—d1926

هم‌چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).
1-2 نشان‌گر چیست؟
صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان‌گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان‌گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود‌فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان‌گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد‌:
1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)
2-به توارث برسد (2).
1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکینشان‌گرهای ژنتیکی عبارتند از:
1-نشان‌گرهای مورفولوژیک
2-نشان‌گرهای پروتئینی
3-نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA
1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک
کاربرد نشان‌گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان‌گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان‌گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل‌کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان‌گرها به شمار می‌آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).
معایب نشان‌گرهای مورفولوژیک
اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.
تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.
فراوانی و تنوع کمی دارند.
گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.
اساس ژنتیک بسیاری از نشان‌گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است‌(2).
1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی
در دهه‌ی 1950، نشان‌گرهای پروتئینی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین‏ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. برخی از تفاوت‏های موجود در ردیفDNA بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‏هایی با اندازه‏های مختلف تجلی کنند، که به روش‏های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می‏گردند. این قبیل نشان‌گرها را نشان‌گرهای مولکولی در سطح پروتئین می‏نامند که از آن جمله می‏توان به سیستم آیزوزایم/آلوزایم اشاره کرد. معمول‏ترین نوع نشان‌گرهای پروتئینی آیزوزایم‏ها هستند که فرم‏های مختلف یک آنزیم را نشان می‏دهند. آیزوزایم‏ها به‏ طور گسترده در بررسی تنوع ژنتیکی به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهای هم‌بارز نشان می‏دهند. اما این دسته از نشان‌گرها هم دارای معایبی هستند. برخی از معایب آن‏ها عبارت‌اند از:
محدود بودن فراوانی این نوع نشان‌گرها؛
تعداد آیزوزایم‏های قابل ثبت و مشاهده که می‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به یکصد عدد نمی‏رسد؛
محدود بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایم‏ها‌(نداشتن چند شکلی)؛
پیچیدگی فنوتیپ‏های الکتروفورزی آیزوزایم‏ها به دلیل دخیل بودن آنزیم‏های مرکب از چند پلی‌پپتید مستقل در ترکیب برخی از آیزوزایم‏ها‌(3).
اما پیشرفت‏هایی که در زمینه‏ی الکتروفورز دو‏بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده، تجزیه تحلیل هم‌زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوری پیشتاز در عرصه نشان‌گر‏های مولکولی مطرح شده‏اند. تاثیرپذیری نشان‌گرها از محیط که به‌طور معمول به‌عنوان یکی از محدودیت‏ها و نکات منفی نشان‌گرهای مولکولی یاد می‏شود، در مورد این نشان‌گر‏ها تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئومیکس‌(مطالعه سراسری کل پروتئین‏های موجود در یک سلول یا یک ارگانیسم) می‏تواند به‌طور هم‌زمان برای مطالعه بیان ژن و هم‌چنین برای شناسایی پروتئین‏های واکنش دهنده به شرایط محیطی مورد استفاده قرار گیرد(3).
1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA وRNA
دسته‌ای دیگر از تفاوت‏های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند. نه صفت خاصی را کنترل می‏کنند و نه در ردیف اسید‏های آمینه پروتئین‏ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‏ها را می‏توان با روش‏های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار داد. این نشان‌گر‏ها که تعدادشان تقریبا نا‏محدود است، فقط از راه تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند. بنابراین به آنها نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‏شود. نشان‌گرهای مولکولی فراوان و در هر موجود زنده‌ای می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. تاکنون تعداد زیادی از نشان‌گرهای DNA معرفی شده‌اند. این نشان‌گرها از نظر بسیاری از ویژگی‏ها مانند درجه‏ی چندشکلی، غالب یا هم‌بارز بودن، تعداد جایگاه‏های تجزیه شده در هر آزمایش DNA، توزیع در سطح کروموزوم، تکرار‌پذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‏یابی DNA الگو و هزینه‏ی مورد نیاز با همدیگر متفاوت‌اند. انتخاب بهترین نشان‌گر به هدف مطالعه (انگشت نگاری، تهیه نقشه پیوستگی، ژنتیک جمعیت و روابط تکاملی) و سطح پلوئیدی موجود مورد مطالعه بستگی دارد‌(4).
مزایای کاربرد نشان‌گرهای مولکولی
عدم تاثیرپذیری آنها از شرایط محیطی خارجی و داخلی موجود؛
امکان به‌کارگیری آنها در مراحل نخستین رشد جنینی حیوانات و مراحل نخستین رشد موجودات؛
فراهم نمودن امکان مطالعه موجودات در خارج از فصل و محیط کشت؛
دقت و قابلیت مطلوب تفسیر نتایج؛
هم‌بارز بودن بسیاری از این نشان‌گرها؛
امکان استفاده از آنها در مورد گونه‏های منقرض شده؛
سهولت تشخیص افراد ناخالص از خالص؛
سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل نتایج؛
دسترسی به برنامه‏های رایانه‏ای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر سریع نتایج‌(4)
انواع نشان‌گرهای مولکولی
نشان‌گرهای DNA گروه بزرگی از نشان‌گرها را تشکیل می‏دهند. این نشان‌گرها سیر تحول و تکامل خود را به پایان نرسانده‏اند و ابداع و معرفی روش‏های متنوع و جدیدتر ثبت و مشاهده‏ی تفاوت‏های ژنتیک بین موجودات از طریق مطالعه‏ی مستقیم تفاوت‏های موجود در بین ردیف‏های DNA هم‌چنان ادامه دارد. نشان‌گر‏های DNA در مدت یک دهه تکاملی شگرف و تحسین‌برانگیز داشته‏اند‌(5).
ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR یک روش سریع تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعه‌های مورد نظر DNA است. در واقع PCR روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون در کم‌تر از نیم‌روز امکان‌پذیر می‏سازد. اما این فرایند هنگامی امکان‌پذیر است که دست‌کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانندسازی DNAدر طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه‏ی مورد‌نظرDNA هستند، به‌عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‏گیرند تا واکنش آنزیمی همانندسازی DNA درون لوله‌ی آزمایش امکان‌پذیر شود. این همانند‏سازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‏های پلی‌مراز صورت می‏گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‏ها به صورت تجاری دردسترس هستند‌(6).
واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز (PCR) در سال 1983 توسط کری‌مولیس در حالیکه در یک نیمه شب تابستانی در حال رانندگی بود، ابداع گردید و سبب انقلاب عظیمی در زیست شناسی مولکولی شد(6).
همان‌گونه که در شکل 1-1 نشان داده شده است، نشان‌گرهای DNAبه دو دسته‏ی کلی طبقه‌بندی می‏شوند.
نشان‌گرهای DNAمبتنی بر PCR
نشان‌گرهای DNA غیر مبتنی PCR(6).

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی‌(10)
1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCRاین دسته از نشان‌گرهای DNA بدون استفاده از روشPCR تولید می‌شوند و مورد استفاده قرار می‌گیرند.
انواع نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر(RFLP)
پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)
ماهوارک‏ها
1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLPسرگروه نشان‌گرهای غیر‌مبتنی برPCR ، همان تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر یا RFLP است. از بین نشان‌گرهای مولکولی DNA، RFLP ها اولین نشان‌گرهایی بودند که برای نقشه‌یابی ژنوم انسان توسط بوتستین و همکاران در سال 1980 و پس از آن برای نقشه‌یابی ژنوم گیاهان توسط بر و همکاران در سال 1983 مورد استفاده قرار گرفتند. در اوایل دهه 1980 بوتستین و همکاران استفاده از تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم یا RFLP را برای مطالعه‏ی مستقیم DNA و یافتن نشان‌گر‏های ژنتیک جدید معرفی کردند. این تحول از پیامد‏های منطقی کشف آنزیم‏های محدودگر بود. این آنزیم‏ها که بسیار اختصاصی‏ هستند، ردیف‏های ویژه‏ای را روی مولکولDNA شناسایی کرده و آنها را از محل خاصی (نقطه‏ی برش) برش می‏دهند‌(7).
RFLP الزاما مختص ژن‏های خاص نیست، بلکه در کل ژنوم پراکنده است. ازاین رو، از نشان‌گرهای RFLP برای نقشه‌یابی تمام ژن‌ها در ژنوم انسان استفاده می‏شد(5). علاوه برRFLP که هنوز هم از قدرتمندترین و معتبرترین نشان‌گرهایDNA است، انواع مختلف نشان‌گرهایDNA با تفاوت‌های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه‌ی کاربرد، امتیاز‌بندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع ومعرفی شده‌اند‌(7).
مهم‌ترین مزایای RFLP
تکرارپذریری، دقت و قابلیت اعتماد این نشان‌گر فوق‌العاده زیاد است؛
این نشان‌گر هم‌بارز است و امکان تشخیص افراد خالص را از افراد ناخالص فراهم می‏آورد؛
فراوانی این نشان‌گر در حد بالایی است؛
RFLP تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد در صد ژنتیکی است(8).
برخی معایب RFLP
دشواری، پیچیدگی و وقت‌گیر بودن؛
RFLP ژنوم‌های بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روش‌های پیچیده‏تر و گران‏تر بیوشیمیایی است؛
RFLP نیازمند نگه‌داری میکروارگانیسم‌ها به‌منظور تهیه‏ی کاوشگر است که خود بر پیچیدگی این روش می‏افزاید؛
هزینه‏ی اولیه و نگه‏داری کاوشگر‏ها و کاربرد آنها بسیار زیاد است؛
نیازمندی به مقدار نسبتا زیاد DNA از محدودیت‏های دیگر روش RFLPاست به‌طوری که ده‏ها میکروگرم از DNAبرای هر فرد به منظور تجزیه‏ی ژنوم مورد نیاز است؛
از دیگر محدودیت‏های این نشان‌گر آن است که در گونه‏های بسیار نزدیک به یکدیگر این نوع نشان‌گر‏ها آلل‏های مشابهی را نشان می‏دهند(8).
1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)در سال1991، هاتادا و همکاران روشی را برای شناسایی و انگشت‌نگاری موجودات عالی ابداع و معرفی کردند. پیش از ابداع این روش که بر مبنای نشان‌دار کردن هم‌زمان انتهای هضم شده‏ی هزاران قطعه‌ی DNA است، ردیابی و ثبت موجودات عالی با روش نشان‌دار کردن انتهای هضم شده غیر ممکن می‌نمود. دو دلیل اصلی برای این تصور ذکر شده است:
ژنوم موجودات عالی بسیار بزرگ و پیچیده است برای مثال ژنوم انسان 109×3 جفت باز دارد و در نتیجه‏ی هضم آن با آنزیمی مانند EcoRI بیش از یک میلیون قطعه‌ی DNA به وجود می‌آید. تفکیک این تعداد مولکولDNA حتی با الکتروفورز دو بعدی نیز غیر ممکن است.
معمولا DNA ژنومی در هنگام استخراج به صورت تصادفی و غیر‌اختصاصی شکسته می‌شود و ایجاد مولکول‏هایی با انتهای تصادفی می‏کند. این امر سبب ایجاد پس‌زمینه‌ی ناشی از نشان‌دار شدن این انتهاها طی فرایند نشان‌دارکردن می‏شود‌(9).


برای رفع این دو نقص تدابیری پیش‏بینی شد و روش RLGS ابداع گردید. این روش جدید که برای تجزیه و تحلیلDNA ژنومی به‌کار می‌رود، بر مبنای این فرضیه است که نقاط برش اختصاصی آنزیم‏های محدودگر می‌توانند به‌عنوان نشانه و وجهه تمایز ارقام و افراد به کار گرفته‌شوند.
در این روش انتهای آزاد مولکول‌های DNA که در اثر صدمات مکانیکی در طی استخراج به وجود آمده‏اند، مسدود می‏شود. سپس برای کاهش پیچیدگی، DNA ژنومی توسط آنزیم‏های محدودگر، با محل برش نادر، هضم و نقاط برش به‌طور مستقیم با فسفر پرتوزا نشان‌دار می‏شوند. آنزیم‏های با محل برش نادر معمولا هزاران قطعه DNA به وجود می‏آورند. سپس با الکتروفورز دو‌بعدی، قطعه‏های هضم‌شده‏یDNA از هم جدا شده و خودپرتونگاری صورت می‏گیرد. این روش یک الگوی دو بعدی با هزاران نقطه‏ی پراکنده (قطعه‏های نشان‌دارDNA) ایجاد می‏کند که هر یک می‏توانند به عنوان یک نشان‌گر به کار گرفته شوند(10)
برخی از مزایای روشRLGS
در هر آزمایش هزاران نشان‌گر به‌دست می‌آید؛
مقدار کمی DNAمورد نیاز است؛
در صورت استفاده از آنزیم‌های محدودگر متفاوت، تفاوت‏های بیشتری ظاهر و ثبت خواهند شد[10].
برخی از معایب روش RLGS
DNA مورد نیاز برای این روش باید از کیفیت مطلوبی برخوردار باشد؛
هضم ناقص DNA توسط آنزیم‏های محدودگر نتایج تکرار ناپذیر و گمراه کننده‏ای خواهد داشت؛
این روش پیچیدگی فوق العاده‏ای داشته و تفسیر نتایج حاصل از آن دشوار است(10).
1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها
ماهوارک‏ها نخستین بار در سال 1985 توسط جفری و همکاران گزارش شدند. پس از آن در سال 1988 تکثیر جایگاه‏های ژنی خاص نواحی تکرارشونده، روی ماهوارک‏ها در ژنوم انسان انجام شد.
این دسته از نشان‌گرها از نظر تکنیکی مبتنی بر استفاده از کاوشگرهای مصنوعی و کاربرد مواد پرتوزا و روش ساترن هستند.
ماهوارک‌ها واحدهایی 10 تا 100 جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. آنها معمولا یک هسته مشترک 10 تا 15 جفت بازی دارند که احتمالا در تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها موثرند. ماهوارک‌ها بیش‌تر در نواحی یوکروماتین ژنوم پستانداران، قارچ‌ها و گیاهان متمرکز‌ند. تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها در حدی است که گاهی در انگشت‌نگاریDNA انسان مورد استفاده قرار می‏گیرند. از جمله‌ی ماهوارک‌ها می‏توان به تکرارهای پشت سر هم با فراوانی بالا (VNTR) اشاره کرد[11]. VNTR ها به دو دسته‌ی کلی تقسیم می‌شوند: VNTR تک مکانی و VNTR چند مکانی.
دسته‏ی نخست، تعداد متفاوت ردیف‌های تکراری در یک جایگاه ژنی و دسته‏ی دوم تعداد متفاوت ردیف‌های تکرار‌شونده در چندین جایگاه ژنی را نشان می‌دهند. الگوی بانددهی به‌دست آمده با استفاده از کاوشگر‌های VNTR تک مکانی ساده‏تر و قابل فهم‌تر است، زیرا هر فرد تعداد کمی باند واضح را نشان می‏دهد. در حالی‌که تعداد باندهای به دست آمده از کاوشگرهای مخصوص VNTRچند‌مکانی بیش‌تر است، به‌طوری که به‌طور هم‌زمان تا بیش از 30 باند به دست می‏آید(12).
در نخستین نشان‌گرهای مبتنی بر ماهوارک‌ها، از الیگونوکلئوتید‏های حاوی ریزماهواره به عنوان کاوشگر استفاده گردید و توسط علی و همکاران انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی نام‌گذاری شد.
از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی نشان‏دار‌شده مکمل با موتیف‌های کوتاه تکرار‌شونده در هیبریداسیون در ژل، با به کارگیری DNAژنومی برش داده شده با آنزیم‌های برشی خاص و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شده است. گوبتا و وارشنی در سال2000 طی تحقیقات خود مراحل زیر را برای انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی مطرح کردند:
جداسازیDNA ژنومی با وزن مولکولی زیاد
هضم DNAژنومی با یک آنزیم محدودگر مناسب
تفکیک قطعه‌های حاصل از هضم روی ژل آگارز
انتقال ساترن قطعه ها به غشا
دو ‏رگ‏گیری غشا با کاوشگر‏های(نشاندار با مواد پرتوزا یا غیر پرتوزا) الیگونوکلئوتیدی دربردارنده‏ی ردیف‌های دو یا سه تایی تکراری
خودپرتونگاری یا رنگ آمیزی برای مشاهده‏ی قطعه‌های دو رگ‌شده.
به‌کمک این روش می‌توان تنوع نواحی تکرار‌شونده‏ی مورد نظر را آشکار کرد. قطعه‌هایی از DNA که با الیگونوکلئوتیدها دو ‌رگ می‌شوند، در دامنه‌ای از اندازه‏ی چند صد جفت تا ده کیلو جفت باز قرار می‏گیرند. هم‌چنین گاهی بیش از یک نوع ماهواره در داخل یک قطعه‏ی برش داده شده قرار می‌گیرد. تفاوت‏هایی که این نوع نشان‌گرها نشان می‏دهند، به دلیل تفاوت در طول قطعه‌های برش داده‌شده‌ای است که در بردارنده‏ی ماهوارک‌ها هستند. از این روش برای شناسایی ژنوتیپ‌ها و همچنین در ژنتیک جمعیت استفاده می‌شود(12).
پس از مدتی، لیت و لوتی و سه گروه دیگر همین روش را برای ریزماهواره‏ها(عمدتا از نوع (CA)n) به‌کار بردند و دریافتند که ریز ماهواره‏ها به دو دلیل به مراتب آسانتر از ماهوارک‌ها با روش PCR تکثیر می‏شوند:
1-ریزماهواره‏ها کوچکتر از ماهوارک‏ها هستند؛
2-ردیف‌های تکرار‌شونده ریز ماهواره‏ای فراوانتر و توزیع آنها در کل ژنوم یکنواخت‌تر ازماهوارک‏هاست(13).
1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCRنشان‌گرهای مبتنی بر PCR نشان‌گرهایی هستند که از توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر برای تکثیر قطعه‏ی خاصی از DNA استفاده می‌کنند. روش‏های مختلف در این گروه، در طول و توالی آغازگرها، سختی شرایط PCR و روش‏های جداسازی و آشکار کردن قطعات با همدیگر فرق دارند.
انواع نشان‌گرهای مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر(AFLP)
DNA چند شکل تکثیر‌شده‏ی تصادفی(RAPD)
تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)
نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف (STS)
1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP)
در سال 1995 نشان‌گرهای جدیدی ابداع و معرفی شدند که به نظر می‌رسد بسیاری از محدودیت‌های نشان‌گر‌های پیشین را نداشته باشند. در این روش که AFLP نامیده می‏شود نشان‌گرهایی تولید می‏شوند که علاوه بر دارا بودن مزایایRFLP مانند دقت و تکرار‌پذیری ویژگی‌های مثبت روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز را نیز دارند. پایه‌ی این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‌ها از بین تمام قطعه‌های هضم شده‌ی DNA است و سه مرحله‌ی مجزا دارد:
هضمDNA با یه جفت آنزیم محدودگر و اتصال آنها به آداپتور‌های اولیگونوکلئوتیدی؛
طراحی، ساخت آغازگر و تکثیر انتخابی دسته‌ای از قطعه‌های حاصل از هضم .با استفاده از ردیف بازی آداپتور‌ها و نیز ردیف بازی نقاط برش، طراحی و ساخت آغازگر انجام می‌شود، اما برای تکثیر انتخابی قطعه‌های حاصل از هضم دو، سه یا چند نوکلئوتید به انتهای’3 ردیف آغازگر اضافه می‌شود که موجب می‌گردد فقط قطعه‌هایی تکثیر‌شوند که ردیف بلافصل آنها در مجاورت نقطه‌ی برش ،مکمل نوکلئوتیدهای یاد شده باشد؛
جداسازی قطعه‌های حاصل از تکثیر روی ژل‌های توالی‌یابی(پلی‌اکریل‌آمید) و خودپرتونگاری یا رنگ‌آمیزی نقره برای ثبت نتیجه‌ها.
با استفاده از این روش تعداد زیادی از قطعه‌های حاصل از هضم، تکثیر و قابل رویت می‌شوند. این در حالی است که نیازی به دانش اولیه در مورد توالی‌بازی قطعه‌هایی که تکثیر می‌شوند، وجود ندارند. هر یک از این قطعه‌هایی که به صورت باند روی ژل ظاهر می‌شوند، می‌توانند به عنوان یک نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرند.
تعداد قطعه‌هایی که با این روش تکثیر می‌شوند، به دقت و توانمندی روش‌های جداسازی (الکتروفورز)، ثبت نتایج و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولا در این روش بین پنجاه تا صد قطعه‌ی حاصل از هضم تکثیر و با استفاده از ژل‌های پلی‌اکریل‌امید واسرشت ساز ثبت می‏شوند(19)
مزایای AFLP
این روش در مقایسه یا سایر روش‌ها بیشترین تعدا نشان‌گر‌ها به ازای هر ژل را ایجاد می‌کند؛
در این روش نیازی به تهیه و تدارک و نگه‌داری کاوشگر نیست .دقت و تکرار‌پذیری این نشان‌گر به دلیل انتخاب دمای زیاد هم رشته‌سازی و اتصال آغازگر به DNA الگو بیشتر از RAPD است(20).
معایب AFLP
پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش‌های میتنی برPCR ؛
عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشان‌گر‌ها؛
غالب بودن این نشان‌گر موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می‏گردد؛
تکثیر قطعه‌های غیر‌واقعی در AFLP موجب کاهش قابلیت اعتماد این روش می‏گردد(20).
1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی(RAPD)در این روش از تک آغازگرهایی به طول هشت تا ده نوکلئوتید که ردیف بازی آن به طور قراردادی تعیین می‌گردد، استفاده می‏شود. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روی دو رشته‏ی DNA ژنومی می‌یابد و در آن نقاط به رشته‌های DNAمتصل می‌شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته‏ی مقابل به هم نزدیک باشند(فاصله‏ای که DNA قابل تکثیر باشد)، ردیف بین آن دو نقطه طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. فراورده‌های واکنش PCRروی ژل آگارز از هم جدا می‏شوند. تولید هر باند بیانگر وجود شباهت زیاد بین ردیف بازی آغازگرها و ردیف بازی محل اتصال درDNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را درDNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل های RAPD بیانگر جهش نقطه‌ای در محل اتصال آغازگرها و یا حذف یا (اضافه) شدن در ناحیه قابل تکثیر است. بنابراین چند شکلی در RAPDمعمولا به شکل حضور و غیاب یک باند پدیدار می‏شود. بدین معنی که نشان‌گرهای RAPD از نوع غالب‌اند و افرادی که دو نسخه از یک آلل دارند، به طور کمی از افرادی که یک نسخه از آن آلل را دارند، قابل تشخیص نیستند. تفاوت طول قطعه‏ها در RAPD از طریق تکثیر قطعه‌های DNA مکمل با ردیف‌های آغازگرهای اختیاری (ردیف مشخص ولی تصادفی) به‌دست می‌آیند. قطعه‏های تکثیر شده به صورت نوارهایی با وزن مولکولی متفاوت به‌طور مستقیم روی ژل قابل مشاهده‌اند (15).
مزایای RAPD
عدم نیاز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غیره؛
امکان بررسی هم زمان چندین جایگاه در ژنوم؛
عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ریف DNA برای ساخت آغازگر(16).
معایب RAPD
عدم تکرار پذیری؛
حساسیت بسیار به آلودگی؛
در صورت تغییر شرایط محیطی ظهور باندهای جدید؛
نامعلوم بودن جایگاه نشان‌گر RAPD روی نقشه‌ی ژنتیکی(16).
1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)تنوع‌ها و تفاوت‌هایی که به واسطه‏ی اختلاف در یک جایگاه نوکلئوتیدی(به علت جایگزینی، حذف یا ازدیاد) اتفاق می‌افتند، با عنوان تفاوت تک نوکلئوتیدی نامیده می‏شوند. این نوع از تنوع به‌وفور در ژنوم انسان اتفاق می‏افتد به طوری که مطالعات انجام گرفته توسط کاتانو-آنولز و گرس هوف (1998) در ژنوم انسان و اسب نشان می‏دهد که در فاصله‏ی هر دویست و پنجاه تا چهارصد نوکلئوتید یک SNP وجود دارد(17).
با اینکه‌SNP ها به وفور در ژنوم انسان یافت می‌شوند، ولی ایجاد و توسعه‌ی نشان‌گرهای SNP چندان آسان نیست. تهیه نشان‌گر‏های SNP شامل مراحل زیر است:
تعیین ردیف DNA اطراف SNP؛
تکثیر قطعه‌ای منحصر به فرد از DNA به کمک PCR به منظور غربال SNP؛
شناسایی SNP که شامل مشاهده‌ی دو آلل در افراد مختلف می‌باشد؛
مکان‌یابی نشان‌گر SNP و تعیین جایکاه خاص کروموزومی آن؛
تعیین فراوانی دو آلل در جمعیت؛
بررسی SNP در افراد و ژنوتیپ‌های مختلف(17).
برخی از معایب نشاگرهای SNP
SNPها به دلیل داشتن فقط دو آلل در یک جایگاه ژنی نسبت به نشان‌گر‌های چند آللی، اطلاعات کمتری را در نقشه‌های پیوستگی نشان می‌دهند؛
شناسایی نشان‌گرSNP بسیار پر‌هزینه و هم‌چنین زمان‌بر است(17).
1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف(STS)هر نشان‌گری که مبتنی بر واکنش PCR باشد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (معمولا بیش از بیست نوکلئوتید) ایجاد شود، یک نقطه‌ی نشانمند از ردیف نامیده می‏شود، زیرا پیش از طراحی آغازگر، بی‏شک در یک مرحله ردیف‌یابی صورت گرفته است. نشان‌گرهایی همچون تفاوت طول قطعه‌های قابل تکثیر (ALP) و ریزماهواره‏ها از آن جهت که مستلزم ردیف‏یابی برای طراحی آغازگر به منظور تکثیر DNA در یک نقطه‌ی خاص هستند، ذیل STS دسته‌بندی می‌شوند:
-تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
-ریز ماهواره‌ها (18).
1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
ALP یکی از ساده‏ترین و سریع‏ترین نشان‌گرهای مبتنی بر PCR است. اگر ردیف باز‏های قطعه‏ای از DNA در یک موجود مشخص باشد (یا دست کم بخشی از دو انتهای آن قطعه معلوم باشد)، براساس آن می‏توان به طراحی و ساخت مصنوعی آغازگرهایی به طول بیست تا سی نوکلئوتید اقدام کرد. چنان‌چه نمونه‏های مختلف DNA توسط این آغازگرها و از طریق واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز تکثیر و سپس روی ژل الکتروفورز از هم جدا شوند، در صورت وجود اختلاف در طول قطعه‏ی قابل تکثیر، باندهایی به اندازه‏های مختلف تولید خواهند شد که بیانگر وقوع پدیده‏ی حذف یا اضافه در بین نمونه‏های مورد مطالعه است. این تفاوت در اندازه‏ی قطعه‏های قابل تکثیر که جهش‏های ژنتیک را نشان می‏دهد به عنوان نشان‌گرهای ژنتیک مورد استفاده قرار می‏گیرد(14).
مزایای ALP
از نظر کاربردی در بین نشان‌گرهای DNA،یکی از سریع ترین و ارزان‌ترین‌ها است؛
به‌کاربرد مواد پرتوزا یا بیوشیمیایی پیچیده نیاز ندارد؛
به‌تدارک، نگهداری و کاربرد کاوشگرها نیاز ندارد؛
بسیار اختصاصی عمل می‌کند، تکرار پذیری آن خوب است و تا حد بسیار زیادی می‌توان به نتایج آن اعتماد داشت؛
به‌مقدار خیلی کمی از DNA نیاز است؛
هم‌بارز بودن این نشان‌گر امکان تشخیص افراد خالص از هر یک از انواع افراد ناخالص را فراهم می‌آورد(14).
معایب ALP
طراحی و ساخت آغازگرها، به اطلاعات اولیه در مورد ردیف DNAژنوم مورد مطالعه نیاز دارد که با توجه به اینکه ژنوم بسیاری از موجودات به طور کامل در دسترس نیست این روش استفاده بسیار کمی دارد؛
هزینه‌ی اولیه مورد نیاز به منظور تولید تعداد کافی نشان‌گر ژنتیک با توزیع مناسب در سرتاسر ژنوم بسیار زیاد و مستلزم صرف وقت است(14).
1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌هاریزماهواره‏ها شامل واحدهای یک الی شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت‏ها پراکنده‏شده‏اند. به طوری که در هر ده کیلو جفت باز از ردیف DNA دست کم یک ردیف ریزماهواره‏ای دیده می‏شود. طول ریز‌ماهواره‏ها معمولا کمتر از 100 جفت باز بوده و توسط دو ردیف منحصر به فرد در دو طرف محدود شده‏اند. ریزماهواره‏ها به سه گروه عمده‌ی تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولا توسط بازهای غیرتکرارشونده قطع می‌شوند) و تکرارهای مرکب(دو یا تعداد بیشتری از واحدهای مجاور یکدیگر) تقسیم می‏شوند. تعداد تکرارها در هر واحد بسیار متفاوت است. حداقل تعداد واحد تکرار‌شونده برای ریز ماهواره‏های دو نوکلئوتیدی به ترتیب ده و هفت بار تکرار تعیین شده است(21).
مزایای ریزماهواره‏ها
کاربرد آنها و تفسیر نتایج نسبتا ساده است؛
سیستم چند آللی(تا 11 آلل) از ویژگی‌های بارز این نوع نشان‌گر است؛
ریزماهواره‌ها بسیار متنوعند؛
به وفور در ژنوم یوکاریوت‏ها یافت می‏شوند؛
بیشتر ریزماهواره‏ها غیر‏عملکردی هستند؛
همبارز هستند [22].
1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنومریزماهواره‌ها بسیار فراوان بوده و در کل ژنوم موجودات به صورت تصادفی پراکنده اند. فراوانی ریزماهواره ها در بین موجودات زنده متفاوت است. برای مثال تخمین زده شده است که ژنوم انسان به طور میانگین ده برابر بیشتر از گیاهان ریزماهواره دارد. علاوه برDNA کروموزومی تعداد زیادی ریزماهواره در DNA کلروپلاست ها نیز گزارش شده است. به کمک روش‏هایی از قبیل دورگه‏گیری در ژل، نقشه‏یابی ژنتیکی و فیزیکی و هم چنین دورگه‏گیری در محل فلورسنت، ثابت شده است که ریزماهواره ها به طور یکنواخت در ژنوم پراکنده‏اند. اگرچه در برخی موارد می توانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند(12).
1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراریچنین فرض می‏شود که جهش در تعداد واحدهای تکرار شونده در هر یک ازDNA های تکرار شونده با یکی از دو سازوکار کراسینگ آور نامساوی(uco) یا جفت نشدن ناشی از سرخوردن در طول رشته (خطای همانندسازی DNA ) صورت می‏گیرد. بیشتر عقیده بر این است که ریزماهواره‏ها و ماهواره‏ها توسط سازوکار کراسینگ آور نامساوی ایجاد می‏شوند، ولی در مورد ریزماهواره‏ها برخی افراد یکی از دو سازوکار و برخی دیگر هر دو سازوکار را موثر می‏دانند(23).
1-5-1 کراسینگ اور نابرابرگاهی کراسینگ اور نابرابر در داخل تکرارهای ریزماهواره‏ای بین کروموزوم های مشابه یا خواهری اتفاق می‏افتد و سبب تغییر در تعداد واحدهای تکرار شونده می‏شود.(شکل 1-2).کراسینگ اور نابرابر می‏تواند هم در میوز و هم میتوز اتفاق بیفتد. چنین توجیه می‏شود که وجود نواحی تکرارشونده احتمالا مانع از ردیف شدن کامل در همولوگ یا کروموزوم‏های خواهری می‏شود. به نظرمی‏رسد که این نوترکیبی مکانیزم اصلی ایجاد تنوع مینی‏ستلایتی است(23).

شکل 1-2 کراسینگ آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف شدگی یا الحاق می‌شود(23.)
1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردن DNA در طول رشته(خطاهای همانند سازی)گاهی DNA پلی‌مراز در طول همانند سازی در نواحی تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای سر می‏خورد و موجب تغییر در تعداد واحد تکرار شونده می‏شود. در حقیقت سر خوردن پلی‌مراز در طول نواحی تکراری موجب عدم جفت شدن کامل دو رشته‏ی DNA شده و در نهایت حلقه‌هایی در رشته‌ی الگو یا رشته‏ی جدید ایجاد می‏شود(شکل1-3). این امر مکانیسم اصلی به وجود آورنده‏ی چندشکلی در میکروستلایت‌هاست(23).

شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد(23).اگر نتیجه‏ی همانند سازی ایجاد واحد های تکرار شونده‏ی اضافی باشد، حلقه در رشته ی جدید و اگر نتیجه‌ی همانند سازی کاهش در تعداد واحد‏های تکرار شونده باشد، حلقه در رشته‏ی الگو تشکیل خواهد شد(23).
گلدستین و شلوترر فرضیه‏ی عدم جفت شدن ناشی از سر‏خوردن در طول رشته را نسبت به فرضیه کراسینگ آور نامساوی به دلایل زیر به واقعیت نزدیکتر دانسته‏اند:
الف)‌در انسان بسیاری از تغییرات ریز ماهواره‏ای موجب تغییر در نشان‌گر های مجاور ناحیه ی ریز ماهواره‏ای نمی‌شود. بنابراین در ایجاد چنین تغییراتی نوترکیبی بی‏تاثیر است. از آنجا که جهش در فرضیه کراسینگ اور نامساوی، وابسته به نوترکیبی است، تغییرات ریز ماهواره ای و عدم تغییر نقاط مجاور با این فرضیه قابل توجیه نیست.
ب)‌نقصان در ژن‏هایی که در نوترکیبی نقش اساسی دارند تاثیری در پایداری ریز ماهواره‏ها ندارد.
ج)‌مطالعات انجام گرفته در ساکارومایسزسرویزیه نشان می‏دهد که پایداری ریز ماهواره‏ها در سلول‏هایی که تقسیم میوز را انجام می‏دهند مشابه با یاخته ها در تقسیم میتوز است. با توجه به اینکه نوترکیبی در میوز بیشتر از میتوز است، پس اگر فرضیه‏ی کراسینگ اور نامساوی صادق باشد، باید ریز ماهواره‏ها در میوز ناپایدارتر از میتوز باشد(23).
1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشوندهدو مدل متفاوت برای توصیف دامنه‏ی تنوع تعداد واحدهای تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای وجود دارد:
1.مدل جهش گام به گام
2. مدل آللی نا محدود
1-6-1 مدل جهش گام به گاماگر فرض کنیم در ریزماهواره‏ها یک گام معادل تغییر در یک واحد تکرار شونده باشد، بنابر این مدل ریز ماهواره‏ها از نظر اندازه فقط در تعداد محدودی گام تفاوت دارند، به‌طوری که هر گام از گام بعدی به وسیله‏ی یک واحد تکرار شونده جدا می‏شود. در این مدل چنین فرض می‏شود که بسیاری از جهش‏های با فراوانی زیاد، فقط ریزماهواره‏ها را در یک گام یا دو گام‌(در یک زمان) تغییر می‏دهند. طرفداران این نظریه معتقدند که در بیشتر آزمایش‏ها، بیشترین تغییر در ساختار ریزماهواره‏ها مربوط به افزایش یا کاهش در یک واحد تکرار شونده بوده است(10).
1-6-2 مدل آللی نا‏محدودبر اساس این مدل هیچگونه محدودیتی در اندازه‏ی پتانسیل ریزماهواره‏ها وجود ندارد. از این رو تعداد نا محدودی از انتخاب‏ها می‌توانند اتفاق بیفتند که تمامی آنها احتمال یکسان را داشته باشند.
بسیاری از پژوهشگران معتقدند که ترکیبی از این دو مدل(عموما تغییر در یک یا دو واحد تکرار شونده و به مقدار کمتر تغییرات بزرگتر) بهتر می‌تواند تغییرات جهشی در ریزماهواره‏ها را توضیح دهد(10).
1-7 مارکرهای STRتوالی‏های تکراری کوتاه پشت سر هم(STRS) ، توالی‏های تکرارشونده کوتاه با طول 1-13 نوکلئوتید هستند که به شکل سر به دم قرار می‏گیرند. در ژنوم انسان، معمول‏ترینSTR ، توالی دو نوکلئوتیدی [CA]n است،که در این فرمول n تعداد تکرارهاست که معمولا بین 5 تا 20 بار متغیر است(24).
1-8 کاربرد مارکرهای STRمارکرهایSTR کاربردهای فراوانی دارد که از مهمترین آنها تعیین هویت افراد است(25). تعیین هویت در موارد بسیاری کاربرد دارد که از جمله‏ی آنها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
1- مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی
2- شناسایی هویت قربانیان حوادث
3- تعیین هویت در موارد جنایی
4- ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی(26).
1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلیاز مارکرهایSTR می توان برای بررسی خویشاوندی دو یا چند نفر استفاده کرد. این نوع مطالعه را آنالیز فامیلی می‌گویند و کاربرد متداول آن در بررسی رابطه والدین ـ فرزندی است(27).
هرساله بیش از 300000 مورد تست ابویت به منظور تعیین رابطه پدر فرزندی در ایالات متحده انجام می‏شود. این تست‏ها معمولا شامل یک مادر، یک کودک و یک یا چند پدر مدعی است. همانطور که می‏دانیم هر فرد دارای دو سری آلل می‏باشد که یک سری آن را از پدر و سری دیگر را از مادر دریافت کرده است. بدین منظور آلل‏های پدر و فرزند برای یافتن تعدادی از جایگاه‏هایSTR مورد بررسی قرار می‏گیرند. اساس این تست بر این است که در فقدان جهش، آلل‏های کودک باید مطابقت کاملی با آلل‏های پدری و مادری داشته باشد(28-29-30).

شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد(26).علاوه بر این بسیاری از افراد برای شناسایی اقوام خود از مارکرهایSTR استفاده می‏کنند. برای مثال با آنالیز STR های کروموزومY می توان نسبت فامیلی میان مردان یک خانواده را مشخص کرد. زیرا همان‌طور که می‏دانید کروموزومY توارث پدری دارد و از پدر به تمام پسران به ارث می‌رسد. پس طبیعی است که تمام پسران خانواده در همه‏ی نسل‌هاSTR های یکسانی روی کروموزوم Y خود داشته باشند. آزمایشی که بدین منظور انجام می‏گیرد آزمایش Y-filer نامیده می‏شود. به کمک این آزمایش می‏توان روابط میان برادرها، عمو و برادرزاده و... را مشخص نمود(27-31).
1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادثفجایع بزرگ، طبیعی یا بدست بشر، می‌تواند جان افراد بسیاری را بگیرد، تست‏‏‏هایی که برای شناسایی قربانیان حادثه انجام می‏شود، تست تعیین هویت قربانیان حادثه نامیده می‏شود. از این تست در مواردی مانند سقوط هواپیما ،آتش سوزی‏های بزرگ و حوادث تروریستی استفاده می‏شود. در این قبیل حوادث با استفاده از اسامی افراد، خانواده‏های آنها شناسایی می‏شوند و پس از مراجعه‏ی خانواده‌ها، از اعضای خانواده شامل پدر، مادر، فرزند، خواهر و برادر نمونه‏ی DNA گرفته می‏شود و نواحی STR آنها بررسی می‏شود. پس از این مرحله با استفاده از DNAبه دست آمده از بقایای اجساد پروفایل ژنتیکی آنها تهیه می‏شود و در نهایت با مقایسه‏ی پروفایل‏های تهیه شده هویت قربانیان شناسایی می‏شود(32).
1-8-3 تعیین هویت در موارد جناییتعیین هویت در موارد جنایی شامل دو بخش می‏باشد:
شناسایی افراد مجهول الهویه
ردیابی مجرمین(25).
1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویههر ساله میلیون‏ها نفر در سراسر جهان تحت شرایط مشکوکی مفقود می‏شوند. بسیاری از این افراد قربانی فعالیت‏های مجرمانه از قبیل تجاوز و قتل می‏شوند و هویت آنها ناشناس باقی می‏ماند. در این موارد هم می‏توان از مارکرهای ژنتیکی موجود در DNA افراد برای تعیین هویت آنها استفاده کرد(33).
سه دسته نمونه در مورد افراد قربانی وجود دارد:
1-نمونه مستقیم از فرد قربانی
2-نمونه خانواده قربانی
3-نمونه‌های ناشناس باقی مانده از انسان در صحنه‏ی جرم
این نمونه‏ی باقی مانده می‏تواند استخوان، دندان، بافت، تار مو، لکه ی خون و یا هر چیز دیگری باشد(34).
1-8-3-2 ردیابی مجرمینعلاوه بر این می‏توان از آنالیز DNA برای ردیابی و شناسایی مجرمین استفاده کرد. این که فردی مرتکب جرم و جنایتی بشود و نمونه‌ای از DNA خود را به جا نگذارد، تقریبا غیرممکن است. مو، لکه‌های خون و حتی اثر انگشت، مقادیر بسیار جزئی از DNA را دارند که برای مطالعه با PCR کافی هستند. این بررسی‌ها لازم نیست که بلافاصله انجام شوند، زیرا در سال‌های اخیر، با آزمایش DNA روی مواد بایگانی شده، تعدادی از جنایات گذشته ـ با عنوان پرونده‌های مختومه ـ نیز روشن شده است(35).
باید به خاطر داشته باشیم که یک پروفایل DNA به تنهایی فاقد اعتبار است و کاربردی ندارد. همیشه برای بررسی یک پروفایل DNA نیاز است که یک مقایسه‏ای انجام شود:
1-نمونه ی مورد بررسی که با Q مشخص می شود
2-نمونه شناخته شده که با K نمایش داده می شود
در موارد جنایی، نمونه ی صحنه ی جرم (Q) با نمونه ی فرد مظنون (K) و یا مظانین (K1,K2,K3,K...) مقایسه می شود . در یک مورد بدون مظنون، نمونه ی صحنه ی جرم با نمونه هایی که در اطلاعات کامپیوتری از افراد سابقه دار وجود دارد، بررسی می شود . (K1,K….,KN)(34).

شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای STR(26).1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتیباستان شناسان با بررسی و مقایسه توالی DNA انسان‌های امروزی با افراد مرده، به کشف منشأ تکاملی انسان امروزی و مسیرهای استقرار انسان در کره زمین می‌پردازند. این زمینه تحقیقاتی آرکئوژنتیک نامیده می‌شود(35).
ردیابی مهاجرت انسانی در طول تاریخ با استفاده از آنالیز DNA روش نوینی است. هدف از این کار تخمین ارتباط میان جمعیت ها بر اساس شباهت‏ها و تفاوت‏هایDNA آنها است. به همین منظور پروژه‏ی عظیمی در سال2005 به منظور ردیابی تاریخ بشر انجام شد که در آن از ده ها هزار نفر از افراد در سراسر جهان آزمایش به عمل آمد. اساس کار بر این مطلب است که اگر تکامل ژنوم‏ها به دلیل انباشتگی جهش ها رخ داده باشد، بنابراین میزان اختلاف در توالی نوکلئوتید های دو ژنوم می تواند زمان حضور جد مشترک آنها را مشخص نماید. انتظار می رود دو ژنومی که اخیرا از یکدیگر جدا شده اند در مقایسه با دو ژنومی که جد مشترک آنها قدیمی‏تر است، اختلاف کمتری داشته باشند(36).
در مطالعه روی یافتن مبدا انسان‏های امروزی و الگوی جغرافیایی مهاجرت‏های بشر از مطالعه‏ی ژن‏ها در جمعیت‏ها می‏توان استفاده کرد. بدین منظور ژن‏های انتخابی جهت بررسی باید دارای گوناگونی باشند. در صورت فقدان گوناگونی ژن‏ها، اطلاعات فیلوژنتیکی بدست نمی‏آید، زیرا همه‏ی افراد حتی اگر به جمعیت‏های مجزایی تقسیم شده باشند که تنها به صورت متناوب با یکدیگر آمیزش داشته‏اند، همچنان دارای همانندی‏های بسیاری خواهند بود. بدین معنی که توالی DNA مورد استفاده در آنالیز فیلوژنتیکی باید از متنوع ترین توالی‏های متغیر باشد(36).
در انسان از سه نوع توالی استفاده می‏شود :
ژن های چند آللی مانند اعضای خانواده‏ی HLA، که اشکال بسیار متفاوتی دارند .
ریز ماهواره‏ها که STR ها نیز جز این گروه به حساب می‏آیند .
DNA میتوکندریایی که به دلیل فقدان سیستم‏های ترمیمی موجود در هسته‌های سلول انسان که نسبتا به سرعت دچار انباشتگی نوکلئوتیدی می‏شوند. انواع مختلف DNA میتوکندریایی موجود در یک گونه را هاپلوگروه می‏نامند(36).
باید توجه نمود که آلل‌ها و هاپلوگروه‌های مختلف به طور هم‌زمان در جمعیت‌ها وجود دارند. به این ترتیب این لوکوس‏ها چند شکلی بوده و به کمک مقایسه ترکیب آلل‌ها و یا هاپلوگروه‌های آنها می‌توان اطلاعات مربوط به وابستگی بین افراد مختلف را بدست آورد. به دلیل جهش‌های ایجاد شده در سلول‏های تولید مثلی هر یک از موجودات، آلل‏ها و هاپلوگروه‏های جدیدی در جمعیت ظاهر می‏شوند. هر یک از آلل‏ها، فراوانی آللی خود را دارند که در طول زمان به دلیل انتخاب طبیعی و تغییر ژنتیکی اتفاقی تغییر می‌کند. انتخاب طبیعی به دلیل تغییر در تناسب (توانائی یک موجود جهت بقا و تولید نسل) رخ می‌دهد و بنابر نظریه‌ی داروین منجر به حفظ انواع مناسب و از بین رفتن انواع زیان آور می‏گردد. به این ترتیب انتخاب طبیعی، فراوانی آلل‏های کاهنده‏ی تناسب را کم کرده و فراوانی آلل‏های افزاینده‌‌ی تناسب را افزایش می‏دهد. در حقیقت در یک جمعیت آلل‏های اندکی ایجاد می‏شوند که تاثیر قابل توجهی بر تناسب موجود داشته باشند، اما هم‌چنان فراوانی آنها به دلیل تغییر ژنتیکی اتفاقی که جز جدا نشدنی طبیعت تولد،تولید مثل و مرگ است در حال تغییر می‏باشد. به دلیل انتخاب طبیعی یا تغییر ژنتیکی اتفاقی ممکن است یک آلل در جمعیت غالب شده و فراوانی آن به صد در صد نیز برسد، به طوریکه این آلل در جمعیت تثبیت شود. اگر یک گونه به دو جمعیت تقسیم شود به طوریکه آمیزش‌های فراوانی بین دو جمعیت رخ ندهد، فراوانی آلل در دو جمعیت به طور مختلف تغییر می‌کند. بنابراین پس از چند ده نسل این دو جمعیت ویژگی‏های ژنتیکی مجزایی را کسب می‏کنند. سرانجام جایگزینی ژنی متفاوتی در این دو جمعیت اتفاق می‏افتد ولی حتی قبل از آن نیز می‏توان از روی اختلاف فراوانی آللی در دو جمعیت، آن دو را از هم باز شناخت(36).
محققان طی سال‏ها تحقیقات در سراسر جهان با استفاده از اصول تئوری اطلاعات، پارامترهای عمومی برای هر جمعیت را به منظور تعیین مقدار اطلاعاتی که مارکرهای STR در جمعیت‏ها به ما می‏دهند، تعریف کردند. در یک نمونه‏گیری از مارکرهای افراد از سراسر جهان، مارکرهایی که بیشترین چندشکلی را در میان جمعیت‏های مختلف داشتند و منحصر به جمعیت‏های خاص بودند، انتخاب شدند .امروزه از این مارکرها برای بررسی تنوع و تفاوت میان جمعیت‏ها استفاده می‏شود(37).
1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STRمارکرهای مختلف STR تحت عنوان کیت های تجاری مختلف در کنار تست‏های تعیین هویت کاربردهای گسترده‏ی دیگری دارند که از مهم ترین آنها می‏توان به موارد زیر اشاره کرد:
جمع آوری سلول های جنینی از خون مادر؛
بیماری های نقشه‏ی ژنومی؛
مشخص نمودن خطوط سلولی؛
تعیین هویت افراد استفاده کننده‏ی سرنگ مشترک؛
تشخیص کلون‏های موفق؛
بررسی و نظارت بر روی پیوند عضو؛
تشخیص کایمرهای ژنتیکی؛
تشخیص تومورهای سرطانی(26).
1-9-1 جمع آوری سلول های جنینی از خون مادرهنگامی که یک خانم باردار است تعدادی از سلول‌های جنینی می‏توانند از راه جفت وارد جریان خون مادر شوند. جمع‌آوری این سلول ها که تحت عنوان micro chimerism خوانده می‏شود و بررسی آنها با مارکرهای STR یک روش غیر تهاجمی برای تعیین رابطه‌ی پدر فرزندی است. همچنین با استفاده از این روش می‏توان جنسیت جنین را نیز تعیین نمود(26).
1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها
اسکن ژنوم انسان برای شناسایی نقشه ژنوم بیماری‏ها به طور معمول با استفاده از حدود چهارصد نشان‌گر STR در سراسر ژنوم در فواصل 10 سانتی مورگان انجام می‏شود. مرکز تحقیقات بیماری‏های ارثی در طول سال ها مطالعات و آزمایشات بسیاری را روی صدها نفر با استفاده از مارکرهای STR انجام داده است. هدف از این آزمایشات یافتن ارتباط میان فراوانی آللی در جمعیت های مختلف و بیماری های ژنتیکی بود. در پژوهش‌های صورت یافته ارتباط میان برخی مارکرها و بیماری‏ها مشخص شد. پس از آن از مارکر‏های مذکور می‏توان برای شناسایی تعیین دقیق محل ناشناخته‏ی ژن بیماری استفاده کرد(26).
1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترکیکی دیگر از کاربردهای مارکرهایSTR نشان دادن به اشتراک گذاری سرنگ در میان مصرف کنندگان مواد مخدر است. با این روش و با استفاده ازجایگاه D8 آزمایشگاه قادر به تشخیص هویت فرد و یا افرادی است که از یک سرنگ مشترک برای تزریق مواد مخدر استفاده کرده‏اند. با این روش می‏توان هویت شخصی را که منشا انتقال بیماری عفونی بوده و از سرنگ مشترک با سایر افراد استفاده می‏کرده تعیین نمود(26).
1-9-4 تشخیص کلون‏های موفقهنگامی که یک موجود کلون می‏شود ازSTR Typing برای آزمایش آن موجود استفاده می‏شود. برای مثال در کلون کردن موجوداتی مانند سگ و گربه. این روش برای آزمودن میزان موفقیت در کلون کردن به کار می‏رود. اگر یک پروفایل STR یکسان میان موجود کلون شده و سلول‎های مادری اولیه مشاهده نشود، در این صورت کلون کردن موفقیت آمیز نبوده(26).
1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضواز کاربردهای دیگر مارکرهای STR، نظارت پیوند سلول‏های پیوند شده بعد از پیوند مغز استخوان است، آزمایش STR از فردی که پیوند گرفته می‏تواند در تشخیص نارسایی پیوند مفید واقع شود(26).
1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکیChimerism حضور دو خط سلولی ژنتیکی متفاوت در یک ارگانیسم است که می‏تواند از طریق پیوند سلول‏های بنیادی خونی و یا انتقال خون و یا به طور ارثی در شخص اتفاق بیفتد. در سال 2004 آزمایشی روی افراد دهنده و گیرنده‏ی پیوند انجام شد که توانایی بالای 27 نشان‌گر STR به کار گرفته شده، ازجمله نشان‌گرهای CODIS در تشخیص کایمرها شگفت انگیز بود(26).
1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولیدر آزمایشگاه خطوط سلولی می‏توانند با سایر خطوط سلولی آلوده شوند. در نتیجه ممکن است با هم مخلوط و یا به یکدیگر تبدیل شوند احراز هویت خط سلولی انسان در حال حاضر به وسیله ی سازمانی در آمریکا انجام شده است. به کمک مارکرهای STR می‏توان آلودگی متقاطع بین خطوط سلولی مختلف را به سرعت کشف کرد و همچنین می‏توان برای مشخص کردن خطوط سلولی انسان به عنوان یک مرجع جهانی سود جست. در طول چند سال گذشته بیش از 500 خط سلولی از انسان به کمک این روش و با استفاده از 8 جایگاه STR بدست آمده است(26).
1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانیفقدان هتروزیگوسیتی (LOH) پدیده‏ای است که در آن حذف در یک ناحیه‏ی لوکوس منجر به عدم تکثیر در PCR می‏شود، به طوری که یک هتروزیگوت واقعی به عنوان یک هموزیگوت به نظر می رسد. این پدیده در بسیاری از افراد مبتلا به تومورهای سرطانی دیده می‏شود. بررسی روی بافت های سرطانی با بافت نرمال با استفاده از STR نشان می‏دهد که جایگاه های مختلف در بافت سالم ارتفاع بلندتری نسبت به بافت های سرطانی نشان می دهند؛چرا که LOH سبب حذف در آن ناحیه شده است(26).
1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولیدو روش کلی برای شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی عبارتند از:
اثر انگشت ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگر
تعیین الگوی DNA با PCR توالی‌های کوتاه تکراری(38).
1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگراولین روشی که در آنالیز DNA با هدف شناسایی افراد به کار رفت، روشی بود که در اواسط دهه 1980 توسط سر آلک جفری از دانشگاه لیستر ارائه شد . این روش براساس نوع دیگری از تنوع ژنوم انسان، موسوم به توالی تکراری بسیار متغیر پراکنده بود. همانگونه که از نام این توالی‌ها بر می‌آید، این توالی‌ها عبارتند از یک توالی تکراری که در جایگاه مختلفی‌(به‌طور پراکنده) از ژنوم انسان وجود دارد. نکته کلیدی این توالی‌ها این است که جایگاه ژنتیکی آنها متنوع است و در افراد مختلف در جایگاه‌های مختلفی از ژنوم قرار دارند(38).
توالی که در ابتدا برای انگشت‌نگاری ژنتیکی بکار رفت، توالی GGGCAGGANG (N: هریک از چهار نوکلئوتید) بود. برای تهیه اثر انگشت یک نمونه، DNA آن را با آنزیم محدودگر برش می‌دهند و قطعات حاصل را با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم تفکیک کرده و با آزمون ساترن بلات مورد بررسی قرار می‌دهند. هیبریداسیون با جستجوگری که دارای این توالی بود چند سری از نوارها را مشخص کرد. هریک از این نوارها مربوط به قطعه‌ای از DNA هضم شده بود که دارای این توالی تکراری بود. به دلیل تنوع جایگاه‌های این توالی اگر این آزمون با نمونه DNA فرد دیگری تکرار شود، نتیجه متفاوتی به دست می‌آید و می‌توان نتایج حاصل را انگشت‌نگاری ژنتیک این افراد محسوب نمود . در شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی نشان داده شده است(38).

شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی(38)
1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت نگاریاین روش در کارهای جنایی خود را بسیار ارزشمند نشان داد اما سه محدودیت داشت:
مقادیر بالایی از DNA برای انجام آزمون مورد نیاز است، زیرا این روش نیازمند آنالیز هیبریداسیون است. برای انگشت‌نگاری نمی‌توان از مقادیر اندک DNA موجود در مو و لکه‌های خون استفاده کرد.
بحث کردن در مورد الگوهای حاصل از انگشت‌نگاری مشکل است، زیرا نوارهای حاصل شدت و ضعف‌های متفاوتی دارند. از نظر قانونی، کوچک‌ترین اختلاف شدت در انگشت‌نگاری ژنتیکی یک متهم برای برائت او کافی است.
با وجود اینکه جایگاه‌های تکراری پراکنده بسیار متنوع هستند، اما اندک احتمالی نیز برای یکسان بودن یا حداقل تشابه الگوی حاصل از دو فرد وجود دارد. این موضوع می‌تواند منجر به برائت یک متهم شود(38).
1-10-2 روش پروفایلینگ
روش قدرتمند پروفایلینگ DNA چنین مشکلاتی را ندارد. در پروفایلینگ از توالی‌های معروف به توالی‌های چند شکلی STR استفاده می‌شود. در این روش، به وسیله PCR با پرایمرهایی که به توالی‌های جانبی STR می‌چسبند، به سرعت می‌توان مقادیر بسیار اندک DNA را افزایش داد. بعد از PCR، محصولات از نظر اندازه نوارها یا وجود نوارهایی که الل‌ یا آلل‌های موجود در نمونه DNAی مورد آزمون هستند، با الکتروفورز ژل آگارز بررسی می‌شوند. روش پروفایلینگ DNA، به دلیل استفاده از PCR بسیار حساس است و امکان انجام آزمون روی مو و دیگر نمونه‌هایی که مقادیر اندکی DNA دارند، فراهم می‌آورد. در نتایج حاصل نیز شکی وجود ندارد و مقایسه میان پروفایل‌های DNA معمولا به عنوان یک مدرک پذیرفته می‌شود. با استفاده از این روش امکان اینکه دو نفر، البته بجز دوقلوهای یکسان، دارای پروفایل‌ مشابهی باشند برابر یک در 1015 می‌باشد. با توجه به جمعیت کره زمین که حدود 109×6 می‌باشد، امکان تشابه آماری پروفایل مربوطه در دو نفر به قدری اندک است که می‌تواند غیرممکن تلقی گردد. نوع هر STR با PCR بوسیله پرایمرهایی که با فلورسنت نشاندار شده‌اند و به دو طرف نواحی تکرار شونده متصل می‌گردند، تعیین می‌شود. سپس الل‌های موجود در STRها با تعیین اندازه به وسیله ژل الکتروفورز موئینه‌ای مشخص می‌شوند. دو یا چند STR می‌تواند با PCR چندگانه مشخص گردد، مشروط به اینکه محصولات از لحاظ اندازه همپوشانی نداشته باشند یا هر جفت پرایمر با فلورسانت متفاوتی نشاندار شده باشند تا امکان تشخیص در ژل الکتروفورز موئینه را داشته باشند. در شکل 1-7 مراحل روش پروفایلینگ نشان داده شده است‌(38).

شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ ‌DNA(36).1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR
مارکرهای STRبرای اولین بار به عنوان ابزاری قوی در تست تعیین هویت انسانی در سال 1990 به‌کار گرفته شدند. دستگاه پزشکی قانونی ((FSS مطالعه برای شناسایی جایگاه‌های جدید و ارتباط جایگاه های شناخته شده با تنوع در جمعیت‏ها را آغاز کرد. پس از آن پلیس سلطنتی کانادا (RCMP) به همراه تعدادی از آزمایشگاه‌های اروپا تلاش‌های اولیه را در رابطه با جایگاه های STR آغاز کردند. اولین جایگاه‏های مورد استفاده شامل چهار جایگاه TH01،VWA ، FES/FPS و.F13A1 نسل دوم کیت‌ها ((SGM شامل جایگاه‌های TH01، VWA‌، FGA ،D8S1179 ،D18S51 و D21S11 بود. پایگاه داده‌های ملی DNA انگلستان ((NDNAD در سال 1995 جایگاه ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت) را به کیت SGM اضافه کرد. با توجه به تکنولوژی STR Typingو موفقیت‏هایی که در این زمینه در انگلستان به‌دست آمد، FBI درصدد برآمد که با استفاده از لوکوس‌های STR، بنیان CODIS را شکل دهد(41).
1-12 CODIS چیست؟سیستم شاخص اندیس‌دهی ترکیبی CODISشامل سیزده جایگاه STRاست. در شکل 1-8 محل قرارگیری این جایگاه‌ها روی کروموزوم‌های انسان نشان داده شده‌اند. نرم افزار CODIS در سال 1990 به عنوان نرم افزاری برای FBI تاسیس گردید. این نرم افزار در صورت اولیه برای آنالیز پروفایل‏های RFLP مورد استفاده قرار می‏گرفت که در بانک اطلاعاتی قابل جستجو بود. تکنولوژی DNA پزشکی قانونی و تکنولوژی کامپیوتری با یکدیگر ادغام گردیدند و باعث بهبود این نرم افزار شدند و این بهبود در جهت نیاز‌های پزشکی قانونی صورت گرفت. در سال 1997نرم افزار CODIS بر اساس مارکرهای STR طراحی شد. سیزده جایگاه STRکه امروزه تحت عنوان CODIS خوانده می‏شوند، عبارتند‌از:
D8S2179
D21S11
D7S820
CSF1PO
D3S1358
TH01
D13S317
D16S539
VWA
TPOX
D18S51
D5S818
FGA (42).

شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم های انسان(25).1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت
برای تعیین هویت از کیتAmp FI STR Identifiler PCR Amplification استفاده می‌شود، که حاوی 15 جایگاه تترانوکلئوتید STRبه همراه مارکر آمیلوژنین که برای تشخیص جنسیت به کار می‏رود می‏باشد. از این پانزده جایگاه، سیزده جایگاه، جایگاه‌های شناخته شده‏ی سیستم اندیس دهی ترکیبی‌(CODIS) هستند، اما علاوه بر آنها دو جایگاه دیگر هم در این کیت گنجانده شده است. جدول(۱-1) نشان دهنده‌ی نام جایگاه‏های موجود در CODIS، به همراه موقعیت کروموزومی هر یک از جایگاه‏ها و آلل‏های موجود در هر جایگاه است(43).
جدول 1-1 جایگاه‏های موجود در کیت ABIآلل‌های موجود در هر جایگاه موقعیت کروموزومی نام جایگاه
8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 8 D8S2179
24,24.2,25,26,27,28,28.2,29,29.2,
30,30.2,31,31.2,32,32.2,33,33.2,
34,34.2,35,35.2,36,37,38 21q11.2-q21 D21S11
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 7q11.21-22 D7S820
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 5q33.3-34 CSF1PO
12,13,14,15.16,17,18,19 3p D3S1358
4,5,6,7,8,9,9.3,10,11,13.3 11p15.5 TH01
8,9,10,11,12,13,14,15 13q22-31 D13S317
5,8,9,10,11,12,13,14,15 16q24-qter D16S539
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,
26,27,28 2q35-37.1 D2S1338
9,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15,
15.2,16,16.2,17,17.2 19q12-13.1 D19S433
11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,
22,23,24 12p12-pter VWA
6,7,8,9,10,11,12,13 2p23-2per TPOX
7,9,10,10.2,11,12,13,13.2,14,14.2,
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25
26,27 18q21.3 D18S51
X,Y Amelogenin
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 5q21-31 D5S818
17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,26.2
27,28,29,30,30.2,31.2,32.2,33.2,
42.2,43.2,44.2,45.2,46.2,47.2,48.2
50.2,51.2 4q28 FGA
1-14 معرفی استان‏ها1-14-1 استان کرمانشاه
کرمانشاه یکی از باستانی‌ترین شهرهای ایران است و بر اساس افسانه ها توسط طهمورث دیوبند - پادشاه افسانه‌ای پیشدادیان ساخته شده است. برخی از مورخین بنای آن را به بهرام پادشاه ساسانی نسبت می‌دهند. کرمانشاه در زمان قباد اول و انوشیروان ساسانی به اوج عظمت خود رسید. در اوایل حکومت شاه اسماعیل صفوی سلطان مراد آق قویونلو با 70 هزار نفر کرمانشاه و همدان را اشغال کرد. صفویه برای جلوگیری از تجاوز احتمالی امپراطوری عثمانی این شهر را مورد توجه قرار داد. در زمان شیخ علیخان زنگنه صدر اعظم صفوی به آبادانی و رونق کرمانشاه افزوده شد. تاورنیه، جهانگرد و بازرگان فرانسوی، درباره کرمانشاه چنین نوشته‌ است: ” هم زمان با حمله افغان و سقوط اصفهان که طومار فرمانروایی خاندان صفوی در نوردیده شد، کرمانشاه به جرم قرب جوار، با تهاجم عثمانی‌ها مواجه گردید و بار دیگر شهر رو به خرابی نهاد.“ نادر شاه به منظور آمادگی در مقابل تجاوز عثمانی‌ها، به این شهر توجهی خاص مبذول داشت. در زمان نادر شاه این شهر مورد هجوم عثمانی‌ها قرار گرفت. اما نادرشاه عثمانی‌ها را به عقب راند، ولی در اواخر زندگی نادرشاه، کرمانشاه با محاصره و تاراج عثمانی‌ها مواجه شد. کرمانشاه در عهد زندیه دستخوش آشوب فراوانی گردید. به طوری‌که درکتاب ”تحفه العالم“ عبدالصیف جزایری از کرمانشاه به عنوان خرابه نام برده شده است. در دوره قاجار تا حدی از حملات عثمانی‌ها به ناحیه کرمانشاه کاسته شد. در سال 1267ه.ق، امام قلی میرزا از طرف ناصرالدین شاه به سرحدداری کرمانشاه منصوب شد و مدت 25 سال در این شهر حکومت کرد و در همین دوره بناهایی را احداث و به یادگار گذاشت. این شهر در جنبش مشروطه سهمی به سزا داشت و در جنگ جهانی اول و دوم به تصرف قوای بیگانه درآمد و پس از پایان جنگ تخلیه شد. در نتیجه جنگ تحمیلی عراق علیه ایران، این شهر خسارات زیادی دید و پس از جنگ اقدامات مؤثری در جهت بازسازی آن صورت گرفت. در حال حاضر شهر کرمانشاه، مرکز استان کرمانشاه یکی از هفت کلانشهر کشور(تهران، مشهد، اصفهان، تبریز، شیراز، کرمانشاه و اهواز) است‌(44).
1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی
استان کرمانشاه در موقعیت ۳۴ درجه شرقی و ۴۷ درجه شمالی شمالی قرار دارد. از شمال به کردستان، از غرب به کشور عراق، از شرق به استان لرستان و همدان و از جنوب به استان ایلام محدود می گردد. شهرستان‌های این استان عبارت‌اند از: اسلام‌آباد غرب، سنقر، پاوه، صحنه، ثلاث باباجانی، قصر شیرین، جوانرود، دالاهو، روانسر، کرمانشاه، کنگاور، گیلان غرب، سر‌پل ذهاب، هرسین. در شکل1-13 استان کرمانشاه به همراه شهرستان‌های آن دیده می‌شود(44).

شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه)44.(1-14-2 استان یَزدیزد سرزمینی کهن با پیشینه‌ای در خور توجه، در تاریخ پر فراز و نشیب ایران است. نام یزد برای اولین بار در آثار دوره‌ی ماد‌ها (701 تا 550 قبل از میلاد) دیده می‌شود که گواهی بر قدمت سه هزار ساله‌ی این سرزمین است. در دوره‌های هخامنشی، اشکانی و ساسانی نیز در اسناد و کتیبه‌ها بار‌ها به نام یزد برمی‌خوریم(45).
حسن پیر‌نیا، در کتاب خود،"ایران باستان"،به نقل از تاریخ هرودوت، مورخ یونانی(484 تا 420 قبل از میلاد)، بر مبنای کتیبه‌های داریوش، یزد را بنا بر رسم یونانیان، به نام ایساتیس می‌خواند. وی می‌افزاید: یزد در عصر اشکانی در قلمرو حکومت مهرداد اول بود و در این شهر به نام او سکه ضرب می‌کردند. در دوره‌ی پادشاهی اردشیر بابکان، (241-224‌م) بنیان‌گذار سلسله‌ی ساسانی، یزد زیر نفوذ او بود. پس از ظهور اسلام و فروپاشی دولت ساسانی، در زمان خلافت عمر، و به روایت برخی، در دوران عثمان (دهه ی سوم هجری)، شهر یزد و نواحی آن فتح شد. از آن زمان تا پایان حکومت امویان، فرمانروایان عرب بر این ولایت حکم‌رانی می‌کردند. چنان‌که آمده است، در دوران خلافت حضرت علی(ع)، مسلم ابن زیاد، والی فارس، مالیات یزد را هم می‌گرفت. چنین بود تا هنگامی‌که به‌دست خود ایرانیان، حکومت های مستقل و نیمه مستقلی تشکیل شد و فرمانروایان ایرانی بر ولایت یزد حاکم شدند(45).
مرکز این استان، شهر یزد است. یزد منطقه‌ای خشک و بیابانی است. گروه بزرگی از زرتشتیان ایران در استان یزد و بویژه شهر یزد زندگی می‌کنند. زبان مردم استان یزد فارسی با لهجه یزدی است. آبادی نشینی در این منطقه از قدمت طولانی برخوردار است. این سرزمین از گذرگاه‌های مهم در ادوار تاریخی محسوب می‌شده‌ است. این ناحیه در دوره هخامنشیان از راه‌های معتبر موسسه‌های راهداری، مراکز پستی و چاپاری برخوردار بوده‌است. راهداری در یزد قدیم چنان اهمیتی داشت که خاندان آل مظفر از منصب راهداری ناحیه میبد به پادشاهی رسیدند. با این‌همه این استان از درگیری‌ها و جنگ‌های تاریخ کشور ایران تا حدودی ایمنی داشته‌است. سخت‌گذر بودن راه‌ها به همراه محدودیت منابع آبی مانع عمده تسخیر این منطقه توسط بعضی از حکومت های بزرگ و کوچک حاشیه و پیرامون این منطقه در طول تاریخ بوده‌است. همان طور که در شکل 1-14 دیده می شود استان یزد دارای شهرستان های ابرکوه، اردکان، بافق، بهاباد، تفت، خاتم، صدوق، طبس، مهریز، میبد و یزد می باشد که شهرستان های مهریز و تفت از آب و هوای خوبی برخوردار می باشد (45).
1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی
استان یزد در مرکز ایران در قلمرو سلسله جبال مرکزی ایران بین عرض های جغرافیایی 29 درجه و 48 دقیقه تا 33 درجه و 30 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 52 درجه و 45 دقیقه تا 56 درجه و 30 دقیقه شرقی از نصف النهار مبدا قرار گرفته است. استان یزد از سرزمین‌های تاریخی است که در میان ایالت های قدیمی و بزرگ پارس، اصفهان، کرمان و خراسان قرار داشته‌است(45).

شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد(45).1-15 هدف از تحقیق:آنچه که باعث استفاده از مارکرهای STR در جمعیت شناسی شده است، این واقعیت است که درجه فراوانی آللی هر مارکر STR در هر جمعیت منحصر به فرد است. در حقیقت طبق مطالعات انجام شده فراوانی آلل‏های STR در نژاد‏های مختلف و حتی در مناطق جغرافیایی خاص، تفاوت‏هایی را نشان داده است. بنابراین بررسی هر یک از لوکوس های STR در هر نژاد یا جمعیت خاص برای تفسیر صحت نتایج حاصل از انجام آزمایش های تعین الگوی ژنتیکی به کمکSTR و انجام محاسبات آماری مربوطه امری ضروری است. برای بهره گیری از فواید این فناوری نوپا در زمینه‏ی تشخیص افراد، ضروری است تا فراوانی آللی لوکوس‏هایSTR مختلف در جمعیت بومی کشور مورد بررسی قرار گیرند (45).
مطالعات گذشته روی جمعیت های ایرانی، حضور تعدادی از آلل‏ها را با پلی مورفیسم بالا نشان می‏دهد‌(37-46.)
هدف از این مطالعه به دست آوردن پارامترهای جمعیتی بر اساس فراوانی آللی به دست آمده از شانزده جایگاه STR، در جمعیت‏های کرمانشاه و یزد به منظور بررسی تفاوت ژنتیکی میان این دو جمعیت و سایر جمعیت‏ها می‏باشد.

فصل دوم
2-1 نمونه‌گیریبرای نمونه‌گیری از اقوام کرد و یزد از نمونه هایی که به آزمایشگاه ژنتیک پزشکی تهران رجوع می‌کردند، استفاده شد. پس ازکسب رضایت نامه 4 میلی لیتر خون محیطی از افراد غیر خویشاوند بر اساس محل تولد و اطلاعات مربوط به سه نسل گذشته (پدری و مادری) تهیه شد و در لوله‌های حاوی ماده ضد انعقاد (EDTA) ریخته شد برای تکمیل نمونه‌های یزدی از همکاری آزمایشگاهی در یزد استفاده گردید و برای نمونه‌های کرد به استان کرمانشاه رفته و از آزمایشگاه بیمارستان طالقانی نمونه‌گیری به عمل آمد.
2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباعاستخراج DNA با استفاده از روش استاندارد نمک اشباع طبق مراحل زیر انجام شد:
۱- ۳ میلی لیتر از نمونه‌ی خون محیطی حاوی ماده‌ی ضد انعقاد EDTA، داخل فالکون ۱۵ میلی لیتری ریخته شد و با استفاده از آب مقطر سرد به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس فالکون به شدت حرکت داده شد این کار جهت لیز بهتر گلبول‌های قرمز از طریق فرآیند تورژسانس می‌باشد. سپس نمونه را در دستگاه EBA 20 Hettich zentrifugen به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۵۰۰۰ سانتریفیوژ شد و محلول رویی خارج گردید و رسوب انتهایی فالکون نگه داشته شد.
۲- با افزودن آب مقطر سرد به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد و مجدداً با همان شرایط ذکر شده آن را سانتریفیوژ گردید و رسوب حاصل که حاوی گلبول‌های سفید است نگه داشته شد.
۳- پس از افزودن ml10 محلول I استخراج DNA به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس در شرایط ذکر شده آن را سانتریفوژ کرده و محلول رویی آن دور ریخته شد.
جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های قرمز)غلظت مواد
10 mM Tris-Hcl: pH:7.5
0.32 mM Sacarose
5 mM MgCl2
%1 Triton X-100
4-5/۱ میلی لیتر از محلول II استخراج DNA(از قبل تهیه شده به شرح زیر)، lμ ۲۵ سدیم دو دسیل سولفات ‌ SDS و lμ ۲۰ پروتئیناز K به رسوب سفید رنگ انتهای فالکون افزوده شد.
جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های سفید)غلظت مواد
10 mM Tris-HCl: pH:8.2
2mM EDTA: pH:8
0.45mM NaCl
۵- نمونه‌ها به مدت ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در دمایc° ۵۶ و یا به مدت یک شب در دمایc° ۳۷ در انکوباتور قرار داده شد تا رسوب حل شود.
۶- پس از افزودن lμ ۵۰۰ نمک اشباع به نمونه، به آرامی تکان داده شد و به مدت ۱۰ دقیقه در ۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی به یک فالکون حاوی ۲ میلی لیتر اتانول خالص (۱۰۰ درصد) انتقال یافت و به آرامی حرکت داده شد تا کلاف DNA شکل بگیرد.
۷- کلاف DNA توسط سمپلر به درون یک ویال حاوی ۱ میلی لیتر الکل ۷۰ درصد انتقال یافت تا الکل 100 خارج شود. در مرحله‌ی بعدی ویال را به مدت ۳ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دستگاه 20 Hettich zentrifugen Mikro سانتریفیوژ گشت.
۸- محلول رویی دور ریخته شد و ویال حاوی DNA به مدت ۵ دقیقه در انکوباتور قرار داده شد تا اتانول کاملاً تبخیر گردد.
۹- بر حسب میزان DNA بین ۵۰ تا ۳۰۰ ماکرولیتر TE به آن افزوده و به مدت یک شب در انکوباتور C°۳۷ قرار داده شد تا DNA به طور کامل حل شود.
جدول 2-3 ترکیبات TEغلظت محتویات
10mM Tris-Hcl, PH:7.6
1mM EDTA, PH:8
2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typingدر هر واکنش Multiplex PCR بهتر است از lμ ۵ نمونه‌ی DNA انسانی با غلظت ng ۱۰۰-50 استفاده شود. اگر‌چه حساسیت آنالیزی این روش در حد ng۵۰-20 از DNA می‌باشد. روش استخراج و نگهداری DNA می‌تواند روی نتایج PCR تأثیر گذار باشد. این روش نیاز به کیت خاصی برای استخراج DNA ندارد با این وجود توجه به این مسئله که در نمونه‌ها غلظت بالایی از آلودگی با نمک وجود نداشته باشد حائز اهمیت است. در این روش نباید از خون هپارینه استفاده شود زیرا هپارین می‌تواند ممانعت کننده‌ی مرحله‌ی PCR باشد. نمونه‌ی DNA را باید در TE حل کرد. pH نمونه‌ی DNA باید بین ۸ تا ۵/۸ باشد تا از دپوریناسیون در طی مرحله‌ی حرارت دادن اولیه جلوگیری شود. بهتر است در صورتی‌که قصد نگهداری طولانی مدت نمونه‌های DNA را داشته، نمونه را در دمای C°۲۰- نگهداری کرد. اگرچه DNA پس از حل شدن در TE به شدت پایدار است اما نگهداری طولانی مدت آن در دمای C °۴ ممکن است منجر به آلودگی آن با میکروارگانیسم‌ها شود .

—d1730

2-8-2- تجزیه غیر هوازی 18
2-9- کمپوست ترکیبی 19
2-10- انواع کمپوست ترکیبی 19
2-11- خصوصیات کمپوست 20
2-12- ویژگیها و موارد مصرف کمپوست 21
2-12-1- کاهش آلودگی محیط زیست ( آب و هوا ) 22
2-12-2- جلوگیری از فرسایش خاک 22
2-12-3- قابلیت نگاهداری آب در زمین 23
2-12-4- متخلخل نمودن خاک 23
2-12-5- سایر موارد کاربرد کمپوست 23
2-13- پژوهش های انجام شده 24
2-14- روشهای تولید کمپوست 25
2-15- فرآیند ویندرو 28
2-15-1- تاریخچه کاربرد فرآیند ویندرو 29
2-15-2- راهبری سیستم 30
2-15-3- اثرات زیست محیطی و بهداشتی 33
2-16- فرآیند توده های ثابت 34
2-16-1- تاریخچه کاربرد توده های ثابت هوادهی شده 35
2-16-2- تشریح فرآیند 36
2-16-3- وضعیت موجود 43
2-16-4- چشم اندازهای اخیر 43
2-17- سیستمهای کمپوست راکتوری 45
2-17-1- راکتورهای جریان عمودی جامدات 45
2-17-2- راکتور بیوسل 48
2-17-3- راکتور BAV 48
2-18- راکتورهای جریان افقی و شیب دار جامدات 49
2-18-1- استوانه های چرخان 49
2-18-2- راکتور دانو 52
2-18-3- محفظه های با بستر همزده شده 52
2-18-4- راکتور فیرفیلد 54
2-19- محفظه های با بستر ثابت 55
2-19-1- راکتور پایگرو 55
2-19-2- راکتور تونلی BVA 56
2-20- میکروبیولوژی فرایند 56
2-20-1- الگوی دما – زمان 58
2-21- عوامل موثر بر تخمیر 59
2-21-1- هوادهی 60
2-21-2- میزان هوادهی مورد نیاز و مکانیزم های آن 61
2-21-3- میزان رطوبت 62
2-21-4- کنترل رطوبت 64
2-21-5- نسبت C/N 65
فصل سوم: روشها و لوازم مورد استفاده
فصل سوم: روشها و لوازم مورد استفاده
68
3-1- وسایل مورد نیاز 68
3-1-1- طراحی و ساخت واحد نمونه آزمایشگاهی 68
3-1-2- عملیات انتقال، شناسایی مواد 69
3-1-3- تهیه مخلوط اولیه کمپوست 69
3-2- مطالعات آزمایشگاهی 71
3-3- انتقال لجن تصفیه خانه به آزمایشگاه 71
3-4- بررسی کیفی لجن های تولیدی و زباله 71
3-5- اندازه گیری دما 72
3-6- تعیین ماده آلی و کربن 72
3-6- تعیین نیتروژن 73
3-6- تعیین رطوبت 73
3-9- تعیین pH 74
3-10- تغلیظ لجن 74
3-12- اقدامات پایش و کنترل فرآیند 74
3-12-1- پایش فرآیند 75
3-12-2- کنترل فرآیند 76
فصل چهارم: نتایج و تحلیل داده ها
فصل چهارم: نتایج و تحلیل داده ها 78
4-1- آزمایش مرحله اول کمپوست ترکیبی 78
4-1-1- پایش و کنترل فرآیند در آزمایش مرحله اول کمپوست ترکیبی 81
4-1-2- نتایج آزمایش مرحله اول کمپوست ترکیبی 82
4-2- آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 85
4-2-1- شرح آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 85
4-2-2- تحلیل آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 89
4-2-3- نتایج آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 90
4-3- معیارهای ارزیابی عملکرد سیستم در تثبیت لجن 90
4-3-1- کنترل فلزات سنگین 90
4-3-2- کنترل پاتوژنها 91
4-3-3- کنترل بو 92
4-3-5- اندازه گیری مواد آلی باقیمانده 93
فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادها
فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادها 95
5-1- نتیجه گیری 95
5-2- پیشنهادات 97
منابع و ماخذ 99
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل (2-1)- سیکل کربن و نیتروژن در فرایندهای هوازی 17
شکل ( 2-2)- شمایی از فرایند ویندرو 27
شکل (2-3)- ابعاد و اندازه های متداول توده های کمپوست ویندرو 31
شکل (2-4)- نمودار ارتباط کاهش پاتوژنها با زمان و درجه حرارت در روش ویندرو 33
شکل (2-5) -مراحل اصلی فرآیند کمپوست به توده های ثابت هوادهی شده 37
شکل (2-6)- سطح مقطع یک نمونه ثابت هوادهی شده 39
شکل (2-7) -نماهایی از توده های ثابت هوادهی شده 40
شکل (2-8)-درجه حرارت در توده های ثابت هوادهی شده با مواد مختلف 42
شکل (2-9)- راکتورهای جریان عمودی با بستر جامدات بهم زده 46
شکل (2-10)- راکتورهای جریان عمودی با بستر پرشده 47
شکل (2-11)- انواع راکتورهای کمپوست با استوانه های چرخان 51
شکل (2-12)- راکتورهای افقی کمپوست با بستر همزده شده 53
شکل (3-1)- نمایی از پایلوت ساخته شده 67
شکل (4-1)- نمودار تغییرات ph نسبت به زمان 79
شکل (4-2)- نمودار تغییرات دما نسبت به زمان 79
شکل (4-3)- نمودار تغییرات رطوبت نسبت به زمان 80
شکل (4-4)- نمودار تغییرات نرخ هوادهی نسبت به زمان 80
شکل (4-5)- نمودار تغییراتph نسبت به زمان 84
شکل (4-6)- نمودار تغییرات دما نسبت به زمان 85
شکل (4-7)- نمودار تغییرات رطوبت نسبت به زمان 85
شکل (4-8)- نمودار تغییرات نرخ هوادهی نسبت به زمان 86
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول (1-1)- مقایسه آنالیز زباله در چندین منطقه جهان 8
جدول (1-2)- تعداد و انواع میکروارگانیسم های معمولی گرم کمپوست مرطوب 56
جدول (2-3)- حداکثر رطوبت مورد نیاز جهت کمپوست شدن مواد مختلف 64
جدول (2-4)- نسبت C/N در مواد مختلف 66
جدول (3-1)- آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست 70
جدول (3-2)- نتایج آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست 73
جدول(4-1)- آنالیز لجن (مرحله اول) 75
جدول(4-2)- آنالیز زباله (مرحله اول) 75
جدول(4-3)- آنالیز مخلوط اولیه کمپوست (مرحله اول) 76
جدول(4-4)- نتایج آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست (مرحله اول) 76
جدول(4-5)- نتایج آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست (مرحله دوم) 82
جدول (4-6)- .مقایسه فلزات سنگین کمپوست مرحله اول و دوم و لجن فاضلاب با استانداردهای کشورهای آلمان، ایتالیا و یونان 87
فصل اول
مـقـدمـــه
1-1- کلیـات
امروزه در اقصی نقاط دنیا شاهد پیشرفت روز افزون ملل مختلف در کلیه زمینه ها، بالاخص اقتصادی می‌باشیم. در هیچ دوره ای جهان چنین دگرگونی سریعی را بر خود ندیده است. از مشخصه های این نظام نوین، تولید بیش از پیش که نتیجه آن مصرف گسترده است، می باشد. این مصرف نتیجه ای جز تولید انبوه مواد ناخواسته یا به عبارت ساده تر، زباله در پی نخواهد داشت. زباله در جوامع شهر نشین، علی الخصوص شهرهای بزرگ که بافت جمعیتی آنها به صورت متمرکز می باشد، به عنوان یک محصول ناخواسته و منفور که در اسرع وقت می بایست آن را از محیط زندگی شخصی دور کرد، تعریف می شود.
امروزه پس از تجارب و آزمایش های طولانی مشخص شده است که ارزشمندترین و مؤثرترین کودها و تقویت کننده ها از انسان بدست می آید. چینی ها قبل از ما این اصل را رعایت می کردند و مدفوعات انسانی را به زمین هایشان بازگشت می دادند[33]. واقعیت اینست که بحرانهای زیست محیطی با وارد کردن خسارات جانی و مالی جبران ناپذیر به انسانها هشدار می دهند که دیگر توان خود پالایی از تن خسته طبیعت بدر آمده است. با این باور مدتهاست که کشورهای پیشرفته به منظور حفاظت از محیط زیست، عملیات تصفیه مواد زائد نظیر فاضلابها را قبل از دفع اجباری نموده اند[32].
تصفیه فاضلابها همواره با تولید دو بخش مجزای پساب و لجن همراه می باشد، از این میان پسابها غالباً کیفیتی مطلوب جهت دفع به محیط دارند در حالیکه لجنها بدلیل آلودگی بسیار زیاد نیاز به تصفیه و تثبیت بیشتر دارند. در یک تصفیه خانه فاضلاب شهری، تأسیسات تصفیه و تثبیت لجن به مراتب حساستر، تخصصی تر و پر هزینه تر از سایر واحدها می باشند، چنانچه به عنوان مثال حدود 30 درصد از کل هزینه احداث تصفیه خانه گرگان به واحد تثبیت لجن اختصاص یافت. بر این اساس بایستی توجهات خاصی بر بهینه سازی فنی و اقتصادی روشهای تصفیه و تثبیت لجن معطوف گردد[32].
در کشورهای پیشرفته چندین سال است که تحقیقات جهت انتخاب الگوی بهینه تصفیه و تثبیت لجن شروع شده است. اینکار بایستی در کشور ما نیز همگام با گسترش صنعت فاضلاب، مورد عنایت مسئولین و متخصصین قرار گیرد. با توجه به اهمیت دو موضوع مطرح شده یعنی زباله شهری و لجن می توان با ترکیب کردن این دو طی فرایند، کود ترکیبی (co-composting) بدست آورد که مشکل زباله شهری و تصفیه خانه را حل کند .
1-2- ضرورت انجام تحقیق
یکی از روشهای مؤثر در خنثی نمودن اثرات نامطلوب زباله ها و لجن، تبدیل آنها به کود کمپوست و استفاده مجدد از آنها به عنوان کودآلی (گیاهی) در کشاورزی است. در بیشتر کشورهای جهان، اقتصادی بودن این روش نسبت به سایر روش ها به اثبات رسیده است، بخصوص در مناطق کشاورزی و اطراف شهرهای کوچک (به طرق غیر صنعتی)، که حتی پایین بودن هزینه حمل و نقل، فراوانی مواد آلی و نیروی انسانی ارزان، می تواند بسیار اقتصادی باشد[10].
البته ذکر این مطلب ضروری است که کمپوست ترکیبی باید کاملاً در شرایط مناسب و بهداشتی تهیه و مصرف شود، زیرا زباله یک ترکیب نامتجانس است و کلیه اجزاء تشکیل دهنده آن قابلیت کمپوست شدن را ندارند و از طرفی بعضی از مواد متشکله زباله چنانچه با خاک مخلوط شوند، موجب نزول کیفیت آن می گردد و تعدادی از آنها موجب آلودگی خاک شده، از طریق جذب در گیاهان به انسانها و حیوانات انتقال می یابد که این خود موجب زیان های جبران ناپذیری می گردد و همچنین لجن دارای مقدار زیادی فلزات سنگین است که خود موجب نزول کیفیت لجن می گردد[10].
1-3- اهداف تحقیق
کمپوست ترکیبی فرآیندی است که خواه ناخواه با توجه به مشکلات عدیده ناشی از دفع نامناسب زباله‌های شهری ومشکلات لجن در تصفیه خانه ها در آینده ای نزدیک رشد و توسعه خواهد یافت. کمپوست فرآیندی سهل و ممتنع است. ساده به آن جهت که نیاز به دستگاهها و تجهیزات پیچیده الکترونیکی و مکانیکی ندارد و با کمترین امکانات در تمامی مناطق با اقلیم های متفاوت و با هر ظرفیتی قابل اجرا است و ممتنع به آن خاطر که فرآیند یک فرآیند بیولوژیکی است. یعنی با موجودات زنده می بایست سروکار داشت و شرایط مناسب را برای تغذیه و رشد آنها می باید تأمین نمود. از این رو شناخت فاکتورها و عوامل موثر بر حیات، تغذیه ورشد این موجودات بسیار اساسی و مهم می باشد و کوچکترین بی اطلاعی از این امر موجب تولید محصولات ناخواسته در فرآیند کمپوست ترکیبی خواهد شد که موضوع اصلی ما در این رساله می باشد.

1-4- فرضیات تحقیق
1) تأثیر میزان هوادهی بر عملکرد کمپوست ترکیبی
2) تأثیر اندازه ذرات بر عملکرد کمپوست ترکیبی
3) تأثیر عمل زیر و رو کردن بر عملکرد کمپوست ترکیبی
4) تأثیر فصول تابستان و زمستان بر عملکرد کمپوست ترکیبی
فصل دوم
ادبیات موضوع
2-1- شناخت کمپوست ترکیبی
یکی از روشهای مؤثر در خنثی نمودن اثرات نامطلوب زباله ها و لجن، تبدیل آنها به کود کمپوست و استفاده مجدّد از آنها به عنوان کودآلی (گیاهی) در کشاورزی است. در بیشتر کشورهای جهان، اقتصادی بودن این روش نسبت به سایر روش ها به اثبات رسیده است، بخصوص در مناطق کشاورزی و اطراف شهرهای کوچک (به طرق غیر صنعتی)، که حتی پایین بودن هزینه حمل و نقل، فراوانی مواد آلی و نیروی انسانی ارزان، می تواند بسیار اقتصادی باشد]10[.
البته ذکر این مطلب ضروری است که کمپوست ترکیبی باید کاملاً در شرایط مناسب و بهداشتی تهیه و مصرف شود، زیرا زباله یک ترکیب نامتجانس است و کلیه اجزاء تشکیل دهنده آن قابلیت کمپوست شدن را ندارند و از طرفی بعضی از مواد متشکله زباله چنانچه با خاک مخلوط شوند، موجب نزول کیفیت آن می گردد و تعدادی از آنها موجب آلودگی خاک شده، از طریق جذب در گیاهان به انسانها و حیوانات انتقال می یابد که این خود موجب زیان های جبران ناپذیری می گردد و همچنین لجن دارای مقدار زیادی فلزات سنگین است که خود موجب نزول کیفیت لجن می گردد]10.[
از این رو قبل از وارد شدن به بحث اصلی یعنی تبدیل زباله و لجن به کودآلی، شناخت منابع گوناگون تولید کننده زباله و ترکیبات آن ضرورت پیدا می کند.
2-2- اجزا موجود در زباله
به طور اعم ، مواد زائد جامد را می توان به صورت زیر تقسیم نمود :
زباله منازل ( باقیمانده مواد غذایی، کاغذ و کارتن و... )
زباله حجیم خانگی ( کمد، میز و ... )
زباله های معمولی زباله های غیر آلوده بیمارستانی
زباله باغات و گل خانه ها ( برگ، شاخه و ... )
زباله کسبه و ادارات ( مشابه زباله منازل )
مواد زائد جامد
زباله های صنعتی
زباله های ویژه نخاله های ساختمانی
لاستیک های فرسوده
مواد رادیواکتیو
زباله های آلوده بیمارستانی

صرفاً از بخش آلی زباله های معمولی می توان به عنوان مواد اولیه کمپوست، استفاده نمود.
آنالیز زباله یکی از مقدم ترین کارها در انتخاب و ارزیابی روش دفع زباله و حتّی روش جمع آوری، انتقال، جابجایی، بازیافت و دفن بهداشتی می باشد. لذا در هر شهری می بایست آنالیز زباله نخست از لحاظ فیزیکی و سپس از نقطه نظر شیمیایی مشخص گردد .
در مقام مقایسه با سایر کشورهای جهان آنالیز زباله در چند کشور و منطقه دیگر به صورت جدول 1-1 آورده می شود. همچنانکه مشاهده می شود میزان مواد آلی در زباله های خانگی ایران (تهران)، نسبت به سایر مناطق از مقدار بالایی برخوردار است.
جدول (1-1) مقایسه آنالیز زباله در چندین منطقه جهان]37 [.
ترکیبات تهران شمال آفریقا خلیج فارس آلمان هلند انگلستان دمشق
مواد آلی 45/76 70-60 40-35 4/42 5/50 6/30 50
کاغذ، مقوا، کارتن 98/7 20-10 30-25 9/19 8/22 2/31 11
انواع پلاستیک 58/4 2-1 15-10 1/6 8/6 2/5 5
شیشه 95/1 3-2 6-5 6/11 2/7 8/3 3
فلزات 93/0 3-2 5-2 9/3 4/4 3/5 3
استخوان 82/0 منسوجات 37/2 3-2 6-5 5/1 1/2 1/4 4
چوب 42/0 2-1 4-3 3/2 - - -
نخاله های ساختمانی 9/0 - - - - - -
سایر مواد 75/0 10-5 3-2 3/12 2/6 8/19 21
جمع کل 15/97 100 100 100 100 100 100
یکی از عوامل اساسی جهت توجیه پذیر بودن احداث کارخانجات کمپوست، این است که مواد اولیه (زباله) حداقل باید به میزان 50 درصد دارای مواد آلی باشد. خوشبختانه این نسبت در زباله های ایران بسیار بالاتر از این حداقل می باشد]35.[
با بررسی آمار و آنالیز زباله بسیاری از شهرهای ایران مشاهده می شود که مقدار و درصد مواد آلی قابل تجزیه موجود در زباله، در حد بسیار مطلوبی است. لذا طرح ایجاد کارخانجات کمپوست، نسبت به سایر روش ها از ارزش و اهمیت اقتصادی، بهداشتی بالاتری برخوردار است]36.[
2-3- لجنهای فاضلاب شهری
منشأ و مقادیر
منابع اصلی تولید لجن در تصفیه خانه های فاضلاب حوضهای ته نشینی هستند اما واحدهای تغلیظ، تثبیت، آماده سازی و آبگیری لجن نیز در شمار منابع تولید لجن قرار می گیرند]5.[
خصوصیات و ویژگیها
لجنهای تولیدی در تصفیه خانه های فاضلاب شهری در حالتهای مایع و یا نیمه جامد بوده، درصد جامدات موجود در آنها از 25/0 تا 12 درصد بسته به فرآیندهای تصفیه و عملکرد آنها متغیر می باشد.]5[
از میان اجزا جدا شده از فاضلاب در یک تصفیه خانه، لجن بیشترین حجم را به خود اختصاص می دهد که با توجه به تغلیظ آلاینده ها، پاتوژنها و مواد آلی قابل تعفن در آن، فرآیندهای تصفیه پیچیده ای را طلب می نماید.
کمیت لجن تولیدی در یک تصفیه خانه فاضلاب شهری رابطه ای مستقیم با درصد تصفیه مورد نیاز دارد. هرچه تصفیه فاضلاب از مرحله اولیه به سمت مراحل ثانویه و پیشرفته، تکامل پیدا می کند میزان لجن تولیدی نیز رو به تزاید می گذارد.
طی دهه های اخیر کیفیت لجن های تولیدی در تصفیه خانه فاضلاب شهری به دلیل تولید و مصرف حدود 10000 نوع ترکیب شیمیایی آلی جدید در سال، دچار دگرگونیهای فراوانی گردیده است]6 و7[.
لجنهای فاضلاب شهری با توجه به نوع فرآیند جداسازی آنها به سه دسته لجنهای اولیه (لجنهای نوع اول)، لجنهای بیولوژیکی (لجنهای نوع دوم) و لجنهای شیمیایی (لجنهای نوع سوم) تقسیم می گردند که خصوصیات و ویژگیهای متفاوتی از هم دارند]5.[
2-3-1- لجن اولیه
به موادی که در حوض ته نشینی اولیه رسوب می کنند، لجن اولیه اطلاق می گردد. لجن اولیه خاکستری رنگ و نسبتاً بدبو می باشد. حوض ته نشینی اولیه قادر است به سادگی حدود 50 درصد وزنی مواد جامد قابل ته نشینی را از فاضلاب جدا نماید، به همین دلیل در اکثر تصفیه خانه های فاضلاب از آن استفاده می گردد.
از ویژگیهای برتر لجن اولیه نسبت به لجنهای بیولوژیکی و شیمیایی می توان، تغلیظ ثقلی آسان و نیاز به آماده سازی جزیی جهت آبگیری مکانیکی را مورد اشاره قرار داد.
کمیت و کیفیت لجن اولیه به ماهیت واحدهای مقدماتی، خصوصیات شبکه جمع آوری و ورود فاضلابهای صنعتی به شبکه فاضلاب بستگی دارد]5[.
2-3-2- لجنهای بیولوژیکی
لجنهای بیولوژیکی در طی فرآیندهای تصفیه فاضلاب نظیر لجن فعّال، صافی چکنده و دیسکهای بیولوژیکی چرخان تولید می شوند. کمیت و کیفیت لجن بیولوژیکی تولیدی بسته به سرعت متابولیسم و رشد، نوع میکروارگانیسم های موجود در سیستم، وجود تأسیسات پیشین نظیر حوض ته نشینی اولیه و نیز شیوه راهبردی واحدهای زلال ساز بسیار متفاوت می باشد.
لجنهای بیولوژیکی بسیار مشکلتر از لجنهای اولیه و برخی از لجنهای شیمیایی تغلیظ و آبگیری می‌گردند]5[.
2-3-3- لجنهای شیمیایی
لجنهای شیمیایی، عموماً در جریان استفاده از مواد شیمیایی برای حذف فسفر و یا افزایش درصد حذف جامدات معلّق از پساب خروجی، در تصفیه خانه های فاضلاب تولید می گردند.
افزایش مواد شیمیایی به پساب خروجی از تصفیه ثانویه و عملیات رسوب گیری شیمیایی به صورت مجزا در حوض ته نشینی سوم، در شمار اندکی از تصفیه خانه ها انجام می گیرد. در عوض، افزایش مواد شیمیایی به فاضلاب خام و یا فاضلاب در مرحله تصفیه بیولوژیکی و جداسازی لجنهای شیمیایی همراه با لجنهای اولیه و یا لجنهای بیولوژیکی در بسیاری از تصفیه خانه ها، متداول می باشد.
خصوصیات لجنهای شیمیایی عمدتاً به نوع رسوب دهنده های مورد استفاده و ترکیب جامدات موجود در فاضلاب بستگی دارد]5[.
2-4- ضرورت کنترل و تصفیه لجن فاضلاب شهری
فاضلاب های شهری پس از عبور از واحدهای عملیایی و فرآیندهای متعارف عمدتاً به دو بخش پساب و لجن تفکیک می گردند که هر یک برای راهیابی مجدد به طبیعت بایستی کیفیتی مطابق با استانداردهای زیست محیطی را دارا باشند.
برخلاف پساب های خروجی از تصفیه خانه ها که معمولاً کیفیتی مناسب و مطلوب جهت تخلیه به طبیعت دارند، لجنها که حاصل تغلیظ آلاینده های موجود در فاضلاب هستند به هیچ وجه به صورت خام و تصفیه نشده مجوز ورود به محیط زیست را ندارند]36.[
متخصصین و مهندسین محیط زیست به منظور رهایی از مشکل لجن تولید شده در تصفیه خانه های فاضلاب دو ایده کلی استفاده مجدد و دفع نهایی را پیش رو دارند. دو روش استفاده مجدّد از حجم آب زیاد و خصوصیات کودی لجن پس از تصفیه و بی خطر سازی برای آبیاری، کوددهی و اصلاح بافت خاک استفاده می گردد. در روش دفع نهایی با انجام پیش تصفیه های لازم لجن به عنوان یک ماده دور ریز تلقی گردیده که جهت دفع بایستی کیفیتی مطابق با استانداردهای قابل قبول را داشته باشد.
بر این اساس در صورتی که هر یک از مقاصد استفاده مجدد و یا دفع نهایی لجن مورد توجه قرار گیرد عملیات کنترل و تصفیه لجن همواره بایستی به عنوان یکی از ارکان اساسی تصفیه خانه در نظر گرفته شود]36 [.
2-5- اهداف و مقررات مربوط به استفاده مجدد و دفع لجن
به طور کلی متخصصین محیط زیست امروزه تصفیه لجن را یکی از ارکان اصلی عملیات تصفیه فاضلاب ‌  می دانند. هدف از عملیات تصفیه لجن دستیابی به اهداف کلی تصفیه فاضلاب یعنی، زیباسازی محیط زیست، حذف مواد آلی قابل تجزیه بیولوژیکی و حذف ارگانیزمهای بیماری زا می باشد. براین اساس قوانین زیست محیطی حاکم بر تصفیه و دفع فاضلابها به طور اعم، تصفیه و دفع لجنها را نیز در بر خواهند گرفت.
در سال 1989 به دنبال تصویب قانون منع تخلیه هرگونه لجن فاضلاب به اقیانوسها، سازمان حفاظت محیط زیست آمریکا (EPA) استانداردهای جدیدی برای دفع لجن تصفیه خانه های فاضلاب پیشنهاد کرد]5.[
مقررات پیشنهادی حدود عددی آلاینده ها و روش های کنترل آنها را به منظورهای استفاده از لجن در زمینهای کشاورزی و غیر کشاورزی، توزیع و بازاریابی، دفع سطحی و سوزاندن تعیین نمود.
این استانداردها بیشتر محدودیتهایی را برای برخی از فلزات سنگین و ترکیبات آلی سمّی مورد تأکید قرار دارند.
مقررات و استانداردهای کنترل آلاینده های موجود در فاضلاب و لجن دائماً در معرض تکمیل و تصحیح هستند، از این رو مهندسین فاضلاب بایستی همواره در جریان آخرین استانداردها قرار داشته و آنها را در طراحی تصفیه خانه های جدید و یا بهینه سازی تصفیه خانه های قدیمی به کار بندند]5.[
جهت گیریهای آینده در مورد وضع قوانین کنترل و تصفیه لجن با موضوع کنترل آلاینده های خاص نظیر فلزات سنگین و ترکیبات آلی سمّی از قبیل پی سی بی ها و آفت کشها در مبدأ تأکید خواهد شد. این آلاینده ها تحت تأثیر فرآیندهای بیولوژیکی متداول تجزیه نمی گردند.
2-6- تعریف کمپوست
کمپوست از کلمه لاتین (composites) به معنای مخلوط و یا مرکب اقتباس شده است و به صورت عبارت زیر قابل تعریف می باشد:
- تجزیه مواد آلی نامتجانس که بوسیله میکروارگانیزم های مختلف در حضور رطوبت و گرما، در محیط هوازی صورت گیرد.
- یک فاز بیولوژیکی و تغییر فرم است که توسط میکروارگانیزم های هوازی در داخل توده انجام گرفته و حرارتی حدود 75- 65 درجه سانتیگراد تولید می نماید.
- تجزیه مواد آلی توسط دسته ای از میکروارگانیزم ها در محیط گرم، مرطوب و هوازی است.
- سیستم مهندسی تصفیه ضایعات جامد به روش تجزیه بیولوژیک در شرایط کنترل شده است.
- یک تجزیه بیولوژیکی و پایداری مواد آلی تحت شرایطی که بر اثر افزایش دمای ترموفیلیک که آن نیز خود ناشی از تولید حرارت بیولوژیکی است، به وجود می آید. محصول نهایی به اندازه کافی پایدار بوده و بدون آنکه عوارض زیست محیطی در پی داشته باشد قابل انبار شدن و یا مصرف کردن می باشد]6و7و8.[
2-7- مباحث اساسی تهیه کمپوست
فرآیند تهیه کمپوست در واقع، تجزیه مواد آلی توسط دسته ای از میکروارگانیزم ها در محیط گرم مرطوب و هوازی است.
مقدار قابل توجهی از مواد آلی که روزانه در طبیعت تولید می شود، توسط عملیات میکروبیولوژیکی تجزیه می شود. این عملیات به آرامی بر روی سطح زمین و دمای طبیعی و مخصوصاً در شرایط هوازی امکان پذیر است. فرآیند طبیعی تجزیه مواد با جمع آوری مواد به شکل پُشته که مانع از هدر رفتن حرارت تخمیر می‌شود، انجام می گیرد. بالطبع افزایش دمای مواد باعث بالا رفتن سرعت واکنش می شود. این فرآیند تسریع شده همان فرآیند ساخت کمپوست است]6.[
موادی که جهت کمپوست جمع آوری می شوند، بسیار متنوع بوده و شامل مخلوطی از مواد معدنی و آلی موجود در زباله های شهری، کودهای هموژن گیاهی، باقیمانده محصولات کشاورزی و لجن فاضلاب است. در فرآیند تولید کمپوست، بیشترین مقدار اکسیژن مصرف شده، جهت تبدیل مواد آلی به محصولات پایدارتر مانند هیومیک اسید، دی اکسیدکربن و آب به مصرف می‌رسد. نکته قابل توجه در افزایش محصولات کشاورزی، بالا بردن مقدار مواد مغذی خاک است. یکی از روش های گسترش و بهبود ساختمان خاک و تهیه مواد غذایی استفاده از هوموس است که هوموس نیز محصول نهایی فرآیند ساخت کمپوست است. در کشورهای درحال توسعه، میزان سرعت اکسیداسیون هوموس خاک، بسیار بیشتر از سرعت تشکیل آن است]37 [.
کمپوست، محصول فرآیندی است که در آن واکنشهایی بین مواد آلی، میکروارگانیزم ها، رطوبت و اکسیژن در می گیرد. مواد آلی با انبوهی از میکروارگانیزم های موجود در خاک، آب و هوا مخلوط هستند. زمانی که مقدار رطوبت مواد به حد مطلوب برسد و همچنین مواد به میزان لازم هوادهی شوند، فرآیند میکروبیولوژیکی تسریع می شود. علاوه بر اکسیژن و رطوبت، میکروارگانیزم ها جهت رشد و تکثیر نیازمند منبع کربن (زباله های آلی)، مواد غذایی مانند نیتروژن، فسفر، پتاسیم و مقادیر ناچیزی از بعضی عناصر دیگر نیز هستند. در حمله میکروارگانیزم ها به مواد آلی، علاوه بر اینکه خود آنها تکثیر یافته و رشد می‌کنند، دی اکسید کربن، آب، بعضی از محصولات آلی و انرژی نیز آزاد می شود. مقداری از این انرژی در فرآیند متابولیسم مصرف شده و باقیمانده آن به صورت گرما، آزاد می شود. محصول نهایی یا همان کمپوست از مواد آلی باقیمانده مقاوم، محصولات شکسته شده و میکروارگانیزم های زنده و مرده تشکیل شده است]6و7و38و8.[
2-8- روشهای تئوریک تولید کمپوست
بطور کلی در تهیه کمپوست از زباله و لجن، می توان از دو روش علمی و اصلی زیر بهره جست:
تجزیه هوازی
تجزیه غیر هوازی
در ذیل در حد اختصار اصول علمی روش های فوق آورده می شود.
2-8-1- تجزیه هوازی
فرآیندی که در آن یک ماده آلی در حضور اکسیژن تجزیه شود، فرآیند هوازی نامیده می شود. در تجزیه هوازی، ارگانیسم های زنده ای که اکسیژن را مصرف می کنند، جهت تغذیه خود از مواد آلی استفاده می‌نمایند. بدین ترتیب مقدار زیادی از کربن موجود، به عنوان منبع انرژی برای ارگانیسم ها بکار رفته و در اثر تنفس و سوخته شدن، به دی اکسیدکربن تبدیل می شود. از آنجائی که کربن هم به عنوان منبع انرژی و هم به عنوان یک عنصر در پروتوپلاسم سلول مصرف می شوند، لذا به مقدار خیلی بیشتر از نیتروژن مورد نیاز می باشد]12و6[.
بطور کلی تقریباً QUOTE 23 کربن در اثر تنفس به QUOTE CO2 تبدیل می شود و QUOTE 13 باقیمانده در سلولهای زنده با نیتروژن ترکیب می گردد[12]. اگر مقدار اضافی کربن نسبت به نیتروژن در مواد آلی تجزیه شده از حد مشخصی بیشتر باشد، فعالیت بیولوژیکی کم شده و ممکن است چند سیکل از ارگانیزم ها جهت سوزاندن مقدار بیشتری از کربن لازم باشد. هنگامی که تعدادی از ارگانیزم ها کُشته می شوند، نیتروژن و کربن ذخیره شده در آنها برای سایر ارگانیزم ها قابل دسترس و استفاده خواهد بود. استفاده از نیتروژن موجود در سلولهای مرده توسط ارگانیزم ها، برای تشکیل سلول جدید نیاز به اکسید کردن کربن اضافی به شکل QUOTE CO2 خواهد داشت. به این ترتیب مقدار کربن کاهش یافته و مقدار محدودی از نیتروژن نیز برگشت داده می شود. نهایتاً هنگامی که نسبت کربن به نیتروژن موجود بیش از اندازه پایین باشد، نیتروژن اضافی باعث تولید آمونیاک خواهد شد. تحت شرایط مناسب، ممکن است مقداری از آمونیاک به نیترات اکسیده شود]12.[
فسفر، پتاسیم و انواع مختلف مواد میکرونی خنثی نیز جهت رُشد بیولوژیکی اساسی هستند. این مواد در حالت عادی، بیشتر از مقدار مورد نیاز در موارد قابل کمپوست وجود دارند و از این نظر مشکلی ایجاد نمی‌شود]13[.
شکل (2-12) سیکل کربن و نیتروژن را در فرایند های هوازی مشخص می کند. این فرآیند که در طبیعت بسیار رایج می باشد بیشتر در سطح زمین مثل کف جنگلها اتفاق می افتد. برگ درختان و فضولات حیوانات بر روی کف جنگلها ریخته شده و به تدریج به خاک برگ و کود خاکی نسبتاً پایداری تبدیل می شود]12[.

شکل (2-1)- سیکل کربن و نیتروژن در فرایندهای هوازی]12[.
مقدار زیادی انرژی در اثر تبدیل C به QUOTE CO2 به صورت گرما آزاد خواهد شد. مثلاً اگر یک مولکول گرم از گلوکز تحت شرایط هوازی تبدیل شود، حدود 674-484 کیلوکالری حرارت تولید خواهد شد. اگر ماده آلی مورد تحول به صورت یک توده یا به صورتی باشد که بتوان آنرا عایق بندی کرد، درجه حرارت آن از تجاوز خواهد کرد. با وجود این اگر درجه حرارت از تجاوز کند، فعالیت باکتریها کاهش خواهد یافت و عمل تجزیه آهسته خواهد شد]14و12.[
به علت اینکه، در اثر درجه حرارت بالا، در حین فرآیند تخمیر باکتریهای فتوژن (فعال در برابر نور)، فتوزوا، تخم کرمها و میکروبهای علفهای هرزه که برای کشاورزی و سلامتی انسان مُضر هستند نابود شده اند، لذا استفاده از کود حاصله در مزارع کاملاً بی خطر است]14و12[.
اکسیداسیون هوازی مواد آلی بوی قابل ملاحظه ای ایجاد نمی کند. اگر در محل، بو ایجاد شود نتیجه گرفته می شود که یا فرآیند هوازی نیست و یا موادی در محیط وجود دارند که اکسیداسیون آنها تولید بو می کند. عمل تجزیه شدن یا کمپوست شدن هوازی، اگر اکسیژن به مقدار کافی وجود داشته باشد، می تواند در سیلوهای هاضم، گودالها، و سطح زمین به صورت پشته ای و یا کومه ای صورت گیرد]37 [.
2-8-2- تجزیه غیر هوازی
فاسد شدن مواد آلی، نتیجه تجزیه آنها در شرایط غیر هوازی است. ارگانیسم های زنده غیر هوازی در سوخت و ساز مواد مغذی، ترکیبات آلی را بوسیله یک فرایند احیاء تجزیه می کنند]37 [.
همانند فرآیند هوازی، ارگانیسم ها از نیتروژن ، فسفر و سایر مواد مغذی در رشد و تولید پروتوپلاسم سلول، استفاده و مواد آلی حاوی نیتروژن را به اسیدهای آلی و آمونیاک تبدیل می کنند. اتمهای کربن موجود در ترکیبات آلی که در پروتئین سلولی مورد استفاده قرار نمی گیرند، به صورت متان آزاد شده و بخش کوچکی از کربن ممکن است در اثر تنفس به QUOTE CO2 تبدیل شود]37و12.[
این فرآیند در طبیعت به صورت تجزیه لجن مواد آلی در ته مرداب ها و مواد آلی مدفون شده که به اکسیژن دسترسی ندارند، اتفاق می افتد. گازی که در مرداب ها متصاعد می شود عمدتاً QUOTE CH4 می‌باشد]37و26[.
احیاء شدید (فاسد شدن) مواد آلی معمولاً توأم با ایجاد بوهای نامطبوعی از سولفید هیدروژن و ترکیبات آلی احیاء شده گوگرددار (از قبیل مرکاپتانها) می باشد.
از آنجائی که تجزیه غیر هوازی مواد آلی فرایند احیاء می باشد، بخشی از محصول نهایی (کود کمپوست) هنگامی که در مزارع مورد استفاده قرار می گیرد، در معرض اکسیداسیون هوازی قرار خواهد گرفت. این اکسیداسیون جزئی است و به سرعت صورت می گیرد و در کاربرد مواد مشکل ساز نمی باشد]37 [.
این انهدام، به صورت آهسته انجام می شود و در دوره های 6 ماهه تا یکساله، کاملاً از بین می روند. هنگامی که مواد بطور غیر هوازی به صورت توده های سطحی یا در واحدهای حوضچه ای کمپوست شوند، تصاعد بوها کاملاً شدید می باشد. در شکل فوق سیکل نیتروژن و کربن در عمل تجزیه غیر هوازی نشان داده شده است]37 [.
با توجه به خصوصیات روش های مذکور، طرق صنعتی تهیه کمپوست بر اصل تجزیه هوازی استوار می‌باشند و به این جهت این روش بیشتر از روش تجزیه غیر هوازی بکار گرفته می شود.
2-9- کمپوست ترکیبی
کمپوست در زمانی رخ می دهد که آب ، اکسیژن ، کربن آلی به اندازه کافی برای تحریک رشد میکروبی وجود دارد. هوادهی مناسب ، آبیاری ، قند کافی و سایر اشکال کربن ساده آلی برای تحریک این فرایند مورد نیاز است. بنابراین، در عمل همه مواد بلافاصله مناسب نیستند و باید سایر مواد به این فرایند اضافه شوند که با نام کمپوست ترکیبی نامیده می شوند.
2-10- انواع کمپوست ترکیبی
کمپوست ترکیبی حاصل از فرآیند تخمیر را با توجه به مدت، شرایط آب و هوائی، پیشرفت تجزیه و... می‌توان به شرح ذیل تقسیم بندی نمود:
- کمپوست ترکیبی خام:
منظور زباله های خُردشده و لجنی است که هیچگونه عملیات تخمیر و پاستوریزاسیون بر روی آن صورت نگرفته باشد.
- کمپوست ترکیبی تازه:
منظور کمپوست ترکیبی است که عمل تخمیر در آن شروع شده ولی تجزیه و واکنش های مربوطه کامل نگردیده است.
- کمپوست ترکیبی کامل:
منظور کمپوست ترکیبی است که شرایط مناسب عمل تخمیر در آن ادامه یافته و در نتیجه مقدار بیشتری از مواد آلی تجزیه و نسبت به کمتر از 25 درصد و میزان مواد آلی به حدود 20 درصد و مقدار ناخالصیها به کمتر از 10 الی 15 درصد تقلیل یافته است]14.[
- کمپوست ترکیبی ویژه:
منظور کمپوست ترکیبی است که جهت جبران کمبود تعدادی از عناصر مغذی و مورد نیاز گیاهان، با توجه به استاندارد تعیین شده، با همان عناصر تکمیل گردیده است]5و3و7.[
2-11- خصوصیات کمپوست
اکثر تولید کنندگان، یک کمپوست مرغوب را از روی ظاهر مواد تجزیه شده می شناسند و بطور کلی می توان زمان عمل آمدن (رسیدن) کمپوست را از نظر کمیت و کیفیت توسط یک کنترل کننده تجربی به خوبی تخمین زد.
در تعیین خصوصیات فیزیکی کمپوست باید اندازه ذرات، پیشرفت عمل تخمیر، مقدار درصد مواد غیر مفید از قبیل پلاستیک، شیشه، کاغذ و... متناسب با نوع مصرف بررسی شوند.
کمپوست را بر حسب اندازه ذرات و با توجه به کاربرد مربوطه به صورت ذیل تقسیم بندی می کنند :
کمپوست نرم با قطر ذرات کمتر از 8 میلیمتر
کمپوست متوسط با قطر ذرات بین 20-8 میلیمتر
کمپوست درشت با قطر ذرات بین 45-20 میلیمتر]11[
تأثیر کلی کمپوست، بیشتر مربوط به تغییر فرم آن در خاک است. این تأثیر هنگامی می تواند به حداکثر مقدار خود برسد که میزان مواد آلی موجود در کمپوست حداقل بالغ بر 15 الی 20 درصد از کل مواد باشد. به این ترتیب تجزیه مواد نه فقط بایستی در زمان تهیه کمپوست انجام گیرد، بلکه بیشتر باید در محل مصرف یعنی خاک انجام پذیرد]7 .[
مطالعات محققین نشان داده است که مصرف کمپوست نسبتاً درشت در باغات میوه و تاکستان ها مناسب تر است، ولی در سبزیکاری و صیفی کاری باید کمپوست در زمان تهیه، حداکثر میزان تخمیر و تغییر فرم را یافته باشد، زیرا در غیر اینصورت فعالیت میکروارگانیزم ها موجب افزایش QUOTE Co2 و کمبود اکسیژن خاک گشته، در نتیجه فعالیت ریشه ها محدود می گردد]8[.
وجود موادی از قبیل شیشه، پلاستیک و ... که وجود هر کدام از آنها در کود کمپوست مضراتی به همراه دارد ( خصوصاً پلاستیک که پس از مدتی موجب نفوذ پذیری خاک و تبدیل آن به باتلاق می شود) باید به حداقل ممکن رسانیده شود. در کمپوست نرم این مواد نباید بیش از 6 درصد و در کمپوست متوسط بیش از 12 درصد باشد.]8[
2-12- ویژگیها و موارد مصرف کمپوست
احداث کارخانجات کمپوست و استفاده از محصول آن می تواند تبعات مفیدی را در پی داشته باشد که به عنوان نمونه به موارد ذیل اشاره می شود:
2-12-1- کاهش آلودگی محیط زیست ( آب و هوا )
قبل از این، به این مطلب اشاره شد که در اکثر قریب به اتفاق شهرهای ایران، عملیات دفن زباله و لجن به صورت غیر بهداشتی و با در نظر گرفتن اصول حفاظتی اولیه صورت می گیرد، که اثرات نامطلوب دراز مدت و کوتاه مدتی در پی دارند. حادثه نشت شیرابه های زباله دفن شده در منطقه دفن آبعلی، علاوه بر مرگ و میر تعداد بسیار زیادی از آبزیان رودخانه، منجر به آلوده شدن آبهای زیر زمین منطقه که مصارف آشامیدنی نیز دارند، گردید.
در مورد سایر شهرهای کشور، خصوصاً شهرهای ساحلی، به علت بالا بودن سطح آبهای زیر زمینی، این مشکلات چند برابر می گردد که باید با دید عمیق تری به موضوع نگریسته شود.
مشکل دیگر دفن های غیر بهداشتی و غیر اصولی، از حیث انتفاع خارج کردن زمین به مدت زمان طولانی است. زیرا بسیاری از مواد دفن شده، فسادپذیر نبوده و به همان صورت اولیه خود در زمین باقی می مانند (از جمله مواد پلیمری و...)، از این رو در مناطقی که زمین از ارزش اقتصادی بالائی برخوردار است و یا کمبود زمین وجود دارد، کمپوست می تواند به عنوان یک راه حل مناسب مورد توجه قرار گیرد.
مسئله تغذیه دامها و طیور از زباله های تخلیه شده در محل دفن نیز، یکی دیگر از مشکلات اساسی است که موجب بروز و شیوع بیماریهای عفونی می گردد و سالانه مقادیر زیادی ارز جهت تهیه داروهای مربوطه از کشور خارج می شود]37.[
از جمله مزایای کود کمپوست می توان به موارد زیر اشاره کرد :
2-12-2- جلوگیری از فرسایش خاک
یکی از مشخصات خاک در اکثر نقاط کشور ایران (خصوصاً مناطق مرکزی) عدم پایداری آن است، در این نوع زمینها، قشر رویی خاک، یعنی قشر غنی از مواد آلی، براثر اکسیداسیون تجزیه شده و از بین می رود.
خاک با از دست دادن مواد آلی خود (هوموس)، خاصیت چسبندگی اش را از دست داده و تحت اثر وزش باد، شروع به فرسایش می کند. ذرات ریز خاک توسط باد پراکنده شده و پس از بارندگی به حرکت در می‌آیند و به این ترتیب تمام مواد مغذی محلول در آب شسته شده، از بین می رود. به این پدیده فرسایش گفته می شود]37.[
برای مثال در آفریقا سالانه در هر هکتار، تحت پدیده فرسایش 250 تن مواد از بین می رود. یعنی تا حدود mm15 از لایه رویی خود را از دست می دهند]37.[ یعنی لایه ای که از لحاظ کشاورزی بسیار ارزشمند است. کمپوست ترکیبی است که هوموس خاک را احیاء نموده و از فرسایش بی رویه خاک جلوگیری می‌کند.
2-12-3- قابلیت نگاهداری آب در زمین
یکی دیگر از مشخصه های زمین مزروعی قدرت نگاهداری آب مورد نیاز گیاه در خاک می باشد، خصوصاً خاک های رُسی که در معرض شرایط جوی فصول خشک قرار گیرند. امروزه از ترکیبات مختلفی جهت بهبود این مشخصه استفاده می شود، مثلاً ورمیکولیت، پرلیت و... .
اما از لحاظ اقتصادی مناسب ترین و بهترین ماده در این مورد، کود کمپوست است که علاوه بر توانائی مذکور، ارزش غذائی مناسبی نیز برای خاک دارد.
2-12-4- متخلخل نمودن خاک
کمپوست حجم خلل و فرج خاک ها را افزایش داده و ساختمان آنها را اصلاح می کند. از عوارض ناخواسته کاربرد انواع کودهای شیمیایی، سخت و محکم شدن خاک های کشاورزی است. با کاربرد کود کمپوست این مشکل نیز برطرف می شود. زیرا قسمتی از فعل و انفعالات تخمیر کمپوست در خاک انجام گرفته و با این عمل گاز QUOTE Co2 تولیدی موجب متخلخل شدن خاک می گردد]37.[
2-12-5- سایر موارد کاربرد کمپوست
کمپوست موارد مصرف متنوع و گسترده ای دارد از قبیل :
به عنوان سوبسترا در کشت قارچ
به عنوان عایق اکوستیک
به عنوان ماده بوگیر (بیوفیلتر)
به عنوان بستر حیوانات در دامداریها
به عنوان یکی از مواد اولیه تهیه آجرهای متخلخل و ...]37 [.
2-13- پژوهش های انجام شده
- استلمچوسکی در سال 2003 روی کوکمپوست تحقیقاتی انجام داد که هدف اصلی او نسبت تهیه لجن به زباله بود. البته ایشان از زباله سبز به عنوان زباله استفاده کرده بود]9.[
- زورپس در سال 2000 از مخلوط زباله خانگی و لجن و همچنین زئولیت طبیعی استفاده کرد. آقای زورپس به این نتیجه رسید که اضافه کردن زئولیت ها می تواند مقدار فلزات سنگین را تا حدود زیاد کاهش دهد]6.[
- گیند در هند در سال 2003 مطالعه ای روی کمپوست خاکستر با کاه گندم انجام داد . آقای گیند دریافت که اضافه کردن خاکستر می تواند تا 20% مقدار را کاهش دهد و همچنین فسفر را در حد بالایی نگه می دارد]1[.
- در چین تولید کوکمپوست با پیشرفت اقتصادی همراه بود. یکی از اهداف اصلی دولت چین در حذف زباله استفاده از کوکمپوست بود که حدود 20 % از زباله چین بدین روش تثبیت می شود که البته در این راه از لجن تصفیه خانه هم استفاده می شود که این تحقیق توسط آقای وی در سال 2000 انجام شد]8[.
2-13- روشهای تولید کمپوست
روشهای تولید کمپوست را می توان بر اساس به کارگیری راکتور، مکانیسم جریان، حرکت جامدات، شرایط بستر و روش هوادهی طبقه بندی نمود. یکی از متداولترین شیوه های طبقه بندی فرآیند کمپوست به قرار ذیل است:
1- سیستمهای غیر راکتوری (باز)
بستر جامد همزده شده (ویندرو)
- تهویه طبیعی
- هوادهی تحت فشار
بستر جامدات ثابت
- هوادهی تحت فشار (توده ثابت هوادهی شده)
- تهویه طبیعی (توده بدون هوادهی)
2- سیستمهای راکتوری (بسته)
الف – جریان عمودی جامدات
بستر جامدات همزده شده
- کوره های متعدد یا چند کوره ای
- کوره های چند طبقه
بسترهای پرشده (سیلوراکتورها)
- با جریانهای متقابل هوا و جامدات
- با جریانهای متقاطع هوا و جامدات
ب – جریان افقی و شیب دار جامدات
بستر لغزان جامدات (استوانه های چرخان)
- جریان پراکنده
- سلولهای سری
- اختلاط کامل
بستر جامدات همزده شده ( محفظه های همزده شده یا کانالهای باز )
- دایره ای شکل
- مستطیلی شکل
بستر جامدات ثابت ( تونلی شکل )
- نوع فشاری
- نوع نقاله ای


ج – بدون جریان ( جعبه های کمپوست )]2[.

شکل ( 2-2)-شمایی از فرایند ویندرو]15و38و9[.
2-15- فرآیند ویندرو
فرآیند ویندرو یا فرآیند توده های طویل سطحی در واقع شیوه ای است که در آن مخلوط آماده شده جهت ورود به سیستم در ردیفهای موازی که از قبل برای آنها تهیه شده است قرار گرفته و هرچند وقت یکبار با وسایل مکانیکی مخصوص زیر و رو می گردد. شکل توده کمپوست، ارتفاع و عرض آن کاملاً بستگی به نوع مواد ورودی و نوع دستگاه های مخلوط کننده دارد.
عملیات اکسیژن رسانی به مخلوط عمدتاً از طریق تهویه طبیعی در اثر نیروی شناوری گازهای گرم خروجی از توده صورت می گیرد، در شرایطی که این میزان کم باشد می توان با زیر ورو کردن توده کمپوست نیز آنرا هوادهی نمود. همچنین در برخی موارد برای عملیات اکسیژن رسانی به توده های کمپوست از هواده های تحت فشار مثبت " دمنده " و یا تحت فشار منفی " مکنده " استفاده می گردد. در هوادهی تحت فشار مثبت، دمنده، هوای محیط را با فشار به داخل توده می راند و در هوادهی تحت فشار منفی، مکنده، گازهای موجود در توده کمپوست را با نیروی مکش از توده خارج می نماید.
درصورتی که مواد خام ورودی به سیستم از ویژگیهایی از قبیل درصد جامدات، میزان رطوبت و نسبت مناسبی برخوردار باشد غالباً این فرآیند بیولوژیکی به صورت خودکار عمل می کند. با این وجود به منظور آگاهی از زمان و تعداد مراحل زیر و رو کردن توده ها بایستی پارامترهای درجه حرارت و درصد رطوبت به طور مستمر مورد پایش قرار گیرند.
مراحل زیر و رو کردن، در فرآیند ویندرو از اهمیت خاصی برخوردار است زیرا موجب تنظیم، درجه حرارت، رطوبت، تخلخل، هوادهی و کنترل بو و مگس در توده های کمپوست می گردد.
فرآیند ویندرو به طور موفقیت آمیزی در تولید کمپوست از مواد آلی نظیر فضولات باغی، زباله و لجن فاضلاب به کارگرفته شده و یک فرآیند متداول در امر کمپوست سازی از فضولات باغی و گیاهی به شمار می آید.
تجربه کاربرد فرآیند ویندرو در کمپوست لجنهای هضم شده نشان می دهد که در اغلب موارد ترکیب این لجنها با کمپوست برگشتی شرایط مطلوبی را به دنبال داشته است اما در صورت نیاز می توان از مواد حجیم کننده و اصلاح کننده نیز جهت متناسب سازی بیشتر مخلوط بهره گرفت]15و2.[
2-15-1- تاریخچه کاربرد فرآیند ویندرو
قدیمی ترین فرآیند تولید کمپوست از لجن فاضلاب فرآیند ویندرو می باشد که قدمت بهره گیری آن به سال 1930 در آلمان بر می گردد. در آن زمان لجن آبگیری شده بدون اضافه نمودن عوامل حجیم کننده برای تولید کمپوست به روش ویندرو مورد استفاده قرار گرفت، که با توجه به تخلخل کم لجن و عدم امکان هوادهی مناسب، بوی نامطبوع زیادی در تأسیسات پخش شد و کاربرد فرآیند متوقف گردید]16[.
در سال 1950 آلریچ و اسمیت نتایج تجارب خود را از کمپوست مخلوط لجن فاضلاب هضم شده با ذرات چوب در آستینِ تگزاس با زمان بندی حدود 11 هفته گزارش نمودند، اما اولین کاربرد روش ویندرو به منظور کمپوست لجن هضم شده در مقیاس اجرایی در شهر آستین بسیار دیرتر یعنی درسال 1987 انجام پذیرفت]15و38.[
تجربه بعدی از کمپوست لجن به فردی به نام ریوز در سال 1959 برمی گردد. او از لجن هضم شده شهر الپاسوِ تگزاس که به مدت 4 تا 6 ماه در معرض هوا قرار گرفته و خشک شده بود مخلوطی با خُرده چوب درست کرد و 2 تا 3 ماده آنرا تحت فرآیند ویندرو قرار داد و سپس محصول را 2 تا 3 ماده جهت عمل آوری در توده های ثابت نگهداری نمود.
اولین واحد بزرگ تولید کمپوست لجن، در سال 1972 در لس آنجلس تأسیس شد و کارخود را با روزانه 100 تن کیک لجن هضم و آبگیری شده شروع کرد. در این واحد از کمپوست برگشتی جهت تنظیم رطوبت (تا حد 60 درصد) و پایداری ساختمانی توده ها استفاده گردید. جهت ایجاد تخلخل مناسب در این سیستم از عملیات زیر و رو کردن و اضافه کردن مواد حجیم کننده نظیر خُرده چوب و پوشال برنج بهره گرفته شد و برای بهبود انرژی تولیدی در فرآیند مواد اصلاحی با درصد مواد آلی بیشتر مورد استفاده قرار گرفت. این واحد کار خود را با کیفیت مطلوبی تا سال 1991 ادامه داد و در این سال به دلیل ملاحظات محلی و تولید بو، نقل مکان کرد]15و38.[
درسال 1980 یک واحد کمپوست لجن به روش ویندرو در واحد احیاء فاضلاب متروپلیتن دنور تأسیس گردید. این واحد برای 100 تن مواد ورودی روزانه در 16 ایکر فضای مُسقف با امکانات هوادهی به ظرفیت 165000 فوت مکعب استاندارد در دقیقه، به کار گرفته شد، اما پس از مدت کوتاهی از آغاز بهره برداری با مشکل تولید بو مواجه گردید]38.[
در سال 1991، شرکت کمپوست سازی سن جوکین در لس آنجلس بهره برداری از تأسیسات کمپوست به روش ویندرو را در منطقه ای دور دست در دره سن جوکین شروع کرد. این واحد با ورودی روزانه معادل 100 تن لجن هضم و آبگیری شده (با 20 درصد مواد جامد) و مواد اصلاح کننده ای نظیر کمپوست برگشتی و یا مواد زائد کشاورزی نظیر پوشال برنج به طور موفقیت آمیز بدون ایجاد بوهای مزاحم به کار گرفته شد]38 [.
بررسیها نشان می دهد که در حال حاضر تعداد زیادی از واحدهای تولید کمپوست به روش ویندرو در کشورهای اروپایی و آمریکایی به طور مطلوبی در حال فعالیت می باشند.
2-15-2- راهبری سیستم
شکل توده ویندرو تا حد زیادی به مشخصات مواد ورودی و نوع ماشین آلات مخلوط کُن بستگی دارد اما سطح مقطع ذوزنقه ای متداولترین شکل توده های ویندرو می باشد. شکل(2-2) نمونه هایی از این توده ها را با ابعاد و اندازه های معمول نمایش می دهد. طول توده های ویندرو در تأسیسات دنور 100 متر و در تأسیسات لس آنجلس به حدود 140 متر می رسید. هنگامی که از موادی با تخلخل زیاد استفاده می گردد می توان ارتفاع توده را بیشتر و سطح مقطع آنرا مستطیلی شکل در نظر گرفت]38.[

شکل (2-3)- ابعاد و اندازه های متداول توده های کمپوست ویندرو]38 [.
طبق اظهارات "های" به کارگیری مخلوط کنهای بزرگتر امکان ساخت توده های بزرگتر را فراهم خواهد آورد. افزایش سرعت استوانه های چرخان و کاربرد خُردکن ها در مجموعه، شرایط تولید کمپوستی یکنواخت با ذرات ریز و مناسب را ایجاد می نماید. همچنین کاربرد مواد اصلاح کننده نظیر خُرده چوب و پوشال برنج در توده های بزرگ کمپوست، موجب افزایش درجه حرارت و کاهش تولید بوهای متعفن در سیستم می‌گردد.
در واحد لس آنجلس به منظور تأمین شرایط بهینه درجه حرارت در طی فرآیند تولید کمپوست، با توجه به ماه های گرم و سرد سال از دو ترکیب متفاوت مواد خام ورودی به سیستم استفاده شده است. در این سیستم در طی ماه های گرم سال از مخلوط کیک لجن، کمپوست برگشتی و خرده چوب با نسبتهای حجمی 1 به 8/0 به 4/0 استفاده شده و برای ماه های سرد سال از مخلوط کیک لجن با خرده چوب با نسبتهای حجمی 1 به 2/1 استفاده می گردد]38.[
فرآیند ویندرو با کمپوست برگشتی نمی تواند در مواقع سرد و بارانی درجه حرارت را به مدت 15 روز در حد 55 درجه سانتی گراد نگهداری نماید. بر این اساس "های" طی آخرین تحولاتی که در واحد لس آنجلس به وجود آورد این فرآیند را به دو مرحله توسعه داد. در مرحله اول با ایجاد ویندروهای کوچک به مدت 2 تا 3 هفته شرایط خشک سازی، هوادهی و پاستوریزاسیون اولیه فراهم می شود. در این مرحله، ویندروها 3 تا 4 مرتبه در هفته زیر و رو شده که بدین ترتیب درجه حرارت طی ماه های گرم به 55 درجه سانتی گراد افزایش یافته ولی طی ماه های سرد این افزایش ایجاد نمی گردد]38.[
پس از تکمیل مرحله اول هر دو یا سه ویندرو مجاور هم توسط یک لودر مجتمع شده و یک ویندرو بزرگ را تشکیل می دهند. بسته به درجه حرارت موجود در مرحله اول ممکن است در این مرحله از مواد اصلاحی اضافی نیز استفاده گردد.
در مرحله دوم درجه حرارت توده اغلب تا 65 درجه سانتیگراد افزایش می یابد که این امر موجب نابودی پاتوژنها و کاهش بیشتر رطوبت در توده می شود.
ویندروهای بزرگ در مرحله دوم تولید کمپوست به مدت 3 هفته یا بیشتر نگهداری شده و سه بار در هفته زیر و رو می گردند تا بدین ترتیب شرایط مناسبی از زمان ماند، درجه حرارت و اختلاط به وجود آید]38.[
جهت صرفه جویی در خرید مواد حجیم کننده مورد نیاز نظیر خرده چوب می توان بخشی از آن را به وسیله سَرند کردن کمپوست نهایی جداسازی نمود، اما بهرحال حدود 25 تا 30 درصد از این مواد طی مراحل تولید کمپوست مورد اکسیداسیون بیولوژیکی قرار گرفته و یا به علت عدم جداسازی از مدار خارج می‌گردند]38و15[.
از معایب عمده روش ویندرو در تولید کمپوست لجن فاضلاب شهری می توان زمین مورد نیاز زیاد و عدم امکان بکارگیری لجنهای خام در این فرآیند را برشمرد. طبق اظهار نظر "کولاسیکو" زمین مورد نیاز برای فرآیند ویندرو حداقل 25 درصد بیشتر از روش توده های هوادهی شده می باشد]38و15[.
2-15-3- اثرات زیست محیطی و بهداشتی
در مناطقی که بیماریهای آندمیک شیوع دارند در فاضلاب آن مناطق میکروارگانیزمهای خاص آن بیماریها به وفور یافت می شوند. پاتوژنهای حمل شده توسط فاضلاب در طی فرآیندهای معمول هضم لجن و روشهای خشک کردن غیر فعال نمی شوند و در محیط به مدت طولانی باقی می مانند. نمودار (2-1) رابطه انهدام پاتوژنها با زمان و درجه حرارت برای روش ویندرو را نشان می دهد. مطالعات جامع در مرکز بهسازی لس آنجلس نشان می دهد که کلیفرمهای کل و سالمونلا در 10 روز اول فرآیند کمپوست به روش ویندرو گرفته شده است، کمتر از یک عدد در هر گرم بوده است. اما در نمونه های قسمتهای خارجی توده تعداد آنها بیشتر بوده است. در اکثر نمونه های کمپوست نهایی مقادیر خیلی کمی از ویروسها، تخم پارازیتها و سالمونلاها جمع آوری شده است]21[.

