—d1522

2-3-1-1) نوروپپتید Y (NPY)24
2-3-1-2)ارکسین25
2-3-1-3)گالانین26
2-3-1-4) نوروپتیید w-2327
2-3-2)هورمون ها27
2-3-2-1)گرلین27
2-3-2-2)ابستاتین28
2-3-2-3)لپتین29
نوروپتیید w30
گیرنده های NPW31
توزیع مرکزی NPW32
2-4-3) توزیع محیطی NPW33
توزیع NPBWR1-2 34
تنظیم تغذیه ومتابولیسم انرژی بوسیله NPW35
عملکرد اندوکرین NPW37
کورتیزول38
کورتیزول و فعالیت بدنی39
متابولیسم انرژی در فعالیت ورزشی41
فعالیت ورزشی فزاینده و شدید41
فعالیت ورزشی دراز مدت41
تاثیرات اسمولاریته بروی هورمون ها42
ارتباط کورتیزول با واسطه های متابولیکی43
ارتباط هورمون کورتیزول با اسید لاکتیک44
ارتباط هورمون کورتیزول با کراتینین44
کورتیزول و چاقی45
2-5-5-1) لینک پتانسیل بین کورتیزول و اشتها46
اثرات مضر چاقی ناشی ازکورتیزول46
تیروکسین47
تاثیر تیروکسین بر متابولیسم: 47
بی حرکت حاد و مزمن بر روی هورمون تیروئیدی48
هورمون های تیروئیدی و لپتین50
هورمون های تیروئیدی وگیاهان داروی51
2-7)جمع بندی 52
فصل سوم- روش شناسی پژوهش
3-1) روش پژوهش 54
3-2) طرح پژوهش54
3-3) جمع آوری وشیوه عصاره گیری ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-1) جمع آوری میوه ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-2) عصاره گیری آبی میوه ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-3) مقدار دوز عصاره مصرفی موش ها55
3-4) جامعه و نمونه آماری و روش نمونه گیری56
3-5) محیط پژوهش56
3-6) تغذیه آزمودنی ها57
3-7) دوره و زمان بندی تمرینی57
3-8) وسایل و ابزار استفاده شده در پژوهش59
3-9) متغیرهای پژوهش60
3-9-1) متغیر مستقل60
3-9-2) متغیرهای وابسته60
3-10) روش اندازه گیری متغیرهای پژوهش60
3-10-1) روش اندازه گیری متغییر های وابسته61
3-10-1-1) روش اندازه گیری NPW 61
3-10-1-2) روش اندازه گیری هورمون کورتیزول 61
3-10-1-3) روش اندازه گیری هورمون T461
3-11) روش اندازه گیری ترکیبات سرخ ولیک , سیاه ولیک با استفاده از GC-MS : 62
3-12) روش ها آماری62
فصل چهارم- تجزیه وتحلیل
4-1) مقدمه65
4-2) توصیف داده ها65
4-2-1) مشخصات آزمودنی های حیوانی65
4-2-2) یافتههای مربوط به متغیرهای مورد مطالعه66
4-3) تجزیه و تحلیل استنباطی یافتههای پژوهش66
4-3-1) یافته های مربوط به نوروپپتید W پلاسمایی68
4-3-2) یافته های مربوط به نوروپپتید w کبدی72
4-3-3) یافته های مربوط به کورتیزول پلاسمایی76
4-3-4) یافته های مربوط به هورمون تیروئید T481
فصل پنجم- بحث ونتیجه گیری
5-1) مقدمه88
5-2) خلاصهی پژوهش88
5-3) بحث و بررسی(نوروپپتید w پلاسمایی و کبدی ، هورمون کورتیزول و T489
5-4) نتیجهگیری93
5-5) پیشنهادات برای پژوهشهای بیشتر94
منابع..................................................................................................................................................................................................95
چکیده انگلیسی112
فهرست شکل
عنوان صفحه
شکل 2- 1) تنظیمات جبرانی دریافت و مصرف کالری 15


شکل 2 – 2) طراحی شماتیک ساده از مناطق هیپوتالاموس 17
شکل 2 – 3) گردش هورمون های موثر بر تعادل انرژی از طریق هسته کمانی 20
شکل 2-4 ) تنظیم مصرف غذا 23
شکل 2-5) فعال سازی سلول های عصبی NPY / AGRP 25
شکل 2-6) گرلین قبل و بعد از دریافت غذا28
شکل 2- 7 ) لپتین 30
شکل 2- 8) فرق نوروپتیید 23- w و نوروپتیید 30- w ( انسان ، خوک ، رت ، موش)32
شکل 2- 9 ) تصویر شماتیک بر اساس یافته های مطالعات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تنظیم اشتها در هیپوتالاموس توسط سلول های عصبی NPW و پپتید مرتبط با تغذیه در هیپوتالاموس36
شکل 3-1) مراحل اجرای طرح تحقیق در موش های صحرایی نر58
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول 2-1) مولکول های سیگنالی کاندید در هموستاز انرژی در CNS 22
جدول 3-1) حجم نمونه و مشخصات آزمودنی های هر گروه56
جدول 3- 2) پروتکل تمرین 8 هفته ای59
جدول 3- 3) مقادیر متغیر های مربوطه برای استخراج الکلی روغن سرخ ولیک63
جدول 4-1)، میانگین و انحراف استاندارد وزن موش های مورد پژوهش65
جدول 4-2) شاخص های توصیفی متغیرهای اصلی پژوهش66
جدول (4-3)، نتایج آزمون لون جهت بررسی هم واریانسی گروه های تحقیق67
جدول4-4) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه نوروپپتید W پلاسمایی68
جدول4-5) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه نوروپپتید W کبدی72
جدول4-6) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه کورتیزول پلاسمایی 76
جدول 4-7) نتایج آزمون توکی برای بررسی تفاوت بین گروه ها در کورتیزول پلاسمایی 77
جدول4-8)، آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه هورمون تیروئید T4 81
جدول( 4-9) نتایج آزمون توکی برای بررسی تفاوت بین گروه ها در هورمون تیروئید T482
فهرست نمودار ها
عنوان صفحه
نمودار (4-1)، مقایسه سطوح نوروپپتید w پلاسمایی گروه های تحقیق71
نمودار (4-2)، مقایسه سطوح نوروپپتید w کبدی گروه های تحقیق75
نمودار (4-3)، مقایسه سطوح کورتیزول پلاسمایی گروه های تحقیق80
نمودار (4-4)، مقایسه سطوح هورمون تیروئید T4 گروه های تحقیق85
فصل اول:
طرح پژوهش

1-1: مقدمه
تغییر سبک زندگی و عدم توجه به برنامه های غذایی، جوامع امروزه را به سمت افزایش وزن، چاقی و عدم مدیریت اشتهای کاذب و به همراه آن به سوی بی تحرکی سوق داده است. چاقی و افزایش بیش از حد بافت چربی یکی از مشکلات سلامت در کشورهای مختلف جهان است که به دنبال تغییر شرایط زندگی و کاهش فعالیت فیزیکی و در نتیجه عدم تعادل انرژی دریافتی و مصرفی رخ می دهد. در سالهای اخیر، چاقی شیوع رو به افزایشی داشته است ]2،1[. چاقی، به عنوان بحران سلامت عمومی شناخته می شود ]3[.
شیوع چاقی و پیشرفت سریع آن موجب شده که پژوهش ها به سمت تنظیم و تعادل وزن بدن پیش رود. در اصل، چاقی و اضافه وزن نتیجه عدم تعادل انرژی است که به موجب آن انرژی دریافت شده بیشتر از انرژی مصرف شده است. یکی از عوامل تاثیرگذار بر چاقی میزان دریافت غذاست. دریافت غذا رفتار پیچیده ای است که سطوح مختلف کنترلی و تنظیمی را در بر می گیرد ]4[. افزایش وزن و یا چاقی که خود مقدمه بسیاری از بیماری های انسانی و مرگ و میر شده است. امروزه در حوزه بهداشت، سلامت و شیوع شناسی و به تازگی در حوزه فیزیولوژی ورزش با عنایت بر تاثیر فعالیت بدنی و ورزشی در اشکال مختلف در مدیریت وزن و تنظیم و تعادل انرژی، توجهات در جهت ساز و کارهای اصلی درگیر جلب شده است. اگر چه هنوز معادله انرژی، هزینه کرد و انرژی دریافتی جزء پایه ای پژوهش های حوزه سلامت تلقی می شود. اما تغییرات در نوع منبع بکارگیری جهت تامین انرژی های سلولی در بدن که بخش قابل ملاحظه ای از آن توسط هیپوتالاموس و بخش دیگری که از اهمیت نیز برخوردار است، توسط عوامل محیطی کنترل می شود. در دهه های گذشته تا قبل از کشف و معرفی تعدادی از پروتئین ها و پپتیدهای موثر در تنظیم انرژی، عقیده بر این بوده است که دستگاه عصبی مرکزی، به ویژه هیپوتالاموس تنها اندام درگیر در تنظیم تعادل انرژی و سوخت و ساز است. اکنون دیگر مطلق بودن حاکمیت هیپوتالاموس در کنترل تعادل و تنظیم انرژی جای خود را به همگرایی مرکز و محیط داده است، به همین خاطر پژوهشگران پپتیدهای مرتبط با کنترل و تنظیم انرژی و اشتها، دریچه ای نو را به سوی این دنیای عظیم موثر بر روند زندگی سالم باز کرده اند]7،6،5[.
با این وجود، به نظر می رسد که هنوز هیپوتالاموس محوریت لازم را در کنترل تعادل انرژی، سوخت ساز قند و اشتها داشته باشد. شاید به این خاطر باشد که تعداد زیادی از نورپپتیدهای مترشحه (AGRP،NPY،CART،POMC ، اورکسین، MCH ، گالانین ، پپتید شبه گلوکاکن، عامل رهایی کورتیکوتروپین) از این اندام در مقایسه با اندامهای محیطی دیگر مشارکت بیشتری را در این امر دارند ]8[. نوروپپتید w یکی از این نوروپپیدهاست که نقش مهمی در متابولیسم تغذیه و انرژی دارد ]9[.
1-2: بیان مسئله:
تمرین و فعالیت بدنی به عنوان یکی از عوامل موثر در تحلیل منابع انرژی سلولی از جمله گلوکز و گلیکوژن است، که می تواند تغییراتی در پپتیدهای و هورمون های موثر بر تنظیم و تعادل انرژی بوجود آورد. همچنین اظهار شده است که بازسازی و ریکاوری آنی ذخایر انرژی از جمله گلوکز و گلیکوژن نیز می توانند بر غلظت این پپتیدها اثرگذار باشند. در صورت عدم بازسازی مناسب و به موقع با مشکلاتی چون تغییر در غلظت پپتیدهای موثر بر تنظیم انرژی مواجه خواهیم شد. عدم تعادل بین پپتیدهای مهارگر و تحریک کننده دریافت غذا مانند لپتین، AGRP,NPY,CART,POMC, و گرلین به عنوان عوامل دخیل در روند سازوکاری می تواند به افزایش درصد چربی بدن، چاقی و غلبه روند اشتهاآوری بر ضد اشتهایی شود. اتخاذ راه کاری صحیح و آنی برای مقابله با این عدم تعادل می تواند از اختلالات سوخت و سازی تعادل و تنظیم انرژی (افزایش وزن یا کاهش غیرمنطقی، اتلاف انرژی) جلوگیری نماید. هرچند نوروپپتیدw در انسان اخیرا کشف شده است]10[ اما از زمان کشف نروپپتایدها، دانش ما از تنظیم وزن، اشتها و تعادل انرژی به نحو چشمگیری افزایش یافت. بسیاری از متخصصان حوزه سلامت، بهداشت و به خصوص تنظیم وزن، امیدوارند که با شناسایی جنبه های مهم و ناشناخته این نروپپتایدها و عوامل موثر بر آنها به روش های درمانی کارآمد و کشف داروهای جدیدی را برای امراضی چون چاقی دست یابند .امروزه تقریبا تاثیر نوروپپتیدها بروی هورمون ها ثابت شده است. از طرفی تغییر در هورمون ها نیز باعث تغییر در وزن بدن می شود.گزارش های رسیده نیز نشان می دهد که NPW نه تنها در تنظیم انرژی بلکه در هموستاز هورمونی نیز نقش دارد، ]11[
هورمون ها نقش مهمی در تنظیم اشتها، متابولیسم بدن و تنظیم سطح انرژی دارند]12[. فعالیت و تمرینات ورزشی روی سطوح خونی هورمون ها تاثیر می گذارند و به کاهش یا افزایش سطح برخی از هورمون ها نسبت به حالت استراحت منجر می شوند. در واقع این نوسانات هورمونی را می توان واکنش بدن در برابر فشارهای تمرینی قلمداد کرد، تا حالت هموستاز بدن برقرار شود ]13،14[. عدم تعادل در سطح هورمون ها در گیر در اشتها ( انسولین ، گلوکاگون ، کورتیزول و هورمون‌های غده تیروئید) می تواند به افزایش وزن منجر شود.
هورمون کوتیزول که یک گلوکوکورتیکوئید است ، و از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود، نقش بسزایی در برقراری این هموستاز دارد ]15[ . کورتیزول به طور مستقیم بر ذخیره چربی و افزایش وزن در افراد تاثیر دارد . یکی از اثرات مهم کورتیزول، نقش آن روی سوخت و ساز کربوهیدرات ها، پروتئین ها و چربی ها است.این هورمون فرآیند گلوکونئوژنز را از اسیدهای آمینه تسهیل، لیپوژنز کبد را کاهش و چربی های موجود در بافت چربی را به حرکت در می آورد . کورتیزول سوبسترای لازم را برای عمل گلوکرنئوژنز (اسیدهای آمینه) و سوخت های جایگزین را برای متابولیسم انرژی عضله اسکلتی (اسیدهای چرب) تامین کند]16،17،18،19[
هورمون تیرکسین یکی از هورمون های مهم متابولیسمی بدن است ]20[. که توسط غده ی تیرویید که تحت تاثیر محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- تیرویید ( H-P-T) است ،تنظیم می شود ]21[ . در بررسی های متعدد ، اثر بسیاری از عوامل مانند دمای محیط ، استرس ، هورمون های دیگر ، ترکیبات شیمیایی ، نوسانات شبانه روزی ،... بر محور نامبرده به اثبات رسیده است. هورمون تیرویید ارتباط ویژه ای با رشد ، اشتها ، متابولیسم ، تنظیم اسمزی و تولید مثل دارد ]22[ افزایش میزان سوخت و ساز پایه، اثر اصلی هورمون های تیروئید است. عمل عمده ی این هورمون ها افزایش سوخت و ساز قندها و چربیها است]23[.
از طرفی استفاده از مواد مغذی ، به ویژه مواد قندی،اسیدهای چرب، نوشیدنی های ورزشی حاوی اسیدهای آمینه ، مواد معدنی و ویتامین ها ، آنتی اکسیدنها پس از تمرین و فعالیت بدنی، برای بازسازی سریع و افزون سازی منابع انرژی (گلیکوژن و ATP ) و کنترل وزن و اشتها توسط متخصصین و مربیان آگاه توصیه شده و می شود. در این راستا، استفاده از مکمل های غذایی طبیعی و صناعی بر عملکرد ورزشی، توازن بین اکساینده ها و ضد اکسایش کننده های بدن، توسط ورزشکاران ، مربیان ، متخصصین و پژوهشگران توصیه و بررسی شده است. علاوه بر موارد فوق، تاثیر برخی از گیاهان خوراکی و دارویی از قبیل: شنبلیله ]24[ ، برگ ریحان ]25[، توت هندی ]26[، لئوکاس سفالوتز (نوعی علف هرز خوراکی در هند) ]27[، بر روند بازسازی منابع انرژی به ویژه گلیکوژن در نمونه های حیوانی مطالعه شده است. با این وجود در هیچ یک از پژوهش های انجام شده به تاثیر این گیاهان دارویی و غذایی بر پپتیدهای درگیر در تنظیم تعادل انرژی، سوخت وساز قند، اشتها و وزن، با و یا بدون فعالیت بدنی و تمرین مورد توجه قرار نگرفته است. همچنین ، ولیک به عنوان یک گیاه دارویی منحصر به فرد از حیث ترکیبات و خواص به طور جدی در حوزه ی فیزیولوژی ورزش مورد توجه قرار نگرفته است.
ولیک یکی از قدیمی ترین گیاهان دارویی در طب اروپایی می باشد و برای اولین با توسط دیوسکورید در قرن 1 شرح داده شد]28[. عصاره ولیک از گل، برگ و میوه این گیاه مشتق می شود. مطالعه بالینی کمی به بررسی میوه ولیک به تنهایی پرداخته است ]29[. برگ، گل و میوه ولیک دارای مقادیر زیادی پروسیانیدین الیگومریک ، فلاونوئیدها می باشد، که مسئول اثر دارویی آن است]30[.
گیاه ولیک سرخ با اسامی مختلفی از قبیل هاثرن و از خانواده روزاسه به صورت سنتی به عنوان تونیک قلبی استفاده می شود. ترکیبات مختلفی در ولیک سرخ وجود دارد که شامل: ساپونین های تری ترپن، فلاونوئیدها، کاتیشن، اپی کاتشین می باشد ]31[.
گزارش شده است سرخ ولیک یک گیاه دارویی با ارزش از تیره گل سرخ است که امروزه در درمان ضایعات قلبی و گردش خون و به ویژه به عنوان ضد عفونت ها و آنتی اکسیدان، تب بر قابل استفاده می شو د؛ و اهمیت دارویی آن به دلیل وجود ترکیبات فنلی است که در این رده فلاونوئیدها نقش دارویی مهمی دارند]32[.همچنین مصرف آنتی اکسیدانهای غذایی می تواند از شیوع بیماری های متابولیک کم کند]33[.فلاونوئیدها بخاطر آنتی اکسیدان بودن در تنظیم تغذیه دخیل است و باعث تنظیم چربی خون ،تنظیم متابولیسم گلوکز و کربوهیدارت می شود ]34[ .
بنابراین ، این پژوهش قصد دارد تا تأثیر همزمانی تمرین با شدت بالا را به همراه دو نوع ولیک ( کراتاگوس ) سرخ و سیاه بر شاخص های مربوط به اشتها را در نمونه حیوانی ( مریوط به موش های نر) مورد ارزیابی قرار دهد. آیا تمرین شدید بر سطوح نوروپپتید W ، T4 ، کورتیزول پلاسمایی و بر سطوح نوروپپتید W کبدی درموش های صحرایی نر اثر دارد؟ آیا مکمل سازی آبی ولیک بر سطوح نوروپپتید W ، T4 ، کورتیزول پلاسمایی و بر سطوح نوروپپتید W کبدی درموش های صحرایی نر اثر دارد؟.
1-3: ضرورت و اهمیت تحقیق:
از آنجایی که بررسی و نمونه برداری بافت های انسانی از دشواری های زیادی برخوردار است و پژوهش های انجام شده بر روی مدل های حیوانی که شباهت های عملکردی با انسان دارند، می تواند تا حدودی بیانگر رخدادهای عملکردی در انسان باشند، از این رو در مطالعه حاضر انجام پژوهش روی پلاسما و بافت موش های صحرائی نر صورت پذیرفته است.
همان طور که گفته شد چاقی و اضافه وزن از یک سو و کمبود وزن و بی اشتهایی از سوی دیگر دو انتهای طیفی می باشند که همواره سلامتی جامعه را تهدید کرده و به عنوان یکی از معضلات جوامع امروزی باشند. شیوع گسترش چاقی و بیماری های مرتبط با آن در سطح جهان، شاهدی بر این مدعاست که پیشرفت های علمی در زمینه شناخت عوامل و مکانیسم های تنظیم وزن و به خصوص پیشگیری ، مبارزه و درمان چاقی توفیق چندانی نداشته است]4[. متاسفانه درکشور ما نیز، چاقی شیوع گسترده ای دارد. بر اساس پژوهش های صورت گرفته در ایران، بررسی ۸۹۹۸ فرد سنین 81 – 35 ساله (2005- 2002) نشان داد که 2/62٪ افراد دارای اضافه وزن و 28٪ ان ها چاق بوده اند ]35[. این در حالی است که چاقی با ابتلا به بیماری های بسیاری همراه است ]36[.دلایل ابتلا به چاقی متعدد می باشند، اما از نظر فیزیولوژی، چاقی ناشی از عدم تعادل انرژی است و درمان اولیه ی آن شامل کاهش دریافت غذا یا افزایش مصرف انرژی و یا هر دوی این موارد می باشد ]36،35[.
بنابراین از جنبه سلامت و بهداشت عمومی، شناخت عوامل و مکانیسم های موثر بر تعادل انرژی و تنظیم وزن می تواند به ارتقاء سطیح سلامت جامعه و صرفه جویی در هزینه های درمانی کمک نماید. هم چنین در شماری از بیماری ها، کاهش اشتها و تعادل منفی انرژی باعث بروز مشکلات عدیده و افزایش مرگ و میر می شود. مشخص شده که در این شرایط نیز نروپپتایدها نقش کلیدی دارند. بنابراین می توان امیدوار بود که شناخت مکانیسم این فرآیندها به درمان آنها اقدام کرد. از طرف دیگر نوروپپتید w که به تازگی (حدود یک دهه) کشف شده است و با توجه به نقش کلیدی خود در هموستاز و تنظیم وزن، تحقیقات بسیار کمی درباره این نوروپپتید صورت گرفته است، همچنین تحقیقات زیادی به تمرین به عنوان یک عامل مهم و موثر بر تعادل انرژی و تنظیم وزن و ارتباط آن نوروپپتید w انجام نشده است .همانطور که دیده می شود متخصصینی که در مورد نوروپتیید w و سایر نروپتاییدها مطالعه می کنند به ورزش ، تمرین و فعالیت بدنی عنایتی نداشته اند. برخی شرایط مانند فعالیت بدنی و تمرین می تواند تغییراتی را در پپتیدهای موثر برتنظیم و تعادل انرژی بوجود آورند. تمرین و فعالیت بدنی ، تعادل انرژی در سلول ها را به هم زده و هزینه ی انرژی سلول ها را افزایش می دهد. فعالیت های بدنی منظم ، دستگاه های مختلف انرژی را در گیر کرده و موجب سازگاری های عضلانی ، تنفسی ، قلبی – عروقی ، و سازگار ی متابولیکی می شود ]37[. از آنجایی که تاکنون پژوهشی در مورد تاثیر تمرین ورزشی و عصاره ولیک بر روی نوروپپتیدW پلاسمایی و بافتی صورت نگرفته ، پژوهش حاضر قصد دارد با بررسی اثر فعالیت ورزشی و عصاره میوه ولیک بر روی این نوروپپتید را بررسی نماید.
1-4 – اهداف پژوهش:
1-4-1-هدف کلی:
هدف کلی این پژوهش تعیین اثر8 هفته تمرین شدید بر سطوح نوروپپتید W پلاسمایی و کبدی، پاسخ های هورمون کورتیزول و T4 در موشهای صحرایی نر با و بدون عصاره آبی ولیک (سرخ و سیاه ) می باشد.
1-4-2-اهداف ویژه:
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید با و بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر سطح نوروپپتید w پلاسما
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر سطح نوروپپتید w کبد
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر هورمون کورتیزول
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر هورمون تیروکسین
بررسی ارتباط سطوح نوروپپتید w پلاسما ، با دیگر متغییر ها
1-5 - فرضیه های پژوهش:
فرضیه 1 : هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح نوروپپتید W پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه 2: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح نوروپپتید W کبدی موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه3: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح هورمون کورتیزول پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه 4: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک بر سطح هورمون تیروکسین پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
1-6- محدودیت های پژوهش :
1-6-1- محدودیت های غیر قابل کنترل
ـ عدم کنترل دقیق فعالیت شبانه آزمودنی ها
ـ عدم اندازه گیری مقدار غذای مصرفی برای هر نمونه بدلیل نبودن امکانات کافی
ـ عدم کنترل تاثیر عوامل وراثتی آزمودنی ها
1-7- تعریف واژها و اصطلاحات پژوهش
ولیک (کراتاکوس) cratacgus
ولیک یک گیاه دارویی با ارزش است که امروزه در درمان ضایعات قلبی و گردش خون و به ویژه به عنوان ضد عفونت ها و آنتی اکسیدان، تب بر استفاده می شود؛ و اهمیت دارویی آن به دلیل وجود ترکیبات فنلی است که در این رده فلاونوئیدها نقش دارویی مهمی دارند. همچنین مصرف آنتی اکسیدانهای غذایی می تواند از شیوع بیماری های متابولیک کم کند. فلاونوئیدها بخاطر آنتی اکسیدان بودن در تنظیم تغذیه دخیل است و باعث تنظیم چربی خون ،تنظیم متابولیسم گلوکز و کربوهیدارت می شود .
نوروپپتید w: نوروپپتید W تشکیل شده از 30 اسید آمینه و مشتق شده از یک پری پرو پروتئین 165 آمینو اسید است که ژن آن در انسان توسط تاناکا و هکارانش شناسای شد. NPW به ایفای نقش به عنوان عامل ضد اشتها عمل و باعث افزایش دما و متابولیسم بدن می شود.
کورتیزول: هورمون کوتیزول که یک گلوکوکورتیکوئید است ، و از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود، نقش بسزایی در برقراری هموستاز بدن دارد . هورمون کورتیزول در بدن به صورت دوره ای ترشح می شود، که دامنه و میزان ترشح آن را ریتم شبانه روزی تنظیم می کند. غلظت این هورمون در گردش خون، صبح زود به دلیل افزایش دامنه و میزان ترشح آن در بالاترین سطح است. میزان ترشح کورتیزول به تدریج در طول روز کاهش می یابد و غلظت آن در شب به حداقل میزان خود می رسد .پژوهش ها نشان داده اند که وزن و درصد چربی بدن بر ترشح کورتیزول تاثیر می گذارد.
هورمون تیروکسین یا 4T: تیروکسین به هورمون ترشح شده ازغده تیروئید می‌گویند. هورمون غده تیروئید تری یدوتیرونین 3 Tو تیروکسین 4Tاست .این هورمون از اضافه شدن چهار اتم ید به آمینواسید تیروزین ساخته می‌شود. هورمون های تیروئیدی در سوخت و ساز کلی بدن نقش داشته و نقص در عملکرد غده تیروئید و ترشح نامناسب این هورمون ها عواقب متعدد فیزیولوژیک را به دنبال دارد. برای مثال کاهش غلظت پلاسمایی هورمون های تیروئیدی باعث افزایش وزن و کاهش اشتها می گردد و افزایش آنها کاهش وزن و پرخوری را به دنبال دارد.
تمرین شدید : فعالیت ورزشی دویدن روی نوار گردان ( 5 روز در هفته ، با سرعت 34 متر در دقیقه ، شیب صفر درجه و به مدت 60 دقیقه ) انجام شد.
فصل دوم:
مبانی نظری و پیشینه پژوهش

:2-1مقدمه
در این فصل ابتدا مبانی نظری پژوهش مورد بحث و بررسی قرار خواهد گرفت.پیشنه و مبانی نظری پژوهش ، طیف وسیعی از اطلاعات و نظریه های علمی است که بیان کننده کمیت و کیفت اطلاعات موجود در رابطه با موضوع پژوهشی می باشد و به تشریح پژوهش های مرتبط با موضوع می پردازد . در این فصل پژوهشگر ابتدا به بررسی و مطالعه مفاهیم اساسی که در حوزه پژوهش دارای اهمیت هستند ، نظیر مکمل سازی ، پروتکل تمرینی و ... می پردازدو در پایان اطلاعات ارائه شده ، تحقیقات قبلی انجام شده و نتایج انها بیان می شود.
2-2: مبانی نظری تحقیق
2-2-1:چاقی
چاقی اختلالی است که از عدم تعادل دریافت و هزینه کرد انرژی ناشی می شود. عدم تعادل انرژی به عنوان فیدبکی برای فیزیولوژی و محیط عمل کرده و بر هزینه کرد و دریافت انرژی اثر می گذارد ]38[. ما انرژی را به صورت چربی ذخیره سازی می کنیم، چرا که هم نسبت به کربوهیدرات متراکم تر است و هم برای ذخیره شدن نیاز به مقدار زیادی آب ندارد. پدیده چاقی دو وجهه کاملا متفاوتی داردکه ژنتیک و محیط ]38[.
اطلاعات و آمار نشان می دهد که چاقی در کشورهای غربی در حال افزایش است . و عوامل مختلفی را می توان در این مورد دخیل دانست. از جمله تماشای تلویزیون، غذاهای فوری، کم تحرکی و استفاده از وسایل ماشینی در انجام امور روزمره و ... اشاره کرد. عقیده کلی بر این است که تعادل انرژی و وزن باید به گونه ای تنظیم شود تا اثرات تعادل بین هزینه کرد و دریافت انرژی بر چاقی و وزن بدن کنترل شود . لذا وزن بدن باید به طریقی تنظیم شود، که می دانیم هموستاز انرژی از طریق سیستم عصبی پیچیده ای تنظیم می شود که اثر فراز و نشیبهای کوتاه مدت در تعادل انرژی را بر روی توده بدن به حداقل می رساند. اخیرا مولکول های میانجی و مسیرهای دریافت غذا و تنظیم وزن در مغز شناسایی شده اند ]39[. گزارش کرده اند که با وجود کاهش در مقدار غذای دریافتی روزانه قادر به کاهش وزن نیستند. این ادعا به ایجاد این فرضیه منجر شد که چاقی در اثر اختلال های متابولیکی و نادرست بودن عادت های رفتاری است ، که موجب کاهش انرژی مصرفی در افراد چاق می شود ]40[.
2-2-2:تنظیم تعادل انرژی
عقیده ی کلی بر این است که تعادل انرژی و وزن بدن پدیده ای اند که باید تنظیم شوند. این عقیده از آن جا ناشی می شود که اثر بالقوه عدم تعادل بین هزینه انرژی و دریافت آن بر چاقی وزن بدن مشاهده می شود ]38[. به همین منظور هموستاز انرژی از راه سیستم عصبی پیچیده ای تنظیم می شود که اثر فراز و نشیب های کوتاه مدت در تعادل انرژی را بر روی توده ی چربی بدن به حداقل می رساند. اخیراً مولکول های میانجی و مسیرهای تنظیمی غذا خوردن و تنظیم وزن در مغز شناسایی شده اند ]39[.
محتوای انرژی سلول ها به تعادل بین تولید و مصرف انرژی در سلول ها بستگی دارد. یکی از شرایطی که می تواند تعادل انرژی را در سلول به هم زده و نیازهای هاصی را به سلول تحمیل نماید، ازدیاد هزینه کرد انرژی در اثر فشارهای مختلف روانی و جسمانی از جمله انجام فعالیت بدنی و تمیرن است. به بیان دیگر، در نتیجه تمرین و فعالیت بدنی، تعادل انرژی در سلول به هم خورده و هزینه ی انرژی سلول افزایشمی یابد. سلول در پاسخ به این وضعیت جدید پاسخ های موقتی و لازم را از خود نشان می دهد که در صورت تداوم یافتن این وضعیت، رفته رفته به سازگاری مناسب متابولیکی نایل می شود و در صورت رفع این فشار تدریجاً وضعیت انرژی سلولی به حالت اولیه ی خود برمی گردد. بنابراین گفته می شود که سلول یا اندام یا دستگاه درگیر در مقابل فشار فیزیکی وارده سازگار شده است. تمرین و فعالیت های بدنی منظم، دستگاه های مختلف انرژی را درگیر کرده و موجب سازگاری های عضلانی، تنفسی، قلبی – عروقی و سازگاری متابولیکی می شود که متعاقب فعالیت های بدنی و ورزشی رخ می دهند ]37[.

