز تاخیری میکروارگانیسمها و یا غیر فعال کردن و نابودی میکروبها باعث افزایش ماندگاری فرآورده غذایی میشود ]5[.
2-12-3- معایب استفاده از بسته بندی های ضد میکروبیماده ضد میکروبی به سرعت از سطح ماده غذایی به داخل آن نفوذ میکند (منتشر میشود ) و در نتیجه خاصیت ضد میکروبی در سطح کاهش مییابد. مواد ضد میکروبی باقی مانده در تماس با مواد فعال موجود در سطح خنثی میشوند و میکروبهای آسیب دیده ممکن است دوباره فعال گردند. برای مثال ثابت شده است که امولیسفایرها و اسیدهای چرب با نایسین واکنش داده و خواص آن را کاهش میدهند ]5[.
2-13- پلاستی سایزرهافیلم ها و پوشش های خوراکی نیاز به کشش خوب و انعطاف پذیری، شکنندگی پایین، چقرمگی بالا برای جلوگیری از ترک خوردن در طول حمل و نقل و ذخیره سازی دارند بنابراین پلاستیسایزرها با وزن مولکولی پایین برای تغییر انعطاف پذیری فیلم های خوراکی به آنها افزوده میشود. سایز کوچک، قطبیت بالا گروههای قطبی در مولکول و فاصله بیشتر گروههای قطبی در مولکولهای پلایستسایزر سبب افزایش اثرات آن بر روی پلیمرها میگردد. در واقع عملکرد آنها اینگونه است که با افزایش حجم آزاد یا کاهش جاذبه ذرات بین زنجیره های پلیمری مجاور سبب کاهش پیوند هیدروژنی بین زنجیره های پلیمر میگردد ]89[. بیشترین پلاستیسایزرهای استفاده شده پروپیلن گلایکول ]97[، گلیسرول ]89[، سوربیتول ]44[، الیگوساکارید ]20[، و آب هستند. در نهایت به این نتیجه میرسیم که افزودن پلاستیسایزرها سبب تغییرات قابل توجه ای در خواص مانعی از فیلم ها به عنوان مثال افزایش نفوذپذی فیلم به گازها، کاهش توانایی فیلم در جذب آب و کاهش استحکام کش ] 34و 38[. به عنوان یک قانون کلی می توان بیان نمود:با افزایش پلاس سایزرها به فیلم های غذایی، قابلیت نفوذ پذیری تا حد قابل توجهی افزایش یافته و باعث پیوند هیدروژنی بین زنجیرههای پلیمری کاهش یافته و در عین حال حجم مولکولی افزایش می یابد که منجر به افزایش قابلیت انعطاف پذیری فیلم میشود ]87[.
تالجا و همکاران (2007)، اعلام کرده اند که گلیسرول به منظور نرم کنندگی به فرمولاسیون فیلم افزوده می شود. پلاستیسایزرها تحرک زنجیره های پلیمر را با پرکردن فضاهای خالی بین شبکه پلیمر، افزایش می دهند و نیروهای پیوندی درون مولکولی کاهش یافته، شکنندگی کم، آبدوستیو قابلیت انتقال گاز و بخار آب زیاد می شود ]92[.
بنابه گزارش ( گیلبرت و همکاران، 1996)، افزودن پلاستیسایزر با کاهش پیوندهای درون مولکولی بین زنجیره های پلیمر، خواص فیلم را اصلاح کره و WVP را افزایش می دهد. علیرغم این یافته فیلم های دارای فروکتوز و سوربیتولWVP کمتری را نسبت به فیلم های بدون پلاستیسایزر نشان دادند. از آنجائیکه فیلم های بدون پلاستیسایزر بسیار شکننده اند، این امکان وجود دارد که منافذ بسیار ریزی داشته باشند که سرعت انتقال بخار آب را افزایش دهند ]37[.
2-14- روشهای تولید فیلمبه طورکلی فیلمهای خوراکی از محلول ها یا دیسپرسیون های ترکیبات فیلمساز پدید می آیند ]50[. اجزای اصلی فیلم سازی را میتوان به سه بخش شامل حلال، پلیمر و نرم کننده (پلاستیسایزر) تقسیم کرد. پلاستیسایزرها همچون پلیمرها باید محلول در حلال و نیز با آنها قابل امتزاج باشند ]70[. تولید فیلم مستلزم وجود دست کم یک ترکیب پلیمری است که قادر به ایجاد ساختار شبکهای با استحکام و پیوستگی کافی باشد ]69[. در ارتباط با تولید فیلم های خوراکی نکات و ظرایف فراوانی وجود دارند که هر یک بر خواص نهایی فیلم های تولید شده اثر قابل ملاحظه دارند. از جمله آنها می توان به اثر عواملی نظیر جنس و غلظت پلیمر فیلم ساز، PHمحلول لفاف ساز، دما، زمان، قدرت یونی محلول فیلم ساز، نوع و مقدار افزودنی های مورد استفاده، فشار، نوع ترکیب بندی فیلم از نظر ساده و یا مرکب بودن و مخلوط یا لایه ای بودن (قرار گیری دو یا چند لایه مجزا روی یکدیگریا مخلوط شدن اجزاء)، جزئیات مربوط به خواص شیمیایی هر یک از اجزای فیلم ساز، حضور الکترولیت ها و روش تولید فیلم اشاره داشت ]54[. تولید این فیلم ها را می توان در دو قسمت شامل تشکیل فیلم به صورت مجزا و تشکیل فیلم به طور مستقیم بر سطح غذا مورد بررسی قرار داد. در حالت نخست، ابتدا فیلم ساخته شده و سپس بر سطح ماده غذایی پوشش داده میشود، حال آن که در حالت دوم تشکیل فیلم و پوشش دهی آن بر سطح غذا در یک مرحله صورت میگیرد. هر یک از روش های بالا که مورد استفاده قرار گیرند، نخستین مرحله در تولید فیلم، تهیه محلول فیلم ساز است. این محلول، حلال، پلیمر فیلم ساز و افزودنی ها را شامل می شود. در شیوه تشکیل مجزای فیلم، محلول فیلم ساز پس از تهیه شدن با یکی از روش های لایه سازی گسترانده و خشکمی شود. فیلم حاصل با روش های روکش دادن بر سطح ماده غذایی پوشش داده می شود. معادل این شیوه ها در روش پوشش دهی مستقیم فیلم بر غذا، شیوه های افشانی، لایه سازی، برس زنی، غرقابی یا غوطه وری و پوشش دهی با بستر سیال را شامل میشود ]48[.
2-15- ارزیابی خواص فیلم های خوراکی2-15-1- خواص ممانعتی خواص ممانعتی فیلمهای خوراکی به گازها/ بخارات در صنعت غذا، در شرایطی که جلوگیری از پدیدههای نامطلوبی نظیر از دست رفتن رایحه، جذب بوهای نامطلوب از محیط، از دست رفتن رطوبت غذا و جذب رطوبت از اتمسفر به غذاهای خشک مطرح باشد، از اهمیت فراوان برخوردار است ]30[. به طور کلی فیلم های خوراکی به دلیل آبدوست بودن، از خواص ممانعتی مطلوب به O2 و CO2 به ویژه در رطوبت نسبی پائین برخوردارند. عوامل محیطی دما و رطوبت نسبی در میزان تراوایی این فیلمها مؤثرند ] 12[. زیاد بودن رطوبت در مواد غذایی باعث واکنش های شیمیایی و آنزیمی مخرب و زایل شدن بافت آنها میشود. به طور کلی خواص ممانعتی فیلمهای زیست پلیمری به رطوبت به دلیل خاصیت آبدوستی آنها، برخلاف خواص ممانعتی به اکسیژن و سایرگازها، ضعیف است ]13[. ممانعت به عبور بخار آب با شاخص "تراوائی بخار آب =WVP، سرعت گذر بخار آب = WVTR
و ممانعت به عبور اکسیژن با شاخص" تراوائی اکسیژن =OP " یا " سرعت گذر اکسیژن = OTR " سنجیده میشود ] 14[ .
OTR= oxygen transmission rate
OP= oxygenpermeability
WVP=water vapor permeability
WVTR=water vapor transmission rate
استفاده از پوشش های خوراکی به ویژگی های ممانعت در برابر گاز، بخار آب، آروما و روغن وابسته است که به ترکیبات شیمیایی و ساختار پلیمر تشکیل دهنده و ویژگی های محصول و شرایط نگهداری بستگی دارد.
کاهشOTR موجب کاهش اکسیداسیون چربی (رنسیدیتی)، اکسیداسیون میوگلوبین (قهوه ای شدن رنگ)، کاهش تصعید مواد فرار از محصول و جلوگیری از نفوذ مواد فرار از محیط می شود.
در مورد نفوذ پذیری به بخار آب از میان ماتریکس پلیمر فیلم میزانWVP برای فیلمهای خوراکی بستگی به پلاستیسایزر، دما، رطوبت نسبی و ... دارد. میل ترکیب شدن با آب در فیلم ها به ترکیبات هیدروفیلیک موجود در پلیمر نسبت داده شود ]91[.
جییوآگو و همکاران در سال 2009بیان داشتند، در فیلم بر پایه نشاسته نخود با پلاستیسایزر گلیسرول (GPS) با پر کننده اکسید روی به همراه40% کربوکسی متیل سلولز ZnO-CMC))، WVPدر فیلم های کامپوزیت Zno-CMC/GPS با افزایش محتوی Zno-CMCکاهش معنی داری پیدا می کند که نشان دهنده اینموضوع استکهمقاومت دربرابرآب درکامپوزیت بهتراز ماتریکسخالصاست] 45[.
لی و همکاران در سال 2010 نشان دادند کهWVPدر فیلم هایPVC با فزایش مقدار نانو ذرات اکسید روی کاهش قابل توجه ای دارد (05/0 > P)، بنابراین فیلمهای پوشیده شده با نانو ذرات اکسید روی میتوانند مولکول آب بیشتری در سیستم بسته بندی نگه دارند و در نتیجه عمر مفید برخی مواد غذایی مانند میوه ها و سیبزیجات را به تاخیر می اندازد. این محققین بیان کردند که ضعف اصلی فیلم های خوراکیWVTR بالای آنهاست که در این تحقیق مشخص شد که نرخ انتقال رطوبت نسبی و اکسیژن در بسته بندی های نانو کاهش یافت در مقایسه با بسته بندی های طبیعی در نتیجه فیلم های پوشش داده شده با نانو اکسید روی پتانسیل خوبی برای بسته بندی مواد غذایی است ]57[.
طی تحقیقات برودی در سال 2006 نشان داده شد که نانو کامپزیت هایCNTs با PLA تا 200 درصد سرعت انتقال بخار آب را بهتر از PLA خالص افزایش میدهد ]24[.
2-15-2- خواص مکانیکیبه طور معمول، مقاومت مکانیکی فیلم های هیدروکلوئیدی بر اساس سه پارامتر مورد بررسی قرار میگیرد: استحکام کششی (TS) مدول یانگ (Y)و درصد افزایش طول در نقطه شکست (E).قدرت کشش، خواص ازیاد طول،مدول یانگ توسط منحنی استرس–استرین (تنش-کرنش) توسط انجمن مواد و آزمایش آمریکا (ASTM ) تعریف شده است.
خواص مکانیکی فیلمها به نیروهای بین مولکولی زنجیرههای پلیمری سازنده آنها، نسبت ترکیبات سازنده افزودنیهای اضافه شده در شرایط محیطی بستگی دارد ]53[.
مهمترین شاخصهای سنجش خواص مکانیکی عبارتند از:
استحکام کششی(TS)، بیشترین نیرویی که سبب کسیختگی جسم میشود تقسیم بر سطح مقطع جسم را گویند. نشان دهنده قدرت کششی یا فشاری آن جسم است و یا نشان دهنده مقاومت جسم است.
کشیدگی در نقطه شکست (E%)، بیشترین تغییر طول نسیت به طول اولیه را گویند.به عنوان یک خاصیت جسم معرفی می شود که انعطاف پذیری جسم را بررسی میکند. نشان دهنده قدرت کشش پذیری است. (چند درصد طول می تواند کش بیاید ولی پاره نشود)
مدول یانگ (Young’s moduls) نسبت stress به strain در ناحیه خطی است که میزان سختی جسم را بررسی می کند و نشان می دهد که هرچه سختی جسم بیشتر باشد سختی جسم بیشتر است.
ویلهلم و همکاران در سال 2003 نشان دادند که افزودن پر کننده غیر آلی به ماتریکسPS-PVOH سفتی فیلم را افزایش میدهد ] 102[.
لین و همکاران در سال 2009 نانو ذرات اکسید روی را در سه شکل(P-N-W)به پلیمر پلی پروپیلن(PP)اضافه کردند. که نتایج نشان داد ساختار شش ضلعی یا چند وجهیrod اجازه می دهد، استرس به طور موثرتری نسبت به دیگر نانو ذرات ZnO به ماتریکس پلیمری منتقل شود که سبب افزایش قدرت و سفتی کامپوزیت میشود. پر کننده ZnO _ N کمترین میزان کشیدگی(E%)را دارد که بدین علت است که بطور متوسط سایز کریستال کوچکتر است و تمایل دارد به آگلومیریزه شدن (بهم پیوستن) در هنگام مخلوط شدن با پلی پروپیلن دارد، در نتیجه ماتریکس حاصل خواص کششی پایین تری دارد ]60[.
لی و همکارانش (2009) اثرات نانو ذرات ZnO بر خواص مکانیکی پوشش های پلی اورتان را بررسی کرده اند. پوشش های پلی اورتان غنی شده با نانو ذرات ZnOتا 2 درصد وزنی بهبود قابل توجهی در Young’s moduls و استحکام کششی (TS) نشان داده اند. پلی اورتان به دلیل خواص فیزیکی خوب مانند انعطاف پذیری در دمای پایین، استحکام کششی، قابلیت کنترل سختی و شفافیت به طور گسترده ای استفاده می شود اما از معایب آن مقاومت دمایی پایین و دوام مکانیکی پایین آن می باشد. اندازه نانومتر و بویژه سطح تماس زیاد نانو فیلرها واکنش سطح داخلی فیلر و پلیمر را افزایش داده و در نتیجه موجب بهبود خواص پلیمر می شود. آزمایش های متناوب نشان می دهد که نانوفیلر ذرات ZnO استحکام را افزایش می دهد اما تأثیری بر انعطاف پذیری فیلم های کامپوزیتی ندارد. بالا رفتنYoung’s moduls و استحکام کششی ممکن است به دلیل محدودیت نسبی حرکت اجزاء ساختاری زنجیرهPU با افزودن ZnO باشد. صاف کردن نیز می تواند سبب تراکم نانو ذرات ZnO در فیلم خشک شده و منجر به تنزل خاصیت مکانیکی فیلم شود ]56[.
2-16- خواص ضد میکروبیبسته بندیهای فعال ضد میکروبی ساخته شده از نانوکامپوزیت های فلزی نسل جدیدی از بسته بندی با ساختار نانو هستند که از ترکیب مستقیم نانو ذرات فلزی با پلیمر پایه تولید میشوند. در بسته بندیهای فعال، انتشار مواد ضد میکروبی از ماتریکس پلیمری به سطح ماده غذایی به صورت آهسته و در زمان طولانی انجام میشود و در نتیجه برای مدت طولانی غلظت بالایی از ماده ضد میکروبی در سطح فرآورده وجود خواهد داشت. مواد ضد میکروبی از طریق کاهش سرعت رشد و طولانی کردن فاز تأخیری میکروارگانیسم ها و یا غیر فعال کردن و نابودی میکروب ها باعث افزایش ماندگاری فرآورده های غذایی میشوند. در مورد فیلم ها و پوشش های خوراکی انتخاب نوع ماده ضد میکروبی تنها به ترکیبات خوراکی محدود میشود. زیرا از آن جا که این مواد همراه ماده بسته بندی و ماده غذایی مصرف می شوند، خوراکی بودن و ایمنی آنها امری ضروری است. ویژگی هایی که یک ترکیب ضد میکروبی مورد استفاده در بسته بندی های فعال باید داشته باشد عبارتند از:
-مورد تأیید سازمان های نظارت کننده بوده و برای تماس با ماده غذای مجاز باشد.
-قیمت پایینی داشته باشد تا مقرون به صرفه باشد.
-بر طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها مؤثر باشد.