شکل (2-4)- نمودار ارتباط کاهش پاتوژنها با زمان و درجه حرارت در روش ویندرو]37 [.
بازگشت کمپوست تکمیل شده به عنوان عامل حجیم کننده سبب کنترل مؤثر برای لجنهای هضم شده می‌گردد. توقف در زیر و رو کردن مواد می تواند سبب انتشار بوهای ناخوشایند گردد، زیرا توده ویندرو به سرعت تحت شرایط بی هوازی قرار می گیرد. همچنین در طی فواصل بارندگیهای شدید ممکن است مسایل ناشی از بو بروز نماید. در نواحی خشک با وزش باد شدید، می بایست توده ها را نمدار کرده تا از تولید گرد و غبار جلوگیری شود.
سیستم جمع آوری و زهکشی آب در محوطه لازم بوده چون سیلابها آلودگی شدید پیدا کرده و نیاز به تصفیه دارند. کارگرانی که در این مکانها کار می کنند بایستی از مخاطرات ذرات و گرد و غبار حفاظت شوند. سیستم حفاظتی شامل استفاده از ماسکهای تنفسی و آب پاشی کردن توده ها در فواصل خشک و پرباد می‌باشد. مطالعات نشان می دهند که قارچ "آسپروژیلوس فومیگاتوس" به عنوان یک پاتوژن ثانویه در هوای نواحی کمپوست لجن فاضلاب به وفور وجود دارد. بر این اساس افرادی که سابقه ناراحتی ریوی دارند، نباید در مناطق کمپوست سازی به کار گرفته شوند]21[.
2-16- فرآیند توده های ثابت
توده های ثابت هوادهی شده یکی از متداولترین انواع سیستمهای بدون راکتور با توده های ثابت به شمار می آیند. این سیستم کاربرد گسترده ای در تولید کمپوست از لجن خام آبگیری شده در کشورهای اروپایی و آمریکا دارد.
فرآیند توده های ثابت هوادهی شده در واقع برای بر طرف کردن مشکلات فرآیند ویندرو یعنی به منظور کاهش زمین مورد استفاده و نیز قابلیت در کمپوست لجنهای خام، گسترش یافته است.
در این روش مواد خام با عوامل حجیم کننده نظیر قطعات چوب مخلوط شده و در قالب توده های بزرگ شکل گیری می گردند. عوامل حجیم کننده ضمن تأمین ساختاری پایدار برای توده ها، به هوادهی آنها بدون عملیات زیر و رو کردن نیز کمک می نمایند.
سیستم هوادهی در این فرآیند با نیروی دمنده یا مکنده انجام می پذیرد. توده ها به صورت ناپیوسته بارگذاری شده و در طی فرآیند کمپوست زیر و رو نمی شوند.
در برخی از طراحیهای جدید، به منظور جلوگیری از سخت و کُلوخه شدن مواد در توده ها تمهیدات خاصی اتخاذ گردیده است، این سیستم ها که اصطلاحاً سیستم های "نیمه بهم خورده" نام گرفته اند از عملیات بهم خوردگی بسیار خوبی نسبت به سیستم های ویندرو برخوردار می باشند]2.[
فرآیند توده های ثابت هوادهی شده در ایالت متحده آمریکا کاربرد گسترده ای برای کمپوست لجن های خام دارد. هم اکنون تعداد زیادی از این تأسیسات در بخشهایی نظیر "مونتگومری- مریلند، فیلادلفیا- پنسیلوانیا، اسکارتن- پنسیلوانیا، نشویل- تنسی، اوکلند- کالیفرنیا، کلمبوس-اوهایو" مشغول به کار می‌باشند]9.[
2-16-1- تاریخچه کاربرد توده های ثابت هوادهی شده
در سالهای 1972 تا 1973 مرکز تحقیقات کشاورزی دپارتمان کشاورزی بلتسویل واقع در مریلند آمریکا به طور موفقیت آمیزی کاربرد فرآیند ویندرو برای تولید کمپوست از مخلوط لجن هضم شده و خرده چوب را تجربه کرد]1[.
این روش در تولید کمپوست لجن خام از کارایی مطلوبی برخوردار نبوده و با مشکلاتی نظیر تولید بوهای متعفن مواجه گردید. به منظور حل این مسأله در سالهای 1975 تا 1976 مطالعاتی در این واحد انجام گرفت که منجر به ابداع روش جدیدی به نام روش توده ای ثابت هوادهی شده و یا روش "بلتسویل" گردید]1[.
در این تکنیک از مواد حجیم کننده برای ایجاد تخلخل مناسب و از هوادهی تحت فشار استفاده شده است از اینرو این سیستم قابلیت ویژه ای در کمپوست لجن خام دارد. در صورت بهره برداری مناسب، امکان تولید بو در این روش بسیار کم است و آماده سازی لجنهای خام با مواد شیمیایی نظیر آهک در مرحله آبگیری مشکل انتشار بو را به ‌حداقل ممکن می رساند]1.[
کاربرد این روش در تولید کمپوست از لجنهای خام و هضم شده مورد استقبال زیادی قرار گرفته به گونه‌ای که تنها تا سال 1990، درآمریکا 76 واحد از این تأسیسات مورد بهره برداری قرار گرفته است]9[.
2-16-2- تشریح فرآیند
از ویژگیهای فرآیند توده های ثابت می توان به عدم زیر و رو کردن توده‌ها، استفاده از سیستم هوادهی تحت فشار و کاربرد موادی نظیر خُرده چوب به عنوان عوامل حجیم کننده و تنظیم رطوبت اشاره کرد که این موارد در واقع وجوه افتراق اصلی با فرآیند ویندرو به شمار می آیند.
مطابق برآوردهای انجام شده نسبت حجمی مناسب خُرده چوب مورد نیاز به لجن در این فرآیند حدود 2 به 1 تا 3 به 1 به دست آمده است. استفاده از خرده چوب به عنوان حجیم کننده در بسیاری از واحدها رضایتبخش بوده با این وجود از موادی نظیر پوست درخت، پوست بادام زمینی و خرده های لاستیک نیز در صورت تخلخل کافی می توان بهره گیری نمود]9[.
شکل (2-4) مراحل اصلی فرآیند توده های ثابت هوادهی شده را نمایش می دهد. این مراحل را می‌توان به صورت زیر خلاصه نمود :
1- آماده سازی و اختلاط نسبت حجمی مناسب از لجن آبگیری شده با درصد جامدات 20 تا 25 درصد با عوامل حجیم کننده نظیر خرده چوب و رساندن درصد جامدات مخلوط به حدود 40 درصد.
2- استقرار یک لایه 30 سانتیمتری از عوامل حجیم کننده بر روی لوله های دائمی هوادهی و یا لوله های موقت سوراخ دار هوادهی به عنوان لایه زیرین توده کمپوست.
3- استقرار مخلوط لجن و خرده چوب با ارتفاع و شکل مناسب بر روی لایه زیرین یا لایه اساس.
4- پوشش دادن لایه بیرونی توده به وسیله کمپوست نهایی سَرند شده و یا سَرند نشده.
5- اتصال پمپ هوا به شبکه لوله های هوادهی.

شکل (2-5) -مراحل اصلی فرآیند کمپوست به توده های ثابت هوادهی شده]9[.
پس از انجام این عملیات مرحله تند یا پربار یا روشن کردن پمپ هوا شروع می شود. دستگاه پمپ هوا می‌تواند حالت دمنده داشته و هوا را تحت فشار وارد توده ها نماید و یا اینکه به صورت مکنده عمل کرده و گازهای موجود در توده ها را مکش کرده و سبب جایگزینی هوای تازه در داخل توده ها گردد. عملیات هوادهی در این سیستم در قالب سیکلهای هوادهی با خاموش و روشن کردن های متناوب پمپهای هوا انجام می گیرد. فاصله زمانی هر خاموش و روشن کردن پمپ با توجه به شرایط هوازی و درجه حرارت داخل توده تنظیم می گردد.
در سیستمهای مکشی، هوای خروجی از توده های کمپوست قبل از تخلیه به محیط بایستی از بوهای موجود پاکسازی گردد. روش های زیادی جهت حذف بوی هوای خروجی ابداع شده اما متداولترین آنها عبور هوای خروجی از توده های فیلتر می باشد. توده های فیلتر به طور متوسط حاوی 76/0 متر مکعب کمپوست نهایی الک شده به ازای هر 6/3 تن مخلوط لجن و خُرده چوب می باشند.
زمان ماند توده ها جهت تکمیل فرآیند کمپوست در مرحله تند در صورت تأمین شرایط مناسب حدود 21 روز پس از شکل گیری توده ها برآورد شده است.
پس از انجام این مرحله، توده های کمپوست مطابق شکل (2-4) تا تشکیل محصول نهایی یکی از مسیرهای زیر را طی می نمایند:
خشکسازی، غربالگری، عمل آوری، ذخیره سازی و فروش محصول نهایی.
عمل آوری، خشکسازی، غربالگری، ذخیره سازی و فروش محصول نهایی.
درصورتی که درصد جامدات موجود در مخلوط حداقل بین 50 تا 55 درصد باشد امکان بهره گیری مطلوب از سَرندهای ارتعاشی یا چرخشی جهت غربالگری فراهم می باشد. در غیر اینصورت بایستی خشکسازی بیشتر با هوادهی و یا نگهداری توده ها قبل از غربالگری انجام گیرد.
جداسازی و استفاده مجدد مواد حجیم کننده نظیر خُرده چوب به دلیل کاربرد زیاد آنها طی فرآیند کمپوست سازی، موجب کاهش قابل ملاحظه هزینه ها و بهبود خواص کمپوست تولیدی می گردد. در هر صورت همواره مقداری از مواد حجیم کننده در اثر تجزیه بیولوژیکی و یا عبور از سَرندها از دست رفته و بایستی جایگزین گردند.
درصورت استفاده از مکنده با مکش هوا، همواره مقداری شیرابه به لوله های هوادهی وارد شده که بایستی آنها را قبل از ورود به پمپ مکنده از طریق یک سیفون جمع آوری کرده و تصفیه نمود[38].
شکل (2-5) سطح مقطع یک نمونه توده ثابت هوادهی شده را نمایش می دهد[15].

شکل (2-6)- سطح مقطع یک نمونه ثابت هوادهی شده]15[
به منظور کاهش زمین مورد نیاز در فرآیند توده های هوادهی ثابت تغییراتی در روشهای اجرایی این فرآیند داده شده و اشکال جدیدتری از آن به کار گرفته شده است[38]. یکی از این اشکال جدید "توده های هوادهی گسترده" است که در آن توده ها چسبیده بهم ساخته می شوند به طوری که ساخت توده جدید بر قسمت انتهایی توده قبلی صورت می گیرد. یکی دیگر از روشهای جدید "توده های هوادهی مرتفع" نام دارد که در آن توده ها به وسیله جرثقیل تا ارتفاع حدود 6 متری ساخته می شوند. با کاربرد روش توده های گسترده و یا توده های مرتفع ضمن حفظ اساس فرآیند میزان زمین و مواد حجیم کننده مورد نیاز تا حدود 50% کاهش خواهد یافت]15و38 [. شکل (2-6) نماهایی از توده های منفرد و گسترده را نمایش می دهد.

شکل (2-7) -نماهایی از توده های ثابت هوادهی شده]15[.
روش توده های گسترده با اغلب تأسیسات موجود سازگاری دارد اما روش توده های مرتفع در بیشتر اوقات قابل استفاده نمی باشد.
درجه حرارتهایی که در طی فرآیند کمپوست لجن خام و خُرده چوب اندازه گیری شده در شکل (2-7) دیده می شود. مطابق این شکل درجه حرارت در 3 تا 5 روز اول به سرعت افزایش یافته سپس ثابت می‌گردد و پس از گذشت سه هفته شروع به کاهش می نماید. پروفیل درجه حرارت در توده های هوادهی شده ثابت با مواد اولیه ای که از ترکیب مخلوط لجن هضم شده با مواد مختلف درست شده اند در شکل (2-7) مشاهده می گردد.
همانطور که در شکل فوق دیده می شود افزایش درجه حرارت برای هر سه ترکیب به خوبی صورت می‌گیرد، اما در مخلوط لجن و کمپوست، فقدان عوامل حجیم کننده موجب کاهش منافذ عبور هوا شده از این رو اُفت درجه حرارت در این مخلوط نسبت به سایر ترکیبات بسیار مشهودتر است. مطالعات نشان داد که در صورت کاربرد کمپوست رسیده به عنوان عامل حجیم کننده، فرآیند با درجه حرارت کمتر، زمان ماند بیشتر، درصد کاهش رطوبت و مواد آلی کمتر مواجه خواهد شد. پس از طی دوره سه هفته ای مرحله عمل آوری با هدف بهبود کیفیت محصول نهایی انجام می گیرد. معمولاً برای کاهش زمین مورد نیاز، قبل از مرحله عمل آوری کمپوست اولیه را غربالگری می نمایند.
دوره عمل آوری برای مواد غربال شده حدود 30 تا 60 روز به طول می انجامد. عملیات هوادهی در مرحله عمل آوری توده های ثابت نیز مورد اهمیت قرار دارد. خصوصاً هنگامی که از توده های گسترده برای تهیه کمپوست استفاده شده باشد]15.[

شکل (2-8)-درجه حرارت در توده های ثابت هوادهی شده با مواد مختلف]15و37 [.
2-16-3- وضعیت موجود
سیستم توده های هوادهی شده در مقیاس اجرایی در "بلتسویل، بنگور، دورهام، دیترویت، میشیگان، ویندرو و اونتاریو" به طور بسیار مؤثری مورد استفاده واقع شده است. پس از شروع فرآیند، متوسط درجه حرارت در توده های هوادهی به 70 درجه سانتیگراد رسیده و بعد از ایجاد شرایط پایدار، معمولاً حداقل درجه حرارت حدود 55 درجه است.
کاربردی بودن این سیستم برای کمپوست سازی لجن هضم شده امتیازی است که این روش را نسبت به روش ویندرو شاخصتر می نماید. از سایر مزایای این روش نسبت به روش ویندرو می توان به کنترل مؤثر بو، غیر فعال سازی پاتوژنها به میزان بیشتر و استفاده از زمین کمتر اشاره نمود. از مزایای توده های هوادهی شده نسبت به سیستمهای راکتوری می توان به هزینه های سرمایه گذاری و راهبری بسیار ساده تر آن اشاره نمود[38].
امتیازات فوق موجب شده تا توجه بیشتری به توده های هوادهی شده برای کمپوست لجن معطوف گردد. مطالعاتی که در سال 1988 در آمریکا صورت گرفت مؤید این است که از میان سیستمهای کمپوست لجن موجود، توده های هوادهی شده 54 درصد، روش ویندرو 25 درصد، روش ویندرو هوادهی شده 4 درصد و سیستمهای راکتوری 17 درصد را تشکیل می دهند.
طبق مطالعات "کلاسیکو" هزینه عملیاتی گزینه ای که در آن از خُرده چوب به عنوان عامل حجیم کننده استفاده می شود تقریباً مشابه روش ویندرو است]38 [.
2-16-4- چشم اندازهای اخیر
تجریباتی که در دهه 80 به دست آمد تحولات زیادی در اساس فرآیند توده های ثابت "بلتسویل" به وجود آورد. عمده ترین پیشرفتها مربوط به سیستم هوادهی فرآیند بود. در فرآیند اصلی "بلتسویل" از هواده های کم قدرت با سیستم کنترل قطع و وصل تایمری استفاده شده که منجر به بروز فرآیندی بسیار پرحرارت می‌گردید. این صنعت به تدریج به سمت سیستم هوادهی زیاد و تولید فرآیندهای با درجه حرارت کمتر متمایل شد. در سیستم جدید درجه حرارت فرآیند تا حدود بهینه آن کاهش داده شد که مزایایی نظیر سرعت تجزیه بیشتر توده ها و آزادسازی حرارت بیشتر در اثر واکنشهای کمپوست سازی را در پی داشت. در این روش از سیستم کنترل حلقه های حساس حرارتی استفاده می شود بدین ترتیب که با افزایش یا کاهش حرارت موجود در توده، گیرنده های حرارتی فرمان شروع و یا توقف کار هواده ها را داده و موجب تنظیم درجه حرارت در حدود مورد نظر می گردند.
سیستم حلقه های حرارتی مدتهاست که در روش کمپوست راکتوری مورد استفاده قرار می گیرد اما کاربرد آن به تازگی در روشهای ویندرو و توده های ثابت متداول شده است.
حداکثر میزان هوای مورد نیاز مربوط به هفته اول کمپوست سازی بوده و پس از آن به تدریج میزان هوای مورد نیاز در طول فرآیند کاهش می یابد. این نوسانات با سیستم کنترل حلقه های حرارتی به خوبی قابل تنظیم هستند. در صورتیکه در روش "بلتسویل" میزان هوادهی در طول فرآیند ثابت باقی می ماند. بر این اساس کاربرد هواده های بزرگتر با تنظیم درجه حرارت در محدوده بهینه شروع شد]15.[
هنوز بخشهای زیادی بر روی سیستم کمپوست سازی تحت درجه حرارت بهینه وجود دارد. حفظ درجه حرارت بهینه حدود 45 درجه سانتیگراد از یک طرف موجب سلامت و فعالیت مطلوب جمعیت میکروبی موجود در توده کمپوست می گردد و از طرف دیگر شرایط پاستوریزاسیون مطلوب در توده کمپوست را فراهم نمی آورد]15.[
متخصصین در این امور اذعان دارند که فرآیند کمپوست سازی تحت درجه حرارت بالا محدودیتهایی را در سرعت انجام واکنش به وجود می آورد اما بسیاری از مشکلات بهداشتی را بر طرف می نماید. اگر طراحان در طراحی سیستم هوادهی تجهیزات کنترل لازم را تعبیه کنند، بهره برداران می توانند به صلاحدید خود درجه حرارت بهینه را برای اخذ بهترین نتایج تنظیم نمایند.
در مورد لجن فاضلاب شهری بسیاری از بهره برداران درجه حرارتهای بین 55 تا 65 درجه سانتیگراد را به عنوان درجه حرارت اولیه برای اطمینان از پاستوریزاسیون مناسب می دانند و سیستم را برای روزهای اول روی آن تنظیم می نمایند]9و38و15.[ پس از حصول اطمینان از کنترل پاتوژنها، بهره بردار درجه حرارت سیستم را بر روی اعداد پایین ترین تنظیم می نماید.
تجربیات به دست آمده بر روی فرآیندهای با درجه حرارت بهینه موجب شد تا این فرآیند در دهه 80 مورد توجه و قبول مجامع علمی قرار گیرد]38.[
2-17- سیستمهای کمپوست راکتوری
فرآیندهای راکتوری کمپوست سازی بر اساس نوع جریان ورودی جامدات به سیستم به دو دسته راکتورهای با جریان عمودی و راکتورهای با جریان افقی تقسیم می گردند. راکتورهای افقی از یکسری راکتورهایی با شیب ملایم نسبت به افق تشکیل شده اند که بدین ترتیب جریان یافتن جامدات در آنها امکان پذیر خواهد بود]2.[
2-17-1- راکتورهای جریان عمودی جامدات
نحوه جریان جامدات در این راکتورها بصورت عمودی می باشد. در برخی از این راکتورها جامدات هنگام جریان عمودی به سمت پایین بهم زده می شوند که به این راکتورها اصطلاحاً "راکتورهای جریان عمودی با بستر جامدات بهم زده" اطلاق می شود. این راکتورها می توانند با تغذیه مداوم و یا متناوب بکار گرفته شوند. نمونه ای از این راکتورها در شکل (2-8) نشان داده شده است.

شکل (2-9)- راکتورهای جریان عمودی با بستر جامدات بهم زده]2[.
در گونه های دیگر راکتورهای عمودی، که به آنها اصطلاحاً "راکتورهای جریان عمودی با بستر پرشده" اطلاق می گردد جامدات ورودی بهم زده نمی شوند این راکتورها نیز می توانند بصورت پیوسته یا ناپیوسته تغذیه و بکار گرفته شوند[2].

شکل (2-10)- راکتورهای جریان عمودی با بستر پرشده]2[.
در راکتورهای جریان عمودی با بستر های پر شده اغلب بصورت زمان بندی جریانی از جامدات از کف به طرف بالا برگشت داده شده و یک بهم زدگی در این حجم ایجاد می گردد. پس از رسیدن این جریان به بستر، بهم خوردگی تا جریان برگشتی بعدی متوقف می گردد. عمق مواد موجود در این راکتورها به 6 تا 9 متر می‌رسد]2و9[.
نمونه های مختلفی از این راکتورها با اشکالی دایره ای و یا مستطیلی و با الگوهای هوادهی متفاوت مورد استفاده قرار گرفته اند.
راکتورهای جریان عمودی با بستر های پرشده کاربرد گسترده‌ای در کمپوست لجن و مواد اصلاح کننده نظیر خاک اره دارد که دلیل عمده آن هزینه نسبتاً پایین در تولید کمپوست به ازای واحد حجم راکتور می‌باشد]9[.
نمونه‌هایی از راکتورهای جریان عمودی متداول در تولید کمپوست از لجن فاضلاب ذیلاً مورد اشاره قرار گرفته است.
2-17-2- راکتور بیوسل

—d1738

TOC h z t "فهرست اشکال,1" شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان PAGEREF _Toc142952501 h 4شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای PAGEREF _Toc142952502 h 8شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis L PAGEREF _Toc142952503 h 15شکل 1-4- گیاه گلپر PAGEREF _Toc142952504 h 19شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifolia PAGEREF _Toc142952505 h 22شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium polium PAGEREF _Toc142952506 h 24شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare L PAGEREF _Toc142952507 h 25

فهرست جداول
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست جداول;1" جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalis PAGEREF _Toc369168412 h 17جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A) PAGEREF _Toc369168413 h 34جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C) PAGEREF _Toc369168414 h 35جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B) PAGEREF _Toc369168415 h 35جدول 2-4- محلول ریزازورین PAGEREF _Toc369168416 h 35جدول 2-5- محلول احیاء کننده PAGEREF _Toc369168417 h 35جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc369168418 h 36جدول 2-7 PAGEREF _Toc369168419 h 45جدول 2-8 PAGEREF _Toc369168420 h 45جدول 2-9 PAGEREF _Toc369168421 h 45جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه PAGEREF _Toc369168422 h 46جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S) PAGEREF _Toc369168423 h 47جدول 3-1 گاز حاصل از تخمیر جیره و عصاره‌های گیاهان دارویی پس از 96 ساعت انکوباسیون PAGEREF _Toc369168424 h 51جدول 3-2- اثر سطوح مختلف پنج عصاره بر فراسنجه‌های تولید گاز PAGEREF _Toc369168425 h 52جدول 3-3- تعداد کل باکتری‌ها در هر میلی لیتر مایع شکمبه بعد از تاثیر عصاره‌ها PAGEREF _Toc369168426 h 56
فصل اولمقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1- مقدمهدر بین حیوانات اهلی گیاهخوار، نشخوارکنندگان سهم بزرگی را در تامین خوراک و سلامت بشر دارند. از طرفی تغذیه نقش اصلی را در بازده اقتصادی و عملکردی این دام‌ها داشته به طوری که تقریبا دوسوم از کل هزینه تولیدات دامی در واحدهای مختلف پرورش دام به هزینه‌های خوراک اختصاص داشته و از طرفی با توجه به مسئله کمبود پروتئین حیوانی و افزایش تولید با منابع علوفه‌ای موجود، لازم است تا از ارزش تغذیه‌ای منابع خوراکی قابل دسترس و مکمل‌های قابل استفاده به منظور افزایش راندمان تولید اطلاع کافی وجود داشته باشد (امیرخانی، 1386). از این رو اهمیت تغذیه مناسب نشخوارکنندگان ایجاب می‌نماید که ارزش غذایی هر یک از مواد خوراکی و اجزای تشکیل دهنده آنها طبق روش‌های صحیح و استاندارد تعیین گردد (قورچی، 1374).
معده حیوانات نشخوارکننده از چهار بخش شکمبه، نگاری، هزارلا و شیردان تشکیل گردیده است (آلاوونگ و همکاران، 2010). سه بخش اول فاقد هر گونه غده بوده و پیش معده نامیده شده و دو بخش آخر جایی است که هضم میکروبی یا تخمیر در آن صورت می‌پذیرد (منصوری و همکاران، 1381). شکمبه دارای انواع باکتری، پروتوزوآ و قارچ است اما باکتری در تمام جنبه‌های تخمیر شکمبه‌ای نقش غالب را بازی می‌کند (راسل و همکاران، 2002).
حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).


شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)
0/1
0/1 Glucose (W/V)
0/1 Cellobiose(W/V)
0/1 Maltose (w/V)
0/1 Xylose (W/V)
0/75 (V/V) %3 Cellolose Suspension
0/1 (W/V) % 1/0 Hemin Solution
0/2 Trypticase (W/V)
0/05 Yeast Extract (W/V)
0/45 VFA Mixture (V/V)
1/67 (V/V) %3 Cystein-HCL-Water

user7-304

2-17-1- راکتورهای جریان عمودی جامدات 45
2-17-2- راکتور بیوسل 48
2-17-3- راکتور BAV 48
2-18- راکتورهای جریان افقی و شیب دار جامدات 49
2-18-1- استوانه های چرخان 49
2-18-2- راکتور دانو 52
2-18-3- محفظه های با بستر همزده شده 52
2-18-4- راکتور فیرفیلد 54
2-19- محفظه های با بستر ثابت 55
2-19-1- راکتور پایگرو 55
2-19-2- راکتور تونلی BVA 56
2-20- میکروبیولوژی فرایند 56
2-20-1- الگوی دما – زمان 58
2-21- عوامل موثر بر تخمیر 59
2-21-1- هوادهی 60
2-21-2- میزان هوادهی مورد نیاز و مکانیزم های آن 61
2-21-3- میزان رطوبت 62
2-21-4- کنترل رطوبت 64
2-21-5- نسبت C/N 65
فصل سوم: روشها و لوازم مورد استفاده
فصل سوم: روشها و لوازم مورد استفاده
68
3-1- وسایل مورد نیاز 68
3-1-1- طراحی و ساخت واحد نمونه آزمایشگاهی 68
3-1-2- عملیات انتقال، شناسایی مواد 69
3-1-3- تهیه مخلوط اولیه کمپوست 69
3-2- مطالعات آزمایشگاهی 71
3-3- انتقال لجن تصفیه خانه به آزمایشگاه 71
3-4- بررسی کیفی لجن های تولیدی و زباله 71
3-5- اندازه گیری دما 72
3-6- تعیین ماده آلی و کربن 72
3-6- تعیین نیتروژن 73
3-6- تعیین رطوبت 73
3-9- تعیین pH 74
3-10- تغلیظ لجن 74
3-12- اقدامات پایش و کنترل فرآیند 74
3-12-1- پایش فرآیند 75
3-12-2- کنترل فرآیند 76
فصل چهارم: نتایج و تحلیل داده ها
فصل چهارم: نتایج و تحلیل داده ها 78
4-1- آزمایش مرحله اول کمپوست ترکیبی 78
4-1-1- پایش و کنترل فرآیند در آزمایش مرحله اول کمپوست ترکیبی 81
4-1-2- نتایج آزمایش مرحله اول کمپوست ترکیبی 82
4-2- آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 85
4-2-1- شرح آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 85
4-2-2- تحلیل آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 89
4-2-3- نتایج آزمایش مرحله دوم کمپوست ترکیبی 90
4-3- معیارهای ارزیابی عملکرد سیستم در تثبیت لجن 90
4-3-1- کنترل فلزات سنگین 90
4-3-2- کنترل پاتوژنها 91
4-3-3- کنترل بو 92
4-3-5- اندازه گیری مواد آلی باقیمانده 93
فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادها
فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادها 95
5-1- نتیجه گیری 95
5-2- پیشنهادات 97
منابع و ماخذ 99
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل (2-1)- سیکل کربن و نیتروژن در فرایندهای هوازی 17
شکل ( 2-2)- شمایی از فرایند ویندرو 27
شکل (2-3)- ابعاد و اندازه های متداول توده های کمپوست ویندرو 31
شکل (2-4)- نمودار ارتباط کاهش پاتوژنها با زمان و درجه حرارت در روش ویندرو 33
شکل (2-5) -مراحل اصلی فرآیند کمپوست به توده های ثابت هوادهی شده 37
شکل (2-6)- سطح مقطع یک نمونه ثابت هوادهی شده 39
شکل (2-7) -نماهایی از توده های ثابت هوادهی شده 40
شکل (2-8)-درجه حرارت در توده های ثابت هوادهی شده با مواد مختلف 42
شکل (2-9)- راکتورهای جریان عمودی با بستر جامدات بهم زده 46
شکل (2-10)- راکتورهای جریان عمودی با بستر پرشده 47
شکل (2-11)- انواع راکتورهای کمپوست با استوانه های چرخان 51
شکل (2-12)- راکتورهای افقی کمپوست با بستر همزده شده 53
شکل (3-1)- نمایی از پایلوت ساخته شده 67
شکل (4-1)- نمودار تغییرات ph نسبت به زمان 79
شکل (4-2)- نمودار تغییرات دما نسبت به زمان 79
شکل (4-3)- نمودار تغییرات رطوبت نسبت به زمان 80
شکل (4-4)- نمودار تغییرات نرخ هوادهی نسبت به زمان 80
شکل (4-5)- نمودار تغییراتph نسبت به زمان 84
شکل (4-6)- نمودار تغییرات دما نسبت به زمان 85
شکل (4-7)- نمودار تغییرات رطوبت نسبت به زمان 85
شکل (4-8)- نمودار تغییرات نرخ هوادهی نسبت به زمان 86
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول (1-1)- مقایسه آنالیز زباله در چندین منطقه جهان 8
جدول (1-2)- تعداد و انواع میکروارگانیسم های معمولی گرم کمپوست مرطوب 56
جدول (2-3)- حداکثر رطوبت مورد نیاز جهت کمپوست شدن مواد مختلف 64
جدول (2-4)- نسبت C/N در مواد مختلف 66
جدول (3-1)- آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست 70
جدول (3-2)- نتایج آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست 73
جدول(4-1)- آنالیز لجن (مرحله اول) 75
جدول(4-2)- آنالیز زباله (مرحله اول) 75
جدول(4-3)- آنالیز مخلوط اولیه کمپوست (مرحله اول) 76
جدول(4-4)- نتایج آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست (مرحله اول) 76
جدول(4-5)- نتایج آزمایشات تعیین فاکتورهای شاخص فرآیند کمپوست (مرحله دوم) 82
جدول (4-6)- .مقایسه فلزات سنگین کمپوست مرحله اول و دوم و لجن فاضلاب با استانداردهای کشورهای آلمان، ایتالیا و یونان 87
فصل اول
مـقـدمـــه
1-1- کلیـات
امروزه در اقصی نقاط دنیا شاهد پیشرفت روز افزون ملل مختلف در کلیه زمینه ها، بالاخص اقتصادی می‌باشیم. در هیچ دوره ای جهان چنین دگرگونی سریعی را بر خود ندیده است. از مشخصه های این نظام نوین، تولید بیش از پیش که نتیجه آن مصرف گسترده است، می باشد. این مصرف نتیجه ای جز تولید انبوه مواد ناخواسته یا به عبارت ساده تر، زباله در پی نخواهد داشت. زباله در جوامع شهر نشین، علی الخصوص شهرهای بزرگ که بافت جمعیتی آنها به صورت متمرکز می باشد، به عنوان یک محصول ناخواسته و منفور که در اسرع وقت می بایست آن را از محیط زندگی شخصی دور کرد، تعریف می شود.
امروزه پس از تجارب و آزمایش های طولانی مشخص شده است که ارزشمندترین و مؤثرترین کودها و تقویت کننده ها از انسان بدست می آید. چینی ها قبل از ما این اصل را رعایت می کردند و مدفوعات انسانی را به زمین هایشان بازگشت می دادند[33]. واقعیت اینست که بحرانهای زیست محیطی با وارد کردن خسارات جانی و مالی جبران ناپذیر به انسانها هشدار می دهند که دیگر توان خود پالایی از تن خسته طبیعت بدر آمده است. با این باور مدتهاست که کشورهای پیشرفته به منظور حفاظت از محیط زیست، عملیات تصفیه مواد زائد نظیر فاضلابها را قبل از دفع اجباری نموده اند[32].
تصفیه فاضلابها همواره با تولید دو بخش مجزای پساب و لجن همراه می باشد، از این میان پسابها غالباً کیفیتی مطلوب جهت دفع به محیط دارند در حالیکه لجنها بدلیل آلودگی بسیار زیاد نیاز به تصفیه و تثبیت بیشتر دارند. در یک تصفیه خانه فاضلاب شهری، تأسیسات تصفیه و تثبیت لجن به مراتب حساستر، تخصصی تر و پر هزینه تر از سایر واحدها می باشند، چنانچه به عنوان مثال حدود 30 درصد از کل هزینه احداث تصفیه خانه گرگان به واحد تثبیت لجن اختصاص یافت. بر این اساس بایستی توجهات خاصی بر بهینه سازی فنی و اقتصادی روشهای تصفیه و تثبیت لجن معطوف گردد[32].
در کشورهای پیشرفته چندین سال است که تحقیقات جهت انتخاب الگوی بهینه تصفیه و تثبیت لجن شروع شده است. اینکار بایستی در کشور ما نیز همگام با گسترش صنعت فاضلاب، مورد عنایت مسئولین و متخصصین قرار گیرد. با توجه به اهمیت دو موضوع مطرح شده یعنی زباله شهری و لجن می توان با ترکیب کردن این دو طی فرایند، کود ترکیبی (co-composting) بدست آورد که مشکل زباله شهری و تصفیه خانه را حل کند .
1-2- ضرورت انجام تحقیق
یکی از روشهای مؤثر در خنثی نمودن اثرات نامطلوب زباله ها و لجن، تبدیل آنها به کود کمپوست و استفاده مجدد از آنها به عنوان کودآلی (گیاهی) در کشاورزی است. در بیشتر کشورهای جهان، اقتصادی بودن این روش نسبت به سایر روش ها به اثبات رسیده است، بخصوص در مناطق کشاورزی و اطراف شهرهای کوچک (به طرق غیر صنعتی)، که حتی پایین بودن هزینه حمل و نقل، فراوانی مواد آلی و نیروی انسانی ارزان، می تواند بسیار اقتصادی باشد[10].
البته ذکر این مطلب ضروری است که کمپوست ترکیبی باید کاملاً در شرایط مناسب و بهداشتی تهیه و مصرف شود، زیرا زباله یک ترکیب نامتجانس است و کلیه اجزاء تشکیل دهنده آن قابلیت کمپوست شدن را ندارند و از طرفی بعضی از مواد متشکله زباله چنانچه با خاک مخلوط شوند، موجب نزول کیفیت آن می گردد و تعدادی از آنها موجب آلودگی خاک شده، از طریق جذب در گیاهان به انسانها و حیوانات انتقال می یابد که این خود موجب زیان های جبران ناپذیری می گردد و همچنین لجن دارای مقدار زیادی فلزات سنگین است که خود موجب نزول کیفیت لجن می گردد[10].
1-3- اهداف تحقیق
کمپوست ترکیبی فرآیندی است که خواه ناخواه با توجه به مشکلات عدیده ناشی از دفع نامناسب زباله‌های شهری ومشکلات لجن در تصفیه خانه ها در آینده ای نزدیک رشد و توسعه خواهد یافت. کمپوست فرآیندی سهل و ممتنع است. ساده به آن جهت که نیاز به دستگاهها و تجهیزات پیچیده الکترونیکی و مکانیکی ندارد و با کمترین امکانات در تمامی مناطق با اقلیم های متفاوت و با هر ظرفیتی قابل اجرا است و ممتنع به آن خاطر که فرآیند یک فرآیند بیولوژیکی است. یعنی با موجودات زنده می بایست سروکار داشت و شرایط مناسب را برای تغذیه و رشد آنها می باید تأمین نمود. از این رو شناخت فاکتورها و عوامل موثر بر حیات، تغذیه ورشد این موجودات بسیار اساسی و مهم می باشد و کوچکترین بی اطلاعی از این امر موجب تولید محصولات ناخواسته در فرآیند کمپوست ترکیبی خواهد شد که موضوع اصلی ما در این رساله می باشد.

1-4- فرضیات تحقیق
1) تأثیر میزان هوادهی بر عملکرد کمپوست ترکیبی
2) تأثیر اندازه ذرات بر عملکرد کمپوست ترکیبی
3) تأثیر عمل زیر و رو کردن بر عملکرد کمپوست ترکیبی
4) تأثیر فصول تابستان و زمستان بر عملکرد کمپوست ترکیبی
فصل دوم
ادبیات موضوع
2-1- شناخت کمپوست ترکیبی
یکی از روشهای مؤثر در خنثی نمودن اثرات نامطلوب زباله ها و لجن، تبدیل آنها به کود کمپوست و استفاده مجدّد از آنها به عنوان کودآلی (گیاهی) در کشاورزی است. در بیشتر کشورهای جهان، اقتصادی بودن این روش نسبت به سایر روش ها به اثبات رسیده است، بخصوص در مناطق کشاورزی و اطراف شهرهای کوچک (به طرق غیر صنعتی)، که حتی پایین بودن هزینه حمل و نقل، فراوانی مواد آلی و نیروی انسانی ارزان، می تواند بسیار اقتصادی باشد]10[.
البته ذکر این مطلب ضروری است که کمپوست ترکیبی باید کاملاً در شرایط مناسب و بهداشتی تهیه و مصرف شود، زیرا زباله یک ترکیب نامتجانس است و کلیه اجزاء تشکیل دهنده آن قابلیت کمپوست شدن را ندارند و از طرفی بعضی از مواد متشکله زباله چنانچه با خاک مخلوط شوند، موجب نزول کیفیت آن می گردد و تعدادی از آنها موجب آلودگی خاک شده، از طریق جذب در گیاهان به انسانها و حیوانات انتقال می یابد که این خود موجب زیان های جبران ناپذیری می گردد و همچنین لجن دارای مقدار زیادی فلزات سنگین است که خود موجب نزول کیفیت لجن می گردد]10.[
از این رو قبل از وارد شدن به بحث اصلی یعنی تبدیل زباله و لجن به کودآلی، شناخت منابع گوناگون تولید کننده زباله و ترکیبات آن ضرورت پیدا می کند.
2-2- اجزا موجود در زباله
به طور اعم ، مواد زائد جامد را می توان به صورت زیر تقسیم نمود :
زباله منازل ( باقیمانده مواد غذایی، کاغذ و کارتن و... )
زباله حجیم خانگی ( کمد، میز و ... )
زباله های معمولی زباله های غیر آلوده بیمارستانی
زباله باغات و گل خانه ها ( برگ، شاخه و ... )
زباله کسبه و ادارات ( مشابه زباله منازل )
مواد زائد جامد
زباله های صنعتی
زباله های ویژه نخاله های ساختمانی
لاستیک های فرسوده
مواد رادیواکتیو
زباله های آلوده بیمارستانی

صرفاً از بخش آلی زباله های معمولی می توان به عنوان مواد اولیه کمپوست، استفاده نمود.
آنالیز زباله یکی از مقدم ترین کارها در انتخاب و ارزیابی روش دفع زباله و حتّی روش جمع آوری، انتقال، جابجایی، بازیافت و دفن بهداشتی می باشد. لذا در هر شهری می بایست آنالیز زباله نخست از لحاظ فیزیکی و سپس از نقطه نظر شیمیایی مشخص گردد .
در مقام مقایسه با سایر کشورهای جهان آنالیز زباله در چند کشور و منطقه دیگر به صورت جدول 1-1 آورده می شود. همچنانکه مشاهده می شود میزان مواد آلی در زباله های خانگی ایران (تهران)، نسبت به سایر مناطق از مقدار بالایی برخوردار است.
جدول (1-1) مقایسه آنالیز زباله در چندین منطقه جهان]37 [.
ترکیبات تهران شمال آفریقا خلیج فارس آلمان هلند انگلستان دمشق
مواد آلی 45/76 70-60 40-35 4/42 5/50 6/30 50
کاغذ، مقوا، کارتن 98/7 20-10 30-25 9/19 8/22 2/31 11
انواع پلاستیک 58/4 2-1 15-10 1/6 8/6 2/5 5
شیشه 95/1 3-2 6-5 6/11 2/7 8/3 3
فلزات 93/0 3-2 5-2 9/3 4/4 3/5 3
استخوان 82/0 منسوجات 37/2 3-2 6-5 5/1 1/2 1/4 4
چوب 42/0 2-1 4-3 3/2 - - -
نخاله های ساختمانی 9/0 - - - - - -
سایر مواد 75/0 10-5 3-2 3/12 2/6 8/19 21
جمع کل 15/97 100 100 100 100 100 100
یکی از عوامل اساسی جهت توجیه پذیر بودن احداث کارخانجات کمپوست، این است که مواد اولیه (زباله) حداقل باید به میزان 50 درصد دارای مواد آلی باشد. خوشبختانه این نسبت در زباله های ایران بسیار بالاتر از این حداقل می باشد]35.[
با بررسی آمار و آنالیز زباله بسیاری از شهرهای ایران مشاهده می شود که مقدار و درصد مواد آلی قابل تجزیه موجود در زباله، در حد بسیار مطلوبی است. لذا طرح ایجاد کارخانجات کمپوست، نسبت به سایر روش ها از ارزش و اهمیت اقتصادی، بهداشتی بالاتری برخوردار است]36.[
2-3- لجنهای فاضلاب شهری
منشأ و مقادیر
منابع اصلی تولید لجن در تصفیه خانه های فاضلاب حوضهای ته نشینی هستند اما واحدهای تغلیظ، تثبیت، آماده سازی و آبگیری لجن نیز در شمار منابع تولید لجن قرار می گیرند]5.[
خصوصیات و ویژگیها
لجنهای تولیدی در تصفیه خانه های فاضلاب شهری در حالتهای مایع و یا نیمه جامد بوده، درصد جامدات موجود در آنها از 25/0 تا 12 درصد بسته به فرآیندهای تصفیه و عملکرد آنها متغیر می باشد.]5[
از میان اجزا جدا شده از فاضلاب در یک تصفیه خانه، لجن بیشترین حجم را به خود اختصاص می دهد که با توجه به تغلیظ آلاینده ها، پاتوژنها و مواد آلی قابل تعفن در آن، فرآیندهای تصفیه پیچیده ای را طلب می نماید.
کمیت لجن تولیدی در یک تصفیه خانه فاضلاب شهری رابطه ای مستقیم با درصد تصفیه مورد نیاز دارد. هرچه تصفیه فاضلاب از مرحله اولیه به سمت مراحل ثانویه و پیشرفته، تکامل پیدا می کند میزان لجن تولیدی نیز رو به تزاید می گذارد.
طی دهه های اخیر کیفیت لجن های تولیدی در تصفیه خانه فاضلاب شهری به دلیل تولید و مصرف حدود 10000 نوع ترکیب شیمیایی آلی جدید در سال، دچار دگرگونیهای فراوانی گردیده است]6 و7[.
لجنهای فاضلاب شهری با توجه به نوع فرآیند جداسازی آنها به سه دسته لجنهای اولیه (لجنهای نوع اول)، لجنهای بیولوژیکی (لجنهای نوع دوم) و لجنهای شیمیایی (لجنهای نوع سوم) تقسیم می گردند که خصوصیات و ویژگیهای متفاوتی از هم دارند]5.[
2-3-1- لجن اولیه
به موادی که در حوض ته نشینی اولیه رسوب می کنند، لجن اولیه اطلاق می گردد. لجن اولیه خاکستری رنگ و نسبتاً بدبو می باشد. حوض ته نشینی اولیه قادر است به سادگی حدود 50 درصد وزنی مواد جامد قابل ته نشینی را از فاضلاب جدا نماید، به همین دلیل در اکثر تصفیه خانه های فاضلاب از آن استفاده می گردد.
از ویژگیهای برتر لجن اولیه نسبت به لجنهای بیولوژیکی و شیمیایی می توان، تغلیظ ثقلی آسان و نیاز به آماده سازی جزیی جهت آبگیری مکانیکی را مورد اشاره قرار داد.
کمیت و کیفیت لجن اولیه به ماهیت واحدهای مقدماتی، خصوصیات شبکه جمع آوری و ورود فاضلابهای صنعتی به شبکه فاضلاب بستگی دارد]5[.
2-3-2- لجنهای بیولوژیکی
لجنهای بیولوژیکی در طی فرآیندهای تصفیه فاضلاب نظیر لجن فعّال، صافی چکنده و دیسکهای بیولوژیکی چرخان تولید می شوند. کمیت و کیفیت لجن بیولوژیکی تولیدی بسته به سرعت متابولیسم و رشد، نوع میکروارگانیسم های موجود در سیستم، وجود تأسیسات پیشین نظیر حوض ته نشینی اولیه و نیز شیوه راهبردی واحدهای زلال ساز بسیار متفاوت می باشد.
لجنهای بیولوژیکی بسیار مشکلتر از لجنهای اولیه و برخی از لجنهای شیمیایی تغلیظ و آبگیری می‌گردند]5[.
2-3-3- لجنهای شیمیایی
لجنهای شیمیایی، عموماً در جریان استفاده از مواد شیمیایی برای حذف فسفر و یا افزایش درصد حذف جامدات معلّق از پساب خروجی، در تصفیه خانه های فاضلاب تولید می گردند.
افزایش مواد شیمیایی به پساب خروجی از تصفیه ثانویه و عملیات رسوب گیری شیمیایی به صورت مجزا در حوض ته نشینی سوم، در شمار اندکی از تصفیه خانه ها انجام می گیرد. در عوض، افزایش مواد شیمیایی به فاضلاب خام و یا فاضلاب در مرحله تصفیه بیولوژیکی و جداسازی لجنهای شیمیایی همراه با لجنهای اولیه و یا لجنهای بیولوژیکی در بسیاری از تصفیه خانه ها، متداول می باشد.
خصوصیات لجنهای شیمیایی عمدتاً به نوع رسوب دهنده های مورد استفاده و ترکیب جامدات موجود در فاضلاب بستگی دارد]5[.
2-4- ضرورت کنترل و تصفیه لجن فاضلاب شهری
فاضلاب های شهری پس از عبور از واحدهای عملیایی و فرآیندهای متعارف عمدتاً به دو بخش پساب و لجن تفکیک می گردند که هر یک برای راهیابی مجدد به طبیعت بایستی کیفیتی مطابق با استانداردهای زیست محیطی را دارا باشند.
برخلاف پساب های خروجی از تصفیه خانه ها که معمولاً کیفیتی مناسب و مطلوب جهت تخلیه به طبیعت دارند، لجنها که حاصل تغلیظ آلاینده های موجود در فاضلاب هستند به هیچ وجه به صورت خام و تصفیه نشده مجوز ورود به محیط زیست را ندارند]36.[
متخصصین و مهندسین محیط زیست به منظور رهایی از مشکل لجن تولید شده در تصفیه خانه های فاضلاب دو ایده کلی استفاده مجدد و دفع نهایی را پیش رو دارند. دو روش استفاده مجدّد از حجم آب زیاد و خصوصیات کودی لجن پس از تصفیه و بی خطر سازی برای آبیاری، کوددهی و اصلاح بافت خاک استفاده می گردد. در روش دفع نهایی با انجام پیش تصفیه های لازم لجن به عنوان یک ماده دور ریز تلقی گردیده که جهت دفع بایستی کیفیتی مطابق با استانداردهای قابل قبول را داشته باشد.
بر این اساس در صورتی که هر یک از مقاصد استفاده مجدد و یا دفع نهایی لجن مورد توجه قرار گیرد عملیات کنترل و تصفیه لجن همواره بایستی به عنوان یکی از ارکان اساسی تصفیه خانه در نظر گرفته شود]36 [.
2-5- اهداف و مقررات مربوط به استفاده مجدد و دفع لجن
به طور کلی متخصصین محیط زیست امروزه تصفیه لجن را یکی از ارکان اصلی عملیات تصفیه فاضلاب ‌  می دانند. هدف از عملیات تصفیه لجن دستیابی به اهداف کلی تصفیه فاضلاب یعنی، زیباسازی محیط زیست، حذف مواد آلی قابل تجزیه بیولوژیکی و حذف ارگانیزمهای بیماری زا می باشد. براین اساس قوانین زیست محیطی حاکم بر تصفیه و دفع فاضلابها به طور اعم، تصفیه و دفع لجنها را نیز در بر خواهند گرفت.
در سال 1989 به دنبال تصویب قانون منع تخلیه هرگونه لجن فاضلاب به اقیانوسها، سازمان حفاظت محیط زیست آمریکا (EPA) استانداردهای جدیدی برای دفع لجن تصفیه خانه های فاضلاب پیشنهاد کرد]5.[
مقررات پیشنهادی حدود عددی آلاینده ها و روش های کنترل آنها را به منظورهای استفاده از لجن در زمینهای کشاورزی و غیر کشاورزی، توزیع و بازاریابی، دفع سطحی و سوزاندن تعیین نمود.
این استانداردها بیشتر محدودیتهایی را برای برخی از فلزات سنگین و ترکیبات آلی سمّی مورد تأکید قرار دارند.
مقررات و استانداردهای کنترل آلاینده های موجود در فاضلاب و لجن دائماً در معرض تکمیل و تصحیح هستند، از این رو مهندسین فاضلاب بایستی همواره در جریان آخرین استانداردها قرار داشته و آنها را در طراحی تصفیه خانه های جدید و یا بهینه سازی تصفیه خانه های قدیمی به کار بندند]5.[
جهت گیریهای آینده در مورد وضع قوانین کنترل و تصفیه لجن با موضوع کنترل آلاینده های خاص نظیر فلزات سنگین و ترکیبات آلی سمّی از قبیل پی سی بی ها و آفت کشها در مبدأ تأکید خواهد شد. این آلاینده ها تحت تأثیر فرآیندهای بیولوژیکی متداول تجزیه نمی گردند.
2-6- تعریف کمپوست
کمپوست از کلمه لاتین (composites) به معنای مخلوط و یا مرکب اقتباس شده است و به صورت عبارت زیر قابل تعریف می باشد:
- تجزیه مواد آلی نامتجانس که بوسیله میکروارگانیزم های مختلف در حضور رطوبت و گرما، در محیط هوازی صورت گیرد.
- یک فاز بیولوژیکی و تغییر فرم است که توسط میکروارگانیزم های هوازی در داخل توده انجام گرفته و حرارتی حدود 75- 65 درجه سانتیگراد تولید می نماید.
- تجزیه مواد آلی توسط دسته ای از میکروارگانیزم ها در محیط گرم، مرطوب و هوازی است.
- سیستم مهندسی تصفیه ضایعات جامد به روش تجزیه بیولوژیک در شرایط کنترل شده است.
- یک تجزیه بیولوژیکی و پایداری مواد آلی تحت شرایطی که بر اثر افزایش دمای ترموفیلیک که آن نیز خود ناشی از تولید حرارت بیولوژیکی است، به وجود می آید. محصول نهایی به اندازه کافی پایدار بوده و بدون آنکه عوارض زیست محیطی در پی داشته باشد قابل انبار شدن و یا مصرف کردن می باشد]6و7و8.[
2-7- مباحث اساسی تهیه کمپوست
فرآیند تهیه کمپوست در واقع، تجزیه مواد آلی توسط دسته ای از میکروارگانیزم ها در محیط گرم مرطوب و هوازی است.
مقدار قابل توجهی از مواد آلی که روزانه در طبیعت تولید می شود، توسط عملیات میکروبیولوژیکی تجزیه می شود. این عملیات به آرامی بر روی سطح زمین و دمای طبیعی و مخصوصاً در شرایط هوازی امکان پذیر است. فرآیند طبیعی تجزیه مواد با جمع آوری مواد به شکل پُشته که مانع از هدر رفتن حرارت تخمیر می‌شود، انجام می گیرد. بالطبع افزایش دمای مواد باعث بالا رفتن سرعت واکنش می شود. این فرآیند تسریع شده همان فرآیند ساخت کمپوست است]6.[
موادی که جهت کمپوست جمع آوری می شوند، بسیار متنوع بوده و شامل مخلوطی از مواد معدنی و آلی موجود در زباله های شهری، کودهای هموژن گیاهی، باقیمانده محصولات کشاورزی و لجن فاضلاب است. در فرآیند تولید کمپوست، بیشترین مقدار اکسیژن مصرف شده، جهت تبدیل مواد آلی به محصولات پایدارتر مانند هیومیک اسید، دی اکسیدکربن و آب به مصرف می‌رسد. نکته قابل توجه در افزایش محصولات کشاورزی، بالا بردن مقدار مواد مغذی خاک است. یکی از روش های گسترش و بهبود ساختمان خاک و تهیه مواد غذایی استفاده از هوموس است که هوموس نیز محصول نهایی فرآیند ساخت کمپوست است. در کشورهای درحال توسعه، میزان سرعت اکسیداسیون هوموس خاک، بسیار بیشتر از سرعت تشکیل آن است]37 [.
کمپوست، محصول فرآیندی است که در آن واکنشهایی بین مواد آلی، میکروارگانیزم ها، رطوبت و اکسیژن در می گیرد. مواد آلی با انبوهی از میکروارگانیزم های موجود در خاک، آب و هوا مخلوط هستند. زمانی که مقدار رطوبت مواد به حد مطلوب برسد و همچنین مواد به میزان لازم هوادهی شوند، فرآیند میکروبیولوژیکی تسریع می شود. علاوه بر اکسیژن و رطوبت، میکروارگانیزم ها جهت رشد و تکثیر نیازمند منبع کربن (زباله های آلی)، مواد غذایی مانند نیتروژن، فسفر، پتاسیم و مقادیر ناچیزی از بعضی عناصر دیگر نیز هستند. در حمله میکروارگانیزم ها به مواد آلی، علاوه بر اینکه خود آنها تکثیر یافته و رشد می‌کنند، دی اکسید کربن، آب، بعضی از محصولات آلی و انرژی نیز آزاد می شود. مقداری از این انرژی در فرآیند متابولیسم مصرف شده و باقیمانده آن به صورت گرما، آزاد می شود. محصول نهایی یا همان کمپوست از مواد آلی باقیمانده مقاوم، محصولات شکسته شده و میکروارگانیزم های زنده و مرده تشکیل شده است]6و7و38و8.[
2-8- روشهای تئوریک تولید کمپوست
بطور کلی در تهیه کمپوست از زباله و لجن، می توان از دو روش علمی و اصلی زیر بهره جست:
تجزیه هوازی
تجزیه غیر هوازی
در ذیل در حد اختصار اصول علمی روش های فوق آورده می شود.
2-8-1- تجزیه هوازی
فرآیندی که در آن یک ماده آلی در حضور اکسیژن تجزیه شود، فرآیند هوازی نامیده می شود. در تجزیه هوازی، ارگانیسم های زنده ای که اکسیژن را مصرف می کنند، جهت تغذیه خود از مواد آلی استفاده می‌نمایند. بدین ترتیب مقدار زیادی از کربن موجود، به عنوان منبع انرژی برای ارگانیسم ها بکار رفته و در اثر تنفس و سوخته شدن، به دی اکسیدکربن تبدیل می شود. از آنجائی که کربن هم به عنوان منبع انرژی و هم به عنوان یک عنصر در پروتوپلاسم سلول مصرف می شوند، لذا به مقدار خیلی بیشتر از نیتروژن مورد نیاز می باشد]12و6[.
بطور کلی تقریباً QUOTE 23 کربن در اثر تنفس به QUOTE CO2 تبدیل می شود و QUOTE 13 باقیمانده در سلولهای زنده با نیتروژن ترکیب می گردد[12]. اگر مقدار اضافی کربن نسبت به نیتروژن در مواد آلی تجزیه شده از حد مشخصی بیشتر باشد، فعالیت بیولوژیکی کم شده و ممکن است چند سیکل از ارگانیزم ها جهت سوزاندن مقدار بیشتری از کربن لازم باشد. هنگامی که تعدادی از ارگانیزم ها کُشته می شوند، نیتروژن و کربن ذخیره شده در آنها برای سایر ارگانیزم ها قابل دسترس و استفاده خواهد بود. استفاده از نیتروژن موجود در سلولهای مرده توسط ارگانیزم ها، برای تشکیل سلول جدید نیاز به اکسید کردن کربن اضافی به شکل QUOTE CO2 خواهد داشت. به این ترتیب مقدار کربن کاهش یافته و مقدار محدودی از نیتروژن نیز برگشت داده می شود. نهایتاً هنگامی که نسبت کربن به نیتروژن موجود بیش از اندازه پایین باشد، نیتروژن اضافی باعث تولید آمونیاک خواهد شد. تحت شرایط مناسب، ممکن است مقداری از آمونیاک به نیترات اکسیده شود]12.[
فسفر، پتاسیم و انواع مختلف مواد میکرونی خنثی نیز جهت رُشد بیولوژیکی اساسی هستند. این مواد در حالت عادی، بیشتر از مقدار مورد نیاز در موارد قابل کمپوست وجود دارند و از این نظر مشکلی ایجاد نمی‌شود]13[.
شکل (2-12) سیکل کربن و نیتروژن را در فرایند های هوازی مشخص می کند. این فرآیند که در طبیعت بسیار رایج می باشد بیشتر در سطح زمین مثل کف جنگلها اتفاق می افتد. برگ درختان و فضولات حیوانات بر روی کف جنگلها ریخته شده و به تدریج به خاک برگ و کود خاکی نسبتاً پایداری تبدیل می شود]12[.

