–413

1-7-1-رده بندی علمی30
فصل دوم: سابقه ی تحقیق
2- سابقه ی تحقیق32
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-مکان و زمان انجام تحقیق41
3-2-مکان پرورش42
3-3-ذخیره سازی ، سازگاری و تقسیم بچه ماهیان43
3-4-پروبیوتیک مورد آزمایشLactobacillus plantarum44
3-5-نحوه ی آماده سازی جیره غذایی44
3-6-زیست سنجی45
3-7-نحوه ی غذادهی45
3-8-بررسی عوامل فیزیکی و شیمیایی آب46
3-9-بررسی پارامترهای خون شناسی46
3-9-1-خون گیری و تهیه سرم46
3-9-2-شاخص های خونی47
3-9-2-1-شمارش گلبول های قرمز و سفید47
3-9-2-2-اندازه گیری هماتوکریت48
3-9-2-3-اندازه گیری هموگلوبین49
3-9-2-4-شاخص های گلبول قرمز49
3-9-2-5-تشخیص افتراقی گلبول های سفید50
3-10-فاکتورهای ایمنی51
3-10-1-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی اختصاصی51
3-10-1-1-اندازه گیری ایمنو گلوبولینM (IgM)51
3-10-2-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی غیر اختصاصی51
3-10-2-1-اندازه گیری فعلیت لیزوزیم51
3-10-2-2-پروتئین کل سرم52
3-11-روش انجام آزمایشات فلور باکتریایی روده در آزمایشگاه52
3-11-1-روش آماده سازی محیط های کشت52
3-11-2-روش آماده سازی رقت های محلول روده و کشت اولیه53
3-11-3-روش شمارش کلنی ها و تقسیم بندی آنها54
3-12-روش محاسبه شاخص های رشد54
3-12-1-اندازه گیری طول و وزن54
3-12-2-شاخص وضعیت55
3-12-3-درصد افزایش وزن55
3-12-4-ضریب تبدیل غذایی55
3-12-5-ضریب رشد ویژه55
3-12-6-میانگین رشد روزانه55
3-12-7-شاخص کبدی56
3-13-آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی 56
3-14-تجزیه و تحلیل آماری56
فصل چهارم: نتایج
4-نتایج58
4-1-نتایج حاصل از اندازه گیری عوامل محیطی58
4-1-1-دمای آب58
4-1-2-اکسیژن محلول آب58
4-1-3-pH آب محیط پرورش58
4-2-نتایج حاصل از عملکرد رشد بچه ماهیان قزل آلا تحت تاثیر سطوح مختلف پروبیوتیک59
4-2-1-اثر بر وزن نهایی59
4-2-2-اثر بر طول نهایی59
4-2-3-اثر بر ضریب تبدیل غذایی60
4-2-4-ضریب رشد ویژه60
4-2-5-درصد افزایش وزن61
4-2-6-میانگین رشد روزانه61
4-2-7-میزان ضریب چاقی62
4-3-فلور باکتریایی روده ماهیان تیمار و شاهد62
4-3-1-میزان باکتریL.p در فلور روده قزل آلا در محیط کشت MRS62
4-3-2-توتال کانت باکتریایی روده ماهی قزل آلای رنگین کمان در محیط کشتTSA 62
4-4-نتایج حاصل از فاکتورهای خونی63
4-4-1-تعداد گلبول های سفید خون63
4-4-2-تعداد گلبول های قرمز خون64
4-4-3-غلظت هموگلوبین خون64
4-4-4-درصد هماتوکریت خون65
4-4-5-متوسط حجم گلبول قرمز65
4-4-6-متوسط غلظت هموگلوبین سلولی66
4-4-7-متوسط هموگلوبین گلبول قرمز66
4-4-8-درصد لنفوسیت67
4-4-9-مقادیر نوتروفیل67
4-4-10-درصد منوسیت68
4-4-11-درصد ائوزینوفیل68
4-5-نتایج فاکتورهای سرم68
4-5-1-میزان توتال ایمنوگلوبولین سرم خون69
4-5-2-میزان IgM69
4-5-3-میزان لیزوزیم سرم خون70
4-6-نتایج آنالیز لاشه70
4-6-1-درصد رطوبت لاشه70
4-6-2-درصد پروتئین لاشه71
4-6-3-درصد چربی لاشه71
4-6-4-درصد خاکستر لاشه72
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-بحث74
5-1-عملکرد رشد74
5-2-فلور باکتریایی روده77
5-3-شاخص های خونی78
5-4-شاخص های ایمنی خون81
5-4-1-لیزوزیم81
5-4-2-ایمنوگلوبین IgM83
5-5-آنالیز لاشه84
5-6-جمع بندی86
پیشنهادات 87
منابع88
پیوست107
چکیده انگلیسی121
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1: آنالیز تقریبی خوراک استفاده شده در تغذیه بچه ماهیان مورد آزمون44
جدول4-1: میانگین دما، اکسیژن محلول و pH آب در مقاطع زمانی مشخص در طول دوره بررسی58
جدول 4-2- میانگین وزن نهایی (گرم) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-3- میانگین طول نهایی (سانتیمتر) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-4- میانگین ضریب تبدیل غذایی بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-5- میانگین ضریب رشد ویژه بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-6- میانگین درصد افزایش وزن بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف61
جدول 4-7- میانگین رشد روزانه بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف61
جدول 4-8- میانگین میزان ضریب چاقی بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف62
جدول 4-9-میزان پروبیوتیک (لاکتوباسیلوس) در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت MRS62
جدول4-10-شمارش کلی فلور باکتریایی در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت TSA63
جدول 4-11-تعدادگلبول های سفید خونی قزل آلا در تیمارهای شاهد وآزمایشی در پایان60روز63
جدول 4-12-تعدادگلبول های قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60روز64
جدول 4-13- غلظت هموگلوبین g/dl)) خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60
روز64
جدول 4-14- درصد هماتوکریت % خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز65
جدول 4-15- متوسط حجم گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز65
جدول 4-16- متوسط غلظت هموگلوبین سلولی خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول 4-17- متوسط هموگلوبین گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول4-18- درصد لنفوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-19-درصد نوتروفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-20-درصد منوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-21-درصد ائوزینوفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-22-توتال ایمنوگلوبولین سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز69
جدول4-23-میزان IgM سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز69
جدول4-24-میزان لیزوزیم سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-25-درصد رطوبت لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-26-درصد پروتئین لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71
جدول4-27-درصد چربی لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71
جدول4-28-درصد خاکستر لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز72
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل( 1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"13
شکل (1-2) رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش29
شکل (3-1) موقعیت جغرافیایی گارگاه پرورش ماهی سردابی(قزل آلا) اشکرآب سیاهکل41
شکل (3-2) نمایی از کارگاه پرورش ماهی سردابی اشکراب سیاهکل42
شکل (3-3) نمایی از کانال های بتونی پرورش و تیمار و تکرارها43
شکل(3-4) پودر اولیه حاوی1011-101244
شکل(3-5) رقت های مختلف از106-101044
شکل(3-6) غذای آماده و غنی شده با پروبیوتیک45
شکل (3-7) غذادهی روزانه بر اساس محاسبات روزانه46
شکل (3-8) خونگیری از سیاهرگ در محل ساقه دمی46
شکل (3-9) دستگاه سانتریفوژ و نحوه ی جداسازی سرم خون47
شکل (3-10) دستگاه سانتریفیوژ هماتوکریت48
شکل (3-11) دستگاه اسپکتروفتو متر نور مرئی و UV49
شکل(3-12): دستگاه اسپکتروفتومتر مدل 2100-VIS شرکت Unico آمریکا51
شکل(3-13)دستگاه Auto Analyzer مدلBT- 150052
شکل (3-14) نحوه ی آماده سازی محیط کشت TSA و MRS آگار53
شکل (3-15) برداشت روده و تهیه رقت های مختلف و کشت در پلت های TSAو MRS54
شکل (3-16) نگهداری پلت ها در انکوباتور و شمارش باکتری ها54
شکل (3-17) آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی56
چکیده
تحقیق حاضر به منظور ارزیابی تاثیر باکتری اسید لاکتیک Lactobacillu plantarum (KC426951) جداسازی شده از روده قزل آلای رنگین کمان بر فاکتورهای رشد ، فلور باکتریایی روده ،فاکتورهای خونی و ایمنی بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) در بهار و تابستان سال 1392انجام شد. بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن 24/2±56/3 به مدت 2 هفته با شرایط پرورشی محیطی در یک مرکز پرورش خصوصی ماهیان سردآبی (اشکرآب سیاهکل) در استان گیلان قبل از شروع آزمایش سازگار شدند . ماهیان در قالب یک طرح کاملا تصادفی به شش گروه شامل 540 قطعه بچه ماهی تقسیم شدند . پارامترهای کیفی آب شامل درجه حرارت ، مقدار اکسیژن محلول و pH به ترتیب 3/0±3/17 درجه سانتی گراد ،43/0±5/8 میلی گرم و 26/0±4/7 اندازه گیری شد .پنج گروه از ماهیان ( هر گروه شامل 90 ماهی) با جیره حاوی 106 (تیمار1) ، 107 (تیمار2) ، 108 (تیمار3) ، 109 (تیمار4) و1010 (تیمار5) cfu g-1 لاکتو باسیلوس پلانتاروم و گروه کنترل (شاهد) بدون جیره حاوی پروبیوتیک به مدت 60 روز تغذیه شدند . تغذیه ماهیان بر اساس 3 درصد بیوماس وزن بدن بصورت روزانه و برابر صورت پذیرفت. نتایج نشان داد که میزان وزن نهایی ، طول نهایی، ضریب رشد ، درصد افزایش وزن و میانگین رشد روزانه در تیمار 2 بیشترین و در تیمار 5 کمترین مقدار و میزان ضریب تبدیل غذایی در تیمار 2 کمترین و در تیمار 5 بیشترین را به خود اختصاص داده بودند(05/0> P). همچنین بالاترین میزان توتال لاکتیک اسید روده ماهیان قزل آلا در تیمار4 و در حالیکه کمترین مقدار مربوط به تیمار شاهد و بالاترین توتال کانت مربوط به تیمار 2 و کمترین تیمار 5 بدست آمد(05/0> P). فاکتورهای خونی: بالاترین سطوح گلبول های قرمز در تیمار 5 (3/10408±3/898333) ، گلبولهای سفید در تیمار4 (4/702±3/10833) ، حجم گلبول های قرمز در تیمار 1(8/3±7/508) ، غلظت هموگلوبین در تیمار 5 (15/0±2/11) ، هماتوکریت در تیمار 5 (2±42) ،فراوانی لنفوسیت ها در گروه شاهد (53/1±67/69) ، فراوانی نوتروفیل ها در تیمار 5 (1±39) ، بدست آمد (05/0> P).
فاکتورهای ایمنی: بالاترین سطوح توتال ایمنوگلوبولین در تیمار 4 (15/1±33/20) ، IgM در تیمار4 (65/2±39) و لیزوزیم در تیمار4(08/2±67/40) حاصل گردید(05/0> P) .حداکثر رطوبت لاشه مربوط به تیمار 3 ، درصد پروتئین مربوط به تیمار 4 ، و کمترین درصد چربی مربوط به تیمار شاهد می باشد (05/0> P). با توجه به نتایج بدست آمده در خصوص بکارگیری Lactobacillus plantarum می توان از آن به عنوان یک فاکتور مثبت جهت بهبود فلور باکتریایی روده ، عملکرد رشد ، شاخص های خونی ، ایمنی و ترکیب لاشه استفاده نمود.
کلمات کلیدی: قزل آلای رنگین کمان،باکتری اسید لاکتیک ، Lactobacillus plantarum ، رشد ، فلور باکتریایی، شاخص خونی، ایمنی ، لاشه
فصل اول
کلیات