–229

1-3-1-7) عصب گیری بیضه
اعصاب بیضه و اپی دیدیم همراه با شریان بیضه نزول می کنند. این اعصاب از شبکه های کلیوی و آئورتیک مشتق می شوند. الیاف سمپاتیک آن از دهمین و یازدهمین سگمان نخاع سینه ای می باشند. دردهای بیضه در قسمت تحتانی جدار شکم حس می شوند.
1-3-2) مجرای دفران مجرایی است به طول 40 تا 50 سانتی متر که از دم اپی دیدیم شروع می شود. این لوله ابتدا در مجاورت کنار خلفی بیضه، در داخل اپی دیدیم صعود می کند. در مجاورت انتهای فوقانی بیضه، مجرای دفران در قسمت خلفی طناب اسپرماتیک قرار گرفته و در ضخامت آن صعود می کند. همراه با طناب اسپرماتیک از کانال اینگوینال عبور کرده و در سوراخ عمقی اینگوینال، طناب را ترک می کند. سپس شریان اپی گاستریک تحتانی را از خارج دور زده و در جلوی شریان ایلیاک خارجی صعود می کند. پس از آن، بطور مایل بطرف عقب و پایین می آید و بعد از تقاطع با عروق ایلیاک خارجی، وارد لگن کوچک می شود. این مجرا در حالیکه نسبت به شریان مسدود شده ی نافی، عروق و عصب ابتراتور و عروق مثانه ای در داخل قرار گرفته، از بین جدار خارجی لگن و صفاق بطرف عقب می رود. سپس با حالب تقاطع کرده و در سطح خلفی مثانه قرار می گیرد. در سطح خلفی مثانه، در حالی که نسبت به سمینال وزیکول در داخل قرار گرفته نزول می کند و بتدریج در مجاورت مجرای طرف مقابل قرار می گیرد. در قاعده ی پروستات مجرای دفران با مجرای سمینال وزیکول پیوند شده، مجرای انزالی ایجاد می شود. مجرای دفران در خلف مثانه متسع و پیچ دار می شود. این قسمت از مجرای دفران را آمپول می نامند. با توجه به اینکه جدار مجرای دفران ضخیم است و مجرای داخلی آن کوچک می باشد، در هنگام لمس این مجرا به شکل طناب است(حسن زاده، 1391).
1-3-2-1) ساختمان مجرای دفرانمجرای دفران شامل سه طبقه ی مخاطی، عضلانی و همبندی است. مخاط آن دارای چینهای طولی بوده و اپی تلیوم آن از نوع مطبق کاذب است که سلولهای منشوری آن فاقد مژه می باشند. طبقه ی عضلانی ضخیم بوده و از دو لایه طولی داخلی و خارجی تشکیل شد ه است که یک لایه حلقوی در بین آن ها قرار می گیرد.
1-3-2-2) عصب گیریمجرای دفران از شبکه هیپوگاستریک عصب گیری می کند.
1-3-3) مجاری ابرنتیک مجرای باریک و بن بست به نام مجرای ابرنت دمی به قسمت دمی اپی دیدیم یا ابتدای مجرای دفران متصل می شود. این مجرا 5 تا 35 سانتی متر طول دارد و فاقد پیچ و خم است.
یک مجرای ابرنت سری نیز بر روی سر اپی دیدیم دیده می شود که با شبکه بیضه ارتباط دارد. مجاری ابرنت از مجاری مزونفریک مشتق می شوند.
1-3-4) پارادیدیممجموعه ی کوچکی از مجاری پیچ و خم دار است که در جلوی طناب اسپرماتیک در بالای سر اپی دیدیم قرار دارند. این مجاری بقایای مزونفروس هستند.
1-3-5) طناب اسپرماتیکطناب اسپرماتیک از سوراخ عمقی کانال اینگوینال تا بیضه امتداد می یابد. این طناب شامل مجرای دفران، شریان مجرای دفران، عروق و اعصاب بیضه می باشد. عناصر فوق توسط سه لایه احاطه شده اند که این سه لایه در اطراف بیضه نیز قرار می گیرند و عبارتند از: فاسیای اسپرماتیک داخلی، فاسیای کرماستریک و فاسیای اسپرماتیک خارجی. در دوران جنینی، هنگامی که بیضه نزول می کند، از داخل کانال اینگوینال عبور کرده، وارد اسکروتوم می شود. در این مرحله عناصری که همراه بیضه هستند (مجرای دفران، عروق مجرای دفران و بیضه و اعصاب بیضه )، لایه هایی از جدار شکم را با خود به طرف اسکروتوم می برند. فاسیای اسپرماتیک داخلی، یک لایه ی نازک و سست است که از فاسیای عرضی شکم مشتق می شود. فاسیای کرماستریک شامل الیاف عضلانی و مقداری بافت همبند سست است که در امتداد عضله مایل داخل شکم قرار می گیرد. فاسیای اسپرماتیک خارجی یک لایه ی متراکم است که در امتداد نیام عضله ی مایل خارجی شکم می باشد. بنابراین مشخص می شود که در داخل کانال اینگوینال، فاسیای اسپرماتیک خارجی وجود ندارد. طناب اسپرماتیک چپ کمی طویل تر از طناب اسپرماتیک راست می باشد. به همین دلیل بیضه ی چپ پایین تر از بیضه ی راست قرار می گیرد. طناب اسپرماتیک در بین سوراخ سطحی کانال اینگوینال و بیضه از جلوی تندون عضله ی آدوکتورلونگوس عبور می کند. شریان پودندال خارجی سطحی از جلو و شریان پودندال خارجی عمقی از عقب با طناب تقاطع می کنند. عناصری که درون طناب اسپرماتیک قرار دارند، عبارتند از: مجرای دفران، شریان بیضه، شریان مجرای دفران، شریان کرماستریک ( شاخه ای از شریان اپی گاستریک تحتانی)، شبکه ی پیچک مانند و وریدهای بیضه، عروق لنفاوی بیضه، شاخه ی ژنیتال عصب ژنیتوفمورال (L2 ) و اعصاب بیضه. در لابلای عناصر فوق مقداری بافت همبند سست قرار می گیرد .
1-3-6) اسکروتوم یا کیسه بیضهکیسه ای است که در پایین سمفیزیس پوبیس، در بین سطوح قدامی داخلی رانها قرار دارد. بیضه ها، اپی دیدیمها و قسمت های تحتانی طنابهای اسپرماتیک درون این کیسه قرار می گیرند. اسکروتوم از دو نیمه ی راست و چپ تشکیل شده است که توسط یک سجاف پوستی به یکدیگر متصل می شوند. این سجاف پوستی در جلو در سطح تحتانی پنیس ودر عقب در خط میانی پرینه تا مقعد امتداد می یابد و بیانگر مبدأ دو طرفه ی اسکروتوم از برجستگیهای لبیواسکروتال است. اسکروتوم در افراد پیر و در هنگام گرما، صاف و آویزان شده ولی در افراد جوان و در هنگام سرما کوتاه و چین خورده است. لایه های کیسه بیضه عبارتند از: پوست، عضله ی دارتوس، فاسیای اسپرماتیک خارجی، فاسیای کرماستیک و فاسیای اسپرماتیک داخلی. پوست اسکروتوم نازک، قابل کشش وتیره رنگ است. این پوست دارای چین های عرضی است که از سجاف میانی به طرف خارج می روند. عضله ی دارتوس یک لایه ی نازک از الیاف عضلانی صاف است که در امتداد لایه ی سطحی فاسیای سطحی شکم قرار می گیرند. عضله ی دارتوس در تشکیل تیغه ی اسکروتال که دو بیضه را از یکدیگر جدا می کند، شرکت می نماید. اتصال عضله ی دارتوس به پوست بسیار محکم ولی به لایه های زیرین سست است. یک نوار لیفی عضلانی بنام رباط اسکروتال از عضله ی دارتوس به انتهای تحتانی بیضه متصل می شود که در تنظیم درجه حرارت بیضه نقش دارد. فاسیای اسپرماتیک داخلی که فاسیای اینفاندیبولیفورم نیز نامیده می شود به سستی به لایه ی جداری تونیکا واژینالیس متصل م
ی گردد(حسن زاده، 1391).
1-3-6-1) عصب گیری
13 قدامی اسکروتوم از طریق عصب ایلیواینگوینال و شاخه ی ژنیتال عصب ژنیتوفمورال از اولین عصب نخاعی کمری (L1) عصب گیری می کند. 23 خلفی اسکروتوم از طریق شاخه های اسکروتال خلفی عصب پودندال و شاخه های پرینه آل عصب جلدی رانی خلفی از سومین عصب نخاعی خاجی (S3) عصب گیری می کند. عضله ی دارتوس از الیاف سمپاتیک همراه با شاخه های ژنیتال عصب ژنیتوفمورال عصب گیری می کند(حسن زاده، 1391).
1-3-7) سمینال وزیکولهاهر سمینال وزیکول لوله ی بن بستی است که به دور خود پیچ خورده و حالت لوبولی دارد. طول این عضو هرمی شکل 5 سانتی متر است و قاعده اش متوجه بالا، عقب و خارج می باشد. سطح قدامی سمینال وزیکول با قاعده ی مثانه مجاورت دارد و سطح خلفی آن به واسطه ی فاسیای رکتووزیکال ( فاسیای دنون ویلیه) از رکتوم جدا می شود. رأس این عضو در پایین، بصورت یک لوله ی مستقیم است که به آن آمپول مجرای دفران متصل شده و در تشکیل مجرای انزالی شرکت می کند. هر سمینال وزیکول در داخل با آمپول مجرای دفران، در خارج با وریدهای شبکه ی پروستاتیک که به ورید ایلیاک داخلی تخلیه می شوند ودر پایین با پروستات مجاورت دارد(Snell ,2008).
1-3-7-1) ساختمان سمینال وزیکولجدار سمینال وزیکول از سه لایه تشکیل می شود: طبقه ی مخاطی، طبقه عضلانی و طبقه آدوانتیس. مخاط دارای چین های متعدد بوده و اپی تلیوم آن مطبق کاذب یا منشوری ساده است. طبقه ی عضلانی نازکتر از طبقه ی عضلانی مجرای دفران می باشد و از یک لایه طولی خارجی و یک لایه حلقوی داخلی تشکیل شده است. بافت همبند آدوانتیس دارای تعدادی الیاف الاستیک می باشد . 70 درصد مایع منی توسط سمینال وزیکولها ترشح می شود(Snell ,2008).
1-3-7-2) عصب گیری
سمینال وزیکول ها از شبکه های لگنی، عصب گیری می کنند. الیاف سمپاتیک که از اولین گانگلیون کمری خارج می شوند، به عنوان عصب حرکتی عضلات جدار سمینال وزیکولها عمل می کنند و تحریک آنها باعث تخلیه ترشحات این عضو می گردد(Snell ,2008)..
1-3-8) مجرای انزالیهر مجرای انزالی، لوله ای است به طول 2 سانتیمتر که از اتصال مجرای دفران به مجرای سمینال وزیکول ایجاد می شود. این مجرا از قاعده ی پروستات شروع شده، از بین لوب میانی و لوب های راست و چپ پروستات به طرف پایین و جلو آمده و در روی کولیکولوس سمینالیس باز می شود. دو مجرای انزالی در ضخامت پروستات به یکدیگر نزدیک شده و در طرفین اوتریکول پروستاتی به کولیکولوس سمینالیس می رسند(Snell ,2008).
1-3-8-1) ساختمان
مخاط مجاری انزالی مشابه مجاری دفران است ولی این ساختمان فاقد لایه ی عضلانی می باشد. مجرای انزالی از خارج توسط بافت همبند احاطه می شود که با استرومای پروستات یکی می شود(Snell ,2008)..
1-3-9) پروستات
عضوی مخروطی شکل یا مشابه شاه بلوط است که در زیر گردن مثانه قرار گرفته، قاعده آن در بالا و رأس آن در پایین می باشد. این عضو، پیشابراه پروستاتی را در بر می گیرد. پروستات دارای یک سطح قدامی، یک سطح خلفی و دو سطح تحتانی خارجی می باشد. قطر عرضی قاعده ی این عضو تقریباً 4 سانتی وقطر قدامی خلفی آن تقریباً 2 سانتی متر است. ارتفاع پروستات تقریبا ً3 سانتیمتر و. وزن این عضو تقریباً 8 گرم می باشد. قاعده پروستات با گردن مثانه مجاورت داشته و پیشابراه از این سطح وارد پروستات می گردد. رأس این عضو در پایین ترین قسمت قرار گرفته و پیشابراه پروستاتی از جلوی آن خارج می شود. سطح قدامی باریک و محدب است و تقریباً 2 سانتی متر عقب تر از سمفیزیس پوبیس قرار می گیرد. پیشابراه از پایین ترین قسمت این سطح، در مجاورت رأس، خارج می شود. سطح خلفی به طور عرضی مسطح و بطور عمودی محدب است و توسط فاسیای رکتووزیکال (فاسیاید نون ویلیه) از رکتوم جدا می شود. مجاری انزالی درست در زیر مثانه وارد این سطح می شوند. سطوح تحتانی خارجی با بخشهای قدامی عضلات لواتورآنی مجاورت دارند(حسن زاده، 1391)..
1-3-9-1) ساختمان پروستات
پروستات از 30 تا 50 غده ی لوله ای حبابی تشکیل شده است و توسط یک کپسول همبندی سرشار از الیاف عضلانی صاف احاطه می شود. آلوئلهای ترشحی و مجاری بسیار نامنظم هستند و اپی تلیوم آنها از نوع منشوری ساده یا مطبق کاذب است. نزدیک به 30 درصد مایع منی توسط پروستات ترشح می شود که این ترشحات به سینوس های پروستات در پیشابراه پروستاتی می ریزند. غالباً در مجرای پروستات اجسام مدور کوچکی از جنس گلیکوپروتئین دیده می شود که به آنها اجسام آمیلاسه می گویند. با افزایش سن بر تعداد اجسام آمیلاسه افزوده می شود(حسن زاده، 1391)..
1-3-9-2) لوب های پروستاتبطور قراردادی پروستات را به 5 لوب تقسیم می کنند که عبارتند از: لوب قدامی، لوب میانی، لوب خلفی و دو لوب خارجی البته بایستی توجه داشت که مرز کاملاً مشخصی بین این لوبها وجود ندارد. لوب قدامی ناحیه ی کوچکی در جلوی پیشابراه است که از نظر ترشحی اهمیت زیادی ندارد. لوب میانی در اطراف پیشابراه پروستاتی قرار داشته و ممکن است در سنین بالای 50 سال دچار هیپرتروفی خوش خیم گردد. بقیه غده مجموعه ای از لوب های خارجی و خلفی می باشد که برای راحتی بیان تحت عنوان لوب های چپ و راست نامگذاری می گردد. اهمیت لوب های چپ و راست از آن جهت است که بیشترین تغییرات سرطانی در این نواحی مشاهده می شود (حسن زاده، 1391).
1-3-9-3) عصب گیری
عصب گیری این عضو از شبکه ی هیپوگاستریک تحتانی می باشد. الیاف سمپاتیک باعث انقباض الیاف عضلانی و تخلیه غده در هنگام انزال می شوند. الیاف پاراسمپاتیک از اعصاب احشایی لگنی می باشند(حسن زاده، 1391).
1-3-10)غدد بولبواورترالغدد بولبواورترال یا غدد کوپر، یک جفت عضو مدور، کوچک و زرد رنگ هستند که تقریباً یک سانتی متر قطر داشته و در طرفین پیشابراه غشایی قرار می گیرند. این غدد در سنین بالا کوچکتر می شوند. مجرای خروجی هر غده تقریباً 3 سانتی متر طول دارد و در خارج مخاط پیشابراه غشایی بطور مایل بطرف جلو می رود. این مجرا پس از سوراخ کردن فاسیای دیافراگماتیک تحتانی (غشاء پرینه آل ) در کف پیشابراه اسفنجی باز می شود. سوراخ مجرای فوق، 5/2 سانتی متر پایین تر از غشاء پرینه آل قرار می گیرد(حسن زاده، 1391)..
1-3-10-1) ساختمان
غدد بولبواورترال از نوع غدد لوله ای – حبابی با اپی تلیوم مکعبی ساده هستند. در جدار این غدد الیاف عضلانی صاف و مخطط دیده می شود. ترشحات موکوسی غدد بولبواورترال به عنوان نرم کننده ی مجرا عمل می کنند(حسن زاده، 1391)..
1-4) سلول های سری اسپرماتوژنزسلول های سری اسپرماتوژنز، سلول های متفاوتی از بافت پوششی لوله های منی ساز هستند که در 4 تا 8 لایه در کنار یکدیگر قرار گرفته و فضای بین لایه قاعده ای تا مجرای لوله را اشغال می کنند. این سلول ها به ترتیب در برگیرنده چند نسل سلول های اسپرماتوگونی با عنوان گروه A وB روی غشای پایه وسپس یک نسل اسپرماتوسیت اولیه، یک نسل اسپرماتوسیت ثانویه، یک نسل اسپرماتید ویک نسل اسپرماتوزوئید است(Eurell and Frappier, 2006).
1-5) سلولهای پشتیبان یا سرتولیسلول های سرتولی، سلولهای هرمی شکل هستند که قاعده آنها به لایه بازال میچسبد، در حالی که انتهای رأسی آنها معمولاً تا مجرای لوله منی ساز امتداد می یابد. این زوائد به عنوان مجراهایی هستند که سلولهای زایا در مراحل مختلف رشد و تکامل دربین آنها قرار داشته و به سمت مجرا حرکت می کنند. بعد از بلوغ اسپرماتوسیت ها، اتصالات محکم جدیدی بین زوائد سلولهای سرتولی در پشت آنها پدید می آید و اتصالات قدیمی جلوی آنها باز می شود و به این ترتیب بدون درهم ریختن جامعیت سد خونی- بیضوی که توسط سیتوپلاسم سلولهای سرتولی ایجاد شده است، اسپرماتوسیتها از بخش قاعده ای به بخش مجرائی عبور میکند. سیتوپلاسم این سلولها به عنوان فیلتر عمل کرده و تنها به مواد خاصی اجازه عبور می دهند(بیگدلی، 1383). این سد در حفظ سلولهای زایای جنس مذکّر در مقابل مواد مضر موجود در خون دارای اهمیت است. در زیر این اتصالات، اسپرماتوگونی ها در یک محوطه قاعده ای قرار می گیرند و در نتیجه به راحتی به مواد درون خون دسترسی می یابند. هنگام اسپرماتوژنز، سلولهای اسپرماتوسیت لپتوتن نهایی و زیگوتن، از این اتصالات گذشته و در محوطه جنب مجرایی قرار می گیرند. از اینجا به بعد، مراحل پیشرفته تر اسپرماتوژنز به کمک سد خونی- بیضوی از دسترس مواد موجود در خون حفظ می شوند. سلول های سرتولی بوسیله اتصالات شکافدار نیز به هم متصل شده اند که خود سبب ایجاد ارتباط یونی و شیمیایی بین سلولها می شود. چنانچه در انسان و حیوانات دیگر شرایط نامطلوبی مانند عفونت، سوء تغذیه و تشعشع اشعه X به سلول های سرتولی آسیب برساند، باعث اختلال سریع در فرایند اسپرماتوژنز می شود و در صورت مرگ سلولهای سرتولی، نا باروری دائمی رخ خواهد داد (Junqueira , 2005).
سلولهای سرتولی با همکاری سد خونی- بیضوی اعمالی همچون؛ پشتیبانی، حفاظت و تغذیه اسپرماتوزوئیدهای درحال تکامل، فاگوسیتوز در حین اسپرمیوژنز را انجام می دهند. سیتوپلاسم باقیمانده اسپرماتیدها به صورت اجسام باقیمانده از آنها جدا گشته و توسط سلولهای سرتولی فاگوسیته و توسط لیزوزوم آنها تجزیه می گردند، علاوه براین چنانچه ذرات خارجی و باکتریها بدینجا رسیده باشند توسط سلولهای سرتولی بیگانه خواری می شوند (جلوگیری از واکنشهای اتوایمن) ترشح سلولهای سرتولی به طور مداوم مایعی به درون لوله های منی ساز ترشّح می کنند که در جهت مجاری تناسلی جریان یافته و برای حمل اسپرم به کار می رود. با کنترل هورمونFSH، یک پروتئین متصل شونده به آندروژن (ABP) ترشح می کند که مسئول تغلیظ تستوسترون در درون لوله های منی ساز می باشد(رجحان، 1376). سلولهای سرتولی قادر به تبدیل تستوسترون به استرادیول هستند. این سلول ها پپتیدی به نام اینهیبین نیز ترشح می کنند که ساخت و آزاد شدن FSH در بخش قدامی غده هیپوفیز را مهار می کند. همچنین تولید هورمون آنتی مولرین، که یک گلیکوپروتئین است و در دوره جنینی، تحلیل مجاری مولر را در جنین مذکر تحریک می کند (Junqueira, 2005).