شکل (2-1)- سیکل کربن و نیتروژن در فرایندهای هوازی]12[.
مقدار زیادی انرژی در اثر تبدیل C به QUOTE CO2 به صورت گرما آزاد خواهد شد. مثلاً اگر یک مولکول گرم از گلوکز تحت شرایط هوازی تبدیل شود، حدود 674-484 کیلوکالری حرارت تولید خواهد شد. اگر ماده آلی مورد تحول به صورت یک توده یا به صورتی باشد که بتوان آنرا عایق بندی کرد، درجه حرارت آن از تجاوز خواهد کرد. با وجود این اگر درجه حرارت از تجاوز کند، فعالیت باکتریها کاهش خواهد یافت و عمل تجزیه آهسته خواهد شد]14و12.[
به علت اینکه، در اثر درجه حرارت بالا، در حین فرآیند تخمیر باکتریهای فتوژن (فعال در برابر نور)، فتوزوا، تخم کرمها و میکروبهای علفهای هرزه که برای کشاورزی و سلامتی انسان مُضر هستند نابود شده اند، لذا استفاده از کود حاصله در مزارع کاملاً بی خطر است]14و12[.
اکسیداسیون هوازی مواد آلی بوی قابل ملاحظه ای ایجاد نمی کند. اگر در محل، بو ایجاد شود نتیجه گرفته می شود که یا فرآیند هوازی نیست و یا موادی در محیط وجود دارند که اکسیداسیون آنها تولید بو می کند. عمل تجزیه شدن یا کمپوست شدن هوازی، اگر اکسیژن به مقدار کافی وجود داشته باشد، می تواند در سیلوهای هاضم، گودالها، و سطح زمین به صورت پشته ای و یا کومه ای صورت گیرد]37 [.
2-8-2- تجزیه غیر هوازی
فاسد شدن مواد آلی، نتیجه تجزیه آنها در شرایط غیر هوازی است. ارگانیسم های زنده غیر هوازی در سوخت و ساز مواد مغذی، ترکیبات آلی را بوسیله یک فرایند احیاء تجزیه می کنند]37 [.
همانند فرآیند هوازی، ارگانیسم ها از نیتروژن ، فسفر و سایر مواد مغذی در رشد و تولید پروتوپلاسم سلول، استفاده و مواد آلی حاوی نیتروژن را به اسیدهای آلی و آمونیاک تبدیل می کنند. اتمهای کربن موجود در ترکیبات آلی که در پروتئین سلولی مورد استفاده قرار نمی گیرند، به صورت متان آزاد شده و بخش کوچکی از کربن ممکن است در اثر تنفس به QUOTE CO2 تبدیل شود]37و12.[
این فرآیند در طبیعت به صورت تجزیه لجن مواد آلی در ته مرداب ها و مواد آلی مدفون شده که به اکسیژن دسترسی ندارند، اتفاق می افتد. گازی که در مرداب ها متصاعد می شود عمدتاً QUOTE CH4 می‌باشد]37و26[.
احیاء شدید (فاسد شدن) مواد آلی معمولاً توأم با ایجاد بوهای نامطبوعی از سولفید هیدروژن و ترکیبات آلی احیاء شده گوگرددار (از قبیل مرکاپتانها) می باشد.
از آنجائی که تجزیه غیر هوازی مواد آلی فرایند احیاء می باشد، بخشی از محصول نهایی (کود کمپوست) هنگامی که در مزارع مورد استفاده قرار می گیرد، در معرض اکسیداسیون هوازی قرار خواهد گرفت. این اکسیداسیون جزئی است و به سرعت صورت می گیرد و در کاربرد مواد مشکل ساز نمی باشد]37 [.
این انهدام، به صورت آهسته انجام می شود و در دوره های 6 ماهه تا یکساله، کاملاً از بین می روند. هنگامی که مواد بطور غیر هوازی به صورت توده های سطحی یا در واحدهای حوضچه ای کمپوست شوند، تصاعد بوها کاملاً شدید می باشد. در شکل فوق سیکل نیتروژن و کربن در عمل تجزیه غیر هوازی نشان داده شده است]37 [.
با توجه به خصوصیات روش های مذکور، طرق صنعتی تهیه کمپوست بر اصل تجزیه هوازی استوار می‌باشند و به این جهت این روش بیشتر از روش تجزیه غیر هوازی بکار گرفته می شود.
2-9- کمپوست ترکیبی
کمپوست در زمانی رخ می دهد که آب ، اکسیژن ، کربن آلی به اندازه کافی برای تحریک رشد میکروبی وجود دارد. هوادهی مناسب ، آبیاری ، قند کافی و سایر اشکال کربن ساده آلی برای تحریک این فرایند مورد نیاز است. بنابراین، در عمل همه مواد بلافاصله مناسب نیستند و باید سایر مواد به این فرایند اضافه شوند که با نام کمپوست ترکیبی نامیده می شوند.
2-10- انواع کمپوست ترکیبی
کمپوست ترکیبی حاصل از فرآیند تخمیر را با توجه به مدت، شرایط آب و هوائی، پیشرفت تجزیه و... می‌توان به شرح ذیل تقسیم بندی نمود:
- کمپوست ترکیبی خام:
منظور زباله های خُردشده و لجنی است که هیچگونه عملیات تخمیر و پاستوریزاسیون بر روی آن صورت نگرفته باشد.
- کمپوست ترکیبی تازه:
منظور کمپوست ترکیبی است که عمل تخمیر در آن شروع شده ولی تجزیه و واکنش های مربوطه کامل نگردیده است.
- کمپوست ترکیبی کامل:
منظور کمپوست ترکیبی است که شرایط مناسب عمل تخمیر در آن ادامه یافته و در نتیجه مقدار بیشتری از مواد آلی تجزیه و نسبت به کمتر از 25 درصد و میزان مواد آلی به حدود 20 درصد و مقدار ناخالصیها به کمتر از 10 الی 15 درصد تقلیل یافته است]14.[
- کمپوست ترکیبی ویژه:
منظور کمپوست ترکیبی است که جهت جبران کمبود تعدادی از عناصر مغذی و مورد نیاز گیاهان، با توجه به استاندارد تعیین شده، با همان عناصر تکمیل گردیده است]5و3و7.[
2-11- خصوصیات کمپوست
اکثر تولید کنندگان، یک کمپوست مرغوب را از روی ظاهر مواد تجزیه شده می شناسند و بطور کلی می توان زمان عمل آمدن (رسیدن) کمپوست را از نظر کمیت و کیفیت توسط یک کنترل کننده تجربی به خوبی تخمین زد.
در تعیین خصوصیات فیزیکی کمپوست باید اندازه ذرات، پیشرفت عمل تخمیر، مقدار درصد مواد غیر مفید از قبیل پلاستیک، شیشه، کاغذ و... متناسب با نوع مصرف بررسی شوند.
کمپوست را بر حسب اندازه ذرات و با توجه به کاربرد مربوطه به صورت ذیل تقسیم بندی می کنند :
کمپوست نرم با قطر ذرات کمتر از 8 میلیمتر
کمپوست متوسط با قطر ذرات بین 20-8 میلیمتر
کمپوست درشت با قطر ذرات بین 45-20 میلیمتر]11[
تأثیر کلی کمپوست، بیشتر مربوط به تغییر فرم آن در خاک است. این تأثیر هنگامی می تواند به حداکثر مقدار خود برسد که میزان مواد آلی موجود در کمپوست حداقل بالغ بر 15 الی 20 درصد از کل مواد باشد. به این ترتیب تجزیه مواد نه فقط بایستی در زمان تهیه کمپوست انجام گیرد، بلکه بیشتر باید در محل مصرف یعنی خاک انجام پذیرد]7 .[
مطالعات محققین نشان داده است که مصرف کمپوست نسبتاً درشت در باغات میوه و تاکستان ها مناسب تر است، ولی در سبزیکاری و صیفی کاری باید کمپوست در زمان تهیه، حداکثر میزان تخمیر و تغییر فرم را یافته باشد، زیرا در غیر اینصورت فعالیت میکروارگانیزم ها موجب افزایش QUOTE Co2 و کمبود اکسیژن خاک گشته، در نتیجه فعالیت ریشه ها محدود می گردد]8[.
وجود موادی از قبیل شیشه، پلاستیک و ... که وجود هر کدام از آنها در کود کمپوست مضراتی به همراه دارد ( خصوصاً پلاستیک که پس از مدتی موجب نفوذ پذیری خاک و تبدیل آن به باتلاق می شود) باید به حداقل ممکن رسانیده شود. در کمپوست نرم این مواد نباید بیش از 6 درصد و در کمپوست متوسط بیش از 12 درصد باشد.]8[
2-12- ویژگیها و موارد مصرف کمپوست
احداث کارخانجات کمپوست و استفاده از محصول آن می تواند تبعات مفیدی را در پی داشته باشد که به عنوان نمونه به موارد ذیل اشاره می شود:
2-12-1- کاهش آلودگی محیط زیست ( آب و هوا )
قبل از این، به این مطلب اشاره شد که در اکثر قریب به اتفاق شهرهای ایران، عملیات دفن زباله و لجن به صورت غیر بهداشتی و با در نظر گرفتن اصول حفاظتی اولیه صورت می گیرد، که اثرات نامطلوب دراز مدت و کوتاه مدتی در پی دارند. حادثه نشت شیرابه های زباله دفن شده در منطقه دفن آبعلی، علاوه بر مرگ و میر تعداد بسیار زیادی از آبزیان رودخانه، منجر به آلوده شدن آبهای زیر زمین منطقه که مصارف آشامیدنی نیز دارند، گردید.
در مورد سایر شهرهای کشور، خصوصاً شهرهای ساحلی، به علت بالا بودن سطح آبهای زیر زمینی، این مشکلات چند برابر می گردد که باید با دید عمیق تری به موضوع نگریسته شود.
مشکل دیگر دفن های غیر بهداشتی و غیر اصولی، از حیث انتفاع خارج کردن زمین به مدت زمان طولانی است. زیرا بسیاری از مواد دفن شده، فسادپذیر نبوده و به همان صورت اولیه خود در زمین باقی می مانند (از جمله مواد پلیمری و...)، از این رو در مناطقی که زمین از ارزش اقتصادی بالائی برخوردار است و یا کمبود زمین وجود دارد، کمپوست می تواند به عنوان یک راه حل مناسب مورد توجه قرار گیرد.
مسئله تغذیه دامها و طیور از زباله های تخلیه شده در محل دفن نیز، یکی دیگر از مشکلات اساسی است که موجب بروز و شیوع بیماریهای عفونی می گردد و سالانه مقادیر زیادی ارز جهت تهیه داروهای مربوطه از کشور خارج می شود]37.[
از جمله مزایای کود کمپوست می توان به موارد زیر اشاره کرد :
2-12-2- جلوگیری از فرسایش خاک
یکی از مشخصات خاک در اکثر نقاط کشور ایران (خصوصاً مناطق مرکزی) عدم پایداری آن است، در این نوع زمینها، قشر رویی خاک، یعنی قشر غنی از مواد آلی، براثر اکسیداسیون تجزیه شده و از بین می رود.
خاک با از دست دادن مواد آلی خود (هوموس)، خاصیت چسبندگی اش را از دست داده و تحت اثر وزش باد، شروع به فرسایش می کند. ذرات ریز خاک توسط باد پراکنده شده و پس از بارندگی به حرکت در می‌آیند و به این ترتیب تمام مواد مغذی محلول در آب شسته شده، از بین می رود. به این پدیده فرسایش گفته می شود]37.[
برای مثال در آفریقا سالانه در هر هکتار، تحت پدیده فرسایش 250 تن مواد از بین می رود. یعنی تا حدود mm15 از لایه رویی خود را از دست می دهند]37.[ یعنی لایه ای که از لحاظ کشاورزی بسیار ارزشمند است. کمپوست ترکیبی است که هوموس خاک را احیاء نموده و از فرسایش بی رویه خاک جلوگیری می‌کند.
2-12-3- قابلیت نگاهداری آب در زمین
یکی دیگر از مشخصه های زمین مزروعی قدرت نگاهداری آب مورد نیاز گیاه در خاک می باشد، خصوصاً خاک های رُسی که در معرض شرایط جوی فصول خشک قرار گیرند. امروزه از ترکیبات مختلفی جهت بهبود این مشخصه استفاده می شود، مثلاً ورمیکولیت، پرلیت و... .
اما از لحاظ اقتصادی مناسب ترین و بهترین ماده در این مورد، کود کمپوست است که علاوه بر توانائی مذکور، ارزش غذائی مناسبی نیز برای خاک دارد.
2-12-4- متخلخل نمودن خاک
کمپوست حجم خلل و فرج خاک ها را افزایش داده و ساختمان آنها را اصلاح می کند. از عوارض ناخواسته کاربرد انواع کودهای شیمیایی، سخت و محکم شدن خاک های کشاورزی است. با کاربرد کود کمپوست این مشکل نیز برطرف می شود. زیرا قسمتی از فعل و انفعالات تخمیر کمپوست در خاک انجام گرفته و با این عمل گاز QUOTE Co2 تولیدی موجب متخلخل شدن خاک می گردد]37.[
2-12-5- سایر موارد کاربرد کمپوست
کمپوست موارد مصرف متنوع و گسترده ای دارد از قبیل :
به عنوان سوبسترا در کشت قارچ
به عنوان عایق اکوستیک
به عنوان ماده بوگیر (بیوفیلتر)
به عنوان بستر حیوانات در دامداریها
به عنوان یکی از مواد اولیه تهیه آجرهای متخلخل و ...]37 [.
2-13- پژوهش های انجام شده
- استلمچوسکی در سال 2003 روی کوکمپوست تحقیقاتی انجام داد که هدف اصلی او نسبت تهیه لجن به زباله بود. البته ایشان از زباله سبز به عنوان زباله استفاده کرده بود]9.[
- زورپس در سال 2000 از مخلوط زباله خانگی و لجن و همچنین زئولیت طبیعی استفاده کرد. آقای زورپس به این نتیجه رسید که اضافه کردن زئولیت ها می تواند مقدار فلزات سنگین را تا حدود زیاد کاهش دهد]6.[
- گیند در هند در سال 2003 مطالعه ای روی کمپوست خاکستر با کاه گندم انجام داد . آقای گیند دریافت که اضافه کردن خاکستر می تواند تا 20% مقدار را کاهش دهد و همچنین فسفر را در حد بالایی نگه می دارد]1[.
- در چین تولید کوکمپوست با پیشرفت اقتصادی همراه بود. یکی از اهداف اصلی دولت چین در حذف زباله استفاده از کوکمپوست بود که حدود 20 % از زباله چین بدین روش تثبیت می شود که البته در این راه از لجن تصفیه خانه هم استفاده می شود که این تحقیق توسط آقای وی در سال 2000 انجام شد]8[.
2-13- روشهای تولید کمپوست
روشهای تولید کمپوست را می توان بر اساس به کارگیری راکتور، مکانیسم جریان، حرکت جامدات، شرایط بستر و روش هوادهی طبقه بندی نمود. یکی از متداولترین شیوه های طبقه بندی فرآیند کمپوست به قرار ذیل است:
1- سیستمهای غیر راکتوری (باز)
بستر جامد همزده شده (ویندرو)
- تهویه طبیعی


- هوادهی تحت فشار
بستر جامدات ثابت
- هوادهی تحت فشار (توده ثابت هوادهی شده)
- تهویه طبیعی (توده بدون هوادهی)
2- سیستمهای راکتوری (بسته)
الف – جریان عمودی جامدات
بستر جامدات همزده شده
- کوره های متعدد یا چند کوره ای
- کوره های چند طبقه
بسترهای پرشده (سیلوراکتورها)
- با جریانهای متقابل هوا و جامدات
- با جریانهای متقاطع هوا و جامدات
ب – جریان افقی و شیب دار جامدات
بستر لغزان جامدات (استوانه های چرخان)
- جریان پراکنده
- سلولهای سری
- اختلاط کامل
بستر جامدات همزده شده ( محفظه های همزده شده یا کانالهای باز )
- دایره ای شکل
- مستطیلی شکل
بستر جامدات ثابت ( تونلی شکل )
- نوع فشاری
- نوع نقاله ای
ج – بدون جریان ( جعبه های کمپوست )]2[.

شکل ( 2-2)-شمایی از فرایند ویندرو]15و38و9[.
2-15- فرآیند ویندرو
فرآیند ویندرو یا فرآیند توده های طویل سطحی در واقع شیوه ای است که در آن مخلوط آماده شده جهت ورود به سیستم در ردیفهای موازی که از قبل برای آنها تهیه شده است قرار گرفته و هرچند وقت یکبار با وسایل مکانیکی مخصوص زیر و رو می گردد. شکل توده کمپوست، ارتفاع و عرض آن کاملاً بستگی به نوع مواد ورودی و نوع دستگاه های مخلوط کننده دارد.
عملیات اکسیژن رسانی به مخلوط عمدتاً از طریق تهویه طبیعی در اثر نیروی شناوری گازهای گرم خروجی از توده صورت می گیرد، در شرایطی که این میزان کم باشد می توان با زیر ورو کردن توده کمپوست نیز آنرا هوادهی نمود. همچنین در برخی موارد برای عملیات اکسیژن رسانی به توده های کمپوست از هواده های تحت فشار مثبت " دمنده " و یا تحت فشار منفی " مکنده " استفاده می گردد. در هوادهی تحت فشار مثبت، دمنده، هوای محیط را با فشار به داخل توده می راند و در هوادهی تحت فشار منفی، مکنده، گازهای موجود در توده کمپوست را با نیروی مکش از توده خارج می نماید.
درصورتی که مواد خام ورودی به سیستم از ویژگیهایی از قبیل درصد جامدات، میزان رطوبت و نسبت مناسبی برخوردار باشد غالباً این فرآیند بیولوژیکی به صورت خودکار عمل می کند. با این وجود به منظور آگاهی از زمان و تعداد مراحل زیر و رو کردن توده ها بایستی پارامترهای درجه حرارت و درصد رطوبت به طور مستمر مورد پایش قرار گیرند.
مراحل زیر و رو کردن، در فرآیند ویندرو از اهمیت خاصی برخوردار است زیرا موجب تنظیم، درجه حرارت، رطوبت، تخلخل، هوادهی و کنترل بو و مگس در توده های کمپوست می گردد.
فرآیند ویندرو به طور موفقیت آمیزی در تولید کمپوست از مواد آلی نظیر فضولات باغی، زباله و لجن فاضلاب به کارگرفته شده و یک فرآیند متداول در امر کمپوست سازی از فضولات باغی و گیاهی به شمار می آید.
تجربه کاربرد فرآیند ویندرو در کمپوست لجنهای هضم شده نشان می دهد که در اغلب موارد ترکیب این لجنها با کمپوست برگشتی شرایط مطلوبی را به دنبال داشته است اما در صورت نیاز می توان از مواد حجیم کننده و اصلاح کننده نیز جهت متناسب سازی بیشتر مخلوط بهره گرفت]15و2.[
2-15-1- تاریخچه کاربرد فرآیند ویندرو
قدیمی ترین فرآیند تولید کمپوست از لجن فاضلاب فرآیند ویندرو می باشد که قدمت بهره گیری آن به سال 1930 در آلمان بر می گردد. در آن زمان لجن آبگیری شده بدون اضافه نمودن عوامل حجیم کننده برای تولید کمپوست به روش ویندرو مورد استفاده قرار گرفت، که با توجه به تخلخل کم لجن و عدم امکان هوادهی مناسب، بوی نامطبوع زیادی در تأسیسات پخش شد و کاربرد فرآیند متوقف گردید]16[.
در سال 1950 آلریچ و اسمیت نتایج تجارب خود را از کمپوست مخلوط لجن فاضلاب هضم شده با ذرات چوب در آستینِ تگزاس با زمان بندی حدود 11 هفته گزارش نمودند، اما اولین کاربرد روش ویندرو به منظور کمپوست لجن هضم شده در مقیاس اجرایی در شهر آستین بسیار دیرتر یعنی درسال 1987 انجام پذیرفت]15و38.[
تجربه بعدی از کمپوست لجن به فردی به نام ریوز در سال 1959 برمی گردد. او از لجن هضم شده شهر الپاسوِ تگزاس که به مدت 4 تا 6 ماه در معرض هوا قرار گرفته و خشک شده بود مخلوطی با خُرده چوب درست کرد و 2 تا 3 ماده آنرا تحت فرآیند ویندرو قرار داد و سپس محصول را 2 تا 3 ماده جهت عمل آوری در توده های ثابت نگهداری نمود.
اولین واحد بزرگ تولید کمپوست لجن، در سال 1972 در لس آنجلس تأسیس شد و کارخود را با روزانه 100 تن کیک لجن هضم و آبگیری شده شروع کرد. در این واحد از کمپوست برگشتی جهت تنظیم رطوبت (تا حد 60 درصد) و پایداری ساختمانی توده ها استفاده گردید. جهت ایجاد تخلخل مناسب در این سیستم از عملیات زیر و رو کردن و اضافه کردن مواد حجیم کننده نظیر خُرده چوب و پوشال برنج بهره گرفته شد و برای بهبود انرژی تولیدی در فرآیند مواد اصلاحی با درصد مواد آلی بیشتر مورد استفاده قرار گرفت. این واحد کار خود را با کیفیت مطلوبی تا سال 1991 ادامه داد و در این سال به دلیل ملاحظات محلی و تولید بو، نقل مکان کرد]15و38.[
درسال 1980 یک واحد کمپوست لجن به روش ویندرو در واحد احیاء فاضلاب متروپلیتن دنور تأسیس گردید. این واحد برای 100 تن مواد ورودی روزانه در 16 ایکر فضای مُسقف با امکانات هوادهی به ظرفیت 165000 فوت مکعب استاندارد در دقیقه، به کار گرفته شد، اما پس از مدت کوتاهی از آغاز بهره برداری با مشکل تولید بو مواجه گردید]38.[
در سال 1991، شرکت کمپوست سازی سن جوکین در لس آنجلس بهره برداری از تأسیسات کمپوست به روش ویندرو را در منطقه ای دور دست در دره سن جوکین شروع کرد. این واحد با ورودی روزانه معادل 100 تن لجن هضم و آبگیری شده (با 20 درصد مواد جامد) و مواد اصلاح کننده ای نظیر کمپوست برگشتی و یا مواد زائد کشاورزی نظیر پوشال برنج به طور موفقیت آمیز بدون ایجاد بوهای مزاحم به کار گرفته شد]38 [.
بررسیها نشان می دهد که در حال حاضر تعداد زیادی از واحدهای تولید کمپوست به روش ویندرو در کشورهای اروپایی و آمریکایی به طور مطلوبی در حال فعالیت می باشند.
2-15-2- راهبری سیستم
شکل توده ویندرو تا حد زیادی به مشخصات مواد ورودی و نوع ماشین آلات مخلوط کُن بستگی دارد اما سطح مقطع ذوزنقه ای متداولترین شکل توده های ویندرو می باشد. شکل(2-2) نمونه هایی از این توده ها را با ابعاد و اندازه های معمول نمایش می دهد. طول توده های ویندرو در تأسیسات دنور 100 متر و در تأسیسات لس آنجلس به حدود 140 متر می رسید. هنگامی که از موادی با تخلخل زیاد استفاده می گردد می توان ارتفاع توده را بیشتر و سطح مقطع آنرا مستطیلی شکل در نظر گرفت]38.[

شکل (2-3)- ابعاد و اندازه های متداول توده های کمپوست ویندرو]38 [.
طبق اظهارات "های" به کارگیری مخلوط کنهای بزرگتر امکان ساخت توده های بزرگتر را فراهم خواهد آورد. افزایش سرعت استوانه های چرخان و کاربرد خُردکن ها در مجموعه، شرایط تولید کمپوستی یکنواخت با ذرات ریز و مناسب را ایجاد می نماید. همچنین کاربرد مواد اصلاح کننده نظیر خُرده چوب و پوشال برنج در توده های بزرگ کمپوست، موجب افزایش درجه حرارت و کاهش تولید بوهای متعفن در سیستم می‌گردد.
در واحد لس آنجلس به منظور تأمین شرایط بهینه درجه حرارت در طی فرآیند تولید کمپوست، با توجه به ماه های گرم و سرد سال از دو ترکیب متفاوت مواد خام ورودی به سیستم استفاده شده است. در این سیستم در طی ماه های گرم سال از مخلوط کیک لجن، کمپوست برگشتی و خرده چوب با نسبتهای حجمی 1 به 8/0 به 4/0 استفاده شده و برای ماه های سرد سال از مخلوط کیک لجن با خرده چوب با نسبتهای حجمی 1 به 2/1 استفاده می گردد]38.[
فرآیند ویندرو با کمپوست برگشتی نمی تواند در مواقع سرد و بارانی درجه حرارت را به مدت 15 روز در حد 55 درجه سانتی گراد نگهداری نماید. بر این اساس "های" طی آخرین تحولاتی که در واحد لس آنجلس به وجود آورد این فرآیند را به دو مرحله توسعه داد. در مرحله اول با ایجاد ویندروهای کوچک به مدت 2 تا 3 هفته شرایط خشک سازی، هوادهی و پاستوریزاسیون اولیه فراهم می شود. در این مرحله، ویندروها 3 تا 4 مرتبه در هفته زیر و رو شده که بدین ترتیب درجه حرارت طی ماه های گرم به 55 درجه سانتی گراد افزایش یافته ولی طی ماه های سرد این افزایش ایجاد نمی گردد]38.[
پس از تکمیل مرحله اول هر دو یا سه ویندرو مجاور هم توسط یک لودر مجتمع شده و یک ویندرو بزرگ را تشکیل می دهند. بسته به درجه حرارت موجود در مرحله اول ممکن است در این مرحله از مواد اصلاحی اضافی نیز استفاده گردد.
در مرحله دوم درجه حرارت توده اغلب تا 65 درجه سانتیگراد افزایش می یابد که این امر موجب نابودی پاتوژنها و کاهش بیشتر رطوبت در توده می شود.
ویندروهای بزرگ در مرحله دوم تولید کمپوست به مدت 3 هفته یا بیشتر نگهداری شده و سه بار در هفته زیر و رو می گردند تا بدین ترتیب شرایط مناسبی از زمان ماند، درجه حرارت و اختلاط به وجود آید]38.[
جهت صرفه جویی در خرید مواد حجیم کننده مورد نیاز نظیر خرده چوب می توان بخشی از آن را به وسیله سَرند کردن کمپوست نهایی جداسازی نمود، اما بهرحال حدود 25 تا 30 درصد از این مواد طی مراحل تولید کمپوست مورد اکسیداسیون بیولوژیکی قرار گرفته و یا به علت عدم جداسازی از مدار خارج می‌گردند]38و15[.
از معایب عمده روش ویندرو در تولید کمپوست لجن فاضلاب شهری می توان زمین مورد نیاز زیاد و عدم امکان بکارگیری لجنهای خام در این فرآیند را برشمرد. طبق اظهار نظر "کولاسیکو" زمین مورد نیاز برای فرآیند ویندرو حداقل 25 درصد بیشتر از روش توده های هوادهی شده می باشد]38و15[.
2-15-3- اثرات زیست محیطی و بهداشتی
در مناطقی که بیماریهای آندمیک شیوع دارند در فاضلاب آن مناطق میکروارگانیزمهای خاص آن بیماریها به وفور یافت می شوند. پاتوژنهای حمل شده توسط فاضلاب در طی فرآیندهای معمول هضم لجن و روشهای خشک کردن غیر فعال نمی شوند و در محیط به مدت طولانی باقی می مانند. نمودار (2-1) رابطه انهدام پاتوژنها با زمان و درجه حرارت برای روش ویندرو را نشان می دهد. مطالعات جامع در مرکز بهسازی لس آنجلس نشان می دهد که کلیفرمهای کل و سالمونلا در 10 روز اول فرآیند کمپوست به روش ویندرو گرفته شده است، کمتر از یک عدد در هر گرم بوده است. اما در نمونه های قسمتهای خارجی توده تعداد آنها بیشتر بوده است. در اکثر نمونه های کمپوست نهایی مقادیر خیلی کمی از ویروسها، تخم پارازیتها و سالمونلاها جمع آوری شده است]21[.

شکل (2-4)- نمودار ارتباط کاهش پاتوژنها با زمان و درجه حرارت در روش ویندرو]37 [.
بازگشت کمپوست تکمیل شده به عنوان عامل حجیم کننده سبب کنترل مؤثر برای لجنهای هضم شده می‌گردد. توقف در زیر و رو کردن مواد می تواند سبب انتشار بوهای ناخوشایند گردد، زیرا توده ویندرو به سرعت تحت شرایط بی هوازی قرار می گیرد. همچنین در طی فواصل بارندگیهای شدید ممکن است مسایل ناشی از بو بروز نماید. در نواحی خشک با وزش باد شدید، می بایست توده ها را نمدار کرده تا از تولید گرد و غبار جلوگیری شود.
سیستم جمع آوری و زهکشی آب در محوطه لازم بوده چون سیلابها آلودگی شدید پیدا کرده و نیاز به تصفیه دارند. کارگرانی که در این مکانها کار می کنند بایستی از مخاطرات ذرات و گرد و غبار حفاظت شوند. سیستم حفاظتی شامل استفاده از ماسکهای تنفسی و آب پاشی کردن توده ها در فواصل خشک و پرباد می‌باشد. مطالعات نشان می دهند که قارچ "آسپروژیلوس فومیگاتوس" به عنوان یک پاتوژن ثانویه در هوای نواحی کمپوست لجن فاضلاب به وفور وجود دارد. بر این اساس افرادی که سابقه ناراحتی ریوی دارند، نباید در مناطق کمپوست سازی به کار گرفته شوند]21[.
2-16- فرآیند توده های ثابت
توده های ثابت هوادهی شده یکی از متداولترین انواع سیستمهای بدون راکتور با توده های ثابت به شمار می آیند. این سیستم کاربرد گسترده ای در تولید کمپوست از لجن خام آبگیری شده در کشورهای اروپایی و آمریکا دارد.
فرآیند توده های ثابت هوادهی شده در واقع برای بر طرف کردن مشکلات فرآیند ویندرو یعنی به منظور کاهش زمین مورد استفاده و نیز قابلیت در کمپوست لجنهای خام، گسترش یافته است.
در این روش مواد خام با عوامل حجیم کننده نظیر قطعات چوب مخلوط شده و در قالب توده های بزرگ شکل گیری می گردند. عوامل حجیم کننده ضمن تأمین ساختاری پایدار برای توده ها، به هوادهی آنها بدون عملیات زیر و رو کردن نیز کمک می نمایند.
سیستم هوادهی در این فرآیند با نیروی دمنده یا مکنده انجام می پذیرد. توده ها به صورت ناپیوسته بارگذاری شده و در طی فرآیند کمپوست زیر و رو نمی شوند.
در برخی از طراحیهای جدید، به منظور جلوگیری از سخت و کُلوخه شدن مواد در توده ها تمهیدات خاصی اتخاذ گردیده است، این سیستم ها که اصطلاحاً سیستم های "نیمه بهم خورده" نام گرفته اند از عملیات بهم خوردگی بسیار خوبی نسبت به سیستم های ویندرو برخوردار می باشند]2.[
فرآیند توده های ثابت هوادهی شده در ایالت متحده آمریکا کاربرد گسترده ای برای کمپوست لجن های خام دارد. هم اکنون تعداد زیادی از این تأسیسات در بخشهایی نظیر "مونتگومری- مریلند، فیلادلفیا- پنسیلوانیا، اسکارتن- پنسیلوانیا، نشویل- تنسی، اوکلند- کالیفرنیا، کلمبوس-اوهایو" مشغول به کار می‌باشند]9.[
2-16-1- تاریخچه کاربرد توده های ثابت هوادهی شده
در سالهای 1972 تا 1973 مرکز تحقیقات کشاورزی دپارتمان کشاورزی بلتسویل واقع در مریلند آمریکا به طور موفقیت آمیزی کاربرد فرآیند ویندرو برای تولید کمپوست از مخلوط لجن هضم شده و خرده چوب را تجربه کرد]1[.
این روش در تولید کمپوست لجن خام از کارایی مطلوبی برخوردار نبوده و با مشکلاتی نظیر تولید بوهای متعفن مواجه گردید. به منظور حل این مسأله در سالهای 1975 تا 1976 مطالعاتی در این واحد انجام گرفت که منجر به ابداع روش جدیدی به نام روش توده ای ثابت هوادهی شده و یا روش "بلتسویل" گردید]1[.
در این تکنیک از مواد حجیم کننده برای ایجاد تخلخل مناسب و از هوادهی تحت فشار استفاده شده است از اینرو این سیستم قابلیت ویژه ای در کمپوست لجن خام دارد. در صورت بهره برداری مناسب، امکان تولید بو در این روش بسیار کم است و آماده سازی لجنهای خام با مواد شیمیایی نظیر آهک در مرحله آبگیری مشکل انتشار بو را به ‌حداقل ممکن می رساند]1.[
کاربرد این روش در تولید کمپوست از لجنهای خام و هضم شده مورد استقبال زیادی قرار گرفته به گونه‌ای که تنها تا سال 1990، درآمریکا 76 واحد از این تأسیسات مورد بهره برداری قرار گرفته است]9[.
2-16-2- تشریح فرآیند
از ویژگیهای فرآیند توده های ثابت می توان به عدم زیر و رو کردن توده‌ها، استفاده از سیستم هوادهی تحت فشار و کاربرد موادی نظیر خُرده چوب به عنوان عوامل حجیم کننده و تنظیم رطوبت اشاره کرد که این موارد در واقع وجوه افتراق اصلی با فرآیند ویندرو به شمار می آیند.
مطابق برآوردهای انجام شده نسبت حجمی مناسب خُرده چوب مورد نیاز به لجن در این فرآیند حدود 2 به 1 تا 3 به 1 به دست آمده است. استفاده از خرده چوب به عنوان حجیم کننده در بسیاری از واحدها رضایتبخش بوده با این وجود از موادی نظیر پوست درخت، پوست بادام زمینی و خرده های لاستیک نیز در صورت تخلخل کافی می توان بهره گیری نمود]9[.
شکل (2-4) مراحل اصلی فرآیند توده های ثابت هوادهی شده را نمایش می دهد. این مراحل را می‌توان به صورت زیر خلاصه نمود :
1- آماده سازی و اختلاط نسبت حجمی مناسب از لجن آبگیری شده با درصد جامدات 20 تا 25 درصد با عوامل حجیم کننده نظیر خرده چوب و رساندن درصد جامدات مخلوط به حدود 40 درصد.
2- استقرار یک لایه 30 سانتیمتری از عوامل حجیم کننده بر روی لوله های دائمی هوادهی و یا لوله های موقت سوراخ دار هوادهی به عنوان لایه زیرین توده کمپوست.
3- استقرار مخلوط لجن و خرده چوب با ارتفاع و شکل مناسب بر روی لایه زیرین یا لایه اساس.
4- پوشش دادن لایه بیرونی توده به وسیله کمپوست نهایی سَرند شده و یا سَرند نشده.
5- اتصال پمپ هوا به شبکه لوله های هوادهی.

شکل (2-5) -مراحل اصلی فرآیند کمپوست به توده های ثابت هوادهی شده]9[.
پس از انجام این عملیات مرحله تند یا پربار یا روشن کردن پمپ هوا شروع می شود. دستگاه پمپ هوا می‌تواند حالت دمنده داشته و هوا را تحت فشار وارد توده ها نماید و یا اینکه به صورت مکنده عمل کرده و گازهای موجود در توده ها را مکش کرده و سبب جایگزینی هوای تازه در داخل توده ها گردد. عملیات هوادهی در این سیستم در قالب سیکلهای هوادهی با خاموش و روشن کردن های متناوب پمپهای هوا انجام می گیرد. فاصله زمانی هر خاموش و روشن کردن پمپ با توجه به شرایط هوازی و درجه حرارت داخل توده تنظیم می گردد.
در سیستمهای مکشی، هوای خروجی از توده های کمپوست قبل از تخلیه به محیط بایستی از بوهای موجود پاکسازی گردد. روش های زیادی جهت حذف بوی هوای خروجی ابداع شده اما متداولترین آنها عبور هوای خروجی از توده های فیلتر می باشد. توده های فیلتر به طور متوسط حاوی 76/0 متر مکعب کمپوست نهایی الک شده به ازای هر 6/3 تن مخلوط لجن و خُرده چوب می باشند.
زمان ماند توده ها جهت تکمیل فرآیند کمپوست در مرحله تند در صورت تأمین شرایط مناسب حدود 21 روز پس از شکل گیری توده ها برآورد شده است.
پس از انجام این مرحله، توده های کمپوست مطابق شکل (2-4) تا تشکیل محصول نهایی یکی از مسیرهای زیر را طی می نمایند:
خشکسازی، غربالگری، عمل آوری، ذخیره سازی و فروش محصول نهایی.
عمل آوری، خشکسازی، غربالگری، ذخیره سازی و فروش محصول نهایی.
درصورتی که درصد جامدات موجود در مخلوط حداقل بین 50 تا 55 درصد باشد امکان بهره گیری مطلوب از سَرندهای ارتعاشی یا چرخشی جهت غربالگری فراهم می باشد. در غیر اینصورت بایستی خشکسازی بیشتر با هوادهی و یا نگهداری توده ها قبل از غربالگری انجام گیرد.
جداسازی و استفاده مجدد مواد حجیم کننده نظیر خُرده چوب به دلیل کاربرد زیاد آنها طی فرآیند کمپوست سازی، موجب کاهش قابل ملاحظه هزینه ها و بهبود خواص کمپوست تولیدی می گردد. در هر صورت همواره مقداری از مواد حجیم کننده در اثر تجزیه بیولوژیکی و یا عبور از سَرندها از دست رفته و بایستی جایگزین گردند.
درصورت استفاده از مکنده با مکش هوا، همواره مقداری شیرابه به لوله های هوادهی وارد شده که بایستی آنها را قبل از ورود به پمپ مکنده از طریق یک سیفون جمع آوری کرده و تصفیه نمود[38].
شکل (2-5) سطح مقطع یک نمونه توده ثابت هوادهی شده را نمایش می دهد[15].

شکل (2-6)- سطح مقطع یک نمونه ثابت هوادهی شده]15[
به منظور کاهش زمین مورد نیاز در فرآیند توده های هوادهی ثابت تغییراتی در روشهای اجرایی این فرآیند داده شده و اشکال جدیدتری از آن به کار گرفته شده است[38]. یکی از این اشکال جدید "توده های هوادهی گسترده" است که در آن توده ها چسبیده بهم ساخته می شوند به طوری که ساخت توده جدید بر قسمت انتهایی توده قبلی صورت می گیرد. یکی دیگر از روشهای جدید "توده های هوادهی مرتفع" نام دارد که در آن توده ها به وسیله جرثقیل تا ارتفاع حدود 6 متری ساخته می شوند. با کاربرد روش توده های گسترده و یا توده های مرتفع ضمن حفظ اساس فرآیند میزان زمین و مواد حجیم کننده مورد نیاز تا حدود 50% کاهش خواهد یافت]15و38 [. شکل (2-6) نماهایی از توده های منفرد و گسترده را نمایش می دهد.

شکل (2-7) -نماهایی از توده های ثابت هوادهی شده]15[.
روش توده های گسترده با اغلب تأسیسات موجود سازگاری دارد اما روش توده های مرتفع در بیشتر اوقات قابل استفاده نمی باشد.
درجه حرارتهایی که در طی فرآیند کمپوست لجن خام و خُرده چوب اندازه گیری شده در شکل (2-7) دیده می شود. مطابق این شکل درجه حرارت در 3 تا 5 روز اول به سرعت افزایش یافته سپس ثابت می‌گردد و پس از گذشت سه هفته شروع به کاهش می نماید. پروفیل درجه حرارت در توده های هوادهی شده ثابت با مواد اولیه ای که از ترکیب مخلوط لجن هضم شده با مواد مختلف درست شده اند در شکل (2-7) مشاهده می گردد.
همانطور که در شکل فوق دیده می شود افزایش درجه حرارت برای هر سه ترکیب به خوبی صورت می‌گیرد، اما در مخلوط لجن و کمپوست، فقدان عوامل حجیم کننده موجب کاهش منافذ عبور هوا شده از این رو اُفت درجه حرارت در این مخلوط نسبت به سایر ترکیبات بسیار مشهودتر است. مطالعات نشان داد که در صورت کاربرد کمپوست رسیده به عنوان عامل حجیم کننده، فرآیند با درجه حرارت کمتر، زمان ماند بیشتر، درصد کاهش رطوبت و مواد آلی کمتر مواجه خواهد شد. پس از طی دوره سه هفته ای مرحله عمل آوری با هدف بهبود کیفیت محصول نهایی انجام می گیرد. معمولاً برای کاهش زمین مورد نیاز، قبل از مرحله عمل آوری کمپوست اولیه را غربالگری می نمایند.
دوره عمل آوری برای مواد غربال شده حدود 30 تا 60 روز به طول می انجامد. عملیات هوادهی در مرحله عمل آوری توده های ثابت نیز مورد اهمیت قرار دارد. خصوصاً هنگامی که از توده های گسترده برای تهیه کمپوست استفاده شده باشد]15.[

شکل (2-8)-درجه حرارت در توده های ثابت هوادهی شده با مواد مختلف]15و37 [.
2-16-3- وضعیت موجود
سیستم توده های هوادهی شده در مقیاس اجرایی در "بلتسویل، بنگور، دورهام، دیترویت، میشیگان، ویندرو و اونتاریو" به طور بسیار مؤثری مورد استفاده واقع شده است. پس از شروع فرآیند، متوسط درجه حرارت در توده های هوادهی به 70 درجه سانتیگراد رسیده و بعد از ایجاد شرایط پایدار، معمولاً حداقل درجه حرارت حدود 55 درجه است.
کاربردی بودن این سیستم برای کمپوست سازی لجن هضم شده امتیازی است که این روش را نسبت به روش ویندرو شاخصتر می نماید. از سایر مزایای این روش نسبت به روش ویندرو می توان به کنترل مؤثر بو، غیر فعال سازی پاتوژنها به میزان بیشتر و استفاده از زمین کمتر اشاره نمود. از مزایای توده های هوادهی شده نسبت به سیستمهای راکتوری می توان به هزینه های سرمایه گذاری و راهبری بسیار ساده تر آن اشاره نمود[38].
امتیازات فوق موجب شده تا توجه بیشتری به توده های هوادهی شده برای کمپوست لجن معطوف گردد. مطالعاتی که در سال 1988 در آمریکا صورت گرفت مؤید این است که از میان سیستمهای کمپوست لجن موجود، توده های هوادهی شده 54 درصد، روش ویندرو 25 درصد، روش ویندرو هوادهی شده 4 درصد و سیستمهای راکتوری 17 درصد را تشکیل می دهند.
طبق مطالعات "کلاسیکو" هزینه عملیاتی گزینه ای که در آن از خُرده چوب به عنوان عامل حجیم کننده استفاده می شود تقریباً مشابه روش ویندرو است]38 [.
2-16-4- چشم اندازهای اخیر
تجریباتی که در دهه 80 به دست آمد تحولات زیادی در اساس فرآیند توده های ثابت "بلتسویل" به وجود آورد. عمده ترین پیشرفتها مربوط به سیستم هوادهی فرآیند بود. در فرآیند اصلی "بلتسویل" از هواده های کم قدرت با سیستم کنترل قطع و وصل تایمری استفاده شده که منجر به بروز فرآیندی بسیار پرحرارت می‌گردید. این صنعت به تدریج به سمت سیستم هوادهی زیاد و تولید فرآیندهای با درجه حرارت کمتر متمایل شد. در سیستم جدید درجه حرارت فرآیند تا حدود بهینه آن کاهش داده شد که مزایایی نظیر سرعت تجزیه بیشتر توده ها و آزادسازی حرارت بیشتر در اثر واکنشهای کمپوست سازی را در پی داشت. در این روش از سیستم کنترل حلقه های حساس حرارتی استفاده می شود بدین ترتیب که با افزایش یا کاهش حرارت موجود در توده، گیرنده های حرارتی فرمان شروع و یا توقف کار هواده ها را داده و موجب تنظیم درجه حرارت در حدود مورد نظر می گردند.
سیستم حلقه های حرارتی مدتهاست که در روش کمپوست راکتوری مورد استفاده قرار می گیرد اما کاربرد آن به تازگی در روشهای ویندرو و توده های ثابت متداول شده است.
حداکثر میزان هوای مورد نیاز مربوط به هفته اول کمپوست سازی بوده و پس از آن به تدریج میزان هوای مورد نیاز در طول فرآیند کاهش می یابد. این نوسانات با سیستم کنترل حلقه های حرارتی به خوبی قابل تنظیم هستند. در صورتیکه در روش "بلتسویل" میزان هوادهی در طول فرآیند ثابت باقی می ماند. بر این اساس کاربرد هواده های بزرگتر با تنظیم درجه حرارت در محدوده بهینه شروع شد]15.[
هنوز بخشهای زیادی بر روی سیستم کمپوست سازی تحت درجه حرارت بهینه وجود دارد. حفظ درجه حرارت بهینه حدود 45 درجه سانتیگراد از یک طرف موجب سلامت و فعالیت مطلوب جمعیت میکروبی موجود در توده کمپوست می گردد و از طرف دیگر شرایط پاستوریزاسیون مطلوب در توده کمپوست را فراهم نمی آورد]15.[
متخصصین در این امور اذعان دارند که فرآیند کمپوست سازی تحت درجه حرارت بالا محدودیتهایی را در سرعت انجام واکنش به وجود می آورد اما بسیاری از مشکلات بهداشتی را بر طرف می نماید. اگر طراحان در طراحی سیستم هوادهی تجهیزات کنترل لازم را تعبیه کنند، بهره برداران می توانند به صلاحدید خود درجه حرارت بهینه را برای اخذ بهترین نتایج تنظیم نمایند.
در مورد لجن فاضلاب شهری بسیاری از بهره برداران درجه حرارتهای بین 55 تا 65 درجه سانتیگراد را به عنوان درجه حرارت اولیه برای اطمینان از پاستوریزاسیون مناسب می دانند و سیستم را برای روزهای اول روی آن تنظیم می نمایند]9و38و15.[ پس از حصول اطمینان از کنترل پاتوژنها، بهره بردار درجه حرارت سیستم را بر روی اعداد پایین ترین تنظیم می نماید.
تجربیات به دست آمده بر روی فرآیندهای با درجه حرارت بهینه موجب شد تا این فرآیند در دهه 80 مورد توجه و قبول مجامع علمی قرار گیرد]38.[
2-17- سیستمهای کمپوست راکتوری
فرآیندهای راکتوری کمپوست سازی بر اساس نوع جریان ورودی جامدات به سیستم به دو دسته راکتورهای با جریان عمودی و راکتورهای با جریان افقی تقسیم می گردند. راکتورهای افقی از یکسری راکتورهایی با شیب ملایم نسبت به افق تشکیل شده اند که بدین ترتیب جریان یافتن جامدات در آنها امکان پذیر خواهد بود]2.[
2-17-1- راکتورهای جریان عمودی جامدات
نحوه جریان جامدات در این راکتورها بصورت عمودی می باشد. در برخی از این راکتورها جامدات هنگام جریان عمودی به سمت پایین بهم زده می شوند که به این راکتورها اصطلاحاً "راکتورهای جریان عمودی با بستر جامدات بهم زده" اطلاق می شود. این راکتورها می توانند با تغذیه مداوم و یا متناوب بکار گرفته شوند. نمونه ای از این راکتورها در شکل (2-8) نشان داده شده است.

شکل (2-9)- راکتورهای جریان عمودی با بستر جامدات بهم زده]2[.
در گونه های دیگر راکتورهای عمودی، که به آنها اصطلاحاً "راکتورهای جریان عمودی با بستر پرشده" اطلاق می گردد جامدات ورودی بهم زده نمی شوند این راکتورها نیز می توانند بصورت پیوسته یا ناپیوسته تغذیه و بکار گرفته شوند[2].

شکل (2-10)- راکتورهای جریان عمودی با بستر پرشده]2[.
در راکتورهای جریان عمودی با بستر های پر شده اغلب بصورت زمان بندی جریانی از جامدات از کف به طرف بالا برگشت داده شده و یک بهم زدگی در این حجم ایجاد می گردد. پس از رسیدن این جریان به بستر، بهم خوردگی تا جریان برگشتی بعدی متوقف می گردد. عمق مواد موجود در این راکتورها به 6 تا 9 متر می‌رسد]2و9[.
نمونه های مختلفی از این راکتورها با اشکالی دایره ای و یا مستطیلی و با الگوهای هوادهی متفاوت مورد استفاده قرار گرفته اند.
راکتورهای جریان عمودی با بستر های پرشده کاربرد گسترده‌ای در کمپوست لجن و مواد اصلاح کننده نظیر خاک اره دارد که دلیل عمده آن هزینه نسبتاً پایین در تولید کمپوست به ازای واحد حجم راکتور می‌باشد]9[.
نمونه‌هایی از راکتورهای جریان عمودی متداول در تولید کمپوست از لجن فاضلاب ذیلاً مورد اشاره قرار گرفته است.
2-17-2- راکتور بیوسل
این سیستم از راکتورهای جریان عمودی با بستر جامدت همزده شده است که اولین بار در کشور آلمان بکار گرفته شد. راکتور موجود در این فرآیند بصورت یک برج عمودی می باشد که از 8 تا 10 طبقه بر روی هم تشکیل شده است. کف هر طبقه از جنس آلومینیوم ساخته شده که با چرخش خود مواد موجود را به طبقه بعدی تخلیه می نماید. اکسیژن مورد نیاز بوسیله سیستم هوادهی تحت فشار تأمین می گردد. مواد ورودی به این سیستم را لجنهای آبگیری شده، کمپوست برگشتی و فضولاب باغی یا خاک اره بترتیب با نسبتهای حجمی 2:2:1 تشکیل می دهند.
مخلوط کمپوست در هر طبقه حدود یک متر ارتفاع و 3 روز توقف دارد و زمان ماند کل در راکتور حدود 30 روز می باشد. در شهرهای "رستت" و "ساربرکن" آلمان راکتورهایی از این نوع از سال 1977 مشغول بکار می باشند]9[.
2-17-3- راکتور BAV
سیستم BAV یک راکتور جریان عمودی استوانه ای با بستر پوشیده می باشد. این راکتور قابلیت تولید کمپوست از لجن فاضلاب با کمپوست نهایی و یا سایر مواد حجیم کننده نظیر خاک اره را دارد. در این راکتور همزمان با ورود مواد جدید از قسمت فوقانی، مخلوط کمپوست از قسمت تحتانی خارج می گردد. زمان ماند در این نوع راکتور بین 10 تا 14 روز بوده و در صورت لزوم در این مدت هوای تحت فشار از قسمتهای جانبی راکتور وارد می گردد]2[.
عملیات عمل آوری توده های کمپوست که مرحله اول را طی کرده اند حداقل نیاز به 6 هفته زمان دارد. در حال حاضر بیش از 25 کارخانه از این نوع با ظرفیتی معادل 375 متر مکعب در آلمان مشغول بکار می‌باشند]9[.

user834

For this purpose the genetic profile of 50 unrelated individual from each population prepared by using ABI kit. This kit contains fifteen str loci (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX, D18S51, D5S818 and FGA) and also amylogenin gene for sex determination. The result showed all the loci were in Hardy Weinberg equilibrium except two loci(D19s433 , D2s820) in Kermanshah and three loci (D19s433, D21s11 and VWA) in Yazd population. More over forensic parameters including PIC, PD, PE and MP have been calculated. After all the results have been compared with other population in neighbor countries.
This study revealed that these loci were the suitable loci for identification people and studying genetic population variation. Also the comparison showed that both of Yazd and Kermanshah people were similar to Turkish genetically, but were different from other countries. In addition Yazd has more homogeneous population than Kermanshah, that it could be due to pristine gene pool of this population in the past centuries.
Keywords: Short tandem repeats; Microsatellite markers; Population genetic
فصل اول
مقدمه
1-1 مقدمهدرگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به‌کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان‌گرهای ژنتیکی افراد است، که از مهم‌ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر‌کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین دلیل ازSTR ‏ها می‏توان در مطالعات جمعیتی و بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها سود جست [1].
علاوه بر مطالعات جمعیتی ازSTR ‏ها می‏توان در موارد تعیین هویت‏، تعیین ابویت، تست‏های پزشکی‏قانونی و سایر موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهایی که برای تعیین هویت و مطالعات ژنتیکی جمعیت به‌کار می‏روند، یکسان هستند و شامل پانزده جایگاه به نام‏های D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOXو TH01 می‏باشند [1].
هم‌چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).
1-2 نشان‌گر چیست؟
صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان‌گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان‌گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود‌فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان‌گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد‌:
1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)
2-به توارث برسد (2).
1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکینشان‌گرهای ژنتیکی عبارتند از:
1-نشان‌گرهای مورفولوژیک
2-نشان‌گرهای پروتئینی
3-نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA
1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک
کاربرد نشان‌گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان‌گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان‌گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل‌کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان‌گرها به شمار می‌آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).
معایب نشان‌گرهای مورفولوژیک
اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.
تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.
فراوانی و تنوع کمی دارند.
گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.
اساس ژنتیک بسیاری از نشان‌گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است‌(2).
1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی
در دهه‌ی 1950، نشان‌گرهای پروتئینی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین‏ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. برخی از تفاوت‏های موجود در ردیفDNA بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‏هایی با اندازه‏های مختلف تجلی کنند، که به روش‏های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می‏گردند. این قبیل نشان‌گرها را نشان‌گرهای مولکولی در سطح پروتئین می‏نامند که از آن جمله می‏توان به سیستم آیزوزایم/آلوزایم اشاره کرد. معمول‏ترین نوع نشان‌گرهای پروتئینی آیزوزایم‏ها هستند که فرم‏های مختلف یک آنزیم را نشان می‏دهند. آیزوزایم‏ها به‏ طور گسترده در بررسی تنوع ژنتیکی به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهای هم‌بارز نشان می‏دهند. اما این دسته از نشان‌گرها هم دارای معایبی هستند. برخی از معایب آن‏ها عبارت‌اند از:
محدود بودن فراوانی این نوع نشان‌گرها؛
تعداد آیزوزایم‏های قابل ثبت و مشاهده که می‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به یکصد عدد نمی‏رسد؛
محدود بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایم‏ها‌(نداشتن چند شکلی)؛
پیچیدگی فنوتیپ‏های الکتروفورزی آیزوزایم‏ها به دلیل دخیل بودن آنزیم‏های مرکب از چند پلی‌پپتید مستقل در ترکیب برخی از آیزوزایم‏ها‌(3).
اما پیشرفت‏هایی که در زمینه‏ی الکتروفورز دو‏بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده، تجزیه تحلیل هم‌زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوری پیشتاز در عرصه نشان‌گر‏های مولکولی مطرح شده‏اند. تاثیرپذیری نشان‌گرها از محیط که به‌طور معمول به‌عنوان یکی از محدودیت‏ها و نکات منفی نشان‌گرهای مولکولی یاد می‏شود، در مورد این نشان‌گر‏ها تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئومیکس‌(مطالعه سراسری کل پروتئین‏های موجود در یک سلول یا یک ارگانیسم) می‏تواند به‌طور هم‌زمان برای مطالعه بیان ژن و هم‌چنین برای شناسایی پروتئین‏های واکنش دهنده به شرایط محیطی مورد استفاده قرار گیرد(3).
1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA وRNA
دسته‌ای دیگر از تفاوت‏های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند. نه صفت خاصی را کنترل می‏کنند و نه در ردیف اسید‏های آمینه پروتئین‏ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‏ها را می‏توان با روش‏های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار داد. این نشان‌گر‏ها که تعدادشان تقریبا نا‏محدود است، فقط از راه تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند. بنابراین به آنها نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‏شود. نشان‌گرهای مولکولی فراوان و در هر موجود زنده‌ای می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. تاکنون تعداد زیادی از نشان‌گرهای DNA معرفی شده‌اند. این نشان‌گرها از نظر بسیاری از ویژگی‏ها مانند درجه‏ی چندشکلی، غالب یا هم‌بارز بودن، تعداد جایگاه‏های تجزیه شده در هر آزمایش DNA، توزیع در سطح کروموزوم، تکرار‌پذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‏یابی DNA الگو و هزینه‏ی مورد نیاز با همدیگر متفاوت‌اند. انتخاب بهترین نشان‌گر به هدف مطالعه (انگشت نگاری، تهیه نقشه پیوستگی، ژنتیک جمعیت و روابط تکاملی) و سطح پلوئیدی موجود مورد مطالعه بستگی دارد‌(4).
مزایای کاربرد نشان‌گرهای مولکولی
عدم تاثیرپذیری آنها از شرایط محیطی خارجی و داخلی موجود؛
امکان به‌کارگیری آنها در مراحل نخستین رشد جنینی حیوانات و مراحل نخستین رشد موجودات؛
فراهم نمودن امکان مطالعه موجودات در خارج از فصل و محیط کشت؛
دقت و قابلیت مطلوب تفسیر نتایج؛
هم‌بارز بودن بسیاری از این نشان‌گرها؛
امکان استفاده از آنها در مورد گونه‏های منقرض شده؛
سهولت تشخیص افراد ناخالص از خالص؛
سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل نتایج؛
دسترسی به برنامه‏های رایانه‏ای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر سریع نتایج‌(4)
انواع نشان‌گرهای مولکولی
نشان‌گرهای DNA گروه بزرگی از نشان‌گرها را تشکیل می‏دهند. این نشان‌گرها سیر تحول و تکامل خود را به پایان نرسانده‏اند و ابداع و معرفی روش‏های متنوع و جدیدتر ثبت و مشاهده‏ی تفاوت‏های ژنتیک بین موجودات از طریق مطالعه‏ی مستقیم تفاوت‏های موجود در بین ردیف‏های DNA هم‌چنان ادامه دارد. نشان‌گر‏های DNA در مدت یک دهه تکاملی شگرف و تحسین‌برانگیز داشته‏اند‌(5).
ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR یک روش سریع تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعه‌های مورد نظر DNA است. در واقع PCR روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون در کم‌تر از نیم‌روز امکان‌پذیر می‏سازد. اما این فرایند هنگامی امکان‌پذیر است که دست‌کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانندسازی DNAدر طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه‏ی مورد‌نظرDNA هستند، به‌عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‏گیرند تا واکنش آنزیمی همانندسازی DNA درون لوله‌ی آزمایش امکان‌پذیر شود. این همانند‏سازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‏های پلی‌مراز صورت می‏گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‏ها به صورت تجاری دردسترس هستند‌(6).
واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز (PCR) در سال 1983 توسط کری‌مولیس در حالیکه در یک نیمه شب تابستانی در حال رانندگی بود، ابداع گردید و سبب انقلاب عظیمی در زیست شناسی مولکولی شد(6).
همان‌گونه که در شکل 1-1 نشان داده شده است، نشان‌گرهای DNAبه دو دسته‏ی کلی طبقه‌بندی می‏شوند.
نشان‌گرهای DNAمبتنی بر PCR
نشان‌گرهای DNA غیر مبتنی PCR(6).

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی‌(10)
1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCRاین دسته از نشان‌گرهای DNA بدون استفاده از روشPCR تولید می‌شوند و مورد استفاده قرار می‌گیرند.
انواع نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر(RFLP)
پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)
ماهوارک‏ها
1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLPسرگروه نشان‌گرهای غیر‌مبتنی برPCR ، همان تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر یا RFLP است. از بین نشان‌گرهای مولکولی DNA، RFLP ها اولین نشان‌گرهایی بودند که برای نقشه‌یابی ژنوم انسان توسط بوتستین و همکاران در سال 1980 و پس از آن برای نقشه‌یابی ژنوم گیاهان توسط بر و همکاران در سال 1983 مورد استفاده قرار گرفتند. در اوایل دهه 1980 بوتستین و همکاران استفاده از تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم یا RFLP را برای مطالعه‏ی مستقیم DNA و یافتن نشان‌گر‏های ژنتیک جدید معرفی کردند. این تحول از پیامد‏های منطقی کشف آنزیم‏های محدودگر بود. این آنزیم‏ها که بسیار اختصاصی‏ هستند، ردیف‏های ویژه‏ای را روی مولکولDNA شناسایی کرده و آنها را از محل خاصی (نقطه‏ی برش) برش می‏دهند‌(7).
RFLP الزاما مختص ژن‏های خاص نیست، بلکه در کل ژنوم پراکنده است. ازاین رو، از نشان‌گرهای RFLP برای نقشه‌یابی تمام ژن‌ها در ژنوم انسان استفاده می‏شد(5). علاوه برRFLP که هنوز هم از قدرتمندترین و معتبرترین نشان‌گرهایDNA است، انواع مختلف نشان‌گرهایDNA با تفاوت‌های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه‌ی کاربرد، امتیاز‌بندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع ومعرفی شده‌اند‌(7).
مهم‌ترین مزایای RFLP
تکرارپذریری، دقت و قابلیت اعتماد این نشان‌گر فوق‌العاده زیاد است؛
این نشان‌گر هم‌بارز است و امکان تشخیص افراد خالص را از افراد ناخالص فراهم می‏آورد؛
فراوانی این نشان‌گر در حد بالایی است؛
RFLP تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد در صد ژنتیکی است(8).
برخی معایب RFLP
دشواری، پیچیدگی و وقت‌گیر بودن؛
RFLP ژنوم‌های بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روش‌های پیچیده‏تر و گران‏تر بیوشیمیایی است؛
RFLP نیازمند نگه‌داری میکروارگانیسم‌ها به‌منظور تهیه‏ی کاوشگر است که خود بر پیچیدگی این روش می‏افزاید؛
هزینه‏ی اولیه و نگه‏داری کاوشگر‏ها و کاربرد آنها بسیار زیاد است؛
نیازمندی به مقدار نسبتا زیاد DNA از محدودیت‏های دیگر روش RFLPاست به‌طوری که ده‏ها میکروگرم از DNAبرای هر فرد به منظور تجزیه‏ی ژنوم مورد نیاز است؛
از دیگر محدودیت‏های این نشان‌گر آن است که در گونه‏های بسیار نزدیک به یکدیگر این نوع نشان‌گر‏ها آلل‏های مشابهی را نشان می‏دهند(8).
1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)در سال1991، هاتادا و همکاران روشی را برای شناسایی و انگشت‌نگاری موجودات عالی ابداع و معرفی کردند. پیش از ابداع این روش که بر مبنای نشان‌دار کردن هم‌زمان انتهای هضم شده‏ی هزاران قطعه‌ی DNA است، ردیابی و ثبت موجودات عالی با روش نشان‌دار کردن انتهای هضم شده غیر ممکن می‌نمود. دو دلیل اصلی برای این تصور ذکر شده است:
ژنوم موجودات عالی بسیار بزرگ و پیچیده است برای مثال ژنوم انسان 109×3 جفت باز دارد و در نتیجه‏ی هضم آن با آنزیمی مانند EcoRI بیش از یک میلیون قطعه‌ی DNA به وجود می‌آید. تفکیک این تعداد مولکولDNA حتی با الکتروفورز دو بعدی نیز غیر ممکن است.
معمولا DNA ژنومی در هنگام استخراج به صورت تصادفی و غیر‌اختصاصی شکسته می‌شود و ایجاد مولکول‏هایی با انتهای تصادفی می‏کند. این امر سبب ایجاد پس‌زمینه‌ی ناشی از نشان‌دار شدن این انتهاها طی فرایند نشان‌دارکردن می‏شود‌(9).
برای رفع این دو نقص تدابیری پیش‏بینی شد و روش RLGS ابداع گردید. این روش جدید که برای تجزیه و تحلیلDNA ژنومی به‌کار می‌رود، بر مبنای این فرضیه است که نقاط برش اختصاصی آنزیم‏های محدودگر می‌توانند به‌عنوان نشانه و وجهه تمایز ارقام و افراد به کار گرفته‌شوند.
در این روش انتهای آزاد مولکول‌های DNA که در اثر صدمات مکانیکی در طی استخراج به وجود آمده‏اند، مسدود می‏شود. سپس برای کاهش پیچیدگی، DNA ژنومی توسط آنزیم‏های محدودگر، با محل برش نادر، هضم و نقاط برش به‌طور مستقیم با فسفر پرتوزا نشان‌دار می‏شوند. آنزیم‏های با محل برش نادر معمولا هزاران قطعه DNA به وجود می‏آورند. سپس با الکتروفورز دو‌بعدی، قطعه‏های هضم‌شده‏یDNA از هم جدا شده و خودپرتونگاری صورت می‏گیرد. این روش یک الگوی دو بعدی با هزاران نقطه‏ی پراکنده (قطعه‏های نشان‌دارDNA) ایجاد می‏کند که هر یک می‏توانند به عنوان یک نشان‌گر به کار گرفته شوند(10)
برخی از مزایای روشRLGS
در هر آزمایش هزاران نشان‌گر به‌دست می‌آید؛
مقدار کمی DNAمورد نیاز است؛
در صورت استفاده از آنزیم‌های محدودگر متفاوت، تفاوت‏های بیشتری ظاهر و ثبت خواهند شد[10].
برخی از معایب روش RLGS
DNA مورد نیاز برای این روش باید از کیفیت مطلوبی برخوردار باشد؛
هضم ناقص DNA توسط آنزیم‏های محدودگر نتایج تکرار ناپذیر و گمراه کننده‏ای خواهد داشت؛
این روش پیچیدگی فوق العاده‏ای داشته و تفسیر نتایج حاصل از آن دشوار است(10).
1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها
ماهوارک‏ها نخستین بار در سال 1985 توسط جفری و همکاران گزارش شدند. پس از آن در سال 1988 تکثیر جایگاه‏های ژنی خاص نواحی تکرارشونده، روی ماهوارک‏ها در ژنوم انسان انجام شد.
این دسته از نشان‌گرها از نظر تکنیکی مبتنی بر استفاده از کاوشگرهای مصنوعی و کاربرد مواد پرتوزا و روش ساترن هستند.
ماهوارک‌ها واحدهایی 10 تا 100 جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. آنها معمولا یک هسته مشترک 10 تا 15 جفت بازی دارند که احتمالا در تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها موثرند. ماهوارک‌ها بیش‌تر در نواحی یوکروماتین ژنوم پستانداران، قارچ‌ها و گیاهان متمرکز‌ند. تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها در حدی است که گاهی در انگشت‌نگاریDNA انسان مورد استفاده قرار می‏گیرند. از جمله‌ی ماهوارک‌ها می‏توان به تکرارهای پشت سر هم با فراوانی بالا (VNTR) اشاره کرد[11]. VNTR ها به دو دسته‌ی کلی تقسیم می‌شوند: VNTR تک مکانی و VNTR چند مکانی.
دسته‏ی نخست، تعداد متفاوت ردیف‌های تکراری در یک جایگاه ژنی و دسته‏ی دوم تعداد متفاوت ردیف‌های تکرار‌شونده در چندین جایگاه ژنی را نشان می‌دهند. الگوی بانددهی به‌دست آمده با استفاده از کاوشگر‌های VNTR تک مکانی ساده‏تر و قابل فهم‌تر است، زیرا هر فرد تعداد کمی باند واضح را نشان می‏دهد. در حالی‌که تعداد باندهای به دست آمده از کاوشگرهای مخصوص VNTRچند‌مکانی بیش‌تر است، به‌طوری که به‌طور هم‌زمان تا بیش از 30 باند به دست می‏آید(12).
در نخستین نشان‌گرهای مبتنی بر ماهوارک‌ها، از الیگونوکلئوتید‏های حاوی ریزماهواره به عنوان کاوشگر استفاده گردید و توسط علی و همکاران انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی نام‌گذاری شد.
از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی نشان‏دار‌شده مکمل با موتیف‌های کوتاه تکرار‌شونده در هیبریداسیون در ژل، با به کارگیری DNAژنومی برش داده شده با آنزیم‌های برشی خاص و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شده است. گوبتا و وارشنی در سال2000 طی تحقیقات خود مراحل زیر را برای انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی مطرح کردند:
جداسازیDNA ژنومی با وزن مولکولی زیاد
هضم DNAژنومی با یک آنزیم محدودگر مناسب
تفکیک قطعه‌های حاصل از هضم روی ژل آگارز
انتقال ساترن قطعه ها به غشا
دو ‏رگ‏گیری غشا با کاوشگر‏های(نشاندار با مواد پرتوزا یا غیر پرتوزا) الیگونوکلئوتیدی دربردارنده‏ی ردیف‌های دو یا سه تایی تکراری
خودپرتونگاری یا رنگ آمیزی برای مشاهده‏ی قطعه‌های دو رگ‌شده.
به‌کمک این روش می‌توان تنوع نواحی تکرار‌شونده‏ی مورد نظر را آشکار کرد. قطعه‌هایی از DNA که با الیگونوکلئوتیدها دو ‌رگ می‌شوند، در دامنه‌ای از اندازه‏ی چند صد جفت تا ده کیلو جفت باز قرار می‏گیرند. هم‌چنین گاهی بیش از یک نوع ماهواره در داخل یک قطعه‏ی برش داده شده قرار می‌گیرد. تفاوت‏هایی که این نوع نشان‌گرها نشان می‏دهند، به دلیل تفاوت در طول قطعه‌های برش داده‌شده‌ای است که در بردارنده‏ی ماهوارک‌ها هستند. از این روش برای شناسایی ژنوتیپ‌ها و همچنین در ژنتیک جمعیت استفاده می‌شود(12).
پس از مدتی، لیت و لوتی و سه گروه دیگر همین روش را برای ریزماهواره‏ها(عمدتا از نوع (CA)n) به‌کار بردند و دریافتند که ریز ماهواره‏ها به دو دلیل به مراتب آسانتر از ماهوارک‌ها با روش PCR تکثیر می‏شوند:
1-ریزماهواره‏ها کوچکتر از ماهوارک‏ها هستند؛
2-ردیف‌های تکرار‌شونده ریز ماهواره‏ای فراوانتر و توزیع آنها در کل ژنوم یکنواخت‌تر ازماهوارک‏هاست(13).
1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCRنشان‌گرهای مبتنی بر PCR نشان‌گرهایی هستند که از توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر برای تکثیر قطعه‏ی خاصی از DNA استفاده می‌کنند. روش‏های مختلف در این گروه، در طول و توالی آغازگرها، سختی شرایط PCR و روش‏های جداسازی و آشکار کردن قطعات با همدیگر فرق دارند.
انواع نشان‌گرهای مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر(AFLP)
DNA چند شکل تکثیر‌شده‏ی تصادفی(RAPD)
تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)
نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف (STS)
1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP)
در سال 1995 نشان‌گرهای جدیدی ابداع و معرفی شدند که به نظر می‌رسد بسیاری از محدودیت‌های نشان‌گر‌های پیشین را نداشته باشند. در این روش که AFLP نامیده می‏شود نشان‌گرهایی تولید می‏شوند که علاوه بر دارا بودن مزایایRFLP مانند دقت و تکرار‌پذیری ویژگی‌های مثبت روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز را نیز دارند. پایه‌ی این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‌ها از بین تمام قطعه‌های هضم شده‌ی DNA است و سه مرحله‌ی مجزا دارد:
هضمDNA با یه جفت آنزیم محدودگر و اتصال آنها به آداپتور‌های اولیگونوکلئوتیدی؛
طراحی، ساخت آغازگر و تکثیر انتخابی دسته‌ای از قطعه‌های حاصل از هضم .با استفاده از ردیف بازی آداپتور‌ها و نیز ردیف بازی نقاط برش، طراحی و ساخت آغازگر انجام می‌شود، اما برای تکثیر انتخابی قطعه‌های حاصل از هضم دو، سه یا چند نوکلئوتید به انتهای’3 ردیف آغازگر اضافه می‌شود که موجب می‌گردد فقط قطعه‌هایی تکثیر‌شوند که ردیف بلافصل آنها در مجاورت نقطه‌ی برش ،مکمل نوکلئوتیدهای یاد شده باشد؛
جداسازی قطعه‌های حاصل از تکثیر روی ژل‌های توالی‌یابی(پلی‌اکریل‌آمید) و خودپرتونگاری یا رنگ‌آمیزی نقره برای ثبت نتیجه‌ها.
با استفاده از این روش تعداد زیادی از قطعه‌های حاصل از هضم، تکثیر و قابل رویت می‌شوند. این در حالی است که نیازی به دانش اولیه در مورد توالی‌بازی قطعه‌هایی که تکثیر می‌شوند، وجود ندارند. هر یک از این قطعه‌هایی که به صورت باند روی ژل ظاهر می‌شوند، می‌توانند به عنوان یک نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرند.
تعداد قطعه‌هایی که با این روش تکثیر می‌شوند، به دقت و توانمندی روش‌های جداسازی (الکتروفورز)، ثبت نتایج و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولا در این روش بین پنجاه تا صد قطعه‌ی حاصل از هضم تکثیر و با استفاده از ژل‌های پلی‌اکریل‌امید واسرشت ساز ثبت می‏شوند(19)
مزایای AFLP
این روش در مقایسه یا سایر روش‌ها بیشترین تعدا نشان‌گر‌ها به ازای هر ژل را ایجاد می‌کند؛
در این روش نیازی به تهیه و تدارک و نگه‌داری کاوشگر نیست .دقت و تکرار‌پذیری این نشان‌گر به دلیل انتخاب دمای زیاد هم رشته‌سازی و اتصال آغازگر به DNA الگو بیشتر از RAPD است(20).
معایب AFLP
پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش‌های میتنی برPCR ؛
عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشان‌گر‌ها؛
غالب بودن این نشان‌گر موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می‏گردد؛
تکثیر قطعه‌های غیر‌واقعی در AFLP موجب کاهش قابلیت اعتماد این روش می‏گردد(20).
1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی(RAPD)در این روش از تک آغازگرهایی به طول هشت تا ده نوکلئوتید که ردیف بازی آن به طور قراردادی تعیین می‌گردد، استفاده می‏شود. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روی دو رشته‏ی DNA ژنومی می‌یابد و در آن نقاط به رشته‌های DNAمتصل می‌شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته‏ی مقابل به هم نزدیک باشند(فاصله‏ای که DNA قابل تکثیر باشد)، ردیف بین آن دو نقطه طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. فراورده‌های واکنش PCRروی ژل آگارز از هم جدا می‏شوند. تولید هر باند بیانگر وجود شباهت زیاد بین ردیف بازی آغازگرها و ردیف بازی محل اتصال درDNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را درDNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل های RAPD بیانگر جهش نقطه‌ای در محل اتصال آغازگرها و یا حذف یا (اضافه) شدن در ناحیه قابل تکثیر است. بنابراین چند شکلی در RAPDمعمولا به شکل حضور و غیاب یک باند پدیدار می‏شود. بدین معنی که نشان‌گرهای RAPD از نوع غالب‌اند و افرادی که دو نسخه از یک آلل دارند، به طور کمی از افرادی که یک نسخه از آن آلل را دارند، قابل تشخیص نیستند. تفاوت طول قطعه‏ها در RAPD از طریق تکثیر قطعه‌های DNA مکمل با ردیف‌های آغازگرهای اختیاری (ردیف مشخص ولی تصادفی) به‌دست می‌آیند. قطعه‏های تکثیر شده به صورت نوارهایی با وزن مولکولی متفاوت به‌طور مستقیم روی ژل قابل مشاهده‌اند (15).
مزایای RAPD
عدم نیاز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غیره؛
امکان بررسی هم زمان چندین جایگاه در ژنوم؛
عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ریف DNA برای ساخت آغازگر(16).
معایب RAPD
عدم تکرار پذیری؛
حساسیت بسیار به آلودگی؛
در صورت تغییر شرایط محیطی ظهور باندهای جدید؛
نامعلوم بودن جایگاه نشان‌گر RAPD روی نقشه‌ی ژنتیکی(16).
1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)تنوع‌ها و تفاوت‌هایی که به واسطه‏ی اختلاف در یک جایگاه نوکلئوتیدی(به علت جایگزینی، حذف یا ازدیاد) اتفاق می‌افتند، با عنوان تفاوت تک نوکلئوتیدی نامیده می‏شوند. این نوع از تنوع به‌وفور در ژنوم انسان اتفاق می‏افتد به طوری که مطالعات انجام گرفته توسط کاتانو-آنولز و گرس هوف (1998) در ژنوم انسان و اسب نشان می‏دهد که در فاصله‏ی هر دویست و پنجاه تا چهارصد نوکلئوتید یک SNP وجود دارد(17).
با اینکه‌SNP ها به وفور در ژنوم انسان یافت می‌شوند، ولی ایجاد و توسعه‌ی نشان‌گرهای SNP چندان آسان نیست. تهیه نشان‌گر‏های SNP شامل مراحل زیر است:
تعیین ردیف DNA اطراف SNP؛
تکثیر قطعه‌ای منحصر به فرد از DNA به کمک PCR به منظور غربال SNP؛
شناسایی SNP که شامل مشاهده‌ی دو آلل در افراد مختلف می‌باشد؛
مکان‌یابی نشان‌گر SNP و تعیین جایکاه خاص کروموزومی آن؛
تعیین فراوانی دو آلل در جمعیت؛
بررسی SNP در افراد و ژنوتیپ‌های مختلف(17).
برخی از معایب نشاگرهای SNP
SNPها به دلیل داشتن فقط دو آلل در یک جایگاه ژنی نسبت به نشان‌گر‌های چند آللی، اطلاعات کمتری را در نقشه‌های پیوستگی نشان می‌دهند؛
شناسایی نشان‌گرSNP بسیار پر‌هزینه و هم‌چنین زمان‌بر است(17).
1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف(STS)هر نشان‌گری که مبتنی بر واکنش PCR باشد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (معمولا بیش از بیست نوکلئوتید) ایجاد شود، یک نقطه‌ی نشانمند از ردیف نامیده می‏شود، زیرا پیش از طراحی آغازگر، بی‏شک در یک مرحله ردیف‌یابی صورت گرفته است. نشان‌گرهایی همچون تفاوت طول قطعه‌های قابل تکثیر (ALP) و ریزماهواره‏ها از آن جهت که مستلزم ردیف‏یابی برای طراحی آغازگر به منظور تکثیر DNA در یک نقطه‌ی خاص هستند، ذیل STS دسته‌بندی می‌شوند:
-تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
-ریز ماهواره‌ها (18).
1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
ALP یکی از ساده‏ترین و سریع‏ترین نشان‌گرهای مبتنی بر PCR است. اگر ردیف باز‏های قطعه‏ای از DNA در یک موجود مشخص باشد (یا دست کم بخشی از دو انتهای آن قطعه معلوم باشد)، براساس آن می‏توان به طراحی و ساخت مصنوعی آغازگرهایی به طول بیست تا سی نوکلئوتید اقدام کرد. چنان‌چه نمونه‏های مختلف DNA توسط این آغازگرها و از طریق واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز تکثیر و سپس روی ژل الکتروفورز از هم جدا شوند، در صورت وجود اختلاف در طول قطعه‏ی قابل تکثیر، باندهایی به اندازه‏های مختلف تولید خواهند شد که بیانگر وقوع پدیده‏ی حذف یا اضافه در بین نمونه‏های مورد مطالعه است. این تفاوت در اندازه‏ی قطعه‏های قابل تکثیر که جهش‏های ژنتیک را نشان می‏دهد به عنوان نشان‌گرهای ژنتیک مورد استفاده قرار می‏گیرد(14).
مزایای ALP
از نظر کاربردی در بین نشان‌گرهای DNA،یکی از سریع ترین و ارزان‌ترین‌ها است؛
به‌کاربرد مواد پرتوزا یا بیوشیمیایی پیچیده نیاز ندارد؛
به‌تدارک، نگهداری و کاربرد کاوشگرها نیاز ندارد؛
بسیار اختصاصی عمل می‌کند، تکرار پذیری آن خوب است و تا حد بسیار زیادی می‌توان به نتایج آن اعتماد داشت؛
به‌مقدار خیلی کمی از DNA نیاز است؛
هم‌بارز بودن این نشان‌گر امکان تشخیص افراد خالص از هر یک از انواع افراد ناخالص را فراهم می‌آورد(14).
معایب ALP
طراحی و ساخت آغازگرها، به اطلاعات اولیه در مورد ردیف DNAژنوم مورد مطالعه نیاز دارد که با توجه به اینکه ژنوم بسیاری از موجودات به طور کامل در دسترس نیست این روش استفاده بسیار کمی دارد؛
هزینه‌ی اولیه مورد نیاز به منظور تولید تعداد کافی نشان‌گر ژنتیک با توزیع مناسب در سرتاسر ژنوم بسیار زیاد و مستلزم صرف وقت است(14).
1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌هاریزماهواره‏ها شامل واحدهای یک الی شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت‏ها پراکنده‏شده‏اند. به طوری که در هر ده کیلو جفت باز از ردیف DNA دست کم یک ردیف ریزماهواره‏ای دیده می‏شود. طول ریز‌ماهواره‏ها معمولا کمتر از 100 جفت باز بوده و توسط دو ردیف منحصر به فرد در دو طرف محدود شده‏اند. ریزماهواره‏ها به سه گروه عمده‌ی تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولا توسط بازهای غیرتکرارشونده قطع می‌شوند) و تکرارهای مرکب(دو یا تعداد بیشتری از واحدهای مجاور یکدیگر) تقسیم می‏شوند. تعداد تکرارها در هر واحد بسیار متفاوت است. حداقل تعداد واحد تکرار‌شونده برای ریز ماهواره‏های دو نوکلئوتیدی به ترتیب ده و هفت بار تکرار تعیین شده است(21).
مزایای ریزماهواره‏ها
کاربرد آنها و تفسیر نتایج نسبتا ساده است؛
سیستم چند آللی(تا 11 آلل) از ویژگی‌های بارز این نوع نشان‌گر است؛
ریزماهواره‌ها بسیار متنوعند؛
به وفور در ژنوم یوکاریوت‏ها یافت می‏شوند؛
بیشتر ریزماهواره‏ها غیر‏عملکردی هستند؛
همبارز هستند [22].
1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنومریزماهواره‌ها بسیار فراوان بوده و در کل ژنوم موجودات به صورت تصادفی پراکنده اند. فراوانی ریزماهواره ها در بین موجودات زنده متفاوت است. برای مثال تخمین زده شده است که ژنوم انسان به طور میانگین ده برابر بیشتر از گیاهان ریزماهواره دارد. علاوه برDNA کروموزومی تعداد زیادی ریزماهواره در DNA کلروپلاست ها نیز گزارش شده است. به کمک روش‏هایی از قبیل دورگه‏گیری در ژل، نقشه‏یابی ژنتیکی و فیزیکی و هم چنین دورگه‏گیری در محل فلورسنت، ثابت شده است که ریزماهواره ها به طور یکنواخت در ژنوم پراکنده‏اند. اگرچه در برخی موارد می توانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند(12).
1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراریچنین فرض می‏شود که جهش در تعداد واحدهای تکرار شونده در هر یک ازDNA های تکرار شونده با یکی از دو سازوکار کراسینگ آور نامساوی(uco) یا جفت نشدن ناشی از سرخوردن در طول رشته (خطای همانندسازی DNA ) صورت می‏گیرد. بیشتر عقیده بر این است که ریزماهواره‏ها و ماهواره‏ها توسط سازوکار کراسینگ آور نامساوی ایجاد می‏شوند، ولی در مورد ریزماهواره‏ها برخی افراد یکی از دو سازوکار و برخی دیگر هر دو سازوکار را موثر می‏دانند(23).
1-5-1 کراسینگ اور نابرابرگاهی کراسینگ اور نابرابر در داخل تکرارهای ریزماهواره‏ای بین کروموزوم های مشابه یا خواهری اتفاق می‏افتد و سبب تغییر در تعداد واحدهای تکرار شونده می‏شود.(شکل 1-2).کراسینگ اور نابرابر می‏تواند هم در میوز و هم میتوز اتفاق بیفتد. چنین توجیه می‏شود که وجود نواحی تکرارشونده احتمالا مانع از ردیف شدن کامل در همولوگ یا کروموزوم‏های خواهری می‏شود. به نظرمی‏رسد که این نوترکیبی مکانیزم اصلی ایجاد تنوع مینی‏ستلایتی است(23).