مقدمه
رشد فزاینده و روز افزون جمعیت جهان، تامین غذا و دستیابی به منابع جدید غذایی را به یکی از مهمترین دغدغه های دولت ها مبدل ساخته و موجب شده است تا تاًمین مواد پروتئینی به سمت سایر منابع از جمله آبزیان سوق یابد. در این میان ارزش بالای پروتئین آبزیان باعث گردید که صنعت ماهیگیری و آبزی پروری به صنعتی مهم و شایان توجه تبدیل شود. پرورش آبزیان یک فعالیت با گستره جهانی است که در بهبود تغذیه و کمک به توسعه اقتصادی کشورها موثر است.
صنعت آبزی پروری علیرغم این رشد قابل توجه، همواره با مشکلاتی روبرو بوده است که از عمده مشکلات را می توان ابتلا به بیماری های مختلف ذکر نمود . بیماریها در آبزیان به سه سه عامل مهم بستگی دارد وضعیت ماهی (میزبان) از نظر سلامت و تناسب اندام ظاهری و دارا بودن صفات مقاومتی و ایمنی در مقابل اجرام بیماریزا ، عوامل محیطی اهم از شرایط فیزیکی و شیمیایی نظیر اوضاع جوی ، تغییرات حرارتی ، تابش خورشید ، بارندگی و ... و عوامل پاتوژن یا بیماریزا را می توان نام برد ( آذری تاکامی، 1376). اغلب آبزیان پرورشی تحت تأثیر عفونت های باکتریایی قرار می گیرند که سیستم ایمنی شان توسط شرایط استرس زا به خطر می افتد. یکی از معمول ترین روش های درمان این عفونت ها، استفاده از آنتی بیوتیک ها می باشد این در حالی است که استفاده بیش از حد از این داروها باعث بروز مقاومت باکتریایی در این حیوانات می شود (Teuber, 2001). لذا بکارگیری آنتی بیوتیک ها جهت درمان بیماری های آبزیان پرورشی به طور گسترده مورد انتقاد قرار گرفته است، که دلائل آن علاوه بر افزودن هزینه ها عبارتند از: افزایش توانایی مقاومت باکتری ها در برابر آنتی بیوتیک ها، از بین بردن فلور میکروبی محیط زیست، هزینه بالای این داروها و عوارض جانبی این داروها بر ماهی و میگومی باشد . ثابت شده که برخی از آنتی بیوتیک ها سیستم ایمنی را سرکوب می کنند و موجودات آبزی را بیشتر مستعد پذیرش بیماری های باکتریایی ، ویروسی و انگلی می نمایند.افزایش نگرانی های ناشی از بکارگیری آنتی بیوتیک ها منجر به کاهش استفاده از آنها در صنعت آبزی پروری آمریکا و اروپا گردیده است.
آنتی بیوتیکها به تعادل باکتریهای موجود در روده آسیب وارد می کنند و اکثر باکتریهای مفید را از بین برده و منجر به پیدایش باکتریهای مقاوم به دارو می گردند و همچنین فقط 20 تا 30 درصد آنتی بیوتیک ها بوسیله ماهی هضم می شوند و بقیه وارد محیط زیست می شوند.
مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی علاوه بر ایجاد مقاومت در میکرو ارگانیسمها سبب نفوذ این مواد به خاک و آب گردیده و محیط زیست مجاور مزارع پرورش آبزیان را به شدت آلوده نموده است تثبیت داروها و مواد شیمیایی در بافتهای ماهی و آبزیان بهداشت انسانی را نیز به خاطر ایجاد حساسیتهای مختلف، مقاومت باکتریایی و عوارض کلیوی و کبدی به مخاطره می اندازد(آذری تاکامی، 1376).
در حال حاضر، استفاده از پروبیوتیک ها و سین بیوتیک ها به عنوان جایگزین استفاده از آنتی بیوتیکها در پرورش آبزیان مطرح هستند. آبزیان در مراحل اولیه تکثیر و پرورش از سطح ایمنی کافی برخوردار نبوده و نیازمند تدابیر لازم در خصوص پیشگیری و درمان می باشند و بهره گیری از پروبیوتیک ها نیز می تواند به عنوان یکی از ابزارهای موثر در پیشگیری از بیماریها و همچنین محرک رشد مد نظر قرار گیرد.
استفاده از پروبیوتیک ها بعنوان جایگزینی برای روشهای سابق به نظر می رسد می تواند بسیاری از مشکلات را مرتفع سازد. استفاده از پروبیوتیک ها در واقع تکنولوژی جدید آبزی پروری همگام با محیط زیست به شمار می رود. با استفاده از این مواد هم می توان تولید را افزایش داد، هم کیفیت آب را اصلاح کرد و هم اینکه آنها را به عنوان مبارزه بیولوژیک مد نظر قرار داد (حسینی فر، 1386).
تأثیر پروبیوتیک ها در تغذیه، مقاومت در برابر بیماریها و دیگر فعالیت های مفید به اثبات رسیده که از
جمله اثرات مفیدی که بر سلامتی دارند تأثیر بر روی سیستم ایمنی و تحریک سیستم ایمنی است(کامکار، 1390).
استفاده از زیست یارهای حیاتی (پروبیوتیک ها) به عنوان یک مکمل غذایی که قادر به بهبود دفاع و ایجاد
مقاومت در برابر عوامل بیماری زا در زمان بروز استرس های متفاوت طی دوره پرورش ماهی باشند، مورد
توجه هستند.پروبیوتیک ها بطور سودمندی با بهبود تعادل فلور میکروبی روده به میزبان سود می رسانند Fuller,1989)).پروبیوتیک ها نه تنها اثرات منفی آنتی بیوتیک ها را ندارند بلکه نقش مهمی در افزایش بهره وری ، تولید و کاهش درصد تلفات ماهی و میگو دارا می باشند.
تا کنون سویه های زیادی جهت استفاده در تغذیّه دام، طیور و آبزیان به عنوان پروبیوتیک معرفی شده است و با بهره گیری از مهندسی ژنتیک و دانش بیوتکنولوژی، سویه های مؤثرتر و بهتری نیز تولید خواهد شد. ولی به طور کلی پروبیوتیک ها از لحاظ نوع سویه میکروبی مؤثرشان به سه گروه تقسیم می شوند، پروبیوتیکهای 1- باکتریایی2- قارچی 3- مخمری.
پروبیوتیکهای باکتریایی عمده ترین پروبیوتیک هایی هستند که تاکنون در آبزی پروری استفاده شده اند. استفاده از پروبیوتیکهای حاوی باکتریهای اسید لاکتیک به افزایش میزان زنده مانی میزبان در مواجه با عوامل بیماریزا منجر میشوند که این عملکرد از طرق زیر صورت میگیرد ( Gatesoupe, 1999)
آثار آنتاگونیستی بر ضد عوامل بیماریزا از طریق ترشح مواد باکتری ُکش همانند باکتریوسینها
محدود کردن عوامل بیماریزا از طریق افزایش محل اتصال یا استفاده از ماده و انرژی در دسترس
افزایش سد دفاعی بدن از طریق افزایش سطوح ایمنی
همچنین مشاهده شده است برخی پروبیوتیکها اشتها را افزایش می دهند، سلامتی را بهبود می بخشند و افزایشی کلی را در وزن به وجود می آورند که احتما ً لا به دلیل افزایش قابلیت هضم مواد غذایی است (Gatesoupe and Ringo,1998)
توانایی باکتریهای اسید لاکتیک در تقویت ایمنی غیر اختصاصی ماهی قزل آلای رنگین کمان توسط مطالعات برخی از محققین ثابت شده است. به خصوص تجویز خوراکی بعضی از سویه های باکتری اسید
لاکتیک موجب افزایش پاسخ ایمنی سلولی مثل فعالیت فاگوسیتوز، انفجار تنفسی فاگوسیت ها، تکثیر لنفوسیتها و سنتز سیتوکنین ها می شود. (Austin &Irianto, 2002; Nikoskelainen et al., 2001; Balcazar et al., 2006; Panigrahi et al., 2010)
دفتر مواد غذایی و مطالعه دارویی آمریکا و انجمن رسمی کنترل مواد غذایی، برای متمایز نمودن میکرو ارگانیسم های مفید و مضر، لیست گونه هایی از میکرو ارگانیسم را ارائه نموده است که می توان آنها را با مواد غذایی مصرف نمود. از جمله این مواد می توان به لاکتوباسیلوس پلانتاروم Lactobacillus plantarum اشاره نمود.
در این تحقیق باکتری توسط دکترشناور ماسوله در سال 1391 از فلور باکتریایی روده برداشت و با روش مولکول 16S rRNA مورد شناسایی و در NCBI مورد ثبت قرار گرفت (KC426951) و برای اولین بار در ایران جهت تغذیه بچه ماهی قزل آلا بصورت in vivo مورد مصرف قرار گرفت.
تحقیقات و استفاده های گسترده ای از باکتری های اسید لاکتیک شده است که از آنها می توان به لاکتو باسیلوس اشاره کرد (Kesarcodi-Watson . et al .,2008)
در خصوص تاثیر انواع پروبیوتیکها بر رشد و بازماندگی ماهیان تحقیقات فراوانی بعمل آمده است ولی در زمینه اثرات ایمنی زایی آن در ماهیان اطلاعات بسیار محدودی در دسترس می باشد. لذا در این مطالعه بررسی ایمنی زایی این ترکیب در ماهی قزل آلای رنگین کمان مدنظر می باشد
قزل آلای رنگین کمان نخستین گونه از خانواده آزادماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش یافت. این ماهی از اواخر قرن نوزدهم میلادی به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار پرورش داده شده است. در حال حاضر، ماهی قزل آلا اساس صنعتی را تشکیل می دهد که در حال توسعه است و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند در حال افزایش است.
لذا با توجه به مطالب ذکر شده در نوشتار بالا که بیانگر نقش و اهمیت بسیار زیاد پرورش گونه قزل آلا
در تامین پروتئین جامعه می باشد و مشکلات پیش رو حاصل از تغییر شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط پرورش این گونه با ارزش که منجر به انواع بیماریها و تلفات قابل توجه و در نهایت از دست رفتن سرمایه پرورش دهندگان می گردد و با هدف کاهش مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی در مبارزه با بیماریها ی این آبزی که در نهایت به نحوی وارد چرخه مواد بدن انسان و اثرات سو می شود مطالعه جایگزینی مناسب نظیر پروبیوتیک ها از جمله باکتری لاکتو باسیلوس پلانتاروم بعنوان اولین زیست یار حیاتی ضروری به نظر میرسد لذا مطالعه ای در خصوص تاثیر مقادیر مختلف زیست یار حیاتیباکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم در جیره غذایی قزل آلای رنگین کمان بر رشد ، فلورباکتریایی روده، شاخصهای خونی و ایمنی این گونه مورد مطالعه قرار گرفت که به ضرورت انجام این تحقیق ، فرضیات و اهداف آن در ذیل اشاره شده است.
تاکنون در زمینه افزودن باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم به جیره غذایی قزل آلا، بویژه در سن رشد (بچه ماهی) جهت پرورش آنها در مزارع پرورش، مطالعه علمی و عملی و نیز بررسی اثر غذای حاوی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم روی فلور باکتریایی روده، عوامل خونی و ایمنی خون قزل آلای رنگین کمان به انجام نرسیده است. هرگونه تغییر در شرایط زیستی، تغذیه ای و ... می تواند روی فلور باکتریایی، شاخص های خونی و ایمنی اثر گذار باشد. برآورد این تغییرات جهت دست یابی به وضعیت ایمنی ماهیان تغذیه شده با پروبیوتیک مذکور از روی شاخص های خونی و بیوشیمیایی، از بررسی های علمی نوین در ایران می باشد.
تحقیق حاضر جهت بررسی سطوح مختلف باکتری Lactobacillus plantarum در جیره غذایی روی برخی فاکتورهای خونی ، ایمنی ماهی و فلور باکتریایی و رشد قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) طی60 روز مورد بررسی قرار گرفت. از آنجا که پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان در جهان بسیار رونق دارد، نتایج این تحقیق می تواند در سطوح بین المللی نیز حایز اهمیت بوده و مورد بهره برداری کارگاهها و مراکز دولتی و خصوصی پرورش ماهیان سرد آبی قرار گیرد.
سوالات تحقیق
1-یا مقادیرمختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتور رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
2- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
3- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
فرضیه تحقیق
1-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت ندارد.
2-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum برفاکتورهای رشد و فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت دارد.
3-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum ، شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان(Oncorhynchus mykiss) را بهبود می بخشد.
اهداف تحقیق
1-تعیین مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum یر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
2-تعیین تاثیر مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum بر فلور باکتریایی روده ی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
3-تعیین مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص های خونی و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
در مقایسه با تیمار شاهد.
1-1- مشخصات آزاد ماهیان (Salmonidae)
اکثر آزاد ماهیان گونه هایی با ارزش تجاری بالا هستند. هیچ یک از گونه های این خانواده کاملاً دریایی نیستند. یعنی به صورت آنادرموس ((Andromouse در دریا زندگی کرده و جهت تخم ریزی به آب شیرین مهاجرت می کنند. از مشخصات عمده این خانواده وجود باله چربی ( Fine Adipose) می باشد. این باله فاقد شعاع است و حد فاصل باله پشتی و دمی است. وجود دندان از مشخصات آزاد ماهیان است و در برخی گونه ها دندان ها در تمام محفظه دهان گسترش یافته است و وجه تمایز جنس های نر و ماده در زمان تخم ریزی می باشد. آزاد ماهیان گونه هایی گوشتخوار هستند (Maitland,2000).
به طور کلی آزادماهیان از نژادها و جمعیت های مختلفی برخوردار بوده و در نقاط مختلف جهان پراکنش گسترده ای دارند. این ماهیان در زمره ماهیان سردآبی قرار دارند و اغلب متعلق به مناطق سردسیری و معتدله جهان می باشند. در بین خانواده آزاد ماهیان، گونه های قزل آلای رنگین کمان، قزل آلای خال قرمز، آزاد ماهی دریای خزر و میزان محدودی ماهی آزاد زیبا و ماهی آزاد کتا در آب های ایران یافت میشود. این گونه ها از ارزش اقتصادی و زیستی بسیار بالایی برخوردارند و بایستی مورد توجه جدی تری قرار گیرند (فرزانفر، 1384)
1-1-1- رده بندی ماهی قزلآلا
این ماهیان از راسته آزادماهی شکلان(Salmoniforms) و مشتمل بر شش خانواده که عبارتند از: آزاد ماهیان (Salmonidae)، سفید ماهیان(Coregonidae)، بلند باله ماهیان(Thymalidae) ، نازک فلس ماهیان(Osmeridae) ، اردک ماهیان(Esocidae) و سگ ماهیان(Umberidae) که در این مجموعه تنها خانواده نخست، بطورمختصرتشریح می‌گردد.
از جنس‌های معروف این خانواده می‌توان به جنس Salmo، Hucho، Oncorhynchus ، Salmothymus ، Salvelinus و Stenodus اشاره نمود (فرزانفر، 1384).
در بین خانواده های راسته آزادماهی شکلان بجز خانواده های اردک ماهیان و سگ ماهیان مابقی دارای یک باله چربی کوچک هستند که در حدواسط بین باله پشتی و دمی آنها قرار دارد و فاقد شعاع های استخوانی سخت و نرم می باشند (وثوقی و مستجیر، 1379). در گذشته ماهی قزل آلای رنگین کمان را متعلق به جنس Salmo و Salvelinus قلمداد می کردند، در حالی که ماهی آزاد را مربوط به جنس Oncorhynchus می دانستند. اما در سال 1989 ماهی قزل آلای رنگین کمان را که قبلاً تحت عنوان علمی Salmo gairdneri معروف بود، جزو جنس Oncorhynchus طبقه بندی نمودند. امروزه قزل آلای رنگین کمان با نام علمی O. mykiss معروف است و از لحاظ علمی این ماهی جزو گونه های آزاد ماهیان محسوب می گردد (Stickney, 1991)
1-1-2- برخی ویژگی های مورفولوژیک و بیولوژیک ماهی قزل آلا ی رنگین کمان
این ماهی دارای یک نوار پهن بصورت رنگین کمان در هر طرف بدن بوده، بر روی سر، بدن، پشت، باله چربی و باله دمی آن لکه های تیره رنگی مشاهده می شود (شکل1-1). حداکثر طول این ماهی 70 سانتی متر و وزن آن به 7 کیلوگرم نیز بالغ می گردد. این ماهی را متعلق به گروه ماهیان رودرو((Anadromous Fishes ، میدانند. یعنی کلیه مهاجرت های تولید مثلی خود را درآب شیرین انجام می دهد (وثوقی و مستجیر،1379)این ماهی بطور طبیعی در ایران، در دریاچه های با آب سرد، نهرها و رودخانه های با بستر قلوه سنگی و سنگلاخی به سر می برد. زیستگاه این ماهی تا حدی مشابه قزل آلای خال قرمز (گونه بومی ایران) می باشد. در اغلب رودخانه های حوزه جنوبی دریای خزر بوسیله انسان معرفی شده است (نادری و عبدلی، 1383) این ماهی قابلیت بسیار خوبی برای پذیرش غذای دستی و پرورش مصنوعی را داشته، از سرعت رشد قابل قبولی برخوردار است.
1-1-2-1- دستگاه گوارش و اندام های مرتبط
آزاد ماهیان ، جانورانی گوشتخوار بوده ، دارای سیستم گوارشی کوتاهی می باشند ، دندان های این جانوران به شکلی بوده که قابلیت شکار را بخوبی برای آنها میسر می سازد. دهان در این ماهیان از قسمت های مختلفی مانند فک میانی ، فک فوقانی ، فک تحتانی ، استخوان تیغه ایی Vomer و زبان تشکیل شده است.
در این ماهیان علاوه بر فکین ، دندان ها بر روی سقف دهان و قاعده زبان نیز یافت می شوند (فرزانفر ، 1384). در محوطه معده واکنش های وابسته بع ترشح اسیدمعده ، آنزیم ها و همچنین حرکات معده می تواند موجب له شدن مواد غذایی شده، مراحلی از هضم صورت پذیرد.در بخش انتهایی معده و در محل اتصال به روده حدود 30 الی 80 زوائد انگشتی بنام زوائد باب المعده ای Pyloric caeca قرار گرفته اند که در هضم می توانندنقش موثری داشته باشند. مواد غذایی از سوی معده از طریق یک دریچه یک طرفه به نام پیلور وارد روده شده تا به کمک آنزیم های آن هضم بیشتری بر روی مواد غذایی انجام پذیرد. بعلاوه آب ، املاح و ویتامین ها نیز از طریق جداره روده جذب می گردند. بقیه مواد باقیمانده سپس بصورت مدفوع از مخرج ماهی دفع می شود(Ali,2000) .
غدد گوارشی مانند ، کبد ، کیسه صفرا و پانکراس نقش بسزایی در هضم مواد غذایی دارند. کبد بعلت داشتن اندازه بزرگ و همچنین بافتی نرم براحتی قابل شناسایی می باشد. رنگ این غده از قرمز تیره تا قهوه ایی روشن متفاوت است. در کنار کبد، کیسه صفرا قرار گرفته است که مایع سبز رنگی به نام صفرا را تولید می نماید. عمل اصلی این مایع ، تاثیر بر روی مواد چربی و شکستن مولکول های چربی می باشد. پانکراس در آزاد ماهیان بصورت غدد پراکنده در میان زوائد باب المعده ای ظاهر می گردد . پانکراس با تولید آنزیم های گوناگون به هضم مواد غذایی کمک کرده ، بعلاوه با ترشح هورمون انسولین در کنترل قند خون نقش موثری دارد (Pannell and barton , 1996) .
1-1-3- برخی ویژگی های ماهی قزلآلایرنگینکمان "Oncorhynchus mykiss"
قزل آلای رنگین کمان جز ماهیان پرورشی است که از اواخر قرن نوزدهم میلادی اهلی شد و به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار، پرورش داده شده است. اکنون ماهی قزل آلا اساس یک صنعت در حال توسعه را تشکیل می دهد و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند، در حال افزایش است. این ماهی نخستین ماهی (گونه) از خانواده آزاد ماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش داده شد. در حال حاضر، این ماهی سهم با ارزشی در تامین غذای انسان دارد. علت این امر فقط به دلیل ارزش غذایی بالای این ماهی و کمیاب و گران شدن ماهیان وحشی که از طبیعت صید می شوند، نیست. بلکه بخاطر وجود چربی های اشباع نشده ای هستند که در این ماهی یافت می شوند (فرزانفر، 1384).
جنسهای این خانواده در آب های سرد با اکسیژن فراوان زندگی می کنند که توسط انسان به اقصی نقاط
دنیا برده شد. به خاطر خاصیت سازگاری زیاد آن، هماکنون در بیشتر آب های شیرین که دارای دمای مناسب جهت رشد این گونه هستند، حضور دارد و گونه پرورشی بیشتر مزارع پرورش ماهیان سردآبی دنیا و تقریباً صددرصد مزارع پرورش ماهیان سردآبی ایران را به خود اختصاص میدهد (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-4- پراکنش ماهی قزل آلا در جهان و ایران
محدوده زیستگاه اصلی ماهی قزل آلای رنگین کمان شمال غرب آمریکاست و از رودخانه Kuskokwim در آلاسکا آغاز شده و به سمت جنوب ادامه می یابد و با عبور از بخش British Clombia به منطقه Baja در کالیفرنیا می رسد. در سواحل شرقی انشعاب اصلی در رودخانه Peace در ایالت British Clombia و Athabasca (در آلبرتا) نیز وجود دارد. جمعیتی از این ماهی نیز به صورت بومی در استان Chihuahua در کشور مکزیک وجود دارند. سرعت رشد نژاد مهاجر پولادسر (که به دریا مهاجرت میکند) بیشتر است. ماهیان نژاد مهاجر عموماً از نژاد غیر مهاجر که تمام دوره زندگی خود را در رودخانه سپری می کنند بزرگترند؛ اما بزرگترین ماهیان قزل آلای رنگین کمان را می توان در دریاچه های آب شیرین یافت (مشائی، 1386)این ماهی
در حوضه خزر، دجله ،کارون، نمک، کویر، زاینده رود، تجن (خراسان) و کرمان پراکنش دارد (هدایتی فرد،1382). همچنین در رودخانه پارک ملی گلستان در مناطقی با دمای کمتر از 20 درجه سانتی گراد مشاهده می گردد (عبدلی،1389).قدمت پرورش آن در ایران نیز به چند دهه قبل، یعنی سال 1338 هجری شمسی مربوط می شود (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-5- بررسی آماری تولیدات پرورشی ماهی قزل آلا
براساس سالنامه آماری سازمان خواربار جهانی ملل متحد (FAO) که در سال 2012 منتشر نمود، میزان کل تولید آبزیان پرورشی در سال 2010، بالغ بر 6/63 میلیون تن بوده است.
نرخ رشد صنعت پرورش آبزیان طی سالهای 1960 الی 2009 برابر 2/3 درصد بود در حالیکه طی مدت مشابه نرخ رشد افزایش جمعیت معادل 7/1 درصد بوده است . میزان تولید ماهیان خانواده آزاد ماهیان در سال 2001 برابر 1785121 تن گزارش شده است که این گونه ها در سال 2010 به مقدار 2411136 تن افزایش یافت. بر اساس گزارش در همین منبع میزان پرورش آبزیان در ایران در سال 2010 برابر 220034 تن می باشد که رتبه 14پرورش آبزیان را بین کشورهای جهان دارا می باشد .
آمار ارائه شده در آمارنامه سازمان شیلات ایران میزان تولیدحاصل از آبزی پروری را در سال 1389 معادل 251374 تن و در سال 1379 معادل 66000 تن گزارش نموده است .طی ده سال اخیر، روند صعودی میزان تولید ماهی قزل‌آلای رنگین کمان در ایران پیشرفت بسیار قابل توجهی داشته است. بطوریکه میزان تولید سالانه این ماهی در سال 1379، از مقـدار 9000 تـن، به مـرز 91519 تـن در سـال 1389 رسـیده است. که معادل 8/3 درصد تولیدات ماهیان سردآبی جهان است (FAO,2012).