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

1-6) اسپرماتوژنزفرآیند تولید اسپرماتوزوئیدها را اسپرماتوژنز می گویند. اسپرماتوژنز در توبول های سمینیفر به طور معمول از ۱۳ سالگی و در نتیجه تحریک هورمون های گنادوتروپیک هیپوفیز قدامی شروع میشود و تا پایان زندگی ادامه مییابد (Guyton and Hall, 2006). تولید اسپرم بطور پیوسته در سرتاسر دوره زندگی تولیدمثلی مرد انجام میشود، تقریبأ ۲۰۰-۱۰۰ میلیون اسپرم روزانه تولید میشود. برای تولید این مقدار انبوه، نیاز است که اسپرماتوگونی ها با تقسیمات سلولی طی چرخه اسپرماتوژنز خود را تجدید کنند (Junqueira, 2005). چرخه اسپرماتوژنز در همه جانوران الگوی یکسان دارد و از سه مرحله مجزا تشکیل میشود:
1-6-1) اسپرماتوسیتوژنزاین فرآیند از یک سلول زایای اولیه (اسپرماتوگونی) که مجاورلایه قاعده ای قرار گرفته است، آغاز میشود. به هنگام بلوغ جنسی، این سلول دستخوش یک سری تقسیم میتوز شده و سلولهایی که تازه تشکیل شدهاند، یکی از این دو راه را انتخاب میکنند: این سلولها ممکن است بعد از یک یا چند تقسیم میتوزی باز به تقسیم ادامه داده و به صورت سلولهای بنیادی تمایز نیافته به نام اسپرماتوگونی نوع A درآیند و یا در حین چرخههای پیش رونده میتوزی به اسپرماتوگونی نوع B تمایز حاصل کنند. اسپرماتوگونی نوع B نیز به نوبت به اسپرماتوسیتهای اولیه تبدیل میشود Junqueira, 2005)).
1-6-2) میوزاسپرماتوسیتهای اولیه، کمی پس از تشکیل در اولین تقسیم میوزی وارد پروفاز میشوند. در این هنگام اسپرماتوسیت دارای ۴۶ کروموزوم وn۴،DNA میباشد. سلول در طی پروفاز یک، از چهار مرحله عبور میکند- لپتوتن، زیگوتن، پاکیتن و دیپلوتن و وارد مرحله دیاکینز میشود که در این مرحله کروموزومها از یکدیگر جدا میشوند. در طی این مراحل از تقسیم میوز، تقاطع ژنهای ۱۶ کروموزومی با یکدیگر صورت میگیرد. پس از آن سلول وارد مرحله متافاز میشود و کروموزومها در مرحله آنافاز به سمت قطبها حرکت میکنند. از آنجائیکه مرحله پروفاز در این تقسیم در حدود ۲۲ روز به طول میانجامد، بیشتر سلولهایی که در مقاطع بافت شناسی مشاهده میشوند، در این مرحله قرار دارند. اسپرماتوسیت های اولیه بزرگترین سلولهای دودمان اسپرماتوژن هستند. از تقسیم اول میوز سلولهای کوچکتری به نام اسپرماتوسیت های ثانویه که تنها دارای ۲۳ کروموزوم (X+۲۲،Y+۲۲) هستند، حاصل میشوند. این کاهش تعداد کروموزوم از ۴۶ به ۲۳ همراه با کاهش مقدار DNA از n۴ به n۲ در هر سلول می باشد. مشاهده اسپرماتوسیتهای ثانویه در برشهای بافتی مشکل است. چون این سلولها دارای عمر کوتاه بوده و مدت زمان بسیار کوتاهی در مرحله اینترفاز باقی مانده (۲ تا ۳ روز) سریعأ وارد دومین مرحله تقسیم میوزی میگردند. از تقسیم اسپرماتوسیتهای ثانویه، اسپرماتیدها به وجود میآیند که دارای ۲۳ کروموزوم هستند. چون مرحله S یعنی مرحله سنتز DNA بین تقسیمات اول و دوم میوزی اسپرماتوسیتها وجود ندارند، لذا مقدار DNA موجود در اسپرماتیدها به نصف مقدار DNA اسپرماتوسیتهای ثانویه تقلیل یافته و شامل n ۱ کروموزوم میشود. بنابراین،فرآیند میوز سبب تشکیل سلولهایی با تعداد کروموزومهای هاپلوئید (n۱) میشود. در هنگام لقاح سلولهای جنسی، این تعداد مجددأ به تعداد دیپلوئید طبیعی میرسد. در واقع فرآیند میوز وجود تعداد ثابتی از کروموزومها را در هرگونه از جانوران تضمین میکند(Junqueira, 2005).
1-6-3) اسپرمیوژنزاسپرماتیدها سلولهایی هستند که در نتیجه تقسیم ثانویه اسپرماتوسیتها به وجود میآیند. این سلولها را میتوان به کمک اندازه کوچک آنها، هسته دارای کروماتین متراکم و قرارگیری در نزدیکی مجرای لوله های منی ساز تشخیص داد. اسپرماتیدها دستخوش یک فرآیند پیچیده تمایز، موسوم به اسپرمیوژنز میشوند که بطور خلاصه شامل مراحل زیر است: تشکیل آکروزوم، متراکم و طویل شدن هسته، تشکیل تاژک و دفع مقدار زیادی از سیتوپلاسم به صورت اجسام باقیمانده نتیجه نهایی این فرآیند تولید اسپرماتوزوئید بالغ است که به واسطه فرآیندی موسوم به اسپرمیاسیون به درون مجرای لولههای منی ساز آزاد میشود. در تقسیم سلولهای اسپرماتوگونیا، عمل سیتوکینزیز غیر کامل است، یعنی سیتوپلاسم آنها از هم جدا نمیشود. حاصل تقسیم یک اسپرماتوگونیا، تعداد زیادی اسپرماتوسیت اولیه، ثانویه و اسپرماتید متصل بهم حاصل می باشد که سیتوپلاسم آنها بوسیله پلی بهم متصل بوده و بصورت سین سی تیوم هستند و بعد از تکامل اسپرماتوزونها، اجسام باقیمانده از آنها جدا شده و هر اسپرم منفردا از زنجیره سین سی تیوم جدا میشود (رجحان، 1376).
1-7) مورفولوژی اسپرماسپرم از لحاظ ساختمانی به دو بخش سر و دم تقسیم میشود. سر اسپرم در بیشتر گونهها از جمله پستانداران عمدتأ به شکل پهن و بیضی شکل است و در جوندگان سر اسپرم داسی شکل می باشند (ضمیری، 1385).
1-7-1) سر اسپرم
ساختار سر اسپرم از دو جزء هسته و آکروزوم تشکیل گشته است:
الف- هسته سر اسپرم واجد کروموزوم هاپلوئیدی است که در هنگام لقاح با هسته n کروموزومی تخمک ادغام گشته و موجب تشکیل تخم 2n کروموزومی میگردد. ویژگیهای هسته اسپرم n کروموزومی بودن و داشتن کروماتین بسیار متراکم و یکنواخت می باشد (Eddy et al, 2004). مهمترین عاملی که باعث این فشردگی شدید شده است، جایگزینی پروتئینهای پروتامین به جای پروتئینهای DNA که هیستونها هستند میباشد. این تراکم و فشردگی باعث محافظت DNA در برابر صدمات فیزیکی و شیمیایی میشود (Knobi and Neills, 2006).
ب- آکروزوم: قسمت قدامی هسته توسط آکروزوم پوشیده شده که واجد دو غشاء داخلی و خارجی است، که این دو غشا در انتهای خلفی به همدیگر متصل میشوند. کلاهک آکروزومی مقادیر متنابهی از آنزیم های هیدرولیتیک و پروتئولیتیک دارد. زمانی که پدیده ظرفیت گیری اسپرماتوزوآ در لوله رحمی صورت می پذیرد، این انزیم ها آزاد شده و برای ایجاد نفوذ پذیری در پرده شفاف اووسیت ها، وارد عمل می شوند. ناحیه خلفی آکروزوم جایی است که کلاهک نازک شده و مواد درون آن متراکم تر می شوند. این ناحیه بخش استوایی آکروزوم اطلاق می شود (Eurell and Frappier, 2006). ازجمله آنزیم های هیدرولیتیک آکروزوم آنزیم هیالورونیداز است که اسپرم توسط این آنزیم اتصالات بین سلول های کومولوس را از بین می برد و خود را به تخمک می رساند. آنزیم مهم دیگر آکروزین است که اسپرم توسط آن زوناپلوسیدا را تجزیه می کند(ضمیری، 1385).
1-7-2) دم اسپرمدم ساختاری تاژک مانند است که موجبات حرکت اسپرم را بوجود آورده و نیروی لازم جهت حرکت اسپرم را نیز فراهم میکند (ضمیری، 1385) و از ۴ قسمت گردن، قطعه میانی- اصلی و انتهایی تشکیل شده است.

تصویر 1-1. ساختمان طبیعی اسپرم انسان (Parsiteb, 2013)1-7-3) اسپرم های غیر طبیعیبین ظاهر طبیعی اسپرم و تحرک آن، رابطه ی مستقیمی وجود دارد. در تمام انزالها، تعدادی اسپرم غیرطبیعی حضور دارد. ارزیابی مورفولوژی اسپرم پس از رنگ آمیزی با ائوزین- نگروزین انجام میگیرد. اسپرمهای غیرطبیعی به ۵ گروه زیر تقسیم میشوند:
الف- بدون دم
ب- سر غیر طبیعی
ج- ساختارهای غیر طبیعی دم
د- ساختارهای غیر طبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پیشین
ه- ساختارهای غیر طبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پسین (Hafez, 2000)

تصویر 2-1 انواع شکل های اسپرم(blogfa, 2013)1-8) سرنوشت و اعمال آندروژن ها1-8-1) آندروژن های داخل بیضه ایتستوسترون حاصل از سلولهای لایدیگ چندین عملکرد و سرنوشت در پیش دارد. به دلیل نزدیکی سلولهای لایدیگ- لوله های سمینیفر مقادیر زیادی از تستوسترون به لوله های سمینیفر انتشار می یابند و در جزء ادولومینال به واسطهABP تغلیط می شوند. سطوح تستوسترون در لوله های سمینیفری در مقایسه با غلظت گردش خون 100 برابر بیشتر است، زیرا برای اسپرماتوژنز طبیعی نیاز مطلق به تستوسترون وجود دارد. سلولهای سرتولی آنزیمی به نام CYP19(آروماتاز) بیان میکنند که مقادیر اندکی تستوسترون را به استروژن بسیار قوی به نام استرادیول 17- بتا تبدیل میکند. سلولهای اسپرم انسان حداقل یک گیرنده استروژن را بیان می کنند (Bern et al, 2010).
1-8-2) تبدیل محیطی استروژندر چندین بافت به ویژه در بافت چربی، تستوسترون به استروژن تبدیل می شود.استروژن محیطی نقشی مهم در بلوغ سازی استخوان و زیست شناسی مردان، پیش برد حساسیت انسولینی، بهبود پروفایل های لیپوپروتئینی(یعنی افزایش HDL، کاهش LDL و تری گلیسرید) و اعمال فیدبک منفی بر گنادوتروپین های هیپوفیز ایفا می کند(Bern et al, 2010).
1-8-3)تبدیل محیطی دی هیدروتستوسترونتستوسترون از طریق آنزیم 5- آلفا- ردوکتاز به آندروژن غیر قابل آرومانیز به نام 5- آلفا- دی هیدروتستوسترون (DHT) تبدیل می شود. دو ایزوفرم برای آنزیم 5-آلفا-ردوکتاز وجود دارد.به نام های 5-آلفا-ردوکتاز نوع 1 و 5-آلفا-ردوکتاز نوع 2. جایگاههای اصلی بیان 5-آلفا-ردوکتاز نوع2 مجرای تناسلی مرد، پوست تناسلی، فولیکول مو وکبد می باشد. 5- آلفا- ردوکتاز نوع 2 هورمون DHT را تولید میکند که برای عضلانی سازی اندام تناسلی خارجی در رحم و برای بروز بسیاری از تغییرات مرتبط با بلوغ از جمله رشد و فعالیت غده پروستات، رشد آلت تناسلی، کدر شدن و چین خوردگی های اسکروتوم، رشد مو در بدن و صورت و افزایش توده عضلانی فرد لازم است. بیان 5-آلفا-ردوکتاز نوع 1 با بلوغ جنسی اتفاق می افتد. این ایزوفرم در پوست بیان شده و در فعالیت غده سباسیوس و بروز آکنه در هنگام بلوغ دخالت دارد (Bern et al, 2010).
1-8-4) اعمال محیطی تستوسترونتستوسترون عملکرد سلولهای سرتولی را تنظیم میکند. این هورمون پیدایش مجرای تناسلی مرد از مجرای مزونفریک را در غیاب آنزیم 5-آلفا-ردوکتاز انجام می دهد.تستوسترون چندین اثر متابولیک شامل افزایش لیپوپروتئین دانسیته پایین LDL را داراست. در مقابل، این هورمون HDL را کاهش می دهد و موجب پیش برد رسوب بافت چربی در ناحیه شکم، افزایش تولید گلبول قرمز خون، پیشروی رشد و سلامت استخوان و اعمال اثر آنابولیک پروتئین در عضله می شود. تستوسترون برای حفظ عملکرد لیبیدو کافی است(Bern et al, 2010).
1-8-5) مکانیسم عمل آندروژنتستوسترون و دی هیدرو تستوسترون از طریق گیرنده آندروژن (AR) عمل میکنند. AR در سیتوپلاسم به صورت متصل به پروتئین های مراقب در غیاب لیگاند قرار دارد. اتصال تستوسترون-AR یا اتصال DHT- AR باعث تفکیک پروتئین های مراقب می شود به دنبال آن کمپلکس AR-آندروژن تشکیل می شود، آنگاه دیمریزاسیون رخ می دهد و در نهایت این مجموعه به هسته می رود و به عنصر پاسخی آندروژن (ARE) متصل می شود و موجب بسیج پروتئین های فعال کننده همراه و فاکتورهای نسخه برداری عمومی برای بسیاری از پروموتورهای خاص ژنی میگردد. این موضوع هنوز ناشناخته باقی مانده است که چگونه تستوسترون و DHT و توانایی آنها برای فعال سازی AR در بین انواع سلول های مختلف تفاوت قائل می شوند، هر چند حضور پروتئین های فعال کننده همراه مختلف احتمالاًًً در انواع سلول های متفاوت درگیر می باشد(Bern et al, 2010).
1-8-6) انتقال و متابولیسم آندروژن هابه مجرد این که تستوسترون وارد گردش خون محیطی می شود، به پروتئین های سرمی متصل می شوند و به سرعت با آنها به تعادل می رسند حدود 60% تستوسترون گردش خونی متصل به گلبولین اتصالی- هورمون جنسی (SHBG)، 38% متصل به آلبومین و حدود 2% به صورت هورمون آزاد هستند. تستوسترون و متابولیت های آن اصولا در ادرار دفع می شوند. تقریبا 50% آندروژن های دفعی به صورت 17- کتواستروئید های ادراری یافت میشوند. بخش اعظم باقیمانده به صورت آندروژن های کونژوگه یا مشتقات دی ال و تری ال هستند. تنهاحدود 30 % سولفات موجود در کبد کونژوگه می شوند و استروئید های کونژوگه در ادرار دفع می شوند(Bern et al, 2010).
1-8-7) محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- بیضهتستوسترون توسط محور اندوکرینی درگیر با نورون های پاروی سلولی هورمون آزاد کننده گنادوتروپین (GnRH) و گنادوتروف های هیپوفیزی که هورمون لوتنینگ (LH)، و محرک فولیکولی (FSH) تولید می کنند تنظیم می شوند(Bern et al, 2010).