شکل 2- 1) تنظیمات جبرانی دریافت و مصرف کالری در پاسخ به تغییرات در محتوای چربی بدن است.]47[
2-2-3:کنترل اشتها و هموستاز انرژی
مرکز اصلی هموستاز یا تعادل انرژی در انسان هیپوتالاموس می باشد ، هرچند نواحی مختلفی از مغز از کورتکس گرفته تا ساقه مغز در رفتار دریافت غذا و هموستاز انرژی دخالت دارند . در بیشترین بزرگسالان ذخایر چربی و وزن بدن علیرغم تغییرات بسیار گسترده مصرف غذای روزانه و مصرف انرژی به طور چشمگیری ثابت است. برای برقراری تعادل بین انرژی دریافتی و مصرف غذای روزانه و مصرف انرژی به طور چشمگیری ثابت است. برای برقراری تعادل بین انرژی دریافتی و مصرفی یک سیستم فیزیولوژیکی پیچیده شامل سیگنال های آوران و وابران فعالیت می کند] 1[. این سیستم شامل مسیرهای چندگانه ای است که در تعامل با هم وزن را کنترل می نماید .در گردش خون هورمون هایی وجود دارند که به صورت حاد و موقت غذا خوردن را شروع یا خاتمه می دهند وهم هورمون هایی هستند که منعکس کننده چاقی و تعادل انرژی بدن می باشد. این سیگنال ها به وسیله اعصاب محیطی و مراکز مغری از جمله هیپوتالموس و ساقه مغزی یکپارچه می شوند هنگامی که سیگنال ها یکپارچه شوند ، نوروپتید های مرکزی را ، که غذا خوردن و هزینه انرژی را تغییر می دهند ، تنظیم می کنند ] 1[.
پیچیدگی رفتار دریافت غذا منعکس کننده ی تعداد نواحی در گیر در مغز است. به عنوان مثال ، قشر پیشانی چشمی در گیر در سیری ویژه حسی است در حالی که آمیگدال در ارزیابی مزه و طعم غذا دخالت دارد . بنابراین رفتار دریافت غذا را می توان به فاز های مختلفی از جمله فاز اشتها ، که شامل جستجو برای غذا است ، و فاز مصرف شامل خوردن واقعی غذا است ، تقسیم بندی کرد ]41[.
برای حفظ یک وزن ثابت در یک دوره ی زمانی نسبتا طولانی همواره باید توازنی بین دریافت غذا و هزینه انرژی برقرار باشد . هیپوتالاموس اولین مرکز ی است که حدود 50 سال قبل نقش آن در این فرایند شناخته شد . علیرغم در گیری نقاط مختلفی از مغز در رفتار غذا خوردن ، هیپوتالاموس به عنوان مرکز اصلی غذا خوردن مطرح می باشد .در اوایل دهه 1940 نشان داده شد که تزریق یا تحریک الکتریکی هسته ها ویژه ای در هیپوتالاموس ، رفتار تغذیه ای را تغییر می دهد. هیپوتالاموس شامل چندین هسته می باشد که در دریافت غذا دخالت دارند شامل هسته های کمانی (ARC) ، هسته ای مجاور بطنی (PVN) ، بخش های جانبی هیپوتالاموس (LHA) ، هسته های بطنی میانی (VMH) و هسته های خلفی میانی (DMH). در ARC دو دسته اصلی نورون که به وضعیت تغذیه ای حساس هستند و جود دارند . یکی دسته از ان ها دریافت غذا و اشتها را تحریک و دسته دیگر ان را مهار می کنند ]41[. هسته های بطنی میانی (VM) به عنوان « مرکز سیری» و هسته های جانبی هیپوتالاموس (LH) عنوان «مرکز گرسنگی» شناخته شده اند. هسته های کمانی (ARC) هیپوتالاموس نیز به عنوان محلی که این سیگنال های تنظیمی اشتها را یکپارچه می کند شناخته شده است ]42[ .

شکل 2 – 2) طراحی شماتیک ساده از مناطق هیپوتالاموس که در مصرف مواد غذایی نقش اصلی ایفا می کند.]41[
2-2-4:هیپوتالاموس
برای حفظ یک وزن در یک دوره زمانی نسبتاً طولانی همواره باید توازنی بین دریافت غذا و هزینه انرژی برقرار باشد. هیپوتالاموس اولبین مرکزی است که حدود 50 سال قبل نقش ان در این فرایند شناخته شد. در اوایل دهه 1940 نشان داده شد که تزریق یا ایجاد تحریک در هسته های ویژه ای از هیپوتالاموس باعث تغییر در رفتار تغذیه ای و دریافت غذا می شود. در هیپوتالاموس هسته های بطنی میانی (VMH) ، به عنوان «مرکز گرسنگی» شناخته شده اند. هسته های کمانی (ARC) هیپوتالاموس نیز به عنوان محلی که این سیگنال های تنظیمی اشتها را یکپارچه می کنند شناخته شده است. چرخه های عصبی متعددی در هیپوتالاموس قرار دارد. بر اساس دانسته های ما شبکه های عصبی و انشعابات آنها در داخل هیپوتالاموس قرار دارد. بر اساس دانسته های ما شبکه های عصبی و انشعابات آنها در داخل هیپوتالاموس گسترش پیدا می کنند و اجتماعات عصبی مجزا، نروترانسمیترهای ویژه ای را ترشح کرده که بردریافت غذا و یا هزینه کرد انرژی اثر گذاشته که خود توسط سیگنال های خاص وضعیت تغذیه ای تنظیم می شوند. سیگنال های محیطی درگیر در تهادل انرژی، از قبیل هورمون های روده ای مثل پپتاید YY و GLP-1 از طریق یک مکانیسم فیرقابل اشباع از سد خونی- مغزی گذشته و بنابراین به ARC می رسند. البته سیگنال های دیگری از قبیل لپتین و انسولین از طریق یک مکانیسم قابل اشباع از خون به مغز می رسند. بنابراین سد خونی – مغزی یک نقش تنظیمی پویا در عبور دادن برخی سیگنال های انرژی گردش خون دارد. در ARC دو دسته اصلی نرون که به وضعیت تغذیه ای حساس هستند ، وجود دارند . یک دسته از انها دریافت غذا و اشتها را تحریک و دسته دیگر ان را مهار می کنند عوامل اشتها آور و شد اشتها به ترتیب فعالیت سیستم عصبی سمپاتیک را کاهش و افزایش می دهند و به موجب آن ذخایر چربی بدن و هزینه انرژی را تنظیم می کنند . این عمل از طریق تغییر گرمازایی در BAT و احتمالاً در محل های دیگری از قبیل بافت سفید چربی وعضله، از طریق القاء پروتئین جفت نشده میتوکندریایی یک UCP-1 و UCP-2 و UCP-3، انجام می شود. ارتباط بین دریافت غذا و فعالیت سمپاتیک از طریق مواد انتقال دهنده عصبی متعددی صورت می گیرد. نروپتایدها عناصر مهم سیستم تنظیم کننده دریافت غذا هستند. هورمون ها ، انتقال دهنده های عصبی و نروپتایدهایی که بر دریافت غذا اثر می گذارند. مولکول های تحریک کننده اشتها شامل نوراپی نفرین، گاما آمینو بوتیریک اسید و هفت دسته از نروپتایدها هستند، در حالی که مولکول های مهار کننده غذا اشتها شامل سروتونین، دوپامین و تعداد زیادی از پپپتایدهای روده ای – مغزی هستند ]42[ .
2-2-5:سیگنال های عصبی و هورمونی کنترل اشتها
در موجودات تکامل یافته، نظیر انسان سیستم تنظیم دریافت غذا شامل دو بخش شبکه تنظیم اشتها و سیگنال های عصبی و هورمونی ارسالی از نواحی مختلف بدن به شبکه تنظیم اشتها می باشد که بخش اول از نورون های ایجاد کننده اشتها یا نورون های اورکسیژنیک و نورون های ایجاد کننده بی اشتهایی یا نورون های انورکسیژنیک تشکیل شده است که همگی در هسته های مختلف هیپوتالاموس قرار دارند و این دو دسته نورون شبکه تنظیم اشتها با یکدیگر در ارتباط هستند و بر فعالیت یکدیگر اثر می گذارند ]43[ . بنابراین عوامل تنظیمی متعددی چون هسته های مختلف هیپوتالاموس واقع در سیستم عصبی مرکزی، ذخایر انرژی و هورمون ها در تنظیم اشتها و دریافت غذا بصورت دراز مدت وکوتاه مدت دخالت دارند . در انسان انتقال دهنده های سیستم عصبی و پپتیدهای روده ای متعددی از عوامل مهم تنظیم اشتها می باشند]44[. اکثر مطالعات انجام گرفته در زمینه اشتها و دریافت غذا، روی دو هورمون لپتین و گرلین متمرکز است. این دو هورمون بعنوان تنظیم کننده های اصلی شبکه تنظیم اشتها و دریافت غذا درهسته های مختلف هیپوتالاموس مطرح هستند]45[.
هورمون لپتین محصول ژن چاقی است که در تنظیم فرایندهای متابولیک دخیل است و نمایانگر میزان ذخیره چربی بدن است . این هورمون با گیرنده های ویژه ای در هیپوتالاموس و با مهار باعث کاهش اشتها می شود و از طرف دیگر ترشح نوروپپتید Y با افزایش فعالیت سیستم عصبی سمپاتیک و لیپولیز موجب افزایش میزان متابولیسم بدن، میزان انرژی مورد نیاز و در نتیجه میزان چربی بدن را کنترل می کند]46[.
گرلین به عنوان یک لیگاند درون زاد برای گیرنده ترشح دهنده هورمون رشد مطرح است. سلول های غده اکسینتیک موکوس فوندوس معده منبع اصلی این پپتید اشتها آور است ]47[. مطالعات گذشته نشان داده است درحالی که تزریق انسولین در برخی از هسته های هیپوتالاموس سیستم اعصاب مرکزی دریک روش وابسته به دوز بعد از ورود به فضای بین سلولی درمغز به رسپتورهای خود نظیر نورون های، نوروپپتید Y متصل و آن را مهار می کند و یا از طریق تحریک انتقال دهنده عصبی α –MSH به دلیل افزایش تولید وترشح لپتین سبب کاهش دریافت غذا می شود ولی افزایش سطح سرمی انسولین (به صورت محیطی) در صورتیکه باعث کاهش غلظت گلوکزخون شود می تواند اشتها را تحریک نماید ]48[.

شکل 2 – 3 ) گردش هورمون های موثر بر تعادل انرژی از طریق هسته کمانی ]44[
2-2-6:سیستم کنترل مرکزی
سیگنال های نماینده چاقی در CNS یکپارچه می شوند. در داخل CNS دریافت غذا و تنظیم وزن به طور موثری انجام می شود. در CNS و بطور اختصاصی در هیپوتالاموس دو سیستم موثر آنابولیک و کاتابولیک وجود دارد که وزن بدن و توده چربی را تنظیم می نمایند . مسیرهای که سیگنال های چاقی از لپتین (مترشحه از آدیپوسیت ها) و انسولین (مترشحه از پانکراس ) با چرخه های خودکار مرکزی اندازه غذا را تنظیم می کنند.لپتین و انسولین مسیر کاتابولیک (نرون های POMC/CART ) را تحریک و مسیر آنابولیک (نرون های NPY/AGRP ) که از ARC منشأ می گیرندۀ را مهار می کنند. درون دادهای آوران وابسته به سیری از کبد و مجاری معده ای ـ روده ای و از پپتیدهایی مثل CCK از طریق عصب واگ و تارهای سمپاتیک به NTS ، یعنی جای که با درون دادهای پایین رونده هیپوتالاموس یکپارچه می شوند. برون داد عصبی خالص از NTS و سایر نواحی بصل النخاع و مخچه مغز منجر به خاتمه غذا خوردن می شوند. کاهش درون دادهای از سیگنال های چاقی ( در حین کاهش وزن ناشی از رژیم) بنابراین باعث افزایش اندازه غذا به وسیله کاهش پاسخ های ساقه مغز به سیگنال های سیری می شوند]4[.
مسیر های که سیگنال های جاقی از لپتین (مترشحه از آدیپوسیت ها) و انسولین (مترشحه از پانکراس) با چرخه های خودکار مرکزی اندازه غذا را تنظیم می کنند. لپتین و انسولین مسیر کاتابولیک (نرون های POMC/CART ) را تحریک و مسیر آنابولیک (نرون های NPY/AGRP ) که از ARC منشأ می گیرند ، را مهار می کنند. درون دادهای آوران وابسته به سیری از کبد و مجاری معده ای-روده ای و از پپتیدهایی مثل CCK از طریق عصب واگ و تارهای سمپاتیک به NTS ، یعنی جای که با درون دادهای پایین رونده هیپوتالاموس یکپارچه می شوند. برون داد عصبی خالص از NTS و سایر نواحی بصل النخاع و مخچه مغز منجر به خاتمه غذا خوردن می شوند. کاهش درون دادها از سیگنال های چاقی (درحین کاهش وزن ناشی از رژیم) بنابراین باعث افزایش اندازه غذا به وسیله کاهش پاسخ های ساقه مغز به سیگنال های سیری می شوند. ]4[.

جدول 2-1- مولکول های سیگنالی کاندید در هموستاز انرژی در CNS ]39[.
سیستم موثر آنابولیک باعث افزایش دریافت غذا، اکتساب وزن، کاهش هزینه انرژی و برعکس سیستم موثر کاتابولیک باعث کاهش دریافت غذا ، از دست دادن وزن و افزایش هزینه انرژی می شود .
2-2-7:کنترل محیطی اشتها
سیگنال های محیطی درگیر در تعادل انرژی، از قبیل هورمون های روده ای مثل پپتاید و GLP1 از راه یک مکانیسم غیرقابل اشباع از سدخونی- مغزی گذشته و بنابراین به ARC می رسند. البته سیگنال های دیگر از قبیل لپتین و انسولین از راه یک مکانیسم قابل اشباع از خون به مغز می رسند. بنابراین سد خونی- مغزی یک نقش تنظیمی پویا در عبور دادن برخی سیگنال های انرژی گردش خون دارد ]49[.
گرلین اولین هورمونی است که به دنبال تزریق محیطی موجب افزایش غذا خوردن می شود. در انسان ها گرلین پلاسمایی قبل زا هر وعده غذا افزایش ناگهانی و پس از صرف هر وعده غذایی به صورت کوتاهی سقوط می کند. این یافته ها دلالت بر این دارند که گرلین سممکن است به عنوان یک شاخص تعادل انرژی کوتاه مدت تلقی شود و ممکن است به عنوان یک مولکول سیگنالینگ در طول مدت زمان تخلیه انرژی در نظر گرفته شده است ]49[.

شکل 2-4 ) تنظیم مصرف غذا بوسیله ی هورمون های محیطی و مسیرهای سیگنالینگ مرکزی انها.]45[
2-3 :تنظیم کننده های وزن و متابولیسم بدن
گزارش ها نشان که وزن و متابولیسم بدن توسط نوروپپتید ها و هورمون های متعددی کنترل و تنظیم می شود.که به اختصار به توضیح برخی از مهمترین آنها می پردازیم.
2-3-1:نروپپتایدها
2-3-1-1: نوروپپتید Y (NPY)
NPY یک پپتید 36 اسید آمینه ای و یکی از فراوان ترین و گسترده ترین (از لحاظ توزیع) عوامل انتقال دهنده عصبی در مغز پستانداران می باشد. ARC محل اصلی بیان NPY در داخل نرون های هیپوتالاموس می باشد. هر چند NPY پس از تزریق مرکزی اثرات گوناگونی روی رفتار و عملکرد به جا می گذارد. ولی قابل توجه ترین اثر آن تحریک غذا خوردن است. تزریق چندباره NPY به داخل PVN یا دهلیزهای مغزی باعث چاقی می شود که نشان دهنده آن است که NPY قادر به مهار سیگنال های مهار کننده دریافت غذا می باشد. NPY باعث تعادل مثبت انرژی از طریق افزایش دریافت غذا می شود و همچنین باعث کاهش هزینه انرژی از طریق کاهش گرمازایی در BAT و همچنین تسهیل ذخیره چربی در بافت سفید چربی از طریق افزایش فعالیت انسولین می گردد ]50[. NPY در ARC سنتز شده و به داخل PVN ترشح می شود و توسط سیگنال های مثل لپتین، انسولین (که هر دو مهار کننده) و گلوکورتیکوئیدها (فعال کننده)، تنظیم می شود. سنتز و ترشح NPY در مدل های با شرایط کمبود انژژی یا افزایش نیازهای متابولیکی از قبیل گرسنگی ، دیابت وابسته به انسولین، شیردهی و فعالیت بدنی افزایش می یابد. نقش فیزیولوژیکی اصلی نرون های ARC ، NPY، احتمالا برقراری مجدد تعادل انرژی و ذخایر چربی بدن در شرایطی است که بدن با کمبود انررژی مواجه است. علیرغم شواهد کافی برای نشان دادن نقش کلیدی NPY در هموستاز انرژی، عجیب این است که در موش های که ژن NPY آنها کاملا حذف شده بود دارای فنوتیپ نرمال بودند به جز اینکه مستعد به جمله ناگهانی شده بودند. بنابراین هنوز کاملا مشخص نیست که آیا NPY فقط در شرایط حادی از قبلی موش های تراریخته ob/ob در پراشتهایی یا چاقی نقش دارد یا آیا فنوتیپ نرمال به علت مکانیسم های جبرانی توسط سایر سیگنال های اشتهاآور است که جایگزین NPY می شوند و به حفظ تغذیه طبیعی و تنظیم وزن کمک می کنند ]51[.

شکل 2-5) فعال سازی سلول های عصبی NPY / AGRP دارای یک اثر اشتهاآور، در حالی که فعال سازی سلول های عصبی POMC / CART اثر ضد اشتهای می باشد.
2-3-1-2: ارکسین ارکسین اخیرا به عنوان دسته ای از نروپپتیدها شناخته شده که همچنین تحت عنوان هیپوکرتینز نامگذاری می شود. ارکسین A و B به ترتیب دارای 23 و 28 اسید آمینه بوده و 46 درصد مشابهت دارند. هر دو پپتید توسط یک ژن کدگذاری شده و در نرون های خلفی و جانبی هیپوتالاموس قرار دارند. تزریق ارکسین A به طور معنی داری موثرتر از ارکسین B می باشد. البته اثر ارکسین بر تحریک غذا خورئن از اثر NPY خفیف تر است. ارکسین احتمالا بیشتر درگیر کنترل متابولیسم انرژی است تا دریافت غذا . ناشتایی باعث تظاهر افزایش ژن ارکسین در هیپوتالاموس می شود ]49[.
2-3-1-3: گالانین
گالانین یک پپتید 29 اسیدآمینه ای است که در دسته ی نورونی PVN , DMH , ARC توزیع شده است. گالانین دریافت غذا در موش های صحرایی پس از تزریق به داخل CV و همچنین VMH , LH , PVN و هسته های مرکزی آمیگدال را تحریک می کند. همانند MCH و ارکسین، غذا خوردن ناشی از گالانین ضعیف تر از NPY بوده و تزریق مداوم گالانین اثری بر حفظ چاقی یا پراشتهایی ندارد. از لحاظ آناتومیکی و عملکردی ارتباط نزدیکی بین نرون های تولید کننده گالانین وسایر سیگنال های اشتهاآور وجود دارد. هر چند سیستم NPY ارتباط نزدیکی با مصرف و هضم کربوهیدرات ها دارد، گالانین احتمالا در وهله اول در کنترل مصرف چربی ها و افزایش ذخیره بافت چربی از طریق کاهش در هزینه کرد انرژی دخالت دارند. گالانین در حین دوره میانی چرخه غذایی طبیعی فعال شده و یک رژیم با چربی بالا می تواند تولید گالانین را در PVN افزایش داده که ارتباط نزدیکی با چاقی بدن دارد ]49[.
2-3-1-4: نوروپتیید w-23
نوروپتیید W-23 که در ده اخیر کشف شده از 23آمینو اسید تشکیل شده است.که در تنظیمات تغذیه ای و هورمونی مشارکت دارد. مطالعات نشان می دهد ، تزریق داخل بطن مغزی NPW23 باعث افزایش جذب غذا و تحریک آزادسازی پرولاکتین]52[ و کورتیکوسترون ]53[ در موش صحرایی می شود،همچنین تحقیقات آزمایشگاهی نشان داده که افزایش غلظت NPW23 ، به طور قابل توجهی بر پرولاکتین، هورمون رشد و انتشار ACTH از سلولهای هیپوفیز قدامی را تغییر می دهد ]53[.
2-3-2:هورمون ها
2-3-2-1:گرلین
گرلین برای اولین بار در سال 1999 توسط کوجیما و همکارانش از معده موش جداسازی شد و به عنوان لیگاند درونی برای گیرنده GHS-Ra مطرح گردید. گرلین به هنگام گرسنگی به مقدار زیادی در سلولهای مخاط معده و به مقدار اندکی در سایر اندام ها از جمله مغز، هیپوفیز، سلولهای لایدیگ و سلولهای سرتولی نیز به نسبت کمتر تولید می شود ]54[. مطالعات نشان داده گرلین علاوه بر افزایش هورمون رشد ]55[ سبب افزایش تخلیه معده، افزایش اشتها، افزایش وزن بدن ]56[ تحریک ترشح ACTH ، مهار LH 6 و کاهش غلظت هورمون های تیروئیدی می شود ]57[. تزریق گرلین از طریق افزایش بیان ژن ها ی AgRP و NPY در هستۀ ARC هیپوتالاموس که نورونهای آنها مستقیماً بر روی TRH گیرنده دارند سبب کاهش هورمونهای تیروییدی می شوند ]58[.