شکل(1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"
1-2- پروبیوتیک چیست؟
واژه پروبیوتیک، واژه ای یونانی و به معنای "برای زندگی" می باشد (Chukeatirote, 2003). پروبیوتیک نخستین بار توسط Lilly & Stillwell (1965) برای برخی مواد مترشحه بوسیله میکروارگانیسم ها بکار گرفته شد که موجب تحریک رشد سایر میکروارگانیسم ها می شوند. بنابر این، ترکیبات اخیر از لحاظ تاثیر می توانند کاملاً در برابر آنتی بیوتیک ها یا مواد پاد زیست، قرار گیرند. با این وجود، بکارگیری این واژه بدین شکل تداوم نیافت و Sperti (1971) از این واژه تحت عنوان عصاره ی بافتی که موجب تحریک رشد میکروبی می شوند، یاد نمود.
تحقیق Metchinkoff (1907) در آغاز قرن بیستم را می توان نخستین تحقیق انجام شده در زمینه پروبیوتیک ها دانست. وی تاثیر مصرف ماست را مورد بررسی قرار داد و متوجه تأثیر این ماده غذایی روی طول عمر کشاورزان بلغاری شد. در واقع او اصول دستکاری میکروفلور روده را درک نموده بود و این موضوع را این گونه شرح داد: "میکروب هایی که با هدف بهبود سلامتی خورده می شوند". همین تعریف، بعدها توسط Parker (1974) اینگونه اصلاح شد: "موجودات و موادی که در تعادل میکروبی روده تأثیرگذارند".
Fuller (1989) نیز تعریف Parker را اینگونه اصلاح نمود: "مکمل های غذایی حاوی میکروب های زنده که از طریق تعادل میکروفلور روده اثرات مفیدی بر سلامت میزبان می گذارد"، این تعریف امروزه بیشتر متعارف است. اجزای اصلی این تعریف منعکس کننده لزوم زنده بودن میکروارگانیسم و استفاده آن به صورت مکمل غذایی برای میزبان است و ابهامی را که با بکاربردن اصطلاح "مواد" ایجاد می شد را از بین می برد. "اثر بر روی تعادل میکروبی روده" که در تعریف اخیر اشاره شد، در تحقیقات انجام شده کمتر مورد توجه قرار گرفته است. Tannock(1997) به این نکته توجه نمود و این تعریف را به این صورت پیشنهاد کرد: "سلول های میکروبی زنده که با هدف بهبود سلامتی، به صورت مکمل های غذایی بکار می روند".
بسیاری از محققین تعریف Fuller را مورد تجزیه و تحلیل بیشتری قرار داده و تعاریف کامل تری را ارئه نمودند. بعنوان نمونه، Gatesoupe (1999) پروبیوتیک ها را اینگونه تعریف نمود: "سلول های میکروبی که به طریقی وارد دستگاه گوارش می شوند و زنده می مانند تا سلامتی را در میزبان ایجاد نمایند". Gram و همکاران (1999) نیز پیشنهاد کردند که "پروبیوتیک هر نوع مکمل میکروبی زنده است که از طریق بهبود تعادل میکروبی بر میزبان تأثیر مثبت می گذارد". همچنین، Salminen و همکاران (1999) تعریف پروبیوتیک را این گونه ارائه کردند: "پروبیوتیک ها فرآورده هایی از سلول های میکروبی یا اجزایی از سلول های میکروبی هستند که اثرات مفیدی روی سلامت میزبان دارند". در این تعریف لزوم زنده بودن سلول های مرتبط با تغذیه نادیده گرفته شد.
روشن است که اختلافات زیادی در درک واقعی اصطلاح "پروبیوتیک" وجود دارد. از آنجا که پروبیوتیک ها در آبزی پروری هم استفاده می شوند، تعاریف بایستی اصلاح شوند. در جانوران آبزی نه تنها دستگاه گوارش مهم است، بلکه آب محیط پرورش هم دارای اهمیت می باشد (Gomez-Gil et al., 2000).
به طور خلاصه می توان پروبیوتیک را اینگونه تعریف نمود: "پروبیوتیک ها باکتری های بی ضرری هستند که به سلامت جانور میزبان کمک می کنند و بطور مستقیم یا غیر مستقیم، میزبان را در بر ابر عوامل بیماریزای باکتریایی محافظت می نمایند" ( Irianto et al.,2000).
1-2-1- ضرورت استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری
در سیستم های متراکم تولید تخم و لارو، آب با روش های گوناگونی مانند فیلتر کردن تصفیه می شود و با این کار عده ای از باکتری ها از سیستم خارج می شوند که این عمل ممکن است تعادل بین جمعیت میکروب ها را از بین ببرد یا سبب تکثیر باکتری های فرصت طلب گردد و یا باعث توسعه جمعیت باکتری های پیش بینی نشده شود. بنابراین برای کنترل میکروبی سیستم، روش های بهتری مورد نیاز است (Olafsen, 1998).
در طی دوره انکوباسیون یا پرورش لارو، میان کنش های متفاوتی بین باکتری ها و سطوح روده جاندار ممکن است رخ دهد که احتمالاً منجر به تشکیل میکروفلور بومی در موجود می گردد و یا زمینه ساز بروز عفونت می گردد. از این رو برای موفقیت در تولید متراکم و انبوه استفاده از روش هایی برای تقویت سیستم های دفاع طبیعی جاندار ضروری بنظر می رسد ( Olafsen, 1998). از دیگر کاربردهای پروبیوتیک بهبود تعادل میکروبی روده و در نتیجه بهبود جذب غذا می باشد (Parker, 1974 ; Fuller, 1989).
در سیستم های آبزی پروری، میکروب ها از اهمیت ویژه ای برخوردار بوده و بر عملکرد رشد اثرات ویژه ای نشان می دهند. علت این امر تا حدی مربوط به ارتباط مستقیم بیماری ها و کیفیت آب، با عوامل میکروبی است. اخیراً در آبزی پروری بمنظور حفظ شرایط اکولوژیک، از پروبیوتیک به جای آنتی بیوتیک استفاده می شود و تکنیک انتقال باکتری به لارو ضروری است (Skjermo & Vadstein, 1999). احتمالاً در فرایند . بمنظور استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، در نظر گرفتن الزاماتی نظیر وجود باکتری با کیفیت مناسب بعنوان پروبیوتیک هاضمه دوکفه ای ها، باکتری ها آنزیم های خارج سلولی همانند پروتئاز و لیپاز تولید کرده و فاکتورهای لازم را برای رشد فراهم می آورند. همچنین احتمالاً باکتری ها در تغذیه بی مهرگان دریایی و ماهی ها نیز نقش دارند (Olafsen, 1998). این گونه باکتری ها با تولید مواد سلولی یا میکرونوترینت هایی شبیه اسیدهای چرب ضروری (Ringo et al.,1995)، ویتامین ها ( Sugita et al.,1998)، مواد معدنی یا حتی آنزیم ها به تغذیه کمک می نمایند.
حضور باکتری های اسید لاکتیک در دستگاه گوارش دلیلی بر وجود تخمیر در روده می باشد، این باکتری ها روی هیدرات های کربن پیچیده همچون نشاسته و سلولز تاثیر گذاشته و آنها را به ترکیبات ساده تر تبدیل می کنند تا جذب و سنتز ویتامین های خانواده B و ویتامین K در لوله گوارش صورت گیرد (Hansen & Olafsen, 1999). در اکوسیستم های آبی ارتباط بین میکروارگانیسم ها و دیگر واحدهای زنده و همچنین جریان مداوم آب، میان دستگاه گوارش ماهیان و بی مهرگان، همه بر روی میکروفلور بومی تاثیر می گذارد(Olafsen, 1998). ایجاد کلنی های پروبیوتیک در امعا و احشا احتمالاً در اثر مصرف آن از محیط آبی اطراف می باشد که سبب تعدیل فلور امعا و احشا میشود و باعث بهبود رشد و بقای لاروها میگردد.
این امکان وجود دارد که پروبیوتیک ها همانند یک ماده فعال کننده مکانیسم های دفاعی عمل نمایند ( Raa, 1996). باکتری های پروبیوتیک هوازی با مصرف اکسیژن، شرایط لوله گوارش را برای عوامل بیماریزا هوازی سخت می نمایند و برای آنها محدودیت ایجاد می نمایند و از رشد آنها جلوگیری می کنند. همچنین از لحاظ فضا و غذا نیز با آنها رقابت می کنند. در این میان تعدادی از پروبیوتیک ها اجباراً از بین میروند.
در واقع استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، باعث کاهش سطح ترکیبات آنتی میکروبیال (بویژه آنتی بیوتیک ها) بکار رفته، افزایش میزان اشتها و یا مقدار رشد گونه های پرورش یافته می شود)