تصویر1-3: محور هیپوتالاموسی- هیپوفیزی- بیضه ای (Bern et al, 2010)1-9) بلئومایسین بلئومایسین(N1-[3-(dimethylsulphonio)propyl]bleomycin-amide) آنتی بیوتیکی کموتراپیک است که توسط باکتری Streptomyces Verticillus تولید میگردد (Sánchez et al, 2000). بلئومایسین‌ در درمان‌ سرطان‌ بیضه، سلولهای‌ سنگفرشی‌ سر و گردن‌، گلو، سرویکس‌، پوست و کلیه‌ کاربرد دارد. همچنین‌ این‌ دارو ممکن‌است‌ در افوزیونهای‌ بدخیم‌ پریتونال‌ و پلورال‌ و در درمان‌ لنفوم‌ هوچکینی‌ وغیرهوچکینی‌ موثر باشد(Lewis et al, 2006). این دارو به صورت پودر در ویال های 15و 30 میلی گرمی موجود بوده و به آسانی در آب مقطر به صورت محلول در می آید. بلئومایسین به طرق مختلف؛ عضلانی، داخل وریدی و یا زیر جلدی تزریق می گردد. فرمول مولکولی آن C55H84N17O21S3 • XH2SO4 بوده و وزن مولکولی محاسبه شده 1414 می باشد (Polovich et al, 2005).
1-9-1) تاریخچه و ساختمان شیمیایی بلئومایسینبلئومایسین برای اولین بار در سال 1966 توسط دانشمند ژاپنی به نام Hamao Umezawa کشف شد. وی در طی غربالگری باکتری S. verticillus به خاصیت ضدسرطانی این ماده پی برد . Umezawa در سال1966 اقدام به انتشارکشف خود نمود. Nippon Kayaku اولین فردی بود که در سال 1969 بلئومایسین را مورد استفاده قرار داد. در جولای 1969 تاییده ی FDA به داروی بلئومایسین داده شد و تحت عنوان تجاری Blenoxane توسط Myers در آزمایشگاه بریستول ایالات متحده ساخته و به بازار عرضه گردید. (Umenzawa et al, 1966 ). بلئومایسین خاصیت ضد سرطانی داشته و به صورت آمپولهای 15 واحدی موجود است. مصرف این دارو در دوران حاملگی غیرمجاز است. مگر اینکه در شرایط ویژه و حداقل استفاده گردد بلئومایسین بر روی کروماتین اسپرم و همچنین پروتئین های سر اسپرم تاثیرات قابل توجهی ایجاد میکند. همچنین ممکن است یک تاثیر منفی بر عملکرد باروری ، باروری و همچنین فرزندان افراد تحت درمان داشته باشد(Lambert and Eriksson, 1979).

تصویر 1-4: ساختمان شیمیایی بلئومایسین(Umenzawa et al, 1966 ).1-9-2) مکانیسم اثر بلئومایسین:بلئومایسین‌ آنتی‌بیوتیکی ‌است‌ که‌ اثر خود را هم‌ بر روی‌ سلولهای ‌قابل‌ تقسیم‌ و هم‌ سلولهایی‌ که‌ در حال‌ رشد نیستند، می‌گذارد. مکانیسم‌ احتمالی‌ آن ‌تداخل‌ در فاز2 Gتقسیم‌ سلولی‌ وجلوگیری‌ از رشد سلول‌ سرطانی‌ است‌. در واقع این دارو باعث مهار چرخه سلولی در مرحله 2 Gو سبب قطعه قطعه شدن DNA و تجزیه RNA شده و با پیدایش رادﻳﻜﺎل ﻫﺎی آزاد ﺳـﺒﺐ ﻣـﺮگ و ﺗﺨﺮﻳـﺐ ﺳﻠﻮلﻫﺎی ﺗﻮﻣﻮرال و در ﺣﺎل ﺗﻜﺜﻴﺮ ﻣﻲ ﺷﻮد. (Yamamoto, 2006)

تصویر 1-5: مکانسم عمل بلئومایسین(Nature, 2013)با فعال شدن بلئومایسین، گیرنده های آسیب در دو رشته DNA فعال می شوند، تا کنون همه گیرنده های مستقیم آسیب DNA شناخته نشده اند ولی به احتمال زیاد این سنسورها بسته به نوع آسیب متفاوت هستند. در هر صورت این گیرنده ها سبب فعالسازی انتقال دهنده سیگنال مرکزی(ATM) میشوند.
ATM یک شبه فسفوتیدیل اینوزیتول 3 کیناز می باشد که چندین پروتئین درون سلولی را فسفریله میکند. به طور مثال با فسفریله نمودن NBS1 در کمپلکس نوکلئاز NBS1- MRE11- RAD50 سبب فعالسازی آن شده که در نتیجه انتهاهای تک رشته ای مورد نیاز در مسیر ترمیم نوترکیبی همولوگ تولید می شوند. علاوه بر این ATM با فعالسازی CHK2 که یک عامل کلیدی در تنظیم چرخه سلولی است سبب فعال شدن P53 میشود. P53 یک سرکوب کننده تومور و جز اصلی توقف چرخه سلولی و آپوپتوز می باشد. توقف چرخه سلولی قبل و یا در حین فرایند میتوز در پاسخ به آسیب دورشته ای DNA منجر به مرگ سلول میتوزی و شکست هسته ای و زیر واحدهای کاتالیزی DNA پروتئین کیناز میشود.
1-9-3) کاربردهای بالینی
در طی 50 سال اخیر به منظور پیشگیری از بیماری هایی همچون سرطان از روشهای شیمی درمانی بهره گرفته میشود. دراین روش داروهایی مورد استفاده قرار میگیرند که رشد سلول های سرطانی را متوقف یا آهسته نمایند. شیمی درمانی با تأثیر روی توانایی سلول هایی که رشد بالایی دارند (مثل سلول های سرطانی) مانع از تقسیم یا تولید آن ها می گردد. گرچه مصرف این داروها باعث بقای عمر بیمار و بهبودی بیماری میگردد اما همراه با عوارض جانبی خطرناکی همراه است. این عوارض میتوانند عملکرد طبیعی بدن را دستخوش تغییرات ناخوشایندی نماید. بلئومایسین، دارویی است که بطور گسترده در درمان سرطان بیضه و نئوپلاسم بدخیم در دوران نوجوانی و جوانی استفاده میگردد. تجویز همزمان بلئومایسین، اتوپوزید و سیس پلاتین (BEP) عمر مبتلایان به این سرطان را تا 5 سال افزایش میدهد(Robinson et al, 2007).
1-9-4) عوارض جانبی 
بلئومایسین
بر روی کروماتین اسپرم، پروتئین های سر اسپرم، عملکرد باروری ، باروری و همچنین فرزندان متولد شده افراد تحت درمان تاثیرات نامطلوب قابل توجهی ایجاد نماید(Lambert and Eriksson ,1979). با مصرف طولانی مدت بلئومایسین ایدیوسنکرازی و سمیت ریوی بروز می‎‏نماید. مهمترین عارضه این دارو، ایجاد سوختگی و زخم در محل تزریق است. سندرم رینود نیز در بعضی موارد دیده می‏شود. از دیگر عوارض این دارو میتوان به ایجاد دانه های پوستی، راش، تب و لرز، آثار پوستی بر روی لثه و زبان و فیبروز ریه بویژه در افراد سالمند، خستگی، ریزش مو، حالت تهوع و استفراغ، آسیب به کلیه، آسیب به اعصاب، آسیب به عروق خونیِ قلب ، افزایش احتمال بیماری قلبی عروقی، آسیب ریوی و بروز سرطان ثانویه در جایی جدید، مثل خون (لوکمی)، ریه، رودۀ بزرگ، پانکراس، مثانه، معده یا سایر ارگان ها اشاره نمود (Amato et al, 2004).
1-10) استرس اکسیداتیودر حقیقت استرس اکسیداتیو همان پیروزی رادیکال های آزاد بر دفاع آنتی اکسیدانی بدن موجود زنده می باشد و به نوعی به حمله های بیولوژیک علیه ارگانیزم بدن اطلاق می شود. رادیکال های اکسیژن بطور مداوم در همه ارگانیزم های زنده تولید می شوند و با اثرات مخرب خود، منجر به آسیب سلولی و مرگ می گردند. تولید گونه های اکسیدان در شرایط فیزیولوزیک دارای سرعت کنترل شده ای است اما این تولید در شرایط اکسیداتیو افزایش می یابد. قرار گرفتن در معرض سیستم های بیولوژیک در مقابل زنوبیوتیک ها و یا ایجاد شرایط پاتولوژیک منجر به استرس اکسیداتیو ودرنتیجه افزایش تولید اکسی رادیکال ها می شود(Aitken, 1994; Warren et al, 1987 ).
1-10-1) گونه های فعال اکسیژن(ROS):(ROS) شامل ملکولهای بسیار فعال واجد اکسیژن از جمله رادیکال های آزاد میباشد((Warren et al, 1987. رادیکال هیدروکسیل، رادیکال آنیون سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، اکسیژن تک، رادیکال NO ،رادیکال هیپوکلریت ولیپید پراکسید های مختلف (Aitken et al, 1994) از جمله گونه های فعال اکسیژن هستند. همه این عوامل قادرند با لیپید های غشا، اسید نوکلئیک پروتئین ها ، آنزیم ها و سایر ملکولهای کوچک واکنش داده ومنجر به آسیب سلولی شوند.
1-10-2) پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر:گونه های اکسیژن فعال (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H2O2)، آنیون سوپر اکسید (O2-U)، مولکول و یا رادیکال هیدروکسیل (UOH) برهر دو گامت نر و ماده تاثیر می گذارند(Agarwal et al, 2008). ROS تولید شده توسط اسپرم نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیک مانند ظرفیت یابی اسپرم، واکنش آکروزومی، همجوشی با تخمک و ثبات کپسول میتوکندری در اواسط قطعه بازی می کند(Aitken et al, 2007; Agarwal et al, 2008(a); de Lamirande et al, 2008). تولید (ROS) در دستگاه تولید مثلی نر به دلیل اثرات توکسیک شدید آنها بر روی کیفیت و عملکرد اسپرم، به موضوعی حائز اهمیت در آندرولوژی تبدیل شده است (Saleh and Agarwal, 2002). مطالعات صورت گرفته نشان داده اند که 45 - 25% مردان نابارور دارای سطوح بالایی از ROS در نمونه های مایع منی خود بودها ند (Agarwal et al., 2004). اما با این وجود باید خاطر نشان کرد که وجود مقادیر اندک ROS برای اسپرم جهت لقاح، واکنش آکروزومی، تحرک و ظرفیت یابی لازم است (Agarwal et al.,2004). واژه استرس اکسیداتیو زمانی به کار میرود که میزان اکسیدانتها از آنتی اکسیدانت ها پیشی بگیرد (Sies , 1993). در واقع این رویداد بیانگر نوعی عدم تعادل بین توالی ROS و مکانیسمهای مهاری آن است (Sikka, 2001). اسپرمها حساسیت ویژهای نسبت به آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو دارند چرا که غشای پلاسمای آنها دارای مقادیر بالایی اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (PUFAs) بوده و در سیتوپلاسم آنها میزان اندکی آنزیم مهاری وجود دارد (Sharma and Agarwal, 1996). علاوه بر این، آنزیم های آنتی اکسیدانت داخل سلولی قادر به محافظت از غشای پلاسمایی احاطه کننده آکروزوم و دم اسپرم نیستند، از این روی اسپرمها جهت تقویت سیستم دفاع آنتیاکسیدانتی داخلی محدود خود از مکانیسمهای دفاعی پلاسمایی منی بهره می جویند (Zini et al, 1993). مطالعات متعدد نشان داده اند که از میان انواع سلول های مختلف موجود در مایع منی، اسپرم های غیرطبیعی و نابالغ و لکوسیتها منابع اصلی تولیدROS را تشکیل میدهند
(Aitken and West, 1990; Kessopolou et al, 1992; Garrido et al, 2004).