شکل 2-6) گرلین قبل و بعد از دریافت غذا
2-3-2-2:ابستاتین
زانگ و همکاران (۲۰۰۵) پپتید ۲۳ اسید آمینه ای دیگری به نام ابستاتین را شناسایی کردند. این پپتید از ژن سازنده ی گرلین مشتق شده که بعد از ترجمه، دستخوش تغییرات متفاوتی شده است. یافته های بررسی ها نشان داد درمان جوندگان با ابستاتین منجر به تعادل انرژی منفی از راه کاهش دریافت غذا و تخلیه ی معده می شود. بنابراین برخی پژوهشگران به این نتیجه رسیدند که گرلین و ابستاتین اثرات متضادی بر تنظیم وزن دارند و ممکن است عملکرد نامطلوب ابستاتین در پاتوفیزیولوژی چاقی درگیر باشد.]59[
پژوهش قنبری نیاکی و همکاران نشان داد کسر و گلیکوژن کبدی ناشی از تزریق اتیونین در موش ها ATP منجر به افزایش سطح گرلین پلاسما می شود که می تواند به عنوان یک آغازگر مهم دریافت غذا مد نظر قرار گیرد؛ هم چنین مشاهده شد سطح ابستاتین پلاسما مورد تاثیر و گلیکوژن کبد نیست و انجام تمرین های ATP کاهش ورزشی نیز نتوانست این نتیجه را مورد تاثیر قرار دهد. پژوهشگران این گونه نتیجه گیری کردند که گرلین نسبت به ابستاتین به کسر انرژی کبد حساس تر است ]60[. گائو و همکاران(2009) انجام پژوهشی روی زنان و مردان چاق دریافتند سطح گرلین و ابستاتین آزمودنی های چاق پایین تر، اما نسبت گرلین به ابستاتین آنها از آزمودنی های با وزن طبیعی بالاتر بود ]61[.
زامرازیلوا و همکاران (۲۰۰9) نیز نسبت سطح گرلین به ابستاتین پلاسما را در زنان با وزن طبیعی، چاق و دچار بی اشتهایی عصبی اندازه گیری نمودند. یافته ها نشان داد نسبت سطح گرلین به ابستاتین در زنان با بی اشتهایی عصبی به طور معنی داری بالاتر از سایر گروه ها بود ]62[. در کل نقش واقعی ابستاتین در سازوکار چاقی هنوز مشخص نیست، اما تعادل بین گرلین و ابستاتین نقش مهمی در سازوکار چاقی و بیماری های متابولیکی ایفا می کند]63[.
2-3-2-3:لپتین
لپتین، پروتئین 167 اسید آمینهای است که در تنظیم فرآیندهای متابولیک دخالت دارد و نمایانگر ذخیره چربی بدن است]64[ برخی از پژوهشگران لپتین را عامل هشدار دهنده در تنظیم محتوای چربی بدن ذکر کرده اند ]65[ لپتین پس از تولید در بافت چربی به داخل خون ریخته می شود . در سد خونی مغز ناقل هایی وجود دارد که باعث ورود لپتین به دستگاه عصبی مرکزی شده و با شرکت در سرکوب سنتز نوروپپتیدهایی از قبیل نوروپپتیدy (عامل افزایش اشتها)، باعث کاهش اشتها می شود]66[ . بنابراین اثر خالص عملکرد لپتین در جهت کاهش وزن است اما کمبود این هورمون و یا مقاومت نسبت به آثار آن، هر دو می تواند سبب افزایش وزن شوند]67[ .
پژوهش استاد رحیمی و همکاران روی زنان چاق، نشان داد توده بافت چربی از پیشگویی کننده های اصلی غلظت لپتین بوده و همبستگی معنی داری بین توده چربی و لپتین وجود دارد ]68[ نتایج پژوهش ضرغامی و همکاران نشان داد که مقادیر سرمی لپتین در زنان چاق حدود 3 برابر زنان با وزن طبیعی بوده و همبستگی مستقیمی بین لپتین و شاخص توده بدن وجود دارد ]69[. همبستگی بین غلظت سرمی لپتین با شاخص توده بدن، درصد و توده چربی بدن، ذخایر مختلف چربی و همچنین ضخامت چربی زیر پوستی در تحقیقات دیگر نیز مشاهده شده است ]70[ این همبستگی در زنان چاق 3 برابر بیش تر از مردان چاق است ]71[.
87630-80645
شکل 2- 7 ) لپتین به عنوان بخشی از یک حلقه بازخورد به حفظ ذخائر ثابت از چربی عمل می کند. از دست دادن چربی بدن منجر به کاهش در لپتین، که مولکول های تغذیه محرک در هیپوتالاموس، مانند NPY را فعال می سازد. در مقابل، افزایش چربی بدن منجر به افزایش لپتین، که مولکول های تغذیه بازدارنده مانند MC را فعال می سازد. ]49[
2-4: نوروپتیید w
نوروپتیید w که اولین بار از هیپوتالاموس خوک جدا شده به دو شکل وجود دارد که شامل نوروپتیید 23- w (NPW23) یا نوروپتیید 30- w (NPW30) که 23 و 30 نشان از تعداد آمینو اسید تشکیل دهنده آن است.این نوروپتییدها به یکی از دو دریافت کننده NPW ، شامل GPR7 (NPBWR1) و GPR8(NPBWR2) متصل می گردد که به خانواده ی گروه پروتیین G تعلق دارند. GPR7 در مغز و قسمت های بیرونی و خارجی بدن انسان و جانوران جونده وجود دارد، در حالیکه GPR8 در جانوران جونده وجود ندارد . mRNA GPR7 در جانوران جونده به شکل گسترده ای در بسیاری از مناطق هیپوتالاموس ، شامل قسمت بطنی ، بصری ، میانی جلویی ، پشتی ، فوقانی وقسمت های قوس داربیان شده است .
مشاهدات نشان می دهد که GPR7 نقش مهم و حیاتی در تعدیل عملکرد غده های درون زا و عصبی ایفا می کند. تزریق بطنی مغزی NPW نشان داده شده که مانع جذب غذا شده و در وزن بدن اختلال ایجاد می نماید و موجب افزایش تولید گرما و حرارت و دمای بدن می شود، این نشان می دهد که NPW به عنوان یک مولکول نشانگر کاتابولیسم درونی عمل می کند ]72[.
2-4-1:گیرنده های NPW
در سال 1995 ، ادد و همکارانش از الیگونکلوتیدهای بر مبنای گیرنده ی اپیوئیدی و همینطور گیرنده ی سوماتواستاتین جهت شناسایی دو ژن GPR7 و GPR8 استفاده کردند.که پیش بینی می شود این دو دریافت کننده مسئول کد گذاری گروه پروتئینی G درون مغز انسان هستند. mRNA GPR7 در مغز انسان و جانوران جونده نشان داده شده ، در حالیکه ژن GPR8 در مغز انسان و خرگوش و نه جانوران جونده شناسایی شده است ]73[. در سال 2002، شیمومورا و همکارانش لیگاندهای درون زا را در مورد-8 GPR7 با در معرض قرار دادن سلول های تخمدان موش های چینی (CHO) با ذره های هیپوتالامیک خوک، تغییراتی در سطح CAMP مشاهده نمودند. علاوه بر این، وقتی بیان سلول GPR7 یا GPR8با عصاره ی هیپوتامیک القا شد تولید CAMP ناشی از فورسکولین متوقف می شود. این دریافت کننده ها به دریافت کننده های گروه پروتیینی Gi متصل بودند ]52[.
تجزیه و تحلیل ساختاری بیشتر در مورد لیگاندهای مسئول مهار تولید cAMP منجر به شناسایی یک پپتید جدید به نام NPW گردید. شیمومورا و همکاران توالی پپتید بالغ 23 و30 آمینو اسید باقی مانده از خوک ، موش و انسان را شناسایی کردند.NPW به دو شکل بالغش : NPW30 (شامل 30 آمینو اسید) و NPW23 (شامل 23 آمینو اسید) نام گذاری شده است که در ژن انسان بوسیله تاناکا و همکاران (2003) شناسای شد ]72[.

شکل 2- 8) فرق نوروپتیید 23- w و نوروپتیید 30- w ( انسان ، خوک ، رت ، موش)].72[
2-4-2: توزیع مرکزی NPW
بر اساس آنالیز RT-PCR ، برزلین و همکارانش (2003)گزارش داده اند که ژن NPW در سیستم عصبی مرکزی انسان مانند جسم سیاه و نخاع ، و در حد متوسط ​​در هیپوکامپ، آمیگدال، جسم پینه ای هیپوتالاموس ، مخچه و ریشه پشتی نخاع بیان شده است. شیمی سلولی هیبریداسیون در جوندگان نشان داده است که ژنNPW در چند مناطق محدود مغزی شامل PAG، هسته EW و هسته پشتی جنین توزیع شده است ]74،53،10 [. در حالی که کیتامورا و همکاران،( 2006) گزارش داده اند که این موضوع به هسته های خاصی در مغز میانی و ساقه مغز محدود می شود. با این حال، بر اساس تجزیه و تحلیل RT-PCR، گزارش داده اند که NPW mRNA در قسمت PVN، VMH ، ARC و LH موش بیان می شود]75[.مطالعه دیگری نیز حاکی از توزیع NPW در قسمت های متعددی از مغز موش صحرایی بوده است ]76[.
مطالعات ایمونوهیستوشیمی نشان داده است که NPW-LI به طور عمده در مناطق هیپوتالاموس، ARC و غده هیپوفیز خلفی ، با یک سطح پایین تر در PVN مشاهده شده است. جالب این است که سلول های NPW-LI هیپوتالاموس نر نسبت به ماده بیشتر است ]76[. در مطالعه دیگری، کیتامورا و همکاران (2006) از استقرار زیادی از NPW-LI را در سلول مغز میانی، شامل PAG و EW خبر داده اند. علاوه بر این، آنها برای اولین بار حضور NPW-LI و فرآیندهای آن را در PVN، VMH و آمیگدال در سطح میکروسکوپ الکترونی شناسایی و بررسی کرده اند]77[. همچنین، رشته های عصبی NPW-LI به وفور در مغز میانی و در دستگاه لیمبیک، از جمله CEA و BST توزیع شده بود، این امر نشان می دهد که NPW ممکن است در فرایند تعدیل ترس و اضطراب و همچنین در رفتار تغذیه نقش مهمی ایفا کند]78،77،76،75[.
2-4-3: توزیع محیطی NPW
در بافت های محیطی، NPW در نای ، در سلول سرطانی لنفوسیت نابالغ کلیه جنین و سرطان روده بزرگ بیان می شود]79[.سلول های وابسته به قشر غده فوق کلیوی نیز NPW تولید می کند]78[.هوکل وهمکاران (2006) گزارشی مبنی بر توزیع NPW در تیروئید و غدد پاراتیروئید، پانکراس، غدد آدرنال، تخمدان و بیضه در موش ارائه کردند.درحالیکه روکینیسکی و همکاران (2007) واکنش پذیری ایمنی NPW در تمام سلول های پانکراس شامل سلول های A ،B وD رانشان داده اند. درمقابل ، دزاکی و همکاران ( 2008) واکنش پذیری ایمنی NPW را در سلول های B ، و نه سلول های A یا D یافتند. بعلاوه NPW mRNA در سیستم ادراری تناسلی از جمله کلیه، بیضه ها، رحم، تخمدان، و جفت توزیع شده است ]80[.
بر اساس انالیز RT-PCR ، از حضور ژنNPW در در غده هیپوفیز، غده فوق کلیوی و معده را تایید کرد ]81[. این مشاهدات نشان می دهد که NPW ممکن است نقش مهمی در تنظیم سیستم غدد درون ریز را در پاسخ به استرس و همچنین در فعال شدن محورهیپوتالاموس هیپوفیز فوق کلیوی (HPA) ایفا کند ]81،82[.
2-4-4: توزیع GPR7-8
تجزیه و تحلیل RT-PCR در انسان نشان داد که ژن GPR7 به شدت در آمیگدال، هیپوکامپ، نئوکورتکس، و هیپوتالاموس بیان می شود ]73[. مطالعات مربوط به شیمی سلولی نشان داده است که ژن GPR7 در هیپوتالاموس موش، از جمله ARC، VMH، PVN و DMH، موجود است .ایشیی و همکاران (2003) گزارش داده اند که از بین بردن NPBW1 باعث پر خوری و توسعه چاقی می شود. سینگ و همکاران (2004) از دریافت کننده ی رادیوگرافی [125I]-NPW استفاده کرده و توزیع قابل توجهی از NPBW1 در آمیگدال موش و هیپوتالاموس، و همچنین در BST، MPA ، PAG ، ارگان سابفورنیکال و سطوح خاکستری رنگ سوپریور کولیکلوس ( قسمتی از مغز میانی) را نشان دادند. به طور کلی، GPR7 در سطح وسیعی در آمیگدال بیان می شود ]84،83،74[. اگر چه BST بالاترین سطح بیان GPR7 در پستانداران کوچک را نشان داده است، این پدیده در انسان ثابت نشده است. کیتامورا و همکاران ( 2006) گزارش کرده اند که GPR7 بیشتر در CeA و BST، موش صحرایی توزیع شده است که این امر ممکن است نشان دهد که GPR7 در تنظیم استرس، احساسات، ترس و اضطراب دخالت دارد. از طرف دیگر ژن های GPR7-8 در غده هیپوفیز و غده فوق کلیوی ( قشری و مرکزی ) بیان شده است ]72[ . این مشاهدات نشان می دهد که GPR7-8 ممکن است در پاسخ به استرس از طریق محور HPA درگیر باشد]82 [.
زیلوکوسکا و همکاران (2009 ) اخیرا آزمایشی مبنی بر توزیع و عملکرد NPW، NPB، و GPR7 در سلول های مانند یاخته ی استخوانی موش صحرایی و همچنین نتایج آن را که حاکی از تاثیر مستقیم بر روی تکثیر سلول ها بود را انجام دادند. NPB در پستانداران بزرگ، و همچنین در خرگوش شناسایی شده است، اما در موش صحرای و هیچ یک از موش ها بیان نشده است. تجزیه و تحلیل RT-PCR نشان داده است که ژن GPR8 است که به شدت در آمیگدال، هیپوکامپ، غده هیپوفیز، غده فوق کلیوی و بیضه ها و همچنین در سلول های قشری در غدد فوق کلیوی بیان شده است ]72[ .
2-4-5: تنظیم تغذیه ومتابولیسم انرژی بوسیله NPW
حذف GPR7 در موش های باعث پرخوری و کاهش مصرف انرژی می شود. این امر نشان می دهد که NPW ممکن است به عنوان یک تعدیل کننده تغذیه عمل کند. تزریق داخل بطن مغزی NPW در موشهای صحرایی نر باعث افزایش جذب غذا طی 2 ساعت اول در فاز نور می شود ]52[. همچنین لوین و همکاران (2005) گزارش کرده اند که تزریق NPW به PVN مصرف مواد غذایی را افزایش می دهد . این نتایج نشان می دهد که NPW به عنوان یک پپتید اشتها آور حاد عمل می کند. با این حال، موندال و همکاران (2003) گزارش کرده اند که هر دو شکل NPW باعث سرکوب تغذیه در فاز تاریک می شود،این نشان می دهد که اثر NPW در مورد تغذیه متفاوت است بسته به اینکه آیا حیوانات در نور و یا فاز تاریک نگهداری می شود]72[.
مطالعات عصبی انجام شده نشان داد که رابطه عصبی بین NPW و دیگر نوروپپتید های درگیر در تنظیم تغذیه باعث فعل و انفعالات عصبی بسیار نزدیک بین رشته های عصبی حاوی NPW و ارکسین یا هورمون MCH و رشته های عصبی در مغز موش های صحرایی می شود ]85[. در حالی که لوین و همکاران (2005) نشان داد که توزیع c-fos در نورون های حاوی ارکسین در منطقه ی پریفورنیکل در LH بعد از تزریق NPW در داخل بطن مغزی (icv) رخ داده است. جالب این است، که آنها همچنین سلول های NPW-LI در VMH، را نیز شناسایی کردند که به عنوان یک مرکز سیری شناخته شده است ]75[.
تاثیر لپتین بر روی عصب در VMH ، باعث کاهش میزان جذب غذا می شود و دیت و همکاران (2010) گزارش داده اند که سلول های عصبی NPW-LI و گیرنده های لپتین در این منطقه از مغز متمرکز شده اند . بیان NPW نیز به طور قابل توجهی در OB / OB و db/db موش تنظیم می شود. بنابراین، NPW ممکن است نقش مهمی در متابولیسم تغذیه و انرژی داشته باشد، و به عنوان یک جایگزین برای لپتین عمل کنید ]9[. علاوه بر این، NPW جذب مواد غذایی را از طریق گیرنده ملانوکورتین – 4 کاهش می دهد ، این بیانگر این است که NPW ممکن است نورون ها حاوی POMC را فعال و نورون های حاوی NPY را در ARC مهار کرده به کنترل و تنظیم در تغذیه بپردازد ]9[.
58420241935
شکل 2- 9 ) تصویر شماتیک بر اساس یافته های مطالعات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تنظیم اشتها در هیپوتالاموس توسط سلول های عصبی NPW و پپتید مرتبط با تغذیه در هیپوتالاموس.]72[

—d1738

فهرست مطالب
عنوانصفحه
TOC h z t "تیتر اصلی,1,تیتر فرعی,2" فصل اول: مقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته1-1- مقدمه PAGEREF _Toc142951498 h 21-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگان PAGEREF _Toc142951499 h 31-2-1- گازهای حاصل از تخمیر PAGEREF _Toc142951500 h 31-2-2- اسیدهای چرب فرار PAGEREF _Toc142951501 h 51-2-3- نیتروژن آمونیاکی PAGEREF _Toc142951502 h 51-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبه PAGEREF _Toc142951503 h 61-3- میکروارگانیسم‌های شکمبه PAGEREF _Toc142951504 h 61-3-1- باکتری‌ها PAGEREF _Toc142951505 h 71-3-2- تک‌یاخته‌ها PAGEREF _Toc142951506 h 81-3-3- قارچ‌ها PAGEREF _Toc142951507 h 91-4- اهمیت گیاهان دارویی PAGEREF _Toc142951508 h 121-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی PAGEREF _Toc142951509 h 131-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهی PAGEREF _Toc142951510 h 131-5-2- ساختار ترشحی PAGEREF _Toc142951511 h 131-5-2-1- ساختار ترشحی خارجی PAGEREF _Toc142951512 h 131-5-2-2- ساختار ترشحی داخلی PAGEREF _Toc142951513 h 131-5-3- عوامل اکولوژیکی PAGEREF _Toc142951514 h 141-5-4- کشت و فرآوری گیاه PAGEREF _Toc142951515 h 141-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه PAGEREF _Toc142951516 h 141-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis) PAGEREF _Toc142951517 h 141-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum) PAGEREF _Toc142951518 h 181-6-3- گیاه zosima absinthifolia PAGEREF _Toc142951519 h 211-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l. PAGEREF _Toc142951520 h 231-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.) PAGEREF _Toc142951521 h 251-7- روش آزمون گاز PAGEREF _Toc142951522 h 28فصل دوم: مواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری PAGEREF _Toc142951525 h 302-1-1- منطقه نمونه‌برداری PAGEREF _Toc142951526 h 302-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاه PAGEREF _Toc142951527 h 302-2- آزمون گاز PAGEREF _Toc142951528 h 312-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گاز PAGEREF _Toc142951529 h 312-2-2- مایع شکمبه و بافر PAGEREF _Toc142951530 h 312-2-3- زمان‌های ثبت تولید گاز PAGEREF _Toc142951531 h 322-2-4- مزایا و معایب آزمون گاز PAGEREF _Toc142951532 h 322-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گاز PAGEREF _Toc142951533 h 332-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌ها PAGEREF _Toc142951534 h 332-2-7- تهیه مایع شکمبه PAGEREF _Toc142951535 h 342-2-8- تهیه بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc142951536 h 342-2-9- تهیه نمونه شاهد PAGEREF _Toc142951537 h 362-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌ها PAGEREF _Toc142951538 h 362-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌ها PAGEREF _Toc142951539 h 372-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدی PAGEREF _Toc142951540 h 382-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی PAGEREF _Toc142951541 h 382-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشت PAGEREF _Toc142951542 h 392-3-1-محیط کشت PAGEREF _Toc142951543 h 392-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همین PAGEREF _Toc142951544 h 412-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرار PAGEREF _Toc142951545 h 412-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره I PAGEREF _Toc142951546 h 412-3-5- محلول مواد معدنی شماره II PAGEREF _Toc142951547 h 412-3-6- تهیه محیط کشت PAGEREF _Toc142951548 h 422-3-7- توزیع محیط کشت PAGEREF _Toc142951549 h 422-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازی PAGEREF _Toc142951550 h 432-3-9- تهیه مایع شکمبه تازه PAGEREF _Toc142951551 h 442-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبه PAGEREF _Toc142951552 h 442-3-11- تلقیح و نگهداری کشت‌های انجام شده PAGEREF _Toc142951553 h 472-4- تخمین تعداد باکتری‌ها PAGEREF _Toc142951554 h 482-5- شمارش تک‌یاخته‌ها PAGEREF _Toc142951555 h 482-6- شمارش قارچ‌های بی‌هوازی PAGEREF _Toc142951556 h 49فصل سوم: نتایج3-1- فراسنجه‌های شکمبه PAGEREF _Toc142951558 h 513-2- مقایسه بین سطوح مختلف PAGEREF _Toc142951559 h 493-2-1- مقایسه بین سطوح عصاره Teucrium polium l (مریم نخودی) PAGEREF _Toc142951560 h 493-2-2- مقایسه بین سطوح عصاره Crambe orientale (سپیده) PAGEREF _Toc142951561 h 503-2-3- مقایسه بین سطوح عصاره Heracleum persicum (گلپر) PAGEREF _Toc142951562 h 513-2-4- مقایسه بین سطوح عصاره zosima absinthifolia (زوسیما) PAGEREF _Toc142951563 h 513-2-5- مقایسه بین سطوح عصاره Oregano vulgare L (پونه) PAGEREF _Toc142951564 h 513-2-6- تولید گاز بخش تجزیه‌پذیر سریع (a) PAGEREF _Toc142951565 h 533-2-7- تولید گاز بخش مواد نامحلول در آب و کند تجزیه در شکمبه (b) PAGEREF _Toc142951566 h 533-2-8- تولید گاز بالقوه (a+b) PAGEREF _Toc142951567 h 543-2-9- ثابت نرخ تولید گاز (c) PAGEREF _Toc142951568 h 553-3- تخمین جمعیت میکروبی شکمبه PAGEREF _Toc142951569 h 563-3-1- تخمین جمعیت باکتری‌ها PAGEREF _Toc142951570 h 563-3-1-1- تخمین جمعیت باکتری‌ها در ساعت صفر PAGEREF _Toc142951571 h 573-3-1-1-1- سطح 100 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951572 h 573-3-1-1-2- سطح 200 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951573 h 573-3-1-1-3- سطح 300 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951574 h 573-3-1-2- تخمین جمعیت باکتری‌ها در ساعت چهار پس از انکوباسیون PAGEREF _Toc142951575 h 573-3-1-2-1- سطح 100 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951576 h 573-3-1-2-2- سطح 200 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951577 h 583-3-1-2-3- سطح 300 میلی گرم بر لیتر PAGEREF _Toc142951578 h 583-3-1-3- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح هر عصاره PAGEREF _Toc142951579 h 583-3-1-3-1- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح هر عصاره در ساعت صفر PAGEREF _Toc142951580 h 583-3-1-3-1-1- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Crambe orientalis PAGEREF _Toc142951581 h 583-3-1-3-1-2- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Heracleum persicum PAGEREF _Toc142951582 h 583-3-1-3-1-3- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Zosima absinthi PAGEREF _Toc142951583 h 593-3-1-3-1-4- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Teucrium polium PAGEREF _Toc142951584 h 593-3-1-3-1-5- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Oregano vulgare PAGEREF _Toc142951585 h 593-3-1-3-2- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف هر عصاره در ساعت چهار PAGEREF _Toc142951586 h 593-3-1-3-2-1- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Crambe orientalis PAGEREF _Toc142951587 h 593-3-1-3-2-2- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Heracleum persicum PAGEREF _Toc142951588 h 593-3-1-3-2-3- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Zosima absinthi PAGEREF _Toc142951589 h 603-3-1-3-2-4- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Teucrium polium PAGEREF _Toc142951590 h 603-3-1-3-2-5- مقایسه جمعیت باکتری‌ها بین سطوح مختلف عصاره Oregano vulgare PAGEREF _Toc142951591 h 603-3-2- تخمین تعداد پروتوزوآ و قارچ‌ها PAGEREF _Toc142951592 h 60
فصل چهارم: بحث4-1- اثر عصاره‌ها بر قابلیت هضم و تولید گاز PAGEREF _Toc142951595 h 484-2- نحوه عمل عصاره‌ها PAGEREF _Toc142951596 h 514-3- اثر عصاره بر pH شکمبه‌ای PAGEREF _Toc142951597 h 524-4- اثر عصاره بر جمعیت میکروبی شکمبه PAGEREF _Toc142951598 h 534-5- ترکیبات شیمیایی عصاره‌های گیاهان دارویی PAGEREF _Toc142951599 h 574-6- نتیجه‌گیری کلی و پیشنهادها PAGEREF _Toc142951600 h 624-6-1- نتیجه‌گیری کلی PAGEREF _Toc142951601 h 624-6-2- پیشنهادها PAGEREF _Toc142951602 h 62منابع PAGEREF _Toc142951603 h 63

فهرست اشکال
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست اشکال,1" شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان PAGEREF _Toc142952501 h 4شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای PAGEREF _Toc142952502 h 8شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis L PAGEREF _Toc142952503 h 15شکل 1-4- گیاه گلپر PAGEREF _Toc142952504 h 19شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifolia PAGEREF _Toc142952505 h 22شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium polium PAGEREF _Toc142952506 h 24شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare L PAGEREF _Toc142952507 h 25

فهرست جداول
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست جداول;1" جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalis PAGEREF _Toc369168412 h 17جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A) PAGEREF _Toc369168413 h 34جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C) PAGEREF _Toc369168414 h 35جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B) PAGEREF _Toc369168415 h 35جدول 2-4- محلول ریزازورین PAGEREF _Toc369168416 h 35جدول 2-5- محلول احیاء کننده PAGEREF _Toc369168417 h 35جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc369168418 h 36جدول 2-7 PAGEREF _Toc369168419 h 45جدول 2-8 PAGEREF _Toc369168420 h 45جدول 2-9 PAGEREF _Toc369168421 h 45جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه PAGEREF _Toc369168422 h 46جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S) PAGEREF _Toc369168423 h 47جدول 3-1 گاز حاصل از تخمیر جیره و عصاره‌های گیاهان دارویی پس از 96 ساعت انکوباسیون PAGEREF _Toc369168424 h 51جدول 3-2- اثر سطوح مختلف پنج عصاره بر فراسنجه‌های تولید گاز PAGEREF _Toc369168425 h 52جدول 3-3- تعداد کل باکتری‌ها در هر میلی لیتر مایع شکمبه بعد از تاثیر عصاره‌ها PAGEREF _Toc369168426 h 56
فصل اولمقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1- مقدمهدر بین حیوانات اهلی گیاهخوار، نشخوارکنندگان سهم بزرگی را در تامین خوراک و سلامت بشر دارند. از طرفی تغذیه نقش اصلی را در بازده اقتصادی و عملکردی این دام‌ها داشته به طوری که تقریبا دوسوم از کل هزینه تولیدات دامی در واحدهای مختلف پرورش دام به هزینه‌های خوراک اختصاص داشته و از طرفی با توجه به مسئله کمبود پروتئین حیوانی و افزایش تولید با منابع علوفه‌ای موجود، لازم است تا از ارزش تغذیه‌ای منابع خوراکی قابل دسترس و مکمل‌های قابل استفاده به منظور افزایش راندمان تولید اطلاع کافی وجود داشته باشد (امیرخانی، 1386). از این رو اهمیت تغذیه مناسب نشخوارکنندگان ایجاب می‌نماید که ارزش غذایی هر یک از مواد خوراکی و اجزای تشکیل دهنده آنها طبق روش‌های صحیح و استاندارد تعیین گردد (قورچی، 1374).
معده حیوانات نشخوارکننده از چهار بخش شکمبه، نگاری، هزارلا و شیردان تشکیل گردیده است (آلاوونگ و همکاران، 2010). سه بخش اول فاقد هر گونه غده بوده و پیش معده نامیده شده و دو بخش آخر جایی است که هضم میکروبی یا تخمیر در آن صورت می‌پذیرد (منصوری و همکاران، 1381). شکمبه دارای انواع باکتری، پروتوزوآ و قارچ است اما باکتری در تمام جنبه‌های تخمیر شکمبه‌ای نقش غالب را بازی می‌کند (راسل و همکاران، 2002).
حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.