Irianto & Austin, 2002)). شاید بتوان مهمترین ویژگی پروبیوتیک ها را در این دانست که ضمن کاهش بیماری و بهبود ضریب تبدیل غذایی در دام و طیور، هیچ باقیمانده ای در بافت ها نداشته و بر خلاف پادزیست ها مقاومت میکروبی ایجاد نمی نمایند. مطمئناً، پروبیوتیک ها نبایستی برای میزبان ضرر داشته باشند (Salminen et al., 1999) و آنها غیر بیماریزا و غیر سمی بوده و می توانند موجب پیشگیری از بروز اثرات جانبی نامناسب باشند. آنها بایستی در یک محدوده دمائی و دامنه شوری مشخصی مؤثر باشند ((Fuller, 1989 .
1-2-2- خطرات مصرف آنتی بیوتیک ها
امروزه درمان با مداخله میکروارگانیسم ها به چند دلیل مورد توجه می باشد (رنجبرو میرنژاد، 1380; Rengpipat et al., 1998):
درمان با آنتی بیوتیک بطور موفقیت آمیزی برای کل عوامل عفونی مثمر ثمر واقع نشده است، اگرچه بدون شک بعضی از مسائل را حل نموده ولی بعضاً خود مساله ساز بوده است.
درمان با آنتی بیوتیک وضعیت فلور معمولی محافظت کننده بدن را بر هم می زند و موجود را نسبت به سایر عفونت های فرصت طلب مستعد می نماید و موجب افزایش نگرانی و ترس از ایجاد سویه های میکروبی مقاوم به آنتی بیوتیک در اثر استعمال گسترده آن شده است. با استفاده از آنتی بیوتیک های مشابه، سویه های میکروبی نسبت به آنها مقاومت پیدا می کنند و به سرعت رشد یافته و تکامل می یابند.
1-2-3- نحوه عمل پروبیوتیک ها
1-2-3-1- تولید ترکیبات ممانعت کننده (Inhibitory Component)
باکتری های پروبیوتیکی ترکیبات شیمیایی مختلفی تولید می کنند، که موجب از بین رفتن سایر باکتری ها و یا توقف فعالیت آنها می گردد (Verschuere et al., 1999). به نظر می رسد تولید مواد ممانعت کننده می تواند در داخل و یا سطح روده و حتی در محیط پرورشی، به عنوان سدی موجب جلوگیری از رشد و نمو عوامل بیماری های فرصت طلب گردد. معمولاً اثر ضد باکتریایی باکتری ها می تواند بعلت تولید برخی از عوامل زیر به تنهایی و یا بصورت ترکیبی باشد: تولید آنتی بیوتیک ها ) Williams & Vickers, 1986)، باکتریوسین ها (Bruno & Montville, 1993 و Boyd et al., 1984)، سیدروفورها ( Pybus et al., 1994،
Yoshida et al., 2002 و Braun, & Braun, 2002)، لیزوزیم ها، پروتئازها، هیدروژن پراکساید ها و یا تغییر میزان pH از طریق تولید اسیدهای آلی (Sugita et al., 1997 و Ringo & Gatesoupe, 1998)، دی اکسید کربن (Gill, 2003). تعدادی ازمحققین ترکیباتی کشف و مشاهده نموده اند. بعنوان نمونه، Nair و همکاران (1985) نشان دادند که تعداد قابل توجهی از باکتری های دریایی، آنزیم های باکتریولیتیک علیه باکتری Vibrio parahaemolyticus تولید می کنند. همچنین،Imad و همکاران (1985)، Alteromonas SB-10-31 را از نواحی نزدیک ساحل دریای ژاپن جداسازی نمودند. آنها نشان دادند که این باکتری قادر است یک پروتئاز آلکالینی ممانعت کننده که موناستاتین نامیده می شود، تولید کند. در آزمایش فعالیت ممانعت کنندگی موناستاتین علیه پروتئاز بدست آمده از Aeromonas hydrophila و پروتئاز تیول بدست آمده از Vibrio anguillarum، به اثبات رسید (هر دو باکتری مذکور عوامل بیماریزای ماهی هستند) (Verschuere et al., 1999).
1-2-3-2- رقابت بر سر مکان های اتصال
موجودات پروبیوتیکی برای مکان های اتصال و غذا در سطح مخاطی روده رقابت می کنند و در نتیجه از تشکیل کلونی باکتری های بیماریزا پیشگیری می کنند ( Vanbelle et al., 1990). قدرت اتصال باکتری های پروبیوتیکی ظاهراً طی مرحله سکون رشد بیشتر از مرحله رشد لگاریتمی است (Vine et al., 2004). اتصال ممکن است غیراختصاصی، بر پایه فاکتورهای فیزیکوشیمیایی و یا اختصاصی باشد. محل اتصال می تواند در بر گیرنده مولکول های چسبیده به سطح باکتری های متصل به روده و یا مولکول های گیرنده روی سطح سلول های مخاطی روده باشد (Salminen 1996). توانایی پروبیوتیک ها برای چسبیدن به موکوس روده احتمالاً می تواند ایجاد عفونت روده را توسط برخی از عوامل بیماریزا متوقف می کند. البته اتصال پروبیوتیک ها به دیواره روده یا سایر بافت ها لزوماً نشان دهنده رقابت بر سر مکان های اتصال به عنوان تنها روش عملی اثر پروبیوتیک ها نیست. این نکته که باکتری ها قادر به تشکیل کلونی، مثلاً در دیواره روده ماهی، هستند و نقش حفاظتی شان از طریق ترشح ترکیبات ممانعت کننده اعمال می نمایند، کاملاً پذیرفته شده است (Verschuere et al., 2000). توانایی اتصال و رشد در سطح روده یا درون موکوس خارجی در شرایط آزمایشگاهی در مورد برخی عوامل بیماریزا در ماهی از قبیلV. anguillarum وA. hydrophila ( Krovacek et al., 1987 ; Garcýa de la Banda et al., 1992) و همچنین برای پروبیوتیک های مانند Carnobacterium SK1 و بسیاری از پروبیوتیک های تخلیص شده نشان داده شده است. همچنین نقش ممانعت کنندگی برایV. anguillarum ( Olsson et al., 1992) نیز به اثبات رسیده است. در یکی از این مطالعات، هدف ارزیابی توانایی سویه های پروبیوتیکی در اتصال یا رشد در موکوس روده ای در شرایط آزمایشگاهی بوده تا پتانسیل آنها در تشکیل کلونی در توربوت پرورشی، به عنوان روشی برای پیشگیری از عفونت میزبان باV. anguillarum بررسی گردد (Olsson et al., 1992).
1-2-3-3- رقابت جهت جذب و مصرف مواد مغذی
پروبیوتیک ها از مواد مغذی که توسط میکروب های بیماریزا مصرف می شوند، استفاده می کنند و در نتیجه محیط را از مواد غذایی مورد نیاز برای سایر میکروارگانیسم ها تهیه می نمایند و موجب بروز مشکلاتی برای رشد آنها می شوند .در تئوری، رقابت بر سر مواد مغذی می تواند نقش مهمی در ترکیب توده زنده میکروبی روده یا محیط زیست موجودات آبزی پرورشی، ایفا نماید.(Ringo & Gatesoupe, 1998). اما تاکنون مطالعات جامعی در این زمینه انجام نگرفته است. از اینرو بکارگیری صحیح و بجای اصل رقابت بر سر مواد مغذی در شرایط طبیعی کاری آسان نبوده و وظیفه اصلی اکولوژیست های میکروبی است (Verschuere et al., 1999).
Verschuere و همکاران (1999) سویه های مختلف باکتریایی را که اثر مثبتی بر روی بقاء و رشد آرتمیای جوان داشتند، انتخاب نمودند. آزمایش های آنتاگونیستی در شرایط in vitro و آزمایشات فیلتری نشان داد که هیچ ترکیب ممانعت کننده خارج سلولی در عمل حفاظتی این سویه ها علیهVibrio  proteolytics CW8T2 شرکت نداشته اند. اما سلول های زنده این سویه در حفاظت آرتمیا در برابر عامل بیماریزا ضروری بنظر می رسند یافته های اخیر بر این نکته اشاره دارند که باکتری های انتخاب شده عمل حفاظتی شان را از طریق رقابت با عامل بیماریزا بر سر دسترسی به مواد مغذی و انرژی اعمال می کنند.
1-2-4- معیارها و روشهای انتخاب پروبیوتیک
نخستین و مهمترین هدف ازکاربرد پروبیوتیک ها، حفظ یا ایجاد مجدد رابطه مطلوب بین میکروارگانیسم های بیماریزا و مفید است که فلور موکوس پوست و روده ماهی را تشکیل می دهند. بنابراین یک پروبیوتیک مناسب بایستی برخی خصوصیات خاصی که اثر مثبت آن را تأیید نماید، داشته باشد( Ali, 2000).
اکثر مطالعات انجام گرفته در زمینه اثر پروبیوتیک ها بر جانوران آبزی پرورشی بر کاهش مرگ و میر و بالعکس، افزایش بقاء (Moriarty, 1998 ; Skjermo & Vadstein, 1999 Chang & Liu, 2002 ; ; Irianto & Austin, 2002)، افزایش مقاومت در برابر بیماری (Gatesoupe, 1994)، توانایی چسبندگی و تشکیل کلونی در روده ( Joborn et al., 1997)، توانایی کاهش تعداد سلول های باکتریایی در کلیه، تولید پلی آمین ها و فعالیت آنزیم های گوارشی (Tovar et al., 2002) و تکامل سیستم ایمنی غیر اختصاصی توسط سیستم های داخل سلولی، مثلاً افزایش فاگوسیتوز و فعالیت های لیزوزیمی ( ;Irianto, & Austin, Panigrahi et al., 2004 ; Gullian et al., 2004) بوده است. اثر مثبت پروبیوتیک ها برمیزبان نظیر، سم زدایی از ترکیبات مضر موجود در غذا و بهبود مواد مغذی آن، تجزیه کردن اجزای غیر قابل هضم موجود در جیره غذایی توسط آنزیم های هیدرولیتیک من جمله آمیلاز و پروتئاز، تولید ویتامین ها مثل بیوتین و B12، تولید ترکیباتی که آنتاگونیست عوامل بیماریزا هستند و در نهایت تحریک سیستم ایمنی میزبان تاکنون گزارش شده اند. روشن است که یک پروبیوتیک مفروض می تواند بیش از یک پاسخ حفاظتی را در میزبان القا نماید. همچنین پروبیوتیک های مختلف می توانند اثرات جداگانه و مشخصی را بر میزبان بگذارندIrianto, 2002) Austin &). دوام پروبیوتیک ها در دستگاه گوارش می تواند منعکس کننده شرایط سن و بهداشت و سلامتی ماهی باشد. مثلاً تجویز پروبیوتیک ها درماهیان جوان، در هنگام انجام اولین مراحل تغذیه و در ماهیان بزرگتر پس از مصرف آنتی بیوتیک ممکن است منجر به تشکیل کلونی بلندمدت از باکتری های پروبیوتیکی در دستگاه گوارش گردد. روش های انتخاب باکتری پروبیوتیکی برای استفاده در پرورش موجودات آبزی شامل مراحل زیر می باشد (Gomez-Gil et al., 2000):
1-2-4-1- جمع آوری اطلاعات زمینه ای
پیش از انجام فعالیت های تحقیقاتی در زمینه توسعه پروبیوتیک ها، در مورد فعالیت های پرورشی و توسعه اقتصادی مزارع پرورشی هم باید بررسی شود. مروری بر مقالات علمی در دسترس و اطلاعات گسترده مربوط به نحوه پرورش در مزارع پرورشی هم باید انجام شود تا تعیین گردد که آیا استفاده از پروبیوتیک میسر است یا خیر؟ وضعیت محیط زنده و غیر زنده اشغال شده توسط موجودات پرورشی با تأکید بر میکروب های موجود و ارتباط بین میکروب های محیط و ظرفیت نگهداری میکروب نیز از جمله مواردی است که بایستی مورد بررسی واقع گردد (Verschuere et al. 2000).
1-2-4-2- تهیه پروبیوتیک
تهیه یک پروبیوتیک مناسب از اهمیت ویژه ای بر خوردار است. ضروریست برای سویه های به کار گرفته شده در فرآورده های پروبیوتیک با مصرف خوراکی ، مقاومت در برابر آنزیم های دستگاه گوارش و دهان از مهمترین معیارهای انتخاب و گزینش می باشد ( مطلبی و همکاران ، 1389).
1-2-4-3- ارزیابی توان پروبیوتیک در جهت خارج سازی سویه های بیماریزا
با استفاده از آزمایش های in vitro توانایی سویه های جداسازی شده را می توان ارزیابی نمود(Gram et al.,2001).
1-2-4-4- ارزیابی امکان بیماریزایی پروبیوتیک
پیش از استفاده از یک باکتری به عنوان پروبیوتیک، لازم است که عدم بیماریزایی آن در میزبان تأیید شود. بنابراین موجودات پرورشی بایستی به همراه پروبیوتیک انتخاب شده، تحت شرایط نرمال و استرس مورد آزمایش قرار گیرند. این کار را می توان با تزریق یا غوطه وری میزبان در سوسپانسیون پروبیوتیک انتخاب شده، یا افزودن پروبیوتیک به محیط پرورشی، انجام داد (Gomez-Gil et al., 2000).
1-2-4-5- ارزیابی اثر پروبیوتیک بر میزبان
اثر پروبیوتیک انتخاب شده بایستی به صورت in vivo هم آزمایش شود. وقتی اثر پروبیوتیک به صورت مصرف در غذا در نظر گرفته شود، پروبیوتیک های انتخاب شده را می توان به محیط پرورش گونه آبزی مورد نظر افزوده و اثرشان را بر رشد و باز ماندگی ارزیابی نمود. اگرچه هنگامیکه کنترل زیستی توده میکروبی مورد نظر است، به نظر می رسد آزمایش های in vivo ابزاری مناسب جهت ارزیابی اثر بالقوه پروبیوتیک انتخاب شده بر میزبان باشد(Kesarcodi-Watson et al., 2008).
پروبیوتیک را می توان به روش های مختلف به میزبان یا محیط اطرافش اضافه نمود:
-اضافه کردن به جیره غذایی (Irianto & Austin, 2002)
-افزودن به آب پرورش (Verschuere et al., 2000)
-غوطه وری ( Austin et al. 1995)
-اضافه کردن از طریق غذای زنده (Gomez-Gil et al. 1998 ;Dhert et al. 1990 ; Robles et al. 1998)
1-2-4-6- تولید انبوه، ارزیابی سود اقتصادی
این مرحله، آخرین مرحله انتخاب پروبیوتیک است. آزمایشات اولیه بایستی در محیط یک سالن تفریخ در مزارع پرورشی انجام شود تا اثرات اقتصادی کاربرد پروبیوتیک مورد ارزیابی واقع گردد. فاکتور مهم در ارزیابی اقتصادی، امکان تولید انبوه یک پروبیوتیک است. همچنین، ممکن است قوانین محدودکننده ای در مورد کاربرد آنها در یک کشور وضع شده باشد. از اینرو بایستی پیش از آنکه کاربردهای تجاری در این خصوص آغاز شود، به آنها توجه بیشتری معطوف گردد. در پایان بایستی تعیین شود که آیا پروبیوتیک ها را می توان در عمل بکار برد یا خیر؟ بر اساس تعریف Fuller (1987)، یک پروبیوتیک بایستی برای میزبان سودمند باشد، قادر باشد در دستگاه گوارش باقی بماند، قابلیت تولید به صورت تجاری را داشته باشد، یعنی در سطح وسیع رشد کند و تولید آن اقتصادی بوده و در شرایط طولانی مدت در انبار و مزرعه، پایدار و مؤثر بماند.
به طور خلاصه، انتخاب باکتری های پروبیوتیکی یک فرایند تجربی مبتنی بر شواهد علمی محدود بوده است. بسیاری از تجارب ناموفق در زﻣﻴﻨﺔ تحقیقات در خصوص پروبیوتیک ها را می توان به انتخاب میکروارگانیسم های نامناسب نسبت داد. توسعه پروبیوتیک های قابل استفاده در کاربردهای تجاری در آبزی پروری یک فرایند چند جانبه و چند مرحله ای است، که نیازمند تحقیقات بنیادی و تجربی بوده و نیز مستلزم انجام آزمایشات در مقیاس وسیع و ارزیابی اقتصادی کاربرد آن است. لازم است که مراحل انتخاب برای میزبان های مختلف و محیط های متفاوت تغییر و اصلاح گردند((Verschuere, et al., 2000
1-3- سیستم ایمنی در ماهیان
اختلاف عمده موجود در سیستم ایمنی از نظر تشریحی بین ماهی و پستانداران، فقدان مغز استخوان و گره های لنفاوی در ماهیان است. تیموس، کلیه و طحال بافت های اصلی لنفوییدی در ماهیان استخوانی حقیقی اند. در حالی که تیموس در ماهی یک اندام لنفوییدی اولیه به حساب می آید ، اندام های لنفوییدی ثانویه تنوع قابل توجهی را نشان می دهند. بافت های لنفوییدی اغلب در اندام هایی تشکیل می شوند که جریان سینوزوییدی داشته و سلول های لنفوییدی در آنها جمع شده و به حضور آنتی ژن ها پاسخ دهند. این اندام ها در ماهیان عبارت اند از : کلیه و طحال. کبد پوست و روده نیز از اجزا مهم سیستم های دفاعی ماهیان هستند. کلیه ، طحال و کبد اندام های اصلی و پاکسازی کننده محسوب می شوند ، بطوریکه سلول های اندوتلیال و ماکروفاژها آنها به شدت نسبت به مواد خودی و غیر خودی که باید از گردش خون حذف شوند ، خاصیت آندوسیتوز دارند (سلطانی، 1387).
مهم ترین اندام ها و بافت های سیستم ایمنی ماهیان شامل تیموس، آبشش ها، پوست، کلیه اندام اپی گونال، خون، طحال، بافت مننژی، فلس ها، کبد، اجسام غاری شکل، قلب گره های لنفاوی یا اندام لیدیگ دیواره مری، مجرای گوارشی و ترشحات موکوسی و صفراوی می باشد. ایمنی در ماهیان به دو صورت اختصاصی و غیر اختصاصی تظاهر می یابد (سلطانی، 1387).
1-3-1- ایمنی غیر اختصاصی
سیستم ایمنی غیر اختصاصی، ماهی را به طیف وسیعی از عوامل بیماریزا مصون می سازد و علت مقاومت
یک فرد به یک عامل خاص بیماریزا نیز همین سیستم دفاعی می باشد (جلالی جعفری، 1377). امروزه تحقیقات در زمینه نحوه عملکرد سیستم ایمنی غیر اختصاصی ماهیان و تولید جمعیت های مقاوم به انواع عوامل بیماریزا متمرکز شده است (Galindo-Villegas & Hosokawa, 2004). دفاع غیر اختصاصی بر پایه گیرنده هایی است که الگوهای مولکولی خاصی را شناسایی می کنند. این مولکول ها در سلول های میکروبی (باکتری ها، قارچ ها و ویروس ها) وجود دارند. اما در خود میزبان دیده می شوند و هر مولکول نا آشنایی که باعث بیان ژن گیرنده خود شود محکوم به مرگ خواهد بود. سیستم ایمنی غیر اختصاصی پاسخ های سازشی را سبب شده و در حفظ هموستازی بدن شرکت می کند (Magnadottir, 2006). علاوه بر این، در القا سیستم ایمنی اکتسابی نیز شرکت دارد که از طریق تولید واسطه های خاصی در سلول ها مواجه شده با عامل خارجی صورت می گیرد (Jones, et al., 1993).
مهم ترین اجزا و سیستم ایمنی غیر اختصاصی شامل موارد زیر می باشند (جلالی جعفری،1377 و Magnadottir, 2006):
عوامل فیزیکی: شامل فلس ها، موکوس و پوست است. موکوس علاوه بر به دام اندازی و ریزش و تجدید شدن، واجد لستین، پنتراکسین، لیزوزیم، پروتئین های خنثی کننده و ایمونوگلبولین ها نیز می باشد.
عوامل سلولی: نظیر سلول های فاگوسیتوزی (گرانولوسیت ها، مونوسیت ها و ماکروفاژها) هستند. که به دو دسته ثابت (مثل سلول های موجود در بافت لنفوئیدی دستگاه گوارش) و متحرک (ماکروفاژها، نوتروفیل ها،...) تقسیم می شوند.
عوامل خونی: این تقسیم بندی به دلیل ویژگی های شناسایی عوامل نا آشنا یا نحوه عملکرد آنها می باشد. ترانسفرین از طریق رقابت برای آهن (جذب سطحی) مانع رشد باکتری ها می گردد. انترفرون نیز پروتئین ضد ویروسی است. آنزیم های پروتئازی ممانعت کننده نیز در مایعات بدنی ماهیان شناسایی شده اند.
1-3-1-1- ایمنی غیر اختصاصی ( ترکیبات مایع)
ساز و کارهای ایمنی مایعات بدن در ماهیان نقش مهمی در همه مراحل رفع یک عفونت دارند. دفاع غیر اختصاصی مایعات بدن ماهی شامل پروتئازها ، لیزین ها و آگلوتینین های موجود در ترشحات موکوسی ، به عنوان اولین خط دفاعی عمل می کنند. در حالی که سلول های پوشش مخاطی دومین سد دفاعی در برابر تهاجم میکروارگانیسم ها محسوب می شوند.
مواد گوناگون ضد میکروبی مانند تریپسین، لیزوزیم، آگلوتینین ها، عامل مکمل، پروتئین فاز حاد و دیگر عوامل لیز کننده در سرم و در موکوس پوست، آبشش ها و روده از جمله عواملی بوده که به عنوان اولین خط دفاعی در ماهی عمل کرده و مانع از چسبیدن و تثبیت میکروارگانیسم ها بر سطوح پوششی خارجی (پوست و آبشش ها) و داخلی (مجرای گوارشی) می شوند. این مواد به طور غیر اختصاصی از رشد و تکثیر عوامل عفونی بیماریزا مثل باکتری ها، قارچ ها، انگل ها و ویروس ها جلوگیری می کنند. این ترکیبات اغلب از نوع پروتئینی یا گلیکوپروتئین بوده و ترکیبات مشابه آنها و یا پیش ساز آنها نیز در همولنف بی مهرگان وجود دارد (سلطانی ، 1387).
1-3-1-1-1- لیزوزیم
لیزوزیم نقش مهمی برای مواجهه با عوامل بیماریزای عفونی در ماهیان ایفا می کند.در ماهیان لیزوزیم اغلب در بافت های غنی از گلبول های سفید مانند قسمت قدامی کلیه و بافت های پوست ، آبشش و دستگاه گوارش یافت می شود (سلطانی، 1387).لیزوزیم یک نوع واکنش ایمنی غیر اختصاصی است که توسط گلبول های سفید منتشر و در بافت های مختلف و خون ترشح می شود. (سلطانی، 1387؛ Sakai, 1999).
1-3-1-1-2- سیستم عامل مکمل (کمپلمان) در ماهیان
کمپلمان به صورت یک سیستم پروتئینی سرمی است، که عمل همولیز با واسطه ایمنی را انجام میدهد، و فعالیتهای بیولوژیکی متنوعی را نیز انجام میدهد( سلطانی، 1387).
سیستم کمپلمان نقش کلیدی در ایمنی ذاتی و اکتسابی و هشدار دادن به سیستم ایمنی میزبان در رابطه با حضور عوامل بیماریزا و برداشتن ان مانع (عامل بیماریزا) بازی می کند (Boshra and Sunyer, 2006 ; Sunyer and Lambris, 1999; Gasque, 2004 ).
1-3-1-2- ایمنی غیر اختصاصی (سلولی)
واکنش های التهابی و واکنش های ناشی از فعالیت گرانولوسیت ها ، مونوسیت ها و لنفوسیت ها ساز و کارهای دفاع غیر اختصاصی سلولی را در ماهیان تشکیل می دهند که در پاسخ به شرایط مختلفی مانند عفونت های باکتریایی ، ویروسی ، قارچی ، تک یاخته ای و انگلی به وقوع می پیوندند. (سلطانی، 1387).
سلول های فاگوسیت کننده ماهیان شامل نوتروفیل ها ، ماکروفاژها ، لنفوسیت ها ، منوسیت ها، ترومبوسیت ها ، بازوفیل ها و ائوزینوفیل ها می باشند که بیشترین نقش را ماکروفاژها و بعد نوتروفیل ها بر عهده دارند(سلطانی، 1387).
1-3-1-2-1- لنفوسیت ها
این سلول ها از سلول های مهم ایمنی می باشند و عبارت اند از : سلول های B که در اندام های مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید در کبد و سلول های T در تیموس تمایز می یابند (سلطانی ، 1387).معمولاً تعداد لنفوسیت ها در خون ماهی ، به استثنای گلبول های قرمز از سایر سلول ها بیشتر و در حالات مختلف ماهی و به خصوص در هنگام بیماری ها تفاوت دارد (ستاری، 1381).
1-3-1-2-2- نوتروفیل ها
اکثر ماهیان دارای این نوع سلول می باشند. این نوع سلول ها در ماهیان بیشترین گلبول های سفید چند هسته ای را تشکیل می دهند. (Stoskopf, 1993).
وظیفه نوتروفیل ها دفاع علیه عفونت های باکتریایی است. در اثر تحریکات تورمی به جریان خون مهاجرت
و در مرحله حاد تورمی به نواحی صدمه دیده تورمی نفوذ می کنند. این سلول ها به باکتری به صورت بیگانه خوار حمله نموده توسط فاگوزوم های داخلی آنها کشته و هضم می گردند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-1-2-3- ائوزینوفیل ها
ائوزینوفیل ها از نظر اندازه مشابه نوتروفیل ها یا به مقدار جزئی کوچکتر از آنها هستند. (Stoskopf, 1993). گرانول ها به صورت پراکنده در سلول وجود دارند و اندازه و شکل آنها در گونه های مختلف و گاهی در بین سویه های مختلف یک گونه نیز متغیر است. قدرت بیگانه خواری آنها در مقایسه با نوتروفیل ها محدود تر است (Stoskopf, 1993).
1-3-1-2-4- مونوسیت ها
کمترین تعداد گلبول های سفید متعلق به مونوسیت ها می باشد و تعداد آنها حداکثر 2 درصد در ماهیان گزارش شده است (Kumar and Tembhre, 1998). در ماهیان مونوسیت های خونی عمل ماکروفاژی دارند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994). مواد خارجی که توسط این سلولها گرفته می شوند، با آنزیم های هیدرولیتیک لیزوزیم های آنها کشته شده و سپس هضم می شوند. این سلول ها به عنوان سلول های خنثی کننده آنتی ژن نیز عمل می کنند (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-2- ایمنی اختصاصی
بطور کلی اساس سیستم ایمنی اختصاصی بر این است که ماهیان را بطور انفرادی قادر به بقاء و حفظ تعادل داخلی خودشان در محیط می نماید. اندام هایی که در ایجاد واکنش دفاع اختصاصی نقش دارند شامل بخش قدامی کلیه، طحال و تیموس است (جلالی جعفری، 1377). سیستم ایمنی اختصاصی از نظر سرعت عمل کند بوده و در مراحل ابتدایی زندگی موجود فعال نمی باشد ولی باعث ایجاد ایمنی برای دفعات بعدی مجاورت با عامل بیماریزا می گردد (Magnadottir, 2006). پاسخ های ایمنی اختصاصی بر اساس اجزاء شرکت کننده در پاسخ به دو گروه زیر تقسیم بندی می شوند (عسگری و همکاران، 1386 و Rotllant et al., 1997):
الف - پاسخ های ایمنی همورال: با واسطه ملکول هایی در خون شکل می گیرند که مسئول شناسایی اختصاصی آنتی ژن ها و انهدام آنها می باشند و همانگونه که قبلاً نیز اشاره شد آنتی بادی نام دارند؛ بروز این پاسخ ها با واسطه لنفوسیت های B انجام می گردد.
ب- پاسخ های ایمنی سلولار: با واسطه سلولی که با واسطه لنفوسیت های T ایجاد می گردد.
ایمنی ذاتی که به عنوان ایمنی طبیعی نیز در ماهیان شناخته می شود دارای دو جزئ اصلی ن شامل عوامل طبیعی و سلول های فاگوسیت کننده (ماکروفاژها) می باشند. از این میان عوامل بازدارنده فیزیکی و شیمیایی لیزوزیم ها، از اهمیت و جایگاه ویژه ای برخوردار بوده و به عنوان یکی از شاخص های استرس محسوب می گردند (Fast, et al., 2002).
1-3-2-1- ایمنی هومورال
1-3-2-1-1- ایمونوگلوبولین M(IgM)
ایمونوگلوبولین ها در ماهیان همگی جزو ماکروگلوبولین ها هستند. ماهیان ایمونوگلوبولین مشابه IgG جانوران عالی را نداشته یا کمی از آن را دارند. در ماهیان فاقد فک ایمونوگلوبولین تنها به میزان کمی وجود دارد و به خوبی شناسایی نشده اند. در ماهیان فکدار ایمونوگلوبولین از نوع IgM و دارای یک زنجیره سنگین مشابه μ پستانداران است. هر مولکول ایمونوگلوبولین در ماهیان استخوانی از نظر ساختمانی تترامر بوده و شامل دو ناحیه اتصال به آنتی ژن یعنی انتهای آمینی و ناحیه تاثیر گذار انتهایی کربوکسی است که در مجموع 4 زیر واحد مونومری را تشکیل می دهد (سلطانی، 1387).
ایمونوگلوبولین ها دارای وظایف و عملکرد های مهمی هستند که از آن جمله می توان به موارد ذیل اشاره نمود:
1.خنثی سازی2. رسوب و آگلوتیناسیون و 3.خاصیت اپسونیزاسیون (فعالیت عامل مکمل در طی فاگوسیتوز توسط نوتروفیل ها و ماکروفاژها)فعال کردن عامل مکمل (سلطانی، 1387).
1-3-2-2- ایمنی با واسطه سلولی
لنفوسیت ها به طور واضح مسئول هر دو نوع پاسخ ایمنی اختصاصی هومورال و با واسطه سلولی اند. دو نوع از لنفوسیت ها عبارت اند از : سلول های T که در تیموس تمایز می یابند و مسئول ایمنی با واسطه سلولی اند و سلول های B که در اندام های غیر از تیموس مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید کبد تولید و تمایز می یابند (سلطانی، 1387).
1-4- اهمیت مطالعات خون شناسی در ماهیان
شناخت فاکتورهای خونی علاوه بر شناخت فیزیولوژی آبزی شاخص مهم و منحصر به فرد هر گونه است که آن را از سایر ماهیان متمایز میکند. اهمیت این شناخت نه تنها در تشخیص گونه مهم است بلکه از نظر اقتصادی نیز می تواند در شناسایی بیماری ها و تعیین شرایط بهداشتی و سلامت ماهی مفید باشد (Bahmani et al., 2001; Abdel-Tawwab et al., 2005).
بافت خون شاخص مهمی برای وضعیت فیزیولوژیک اندام های بدن در تشخیص سلامت یا بیماری و کنترل روند زیستی موجودات زنده بوده و تجزیه وتحلیل شاخص های خونی راهنمای ارزشمندی در سنجش وضعیت زیستی آبزیان می باشد (بهمنی، 1377).
1-4-1- شاخص های خونی
1-4-1-1- گلبول های سفید(White Blood Cells = WBC) (لکوسیت)
تعداد این سلول ها بسیار کمتر از گلبول های قرمز است (مشایی،1386). گلبول های سفید در خون ماهیان به دو دسته تقسیم می شوند:
-گرانولوسیت (دانه دار بوده و هسته چند قسمتی دارند) شامل نوتروفیل یا هتروفیل، ائوزینوفیل و بازوفیل
-آگرانولوسیت (فاقد دانه بوده و هسته تک قسمتی دارند) شامل لنفوسیت و مونوسیت (ستاری، 1381).
هر یک اعمال حیاتی متنوعی را بر عهده دارند. گلبول های سفید در برابر عوامل گوناگون بیماریزا در بدن ماهی مقاومت ایجاد می‌کنند و پاسخ های ایمنی مختلفی بوجود می‌آورند. وظیفه اصلی این سلول ها تولید پادتن می‌باشد. مونوسیت‌ها، ماکروفاژها و گرانوسیت‌ها، وظیفه بیگانه خواری دارند، بعلاوه گرانولوسیت ها موادی برای از بین بردن باکتری ها ترشح می‌نمایند.
1-4-1-2- گلبول های قرمز (Red Blood Cells = RBC) (اریتروسیت، هموسیت)
سلولهای گلبول قرمز بیضی شکل بوده و در ماهیان مانند دوزیستان، خزندگان و پرندگان هسته دار هستند. جمعیت گلبول های قرمز در خون محیطی ماهیان را عمدتاً گلبول های قرمز بالغ تشکیل می دهد(تاکاشیما و هایبیا، 1994). تعداد آنها با افزایش سن کمتر و در فصل جفتگیری دوباره افزایش می یابد (وثوقی و مستجیر، 1388). گلبول های قرمز یا اریتروسیت ها بیشترین فراوانی را در بین سلول های خونی دارند (ستاری، 1381).
1-4-1-3- شاخص های گلبول قرمز یا اندیس های خونی
مهم ترین این شاخص ها عبارت اند از: متوسط حجم گلبول قرمز (MCV)، متوسط هموگلوبین گلبول قرمز (MCH) و متوسط غلظت هموگلوبین سلولی (MCHC) که از طریق روابط ریاضی ذیل محاسبه می شوند (Houston, 1990).
1-4-1-4- هماتوکریت
هنگامی که خون کامل دارای ماده ضد انعقاد، سانتریفوژ می شود، فضایی که توسط گلبول های قرمز فشرده شده اشغال می شود را هماتوکریت می گویند که به صورت درصد گلبول های قرمز خون نسبت به خون کامل بیان می شود. (عامری مهابادی، 1378).در صورت وجود عوامل بیماریزا در بدن یا بهم خوردن تعادل تراکم مواد معدنی در خون یا هر دو، میزان هماتوکریت متغیر خواهد بود. بعلاوه، حجم بسیار زیاد هماتوکریت نیز خود می‌تواند بیانگر احتمال وجود شرایط محیطی نامساعد همراه با استرس باشد (Parker, 1974).
1-4-1-5- هموگلوبین
هموگلوبین کروموپروتئینی است که جز اصلی گلبول قرمز را تشکیل می دهد. هر گرم هموگلوبین هنگامی که کاملاً اشباع شده باشد، 34/1 میلی لیتر اکسیژن حمل می کند (عامری مهابادی، 1378).
چندین نوع هموگلوبین مختلف ممکن است در یک ماهی وجود داشته باشد که احتمالاً برای سازگاری سیستم حمل گاز با شرایط متغیر است (کیوانی،1384).
1-5- شاخصهای بیوشیمیایی
1-5-1- پروتئین کل پلاسما و آلبومین
تقریبا بین 5 الی 10 درصد پلاسمای خون را پروتئین های خون تشکیل می دهند. اغلب پروتئین ها توسط کبد و برخی نیز مانند آنتی بادیها توسط سیستم ایمنی ساخته می شوند. اگر چه تغییر در میزان پروتئین کل پلاسمای خون به عنوان یک شاخص اختصاصی مطرح نمی باشد ولی می تواند بیانگر یک تغییر متابولیک و یا آسیب شناسی باشد( کاظمی و همکاران، 1389). آلبومین سرم فراوان ترین پروتئین پلاسما می باشد. آلبومین ها اساساً در کبد ساخته شده و از خارج شدن خون از رگهای خونی جلوگیری می کنند. (دانیال زاده و همکاران، 1385).توتال پروتئین شامل آلبومین و گلوبولین های سرمی است. این ترکیب مانند آلبومین در بیماریهای حاد و مزمن کبدی و کلیوی کاهش می یابد (Densmore, 2001). در ماهیان واجد عفونت این فاکتور نیز بصورت معنی داری نسبت به ماهیان فاقد عفونت کاهش داشته است (Austin, 1993)
1-5-2- گلوکز
گلوکز می تواند به عنوان یکی از شاخصهای مهم در تعیین وضعیت فیزیولوژیک ماهی بکار رود.با افزایش مصرف گلوکز ومتابولیت های دیگر در بعضی گونه ها ذخایر گلیکوژن چربی ها کاهش می یابد و احتمالا پروتئین ها برای تامین انرژی شکسته می شوند ( کاظمی و همکاران، 1389).
1-5-3- گلوتامیک پیرویک ترانس آمیناز (SGPT)=ALT
گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز (SGOT)AST=
دو آنزیم گلوتامیک پیرویت ترانس آمیناز) آلاتین آمینو ترانسقراز یا ALT) و گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز(آسپارات آمینو ترانسفراز یا AST)، نقش بسیار مهمی در خنثی سازی عوامل سمی و نیز فعالیتهای متابولیکی کبد داشته و دو آنزیم کلیدی برای تعیین عملکرد کبد می باشند در عفونتهایی که آسیب کبدی را با خود به همراه دارند مقدار این آنزیم کاهش می یابد(Shariffi et a.l, 2001).
1-6- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارشی
در اکثر موارد، زمانی که صحبت از میکروارگانیسمها میشود، آنها موجوداتی مضر و زیانبار تصور میشوند. چنین تصوری نمیتواند صحیح باشد، چرا که تعداد باکتریهای غیربیماریزا بمراتب بیش از باکتریهای بیماریزا است و بسیاری از گونههای غیربیماریزای باکتریها نه تنها مفیدند، بلکه برای ادامه حیات ضروری هستند. یک دسته از این باکتریها سودمند، آنهایی هستند که در دستگاه گوارش حیوانات زندگی میکنند. این میکروارگانیسمها تحتتأثیر عوامل مختلفی قرار میگیرند (شکل 1-2).
تنشهای محیطی، نوع جیره غذایی، داروها، سموم شیمیایی و همچنین شرایط آب و هوایی از جمله عواملی هستند که بر رشد میکروفلور روده تأثیرگذارند (فولر، 1380).