تصویر 1-6: پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر(Clevelandclinic, 2013)بررسیها نشان داده است که بین کیفیت پایین اسپرم و افزایش تولید ROS ارتباط مستقیمی وجود دارد. در واقع بقایای سیتوپلاسمی اسپرم، حلقه گمشده ارتباطی بین این دو فرایند میباشند (Gomez et al, 1998). در مواردی که اسپرماتوژنز دچار اختلال می شود، مکانیسم های بیرون راندن سیتوپلاسم دچار نقص شده و اسپرم به همراه بقایای سیتوپلاسمی از اپیتلیوم زایا جدا میشود. اسپرمی که تحت این شرایط آزاد میشود، نابالغ بوده و دارای نقص عملکردی میباشد (Huszar et al, 1997). باقی ماندن این قطرات سیتوپلاسمی در اسپرم وابستگی مستقیمی با تولید ROS از طریق مکانیسم هایی دارد که به نظر میرسد به واسطه آنزیم سیتوزولی گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز صورت می گیرد (Aitken, 1999). از سوی دیگر، اسپرمها به سبب نیاز مداوم به انرژی جهت حرکت، دارای میتوکندریهای فراوانی میباشند. از این روی، اختلال در عملکرد میتوکندریها میتواند به افزایش تولید ROS منجر گردد که این امر به نوبه خود مجدداً میتوکندریها را تحت تأثیر قرار میدهد، چرا که ROS موجب آسیب غشای میتوکندریها شده و این غشاهای آسیب دیده موجبات افزایش میزان ROS را فراهم میآورند (Evenson et al, 1982).
از سوی دیگر، کاهش کیفیت اسپرم و نیز نقص عملکردی آنها با افزایش میزان لکوسیتها در مایع منی در ارتباط است. لکوسیتهای پراکسیداز مثبت که یکی از منابع اصلی تولید ROS در مایع منی محسوب میگردند، لکوسیتهای هستند که هسته چند شکلی دارند و 60-50% لکوسیتهای مایع منی را تشکیل می دهند. غده پروستات و کیسههای منی منابع اصلی این لکوسیتهای پراکسیداز مثبت میباشند (Wolff, 1995). لکوسیتها در پاسخ به محرکهای مختلفی نظیر عفونت و آماس، فعال شده و این لکوسیتهای فعال قادر خواهند بود 100 برابر لکوسیتهای غیر فعال ROS تولید نمایند (Plante et al, 1994). این مکانیسم به واسطه افزایش تولید NADPH از مسیر هگزوز منو فسفات صورت میپذیرد که فعال سازی سیستم میلو پراکسیداز لکوسیتهای دارای هسته چند شکلی و ماکروفاژ را در پی داشته، نهایتاً به انفجار تنفسی و تولید مقادیر بالای ROS میانجامد. بنابراین، افزایش غیرطبیعی میزان لکوسیتهای مایع منی و یا جداسازی اسپرم از پلاسمای منی جهت انجام کارهای آزمایشگاهی، میتواند به آسیب دیدن اسپرمها توسط ROS تولیدی لکوسیتها منجر گردد (Shekarriz et al, 1995).
تمامی ترکیبات سلولی نظیر لیپیدها، پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و قندها، اهداف بالقوه استرس اکسیداتیو میباشند. میزان آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو به ماهیت و میزان ROS ، مدت زمان قرار گرفتن در معرض ROS و فاکتورهای خارج سلولی مانند دما و اجزاء محیط ( یونها، پروتئین ها و آنتی اکسیدانت ها ) بستگی دارد(Makker et al, 2009). ROS به اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (PUFAs) که در غشاء سلولی حضور دارند حمله کرده و مجموعهای از واکنش های شیمیایی را که در مجموع پراکسیداسیون لیپیدی نامیده میشود، موجب میگردد (Aitken, 1995; Kodama et al, 1996).
این فرآیند با واکنش رادیکالهای آزاد با زنجیره های اسیدچرب و آزادسازی رادیکالهای آزاد لیپیدی آغاز میگردد. این رادیکالهای آزاد لیپیدی متعاقباً با اکسیژن مولکولی وارد واکنش شده و رادیکالهای پروکسیل لیپیدی را شکل میدهند. رادیکالهای پروکسیل نیز میتوانند با اسیدهای چرب واکنش داده ، رادیکالهای آزاد لیپیدی تولید کنند که این امر موجب تداوم چرخه واکنشها میگردد (Alvares and Storey, 1995). یکی از محصولات جانبی پراکسیداسیون لیپیدی، مالون دی آلدئید میباشد. این محصول جانبی در ارزیابیهای بیوشیمیایی متعددی جهت برآورد میزان آسیب پراکسیداتیو کاربرد دارد (Aitken et al, 1995).
1-11) آنتی اکسیدانت ها و نقش حفاظتی آنها در برابر استرس اکسیداتیو:خوشبختانه تولید رادیکالهای آزاد بوسیله آنتی اکسیدانت ها کنترل می شود. هنگامی که دسترسی به آنتی اکسیدانت ها محدود شود آسیب افزایش یافته و بدن ناتوان میگردد. آنتی اکسیدانت ها قادرند عوامل اکسیدان را قبل از حمله به سلولها پایدار ،غیر فعال ویا بلع کنند. بنابراین آنتی اکسیدانت ها برای نگهداری بدن در حالت سلامت وبهبودی کاملا ضروری هستند. عملکرد آنتی اکسیدانت ها شامل ظرفیت بلع رادیکال های آزاد ،ممانعت از پراکسیداسیون لیپید ها، توانایی غیر فعال نمودن یونهای فلزی وظرفیت احیا کنندگی آنهاست (Jha et al, 1995). به طورکلی آنتی اکسیدانت ها از نظر شکل، خصوصیات فیزیکی وشیمیایی وجایگاه عملشان با هم فرق دارند.
1-آنتی اکسیدانت های آنزیمی: آنزیم هایی هستند نظیر گلوتاتیون احیا، SOD ، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز.این عوامل، تولید گونه های فعال اکسیژن را بوسیله حذف ظرفیت اکسیدانی یا تغییر شکل آنها (ROS&RNS)به اجزا پایدار تقلیل می دهند( Davies, 1995).
2-ساختارهای با وزن ملکولی بالا (پروتئین ها) شامل آلبومین ، سرولوپلاسمین، ترانسفرین، هاپتوگلوبولین که با جایگاه فعال فلزات باند میشوند وتولید فلزات کاتالیز کننده رادیکالهای آزاد را محدود می کنند(Chaudiere et al, 1999)..
3-ساختارهای با وزن ملکولی پائین، شامل دو دسته آنتی اکسیدانت های محلول در چربی (توکوفرول، کاروتنوئید، کوئینین و برخی پلی فنل ها) و آنتی اکسیدانت های محلول در آب (اسکوربیک اسید، اسید اوریک وبرخی پلی فنل ها). (Chaudiere et al, 1999)
4-مینرال ها (سلنیوم، منگنز، مس و روی) آنتی اکسیدانت های همه کاره (Chaudiere et al, 1999)
5-ویتامین ها.(Jha et al, 1995)
6-آنتی اکسیدانت های گیاهی(Jha et al, 1995)
1-11-1) سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در بدن
مطالعات نشان داده اند که آنتی اکسیدانت ها دارای اثرات گسترده ای در آندرولوژی بوده و قادرند از اسپرم ها در برابر ناهنجاری های ناشی از ROS محافظت نمایند. این ترکیبات همچنین موجب مهار ROS تولید شده توسط لکوسیت ها و بهبود کیفیت مایع منی شده و از قطعه قطعه شدن DNA و بلوغ نا بهنگام اسپرم ها جلوگیری می کنند. سه سیستم آنتی اکسیدانتی متفاوت و وابسته به هم که نقش کلیدی در کاهش استرس اکسیداتیو در جنس نر ایفا می کنند عبارتند از: آنتی اکسیدانت های رژیم غذایی، آنتی اکسیدانت های اندروژن و پروتئین های غیرفعال کننده یون های فلزی ( Hughes et al, 1998; Agarwal et al, 2004).
آنتی اکسیدانتهای موجود در پلاسمای منی و اسپرم در گروه آنتی اکسیدانتهای اندروژن قرار میگیرند. پلاسمای منی دارای سه آنتی اکسیدانت آنزیمی اصلی سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز/گلوتاتیون ردوکتاز (GPX/GRD) در کنار طیف وسیعی از آنتی اکسیدانتهای غیرآنزیمی مانند آسکوربات، اورات، ویتامینE، ویتامین A، پیروات، گلوتاتیون، آلبومین، یوبی کوئیتول، تائورین و هایپوتائورین میباشد. اسپرمها علاوه بر SOD که عمده ترین آنتی اکسیدانت موجود در آنها را تشکیل میدهد، دارای آنتی اکسیدانتهای آنزیمی اولیه نیز میباشند. آنتی اکسیدانت های رژیم غذایی غالباً به شکل ویتامین C، ویتامین E، بتاکاروتنها، کاروتنوئیدها و فلاونوئیدها میباشند. پروتئین های غیرفعال کننده یونهای فلزی نظیر آلبومین، سرولوپلاسمین، متالوتیونئین، ترانسفرین، فریتین و میوگلوبولین ، به واسطه غیرفعال کردن انتقال یونهای فلزی که تولید رادیکالهای آزاد را کاتالیز میکنند، عمل میکنند (Sies, 1993; Tarin et al, 1998; Greco et al, 2005a) این ترکیبات همچنین پراکسیداسیون لیپیدی غشاء پلاسمایی اسپرم را کنترل می کنند و موجب حفظ یکپارچگی آن میگردند (Wroblewski et al, 2003).
بررسیهای آزمایشگاهی صورت گرفته نیز نقش آنتیاکسیدانتها را در کاهش تولید ROS توسط اسپرم و بهبود توانایی تکاملی جنین مورد تأیید قرار داده است (Ta--oto et al, 2001; Ali et al, 2003; Esfandiari et al, 2005). در همین راستا ، گزارشات دیگری نیز بر نقش آنتی اکسیدانتها در کاهش آسیب DNA و آپوپتوز در اسپرمها و نیز افزایش میزان بارداری و لانه گزینی بالینی صحهگذاردهاند (Hughes et al, 1998; Greco et al, 2005b). از این روی با توجه به کاربرد روز افزون تکنیک های آزمایشگاهی نظیرIVF، ارزیابی سطوح ROS و وضعیت استرس اکسیداتیو در نمونههای اسپرم پیش از IVF و نیز استفاده از آنتی اکسیدانتهای مؤثر و کارا میتوانند ما را به نتایج بهینه رهنمون سازد . همچنان که تحقیقات صورت گرفته نشان داده است که این ترکیبات قادرند اثرات سمی پراکسید هیدروژن بر روی جنین را به نحو مطلوبی کاهش دهند (Zhang et al, 2005).

–256

1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن 34
1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم 34
1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت 35
1-10-الایزا (ELISA) 35
1-10-1- الایزای مستقیم 36
1-10-2- الایزای غیر مستقیم 36
1-10-3- الایزای ساندویچ 37
1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم 37
1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم 37
1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری 37
1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ 38
1-12-تولید پروتئین نوترکیب 39
1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی 39
1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین
اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت 40
1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس 42
1-16-درمان 44
1-17-پیشگیری 47
1-18- بیان مسئله و اهمیت آن 48
1-19- دلایل انتخاب موضوع 50
1-20-اهداف و فرضیا ت 51
فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته
2-1- مروری بر تحقیقات گذشته 53
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59
3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59
3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7) و
rGRA6(PUET-GRA6 60
3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده 62
3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62
3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات 66
3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده 71
3-4- تعیین غلظت پروتئین 71
3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) 71
3-5-1- طراحی سیستم های الایزا 72
3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا 72
3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا 74
3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن
توکسوپلاسموز با روش الایزا 76
3-6-1-برقراری شرایط الایزا 76
3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا 76
3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم 77
3-8-تعیین Cut off در روش الایزا 80
3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun 81
3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun 82
3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG 82
3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و
PUET-GRA6 83
3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN 83
3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen 85
3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index 88
3-16- کنترل کیفی 88
3-16-1- حساسیت 88
3-17-طراحی تحقیق 88
3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری 89
3-18-1- تعداد نمونه 89
3-18-2- روش نمونه گیری 89
فصل چهارم: نتایج آزمایشات
4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6
(PUET-GRA6 92
4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات 93
4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94
4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای
ایرانی با کیت Euroimmun... 95
4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95
4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها
با کیت Euroimmun 96
4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب 100
4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز
عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار 103
4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز
عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران 103
4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت
Euroimmun با استفاده از کیت Microgen 104
فصل پنجم:بحث، پیشنهادات
منابع 121
خلاصه انگلیسی 127
ضمائم 129
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن 87
جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon 97
جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های
GRA6 وGRA7 106
جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7
بر روی سرم های زنان باردار ............................................................................................................... 108
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1- شکل شماتیک یک تاکی زوایت و یک برادی زوایت توکسوپلاسما گوندی 4
شکل1-2- عکس میکروسکوپ الکترونی یک تاکی زوایت، سوش VEGکه در حال
نفوذ به یک نوتروفیل صفاق موش می باشد 7
شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم
اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش 8
شکل1-4- یک کیست بافتی توکسوپلاسما که حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد 9
شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط 16
شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی 25
شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا............................................................................................... 38
شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن............................................................................... 87
شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی 92
شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی 93
شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7
تخلیص شده باروش وسترن بلات 94
شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101
شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101
شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102
شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102
شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای 105
شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن106
شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق
عفونت حاد و مزمن و تحت حاد............................................................................................................... 107
Abbreviations:
AC- Affinity chromatography
ADCC – Antibody – Dependent Cell – Mediated Cytotoxicity
AIDS – acquired immunodeficiency syndrome
APS – Ammonium persulfate
BAG – b--yzoite antigen
BCA – bicinchoninic acid assay
BSA – bovine serum albumin
CSF – Cerebrospinal fluid
CD – cluster of differentiation
DAB – Diamino benzidine
DNA – Deoxyiribonucleic acid
EDTA – Ethylenediaminetraacetic acid
ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay
EI – Enzyme immunoassay
FPLC – Fast protein liquid chromatography
FSH – Follicle – stimulating hormone
FDA – Food and drug Administration
GRA – granule antigen
GST – glutathione S-transferase
HCG – Human chorionic gonadotropin
HIS-TAG – histidine-tag
IEC – Ion-exchange chromatography
IMAC – immobilized – metal affinity chromatography
IPTG – Isoproyl –B-D-thio-galactoside
Ig – immunoglobulin
IFN- Interferon
IL – interleukin
LH- Luteinnizing hormone
MBP – Maltose Binding Protein
MAG – Matrix antigen
MIC – Microneme
NI-NTA – Nikel nitrilotriacetic acid
OD – Optical density
OPD – o – phenylenediaminedihydrochloride
PBS – Phosphate – bufferedsaline
PSA- Prostate – specific antigen
PV – Parasitophorus vacuole
PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis
PCR – Polymerase chain reaction
RAI – Relative avidity index
ROP – Rhoptry protein
RNA – Ribonucleid acid
SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SAG – surface antigen
TBS – Tris buffered Saline
TEMED – Tetramethylenediamine
TMB – Tetra Methyl Benzidine
Th – T –helper
TRX – Thioredoxin
TSH – Thriod – Stimulating hormone
TNF – Tumor necrosis factor
چکیده فارسی
توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توکسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد ترکیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند. شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئین GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهایت ،کارایی روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما که حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست های استاندارد سرولوژیک برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.
کلمات کلیدی : توکسوپلاسما،گوندی ،آویدیته الایزا ، GRA7 ،GRA6

مقدمه
تاریخچه و طبقه بندی
انگل توکسوپلاسما گوندی، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.این انگل با گسترش جهانی، قادر به تکثیر در بسیاری از میزبان های مهره دار از جمله انسان است. این ارگانیسم در سال 1908 توسط نیکول و مانسو در یک جونده کوچک به نام کتنوداکتیلوس گوندی در انستیتو پاستور تونس و تقریباً به طور همزمان توسط اسپلندور در برزیل در یک خرگوش آزمایشگاهی کشف شد. ابتدا تصور می شد این ارگانیسم گونه ای از جنس لیشمانیا است ولی یک سال بعد، پس از مطالعات بیشتر آن را به عنوان یک ارگانیسم متفاوت شناختند و نام جنس جدید توکسوپلاسما را برای آن پیشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توکسوپلاسما گوندی عوارض متعددی در انسان بوجود می آورد ولی 15 سال بعد از کشف آن بود که انگل از اتوپسی چشم یک کودک مبتلا به هیدروسفالی جدا شد)3و4(. شیوع توکسوپلاسموزیس تا قبل از ابداع روش تشخیص سرولوژیکی تست رنگی به وسیله سابین و فلدمن در 1948 )5(، به طور دقیق مورد ارزیابی قرار نگرفت. فرنکل در سال 1970 چرخه زندگی را به طور کامل شناسایی و معرفی کرد )1(. موقعیت تاکسونومیک توکسوپلاسما گوندی بر اساس خصوصیات شکل شناسی و چرخه انگلی آن به وسیله ملهورن در سال 1988 به صورت زیر تعریف شده است.
Kingdom: Protozoa
Phylum: Apicomplexa
Class: Sporozoea
Sub-class: Coccidia
Super- order: Eucoccidea
Order: Eucoccidida
Sub- order: Eimeriina
Family: Eimeriidae
Genus: Toxoplasma
Species: gondii
مورفولوژی و ساختار انگل
توکسوپلاسما از دو کلمه توکسون به معنای کمان یا قوس و پلاسما به معنای سلول مشتق شده است، زیرا ارگانیسم شکل هلالی یا قوسی دارد. انگل دارای سه شکل در چرخه زندگی می باشد:
1-تاکی زوایت 2-برادی زوایت 3-اسپوروزوایت
33718534798000هر سه شکل انگل می توانند میزبان نهایی و واسطه را آلوده سازند )7(. ولی نقش بیولوژیک این سه شکل متفاوت است.
شکل 1-1- شکل شماتیک یک تا کی زوایت (چپ) و یک برادی زوایت (راست) توکسوپلاسما گوندی )8(
تاکی زوایت (اندودیوزوایت)
تاکی زوایت شکل آزاد انگل و مربوط به مرحله تکثیر سریع آن است که قوسی شکل، به طول 4-8 وعرض2-4 میکرومتر می باشد. در عکس های حاصل از میکروسکوپ الکترونی سیستم پیچیده ای از اندامک ها شامل غشاء نازک پوشش خارجی، حلقه قطبی، یک مخروط تقریباً تو خالی و بدون رأس به نام کونوئید در انتهای نوک تیز (قدامی)، روپتری ها، میکرونم ها، میتوکندری ها، میکروتوبول های زیر غشایی، رتیکولوم آندوپلاسمی صاف و خشن، دستگاه گلژی، ریبوزومها، یک ارگانل شبیه پلاستید به نام آپیکوپلاست و میکروپور و هسته کاملاً مشخص را مشاهده کرد. )4( (شکل1-1). معمولاً هسته در جهت انتهای خلفی یا در ناحیه مرکزی سلول قرار گرفته است. کروماتین به طور انبوه در تمامی هسته پخش شده و معمولاً هستک در مرکز هسته جا دارد. کروموزوم ها طی میتوز متراکم نمی شوند، بنابراین، تعداد کروموزوم ها که 11 عدد می باشد ، اولین بار با استفاده از PFGE شناسایی شده است )9(. در مقاطع هیستولوژی تاکی زوایت ها اغلب تخم مرغی شکل می باشند )1(. تاکی زوایت ها به شرایط محیطی خیلی حساسند و معمولاً در خارج بدن میزبان سریعاً از بین می روند )6(. تاکی زوایت با هجوم فعالانه به غشاء سلول میزبان و یا به وسیله فاگوسیتوز وارد سلول میزبان می گردد. ابتدا انتهای کونوئید نفوذ نموده ، کونوئید به طرف جلو فرورفته و غشاء روپتری با غشاء واحد در انتهای خلفی توکسوپلاسما گوندی در آمیخته، و سوراخی را تشکیل داده که از طریق آن ترشحات روپتری آزاد می گردد. احتمالاً محتویات روپتری ها غشای پلاسمائی سلول میزبان را در اطراف انتهای قدامی توکسو پلاسما گوندی حل می نماید. زمانی که توکسوپلاسما گوندی وارد سلول میزبان می شود، غشای پلاسمائی پاره شده و گروهی از حفرات ریز یا وزیکول ها (احتمالاً ترشحات روپتری) در نواحی مجاور سیتوپلاسم دیده می شود. غشاء سلول میزبان تنها در انتهای قدامی توکسوپلاسما گوندی پاره می شود. در طی 15 ثانیه انگل در ماکروفاژ دیده شده، و دخول آن به وسیله فاگوسیتوز 120 ثانیه به طول می انجامد. به فاصله کوتاهی پس از نفوذ ، توکسوپلاسما گوندی به وسیله حفره یا واکوئل حامل انگل (PV) از سلول میزبان مجزا می شود. به نظر می رسد PV به طور دو جانبه از انگل و میزبان مشتق شده باشد )8(. تاکی زوایت به طریق غیر جنسی به وسیله آندودیوژنی مکرر در درون سلول میزبان تکثیرمی یابد (شکل1-3). آندودیوژنی شکل اختصاصی تقسیم بوده که در خلال آن دو سلول دختر تشکیل شده و سلول مادری تحلیل می رود. تقسیم تاکی زوایت ها به طریق آندودیوژنی تا پر شدن سلول میزبان از انگل ها ادامه می یابد. سلول های میزبان که حاوی تاکی زوایت های متعدد هستند، کلون ها، کلنی های نهایی یا پزودوسیست (کیست کاذب) نامیده می شوند. ندرتاً انگل های یک گروه به طور همزمان تقسیم شده، به طوری که معمولاًسلول های پروژنی به طور تصادفی یا بی قاعده مرتب می شوند. با این وجود، گاهی ممکن است تقسیم همزمان پروژنی انجام شده و توده رُز مانند تشکیل گردد. گروهی از تاکی زوایت هایی که به وسیله یک PV احاطه شده، کلون نامیده می شوند ) 8و4( . تاکی زوایت های توکسوپلاسما فاقد اندامهای حرکتی مانند تاژک ، مژه یا پای کاذب بوده و حرکت ارگانیسم با تا شدن بدن یا لغزیدن تواءم با چرخش در حول محور طولی بدن ، انقباض یا موج دار شدن انجام می گیرد(8و10). در مراحل اولیه عفونت توکسوپلاسمایی یا مرحله حاد بیماری ممکن است گروههایی از تاکی زوایت های در حال تکثیر در سیتوپلاسم سلولهای انواع بافتها مشاهده گردند که به مجموعه تاکی زوایت های داخل سلول میزبان کیست کاذب یا کلنی نهایی یا تجمعات انتهایی اطلاق می شود(8و10).این کلنی های تاکی زوایتی را می توان بر اساس تفاوت در رنگ پذیری از ارگانیسم های موجود در کیستهای حقیقی توکسوپلاسما متمایز نمود. شکل تاکی زوایت انگل در مرحله حاد عفونت دیده می شود و می تواند تمام سلولهای نسوج پستانداران را مورد حمله قرار دهد . پس از حمله ، انگل هر 4 تا 6 ساعت یک بار تکثیر می یابد و تجمعات شبیه به به آرایش گل تشکیل می دهد و سر انجام در هر سلول آلوده 16-8 و در مواردی تعداد بیشتری تاکی زوایت تجمع می یابد. سر انجام سلول با تعداد 64 تا 124 انگل پر شده و سپس سیتوپلاسم انباشته از تاکی زوایت سلول پاره می شود و ارگانیسم های آزاد شده به سلولهای مجاور حمله می کنند و در آنها به شیوه اندودیوژنی تکثیر می یابند(11).همچنین تاکی زوایت های آزاد شده از طریق جریان خون به بافت های متعددی از جمله سیستم اعصاب مرکزی ، چشم ،عضلات اسکلتی و قلبی راه یافته و سلولهای بافتی را آلوده می کنند. تکثیر انگل باعث ایجاد یک پاسخ التهابی شدید و تخریب بافت شده و بنابر این منجر به تظاهرات بالینی بیماری می گردد(11).