س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)
0/1

—d1794

3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-7- استخراج عصاره متانولی24
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل24
3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی25
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC26
3-8-1- آماده سازی نمونه26
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک27
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی27
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC29
3-9-1- آماده سازی نمونه29
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین29
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی30
3-10- مشخصات طرح31
3-11- تجزیه و تحلیل آماری31
فصل چهارم- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک34
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ34
4-1-2- تعداد برگ در بوته36
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها36
4-1-4- قطر ساقه37
4-1-5- قطر و طول ریشه37
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته.37
4-1-7-ارتفاع گیاه38
4-1-8- میزان کلروفیل38
4-2- صفات بیوشیمیایی39
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل39
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل42
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل44
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل46
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل48
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید50
4-4- نتیجه گیری کلی56
4-5- پیشنهادات56
منابع58
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- طبقه بندی ترکیبات فنلی12
جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک35
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن35
جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه36
جدول4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر40
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمایی مورد بررسی با دستگاه HPLC40
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه7
شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ، ب- فیروزجاه، پ- خشک کردن گزنه21
شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید25
شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین26
شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک28
شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک28
شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین30
شکل 3-7- کروماتوگرام استاندارد روتین31
شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ41
شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل41
شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه42
شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ43
شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل43
شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه44
شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ45
شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل45
شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه46
شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ47
شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل47
شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه48
شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ49
شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل49
شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ51
شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل51
شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه52
شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی52

1-1- مقدمه
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور است که امکان صادرات آن نیز وجود دارد. ایران از نظر آب و هوا در زمینه رشد گیاهان دارویی یکی از بهترین مناطق جهان محسوب می‌‌شود، به همین دلیل صادرات آن می‌‌تواند منبع بزرگی از درآمد برای کشور باشد (صمصام شریعت، 1382). بنابراین ضروریست تا با توجه به توان بالقوه بسیار خوب کشور در زمینه تنوع گیاهان دارویی، با شناخت گونه‌‌های گیاهی و دستیابی به اطلاعات لازم در مورد محل‌‌های رویش و خصوصیات بوم‌‌شناختی آن‌ها، گام‌‌های اساسی برای استفاده از اسانس‌‌های گیاهی و ترویج شیوه‌‌های اصولی بهره‌‌برداری از این گیاهان برداشته شود (حسنی، 1383).
گیاه دارویی به گیاهان و مشتقات آن‌ها گفته می‌‌شود که دارای مواد موثر مشخص است، در درمان بیماری یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می‌‌گیرد و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه‌‌های معتبر بین‌‌المللی ذکر شده باشد (دوازده امامی و مجنون‌‌حسینی، 1387).
فارماکوپه یک کتاب رسمی است که توسط دولت هر کشور و یا انجمن‌‌های پزشکی و داروسازی زیر نظر دولت به چاپ می‌‌رسد و حاوی حقایق علمی و اصول استاندارد‌‌سازی مواد دارویی از قبیل روش‌‌های جمع‌‌آوری مواد دارویی از منابع مختلف، آماده سازی، نگهداری، ترکیب و اختلاط داروهای مختلف و روش‌‌های اثبات آن‌ها می‌‌باشد. به علاوه این کتاب شامل دارو‌‌هایی با استعمال خارجی، نحوه نسخه‌‌نویسی، نحوه و مقدار تجویز دارو‌‌ها و اطلاعات کامل تهیه، ساخت و کاربرد داروهاست (دوازده امامی، 1382).
استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده‌‌های حاصل از آن‌ها نقش این گیاهان را در چرخه اقتصادی پر اهمیت کرده است. به طوری که مصرف رو به ازدیاد آن‌ها تنها به کشور‌‌های در حال توسعه محدود نشده است، بلکه اخیراً در کشور‌‌های توسعه یافته نیز جایگاه ویژه‌‌ای به خود اختصاص داده است. در اواخر قرن بیستم حجم مبادلات جهانی گیاهان دارویی به 200 میلیارد دلار بالغ گردیده است. بر اساس گزارش سازمان خوار و بار جهانی (FAO) ارزش صادرات گیاهان دارویی در سال 1995 بالغ بر 880 میلیون دلار بوده است. بر اساس گزارش بانک جهانی، حجم تجارت گیاهان دارویی تا سال 2050 بالغ بر 5 تریلیون دلار خواهد بود (امیدبیگی، 1384). در حالی که طی گزارشی میزان ارزش فروش گیاهان دارویی در ایران در سال 2000 میلادی تنها در حدود 37 میلیارد ریال برآورد شده است و این در حالی است که ایران جزء 8 کشور مهم دارای فلور متنوع گیاهان دارویی در دنیاست (قاسمی، 1389).
گزنه از مهمترین گیاهان دارویی است که از دوران ماقبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم آن زمان از آن برای تغذیه استفاده می‌کردند و از خواص درمانی آن اطلاع داشته‌اند. از کاربرد‌‌های دارویی آن می‌توان به کاهش قند خون، کاهش التهاب آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، درمان پروستات و اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق
تاثیر ارتفاع بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی (ریخت‌‌شناسی) گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اندام‌‌های گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گیاه گزنه چگونه است؟
1-3- فرضیهها
عوامل محیطی روی میزان ترکیبات ثانویه گیاه گزنه موثر است.
شرایط محیطی متنوع در زیستگاه‌های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیکی گیاه تاثیر می‌گذارند.
میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی تحت تاثیر ارتفاع قرار دارد.
1-4- اهداف
ارزیابی تاثیر اقلیم‌‌های مختلف بر صفات ریختی و عملکرد برخی مواد موثره گزنه.
معرفی بهترین ارتفاع و اندام دارویی گزنه از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی.
مقایسه برخی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی موجود درگزنه در ارتفاعات مختلف.
-76508-504458

2- بررسی منابع
2-1- گیاه‌شناسی گزنه
گزنه با نام علمی Urtica dioica از خانواده Urticaceae می‌باشد. گزنه، گیاهی است علفی، چند‌‌ساله، پایا، دوپایه و بندرت تکپایه، ریزوم‌‌دار، به ارتفاع 150-50 سانتیمتر، دارای کرک‌‌های گزنده، ساقه آن علفی، کمی زاویه‌‌دار و چهار پهلو، تقریباً ضخیم، ساده و یا خیلی کمانشعاب و پوشیده از کرک‌‌های گزنده، برگ‌‌ها نیزه‌‌ای، نیزه‌‌ای باریک، تخممرغی، تخممرغی پهن تا تقریبا دایره‌‌ای، نوک تیز یا نوک باریک، قاعده قلبی، باریک یا گوه‌‌ای، اندازه برگ 5/2-12×5/4-15 سانتیمتر، رنگ برگ‌‌ها سبز روشن است. برگ‌‌ها عموما گوشواره‌‌دار و گاه بدون گوشواره، متقابل و پوشیده از کرک‌‌های گزنده است. گل‌‌های آن، تک جنسی، بسیار ریز، سبز فام، مجتمع در توده‌‌های کوچک کروی، و واقع در طول محورهای خوشه‌‌ای شکل، گل‌‌های نر دارای 4 کاسبرگ هم اندازه و 4 پرچم با بساک‌‌های پهن دراز و قلوه‌‌ای شکل، ماده‌‌ها دارای 4 کاسبرگ متقابل صلیبی، دو کاسبرگ خارجی بسیار کوچک و گاهی گل فاقد آن و رنگ آن‌ها سبز مایل به زرد می‌‌باشد. گلآذین سنبله یا خوشهای مرکب، کرکی متراکم، گل‌آذین نر 4-11 سانتیمتر و ماده 5/1-9 سانتیمتر میباشد میوه آن فندقه تخم‌مرغی تا بیضوی و محتوی آلبومین روغن‌‌دار است. فندقه به طول 5/1 میلی‌‌متر و محصور در کاسه پایای گل می‌‌باشد (شکل 2-1)، (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ قهرمان، 1372).
تکثیر آن از طریق کاشت بذر در بهار یا تابستان و کاشت قطعات ریشه‌‌دار در پاییز صورت می‌‌گیرد (زرگری، 1383).

شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه (ویلر، 1981)
2-2- دامنه انتشار
این گیاه غالبا در اماکن مخروبه، باغ‌‌ها، و نقاط مرطوب خارج شهر و نواحی سایه‌‌دار و جاهایی که چهار‌‌پایان در آنجا به سر می‌‌برند، به حالت خودرو می‌‌روید. از ریشه‌‌‌‌های خزنده آن پاجوش‌‌هایی در کلیه جهات خارج می‌‌گردد که خود باعث می‌‌شود گیاه بصورت پایه‌‌های متعدد در آمده، تا محل رویش خود را به کلی فرا گیرد. انتشار عمومی گیاه گزنه در نقاط مرطوب ایران خصوصاً نواحی شمالی، غربی و مرکزی مانند اصفهان، شاهرود، بسطام و کاشان است (زرگری، 1376).
2-3- اندام‌های دارویی
برگ‌‌ها، ریشه، دانه و شیرابۀ گیاه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌‌دهند (زرگری، 1376). گلدهی آن از اواسط اردیبهشت تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد و بهترین زمان برداشت و جمع‌‌آوری برگ‌‌‌‌های این گیاه از اردیبهشت‌‌ تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی
گزنه دارای تانن، موسیلاژ، اسید فورمیک، ماده مومی، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کنندگی پوست، نیتراتپتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن‌‌دار، گوگرد و نوعی ماده رنگی به نام اورتی‌‌سین در سر شاخه هوایی می‌‌باشد (زرگری، 1376). در برگ گیاه گزنه، کلروفیل، گزانتوفیل، لوکوآنتوسیانیدین، فلاوون و فلاونول موجود است که فلاوون و فلاونول به میزان کمتری از لوکوآنتوسیانیدین در این گیاه است. تری‌‌ترپن‌‌ها و استرول‌‌ها شامل بتاسیتوسترول در گیاه موجود است. اسید فرمیک نیز در برگ وجود دارد. برگ‌‌های تازه گزنه حاوی سکرتین می‌‌باشد. همین‌‌طور دارای 5/1 درصد کلروفیل خالص است. برگ خشک گزنه 5/7 درصد کلروفیل دارد. اسیدهای فنلی نیز در این گیاه وجود دارد که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، اسکولتین و کافئوئیل مالیک اسید و کلروژنیک اسید می‌‌باشد. تری گلیسیرید، دی گلیسیرید و فسفولیپید‌‌های مختلفی هم از این گیاه جدا شده است. سیتوکنین‌‌های عمده گزنه شامل زآتین، زآتین نوکلئوتید، ایزو پنتیل آدنین، ایزو پنتیل آدنوزین، ایزو پنتیل آدنین نوکلئوتید و دی هیدرو زآتین می‌‌باشد. همچنین ترکیبات ایندولی همراه با هیستامین و 5- هیدروکسی تریپتامین و اسید‌‌هایی از جمله اسید آسکوربیک، سالیسیلیک اسید و عناصری مانند ازت، گوگرد، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و عناصر نادر مانند آهن، روی، مولیبدن و مس موجود است (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
ترکیبات فنلی موجود در گزنه که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، فیستین و میریستین می‌‌باشند. بر باکتری‌‌هایی مثل اشریشیاکلی، پروتئوس ‌‌ولگاریکوس، کلبسیلا و پسودوموناس اثر دارد و عصاره این گیاه بر سالمونلا و پروتئوس که در مقابل آنتی‌‌بیوتیک‌‌ها مقاوم است، خاصیت آنتی‌‌بیوتیکی دارد. همچنیین باعث وقفه در رشد چندین مخمر، کپک، قارچ و باکتری شده است. اثرات ضد قارچی بعضی ترکیبات موجود در گزنه نیز تائید شده است. گزنه دارای اثرات مدری است. اثرات دیورتیک این گیاه با افزایش دفع کلر و اوره همراه است و ثابت شده که مصرف 14 روزه این گیاه موجب کاهش وزن بدن و نیز کاهش فشار سیستولیک می‌‌گردد (محمودی و همکاران، 2007). گزنه بصورت خوراکی به عنوان مدر، پایین آورنده قند خون و اسید اوریک و به صورت موضعی در درمان برخی از بیماری‌‌های پوستی و مو از جمله اگزما، بیماری‌‌های التهابی و حتی در درمان ریزش مو مورد استفاده قرار می‌‌گیرد (محمودی و همکاران، 2007). اعتقاد بر این است که جوشانده گیاه و خیسانده ریشه آن در الکل بصورت لوسیون در رشد موی سر موثر است. همچنین عصاره ریشه گزنه در بعضی حالات هیپرتروف غده پروستات را بهبود می‌بخشد (آزاد بخت، 1378). از دیگر کاربردهای دارویی گزنه می‌‌توان به درمان آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، بزرگ شدگی ‌‌پروستات، حساسیت فصلی و درمان اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی
پراکنش و استقرار گیاهان اصولاً تحت تاثیر شرایط محیط و عوامل داخلی گیاه صورت می‌‌گیرد. مهم‌‌ترین عوامل موثر بر ترکیبات شیمیایی ثانویه گیاهان عوامل ژنتیکی، محیطی و اثرات متقابل آن‌ها ست. عوامل ژنتیکی مربوط به ژنوم گیاه است. از عوامل محیطی و اکولوژیکی مؤثر می‌‌توان عوامل آب و هوایی، جغرافیایی و ادافیکی (خاکی) را نام برد. عوامل آب و هوایی مانند دما، بارندگی، طول روز، نور خورشید، تبخیر و تعرق و باد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌‌های ثانویه این گیاهان دارند. ارتفاع از سطح دریا، درصد شیب و جهت آن، عرض جغرافیایی، پوشش اراضی، نزدیکی به منابع آبی به طور مستقیم یا غیر مستقیم به واسطه تأثیر بر سایر عوامل بوم شناسی بر سنتز ترکیبات ثانویه به خصوص اسانس در گیاهان موثر هستند. خصوصیات خاک مثل بافت خاک، مواد آلی، آهک، شوری و اسیدیته از فاکتورهای محیطی می‌‌باشند که باید مورد مطالعه قرار گیرند. در صورتیکه گیاه اهلی شده باشد عوامل مدیریتی نیز تاحدودی بر درصد ترکیبات ثانویه گیاهان دارویی موثر است (قاسمی، 1389). از مهمترین عوامل محیط رویش گیاهان که تاثیر بسیار عمده‌‌ای بر کمیت و کیفیت مواد موثره آن‌ها می‌‌گذارند، نور، درجه‌‌حرارت، آبیاری و ارتفاع محل می‌‌باشد (امید بیگی، 1384). بر پایه تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محـور زیـر بر آن‌ها تاثیـر می‌‌گـذارد: 1- تاثیر بر مقدار کلی ماده موثره گیاهان دارویی؛ 2- تاثیر بر عناصر تشکیل دهنده مواد موثره؛ 3- تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه (امیدبیگی، 1384).
به‍طور‌‌ کلی مواد مؤثره گیاهان دارویی که حاصل سوخت‌‌و‌‌ساز (متابولیسم) ثانویه است به ‍عنوان ترکیبــات ثانویه معروف می‌‌باشند. این ترکیبات عموماً وزن مولکولی کمتر از 1000 داشته و به ‍مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول‌های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولیـد می‌شوند. گیـاهان دارای این نوع مکانیـسم‌ها، نسبت به سایر گیاهان از سازگاری و بقای طولانی‌‌تری برخوردارند (تایز و زایگر، 1379). مهـم‍ترین آن‌ها آلــکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن‌‌های فرار (اسانس‌ها)، فنلها، تانن‌ها، فلاونوئیدها و غیره هستند. تولید این ترکیبات برای گیاه گران و هزینه‍بر می‌باشند، ولی گیاه این ترکیبات را بیهوده تولید نمی‌کند و اهـداف خاصی جهت تولید، ترشح و ذخیره آن‌ها دارد که مهم‍ترین این وظایف به شرح زیر است:
- دفع عوامل بیماریزا
- دفع آفات و حیـوانات گیاه‍خوار
- افزایش توان رقابتی گیاه بر سر منابع مانند نور، آب و مواد غذایی
- جلب حشرات و پرندگان گردهافشان
- رفع تنشهای غـیرزنده و حفاظت در برابر اشعۀ ماوراء بنفش (قاسمی، 1389).
2-6- فنل و فلاونوئید
ترکیبات فنلی به یک گروه وسیع و متنوعای از ترکیبات شیمیایی اطلاق میشود که این ترکیبات می‌‌توانند به روش‌‌های مختلفی طبقه‌‌بندی شوند. هاربورن و سیموندس این ترکیبات را به گروه‌‌هایی بر اساس تعداد کربن‌‌های موجود در مولکول طبقه‌بندی کردند (جدول 2-1) (ورمریس و نیکولسون، 2006).
ترکیبات فنولی در طی رشد و نمو با هدایت عوامل ژنتیکی و در پاسخ به محرکهای محیطی از جمله آلودگی، زخم و تابش فرابنفش ساخته میشوند که از میان آنها میتوان به لیگنینها، لیگنانها، فنلهای ساده و اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها اشاره کرد. این ترکیبات بخش جدایی ناپذیری در رژیم غذایی بشر بوده و به دلیل ویژگیهای آنتیاکسیدانی قوی و ضدسرطانی، بسیار مورد توجه است (قربانی و همکاران، 1390؛ محمد و همکاران، 2001؛ دینکا و همکاران، 2004؛ اسکین و رابینسون، 2000).
ترکیبات فنولی دارای خواص متعددی از جمله خواص آنتی باکتریال، ضدقارچ، ضدویروس، ضددیابت، ضدالرژی و ضدالتهاب هستند. اما بیشتر به منظور فعالیت‌های ضدویروسی و آنتی‌اکسیدانیشان شهرت دارند به خصوص در بعضی از اسیدهای فنولیکی مانند اسیدکلرژنیک، اسیدگالیک و اسیدکافئیک (دیمیتری جویک و همکاران، 2010).
فلاونوئیدها دسته‌‌ای از ترکیبات طبیعی هستند که در سلسله گیاهان گسترش وسیعی دارند. آن‌ها به عنوان یکی از بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی شناخته می‌‌شوند. تا به امروز متجاوز از 4000 فلاونوئید شناخته شده است که به طور وسیعی در برگ‌‌ها، دانه‌‌ها، پوسته و گل‌‌های گیاهی وجود دارند. به‌‌طور کلی فلاونوئیدها بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی فنلی در گیاهان هستند و به دلیل حضور آن‌ها در تقریبا همه گروه‌‌های گیاهی، در بیشتر مطالعات مربوط به عصاره‌‌های گیاهی مورد بررسی قرار می‌‌گیرند (مدیکا و همکاران، 2004).

جدول 2-1- طبقهبندی ترکیبات فنلی (ورمریس و نیکولسون، 2006).

فلاونوئیدها به عنوان یکی از گستردهترین متابولیتهای ثانویه در گیاهان هستند که فعالیتهای مختلفی را بر عهده دارند. آنها دارای اثرات و عملکرد بسیار مفیدی بر سلامتی انسان هستند که دارای شش زیر گروه میباشند: فلاوونها، ایزو فلاوونها، فلاونولها، فلاونون، آنتوسیانین‌‌ها و آنتوسیانیدین. فلاونوئیدها معمولاً در واکوئل گیاهان به صورت گلیکوزید تجمع مییابند. فلاونها مخصوصا کامپفرول و کوئرستین در بسیاری از گونههای گیاهی وجود دارد که برای جوانهزنی گرده و رشد لوله گرده ضروری است (جاکولا و هوتولا، 2010؛ کاسیمیر و مین، 2008).
فلاونوئیدها ترکیبات دیفنیل پروپانوئیدهایی هستند که تقریبا در همه گیاهان یافت می‌‌شوند و نقش‌‌های فراوانی برای این ترکیبات شناخته شده است، در گیاهان عالی، فلاونوئیدها دفاع در برابر نور ماورابنفش، پاتوژن‌‌ها و علف‌‌خوران را سبب می‌‌شوند. نقش‌‌های ویژه‌‌ آن‌ها در گیاهان، در ایجاد رنگ و تثبیت نیتروژن در گیاهانی است که دارای زندگی همزیستی‌‌اند. اثرات سلامت فلاونوئیدها بیشتر در نتیجه خاصیت آنتی‌‌اکسیدانی و توانایی کلات‌‌کنندگی آن‌ها ست. مطالعات زیادی انجام شده است تا موثر بودن فلاونوئیدها به عنوان، عوامل ضدقارچی، ضدباکتری، ضدویروسی، ضداشتعال، آنتی‌‌اکسیدانت، متعادل کننده ایمنی، بازدارنده آنزیمی و عوامل موتاژنی سمی به اثبات رساند (مدیکا و همکاران، 2004).
روتین نوعی فلاونوئید است، روتین در پیشگیری و درمان افزایش فشار خون و سایر نارسائیهای قلبی و عروقی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی مطرح است (افشار و همکاران، 1376).
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد
عملکرد، میزان و کیفیت مواد ثانویه یک گیاه در رویشگاه‌‌ها و مناطق مختلف تغییر می‌‌یابد، دلیل این امر نوسان فعالیت‌‌های متابولیکی گیاه تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی است، نتیجه تاثیر طولانی عوامل محیطی، تشکیل جمعیت‌‌های تازه زیرگونه‌‌ای یا اکوتیپ‌‌های مشتق از یک گونه گیاهی خاص است (امیدبیگی، 1388). تفاوت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بین اکوتیپ‌‌های گیاهی به اثبات رسیده است و این اختلافات می‌‌تواند به منظور انتخاب بهترین کمیت و کیفیت مورد استفاده قرار گیرد (آواتو و همکاران، 1998؛ برادلی و همکاران، 1996). در دهه اخیر در کشورهای مطرح دنیا در زمینه تولید گیاهان دارویی مانند مجارستان، ایتالیا و اسلواکی بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و ترکیبات ثانویه به منظور به کارگیری در برنامه‌‌های به‌‌نژادی صورت گرفته است و اکوتیپ‌‌های برتر نسبت به ارقام اصلاح شده شناسایی گردیده‌‌اند (من و استابا، 1986). در ارزیابی خصوصیات گیاهشناسی، درصد و اجزای اسانس اکوتیپ‌‌های آویشن کرمانی توسط مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران (1389)، نتایج نشان داد که بیشترین ارتفاع بوته، قطر بوته، تعداد شاخساره، طول و عرض برگ، وزن تر و وزن خشک بوته مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین مربوط به اکوتیپ شاهرود بود، ولی تعداد شاخساره در بوته، طول برگ و عرض برگ در هیچ یک از اکوتیپ‌‌ها با اکوتیپ دیگری اختلاف معنی‌‌داری نداشت. عسکرزاده و همکاران (1387) در مقایسه 8 اکوتیپ زیرهکوهی از نقاط مختلف ایران در شرایط مزرعه به منظور بررسی عملکرد کمی و کیفی گزارش کردند که بیشترین عملکرد تکبوته مربوط به اکوتیپ منطقه خواجه خراسان و کمترین عملکرد مربوط به اکوتیپ کوه باقران بیرجند بود. نتایج مطالعه‌‌ای روی بررسی مورفولوژی، فنولوژی و برخی مشخصات کیفی چند اکوتیپ علف باغ از مناطق مختلف ایران و یک اکوتیپ خارجی در شرایط آزمایشگاه نشان داد که بالاترین ارتفاع بوته مربوط به اکوتیپ همدان و کمترین مربوط به اکوتیپ کرج، بیشترین میزان وزنتر متعلق به اکوتیپ خارجی و کمترین متعلق به اکوتیپ همدان بود در حالیکه بیشترین وزن خشک در اکوتیپ اردبیل و کمترین در اکوتیپ خارجی مشاهده شد (علیزاده و جعفری، 2011). به منظور بررسی اجزای عملکرد، مورفولوژی اکوتیپ‌‌های بومی یونجه کشور ترکیه آزمایشی توسط سینگ در سال 2002 انجام شد و نتایج این آزمایش بدین صورت بود که بالاترین ارتفاع بوته متعلق به اکوتیپ محمودی و کوتاهترین متعلق به اکوتیپ ارسیس3 بود، اکوتیپ قاسم‌‌اوغلو بیشترین تعداد ساقه و اکوتیپ‌‌های الاکوی و کایرباسی کمترین تعداد ساقه را داشتند، بیشترین تعداد غلاف در اکوتیپ محمودی و کمترین در اکوتیپ گلگورن مشاهده شد.
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیتهای ثانویه
اصولاً مواد ثانویه به اقتضای ساختار طبیعی (وراثت) و هم تحت تاثیر تهییج‌‌های غیرطبیعی(تنشی) در گیاه ساخته می‌‌شوند به‌طوری‌که حضور برخی از این مواد در تعدادی از افراد یک گونه، به‌طور مستثنی از افراد دیگر ممکن است به منزله نشانه فعالیت ژن‌‌های خاص سازگاری آن افراد نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی به شمار آید و افراد مذکور را به عنوان یک جمعیت زیرگونه‌‌ای متفاوت از بقیه که نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی پاسخ شیمیایی ویژه‌‌ای دارند معرفی کند (فیتر و هی، 1987). طی مطالعه‌‌ای با هدف بررسی توده‌‌های محلی مرزه تابستانه نتایج نشان داد که تنوع قابل توجهی از نظر صفات بیوشیمیایی بین توده‌‌ها وجود دارد، میانگین بازده اسانس توده‌های مختلف بین 57/0 و 9/2 درصد متنوع بود که کمترین مقدار آن در توده ارومیه و بیشترین آن متعلق به توده اهواز بود، توده‌‌های اراک، نیشابور، مریوان و اهواز به ترتیب با میزان کارواکرول 3/83، 3/83، 9/76 و 67 درصد در گروه توده‌های غنی از کارواکرول قرار گرفتند (هادیان، 1387).
نتایج تحقیقی با موضوع ارزیابی درصد و اجزای اسانس چندین اکوتیپ‌‌ آویشن کرمانی از مناطق مختلف کشور با ارتفاع مختلف نشان داد که بازده اسانس بر حسب حجم اسانس در 100 گرم سرشاخه خشک در اکوتیپ کرمان- راین، 5/2 درصد، در اکوتیپ کرمان- سیرچ، 9/1 درصد، در اکوتیپ یزد، 2 درصد، در اکوتیپ شاهرود، 8/1 درصد و در اکوتیپ اصفهان، 5/1 درصد بود. همچنین در بررسی میزان ترکیبات غالب اسانس، بیشترین میزان کارواکرول در اکوتیپ کرمان- راین و بیشترین میزان تیمول در اکوتیپ شاهرود مشاهده شد (مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران، 1389). زینلی و همکاران (1386) در بررسی ژنوتیپ‌‌های مختلف دو گونه نعناع لانگیفولیا و اسپیکاتا پس از استخراج اسانس، شناسایی و تعیین مقدار اجزای اسانس با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی، گزارش کردند که توده‌‌های مختلف از لحاظ میزان اسانس و ترکیبات اسانس با هم اختلاف قابل‌‌ توجهی داشتند، این محققین اختلاف در میزان اسانس را مربوط به بالا بودن تعداد برگ و ارتفاع زیاد در تیمارهای با اسانس بالا اعلام کرد و پیشنهاد کردند که از این فاکتورها می‌‌توان به عنوان معیار انتخاب در بین ژنوتیپ‌ها در جهت افزایش عملکرد اسانس استفاده نمود. نری و همکاران (2009) در آزمایشی به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی اکوتیپ‌‌های مختلف شاه‌‌بلوط شیرین مناطق مختلف ایتالیا به این نتیجه رسیدند که بالاترین میزان ساکارز در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا و کمترین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو بود درحالیکه بیشترین میزان پروتئین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو و کمترین میزان در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا مشاهده شد، همچنین درصد اسید مالیک، پلی‌‌فنل‌‌ها و خواص آنتی‌‌اکسیدانتی در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو به طور معنی‌‌داری بالاتر از اکوتیپ وال‌‌کاستلانا بود. طی مطالعه‌‌ای مقایسه‌‌ای اکوتیپ‌‌های مختلف سیر از مناطق مختلف کشور از لحاظ میزان ماده آلیسین مورد مقایسه قرار داده شدند و نشان داده شد که اختلاف در میزان آلیسین در بین اکوتیپ‌‌ها نسبتاً زیاد بود بهطوری که بالاترین میزان (13 درصد) در اکوتیپ گرگان و کمترین میزان (61/1 درصد) در اکوتیپ تالش یک بود، و اکوتیپ‌‌های تارم 1، تربت‌‌جام، بهشهر و تالش 2 از لحاظ میزان آلیسین با هم اختلاف معنی‌‌داری نداشتند.
همتی و همکاران (1386) با بررسی تاثیر اقلیم و اندامهای مختلف روی برخی فلاونویید‌‌های درختچه سرخ ولیک، نشان دادند که اثرات متقابلی بین مکان و صفات وجود دارد و آن‌ها به این نتیجه رسیدند که میزان کوئرستین در اندام کل گیاه سرخ ولیک در کلاردشت مازندران بیشتر از گرگان بود. در بررسی دیگری که جایمند و همکاران (1388) با استفاده از استخراج و اندازهگیری ترکیب‌‌های فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی در مناطق غربی ایران انجام دادند دریافتند که بهترین اکشن‌‌ها از نظر میزان ترکیب‌‌های کامفرول و کوئرستین به ترتیب شامل آذربایجان غربی، ایلام و اردبیل بودند.
یکی از محققان در سال 1973 نسبت به کاشت گونه‌‌ای گل انگشتانه‌‌ در چهار نقطه که از نظر ارتفاع متفاوت بودند (بین 660 تا 1840 متر ارتفاع از سطح دریا) اقدام نموده و پس از مطالعات لازم به این نتیجه رسید که کاشت این گیاه در ارتفاعات بالا بویژه سبب کاهش برخی کلیکوزیدها می‌‌گردد (امیدبیگی، 1384). در تحقیقاتی که در سال 1975 در اتیوپی روی گونه‌‌ای از ریحان انجام گرفت معلوم گردید که در ارتفاعات پایین مقدار لینالول موجود در اسانس گیاه مذکور افزایش می‌‌یابد، در حالی که کاشت این گیاه در ارتفاعات باعث افزایش تولید اوژنول موجود در اسانس می‌‌گردد (امید بیگی، 1384).
تجلی و همکاران (2002) با بررسی تأثیر ارتفاع و اندامها بر روی فنول و فلاونوئید گیاه Carateagus Microphylla بیان داشتند که این گیاه در ارتفاع 1000 متری، دارای بیشترین سطح فنول و فلاونوئید نسبت به گیاهان رشد یافته در ارتفاعات پست بوده است. قاسمی و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتی اکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد.
گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تأثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتی‌کسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیای غربی نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
سپهری‌‌فر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی در عصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره‌‌قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌‌باشد.
نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (2006) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمعآوری شده در سالهای متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

-104361-473572

3- مواد و روش‌ها
3-1- مواد گیاهی
در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
3-2- وسایل و دستگاههای مورد استفاده
کلروفیلسنج: جهت اندازهگیری میزان کلروفیل برگ
خطکش
ترازوی دیجیتال
آسیاب برقی
دستگاه موقعیت سنج (GPS)
سانتریفوژ آزمایشگاهی
دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
3-3- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرفها از شرکت مرک و حلالها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
3-4- آمادهسازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمعآوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال 1390 در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال 91) جهت جمعآوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمعآوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل 3-1). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با استفاده از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش 18 عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمعآوری شد با استفاده از دستگاه موقیعتسنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول 3-1). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول 3-2). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 13 صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گلآذین، تعداد گلآذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.

جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

3-7- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره 18 گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن100 میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با 10 سی‌‌سی متانول 80 درصد (نسبت 1 به 10) مخلوط شد. سپس نمونهها به مدت 24 ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک میباشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکیوالانت اسید گالیک بیان میگردد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با 16/1 میلی‌‌لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از 8-1 دقیقه استراحت، 300 میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (6/10 گرم در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در حمام بخار oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیکاسید (50، 100، 200، 250، 350 میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (50:50) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل 3-2).

شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) استفاده شد؛ به این صورت که 5/0 میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلی‌‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید 10درصد در اتانول (10 گرم آلومینیوم کلرید در 100 میلی‌‌لیتر اتانول و آبمقطر)، 1/0 میلی‌‌لیتر استاتپتاسیم یکمولار (41/2 گرم در 10 میلی‌‌لیتر آب مقطر) و 8/2 میلی‌‌لیتر آبمقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (10، 50، 100 و 200 میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل 3-3).

شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC
3-8-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- 7100
دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- 2450
آون ستون: هیتاچی ال-2300
نوع ستون: آر پی- 18 با ابعاد 6/4 250 میلی‌متر و اندازه ذرات 5 میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 1 میلیلیتر اسیداستیک، 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و 10 میلیلیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استاندارد‌‌های اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های 10، 20، 50، 100، 150 و 200 و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های 20، 25، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-4 و 3-5).
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد اسید کلروژنیک و اسید کافئیک به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد نمونهها در طول موج 330 نانومتر قرائت شد.
میزان اسید کلروژنیک و اسید کافئیک بر حسب درصد بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم. واحد مجهول (x) برحسب پی‌‌پی‌‌ام می‌‌باشد.

شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک

شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC
3-9-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فلاونوئیدی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 50 میلیلیتر متانول خالص مرک، 49 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه شده و 1 میلیلیتر اسید استیک با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر (مدت زمانی که طول می‌‌کشد تا ترکیب مورد نظر از ستون خارج شود) و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان روتین تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک نمونه بیان گردید (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد برای روتین غلظت‌‌های 20، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-6).

شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد روتین به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به روتین در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد (شکل 3-7). برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد. نمونهها در طول موج 285 نانومتر قرائت شد. میزان روتین بر حسب درصد یا میلیگرم بر گرم وزن خشک بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم.

شکل 3-7- کروماتوگرام نمونه استاندارد روتین در دقیقه 4:50
3-10- مشخصات طرح
برای انجام این تحقیق از طرح کاملاً تصادفی به صورت آشیانه‌ای استفاده شد. در این طرح اثر چهار ارتفاع در هر یک از دو استان مازندران و گلستان بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مورد بررسی قرار گرفت. برای ویژگی‌های مورفولوژیکی از پنج تکرار و برای ویژگی‌های بیوشیمیایی از سه تکرار استفاده شد. طرح آشیانه‌ای یا نستد در واقع یک طرح کاملاً تصادفی چند مشاهده‌ای می‌باشد، در این تحقیق استان به عنوان تیمار می‌باشد و ارتفاع نقش تکرار را دارد، و از آنجایی که چند نمونه در هر ارتفاع برداشت می‌شود به این طرح‌ها چند مشاهده‌ای گفته می‌شود.
3-11- تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس داده‌های به دست آمده با نرم‌افزار SAS انجام شد و به علت معنی‌دار شدن اثر متقابل ارتفاع در استان، مقایسه میانگین این اثر به کمک نرم‌افزار MSTAT و با روش آزمون دانکن صورت پذیرفت، رسم نمودارها نیز با نرم‌افزار Excel انجام شد.

-225529-624053

4- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک
نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گزنه نشان داد که بین دو استان مازندران و گلستان در تمامی صفات به جزء تعداد گل آذین در بوته اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان، در همه صفات معنی‌دار بود (جدول 4-1). جدول 4-2 مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان را برای صفات مورفولوژیک نشان میدهد.
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که مقدار هر سه صفت طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ با افزایش ارتفاع کاهش یافت به طوریکه بیشترین مقدار طول برگ (3/14 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری استان گلستان و کمترین مقـدار آن (9/6 سانتیمتر) در ارتفاع 2250 متری استان مازندران بدست آمد.
بیشترین مقدار عرض برگ (16/9 سانتیمتر) در ارتفاع 10 متری مازندران و کمترین مقدار آن (5/5 سانتی‌متر) در ارتفاع 2250 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین نسبت طول به عرض برگ (85/1) در ارتفاع 1450 متری گلستان و کمترین مقدار آن (18/1) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد.
تجزیه همبستگی نشان داد که دو صفت طول و عرض برگ همبستگی مثبت بالا (71/0=r) دارند (جدول 4-3).

جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک

*، ** و ns به ترتیب نشان معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دارمی‌باشد.
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن

در هر ستون حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است.

جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه

*، ** و ns به ترتیب نشاندهنده معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
4-1-2- تعداد برگ در بوته
با افزایش ارتفاع، تعداد برگ در بوته کاهش محسوسی نشان داد به طوریکه در ارتفاعات پایین مازندران و گلستان تعداد برگ در بوته، به ترتیب 8/84 و 2/80 عدد بود اما در ارتفاع 2250 متری این تعداد به 2/19 و 4/36 عدد کاهش یافت.
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها
با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان، تعداد گره در گزنه کاهش اما فاصله گره‌ها افزایش نشان داد. در پایین‌ترین ارتفاع مازندران و گلستان تعداد گره به ترتیب 23 و 2/26 عدد بود اما در بالاترین ارتفاع دو استان این تعداد به 6/9 و 11 عدد کاهش یافت.
بیشترین فاصله گره (48/8 سانتی‌متر) مربوط به استان مازندران و ارتفاع 1450 متری بود که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری اختلاف معنی‌دار نداشت. کمترین فاصله گره (4/3 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد. با توجه به همستگی منفی و بالا (71/0= r) بین دو صفت تعداد و فاصله گره، می‌توان نتایج حاصله را مورد انتظار دانست، یعنی در ارتفاعات افزایش فاصله گره‌ها در نتیجه کاهش تعداد گره قابل توجیه هست.
4-1-4- قطر ساقه
بیشترین میزان قطر ساقه که به ترتیب 05/7 و 98/6 میلی‌متر بود در ارتفاعات 1450 و 2250 متری گلستان و کمترین مقدار آن (44/4 میلی‌متر) در ارتفاع 10 متری مازندران مشاهده شد.
4-1-5- قطر و طول ریشه
با افزایش ارتفاع روند مشخصی برای دو صفت قطر و طول ریشه مشاهده نشد، بهطوری که بیشترین مقدار قطر ریشه (01/5 میلی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری این استان و همچنین ارتفاع 10 متری مازندران اختلاف معنی‌داری نشان نداد (05/0 ≤ P) کمترین مقدار قطر ریشه (02/3 میلی‌متر) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین مقدار طول ریشه (01/31 سانتی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد.
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته
بین دو استان از نظر تعداد گل آذین اختلاف معنی‌دار (05/0 ≤ P) مشاهده شد. میانگین تعداد گل آذین در بوته، در گلستان 8/46 عدد بود، در حالی‌که در مازندران 35/41 عدد بود. در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، مشخص شد که استان گلستان با ارتفاع 1450 متر بیشترین تعداد گل آذین (2/59 عدد) را داشت در حالیکه در ارتفاع 750 متری مازندران کمترین تعداد گل آذین (8/35 عدد) مشاهده شد.
تعداد گل آذین در بوته با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره، قطر ساقه و طول ریشه همبستگی مثبت و معنیداری نشان داد.
اندازه گل آذین در مناطق نمونه برداری کم و بیش مشابه بود، تنها در ارتفاع 1450 متری مازندران گزنه‌هایی با اندازه گل آذین بالاتر (52/5 سانتی‌متر) نسبت به سایر مناطق مشاهده شد.
4-1-7- ارتفاع گیاه
افزایش ارتفاع نقش موثری در کاهش ارتفاع گیاه گزنه داشت، بهطوری‌که نتایج نشان داد در ارتفاعات پایین (تا 750 متر) ارتفاع بوته‌ها بالا بود اما در ارتفاعات بالاتر کاهش چشمگیری در ارتفاع گیاه مشاهده شد. بیشترین ارتفاع گیاه (3/120 سانتی‌متر) در استان مازندران با ارتفاع 750 متر بدست آمد و کمترین مقدار این صفت (2/77 سانتی متر) در ارتفاع 2250 متری مازندران مشاهده شد که البته با ارتفاع 2250 متری گلستان اختلاف معنی‌دار نداشت.
ارتفاع گیاه گزنه با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره و طول ریشه همبستگی مثبت و معنی داری داشت (جدول 4-3).
4-1-8- میزان کلروفیل
با افزایش ارتفاع میزان کلروفیل روند افزایشی داشت بهطوری که بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد در حالیکه مقدار این صفت در ارتفاع 750 متری 3/27 درصد بود. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که میزان کلروفیل با طول برگ و تعداد گره، همبستگی منفی و معنی‌دار و با فاصله گره (40/0= r) همبستگی مثبت و معنی‌داری داشت (جدول 4-3).
طبق نتایج بدست آمده، صفات مورفولوژیکی و بیوشمیایی گیاه گزنه تحت تاثیر شرایط محیطی مختلف ناشی از تغییر ارتفاع محل رویش قرار گرفتند، یهطوری‌‌که ارتفاعات بالا در دو استان مازندران و گلستان به خصوص منطقه له کوه بابل با ارتفاع 2250 متر از سطح دریا، دارای بیشترین تاثیرپذیری از افزایش ارتفاع بودند. با توجه به داده‌های هواشناسی (جدول 3-1) با افزایش ارتفاع، دما به طور محسوسی کاهش یافت به‌طوری‌که میانگین دمای سالیانه از 17 درجه سانتی‌گراد در پایینترین ارتفاع به 8 درجه سانتیگراد در بالاترین ارتفاع رسید و از آنجایی که رشدونمو اندام‌های گیاهی در شرایط دمای پایین کاهش می‌یابد بسیاری از صفات مورفولوژیکی مورد بررسی در این مطالعه نظیر طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه کاهش یافت. در بسیاری از گیاهان تاثیر دمای پایین در کاهش خصوصیات رویشی به اثبات رسیده است (امیدبیگی، 1379). همزمان با کاهش دما در ارتفاعات بالا میزان کلروفیل افزایش نشان داد، افزایش درصد کلروفیل در شرایط سرد نوعی مقاومت در برابر سرما محسوب می‌شود تا گیاه بتواند تا حدودی خسارات ناشی از کاهش فتوسنتز را جبران کند (اسپیرینگ و کارلاندر، 1979).
4-2- صفات بیوشیمیایی
نتایج تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر و دستگاه HPLC نشان داد که اثر متقابل ارتفاع در استان برای تمامی صفات معنی‌دار بود (جدول 4-4 و جدول 4-5). مقایسه میانگین نیز برای این صفات انجام شد.
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج بررسی‌ها نشان داد که با افزایش ارتفاع، میزان فنل در اندام‌های مختلف گزنه افزایش می‌یابد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل برگ (57/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر، فنل کل برگ کاهش محسوسی نشان داد، ارتفاعات بالای استان گلستان نیز از فنل بالاتری نسبت به ارتفاعات پایین ر برخوردار بودند (شکل 4-1).
میزان فنل کل ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری که بیشترین میزان آن (38/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (48/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-2).
در ریشه نسبت به اندام‌های دیگر میزان فنل کل کاهش محسوسی نشان داد و حتی اختلاف کمتری در ارتفاعات مختلف مشاهده شد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل ریشه (21/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (09/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-3).

جدول 4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه HPLC

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.

شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان میزان فلاونوئید کل در اندام‌های مختلف افزایش یافت، به‌طوری‌که بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ (64/5 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، در ارتفاع 1450 متری مازندران مقدار آن به 94/4 میلی‌گرم بر گرم رسید و پس از آن ارتفاعات بالای گلستان بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ را داشته‌اند. کمترین میزان فلاونوئید برگ (3 میلی‌گرم بر گرم) مربوط به ارتفاع 50 متری گلستان بود (شکل 4-4).
مقدار فلاونوئید کل ساقه وگل نسبت به برگ کاهش نشان داد اما همچنان در ارتفاعات بالاتر مقدار بیشتری از این ماده در اندام‌های ساقه و گل وجود داشت. بیشترین میزان فلاونوئید ساقه و گل (98/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران حاصل شد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر میزان آن کاسته شد اما در سایر مناطق نمونه برداری میزان این ماده تقریباً یکسان بود و با هم اختلاف معنی‌داری نداشتند (شکل 4-5).
فلاونوئید کل ریشه کاهش چشمگیری نسبت به برگ و ساقه و گل داشت به‌طوری‌که بیشترین میزان آن (53/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و سایر مناطق مرتفع دو استان میزان تقریباً مشابهی از فلاونوئید کل را در اندام ریشه داشتند، کمترین میزان این ماده (1/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران بدست آمد (شکل 4-6).

شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل
مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ گیاه گزنه نشان داد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع میزان کلروژنیک برگ افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (29/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن ارتفاع 2250 متری گلستان مقدار کلروژنیک بالایی داشت، کمترین مقدار این ماده (1/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-7).
در اندام‌های ساقه و گل نیز بیشترین میزان اسید کلروژنیک در ارتفاعات بالا مشاهده شد، به‌طوری‌که بیشترین مقدار این ماده (3/0 میلی‌گرم بر گرم) در رویشگاه‌های 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن سایر مناطق مرتفع دو استان قرار داشتند، کمترین مقدار کلروژنیک اسید ساقه و گل (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران دیده شد (شکل 4-8).
در ریشه گزنه نسبت به اندام‌های هوایی مقدار اسید کلروژنیک کمتری دیده شد، بهطوری‌که بیشترین مقدار این ماده (13/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع مقدار این ماده در ریشه بصورت چشمگیری کاهش یافت بهطوری که در ارتفاع 50 متری گلستان به 02/0 میلی‌گرم بر گرم رسید (شکل 4-9).

شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ گیاه گزنه نشان داد که بیشترین مقدار این ماده (054/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن ارتفاع 1450 متری این استان قرار داشت، بین سایر مناطق نمونه‌برداری اختلاف معنی‌دار مشاهد نشد (شکل 4-10).
مقدار اسید کافئیک در اندام‌های ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (065/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، سایر مناطق مرتفع دو استان در جایگاه دوم قرار گرفتند و کمترین مقدار اسید کافئیک (046/0 میلی‌گرم بر گرم) در پایین‌ترین ارتفاع گلستان مشاهده شد (شکل 4-11).
نتایج بررسی‌ها نشان داد که در ریشه گزنه اسید کافئیک کمتری نسبت به سایر اندام‌ها وجود داشت و مقدار آن در ارتفاعات پایین بسیار ناچیز بود، بیشترین مقدار این اسید (021/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بود و ارتفاع1450 متری مازندران و مناطق مرتفع گلستان در رده‌های بعدی قرار گرفتند (شکل 4-12).

شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل
در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، بر میزان روتین برگ مشاهده شد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع مقدار روتین افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (34/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن، سایر مناطق مرتفع دو استان قرار گرفتند، کمترین مقدار روتین برگ (16/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-13).
نتایج مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل نیز، روندی مشابه با روتین برگ داشت، بهطوری که بیشترین مقدار آن (37/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان دیده شد (شکل 4-14).
طبق نتایج HPLC در ریشه گیاه گزنه روتین مشاهده نشد.

شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید
در همه اندام‌های گیاه گزنه، مقدار فلاونوئید کل بیشتر از فنل کل بوده است. با افزایش ارتفاع از سطح دریا میزان فنل و فلاونوئید کل به صورت چشمگیری افزایش نشان داد. در ارتفاعات کمتر از 1000 متر مقدار شیب رگرسیون بسیار کمتر از ارتفاعات بالاتر بوده است. در برگ گزنه مقدار فلاونوئید کل ارتباط بیشتری با ارتفاع نسبت به فنل کل نشان داد (96/0= r2)، به‌طوری‌که در ارتفاعات بالا شیب خط رگرسیون افزایش بیشتری نشان داد (شکل 4-15).
برخلاف برگ در اندام‌های ساقه و گل مقدار فنل کل ارتباط مثبت و معنی‌دار بیشتری با ارتفاع از سطح دریا نشان داد (95/0=r2)، بطوریکه در ارتفاعات بالاتر از 1000 متر، میزان فنل کل با شیب رگرسیونی بیشتری نسبت به فلاونوئید کل افزایش یافت (شکل 4-16).
در ریشه گیاه گزنه علاوه بر کمتر بودن مقدار فنل کل نسبت به فلاونوئید کل، پاسخ کمتری (87/0=r2) هم نسبت به افزایش ارتفاع از سطح دریا مشاهده شد (شکل 4-17).
میزان اسید کلروژنیک و روتین گیاه به طور محسوسی بیشتر از اسید کافئیک بود، همچنین بیشترین ارتباط (99/0=r2) با ارتفاع از سطح دریا، مربوط به میزان اسید کلروژنیک کل گیاه بود که بهشدت تحت تاثیر ارتفاع از سطح دریا قرار گرفت (شکل 4-18).

شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ گیاه گزنه

شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل گیاه گزنه

شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه گیاه گزنه

شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی در گیاه گزنه
میزان فنل و فلاونوئید کل و همچنین ترکیبات آن‌ها با ارتفاع از سطح دریا ارتباط مثبت و معنی‌دار داشتند، بهطوری که بیشترین میزان این ترکیبات در منطقه له کوه بابل مشاهده شد. با افزایش ارتفاع علاوه بر دما میزان رطوبت نسبی نیز کاهش یافت (جدول 3-1) و به نظر می‌رسد کاهش دما و رطوبت از مهمترین عوامل تاثیرگذار در افزایش تولید ترکیبات فنل و فلاونوئیدی باشند، هر چند در منطقه له کوه مقدار مواد آلی نیز نسبت به سایر مناطق بیشتر بود (جدول 3-2). در مطالعات مختلف تاثیر رویشگاه بر میزان متابولیت‌های ثانویه در گیاهان مختلف بررسی شده است که در اکثر موارد بر نقش رویشگاه به عنوان عامل تاثیر گذار در تجمع متابولیت‌های ثانویه تاکید شده است. مکان رشد گیاه می‌تواند از طریق تغییرات دمایی و رطوبتی بر فرآیند تشکیل مواد موثره تاثیرگذار باشد، مکانیسم تاثیرات محیط بر تجمع متابولیت‌های ثانویه به درستی روشن نیست، با این وجود این نکته روشن است که محیط از طریق تاثیری که در فرایند تولید متابولیت و عوامل مرتبط در تولید آنزیم‌ها دارد، در نوع و شدت واکنش‌های شیمیایی موثر است (همتی و همکاران، 2003؛ سیوستاوا و شیم، 2002). درجه حرارت از جمله عوامل محیطی تاثیرگذار در تشکیل و تجمع متابولیت‌های ثانویه است. بررسی‌های اولیه نشان داد که در مناطقی با درجه حرارت پایینتر تجمع فلاونوئید بیشتر است (داویس و آلبریگو، 1994). میزان مواد موثره در اندام‌های گیاهان هیچگاه ثابت نیست و متناسب با مراحل رشد گیاه و بعضی شرایط محیطی قابل تغییر است. کمیت و کیفیت ترکیبات شیمیایی وابسته به تنوع ژنتیکی، شرایط محیط و فنولوژی گیاه متغیر است (پلاتی و همکاران، 2005). در ضمن اختلاف زیادی در میزان مواد موثره یک گونه در شرایط مختلف رویشی وجود دارد (هانلیدو و همکاران، 1992). کسکیتالو و همکاران (2001) اعلام داشتند که نمی‌توان رابطه روشنی بین محصول و مقدار مواد موثره در گیاهان دارویی یافت. مهمترین عوامل در تغییرات کمی و کیفی به ترتیب به نوع گونه، زمان و مکان برداشت، تغییرات فصلی و روش‌های عصارهگیری بستگی دارد. اوماه و مازا (1996) نشان دادند که با افزایش ارتفاع بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی در اندام‌های گیاهی افزوده می‌شود. ترکیبات فلاونوئیدی جاذب نور مانند فلاونها و آنتوسیانینها، در پاسخ به اشعه یو-وی و برای محافظت بافتهای درونی ساقه و برگ از آسیبهای ناشی از این اشعه، در سلولهای اپی درمال تجمع پیدا میکنند. کامپفرول و کوئرستین از جمله این فلاونوئیدها هستند که در پاسخ به این اشعه در گیاه تولید میشوند. ارتفاع جغرافیایی در میزان متابولیتهای ثانویه مؤثر بوده است که یکی از دلایل این به کیفیت تشعشعات مخصوصا Uv-B در ارتفاعات ارتباط میدهند. اشعه Uv-B در ارتفاعات بالاتر بیشتر است و در نتیجه سبب تولید بیشتر بعضی از فلاونوئیدها میشود. (جاکولا و همکاران، 2010).
همتی و همکاران (1391) نشان دادند که میزان کورسترین اندام‌های مختلف گیاه نمدار در منطقه کلاردشت مازندران در مقایسه با منطقه گرگان بیشتر بوده است، بر طبق داده‌های هواشناسی منطقه کلاردشت نسبت به گرگان از ارتفاع بیشتر و هوای خنکتر برخوردار بوده است. علاوه بر این با توجه به اینکه منطقه کلاردشت نسبت به جنگل شصت‌کلا گرگان در ارتفاع بالاتری قرار دارد و با توجه به نقش فلاونوئیدها در حفاظت گیاه در برابر نور فرابنفش، تراکم بیشتر ترکیبات فلاونوئیدی در منطقه کلاردشت توجیح‌پذیر است. تاثیر هوای خنک بر تجمع مواد موثره اندازه‌گیری شده، می‌تواند به طولانی بودن بیشتر دوره تقسیم سلولی و فعالیت بافت گیاهی در مناطق خنک مرتبط باشد. در همین رابطه تحقیقات انجام شده روی برخی فلاونوئیدهای مرکبات نشان داد که تولید آن‌ها در مناطقی با آب و هوای خنک بیشتر ازمناطق گرم می‌باشد، زیرا طول دوره تقسیم سلولی بیشتر می‌شود و در این مرحله عوامل تولید برخی فلاونوئیدها بیشتر می‌شود (داویس و آلبریگو، 1994). میزان آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی در گیاه دارویی مامیران در دو منطقه گرگان و زیارت مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد میزان این ترکیبات در منطقه زیارت نسبت به گرگان بیشتر بود، با توجه به اینکه آب و هوای دو منطقه متفاوت است و منطقه زیارت دارای ارتفاع بالاتر و هوای سردتر است این شرایط برای گیاه تنش ایجاد کرده و تولید متابولیت‌های ثانویه افزایش یافت (قربانلی و همکاران، 1388). تحقیقات مشابه نیز نشان داد که در شرایط تنش برخی از ترکیبات ثانویه به میزان قابل توجهی در گیاه افزایش می‌یابد (آتال، 1998). قاسمی و همکاران (2011) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتیاکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد. گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتیاکسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیا نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی مورد مطالعه در این تحقیق در برگ گیاه گزنه بیشتر از اندام‌های دیگر بود، در بررسی میزان فلاونوئیدهای سرخ ولیک، میزان روتین این گیاه در برگ نسبت به گل و میوه بیشتر بود (همتی و همکاران، 2006). تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در اندام‌های مختلف گیاه ممکن است در نتیجه تغییر در برخی فعالیت‌های آنزیمی و نقش پیش ماده آن باشد (پیتر و ریچارد، 1993). در حمایت از این فرضیه محققین دیگر اشاره کردند که تنظیم کننده‌های رشد و نمو مانند هورمون‌های سیتوکنین و اسید جیبرلیک ممکن است بعضی آنزیم‌های تولید کننده فلاونوئیدها را فعال کنند (سیمور و همکاران، 1993).
سپهریفر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی درعصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌باشد.
آذریوند و همکاران (1388) در تحقیقی روی اسانس برگ و گل گیاه بومادران در ارتفاعات مختلف منطقه سیاه بیشه استان مازندران به این نتیجه رسیدند که ارتفاع بر میزان اسانس این گیاه تاثیر بسزایی داشته بطوریکه میزان ترکیبات اسانسی در ارتفاعات بالاتر بیشتر بود و این میزان در گل بیشتر از برگ بوده است.
حبیبی و همکاران (1384) با بررسی اثر ارتفاع روی اسانس گیاه دارویی آویشن وحشی منطقه طالقان به این نتیجه رسیدند که با افزایش ارتفاع مقدار ترکیبات اسانسی لینانول و آلفا ترپنین که بیشترین ترکیبات اسانسی در آویشن وحشی را تشکیل می‌دهند افزایش می‌یابد بهطوری‌که در ارتفاع 1800 متری کمترین و در ارتفاع 2800 متری بیشترین مقدار بوده است.
4-4- نتیجه‌گیری کلی
در بررسی اثر ارتفاع از سطح دریا، بر ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مشخص گردید که بین دو استان مازندران و گلستان اختلاف معنیداری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان بر صفات مورد مطالعه معنی‌دار بود، بسیاری از صفات مورفولوژیکی مثل طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه با افزایش ارتفاع کاهش و مقدار کلروفیل افزایش نشان داد. کمترین مقدار طول برگ (9/6 سانتی‌متر)، کمترین مقدار عرض برگ (8/5 سانتی‌متر) کمترین ارتفاع گیاه (2/77 سانتی‌متر) و بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در منطقه له کوه مازندران با ارتفاع 2250 متر بدست آمد. از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، در ارتفاعات بالا میزان ترکیباتی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین افزایش چشمگیری نشان داد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل (16/8 میلیگرم بر گرم)، فلاونوئید کل (15/12 میلیگرم بر گرم)، اسید کلروژنیک (72/0 میلیگرم بر گرم)، اسید کافئیک (140/0 میلیگرم بر گرم) و روتین (71/0 میلیگرم بر گرم) در کل گیاه در ارتفاع 2250 متری منطقه له کوه مازندران مشاهده شد.
4-5- پیشنهادات
با توجه به خودرو بودن گیاه گزنه توصیه می‌شود با کاشت این گیاه در شرایط کنترل شده زراعی و گلخانه‌ای زمینه جهت مطالعات بیشتر در این گیاه فراهم شود.
با توجه به کمبود تحقیقات پژوهشی در گیاه گزنه پیشنهاد می‌شود تاثیر عوامل مختلف محیطی و همچنین تنش‌ها در افزایش متابولیت‌های ثانویه این گیاه مورد بررسی قرار گیرد.
ناشناس بودن گیاه دارویی گزنه باعث می‌شود انجام یکسری مطالعات پایه سیتوژنتیکی و بررسی تنوع ژنتیکی در این گیاه ضروری به نظر آید.
تحقیقات بیشتر در زمینه دیگر ترکیبات فنل و فلاونوئیدی که در این پایاننامه مورد مطالعه قرار نگرفت.
منابع
فهرست منابع
آذرنیوند، ح.، قوام عربانی، م.، سفیدکن، ف. و طویلی، ع. 1388. بررسی تاثیر ویژگی‌های اکولوژیک (خاک و ارتفاع) بر کمیت و کیفیت اسانس گل و برگ Achillea millefolium. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 25(4):571-556.