شکل 1-2- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش (فولر، 1380)
طی سالهای اخیر با استفاده از مواد افزودنی در خوراک دام و طیور بشدت مورد توجه متخصصین تغذیه و دام واقع شده است، یکی از مهمترین افزودنیها محصولاتی است که به طور زنده مستقیم در جیره به مصرف میرسند و در تجارت به نام پروبیوتیک شناخته شدهاند.
1-7- با کتری های اسید لاکتیک (LAB)
باکتریهای اسید لاکتیک به باکتریهایی اطلاق می شود که قادرند از تخمیر قند تولید اسید لاکتیک کنند . پرو بیو تیکها یا باکتریهای سلامت بخش جزو همین نوع باکتری هستند. استفاده از باکتریهای اسید لاکتیک در تولید فرآورده های غذایی تخمیری به حدود 4000 سال پیش بر می گردد . به طوریکه عملا آنها در تولید فرآورده هایی چون ماست و پنیر بکار می رفته اند. تحقیقات نشان می دهد علاوه بر نقش مهار کننده بر باکتریهای غیر مفید روده ، در متابولیسم لاکتوز، کاهش مصرف آنتی بیوتیک، افزایش جذب عناصر و ویتامینها و افزایش رشد و ایمنی نقش دارند(کاظمی و قدس، 1389)
این باکتری گرم مثبت بوده و برای تغذیه نیاز به کربوهیدرات، اسیدهای آمینه، پپتید، مشتقات اسید نوکلئیک و ویتامینها دارند.درک بهتر از بسیاری از عوامل موثر بر سطح جمعیت اسید لاکتیک باکتری های موجود در دستگاه گوارش برای تجارت آبزی پروری ممکن است جالب باشد. استخراج این باکتری ها از جدار روده نسبت به اندامهای دیگر بهتر است چون در آنجا در اکثر ماهی ها، بیشتر از اندام های دیگر ماهی این باکتری ها (LAB) یافت می شوند. عواملی که بر (LAB) تاثیر گذار است شامل دما، شوری، استرس، نوع تغذیه و استفاده از انواع پروبیوتیک می باشد (Ringo and Gatesoupe, 1998).
1-7-1- رده بندی علمی lactobacillus plantarum
سلسله: Bacteria
تقسیمات Firmicutes :
کلاس: Bacilli
راسته : Lactobacillales lactobacillus plantarum

pro12

2-5- تفاوت پنهان نگاری و رمزنگاری21
2-6- تفاوت پنهان نگاری، واترمارکینگ و رمزنگاری22
2-7- اهداف و ملزومات پنهان نگاری 23
2-8- انواع بازرسی25
2-9- شیوه حملات تحلیل25
2-10- اصطلاحات استگانوگرافی26
2-11- روش های پنهان سازی اطلاعات26
2-12- استگانوگرافی در رسانه های مختلف28
2-12-1- استگانوگرافی در متن29
2-12-2- استگانوگرافی در عکس31
2-12-2-1- فشرده سازی عکس32
2-12-2-2- روش های رمز کردن عکس33
2-12-2-3- درج بیت کمترین ارزش 33
2-12-2-4- پوشش و فیلتر35
2-12-2-5- الگوریتم ها و تبدیلات35
2-12-3- استگانوگرافی در صدا36
2-12-3-1- محیط های صدا37
-12-3-2- ذخیره صدا37
2-12-3-3- وسایل پخش37
2-12-3-4- روش های مخفی کردن اطلاعات در صدا38
2-12-3-5- مخفی کردن اطلاعات در Echo39
2-11- ابزارهای پنهان نگاری و بازیابی40
2-12- استفاده از خط فرمان و ادغام فایل زیپ با گیف41
2-15-کاربردهای استگانوگرافی42
2-13- تبدیل فوریه44
2-14- تبدیل موجک45
2-15- تبدیل موجک گسسته (DWT)45
2-16- تجزیه مقدار منفرد48
2-17- مقدار منفرد چیست؟49
2-18- تعریف تجزیه مقدار منفرد49
2-18- مثالی از SVD51
2-19- خواص SVD در پردازش تصاویر دیجیتال51
2-20- پنهان نگاری دیجیتالی با استفاده از تجزیه مقدار منفرد53
2-20-1- الگوریتمهای مبتنی بر SVD خالص53
2-20-1-1- الگوریتم های مبتنی بر غیر بلوک54
2-20-1-2- الگوریتم های مبتنی بر بلوک55
2-20-2- SVD و الگوریتم های مبتنی بر دامنه تبدیل55
2-20-2-1- الگوریتم مبتنی بر SVD و DCT56
2-20-2-2- الگوریتم مبتنی بر SVD و DWT56
2-20-2-3- الگوریتم مبتنی بر SVD و FHT57
2-20-2-4- الگوریتم مبتنی بر SVD و Zernike57
فصل سوم: روش تحقیق
3-1- پنهان نگاری دیجیتالی59
3-2- پیشینه تحقیق61
3-3- روش های پنهان نگاری مبتنی بر SVD63
3-4- نهان نگاری مبتنی بر SVDچندگانه در حوزه موجک... (زارعی، 2014)63
3-4-1- الگوریتم جاسازی تصویر نهان نگاری63
3-4-2- الگوریتم استخراج تصویر نهان نگاری65
3-5- روش پیشنهادی پنهان نگاری مبتنی بر DWT-SVD67
3-5-1- الگوریتم جاسازی پنهان نگاری68


3-5-2- الگوریتم استخراج پنهان نگاری70

فصل چهارم: محاسبات و یافته های تحقیق
4-1- پیاده سازی الگوریتم72
4-1-1- ابزار مورد استفاده برای آزمایش و پارامترهای اندازه گیری72
4-2- نتایج پیاده سازی74
4-3- مقایسه با سایر روش های پنهان نگاری78
فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات
نتیجه گیری و پیشنهادات74
منابع و مآخذ84
پیوست (الف) کدهای پیاده سازی شده به زبان متلب89
Abstract92
فهرست جداول
جدول 2-1 مقایسه پنهان نگاری، نهان نگاری و رمزنگاری22
جدول 2-2 ارزش های منفرد از دو تصویر52
جدول 4-1 MSE و PSNR با استفاده از روش پنهان نگاری پیشنهاد شده DWT-SVD78
جدول 4-1 MSE و PSNR با استفاده از روش نهان نگاری زارعی (2014)78
فهرست اشکال
شکل 2-1 Johannes Trithemius و نمونه ای از کتابهایش12
شکل 2-2 طبقه بندی انواع واترمارکینگ براساس مدل دی ولیچساور15
شکل 2-3 شکل های پنهان سازی اطلاعات توسط پتیتکولاس26
شکل 2-4 تصویر لنا – تصویر اصلی و تصویر فیلتر شده52
شکل3-1 چارچوب استگانوگرافی سرپرست فعال60
شکل 3-2 استگانوگرافی مدرن61
شکل 3-3 الگوریتم جاسازی نهان نگاری زارعی 64
شکل 3-4 الگوریتم استخراج نهان نگاری زارعی65
شکل 3-5 فلوچارت الگوریتم پرندگان در الگوریتم پیشنهادی66
-21863051652905تصویر رنگی پوشش
00تصویر رنگی پوشش
شکل 3-6 الگوریتم جاسازی به روش DWT-SVD69
-21863051652905تصویر رنگی پوشش
00تصویر رنگی پوشش
شکل 3-7 الگوریتم استخراج به روش DWT-SVD70
شکل 4-1 تصویر پوششی72
شکل 4-2 تصویر مخفی72
شکل 4-3 تصویر پنهان نگاری شده73
شکل 4-4 تصویر مخفی استخراج شده73
شکل 4-5 تصویر پنهان نگاری شده توسط الگوریتم DWT-SVD پیشنهاد شده74
شکل 4-6 تصویر پنهان نگاری شده توسط الگوریتم زارعی74
شکل 4-7 حمله Salt & paper بر روی الگوریتم DWT-SVD پیشنهاد شده75
شکل 4-8 حمله Salt & paper بر روی الگوریتم زارعی75
شکل 4-9 حمله Rotation بر روی الگوریتم DWT-SVD پیشنهاد شده76
شکل 4-10 حمله Rotation بر روی الگوریتم زارعی 76
شکل 4-11 حمله gaussian بر روی الگوریتم DWT-SVD پیشنهاد شده76
شکل 4-12 حمله gaussian بر روی الگوریتم زارعی77
شکل 4-13 حمله Cropping بر روی الگوریتم DWT-SVD پیشنهاد شده77
شکل 4-14 حمله Cropping بر روی الگوریتم زارعی77
فصل اول
2505075465899500مقدمه و کلیات تحقیق
232854567043300023285456179185002505075432943000
1-1- مقدمه
پیشرفت سریع اینترنت و انقلاب اطلاعات دیجیتالی باعث تغییرات مهمی در کل جامعه شده است. داده های مولتی مدیا که در فرمت های دیجیتالی موجودند (تصویر، ویدئو، صدا) زمینه های چالش برانگیزی از نوآوری را باز کرده اند. نرم افزارهای ساده کاربردی و کاهش قیمت وسایل دیجیتالی این امکان را برای همه ی مردم در سراسر جهان فراهم کرده که داده های مولتی مدیا را براحتی ایجاد و ویرایش کنند.
پهنای باند ارتباطات اینترنتی و انتقال تقریباً بدون خطای اطلاعات ایجاد کپی های یکسان از داده ها را آسان کرده است، به عکس فایل های آنالوگ (نوارهای کاست، نوارهایVHS )، فایل های دیجیتالی بر اثر کپی های زیاد کیفیتشان کم نمی شود، در نگاه اول این مزیت فایل های دیجیتالی به نوع آنالوگ آن است ولی اشکال در حفظ حقوق کپی رایت می باشد.[6]
روش های قدیم حقوق کپی رایت برای محافظت از داده های مولتی مدیا دیگر کافی نیست یک مکانیسم ساده ی حفاظت که براساس تعبیه اطلاعات در بیت های سرآمد یک فایل دیجیتالی بود، ناکارآمد شده زیرا این اطلاعات می تواند به آسانی با تغییر در فرمت داده بی اثر شود بدون آنکه هیچ اثری روی کیفیت فایل بگذارد.
رمزگذاری یک فایل مولتی مدیای دیجیتالی از دسترسی داشتن به آن فایل تا زمانی که کلید آشکار سازی مناسب را در اختیار نداشته باشند جلوگیری می کند، بنابراین مؤلف می تواند برای تحویل مولتی مدیا بصورت قابل مشاهده پول دریافت کند و هر مشتری که حق تایپ را پرداخت کرده قادر خواهد بود فایل دریافت شده را بطور مناسب رمزگشایی کرده و استفاده نماید، اما اشکال در این است که وقتی یکبار فایل مولتی مدیا رمز گشایی شد آن فایل می تواند بدون مانع مکرراً کپی شده و توزیع گردد.[6]
پنهان نگاری دیجیتالی یک راه حل دیگر را برای حل این مشکل فراهم می کند. پنهان نگاری معادل فارسی واژه ی استگانوگرافی می باشد که در اصل کلمه ای یونانی بوده و از دو کلمهSteganos به معنای پنهان کردن و Graphy به معنای نوشتن تشکیل شده است.[7,8] اساس پنهان نگاری بر این فرض استوار است که پیام پنهان شده در اسناد یا تصویر توسط شخص سوم قابل تشخیص و یا بازیابی نباشد. پوشش می تواند یک فایل صوتی، صدا، متن و یا ویدئو و ... باشد.
با توجه به اینکه پنهان نگاری در طیف گسترده ای از رسانه های دیجیتالی و با اهداف خاصی طراحی می شوند، لذا با توجه به موارد کاربردی در دسته های مختلفی طبقه بندی می شوند. با وجود تفاوت در اعمال روش های پنهان نگاری دیجیتال، همه روش ها در داشتن امنیت بالا دارای نقطه اشتراک هستند با توجه به دامنه وسیع کاربرد تکنیک های پنهان نگاری آنها را می توان به صورت زیر طبقه بندی نمود:
طبقه بندی با توجه به حوزه کاری (حوزه فرکانس یا حوزه مکان) با توجه به نوع اسناد (متن، صدا و تصویر) و با توجه به ادارک و آگاهی انسانی (سیستم بینایی و یا شنوایی)؛ با توجه به برنامه های کاربردی (مبتنی بر منبع یا مبتنی بر مقصد).[9]
استگانوگرافی دارای روش های گسترده ای برای مخفی کردن اطلاعات در رسانه های مختلف است. در میان این روش ها می توان به جوهرهای نامرئی، امضای دیجیتالی، کانالهای پیچیده و ارتباطات طیف گسترده اشاره کرد. امروزه به خاطر وجود تکنولوژی پیشرفته از استگانوگرافی در متن، تصویر، صدا، سیگنالها و خیلی رسانه های دیگر استفاده می کنند. با این حال استگانوگرافی دارای عیوبی نیز می باشد. به طور مثال، برای فرستادن چند بیت اطلاعات، احتیاج به فرستادن تعداد بسیار زیادی بیت بدون اطلاعات هستیم و تلفات آن زیاد است. یا اینکه به محض لو رفتن الگوریتم یک روش، دیگر از آن روش نمی توان در مخفی کردن اطلاعات استفاده کرد.[2] به صورت کلی در سیستم های اختفاء اطلاعات سه عنصر مقاومت، امنیت، و ظرفیت دخیل هستند. در روش های پنهان نگاری عناصر ظرفیت و امنیت اهمیت اصلی را دارند. تصاویر مهمترین رسانه مورد استفاده به خصوص در اینترنت هستند و درک تصویری انسان از تغییرات در تصاویر محدود است. تصاویر نوعی رسانه پوششی مناسب در پنهان نگاری محسوب می شوند و الگوریتم های پنهان نگاری متعددی برای ساختارهای مختلف تصاویر ارائه شده است.[2] به طور کلی روش های پنهان نگاری در تصویر از الگوریتم جاسازی بیت ها و الگوریتم استخراج تشکیل شده اند. برخی روش های روش های رایج در استگانوگرافی فایلهای تصویری عبارتند از [10] :
جایگزینی بیت کمترین ارزش (LSB)
همبستگی بر پایه آستانه
همبستگی بر پایه مقایسه
روش طیف گسترده
مقایسه ضریب باند متوسط DCT
مقایسه – همبستگی مستقر در باند متوسط DCT
طیف گسترده در دامنه موجک
با توجه به کارهای گذشته ای که در این زمینه انجام شده است، در این تحقیق قصد داریم تا الگوریتم های پنهان نگاری در تصاویر دیجیتالی با استفاده از تجزیه مقدار منفرد را توسعه دهیم. برای این منظور از روش های پنهان نگاری ترکیبی که شامل تجزیه مقدار منفرد و تبدیل موجک گسسته می باشد استفاده خواهیم کرد.
1-2- بیان مساله
متن، تصویر، صوت و ویدئو را می توان به صورت داده های دیجیتال بیان کرد. فراگیری فزاینده و رشد سریع استفاده از اینترنت انسان ها را به سوی جهان دیجیتال و ارتباط از طریق داده های دیجیتال سوق داده است. هر جا سخن از ارتباط به میان آید، مساله امنیت کانال ارتباطی نیز مطرح می گردد. در واقع، در یک کانال ارتباطی، استگانوگرافی یا همان پنهان نگاری روشی از ارسال اطلاعات محرمانه است به نحوی که وجود خود کانال در این ارتباط مخفی بماند. روش استگانوگرافی کامپیوتری، روشی از استگانوگرافی است که امنیت اطلاعات را در رسانه دیجیتال فراهم می سازد و هدف آن درج و ارسال پیام محرمانه از طریق رسانه دیجیتال است بگونه ای که هیچ ظنّی مبنی بر ارسال اطلاعات برانگیخته نشود. پیام محرمانه می تواند به صورت یک تصویر یا متن و یا سیگنال کنترل و خلاصه هر چیزی که بتوان بصورت یک رشته بیتی از صفر و یک بیان شود، باشد. قابل توجه است، امکان دارد، پیام محرمانه قبل از استگانوگرافی تحت مراحل فشرده سازی و یا رمزنگاری نیز قرار گیرد. استگانوگرافی دارای سه پارامتر ظرفیت اطلاعات وارد شونده، کیفیت ادراکی و مقاومت است. بدون شک پیشینه سازی تؤام همه ی این پارامترها امکان پذیر نیست و تنها بسته به کاربرد می باید مصالحه ای بین این پارامترها ایجاد کرد. روش های استگانوگرافی کامپیوتری، اساساً باید به گونه ای باشد که به هیچ وجه تصویر استگانوگرافی قابل کشف از تصویر اصلی نباشد. این چنین روش هایی از استگانوگرافی می توانند برای اهداف مختلفی مورد استفاده قرار گیرند. برای مثال، کاربرد دیگر استگانوگرافی علاوه بر ارتباطات امنیتی، کمک در ایجاد بانک اطلاعاتی است. در این کاربری، وظیفه استگانوگرافی همراه کردن اطلاعات اضافی و مربوطه به تصویر با آن به منظور یکپارچه سازی اطلاعات و تسهیل در ذخیره سازی است. چنین کاربردهایی از استگانوگرافی، وجود اطلاعات در تصویر عموماً معلوم بوده و سیستم بسته فرض می شود و هیچگونه نگرانی از حمله به تصویر از خارج به منظور کشف اطلاعات وجود ندارد. در این موارد، روش های غیر مقاوم مناسب به نظر می رسند. از طرف دیگر در کاربردهای اطلاعاتی، تصویر دیجیتال به عنوان سیگنال حامل بوده و پیام محرمانه می تواند به صورت نامه های بسیار محرمانه نقشه های نظامی و تصاویر مخصوصی باشد در این کاربردها تاکید اصلی بر این است که ناظر سوم به هیچ وجه متوجه وجود اطلاعات در تصویر نشده و نتواند تداخلی در کانال ارتباطی ایجاد کند یا موفق به کشف پیام شود. در این کاربردها، می توان از شکل های مقاوم یا از روش های غیر مقاوم استفاده کرد.
1-3- ضرورت و اهمیت تحقیق
به دلیل رشد وسیع ارتباطات دیجیتال و سهولت در رد و بدل نمودن اطلاعات پرونده ها از طریق شبکه های کامپیوتری نظیر اینترنت و همچنین حجم بسیار زیاد اطلاعات رد و بدل شده، پنهان نگاری کاربرد مناسبی پیدا کرده است و استفاده از آن روز به روز بیشتر می شود. از طرفی برای جلوگیری اطلاع از ارتباطات باندهای تروریستی یا افراد بزهکار و یا خروج اطلاعات محرمانه از شرکت ها یا سازمان ها به منظور ارزیابی امنیتی سیستم های پنهان نگاری که توسط نیروهای نظامی یا امنیتی استفاده می شوند، به تحلیل پنهان نگاری نیاز است. هر چقدر پهنای باند اینترنت برای انتقال پرونده های بزرگ نظیر پرونده های ویدئویی، بیشتر می شود، انتقال اطلاعات غیر عادی و مشکوک نیز ساده تر شده و غیر قابل آشکارتر می شود. در طی سالهای اخیر تلاش هایی برای طراحی الگوریتم های تحلیل انجام شده است. اکثر پژوهشگران با توجه به راه حل های پیشنهادی خود بر این باورند که سایر الگوریتم های پنهان نگاری دارای ضعف هستند و اختلاف آرا در این زمینه وجود دارد. لذا مقایسه و بررسی الگوریتم های پیشنهادی با سایر روش ها برای تحقیق در نظر گرفته شده است.