شکل 1-2- عکس میکروسکوپ الکترونی یک تاکی زوایت، سوش VEGکه در حال نفوذ به یک نوتروفیل صفاق موش می
باشد )8(.
83820011938000
شکل 1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش .
برادی زوایت (سیستی زوایت)
ماحصل سیکل غیر جنسی انگل در میزبان است که انگل در نسوج میزبان به صورت کیستی در می آید. اندازه آن بین 120-20 میکرومتر متغیر است )1(. کیست نسجی در واقع مرحله در حال استراحت انگل در بدن میزبان است این کیست ها در حقیقت مجموعه ای از برادی زوایت ها ی انگلی هستند که دارای جدار کیستی نازک می باشند(برادی در زبان یونانی به معنای کند و آرام ). برادی زوایت نیز توسط تقسیم دوتایی آندودیوژنی تکثیر می شود که بر خلاف تاکی زوایت به کندی صورت می گیرد )12(. تاکی زوایت تحت تأثیر فشار پاسخ ایمنی به برادی زوایت تبدیل می شود و تشکیل کیست می دهد. کیست های بافتی حاوی صدها و هزاران برادی زوایت می باشند. برادی زوایت های داخل کیست ها مادام العمر در میزبان باقی می مانند )11(. از نظر ساختاری برادی زوایت و تاکی زوایت اندکی متفاوت هستند . در برادی زوایت ها هسته در جهت انتهای خلفی قرار دارد. برادی زوایت باریک تر از تاکی زوایت بوده و در محتوای بالای میکرونم ها و گرانول های آمیلوپکتین (منبع انرژی) با تاکی زوایت متفاوت است )8و12(. دانه های لیپیدی در برادی زوایت دیده نمی شوند ولی گاهاً در تاکی زوایت دیده می شوند. در حضور آنزیم های پروتئولیتیک، برادی زوایت ها 1-2 ساعت پایدار می مانند ولی تاکی زوایت ها در مدت 10 دقیقه از بین می روند. در گربه که میزبان نهایی است، دوره کمون عفونت زایی (فاصله بین عفونت اولیه تا دفع اووسیست ها) برای برادی زوایت کوتاهتر از تاکی زوایت است )12(. علاوه بر سرعت همانند سازی، برادی زوایت ها وتاکی زوایت ها در بیان ژن و متابولیسم نیز متفاوت هستند. بیان بعضی ژن ها اختصاصی مرحله تاکی زوایت یا برادی زوایت می باشد. همچنین متابولیسم در برادی زوایت کندتر است.

شکل 1-4- یک کیست بافتی توکسوپلاسما که حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد)8(.
اسپوروزوایت
از نظر شکل شناسی بسیار نزدیک به تاکی زوایت می باشد. در بررسی میکروسکوپ الکترونی نیز بسیار مشابه تاکی زوایت است، جز اینکه میکرونم ها و روپتری فراوانی در اسپور زوایت وجود دارد. روپتری ها یا متراکم هستند (در برادی زوایت) یا پراکنده هستند (در تاکی زوایت). اسپوروزوایت همانند برادی زوایت، تعداد بسیار زیادی گرانول های متراکم دارد. اسپوروزوایت شکلی از انگل است که مسئول تکثیر جنسی توکسوپلاسما گوندی در گربه (میزبان نهایی) می باشد و اووسیت ها را به وجود می آورد که قطر 10 تا 12 میکرومتر دارند و شکل مقاوم انگل به محیط بیرونی هستند و در مدفوع گربه دفع می شوند. اسپورولاسیون یک اووسیت تولید دو اسپوروسیت می کند که هر کدام حاوی دو اسپوروزوایت هستند )14(.
تغییر اشکال مختلف توکسوپلاسما به یکدیگر و نقش آن در بیماری زایی توکسوپلاسما
مشخصه عفونت اولیه و بیماری حاد، حضور تاکی زوایت های سریع تکثیر شونده می باشد. حدود 10 تا 14 روز بعد از عفونت، تاکی زوایت ها به برادی زوایت ها تمایز می یابند که خیلی آهسته تر تکثیر می شوند و در سراسر بدن تشکیل کیست می دهند. کیست های بافتی مدت زیادی باقی می مانند و باعث بیماری نمی شوند. در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی مثل AIDS و بدخیمی ها، پاره شدن کیست های بافتی و تغییر شکل برادی زوایت به تاکی زوایت منجر به فعال شدن مجدد بیماری می شود. افراد مبتلا شده از طریق انتقال مادر به نوزاد نیز در معرض خطر فعال شدن مجدد بیماری هستند که می تواند چندین بار تکرار شود و بیشتر مغز و چشم های آنها را مبتلا می کند )2(. تغییر شکل تاکی زوایت ها به برادی زوایت ها و بالعکس، نه تنها نقش حیاتی در ایجاد عفونت مزمن دارد بلکه مسئول فعال شدن مجدد بیماری نیز می باشد. فهم این فرایند می تواند همچنین در طراحی داروهای شیمیایی جدید که قادر به از بین بردن کیست های بافتی باشند، کمک کند. همچنین شناسایی مولکول های سطحی اختصاصی هر مرحله (تاکی زوایت یا برادی زوایت) می تواند منجر به یافتن واکسن های مؤثر یا پیشنهاد راه هایی برای جلوگیری از تهاجم انگل منجر شود )8و14(.
1028272238760فصل اول
کلیات
00فصل اول
کلیات

1889760278130
1-1- اتصال و نفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول
به طور کلی، اتصال و نفوذ به سلول های میزبان توسط اشکال مختلف انگل توکسوپلاسما گوندی (تاکی زوایت، برادی زوایت و اسپور زوایت) شبیه به دیگر انگل های کوکسیدی بوده و شامل مراحل زیر است: 1- حرکت کردن انگل 2- شناسایی کردن سلول میزبان با سرکونوئیدال 3- دندانه دار کردن و ایجاد بریدگی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان 4- تشکیل یک محل اتصال متحرک که هنگامی که انگل داخل سلول میزبان نفوذ می کند پشت سر انگل حرکت می کند 5- ترشح جزئی میکرونم ها، روپتری ها و گرانول های متراکم [8]. زوایت های (اشکال مختلف توکسوپلاسما) توکسوپلاسما گوندی می توانند به سلول های مختلفی از میزبانان بسیار متفاوتی نفوذ کنند. وقتی این انگل در آزمایشگاه کشت می شود، تقریباً قادر است که تمام سلول های پستانداران، حشرات و ماهی ها را مورد تهاجم قرار دهد، که نشان می دهد احتمالاً توکسوپلاسما قادر به بیان چندین نوع متفاوت رسپتور برای لیگاندهای مختلف می باشد یا اینکه تعداد کمی از رسپتورها که قادرند به لیگاندهای مشترک از دودمان های سلولی متفاوت متصل شوند. برای شناسایی هر یک از این دو فرضیه کارهای زیادی انجام شده و توصیف های زیادی انجام شده است و تا به امروز متوجه شده اند که گیرنده های سلول میزبان از جمله لامینین و لکتین و رسپتور سطحی توکسوپلاسما به نامSAG1 در اتصال و نفوذ توکسوپلاسما گوندی دخیل هستند [8، 10]. در واقع در اغلب موارد، غشاء دارای یک خانواده از پروتئین ها است که وابسته به آنتی ژن سطحی SAG1می باشند.SAG1 مهمترین این پروتئین ها می باشد و حداقل در قسمتی از اتفاقات اولیه در اتصال به غشاء میزبان بکار می رود. به طور واضحی این پروتئین تنها مولکول انگل که در اتصال به سلول میزبان دخیل باشد نیست به طوری که موتانت هایSag- هنوز قادر به عفونت هستند. اگر چه با مشخصات و صفات متفاوت، این موتانت ها راحت متصل نمی شوند اما به طور میانگین قادرند در مدت زمان بیشتری وارد سلول میزبان شوند. این مدت زمان ورود به داخل سلول های میزبان در این موتانت ها دو برابر تیپ های وحشی می باشد [36]. زوایت های توکسوپلاسما می توانند همچنین به وسیله راه هایی غیر از نفوذ با واسطه رسپتور، وارد سلول های میزبان شوند. اسپیر و همکاران دریافتند که بعد از گذر کامل از غشاء سلولی، بعضی از زوایت های توکسوپلاسما گوندی پوششی از غشاء سلولی و سیتوپلاسم میزبان را همراه دارند ولی هنوز قادر به نفوذ به سلولهای دیگر هستند. زوایت های توکسوپلاسما همچنین می توانند توسط سلول میزبان اندوستیوز شوند و از این مسیر وارد سلول شوند [10].
اخیراً تحقیقات زیادی روی چگونگی تشکیل واکوئل پارازیتوفوروس (PV) انجام شده است. هنگامی که تاکی زوایت ها به سلول های میزبان نفوذ می کنند به وسیله غشایی که واضحاً از پلاسمالما (ولی عاری از پروتئین های میزبان) است احاطه می شوند. این غشاء بعداً تبدیل به غشاءPVM)) می شود و تعدادی از پروتئین های انگل از جمله ROP2، ROP3، ROP4 و ROP7 به آن متصل می شوند ROP2 در قسمتی از PVM قرار می گیرد که منشأ آن از سیتوپلاسم سلول میزبان است که این احتمالاً نشانگر این است کهROP2 در ارتباطات بیوشیمیایی میزبان و انگل نقش دارد [10]. ظرف چند دقیقه بعد از نفوذ،تاکی زوایت ها PV تازه تشکیل داده، PVM را با پروتئین های انگل تغییر می دهند و یک شبکه غشایی توبولووزیکولار داخل PV شکل میدهند. PVM احتیاج به ساختارهای منفذ مانندی دارد که به راحتی مولکول های باردار تا اندازهkDa 1200 بتوانند بین PV و سیتوپلاسم سلول میزبان حرکت کنند. پروتئین های گرانول های متراکم (GRA) بعد از نفوذ تاکی زوایت، به داخل PV ترشح می شوند. GRA3 و GRA5 روی PVM قرار می گیرند و GRA6،GRA4 و GRA2 و GRA1 به TMN می پیوندند. در جمع این تغییرات یک محیط مناسب برای انگل در سیتوپلاسم سلول میزبان فراهم می کنند که به کار تکثیر انگل می آید [10].
1-2-راه انتقال :
توکسوپلاسما گوندی یک انگل تک یاخته ای است که بیش از یک سوم جمعیت جهان به آن آلوده می باشند. عفونت عمدتا" از طریق غذا وآب الوده با اووسیست های دفع شده بوسیله گربه ها یا از طریق خوردن گوشت خام یا نیم پخته حاوی کیست های بافتی ایجاد می گردد (7و11). اما بطور کلی منبع مهم انتقال عفونت در طبیعت گربه ها و گربه سانان می باشند. گربه های آلوده اووسیست های انگل را از طریق مدفوع دفع می کنند که در خارج از بدن انسان در شرایط مناسب محیطی طی یک تا پنج روز هاگ دار و آلوده کننده می شوند و از طریق مدفوع گربه های آلوده ادامه می یابد که مدت زمان دفع اووسیست طی یک تا سه هفته و ندرتا" تکرار می شود .علی رغم اینکه تعداد گربه های دفع کننده اووسیست در هر زمان زیاد نبوده و معمولا" در اکثر کشورها بیش از 2 % نیست ، اما یک گربه آلوده ممکن است روزانه میلیونها اووسیست دفع نماید .میزان شیوع توکسوپلاسما گوندی در گربه ها به قابلیت دسترسی آنها به پرندگان و پستانداران کوچک که خود از طریق بلع اووسیست آلوده می شوند ، بستگی دارد . بدیهی است در چنین شرایطی خطر عفونت در گربه های روستایی بیشتر از گربه های شهری و در گربه های ولگرد بیشتر از گربه های خانگی خواهد بود (1). انتقال مستقیم انسان به انسان بجز انتقال مادر به جنین گزارش نشده (11و20). علاوه بر این در برخی میزبانها ممکن است همچنین تاکی زوایت ها از طریق شیر مادر به نوزاد منتقل گردند(7). روشهای انتقال آلودگی بر حسب نوع آب و هوای منطقه ، عادات بهداشتی و رژیم غذایی افراد متفاوت می باشد(11). در ایالات متحده آمریکا ، فرانسه و کشورهای غربی مصرف گوشت خام یا نیم پخته راه عمده انتقال عفونت است ، در حالی که آلودگی از طریق بلع اووسیست (ناشی از تماس با گربه) در نواحی گرمسیری متداول تر است(21). با توجه به راههای مختلف انتقال عفونت به میزبان های واسطه ، انسان در هر دوره از حیات خود ، از دوران زندگی جنینی در رحم مادر تا سنین کودکی و بزرگسالی در معرض ابتلا به این عفونت انگلی قرار دارد، اما تا کنون مشخص نشده که کدامیک از راههای انتقال انگل نقش اپیدمیولوژیکی مهمتری دارد(7).
به طور کلی انتقال توکسوپلاسما به میزبانهای واسطه از جمله انسان از راههای زیر صورت می پذیرد :
1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست
آلودگی از طریق بلع اووسیست تنها روش انتقال انگل به علفخواران و یکی از روشهای متداول انتقال توکسوپلاسما به همه چیزخواران و گوشتخواران است. گربه ها معمولا" مدفوع خود را زیر خاک پنهان می کنند ،اما اوسیست ها در اثر آب باران ، حرکت کرم خاکی و عوامل دیگر به سطح زمین آورده می شوند. پرندگان و جوندگان در حین خوردن غذا به اووسیست های اسپوردار آلوده شده و مجددا" گربه ها با شکار این حیوانات و تغذیه از آنها به انگل مبتلا می گردند(7).
1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی
وجود کیستهای نسجی زنده ی توکسوپلاسما در بافت های حیوانات اهلی (بویژه خوک و گوسفند) و وحشی که انسان از گوشت آنها جهت تغذیه استفاده می کند، عامل مهمی در آلودگی انسان به این انگل محسوب می گردد. گزارش های متعددی در ارتباط با توکسوپلاسموزیس ناشی از گوشت آلوده منتشر شده است و برخی از بررسی های سرولوژیک نیز نشان می دهند که مصرف گوشت آلوده نقش مهمتری از بلع اووسیستها به عنوان منشاء عفونت در انسان ایفا می کند(7و22). انسان با خوردن گوشت خام یا سایر فراورده های گوشتی که حرارت کافی ندیده اندآلوده به توکسوپلاسما گوندی می شود(23).
از آنجائیکه فراورده های غذایی نظیر سوسیس و کالباس معمولا" به صورت حرارت دیده وارد بازار می شوند از این جهت آلوده کننده بنظر نمی رسد(23).
1-2-3-انتقال از طریق جفت
انتقال عفونت از مادر به جنین هنگامی اتفاق می افتد که مادر برای اولین بار در دوره حاملگی به عفونت توکسوپلاسمایی مبتلا گردد. در این شرایط توکسوپلاسما گوندی در طی دوره حاد بیماری ، زمانی که
پارازیتمی وجود دارد از جفت عبور کرده و جنین را آلوده می نماید (22).در مواردی نیز ممکن است در مادرانی که قبلا" به عفونت مبتلا گردیده اند ، وجود بیماریهای زمینه ای نظیر لوپوس اریتماتوز که جهت درمان آن نیاز به استفاده از کورتیکواستروئید است ، به علت تضعیف سیستم ایمنی توسط دارو ، عفونت خفته قبلی مجددا" فعال گردیده و انگل از طریق جفت جنین را آلوده می سازد. احتمال انتقال توکسوپلاسما در سه ماهه اول کمتر از سه ماهه دوم و سوم حاملگی است ولی عوارض جنینی در سه ماهه اول حاملگی به مراتب بیشتر خواهد بود(24).