شکل 1-2 کراسینگ آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف شدگی یا الحاق می‌شود(23.)
1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردن DNA در طول رشته(خطاهای همانند سازی)گاهی DNA پلی‌مراز در طول همانند سازی در نواحی تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای سر می‏خورد و موجب تغییر در تعداد واحد تکرار شونده می‏شود. در حقیقت سر خوردن پلی‌مراز در طول نواحی تکراری موجب عدم جفت شدن کامل دو رشته‏ی DNA شده و در نهایت حلقه‌هایی در رشته‌ی الگو یا رشته‏ی جدید ایجاد می‏شود(شکل1-3). این امر مکانیسم اصلی به وجود آورنده‏ی چندشکلی در میکروستلایت‌هاست(23).

شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد(23).اگر نتیجه‏ی همانند سازی ایجاد واحد های تکرار شونده‏ی اضافی باشد، حلقه در رشته ی جدید و اگر نتیجه‌ی همانند سازی کاهش در تعداد واحد‏های تکرار شونده باشد، حلقه در رشته‏ی الگو تشکیل خواهد شد(23).
گلدستین و شلوترر فرضیه‏ی عدم جفت شدن ناشی از سر‏خوردن در طول رشته را نسبت به فرضیه کراسینگ آور نامساوی به دلایل زیر به واقعیت نزدیکتر دانسته‏اند:
الف)‌در انسان بسیاری از تغییرات ریز ماهواره‏ای موجب تغییر در نشان‌گر های مجاور ناحیه ی ریز ماهواره‏ای نمی‌شود. بنابراین در ایجاد چنین تغییراتی نوترکیبی بی‏تاثیر است. از آنجا که جهش در فرضیه کراسینگ اور نامساوی، وابسته به نوترکیبی است، تغییرات ریز ماهواره ای و عدم تغییر نقاط مجاور با این فرضیه قابل توجیه نیست.
ب)‌نقصان در ژن‏هایی که در نوترکیبی نقش اساسی دارند تاثیری در پایداری ریز ماهواره‏ها ندارد.
ج)‌مطالعات انجام گرفته در ساکارومایسزسرویزیه نشان می‏دهد که پایداری ریز ماهواره‏ها در سلول‏هایی که تقسیم میوز را انجام می‏دهند مشابه با یاخته ها در تقسیم میتوز است. با توجه به اینکه نوترکیبی در میوز بیشتر از میتوز است، پس اگر فرضیه‏ی کراسینگ اور نامساوی صادق باشد، باید ریز ماهواره‏ها در میوز ناپایدارتر از میتوز باشد(23).
1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشوندهدو مدل متفاوت برای توصیف دامنه‏ی تنوع تعداد واحدهای تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای وجود دارد:
1.مدل جهش گام به گام
2. مدل آللی نا محدود
1-6-1 مدل جهش گام به گاماگر فرض کنیم در ریزماهواره‏ها یک گام معادل تغییر در یک واحد تکرار شونده باشد، بنابر این مدل ریز ماهواره‏ها از نظر اندازه فقط در تعداد محدودی گام تفاوت دارند، به‌طوری که هر گام از گام بعدی به وسیله‏ی یک واحد تکرار شونده جدا می‏شود. در این مدل چنین فرض می‏شود که بسیاری از جهش‏های با فراوانی زیاد، فقط ریزماهواره‏ها را در یک گام یا دو گام‌(در یک زمان) تغییر می‏دهند. طرفداران این نظریه معتقدند که در بیشتر آزمایش‏ها، بیشترین تغییر در ساختار ریزماهواره‏ها مربوط به افزایش یا کاهش در یک واحد تکرار شونده بوده است(10).
1-6-2 مدل آللی نا‏محدودبر اساس این مدل هیچگونه محدودیتی در اندازه‏ی پتانسیل ریزماهواره‏ها وجود ندارد. از این رو تعداد نا محدودی از انتخاب‏ها می‌توانند اتفاق بیفتند که تمامی آنها احتمال یکسان را داشته باشند.
بسیاری از پژوهشگران معتقدند که ترکیبی از این دو مدل(عموما تغییر در یک یا دو واحد تکرار شونده و به مقدار کمتر تغییرات بزرگتر) بهتر می‌تواند تغییرات جهشی در ریزماهواره‏ها را توضیح دهد(10).
1-7 مارکرهای STRتوالی‏های تکراری کوتاه پشت سر هم(STRS) ، توالی‏های تکرارشونده کوتاه با طول 1-13 نوکلئوتید هستند که به شکل سر به دم قرار می‏گیرند. در ژنوم انسان، معمول‏ترینSTR ، توالی دو نوکلئوتیدی [CA]n است،که در این فرمول n تعداد تکرارهاست که معمولا بین 5 تا 20 بار متغیر است(24).
1-8 کاربرد مارکرهای STRمارکرهایSTR کاربردهای فراوانی دارد که از مهمترین آنها تعیین هویت افراد است(25). تعیین هویت در موارد بسیاری کاربرد دارد که از جمله‏ی آنها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
1- مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی
2- شناسایی هویت قربانیان حوادث
3- تعیین هویت در موارد جنایی
4- ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی(26).
1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلیاز مارکرهایSTR می توان برای بررسی خویشاوندی دو یا چند نفر استفاده کرد. این نوع مطالعه را آنالیز فامیلی می‌گویند و کاربرد متداول آن در بررسی رابطه والدین ـ فرزندی است(27).
هرساله بیش از 300000 مورد تست ابویت به منظور تعیین رابطه پدر فرزندی در ایالات متحده انجام می‏شود. این تست‏ها معمولا شامل یک مادر، یک کودک و یک یا چند پدر مدعی است. همانطور که می‏دانیم هر فرد دارای دو سری آلل می‏باشد که یک سری آن را از پدر و سری دیگر را از مادر دریافت کرده است. بدین منظور آلل‏های پدر و فرزند برای یافتن تعدادی از جایگاه‏هایSTR مورد بررسی قرار می‏گیرند. اساس این تست بر این است که در فقدان جهش، آلل‏های کودک باید مطابقت کاملی با آلل‏های پدری و مادری داشته باشد(28-29-30).

شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد(26).علاوه بر این بسیاری از افراد برای شناسایی اقوام خود از مارکرهایSTR استفاده می‏کنند. برای مثال با آنالیز STR های کروموزومY می توان نسبت فامیلی میان مردان یک خانواده را مشخص کرد. زیرا همان‌طور که می‏دانید کروموزومY توارث پدری دارد و از پدر به تمام پسران به ارث می‌رسد. پس طبیعی است که تمام پسران خانواده در همه‏ی نسل‌هاSTR های یکسانی روی کروموزوم Y خود داشته باشند. آزمایشی که بدین منظور انجام می‏گیرد آزمایش Y-filer نامیده می‏شود. به کمک این آزمایش می‏توان روابط میان برادرها، عمو و برادرزاده و... را مشخص نمود(27-31).
1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادثفجایع بزرگ، طبیعی یا بدست بشر، می‌تواند جان افراد بسیاری را بگیرد، تست‏‏‏هایی که برای شناسایی قربانیان حادثه انجام می‏شود، تست تعیین هویت قربانیان حادثه نامیده می‏شود. از این تست در مواردی مانند سقوط هواپیما ،آتش سوزی‏های بزرگ و حوادث تروریستی استفاده می‏شود. در این قبیل حوادث با استفاده از اسامی افراد، خانواده‏های آنها شناسایی می‏شوند و پس از مراجعه‏ی خانواده‌ها، از اعضای خانواده شامل پدر، مادر، فرزند، خواهر و برادر نمونه‏ی DNA گرفته می‏شود و نواحی STR آنها بررسی می‏شود. پس از این مرحله با استفاده از DNAبه دست آمده از بقایای اجساد پروفایل ژنتیکی آنها تهیه می‏شود و در نهایت با مقایسه‏ی پروفایل‏های تهیه شده هویت قربانیان شناسایی می‏شود(32).
1-8-3 تعیین هویت در موارد جناییتعیین هویت در موارد جنایی شامل دو بخش می‏باشد:
شناسایی افراد مجهول الهویه
ردیابی مجرمین(25).
1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویههر ساله میلیون‏ها نفر در سراسر جهان تحت شرایط مشکوکی مفقود می‏شوند. بسیاری از این افراد قربانی فعالیت‏های مجرمانه از قبیل تجاوز و قتل می‏شوند و هویت آنها ناشناس باقی می‏ماند. در این موارد هم می‏توان از مارکرهای ژنتیکی موجود در DNA افراد برای تعیین هویت آنها استفاده کرد(33).
سه دسته نمونه در مورد افراد قربانی وجود دارد:
1-نمونه مستقیم از فرد قربانی
2-نمونه خانواده قربانی
3-نمونه‌های ناشناس باقی مانده از انسان در صحنه‏ی جرم
این نمونه‏ی باقی مانده می‏تواند استخوان، دندان، بافت، تار مو، لکه ی خون و یا هر چیز دیگری باشد(34).
1-8-3-2 ردیابی مجرمینعلاوه بر این می‏توان از آنالیز DNA برای ردیابی و شناسایی مجرمین استفاده کرد. این که فردی مرتکب جرم و جنایتی بشود و نمونه‌ای از DNA خود را به جا نگذارد، تقریبا غیرممکن است. مو، لکه‌های خون و حتی اثر انگشت، مقادیر بسیار جزئی از DNA را دارند که برای مطالعه با PCR کافی هستند. این بررسی‌ها لازم نیست که بلافاصله انجام شوند، زیرا در سال‌های اخیر، با آزمایش DNA روی مواد بایگانی شده، تعدادی از جنایات گذشته ـ با عنوان پرونده‌های مختومه ـ نیز روشن شده است(35).
باید به خاطر داشته باشیم که یک پروفایل DNA به تنهایی فاقد اعتبار است و کاربردی ندارد. همیشه برای بررسی یک پروفایل DNA نیاز است که یک مقایسه‏ای انجام شود:
1-نمونه ی مورد بررسی که با Q مشخص می شود
2-نمونه شناخته شده که با K نمایش داده می شود
در موارد جنایی، نمونه ی صحنه ی جرم (Q) با نمونه ی فرد مظنون (K) و یا مظانین (K1,K2,K3,K...) مقایسه می شود . در یک مورد بدون مظنون، نمونه ی صحنه ی جرم با نمونه هایی که در اطلاعات کامپیوتری از افراد سابقه دار وجود دارد، بررسی می شود . (K1,K….,KN)(34).

شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای STR(26).1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتیباستان شناسان با بررسی و مقایسه توالی DNA انسان‌های امروزی با افراد مرده، به کشف منشأ تکاملی انسان امروزی و مسیرهای استقرار انسان در کره زمین می‌پردازند. این زمینه تحقیقاتی آرکئوژنتیک نامیده می‌شود(35).
ردیابی مهاجرت انسانی در طول تاریخ با استفاده از آنالیز DNA روش نوینی است. هدف از این کار تخمین ارتباط میان جمعیت ها بر اساس شباهت‏ها و تفاوت‏هایDNA آنها است. به همین منظور پروژه‏ی عظیمی در سال2005 به منظور ردیابی تاریخ بشر انجام شد که در آن از ده ها هزار نفر از افراد در سراسر جهان آزمایش به عمل آمد. اساس کار بر این مطلب است که اگر تکامل ژنوم‏ها به دلیل انباشتگی جهش ها رخ داده باشد، بنابراین میزان اختلاف در توالی نوکلئوتید های دو ژنوم می تواند زمان حضور جد مشترک آنها را مشخص نماید. انتظار می رود دو ژنومی که اخیرا از یکدیگر جدا شده اند در مقایسه با دو ژنومی که جد مشترک آنها قدیمی‏تر است، اختلاف کمتری داشته باشند(36).
در مطالعه روی یافتن مبدا انسان‏های امروزی و الگوی جغرافیایی مهاجرت‏های بشر از مطالعه‏ی ژن‏ها در جمعیت‏ها می‏توان استفاده کرد. بدین منظور ژن‏های انتخابی جهت بررسی باید دارای گوناگونی باشند. در صورت فقدان گوناگونی ژن‏ها، اطلاعات فیلوژنتیکی بدست نمی‏آید، زیرا همه‏ی افراد حتی اگر به جمعیت‏های مجزایی تقسیم شده باشند که تنها به صورت متناوب با یکدیگر آمیزش داشته‏اند، همچنان دارای همانندی‏های بسیاری خواهند بود. بدین معنی که توالی DNA مورد استفاده در آنالیز فیلوژنتیکی باید از متنوع ترین توالی‏های متغیر باشد(36).
در انسان از سه نوع توالی استفاده می‏شود :
ژن های چند آللی مانند اعضای خانواده‏ی HLA، که اشکال بسیار متفاوتی دارند .
ریز ماهواره‏ها که STR ها نیز جز این گروه به حساب می‏آیند .
DNA میتوکندریایی که به دلیل فقدان سیستم‏های ترمیمی موجود در هسته‌های سلول انسان که نسبتا به سرعت دچار انباشتگی نوکلئوتیدی می‏شوند. انواع مختلف DNA میتوکندریایی موجود در یک گونه را هاپلوگروه می‏نامند(36).
باید توجه نمود که آلل‌ها و هاپلوگروه‌های مختلف به طور هم‌زمان در جمعیت‌ها وجود دارند. به این ترتیب این لوکوس‏ها چند شکلی بوده و به کمک مقایسه ترکیب آلل‌ها و یا هاپلوگروه‌های آنها می‌توان اطلاعات مربوط به وابستگی بین افراد مختلف را بدست آورد. به دلیل جهش‌های ایجاد شده در سلول‏های تولید مثلی هر یک از موجودات، آلل‏ها و هاپلوگروه‏های جدیدی در جمعیت ظاهر می‏شوند. هر یک از آلل‏ها، فراوانی آللی خود را دارند که در طول زمان به دلیل انتخاب طبیعی و تغییر ژنتیکی اتفاقی تغییر می‌کند. انتخاب طبیعی به دلیل تغییر در تناسب (توانائی یک موجود جهت بقا و تولید نسل) رخ می‌دهد و بنابر نظریه‌ی داروین منجر به حفظ انواع مناسب و از بین رفتن انواع زیان آور می‏گردد. به این ترتیب انتخاب طبیعی، فراوانی آلل‏های کاهنده‏ی تناسب را کم کرده و فراوانی آلل‏های افزاینده‌‌ی تناسب را افزایش می‏دهد. در حقیقت در یک جمعیت آلل‏های اندکی ایجاد می‏شوند که تاثیر قابل توجهی بر تناسب موجود داشته باشند، اما هم‌چنان فراوانی آنها به دلیل تغییر ژنتیکی اتفاقی که جز جدا نشدنی طبیعت تولد،تولید مثل و مرگ است در حال تغییر می‏باشد. به دلیل انتخاب طبیعی یا تغییر ژنتیکی اتفاقی ممکن است یک آلل در جمعیت غالب شده و فراوانی آن به صد در صد نیز برسد، به طوریکه این آلل در جمعیت تثبیت شود. اگر یک گونه به دو جمعیت تقسیم شود به طوریکه آمیزش‌های فراوانی بین دو جمعیت رخ ندهد، فراوانی آلل در دو جمعیت به طور مختلف تغییر می‌کند. بنابراین پس از چند ده نسل این دو جمعیت ویژگی‏های ژنتیکی مجزایی را کسب می‏کنند. سرانجام جایگزینی ژنی متفاوتی در این دو جمعیت اتفاق می‏افتد ولی حتی قبل از آن نیز می‏توان از روی اختلاف فراوانی آللی در دو جمعیت، آن دو را از هم باز شناخت(36).
محققان طی سال‏ها تحقیقات در سراسر جهان با استفاده از اصول تئوری اطلاعات، پارامترهای عمومی برای هر جمعیت را به منظور تعیین مقدار اطلاعاتی که مارکرهای STR در جمعیت‏ها به ما می‏دهند، تعریف کردند. در یک نمونه‏گیری از مارکرهای افراد از سراسر جهان، مارکرهایی که بیشترین چندشکلی را در میان جمعیت‏های مختلف داشتند و منحصر به جمعیت‏های خاص بودند، انتخاب شدند .امروزه از این مارکرها برای بررسی تنوع و تفاوت میان جمعیت‏ها استفاده می‏شود(37).
1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STRمارکرهای مختلف STR تحت عنوان کیت های تجاری مختلف در کنار تست‏های تعیین هویت کاربردهای گسترده‏ی دیگری دارند که از مهم ترین آنها می‏توان به موارد زیر اشاره کرد:
جمع آوری سلول های جنینی از خون مادر؛
بیماری های نقشه‏ی ژنومی؛
مشخص نمودن خطوط سلولی؛
تعیین هویت افراد استفاده کننده‏ی سرنگ مشترک؛
تشخیص کلون‏های موفق؛
بررسی و نظارت بر روی پیوند عضو؛
تشخیص کایمرهای ژنتیکی؛
تشخیص تومورهای سرطانی(26).
1-9-1 جمع آوری سلول های جنینی از خون مادرهنگامی که یک خانم باردار است تعدادی از سلول‌های جنینی می‏توانند از راه جفت وارد جریان خون مادر شوند. جمع‌آوری این سلول ها که تحت عنوان micro chimerism خوانده می‏شود و بررسی آنها با مارکرهای STR یک روش غیر تهاجمی برای تعیین رابطه‌ی پدر فرزندی است. همچنین با استفاده از این روش می‏توان جنسیت جنین را نیز تعیین نمود(26).
1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها


اسکن ژنوم انسان برای شناسایی نقشه ژنوم بیماری‏ها به طور معمول با استفاده از حدود چهارصد نشان‌گر STR در سراسر ژنوم در فواصل 10 سانتی مورگان انجام می‏شود. مرکز تحقیقات بیماری‏های ارثی در طول سال ها مطالعات و آزمایشات بسیاری را روی صدها نفر با استفاده از مارکرهای STR انجام داده است. هدف از این آزمایشات یافتن ارتباط میان فراوانی آللی در جمعیت های مختلف و بیماری های ژنتیکی بود. در پژوهش‌های صورت یافته ارتباط میان برخی مارکرها و بیماری‏ها مشخص شد. پس از آن از مارکر‏های مذکور می‏توان برای شناسایی تعیین دقیق محل ناشناخته‏ی ژن بیماری استفاده کرد(26).
1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترکیکی دیگر از کاربردهای مارکرهایSTR نشان دادن به اشتراک گذاری سرنگ در میان مصرف کنندگان مواد مخدر است. با این روش و با استفاده ازجایگاه D8 آزمایشگاه قادر به تشخیص هویت فرد و یا افرادی است که از یک سرنگ مشترک برای تزریق مواد مخدر استفاده کرده‏اند. با این روش می‏توان هویت شخصی را که منشا انتقال بیماری عفونی بوده و از سرنگ مشترک با سایر افراد استفاده می‏کرده تعیین نمود(26).
1-9-4 تشخیص کلون‏های موفقهنگامی که یک موجود کلون می‏شود ازSTR Typing برای آزمایش آن موجود استفاده می‏شود. برای مثال در کلون کردن موجوداتی مانند سگ و گربه. این روش برای آزمودن میزان موفقیت در کلون کردن به کار می‏رود. اگر یک پروفایل STR یکسان میان موجود کلون شده و سلول‎های مادری اولیه مشاهده نشود، در این صورت کلون کردن موفقیت آمیز نبوده(26).
1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضواز کاربردهای دیگر مارکرهای STR، نظارت پیوند سلول‏های پیوند شده بعد از پیوند مغز استخوان است، آزمایش STR از فردی که پیوند گرفته می‏تواند در تشخیص نارسایی پیوند مفید واقع شود(26).
1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکیChimerism حضور دو خط سلولی ژنتیکی متفاوت در یک ارگانیسم است که می‏تواند از طریق پیوند سلول‏های بنیادی خونی و یا انتقال خون و یا به طور ارثی در شخص اتفاق بیفتد. در سال 2004 آزمایشی روی افراد دهنده و گیرنده‏ی پیوند انجام شد که توانایی بالای 27 نشان‌گر STR به کار گرفته شده، ازجمله نشان‌گرهای CODIS در تشخیص کایمرها شگفت انگیز بود(26).
1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولیدر آزمایشگاه خطوط سلولی می‏توانند با سایر خطوط سلولی آلوده شوند. در نتیجه ممکن است با هم مخلوط و یا به یکدیگر تبدیل شوند احراز هویت خط سلولی انسان در حال حاضر به وسیله ی سازمانی در آمریکا انجام شده است. به کمک مارکرهای STR می‏توان آلودگی متقاطع بین خطوط سلولی مختلف را به سرعت کشف کرد و همچنین می‏توان برای مشخص کردن خطوط سلولی انسان به عنوان یک مرجع جهانی سود جست. در طول چند سال گذشته بیش از 500 خط سلولی از انسان به کمک این روش و با استفاده از 8 جایگاه STR بدست آمده است(26).
1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانیفقدان هتروزیگوسیتی (LOH) پدیده‏ای است که در آن حذف در یک ناحیه‏ی لوکوس منجر به عدم تکثیر در PCR می‏شود، به طوری که یک هتروزیگوت واقعی به عنوان یک هموزیگوت به نظر می رسد. این پدیده در بسیاری از افراد مبتلا به تومورهای سرطانی دیده می‏شود. بررسی روی بافت های سرطانی با بافت نرمال با استفاده از STR نشان می‏دهد که جایگاه های مختلف در بافت سالم ارتفاع بلندتری نسبت به بافت های سرطانی نشان می دهند؛چرا که LOH سبب حذف در آن ناحیه شده است(26).
1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولیدو روش کلی برای شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی عبارتند از:
اثر انگشت ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگر
تعیین الگوی DNA با PCR توالی‌های کوتاه تکراری(38).
1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگراولین روشی که در آنالیز DNA با هدف شناسایی افراد به کار رفت، روشی بود که در اواسط دهه 1980 توسط سر آلک جفری از دانشگاه لیستر ارائه شد . این روش براساس نوع دیگری از تنوع ژنوم انسان، موسوم به توالی تکراری بسیار متغیر پراکنده بود. همانگونه که از نام این توالی‌ها بر می‌آید، این توالی‌ها عبارتند از یک توالی تکراری که در جایگاه مختلفی‌(به‌طور پراکنده) از ژنوم انسان وجود دارد. نکته کلیدی این توالی‌ها این است که جایگاه ژنتیکی آنها متنوع است و در افراد مختلف در جایگاه‌های مختلفی از ژنوم قرار دارند(38).
توالی که در ابتدا برای انگشت‌نگاری ژنتیکی بکار رفت، توالی GGGCAGGANG (N: هریک از چهار نوکلئوتید) بود. برای تهیه اثر انگشت یک نمونه، DNA آن را با آنزیم محدودگر برش می‌دهند و قطعات حاصل را با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم تفکیک کرده و با آزمون ساترن بلات مورد بررسی قرار می‌دهند. هیبریداسیون با جستجوگری که دارای این توالی بود چند سری از نوارها را مشخص کرد. هریک از این نوارها مربوط به قطعه‌ای از DNA هضم شده بود که دارای این توالی تکراری بود. به دلیل تنوع جایگاه‌های این توالی اگر این آزمون با نمونه DNA فرد دیگری تکرار شود، نتیجه متفاوتی به دست می‌آید و می‌توان نتایج حاصل را انگشت‌نگاری ژنتیک این افراد محسوب نمود . در شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی نشان داده شده است(38).

شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی(38)
1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت نگاریاین روش در کارهای جنایی خود را بسیار ارزشمند نشان داد اما سه محدودیت داشت:
مقادیر بالایی از DNA برای انجام آزمون مورد نیاز است، زیرا این روش نیازمند آنالیز هیبریداسیون است. برای انگشت‌نگاری نمی‌توان از مقادیر اندک DNA موجود در مو و لکه‌های خون استفاده کرد.
بحث کردن در مورد الگوهای حاصل از انگشت‌نگاری مشکل است، زیرا نوارهای حاصل شدت و ضعف‌های متفاوتی دارند. از نظر قانونی، کوچک‌ترین اختلاف شدت در انگشت‌نگاری ژنتیکی یک متهم برای برائت او کافی است.
با وجود اینکه جایگاه‌های تکراری پراکنده بسیار متنوع هستند، اما اندک احتمالی نیز برای یکسان بودن یا حداقل تشابه الگوی حاصل از دو فرد وجود دارد. این موضوع می‌تواند منجر به برائت یک متهم شود(38).
1-10-2 روش پروفایلینگ
روش قدرتمند پروفایلینگ DNA چنین مشکلاتی را ندارد. در پروفایلینگ از توالی‌های معروف به توالی‌های چند شکلی STR استفاده می‌شود. در این روش، به وسیله PCR با پرایمرهایی که به توالی‌های جانبی STR می‌چسبند، به سرعت می‌توان مقادیر بسیار اندک DNA را افزایش داد. بعد از PCR، محصولات از نظر اندازه نوارها یا وجود نوارهایی که الل‌ یا آلل‌های موجود در نمونه DNAی مورد آزمون هستند، با الکتروفورز ژل آگارز بررسی می‌شوند. روش پروفایلینگ DNA، به دلیل استفاده از PCR بسیار حساس است و امکان انجام آزمون روی مو و دیگر نمونه‌هایی که مقادیر اندکی DNA دارند، فراهم می‌آورد. در نتایج حاصل نیز شکی وجود ندارد و مقایسه میان پروفایل‌های DNA معمولا به عنوان یک مدرک پذیرفته می‌شود. با استفاده از این روش امکان اینکه دو نفر، البته بجز دوقلوهای یکسان، دارای پروفایل‌ مشابهی باشند برابر یک در 1015 می‌باشد. با توجه به جمعیت کره زمین که حدود 109×6 می‌باشد، امکان تشابه آماری پروفایل مربوطه در دو نفر به قدری اندک است که می‌تواند غیرممکن تلقی گردد. نوع هر STR با PCR بوسیله پرایمرهایی که با فلورسنت نشاندار شده‌اند و به دو طرف نواحی تکرار شونده متصل می‌گردند، تعیین می‌شود. سپس الل‌های موجود در STRها با تعیین اندازه به وسیله ژل الکتروفورز موئینه‌ای مشخص می‌شوند. دو یا چند STR می‌تواند با PCR چندگانه مشخص گردد، مشروط به اینکه محصولات از لحاظ اندازه همپوشانی نداشته باشند یا هر جفت پرایمر با فلورسانت متفاوتی نشاندار شده باشند تا امکان تشخیص در ژل الکتروفورز موئینه را داشته باشند. در شکل 1-7 مراحل روش پروفایلینگ نشان داده شده است‌(38).

شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ ‌DNA(36).1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR
مارکرهای STRبرای اولین بار به عنوان ابزاری قوی در تست تعیین هویت انسانی در سال 1990 به‌کار گرفته شدند. دستگاه پزشکی قانونی ((FSS مطالعه برای شناسایی جایگاه‌های جدید و ارتباط جایگاه های شناخته شده با تنوع در جمعیت‏ها را آغاز کرد. پس از آن پلیس سلطنتی کانادا (RCMP) به همراه تعدادی از آزمایشگاه‌های اروپا تلاش‌های اولیه را در رابطه با جایگاه های STR آغاز کردند. اولین جایگاه‏های مورد استفاده شامل چهار جایگاه TH01،VWA ، FES/FPS و.F13A1 نسل دوم کیت‌ها ((SGM شامل جایگاه‌های TH01، VWA‌، FGA ،D8S1179 ،D18S51 و D21S11 بود. پایگاه داده‌های ملی DNA انگلستان ((NDNAD در سال 1995 جایگاه ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت) را به کیت SGM اضافه کرد. با توجه به تکنولوژی STR Typingو موفقیت‏هایی که در این زمینه در انگلستان به‌دست آمد، FBI درصدد برآمد که با استفاده از لوکوس‌های STR، بنیان CODIS را شکل دهد(41).
1-12 CODIS چیست؟سیستم شاخص اندیس‌دهی ترکیبی CODISشامل سیزده جایگاه STRاست. در شکل 1-8 محل قرارگیری این جایگاه‌ها روی کروموزوم‌های انسان نشان داده شده‌اند. نرم افزار CODIS در سال 1990 به عنوان نرم افزاری برای FBI تاسیس گردید. این نرم افزار در صورت اولیه برای آنالیز پروفایل‏های RFLP مورد استفاده قرار می‏گرفت که در بانک اطلاعاتی قابل جستجو بود. تکنولوژی DNA پزشکی قانونی و تکنولوژی کامپیوتری با یکدیگر ادغام گردیدند و باعث بهبود این نرم افزار شدند و این بهبود در جهت نیاز‌های پزشکی قانونی صورت گرفت. در سال 1997نرم افزار CODIS بر اساس مارکرهای STR طراحی شد. سیزده جایگاه STRکه امروزه تحت عنوان CODIS خوانده می‏شوند، عبارتند‌از:
D8S2179
D21S11
D7S820
CSF1PO
D3S1358
TH01
D13S317
D16S539
VWA
TPOX
D18S51
D5S818
FGA (42).

شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم های انسان(25).1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت
برای تعیین هویت از کیتAmp FI STR Identifiler PCR Amplification استفاده می‌شود، که حاوی 15 جایگاه تترانوکلئوتید STRبه همراه مارکر آمیلوژنین که برای تشخیص جنسیت به کار می‏رود می‏باشد. از این پانزده جایگاه، سیزده جایگاه، جایگاه‌های شناخته شده‏ی سیستم اندیس دهی ترکیبی‌(CODIS) هستند، اما علاوه بر آنها دو جایگاه دیگر هم در این کیت گنجانده شده است. جدول(۱-1) نشان دهنده‌ی نام جایگاه‏های موجود در CODIS، به همراه موقعیت کروموزومی هر یک از جایگاه‏ها و آلل‏های موجود در هر جایگاه است(43).
جدول 1-1 جایگاه‏های موجود در کیت ABIآلل‌های موجود در هر جایگاه موقعیت کروموزومی نام جایگاه
8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 8 D8S2179
24,24.2,25,26,27,28,28.2,29,29.2,
30,30.2,31,31.2,32,32.2,33,33.2,
34,34.2,35,35.2,36,37,38 21q11.2-q21 D21S11
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 7q11.21-22 D7S820
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 5q33.3-34 CSF1PO
12,13,14,15.16,17,18,19 3p D3S1358
4,5,6,7,8,9,9.3,10,11,13.3 11p15.5 TH01
8,9,10,11,12,13,14,15 13q22-31 D13S317
5,8,9,10,11,12,13,14,15 16q24-qter D16S539
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,
26,27,28 2q35-37.1 D2S1338
9,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15,
15.2,16,16.2,17,17.2 19q12-13.1 D19S433
11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,
22,23,24 12p12-pter VWA
6,7,8,9,10,11,12,13 2p23-2per TPOX
7,9,10,10.2,11,12,13,13.2,14,14.2,
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25
26,27 18q21.3 D18S51
X,Y Amelogenin
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 5q21-31 D5S818
17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,26.2
27,28,29,30,30.2,31.2,32.2,33.2,
42.2,43.2,44.2,45.2,46.2,47.2,48.2
50.2,51.2 4q28 FGA
1-14 معرفی استان‏ها1-14-1 استان کرمانشاه
کرمانشاه یکی از باستانی‌ترین شهرهای ایران است و بر اساس افسانه ها توسط طهمورث دیوبند - پادشاه افسانه‌ای پیشدادیان ساخته شده است. برخی از مورخین بنای آن را به بهرام پادشاه ساسانی نسبت می‌دهند. کرمانشاه در زمان قباد اول و انوشیروان ساسانی به اوج عظمت خود رسید. در اوایل حکومت شاه اسماعیل صفوی سلطان مراد آق قویونلو با 70 هزار نفر کرمانشاه و همدان را اشغال کرد. صفویه برای جلوگیری از تجاوز احتمالی امپراطوری عثمانی این شهر را مورد توجه قرار داد. در زمان شیخ علیخان زنگنه صدر اعظم صفوی به آبادانی و رونق کرمانشاه افزوده شد. تاورنیه، جهانگرد و بازرگان فرانسوی، درباره کرمانشاه چنین نوشته‌ است: ” هم زمان با حمله افغان و سقوط اصفهان که طومار فرمانروایی خاندان صفوی در نوردیده شد، کرمانشاه به جرم قرب جوار، با تهاجم عثمانی‌ها مواجه گردید و بار دیگر شهر رو به خرابی نهاد.“ نادر شاه به منظور آمادگی در مقابل تجاوز عثمانی‌ها، به این شهر توجهی خاص مبذول داشت. در زمان نادر شاه این شهر مورد هجوم عثمانی‌ها قرار گرفت. اما نادرشاه عثمانی‌ها را به عقب راند، ولی در اواخر زندگی نادرشاه، کرمانشاه با محاصره و تاراج عثمانی‌ها مواجه شد. کرمانشاه در عهد زندیه دستخوش آشوب فراوانی گردید. به طوری‌که درکتاب ”تحفه العالم“ عبدالصیف جزایری از کرمانشاه به عنوان خرابه نام برده شده است. در دوره قاجار تا حدی از حملات عثمانی‌ها به ناحیه کرمانشاه کاسته شد. در سال 1267ه.ق، امام قلی میرزا از طرف ناصرالدین شاه به سرحدداری کرمانشاه منصوب شد و مدت 25 سال در این شهر حکومت کرد و در همین دوره بناهایی را احداث و به یادگار گذاشت. این شهر در جنبش مشروطه سهمی به سزا داشت و در جنگ جهانی اول و دوم به تصرف قوای بیگانه درآمد و پس از پایان جنگ تخلیه شد. در نتیجه جنگ تحمیلی عراق علیه ایران، این شهر خسارات زیادی دید و پس از جنگ اقدامات مؤثری در جهت بازسازی آن صورت گرفت. در حال حاضر شهر کرمانشاه، مرکز استان کرمانشاه یکی از هفت کلانشهر کشور(تهران، مشهد، اصفهان، تبریز، شیراز، کرمانشاه و اهواز) است‌(44).
1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی
استان کرمانشاه در موقعیت ۳۴ درجه شرقی و ۴۷ درجه شمالی شمالی قرار دارد. از شمال به کردستان، از غرب به کشور عراق، از شرق به استان لرستان و همدان و از جنوب به استان ایلام محدود می گردد. شهرستان‌های این استان عبارت‌اند از: اسلام‌آباد غرب، سنقر، پاوه، صحنه، ثلاث باباجانی، قصر شیرین، جوانرود، دالاهو، روانسر، کرمانشاه، کنگاور، گیلان غرب، سر‌پل ذهاب، هرسین. در شکل1-13 استان کرمانشاه به همراه شهرستان‌های آن دیده می‌شود(44).

شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه)44.(1-14-2 استان یَزدیزد سرزمینی کهن با پیشینه‌ای در خور توجه، در تاریخ پر فراز و نشیب ایران است. نام یزد برای اولین بار در آثار دوره‌ی ماد‌ها (701 تا 550 قبل از میلاد) دیده می‌شود که گواهی بر قدمت سه هزار ساله‌ی این سرزمین است. در دوره‌های هخامنشی، اشکانی و ساسانی نیز در اسناد و کتیبه‌ها بار‌ها به نام یزد برمی‌خوریم(45).
حسن پیر‌نیا، در کتاب خود،"ایران باستان"،به نقل از تاریخ هرودوت، مورخ یونانی(484 تا 420 قبل از میلاد)، بر مبنای کتیبه‌های داریوش، یزد را بنا بر رسم یونانیان، به نام ایساتیس می‌خواند. وی می‌افزاید: یزد در عصر اشکانی در قلمرو حکومت مهرداد اول بود و در این شهر به نام او سکه ضرب می‌کردند. در دوره‌ی پادشاهی اردشیر بابکان، (241-224‌م) بنیان‌گذار سلسله‌ی ساسانی، یزد زیر نفوذ او بود. پس از ظهور اسلام و فروپاشی دولت ساسانی، در زمان خلافت عمر، و به روایت برخی، در دوران عثمان (دهه ی سوم هجری)، شهر یزد و نواحی آن فتح شد. از آن زمان تا پایان حکومت امویان، فرمانروایان عرب بر این ولایت حکم‌رانی می‌کردند. چنان‌که آمده است، در دوران خلافت حضرت علی(ع)، مسلم ابن زیاد، والی فارس، مالیات یزد را هم می‌گرفت. چنین بود تا هنگامی‌که به‌دست خود ایرانیان، حکومت های مستقل و نیمه مستقلی تشکیل شد و فرمانروایان ایرانی بر ولایت یزد حاکم شدند(45).
مرکز این استان، شهر یزد است. یزد منطقه‌ای خشک و بیابانی است. گروه بزرگی از زرتشتیان ایران در استان یزد و بویژه شهر یزد زندگی می‌کنند. زبان مردم استان یزد فارسی با لهجه یزدی است. آبادی نشینی در این منطقه از قدمت طولانی برخوردار است. این سرزمین از گذرگاه‌های مهم در ادوار تاریخی محسوب می‌شده‌ است. این ناحیه در دوره هخامنشیان از راه‌های معتبر موسسه‌های راهداری، مراکز پستی و چاپاری برخوردار بوده‌است. راهداری در یزد قدیم چنان اهمیتی داشت که خاندان آل مظفر از منصب راهداری ناحیه میبد به پادشاهی رسیدند. با این‌همه این استان از درگیری‌ها و جنگ‌های تاریخ کشور ایران تا حدودی ایمنی داشته‌است. سخت‌گذر بودن راه‌ها به همراه محدودیت منابع آبی مانع عمده تسخیر این منطقه توسط بعضی از حکومت های بزرگ و کوچک حاشیه و پیرامون این منطقه در طول تاریخ بوده‌است. همان طور که در شکل 1-14 دیده می شود استان یزد دارای شهرستان های ابرکوه، اردکان، بافق، بهاباد، تفت، خاتم، صدوق، طبس، مهریز، میبد و یزد می باشد که شهرستان های مهریز و تفت از آب و هوای خوبی برخوردار می باشد (45).
1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی
استان یزد در مرکز ایران در قلمرو سلسله جبال مرکزی ایران بین عرض های جغرافیایی 29 درجه و 48 دقیقه تا 33 درجه و 30 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 52 درجه و 45 دقیقه تا 56 درجه و 30 دقیقه شرقی از نصف النهار مبدا قرار گرفته است. استان یزد از سرزمین‌های تاریخی است که در میان ایالت های قدیمی و بزرگ پارس، اصفهان، کرمان و خراسان قرار داشته‌است(45).

شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد(45).1-15 هدف از تحقیق:آنچه که باعث استفاده از مارکرهای STR در جمعیت شناسی شده است، این واقعیت است که درجه فراوانی آللی هر مارکر STR در هر جمعیت منحصر به فرد است. در حقیقت طبق مطالعات انجام شده فراوانی آلل‏های STR در نژاد‏های مختلف و حتی در مناطق جغرافیایی خاص، تفاوت‏هایی را نشان داده است. بنابراین بررسی هر یک از لوکوس های STR در هر نژاد یا جمعیت خاص برای تفسیر صحت نتایج حاصل از انجام آزمایش های تعین الگوی ژنتیکی به کمکSTR و انجام محاسبات آماری مربوطه امری ضروری است. برای بهره گیری از فواید این فناوری نوپا در زمینه‏ی تشخیص افراد، ضروری است تا فراوانی آللی لوکوس‏هایSTR مختلف در جمعیت بومی کشور مورد بررسی قرار گیرند (45).
مطالعات گذشته روی جمعیت های ایرانی، حضور تعدادی از آلل‏ها را با پلی مورفیسم بالا نشان می‏دهد‌(37-46.)
هدف از این مطالعه به دست آوردن پارامترهای جمعیتی بر اساس فراوانی آللی به دست آمده از شانزده جایگاه STR، در جمعیت‏های کرمانشاه و یزد به منظور بررسی تفاوت ژنتیکی میان این دو جمعیت و سایر جمعیت‏ها می‏باشد.

فصل دوم
2-1 نمونه‌گیریبرای نمونه‌گیری از اقوام کرد و یزد از نمونه هایی که به آزمایشگاه ژنتیک پزشکی تهران رجوع می‌کردند، استفاده شد. پس ازکسب رضایت نامه 4 میلی لیتر خون محیطی از افراد غیر خویشاوند بر اساس محل تولد و اطلاعات مربوط به سه نسل گذشته (پدری و مادری) تهیه شد و در لوله‌های حاوی ماده ضد انعقاد (EDTA) ریخته شد برای تکمیل نمونه‌های یزدی از همکاری آزمایشگاهی در یزد استفاده گردید و برای نمونه‌های کرد به استان کرمانشاه رفته و از آزمایشگاه بیمارستان طالقانی نمونه‌گیری به عمل آمد.
2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباعاستخراج DNA با استفاده از روش استاندارد نمک اشباع طبق مراحل زیر انجام شد:
۱- ۳ میلی لیتر از نمونه‌ی خون محیطی حاوی ماده‌ی ضد انعقاد EDTA، داخل فالکون ۱۵ میلی لیتری ریخته شد و با استفاده از آب مقطر سرد به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس فالکون به شدت حرکت داده شد این کار جهت لیز بهتر گلبول‌های قرمز از طریق فرآیند تورژسانس می‌باشد. سپس نمونه را در دستگاه EBA 20 Hettich zentrifugen به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۵۰۰۰ سانتریفیوژ شد و محلول رویی خارج گردید و رسوب انتهایی فالکون نگه داشته شد.
۲- با افزودن آب مقطر سرد به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد و مجدداً با همان شرایط ذکر شده آن را سانتریفیوژ گردید و رسوب حاصل که حاوی گلبول‌های سفید است نگه داشته شد.
۳- پس از افزودن ml10 محلول I استخراج DNA به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس در شرایط ذکر شده آن را سانتریفوژ کرده و محلول رویی آن دور ریخته شد.
جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های قرمز)غلظت مواد
10 mM Tris-Hcl: pH:7.5
0.32 mM Sacarose
5 mM MgCl2
%1 Triton X-100
4-5/۱ میلی لیتر از محلول II استخراج DNA(از قبل تهیه شده به شرح زیر)، lμ ۲۵ سدیم دو دسیل سولفات ‌ SDS و lμ ۲۰ پروتئیناز K به رسوب سفید رنگ انتهای فالکون افزوده شد.
جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های سفید)غلظت مواد
10 mM Tris-HCl: pH:8.2
2mM EDTA: pH:8
0.45mM NaCl
۵- نمونه‌ها به مدت ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در دمایc° ۵۶ و یا به مدت یک شب در دمایc° ۳۷ در انکوباتور قرار داده شد تا رسوب حل شود.
۶- پس از افزودن lμ ۵۰۰ نمک اشباع به نمونه، به آرامی تکان داده شد و به مدت ۱۰ دقیقه در ۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی به یک فالکون حاوی ۲ میلی لیتر اتانول خالص (۱۰۰ درصد) انتقال یافت و به آرامی حرکت داده شد تا کلاف DNA شکل بگیرد.
۷- کلاف DNA توسط سمپلر به درون یک ویال حاوی ۱ میلی لیتر الکل ۷۰ درصد انتقال یافت تا الکل 100 خارج شود. در مرحله‌ی بعدی ویال را به مدت ۳ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دستگاه 20 Hettich zentrifugen Mikro سانتریفیوژ گشت.

user8251

TOC h z t "تیتر اصلی,1,تیتر فرعی,2" فصل اول: مقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته1-1- مقدمه PAGEREF _Toc142951498 h 21-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگان PAGEREF _Toc142951499 h 31-2-1- گازهای حاصل از تخمیر PAGEREF _Toc142951500 h 31-2-2- اسیدهای چرب فرار PAGEREF _Toc142951501 h 51-2-3- نیتروژن آمونیاکی PAGEREF _Toc142951502 h 51-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبه PAGEREF _Toc142951503 h 61-3- میکروارگانیسم‌های شکمبه PAGEREF _Toc142951504 h 61-3-1- باکتری‌ها PAGEREF _Toc142951505 h 71-3-2- تک‌یاخته‌ها PAGEREF _Toc142951506 h 81-3-3- قارچ‌ها PAGEREF _Toc142951507 h 91-4- اهمیت گیاهان دارویی PAGEREF _Toc142951508 h 121-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی PAGEREF _Toc142951509 h 131-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهی PAGEREF _Toc142951510 h 131-5-2- ساختار ترشحی PAGEREF _Toc142951511 h 131-5-2-1- ساختار ترشحی خارجی PAGEREF _Toc142951512 h 131-5-2-2- ساختار ترشحی داخلی PAGEREF _Toc142951513 h 131-5-3- عوامل اکولوژیکی PAGEREF _Toc142951514 h 141-5-4- کشت و فرآوری گیاه PAGEREF _Toc142951515 h 141-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه PAGEREF _Toc142951516 h 141-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis) PAGEREF _Toc142951517 h 141-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum) PAGEREF _Toc142951518 h 181-6-3- گیاه zosima absinthifolia PAGEREF _Toc142951519 h 211-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l. PAGEREF _Toc142951520 h 231-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.) PAGEREF _Toc142951521 h 251-7- روش آزمون گاز PAGEREF _Toc142951522 h 28فصل دوم: مواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری PAGEREF _Toc142951525 h 302-1-1- منطقه نمونه‌برداری PAGEREF _Toc142951526 h 302-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاه PAGEREF _Toc142951527 h 302-2- آزمون گاز PAGEREF _Toc142951528 h 312-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گاز PAGEREF _Toc142951529 h 312-2-2- مایع شکمبه و بافر PAGEREF _Toc142951530 h 312-2-3- زمان‌های ثبت تولید گاز PAGEREF _Toc142951531 h 322-2-4- مزایا و معایب آزمون گاز PAGEREF _Toc142951532 h 322-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گاز PAGEREF _Toc142951533 h 332-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌ها PAGEREF _Toc142951534 h 332-2-7- تهیه مایع شکمبه PAGEREF _Toc142951535 h 342-2-8- تهیه بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc142951536 h 342-2-9- تهیه نمونه شاهد PAGEREF _Toc142951537 h 362-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌ها PAGEREF _Toc142951538 h 362-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌ها PAGEREF _Toc142951539 h 372-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدی PAGEREF _Toc142951540 h 382-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی PAGEREF _Toc142951541 h 382-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشت PAGEREF _Toc142951542 h 392-3-1-محیط کشت PAGEREF _Toc142951543 h 392-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همین PAGEREF _Toc142951544 h 412-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرار PAGEREF _Toc142951545 h 412-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره I PAGEREF _Toc142951546 h 412-3-5- محلول مواد معدنی شماره II PAGEREF _Toc142951547 h 412-3-6- تهیه محیط کشت PAGEREF _Toc142951548 h 422-3-7- توزیع محیط کشت PAGEREF _Toc142951549 h 422-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازی PAGEREF _Toc142951550 h 432-3-9- تهیه مایع شکمبه تازه PAGEREF _Toc142951551 h 442-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبه PAGEREF _Toc142951552 h 442-3-11- تلقیح و نگهداری کشت‌های انجام شده PAGEREF _Toc142951553 h 472-4- تخمین تعداد باکتری‌ها PAGEREF _Toc142951554 h 482-5- شمارش تک‌یاخته‌ها PAGEREF _Toc142951555 h 482-6- شمارش قارچ‌های بی‌هوازی PAGEREF _Toc142951556 h 49فصل سوم: نتایج3-1- فراسنجه‌های شکمبه PAGEREF _Toc142951558 h 513-2- مقایسه بین سطوح مختلف PAGEREF _Toc142951559 h 493-2-1- مقایسه بین سطوح عصاره Teucrium polium l (مریم نخودی) PAGEREF _Toc142951560 h 493-2-2- مقایسه بین سطوح عصاره Crambe orientale (سپیده) PAGEREF _Toc142951561 h 503-2-3- مقایسه بین سطوح عصاره Heracleum persicum (گلپر) PAGEREF _Toc142951562 h 513-2-4- مقایسه بین سطوح عصاره zosima absinthifolia (زوسیما) PAGEREF _Toc142951563 h 513-2-5- مقایسه بین سطوح عصاره Oregano vulgare L (پونه) PAGEREF _Toc142951564 h 513-2-6- تولید گاز بخش تجزیه‌پذیر سریع (a) PAGEREF _Toc142951565 h 533-2-7- تولید گاز بخش مواد نامحلول در آب و کند تجزیه در شکمبه (b) PAGEREF _Toc142951566 h 533-2-8- تولید گاز بالقوه (a+b) PAGEREF _Toc142951567 h 543-2-9- ثابت نرخ تولید گاز (c) PAGEREF _Toc142951568 h 553-3- تخمین جمعیت میکروبی شکمبه PAGEREF _Toc142951569 h 563-3-1- تخمین جمعیت باکتری‌ها PAGEREF _Toc142951570 h 563-3-1-1- تخمین جمعیت باکتری‌ها در ساعت صفر PAGEREF _Toc142951571 h 573-3-1-1-1- سطح 100 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951572 h 573-3-1-1-2- سطح 200 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951573 h 573-3-1-1-3- سطح 300 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951574 h 573-3-1-2- تخمین جمعیت باکتری‌ها در ساعت چهار پس از انکوباسیون PAGEREF _Toc142951575 h 573-3-1-2-1- سطح 100 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951576 h 573-3-1-2-2- سطح 200 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951577 h 583-3-1-2-3- سطح 300 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951578 h 583-3-1-3- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح هر عصاره PAGEREF _Toc142951579 h 583-3-1-3-1- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح هر عصاره در ساعت صفر PAGEREF _Toc142951580 h 583-3-1-3-1-1- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Crambe orientalis PAGEREF _Toc142951581 h 583-3-1-3-1-2- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Heracleum persicum PAGEREF _Toc142951582 h 583-3-1-3-1-3- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Zosima absinthi PAGEREF _Toc142951583 h 593-3-1-3-1-4- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Teucrium polium PAGEREF _Toc142951584 h 593-3-1-3-1-5- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Oregano vulgare PAGEREF _Toc142951585 h 593-3-1-3-2- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف هر عصاره در ساعت چهار PAGEREF _Toc142951586 h 593-3-1-3-2-1- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Crambe orientalis PAGEREF _Toc142951587 h 593-3-1-3-2-2- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Heracleum persicum PAGEREF _Toc142951588 h 593-3-1-3-2-3- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Zosima absinthi PAGEREF _Toc142951589 h 603-3-1-3-2-4- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Teucrium polium PAGEREF _Toc142951590 h 603-3-1-3-2-5- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Oregano vulgare PAGEREF _Toc142951591 h 603-3-2- تخمین تعداد پروتوزوآ و قارچ‌ها PAGEREF _Toc142951592 h 60
فصل چهارم: بحث4-1- اثر عصاره‌ها بر قابلیت هضم و تولید گاز PAGEREF _Toc142951595 h 484-2- نحوه عمل عصاره‌ها PAGEREF _Toc142951596 h 514-3- اثر عصاره بر pH شکمبه‌ای PAGEREF _Toc142951597 h 524-4- اثر عصاره بر جمعیت میکروبی شکمبه PAGEREF _Toc142951598 h 534-5- ترکیبات شیمیایی عصاره‌های گیاهان دارویی PAGEREF _Toc142951599 h 574-6- نتیجه‌گیری کلی و پیشنهادها PAGEREF _Toc142951600 h 624-6-1- نتیجه‌گیری کلی PAGEREF _Toc142951601 h 624-6-2- پیشنهادها PAGEREF _Toc142951602 h 62منابع PAGEREF _Toc142951603 h 63

فهرست اشکال
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست اشکال,1" شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان PAGEREF _Toc142952501 h 4شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای PAGEREF _Toc142952502 h 8شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis L PAGEREF _Toc142952503 h 15شکل 1-4- گیاه گلپر PAGEREF _Toc142952504 h 19شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifolia PAGEREF _Toc142952505 h 22شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium polium PAGEREF _Toc142952506 h 24شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare L PAGEREF _Toc142952507 h 25

فهرست جداول
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست جداول;1" جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalis PAGEREF _Toc369168412 h 17جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A) PAGEREF _Toc369168413 h 34جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C) PAGEREF _Toc369168414 h 35جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B) PAGEREF _Toc369168415 h 35جدول 2-4- محلول ریزازورین PAGEREF _Toc369168416 h 35جدول 2-5- محلول احیاء کننده PAGEREF _Toc369168417 h 35جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc369168418 h 36جدول 2-7 PAGEREF _Toc369168419 h 45جدول 2-8 PAGEREF _Toc369168420 h 45جدول 2-9 PAGEREF _Toc369168421 h 45جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه PAGEREF _Toc369168422 h 46جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S) PAGEREF _Toc369168423 h 47جدول 3-1 گاز حاصل از تخمیر جیره و عصاره‌های گیاهان دارویی پس از 96 ساعت انکوباسیون PAGEREF _Toc369168424 h 51جدول 3-2- اثر سطوح مختلف پنج عصاره بر فراسنجه‌های تولید گاز PAGEREF _Toc369168425 h 52جدول 3-3- تعداد کل باکتری‌ها در هر میلی لیتر مایع شکمبه بعد از تاثیر عصاره‌ها PAGEREF _Toc369168426 h 56
فصل اولمقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1- مقدمهدر بین حیوانات اهلی گیاهخوار، نشخوارکنندگان سهم بزرگی را در تامین خوراک و سلامت بشر دارند. از طرفی تغذیه نقش اصلی را در بازده اقتصادی و عملکردی این دام‌ها داشته به طوری که تقریبا دوسوم از کل هزینه تولیدات دامی در واحدهای مختلف پرورش دام به هزینه‌های خوراک اختصاص داشته و از طرفی با توجه به مسئله کمبود پروتئین حیوانی و افزایش تولید با منابع علوفه‌ای موجود، لازم است تا از ارزش تغذیه‌ای منابع خوراکی قابل دسترس و مکمل‌های قابل استفاده به منظور افزایش راندمان تولید اطلاع کافی وجود داشته باشد (امیرخانی، 1386). از این رو اهمیت تغذیه مناسب نشخوارکنندگان ایجاب می‌نماید که ارزش غذایی هر یک از مواد خوراکی و اجزای تشکیل دهنده آنها طبق روش‌های صحیح و استاندارد تعیین گردد (قورچی، 1374).
معده حیوانات نشخوارکننده از چهار بخش شکمبه، نگاری، هزارلا و شیردان تشکیل گردیده است (آلاوونگ و همکاران، 2010). سه بخش اول فاقد هر گونه غده بوده و پیش معده نامیده شده و دو بخش آخر جایی است که هضم میکروبی یا تخمیر در آن صورت می‌پذیرد (منصوری و همکاران، 1381). شکمبه دارای انواع باکتری، پروتوزوآ و قارچ است اما باکتری در تمام جنبه‌های تخمیر شکمبه‌ای نقش غالب را بازی می‌کند (راسل و همکاران، 2002).
حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم


جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)
0/1
0/1 Glucose (W/V)
0/1 Cellobiose(W/V)
0/1 Maltose (w/V)
0/1 Xylose (W/V)
0/75 (V/V) %3 Cellolose Suspension
0/1 (W/V) % 1/0 Hemin Solution
0/2 Trypticase (W/V)
0/05 Yeast Extract (W/V)
0/45 VFA Mixture (V/V)
1/67 (V/V) %3 Cystein-HCL-Water
3/33 (V/V) %12 Sodium Carbonate Solution
0/0100 CO2 Gas Phase

جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S)محلول مواد معدنی شماره I15%
محلول مواد معدنی شماره II15%

–278

الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)........................................................24
سنتز ژن gcsf...................................................................................................................................29
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf....................................................................................................30
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.................................................................................31
هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf.......................................................................................................32
هضم آنزیمی وکتوربیانی pHan......................................................................................................33
کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan.................................................................................33
بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf...........................................................................................34
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf......................................................................................................35
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.....................................................35
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین..............................................................................35
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy..........................................................37
بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo.........................................................................................38
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf......................................................39
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo..............................................................................39
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf.........40
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................41
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا...................................................................................42
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین.............................43
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا......................................................................................44
کشت سلولهای مخمری....................................................................................................................44
بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE........................................................................44
تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش.....................................................................................................45
ایمونوبلاتینگ...................................................................................................................................46
فصل سوم نتایج
سنتز ژن gcsf...................................................................................................................................49
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf...................................................................................................49
طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf...........................................................................................49
بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf...........................................................................................50
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.................................................................................51
هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan.......................................................51
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf.............................................................................................52
بررسی کلونها به روش سریع...........................................................................................................52
انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf............................................................52
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf......................................................................................53
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.....................................................54
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble).............................................................54
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy..........................................................55
تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin.......................................................................................55
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................55
هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII.....................................................................56
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf......................................................57
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin..............................................................................57
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................57
بررسی کلونها به روش Colony-PCR.............................................................................................58
برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo.................................................................................58
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................59
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا........................................59
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین..............................................59
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا.....................................................................................60
تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting.......................................................61
فصل چهارم :بحث و پیشنهادات
رویکرد کلی پژوهش........................................................................................................................63
فصل پنجم : منابع و پیوست
فهرست منابع و مواخذ......................................................................................................................66
پیوست‌ها..........................................................................................................................................75
مقدمه
تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.
هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.
مواد و روش ها
cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده مربوط به هانسونلا پلی مورفا که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.
نتایج
ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با استفاده از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.
بحث
پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.
کلید واژه ها
هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک
فصل اول : مقدمه
در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:
رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،
تحمل دماهای بالا (توانایی رشد در دمای °C49)،
تبادل آسان محتوای ژنتیکی بین سلولهای هاپلوئید و دیپلوئید ( (Teunisson, 1960.
1-1میکروبیولوژی هانسونلا
این مخمر برای اولین بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوی 50% قند در فلوریدای آمریکا جداسازی شد.
سلولهای هانسونلا به هر دو صورت سلولهای دیپلوئیدی و هاپلوئیدی رشد می کنند. کلنی ها بر روی محیط کشت جامد دارای طیف رنگی صورتی هستند که به علت آسکوسپورها می باشد. کلنی سلولهای هاپلوئیدی و دیپلوئیدی از نظر رنگ، اندازه، چیدمان سلولی و سایر ویژگیها با یکدیگر متفاوت می باشند.
تاکنون اطلاعاتی در مورد توانایی هانسونلا پلی مورفا در تشکیل میسلیوم کاذب پیدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).