1-4- اهداف تحقیق
به طور کلی اهداف تحلیل پنهان نگاری و یا حالت هایی که تحلیل انجام می گیرد شامل اثبات وجود یا عدم وجود پیغام پنهانی، تخریب پیغام، استخراج پیغام، تغییر پیغام، استخراج کلید عمومی و کلید رمز، یافتن الگوریتم پنهان نگاری می باشد. در میان روش های ابتکاری توسعه یافته برای حل این مشکل، تکنیک پنهان نگاری تصاویر دیجیتال مبتنی بر تجزیه مقدار منفرد یکی از پرکاربردترین روش ها است. روش های مشابه دارای معایبی از جمله برگشت پذیر بودن و تشخیص مثبت- کاذب و ناتوان بودن در برابر برخی حملات از جمله اعوجاج هندسی و ... است. یکی از راه های مقابله با دستکاری غیر مجاز در تصاویر دیجیتالی استفاده از تکنیک پنهان نگاری مبتنی بر تجزیه مقدار منفرد می باشد. هدف اصلی این تحقیق، بهبود الگوریتم پنهان نگاری در تصاویر دیجیتال با استفاده از تجزیه مقدار منفرد می باشد. روش پیشنهادی از ترکیب تجزیه مقدار منفرد بهمراه تبدیل موجک گسسته بهره می برد و هدف آن امنیت تصاویر دیجیتالی است که در مقایسه با دیگر روش ها کارایی بیشتری داشته باشد. همچنین بدلیل ایجاد تخریب هایی که توسط کاربران غیر مجاز بر روی تصاویر پنهان نگاری شده انجام می گیرد و گاهاً باعث لو رفتن اطلاعات پنهان نگاری با تخریب داده های اصلی می شوند. لذا از اهداف دیگر الگوریتم پیشنهادی افزایش توانمندی الگوریتم در برابر حملات تخریب کننده و برطرف کردن مشکل نرخ هشدار – کاذب است.
1-5- سوالات تحقیق
استفاده از الگوریتم های پنهان نگاری در تصاویر دیجیتالی باعث می شود تا از اطلاعات محرمانه حفاظت شود و آن را در برابر استفاده غیر مجاز کاربران مصون بدارد. با توجه به عملکرد این نوع الگوریتم های پنهان نگاری سوالات در این زمینه مطرح می کنیم و در این طرح به آن ها می پردازیم:
چگونه می توان الگوریتم های پنهان نگاری در تصاویر دیجیتال را با استفاده از روش تجزیه مقدار منفرد بهبود بخشید؟
چطور می توان الگوریتم پنهان نگاری مبتنی بر تجزیه مقدار منفرد و تبدیل موجک گسسته در تصاویر دیجیتال را در برابر حملات تخریب کننده معمول از قبیل چرخش، تغییر اندازه، برداشت و ایجاد نویز توانمند و مقاوم کرد؟

1-6- فرضیه های تحقیق
الگوریتم پنهان نگاری پیشنهاد شده، روش پنهان نگاری مبتنی بر تجزیه مقادیر منفرد را توسعه داده است. این روش یک الگوریتم ترکیبی است که از تجزیه مقدار منفرد و تبدیل موجک گسسته بهره می برد.
بمنظور حفاظت از افشای اطلاعات محرمانه، الگوریتمی ارائه شده که در برابر رایج ترین حملات و به طور خاص، در برابر حملات اعوجاج هندسی توانمند و ایمن می باشد.
این الگوریتم از روش اعداد تصادفی در تصویر پنهان نگاری، از یک تصویر با متن معنی دار استفاده می کند. بنابراین کیفیت تصویر پنهان نگاری استخراج شده عملکرد الگوریتم را تضمین می کند.
در روش پیشنهادی در استخراج تصویر پنهان نگاری کور می باشد به این صورت که حمله کننده از نوع الگوریتم به کاررفته در فرایند استگانوگرافی اطلاعی ندارد.
1-7- کلمات کلیدی
1-7-1- استگانوگرافی
استگانوگرافی یا پنهان نگاری دانشی است برای پنهان کردن داده یا فایلی در فایل دیگر، بطوری که فقط افراد آگاه با ابزار لازم بتوانند به آن دست یابند. استفاده از این روش در مواردی بسیار عالی و کاربردی است. برخلاف رمزگذاری که فایل حفاظت شده را کاملاً حساس جلوه می‌دهد و جلب توجه می کند، این روش از ناآگاهی افراد، برای جلوگیری از دستیابی آن‌ها به اطلاعات خاص بهره می برد. پنهان نگاری خود شاخه ای از دانشی به نام ارتباطات پوشیده است. دانش ارتباطات پوشیده خود شامل چندین شاخه از جمله رمز نگاری، ته نقش نگاری و ... می باشد.
1-7-2- حوزه تبدیل
تکنیک های پنهان نگاری می توانند به دو دسته تقسیم بندی شدند: تکنیک های دامنه فضایی (مکان) و تکنیک های دامنه تبدیل (فرکانس). در شکل های دامنه فضایی برای گنجاندن شی دیجیتال مورد نظر مقادیر پیکسل ها بطور مستقیم دستکاری می شود. این روش پیچیدگی کمتری دارند، شکننده ترند و قوی نیستند، اما در شکل های حوزه تبدیل (فرکانس) ابتدا تصاویر به یکی از حوزه های فرکانسی انتقال یافته و سپس پنهان نگاری با دستکاری مقادیر در حوزه فرکانس انجام می گیرد و در نهایت تصویر به حوزه مکان بازگردانده می شود. در مقایسه با تکنیک های دامنه فضایی ثابت شده است که تکنیک های حوزه تبدیلی در دست یافتن به الگوریتم پنهان نگاری دیجیتال از لحاظ غیر قابل مشاهده بودن و نیازمندی های استحکام بهتر می باشد. انتقال های حوزه تبدیل که عموماً در الگوریتم های پنهان نگاری تصاویر دیجیتال مورد استفاده قرار می گیرد شامل انتقال های زیر است: دامنه تبدیل کسینوسی گسسته (DCT)، دامنه تبدیل فوریه گسسته (DFT)، دامنه تبدیل موجک (DWT)، دامنه تبدیل سریع هادامارد (FHT) و تجزیه مقدارمنفرد (SVD) و ... می باشد.
1-7-3- تجزیه مقدار منفرد
روش های متعدد پنهان نگاری در حوزه تبدیل وجود دارند. تجزیه مقدار منفرد یا تجزیه مقدارهای تکین (SVD) یکی ازاین موارد است. این روش توسط بلترامی در سال 1873 و جردن در سال 1874 مستقلاً ابداًع شد و بعدها در سال 1930 یانگ آن را برای ماتریس های مستطیل شکل گسترش داد. تا سال 1960 به دلیل نیاز به تکنیک های پیچیده عددی، از SVD به عنوان یک ابزار محاسباتی استفاده نمی شد. ژنه کلوب آن را به عنوان یک ابزار سودمند در موارد گوناگون معرفی کرد.[11] SVD یکی از مفیدترین ابزارهای جبر خطی برای کاربردهای مختلف مانند فشرده سازی تصویر و سایر زمینه های پردازش تصویر و سیگنال می باشد. بطور کلی طرح های پنهان نگاری مبتنی بر تجزیه مقدار منفرد با توجه به سادگی در پیاده سازی و برخی ویژگی های جذاب ریاضی، محبوبیت زیادی را به دست آورده اند.
1-7-4- تبدیل موجک گسسته
تبدیل موجک گسسته (DWT) یک ابزار ریاضی مناسب برای نمایش و پردازش تصویر دیجیتالی است. این تبدیل در حوزه فرکانس صورت می گیرد اصولاً تبدیلاتی که در حوزه فرکانس انجام می شوند پیچیدگی بیشتری دارند و در برابر تخریب ها و حملات مقاوم تر عمل می کنند.

1-8- نوآوری تحقیق
با توجه به تلاش هایی که در زمینه پنهان نگاری تصاویر دیجیتالی صورت گرفته، نوآوری تحقیق پیشرو ارائه روش پیشنهادی پنهان نگاری تصاویر دیجیتال با استفاده از روش ترکیبی تجزیه مقدار منفرد و تبدیل موجک گسسته 1- سطحی می باشد که همانطور که در نتایج این تحقیق نشان داده شده است در امنیت و حفظ تصویر مخفی موثر واقع شده است.
1-9- ساختار پژوهشدر این پایان نامه در فصل اول مقدمه و کلیات تحقیق ارائه شده است، در ادامه بحث فصل دوم ادبیات و پیشینه تحقیق، مفاهیم کلی پنهان نگاری دیجیتالی، تجزیه مقدار منفرد و تبدیل موجک گسسته ارائه می شود و در فصل سوم روش تحقیق شرح داده شده می شود، در فصل چهارم محاسبات و یافته های تحقیق روش پیشنهادی ارائه می گردد و سرانجام فصل پنجم نتیجه گیری و پیشنهادات بیان شده است.

فصل دوم
ادبیات و پیشینه تحقیق
226568040170100023679156535420002480945585343000255714562236350022656804645025002-1- تاریخچه
پنهان کردن اطلاعات تاریخچه ی کهنی دارد. جوهرهای نامرئی، کدهای رمزی، پیغام های مخفی و به طور کلی استگانوگرافی همواره مورد توجه بشر بوده است. [12]اولین استفاده از تکنیک های پنهان نگاری توسط هرودوت که یک مورخ یونانی است در کتابش «تاریخها» شرح داده شده است. [13]داستان آن به حوالی سالهای 440 قبل از میلاد برمی گردد، وقتی که حاکم یونان به دست داریوش در شوش زندانی شده بود ولی بایست پیامی را بصورت محرمانه برای برادر خوانده اش در میلتیوس ارسال کند. به همین منظور موی سر غلامش را تراشید و پیام خود را روی سرش خال کوبی نمود و وقتی موهای غلام به اندازه کافی رشد نمود او را عازم مقصد نمود و جالب است که در اوایل قرن بیستم نیز از همین روش جاسوسان آلمانی استفاده نمودند. داستان دیگر نیز مربوط به زمانه همین پادشاه است. دمراتوس، یک یونانی در دربار ایران بود و یک پیام مخفی را برای اسپارتا ارسال کرد تا او را از حمله کوروش آگاه سازد. او ابتدا موم روی لوح را برداشت و پیام را روی چوب زیر موم نوشت سپس پیام را با موم دوباره مخفی کرد. به گونه ای که لوح دوباره بصورت یک لوح مفید که هنوز هیچ پیامی روی آن نوشته نشده بود درآمد. به همین ترتیب روش های دیگری توسط آلفیس استفاده شد. روش های مخفی سازی پیام در پاشنه کفش پیکهای خبررسان، گوشواره های زنان و نوشتن متن داخل لوح های چوبی که توسط گچ سفید پوشانده می شدند از این جمله بودند. همچنین او در روش دیگری پیشنهاد کرد که می توان جهت مخفی سازی یک پیام سوراخهایی در بالا و پایین حروف ایجاد و یا ارتفاع حروف مورد نظر را در یک متن که ما آن را متن پوششی می نامیم تغییر داد. سوراخ های ایجاد شده روی حروف و یا زیر آن به علت تضاد رنگ سیاه حروف و سفید کاغذ اصولاً محو می شدند و قابل دیدن نمی باشند. این روش تا قرن 17 میلادی نیز استفاده می شد. اما در سالهای بعدی توسط وایلکنس توسعه یافت. او از نقاط بسیار کوچک که با جوهرهای قابل رؤیت ایجاد می کرد بجای سوراخ کردن کاغذ استفاده می نمود. جوهرهای نامریی نیز یکی از عمومی ترین ابزارها برای پنهان نگاری هستند و در روم باستان حتی در جنگ جهانی دوم مورد استفاده قرار می گرفتند. یکی از پیشگامان پنهان نگاری تریتمیوس روحانی آلمانی بود و کتابی پیرامون پنهان نگاری با عنوان «Steganographia» نوشت که در زمان وی منتشر نشد.[8] اولین کتاب واقعی در این زمینه را اسکات در سال 1665 در 400 صفحه با نام Schola Steganographica نوشت. [14] او در این کتاب به چگونگی مخفی کردن پیام در لابلای نتهای موسیقی اشاره کرده است.