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط )8(
1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی :
عفونت توکسوپلاسما گوندی در انسان انتشار جهانی داشته، و میزان شیوع آن از ناحیه ای به ناحیه دیگر متغیر است. تعداد نمونه ، سن افراد و روش های آزمایش سرمی ممکن است برخی اختلافات در موارد گزارش شده را توجیه نماید. به نظر می رسد که میزان آلودگی انسان از صفر تا 90% متغیر است. در مطالعه ای توسط آسمار و همکاران که روی 13018 نمونه سرم خون تهیه شده از یازده استان کشور را به طور تصادفی نمونه برداری و با روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم از نظر آنتی بادی مورد بررسی قرار دادند 8/51 % نمونه ها مثبت بودند. بر اساس این مطالعه میزان آلودگی به توکسوپلاسما در استان های جنوبی کشور کمتر از مناطق شمالی بوده است)25(. میزان آلودگی بالغین در ایالات متحده امریکا و انگلستان حدود 30% تخمین زده شده، لیکن در سطح قاره اروپا بالاتر و متفاوت از 50 تا 80% بوده است این میزان در آمریکای لاتین در حدود 51-72% ، در کشورهای آفریقای غربی 54-77% ، در جنوب شرقی آسیا (چین و کره)4-39% و در کشورهایی با آب و هوای سرد مثل کشورهای اسکاندیناوی درحدود 11-28% می باشد)7( .روی هم رفته عفونت در شرایط اقلیمی گرم و در نواحی پست متداول تر از شرایط اقلیمی سرد و نواحی کوهستانی است. احتمالاً این تفاوت به شرایط مناسب اسپورولاسیون و بقای اووسیست ها در محیط وابسته است. تمامی بررسی ها افزایش مداوم میزان شیوع آنتی بادی های ضد توکسوپلاسما را در ارتباط با سن نشان می دهند. در آمریکای شمالی افزایش سریع آلودگی در خلال دوره نوجوانی است، در حالی که در آمریکای مرکزی و جنوبی افزایش مداوم در خلال دوره کودکی اتفاق می افتد. شیوع عفونت بین گروه های قومی متفاوت بوده، اما این تفاوت بیشتر از اختلافات ژنتیکی به بهداشت و عادات طبخ غذا مربوط می گردد. اکثر بررسی ها میزان شیوع بالاتر در روستا را نسبت به شهر نشان داده، لیکن برخی نیز فاقد هر گونه اختلاف است. میزان شیوع در افراد تحت تماس زیاد با خاک و حیوانات بالاتر است. در این خصوص، موارد شیوع عفونت در بین کودکانی که با خاک آلوده به مدفوع گربه ها بازی نموده یا آن را خورده اند، مطرح است. همچنین عفونت توکسوپلاسما گوندی در کارکنان کشتارگاه ها بیشتر است )7(. مواردی از بیماری توکسوپلاسموز در پرسنل آزمایشگاه که حیوانات یا لوازم آلوده آزمایشگاهی را جابجا می کرده اند گزارش شده است. در یک مورد آلودگی به عفونت در جریان یک اتوپسی حاصل گردیده است. در مجموع به جز موارد ابتلاء جنین از طریق مادر و مصرف کیست توکسوپلاسما با گوشت، و یا در کارکنان آزمایشگاه که به طور مستقیم با عوامل بیماری زا تماس دارند، در دیگر موارد اثبات منبع اختصاصی که موجب آلودگی می
گردد تقریباً غیر ممکن است. بر اساس نظریه ژاکوب ممکن است مرحله ای از زندگی و تکامل انگل در خاک انجام شود و این مسئله می تواند تا حدی گویای تغییرات در میزان شیوع عفونت در آب و هوا و خاک های
مختلف باشد (11).
1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی :
عوامل مختلفی که در انتشار گسترده توکسوپلاسما نقش دارند عبارتند از عومل مربوط به انگل ، عوامل مربوط به میزبان و محیط.
1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل :
تعداد اشکال عفونت زا و تنوع راههای انتقال
دوام و بقاء اووسیست های رسیده و کیست های نسجی توکسوپلاسما
قابلیت دفع اووسیست ، بطور معمول دوره دفع اووسیست بوسیله گربه تا یک هفته طول می کشد و ندرتا" این دوره تکرار می شود . البته ممکن است دفع اووسیست بر اثر سوء تغذیه ، عفونت ناشی از ایزوسپورا فلیس یا تجویز کورتیزون تحریک شود (26).
جایگزینی کیست های توکسوپلاسما در نسوج مختلف میزبانان واسط و تعدد کیست ها
چرخه زندگی توکسوپلاسما ، توکسوپلاسما قادر است چرخه زندگی خود را فقط در یک میزبان (میزبان نهایی) طی نماید .
1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان :
تعداد میزبانهای واسط
حساسیت و مقاومت میزبانهای واسطه
وفور و پراکندگی گربه
عدات بهداشتی و غذایی ، در مناطقی که گوشت خام به صورت استیک ، جگر ابدار و همبرگر کم پخته و سایر فرآورده های گوشتی که حرارت کافی ندیده اند ، مصرف می شود ، توکسوپلاسما شیوع بیشتری دارد.
تسهیلات تجاری ، امروزه در یک کشور و حتی بین کشورهای مختلف گوشت و سبزیجات به سهولت از نقطه ای به نقطه دیگر منتقل می شود . این عامل می تواند سبب انتشار توکسوپلاسما در نقاطی شود که حتی عاری از گربه ها می باشند.
1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط :
عفونت در شرایط اقلیمی گرم و نواحی پست شایعتر از شرایط اقلیمی سرد و نواحی کوهستانی است. همچنین در نواحی مرطوب شیوع عفونت بیش از نواحی خشک است .رطوبت و گرمای مناسب دو عامل محیطی مطلوب برای هاگ دار شدن اووسیست های توکسوپلاسما محسوب می شوند. از سویی گرمای زیاد ، خشکی و برودت از تکامل اووسیست های توکسوپلاسما جلوگیری می کند (27).

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

1-4-آنتی ژنهای توکسوپلاسما گوندی :
از سالها پیش آنتی ژنهای مختلف غشایی و سیتوپلاسمی توکسوپلاسما گوندی شناخته شده اند و تفاوت آنها مورد بررسی قرار گرفته است . تحقیقات فراوانی جهت شناسایی آنتی ژنهای تاکی زوایت با استفاده از آنتی بادی های تک دودمانی ،مواد نشاندار رادیواکتیو و ایمنوبلاتینگ بررسی های موتانت های مختلف آن صورت گرفته است . این آنتی ژنها وزن ملکولی بین 10 تا 80 کیلودالتون دارند (28).بیشتر آنها ساختمان پروتئینی و برخی از آنها ساختمان گلیکوپروتئینی و لیپوپلی ساکاریدی دارند. تجزیه وتحلیل های ایمنوشیمیایی با استفاده از روش SDS-PAGE وجود پنج آنتی ژن اصلی سطحی با وزن ملکولی 22 ، 23 ، 30 ، 35 و 43 کیلودالتونی را که بصورت P22,P23,P30,P35,P43 نامگذاری شده اند نشان می دهد. همه این آنتی ژنهای پروتئینی از طریق پیوند های گلیکوزیل – فسفاتیدیل اینوزیتول به غشاء سلولی انگل متصل هستند (29). مشخص شده است که فراوانترین پروتئین سطحی در تاکی زوایت انگل P30 است که وزن ملکولی آن تحت شرایط احیاء 35-30 کیلودالتون و تحت شرایط غیر احیاء 28-27 کیلودالتون می باشد و در بیشتر سویه های انگل وجود دارد و پاسخهای آنتی بادی IgG,IgA ,IgM را سبب می شود .این پروتئین که 5 درصد کل پروتئین تاکی زوایت را تشکیل می دهد بطور یکنواخت بر روی سطح و داخل تاکی زوایت و داخل واکوئل حاوی انگل وجود دارد. با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال و روشهای ایمنوفلورسانس و ایمونوالکترون میکروسکوپی ، آنتی ژن 5-4 کیلودالتونی را در سطح تاکی زوایت توکسوپلاسما تشخیص دادند. این آنتی ژن که دارای وزن ملکولی پایین می باشد ، باعث ایجاد ایمنی سریع و برجسته همراه با تولید IgM می گردد . بنابر این آنتی ژن یک نشانگر مناسب در دوره حاد بیماری توکسوپلاسموزیس محسوب می شود (29). همچنین آنتی ژن ترشحی این انگل نیز شناسایی و توصیف شده است . این آنتی ژن نیز در مرحله حاد بیماری در گردش خون وجود دارد و مقادیر اندک آن (حدود نانوگرم) نیز با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال و روش ELISA قابل تشخیص است و حتی قبل از تولید آنتی بادی در خون وجود دارد بنابر این ردیابی این آنتی ژن در تشخیص مرحله حاد بیماری ارزش دارد (30).
هر یک از اشکال توکسوپلاسما در دیواره خود واجد تعدادی از آنتی ژنهای اختصاصی هستند ، چنانچه دو پروتئین اصلی غشاء یعنی P62 و P72 در اسپوروزوئیت شناسایی شده اند ولی در تاکی زوایت وجود ندارند (31و32). آنتی ژنهای سیتوپلاسمی با وزن ملکولی 10 کیلودالتون نسبت به حرارت مقاوم است و در آزمایش IHA دخالت دارد . تریپسین در مجاورت با تاکی زوایت 2 تا 3 آنتی ژن عمده واکنش دهنده با IgM (32 و 22 کیلودالتون) را از بین برد، اما هیچیک از آنها بر روی ماهیت جزء 6 کیلودالتون اثری نداشتند (33). بر اساس بررسی شرما و همکاران باند قوی و شدیدا" رنگی با آنتی ژن 6 کیلودالتون آشکار شده است . IgA الگویی تقریبا" مشابه IgM نشان داده و باندهای 25 ، 30 ، 32 ، 35 ، 40 و 50 کیلودالتون در مراحل زودرس بیماری آشکار گردید. در این مطالعه در هفته 45 پس از آلودگی هیچ باندی با IgA و IgM آشکار نگردید (33).
1-5-واکسیناسیون :
واکسیناسیون ، بهترین و موفق ترین روش برای جلوگیری از بیماریهای عفونی است . واکسن با القای دگرگونی سلولهای ایمنی به سلولهای اجرایی دارای عمر طولانی و سلولهای خاطره ای ، سبب ایجاد ایمنی حفاظتی در مقابله با عفونت ها می شود . بیشتر واکسنهایی که امروزه در دسترس هستند و کاربرد دارند ، پاسخهای ایمنی هومورال را بر می انگیزند . همچنین تلاش برای برانگیختن پاسخ های ایمنی سلولی با واکسیناسیون ادامه دارد. یک واکسن توکسوپلاسما گوندی می تواند با ایمن کردن انسان از ایجاد بیماری جلوگیری نماید. همچنین در حیوانات واکسن با ممانعت از بیماری از خسارت ناشی از آن جلوگیری می نماید . در اروپا و نیوزیلند از یک سوش S48 زنده توکسوپلاسما گوندی جهت واکسیناسیون گوسفندان استفاده می شود اما این سوش به منظور ایمن سازی انسان مناسب نمی باشد (41).نتیجه واکسیناسیون وابستگی زیادی به نحوه شکل گیری ، دوز و راه تجویز واکسن ، گونه و حتی سوش میزبان دارد . بیشتر کارهای انجام شده بر روی ملکول انگل جهت تولید یک واکسن متعلق به 4 خانواده اصلی پروتئین ها می باشد که شامل : 1- آنتی زنهای سطحی مثل P30 یا انتی ژن سطحی تاکی زوایت (SAG) 2- آنتی ژنهای دفعی ترشحی گرانولهای متراکم 3- آنتی زنهای میکرونم 4- آنتی ژنهای روپتری می باشد (43).بین آنتی ژنهای کیست ، آنتی ژنهای برادی زوایت BAG1 و MAG1 مناسب واکسن بوده و در طی مرحله مزمن عفونت انگلی بطور مشخص وجود دارند.
اخیرا" واکسنهای نوترکیب ژنی (DNA & RNA Vaccine) با بیان چند آنتی ژن همراه با پلاسمید های کد کننده فاکتور محرک کلنی در مدل حیوانی (موش) جهت ایمنی زایی این حیوانات انجام گرفته است که قادر به ایجاد یک محافظت معنی دار بر ضد عفونت حاد و مزمن و یک محافظت مختصر بر ضد توکسوپلاسموزیس مادر زادی می باشد .اگر چه تهیه mRNA مشکل است و از پلاسمید DNA کمتر پابرجاست ، اما ایمنی زایی با cDNA می تواند هر دو پاسخهای ایمنی هومورال و با واسطه سلولی را القاء کند که هر دو آنها در ایجاد ایمنی بر ضد توکسوپلاسما گوندی لازم هستند(44).
1-6- بیماریزایی :
در اکثر موارد عفونت های توکسوپلاسمایی هیچگونه نشانه و تظاهر بالینی مشخصی در بر ندارند یا تعداد اندکی از آنها دارای علاءم مشخصی می باشند که عموما" خود محدود شونده اند و از این رو بسیاری از موارد عفونت بدون تشخیص باقی می ماند . سیر بیماری در افرادی که از نظر سیستم ایمنی طبیعی هستند ، معمولا" خوش خیم است . به هر حال دوره نهفتگی توکسوپلاسموزیس اکتسابی بین 4 تا 21 روز ( بطور متوسط 7 روز ) تخمین زده شده است(44).گزارشات متعددی نشانگر شیوع گسترده عفونت توکسوپلاسمایی در حیوانات اهلی ، وحشی و انسان است ، اما چنانچه ژاکوب در سال 1956 بیان نموده ، علیرغم دریای وسیعی از عفونت توکسوپلاسمایی که اطراف ما را در بر گرفته موارد بالینی نسبتا" اندکی از بیماری اتفاق می افتد . اگر چه توکسوپلاسموزیس حاد بدون علامت نقش بسیار مهمی در ایجاد عفونت های مادرزادی در
انسان و گوسفند ایفاء می کند ، اما نمی توان اهمیت عفونت های توکسوپلاسمایی مزمن بدون علامت در
انسان را نیز نادیده انگاشت زیرا این عفونت ها در صورت تضعیف سیستم ایمنی ، خطر شعله ور شدن
عفونت به صورت " حاد " و در مواردی " فوق حاد" وجود دارد. توکسوپلاسما گوندی به عنوان یک انگل اجباری داخل سلولی از طریق جریان خون به بسیاری از اعضاء و بافت های بدن منتشر می گردد و سر انجام در تمامی آنها به سلولهای بافتی حمله ور می شود و با تکثیر گسترده در این سلولها موجب انهدام سلولهای آلوده می شود . تکثیر تاکی زوایت های توکسوپلاسما در سلولهای بافتی موجب مرگ سلولهای گرفتار و پدید آمدن کانونهای نکروز در بافت می گردد . این کانونها عمدتا" توسط لمفوسیتها ، مونوسیت ها و پلاسماسل ها محصور میگردند . در این مرحله از عفونت پارازیتیسم به اوج خود رسیده و ممکن است موجب از پای درآمدن میزبان گردد . در خلال اوج این مرحله ممکن است ارگانیسم در ترشحات و مواد دفعی نظیر ادرار ، مدفوع ، شیر ترشحات ملتحمه چشم و حتی بزاق نیز یافت شود ، اما این اشکال انگلی توانایی ماندگاری چندانی در محیط های آزاد خارج از بدن را ندارند بطوریکه در مرحله حاد عفونت شواهد چندانی در مورد احتمال انتشار توکسوپلاسموزیس از یک حیوان به حیوان دیگر هنگامی که حیوانات در یک فضای بسته نگهداری می شوند ، وجود ندارد( بعنوان مثال موشهای نگهداری شده در یک قفس ). شکل تحت حاد توکسوپلاسموزیس با پیدایش آنتی بادی های انگلی همراه است . این آنتی بادی ها می توانند موجب پاک سازی خون و بافت ها از تاکی زوایت های انگلی گردند (40و10). غالبا" پس از خون بافت هایی نظیر کبد ، طحال و ریتین از انگل پاک می شود و سپس محو تاکی زوایت های انگلی از مغز و متعاقب آن قلب صورت می پذیرد. در این مرحله از عفونت تحریک سیستم ایمنی توسط انگل موجب ظهور عوامل ایمنی زا گردیده و انگل برای فرار از تاثیرات سیستم ایمنی به اندامها و بافت های مختلفی بویژه عضلات و مغز وارد می شود و در این اندامها کیست های نسجی تشکیل می گردد . تشکیل این کیست ها و جایگزینی برادی زوایت ها در داخل آن نشانه ای بارز از عفونت مزمن توکسوپلاسمایی است . این مرحله از حیات انگل ممکن است تا مدتهای مدیدی در میزبان بدون بروز هر گونه علائم و تظاهرات بالینی پایدار بماند به گونه ای که این زمان در" سگ " تا ده ماه و در " رات ، موش و کبوتر " تا بیش از سه سال بعد از عفونت گزارش شده است . عفونت توکسوپلاسمایی در اکثر بالغینی که از سیستم ایمنی سالم و طبیعی برخوردارند( به علت پیدایش
آنتی بادی های خارج سلولی ، عوامل داخل سلولی وابسته به لمفوسیتهای T و ایجاد ایمنی محافظت کننده موثر) غالبا" بدون علائم و نشانه های اختصاصی است . همچنین به نظر می رسد " اینترفرون گاما با منشاء داخلی " یک واسطه مهم در مقاومت میزبان بر علیه توکسوپلاسما باشد . پایداری عفونت فعال توکسوپلاسمایی در سیستم اعصاب مرکزی و چشم در مقایسه با سایر اندامها و بافتها طولانی تر است . جایگزینی انگل در مغز می تواند منجر به پیدایش کانون های نکروتیک منتشر و بسیار کوچکی گردد که در مراحل بعد به موازات کلسیفیه شدن آنها در کلیشه های رادیوگرافی تصویری قابل روئیت و نسبتا" مشخص ایجاد می نماید. " رتینوکوروئیدیت یا کوریورتینیت " توکسوپلاسمایی یکی از عوارض بسیار مهم توکسوپلاسموزیس است که ممکن است به علت پاسخ " افزایش حساسیت تاخیری " میزبان نسبت به پاره شدن کیست و یا به عنوان یک عارضه مزمن پیشرونده ی ناشی از تکثیر تاکی زوایت ها در شبکیه چشم ( که دارای سیستم دفاعی ضعیفی است) ایجاد گردد.
1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی
مهمترین فرم بیماری ناشی از آلوده شدن به توکسوپلاسما گوندی ، فرم مادرزادی آن می باشد.توکسوپلاسموزیس مادرزادی وقتی اتفاق می افتد که مادر در دوران حاملگی به فرم حاد بیماری مبتلا شود و یا در معرض مخاطره ضعف سیستم ایمنی باشد و به سبب آلودگی قبلی به توکسوپلاسما گوندی انگل در او فعال شده و جنین در خطر ابتلاء به توکسوپلاسموزیس مادرزادی قرار گیرد.زمانی که مادر دچار پارازیتمی است ، در شرایطی که ایمنی سلولی در جنین هنوز کامل نشده است ، جنین به عفونت های داخل سلولی مانند عفونت توکسوپلاسمایی حساس می باشد . بیشتر مادرانی که در حین حاملگی آلوده می شوند بدون علائم بیماری هستند (22).مجموعه تعداد توکسوپلاسموزیس مادرزادی حدود 30%موارد عفونت حاد در دوره بارداری را شامل می شود ، اما نرخ عفونت از 6% در هفته سیزدهم تا 72% در هفته سی و ششم بارداری متغیر است. چنانچه ابتلاء مادر به به عفونت در مراحل اولیه بارداری (در چهار هفته اول ) اتفاق افتد احتمال آلودگی جنین تنها 1% خواهد بود که با پیشرفت دوره بارداری این احتمال افزایش می یابد . به گونه ای که احتمال ابتلای جنین در سه ماهه اول ، دوم و سوم حاملگی به ترتیب 10 تا 25% ،30 تا 54% و 60 تا 65% می باشد ، اما بیشترین عوارض ناشی از توکسوپلاسموزیس در سه ماهه اول حاملگی رخ می دهد که شامل سقط جنین طبیعی ، تولد زود هنگام ، هیدروسفالی ، میکروسفالی می باشد . فراوانترین ناهنجاری های شدید در طی عفونت اکتسابی مادر بین هفته دهم و بیست و چهارم بارداری رخ می دهد (45). شدت آلودگی جنین رابطه عکس با شانس ابتلاء دارد چنانچه مادران در مراحل اولیه بارداری آلوده شوند هر چند شانس ابتلای جنین کم است ولی ضایعاتی که ایجاد می کندبسیار شدید است زیرا سیستم اعصاب مرکزی در حال تشکیل می باشد . بر عکس در سه ماهه سوم بارداری که خطر انتقال به جنین بیشتر است ، تقریبا" غالب نوزادان متولد شده فاقد علائم آشکار بیماری می باشند. شیوع توکسوپلاسموزیس مادرزادی در جهان از 3 تا 8 مورد در 1000 تولد زنده بر حسب راه انتقال ، اقلیم ، رفتار فرهنگی ، عادات غذایی و استانداردهای بهداشتی متغیر می باشد . به طور مثال توکسوپلاسموز مادرزادی در کشور فرانسه بین 2 تا 3 مورد در 1000 تولد زنده و در کشور آمریکا بین 1 در 1000 تا 1 در 10000 تولد زنده رخ می دهد.