آزاد بخت، م. 1378. رده بندی گیاهان دارویی. چاپ اول. انتشارات تیمورزاده. ص 401.
افشار، ج.، و دل اذر، ع. 1373. روتین از Ruta graveolens. مجله دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، 1، ص 12-1.
امیدبیگی، ر. 1379. رهیافت‌های تولید و فرآوری گیاهان دارویی. انتشارات طراحان نشر. مشهد. جلد 1. چاپ دوم. ص 283.
امیدبیگی، ر. 1384. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد اول، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 347.
امیدبیگی، ر. 1388. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد دوم، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 430.
تایز، ل. و زایگر، ل. 1379. فیزیولوژی گـیاهی. جلد دوم. ترجمه: کافی،م. لاهوتی، م. زند، ا. شریفی، ح. گلدانی، م. و کامکار، ح. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. ص 379.
دوازده امامی، س. 1382. کاربرد گیاهان دارویی. انتشارات نصوح. ص 113.
دوازده امامی، س. و مجنون حسینی، ن. 1387. زراعت و تولید برخی گیاهان دارویی و ادویهای. چاپ دوم. انتشارات دانشگاه تهران. ص 300.
حبیبی، ح.، مظاهری، د.، مجنون حسینی، ن.، چایچی، م.ر. و فخرطباطبایی، م. 1385. اثر ارتفاع بر روغن، اسانس و ترکیبات گیاه دارویی آویشن وحشی Thymus kotschynus منطه طالقان. مجله پژوهش و سازندگی در زراعت و باغبانی. شماره 73: 10-1.
جایمند، ک.، رضایی، م.، عصاره، م. و مشکی‌زاده، س. 1388. استخراج واندازه‌گیری ترکیبهای فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی (Rosa damascene Mill) از مناطق غربی ایران، فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 555:4-47.
حسنی، ج. 1383. شناسایی و بررسی اکولوژیکی دو جنس از گیاهان معطر Thymus و Ziziphora در استان کردستان. فصلنامه تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20(1): 17-1.
زرگری، ع. 1376. گیاهان دارویی. جلد چهارم، چاپ پنجم. انتشارات دانشگاه تهران، ص970.
زرگری، ع. 1383. گیاهان دارویی. جلد پنجم. چاپ ششم، انتشارات دانشگاه تهران، ص1010.
زینلی، ح.، رزمجو، خ. ارزانی، ا. و رضایی، م. 1386. ارزیابی دو گونه نعناع پونه سنبله‌ای و پودنه از لحاظ صفات زراعی، فیتوشیمیایی و سیتوژنتیکی. سومین همایش گیاهان دارویی. تهران، دانشگاه شاهد.
سپهری‌فر، ر. و حسنلو، ط. 1388. بررسی ترکیبات پلی‌فنلی، آنتوسیانینها و فلاونوئیدهای تام و خواص آنتی‌اکسیدانی گیاه دارویی قره قاط، جمع‌آوری شده از جهار منطقه مختلف ایران. فصلنامه گیاهان دارویی، 74:33 -66.
صمصام شریعت، ه. 1382. پرورش و تکثیر گیاهان دارویی. انتشارات مانی، ص420.
عسکرزاده، م. ع.، غلامی، ب. و نگاری، ع. 1387. بررسی عملکرد کمی و کیفی اکوتیپهای زیره کوهی کشور در شرایط آب و هوایی مشهد، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی خراسان.
فارماکوپه گیاهی ایران. 1381. کمیته تدوین فارماکوپه گیاهی ایران. تهران: وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی. معاونت غذا دارو. چاپ اول.
قاسمی، ع. 1389. گیاهان دارویی و معطر (شناخت و اثرات آن‌ها). چاپ دوم. انتشارات دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد. ص542.
قهرمان، ا. 1372. فلور رنگی ایران، جلد هفت. انتشارات موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع.
قربانلی، م.، فانی، پ. و ساطعی، آ. 1388. تغییرات فصلی میزان آلکالوئید و ترکیبات فنلی در گیاه مامیران (Chelidonium majus L.) در دو رویشگاه. فصلنامه پژوهشهای علوم گیاهی. 15(4): 3.
قربانی، ا.، و بخشی، د. 1390. ارزیابی مقدار کلروژنیک اسید، فلاونوئیدها و ظرفیت آنتی اکسیدانی 13 رقم ایرانی و خارجی سیب. مجله فن آوری تولیدات گیاهی، 11، ص 62-53.
مکی‌زاده تفتی، م.، نقدی بادی، ح.، رضازاده، ش.، اجنی، ی. و کدخدا، ز. 1389. ارزیابی خصوصیات گیاه‌شناسی و بازده و اجزای اسانس اکوتیپ‌های آویشن کرمانی (Thymus carmanicus Jalas) در ایران. فصلنامه گیاهان دارویی. 9(4):65-57.
هادیان، ج. 1387. بررسی تنوع ژنتیکی گونه‌های مرزه بومی ایران. رساله دکتری علوم باغبانی، دانشگاه تهران، ص 180.
همتی، خ.، بشیری صدر، ز.، برزعلی، م. و کلاتی، ح. 1386. تاثیر اقلیم و اندام‌های مختلف روی برخی فلاونوئیدهای درختچه سرخ ولیک (Crataegus monogyna). مجله علوم کشاورزی و منابع طبیعی، شماره پنجم.
همتی، خ.، قاسم‌نژاد، ع.، مشایخی، ک. و بشیری صدر، ز، 1391. مطالعه اثر رویشگاه بر میزان برخی از ترکیبات فلاونوئیدی درخت نمدار (Tilia platifolia L.). مجله پژوهش‌های تولید گیاهی، شماره دوم.
Alizadeh, M.A. and Jafari, A.A. 2011. Effect of cold --perature and growth degree days on morphological and phenological development and quality characteristics of some ecotypes of Cocksfoot (Dactylis glomerata). Middle-East Jornal of scientific Research. P. 561-566.
Atal, C.K. 1998. Cultivation utilization of medicinal plant. Jamu / Tawi-India.72: 644-648.
Avato, P., Miccolis, V. and Tursi, F. 1998. Agronomic evaluatin and essential oil content of Garlic (Allium sativum) ecotypes grown in southern Italy. Adv. Horticulture. Sci. 12: 201-204.
B--eley, K.F., Rieger, M.A. and Collins, G.G. 1996. Classification of Australian Garlic cultivars by DNA fingerprinting. Aust. J. Exp. Agric. Kagoshima Uni. 37: 21-27.
Casimir, A.C. and Min, B.D. 2008. Anti oxidants in: FOOD LIPIDS chemistry, Nutrtion, and Biotechnology. CRC Press. Boca Raton, FL. 409.
Chen, B., and Yao, S. 2005. Application of ultrasonic technique for extracting chlorogenic acid from (Eucommia ulmodies( Oliv. (E. ulmodies). Ultrasonics sonochemistry. 12: 295-300.

—c2392

3-7- استخراج عصاره متانولی24
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل24
3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی25
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC26
3-8-1- آماده سازی نمونه26
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک27
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی27
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC29
3-9-1- آماده سازی نمونه29
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین29
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی30
3-10- مشخصات طرح31
3-11- تجزیه و تحلیل آماری31
فصل چهارم- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک34
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ34
4-1-2- تعداد برگ در بوته36
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها36
4-1-4- قطر ساقه37
4-1-5- قطر و طول ریشه37
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته.37
4-1-7-ارتفاع گیاه38
4-1-8- میزان کلروفیل38
4-2- صفات بیوشیمیایی39
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل39
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل42
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل44
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل46
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل48
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید50
4-4- نتیجه گیری کلی56
4-5- پیشنهادات56
منابع58
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- طبقه بندی ترکیبات فنلی12
جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک35
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن35
جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه36
جدول4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر40
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمایی مورد بررسی با دستگاه HPLC40
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه7
شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ، ب- فیروزجاه، پ- خشک کردن گزنه21
شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید25
شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین26
شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک28
شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک28
شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین30
شکل 3-7- کروماتوگرام استاندارد روتین31
شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ41
شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل41
شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه42
شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ43
شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل43
شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه44
شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ45
شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل45
شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه46
شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ47
شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل47
شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه48
شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ49
شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل49
شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ51
شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل51
شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه52
شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی52

1-1- مقدمه
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور است که امکان صادرات آن نیز وجود دارد. ایران از نظر آب و هوا در زمینه رشد گیاهان دارویی یکی از بهترین مناطق جهان محسوب می‌‌شود، به همین دلیل صادرات آن می‌‌تواند منبع بزرگی از درآمد برای کشور باشد (صمصام شریعت، 1382). بنابراین ضروریست تا با توجه به توان بالقوه بسیار خوب کشور در زمینه تنوع گیاهان دارویی، با شناخت گونه‌‌های گیاهی و دستیابی به اطلاعات لازم در مورد محل‌‌های رویش و خصوصیات بوم‌‌شناختی آن‌ها، گام‌‌های اساسی برای استفاده از اسانس‌‌های گیاهی و ترویج شیوه‌‌های اصولی بهره‌‌برداری از این گیاهان برداشته شود (حسنی، 1383).
گیاه دارویی به گیاهان و مشتقات آن‌ها گفته می‌‌شود که دارای مواد موثر مشخص است، در درمان بیماری یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می‌‌گیرد و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه‌‌های معتبر بین‌‌المللی ذکر شده باشد (دوازده امامی و مجنون‌‌حسینی، 1387).
فارماکوپه یک کتاب رسمی است که توسط دولت هر کشور و یا انجمن‌‌های پزشکی و داروسازی زیر نظر دولت به چاپ می‌‌رسد و حاوی حقایق علمی و اصول استاندارد‌‌سازی مواد دارویی از قبیل روش‌‌های جمع‌‌آوری مواد دارویی از منابع مختلف، آماده سازی، نگهداری، ترکیب و اختلاط داروهای مختلف و روش‌‌های اثبات آن‌ها می‌‌باشد. به علاوه این کتاب شامل دارو‌‌هایی با استعمال خارجی، نحوه نسخه‌‌نویسی، نحوه و مقدار تجویز دارو‌‌ها و اطلاعات کامل تهیه، ساخت و کاربرد داروهاست (دوازده امامی، 1382).
استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده‌‌های حاصل از آن‌ها نقش این گیاهان را در چرخه اقتصادی پر اهمیت کرده است. به طوری که مصرف رو به ازدیاد آن‌ها تنها به کشور‌‌های در حال توسعه محدود نشده است، بلکه اخیراً در کشور‌‌های توسعه یافته نیز جایگاه ویژه‌‌ای به خود اختصاص داده است. در اواخر قرن بیستم حجم مبادلات جهانی گیاهان دارویی به 200 میلیارد دلار بالغ گردیده است. بر اساس گزارش سازمان خوار و بار جهانی (FAO) ارزش صادرات گیاهان دارویی در سال 1995 بالغ بر 880 میلیون دلار بوده است. بر اساس گزارش بانک جهانی، حجم تجارت گیاهان دارویی تا سال 2050 بالغ بر 5 تریلیون دلار خواهد بود (امیدبیگی، 1384). در حالی که طی گزارشی میزان ارزش فروش گیاهان دارویی در ایران در سال 2000 میلادی تنها در حدود 37 میلیارد ریال برآورد شده است و این در حالی است که ایران جزء 8 کشور مهم دارای فلور متنوع گیاهان دارویی در دنیاست (قاسمی، 1389).
گزنه از مهمترین گیاهان دارویی است که از دوران ماقبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم آن زمان از آن برای تغذیه استفاده می‌کردند و از خواص درمانی آن اطلاع داشته‌اند. از کاربرد‌‌های دارویی آن می‌توان به کاهش قند خون، کاهش التهاب آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، درمان پروستات و اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق
تاثیر ارتفاع بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی (ریخت‌‌شناسی) گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اندام‌‌های گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گیاه گزنه چگونه است؟
1-3- فرضیهها
عوامل محیطی روی میزان ترکیبات ثانویه گیاه گزنه موثر است.
شرایط محیطی متنوع در زیستگاه‌های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیکی گیاه تاثیر می‌گذارند.
میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی تحت تاثیر ارتفاع قرار دارد.
1-4- اهداف
ارزیابی تاثیر اقلیم‌‌های مختلف بر صفات ریختی و عملکرد برخی مواد موثره گزنه.
معرفی بهترین ارتفاع و اندام دارویی گزنه از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی.
مقایسه برخی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی موجود درگزنه در ارتفاعات مختلف.
-76508-504458

2- بررسی منابع
2-1- گیاه‌شناسی گزنه
گزنه با نام علمی Urtica dioica از خانواده Urticaceae می‌باشد. گزنه، گیاهی است علفی، چند‌‌ساله، پایا، دوپایه و بندرت تکپایه، ریزوم‌‌دار، به ارتفاع 150-50 سانتیمتر، دارای کرک‌‌های گزنده، ساقه آن علفی، کمی زاویه‌‌دار و چهار پهلو، تقریباً ضخیم، ساده و یا خیلی کمانشعاب و پوشیده از کرک‌‌های گزنده، برگ‌‌ها نیزه‌‌ای، نیزه‌‌ای باریک، تخممرغی، تخممرغی پهن تا تقریبا دایره‌‌ای، نوک تیز یا نوک باریک، قاعده قلبی، باریک یا گوه‌‌ای، اندازه برگ 5/2-12×5/4-15 سانتیمتر، رنگ برگ‌‌ها سبز روشن است. برگ‌‌ها عموما گوشواره‌‌دار و گاه بدون گوشواره، متقابل و پوشیده از کرک‌‌های گزنده است. گل‌‌های آن، تک جنسی، بسیار ریز، سبز فام، مجتمع در توده‌‌های کوچک کروی، و واقع در طول محورهای خوشه‌‌ای شکل، گل‌‌های نر دارای 4 کاسبرگ هم اندازه و 4 پرچم با بساک‌‌های پهن دراز و قلوه‌‌ای شکل، ماده‌‌ها دارای 4 کاسبرگ متقابل صلیبی، دو کاسبرگ خارجی بسیار کوچک و گاهی گل فاقد آن و رنگ آن‌ها سبز مایل به زرد می‌‌باشد. گلآذین سنبله یا خوشهای مرکب، کرکی متراکم، گل‌آذین نر 4-11 سانتیمتر و ماده 5/1-9 سانتیمتر میباشد میوه آن فندقه تخم‌مرغی تا بیضوی و محتوی آلبومین روغن‌‌دار است. فندقه به طول 5/1 میلی‌‌متر و محصور در کاسه پایای گل می‌‌باشد (شکل 2-1)، (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ قهرمان، 1372).
تکثیر آن از طریق کاشت بذر در بهار یا تابستان و کاشت قطعات ریشه‌‌دار در پاییز صورت می‌‌گیرد (زرگری، 1383).

شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه (ویلر، 1981)
2-2- دامنه انتشار
این گیاه غالبا در اماکن مخروبه، باغ‌‌ها، و نقاط مرطوب خارج شهر و نواحی سایه‌‌دار و جاهایی که چهار‌‌پایان در آنجا به سر می‌‌برند، به حالت خودرو می‌‌روید. از ریشه‌‌‌‌های خزنده آن پاجوش‌‌هایی در کلیه جهات خارج می‌‌گردد که خود باعث می‌‌شود گیاه بصورت پایه‌‌های متعدد در آمده، تا محل رویش خود را به کلی فرا گیرد. انتشار عمومی گیاه گزنه در نقاط مرطوب ایران خصوصاً نواحی شمالی، غربی و مرکزی مانند اصفهان، شاهرود، بسطام و کاشان است (زرگری، 1376).
2-3- اندام‌های دارویی
برگ‌‌ها، ریشه، دانه و شیرابۀ گیاه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌‌دهند (زرگری، 1376). گلدهی آن از اواسط اردیبهشت تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد و بهترین زمان برداشت و جمع‌‌آوری برگ‌‌‌‌های این گیاه از اردیبهشت‌‌ تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی
گزنه دارای تانن، موسیلاژ، اسید فورمیک، ماده مومی، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کنندگی پوست، نیتراتپتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن‌‌دار، گوگرد و نوعی ماده رنگی به نام اورتی‌‌سین در سر شاخه هوایی می‌‌باشد (زرگری، 1376). در برگ گیاه گزنه، کلروفیل، گزانتوفیل، لوکوآنتوسیانیدین، فلاوون و فلاونول موجود است که فلاوون و فلاونول به میزان کمتری از لوکوآنتوسیانیدین در این گیاه است. تری‌‌ترپن‌‌ها و استرول‌‌ها شامل بتاسیتوسترول در گیاه موجود است. اسید فرمیک نیز در برگ وجود دارد. برگ‌‌های تازه گزنه حاوی سکرتین می‌‌باشد. همین‌‌طور دارای 5/1 درصد کلروفیل خالص است. برگ خشک گزنه 5/7 درصد کلروفیل دارد. اسیدهای فنلی نیز در این گیاه وجود دارد که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، اسکولتین و کافئوئیل مالیک اسید و کلروژنیک اسید می‌‌باشد. تری گلیسیرید، دی گلیسیرید و فسفولیپید‌‌های مختلفی هم از این گیاه جدا شده است. سیتوکنین‌‌های عمده گزنه شامل زآتین، زآتین نوکلئوتید، ایزو پنتیل آدنین، ایزو پنتیل آدنوزین، ایزو پنتیل آدنین نوکلئوتید و دی هیدرو زآتین می‌‌باشد. همچنین ترکیبات ایندولی همراه با هیستامین و 5- هیدروکسی تریپتامین و اسید‌‌هایی از جمله اسید آسکوربیک، سالیسیلیک اسید و عناصری مانند ازت، گوگرد، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و عناصر نادر مانند آهن، روی، مولیبدن و مس موجود است (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
ترکیبات فنلی موجود در گزنه که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، فیستین و میریستین می‌‌باشند. بر باکتری‌‌هایی مثل اشریشیاکلی، پروتئوس ‌‌ولگاریکوس، کلبسیلا و پسودوموناس اثر دارد و عصاره این گیاه بر سالمونلا و پروتئوس که در مقابل آنتی‌‌بیوتیک‌‌ها مقاوم است، خاصیت آنتی‌‌بیوتیکی دارد. همچنیین باعث وقفه در رشد چندین مخمر، کپک، قارچ و باکتری شده است. اثرات ضد قارچی بعضی ترکیبات موجود در گزنه نیز تائید شده است. گزنه دارای اثرات مدری است. اثرات دیورتیک این گیاه با افزایش دفع کلر و اوره همراه است و ثابت شده که مصرف 14 روزه این گیاه موجب کاهش وزن بدن و نیز کاهش فشار سیستولیک می‌‌گردد (محمودی و همکاران، 2007). گزنه بصورت خوراکی به عنوان مدر، پایین آورنده قند خون و اسید اوریک و به صورت موضعی در درمان برخی از بیماری‌‌های پوستی و مو از جمله اگزما، بیماری‌‌های التهابی و حتی در درمان ریزش مو مورد استفاده قرار می‌‌گیرد (محمودی و همکاران، 2007). اعتقاد بر این است که جوشانده گیاه و خیسانده ریشه آن در الکل بصورت لوسیون در رشد موی سر موثر است. همچنین عصاره ریشه گزنه در بعضی حالات هیپرتروف غده پروستات را بهبود می‌بخشد (آزاد بخت، 1378). از دیگر کاربردهای دارویی گزنه می‌‌توان به درمان آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، بزرگ شدگی ‌‌پروستات، حساسیت فصلی و درمان اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی
پراکنش و استقرار گیاهان اصولاً تحت تاثیر شرایط محیط و عوامل داخلی گیاه صورت می‌‌گیرد. مهم‌‌ترین عوامل موثر بر ترکیبات شیمیایی ثانویه گیاهان عوامل ژنتیکی، محیطی و اثرات متقابل آن‌ها ست. عوامل ژنتیکی مربوط به ژنوم گیاه است. از عوامل محیطی و اکولوژیکی مؤثر می‌‌توان عوامل آب و هوایی، جغرافیایی و ادافیکی (خاکی) را نام برد. عوامل آب و هوایی مانند دما، بارندگی، طول روز، نور خورشید، تبخیر و تعرق و باد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌‌های ثانویه این گیاهان دارند. ارتفاع از سطح دریا، درصد شیب و جهت آن، عرض جغرافیایی، پوشش اراضی، نزدیکی به منابع آبی به طور مستقیم یا غیر مستقیم به واسطه تأثیر بر سایر عوامل بوم شناسی بر سنتز ترکیبات ثانویه به خصوص اسانس در گیاهان موثر هستند. خصوصیات خاک مثل بافت خاک، مواد آلی، آهک، شوری و اسیدیته از فاکتورهای محیطی می‌‌باشند که باید مورد مطالعه قرار گیرند. در صورتیکه گیاه اهلی شده باشد عوامل مدیریتی نیز تاحدودی بر درصد ترکیبات ثانویه گیاهان دارویی موثر است (قاسمی، 1389). از مهمترین عوامل محیط رویش گیاهان که تاثیر بسیار عمده‌‌ای بر کمیت و کیفیت مواد موثره آن‌ها می‌‌گذارند، نور، درجه‌‌حرارت، آبیاری و ارتفاع محل می‌‌باشد (امید بیگی، 1384). بر پایه تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محـور زیـر بر آن‌ها تاثیـر می‌‌گـذارد: 1- تاثیر بر مقدار کلی ماده موثره گیاهان دارویی؛ 2- تاثیر بر عناصر تشکیل دهنده مواد موثره؛ 3- تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه (امیدبیگی، 1384).
به‍طور‌‌ کلی مواد مؤثره گیاهان دارویی که حاصل سوخت‌‌و‌‌ساز (متابولیسم) ثانویه است به ‍عنوان ترکیبــات ثانویه معروف می‌‌باشند. این ترکیبات عموماً وزن مولکولی کمتر از 1000 داشته و به ‍مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول‌های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولیـد می‌شوند. گیـاهان دارای این نوع مکانیـسم‌ها، نسبت به سایر گیاهان از سازگاری و بقای طولانی‌‌تری برخوردارند (تایز و زایگر، 1379). مهـم‍ترین آن‌ها آلــکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن‌‌های فرار (اسانس‌ها)، فنلها، تانن‌ها، فلاونوئیدها و غیره هستند. تولید این ترکیبات برای گیاه گران و هزینه‍بر می‌باشند، ولی گیاه این ترکیبات را بیهوده تولید نمی‌کند و اهـداف خاصی جهت تولید، ترشح و ذخیره آن‌ها دارد که مهم‍ترین این وظایف به شرح زیر است:
- دفع عوامل بیماریزا
- دفع آفات و حیـوانات گیاه‍خوار
- افزایش توان رقابتی گیاه بر سر منابع مانند نور، آب و مواد غذایی
- جلب حشرات و پرندگان گردهافشان
- رفع تنشهای غـیرزنده و حفاظت در برابر اشعۀ ماوراء بنفش (قاسمی، 1389).
2-6- فنل و فلاونوئید
ترکیبات فنلی به یک گروه وسیع و متنوعای از ترکیبات شیمیایی اطلاق میشود که این ترکیبات می‌‌توانند به روش‌‌های مختلفی طبقه‌‌بندی شوند. هاربورن و سیموندس این ترکیبات را به گروه‌‌هایی بر اساس تعداد کربن‌‌های موجود در مولکول طبقه‌بندی کردند (جدول 2-1) (ورمریس و نیکولسون، 2006).
ترکیبات فنولی در طی رشد و نمو با هدایت عوامل ژنتیکی و در پاسخ به محرکهای محیطی از جمله آلودگی، زخم و تابش فرابنفش ساخته میشوند که از میان آنها میتوان به لیگنینها، لیگنانها، فنلهای ساده و اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها اشاره کرد. این ترکیبات بخش جدایی ناپذیری در رژیم غذایی بشر بوده و به دلیل ویژگیهای آنتیاکسیدانی قوی و ضدسرطانی، بسیار مورد توجه است (قربانی و همکاران، 1390؛ محمد و همکاران، 2001؛ دینکا و همکاران، 2004؛ اسکین و رابینسون، 2000).
ترکیبات فنولی دارای خواص متعددی از جمله خواص آنتی باکتریال، ضدقارچ، ضدویروس، ضددیابت، ضدالرژی و ضدالتهاب هستند. اما بیشتر به منظور فعالیت‌های ضدویروسی و آنتی‌اکسیدانیشان شهرت دارند به خصوص در بعضی از اسیدهای فنولیکی مانند اسیدکلرژنیک، اسیدگالیک و اسیدکافئیک (دیمیتری جویک و همکاران، 2010).
فلاونوئیدها دسته‌‌ای از ترکیبات طبیعی هستند که در سلسله گیاهان گسترش وسیعی دارند. آن‌ها به عنوان یکی از بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی شناخته می‌‌شوند. تا به امروز متجاوز از 4000 فلاونوئید شناخته شده است که به طور وسیعی در برگ‌‌ها، دانه‌‌ها، پوسته و گل‌‌های گیاهی وجود دارند. به‌‌طور کلی فلاونوئیدها بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی فنلی در گیاهان هستند و به دلیل حضور آن‌ها در تقریبا همه گروه‌‌های گیاهی، در بیشتر مطالعات مربوط به عصاره‌‌های گیاهی مورد بررسی قرار می‌‌گیرند (مدیکا و همکاران، 2004).

جدول 2-1- طبقهبندی ترکیبات فنلی (ورمریس و نیکولسون، 2006).