شکل 2-1 Johannes Trithemius و نمونه ای از کتابهایش [14]
در قرن 15 و 16، پنهان نگاری توسعه زیادی پیدا نمود. در سال 1875 بروستر پیشنهاد کرد که می توان پیام های محرمانه را در فواصل خالی در حدود یک نقطه پنهان نمود.
در اوایل قرن بیستم و در طی جنگ بور در آفریقای جنوبی یک پیشاهنگ انگلیسی نقشه هایش را روی نقاشیهایی از بالهای پروانه مخفی می کرد و برای فرمانده اش می فرستاد. در جنگ بین روسیه و ژاپن در سال 1905، تصاویر میکروسکوپی در گوش، سوراخ های بینی و یا زیر ناخن انگشتان جاسازی می شد. در جنگ جهانی اول پیامهایی که بین جاسوسان رد و بدل می گشت محدود به یک سری نقاط بسیار ریز بود که در چندین مرحله کوچک شده بودند و در بالای نقطه ها و یا علامت های کاما که در یک جمله استفاده می گشتند قرار می گرفتند و بگونه ای که هیچ توجهی را جلب کنند.
در جنگ جهانی دوم نیز توجه زیادی به پنهان نگاری شد و تجربیات زیادی در این زمینه کسب شد. در ابتدای جنگ از جوهرهای نامریی استفاده می شد ولی بعداً از حروف و پیام های معمولی برای مخفی کردن پیام اصلی استفاده کردند.
اولین روش های پنهان نگاری دیجیتال در دهه ی 80 مطرح شدند و روش های جدیدتر همه مربوط به یک دهه ی اخیر هستند. با ارائه هر الگوریتم، روشی نیز بر ضد آن طراحی می شود و روش های قدیمی جای خود را به روش های جدیدتر می دهند. البته دولت آمریکا تا سال 1999 از ترس استفاده ی تروریستی و جاسوسی کشورهای دیگر، استفاده تجاری از پنهان نگاری را ممنوع کرده بود ولی با فشار شرکتها و محققان آمریکایی و طی یک دادخواهی چهار ساله اجازه ی استفاده مشروط از این فناوری در کاربردهای عمومی را صادر کرد. [12,15,16]
2-2- معرفی
همزمان با پیشرفت تکنولوژی و رشد روز افزون اینترنت ، امکان استفاده غیر مجاز از اطلاعات افزایش یافته است، لذا نیاز مبرم به روش های جدید به منظور حفظ حریم اشخاص و شرکت ها در این حوزه احساس می شود. رمزنگاری و استگانوگرافی علومی هستند که به بشر در زمینه امنیت اطلاعات کمک می نمایند. در حوزه رمز نگاری، ابتدا داده به صورتی که برای مهاجم نامفهوم باشد، تغییر شکل می یابد و سپس ارسال می شود. تغییر شکل به گونه ای است که امکان دستیابی مهاجم به اطلاعات بدون داشتن کلید رمز غیرممکن خواهد بود. اما در حوزه نهان نگاری، ابتدا داده درون یک سیگنال پوشاننده برای ایجاد «سیگنال نهان نگاری شده» مخفی می شود سپس این سیگنال، ذخیره یا مخابره خواهد شد. بنابراین وجود داده و حتی انتقال آن مخفی خواهد ماند.
مبنای انواع کریپتوگرافی و استگانوگرافی به این دلیل است که ارتباطات الکترونیکی در رسانه های ناامنی نظیر ایمیل و صفحات وب انجام می شود. در واقع، بیشتر دولتها مقرراتی دارند که به آنها اجازه می دهد هر نوع ارتباطات در اینترنت و شبکه های تلفنی سوییچ عمومی را کنترل نمایند. این موضوع شامل کنترل ایمیل ها، صفحات وب، تلفن های عمومی و سایر شکل های ارتباط الکترونیکی می باشد.[17] آژانس های امنیتی دولتها از سخت افزارها و نرم افزارهای ویژه برای دریافت سیگنالهای الکترونیکی در مخابرات ماهواره های بین المللی استفاده می کنند. سپس کامپیوترها اطلاعات مشکوک در ارتباط تلفنی را براساس کلید واژه هایی نظیر «بمب» با تطبیق یک الگوی ویژه صوتی فیلتر می کنند.[18]
برنامه های استگانوگرافی گسترده ای بصورت آماده در اینترنت قابل دسترسی هستند که به تروریستها یا افراد سودجو کمک می کند تا اطلاعات با ارزش خود را از طریق اینترنت پخش کنند بدون اینکه آژانس های امنیتی دولت ها متوجه شوند. در حال حاضر برخی از گروههای امنیتی مشغول توسعه روش هایی برای تشخیص اطلاعات استگانوگرافی شده هستند. با توجه به وجود هزاران روش و برنامه قابل دسترس استگانوگرافی، تقریباً غیر ممکن است که هر تجزیه و تحلیل روی ارتباطات نتیجه دهد و اطلاعات استگانوگرافی شناسایی شوند.[19]
در ادامه به طور کامل به معرفی کامل شکل های مختلف حفاظت از محتوای رسانه دیجیتالی خواهیم پرداخت.
2-2-1- پنهان نگاری
بسیاری از شما نوشتن با آبلیمو و آب پیاز را در کودکی تجربه کرده‌اید و شاید هم برای دوستان تان این تردستی را اجرا کرده باشید که با گرم کردن کاغذ نوشته‌ها نمایان می شدند. از قلم‌های بی‌رنگ که استفاده کرده اید؟ قلم‌هایی که جوهر نامرئی دارند. نوشته‌های این قلم‌ها تنها با استفاده از نورهای مخصوص نمایش داده می‌شوند. برای نوشتن عبارات مخفی و سرّی بر روی کاغذ می‌توان از این روش استفاده کرد. تنها کسانی می‌توانند نوشته‌ی روی آن را بخوانند که از شیوه کار آگاه بوده و چراغ مخصوص اش را داشته باشند.
پنهان نگاری معادل فارسی واژه ی استگانوگرافی می باشد که در اصل کلمه ای یونانی بوده و از دو کلمه Steganos به معنای پنهان کردن و Graphy به معنای نوشتن تشکیل شده است. ترجمه کلمه به کلمه این لغت «نوشتار پوششی» می باشد که البته برداشت این معنی از استگانوگرافی چندان متداول نیست و بیشتر به مفهوم پنهان سازی اطلاعات در یک رسانه به عنوان پوشش بکار می رود به گونه ای که توسط اشخاص غیر مجاز قابل تشخیص نباشد.
مفاهیم مخفی سازی اطلاعات، جاسازی داده ها و واترمارکینگ دیجیتال اغلب در یک واژه کلی تحت عنوان واترمارکینگ مورد استفاده قرار می گیرند که البته این موضوع در کاربردهای تجاری بیشتر صدق می کند و لیکن در مقالات و کتب تخصصی پیرامون این موضوع، نویسندگان از عناوین مختلف استفاده می نمایند. به عنوان نمونه دی ولیسچاور بنا به استفاده تخصصی در هر موضوع، استگانوگرافی را در دسته های مختلف مطابق شکل (2-2) تقسیم نمود [20] و یا نیکولیدیس معیار دیگری برای تقسیم بندی این موضوع مطرح کرد.[21]

شکل 2-2 طبقه بندی انواع واترمارکینگ براساس مدل دی ولیچساور [20]
یک اصل اساسی در انواع روش های پنهان نگاری این است که پیام پنهان شده در اسناد یا تصویر توسط شخص سوم قابل تشخیص و یا بازیابی نباشد. به عنوان مثال، پیام پنهان شده می تواند شامل یک شماره سریال یا یک دنباله ارقام تصادفی یا داده های کپی رایت و یا مشخصات پدیدآورنده اثر باشد. بنابراین در جهان امروز استگانوگرافی را به صورت نوعی رمزنگاری الکترونیک می توان تعریف کرد که در آن اطلاعات در یک فایل که آن را پوشش می نامند، به گونه ای مخفی شود که تنها توسط گیرنده ی مجاز (فردی که الگوریتم و رمز به کار گرفته شده را می داند) قابل بازیابی باشد. پوشش می تواند یک فایل تصویری، صدا، متن و یا ویدئو و ... باشد. به فایل نهایی اصطلاحاً «استگانوگرام » می گویند.
با نگاهی به تاریخ در می یابیم که روش های مختلف پنهان سازی اطلاعات از یک سابقه هزار ساله برخوردار است. [7,8,22] اما تنها در سالهای اخیر روش های جدید پنهان نگاری پیشرفت چشمگیری داشته است. هر روز میلیون ها فایل در اینترنت بین افراد جابه جا می شود وگستردگی و ارزان قیمت بودن این شبکه، این امکان را فراهم آورده است که به صورت کانالی ارزان و سهل الوصول برای مبادله ی پیغام های سری مورد استفاده قرار گیرد، که در این زمینه جالب است بدانیم اعضای القاعده برای تبادل پیام های خود قبل از 11 سپتامبر از تصاویر و متن های استگانوگرام استفاده کرده بودند. روش های متعددی برای پنهان نگاری مطرح شده است که اکثر آنها مربوط به همین چند سال اخیر می باشند. هر روش مزایا، معایب و کاربردهای خاص خود را دارد.
به دلیل احتمال استفاده ی غیر قانونی از این تکنولوژی، روش های تشخیص و بیرون کشیدن اطلاعات پنهان شده نیز اهمیت فوق العاده ای دارند. جنگ دیرینه ی بین روش های مختلف پنهان کردن و تشخیص اطلاعات همچنان ادامه دارد و هر دو در ابتدای راه پیشرفت خود هستند.
2-2-2- واترمارکینگ یا نقشاب داده ها
واتر + مارکینگ به معنی نشانه گذاری یا نقش بر آب می باشد که از ترکیب دو واژه به معنی نشانه گذاشتن و آب می باشد. اگر توجه کرده باشید اگر یک چوبی را در دست خود بگیرید و بر روی آب نقشی حک کنید می بینید بعد از مدتی محو می شود ولی این نوشته وجود داشته است. بیشترین کاربرد واترمارکینگ در حک کردن اسم ها و امضاها بر روی عکس ها می باشد به طوری که مشخص نخواهد بود. این امر باعث می شود تا دیگر عکسی تقلب در آن صورت نگیرد و می توانید ادعا کنید که این عکس برای شماست. کسی این نوشته را نمی بیند ولی شما می توانید با یک الگوریتمی آن را استخراج کنید این نرم افزار همین کار را بر روی عکس انجام می دهد و نوشته هایی را به صورت هاید بر روی عکس می نویسد. پنهان‌نگاری هنر و علم جاسازی اطلاعات در یک رسانه حامل است که با توجه به پیشرفت قابل توجه ارتباطات دیجیتال استفاده از آن رو به افزایش می‌باشد. در پنهان‌نگاری هدف اصلی، امنیت به معنای عدم توانایی در اثبات وجود پیغام است در حالیکه در واترمارکینگ با توجه به کاربردهای مختلف، بیشتر مقاومت در مورد تغییرات اهمیت دارد. هر یک از حوزه‌های پنهان‌نگاری و واترمارکینگ کاربردهای متنوع و خاص خود را دارند. امروزه واترمارکینگ قابل مشاهده و پنهان در شاخه‌های مختلف کاربردی شده و یک نیاز جدی به حساب می‌آید. نرم‌افزار نهان‌ساز با هدف واترمارکینگ و پنهان‌نگاری در تصویر، طراحی و پیاده‌سازی شده است و از الگوریتم‌های متنوع با هدف دستیابی به امنیت، مقاومت و ظرفیت‌های مورد نظر بهره گرفته شده تا کاربردهای مختلفی از واترمارکینگ و پنهان‌نگاری پوشش داده شود. واترمارکینگ (فیزیکی) که در زبان فارسی به چاپ سفید ترجمه شده‌است، طرحی است که علاوه بر طرح زمینه، به صورتی غیر محسوس بر روی اسناد کاغذی چاپ می‌شود و با کمک رنگ روشن‌تر و یا از راه در معرض نور قرار گرفتن قابل رؤیت می‌باشد. واترمارکینگ دیجیتال رابطه نزدیکی با پنهان نگاری و پنهان‌سازی داده دارد. ولی با این حال، بسته به کاربردهایی که دارد، تفاوت‌هایی نیز مشاهده می‌شود. لذا در عین حال که می‌توان از مفاهیم مشابه در پنهان نگاری برای ارزیابی الگوریتم‌های واترمارکینگ بهره گرفت، نباید از تفاوت‌هایی که در عمل بین آن‌ها وجود دارد، غافل بود.
2-2-3-پوشیده نگاری
متشکل از دو آلمه یونانی stego به معنی مخفی و graphos به معنای نوشته که روی هم معنی نوشته مخفی را تداعی می کنند. در رمز نگاری دسترسی به محتوای پیام برای فرد غیر مجاز ناممکن می گردد لیکن در پوشیده نگاری موجودیت پیام انکار می شود. هدف رمزنگاری حفظ محرمانگی و تمامیت پیام است که با رمز کردن آن حاصل می شود. پوشیده نگاری هم همین اهداف را با پنهان نمودن پیام دنبال می کند بعلاوه در پوشیده نگاری انتخاب جا و ترتیب پنهان نمودن پیام نیز با بهره گیری از نوعی رمز در چینش بیت های پیام لابه لای بیت های میزبان صورت می پذیرد .همچنین می توان پیام را قبل از جا سازی داخل میزبان با استفاده از الگوریتم های رمز نگاری به صورت رمز در آورد و سپس عمل پنهان سازی را انجام داد.
بطوریکه می توان گفت با استفاده از پوشیده نگاری در حقیقت سه لایه حفاظتی بسیار محکم در دسترسی به پیام ایجاد خواهد شد: اول اینکه وجود ارتباط نامحسوس است و این هدف اصلی در پوشیده نگاری است و بنابراین گذشتن از اولین مانع کار چندان ساده ای نخواهد بود در صورتیکه وجود اطلاعات در یک میزبان مورد سوءظن واقع شود مرحله دوم پیدا کردن الگوریتم پنهان سازی است طوریکه باید جا و ترتیب پنهان شدن اطلاعات معلوم شود لیکن در این مرحله نیز چون از یک کلید بنام کلید استگ برای جاسازی پیام استفاده شده دانستن این کلید ضروری است و بنابراین گذشتن از این مرحله نیز با دشواری همراه خواهد بود و چنانچه دو مرحله قبلی با موفقیت پشت سر گذاشته شوند اکنون به متن رمزی دسترسی پیدا شده است که تازه در این مرحله مسائل مربوط به رمزنگاری مطرح می گردند .
در دنیای واقعی کنونی نیز استفاده از رمزنگاری قوی در ارتباطات شخصی توسط دولت ها محدود شده است. علت این محدودیت سوء استفاده از این علم برای انجام فعالیت های جنایی و تروریستی و سایر امور مرتبط با این موضوعات می باشد و به شدت توسط ارگانهای مربوطه کنترل می گردد و در صورت انجام تخلّف از فرستنده و گیرنده پیام رمزی توضیح خواسته می شود.
2-2-4- پنهان شکنی
در حالی که هدف استگانوگرافی مخفی کردن اطلاعات و جلوگیری از پیدا شدن و جلب توجه آنهاست، پنهان شکنی علمی است که برای پیدا کردن چنین مطالب مخفی شده ای به کار می رود. پنهان شکنی سعی می کند تا اطلاعات پنهان شده را پیدا کند اما اغلب متون مخفی که با استفاده از نرم افزارهای استگانوگرافی مخفی شده اند علامت خاصی از خود نشان نمی دهند یعنی مثلا اگر به شما چندین عکس داده شود تا یک متن مخفی را از درون آنها پیدا کنید بایستی ابتدا تشخیص دهید که کدام عکس شامل این متن مخفی است چرا که هیچ علامت خاصی وجود ندارد تا شما آن را تشخیص دهید حتی اگر عکس اولیه و اصلی نیز وجود داشته باشد براحتی قابل تشخیص نیست چرا که نه از لحاظ ظاهری و نه از لحاظ حجم این دو عکس تفاوت چندانی با یکدیگر ندارند. نسل های مختلفی از نرم افزار های استگانوگرافی وجود دارد که پنهان شکنی یکی از انواع آن است. به طور کلی شکل های پنهان نگاری در صورتی امن هستند که تصویر پوششی یا گنجانه دارای نشانه‌های قابل کشف نباشد. به بیان دیگر، خواص آماری تصویر پوششی یا گنجانه باید همانند خواص آماری پوشانده باشد. توانایی کشف پیام در تصویر به طول پیام پنهان بستگی دارد. واضح است که هرچه مقدار اطلاعاتی که در یک تصویر قرار می‌دهیم کمتر باشد امکان کمتری هست که نشانه‌های قابل کشف به وجود آید. انتخاب فرمت تصویر نیز تأثیر زیادی بر سیستم پنهان نگاری دارد. فرمت‌های فشرده نشده‌ای مثل BMP، فضای زیادی برای پنهان نگاری فراهم می‌کنند ولی استفاده از آنها به دلیل حجم اطلاعات زائد بالای آنها شک برانگیز است.
پیدا کردن پیغام ها که بسیار مفید تر از نابودی آن است می تواند به دو دسته کلی تقسیم شود، عکس ها و متن ها. البته دسته های دیگری مانند بررسی های بلا درنگ بر روی ISDN و TCP/IP می تواند باشد که برای آنها به علت حجم بسیار بالای اطلاعات منتقل شده باید از الگوریتم های پیچیده استفاده کرد. همچنین در مورد پیدا کردن پیغام در متن، یک text باید از جنبه هایی مثل: گرامر، تعداد لغات تکرار شده، تعداد حرف های تکرار شده، محتوای متن و معنای آن. با وجود روش های بسیار زیاد انتقال متن مانند فکس، پست الکترونیکی، چاپ های با کیفیت بالا حتی با چاپگر های خانگی، تلگراف، پیدا کردن یک پیغام مخفی شده در حجم عظیمی از متن ها که جابجا می شوند کار بسیار دشوار و تقریباً غیر ممکن است.
2-2-5- تشخیص استگانوگرافی
هنر تشخیص استگانوگرافی، به عنوان آنالیزاستگ یاد می شود، که برای تشخیص استگانوگرافی موجود در یک فایل استفاده می شود .
روش های زیادی برای تشخیص استگانوگرافی وجود دارند:
1- مشاهده آن فایل و مقایسه آن با دیگر کپی آن فایل از طریق پیداکردن آن در اینترنت: معمولاً کپی های چندگانه ای از تصاویر در اینترنت وجود دارند، به طوری که شما می توانید چند تا از آنها را جهت مقایسه با فایل مشکوک به کار گیرید .
به عنوان مثال اگر شما یک فایل JPEG را دانلود کردید و فایل مشکوک هم JPEG بود و دو فایل، از واقعیت فاصله داشتند ، یکی از دیگری بزرگتر است. احتمال اینکه فایل مشکوک شما اطلاعات مخفی در درون خود داشته باشد زیاد است.
2- گوش کردن به یک فایل: این روش مانند روش بالا است و سعی در تشخیص استگانوگرافی در فایل تصویر دارد. اگر شما سعی در تشخیص استگانوگرافی در یک فایل صوتی دارید ، شما نیازمند این هستید که فایل یکسانی را برای مقایسه پیدا کنید که از همان فرمت صوتی استفاده می کند.
2-2-6- علامت حق تکثیر
در حقیقت علامت های حق تکثیر جنبه تجاری استفاده از پنهان سازی اطلاعات هستند که برای جلوگیری از استفاده های غیرمجاز تولیدات الکترونیکی اطلاعات به صورت نامحسوس و غیرقابل تفکیک از محصول داخل آن جاسازی می شود که در مواقع لزوم برای پیگیری استفاده غیر مجاز و اثبات حق مالکیت از طریق قانون می تواند به مالک واقعی محصول کمک کند . علامت حق تکثیر را می توان به دو دسته تقسیم کرد:
الف) واترمارکینگ: علامت واترمارکینگ اطلاعاتی هستند که داخل محصول الکترونیکی جاسازی می شوند و یا به بیان بهتر ترکیب می شوند طوری که از مقاومت بسیار بالایی برخوردار می باشند و معمولاً این اطلاعات شامل آرم یا علامت مخصوص شرکت یا مالک است که به آن لوگو گفته می شود. فرقی که پوشیده نگاری با واترمارکینگ دارد این است که در پوشیده نگاری آنچه مهم است پیامی است که داخل میزبان پنهان شده است و میزبان در حقیقت سدی است برای محافظت از پیام، لیکن در واترمارکینگ آنچه که مهم است میزبان است و پیام برای محافظت از میزبان داخل آن جاسازی شده است. یکی از خصوصیات ضروری واترمارکینگ داشتن مقاومت بسیار بالا است به طوری که به هیچ وجه قابل تفکیک از میزبان نباشد و از بین بردن آن منجر به از بین رفتن میزبان شود.
ب) فینگرپرینتینگ: فینگرپرینتینگ اطلاعاتی است که برای محافظت در مقابل استفاده غیر مجاز از محصولات نرم افزاری داخل آن پنهان می شود طوری که استفاده کننده مجاز با وارد کردن آنها به صورت عدد شناسایی قادر به استفاده از آن خواهد بود. همچنین این عدد شناسایی برای پیگیری کپی های غیر مجاز از نرم افزار نیز می تواند مورد استفاده قرار گیرد.
2-3- معایب استگانوگرافی
استگانوگرافی به اعتقاد بسیاری از نویسندگان و متخصصان علوم کامپیوتر، استگانوگرافی کاربردهای بد و غیرقانونی نیز وجود دارد. براساس آمار وب سایت www.techsec.com بیش از 300 نوع برنامه استگانوگرافی در اینترنت وجود دارند که به صورت رایگان و بی نام قابل دانلود شدن هستند. بدین ترتیب هر کس که تنها اطلاعات کمی در مورد کامپیوتر داشته باشد می تواند یکی از این برنامه ها را دانلود کرده و از آنها برای فرستادن پیام های مخفی استفاده کند. حال این فرد می تواند یک فرد عضو یک گروه جنایتکار و تبهکار باشد. و یا یکی دیگر ازاستفاده های بد استگانوگرافی را می توان هرزه نگاری برخی افراد و پنهان کردن آنها در داخل عکس های معمولی و قرار دادن آن عکس ها در داخل وب سایت ها برشمرد که در این صورت حتی ما از وجود آنها در بین فایل هایمان نیز بی اطلاع خواهیم بود.
2-4- تفاوت بین واترمارکینگ و فینگرپرینتینگ
واترمارکینگ و فینگرپرینتینگ کمی با یکدیگر تفاوت دارند، وقتی نشانه تجاری یا مشخصه ای در یک اثر مانند عکس، ویدئو یا صدا به شکل مخفیانه ذخیره می شود به آن واترمارکینگ می گویند؛ اما مخفی کردن شماره سریال یا یک مشخصه از یک چیز در چیز مشابه دیگر را فینگرپرینتینگ می نامند. هر دوی این روش ها برای جلوگیری از دزدی آثار بکار می روند، از دومی برای پیدا کردن ناقضین کپی رایت و از اولی برای اثبات آن استفاده می شود. اما این دو روش بخشی از مطلب کلی تری به نام استگانوگرافی هستند.
2-5- تفاوت پنهان نگاری و رمزنگاریتفاوت اصلی رمزنگاری و پنهان نگاری آن است که در رمز نگاری هدف اختفاء محتویات پیام است و نه به طور کلی وجود پیام، اما در پنهان نگاری هدف مخفی کردن هر گونه نشانه‌ای از وجود پیام است. در مواردی که تبادل اطلاعات رمز شده مشکل آفرین است باید وجود ارتباط پنهان گردد. به عنوان مثال اگر شخصی به متن رمزنگاری شده‌ای دسترسی پیدا کند، به هر حال متوجه می‌شود که این متن حاوی پیام رمزی می‌باشد. اما در پنهان نگاری شخص سوم ابداً از وجود پیام مخفی در متن اطلاعی حاصل نمی‌کند.
بنابراین استگانوگرافی به نوعی امنیت بیشتری نسبت به رمزنگاری دارد. البته همانطور که گفته شد می توان از ترکیب هر دو با هم نیز استفاده کرد، بدین ترتیب که پیام ابتدا رمز و سپس مخفی می شود که در این صورت یک لایه ی امنیتی دیگر به روش های متداول رمزنگاری اضافه می شود.