1- 6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی
1-8-تظاهرات بالینی
اگر چه معمولا" وقوع عفونت های توکسوپلاسمایی در بالغین و کودکان بدون بروز هر گونه نشانه و تظاهرات بالینی است ، اما بعضی مواقع ممکن است ابتلاء به این انگل موجب بروز یک عفونت حاد سیستمیک و
گسترده گردد. در این شکل در 30-10 درصد از موارد علائم و نشانه های بالینی بیماری ظاهر می شود . در چنین مواقعی شایعترین علامت بالینی بیماری "لنفادنوپاتی" است که ممکن است در 70-30 درصد موارد مشاهده شود و غدد لنفاوی سطحی یا عمقی نواحی مختلف بدن را گرفتار سازد و با دردهای عضلانی ناشی از آماس ماهیچه ها یا آماس پوست و ماهیچه همراه باشد (27).اما عمدتا" تورم غدد لنفاوی بویژه در ناحیه خلف گردن مشهود تر است اما غدد لنفاوی در هر نقطه از بدن ممکن است مبتلا شوند . غدد لنفاوی گرفتار قوامی نرم داشته فاقد ترشحات چرکی می باشند و اندازه آنها بندرت از 3 سانتیمتر تجاوز می نماید . آدنوپاتی های توکسوپلاسمایی غالبا" خود محدود شونده اند و در مدت کمتر از 12 ماه بهبود می یابند ، اما گاهی غدد لنفاوی برای ماهها بزرگ و کوچک شده و ممکن است مدتها متورم باقی بمانند . تب خفیف ، ضعف ، درد عضلات ، عرق شبانه ، گلودرد ، راشهای ماکولوپاپولر ، هپاتواسپلنومگالی و شکم درد به علت گرفتاری غدد لنفاوی مزانتریک و رتروپریتونال و در مواردی کوریورتینیت نیز ممکن است از علائم دیگر این شکل از بیماری باشند. گاه پیدایش تظاهراتی نظیر لرز ، تب ، سردرد ، درد عضلات ، تورم غدد لنفاوی و بی حالی شدید می تواند تصویری مشابه با منو نوکلئوز عفونی ایجاد کند. در مواردی از توکسوپلاسموزیس حاد گاه هپاتیت ، آنسفالومیلیت و میوکاردیت نیز بوقوع می پیوندد (7و11). در بیماران مبتلا به نقص سیستم ایمنی از جمله بیماران مبتلا به ایدز شایعترین تظاهرات بالینی توکسوپلاسموزیس مربوط به گرفتاری مغز، قلب ، ریه و چشم می باشد. شعله ور شدن عفونت های مزمن توکسوپلاسمایی در سیستم اعصاب مرکزی از شایعترین علل انسفالیت در این گروه از بیماران محسوب می شود که یکی از علل عمده مرگ و میر و معلولیت در مبتلایان به ایدز است (34). بر اساس شواهد موجود بیش از 50-10 درصد از بیماران مبتلا به ایدز که واکنش سرمی آنها از نظر ابتلاء به توکسوپلاسما مثبت و شمارش لمفوسیت های T آنها با نشانگرهای (CD4) کمتر از یکصد سلول در هر میکرولیتر است به آنسفالیت توکسوپلاسمایی گرفتار می شوند . این عارضه ممکن است با نشانه هایی نظیر سردرد ، اختلال حواس ، عدم تعادل در هنگام راه رفتن ، فلج نیمی از بدن و کوریورتینیت تظاهر نماید. در چنین شرایطی افزایش لمفوسیت های مایع نخاعی ، وجود آنتی بادیهای ضد انگلی از رده IgG در سرم بیماران و اثبات ضایعاتی در کلیشه های تهیه شده از مغز در " سی تی اسکن " تا حدود بسیاری نشان دهنده ابتلاء فرد به آنسفالیت توکسوپلاسمایی است . علاوه بر این مشاهده کانون های نکروتیک همراه با وجود انگل در مقاطع بافتی تهیه شده از مغز ، اثبات وجود انگل در مایع نخاعی و همچنین افزایش IgG مایع مغزی – نخاعی بدون افزایش سطوح IgG سرمی نشاندهنده ابتلاء فرد به انسفالیت توکسوپلاسمایی است . در اکثریت مبتلایان به این شکل از بیماری فقدان آنتی بادی رده IgM و یا تغییر در سطوح آنتی بادی رده IgG سرمی بیشتر نشانگر آن است که علت بیماری شعله ور شدن یک عفونت خفته مزمن است تا ابتلاء به عفونت اکتسابی اولیه (11). در بیماران مبتلاء به توکسوپلاسموزیس مغزی که دچار نقص سیستم ایمنی هستند و یا بیمارانی که سیستم ایمنی آنها با داروهای مهار کننده تضعیف شده است غالبا" اشکال تاکی زوایتی انگل مشاهده می شود . همچنین در مواردی ، در بیماران مبتلا به ایدز ممکن است توکسوپلاسموزیس با گرفتاری طناب نخاعی همراه باشد که در چنین شرایطی تخریب سلولهای بافت نخاع می تواند منجر به بروز تظاهرات مربوطه گردد (24). چون در افراد مبتلا به ایدز میکروارگانیسم های دیگر مانند کریپتوکوکوس نئوفورمنس ،مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و آسپرژیلوس هم ممکن است باعث مننگوآنسفالیت گردند، لذا تشخیص افتراقی آنها از توکسوپلاسما گوندی حائز اهمیت است. توکسوپلاسموزیس ریوی یکی دیگر از اشکال بیماری است که غالبا" در مبتلایان به نقص سیستم ایمنی ایجاد می گردد و با تظاهرات تنفسی نظیر سرفه ، تنگی نفس و تب طولانی مدت همراه است . یافته های رادیوگرافی و بالینی در توکسوپلاسموزیس ریوی همانند پنومونی ناشی از پنوموسیستیس کارینی بوده و ممکن است از پنوموسیستوزیس غیر قابل تمایز باشد (45 و 42). این عارضه در صورت عدم درمان به موقع در بیش از 35 درصد موارد منجر به مرگ بیمار می گردد. در مواردی توکسوپلاسموزیس با تظاهرات چشمی خود نمایی می کند . غالبا" این تظاهرات ناشی از وقوع کوریورتینیت است که با درد چشم و کاهش قدرت بینایی همراه می باشد . کوریورتینیت یکی از عوارض مهم توکسوپلاسموزیس است که در غالب موارد منشاء مادرزادی دارد . غالبا" این شکل از بیماری در سالهای ابتدایی پس از تولد علائم و تظاهرات مشخصی نداشته ، اما به تدریج طی دهه ی دوم و سوم زندگی آثار آن بروز می نماید . همچنین این فرم از بیماری در شکل اکتسابی هم ممکن است دیده شود . کوریورتینیت حاد می تواند با علائمی چون ضعف بینایی ، اسکوتوماتا ، درد ، آپی فوریا ، ترس از نور و در صورت گرفتاری ماکولا اختلال دید مرکزی همراه باشد و اگر چه درمان بیمار موجب از بین رفتن التهاب و بهبود بینایی می گردد ف اما بیمار هیچگاه بینایی کامل خود را باز نمی یابد . در چنین شرایطی در فوندوسکوپی ضایعات نکروزان متعدد یکطرفه یا دو طرفه مشاهده می گردد و در ده درصد موارد امکان گرفتاری " ویتره " و عصب بینایی وجود دارد . همچنین در 63 درصد از بیماران مبتلا به کوریورتینیت توکسوپلاسمایی احتمال بروز آنسفالیت توکسوپلاسمایی وجود داشته و در 30-13 درصد مبتلایان به این شکل از بیماری احتمال عود کوریورتینیت وجود دارد(11). تورم بیضه یا ارکیت توکسوپلاسمایی یکی از عوارض ابتلاء به توکسوپلاسموزیس است که بطور نادر در برخی از مردان رخ می دهد .این شکل از بیماری غالبا" با پیدایش یک توده ی غیر حساس به لمس در بیضه ها خودنمایی می کند و در مبتلایان به ایدز چندین روز قبل از وقوع آنسفالیت توکسوپلاسمایی ظاهر می گردد (11).توکسوپلاسما گوندی گاه در مبتلایان به ایدز می تواند موجب گرفتاری عضله قلب ، عضلات اسکلتی و یا لایه های عضلانی لامینا پروپریای دستگاه گوارش و یا عضلات اسکلتی گردد. در مواردی ممکن است به علت مهار یا تضعیف سیستم ایمنی عفونت های اولیه توکسوپلاسمایی به شکل فوق حاد بروز نماید . علاوه بر این شعله ور شدن توکسوپلاسموزیس در افرادی که سیستم ایمنی آنها توسط تجویز داروهای مضعف سیستم ایمنی مهار گردیده مکررا" مشاهده شده است . تصویر بالینی توکسوپلاسموزیس مادرزادی تا حدودی با توکسوپلاسموزیس اکتسابی متفاوت است ، بدان معنی که در اکثریت مبتلایان ، بیماری بصورت حاد بروز می نماید . سقط جنین ، مرده زایی ، کوریورتینیت ، آنسفالومیلیت ، هیدروسفالی ، میکروسفالی و بسیاری از عوارض دیگر از پیامدهای این شکل از بیماری است . با مشاهده چنین تظاهراتی در نوزادان می توان ابتلاء آنان به توکسوپلاسموزیس را بسیار محتمل دانست." انسفالیت توکسوپلاسمایی " معمولا" همراه با پیدایش کانونهای کلسیفیکاسیون در سیستم اعصاب مرکزی است . این کانون ها غالبا" در کلیشه های رادیوگرافی مشهود و قابل روءیت می باشند . عفونت توکسوپلاسمایی در نوزادان تازه متولد غالبا" با تب ، پنومونی و بزرگی طحال و کبد خود نمایی می کند . در این موارد بروز تشنج در نوزادان امری معمول بوده و بهبودی بندرت حاصل می گردد . در این گروه از مبتلایان وقوع عفونت های توکسوپلاسمایی در سیستم اعصاب مرکزی غالبا" منجر به کوری یا اختلالات بینایی و عقب افتادگی ذهنی می گردد . تصور می شود درصد اندکی از عفونت های سیستمیک خفیف تر با بهبودی کامل همراه باشد ، اما حتی در این گروه از مبتلایان نیز نشانه های " کوریورتینیت توکسوپلاسمایی " سالها پس از ابتلاء که بیماری تظاهر می یابد . گزارشات نسبتا" زیادی وجود یک ارتباط سبب شناختی بین " پلی میوزیت " و توکسوپلاسموزیس را نشان می دهد ( 11 ).
1-9-تشخیص توکسوپلاسموز
بطور کلی عفونت توکسوپلاسما گوندی یا به طور غیر مستقیم با روش های سرولوژیکی ویا بطور مستقیم به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، جداسازی انگل و مشاهده انگل با روش های هیستولوژی (بافت شناسی) تشخیص داده می‌شود. نشان دادن آنتی ژن در خون و مایعات بدن روش دیگر تشخیصی است که به ندرت استفاده می شود )48و11(.
در چهار گروه از اشخاص تشخیص توکسوپلاسموز حائز اهمیت می باشد که عبارتند از:
-زنان باردار مبتلا به عفونت اولیه
-جنین و نوزادان دارای عفونت مادرزادی