شکل 1-1 مخمر H. polymorpha
هانسونلا پلی مورفا میتواند در دمای بالا و در °C42 رشد کند. به نظر می رسد در این مخمر سنتز تره هالوز قسمتی از پاسخ به قحطی منبع کربن و شوک حرارتی است و پیشنهاد شده که این ترکیب، فاکتور مهمی در مقاومت دمایی است (Reinders, 1999).
مطالعات انجام شده بر روی هانسونلا پلی مورفا به طور عمده به بررسی پروتئین های سلولی، ساختار سلولهای مخمر در حال رشد و یا بررسی متابولیسم مخمر پرداخته اند.
در سویه هایی از این مخمر که از متانول به عنوان منبع انرژی استفاده می کنند، آنزیمهای متانول اکسیداز و کاتالاز، به فرم کریستالی درون اندامکی به نام پراکسی زوم قرار گرفته اند (Van Dijken, 1975).
هانسونلا پلی مورفا بعنوان یک ارگانیسم متیلوتروف، یک مدل مطلوب برای تحقیق در مورد عملکرد پراکسی زم ها و تکامل حیات می باشد. همچنین به منظور بررسی ژنتیکی جنبه های مختلف متابولیسم سلولی از جمله متابولیسم متانول، جذب نیترات و مقاومت به فلزات سنگین مورد مطالعه قرار می گیرد ( (Mannazzu, 2000.
با وجود این ویژگیها، هنوز قابلیت های ژنتیکی و طبیعی سویه های مورد استفاده از این مخمر کاملاً مشخص نیست و کنترل ژنتیکی فرایندهای سلولی پایه از جمله کنترل تقسیم سلولی، تولید مثل و اسپورزایی هنوز با سؤالات زیادی مواجه می باشد.
با اینحال هانسونلا پلی مورفا به عنوان یک میزبان برای تولید پروتئین های خارجی(ترشحی به خارج از سلول) توجه زیادی را به خود جلب کرده است ( (Gellissen, 2000.
1-2مطالعات ژنتیکی
تحقیقات ژنتیکی تاکنون تنها بر روی سه سویه از این مخمر انجام شده است که شامل سویه های DL-1، CBS 4732 و NCYC 495 می باشند.
پیدایش سویه های هانسونلا پلی مورفا از سویه های جهش یافته اکسوتروف شروع شده است.این موتانت ها از سویه هایی که در بالا نام برده شد با استفاده از ترکیب شیمیایی N-متیل-N-نیترونیتروزو گوانیدین یا اتیل متان سولفونات به دنبال یک مرحله غنی سازی با نیستاتین به دست آمده اند.
از طرف دیگر اشعه ماوراء بنفش نیز یک موتاژن بسیار قوی است که طیف موتانت های ایجاد شده بوسیله آن در مقایسه با موتانت های حاصل از مواد شیمیایی متفاوت و گسترده تر می باشد (Roggenkamp, 1986).
بطور کلی فرایندهای جهش زایی متعددی در این مخمر انجام شده است که یکی از این فرایندها، جهش های ژنتیکی است که منجر به سنتز اسیدآمینه های آروماتیک می شود که به مخمر اجازه رشد در محیط غنی YPD را نمی دهند (Krappmann, 2000).
از جمله انواع جهش یافته های اکسوتروف میتوان به موارد زیر اشاره نمود:
سویه هانسونلا پلی مورفای جهش یافته ای که برای رشد بر روی محیط های معدنی الزاماً به ریبوفلاوین نیاز دارد و محدود نمودن منبع ریبوفلاوین تأثیر شدیدی بر روی سنتز مجموعه الکل اکسیداز و تکثیر پروکسی زومهای سلولی دارد (Evers, 1994).
نوع دوم جهشهای ایجاد شده در ژن FAD1 است که اسید چرب دلتا را کد می کند. کاربرد این سلولهای جهش یافته در بررسی ژنتیکی سنتز اسیدهای چرب غیراشباع می باشد ( (Anamnart, 1998.
تحقیقات اخیر نشان داده است که هانسونلا پلی مورفا میتواند برای بررسی مقاومت به فلزات سنگین مورد استفاده قرار گیرد چراکه توانایی رشد در حضور تجمع فلزات سنگین متفاوت را که برای سایر موجودات سمی است دارا می باشد (Mannazzu, 1997).
در طی رشد در محیط حاوی vanadate، سلول ها افزایش قابل توجهی از پلی فسفات های واکوئلی پیدا میکنند. احتمالاً نقش این واکوئل ها در فعال کردن مکانیسم های اتوفاژی است که شاید برای جبران کمبود مواد مغذی و یا حذف ساختارهای سلولی ناهنجار القاء شده توسط این یون فلزی لازم باشند (Mannazzu, 1998).
سلول های هانسونلا پلی مورفا در مقایسه با S. cerevisiae به یون های کادمیوم(cd2+) بسیار مقاومند )این مقاومت به شدت به ماهیت منبع کربن استفاده شده بستگی دارد. سلول ها اغلب زمانیکه بر روی محیط حاوی گلوکز رشد میکنند به کادمیم مقاومتراند اما در طی رشد بر روی محیط حاوی متانول، به عنوان منبع کربن و انرژی، به این یون بسیار حساس می باشند. سویه های جهش یافته مقاوم به کادمیوم به سه گروه cds1، cds2 و cds3 تقسیم میشوند ( (Lahtchev, unpublished data.
جهش در ژنهای کدکننده آنزیم های پراکسی زومی یا سیتوپلاسمی درگیر در متابولیسم متانول
ژن AOX1 (MOX)، کدکننده آنزیم الکل اکسیداز (AO) موجود در ماتریکس پروکسی زوم است و یکی از بهترین ژن های هانسونلا پلی مورفا در تحقیقات می باشد (Ledeboer, 1985). الکل اکسیداز یک آنزیم فلاووهومواکتامری است که اولین مرحله در متابولیسم متانول را کاتالیز میکند. مونومر این آنزیم در سیتوپلاسم سنتز شده و به صورت هومواکتامر فعال، تجمع یافته و در داخل پراکسی زوم قرار میگیرد. حدود 210 نوع جهش یافته از ژن AO وجود دارد ( (Titorenko, 1995. بیان این ژن در مرحله رونویسی تنظیم میشود.

شکل 1-2 مورفولوژی سلولهای H. polymorpha جهش یافته
در هانسونلا پلی مورفا وقایع مربوط به مهار و القاء ژنهای کد کننده آنزیم های اختصاصی متانول و یا آنزیمهای پراکسی زومی به شدت کنترل می شوند. تنظیم در سطح رونویسی با مکانیسم های کنترلی قابل ملاحظه ای انجام میشود. عناصر تنظیمی به فرم سیس در بالادست ژنهای DAS، CAT و FMD با نقش مهاری برای گلوکز شناسایی شده اند.
1-3 نقشه ژنتیکی
آنالیز تتراد در هانسونلا پلی مورفا امکان پذیر است اما اندازه کوچک اسپورها روند این آنالیز را کند می نماید. در کشت سلول های دیپلوئیدی تفکیک مندلی نرمال در مورد بیشتر مارکرهای ژنتیکی مشاهده شده است.
الکتروفورز DNA کروموزومی هانسونلا پلی مورفا به روش pulse field، 3 تا 7 باند را نشان داده است که به نوع سویه وابسته است (Mari, 1993)اما بطور کلی مشخص شده است که هانسونلا پلی مورفا حداقل 7 کروموزوم دارد که بعضی از آنها مضاعف (دو تایی) هستند (Naumov, 1992).
1-4 تولیدمثل و اسپورزایی
فاکتورهایی در تولیدمثل و اسپورزایی هانسونلا پلی مورفا درگیرند که هنوز بطور کامل شناسایی نشده اند. از القاء کننده های قوی تولیدمثل جنسی میتوان به مالتوز، گلیسرول و سوربیتول اشاره کرد (Lahtchev, unpublished data).
سلول های هاپلوئید بر اساس نوع فنوتیپشان به چهار گروه تقسیم میشوند:
سویه های گروه 1 و 2 میتوانند هیبریداسیون متقاطع داشته باشند. این سویه ها سریع الرشد و تهاجمی بوده و پس از گذشت یک روز در محیط انتخابی، دیپلوئیدی می شوند. سویه های گروه 3 توانایی جفتگیری با اعضای گروه 1 و 2 را دارند و سویه های مثبت (+) نامگذاری می شوند. سویه های گروه 4 تنها میتوانند با گروه مثبت جفتگیری کنند و گروه منفی (-) را تشکیل دهند.
1-4-1 اسپورزایی
در هانسونلا پلی مورفا سلولهای هاپلوئیدی توانایی اسپورزایی دارند. اسپورزایی هاپلوئیدها بعد از گذشت 8 روز در محیط حاوی 3% مالتوز در دماهای پائین قابل تشخیص است. اسپورزایی با ظاهر شدن کلنی های دیپلوئیدی به رنگ صورتی روشن همراه می باشد.
در اواخر دهه 1960 کشف شد که مخمرها توانایی رشد بر روی محیط حاوی متانول به عنوان منبع کربن و انرژی را دارند (Ogata, 1969). اخیراً در تحقیقات پایه، متیلوتروف ها به عنوان منبع پروتئین های تک سلولی (SCP) ((Cooney and Levine, 1976) و آنزیم های غیرمعمول و متابولیت ها توجه بسیاری را به خود جلب کرده اند. با استفاده از روشهای جدید کلونینگ، ژن های کد کننده آنزیم های کلیدی در متابولیسم متانول شناسایی شده اند (Wegner, 1990).
پروموترهای MOX و FMD بعد از القاء، بسیار قوی عمل می نمایند. این مطلب با مشاهده میزان بالای بیان محصولات تحت تأثیر این پروموترها قابل انتظار است.
این یافته ها استفاده از هانسونلا پلی مورفا، به عنوان یک میزبان مناسب برای بیان به میزان زیاد ژنهای هترولوگ با استفاده از این پروموترها، به عنوان اجزاء کنترل کننده بیان، را قابل قبول نماید (Roggenkamp, 1984; Hollenberg and Janowicz, 1988).
سیستم بیانی شامل هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 و پلاسمیدهای حاوی توالی های URA3و HARS1 است که به دنبال هم قرار گرفته اند. استفاده از پروموترهای FMD یا MOX و ترمیناتور MOX همراه با جایگاههای برش آنزیمی کوتاه مربوط به کلونینگ (MSC) بین این دو واحد، کلونینگ و بیان ORFهای هترولوگ را ممکن ساخته است.
آنالیز سویه های بیانی، پایداری میتوزی قابل توجه پلاسمید های الحاق شده به درون ژنوم را نشان می دهد که در بعضی موارد بیانگر سرعت بیان بالای ORF هترولوگ می باشد.
از طرف دیگر، سویه RB11، اغلب دستکاری های ژنتیکی به صورت نوترکیبی را به راحتی نمی پذیرد که شاید ناشی از پایداری میتوزی فوق باشد. به نظر می رسد سویه DL-1 نسبت به سویه RB11 توانایی پذیرش بیشتری را دارد (Gellissen, 1992).
1-6 پروموترهای مورد استفاده در سیستم های بیانی هانسونلا پلی مورفا RB11
یکی از پروموترهای مورد استفاده برای تولید پروتئینهای هترولوگ در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11، پروموتر ژن MOX می باشد که طول آن بیش از 5/1 کیلوباز بوده و در حضور منبع کربن تنظیم می شود. به این صورت که در حضور گلوکز، پروموتر MOX مهار می شود ولی در حضور متانول، القاء می گردد.
پروموتر سایر ژن های کدکننده آنزیم های کلیدی در کاتابولیسم متانول از جمله FMD، DAS و CAT نیز مشابه با پروموتر ژن MOX کنترل می شوند اما سطح تنظیمی بعضی از آنها همچون CAT مشخص نیست (Veenhuis, 1983).
اگرچه پروموترهای FMD و MOX به طور واضحی مقایسه نشده اند اما بعضی مقایسه ها نشان داده است که مزایای پروموتر FMD از پروموتر MOX بیشتر است. بعنوان مثال، هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 بیان کننده ژن فیتاز تحت کنترل پروموتر FMD، بازده زیادی در تخمیر در شرایط قحطی گلوکز دارد.
1-6-1 HARS1
پلاسمیدهای بیانی مورد استفاده در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 دارای عنصر HARS1 به طول تقریبی 5/0 کیلوباز می باشند. این قطعه ژنی در سالهای اخیر در طراحی وکتورهای مناسب برای انتقال به هانسونلا پلی مورفا مورد توجه قرار گرفته است Roggenkamp, 1986)). پلاسمیدهای حامل توالی HARS1 در 30-20 نسل ابتدایی رشد سلولها به صورت اپی زومال باقی می مانند اما پس از آن در ژنوم سلول مزبان به صورت تکرارهای متوالی به تعداد زیاد الحاق می شوند. این در حالی است که ناحیه ای که این پلاسمیدها دقیقاً در ژنوم ادغام می شوند هنوز مشخص نیست Gellissen, 1990)). چهار عنصر دیگر از خانواده قطعه ژنی HARS در سویه های DL-1 به دست آمده است اما تعداد کپی آنها از تعداد عناصر HARS1 در سویه RB11 کمتر است.
جزئیات مکانیسم ادغام شدن پلاسمیدهای حاوی توالی HARS1 در ژنوم این مخمر هنوز مشخص نیست. تنها ویژگی شناخته شده، توانایی ادغام شدن به صورت توالیی تکراری و غیرتصادفی است که قسمت خاصی از ژنوم را انتخاب می کند (Sohn, 1996).

شکل 1-3 تصویر پلاسمید بیانی مخمر H. polymorpha
1-7 بیان همزمان:
با چنین سیستم هایی، مجموعه های پروتئینی هترومری تولید می شود. یک مثال قابل توجه از این نوع بیان، بیان همزمان آنتی ژن های S و Lویروس هپاتیت B است.
از دیگر موارد بیان همزمان میتوان به بیان ژن های کد کننده گلیکولات اکسیداز (GO) اسفناج و کاتالاز (CTT1) T ساکارومیسس سرویزیه در هانسونلا پلی مورفا اشاره نمود.
بیان، پردازش، تغییر و تبدیل و یا ترشح مؤثر پروتئینهای نوترکیب خاص در هانسونلا پلی مورفا ممکن است دچار تغییر شود. این محدودیت می تواند با بیان همزمان ژن مورد نظر با یک ژن دوم (یا بیش از یک ژن دیگر) برطرف شود به همراه می آورد. به عنوان مثال فرآیند پردازش نادرست اینترفرون آلفا 2a، می تواند با بیان همزمان ژن KEX2 ساکارومیسس سرویزیه بهبود یابد.
1-8 ترشح پروتئین های هترولوگ الیگومری و فعال
هانسونلا پلی مورفا مقدار کمی پروتئین درونی (خودی) ترشح می کند و در نتیجه این ویژگی، پروتئین های هترولوگ ترشح شده به محیط کشت، عموماً خالص هستند. بنابراین استفاده از این میزبان بیانی، روش مناسبی جهت تولید پروتئین های نوترکیب خارجی به فرم محلول می باشد. ترشح پروتئین ها توسط توالیهای نشانه (سیگنال) قابل جداسازی انجام می شود. اگرچه گاهاً مستقل از سیگنال ترشحی، در مواردی ترشح خودبخودی پروتئین هترولوگ نیز مشاهده شده است (Gellissen, 2000).
برای درک توانایی هانسونلا پلی مورفا در تولید و ترشح پروتئین های هترولوگ، سویه هایی از این مخمر به منظور ترشح الکل اکسیداز (AOX) مهندسی گردیدند. الکل اکسیداز، یک پروتئین هومواکتامر کوفاکتوری است که هر زیرواحد آن دارای یک مولکول FAD می باشد (van der Klei et al, 1991). زمانیکه هانسونلا پلی مورفا بر روی محیط حاوی متانول رشد می کند فعالیت پروتئین AOX در ماتریکس پراکسی زومی، جائیکه اکثر پروتئین های اصلی وجود دارند، محدود می شود.
از طرف دیگر، برای فهم چگونگی ترشح الکل اکسیداز، سویه هایی از هانسونلا پلی مورفا مهندسی گردید که ژن اندوژن AOX با ژن AOX به دنبال سیگنال ترشحی در انتهای N، جایگزین شد. به دنبال کشت این سویه در محیط کشت حاوی متانول، حضور AOX فعال شناسایی گردید که این بیان نشان می دهد هانسونلا پلی مورفا قادر به تولید و ترشح کمپلکسهای پروتئینی دارای کوفاکتور و ساختارهای الیگومری می باشد (van der Heide and Veenhuis, Unpublished results).
1-9 تولید واکسن نوترکیب
در بسیاری از کشورها واکسن های علیه هپاتیت در اوایل دهه 1980 در دسترس عموم قرار گرفت. این واکسن ها با جداسازی آنتی ژن HBs از سرم افراد ناقل تولید شده بود که اگرچه مؤثر بودند اما به دلیل مشتق شدن از سرم، گران بوده و مدت زمان کوتاهی به سیستم ایمنی عرضه می شوند. به همین دلیل، تولید آنتی ژن HBS هترولوگ در سیستم های بیانی مختلف از جمله مخمر، باکتری، سلولهای گیاهی یا جانوری و نیز حیوانات تراریخته توسعه پیدا نمود. (Billman-Jacobe, 1996, Makrides, 1996).
1-10 مخمرها به عنوان میکروارگانیسم های تولیدی
سیستم های مخمری دارای مزایایی از جمله توانایی دستکاری ژنتیکی آسان، فرآیند های پس از ترجمه یوکاریوتی با میزان بالای تولید محصول و فرآیندهای تخمیری ارزان قیمت هستند. بنابراین تعجب آور نیست که ساکارومیسس سرویزیه به عنوان یکی از میزبانهای مطلوب در تولید پروتئین های هترولوگ شناخته شده است (Hinnen et al, 1995; Barr et al, 2000).
تاکنون دو روش در سیستم بیانی هانسونلا پلی مورفا به منظور تولید زیرواحدهای adw2 و adr از آنتی ژن HBs ابداع شده است که یکی از آنها توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) تأیید شده است (Gregg et al, 1985; Gregg and Madden, 1987).
1-10 ساخت سویه هانسونلا پلی مورفا بیان کننده آنتی ژن HBs
به طور کلی تولید سویه های هانسونلا پلی مورفا نوترکیب نیازمند دنبال کردن پروتکل استاندارد زیر است:
تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
انتقال وکتور طراحی شده به سلول هانسونلا پلی مورفا
جداسازی سویه های نوترکیب
1-10-1 تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
تولید سویه H415 بیان کننده آنتی ژن HBs بوسیله گروهی از محققین یک مثال از این فرآیند است. توالی کدکننده آنتی ژن به طول 683 نوکلئوتید از پلاسمید pRIT10616 جدا گردید (Harford et al, 1987) و قطعه پروموتریMOX به عنوان سیگنال برای رونویسی از ژن MOX هانسونلا پلی مورفا مشتق شد (Ledeboer et al, 1985; Eckart 1988). این سه عنصر ترکیب شده و قطعه MOX promoter-HBsAg gene-MOX terminator را تشکیل می دهند که اساس کاست بیانی می باشند (Stinchcomb et al, 1980). سپس این کاست دارای عملکرد بیانی درون وکتور پلاسمیدی حاوی عناصر زیر قرار داده شد. ژن مقاومت به کلرامفنیکل به منظور تکثیر در باکتری E. coli، توالی همانند سازی هانسونلا پلی مورفا (HARS1) و ژن URA3 از ساکارومیسس سرویزیه به عنوان مارکر انتخابی در بررسی انتقال پلاسمید به هانسونلا پلی مورفا می باشند.
پلاسمیدهای دارای توالی HARS1 توانایی بالایی برای ادغام در ژنوم میزبان دارند. امروزه سویه هایی شناسایی شده که دارای بیش از 60 کپی از کاست بیانی خارجی اند که این مطلب به دلیل وجود این توالی می باشد.
1-11 انتقال (ترانسفرم) وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا
1-11-1 روش پلی اتیلن گلیکول
پلاسمیدpRBS-269 با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول به سویه RB10 انتقال یافت و برای مشخص شدن ادغام پلاسمید به درون ژنوم، غربالگری صورت گرفت (Gregg et al, 1985).
تاکنون چندین سویه ترانسفرم شده با کاست های بیانی الحاقی بطور پایدار تولید شده است و سویه H415 یکی از این سویه هاست که برای بیان آنتی ژن HBs تحت شرایط خاص مورد آزمایش قرار گرفته است (Janowicz et al, 1991).
1-12 جداسازی سویه های نوترکیب
تشخیص بیان پروتئین با رشد سویه های ترنسفورم شده بر روی محیط های تقریباً مغذی حاوی گلوکز، گلیسرول و یا متانول بررسی می شود. در این راستا، مقدار آنتی ژنHBs تولید شده در این سیستم بیانی در مقایسه با مقدار استاندارد آنتی ژن خالص با روش ایمونوبلاتینگ کمی اندازه گیری شد. میزان تولید د ر سویه H415 در محیط کشت حاوی متانول mg100 بود. زمانیکه سلول ها در محیط حاوی گلیسرول قرار گرفتند سنتز آنتی ژن HBs 70% کاهش پیدا کرد و زمانیکه سلول ها به محیط حاوی گلوکز منتقل شدند آنتی ژنی تولید نگردید که این مطلب نشان دهنده تولید این آنتی ژن به طور طبیعی تحت کنترل ژن MOX میباشد (Rutgers et al, 1988).
1-13 تنظیم متابولیسم متانول
تنظیم آنزیم های احیاکننده به روش مهاری و نه القاء صورت می پذیرد. در طی فرایند رشد، در شرایط کمبود گلوکز این آنزیم ها افزایش پیدا می کنند (Egli, 1980). تجزیه و تحلیل منطقه پروموتر ژن کد کننده AOD نشان داده است که در H. polymorpha بیان ژن MOX نیز توسط یک مکانیسم مهاری تنظیم می شود (Roggenkamp, 1984; Sakai and Tani, 1992).
1-14 فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (G-CSF)
در دهه 60 میلادی، دو گروه به طور همزمان روش هایی را برای توسعه و بهبود رشد کلنی های گرانولوسیتی و مونوسیتی مغز استخوان موش و یا سلول های طحال بر روی آگار نیمه جامد مورد بررسی قرار دادند. رشد کلنی این سلولها به حضور فاکتورهایی بستگی دارد که اصطلاحاً آنها را فاکتورهای محرک رشد کلنی(CSF) می نامند. تلاش برای شناخت بیولوژیکی و بیوشیمیایی این محرکها آزمایشگاههای زیادی را تا اواسط دهه 80 میلادی درگیر کرده بود (Metcalf, 2010). این تحقیقات نشان دادند که CSF ها عملکردی اختصاصی و مجزا ندارند بلکه چهار CSF که از نظر بیوشیمیایی کاملاً متفاوت هستند با هم همکاری می کنند. این چهار CSF با توجه به نوع فعالیت شان بر روی کلنی های متفاوت، نامگذاری شدند. به طور مثال GM-CSF که محرک رشد کلنی ماکروفاژها و گرانولوسیت ها می باشد.M-CSF محرک تولید کلنی ماکروفاژها و G-CSF محرک رشد کلنی گرانولوسیتی می باشد.
1-15 ژن gcsf
این ژن بر روی کروموزوم 17 قرار گرفته و دارای 4 اینترون است. دو نوع پلی پپتید متفاوت در نتیجه پردازش های مختلف از این ژن ایجاد می شود. تفاوت این دو پلی پپتید در وجود و یا عدم وجود 3 اسید آمینه می باشد. مطالعات انجام گرفته بر روی بیان این دو نشان می دهد که هر دوی آنها دارای فعالیت های مربوط به GCSF می باشند.
1-16 پروتئین GCSF
فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF)که فاکتور محرک کلنی3 هم نامیده می شود، یک سیتوکین وهورمون محرک رشد و دارای 175 اسید آمینه می باشد. گلیکوپروتئین های طبیعی انسانی در دو فرم وجود دارند. 174 آمینو اسیدی و 180 آمینو اسیدی که پروتئینی طویل با وزن مولکولی 19600 دالتون می باشد. فرم 174 آمینو اسیدی بیشترین فعالیت را دارد که در محصولات دارویی به کمک تکنولوژی DNA نوترکیب ساخته می شود. این فاکتور در بافت های مختلف اثربخشی خود را از طریق تحریک مغز استخوان برای ساخت گرانولوسیت و سلولهای بنیادی انجام می دهد.GCSF همچنین توسط اندوتلیوم، ماکروفاژها و تعدادی از سلولهای ایمنی تولید می شود.

شکل 1-4 ساختار کریستالی از 3 مولکول G-CSF انسانی
1-17 عملکرد پروتئین GCSF
G-CSF مغز استخوان را برای انتشار گرانولوسیت و سلولهای بنیادی در خون تحریک می کند. این پروتئین همچنین باعث تحریک بقاء، تکثیر، تمایز و عملکرد پیش سازه های نوتروفیلی و نوتروفیل های بالغ می شود که تنظیم این واکنش ها از طریق Janus kinase (JAK)، مبدل سیگنال و فعال کننده رونویسی STAT، پروتئین کیناز میتوژنی فعال (MAPK) و فسفاتیدیل اینوزیتول-3-کیناز انجام میشود.
شکل 1-5 مکانیسم عملکرد GCSF
گیرنده های GCSF بر روی سلول های پیش ساز مغز استخوان قرار دارند و در پاسخ به GCSF تحریک می شوند و این باعث رشد و تمایز این سلول ها به گرانولوسیت بالغ می شود. این پروتئین همچنین یک القاء کننده قوی برای انتقال سلول های بنیادی خون ساز هماتوپویتیک از مغز استخوان به درون خون می باشد (Wonganu, 2008).
GCSF همچنین محرک تولید گلبولهای سفید خون نیز می باشد و در انکولوژی و هماتولوژی، در بعضی سرطان های خاص برای افزایش سرعت بهبودی افراد نوتروپنی بعد از شیمی درمانی از شکل نوترکیب آن استفاده می شود. شیمی درمانی سبب تولید سطح غیر قابل قبول (کم) سلولهای سفید خون می شود که این مورد بیماران را در مقابل حملات میکروبی و عفونت ها حساس می نماید.
به نظر میرسدGCSF برای یک بارداری امن در طی مرحله لانه گزینی مؤثر باشد که این امر در بارداری های دوم و سوم بیشتر می شود (Strife, 2013).
در کنار تاثیر بر روی سیستم خون سازی، GCSF همچنین می تواند بر روی سلول های عصبی به عنوان مثال فاکتور نوتروفیک تأثیر بگذارد. در واقع گیرنده های این گلیکوپروتئین بر روی نورون های مغز و نخاع ظاهر می شوند (Cooper, 2011).
همچنین از GCSF برای درمان تخریب بافت قلب از طریق تزریق در خون محیطی به همراهSDF stromal) (cell-derived factor استفاده می شود (Anderlini, 2005) .
امروزهGCSF نوترکیب انسانی در سیستم بیانی باکتری E. coli تولید می شود که با نام فیلگراستیم شناخته شده است. فیلگراستیم از لحاظ ساختاری تفاوت کمی با گلیکوپروتئین طبیعی GCSF دارد. فیلگراستیم (Neupogen) و فیلگراستیم پگیله شده (Neulasta) (PEG-filgrastim) دو نوع تجاری متداول فرم نوترکیب GCSF انسانی rhG-CSF هستند. فرم پگیله، نیمه عمر طولانی تری دارد و این موضوع سبب کاهش ضرورت تزریق روزانه این دارو می شود.
شکل دیگر GCSF نوترکیب انسانی در سلولهای تخمدان هامستر چینی (CHO cells) ساخته می شود که با نام لنوگراستیم شناخته می شود. از آنجا که این سیستم بیانی در سلول پستانداران می باشد، لنوگراستیم تولیدی تفاوت بسیار کمی (غیر قابل تشخیص) در 174 آمینو اسید با GCSF طبیعی انسان دارد.
برای اولین بار در سال 1999 در آکادمی بیوتکنیک چین، ژنوم انسان به عنوان رشته الگو برای کلونینگ و بیان GCSF در غدد پستانی موش استفاده شد و قطعه ای به طول 5/1 کیلوباز با PCR بدست آمد(Lu, 1999).
در سال 2009 محققین به بیان پروتئین نوترکیب GCSF در مخمرPichia Pastoris پرداختند که نتیجه این تلاش بیان این پروتئین تحت پروموتور AOX1 بوده که در نتیجه القاء با متانول میزان پروتئین شده به 2 میلی گرم در لیتر رسید (Apte-Deshpande, 2009).
در سال 1387 محققین ایرانی به جهش زایی هدفمند در فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیت انسانی و کلونینگ و بیان آن در باکتری E. coli پرداختند و نتایج آنها نشان داد که پروتئین نوترکیب مورد نظر با موفقیت در سیستم پروکاریوتی کلون و بیان شده است (حامد ناقوسی، 1387).
به دلیل اهمیت بالینی بالا و نیز نیاز گسترده به GCSF در مراقبت های بهداشتی، تلاش های زیادی به منظور تولید مولکولهای مشابه با فرم طبیعی انسانی آن که دارای عملکرد باشند در حال انجام است.
در سالهای گذشته محققین ایرانی سعی در بیان آن در کاهوی تراریخته داشتنه اند چراکه در این سالها گیاهان تراریخته برای تولید انواع داروی نوترکیب و واکسن ها مورد استفاده قرار گرفته اند (مهدی شریفی تبار،1392).
فصل دوم مواد و روش ها
2-1 میکروارگانیسم های مورد استفاده
از باکتری E. coli سویه ' TOP10F به منظور کلونینگ و تکثیر پلاسمیدها و از مخمر Hansenula polymorpha سویه RB11 به عنوان میزبان بیانی مخمری استفاده شد.
2-2 محیط های کشت مورد نیاز
جهت رشد باکتری‌ E. coli از محیط کشت LB جامد یا مایع و جهت رشد مخمر از محیطهای کشت YPD جامد یا مایع، BMMY و BMGY استفاده شد (پیوست 1).
پس از آماده نمودن محیط¬های کشت میکروبی مورد نیاز، این محیط ها در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه در فشار یک اتمسفر اتوکلاو گردیدند. محلول‌های قندی یا محلولهای حساس به اتوکلاو با استفاده از فیلترهای 22/0 میکرون استریل شدند.
2-3 پلاسمیدهای مورد استفاده
وکتور کلونینگ pGH برای کلون نمودن ژن سنتز شده gcsf توسط شرکت مربوطه مورد استفاده قرار گرفت (شکل 3-1). وکتور بیانی مورد نیاز برای سلولهای مخمری به صورت سنتتیک و با درج عناصر ضروری جهت بیان پروتئین های هترولوگ در این سلولها با استفاده از وکتور کلونینگ pGH به عنوان وکتور اولیه ساخته شده است.

شکل 3-1. وکتور کلونینگ pGH
2-4 آنزیم ها و کیت‌ها
آنزیم Taq DNA polymerase، آنزیم های محدودالأثر، RNaseA و آنزیم T4 DNA ligase از شرکت Fermentas تهیه شدند.
کیت استخراج محصول PCR یا DNA از ژل آگارز از شرکت Roche تهیه گردید.
2-5 آنتی بیوتیکها
آنتی بیوتیک ها (آمپی سیلین، تتراسایکلین و زئوسین) با غلظت مناسب (پیوست 2) تهیه و در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2-6 روش های عمومی
2-6-1 الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز
به منظور بررسی نتایج PCR و یا کیفیت هرنوع مولکول DNA، از ژل آگارز استفاده می شود. به همین جهت ابتدا ژل آگارز با غلظت متناسب با سایز مولکول مورد بررسی تهیه می شود. با توجه به ظرفیت کاست ژل، ابتدا پودر آگارز وزن شده و سپس در حجم مشخصی از بافر TAE (پیوست 3) با رقت X1 حل می گردد. این مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق باقی مانده و سپس مخلوط به مدت 1 دقیقه جوشانده می شود تا به خوبی حل شده و محلول یکنواختی حاصل شود. پس از کاهش دمای محلول تا حدود °C40، به میزان لازم از محلول رنگی DNA Safety Stain به آن اضافه کرده و به آرامی به درون کاست ژل ریخته شده و شانه روی آن قرار داده می شود. پس از چند دقیقه و پس از بستن کامل ژل، شانه به آرامی و به صورت عمودی از داخل آن خارج ‌شده و ژل به همراه کاست در داخل تانک الکتروفورز افقی حاوی بافر TAE (X1) قرار داده می شود. در ادامه نمونه های DNA همراه با حجم مشخصی از بافر بارگذاری ، با ترتیب مشخص به آرامی به درون چاهک ها ریخته می شود. سپس الکترودهای تانک به منبع تغذیه متصل می شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص با توجه به اندازه قطعه، جریان برق قطع گشته و ژل از درون کاست خارج می گردد. ژل را در معرض نور فرابنفش قرار داده و باندها را مشاهده می نماییم.
نکته: در صورتی که قرار است DNA از ژل تخلیص شود، به هیچ‌وجه نمی‌بایست به مدت طولانی در معرض اشعه فرابنفش قرار گیرد زیرا این اشعه طول موج پایینی داشته و قادر است در توالی DNA جهش ایجاد کند.
2-6-2 تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز
جهت انجام کلونینگ، تخلیص محصول هضمهای آنزیمی فوق با استفاده از کیت تخلیص از ژل (Roche) و بر اساس پروتوکل موجود در کیت به شرح زیر انجام ‌شد:
1.به ازای هر mg100 ژل آگارز بریده شده ، µl300 بافر 1 (Binding buffer) به هر تیوب اضافه گردید.
2.تیوب ها به مدت 30-15 ثانیه ورتکس شده و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای C°56 گرماگذاری شدند.
3.در این مرحله به ازای هر mg100 ژل اولیه، µl150 ایزوپروپانول به تیوب ها اضافه شده وسپس ورتکس گردیدند.
4.محتویات هر تیوب به یکی از ستون های کیت افزوده شده و این مجموعه را با بالاترین سرعت (rpm13000) به مدت 30-60 ثانیه سانتریفوژ نمودیم.
5.مایع زیرین دور ریخته شده و سپس µl500 بافر شستشو به هر ستون اضافه گردید.
6.پس از سانتریفوژ در بالاترین سرعت به مدت 1 دقیقه، مایع زیرین دور ریخته شده و در این مرحله µl250 بافر شستشو مجدداً اضافه گردید.
7.پس از سانتریفوژ به مدت 1 دقیقه (در بالاترین سرعت)، هریک از ستون ها را به تیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال داده و µl35 آب دیونیزه به فیلتر ستون ها اضافه کرده و پس از انکوباسیون 5 دقیقه ای در دمای اتاق، هریک از تیوبها را مشابه با مراحل قبلی سانتریفیوژ نمودیم.
2-6-3 واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده
واکنش لیگاسیون پس از تعیین غلظت وکتور و قطعه الحاقی تخلیص شده از ژل آگارز، بر طبق واکنش مندرج در جداول مربوطه انجام گرفت. در نمونه کنترل منفی، وکتور خطی شده به تنهایی در یک واکنش لیگاسیون وارد گردید. به عبارت دیگر، در این واکنش به جای قطعه DNA، آب دیونیزه به مخلوط واکنش اضافه گردید. تمامی تیوب ها به مدت 16 ساعت (ON) در دمای °C4 گرماگذاری شدند. این دما کمک می‌کند تا تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین انتهاهای چسبنده آسان‌تر و با پایداری بیشتری انجام شود و آنزیم لیگاز نیز زمان کافی برای تشکیل پیوند فسفودی‌استری را خواهد داشت.
2-6-4 تهیه سلول‌ های مستعد 'E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم
باکتری مستعد، سلولی است که توانایی لازم برای وارد نمودن پلاسمید به درون خود را پیدا کرده است.
1.یک کلنی از باکتری مورد نظر به مدت 3-2 ساعت در حضور تتراسایکلین در محیط LB مایع و در دمای °C37 بر روی شیکر با سرعت rpm 150 کشت داده شد تا جذب نوری محیط کشت در طول موج nm600 (OD600nm) به 6/0-4/0 رسید.
2.محیط کشت در شرایط استریل (در کنار شعله) به میکروتیوپ استریل منتقل شده و با سرعت rpm9000 به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شد.
3.محیط کشت دور ریخته شده و رسوب سلولی در µl720 کلرید سدیم mM100 سرد استریل، حل شده و به مدت 20 دقیقه در یخ گذاشته شد.
4.پس از گذشت این مدت، سوسپانسیون باکتریایی با دور rpm9000 و به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شده و مراحل 3 و 4 تکرار شدند.
5.رسوب باکتریایی حاصل در µl300 محلول کلرید کلسیم حل گردید.
2-6-5 انتقال پلاسمید به سلول های مستعد (ترانسفورماسیون)
1.µl100 از سوسپانسیون سلول های مستعد به تیوپ استریل انتقال داده شد.
2.حجم مشخصی از پلاسمید و یا محصول لیگاسیون به سوسپانسیون باکتریایی اضافه شده و تیوب ها به مدت 30 دقیقه درون یخ قرار داده می شوند.
3.بلافاصله تیوب ها به حمام آبی دمای °C42 منتقل شده و به مدت 90 ثانیه گرماگذاری شدند. پس از اتمام این زمان سریعاً تیوب ها را به ظرف یخ منتقل نمودیم.
4.ml 1 محیط کشت مایع LB به محتویات هر یک از تیوبها اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در °C37 گرماگذاری گردیدند.
5.100 تا 150 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی بر روی محیط کشت LB جامد حاوی آنتی بیوتیک های مناسب (آمپی سیلین، تتراسایکلین یا زئوسین) کشت داده شد و پلیت ها به مدت 16 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری شدند.
6.پس از گذشت این مدت، از کلنی های تشکیل شده بر روی محیط کشت جامد، ماتریکس سلولی تهیه گردید.
2-6-6 بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع
1.مقدار µl50 از محلول EDTA(10 میلی مولار) به تیوبها اضافه کرده و حدود 70% از ماتریکس باکتریایی را در آن حل نموده و سوسپانسیون را ورتکس نمودیم.
2.مقدارµl 50 از محلول NSS (پیوست 4) را به هر تیوب افزوده و به مدت 30 ثانیه ورتکس نمودیم.
3.تیوب ها را به مدت 5 دقیقه در حمام آبی°C 70 گرماگذاری نمودیم.
4.مقدار µl 5/1 از محلول KCl (4 مولار) به تیوب ها اضافه کرده و هر تیوب به مدت 30 ثانیه ورتکس گردیده و سپس به مدت 5 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد.
5.محتویات هر سلول در دمای 4 درجه به مدت 3 دقیقه در g3000 سانتریفوژ گردید.
6.مایع رویی هر تیوب به تیوب جدید منتقل شد و میزان µl25 از آن بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
2-6-7 PCR بر روی کلنی های باکتریایی/ مخمری
با رعایت شرایط استریل، از کلنی های رشد یافته بر روی پلیت ماتریکس، مقداری باکتری برداشته و در مقداری آب دیونیزه استریل حل نموده و به مدت 5 دقیقه در بن ماری در حال جوش (100 درجه سانتی گراد) جوشانده و سپس از این محلول بعنوان الگوی DNA برای انجام PCR بر اساس پروتوکل مندرج در قسمت مربوطه استفاده می شود.

2-6-8 استخراج پلاسمید در مقیاس کم
1.باکتری E. coli حاوی پلاسمید مورد نظر را به لوله ml5 محیط کشت LB مایع حاوی آنتی بیوتیک مناسب تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) درون شیکر انکوباتور در دمای C°37 با دور 140 rpm قرار می دهیم.
2.سلولهای باکتریایی را با سرعت rpm10000 به مدت 3 دقیقه جمع آوری می نماییم.
3.در این مرحله رسوب باکتریایی را می توان در دمای °C20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصله از مرحله 3 را در µl100 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5. µl200 از محلول شماره 2 (پیوست 5) را به محلول حاصل از مرحله قبل اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.µl150 استات سدیم به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون ظرف یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول فوق را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
8.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
9.هم حجم مایع بدست آمده از مرحله قبل به آن مخلوط فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل به نسبت 25، 24، 1 اضافه می کنیم.
10.محلول را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
11.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
12.به میزان ml1 اتانول 96% سرد به مایع رویی اضافه کرده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C20- نگهداری می نماییم.
13.نمونه را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
14.به میزان µl750 اتانول 70% سرد به رسوب مرحله قبل اضافه کرده و مشابه با مرحله قبل سانتریفوژ می نماییم.
15.رسوب بدست آمده را در µl30-20 آب دیونیزه استریل حل می نماییم.
2-6-9 استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد
برای این کار از روش لیز قلیایی استفاده شد. مراحل انجام این روش به شرح زیر می باشد:
1.میزان µl450 از محلول آنتی بیوتیکی تتراسایکلین (غلظت نهاییml / µg15) را به ml300 محیط کشت مایع LB اضافه نموده و سپس سلول E. coli TOP10F' حاوی پلاسمید مورد نظر را به این محیط تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) بر روی شیکر انکوباتور C°37 قرار می دهیم.
2.محیط کشت به لوله های 50 میلی لیتری منتقل شده و با سرعت rpm10000 به مدت 4 دقیقه سانتریفوژ می گردد.
3.پس از انجام سانتریفوژ، محیط کشت رویی تخلیه شده و رسوب سلولی جمع آوری می گردد. در این مرحله می توان رسوب سلولی را در دمای °C 20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصل از مرحله 3 را در ml6 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5.به مقدار ml12 از محلول شماره 2 (پیوست 5) به تیوب فوق اضافه نموده و 10 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.سی میلی لیتر از محلول استات سدیم M3 (2/5pH) به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه درون یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول را به مدت 15 دقیقه در rpm12000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ می نماییم.
8.مایع رویی را از گاز استریل عبور داده و به محلول فیلتر شده، ml16 ایزوپروپانول اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری می کنیم. سپس این محلول را در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ نموده، مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک می کنیم.
9.رسوب خشک شده را در ml1 آب دیونیزه استریل حل کرده و به آن µl40 از محلول RNaseA (mg/ml10) اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری می نماییم.
10. به محلول فوق به نسبت 1:1 از فنل و کلروفرم اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ می نماییم.
11.فاز رویی (فاز آبی) را به تیوپ جدید منتقل کرده و دو برابر حجم این فاز، به آن اتانول 96% سرد اضافه نموده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C 20- قرار داده و سپس به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژمی نماییم.
12.مایع رویی را دور ریخته و به رسوب حاصل ml1 اتانول 70% سرد اضافه نموده و مجدداً سانتریفوژ می نماییم.
13.مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک نموده و سپس در µl150-100 آب دیونیزه حل می کنیم.
2-6-10 الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید (SDS-PAGE)
مقدمه
الکتروفورز در واقع همان حرکت ذرات باردار تحت تأثیر میدان الکتریکی، می باشد. خصوصیات مولکول ها (اندازه، شکل، میزان بار الکتریکی)، شرایط محیطی (قدرت یونی، pH، درجه حرارت و نوع ژل) و فاکتورهای الکتریکی (اختلاف پتانسیل، شدت جریان و ولتاژ) میتوانند در این فرایند مؤثر باشند. از متداول ترین محیط های نیمه جامد برای الکتروفورز پروتئین ها پلی اکریل آمید می باشد که پروتئین ها را در محدوده وزنی 500 تا 250000 دالتون از هم جدا می کند. این ماتریکس، پلیمری از مولکول های خطی اکریل آمید و N و N- متیلن بیس اکریل آمید می باشد. مولکول های بیس اکریل آمید پل های عرضی را بین مولکول های خطی اکریل آمید ایجاد می کنند و تشکیل یک شبکه رشته ای را می دهند که قادرند پروتئین ها را از هم جدا کنند. پلیمریزاسیون این ترکیبات در حضور آمونیوم پرسولفات آغاز می شود و به دلیل سرعت کم این واکنش، از ماده TEMED بعنوان کاتالیزور واکنش پلیمریزاسیون استفاده می شود. عامل اصلی حرکت مولکول های باردار در الکتروفورز، اختلاف پتانسیل (V) بین قطب های مثبت و منفی می باشد. در روش SDS-PAGE پروتئین ها در حضور شوینده یونی SDS، الکتروفورز می شوند. این ماده به اسید های آمینه هیدروفوب پروتئین ها متصل شده و ساختمان طبیعی پروتئین ها را واسرشته کرده و به ازای طول زنجیره پپتیدی بار منفی ثابتی به آن ها اضافه می کند. بنابر این در این نوع الکتروفورز، به دلیل خنثی شدن اثر بار پروتئین ها توسط SDS، پروتئین ها تنها بر اساس اندازه و شکل از هم جدا می شوند(Sambrook, 2001).
مواد لازم
-اکریل آمید
-N,N متیلن بیس اکریل آمید
-سدیم دو دسیل سولفات (SDS)
-تریس بازی
-TEMED
-آمونیوم پرسولفات (APS)
-آب مقطر
-رنگ کوماس بلو (شامل کوماسی بریلینت بلو G250، متانول، اسید استیک گلاسیال می باشد)
-بافر نمونه x6 ( شامل تریس بازی، گلیسرول، SDS، برومو فنل بلو و 2-مرکاپتو اتانول (2-ME) می باشد)
-بافر تانک X1 (شامل تریس، گلایسین،SDS و آب مقطر می باشد، پیوست 6).
-الکل 96%
وسایل لازم
•سیستم الکتروفورز (منبع تغذیه، تانک، شیشه ها، فضا سازها و شانه )
•سرنگ هامیلتون
روش انجام کار
روش تهیه ژل تحتانی یا جدا کننده (پیوست 6)
•ژل تحتانی بر اساس جدول (3-1) تهیه می شود. درصد ژل بستگی به وزن مولکولی پروتئین دارد. هر چه وزن مولکولی نمونه، بیشتر باشد از درصد پائین تر ژل استفاده می شود تا پروتئین بهتر بتواند در ژل حرکت کند.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه نموده و خوب مخلوط نمایید.
2-6-10-1روش تهیه ژل فوقانی (پیوست 6)
•از این ژل به منظور متراکم کردن نمونه پروتئینی استفاده می شود و عموماً از ژل 4% استفاده می شود. این ژل بر اساس مقادیر جدول(3-1) تهیه می گردد.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه و به خوبی مخلوط نمایید.
•صفحات شیشه ای را با آب و الکل 70% کاملاً تمیز کرده و دو فضا ساز بین صفحات شیشه ای قرار دهید و با گیره محکم کنید. در ظرفی جداگانه به 1 تا 2 میلی لیتر از محلول ژل تحتانی کل TEMED لازم برای ژل تحتانی را اضافه کرده وتوسط آن سریعاً اطراف قالب شیشه ای و به ویژه انتهای ژل را پوشانده تا از نشت احتمالی جلوگیری شود. قالب شیشه ای بطور عمودی روی سطح صاف قرار داده شود.
•پس از تهیه ژل تحتانی، TEMED را به آن اضافه کرده و پس از اینکه کاملاً مخلوط شد، داخل قالب شیشه ای تا ارتفاعی که حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل فوقانی باقی بماند، بریزید.
• سپس مقداری اتانول 96% را به گونه ای که سطح ژل بهم نخورد، به آرامی در بالای ژل ریخته و صبر کنید تا ژل ببندد.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل تحتانی، الکل روی ژل را خالی و سطح ژل را چند بار با آب مقطر شستشو دهید.
•شانه را بین دو شیشه در بالای ژل قرار دهید و سپس به ژل فوقانی تهیه شده، TEMED را اضافه نموده و پس از خوب مخلوط کردن بر روی ژل تحتانی بریزید.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل فوقانی، شانه را به آرامی خارج و داخل چاهک ها را چندین بار با آب مقطر شستشو دهید. قالب شیشه ای را با گیره به سیستم الکتروفورز وصل کرده و محفظه بالا و پائین سیستم را با بافر تانک پرکنید.

جدول 2-1 نحوه تهیه درصدهای مختلف ژل های فوقانی و تحتانی در SDS-PAGE

2-6-10-2 آماده سازی نمونه
•بر اساس نوع و غلظت نمونه، از بافر نمونه به آن اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار دهید.
•نمونه ها را با استفاده از سرنگ هامیلتون در داخل چاهک ها بریزید. مقدار نمونه قرار داده شده در هر چاهک بستگی به اندازه چاهک، میزان خلوص نمونه، روش رنگ آمیزی و نوع بافر نمونه (X2و X6) دارد.
•سیستم الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل نمایید و در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، هنگامیکه نمونه داخل ژل فوقانی است از ولتاژ V60 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل تحتانی ولتاژ به V130 رسانده شود.
•پس از اتمام الکتروفورز (رسیدن رنگ نشانه به انتهای ژل)، منبع تغذیه را خاموش کنید. قالب شیشه ای را خارج کرده و فضا سازها بیرون آورده شود. با قرار دادن یکی از فضا سازها بین دو صفحه شیشه ای، شیشه بالایی را جدا نمایید.
• سپس ژل رنگ آمیزی گردد.
2-6-10-3 رنگ آمیزی ژل SDS-PAGE
به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، لازم است ژل را رنگ آمیزی نمود. روشهای مختلفی برای رنگ آمیزی ژل های SDS-PAGE وجود دارد که متداولترین آنها روش رنگ آمیزی با کوماسی بلو و یا نیترات نقره می باشد. عموماً از روش کوماسی بلو استفاده می شود زیرا که یک روش سریع و ارزان بوده و ثبات رنگ طولانی است.
استفاده از کوماسی بلو
مواد لازم
-رنگ کوماسی بلو
-الکل 96% (برای رنگ بری)
-آب مقطر
روش انجام رنگ آمیزی
•ژل را در داخل ظرف رنگ آمیزی قرار می دهیم و مقداری رنگ به آن اضافه و به مدت10 دقیقه بر روی شیکر می گذاریم.
•رنگ را خالی کرده و ژل را داخل محلول رنگ بر (آب مقطر حاوی اتانول) بر روی شیکر قرار می دهیم تا زمینه ژل شفاف شده و باندهای پروتئینی آبی رنگ نمایان شوند.
2-6-10-4 رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (پیوست 7)
•قرار دادن ژل در بافر فیکساسیون به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر.
•دور ریختن بافر فیکساسیون و اضافه نمودن بافر شستشو سه بار و هر بار به مدت 20 دقیقه.
•اضافه کردن بافر sensitizing به مدت 2 دقیقه.
•دور ریختن بافر sensitizing و شستشو با آب مقطر سه بار و هر بار 5 دقیقه.
•اضافه کردن بافر رنگزا به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر.
•شستشوی ژل در آب مقطر و اضافه کردن بافرdeveloping تا ظهور باندهای پروتئینی.
•اضافه کردن بافر متوقف کننده به مدت 15 دقیقه.
•شستشوی ژل در آب مقطر.

2-7 روشهای اختصاصی
2-7-1 سنتز ژن gcsf
توالی cDNA کد کننده پروتئین GCSF به طول bp 615 از بانک ژنومی (شماره 172219.1) استخراج و به منظور سنتز به یکی از شرکتهای فعال در این زمینه سفارش داده شد. این توالی به منظور بیان در سلولهای مخمری از نظر کدونهای مورد استفاده در سنتز پروتئین، بهینه سازی شده و پس از بررسی های نهایی از نظر جایگاه های برش آنزیم های محدودالأثر، ساخته شده و در وکتور کلونینگ pGH کلون گردید. در دو انتهای این ژن، دو جایگاه برش آنزیمی برای آنزیمهای محدودالأثر HpaI و BamHI در نظر گرفته شد تا برای جدا نمودن این قطعه و کلون کردن آن در وکتور بیانی مخمر استفاده شوند. لازم به ذکر است که جایگاه برش این آنزیم ها بر روی قطعه ژنی سنتز شده، وکتور pGH و وکتور بیانی هانسونلا وجود ندارد.
2-7-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
2-7-1-1-1 طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf


به منظور انجام PCR بر روی ژن gcsf در وکتورهای بدست آمده در مراحل مختلف، پرایمرهای اختصاصی این ژن با استفاده از برنامه genrunnr سنتز گردید (جدول 2-2).

پرایمر F 'gtagatcttgcggatccccc-3-'5
پرایمر R 'gtagatcttggtctccagcttgc-3-'5
جدول 2-2: توالی پرایمرهای ژن gcsf
2-7-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
با انجام گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها به منظور بهینه سازی شرایط این واکنش مشخص گردید. این واکنش بر اساس مواد ذکر شده در جدول2-3 و بر طبق برنامه مندرج در جدول 2-4 انجام شد.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-3 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش gcsf PCR
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-4 برنامه PCR گرادیان مربوط به ژن gcsf

2-7-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
به منظور کلون نمودن قطعه ژنی gcsf، این قطعه با برش آنزیمی از وکتور کلونینگ حامل قطعه (pGH-gcsf) جدا شده و در وکتور بیانی برش خورده با همان آنزیمها وارد گردید.
2-7-2-1 هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
با توجه به جایگاههای برشی که در دو انتهای این قطعه (ژن gcsf) در نظر گرفته شد (جایگاه برش BamHI در انتهای ´5 و جایگاه‌ برش HpaI در انتهای ´۳)، این قطعه از وکتور مورد نظر (pGH-gcsf) بر اساس واکنش مندرج در جدول 2-5 در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 5 ساعت مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-5 واکنش هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
2-7-2-2 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan
وکتور pHan نیز با آنزیمهای BamHI و HpaI بر طبق جدول 2-6 مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-6 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan
2-7-2-3 کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan
واکنش لیگاسیون قطعات هضم و تخلیص شده پس از تعیین غلظت، بر طبق واکنش مندرج در جدول 2-7 انجام گرفت. تیوب ها به مدت 16 ساعت در یخچال قرار گرفته و پس از آماده سازی سلولهای مستعد از E. coli TOP10F'، به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های حاوی آمپی سیلین و تتراسایکلین کشت داده شدند.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan خطی شده (ng/µl100) 1 1
قطعه gcsf (ng/µl15) 16 -
بافر T4 DNA ligase (10X) 2 2
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 17
جدول 2-7 واکنش لیگاسیون ژن gcsf در وکتور بیانی pHan

کلنی های ظاهر شده بر روی پلیت ها، به صورت ماتریکس کشت داده شده و به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند.
2-7-2-4 بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf
•بررسی کلون ها به روش سریع
مقداری از هر کلنی بر اساس پروتوکل موجود (2-6-6) آماده سازی شده و بر روی ژل آگارز برده شد. وکتورهای سنگین تر از وکتور بیانی pHan (بدون ژن الحاقی)، به عنوان وکتورهای مشکوک گزارش گردید.
•استخراج پلاسمید در مقیاس کم
از کلنی هایی که gcsf PCR آنها مثبت گردید، بر اساس پروتوکل2-6-8 به لوله های ml5 حاوی محیط LB مایع کشت داده و پس از گرماگذاری در °C37 به مدت 16 ساعت، استخراج پلاسمید در مقیاس کم انجام گردید.
•gcsf PCR بر روی پلاسمیدهای استخراج شده pHan-gcsf
پلاسمیدهای استخراج شده در واکنش PCR ژن gcsf بر اساس پروتوکل 2-7-1-1 وارد شده و محصول PCR بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
•هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf
پلاسمید تأیید شده در مراحل قبل، مورد هضم آنزیمی با آنزیم های محدودالأثر BamHI، EcoRI و HpaI بر طبق جدول2-8 قرار گرفته و پس از گرماگذاری در C °37 به مدت 3 ساعت، محصول واکنشها بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 2
بافر آنزیمی (10X) 2
آنزیم محدودالأثر (units/µl10) 75/0
آب دیونیزه 25/15
جدول 2-8 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf
•استخراج پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf در مقیاس زیاد
پلاسمید تأیید شده با تست های فوق، بر اساس پروتوکل های2-6-9 منظور استفاده در مراحل بعدی، به مقیاس انبوه استخراج گردید.
2-7-3 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-3-1 PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)
در این تحقیق، به منظور غربالگری کلونهای هانسونلا بر آن شدیم تا ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble) را در وکتور بیانی pHan که حاوی ژن gcsf می باشد کلون نماییم. برای این منظور، توالی این ژن در وکتور pPICZα (Invitrogen, USA) موجود در بخش بیوتکنولوژی بررسی گردید و پرایمرهای لازم جهت تکثیر این ژن طراحی گردید (جدول 2-9) و جهت سنتز سفارش داده شد. پس از دریافت پرایمرها، دمای بهینه برای تکثیر این ژن، به روش PCR گرادیان، در محدوده 65-50 درجه سانتی گراد (جدول2-10) بر طبق جدول 2-11 انجام شد.
پرایمر F 5'-gtagatcttgcggatccccc-3'
پرایمر R 5'-gtagatcttggtctccagcttgc-3'
جدول 2-9 پرایمرهای طراحی شده جهت تکثیر ژن zeocin
تعداد چرخه مدت زمان (دقیقه) دما (°C)
واسرشتی اولیه 1 '5 ˚94
واسرشتی
اتصال پرایمرها
طویل شدن 35 '1
"30
"30 ˚94
60-50
˚72
طویل شدن نهایی 1 '5 ˚72
جدول 2-10 برنامه PCR گرادیان ژن zeocin
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (پلاسمید pPICZα) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-11 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش zeocin PCR
2-7-3-2 کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy
قطعه تکثیر شده zeocin با استفاده از کیت از ژل آگارز بر اساس پروتوکل 2-6-2 استخراج شده و پس از تعیین غلظت،واکنش لیگاسیون آن در وکتور کلونینگ pGEM بر طبق جدول 2-12 صورت گرفت.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pGEM-T Easy خطی (ng/µl50) 1 1
ژن zeocin (ng/µl50) 2 -
بافر T4 DNA ligase (X4) 5 5
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه 11 13
جدول 2-12 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور pGEM-T Easy

واکنشهای فوق به صورت ON در دمایC ˚4 قرار داده شدند و پس از تهیه سلولهای مستعد از سلولهای ' E. coli TOP10F ، به این سلول ها منتقل شده و بر روی محیط LB آگار با غلظت پایین NaCl (پیوست 1) و حاوی زئوسین، تتراسایکلین، IPTG و X-gal (پیوست 5) کشت داده شد. پس از گرماگذاری در 37 درجه به مدت 16 ساعت، کلنی های سفید تشکیل شده، بر روی پلیت ماتریکس حاوی ترکیبات فوق کشت داده شدند.
2-7-3-3 بررسی کلونهای نوترکیب pGEM-Zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
70% هر یک از کلنی های سفید به روش quick check (پروتوکل 2-6-6) مورد بررسی قرار گرفت.
•استخراج پلاسمید pGEM-Zeo در مقیاس کم
از کلون نوترکیب تأیید شده با دو روش قبل، استخراج پلاسمید در مقیاس کم (2-6-8) انجام گردید.
•هضم آنزیمی وکتور pGEM-Zeo
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده از مراحل قبل با آنزیم BglII به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد بر اساس جدول 2-13 صورت گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pGEM-Zeo 2
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/15
جدول 2-13 واکنش هضم آنزیمی pGEM-Zeo با BglII
2-7-4 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-4-1 هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo
برای کلون نمودن قطعه ژنی مقاومت به زئوسین در وکتور pHan-gcsf، این دو وکتور با آنزیم BglII که جایگاه برش آن در دو انتهای قطعه ژنی زئوسین و نیز بر روی وکتور pHan-gcsf در نظر گرفته شده بود، مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند (جدول 2-14).
مواد مقدار (µl)
پلاسمید 20
بافر آنزیمی (X10) 20
BglII (units/µl10) 5
آب دیونیزه 155
جدول 2-14 واکنش هضم آنزیمی pGEM-zeo و pHan-gcsf با BglII
وکتور pHan-gcsf هضم و تخلیص شده، بر اساس جدول 2-15 به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی گراد تحت تیمار با آلکالین فسفاتاز قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 60
بافر آنزیمی (X10) 8
آنزیم آلکالین فسفاتاز (units/µl10) 2
آب دیونیزه -
جدول 2-15 تیمار وکتور هضم شده pHan-gcsf با آلکالین فسفاتاز
2-7-4-2 کلون نمودن قطعه ژنی zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
پس از هضم آنزیمی، قطعه مورد نظر (ژن مقاومت به زئوسین، حدوداً bp1100( از روی ژل جدا شده و پس از تخلیص با کیت، بر طبق واکنشهای لیگاسیون جدول 2-16 در درون وکتور بیانی pHan-gcsf تیمار شده با آلکالین فسفاتاز کلون گردید.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan-gcsf خطی شده (ng/µl100) 5/1 5/1
قطعه zeocin (ng/µl15) 25 -
بافر T4 DNA ligase (X2) 3 3
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 5/24
جدول 2-16 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
واکنش‌های فوق به صورتON در دمای C˚4 قرار داده شدند و روز بعد پس از تهیه سلولهای مستعد از E. coli TOP10F' به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های LB آگار با غلظت پایین NaCl و حاوی زئوسین با غلظت µg/ml25 کشت داده شدند. پس از گذشت 16 ساعت در دمای C˚37، از کلنی های رشد یافته، پلیت ماتریکس تهیه گردید.
2-7-4-3 بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
کلونهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی زئوسین به منظور بررسی الحاق قطعه ژنی مقاومت به زئوسین بر روی ژل آگارز برده شدند.
•بررسی کلونها به روش Colony-PCR
کلونهایی که با روش سریع سنگینتر تشخیص داده شدند، برای انجام PCR اختصاصی ژن زئوسین مورد استفاده قرار گرفتند.
•برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
به منظور تأیید نهایی وکتور نوترکیب فوق، با توجه به سایت‌های برشی موجود، وکتور بر اساس جدول 2-17 با آنزیم BglII برش داده شد. مخلوط این واکنش به مدت 3 ساعت در دمای C˚37 گرماگذاری شد و سپس بر روی ژل 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 3
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/14
جدول 2-17 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با BglII
2-7-5 انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا
2-7-5-1 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin
پس از اطمینان از قرار گرفتن ژنهای مورد نظر در پلاسمید هانسونلا، انتقال این پلاسمید به درون میزبان مخمری (هانسونلا پلی مورفا) با روش الکتروپوریشن صورت گرفت. برای این منظور، به مولکول DNA خطی شده با غلظت بالا نیاز می باشد. برای تهیه DNA خطی، وکتور نوترکیب تأیید شده در مراحل قبل با آنزیم EcoRI بر طبق جدول 2-18 مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و پس از استخراج از ژل، در پروسه الکتروپوریشن مورد استفاده قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 15
بافر آنزیمی (X1) 20
EcoRI (units/µl10) 5
آب دیونیزه 160
جدول 2-18 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با EcoRI
2-7-5-2 الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا
1.ابتدا میزان مناسبی از کلنی تازه رشد یافته مخمر را به درون ml200 محیط کشت مایع YPD تلقیح نموده و محیط را بر روی شیکر در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری میکنیم تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر (OD600nm) به 2/1-8/0 برسد.
2.محیط کشت فوق را در rpm5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نموده و به میزان 2/0 برابر، بافر فسفات پتاسیم mM50 ولرم (C°37( با 5/7pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهایی mM25 به آن اضافه نمایید.
3.سلولها را به مدت 15 دقیقه در دمای C°37 قرار می دهیم.
4.سلول ها را با سانتریفوژ در rpm5000 به مدت 5 دقیقه جمع آوری نموده و دو بار با بافر STM (پیوست 7) درحالیکه سلولها بر روی یخ قرار دارند شستشو می دهیم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اولیه).
5.رسوب سلولی نهایی را در 005/0 حجم اولیه از بافر STM حل کرده و این سوسپانسیون سلولی مستعد را در حجم های کم در دمای C°70- نگهداری میکنیم.
6.به منظور ترانسفورم نمودن سلولهای مستعد، سوسپانسیون های سلولی (حجم µl60) را بر روی یخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطی شده را به آن اضافه میکنیم.
7.سپس سلولها به کووت الکتروپوریشن 2 میلی متری سرد منتقل می شوند.
8.بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوریشن قرار داده و به آن پالسی با مشخصات 2 کیلوولت، 25 میکروفاراد و 200 اهم وارد مینماییم.
9.بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محیط کشت YPD به تیوب حاوی سلولها اضافه کرده و به مدت 1ساعت در دمای °C 37 در شیکر انکوباتور قرار می دهیم.
10.محیط را سانتریفوژ نموده (rpm5000, 5دقیقه( و سلولها را بر روی محیط کشت YPD جامد حاوی زئوسین با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت 5-3 روز در دمای °C37 قرار میدهیم.
11.سلولهای رشد یافته در غلظت بالای زئوسین (µg/ml400)، به صورت ماتریکس بر روی پلیت حاوی 800 و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.
12.پس از گذشت مدت زمان لازم (3 روز) از کلونهای رشد یافته برای انجام PCR اختصاصی ژنهای کلون شده در وکتور بیانی استفاده گردید.
2-7-5-3 تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین
PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلونهای نوترکیب رشد یافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل 2-7-3-1 و جدول 2-13 انجام گردید.
2-7-6 بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
2-7-6-1 کشت سلولهای مخمری
1.سلول مخمری تأیید شده با PCR ژن زئوسین و نیز سلول مخمری فاقد پلاسمید در ml5 محیط کشت BMGY (پیوست 1) کشت داده شده و بر روی شیکر در دمای С °30 با دور rpm200 قرار داده شد تا OD600 محیط به 6-2 برسد (حدود 18-16 ساعت).
2.محیط کشت فوق را در g3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نمودیم.
3.رسوب سلولی را در 30 میلی لیتر محیط BMMY (پیوست 1)، اختصاصی جهت بیان پروتئین های نوترکیب با اتانول حل نموده و مجدداً برای ادامه رشد در انکوباتور قرار دادیم.
4.پس از گذشت 24 ساعت، از متانول 100% به غلظت نهایی 5/0% به محیط اضافه نمودیم تا بیان پروتئین القاء گردد.
5.پس از گذشت مدت زمان 96 ساعت از شروع کشت، محیط بیانی را در دور rpm6000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوز مینماییم.
6.محلول رویی را به تیوب جدید منتقل نموده و پس از اندازه گیری غلظت پروتئینی در 280 نانومتر، اقدام به تغلیظ این محلول به منظور بررسی با SDS-PAGE می نماییم.
7.محلول فوق را با عبور از فیلترهای Centriprep YM50 بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده تغلیظ می نماییم.
2-7-6-2 بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE
•ژل SDS-PAGE 15% بر اساس روش ذکر شده در بخش2-6-10 تهیه گردید.
•پس از انجام الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل، میزان بیان پروتئین نوترکیب با روش کوماسی بلو بر اساس شدت باند حاصله مورد بررسی قرار گرفت.
2-7-7 تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش
تولید آنتی بادی پلی کلونال به روشهایی برای معرفی یک ایمونوژن به حیوان و خونگیری برای سنجش میزان آنتی بادی نیاز دارد. انتخاب حیوان بستگی به امکانات موجود در نگهداری حیوان، میزان آنتی سرم مورد نیاز و میزان ایمونوژن موجود، دارد. پاسخ ایمنی بهتر، عموماً زمانی بدست می آید که از یک ادجوان مناسب در اولین ایمنی زایی استفاده گردد. برای این منظور، ایمونوژن بصورت یک امولسیون آب و روغن آماده می شود که حاوی میکوباکتریوم کشته شده با حرارت می باشد که تحت عنوان آدجوان کامل فروند معرفی می گردد. استفاده از این امولسیون فرد را مطمئن می کند که آنتی ژن به آرامی در جریان خون حیوان آزاد می شود و از طرفی باکتریهای کشته شده میکوباکتریوم، سیستم ایمنی حیوان را تحریک می کنند. ایمن سازی های بعدی، برای افزایش سطح آنتی بادی لازم اند و در بافر فسفات سالین (PBS) یا در امولسیون روغنی (ادجوان ناقص فروند ) مصرف می شوند (Johnstone, 1996).
روشهای مختلفی برای تزریق ایمونوژن وجود دارد (Johnstone, 1996) که عبارتند از :
1)درون ماهیچه ای (i.m=Intra muscular)
2)درون رگی (i.v = Intra venous)
3)درون پوستی (i.d = Intra dermal)
4)درون صفاقی (i.p = Intra peritoneal)
5)زیر پوستی (s.c = Sub cutaneous)
ایمن سازی درون پوستی یک روش مؤثر در ایجاد پاسخ اولیه است. روشهای i.m و i.d و یا s.c بهتر است در چندین محل مختلف صورت گیرند.
در مورد خرگوشها، در اولین ایمن سازی به μg200-50 پروتئین در FCA نیاز است که باید به صورت درون پوستی به 8-6 جای مختلف از پشت حیوان تزریق گردد. تزریقهای بعدی با فاصله 28 روز یا بیشتر، با 200-50 میکروگرم پروتئین آماده شده در PBS یا FIA به فرم i.m یا i.v یا s.c صورت می گیرد (Johnstone, 1996).
1) اولین تزریق:
•براساس غلظت نمونه پروتئینی مورد نظر (پروتئین GCSF نوترکیب موجود در بازار دارویی (ساخت شرکت پویش دارو)، l85 از ویال (200 میکروگرم) را برداشته و با l415 از PBS استریل مخلوط کرده و آن را با μl500 ادجوان کامل فروند مخلوط کرده و با emulsifier آنقدر این دو ماده را مخلوط کردیم تا شیری رنگ و سفت شد.
•قبل از اولین تزریق،ml 1 خون از حیوان گرفته شد تا به عنوان کنترل منفی (قبل از تزریق) از آن استفاده شود.
•این نمونه در rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید و سرم از گلبول های قرمز جدا گردید. سرم را در تیوب جدید ریخته و در 20- درجه سانتیگراد نگهداشتیم.
•محلول آماده شده از آنتی ژن در FCA به 8 جای مختلف از پشت خرگوش به صورت درون پوستی تزریق گردید.
2) دومین تزریق:
•سی روز پس از اولین تزریق، دومین تزریق به خرگوش باμl 85 از نمونه پروتئینی (200 میکروگرم) در μl415 PBS استریل با μl 500 ادجوان ناقص فروند مجدداً به صورت درون پوستی صورت گرفت.
•30 روز بعد، ml1 خون از حیوان گرفته شد تا از نظر ایمنی زایی تزریقهای فوق با روش ایمونوبلاتینگ، مورد بررسی قرار بگیرد.
2-7-8 ایمونوبلاتینگ
برای شناسایی پروتئین های اختصاصی از طریق آنتی بادی های پلی کلونال یا مونو کلونال، از لکه گذاری ایمنی استفاده می شود. در روش لکه گذاری ایمنی نمونه های پروتئینی در حضور ماده SDS و عوامل احیاء کننده (مانند 2- مرکاپتواتانول) الکتروفورز شده و سپس از روی ژل به غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی منتقل می گردند و با استفاده از آنتی بادی های نشاندار شده شناسایی می شوند. برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء از روش هایی مانند روش تانک و یا روش نیمه خشک استفاده می شود. در روش انتقال با تانک، از بافر حاوی تریس -گلایسین و متانول استفاده می شود که متانول علاوه بر اینکه از تورم ژل جلوگیری می کند، باعث جدا شدن SDS از پروتئین ها شده و بازده اتصال پروتئین به غشاء را افزایش می دهد. در روش انتقال نیمه خشک، ساندویچ انتقال پس از خیس شدن در بافر انتقال، بین دو الکترود بزرگ گرانیتی قرار گرفته و عمل انتقال انجام می گیرد (Sambrook, 2001).
در اینجا روش انتقال با روش نیمه خشک توضیح داده می شود.
مواد لازم
-غشاء نیتروسلولز با منافذ 45/0 میکرومتری
-کاغذ واتمن
-بافر انتقال (شامل تریس بازی، گلایسین، متانول و آب مقطر می باشد، پیوست 8).
-دستگاه Semidry
-رنگ پانسوS
روش انجام کار
•نمونه پروتئینی در مجاورت مارکر پروتئینی با روش SDS-PAGE، الکتروفورز شد.
•به مدت 30 دقیقه ژل در بافر انتقال قرار داده شد تا از تغییر حجم ژل در هنگام انتقال جلوگیری شود.
•غشای نیترو سلولزی را به اندازه ژل برش زده و در بافر انتقال قرار می دهیم.
•چندین لایه کاغذ واتمن (هم اندازه با ژل) را در ظرف حاوی بافر انتقال، مرطوب کرده و سپس کاغذ ها روی صفحه گرانیتی دستگاه بلاتینگ با سیستم نیمه خشک گذاشته شد ( با غلتاندن یک میله شیشه ای حباب های احتمالی بین کاغذها خارج گردید).
•غشای نیترو سلولز خیس شده به آرامی به گونه ای که حبابی تشکیل نگردد بر روی کاغذ های واتمن قرار داده شد. سپس ژل مورد نظر را را به گونه ای که حباب تشکیل نگردد به آرامی روی کاغذ قرار دادیم.
•مجدداً چند لایه کاغذ واتمن خیس شده در بافر انتقال، روی ژل قرار داده شد و با غلتاندن میله شیشه ای، حباب های احتمالی را خارج نمودیم.
•درب دستگاه را بسته و دستگاه را به جریان برق متصل نمودیم و با توجه به اندازه پروتئین، ولتاژ ثابت و زمان انتقال دستگاه تنظیم شد.
•پس از اتمام زمان انتقال، کاغذ نیتروسلولز با رنگ پانسوS رنگ آمیزی شد تا باندهای پروتئینی ظاهر گردند. از طرفی باندهای مارکر پروتئینی نیز علامت گذاری گردیدند. سپس غشاء با آب مقطر شسته شد تا رنگ پانسوS آن از بین برود.
•غشاء نیتروسلولز به مدت 1 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر در بافر بلوکه کننده قرار گرفت. سپس به مدت 16 ساعت در 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
نکته: به منظور بلوکه کردن غشاء در نواحی که فاقد پروتئین است می توان از شیر خشک بدون چربی و یا آلبومین سرم گاوی (BSA) محلول در بافر PBS دارای توئین20 استفاده کرد.
•آنتی بادی اولیه، سرم خرگوشی رقیق شده به نسبت 1 به 500 در PBS بود. این آنتی بادی به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•غشاء 5 بار 10 دقیقه ای در TTBS بر روی شیکر شسته شد.
•آنتی بادی دوم، Goat anti Rabbit IgG کونژوگه با HRP بود که به نسبت 1 به 1000 در PBS رقیق شده بود. این آنتی بادی به مدت 1 ساعت بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•بعد از اتمام زمان انکوباسیون در آنتی بادی ثانویه، کاغذ پنج بار 10 دقیقه ای با PBS حاوی 05/0% توئین 20 شستشو داده شد.
•کاغذ به مدت 10 دقیقه با بافر PBS بدون توئین شستشو داده شد.
•کاغذ نیتروسلولز در محلول سوبسترای آنزیم نشاندار (DAB) گذاشته شد تا باندهای مورد نظر نمایان گردند.
•پس از نمایان شدن باندها، کاغذ با آب مقطر چند بار شستشو داده شد و سپس کاغذ را خشک کرده و در جای تاریک نگهداری گردید.
فصل سوم نتایج
3-1 سنتز ژن gcsf
cDNA کد کننده پروتئین GCSF پس از بهینه سازی کدونها برای بیان در سلول مخمری به یکی از شرکت های مرتبط سفارش داده شد و توالی سنتز شده در وکتور کلونینگ pGH به گروه تحویل داده شد (شکل 3-1).