2-6- تفاوت پنهان نگاری، واترمارکینگ و رمزنگاری
جدول 2-1 مقایسه پنهان نگاری، نهان نگاری و رمزنگاری [23]
روش پنهان نگاری نهان نگاری رمزنگاری
حامل انواع رسانه دیجیتالی بیشتر ویدئو و تصویر متن هایی که مبتنی بر بسط فایل تصویری هستند
داده مخفی بار مفید واترمارک متن ساده
کلید اختیاری ضروری
فایل های ورودی حداقل دو تا مگر اینکه در تابع تعبیه سازی باشد یکی
آشکارسازی کور یادگیرنده است(نیاز به پوشش اصلی یا واترمارک برای استخراج دارد) کور
احراز هویت بازیابی کامل داده معمولاً توسط ارتباط متقابل بدست می آید. بازیابی کامل داده
هدف ارتباط مخفی حفظ قانون کپی رایت حفاظت از داده
نتیجه فایل استگ فایل واترمارک رمز گذاری متن
بحران مطلوبیت / ظرفیت استقامت استقامت
انواع حمله پنهان شکنی پردازش تصویر رمزگشایی
قابلیت مشاهده هیچ وقت گاهی اوقات همیشه
زمان شکست شناسایی شود حذف یا جایگزین شود رمزگشایی شود
ارتباط با پوشش لزوما وابسته به پوشش نیست. پیام مهمتر از پوشش است. معمولاً ویژگی از پوشش می آید. پوشش مهمتر از پیام است. کاربرد ندارد.
قابلیت انعطاف برای انتخاب پوشش مناسب آزاد است. انتخاب پوشش محدودیت دارد. کاربرد ندارد
تاریخچه بسیار سنتی بغیر از مدل های دیجیتالی مدرن مدرن
2-7- اهداف و ملزومات پنهان نگاری
به طور کلی اهداف تحلیل پنهان نگاری و یا حالت هایی که تحلیل انجام می گیرد به ترتیب شامل موارد زیر است:
1- اثبات وجود یا عدم وجود پیغام پنهانی: در یک رسانه ی مشکوک این حالت مهمترین هدف تحلیل پنهان نگاری است و اکثر الگوریتم های ارائه شده نیز در این مقوله هستند.
2- تخریب پیغام: این حالت مربوط به بازرسی فعال می شود. در یک کانال ارتباطی مشکوک تمام رسانه های رد و بدل شده را طوری تغییر می دهند که مطمئن باشند هیچ پیغامی رد و بدل نمی شود. البته در این زمینه باید توجه داشت که تغییر رسانه با هدف تخریب، کمترین تاثیر را روی کیفیت رسانه بگذارد.
3- استخراج پیغام: اگر فرستنده و گیرنده از الگوریتم های ساده ی پنهان نگاری استفاده کنند که نیازی به کلید رمز یا عمومی ندارد و یا این که کلید لو رفته باشد و الگوریتم توسط دشمن شناسایی شده باشد، دشمن می تواند پیغام را استخراج نماید. البته این حالت در پنهان نگاری به سختی اتفاق می افتد.
4- تغییر پیغام: پس از استخراج پیغام، ممکن است دشمن به قصد فریب پیغام را تغییر دهد و آن را در تصویر قرار داده و برای گیرنده ارسال کند.
5- استخراج کلید عمومی و کلید رمز: در بسیاری از الگوریتم های پنهان نگاری، کلید عمومی در بخشی از رسانه ی پنهان نگار به صورت ترتیبی قرار می گیرد که می توان الگوریتم های تحلیل خاصی به این منظور طراحی نمود.
6- یافتن الگوریتم پنهان نگاری: یک نوع تحلیل می تواند این باشد که پیغام به نوعی به دست دشمن رسیده است و دشمن می خواهد الگوریتم پنهان نگاری را به دست آورد تا برای رسانه های پنهان نگار بعدی بتواند پیغام پنهانی را استخراج کند.
گرچه هر کاربردی از پنهان نگاری تصویر نیازهای خاص خود را دارد، با این همه تمام روش های پنهان نگاری باید ملزومات مشترکی را رعایت کنند که عبارتند از :
١) شفافیت از نظر درک سیستم، ٢) امنیت و ٣) رعایت ظرفیت سیگنال
واضح است که این ملزومات به یکدیگر مربوطند. الگوریتم های پنهان نگاری، به منظور درج اطلاعات سیگنال پیام در داخل داده میزبان، تغییرات کوچکی را بر اساس سیگنال پیام در داده میزبان، ایجاد می کنند، به نحوی که با چشم انسان قابل مشاهده نباشد.
مواردی که در طراحی یک روش پنهان سازی دارای اهمیت هستند:
شفافیت: شفافیت سیستم بیان می دارد که موضوع میزبان قبل و بعد از جاسازی در پیام نباید تفاوت محسوسی داشته باشد چرا که هدف غیر قابل حس کردن انتقال پیام است و در حقیقت امنیت یک سیستم پنهان سازی در همین مسئله شفافیت نهفته است و هر چقدر که شباهت موضوع میزبان پیام در هر دو حالت عاری و حاوی پیام بیشتر باشد امنیت این سیستم در سطح بالاتری قرار دارد.
مقاومت: مقاومت یک سیستم پنهان سازی به معنای این است که پیام پنهان شده در مقابل اعمال تغییرات ناخواسته و غیر عمدی که وجود نویز در طول مسیر انتقال بوجود می آورد و یا اعمال تغییرات عمدی که توسط حمله کننده فعال به منظور تغییر پیام یا از بین بردن آن انجام می گیرد مقاومت لازم را داشته باشد.
ظرفیت: در یک سیستم پنهان سازی هر چقدر بتوان پیام بیشتری را در یک میزبان مخفی نمود این سیستم مناسب تر خواهد بود حجم داده ای که می توان در یک میزبان ذخیره کرد دقیقا بستگی به ماهیت میزبان دارد و این که تاچه حدی می توان داده در آن پنهان کرد بدون اینکه در شفافیت آن تاثیری جدی بگذارد. سه ویژگی فوق بطور بسیار تنگاتنگی در ارتباط با یکدیگر هستند بدین معنی که با ثابت فرض کردن ویژگی اول و افزایش ویژگی دوم ویژگی سوم حتما کاهش خواهد یافت.
ثابت =مقاومت*ظرفیت
در شکل های پنهان نگاری عناصر ظرفیت و شفافیت اهمیت اصلی را دارند. در دنیای امروز، جوهر نامرئی و کاغذ که در گذشته برای برقراری ارتباط پنهانی به کار برده می‌شد به وسیله رسانه‌های عملی‌تر مثل تصویر، ویدئو و فایل‌های صوتی جایگزین شده‌اند. به دلیل اینکه این رسانه‌های دیجیتال دارای افزونگی اطلاعاتی زیادی هستند می‌توانند به عنوان یک پوشش مناسب برای پنهان کردن پیام استفاده شوند. تصاویر مهم‌ترین رسانه مورد استفاده به خصوص در اینترنت هستند و درک تصویری انسان از تغییرات در تصاویر محدود است. تصاویر نوعی رسانه پوششی مناسب در پنهان نگاری محسوب می‌شوند و الگوریتم‌های پنهان نگاری متعددی برای ساختارهای مختلف تصاویر ارائه شده‌است. هیچ یک از این الگوریتم‌ها تاکنون امنیت را به طور کامل تأمین نکرده‌اند. به طور کلی شکل های پنهان نگاری در تصویر از الگوریتم جاسازی و الگوریتم استخراج بیت‌ها تشکیل شده‌اند. به تصویر مورد استفاده برای پنهان نگاری پوشانه و به تصویری که در اثر قرار دادن پیام به وسیله الگوریتم جاسازی به دست می‌آید تصویر پوششی یا گنجانه می‌گوییم. الگوریتم‌های پنهان نگاری به صورت عمومی از افزونگی در فضای مکانی یا افزونگی در فضای تبدیل استفاده می‌کنند. در هر کدام از این فضاها به شیوه‌های گوناگونی می‌توان داده‌ها را پنهان کرد که یکی از ساده‌ترین روش ها، استفاده از بیت‌های کم ارزش فضای مورد نظر است. در پنهان نگاری نیز همانند رمز نگاری فرض بر آن است که الگوریتم‌های بکار رفته در پنهان نگاری برای همه آشکار است. شفافیت در این روش ها بر پایه پنهان بودن کلید تعریف می‌گردد به طوری که نتوان بدون داشتن کلید هیچ اطلاعی از وجود پیام پنهان کسب کرد.
2-8- انواع بازرسی
در راستای رسیدن به اهداف یاد شده تحلیلگر دو نوع بازرسی می تواند انجام دهد:
1- بازرسی فعال: در این نوع بازرسی، ناظر پیغام را با اندکی دست کاری تغییر می دهد تا امیدوار باشد که هیچ ارتباط پنهانی برقرار نمی شود. چون روش های پنهان نگاری بیشتر روی امنیت و ظرفیت تکیه دارد، معمولاً شکننده و غیر مقاوم هستند. لذا پنهان نگاری در برابر ناظر فعال، کار مشکلی است و در این حالت باید از تکنیک های واترمارکینگ مقاوم بهره گرفت.
2- بازرسی غیر فعال: در بازرسی غیر فعال، تحلیلگر تمام پیغام هایی را که بین فرستنده و گیرنده رد و بدل می شود بررسی می کند. هیچ پیغامی را تغییر نمی دهد. لازم به ذکر است که در ارتباط فرستنده و گیرنده، رسانه پنهان نگاری شده قابل تشخیص نیست و این تحلیلگر است که باید با هنر خود آن را پیدا کند.
2-9- شیوه حملات تحلیل
تحلیل را با دو شیوه حملات مشاهده ای و آماری می توان انجام داد. اگرچه پنهان نگاری سعی می کند اطلاعات را طوری پنهان نماید که قابل مشاهده و ادراک نباشد ولی اعوجاج هایی روی مشخصات آماری سیگنال پوششی ایجاد می کند. هنر روش های تحلیل، شناسایی این ویژگی ها و دسته بندی آن ها، برای جداسازی تصاویر پنهان نگار و غیر پنهان نگار است.
روش های تحلیل آماری خود به دو گروه روش های عمومی و الگوریتم هایی که برای یک روش خاص پنهان نگاری طراحی می شوند، تقسیم می گردند. در روش های عمومی، تحلیل برای همه روش های پنهان نگاری یا برای دسته ای از روش های پنهان نگاری انجام می شود. اگرچه روش های عمومی کاربردی تر و جذاب تر هستند برای یک الگوریتم خاص نسبت به گروه دوم، پاسخ های ضعیف تری تولید می کنند. البته بایستی اشاره کرد که با توجه به ساختارهای تصویر، دسته بندی های مختلفی برای تحلیل پنهان نگاری می توان ارائه نمود. به عنوان مثال می توان به تحلیل پنهان نگاری در حوزه مکانی و در حوزه تبدیل و یا تحلیل پنهان نگاری برای تصاویر غیر فشرده و تصاویر فشرده، تحلیل پنهان نگاری برای تصاویر رنگی، سیاه و سفید و باینری اشاره کرد.
2-10- اصطلاحات استگانوگرافی
فایل حامل: فایلی که اطلاعات مخفی شده را درون خود نگه می دارد .
آنالیزگر استگ: فرایندی که اطلاعات مخفی درون یک فایل را تشخیص می دهد .
وسیله استگ: وسیله ای که در اطلاعات مخفی وجود دارد.
بیت های فراوانی: قسمتهایی از اطلاعات درون یک فایل که می تواند بدون صدمه به فایل در آن عمل اوررایت یا تغییر فایل را انجام دهد.
محل حمل (داده): اطلاعاتی که مخفی می شوند .
2-11- روش های پنهان سازی اطلاعات
همانطور که در شکل (2-3) نشان داده شده است پتیتکولاس (1999) روش های پنهان سازی اطلاعات را به صورت زیر دسته بندی کرد [8]:
-25336513970پنهان سازی اطلاعات
کانالهای مخفی
پنهان نگاری
ناشناس ماندن
علامت گذاری کپی رایت
زبان شناختی
فنی
قوی
شکننده
فینگرپرینتینگ
واترمارکینگ
غیرقابل مشاهده
قابل مشاهده
00پنهان سازی اطلاعات
کانالهای مخفی
پنهان نگاری
ناشناس ماندن
علامت گذاری کپی رایت
زبان شناختی
فنی
قوی
شکننده
فینگرپرینتینگ
واترمارکینگ
غیرقابل مشاهده
قابل مشاهده

شکل 2-3 شکل های پنهان سازی اطلاعات توسط پتیتکولاس[8]
بلوک دیاگرام و تعاریفی که در اولین کارگاه بین المللی پنهان سازی اطلاعات برای انجام این عمل عنوان شد به شرح زیر است [24]:
over-medium : شئ ای که پیام در قالب آن منتقل می شود و می توان شامل تصویر، متن و …باشد در این تحقیق به آن تصویر پوششی گفته می شود.
Embedded-message : داده ای که باید به صورت پنهانی منتقل شود و داخل پیام پوششی جاسازی می گردد در این تحقیق به آن پیام مخفی گفته می شود.
Stego-medium : حاصل ترکیب پیام در میزبان است در این تحقیق به آن تصویر پنهان نگاری شده گفته می شود.
Stego-key : اطلاعات سری است که مشترک بین فرستنده و گیرنده است و به منظور جاسازی و بازیابی اطلاعات از آن استفاده می شود.
Embedder(E ) : تابع جاسازی کننده پیام .
Extractor(E-1 ) : تابع استخراج کننده پیام .
برای انجام هر روش پنهان سازی دو کار زیر باید صورت پذیرد [25]:
الف) در آنچه به عنوان تصویر پوششی بکار می رود این تحقیق باید انجام شود که چه تغییراتی را می توان روی آن اعمال نمود بدون اینکه تفاوت قابل درکی بین نمونه اصلی و نمونه ای که در آن تغییرات ایجاد شده بوجود آید. این تحقیق برای انجام عملیات فشرده سازی نیز جهت حذف اجزاء زائدی که وجود یا عدم وجود آنها در کیفیت تاثیر چندانی ندارد انجام می شود.
ب) از مشخصه تحقیق شده در قسمت (الف) برای پنهان کردن اطلاعات استفاده شود.
اگرخواسته باشیم پنهان سازی اطلاعات را به صورت فرمولی عنوان کنیم می توان گفت برای قطعه ای اصلی از داده d که به عنوان میزبان مطرح است حد آستانه ای وجود دارد t که چنانچه زیر این حد آستانه، تغییراتی در d بوجود آوریم قابل تشخیص برای حسگرهای انسانی نیست. این حد آستانه از راه آزمایش بدست می آید و در افراد مختلف متفاوت است. لیکن کمترین مقدار آن از لحاظ حس انسانی می تواند برای t در نظر گرفته می شود. بنابراین ما همواره می توانیم تغییر c در d را زیر حد آستانه t بوجود آوریم طوری که قابل تشخیص بوسیله احساس نباشد.
d+c<t
اساس کار روش های موجود در پوشیده نگاری را می توان به دو دسته کلی زیر تقسیم کرد [24]:
روش هایی که بر پایه نقص در سیستم بینایی انسان (HVS) استواراست.
روش هایی که بر پایه نقص در سیستم شنوایی انسان(HOS ) استوار است.
سیستم شنیداری انسان آنقدر دقیق نیست که تغییرات جزئی ایجاد شده در قطعات صوت را تشخیص دهد و بنابراین از همین نقطه ضعف می توان استفاده نمود و داده ای را لابه لای قطعات صوت جا سازی کرد همچنین سیستم دیداری انسان دارای خصوصیاتی است که بر مبنای آنها روش های پنهان سازی متفاوتی در قالب تصاویر خصوصاً تصاویر ثابت ابداًع شده اند.
2-12- استگانوگرافی در رسانه های مختلف
در سه بخش بعدی درباره اینکه چگونه از استگانوگرافی در متن، عکس و صدا ایجاد و استفاده می شود بحث می کنیم. اغلب، در حالی که احتیاجی به آن نیست، متن هایی که در متن مخفی می شوند را نیز رمزگذاری می کنند. این برای تبعیت از یکی از قوانین کیرشهف در رمزنگاری است. طبق این قانون باید فرض شود دشمن از علم و تکنولوژی برخوردار است که می تواند تشخیص دهد شما از استگانوگرافی استفاده کرده اید. تنها قسمتی که دشمن از آن بی خبر است کلمه کوتاهی است که برای رمزگشایی مورد استفاده قرار می گیرد. سیستم باید به شکلی باشد که دشمن بدون آن کلمه بختی برای یافتن متن شما نداشته باشد.
 وقتی اطلاعات را جاسازی می کنیم باید نکات زیر را در نظر داشته باشیم:
اطلاعات پوشاننده باید به شکلی باشد که وقتی اطلاعات مورد نظر را درون آن جاسازی می کنیم تغییر نکند، اطلاعاتی که جاسازی می شود نیز باید به شکلی باشد که دیده نشود، البته منظور همیشه مخفی بودن نیست، اطلاعات می تواند دیده بشود ولی نظر کسی را جلب نکند.
اطلاعات جاسازی شده باید مستقیما ً در خود اطلاعات پوشاننده جاسازی شود و در هِدِر آن یا بالای آن قرار نگیرد.
اطلاعات جاسازی شده باید مقاومت کافی در برابر حمله ها و روش های مقابله با آن را داشته باشد.
ممکن است وقتی اطلاعات پوشاننده تغییر می کنند اطلاعات جاسازی شده کمی تغییر بکند، بدین منظور باید قابلیت استفاده از کد های خطایاب را داشته باشد.
اطلاعات جاسازی شده باید قابلیت آن را داشته باشد تا اگر قسمتی از اطلاعات پوشاننده از دست رفت دوباره بازیابی شود. مثلا ً اگر فقط قسمتی از عکس در دست بود بتوان همان قسمت از پیغام اصلی را استخراج کرد.
2-12-1- استگانوگرافی در متن