شکل 3-1 طرح شماتیک وکتور کلونینگ حاوی ژن gcsf
3-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
3-1-1-1طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
با توجه به این که جایگاه برش آنزیم‌های BamHΙ و HpaI در توالی ژن هدف، gcsf، و نیز وکتور بیانی طراحی شده وجود ندارد، این دو جایگاه بر روی توالی پرایمرهای F و R تعبیه شدند. طراحی پرایمرها با بررسی نکات کلیدی در زمینه عدم تشکیل فرم سنجاق سری ، دایمرهای پرایمری و سایر ساختارهای ثانویه با استفاده از نرم‌افزار genrunnr انجام شد. نتایج حاصل از بررسی پرایمرها در این نرم‌افزار در شکل‌های 3-2 الف و ب آورده شده است.

(الف) (ب)
شکل3-2 بررسی توالی پرایمرهای F (الف) و R (ب) ژن gcsf.
3-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها و تکثیر ژن gcsf را 60 درجه سانتی گراد نشان داد (شکل 3-3).
17856203187708 7 6 5 4 3 2 1
008 7 6 5 4 3 2 1

شکل 3-3 PCR گرادیان ژن مقاومت به gcsf
چاهک 7-1: محصول PCR در دماهای 50 تا 60 درجه سانتی گراد
چاهک 5: مارکر DNA (kb1)
چاهک 8: کنترل منفی PCR
3-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
3-2-1 هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan
به دنبال هضم آنزیمی این وکتورها با آنزیمهای BamHI و HpaI، در مورد وکتور کلونینگ، بر روی ژل آگارز قطعه ژنی gcsf به طول تقریبی bp615 و وکتور کلونینگ pGH به طول تقریبی bp2900 مشاهده شد در حالیکه در مورد وکتور بیانی، وکتور خطی شده ای به طول حدوداً 6500 نوکلئوتید بر روی ژل ظاهر گردید (شکل 3-4).
191262065405 5 4 3 2 1
00 5 4 3 2 1

شکل 3-4 هضم آنزیمی وکتورهای pGH-gcsf و pHan با آنزیم های HpaI و BamHI
چاهک 1: مارکر DNA (kb1)
چاهک 2: وکتور هضم نشده pGH-gcsf
چاهک 3: وکتورpGH-gcsf هضم شده با HpaI و BamHI (ژن gcsf به طول bp615)

–142

فصل دوم:مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1 نقش ALCAM در درمان سرطان..................................................................................................................................20
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1 مواد مورد استفاده...............................................................................................................................................................23
3-1-1 باکتری مورد استفاده .....................................................................................................................................................23
3-1-2 پلاسمید ........................................................................................................................................................................23
3-1-3 انزیم ها .........................................................................................................................................................................23
3-1-4 کیت های ازمایشگاهی. ................................................................................................................................................24
3-1-5 انتی بیوتیک ها. .............................................................................................................................................................24
3-1-6 محیط کشت باکتری .....................................................................................................................................................25
3-1-7 ژل الکتروفورز...............................................................................................................................................................25
3-1-8 مواد شیمیایی. ................................................................................................................................................................25
3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی ...................................................................................................................................25
3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئین ALCAM. .......................................................................................................29
3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM ............................................................................................................29
3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization ........................................................................................................................29
3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAM .............................................................................................................29
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب ...............................................................................................................................................29
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده ....................................................................................................................30
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه...........................................................................................................................................30
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM ......................................................30
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته............................................................................................................................................30
3-4-1-1 مواد و محلول ها.......................................................................................................................................................30
3-4-1-2 روش کار..................................................................................................................................................................30
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli.. ..........................................................................31
3-4-2-1 روش کار.................................................................................................................................................................31
3-4-3 ارزیابی کلونی ها...........................................................................................................................................................32
3-4-4 استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه C2................................................................................33
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده.............................................................................................................................35
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion........................................................................................................35
3-4-5-2 الکتروفورز................................................................................................................................................................35
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM.............................................................................................................37
3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2 از ژل..................................................................................................................................37
3-5-2 لایگیشن.........................................................................................................................................................................38
3-5-3 ترانسفورماسیون.............................................................................................................................................................39
3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته.................................................................................................................................39
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن................................................40
3-5-4 ارزیابی کلونی ها...........................................................................................................................................................40
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM..............................................................41
3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده.............................................................................................................................42
3-6 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM................................................................................................................................43
3-6-1 القاء بیان پروتئین...........................................................................................................................................................43
3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page...................................................................................................................43
3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها.............................................................................................................................44
3-6-2-2 Run کردن نمونه ها...............................................................................................................................................45
3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی................................................................................................................45
فصل چهارم:نتایج
4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی ...........................................................................................................................................47
................................................................................................................50..........................C2ناحیهDNA4-2 سنتز شیمیایی
4-3کلونینگ پلاسمید AMP+ -pBSK حاویDNA ناحیهC2.................................................................................................52
4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2.................................................................................................................................................54
4-5بیان پروتئینC2 و تایید آن به کمک تکنیک SDS_page........................................................................................................57
فصل پنجم:
بحث...................................................................................................................................................................................................59
نتیجه گیری.........................................................................................................................................................................................69
منابع....................................................................................................................................................................................................71
چکیده انگلیسی...........................................................................................................................................................................................74
فهرست شکل ها:
شکل 1-1 تصویر بخش های مختلف روده بزرگ.....................................................................................................................5
شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده.............................................................................................................6
شکل1-3 درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال .....................................................................................................7
شکل1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال.................................................................................................................12
شکل1-5 نقشه ژنتیکی پروتئین ALCAM............................................................................................................................15
شکل1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری...............................................................................17
شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a.....................................................................................................................................24
شکل3-2 دستگاه انکوباتور......................................................................................................................................................25
شکل3-3 دستگاه اتوکلاو.........................................................................................................................................................26
شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژو تانک الکتروفورز.......................................................................................................................26
شکل3-5 شیکر انکی باتور.......................................................................................................................................................27
شکل3-6 سانتریفیوژ.................................................................................................................................................................27
شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل.............................................................................................................................................27
شکل3-8 ترموسایکلر...............................................................................................................................................................28
شکل3-9 بن ماری ..................................................................................................................................................................28
شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید..........................................................................................................................................33
شکل3-11 کیت استخراج DNA از ژل فرمانتاز.....................................................................................................................37
شکل4-1 شاخص سازی کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی.........................................48
شکل4-2 میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی سمت راست:بعد از بهینه سازی ..........................48
شکل4-3 شاخص سازی محتوای G-C سمت راست:قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی.............................49
شکل4-4ترادف ناحیهC2 مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli...........................49
شکل4-5 مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.......................................................50
شکل4-6 تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی......................................................................................................51
شکل4-7 نقشه ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2 پروتئینALCAM...........................................................................53
شکل4-8 تائید حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 در محصول استخراج پلاسمید.............................................................53
شکل4-9 هضم دوگانه آنزیمی پلاسمید تکثیر یافتهPBSK....................................................................................................54
شکل4-10 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a..................................................................................................................................55
شکل4-11 باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با Pet28a حاوی ژن ناحیه C2....................................................55
شکل4-12 تائید حضور پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) ......................56
شکل4-13 نتیجه حاصلهاز هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2......................................................57
شکل4-14 بررسی بیان پروتئین ناحیه C2 به کمک تکنیک SDS-Page...................................................................58
چکیده:
همه سرطان ها از سلول ها شروع می شوند به طور طبیعی‌، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می کنند و تقسیم می شوند. سلول های جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.
سرطان کولورکتال یکی از شایع ترین سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد که میزان ابتلا به آن حدود 6/0 می باشد که منجر به مرگ600 هزار نفر در سال می گردد. .CD166 به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی و معرفی شده است.که با توجه به بیان آن بر سطح سلول های سرطان کولورکتال در مراحل مختلف بیماری می توان از آن جهت کارهای درمانی و تشخیصی استفاده نمود.
ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند.ALCAM معمولا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد که بر اهمیت ان در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.در این مطالعه ما ابتدا سعی بر آن داشتیم توالی مورد نظر را از بانک های اطلاعاتی ژنی استخراج نماییم و سپس از طریق آنالیز بیوانفورماتیکی توالی مورد نظر را از نظر بهترین بیان در میزبان باکتریایی آماده نماییم.ژن مورد نظر از طریق شیمیایی سنتز شده و سپس با استفاده از فرایند کلونینگ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال داده و تکثیرنموده. در انتها نیز بیان ناحی C2در باکتری های نوترکیب با القاگر مناسب القا می نماییم و وجود پروتئین مورد نظر را به کمک تکنیک SDS-page مورد بررسی قرار می دهیم.
ناحیه C2 می تواند به مانند پروتئین اصلی خاصیت ایمنی زائی داشته باشد. این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین مورد نظر را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت نمود.
واژه های کلیدی:
سرطان کولورکتال، ALCAM، ناحیه C2 پروتئینALCAM ،کلونینگ
فصل اول
مقدمه
1-1سرطان چیست
اصطلاح سرطان به تومورهای اطلاق می شود که می توانند به بافت های مجاور خود که از سلولهای سالم تشکیل میشوند حمله کنند توانایی مجاورت و هجوم سلول های توموری عامل طبقه بندی تومورها به دو دسته خوش خیم و بدخیم است اگر یک تومور بدخیم به یک رگ خونی یا لنفی برسد می تواند متاستاز دهد ودر بافت های دیگری رشد کند. نئوپلاسم(که معنی آن رشد جدید است) شکل غیر طبیعی رشد سلولها است و تومور، نئپلاسمی است که با وضعیت بیمار گونه همراه است، تومور ها بیماری هایی هستند که در آنها جمعیتی از سلول های، که به لحاظ ژنتیکی هم خانواده هستند توانایی رشد نا به هنجار را کسب می کنند(نخعی سیستانی وهمکاران 1389). همه سرطان ها از سلول ها شروع می شوند که واحد سازنده بدن و اساس زندگی محسوب می شوند. سلول ها بافت را می سازند و بافت های بدن، اندام ها را تشکیل می دهند. به طور طبیعی‌، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می کنند و تقسیم می شوند. سلول های پیر می میرند وسلول های جدید جای آنها را می گیرند. گاهی نظم مراحل رشد به هم می خورد. سلول های جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.
تومورها خوش خیم یا بد خیم می باشند.
تومورهای خوش خیم سرطانی نیستند.
این نوع تومورها به ندرت زندگی فرد را تهدید می کنند.
بیشتر تومورهای خوش خیم قابل جراحی بوده و معمولا عود نمی کنند.
تومورهای خوش خیم، به بافت های اطراف و سایر قسمت های بدن گسترش نمی یابند.
تومورهای بدخیم سرطانی هستند.
عموما این تومورها بسیار خطرناک تر از تومورهای خوش خیم بوده و زندگی فرد را تهدید می کنند.
تومورهای بدخیم قابل جراحی بوده ولی در مواردی بعد از عمل جراحی مجددا عود می کنند.
تومورهای بدخیم انتشار یافته و به بافت ها و اعضای مجاور، آسیب می رسانند.
سلول های سرطانی از بافت توموری جدا شده و با وارد شدن در جریان خون یا سیستم لنفاوی، تومورهای جدیدی درسایراعضاء بدن تشکیل می دهند. گسترش و انتشار سلول های سرطانی به سایر بافت های بدن را متاستاز می نامند.
زمانی که سرطان از بافت اصلی به سایر قسمت های بدن گسترش پیدا می کند، تومور جدید شبیه همان نوع سلول های غیر طبیعی تومور اولیه بوده و به همان اسم تومور اولیه خوانده می شود. برای مثال اگر سرطان کولورکتال به کبد متاستاز دهد سلول های سرطانی کبد همان سلول های سرطانی کولورکتال بوده و بیماری سرطان متاستاتیک کولورکتال نامیده شده و همانند سرطان کولورکتال، درمان می شود (کاظمی اسکندانی 1388).
دانش کنونی از مکانیسم های سرطان پیشنهاد کننده این مطلب است که علت ایجاد همهی سرطان ها ناشی از هر دو عامل محیطی و ژنتیکی است(clapp et at 2005).
عوامل ژنتیکی، هورمونی و ویروسی روی سرطان تاثیر می گذارند باقی ماندن تغییراتی مانند آسیب بافتی، تغییرات ژنتیکی و اپیژنتیک(مثل جهش،از دست دادن هتروزیگوسیتی و متیلاسیون پروموتور)و تغییرات ترانسکریپتوم(مثل التهاب و مسیر های آپاپتوز) در دراز مدت منجر به فعال شدن مسیر ها و عملکرد های سلولی نابجا گشته و در نهایت منجر به تغییرات پیش سرطانی می گردد(Roy et el 2008).
انکوژن ها کد کننده پروتئین های هستند که کنترل کنندهی تقسیم سلولی، آپاپتوز و یا هر دوی آنها هستند. آنها می توانند به وسیله تغییرات ساختمانی، که حاصل جهش یا اتصال ژن ها توسط کنار هم نشینی عناصر تحریک کننده و یا به وسیله تحریک فعال شوند. جا به جای و جهش می تواند به عنوان وقایع اولیه یا در طی پیشرفت تومور اتفاق بیفتد در حالی که تکثیر معمولا در طی پیشرفت اتفاق می افتد هنگامی که یک
انکوژن توسط جهش فعال می شود ساختار پروتئین کد شده توسط آن در مسیر افزایش فعالیت تغییر می کند(croce2008).
جهش های که پروتوانکوژن ها را به انکوژن ها تبدیل می کند شامل:تغییرات تک نوکلئوتیدی،تکثیر یا ازدیاد ژنی، ترکیب ژنی و سایر بازآرایی های کروموزومی است که فعالیت پروتئین های ساخته شده توسط پروتوانکوژن ها را افزایش می دهند. جهش های تغییر دهنده قالب، جهش های بی معنی و جهش هایی که در جایگاه پردازش روی می دهند عموما موجب فعال شدن انکوژن ها نمی شوند(Thomas et al 2007).
سرطان بوسیلهی تغییر در انکوژن ها، ژن های سرکوب گر تومور و ژن های microRNA ایجاد می شود
یک تغییر ژنتیکی به ندرت برای توسعه یک تومور بدخیم کافی است. بیشتر شواهد به یک فرآیند چند مرحله ای از تغییرات پی در پی در انکوژن های مختلف، ژن های سرکوب گر تومور یا ژن های microRNA در سلول های سرطانی اشاره دارند(croce 2008).
انکوژن ها شکل جهش یافتهی یک ژن طبیعی سلولی به نام پروتوانکوژن ها است که در گسترش سرطان شرکت می کند انکوژن های که اغلب در رشد و گسترش سرطان های انسانی شرکت دارند به وسیلهی ویروس ها منتقل نمی شوند بلکه در نتیجه جهش های سوماتیک در پروتوانکوژن ها ایجاد می گردند (نخعی سیستانی و همکاران1389). پروتئین های حاصل از پروتوانکوژن ها در شرایط عادی عملکرد حیاتی در پیام رسانی سلول، رشد و تمایز بر عهده دارند اما بیان غیر طبیعی آنها قادر به القای تومور زایی است(pappou 2010).
یک ژن سرکوب کننده تومور نوعی ژن است که بوسیلهی جهش های حذف عملکرد ایجاد می شود، ژن های سرکوب کننده تومور فرآیند های اصلی مسئول حفظ بخش های پایدار بافتی را کنترل می کنند این فرآیند ها شامل تمامیت ژنتیکی، پیشرفت چرخه سلولی،تمایز، برهمکنش های سلولی و مرگ می باشند. غیر فعال شدن این ژن ها موجب حذف هموستازی بافتی می شود که مشخصه یک تومور در حال گسترش است(نخی سیستانی و همکاران1389).
1-2 آناتومی روده بزرگ:
روده بزرگ از دریچه ایلئوسکال روده کوچک تا آنوس گسترش یافته است و شامل آپاندیس، کولون، رکتوم و کانال آنال می باشد بنا به موقعیت کولون به قسمت های مختلف تقسیم شده است: سکوم، کولون
صعودی، زاویهی کبدی، کولون عرضی، زاویه طحالی، کولون نوزولی و کولون سیگموئید (میبدی و همکاران 1382، ACS 2010).

شکل 1-1 تصویر و بخشهای مختلف روده بزرگ (کاظمی اسکندانی 1388)
کولون از انتهای ایلئوم شروع می شود و در پرومونتوری ساکروم جایی که تیناکولی ها حالت باند های مشخص و مجزای خود را از دست می دهند پایان می یابد.تیناکولی ها سه نوار عضله طولی هستند که در فواصل 120 درجه از هم در محیط کولون قرار گرفته اند رکنوم در سطح پرومونتوری ساکروم جایی که سه تنیا ها پخش می شوند و یک لایه عضلانی طولی صاف تشکیل می دهند شروع می شود. رکتوم به پایین تا
سطح عضلات بالابرنده مقعد ادامه پیدا می کند و طول آن از 12 تا 15 سانتی متر ادامه پیدا می کند.کانال جراحی آنال که حدودا 4 سانتی متر می باشد، قسمت انتهای روده بزرگ است که از بین عضلات بالا رونده مقعد عبور می کند و به لبه مقعد باز می شود(میبدی و همکاران 1382).
دیواره روده بزرگ شامل شش لایه است: مخاط، موسکولاریس موکوزا، زیر مخاط، موسکولاریس پروپریا، چربی زیر سروزی و سروز، رکتوم نیز بافت مشابهی دارد ولی سروز ندارد(میبدی و همکاران 1382).
1-3جنین شناسی روده بزرگ:
در طول هفته چهارم حاملگی، روده اولیه که شامل پیش روده، میان روده و پس روده می باشد تشکیل می شود. میان روده به روده کوچک(که از نقطهی ورودی مجرای صفراوی شروع می شود) و بخشی از روده بزرگ که پیش از نقطه میانی کولون عرضی قرار گرفته تبدیل می شود. خون این بخش از روده توسط شریان مزانتریک فوقانی تامین می گردد. پس روده به بخشی از روده بزرگ که پس از نقطه میانی کولون عرضی قرار گرفته نیز قسمت پرگزیمال مقعد و مجرای ادراری تناسلی تحتانی تبدیل می شود.
در طول هفته ششم حاملگی میان روده به خارج از حفره شکمی منتقل می گردد بیش از آنکه میان روده موقعیت نهایی خود را در حفره شکمی به دست آورد. در طول چهار هفتهی بعدی در خلاف جهت عقربه های ساعت حول شریان مزانتریک فوقانی 270 درجه می چرخد.


انتهای پس روده به کلواک ختم می شود که در هفته ششم توسط دیواره اتورکتال به دو بخش شکمی و پشتی یعنی سینوس ادراری تناسلی و رکتوم تقسیم می شود. تکمیل مجرای آنال در انتهای هفته هشتم است یعنی هنگامی که غشاء نازک آنال پاره می شود خط دندانه ای در قسمت تحتانی مجرای آنال مشخص کننده مرز بین پس روده اندودرمی و بافت اکتودرمی می باشد(میبدی و همکاران1382).
1-4سرطان کولورکتال:
سرطان کولون و رکتوم را سرطان کولورکتال گویند(kang et at 2011). سرطان کولورکتال سومین عامل مرگ از سرطان ها در جهان محسوب می شود(پارکین 2001 ) این بیماری در ایران به عنوان چهــارمین سرطان شایع در هر دو جنس به شمار می رود(بویل و لانگمان 2000). سرطان کولورکتال سومین سرطان شایع در بین مردان و چهارمین سرطان شایع در بین زنان در ایران می باشد(کلاهدوزان 2009).تخمین زده می شود سالانه در ایران 3641 نفر به این بیماری مبتلا می شوند(ملک زاده 2009).
سرطان کولورکتال به دو شکل عمده وجود دارد سرطان کولورکتال موردی(spo--ic) و سرطان کولورکتال ارثی(kang et at2011).

شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده (کاضمی اسکندانی 1388)
سرطان کولورکتال دارای سه زیر گروه بر اساس عمده ژنتیکی یا تغییرات اپی ژنتیک است:
1.تومور با بی ثباتی کروموزومی
2.کسانی با ناپایداری میکروستلایت
3.تومورهای با جزایر CpG متیلاتور
آسیب شناسی مولکولی سرطان کولورکتال یکی از برجسته ترین موارد مطالعه در سال های اخیر بوده است(kang et al-2001) .و به دلیل اثرات جانبی شدید شیمی درمانی استراتژی های جدید بر مبنای مکانیسم های مولکولی به شدت احساس می گردد(hisayuki and Gazdar 2005).
هم چنین یکی از معظلات اساسی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز آن به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.

1-3درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال (دکتر سید مهدی جلالی و همکاران با تحقیق بر روی بیماران از سال 1360تا 1380 )1-4-1چه کسانی در معرض خطر قرار دارند (ریسک فاکتورها یا عوامل خطر ):
علت دقیق بروز سرطان کولورکتال شناخته شده نیست. پزشکان به ندرت می توانند علت ابتلا و یا عدم ابتلای افراد به سرطان کولورکتال را بیان کنند. به هر حال آنچه مشخص است این است که این بیماری مسری نبوده و هیچ فردی این بیماری را از فرد دیگری نمی گیرد.تحقیقات نشان داده اند که افراد با عوامل خطر معین، نسبت به سایر افراد در معرض خطر بالای ابتلا به سرطان کولورکتال قرار دارند. وجود عامل خطر یا ریسک فاکتور، شانس ابتلا و پیشرفت بیماری را در یک فرد افزایش می دهد(کاظمی اسکندانی1388).
فاکتور های مختلفی در تبدیل موکوس رودهی بزرگ به سرطان دخالت دارند عوامل محیطی و ژنتیکی هر دو از عوامل مهم در ایجاد این بیماری هستند(caseito and lowitz 2001).
1-4-2عوامل محیطی:
سن بالای 50 سالگی: احتمال بروز سرطان کولورکتال در افراد مسن بیشتر است. بیش از 90% مبتلایان، بالای50 سال سن دارند و متوسط سن مبتلایان در زمان تشخیص، بالای 72 سال می باشد.
رژیم غذایی: مطالعات نشان داده است که رژیم های پر چرب (بخصوص چربی های حیوانی)، کم فیبر، کم کلسیم و کم فولات خطر ابتلا را افزایش می دهند. هم چنین خطر ابتلا به سرطان کولورکتال در افرادی که از میوه جات و سبزیجات کمتراستفاده می کنند، بیشتر است.
مصرف سیگار : خطر بروز پولیپ و سرطان کولورکتال در افراد سیگاری بیشتراست(کاظمی اسکندانی 1388).
1-4-3عوامل ژنتیکی:
کشف انکوژن ها در سال 1910 زمانی که پیتون رویس(Peyton Rous) نشان داد یک عصاره عبور داده شده از فیلتر که فاقد سلول و باکتری است می تواند باعث ایجاد فیبروسارکوما در جوجه ها شود آغاز شد(pappou 2010). بعد از آن او دریافت که سارکومای جوجه می تواند به دفعات به وسیله عصاره توموری فاقد سلول، از حیوانی به حیوان دیگر منتقل شود.عامل این بیماری در عصاره سلولی ویروسRouse sarcoma Virus بود. کشف انکوژن های ویروسی برای اولین بار باعث شد که یک عامل ایجاد کننده سرطان از منظر ژنتیک مورد مطالعه قرار گیرد(نخعی سیستانی 1389).
از دست دادن ثبات ژنومی از طریق تسهیل دستیابی به جهش های مرتبط با تومور در توسعه سرطان روده بزرگ دخالت دارد. در این بیماری بی ثباتی ژنومی اشکال مختلفی دارد که هر کدام علل متفاوتی دارند.متداول ترین بی ثباتی ژنومی در سرطان کولورکتال بی ثباتی کروموزومی است که منجر به تغییرات زیاد در تعداد رونوشت و ساختار کروموزوم می شود. بی ثباتی کروموزومی مکانیسم موثری در فقدان فیزیکی رونوشت های نوع وحشی ژن های سرکوب کننده تومور مانند APC و P53 است (Sanford and bertagnolli 2009).
1-4-4عوامل دیگر در بروز سرطان کولورکتال:
پولیپ های کولورکتال: پولیپ ها در دیواره داخلی روده بزرگ یا رکتوم رشد می کنند.
سابقه خانوادگی ابتلا به سرطان کولورکتال: سابقه ابتلا به سرطان درفامیل نزدیک ( والدین،برادران و خواهران و یا فرزندان ) به ویژه در سنین پایین، احتمال بروز سرطان را افزایش می دهد.
داشتن سابقه ابتلا به سرطان : سرطان کولورکتال ممکن است مجددا در فرد دارای سابقه ابتلای قبلی به این بیماری، بروز نماید
بیماری های التهابی روده یا بیماری کرون: خطر بروز سرطان کولون ، در فردی که سابقه بیماری های التهابی زخم شونده روده و بیماری کرون را برای چندین سال دارند، بیشتر می باشد(کاظمی اسکندانی 1388).
1-4-5علائم و نشانه ها
علائم و نشانه های شایع عبارتند از :
اسهال، یبوست
احساس عدم تخلیه کامل روده
مشاهده خون (قرمز روشن یا خیلی تیره) در مدفوع
باریک شدن بیش از حد معمول مدفوع
کاهش وزن بدون علت مشخص
احساس خستگی مداوم
تهوع و استفراغ
ناراحتی های عمومی شکم (احساس پری شکم، درد، پیچش شکم و شکم نفاخ)
در اغلب موارد، این علائم ناشی از سرطان نمی باشند. سایر بیماری ها نیز این نشانه ها را ایجاد می کنند. بایستی در صورت وجود این علائم ، جهت تشخیص و درمان هر چه سریع تر به پزشک مراجعه نمود(کاظمی اسکندانی 1388).
1-5غربالگری
بررسی های انجام شده حاکی از این است که در صورت شناسایی سرطان کولورکتال در مراحل ابتدایی شانس بهبودی کامل مبتلایان به این بدخیمی در حدود 90% می باشد ولی در صورتی که در تشخیص و درمان این سرطان تعویق ایجاد شود بدخیمی وارد مرحله پیشرفته و غیر قابل درمان می شود (ma et at 2009). غربالگری سرطان قبل از بروز علائم و نشانه های بیماری، به پزشک در شناسایی پولیپ ها یا سرطان اولیه کمک می کند. شناسایی وخارج نمودن پولیپ ها، از بروز سرطان کولورکتال پیشگیری می کند.
برای شناسایی سرطان و پولیپ در مراحل اولیه بایستی:
افراد 50 سال و به بالا، غربالگری شوند.
افرادی که احتمال بروز بیماری در آنها بیشتر است ، با پزشک خود در مورد انجام آزمایشات غربالگری قبل از 50 سالگی ، نوع آزمایشات و فواید و مضرات هرکدام از آزمایشات صحبت نمایند.
از آزمایشات غربالگری زیر برای تشخیص سرطان، پولیپ ها و سایر موارد غیر طبیعی کولون و رکتوم استفاده می شود:
وجود خون مخفی در مدفوع: اغلب اوقات سرطان ها یا پولیپ ها دچار خونریزی می شوند و این آزمایش قادر به شناسایی کمترین مقادیر خون در مدفوع می باشد. در صورت شناسایی وجود خون در مدفوع سایر آزمایشات برای شناسایی منبع خون مورد نیاز می باشد. البته لازم به ذکر است که موارد خوش خیم همانند بواسیر( هموروئید ) نیز موجب بروز خون در مدفوع می شوند.
سیگموئیدوسکپی: پزشک با سیگموئیدوسکپ ( لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد) داخل رکتوم و قسمت تحتانی کولون (سیگموئید) را بررسی می کند و در صورت وجود پولیپ، آنها را خارج می کند. به خارج کردن پولیپ، پولیپکتومی گفته می شود.
کولونوسکپی: پزشک با استفاده از کولونوسکپ (لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد) داخل کولون و رکتوم را بررسی نموده و در صورت وجود پولیپ، آنها را خارج می کند.
تنقیه با محلول باریم : پس از تنقیه بیمار با محلول باریم، هوا داخل رکتوم پمپ شده و توسط اشعه ایکس از کولون و رکتوم ، عکس برداری های متعدد انجام می شود. توسط باریم و هوا، پولیپ ها در عکس برداری مشخص می شوند.
معاینه انگشتی رکتوم : معاینه رکتوم یکی از روش های معمول معاینه بدنی است. پزشک پس از پوشیدن دستکش و مالیدن ژل، با داخل کردن انگشت داخل رکتوم نواحی غیر طبیعی موجود در قسمت های تحتانی رکتوم را بررسی می کنند (کاظمی اسکندانی1388).
1-6تعیین مرحله بیماری
زمانی که نمونه برداری نشانگر وجود سرطان کولورکتال باشد، لازم است پزشک وسعت بیماری( درجه بیماری) را بداند تا بهترین روش درمانی را طرح ریزی کند.
مرحله بیماری به تهاجم تومور به بافت های مجاور و انتشار سرطان بستگی دارد و اینکه در صورت انتشار، به کدام قسمت از بدن منتشر شده است. برای تعیین مرحله بیماری آزمایشات و اقدامات زیر انجام می شود:
آزمایشات خون: پزشک میزان CEA (آنتی ژن کارسینومای امبریونیک) و سایر مواد موجود در خون را کنترل می کند. در اغلب مبتلایان به سرطان کولورکتال، میزان CEA بالا می باشد.
کولونوسکپی: پزشک با کولونوسکپی داخل کولون و رکتوم را از نظر وجود نواحی غیرطبیعی بررسی می کند.
سونوگرافی داخل مقعدی: پروب سونوگرافی داخل رکتوم قرار داده می شود. پروب، امواج صوتی را که افراد قادر به شنیدن آن نیستند به داخل رکتوم و بافت های اطراف می فرستد. کامپیوتر با استفاده از انعکاس صوت(اکو) تصویر ایجاد می کند. تصویر ایجاد شده، نشان میدهد که تا چه عمقی تومور رکتوم رشد کرده است و همچنین انتشارسرطان به گره های لنفاوی یا سایر بافت های مجاور را نشان می دهد.
عکس برداری توسط اشعه ایکس از قفسه سینه: عکس برداری از قفسه سینه، نشان دهنده انتشار سرطان به ریه است.
سی تی اسکن: دستگاه عکسبرداری توسط اشعه ایکس که به کامپیوتر متصل می باشد، یک سری تصاویر با جزئیات بیشتر را از نواحی داخل بدن در دسترس قرار می دهد. ممکن است ماده حاجب تزریق گردد. این روش انتشار تومور به کبد، ریه ها و یا سایر نواحی بدن را نشان می دهد(کاظمی اسکندانی 1388).
مراحل سرطان کولورکتال به شرح زیر می باشد:
مرحله I : سرطان درون دیواره داخلی رکتوم و کولون رشد کرده است ولی هنوز به دیواره خارجی کولون نرسیده و یا به بیرون از کولون گسترش نیافته است .
مرحلهII : تومور به قسمت های عمقی و یا سرتاسرعمق دیواره کولون و رکتوم انتشار یافته و ممکن است بافت های مجاور را نیز درگیر کند اما سلول های سرطانی هنوز به گره های لنفاوی انتشار نیافته اند.
مرحله III : سرطان به گره های لنفاوی مجاور انتشار پیدا کرده اما به سایر قسمت های بدن منتشر نشده است.
مرحلهIV : سرطان در سایر قسمت های بدن همانند کبد و ریه ها منتشر شده است(کاظم اسکندانی 1388).
در مراحل 1و2 سرطان کولورکتال امکان درمان این سرطان با عمل جراحی وجود دارد ولی احتمال بهبودی در مرحله 4 بسیار ضعیف است(ma et at 2009).
سرطان عود کرده : سرطانی است که درمان شده است ولی پس از یک دوره زمانی مجددا عود نموده است. این بیماری ممکن است در کولون، رکتوم و یا سایر قسمت های بدن عود کند (کاظمی اسکندانی1388).

1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال(دکتر سید مهدی جلالی و همکاران با تحقیق بر روی بیماران از سال 1360تا 1380 )
1-7روش های درمانی:
اساسا انتخاب نوع درمان به محل تومور در رکتوم و کولون و مرحله بیماری بستگی دارد. برای درمان سرطان کولورکتال از جراحی، رادیوتراپی (پرتودرمانی)، شیمی درمانی و یا ترکیبی از این درمان ها استفاده می شود درمان سرطان به صورت درمان موضعی یا درمان سیستمیک است(کاضمی اسکندانی 1388)..
کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. )محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از 90% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ میدهند.تومورهای اولیه میتوانند توسط جراحی یا درمانهای مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطانهایی که به مرحله متاستاز رسیده اندبه درمان مقاوماند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ را در میان افراد دارای
متاستاز نشان میدهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایندهای ایجادکننده متاستاز و فراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن میباشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).
1-7-1درمان موضعی:
جراحی و پرتودرمانی جزء درمان های موضعی هستند. در جراحی، تومور خارج شده و پرتودرمانی، سلول های سرطانی را نابود می کند. در صورت انتشار سرطان کولورکتال به سایر قسمت های بدن ، از درمان موضعی برای کنترل بیماری در آن مناطق خاص، استفاده می شود. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-2درمان سیستمیک:
شیمی درمانی و درمان بیولوژیکی از سایر روش های درمانی سیستمیک هستند و برای کنترل سرطان، دارو وارد جریان خون می شود.
بروز عوارض جانبی به علت تاثیر درمان روی سلول ها و بافت های سالم، شایع است. عوارض جانبی به نوع و وسعت درمان بستگی داشته و در تمام افراد یکسان نمی باشد. ممکن است عوارض جانبی، در هر جلسه از درمان متفاوت باشد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-3کولونوسکپی:
یک پولیپ سرطانی کوچک موجود در کولون یا قسمت فوقانی رکتوم ممکن است توسط کولونوسکوپ خارج گردد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-4لاپاراسکپی:
ممکن است سرطان کولون در مراحل اولیه با استفاده از لاپاراسکوپ ( لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد ) برداشته شود. سه الی چهار برش کوچک در شکم داده می شود. جراح با لاپاراسکوپ داخل شکم را مشاهده کرده و تومور و قسمتی از نواحی سالم کولون را خارج می کند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-6جراحی باز:
رایج ترین درمان سرطان کولورکتال، جراحی است. جراح برای خارج نمودن تومور و قسمتی از نواحی سالم رکتوم و کولون، روی شکم برش بزرگی ایجاد می کند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-7شیمی درمانی
شیمی درمانی استفاده از داروهای ضد سرطان برای از بین بردن سلول های سرطانی است. داروهای شیمی درمانی وارد گردش خون شده و بر سلول های سرطانی تمام بدن اثر می کنند.
عوارض شیمی درمانی:
سلول های خونی: این سلول ها با عفونت مقابله نموده و به لخته شدن خون کمک می کنند، هم چنین اکسیژن را به تمام بافت های بدن حمل می کنند. ممکن است به علت تاثیر دارو روی سلول های خونی، عفونت و خونریزی های خودبخودی و کبودی، احساس ضعف و خستگی ایجاد شود.
سلول های ریشه مو: شیمی درمانی موجب ریزش مو می شود. باید دانست که موها مجدد رشد می کنند ولی ممکن است از نظر بافت و رنگ متفاوت باشد.
سلول های دستگاه گوارشی: شیمی درمانی موجب کاهش اشتها، تهوع و استفراغ، اسهال یا زخم های دهان و لب ها می شود. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-8درمان بیولوژیکی:
.برخی از مبتلایان به سرطان کولورکتال انتشار یافته، نوعی درمان بیولوژیکی به نام آنتی بادی مونوکلونال دریافت می کنند. آنتی بادی های مونوکلونال به سلول های سرطانی کولورکتال می پیوندند و رشد و انتشار آن ها را مهار می کنند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-9پرتودرمانی ( درمان با اشعه )
دراین روش از اشعه های پرانرژی جهت از بین بردن سلول های سرطانی استفاده می شود. پرتودرمانی تنها در ناحیه تحت درمان، بر سلول های سرطانی تاثیر می گذارد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-9-1 انواع درمان با اشعه:
پرتو درمانی خارجی : دستگاهی بزرگ، اشعه هایی را به سمت موضع هدایت می کند.
پرتودرمانی داخلی: اشعه، توسط ماده رادیواکتیو قرار داده شده در لوله باریکی که مستقیما در داخل و یا نزدیک تومور کار گذاشته است، تابانده می شود.
پرتودرمانی حین جراحی: در برخی موارد، پرتو درمانی خارجی در طول جراحی داده می شود (کاضمی اسکندانی 1388).
CD166 یا ALCAM 8-1
ALCAM یا CD166 به عنوان مارکر های سلول های بنیادی سرطان کولورکتال عمل کرده و همچنین در تومور زایی سرطان کولورکتال نقش دارند و از آن می توان به عنوان یک مارکر جهت تشخیص زود هنگام و هم درمان سرطان کولورکتال استفاده کرد.دومین C2 پروتئین ALCAM یک دومین ایمونوگلوبولین می باشد که در بخش خارج سلولی قرار دارد.
همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،2013)
1- 9 ویژگی های عمومی ALCAM
ALCAM یک عضو از خانواده ایمونوگلوبولین است و بر اساس توانایی آن در باند شدن با cd6 شناسایی میشود و از سلولهای cos به همراه DNA آزمایشی استفاده میشود Bowen et al1995, Pate et al 1995)). ALCAM قادر است که واکنش متقابل هموفیلیک را همانند هتروفیلیک به کار اندازد. ژن انسانی برای ALCAM روی کروموزم 3 قرار گرفته است(3q33، 1q132) و از 16 اگزون تشکیل شده است که دارای اندازه ای بیش از kb 200 است. ALCAM یک نوع مولکول غشایی تیپ 1 است و دارای 500 اسید آمینه در ناحیه خارج سلول و 22 اسید آمینه در ناحیه گذرنده از غشا ، 34 اسید آمینه در ناحیه سیتوپلاسمیک و یک ناحیه مولکولی KDa 105 است.

شکل 1-5 نمای کلی پروتئین ALCAM (اولریج و همکاران ،2010)
1- 10 شناسایی ALCAM به عنوان یک هدف مرتبط با آنکولوژی
روشهای مختلف ژنومیک و پروتئومیک مختلف اشاره کرده اند که ALCAM به عنوان یک هدف مرتبط با آنکولوژی است. همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،2013) کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. روش های متداول شیمی درمانی سلول ها تمایز یافته یا درحال تمایز را که قسمت عمده ی توده تومور را شکل می دهند هدف قرار می دهند اما باید توجه داشت که این سلول ها تنها حجم تومور را می سازند و  قادر به تولید سلول های جدید نیستند و در پیشرفت بیماری و رشد تومور نقشی ندارند در حالیکه جمعیت سلول های سرطانی که سرطان و رشد تومور را سبب می شوند، دست نخورده و دور از چشم باقی مانده و باعث عود کردن بیماری می شوند.برخی محققان بر این باورند که در مرکز هر توموری تعداد کمی سلول های بنیادی نابهنجار قرار گرفته اند که رشد بافت های بدخیم و ناهنجار را تداوم می بخشند.اگر این نظر درست باشد، می تواند توضیح دهد که چرا تومورها اغلب حتی پس از اینکه به وسیله داروهای ضدسرطان تقریباً تخریب شده اند دوباره بازسازی می شوند. این حالت همچنین یک راهکار متفاوت برای ایجاد داروهای ضدسرطان را نشان می دهد و دال بر آن است که این داروها می بایستی برای از بین بردن سلول های بنیادی سرطانی و نه برای توانایی شان در از بین بردن هر سلولی و کوچک کردن تومورها، انتخاب شوند.چندین روش مبتنی بر روش های ژنومیکو پروتئومیکس این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.
این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان آنتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010 ) آنتی ژن ها مارکر های سطح سلولی اند و می توانند برای شناسایی گروه های سلولی که تشکیل دهنده یک ارگان هستند مورد استفاده قرار گیرند.این مارکرها را می توان جهت پیش بینی پاسخ به درمان ،مرتب سازی سلول های بنیادی سرطان، درمان سرطان و مرتب سازی رده های سلولی مورد استفاده قرار داد.(الوین لیو و همکاران، 2004).
این پروتئین نقش مهمی در تهاجم و پیشرفت تومور در سرطان کولورکتال دارد(جیایی وانگ و همکاران،2011).

1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری(مرته تونه وایجر و همکاران،2010)
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از 90% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ میدهند.تومورهای اولیه میتوانند توسط جراحی یا درمانهای مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطانهایی که به مرحله متاستاز رسیدهاند به درمان مقاوماند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ را در میان افراد دارای متاستاز نشان میدهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایندهای ایجاد کننده متاستاز و فراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن میباشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).هم چنین یکی از
معظلات اساسی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز آن به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.
در طول شکل گیری ضایعات توده ، سلول های سرطانی باید به یکدیگر متصل شوند بنابراین از مولکولهای چسبنده برای اینکه با هم بمانند استفاده می کنند.تومور می تواند از طریق افزایش حجم خود به ساختارهای مجاور به طور مستقیم هجوم برده و یا اینکه می توانند به سایت های دور متاستاز شوند.متاستاز هنگامی رخ می دهد سلول ها از تومور اولیه جدا شده و محیط خودشان را ترک کرده ، به رگ های خونی یا لمفاتیک حمله کرده و به مکان های دور مهاجرت کنند.با توجه به اهمیت این پروتئین در چسبندگی
سلول ها می توان نقش مهمی را برای این پروتئین در ایجاد متاستاز در سرطان کولورکتال قائل بود(سالمون اوفوری و جودی کینگ،2008).
مساله تحقیق:
در این مطالعه سعی بر آن داریم که با آنالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان یک دومین اختصاصی (دومینC2) پروتئین غشایی ALCAM که در سطح سلول های سرطانی کولورکتال است و پتانسیل موجود برای بهبود روشهای تشخیصی(تولید کیت های تشخیصی) قبل از وارد شدن به فاز بدخیمی، و گشایشی در تولید واکسن برای تقویت سیستم ایمنی فرد جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان کولورکتال، را بررسی می کنیم.
با استفاده از فرآیند کلونینگ قطعه ژن اپتیمایز شده پروتئین ALCAM را به کمک وکتور وارد باکتری کامپتنت کرده و سپس باکتری حاوی ژن مورد نظر خود را از دیگر سلول ها جدا می کنیم و از آن ها استخراج پلاسمید انجام داده و سپس از طریق ساب کلونینگ ژن مورد نظر خود را وارد یک وکتور بیانی کرده و از سلول های ترنسفکت شده استخراج پروتئین انجام داده و سپس بیان پروتئین مورد نظر خود را بررسی می کنیم.
در این مطالعه فرضیه ای مطرح شد که مولکول دومین سنتز شده می تواند در میزبان پروکاریوتی کلون و بیان شود.
فصل 2:مروری بر تحقیقات انجام شده
کلونینگ و بیان این پروتئین در سال 1995 توسط مایک بوون و همکارانش شرح داده شد.آنها نشان دادند که آنتی بادی های CD166 به عنوان یک پروتئین ایمنوگلوبولین به CD6متصل می گردد.(مایکل بوون و همکاران ،1995؛ مایکل بوون و اروفو،1999).
CD166 نقش بسیار مهمی در تهاجم توموری دارد.(جیاجی وانگ و همکاران،2011)
چندین روش مبتنی بر روش های ژنومیک و پروتئومیکس این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان آنتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010)
در آزمایشات صورت گرفته مرته تونه و همکارانش در شرایط آزمایشگاهی و هم چنین محیط زنده، آنتی بادی های ضد این مارکر اثر مهارکننده ایی بر سرطان کولورکتال از خود نشان دادند.در آزمایش آنها رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی برای این مارکر در تومور مثبت بود در صورتی که در اکثر تست هایی که بروی بافت های طبیعی انسان صورت گرفته بودALCAMمشاهده نشد. با توجه به منفی بودن رنگ آمیزی بافت نرمال انسان و مشاهده فعالیت ضد توموری این مارکر بر سرطان کولورکتال در داخل بدن آنتی بادی scFvیک کاندیدای بالقوه جهت درمان سرطان کولورکتال معرفی گردید(مرته تونه و همکاران، 2010).
هم چنین الگوی بیان این مارکر در بافت نرمال و توموری ، روده انسان و موش با استفاده از روش های ایمنوهیستوشیمی،فلوسیتومتری و واکنش زنجیره ایی پلی مراز ترانس کریپتاز معکوس مورد بررسی قرار
گرفت.در نهایت پس از بررسی صورت گرفته ALCAM را به عنوان یک مارکر بالقوه جهت اهداف درمانی برای سرطان کولورکتال معرفی کردند.(لوین و همکاران ،2010)
بیان ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند .افزایش بیان در تومورهای با تمایز بالا ممکن است مشخص کننده نقش بالقوه این مارکر در مراحل اولیه تومورزایی باشد،از دست دادن این پروتئین نیز ممکن است با کاهش چسبندگی سلولی همراه شود ، نتیجه پتانسل بالقوه بالای
تومور در متاستاز خواهد بود.این نتایج از طریق آنالیز ایمونوهیستوشیمیایی ALCAM که بروی نمونه بافتی بیماران تحت درمان صورت گرفته بود بدست آمد.(مایکل تاچزی و همکاران، 2010؛سالمون اوفوری و جودی کینگ،2008)
همچنین مشخص شده است که ریزش ALCAM در مراحل اولیه بیماری می تواند به عنوان یک مارکر تشخیصی دقیق برای شناسایی سریع بیمارانی که در معرض خطر پیشرفت بیماری هستند مورد استفاده قرار گیرد.(اماندا هنسن و همکاران ، 2013)
این نکته مشخص گردیده است ALCAM در دو نوع تعامل سلول –سلول هموفیلیک و هتروفیلیک به عنوان میانجی عمل می کند. مشخص شده گلیکوزیلاسیون پس از ترجمه هیچ اثری بروی خاصیت اتصالی هموفیلیک ندارد.(گیادو اسوارت،2002)
در مطالعاتی که جهت تهیه نقشه خانواده مولکلوهای ایمونوگلوبولین چسبنده سلولی ((Igfs صورت گرفته مشخص شده است که دومین های ناحیه C2 نقش بسیار مهمی در اتصال به لیگاند ایفا می کنند.) گیادو اسوارت و همکاران ،2002 ؛ کوین زن وهمکاران،1999)
تجزیه و تحلیل سلول هایی با مجموعه مولکول های سطحی EpCAMhigh/CD44+ منجر شناسایی CD166 به عنوان مارکر بیانی اضافی متفاوت، که جهت جداسازی سلول های بنیادی به شناسایی سرطان در سرطان کولورکتال مفید می باشد شد.(پیه رو دالربا و همکاران ،2006)
هم چنین پیشنهاد شده است که CD166 به همراه CD44 نیز می تواند نقش بالقوه ایی در سرطان کولورکتال انسانی ایفا کند زیرا سلول های موشی که برای هر دوی این ماکر ها مثبت بودند تومورزایی بسیار بیشتری در مقایسه با سلول هایی که تنها برای CD44 مثبت بودند داشتند.(کاترینا فانالی و همکاران ،2014)
در بیشتر مطالعاتی که اخیرا بروی بافت های سرطان کولورکتال صورت گرفته گزارش شده است که از دست دادن غشایی CD166 و CD44 استاندارد(CD44s) با تهاجم و بدتر شدن وضعیت بقا در ارتباط می باشد.(توماس برونر و همکاران ،2012)
هم چنین ترکیب مارکرهایCD166،CD44 و CD133 می تواند به طور موفق آمیزی جهت شناسایی بیمارانی که خطر متاستاز و عود بیماری در انها کم،متوسط و یا زیاد است در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال استفاده گردد.(یوسوکه شینوزووا و همکاران،2013)
همچنین در طی آزمایشی دیگری مشخص شد که ALCAM غالبا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد ، که بر اهمیت آن در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.( ویچرت و همکاران،2004)
بر اساس تحقیقی دیگری که بروی بیان CD166 صورت گرفت مشخص شد که موقعیت های مختلف سلولی این پروتئین ارزش تشخیصی متفاوتی دارند و بیان سیتوپلاسمی آن با نتایج تشخیصی بدتری همراه می باشد.هم چنین اینها متوجه شدند که بیان CD166 به صورت خاصی در انواع رده های توموری افزایش پیدا می کند.(چائو نی و همکاران،2013)
بیان بالای CD166 به همراه P21 در نمونه برداری های قبل درمان با عود تومور و پیش بینی ضعیف در بیماران درمان شده با 5-FU بر پایه شیمورادیوتراپی قبل عمل ارتباط داشت.البته برای تعیین نقش CD166 وP21 به عنوان نشانگرهای پیش بینی به پاسخ شیمورادیوتراپی قبل از عمل جراحی به مطالعات بزرگتر و کابردی تری در آینده نیاز می باشد.(سانگ هون سیم و همکاران،2014)
در تحقیقی بروی نمونه های کولکتومی به دست آمده از سرطان کولون به منظور بررسی ماکر CD166 صورت گرفت مشخص شد که بیش از دو سوم نمونه ها CD166 را بیان می کنند.هم چنین بیان غشایی CD166 مرتبط با سرطان کولورکتال در قسمت کولون این سرطان بیشتر می باشد. (شهریار صفایی و همکاران،2013)
فصل 3 : مواد و روش ها:
3-1 مواد مورد استفاده:
3-1-1 باکتری مورد استفاده
برای این مطالعه در مرحله کلونینگ ژن دومینC پروتئین ALCAM از باکتری E.coli سویه TOP10 و در مرحله ی ساب کلونینگ از باکتری E.coli سویه BL21(DE3)استفاده شد . این باکتری ها ابتدا بصورت لیوفیلزه بوده و سپس برای استفاده از آن، پودر باکتری را به 5 میلی لیتر محیط کشت مایع LB اضافه کرده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شبانه روز کشت می دهیم.
3-1-2 آنزیم ها
از آنزیم های NcoI و XhoI که از شرکت فرمنتازخریداری و تهیه شدند و همچنین از آنزیم اتصال دهنده T4 DNA Ligase هم در مرحله ی Ligation استفاده شد. این آنزیم ها در دمایی 20- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
3-1-3 پلاسمید
برای مرحله ی ساب کلونینگ از پلاسمید بیانی (pet-28a ) استفاده شد . این پلاسمید دارای جایگاه های مختلف برای انواع آنزیم های محدود کننده می باشد که می توان ژن مورد نظر را به کمک آنها وارد پلاسمید کرد. این پلاسمید دارای پارامترهای بیان کننده و همچنین جایگاه های برش آنزیمی دلخواه است و همچنین ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین را دارا بوده که به باکتری ترانسفورم شده امکان زنده بودن و بقاء در محیط کشت حاوی کانامایسین را می دهد. جهت بیان قطعه ژن کلون شده در آن هم دارای پارامتر های بیانی مانند پروموتر lac می باشد که در حضور القاگرIPTG شروع به بیان ژن مورد نظر می کند. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a در شکل 3-1 نشان داده شده است.

شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید pet28
3-1-4 آنتی بیوتیک ها
از آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و کانامایسین استفاده شد. که ابتدا این آنتی بیوتیک ها به غلظت مناسب رسانده شد و در تیوب های 5/1 میلی لیتری تقسیم گردید و سپس در شرایط دمایی20- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
3-1-5 کیت های آزمایشگاهی
از کیت های استخراج DNA از ژل و استخراج پلاسمید که از شرکت فرمنتاز تهیه و خریداری شدند استفاده شد. که این کیت ها در شرایط دمایی 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
3-1-6 ژل الکتروفورز
برای ساختن ژل الکتروفورز از پودر آگارز Low که از شرکت هیسپانلب تهیه شد استفاده گردید و همچنین در ساختن ژل از رنگ اتیدیوم برماید و بافر TAE50X که آن را به یک ایکس رقیق نموده استفاده شد.
3-1-7 مواد شیمیایی
کلیه مواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان با درجه ی خلوص بیولوژی مولکولی تهیه گردید و در مراحل مختلف مطالعه از جمله تولید ژل الکتروفورز (SDS-page ) مورد استفاده قرار گرفت.
3-1-8 محیط کشت باکتری
در این مطالعه از محیط کشت های آگار و محیط کشت LBآگار جهت تکثیر و رشد باکتری استفاده شد.
3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی استفاده شده در این مطالعه
1- میکروتیوب های 2/0 ، 5/0 و 5/1
2- لوله ی آزمایش 160 × 16 سیماکس
3- پلیت یکبار مصرف 10 سانتیمتری
4- سمپلر در سایزهای مختلف
5- نوک سمپلر آبی، زرد، کریستالی
6- انکوباتور ساخت شرکت ممرت ایالات متحده امریکا (شکل 3-2 )

شکل3-2 دستگاه انکوباتور
7- اتوکلاو جهت ضد عفونی کردن وسایل پلاستیکی و محیط کشت ها(شکل 3-3)

شکل3-3 دستگاه اتوکلاو
8- دستگاه فور جهت ضد عفونی کردن وسایل شیشه ای
9- تانک الکتروفورز (SDS-Page )
10- تانک الکتروفوز افقی
11- دستگاه مولد ولتاژ (شکل 3-4 )

شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژ و تانک الکتروفورز
12- شیکرانکوباتور ساخت (شکل 3-5 )

شکل 3-5 شیکر انکو باتور
14- سانتریفیوژ ساخت شرکت اپندور آلمان (شکل 3-6 )

شکل 3-6 سانتریفیوژ
14- گرماساز
16- دستگاه تصویر ساز ژل ( شکل3-7)

شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل
17- انکی باتور شانزده درجه ( شکل 3-8 )

شکل3-8 انکی باتور شانزده درجه
18- بن ماری (شکل 3-9 )

شکل3-9 بن ماری
19.سانتریفیوژ یخچال دار
3-2 آنالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
توالی مورد نظر از طریق سایت های Swiss-port / Uniprot KB و مرکز ملی اطلاعات ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite Hidden="1"><Author>Online</Author><RecNum>84</RecNum><record><rec-number>84</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="vpp0ad9pgwdrfoefffjxvv9er2zwf0z0ep5z">84</key></foreign-keys><ref-type name="Online Database">45</ref-type><contributors><authors><author>Server Online</author></authors></contributors><titles><title>National Center for Biotechnology Information</title></titles><dates></dates><pub-location>www.ncbi.nlm.nih.gov</pub-location><urls><related-urls><url>www.ncbi.nlm.nih.gov</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote> بیوتکنولوژی (NCBI) بدست آورده شد. سپس در انتهای 3' توالی مورد نظر ، 6 اسید آمینه ی هیستیدین (His-Tag ) قرار داده شد و کدون پایان (TAA ) هم بعد از آن قرار گرفت. در انتها نیز جایگاه های برش آنزیمی برای آنزیم های محدود کننده NcoI در سر '5 توالی و جایگاه برش آنزیمی برای آنزیم محدود کننده XhoI در سر '3 توالی قرار داده شد.
3-2-2 بهینه سازی یا Optimization توالی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
از آنجای که ثابت شده فرآیند گلیکوزیلاسیون به نحوه اتصال این پروتئین در واکنش های هموفیلیک تاثیری ندارد میزبان پروکاریوتی E.coli برای فرآیند کلونینگ انتخاب شد. برای دستیابی به بیشترین میزان بیان صحیح در E.coli توالی 792 نوکلئوتیدی ناحیه C2 پروتئیینALCAM طراحی شده توسط شرکت Genscript ایالات متحده آمریکا بهینه سازی شد.
پارامترهایی که توسط این شرکت برای فرآیند بهینه سازی در نظر گرفته شد، شامل موارد زیر می شود :
codon usage میزبان
محتوای CG
ساختار دوم mRNA پیش بینی شده .
از بین بردن نواحی برش ناخواسته .
جایگاه های آنزیمی آنزیم های محدودالاثر که ممکن است در فرآیند کلونینگ اختلال ایجاد کنند.
6.به حداقل رساندن نواحی تکرار شونده مستقیم یا غیر مستقیم.
3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده ناحیه C2 پروتئین ALCAM توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد.
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده
DNA لیوفیلیزه شده را می توان توسط بافر TE استریل یا آب بدون نوکلئاز در PH طبیعی و با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول در آورد. و سپس می توان آن را در دمای بین20- تا 80- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد. DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TE می تواند به مدت 6 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود در صورتی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در 4 درجه سانتیگراد وجود ندارد.
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا بهتر است به مدت چند ثانیه تیوب را سانتریفیوژ کنیم تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند. در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیرهی DNA در هنگام برداشتن آن به دیواره های سر سمپلر بچسبد و از دسترس خارج شود.
1.استوک اصلی: µg 10 از DNA لیوفیلیزه در µl 100 از بافر TE حل شد.
2. استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگرµl 1 از استوک اصلی در µl10 از بافر TE حل شد. ( غلظت نهایی به ng/ µl10 رسید.)
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهC2پروتئین ALCAM
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته
جهت آماده سازی باکتری Top 10 برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید آن را کامپتنت یا شایسته سازی کرد.
3-4-1-1 مواد و محلول ها
- محلول کلرید کلسیم 0.1 مولار
- LB براث بدون آنتی بیوتیک
- LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن آن بعد از اتوکلاو کردن، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد. غلظت آمپی سیلین باید حدود 100 میکروگرم در هر میلی لیتر باشد )
- LB آگار حاوی آمپی سیلین ( روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است ).
3-4-1-2 روش کار
باکتری را در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده.
2- برای مدت24 ساعت (over night) محیط کشت را در انکوباتور قرار داده، یک تک کلون از آن را انتخاب کرده و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
3- 400 میکرو لیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB براث تازه تلقیح نموده و مجددا آن را به مدت 2تا 3 ساعت در شیکرانکوباتور قرار می دهیم. تا محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را به ما می دهد در این حالت باکتری در فاز رشد لگاریتمی خود قرار دارد.
4- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم.
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
9- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
10- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
12- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا 72 ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli
بدین منظور از سویه E.coli Top10 که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم. این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است و نمی تواند در محیط حاوی آمپی سیلین رشد نماید ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین رشد می کند .3-4-2-1 روش کار:
1- 50 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته را ابتدا روی یخ ذوب می کنیم.
2- 2 میکرولیتر از پلاسمید AMP+-pBSK حاوی DNA ناحیه C2پروتئینALCAM را به آن اضافه می کنیم .
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار می دهیم .
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و 5 دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB فاقد آمپی سیلین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 700 میکرولیتر از مایع رویی را دور ریخته و رسوب را در 250 میکرولیتر باقی مانده خوب حل می کنیم.
8- 100 میکرولیتر را روی یک پلیت LB آگار و150 میکرولیتر را روی یک پلیت دیگر دارای LB آگار آمپی سیلین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
9. 100 میکرولیتر از باکتری شایسته شده که عمل ترانسفوماسیون را روی آن انجام نداده ایم برای کنترل منفی روی پلییتLB آگار کشت می دهیم به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم.
3-4-3 ارزیابی کلونی ها
پس از 18 تا 20 ساعت پلیت ها را ارزیابی می کنیم، پلیت داری باکتری ترانسفورم شده تشکیل کلونی داد و پلیت حاوی باکتری ترانسفورم نشده نباید تشکیل کلونی دهد چون ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را دریافت نکرده است. پس از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود 1 تا 2 میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر LB براث آمپی سیلین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم . با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری، پلاسمید حاوی ژن ما را دریافت کرده است.

3-4-4 استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK حاوی DNA ، C2 پروتئین ALCAM
اساس استخراج پلاسمید مبتنی بر لیز قلیایی و متعاقب آن جذب DNA توسط سیلیکا است و سپس جداسازی پلاسمید از ستون می باشد. برای استخراج پلاسمید از کیت تهیه شده از شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد . ( شکل 3-10 )

شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید
روش کار :
1- از محیط کشتLB مایع حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تا اتمام محیط کشت5 میلی لیتری تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را 4 تا 6 بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول رویی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله12و13 را یک بار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.ستون را به مدت 15 دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم تا الکل آن به طور کامل تبخیر شود.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور ستون را در درون میکروتیوب5/1 سانتریفیوژ می کنیم .
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK که حاوی ژن C2 پروتئین ALCAM سنتز شده توسط کمپانی می باشد، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن سنتز شده می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion
با توجه به سازه ی طراحی شده از دو آنزیم محدود کننده ی Nco1 و XhoI جهت تایید آنزیمی استفاده شد. مراحل انجام کار به شکل زیر است:
1- ابتدا باید بافر مناسب برای هضم دوگانه آنزیم های NcoI و XhoI را انتخاب کنیم که این کار را با کمک سایت شرکت تولید کننده آنزیم ها یعنی فرمنتاز لیتوانی انتخاب می کنیم . بهترین شرایط بافری برای این واکنش بافرx2 تانگو می باشد .
2- یک میکروتیوب 2/0 برمی داریم و محتویات واکنش که توسط سایت فرمانتاز انتخاب کردیم را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید : 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
3- میکروتیوب را به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیموم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
3-4-5-2 الکتروفورز
جهت جداسازی قطعات حاصل از هضم دو گانه آنزیمی از الکتروفورز استفاده می شود.
3-4-5-2-1 تهیه بافر 50x TAE
برای تهیه بافر TAE 50x از موارد زیر استفاده می بریم:
Tris : 5/60 گرم
EDTA 5/0 مولار ( در 8 PH = ) : 25 میلی لیتر
اسید استیک: 28/14 میلی لیتر
آب استریل: به مقداری که حجم نهایی به 250 میلی لیتر برسد.
حجم نهایی:250 میلی لیتر
نکته: برای اینکه بافر 50x TAE را به بافر TAE 1x مورد استفاده دربیاوریم آن را در حجم مناسب رقیق می کنیم .
3-4-5-2-2 تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از ژل آگارز Low استفاده می کنیم . برای تهیه ی ژل 1.5 درصد آگارز، 0.45 گرم آگارز را در 30 میلی لیتر از بافر TAE 1x حل می کنیم و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی آن را مخلوط می کنیم . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت می دهیم تا کاملا ذوب شود. این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد ولی نباید به مرحله جوشیدن برسد. باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده و محلول کاملا شفاف شود.
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای 50 تا 60 درجه سرد شد(زمانی که دست را نسوزاند) ، رنگ گرین ویوئریا اتیدیوم برماید را به میزان 2 میکرولیتر به آن اضافه می کنیم و به ظرف مناسب شانه دار منتقل می کنیم و در دمای محیط قرار می دهیم تا ژل سفت شود و ببندد(تقریبا 15 دقیقه) . این ژل در حضور بافر TAE 1x تا یک هفته در دمای 4 درجه قابل نگه داری است.
3-4-5-2-3 Run کردن نمونه
پس از بسته شدن کامل ژل، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند . تانک الکتروفورز را با بافر TAE 1x پر می کنیم تا حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را با 2میکرولیتر (loading dye) مخلوط کرده و در درون چاهک ریخته ومقدار 2میکرولیتر از یک مارکر با وزن مولکولی kb 1 هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهک ها استفاده می کنیم .
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ 120 ولت و 55 آمپر الکتروفورز را انجام می دهیم .
وقتی رنگ تا حدود 3/2 ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه Gel) (documentation مورد بررسی قرار می دهیم .
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM
جهت بیان ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM از باکتری E.coli BL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از روی ژل اگارز مرحله الکتروفورز با استفاده از کیت خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد.
3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAMاز ژل
برای تخلیص از کیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل 3-11 )

شکل 3-11. کیت استخراج DNA از ژل فرمنتاز
روش انجام آن بصورت زیر می باشد:
1- به کمک یک اسکالپل استریل، ناحیه ای از ژل که DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM در آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم می کنیم برای راحت ذوب شدن ژل .
2- به ژل حاوی DNA نوترکیب ، 400 میکرولیتر Binding Buffer در داخل یک میکروتیوب اضافه می کنیم.
3- مخلوط را به داخل بن ماری 55 درجه انتقال داده و به مدت 5 دقیقه انکوبه می کنیم برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر 2 دقیقه هم می زنیم .
4- 5 میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه می کنیم .
5- 5 دقیقه در بن ماری 55 درجه قرار می دهیم تا سیلیکا به خوبی حل شود.
6- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند . محلول رویی را دور می ریزیم.
7- 500 میکرولیتر washing buffer به میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط می کنیم.
8- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را دور می ریزیم.
9- مرحله ی 7 و 8 را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود ( الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
10- 30 میکرولیتر بافر TE به رسوب اضافه کرده و ورتکس می کنیم تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود .
11- میکروتیوب را به مدت 5 دقیقه در 55 درجه قرار می دهیم.
12- به مدت 1 دقیقه میکروتیوب را در 000/15 دور سانتریفیوژ کرده تا تمامی ترکیبات جامد ته نشین شود . اینک محلول رویی حاوی DNA تخلیص شده است.
3-5-2 لایگیشن
برای اتصال DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM استخراج شده از ژل، با پلاسمید بیانی pet-28a در آزمایشگاه از آنزیم لیگاز استفاده می شود که می تواند اتصالات فسفودی استری شکسته شده را ترمیم کند. این آنزیم از فاژ T4 استخراج شده است و انرژی لازم برای فعالیت خود را از ATP تامین می کند و می تواند هم انتهاهای صاف و هم چسبنده را به هم متصل کند.
روش انجام این عمل به شکل زیر است:
1- محتویات واکنش را بصورت زیر مخلوط می کنیم.
بافر لایگیشن x 10 : 3 میکرولیتر
آب استریل: 9 میکرولیتر
DNA لیگاز T4 : 1 میکرولیتر
پلاسمید Pet-28a : 2 میکرولیتر
Insert (DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM) : 15 میکرولیتر
حجم نهایی: 30 میکرولیتر
نکته : در آخرین مرحله آنزیم T4، DNA لیگاز اضافه شود. چون اگر بعد از اضافه کردن آنزیم T4 ، محلول برای مدت طولانی در محیط بماند با توجه به قدرت بالای اتصال T4 اتصال های که مورد نظر ما نیست اتفاق خواهد افتاد.
2- به کمک دستگاه ترموسایکلر میکروتیوب حاوی مخلوط واکنش را به مدت 4 ساعت در 16 درجه سانتیگراد سپس به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار می دهیم .
3-5-3 ترانسفورماسیون
برای این مرحله از سویه E.coli BL21(DE3) که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم . این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب می کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین رشد، و تشکیل کلونی می دهد .
3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته
1- باکتری در محیط کشت فاقد کانامایسین کشت داده شد.
2- پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را برداشته و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون کانامایسین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح(over night) در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
3- 400 میکرولیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB مایع تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار می دهیم . 2 تا 3 ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را به ما می دهد.در این حالت باکتری ها در مرحله فاز رشد لگاریتمی قرار دارد.
4- باکتری هایی که تازه شده و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل تقسیم کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم .
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8.سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
9- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
10- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
11- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
12- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
13- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها را می توان برای مدت 72 ساعت روی یخ در یخچال نگهداری کرد و همچنین می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
1- ابتدا 100 میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) را روی یخ ذوب می کنیم.
2- 30 میکرولیتر از محصول لایگیشن را به 100 میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه می کنیم به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه بر روی یخ انکوبه می کنیم.
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار می دهیم، بدون حرکت و کاملا ثابت.
5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB مایع فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 800 میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در 230 میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل می کنیم .
8- 230 میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
3-5-4 ارزیابی کلونی ها
پس از مدت18 تا 20 ساعت در انکوباتور باکتری BL21 بر روی محیط کشت تشکیل کلونی می دهد. یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر محیط LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت
یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب در شیکر انکوباتور قرار می دهیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3) ، پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه آلودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت.
1- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را چند بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله 12 و 13 را یکبار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- ستون را در داخل میکروتیوپ 5/1 قرار داده و به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید بیانی pet-28a که حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM است که به کمک تکنیک لایگیشن به آن انتقال داده شده است، و برای تایید حضور ژن از جایگاه برش آنزیمی که در دو طرف، ابتدا و انتهای ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM در نظر گرفته شده است استفاده می کنیم، برای این منظور از هضم آنزیمی دو گانه استفاده می کنیم سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-5-6-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion و الکتروفورز
1- یک میکروتیوب 2/0 برمی داریم و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید pet-28a نوترکیب: 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
2- میکروتیوب را به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیموم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
3-الکتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسمید و ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM شناسایی و تایید شوند.

nan8

2-5-5- شرایط فیزیکی واکنش آنزیمی .............................................................................................. 34
2-5-6- اثرات فیبر خوراک ............................................................................................................... 34
2-5-7- سن پرنده .............................................................................................................................. 35
2-5-8- ژنوتیپ پرندگان ................................................................................................................... 36
2-5-9- اسیدیته دستگاه گوارش ........................................................................................................ 36
2-6- بهبود قابلیت هضم .................................................................................................................................. 38
2-6-1- روش های کاهش میزان فیتات گیاهی .................................................................................... 38
2-6-1-1- تولید گیاهان با فیتات کمتر ................................................................................................ 38
2-6-1-2- تحریک فعالیت فیتاز با جوانه زدن ...................................................................................... 38
2-6-1-3- خیساندن ........................................................................................................................... 39
2-6-1-4- پیش تیمار آنزیمی خوراک های گیاهی ............................................................................. 39
2-6-1-5- انتقال ژن به گیاهان ............................................................................................................ 40
2-6-2- افزایش قابلیت هضم به کمک افزودنی های جیره ای .............................................................. 41
2-6-2-1- ویتامین D ......................................................................................................................... 41
2-6-2-2- استفاده از فیتاز میکروبی .................................................................................................... 42
2-6-2-3- افزودن کیلات کننده های مواد معدنی ............................................................................... 45
هفت

عنوان صفحه
فهرست مطالب
2-7- اثرات مطلوب تغذیه ای فیتاز بر مواد معدنی ............................................................................................. 45
2-7-1- فسفر ...................................................................................................................................... 45
2-7-2- کلسیم ................................................................................................................................... 46
2-7-3- آهن ...................................................................................................................................... 47
2-7-4- روی ...................................................................................................................................... 47
2-8- عوامل مؤثر بر عملکرد فیتاز میکروبی ..................................................................................................... 48
2-8-1- نسبت کلسیم به فسفر جیره و اثرات متقابل مواد معدنی ............................................................ 48
2-8-2- کوله کلسیفرول ..................................................................................................................... 49
2-8-3- اسیدهای آلی ......................................................................................................................... 50
فصل سوم: مواد و روش
3-1- مشخصات محل آزمایش .......................................................................................................................... 53
3-2- مشخصات واحد آزمایشی ......................................................................................................................... 53
3-3- آماده سازی سالن ..................................................................................................................................... 53
3-4- شرایط محیطی پرورش ............................................................................................................................. 54
3-5- مواد و حیوانات ........................................................................................................................................ 54
3-6- چگونگی توزیع جوجه ها ......................................................................................................................... 55
3-7- جیره های آزمایشی .................................................................................................................................. 55
3-8- برنامه واکسیناسیون گله تحت آزمایش ...................................................................................................... 62
3-9- شاخص های مورد اندازه گیری ................................................................................................................ 62
3-9-1- مصرف خوراک ................................................................................................................... 62
3-9-2- افزایش وزن بدن ................................................................................................................... 62
3-9-3- ضریب تبدیل خوراک .......................................................................................................... 63
3-9-4- صفات مربوط به لاشه ............................................................................................................ 63
3-9-4-1- بازده لاشه ......................................................................................................................... 63
3-9-4-2- وزن نسبی سینه .................................................................................................................. 64
هشت
3-9-4-3- وزن نسبی ران ها .............................................................................................................. 64
عنوان صفحه
فهرست مطالب
3-9-4-4- وزن نسبی بال ها ................................................................................................................ 64
3-9-4-5- وزن نسبی پشت ................................................................................................................. 64
3-9-4-6- وزن نسبی گردن ................................................................................................................ 64
3-9-5- اندام های حفره بطنی ............................................................................................................. 65
3-9-5-1- وزن نسبی چربی................................................................................................................. 65
3-9-5-2- وزن نسبی کبد، طحال و قلب ............................................................................................. 65
3-9-6- اجزای دستگاه گوارش .......................................................................................................... 65
3-9-6-1- وزن نسبی پیش معده ......................................................................................................... 65
3-9-6-2- وزن نسبی سنگدان ............................................................................................................ 66
3-9-6-3- وزن نسبی روده ها ............................................................................................................. 66
3-9-6-4- طول ژژنوم و ایلیوم ........................................................................................................... 66
3-9-7- نمونه گیری و آنالیز های خونی .............................................................................................. 67
3-9-8- تعیین قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی .....................................................................................67
3-9-8-1- اندازه گیری اکسید تیتانیوم در نمونه های خوراک و محتویات ایلئوم .................................. 68
3-9-8-2- تعیین انرژی قابل متابولیسم ظاهری ..................................................................................... 69
3-9-8-3- اندازه گیری قابلیت هضم پروتئین ...................................................................................... 69
3-9-8-4- تعیین قابلیت هضم کلسیم .................................................................................................. 69
3-9-8-5- تعیین قابلیت هضم فسفر کل .............................................................................................. 70
3-10- مدل آماری طرح ................................................................................................................................... 70
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1- مصرف خوراک ...................................................................................................................................... 73
4-2- افزایش وزن و وزن پایانی ......................................................................................................................... 82


4-2-1- افزایش وزن .......................................................................................................................... 82
4-2-2- وزن پایانی ............................................................................................................................ 84
4-3- ضریب تبدیل خوراک ............................................................................................................................. 98
نه

عنوان صفحه
فهرست مطالب
4-4- صفات مربوط به لاشه ............................................................................................................................ 107
4-4-1- بازده لاشه ........................................................................................................................... 107
4-4-2- وزن نسبی سینه .................................................................................................................... 107
4-4-3- وزن نسبی ران ها ................................................................................................................. 108
4-4-4- وزن نسبی بال ها ................................................................................................................. 108
4-4-5- وزن نسبی پشت .................................................................................................................. 108
4-4-6- وزن نسبی گردن ................................................................................................................. 109
4-5- اندام های حفره بطنی ............................................................................................................................. 114
4-5-1- وزن نسبی چربی ................................................................................................................. 114
4-5-2- وزن نسبی کبد .................................................................................................................... 114
4-5-3- وزن نسبی طحال ................................................................................................................. 115
4-5-4- وزن نسبی قلب .................................................................................................................... 115
4-6- اندام های دستگاه گوارش ...................................................................................................................... 121
4-6-1- وزن نسبی پیش معده ........................................................................................................... 121
4-6-2- وزن نسبی سنگدان .............................................................................................................. 121
4-6-3- وزن نسبی روده ها ............................................................................................................... 122
4-6-4- طول نسبی روده کوچک .................................................................................................... 122
4-7- فراسنجه های خونی ............................................................................................................................... 128
4-7-1- آنالیز سرم خون ................................................................................................................... 128
4-7-1-1- متابولیت های سرم .......................................................................................................... 128
4-7-1-1-1- اوره ........................................................................................................................... 128
4-7-1-1-2- کلسترول .................................................................................................................... 128
4-7-1-1-3- تری گلیسریدهای خون .............................................................................................. 129
4-7-1-1-4- پروتئین کل ................................................................................................................ 129
4-7-1-2- فعالیت آنزیمی سرم ........................................................................................................ 136
4-7-1-2-1- آلکالین فسفاتاز .......................................................................................................... 136
ده
4-7-1-2-2- آسپارتات آمینوترانسفراز ............................................................................................ 136
عنوان صفحه
فهرست مطالب
4-7-1-2-3- آلانین آمینو ترانسفراز ................................................................................................ 137
4-7-1-2-4- لاکتات دهیدروژناز .................................................................................................... 137
4-7-2- غلظت مواد معدنی پلاسما ................................................................................................... 145
4-7-2-1- کلسیم ............................................................................................................................ 145
4-7-2-2- فسفر .............................................................................................................................. 145
4-7-2-3- منیزیوم ........................................................................................................................... 146
4-7-2-4- آهن ............................................................................................................................... 146
4-7-2-5- روی ............................................................................................................................... 147
4-8- قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی ............................................................................................................. 155
4-8-1- پروتئین ............................................................................................................................... 155
4-8-2- انرژی قابل متابولیسم ........................................................................................................... 155
4-8-3- کلسیم ................................................................................................................................ 156
4-8-4- فسفر کل ............................................................................................................................ 157
نتیجه گیری کلی .............................................................................................................................................. 169
پیشنهادات ........................................................................................................................................................ 170
منابع مورد استفاده ............................................................................................................................................ 172
ضمائم ............................................................................................................................................................. 187
چکیده انگلیسی .................................................................................................................................................. II
یازده

عنوان صفحه
فهرست جداول
جدول شماره 3-1. درصد اجزای تشکیل دهنده جیره های آزمایشی در دوره 21-7 روزگی ............................... 57
جدول شماره 3-2. درصد اجزای تشکیل دهنده جیره های آزمایشی در دوره 42-21 روزگی.............................. 58
جدول شماره 3-3. مقادیر محاسبه شده ترکیبات مواد مغذی مواد خوراکی.......................................................... 59
جدول شماره 3-4. ترکیب مواد مغذی جیره های آزمایشی در دوره 42-21 روزگی........................................... 60
جدول شماره 3-5. ترکیب مواد مغذی جیره های آزمایشی در دوره 42-21 روزگی............................................ 61
جدول 3-6. برنامه واکسیناسیون جوجه ها در طول دوره آزمایش ....................................................................... 62
جدول شماره 4-1. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر مصرف خوراک هفتگی جوجه های گوشتی............................................................................................................................................. 77
جدول شماره 4-2. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر مصرف خوراک دوره ای جوجه های گوشتی............................................................................................................................................. 78
جدول شماره 4-3. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر افزایش وزن هفتگی جوجه های گوشتی............................................................................................................................................. 90
جدول شماره 4-4. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر افزایش وزن دوره ای جوجه های گوشتی............................................................................................................................................. 91
جدول شماره 4-5. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر وزن جوجه های گوشتی در سنین مختلف ................................................................................................................................................ 95
جدول شماره 4-6. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر ضریب تبدیل خوراک جوجه های گوشتی ......................................................................................................................................... 102
جدول شماره 4-7. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر ضریب تبدیل خوراک دوره ای جوجه های گوشتی ............................................................................................................................ 103
جدول شماره 4-8. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر صفات لاشه جوجه های گوشتی ........................................................................................................................................................... 111
جدول شماره 4-9. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر چربی حفره بطنی و اندام های حفره بطنی جوجه های گوشتی ....................................................................................................... 117
جدول شماره 4-10. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر اندام های دستگاه گوارش جوجه های گوشتی ............................................................................................................................ 124
دوازده

عنوان صفحه
فهرست جداول
جدول شماره 4-11. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر غلظت متابولیت های سرم خون جوجه های گوشتی ................................................................................................................................. 132
جدول شماره 4-12. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر فعالیت آنزیمی سرم خون جوجه های گوشتی .......................................................................................................................................... 141
جدول شماره 4-13. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر غلظت مواد معدنی پلاسمای خون جوجه های گوشتی ................................................................................................................... 151
جدول شماره 4-14. اثر جیره های آزمایشی حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک و فیتاز بر قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی در جوجه های گوشتی ........................................................................................................................... 166
جدول 1. نتایج آنالیز داده های تکرار دار مربوط به مصرف خوراک ................................................................. 188
جدول 2. نتایج آنالیز داده های تکرار دار مربوط به وزن بدن ............................................................................. 188
جدول 3. نتایج آنالیز داده های تکرار دار مربوط به افزایش وزن ........................................................................ 189
جدول 4. نتایج آنالیز داده های تکرار دار مربوط به ضریب تبدیل خوراک ........................................................ 189
جدول 5. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به بازده لاشه ............................................................................ 190
جدول 6. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی سینه ..................................................................... 190
جدول 7. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی ران ها .................................................................. 190
جدول 8. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی بال ها ................................................................... 191
جدول 9. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی پشت .................................................................... 191
جدول 10. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی گردن ................................................................. 191
جدول 11. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی چربی حفره بطنی............................................... 192
جدول 12. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی کبد .................................................................... 192
جدول 13. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی طحال ................................................................. 192
جدول 14. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی قلب ................................................................... 193
جدول 15. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی پیش معده .......................................................... 193
جدول 16. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی سنگدان ............................................................. 193
جدول 17. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به وزن نسبی روده ها .............................................................. 194
جدول 18. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به طول نسبی ژژنوم ................................................................ 194
سیزده
جدول 19. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به طول نسبی ایلئوم ................................................................. 194
عنوان صفحه
فهرست جداول
جدول 20. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به غلظت اوره سرم ................................................................. 195
جدول 21. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به غلظت کلسترول سرم .......................................................... 195
جدول 22. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به تری گلیسریدهای خون ...................................................... 195
جدول 23. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به پروتئین کل سرم ................................................................ 196
جدول 24. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به آنزیم آلکالین فسفاتاز سرم ................................................. 196
جدول 25. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز سرم .................................. 196
جدول 26. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز سرم ........................................ 197
جدول 27. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به آنزیم لاکتات دهیدروژناز سرم ........................................... 197
جدول 28. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به غلظت کلسیم پلاسما .......................................................... 197
جدول 29. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به غلظت فسفر پلاسما ............................................................ 198
جدول 30. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به غلظت منیزیوم پلاسما ......................................................... 198
جدول 31. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به غلظت آهن پلاسما ............................................................. 198
جدول 32. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به غلظت روی پلاسما ............................................................. 199
جدول 33. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به قابلیت هضم پروتئین ........................................................... 199
جدول 34. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به قابلیت هضم انرژی قابل متابولیسم ....................................... 199
جدول 35. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به قابلیت هضم کلسیم ............................................................ 200
جدول 36. نتایج آنالیز واریانس داده های مربوط به قابلیت هضم فسفر کل ........................................................ 200
چهارده

عنوان صفحه
فهرست شکل ها
شکل 2-1- اسید فایتیک یا اینوزیتول 1، 2، 3، 4، 5، 6- هگزا دی هیدروژن فسفات ............................................. 7
شکل 2-2- شکل کیلات شده اسید فایتیک (فیتین) ........................................................................................... 13
شکل 2-3- کمپلکس های دو گانه و سه گانه پروتئین-فیتات ............................................................................. 19
شکل 3-1- نمایی از سالن پرورش ..................................................................................................................... 53
عنوان صفحه
فهرست نمودارها
نمودار شماره 4-1: اثر جیره های مختلف بر مصرف خوراک هفتگی جوجه های گوشتی .................................... 79
نمودار شماره 4-2: اثر جیره های مختلف بر مصرف خوراک دوره ای جوجه های گوشتی .................................. 79
نمودار شماره 4-3: اثر اسید سیتریک بر مصرف خوراک جوجه های گوشتی ...................................................... 80
نمودار شماره 4-4: اثر فیتاز میکروبی بر مصرف خوراک جوجه های گوشتی ...................................................... 81
نمودار شماره 4-5: اثر جیره های مختلف بر افزایش وزن هفتگی جوجه های گوشتی .......................................... 92
نمودار شماره 4-6: اثر جیره های مختلف بر افزایش وزن جوجه های گوشتی ...................................................... 92
نمودار شماره 4-7: اثر اسید سیتریک بر افزایش وزن جوجه های گوشتی ............................................................ 93
نمودار شماره 4-8: اثر فیتاز میکروبی بر افزایش وزن جوجه های گوشتی ............................................................ 94
نمودار شماره 4-9: اثر جیره های مختلف بر وزن جوجه های گوشتی................................................................... 96
نمودار شماره 4-10: اثر اسید سیتریک بر وزن جوجه های گوشتی....................................................................... 97
نمودار شماره 4-11: اثر فیتاز میکروبی بر وزن جوجه های گوشتی....................................................................... 97
نمودار شماره 4-12: اثر جیره های مختلف بر ضریب تبدیل خوراک جوجه های گوشتی .................................. 104
نمودار شماره 4-13: اثر جیره های مختلف بر ضریب تبدیل خوراک جوجه های گوشتی .................................. 104
نمودار شماره 4-14: اثر اسید سیتریک بر ضریب تبدیل خوراک جوجه های گوشتی ........................................ 105
نمودار شماره 4-15: اثر فیتاز میکروبی بر ضریب تبدیل خوراک جوجه های گوشتی ........................................ 106
نمودار شماره 4-16: اثر جیره های مختلف برصفات لاشه جوجه های گوشتی ................................................... 112
نمودار شماره 4-17: اثر اسید سیتریک برصفات لاشه جوجه های گوشتی ............................................... 113 نمودار شماره 4-18: اثر فیتاز میکروبی برصفات مربوط به لاشه جوجه های گوشتی ........................................... 113
پانزده
نمودار شماره 4-19: اثر جیره های مختلف بر اندام های حفره بطنی جوجه های گوشتی .................................... 118
عنوان صفحه
فهرست نمودارها
نمودار شماره 4-20: اثر اسید سیتریک بر اندام های حفره بطنی جوجه های گوشتی .......................................... 119
نمودار شماره 4-21: اثر فیتاز میکروبی بر اندام های حفره بطنی جوجه های گوشتی ........................................... 120
نمودار شماره 4-22: اثر جیره های مختلف بر اندام های دستگاه گوارش جوجه های گوشتی ............................. 125
نمودار شماره 4-23: اثر اسید سیتریک بر اندام های دستگاه گوارش جوجه های گوشتی .............................. 126 نمودار شماره 4-24: اثر فیتاز میکروبی بر اندام های دستگاه گوارش جوجه های گوشتی ................................... 127
نمودار شماره 4-25: اثر جیره های مختلف بر غلظت متابولیت های سرم خون جوجه های گوشتی ..................... 133 نمودار شماره 4-26: اثر اسید سیتریک بر غلظت متابولیت های سرم خون جوجه های گوشتی ........................... 134
نمودار شماره 4-27: اثر فیتاز میکروبی بر غلظت متابولیت های سرم خون جوجه های گوشتی ........................... 135
نمودار شماره 4-28: اثر جیره های مختلف بر فعالیت آنزیمی سرم خون جوجه های گوشتی .............................. 142
نمودار شماره 4-29: اثر اسید سیتریک بر فعالیت آنزیمی سرم خون جوجه های گوشتی .................................... 143
نمودار شماره 4-30: اثر فیتاز میکروبی بر فعالیت آنزیمی سرم خون جوجه های گوشتی .................................... 144
نمودار شماره 4-31: اثر جیره های مختلف بر غلظت مواد معدنی پلاسما خون جوجه های گوشتی ..................... 152
نمودار شماره 4-32: اثر اسید سیتریک بر غلظت مواد معدنی پلاسما خون جوجه های گوشتی ........................... 153
نمودار شماره 4-33: اثر فیتاز میکروبی بر غلظت مواد معدنی پلاسما خون جوجه های گوشتی ........................... 154
نمودار شماره 4-34: اثر جیره های مختلف بر قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی .................................................. 167
نمودار شماره 4-35: اثر اسید سیتریک بر قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی ........................................................ 168
نمودار شماره 4-36: اثر فیتاز میکروبی بر قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی ......................................................... 168
شانزده

اثر اسید سیتریک و فیتاز میکروبی بر قابلیت هضم ایلئومی پروتئین
و عملکرد جوجه های گوشتی
چکیده:
تعداد 270 قطعه جوجه گوشتی نر سویه راس در یک طرح بر پایه بلوک کامل تصادفی و در قالب آزمایش فاکتوریل 3×3 با 9 تیمار آزمایشی، سه تکرار و 10 قطعه جوجه در هر تکرار از سن 7 تا 42 روزگی مورد آزمایش قرار گرفتند. جیره ها بر پایه ذرت-سویا و حاوی سطوح مختلف اسید سیتریک (0، 3 و 6 درصد) و جیره های حاوی سطوح مختلف آنزیم فیتاز میکروبی (0، 500 و 1000 واحد فعال آنزیم) بودند. صفاتی نظیر مصرف خوراک، وزن بدن، افزایش وزن هفتگی، ضریب تبدیل خوراک، صفات مربوط به لاشه، وزن نسبی اندام های حفره بطنی، وزن نسبی اجزاء دستگاه گوارش، متابولیت های سرم، فعالیت آنزیمی سرم، غلظت مینرال های پلاسما، قابلیت هضم ایلئومی پروتئین، انرژی قابل متابولیسم، کلسیم و فسفر کل در طول دوره آزمایش اندازه گیری و مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج نشان داد که جیره های حاوی اسید سیتریک بر مصرف خوراک، افزایش وزن و وزن پایانی اثر معنی دار (01/0>P) داشتند و موجب بهبود غیر معنی دار ضریب تبدیل خوراک گردیدند. همچنین اثر آن بر بازده لاشه معنی دار (01/0>P) بود اما بر صفات لاشه اثر معنی داری نداشت. اثر استفاده از سطوح مختلف اسید سیتریک در جیره ها بر اندام های حفره بطنی (باستثنای وزن نسبی قلب) معنی دار نبود. مشخص گردید که اثر اسید سیتریک بر وزن نسبی اندام های مختلف دستگاه گوارش، غلظت کلسترول و فعالیت آنزیم های ALP و LDH سرم خون معنی دار (05/0>P) بود اما بر غلظت اوره، تری گلیسریدها، پروتئین کل و فعالیت آنزیم های ALT و AST سرم اثر معنی داری نداشت. اثر جیره های حاوی اسید سیتریک بر غلظت فسفر و آهن پلاسما معنی دار (05/0>P) اما بر غلظت مینرال های کلسیم، منیزیوم و روی معنی دار نبود. نتایج نشان داد که افزودن 3 درصد اسید سیتریک موجب بهبود معنی دار (05/0>P)، قابلیت هضم ایلئومی پروتئین، انرژی قابل متابولیسم و فسفرکل می شود اما بر قابلیت هضم ایلئومی کلسیم اثر معنی داری نداشت. اثر آنزیم فیتاز میکروبی بر صفاتی نظیر مصرف خوراک، وزن بدن و افزایش وزن معنی دار بوده (05/0>P) اما بر ضریب تبدیل خوراک معنی دار نبود. آنزیم فیتاز موجب افزایش معنی دار وزن نسبی گردن (05/0>P) و کاهش معنی دار چربی حفره بطنی (05/0>P) گردید اما بر سایر صفات لاشه، اندام های مختلف دستگاه گوارش و اندام های حفره بطنی اثر معنی داری نداشت. آنزیم فیتاز هر چند بر غلظت تری گلیسریدهای خون (05/0>P) و فعالیت آنزیمی سرم اثر معنی داری (01/0>P) داشت اما غلظت اوره، کلسترول و پروتئین کل سرم معنی دار نبود. همچنین جیره های حاوی آنزیم فیتاز بر غلظت فسفر و آهن پلاسما اثر معنی دار (05/0>P) داشت اما بر غلظت سایر مینرال های پلاسما اثر معنی داری ایجاد نکرد. نتایج نشان داد که اثر جیره های مکمل شده با آنزیم فیتاز بر قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی معنی دار (01/0>P) بود.
واژگان کلیدی: اسید سیتریک، فیتاز میکروبی، قابلیت هضم ایلئومی، عملکرد، جوجه های گوشتی.
هفده

فصل اول

1- 1 مقدمه
فسفر از لحاظ اهمیت در بدن دام اولین ماده معدنی است و تقریباً 80% آن در استخوان ها یافت می شود. هم چنین در تشکیل و نگهداری استخوان نقش دارد (آندروود و ساتل، 1999). کمبود فسفر موجب شکستن یا ترک برداشتن استخوان های درشت نی و نازک نی در طی مراحل رشد و در نتیجه موجب کاهش ارزش گوشت طیور می شود. تقریباً دو سوم کل فسفر گیاهان به شکل فیتات (پانا و رولند، 1999؛ وایوروس و همکاران، 2000)، که غیر قابل دسترس به منظور استفاده تغذیه ای طیور، می باشد. اسید فایتیک (میواینوزیتول 1، 2، 3، 4، 5 و 6 –هگزا کیس دهیدروژن فسفات) شکل ذخیره اولیه فسفر در دانه های غلات، حبوبات و دانه های روغنی است. مولکولهای اسید فایتیک دارای فسفر بالا (2/28) و پتانسیل تشکیل کیلات، به فرم های مختلفی از نمک های غیر محلول، مانند کاتیون های دو و سه ظرفیتی در pH طبیعی هستند. یک مول از اسید فایتیک در شرایط روده کوچک می تواند به طور متوسط 3 تا 6 مول کلسیم را به شکل فیتات غیرمحلول درآورد. تشکیل فیتات غیر محلول، کلسیم و فسفر را غیر قابل دسترس می سازد. هم چنین روی، مس، کبالت، منگنز، آهن و منیزیم نیز تحت تأثیر فیتات قرار می گیرند. میل ترکیبی روی و مس با اسید فایتیک نسبت به یون های دیگر بیشتر است. تشکیل این کمپلکس می تواند جذب این مواد معدنی را در روده کوچک کاهش دهد. حیوانات تک معده ای فاقد فیتاز مخاطی اندوژنیک کافی، جهت هضم مؤثر فیتات می باشند. در نتیجه بیشتر فسفر باند شده با فیتات از طریق فضولات دفع می شود. از طرفی دفع فسفر از طریق فضولات بیشترین نگرانی را از لحاظ زیست محیطی ایجاد می کند. فسفات ها به مقدار کمی در آب، محلول می باشند و در نهایت تجمع آنها در خاک ممکن است موجب آلودگی های محیطی گردد، چنانکه حیات آبزیان را به خطر اندازد. همچنین فیتات غیر قابل هضم، دارای اثر منفی بر قابلیت هضم پروتئین و مواد معدنی است (آنجل و همکاران، 2000) و عمل آنزیم های پروتئولیتیک از قبیل پپسین و تریپسین را در دستگاه گوارش محدود می کند. در شرایط اسیدی، گروه های فسفر اسید فایتیک ممکن است با گروه های آمینی اسیدهای آمینه، از قبیل لیزین، هیستیدین و آرژنین باند شده و قابلیت استفاده آنها را کاهش دهند. در شرایط طبیعی گروه های کربوکسیل تعدادی از اسیدهای آمینه، ممکن است از طریق مواد معدنی دو و سه ظرفیتی با اسید فایتیک باند شوند. کمپلکس فیتات و پروتئین و یا پروتئین، مواد معدنی و فیتات، قابلیت مصرف پروتئین را کاهش می دهد. هم چنین طی بررسی های متعدد نشان داده شده که، نشاسته هم توسط اسید فایتیک باند شده و در نتیجه انرژی قابل سوخت و ساز جیره را کاهش می دهد. در سال های اخیر تحقیقات قابل توجهی در مسیر شناخت فرآیند فیتات و توسعه روش هایی به منظور بهبود بهره وری از فسفر فیتاته با استفاده از حیوانات صورت پذیرفته است. روش های فیزیکی مانند خیساندن، خشک کردن، جوانه زنی (جان بلود و همکاران، 1991)، استفاده از مکمل جیره با فیتاز میکروبی برون زادی و ویتامین D، روش هایی هستند که در افزایش هیدرولیز فیتات مؤثرند (میشل و ادواردز، 1996). یکی از روش های مؤثر و کاربردی در جهت بهبود قابلیت هضم فیتات در جیره حیوانات، توسعه صنعت تولید آنزیم و مکمل کردن جیره ها با منابع فیتاز میکروبی یا قارچی می باشد. فیتاز آنزیمی از گروه فسفاتازها است که توانایی کاتالیز و آزاد کردن فسفر از فیتات را دارا می باشد. فیتاز توسط بسیاری از قارچ ها، باکتری ها و مخمرها تولید می شود و قادر به هیدرولیز فیتات به میواینوزیتول و فسفر معدنی است. تحقیقات زیادی در زمینه پیامدهای تغذیه ای و محیطی اسید فایتیک و خصوصیات سنیتیکی، ساختاری و کاربردی آنزیم فیتاز انجام گردیده است. نتایج چندین پژوهش، کارایی آنزیم تجاری فیتاز میکروبی را به عنوان افزودنی خوراک در بهبود عملکرد، ضریب تبدیل، درصد خاکستر استخوان درشت نی و قابلیت هضم فسفر، کلسیم و در مواردی پروتئین را در جوجه های گوشتی نشان داده است (دنبو و همکاران، 1998؛ یان و همکاران، 2003؛ اونیانگو و همکاران، 2005). فیتازهای میکروبی به طور مؤثری قابلیت بهره وری فسفر فیتاته جیره را بهبود بخشیده است، لذا جایگزینی جزئی یا کامل آن به جای مکمل فسفر غیرآلی در جیره حیوانات تک معده ای، امکان پذیر است. به نظر می رسد استفاده از آنزیم فیتاز علاوه بر افزایش قابلیت دسترسی فسفر فیتات، دارای مزایای دیگری است که عبارتند از: 1- افزایش فراهمی سایر مواد معدنی از قبیل آهن، روی، مس، کلسیم، مولیبدن، کبالت و ... 2- بهبود کارایی آنزیم های گوارشی و افزایش آنها نظیر آلفا آمیلاز، پپسین و تریپسین 3- فراهمی پروتئین و اسیدهای آمینه 4- بهبود انرژی قابل متابولیسم و ماده خشک مصرفی 5- کاهش فسفر دفعی در فضولات طیور 6- کاهش قیمت جیره 7- استفاده از جیره های متراکم تر.
توانایی آنزیم فیتاز میکروبی در تشخیص پیوند فیتات با فسفر و تأثیر آن در کاهش دفع فسفر به خوبی شناسایی شده است. فیتاز به عنوان یک منبع اقتصادی فسفر بوده و در حفاظت از ذخیره های فسفر غیر قابل تجدید مفید است. به نظر می رسد که در شرایط ایده آل، فیتاز خارجی کمتر از 35/0 % از فیتات موجود در رژیم غذایی مرغ های گوشتی را هیدرولیز می کند. جای امیدواری است که بتوان با تولید آنزیم های مؤثرتر در تجزیه ی فیتات، تجزیه ی آن را افزایش داده و به این ترتیب تغذیه را بهبود بخشید. در ضمن می توان با انتخاب علوفه ای با میزان فیتات کم و یا علوفه ای که تجزیه کننده های فیتات زیادی داشته باشد، مقدار فیتات را در رژیم غذایی کاهش داد. فیتات بر روی مصرف انرژی و پروتئین در پرندگان، اثرات منفی دارد و اثرات منفی این ترکیب از طریق آنزیم فیتاز قابل جبران است. البته هنوز روی این نکته که فیتاز باعث افزایش مصرف انرژی و پروتئین می شود اتفاق نظر وجود ندارد. میزان هضم اسیدهای آمینه در مجاورت فیتاز متفاوت بوده و مکانیسم های انجام این فرآیند هنوز به خوبی درک نشده است. شاید آنزیم های فیتاز روی مصرف انرژی و پروتئین اثر بسیار مثبتی داشته باشند اما این مسئله زمانی آشکارتر می گردد که میزان تجزیه فیتات بیشتر شود. استفاده آزمایشی از تجریه کننده فیتات می تواند در شناسایی اثرات منفی فیتات روی مصرف انرژی و پروتئین و نیز شناسایی فاکتورهای کمکی بویژه در رابطه با مصرف انرژی کمک کند. برخی مطالعات اخیر نشان می دهد که میزان سدیم داخلی در اثر مصرف فیتات و فیتاز در خوراک به ترتیب افزایش و کاهش می یابد. اگر چه علت اساسی افزایش سدیم در فضای داخلی روده در اثرات فیتات معلوم نیست اما این مسئله در جذب روده ای گلوکز و اسیدهای آمینه و در هموستازی اسیدی کاربرد دارد.
هم چنین تحقیقات نشان داده که اسیدیته دستگاه گوارش طیور برای تجزیه کامل یا قابل قبول فیتات توسط فیتاز مطلوب نیست. بدلیل اینکه بازده عمل فیتاز به اسیدیته و غلظت سایر کاتیون های آزاد مرتبط می باشد، لذا ممکن است با استفاده از اسیدهای آلی با خواص کیلات کنندگی بتوان بازده عمل فیتاز را تشدید نمود. در صورتی که اسیدهای آلی pH مناسبی برای آنزیم های پروتئولیتیک در دستگاه گوارش ایجاد می کنند.
گزارش شده است افزودن اسید سیتریک در جیره های حاوی فسفر کم، موجب بهبود وزن بدن، ضریب تبدیل، کاهش فعالیت آلکالین فسفاتاز و افزایش غلظت فسفر پلاسما می گردد اما اثری بر مصرف خوراک، خاکستر استخوان درشت نی و غلظت کلسیم پلاسما ندارد. فیتاز میکروبی موجب بهبود وزن بدن و ضریب تبدیل خوراک در جیره های کم فسفر شده ولی اثر متقابل میان اسید سیتریک و فیتاز مشاهده نگردیده است (ابراهیم نژاد و همکاران، 2008). در آزمایشی که توسط سنتنو و همکاران (2007) انجام شد، با افزایش سطح اسید سیتریک از 2 به 5% اثری در عملکرد مشاهده نگردید ولی موجب بهبود قابلیت هضم پروتئین خام شد که معنی دار نبود. اسید سیتریک به تنهایی در قابلیت هضم پروتئین مؤثر نبوده و همچنین اثر متقابل اسید سیتریک و فیتاز میکروبی مشاهده نگردیده است. نتایج بررسی اثر چند اسیدآلی بر هیدرولیز فسفر فیتاته نشان داد که افزودن اسید سیتریک موجب ابقاء بیشتر کلسیم و فسفر و همچنین بهبود در عملکرد رشد جوجه های گوشتی در مقایسه با اسید فورمیک و اسید مالیک گردیده است (لیم و همکاران، 2008). آزمایش موجود نیز به منظور بررسی اثر اسید سیتریک و فیتاز میکروبی بر قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی (پروتئین، انرژی، کلسیم و فسفر) و عملکرد جوجه های گوشتی اجرا گردید.
1- 2 اهداف
اهداف این تحقیق عبارت بودند از:
افزایش قابلیت دسترسی فسفر و قابلیت هضم ایلئومی مواد مغذی جیره.
بررسی اثرات اسید سیتریک و فیتاز میکروبی و اثر همکوشی آنها و مقایسه ی اثرات اصلی در بهبود عملکرد جوجه های گوشتی.
بررسی اثر اسید سیتریک و فیتاز میکروبی بر فعالیت آنزیمی سرم و ابقاء مواد معدنی دو ظرفیتی پلاسما.
فصل دوم

2- 1 اسید فایتیک
2- 1- 1 ساختار اسید فایتیک
1694180847725اسید فایتیک در اثر استریفیکاسیون میو اینوزیتول (که یک الکل حلقویی با 6 ریشه ی هیدروکسی مشابه قندهای هگزوز است) با 6 مولکول فسفات تشکیل می شود (شکل 2-1).
شکل 2- 1 - اسید فایتیک یا میو اینوزیتول 1، 2، 3، 4، 5، 6- هگزا دی هیدروژن فسفات
این مولکول دارای 12 محل تجزیه پروتون بوده که شش محل از این مراکز شدیداً اسیدی (دارای pKa تقریباً 5/1)، سه محل دیگر از این مراکز، اسیدی ضعیف با مقادیر pKa ، 7/5، 8/6، 6/7 و سه مرکز باقیمانده، اسیدی بسیار ضعیف با pKa بیشتر از 10 هستند (مائنز، 2001). ساختمان این مولکول دارای قدرت کیلات کنندگی زیادی برای کاتیون های دو ظرفیتی است و برای اندازه گیری میزان پایداری کمپلکس های فیتات–مواد معدنی در محلول از روش کاهش pH استفاده می گردد، زیرا یون های فلزی برای اتصال به گروه های فسفات مولکول فیتات، جایگزین یون های H+ می شوند.
یکی از عوامل رسوب فیتات–ماده معدنی، افزایش غلظت و نسبت مولی ماده معدنی به فیتات در pH خنثی می باشد (چامپینگ و فیشر، 1990). هنگامی که غلظت مواد معدنی نسبت به غلظت فیتات فزونی می یابد تمایل به تشکیل کمپلکس های نامحلول فیتات–ماده معدنی در pH های خنثی و بازی افزایش می یابد. فیتات در محیط اسیدی(5 > pH)، در حضور یون کلسیم (2+Ca) و یا منیزیوم (2+Mg) حتی در نسبت های 12 به 1 ماده معدنی به فیتات، ایجاد رسوب نمی کند (چریان و همکاران، 1983). این یافته ها نشان می دهد که یک یا چندین گروه از گروه های فسفات با قدرت اسیدی ضعیف در مولکول فیتات، تمایل بیشتری برای پروتون ها نسبت به یون های کلسیم (2+Ca) و منیزیوم (2+Mg) از خود بروز می دهند. با افزایش pH محیط، نسبت مولی ماده معدنی به فیتات مورد نیاز برای رسوب فیتات کاهش یافت (چریان و همکاران، 1983). نشان داده شده است هنگامی که در محیط با pH خنثی غلظت مواد معدنی افزایش می یابد، بیشتر رسوبات نمکی فیتات، بصورت پنتا کلسیم یا پنتا منیزیوم می باشند (چریان و همکاران، 1983). در pH اسیدی، به علت اتصال یون های پروتون با مولکول فیتات، اتصال مواد معدنی با این مولکول کاهش یافته، بنابراین از تشکیل رسوبات نامحلول جلوگیری می شود.
چریان (1980) با خلاصه کردن نتایج چندین مطالعه که در آنها از روش کاهش pH استفاده شده بود، نتیجه گرفت که اسید فایتیک به آسانی با کاتیون های چند ظرفیتی کمپلکس تشکیل می دهد که در این راستا پایدارترین کمپلکس با یون روی (2+Zn) است، بعد از آن به ترتیب کمپلکس های ایجاد شده با یون های 2+ Cu، 2+ Ni، 2+ Co، 2+ Mn،2+ Ca و 2+ Fe پایداری کمتری دارند. کمپلکس فیتات–ماده معدنی به دو شکل کیلات محلول و یا کمپلکس نامحلول وجود دارد که شکل نامحلول بسته به غلظت اسید فایتیک و مواد معدنی و pH محلول، رسوب می کند. اطلاعاتی در زمینه ساختمان کمپلکس های محلول فیتات-مواد معدنی در دسترس است، به طوری که چمپانجی و همکاران (1990) با روش پرتوسنجی تغییر مکان فسفر نشان دار را در محلولی با 7 = pH و نسبت مولی پایین مواد معدنی به فیتات بررسی کردند و نشان دادند که تحت شرایط آزمایش آنها، یک یون روی (2+Zn) به گروه های فسفات شماره پنج (5P) فیتات متصل شده و به این وسیله پلی بین دو مولکول فیتات تشکیل می دهد. در مقایسه با یون روی، یون های کلسیم (2+Ca) و مس (2+Cu) تمایل بیشتری برای اتصال با گروه های فسفات شماره چهار و شش (4 P و 6P) نشان دادند و کمپلکس های محلولی را از طریق ایجاد پیوندهای الکترواستاتیک داخل یک مولکول فیتات تشکیل دادند.
2- 1- 2 اسید فایتیک در گیاهان
دانه های غلات (ذرت، جو، گندم و یولاف) و برخی حبوبات (مانند نخود) که عموماً به عنوان مواد غذایی در جیره غذایی طیور استفاده می شوند، دارای مقادیر مشابهی فیتات (تقریباً 25/0 درصد ماده خشک) می باشند و این مقدار در سویا 39/0 درصد، کنجاله منداب 70/0 درصد، کنجاله تخم پنبه دانه 84/0 درصد و کنجاله تخم آفتابگردان 89/0 درصد ماده خشک می باشد. اسید فایتیک به عنوان شکل ذخیره ای فسفر در دانه های گیاهی محسوب شده و 65 تا 70 درصد فسفر منابع گیاهی به صورت فسفر فیتاتی است (نیوکایرک و همکاران، 1998). راویندران و همکاران (1995) تحقیقات گسترده ای در مورد میزان اسید فایتیک در طیف وسیعی از واریته های گیاهی انجام دادند. در گیاهان، اسید فایتیک به میزان زیادی با یون های پتاسیم (+K)، منیزیوم (2+Mg) و به میزان کمتری با یون های کلسیم (2+Ca) تشکیل کمپلکس فیتین می دهد. فیتین در داخل غشاء به واکوئل های پروتئینی متصل می گردد. در زیر میکروسکوپ الکترونی، فیتین اغلب به صورت ساختمان کریستالی گلوبوئید نامحلول در داخل اجسام پروتئینی قابل رؤیت است. در دانه ی برنج، کریستال های گلوبوئید بر اساس وزن خشک از 67 درصد اسید فایتیک، 19 درصد پتاسیم (+K) و 11 درصد منیزیوم (2+Mg) تشکیل شده اند (لوت و همکارن، 1985). محل ذخیره اجسام پروتئینی دارای فیتین در دانه های گیاهان، به طور قابل ملاحظه ای متغیر است. در گندم و برنج، فیتین در لایه آلورون و سبوس یافت می شود، در حالی که فیتین ذرت در داخل آندوسپرم متمرکز شده است (دبولاند و همکاران، 1975). فیتین دانه های روغنی و حبوبات به صورت یکنواختی در سرتاسر دانه توزیع شده است (اردمان، 1979). به احتمال زیاد شکل و محل ذخیره فیتین در دانه ها عامل مهمی است که بازده هیدرولیز فیتات را تحت تأثیر قرار می دهد. احتمالاً کریستال های گلوبوئید فیتین نامحلول موجود در پوشش فیبری بذر در مقایسه با فیتین محلول موجود در بخش جنین دانه، قابلیت هضم نسبتاً پایین تری دارد (اردمان، 1979). اندازه کریستال های گلوبوئید اجسام پروتئینی بستگی به نسبت کاتیون های دو ظرفیتی به پتاسیم دارد. افزایش میزان کاتیون های دو ظرفیتی باعث تشکیل کریستال های نامحلول بزرگتری می شود. حبوبات مانند سویا و نخود که دارای سطوح بالاتری از پتاسیم هستند، ساختمان کریستالی گلوبوئید کوچک تری دارند و سهم بیشتری از فیتین موجود در آنها به صورت اسید فایتیک متصل با پتاسیم محلول می باشد (لوت و همکاران، 1985). فیتین محلول به صورت کمپلکس های پروتئین-فیتات می باشد که به شکل منظمی در داخل اجسام پروتئینی قرار گرفته است. غلظت فیتات در گیاهان بسته به مرحله بلوغ، میزان فرآیند، واریته (پوررضا و کلاسن، 1381)، شرایط محیطی، قابلیت دسترسی آب، عوامل خاک، محل و سال رشد متغیر است و اثر معنی دار رقم روی مقدار فیتات گندم، سویا، لوبیا و تریتیکاله ثابت شده است. همچنین گزارش شده که فسفر فیتاتی در گندم و برنج با بلوغ دانه و استفاده از کودهای فسفاتی افزایش می یابد. مشخص شده که ارقام گندم کشت شده در شرایط گرم و خشک، اسید فایتیک کمتری نسبت به شرایط پر آب دارند. علاوه بر این، اثرات معنی دار سال و محل کشت بر مقدار فیتات گندم، چاودار، تریتیکاله و جوی دو سر گزارش شده است (راویندران و همکاران، 1995).
2- 2 اثرات نامطلوب اسید فایتیک
2- 2- 1 اثرات زیست محیطی
در هلند افزودن نامتعادل ازت، فسفر و پتاسیم به خاک و فعالیت های دامپروری عامل بیش از 80 درصد تراکم زیاد مواد معدنی در محیط می باشد. این مشکل سبب ایجاد محدودیت های قانونی در استفاده از کودهای حیوانی برای غنی سازی خاک شده است (دبوئر و همکاران، 1997). منبع اصلی فسفر در کودهای حیوانی، فسفر فیتاتی غیر قابل هضم است، بنابراین هر گونه راهکاری که میزان فسفر فیتاتی غیر قابل دسترس را در جیره طیور کاهش دهد، در کاهش آلودگی ناشی از فسفر فضولات دامی مؤثر خواهد بود.
در ایالات متحده، یکی از منابع ایجاد کننده ی آلودگی، کشاورزی است، که اثرات منفی بر کیفیت آب دارد. بر اساس برآوردها، سهم کشاورزی در آلودگی دریاچه ها و رودخانه ها به ترتیب 50 و 60 درصد می باشد (شارپلی، 1999). در نواحی که تراکم دامداری ها زیاد است، به همراه کودهای حیوانی فسفر زیادی به زمین های کشاورزی وارد می شود (بدفورد، 2000). این امر باعث افزایش ظرفیت محصولات زراعی در جذب مواد معدنی شده و به نوبه خود موجب تجمع زیاد فسفر در خاک می گردد، لذا زمینه برای جریان آن به داخل رودخانه ها و دریاچه ها فراهم می شود. بیشترین مشکل در ارتباط با کشاورزی و آلودگی فسفر، در مناطقی است که تراکم دامپروری نزدیک به منشاء سیستم های آب شیرین است (نولتون و همکاران، 2004).
2- 2- 2 قابلیت استفاده از مواد معدنی
مشخص شده است که قابلیت دسترسی مواد معدنی، به وسیله اسید فایتیک غیر قابل هضم کاهش می یابد (آنجل و همکاران، 2000). به طور کلی بین مقدار فیتات جیره و قابلیت هضم کاتیون های چند ظرفیتی، رابطه منفی وجود دارد. همان گونه که قبلاً بحث شد، فیتات می تواند در pH خنثی با کاتیون های چند ظرفیتی کمپلکس های نامحلولی را تشکیل دهد که به فرآیند هضم و جذب در دستگاه گوارش مقاوم هستند، در نتیجه بخشی از ذخایر معدنی جیره غذایی برای حیوان غیر قابل دسترس خواهد شد. نتایج مطالعات آزمایشگاهی نشان داده است که کمپلکس های روی–فیتات، پایداری بالایی دارند (چریان، 1980).
هان و همکاران (1994) اثرات اینوزیتول هگزا فسفات 6IP (اسید فایتیک)، اینوزیتول پنتا فسفات (5IP)، اینوزیتول تترا فسفات (4IP) و اینوزیتول تری فسفات (3IP) را بر جذب آهن، به وسیله ی سلول های سرطانی انسان بررسی نمودند. در این تحقیق مشخص گردید که با افزایش درجه فسفوریلاسیون حلقه اینوزیتول، قابلیت حل شدن و میزان جذب مواد معدنی کاهش می یابد.
همچنین مشخص شده است که در سطح ثابت فیتات جیره موش صحرایی، قابلیت دسترسی روی تا حد زیادی با افزایش میزان سایر مواد معدنی مانند کلسیم، کاهش می یابد (فوربس و همکاران، 1984). مکانیسم درگیر با این اثر احتمالاً مرتبط با تشکیل کمپلکس های فیتات–املاح نامحلول محتوی روی و کلسیم است که نسبت به فرآیند هضم و جذب مقاوم اند. جداسازی فیتات از پروتئین سویا، سبب دو برابر شدن آهن در گلبول های قرمز انسان شد و همچنین موجب افزایش3/2 برابری جذب منگنز گردید (داویدسون و همکاران، 1994). تحت شرایط فیزیولوژیکی مشابه در محیط آزمایشگاهی با فیتات زدایی سبوس گندم و پودر چاودار، حلالیت آهن به ترتیب از 3 به 53 درصد و از 5 به 21 درصد افزایش یافت (ساندبرگ و اسوانبرگ، 1993).
نشان داده شده که اسید آسکوربیک نیز قابلیت دسترسی آهن سویا را در رژیم غذایی اطفال افزایش داد (داویدسون و همکاران، 1994). مکانیسم درگیر در اثر کیلات کننده ها بر بهبود قابلیت دسترسی مواد معدنی، از نوع مدل رقابتی است. در این مدل، کیلات کننده به مواد معدنی متصل شده و به این وسیله میزان مواد معدنی قابل دسترس، برای تشکیل کمپلکس های نامحلول با فیتات را کاهش می دهد. کمپلکس کیلات کننده–ماده معدنی به صورت محلول است، لذا می تواند به همین شکل جذب شده و یا اینکه مواد معدنی را در محل های جذب آنها در غشای پوششی روده آزاد کند (دیویدسون و همکاران، 1994).
در فرآیند هیدرولیز فیتات، اشکال اینوزیتول با فسفات کمتر ایجاد شده بنابراین جایگاه کمتری برای اتصال با مواد معدنی دارد. این عامل سبب کاهش قدرت اتصال آن گردیده و در نتیجه اثر کمتری بر قابلیت دسترسی مواد معدنی در مقایسه با اسید فایتیک دارد (هان و همکاران، 1994). جالب آنکه معلوم شده است ترکیبات با قدرت کیلات کنندگی، قادرند قابلیت دسترسی مواد معدنی را در جیره های گیاهی تغذیه شده به حیوانات، افزایش دهند. مکمل کردن جیره دارای کمبود روی (2+Zn) با کیلات کننده های مختلف مانند اتیلن دی آمین تترا استیک اسید سبب بهبود رشد و پیشگیری از علائم کمبود روی در جوجه ها و پولت های بوقلمون شد (نیلسن و همکاران، 1966). پکتین ها که به وسیله قدرت بالای استریفیکاسیون و وزن مولکولی پایین شناسایی می شوند، قادرند با مواد معدنی کمپلکس تشکیل داده و در نتیجه حلالیت و جذب آهن را بهبود بخشند (کیم و آتالا، 1993).
2- 2- 3 قابلیت هضم پروتئین
از لحاظ نظری، پروتئین متصل به فیتات در خلال عبور از روده حساسیت کمتری به فعالیت پروتئاز دارد. علاوه بر این، فیتات متصل به پروتئین ها و مواد معدنی توانایی مختل کردن فعالیت آنزیم های هضمی را دارد. نشان داده شده که فیتات از فعالیت تریپسین ممانعت کرده و همچنین از هضم نشاسته توسط بزاق انسان در محیط لوله آزمایش ممانعت به عمل می آورد. مکانسیم مرتبط با این ممانعت به دو صورت است: یا اینکه مولکول فیتات با باند کردن مواد معدنی سبب حذف کوفاکتورهای مورد نیاز برای فعالیت مناسب آنزیم ها می گردد و یا فیتات با متصل شدن به مولکول آنزیم سبب تشکیل کمپلکس آنزیم–فیتات با فعالیت کمتر می شود (کالدول، 1992).
در مولکول اسید فایتیک، گروه های فسفات دار می توانند با گروه های آمینی انتهای مولکول پروتئین و یا با گروه های آمینی آزاد لیزین و آرژنین در داخل مولکول پروتئین، پیوندهای الکترواستاتیک تشکیل دهند (چریان، 1980). علاوه بر این، کمپلکس های فیتات–ماده معدنی–پروتئین با واسطه کاتیون های چند ظرفیتی که به صورت پلی بین گروه های دارای فسفات مولکول اسید فایتیک و گروه های کربوکسیل انتهایی مولکول پروتئین و یا گروه کربوکسیل آسپارتات و گلوتامات مولکول پروتئین قرار می گیرند، تشکیل می شود (شکل 2 – 2).
1149352540
شکل 2 – 2 – شکل کیلات شده اسید فایتیک (فیتین). a. با پروتئین و نشاسته
b. با کاتیون و پروتئین c. با کاتیون d. با نشاسته
بررسی بیشتر منابع در این بحث، معمولاً از این فرضیه حمایت می کند که اسید فایتیک هضم پروتئین را در دستگاه گوارش مختل می کند. تامپسون و سرانیو (1986) گزارش نمودند که اسید فایتیک تأثیری بر قابلیت هضم پروتئین منداب و جذب اسیدهای آمینه آن نداشت. چیترا و همکاران (1995) بین مقدار اسید فایتیک و قابلیت هضم پروتئین لوبیا و سویا در محیط آزمایشگاه، همبستگی منفی مشاهده نمودند. مشخص شده است که فیتات زدایی کامل جیره بر پایه ی ذرت–سویا، پروتئین قابل تجزیه را به میزان 12 تا 29 درصد افزایش داد (زایلا و همکاران، 1996). یکی از فرضیه های بسیار مهم در ارتباط با تغییرات قابل ملاحظه قابلیت هضم پروتئین و اسیدهای آمینه جیره، مربوط به مواد خوراکی تشکیل دهنده و وضعیت مواد معدنی آنها می باشد. در صورت تشکیل کمپلکس فیتات–مواد معدنی نامحلول، احتمال تشکیل کمپلکس فیتات–پروتئین کاهش یافته و در نتیجه فیتات در ممانعت از هضم پروتئین فعالیت کمتری خواهد داشت.
2- 2- 3- 1 فیتاز میکروبی و بهره وری پروتئین
نتایج مطالعات متعدد نشان داده است که با افزودن آنزیم فیتاز به جیره، رشد حیوان بهبود می یابد که این امر می تواند در نتایج افزایش بهره وری پروتئین باشد. فارل و همکاران (1992 و 1998) نشان دادند در جوجه های گوشتی تغذیه شده با جیره های بر پایه سورگوم و سویا، افزودن 750 واحد فیتاز میکروبی در کیلوگرم جیره سبب بهبود بهره وری ازت گردید. همچنین گزارش شده است که با افزودن 600 واحد فیتاز به هر کیلوگرم خوراک جوجه های گوشتی تغذیه شده با جیره های بر پایه سورگوم، کنجاله سویا، کنجاله منداب، کنجاله پنبه دانه و زبره گندم، ابقای ازت افزایش یافته است (سل و همکاران، 1999). این نتایج مؤید این نکته است که اجزای جیره ای متفاوت یا تغییر در ترکیب جیره، پاسخ به مکمل فیتاز را تغییر می دهد. در آزمایش دیگری بیهل و بیکر (1997)، جوجه های گوشتی را با جیره های بر پایه ذرت دارای اسید آمینه کم و با کنجاله های سویا و بادام زمینی به عنوان منبع پروتئینی تغذیه نمودند. اضافه نمودن 1200 واحد فیتاز در هر کیلوگرم خوراک و ضریب تبدیل غذایی جوجه های تغذیه شده با جیره دارای کنجاله سویا را بهبود داد، اما اثری بر این شاخص ها در پرندگان تغذیه شده با جیره دارای کنجاله بادام زمینی نداشت. بنابراین چنین نتیجه گیری شد که فیتاز تأثیر مثبتی بر بهره وری متیونین، ترئونین، لیزین و والین پروتئین سویا دارد. در مطالعه دیگری (بولینگ و همکاران، 1999)، فیتاز تأثیری بر بهبود استفاده از پروتئین در برخی از مواد خوراکی نداشت. استفاده از مکمل فیتاز در جیره پایانی جوجه های گوشتی بر پایه ذرت–سویا با پروتئین پایین، بهره وری پروتئین را بر حسب وزن گوشت سینه بهبود بخشید (کورنگی و همکاران، 1999). در این مطالعه فیتاز اثرات خطی معنی داری بر وزن سینه و وزن سینه به صورت نسبتی از وزن لاشه داشت که این اثر احتمالاً می تواند به دلیل افزایش قابلیت دسترسی اسیدهای آمینه در سنتز بافت ماهیچه سینه باشد. وجود فعالیت های آنزیمی جانبی در مکمل های فیتاز میکروبی، بر فعالیت این مکمل تأثیر می گذارد (فرل و همکاران، 1992). برخی از مکمل های فیتاز میکروبی دارای مخلوطی از فعالیت های آنزیم های زایلاناز، بتاگلوکاناز و سلولاز می باشند (زایلا، 1993). در صورت فعالیت این آنزیم ها، گلوکاناز می تواند اثرات فیتاز را تشدید نموده (راویندران و همکاران، 1999) و اثرات مستقلی بر قابلیت هضم پروتئین داشته باشند (هیو و همکاران، 1998). انتظار می رود فعالیت جانبی اسید فسفاتاز در مکمل فیتاز، هیدرولیز فیتات را تشدید کند (زایلا و کورلسکی، 1993). بنابراین چنین استنباط می شود که افزایش قابلیت هضم اسیدهای آمینه به دنبال افزودن فیتاز، به دلیل هیدرولیز فیتات است که ممکن است به وسیله ی فعالیت های جانبی آنزیمی در مکمل فیتاز تسهیل گردد.
2- 2- 3- 2 اثرات منفی فیتات بر بهره وری پروتئین
اثرات ضد تغذیه ای فیتات با افزودن مکمل فیتاز تعدیل می یابند (راویندران، 2000). افزون بر این، فیتات از طریق تداخل با آنزیم های هضمی یا سوبسترای آنها، اثر هضمی این آنزیم ها را کاهش داده و در نتیجه منجر به کاهش هضم پروتئین جیره و همچنین افزایش دفع درون زادی اسیدهای آمینه می گردد.