فلاونوئیدها به عنوان یکی از گستردهترین متابولیتهای ثانویه در گیاهان هستند که فعالیتهای مختلفی را بر عهده دارند. آنها دارای اثرات و عملکرد بسیار مفیدی بر سلامتی انسان هستند که دارای شش زیر گروه میباشند: فلاوونها، ایزو فلاوونها، فلاونولها، فلاونون، آنتوسیانین‌‌ها و آنتوسیانیدین. فلاونوئیدها معمولاً در واکوئل گیاهان به صورت گلیکوزید تجمع مییابند. فلاونها مخصوصا کامپفرول و کوئرستین در بسیاری از گونههای گیاهی وجود دارد که برای جوانهزنی گرده و رشد لوله گرده ضروری است (جاکولا و هوتولا، 2010؛ کاسیمیر و مین، 2008).
فلاونوئیدها ترکیبات دیفنیل پروپانوئیدهایی هستند که تقریبا در همه گیاهان یافت می‌‌شوند و نقش‌‌های فراوانی برای این ترکیبات شناخته شده است، در گیاهان عالی، فلاونوئیدها دفاع در برابر نور ماورابنفش، پاتوژن‌‌ها و علف‌‌خوران را سبب می‌‌شوند. نقش‌‌های ویژه‌‌ آن‌ها در گیاهان، در ایجاد رنگ و تثبیت نیتروژن در گیاهانی است که دارای زندگی همزیستی‌‌اند. اثرات سلامت فلاونوئیدها بیشتر در نتیجه خاصیت آنتی‌‌اکسیدانی و توانایی کلات‌‌کنندگی آن‌ها ست. مطالعات زیادی انجام شده است تا موثر بودن فلاونوئیدها به عنوان، عوامل ضدقارچی، ضدباکتری، ضدویروسی، ضداشتعال، آنتی‌‌اکسیدانت، متعادل کننده ایمنی، بازدارنده آنزیمی و عوامل موتاژنی سمی به اثبات رساند (مدیکا و همکاران، 2004).
روتین نوعی فلاونوئید است، روتین در پیشگیری و درمان افزایش فشار خون و سایر نارسائیهای قلبی و عروقی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی مطرح است (افشار و همکاران، 1376).
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد
عملکرد، میزان و کیفیت مواد ثانویه یک گیاه در رویشگاه‌‌ها و مناطق مختلف تغییر می‌‌یابد، دلیل این امر نوسان فعالیت‌‌های متابولیکی گیاه تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی است، نتیجه تاثیر طولانی عوامل محیطی، تشکیل جمعیت‌‌های تازه زیرگونه‌‌ای یا اکوتیپ‌‌های مشتق از یک گونه گیاهی خاص است (امیدبیگی، 1388). تفاوت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بین اکوتیپ‌‌های گیاهی به اثبات رسیده است و این اختلافات می‌‌تواند به منظور انتخاب بهترین کمیت و کیفیت مورد استفاده قرار گیرد (آواتو و همکاران، 1998؛ برادلی و همکاران، 1996). در دهه اخیر در کشورهای مطرح دنیا در زمینه تولید گیاهان دارویی مانند مجارستان، ایتالیا و اسلواکی بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و ترکیبات ثانویه به منظور به کارگیری در برنامه‌‌های به‌‌نژادی صورت گرفته است و اکوتیپ‌‌های برتر نسبت به ارقام اصلاح شده شناسایی گردیده‌‌اند (من و استابا، 1986). در ارزیابی خصوصیات گیاهشناسی، درصد و اجزای اسانس اکوتیپ‌‌های آویشن کرمانی توسط مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران (1389)، نتایج نشان داد که بیشترین ارتفاع بوته، قطر بوته، تعداد شاخساره، طول و عرض برگ، وزن تر و وزن خشک بوته مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین مربوط به اکوتیپ شاهرود بود، ولی تعداد شاخساره در بوته، طول برگ و عرض برگ در هیچ یک از اکوتیپ‌‌ها با اکوتیپ دیگری اختلاف معنی‌‌داری نداشت. عسکرزاده و همکاران (1387) در مقایسه 8 اکوتیپ زیرهکوهی از نقاط مختلف ایران در شرایط مزرعه به منظور بررسی عملکرد کمی و کیفی گزارش کردند که بیشترین عملکرد تکبوته مربوط به اکوتیپ منطقه خواجه خراسان و کمترین عملکرد مربوط به اکوتیپ کوه باقران بیرجند بود. نتایج مطالعه‌‌ای روی بررسی مورفولوژی، فنولوژی و برخی مشخصات کیفی چند اکوتیپ علف باغ از مناطق مختلف ایران و یک اکوتیپ خارجی در شرایط آزمایشگاه نشان داد که بالاترین ارتفاع بوته مربوط به اکوتیپ همدان و کمترین مربوط به اکوتیپ کرج، بیشترین میزان وزنتر متعلق به اکوتیپ خارجی و کمترین متعلق به اکوتیپ همدان بود در حالیکه بیشترین وزن خشک در اکوتیپ اردبیل و کمترین در اکوتیپ خارجی مشاهده شد (علیزاده و جعفری، 2011). به منظور بررسی اجزای عملکرد، مورفولوژی اکوتیپ‌‌های بومی یونجه کشور ترکیه آزمایشی توسط سینگ در سال 2002 انجام شد و نتایج این آزمایش بدین صورت بود که بالاترین ارتفاع بوته متعلق به اکوتیپ محمودی و کوتاهترین متعلق به اکوتیپ ارسیس3 بود، اکوتیپ قاسم‌‌اوغلو بیشترین تعداد ساقه و اکوتیپ‌‌های الاکوی و کایرباسی کمترین تعداد ساقه را داشتند، بیشترین تعداد غلاف در اکوتیپ محمودی و کمترین در اکوتیپ گلگورن مشاهده شد.
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیتهای ثانویه
اصولاً مواد ثانویه به اقتضای ساختار طبیعی (وراثت) و هم تحت تاثیر تهییج‌‌های غیرطبیعی(تنشی) در گیاه ساخته می‌‌شوند به‌طوری‌که حضور برخی از این مواد در تعدادی از افراد یک گونه، به‌طور مستثنی از افراد دیگر ممکن است به منزله نشانه فعالیت ژن‌‌های خاص سازگاری آن افراد نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی به شمار آید و افراد مذکور را به عنوان یک جمعیت زیرگونه‌‌ای متفاوت از بقیه که نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی پاسخ شیمیایی ویژه‌‌ای دارند معرفی کند (فیتر و هی، 1987). طی مطالعه‌‌ای با هدف بررسی توده‌‌های محلی مرزه تابستانه نتایج نشان داد که تنوع قابل توجهی از نظر صفات بیوشیمیایی بین توده‌‌ها وجود دارد، میانگین بازده اسانس توده‌های مختلف بین 57/0 و 9/2 درصد متنوع بود که کمترین مقدار آن در توده ارومیه و بیشترین آن متعلق به توده اهواز بود، توده‌‌های اراک، نیشابور، مریوان و اهواز به ترتیب با میزان کارواکرول 3/83، 3/83، 9/76 و 67 درصد در گروه توده‌های غنی از کارواکرول قرار گرفتند (هادیان، 1387).
نتایج تحقیقی با موضوع ارزیابی درصد و اجزای اسانس چندین اکوتیپ‌‌ آویشن کرمانی از مناطق مختلف کشور با ارتفاع مختلف نشان داد که بازده اسانس بر حسب حجم اسانس در 100 گرم سرشاخه خشک در اکوتیپ کرمان- راین، 5/2 درصد، در اکوتیپ کرمان- سیرچ، 9/1 درصد، در اکوتیپ یزد، 2 درصد، در اکوتیپ شاهرود، 8/1 درصد و در اکوتیپ اصفهان، 5/1 درصد بود. همچنین در بررسی میزان ترکیبات غالب اسانس، بیشترین میزان کارواکرول در اکوتیپ کرمان- راین و بیشترین میزان تیمول در اکوتیپ شاهرود مشاهده شد (مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران، 1389). زینلی و همکاران (1386) در بررسی ژنوتیپ‌‌های مختلف دو گونه نعناع لانگیفولیا و اسپیکاتا پس از استخراج اسانس، شناسایی و تعیین مقدار اجزای اسانس با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی، گزارش کردند که توده‌‌های مختلف از لحاظ میزان اسانس و ترکیبات اسانس با هم اختلاف قابل‌‌ توجهی داشتند، این محققین اختلاف در میزان اسانس را مربوط به بالا بودن تعداد برگ و ارتفاع زیاد در تیمارهای با اسانس بالا اعلام کرد و پیشنهاد کردند که از این فاکتورها می‌‌توان به عنوان معیار انتخاب در بین ژنوتیپ‌ها در جهت افزایش عملکرد اسانس استفاده نمود. نری و همکاران (2009) در آزمایشی به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی اکوتیپ‌‌های مختلف شاه‌‌بلوط شیرین مناطق مختلف ایتالیا به این نتیجه رسیدند که بالاترین میزان ساکارز در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا و کمترین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو بود درحالیکه بیشترین میزان پروتئین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو و کمترین میزان در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا مشاهده شد، همچنین درصد اسید مالیک، پلی‌‌فنل‌‌ها و خواص آنتی‌‌اکسیدانتی در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو به طور معنی‌‌داری بالاتر از اکوتیپ وال‌‌کاستلانا بود. طی مطالعه‌‌ای مقایسه‌‌ای اکوتیپ‌‌های مختلف سیر از مناطق مختلف کشور از لحاظ میزان ماده آلیسین مورد مقایسه قرار داده شدند و نشان داده شد که اختلاف در میزان آلیسین در بین اکوتیپ‌‌ها نسبتاً زیاد بود بهطوری که بالاترین میزان (13 درصد) در اکوتیپ گرگان و کمترین میزان (61/1 درصد) در اکوتیپ تالش یک بود، و اکوتیپ‌‌های تارم 1، تربت‌‌جام، بهشهر و تالش 2 از لحاظ میزان آلیسین با هم اختلاف معنی‌‌داری نداشتند.
همتی و همکاران (1386) با بررسی تاثیر اقلیم و اندامهای مختلف روی برخی فلاونویید‌‌های درختچه سرخ ولیک، نشان دادند که اثرات متقابلی بین مکان و صفات وجود دارد و آن‌ها به این نتیجه رسیدند که میزان کوئرستین در اندام کل گیاه سرخ ولیک در کلاردشت مازندران بیشتر از گرگان بود. در بررسی دیگری که جایمند و همکاران (1388) با استفاده از استخراج و اندازهگیری ترکیب‌‌های فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی در مناطق غربی ایران انجام دادند دریافتند که بهترین اکشن‌‌ها از نظر میزان ترکیب‌‌های کامفرول و کوئرستین به ترتیب شامل آذربایجان غربی، ایلام و اردبیل بودند.
یکی از محققان در سال 1973 نسبت به کاشت گونه‌‌ای گل انگشتانه‌‌ در چهار نقطه که از نظر ارتفاع متفاوت بودند (بین 660 تا 1840 متر ارتفاع از سطح دریا) اقدام نموده و پس از مطالعات لازم به این نتیجه رسید که کاشت این گیاه در ارتفاعات بالا بویژه سبب کاهش برخی کلیکوزیدها می‌‌گردد (امیدبیگی، 1384). در تحقیقاتی که در سال 1975 در اتیوپی روی گونه‌‌ای از ریحان انجام گرفت معلوم گردید که در ارتفاعات پایین مقدار لینالول موجود در اسانس گیاه مذکور افزایش می‌‌یابد، در حالی که کاشت این گیاه در ارتفاعات باعث افزایش تولید اوژنول موجود در اسانس می‌‌گردد (امید بیگی، 1384).
تجلی و همکاران (2002) با بررسی تأثیر ارتفاع و اندامها بر روی فنول و فلاونوئید گیاه Carateagus Microphylla بیان داشتند که این گیاه در ارتفاع 1000 متری، دارای بیشترین سطح فنول و فلاونوئید نسبت به گیاهان رشد یافته در ارتفاعات پست بوده است. قاسمی و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتی اکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد.
گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تأثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتی‌کسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیای غربی نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
سپهری‌‌فر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی در عصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره‌‌قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌‌باشد.
نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (2006) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمعآوری شده در سالهای متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

-104361-473572

3- مواد و روش‌ها
3-1- مواد گیاهی
در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
3-2- وسایل و دستگاههای مورد استفاده
کلروفیلسنج: جهت اندازهگیری میزان کلروفیل برگ
خطکش
ترازوی دیجیتال
آسیاب برقی
دستگاه موقعیت سنج (GPS)
سانتریفوژ آزمایشگاهی
دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
3-3- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرفها از شرکت مرک و حلالها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
3-4- آمادهسازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمعآوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال 1390 در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال 91) جهت جمعآوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمعآوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل 3-1). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با استفاده از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش 18 عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمعآوری شد با استفاده از دستگاه موقیعتسنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول 3-1). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول 3-2). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 13 صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گلآذین، تعداد گلآذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.

جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

3-7- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره 18 گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن100 میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با 10 سی‌‌سی متانول 80 درصد (نسبت 1 به 10) مخلوط شد. سپس نمونهها به مدت 24 ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک میباشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکیوالانت اسید گالیک بیان میگردد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با 16/1 میلی‌‌لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از 8-1 دقیقه استراحت، 300 میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (6/10 گرم در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در حمام بخار oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیکاسید (50، 100، 200، 250، 350 میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (50:50) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل 3-2).

شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) استفاده شد؛ به این صورت که 5/0 میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلی‌‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید 10درصد در اتانول (10 گرم آلومینیوم کلرید در 100 میلی‌‌لیتر اتانول و آبمقطر)، 1/0 میلی‌‌لیتر استاتپتاسیم یکمولار (41/2 گرم در 10 میلی‌‌لیتر آب مقطر) و 8/2 میلی‌‌لیتر آبمقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (10، 50، 100 و 200 میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل 3-3).

شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC
3-8-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- 7100
دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- 2450
آون ستون: هیتاچی ال-2300
نوع ستون: آر پی- 18 با ابعاد 6/4 250 میلی‌متر و اندازه ذرات 5 میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 1 میلیلیتر اسیداستیک، 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و 10 میلیلیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استاندارد‌‌های اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های 10، 20، 50، 100، 150 و 200 و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های 20، 25، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-4 و 3-5).
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد اسید کلروژنیک و اسید کافئیک به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد نمونهها در طول موج 330 نانومتر قرائت شد.
میزان اسید کلروژنیک و اسید کافئیک بر حسب درصد بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم. واحد مجهول (x) برحسب پی‌‌پی‌‌ام می‌‌باشد.

شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک

شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC
3-9-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فلاونوئیدی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 50 میلیلیتر متانول خالص مرک، 49 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه شده و 1 میلیلیتر اسید استیک با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر (مدت زمانی که طول می‌‌کشد تا ترکیب مورد نظر از ستون خارج شود) و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان روتین تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک نمونه بیان گردید (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد برای روتین غلظت‌‌های 20، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-6).

شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد روتین به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به روتین در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد (شکل 3-7). برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد. نمونهها در طول موج 285 نانومتر قرائت شد. میزان روتین بر حسب درصد یا میلیگرم بر گرم وزن خشک بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم.

شکل 3-7- کروماتوگرام نمونه استاندارد روتین در دقیقه 4:50
3-10- مشخصات طرح
برای انجام این تحقیق از طرح کاملاً تصادفی به صورت آشیانه‌ای استفاده شد. در این طرح اثر چهار ارتفاع در هر یک از دو استان مازندران و گلستان بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مورد بررسی قرار گرفت. برای ویژگی‌های مورفولوژیکی از پنج تکرار و برای ویژگی‌های بیوشیمیایی از سه تکرار استفاده شد. طرح آشیانه‌ای یا نستد در واقع یک طرح کاملاً تصادفی چند مشاهده‌ای می‌باشد، در این تحقیق استان به عنوان تیمار می‌باشد و ارتفاع نقش تکرار را دارد، و از آنجایی که چند نمونه در هر ارتفاع برداشت می‌شود به این طرح‌ها چند مشاهده‌ای گفته می‌شود.
3-11- تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس داده‌های به دست آمده با نرم‌افزار SAS انجام شد و به علت معنی‌دار شدن اثر متقابل ارتفاع در استان، مقایسه میانگین این اثر به کمک نرم‌افزار MSTAT و با روش آزمون دانکن صورت پذیرفت، رسم نمودارها نیز با نرم‌افزار Excel انجام شد.

-225529-624053

4- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک
نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گزنه نشان داد که بین دو استان مازندران و گلستان در تمامی صفات به جزء تعداد گل آذین در بوته اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان، در همه صفات معنی‌دار بود (جدول 4-1). جدول 4-2 مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان را برای صفات مورفولوژیک نشان میدهد.
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که مقدار هر سه صفت طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ با افزایش ارتفاع کاهش یافت به طوریکه بیشترین مقدار طول برگ (3/14 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری استان گلستان و کمترین مقـدار آن (9/6 سانتیمتر) در ارتفاع 2250 متری استان مازندران بدست آمد.
بیشترین مقدار عرض برگ (16/9 سانتیمتر) در ارتفاع 10 متری مازندران و کمترین مقدار آن (5/5 سانتی‌متر) در ارتفاع 2250 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین نسبت طول به عرض برگ (85/1) در ارتفاع 1450 متری گلستان و کمترین مقدار آن (18/1) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد.
تجزیه همبستگی نشان داد که دو صفت طول و عرض برگ همبستگی مثبت بالا (71/0=r) دارند (جدول 4-3).


جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک

*، ** و ns به ترتیب نشان معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دارمی‌باشد.
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن

در هر ستون حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است.

جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه

*، ** و ns به ترتیب نشاندهنده معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
4-1-2- تعداد برگ در بوته
با افزایش ارتفاع، تعداد برگ در بوته کاهش محسوسی نشان داد به طوریکه در ارتفاعات پایین مازندران و گلستان تعداد برگ در بوته، به ترتیب 8/84 و 2/80 عدد بود اما در ارتفاع 2250 متری این تعداد به 2/19 و 4/36 عدد کاهش یافت.
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها
با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان، تعداد گره در گزنه کاهش اما فاصله گره‌ها افزایش نشان داد. در پایین‌ترین ارتفاع مازندران و گلستان تعداد گره به ترتیب 23 و 2/26 عدد بود اما در بالاترین ارتفاع دو استان این تعداد به 6/9 و 11 عدد کاهش یافت.
بیشترین فاصله گره (48/8 سانتی‌متر) مربوط به استان مازندران و ارتفاع 1450 متری بود که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری اختلاف معنی‌دار نداشت. کمترین فاصله گره (4/3 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد. با توجه به همستگی منفی و بالا (71/0= r) بین دو صفت تعداد و فاصله گره، می‌توان نتایج حاصله را مورد انتظار دانست، یعنی در ارتفاعات افزایش فاصله گره‌ها در نتیجه کاهش تعداد گره قابل توجیه هست.
4-1-4- قطر ساقه
بیشترین میزان قطر ساقه که به ترتیب 05/7 و 98/6 میلی‌متر بود در ارتفاعات 1450 و 2250 متری گلستان و کمترین مقدار آن (44/4 میلی‌متر) در ارتفاع 10 متری مازندران مشاهده شد.
4-1-5- قطر و طول ریشه
با افزایش ارتفاع روند مشخصی برای دو صفت قطر و طول ریشه مشاهده نشد، بهطوری که بیشترین مقدار قطر ریشه (01/5 میلی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری این استان و همچنین ارتفاع 10 متری مازندران اختلاف معنی‌داری نشان نداد (05/0 ≤ P) کمترین مقدار قطر ریشه (02/3 میلی‌متر) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین مقدار طول ریشه (01/31 سانتی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد.
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته
بین دو استان از نظر تعداد گل آذین اختلاف معنی‌دار (05/0 ≤ P) مشاهده شد. میانگین تعداد گل آذین در بوته، در گلستان 8/46 عدد بود، در حالی‌که در مازندران 35/41 عدد بود. در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، مشخص شد که استان گلستان با ارتفاع 1450 متر بیشترین تعداد گل آذین (2/59 عدد) را داشت در حالیکه در ارتفاع 750 متری مازندران کمترین تعداد گل آذین (8/35 عدد) مشاهده شد.
تعداد گل آذین در بوته با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره، قطر ساقه و طول ریشه همبستگی مثبت و معنیداری نشان داد.
اندازه گل آذین در مناطق نمونه برداری کم و بیش مشابه بود، تنها در ارتفاع 1450 متری مازندران گزنه‌هایی با اندازه گل آذین بالاتر (52/5 سانتی‌متر) نسبت به سایر مناطق مشاهده شد.
4-1-7- ارتفاع گیاه
افزایش ارتفاع نقش موثری در کاهش ارتفاع گیاه گزنه داشت، بهطوری‌که نتایج نشان داد در ارتفاعات پایین (تا 750 متر) ارتفاع بوته‌ها بالا بود اما در ارتفاعات بالاتر کاهش چشمگیری در ارتفاع گیاه مشاهده شد. بیشترین ارتفاع گیاه (3/120 سانتی‌متر) در استان مازندران با ارتفاع 750 متر بدست آمد و کمترین مقدار این صفت (2/77 سانتی متر) در ارتفاع 2250 متری مازندران مشاهده شد که البته با ارتفاع 2250 متری گلستان اختلاف معنی‌دار نداشت.
ارتفاع گیاه گزنه با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره و طول ریشه همبستگی مثبت و معنی داری داشت (جدول 4-3).
4-1-8- میزان کلروفیل
با افزایش ارتفاع میزان کلروفیل روند افزایشی داشت بهطوری که بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد در حالیکه مقدار این صفت در ارتفاع 750 متری 3/27 درصد بود. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که میزان کلروفیل با طول برگ و تعداد گره، همبستگی منفی و معنی‌دار و با فاصله گره (40/0= r) همبستگی مثبت و معنی‌داری داشت (جدول 4-3).
طبق نتایج بدست آمده، صفات مورفولوژیکی و بیوشمیایی گیاه گزنه تحت تاثیر شرایط محیطی مختلف ناشی از تغییر ارتفاع محل رویش قرار گرفتند، یهطوری‌‌که ارتفاعات بالا در دو استان مازندران و گلستان به خصوص منطقه له کوه بابل با ارتفاع 2250 متر از سطح دریا، دارای بیشترین تاثیرپذیری از افزایش ارتفاع بودند. با توجه به داده‌های هواشناسی (جدول 3-1) با افزایش ارتفاع، دما به طور محسوسی کاهش یافت به‌طوری‌که میانگین دمای سالیانه از 17 درجه سانتی‌گراد در پایینترین ارتفاع به 8 درجه سانتیگراد در بالاترین ارتفاع رسید و از آنجایی که رشدونمو اندام‌های گیاهی در شرایط دمای پایین کاهش می‌یابد بسیاری از صفات مورفولوژیکی مورد بررسی در این مطالعه نظیر طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه کاهش یافت. در بسیاری از گیاهان تاثیر دمای پایین در کاهش خصوصیات رویشی به اثبات رسیده است (امیدبیگی، 1379). همزمان با کاهش دما در ارتفاعات بالا میزان کلروفیل افزایش نشان داد، افزایش درصد کلروفیل در شرایط سرد نوعی مقاومت در برابر سرما محسوب می‌شود تا گیاه بتواند تا حدودی خسارات ناشی از کاهش فتوسنتز را جبران کند (اسپیرینگ و کارلاندر، 1979).
4-2- صفات بیوشیمیایی
نتایج تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر و دستگاه HPLC نشان داد که اثر متقابل ارتفاع در استان برای تمامی صفات معنی‌دار بود (جدول 4-4 و جدول 4-5). مقایسه میانگین نیز برای این صفات انجام شد.
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج بررسی‌ها نشان داد که با افزایش ارتفاع، میزان فنل در اندام‌های مختلف گزنه افزایش می‌یابد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل برگ (57/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر، فنل کل برگ کاهش محسوسی نشان داد، ارتفاعات بالای استان گلستان نیز از فنل بالاتری نسبت به ارتفاعات پایین ر برخوردار بودند (شکل 4-1).
میزان فنل کل ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری که بیشترین میزان آن (38/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (48/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-2).
در ریشه نسبت به اندام‌های دیگر میزان فنل کل کاهش محسوسی نشان داد و حتی اختلاف کمتری در ارتفاعات مختلف مشاهده شد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل ریشه (21/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (09/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-3).

جدول 4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه HPLC

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.

شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان میزان فلاونوئید کل در اندام‌های مختلف افزایش یافت، به‌طوری‌که بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ (64/5 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، در ارتفاع 1450 متری مازندران مقدار آن به 94/4 میلی‌گرم بر گرم رسید و پس از آن ارتفاعات بالای گلستان بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ را داشته‌اند. کمترین میزان فلاونوئید برگ (3 میلی‌گرم بر گرم) مربوط به ارتفاع 50 متری گلستان بود (شکل 4-4).
مقدار فلاونوئید کل ساقه وگل نسبت به برگ کاهش نشان داد اما همچنان در ارتفاعات بالاتر مقدار بیشتری از این ماده در اندام‌های ساقه و گل وجود داشت. بیشترین میزان فلاونوئید ساقه و گل (98/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران حاصل شد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر میزان آن کاسته شد اما در سایر مناطق نمونه برداری میزان این ماده تقریباً یکسان بود و با هم اختلاف معنی‌داری نداشتند (شکل 4-5).
فلاونوئید کل ریشه کاهش چشمگیری نسبت به برگ و ساقه و گل داشت به‌طوری‌که بیشترین میزان آن (53/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و سایر مناطق مرتفع دو استان میزان تقریباً مشابهی از فلاونوئید کل را در اندام ریشه داشتند، کمترین میزان این ماده (1/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران بدست آمد (شکل 4-6).

شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل
مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ گیاه گزنه نشان داد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع میزان کلروژنیک برگ افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (29/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن ارتفاع 2250 متری گلستان مقدار کلروژنیک بالایی داشت، کمترین مقدار این ماده (1/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-7).
در اندام‌های ساقه و گل نیز بیشترین میزان اسید کلروژنیک در ارتفاعات بالا مشاهده شد، به‌طوری‌که بیشترین مقدار این ماده (3/0 میلی‌گرم بر گرم) در رویشگاه‌های 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن سایر مناطق مرتفع دو استان قرار داشتند، کمترین مقدار کلروژنیک اسید ساقه و گل (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران دیده شد (شکل 4-8).
در ریشه گزنه نسبت به اندام‌های هوایی مقدار اسید کلروژنیک کمتری دیده شد، بهطوری‌که بیشترین مقدار این ماده (13/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع مقدار این ماده در ریشه بصورت چشمگیری کاهش یافت بهطوری که در ارتفاع 50 متری گلستان به 02/0 میلی‌گرم بر گرم رسید (شکل 4-9).

شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ گیاه گزنه نشان داد که بیشترین مقدار این ماده (054/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن ارتفاع 1450 متری این استان قرار داشت، بین سایر مناطق نمونه‌برداری اختلاف معنی‌دار مشاهد نشد (شکل 4-10).
مقدار اسید کافئیک در اندام‌های ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (065/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، سایر مناطق مرتفع دو استان در جایگاه دوم قرار گرفتند و کمترین مقدار اسید کافئیک (046/0 میلی‌گرم بر گرم) در پایین‌ترین ارتفاع گلستان مشاهده شد (شکل 4-11).
نتایج بررسی‌ها نشان داد که در ریشه گزنه اسید کافئیک کمتری نسبت به سایر اندام‌ها وجود داشت و مقدار آن در ارتفاعات پایین بسیار ناچیز بود، بیشترین مقدار این اسید (021/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بود و ارتفاع1450 متری مازندران و مناطق مرتفع گلستان در رده‌های بعدی قرار گرفتند (شکل 4-12).

شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل
در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، بر میزان روتین برگ مشاهده شد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع مقدار روتین افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (34/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن، سایر مناطق مرتفع دو استان قرار گرفتند، کمترین مقدار روتین برگ (16/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-13).
نتایج مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل نیز، روندی مشابه با روتین برگ داشت، بهطوری که بیشترین مقدار آن (37/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان دیده شد (شکل 4-14).
طبق نتایج HPLC در ریشه گیاه گزنه روتین مشاهده نشد.

شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید
در همه اندام‌های گیاه گزنه، مقدار فلاونوئید کل بیشتر از فنل کل بوده است. با افزایش ارتفاع از سطح دریا میزان فنل و فلاونوئید کل به صورت چشمگیری افزایش نشان داد. در ارتفاعات کمتر از 1000 متر مقدار شیب رگرسیون بسیار کمتر از ارتفاعات بالاتر بوده است. در برگ گزنه مقدار فلاونوئید کل ارتباط بیشتری با ارتفاع نسبت به فنل کل نشان داد (96/0= r2)، به‌طوری‌که در ارتفاعات بالا شیب خط رگرسیون افزایش بیشتری نشان داد (شکل 4-15).
برخلاف برگ در اندام‌های ساقه و گل مقدار فنل کل ارتباط مثبت و معنی‌دار بیشتری با ارتفاع از سطح دریا نشان داد (95/0=r2)، بطوریکه در ارتفاعات بالاتر از 1000 متر، میزان فنل کل با شیب رگرسیونی بیشتری نسبت به فلاونوئید کل افزایش یافت (شکل 4-16).
در ریشه گیاه گزنه علاوه بر کمتر بودن مقدار فنل کل نسبت به فلاونوئید کل، پاسخ کمتری (87/0=r2) هم نسبت به افزایش ارتفاع از سطح دریا مشاهده شد (شکل 4-17).
میزان اسید کلروژنیک و روتین گیاه به طور محسوسی بیشتر از اسید کافئیک بود، همچنین بیشترین ارتباط (99/0=r2) با ارتفاع از سطح دریا، مربوط به میزان اسید کلروژنیک کل گیاه بود که بهشدت تحت تاثیر ارتفاع از سطح دریا قرار گرفت (شکل 4-18).

شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ گیاه گزنه

شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل گیاه گزنه

شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه گیاه گزنه

شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی در گیاه گزنه
میزان فنل و فلاونوئید کل و همچنین ترکیبات آن‌ها با ارتفاع از سطح دریا ارتباط مثبت و معنی‌دار داشتند، بهطوری که بیشترین میزان این ترکیبات در منطقه له کوه بابل مشاهده شد. با افزایش ارتفاع علاوه بر دما میزان رطوبت نسبی نیز کاهش یافت (جدول 3-1) و به نظر می‌رسد کاهش دما و رطوبت از مهمترین عوامل تاثیرگذار در افزایش تولید ترکیبات فنل و فلاونوئیدی باشند، هر چند در منطقه له کوه مقدار مواد آلی نیز نسبت به سایر مناطق بیشتر بود (جدول 3-2). در مطالعات مختلف تاثیر رویشگاه بر میزان متابولیت‌های ثانویه در گیاهان مختلف بررسی شده است که در اکثر موارد بر نقش رویشگاه به عنوان عامل تاثیر گذار در تجمع متابولیت‌های ثانویه تاکید شده است. مکان رشد گیاه می‌تواند از طریق تغییرات دمایی و رطوبتی بر فرآیند تشکیل مواد موثره تاثیرگذار باشد، مکانیسم تاثیرات محیط بر تجمع متابولیت‌های ثانویه به درستی روشن نیست، با این وجود این نکته روشن است که محیط از طریق تاثیری که در فرایند تولید متابولیت و عوامل مرتبط در تولید آنزیم‌ها دارد، در نوع و شدت واکنش‌های شیمیایی موثر است (همتی و همکاران، 2003؛ سیوستاوا و شیم، 2002). درجه حرارت از جمله عوامل محیطی تاثیرگذار در تشکیل و تجمع متابولیت‌های ثانویه است. بررسی‌های اولیه نشان داد که در مناطقی با درجه حرارت پایینتر تجمع فلاونوئید بیشتر است (داویس و آلبریگو، 1994). میزان مواد موثره در اندام‌های گیاهان هیچگاه ثابت نیست و متناسب با مراحل رشد گیاه و بعضی شرایط محیطی قابل تغییر است. کمیت و کیفیت ترکیبات شیمیایی وابسته به تنوع ژنتیکی، شرایط محیط و فنولوژی گیاه متغیر است (پلاتی و همکاران، 2005). در ضمن اختلاف زیادی در میزان مواد موثره یک گونه در شرایط مختلف رویشی وجود دارد (هانلیدو و همکاران، 1992). کسکیتالو و همکاران (2001) اعلام داشتند که نمی‌توان رابطه روشنی بین محصول و مقدار مواد موثره در گیاهان دارویی یافت. مهمترین عوامل در تغییرات کمی و کیفی به ترتیب به نوع گونه، زمان و مکان برداشت، تغییرات فصلی و روش‌های عصارهگیری بستگی دارد. اوماه و مازا (1996) نشان دادند که با افزایش ارتفاع بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی در اندام‌های گیاهی افزوده می‌شود. ترکیبات فلاونوئیدی جاذب نور مانند فلاونها و آنتوسیانینها، در پاسخ به اشعه یو-وی و برای محافظت بافتهای درونی ساقه و برگ از آسیبهای ناشی از این اشعه، در سلولهای اپی درمال تجمع پیدا میکنند. کامپفرول و کوئرستین از جمله این فلاونوئیدها هستند که در پاسخ به این اشعه در گیاه تولید میشوند. ارتفاع جغرافیایی در میزان متابولیتهای ثانویه مؤثر بوده است که یکی از دلایل این به کیفیت تشعشعات مخصوصا Uv-B در ارتفاعات ارتباط میدهند. اشعه Uv-B در ارتفاعات بالاتر بیشتر است و در نتیجه سبب تولید بیشتر بعضی از فلاونوئیدها میشود. (جاکولا و همکاران، 2010).
همتی و همکاران (1391) نشان دادند که میزان کورسترین اندام‌های مختلف گیاه نمدار در منطقه کلاردشت مازندران در مقایسه با منطقه گرگان بیشتر بوده است، بر طبق داده‌های هواشناسی منطقه کلاردشت نسبت به گرگان از ارتفاع بیشتر و هوای خنکتر برخوردار بوده است. علاوه بر این با توجه به اینکه منطقه کلاردشت نسبت به جنگل شصت‌کلا گرگان در ارتفاع بالاتری قرار دارد و با توجه به نقش فلاونوئیدها در حفاظت گیاه در برابر نور فرابنفش، تراکم بیشتر ترکیبات فلاونوئیدی در منطقه کلاردشت توجیح‌پذیر است. تاثیر هوای خنک بر تجمع مواد موثره اندازه‌گیری شده، می‌تواند به طولانی بودن بیشتر دوره تقسیم سلولی و فعالیت بافت گیاهی در مناطق خنک مرتبط باشد. در همین رابطه تحقیقات انجام شده روی برخی فلاونوئیدهای مرکبات نشان داد که تولید آن‌ها در مناطقی با آب و هوای خنک بیشتر ازمناطق گرم می‌باشد، زیرا طول دوره تقسیم سلولی بیشتر می‌شود و در این مرحله عوامل تولید برخی فلاونوئیدها بیشتر می‌شود (داویس و آلبریگو، 1994). میزان آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی در گیاه دارویی مامیران در دو منطقه گرگان و زیارت مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد میزان این ترکیبات در منطقه زیارت نسبت به گرگان بیشتر بود، با توجه به اینکه آب و هوای دو منطقه متفاوت است و منطقه زیارت دارای ارتفاع بالاتر و هوای سردتر است این شرایط برای گیاه تنش ایجاد کرده و تولید متابولیت‌های ثانویه افزایش یافت (قربانلی و همکاران، 1388). تحقیقات مشابه نیز نشان داد که در شرایط تنش برخی از ترکیبات ثانویه به میزان قابل توجهی در گیاه افزایش می‌یابد (آتال، 1998). قاسمی و همکاران (2011) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتیاکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد. گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتیاکسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیا نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی مورد مطالعه در این تحقیق در برگ گیاه گزنه بیشتر از اندام‌های دیگر بود، در بررسی میزان فلاونوئیدهای سرخ ولیک، میزان روتین این گیاه در برگ نسبت به گل و میوه بیشتر بود (همتی و همکاران، 2006). تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در اندام‌های مختلف گیاه ممکن است در نتیجه تغییر در برخی فعالیت‌های آنزیمی و نقش پیش ماده آن باشد (پیتر و ریچارد، 1993). در حمایت از این فرضیه محققین دیگر اشاره کردند که تنظیم کننده‌های رشد و نمو مانند هورمون‌های سیتوکنین و اسید جیبرلیک ممکن است بعضی آنزیم‌های تولید کننده فلاونوئیدها را فعال کنند (سیمور و همکاران، 1993).
سپهریفر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی درعصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌باشد.
آذریوند و همکاران (1388) در تحقیقی روی اسانس برگ و گل گیاه بومادران در ارتفاعات مختلف منطقه سیاه بیشه استان مازندران به این نتیجه رسیدند که ارتفاع بر میزان اسانس این گیاه تاثیر بسزایی داشته بطوریکه میزان ترکیبات اسانسی در ارتفاعات بالاتر بیشتر بود و این میزان در گل بیشتر از برگ بوده است.
حبیبی و همکاران (1384) با بررسی اثر ارتفاع روی اسانس گیاه دارویی آویشن وحشی منطقه طالقان به این نتیجه رسیدند که با افزایش ارتفاع مقدار ترکیبات اسانسی لینانول و آلفا ترپنین که بیشترین ترکیبات اسانسی در آویشن وحشی را تشکیل می‌دهند افزایش می‌یابد بهطوری‌که در ارتفاع 1800 متری کمترین و در ارتفاع 2800 متری بیشترین مقدار بوده است.
4-4- نتیجه‌گیری کلی
در بررسی اثر ارتفاع از سطح دریا، بر ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مشخص گردید که بین دو استان مازندران و گلستان اختلاف معنیداری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان بر صفات مورد مطالعه معنی‌دار بود، بسیاری از صفات مورفولوژیکی مثل طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه با افزایش ارتفاع کاهش و مقدار کلروفیل افزایش نشان داد. کمترین مقدار طول برگ (9/6 سانتی‌متر)، کمترین مقدار عرض برگ (8/5 سانتی‌متر) کمترین ارتفاع گیاه (2/77 سانتی‌متر) و بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در منطقه له کوه مازندران با ارتفاع 2250 متر بدست آمد. از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، در ارتفاعات بالا میزان ترکیباتی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین افزایش چشمگیری نشان داد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل (16/8 میلیگرم بر گرم)، فلاونوئید کل (15/12 میلیگرم بر گرم)، اسید کلروژنیک (72/0 میلیگرم بر گرم)، اسید کافئیک (140/0 میلیگرم بر گرم) و روتین (71/0 میلیگرم بر گرم) در کل گیاه در ارتفاع 2250 متری منطقه له کوه مازندران مشاهده شد.
4-5- پیشنهادات
با توجه به خودرو بودن گیاه گزنه توصیه می‌شود با کاشت این گیاه در شرایط کنترل شده زراعی و گلخانه‌ای زمینه جهت مطالعات بیشتر در این گیاه فراهم شود.
با توجه به کمبود تحقیقات پژوهشی در گیاه گزنه پیشنهاد می‌شود تاثیر عوامل مختلف محیطی و همچنین تنش‌ها در افزایش متابولیت‌های ثانویه این گیاه مورد بررسی قرار گیرد.
ناشناس بودن گیاه دارویی گزنه باعث می‌شود انجام یکسری مطالعات پایه سیتوژنتیکی و بررسی تنوع ژنتیکی در این گیاه ضروری به نظر آید.
تحقیقات بیشتر در زمینه دیگر ترکیبات فنل و فلاونوئیدی که در این پایاننامه مورد مطالعه قرار نگرفت.
منابع
فهرست منابع
آذرنیوند، ح.، قوام عربانی، م.، سفیدکن، ف. و طویلی، ع. 1388. بررسی تاثیر ویژگی‌های اکولوژیک (خاک و ارتفاع) بر کمیت و کیفیت اسانس گل و برگ Achillea millefolium. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 25(4):571-556.
آزاد بخت، م. 1378. رده بندی گیاهان دارویی. چاپ اول. انتشارات تیمورزاده. ص 401.
افشار، ج.، و دل اذر، ع. 1373. روتین از Ruta graveolens. مجله دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، 1، ص 12-1.
امیدبیگی، ر. 1379. رهیافت‌های تولید و فرآوری گیاهان دارویی. انتشارات طراحان نشر. مشهد. جلد 1. چاپ دوم. ص 283.
امیدبیگی، ر. 1384. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد اول، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 347.
امیدبیگی، ر. 1388. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد دوم، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 430.
تایز، ل. و زایگر، ل. 1379. فیزیولوژی گـیاهی. جلد دوم. ترجمه: کافی،م. لاهوتی، م. زند، ا. شریفی، ح. گلدانی، م. و کامکار، ح. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. ص 379.
دوازده امامی، س. 1382. کاربرد گیاهان دارویی. انتشارات نصوح. ص 113.
دوازده امامی، س. و مجنون حسینی، ن. 1387. زراعت و تولید برخی گیاهان دارویی و ادویهای. چاپ دوم. انتشارات دانشگاه تهران. ص 300.
حبیبی، ح.، مظاهری، د.، مجنون حسینی، ن.، چایچی، م.ر. و فخرطباطبایی، م. 1385. اثر ارتفاع بر روغن، اسانس و ترکیبات گیاه دارویی آویشن وحشی Thymus kotschynus منطه طالقان. مجله پژوهش و سازندگی در زراعت و باغبانی. شماره 73: 10-1.
جایمند، ک.، رضایی، م.، عصاره، م. و مشکی‌زاده، س. 1388. استخراج واندازه‌گیری ترکیبهای فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی (Rosa damascene Mill) از مناطق غربی ایران، فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 555:4-47.
حسنی، ج. 1383. شناسایی و بررسی اکولوژیکی دو جنس از گیاهان معطر Thymus و Ziziphora در استان کردستان. فصلنامه تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20(1): 17-1.
زرگری، ع. 1376. گیاهان دارویی. جلد چهارم، چاپ پنجم. انتشارات دانشگاه تهران، ص970.
زرگری، ع. 1383. گیاهان دارویی. جلد پنجم. چاپ ششم، انتشارات دانشگاه تهران، ص1010.
زینلی، ح.، رزمجو، خ. ارزانی، ا. و رضایی، م. 1386. ارزیابی دو گونه نعناع پونه سنبله‌ای و پودنه از لحاظ صفات زراعی، فیتوشیمیایی و سیتوژنتیکی. سومین همایش گیاهان دارویی. تهران، دانشگاه شاهد.
سپهری‌فر، ر. و حسنلو، ط. 1388. بررسی ترکیبات پلی‌فنلی، آنتوسیانینها و فلاونوئیدهای تام و خواص آنتی‌اکسیدانی گیاه دارویی قره قاط، جمع‌آوری شده از جهار منطقه مختلف ایران. فصلنامه گیاهان دارویی، 74:33 -66.

user8328

عنوان صفحه
فهرست جدول ها
TOC h z t "جدول ها;1" جدول 4-1-مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه در گروه کنترل PAGEREF _Toc398906551 h 32جدول 4-2- مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درحالت تزریق عصاره بومادران نسبت به حالت پایه در گروه آزمایش PAGEREF _Toc398906552 h 33جدول 4-3-مقایسه تغییرات ضربان قلب درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه(گروه کنترل) و تزریق عصاره نسبت به حالت پایه(گروه آزمایش) PAGEREF _Toc398906553 h 33جدول4-4 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906554 h 37جدول 4-5- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906555 h 38جدول4-6- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906556 h 39جدول4-7- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906557 h 40جدول4-8-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906558 h 41جدول4-9-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906559 h 43عنوان صفحه
جدول4-10-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906560 h 44جدول4-11- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906561 h 45جدول4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906562 h 48جدول 4-13 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906563 h 49جدول4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906564 h 50جدول 4-15- تغییرات فشاردیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906565 h 51جدول4-16- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906566 h 52جدول4-17- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906567 h 53جدول4-18-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906568 h 54جدول4-19-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره (erio)و اپی نفرین(Epi) PAGEREF _Toc398906569 h 55جدول4-20- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906570 h 57جدول4-21- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906571 h 58عنوان صفحه
جدول4-22- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906572 h 59جدول4-23- تغییرات فشاردیاستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906573 h 61جدول4-24- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و PAGEREF _Toc398906574 h 62L-NAME PAGEREF _Toc398906575 h 62جدول4-25- تغییرات فشارمیانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906576 h 63جدول4-26- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906577 h 64جدول4-27- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906578 h 65

فهرست شکل ها
عنوان صفحه
TOC h z t "شکلا;1" شکل 1-1- بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.) PAGEREF _Toc398906078 h 3شکل(1-2) ساختار برخی از فلاوونوئید های موجود در گونه های مختلف جنسAchillea PAGEREF _Toc398906079 h 4شکل 1- 3-سنتز نیتریک اکساید در اندوتلیوم عروق PAGEREF _Toc398906080 h 6شکل 3-1قیف پرکولاتور PAGEREF _Toc398906081 h 20شکل 3-2-روتاری PAGEREF _Toc398906083 h 20شکل 3-3- Freez-dryer PAGEREF _Toc398906084 h 21 شکل 3-4- دستگاه Power lab PAGEREF _Toc398906085 h 24شکل 3-5-تراکئوستومی PAGEREF _Toc398906086 h 25شکل 3-7-اتصال کانول سرخرگی به ترانسدیوسر فشار و نحوه قرار گیری کانول سیاهرگی PAGEREF _Toc398906087 h 26شکل 3-6-کانول گذاری سرخرگ و سیاهرگ رانی PAGEREF _Toc398906088 h 25شکل 4-1-گراف ثبت شده از ABP , Ps , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه PAGEREF _Toc398906089 h 29شکل 4-2-گراف ثبت شده از ABP , PS , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق عصاره PAGEREF _Toc398906090 h 29شکل 4-3-گراف ثبت شده از ABP ,PS, Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق حلال عصاره(اتانول 70 درصد) PAGEREF _Toc398906091 h 30عنوان صفحه
شکل 4-4- مقایسه میزان افت فشارمیانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره بومادران شیرازی نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906101 h 31شکل 4-5- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906102 h 34شکل 4-6- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906103 h 34شکل 4-7-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق حلال نسبت به سطح پایه PAGEREF _Toc398906104 h 35شکل 4-8-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق عصاره نسبت به سطح پایه PAGEREF _Toc398906105 h 35شکل 4-9-مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906106 h 36شکل 4-10-مقایسه میزان تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906107 h 37شکل 4-11- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906108 h 38شکل 4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906109 h 39شکل4-13- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906110 h 40عنوان صفحه
شکل 4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906111 h 41شکل 4-15- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906112 h 42شکل 4-16- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906113 h 43شکل 4-17- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906114 h 454-18- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906115 h 46شکل 4-19- مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی اپی نفرین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906116 h 47شکل 4-20-مقایسه تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی اپی نفرین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906117 h 47شکل 4-21- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906118 h 48شکل 4-22- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906119 h 49شکل 4-23- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906120 h 50شکل 4-24- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906121 h 51شکل 4-25- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906122 h 52شکل 4-26- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906123 h 53عنوان صفحه
شکل 4-27- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906124 h 54شکل 4-28- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین(erio+Epi) PAGEREF _Toc398906125 h 55شکل 4-29- مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی L-NAME(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906126 h 56شکل 4-30- مقایسه تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی L-NAME(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906127 h 57شکل 4-31- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906128 h 58شکل 4-32- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906129 h 59شکل 4-33- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906130 h 60شکل 4-34- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906131 h 61شکل 4-35- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906132 h 62شکل 4-36- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906133 h 63شکل 4-37- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906134 h 64شکل 4-38- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906135 h 65

فصل اولمقدمه

1-1بومادرانگیاه بومادران متعلق به جنس Achillea L. و تیره Asteraceae می باشد. جنس Achillea در ایران 19 گونه گیاه علفی چندساله و غالبا معطّر دارد. گونه های بومی آن عبارتند از:
A. Aucheri Boiss. A. eriophora DC.A.callichroa Boiss. Boiss. A. talagonica
A. kellalensis Boiss. Rech.f.A. pachycephala
Oxyodonata Bioss.
دیگر گونه های این جنس علاوه بر ایران در عراق، آناتولی، سوریه، قفقاز، لبنان، فلسطین، روسیه مرکزی، ماورای قفقاز، ترکمنستان، افغانستان، آسیای جنوب غربی و آسیای مرکزی نیز می رویند)1(.
بومادران ساقه ای به ارتفاع 20 تا 90 سانتیمتر و حتّی بیشتر دارد. در دشت ها و دامنه های بعضی از نواحی کوهستانی اروپا و آسیا، منجمله ایران به حالت خودرو می روید. برگ های آن عاری از دمبرگ، پوشیده از کرک و منقسم به بریدگی های بسیار باریک است. کاپیتول های کوچک و متعدد آن، وضع مجتمع به صورت گل آذین دیهیم دارد(2).
از کلیه قسمت های این گیاه، بوی قوی استشمام می شود به طوریکه به مجرد دست زدن به اعضاء گیاه، این بو احساس می گردد. قسمت های مورد استفاده این گیاه، سرشاخه های گلدار و برگ آن است که طعم تلخ و بوی قوی دارند(3).
1-2-بومادران شیرازیAchillea eriophora DC. (شکل1 -1)یکی از گیاهان بومی جنس Achillea در ایران می باشد و در زبان فارسی به آن بومادران جنوبی، سرزردو، بومادران شیرازی گفته می شود. پراکندگی این گیاه در استان های جنوبی و در ارتفاع 700 تا 3000 متر می باشد.( Peter et al ,1997)

شکل 1-1- بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.)1-3ترکیبات موجود در گیاهان جنس Achillea با تحقیقات فیتوشیمیایی بر روی گونه های مختلف جنس Achillea مشخص شده که ترکیبات موجود در گیاهان این جنس، از نظر زیستی ترکیبات بسیار فعالی هستند. از ترکیبات مهم موجود در در این گیاهان فلاوونوئیدها(شکل 1-2)، ترپنوییدها، لیگنان ها، مشتقات آمینواسیدی، اسیدهای چرب،آلکامیدها می باشند(Saeidnia et al, 2011).

شکل(1-2) ساختار برخی از فلاوونوئید های موجود در گونه های مختلف جنسAchilleaSaeidnia et al (2011)
1-4خواص درمانی بومادرانبومادران، گیاهی است دارویی و ارزنده که مصرف آن از قرن اول میلادی بین مردم معمول بوده است به طوری که در آن زمان برای برای بند آوردن خون و علاج زخم هایی که با خونروی همراه بوده استفاده می شده و به آن اعتقاد زیاد داشته اند. ضمناً از این گیاه در مراسم سحر و جادو استفاده می کرده اند. در قرون وسطی، بومادران را برای بند آوردن خونروی های بینی، اختلالات قاعدگی، بی خوابی، اختلالات بینایی، وجود خون در ادرار، اخلاط خونی، صرع و غیره به کار می برده اند. استفاده از آن برای مصارف درمانی از این زمان به بعد رو به افزایش یافت به طوری که تدریجاً علاوه بر موارد مذکور، از آن در رفع بیماری هایی نظیر بیماری های کبدی و کلیوی، بواسیر و غیره استفاده می شده است و با آن که در قرن حاضر، تدریجاً استفاده از آن کاهش یافت، با این حال، بررسی های جدید، ضمن تأیید برخی از اثرات درمانی بومادران، جای آن را در ردیف گیاهان دارویی مفید، محفوظ نگهداشت. دم کرده سرشاخه های گلدار بومادران، در رفع گاستریت های حاد و مزمن، رفع نفخ اثر نافع دارد. ضمناً سوء هاضمه های ناشی از نفخ را از بین می برد.
بومادران ، در رفع ترشحات زنانگی، بند آورندن خون، بواسیرهای خونی و اسهال های ساده اثر معالج دارد و چون در این گونه موارد به طور قاطع عمل می کند، اعتقاد مردم به آن در طی قرون متمادی همواره زیاد بوده است. بررسی ها نشان داد که با مصرف بومادران، از ترشحات مخاط رکتوم نیز که موجب پرخونی و تورم ناحیه دردناک بواسیر می شود، جلوگیری می شود. اثر قاعده آور بومادران باعث آن شد که در طی قرون متمادی، مردم از آن پیوسته استفاده کنند و چون با تکرار مصرف آن، اثر سویی در بیمار به وجود نمی آید، از آن برای تنظیم قاعدگی در مواقعی که به صورت ناکافی به وقوع می پیوندد و هم چنین برای جلوگیری از درد و ناراحتی در مواقع اشکال وقوع قاعدگی استفاده می شود. بومادران به علت اثر مدر خود در ازدیاد حجم ادرار و دفع سنگ کلیه نیز موثر است، به علاوه باد شکن و تب بر می باشد(2و3).
1-5- نقش سیستم نیتررژیک در دستگاه قلب و عروق:در سال 1980 ، Furchgott و Zawadski در تحقیقات خود بر روی عروق متوجه شدند که استیل کولین در آئورتی که دارای اندوتلیوم سالم می باشد اثر شل کنندگی دارد. این محققین به این نتیجه رسیدند که استیل کولین سبب تحریک آزاد شدن ماده ای از اندوتلیوم می گردد که باعث اتساع عروقی می شود و آن ها این ماده را ، فاکتور متسع کننده ی مشتق شده از اندوتلیوم (EDRF) نامیدند. چند سال بعد محققینی دیگر متوجه شدند که این ماده که باعث اتساع عروقی می شود همان گاز NO (نیتریک اکساید) است که این مولکول ، یکی از مهمترین مولکول ها در فیزیولوژی پستانداران است. در سلول های پستانداران، NO از آمینواسید L-arginine تولید می شود که از اکسید شدن این آمینواسید، L-Citruline و گاز NO تولید می شود(شکل 1-3). این واکنش به وسیله آنزیم های خانواده NOS کاتالیز می شود که تا به حال سه ایزوفرم از آن شناسایی شده است. نیتریک اکساید به عنوان یک مولکول سیگنالینگ در سیستم های قلب و عروق ودستگاه عصبی عمل می کند و در سیستم ایمنی و بهبود زخم هم نقش دارد. در سیستم قلب و عروق، NO عمدتا از سلول های اندوتلیال عروق و به میزان کمتری توسط پلاکت ها تولید می شود و مهمترین عملکرد آن خاصیت Vasodilation آن است. این مولکول همچنین از تجمع پلاکت ها و تکثیر بیش از حد سلول های اندوتلیال عروق جلوگیری می کند. از ایزوفرم های مختلف آنزیم NOS ، ایزوفرم eNOS در سلول های اندوتلیالی وجود دارد که با افزایش غلظت کمپلکس کلسیم-کالمودولین و فعال سازی آنزیم eNOS باعث تولید نیتریک اکساید می شود. نیتریک اکساید بسیاری از اثرات خود را بر روی مولکول هدف از طریق گوانیلیل سیکلاز(sGC) اعمال می کند که این آنزیم باعث تبدیل GTP به cGMP می شود که مهمترین پیام بر ثانویه داخل سلولی برای NO است که cGMP باعث فعال ساز ی پروتئین کیناز G) (PK می شود که این پروتئین کیناز باعث کاهش غلظت کلسیم داخل سلولی می شود که این باعث کاهش فسفریلاسیون وابسته به کلسیم زنجیره سبک میوزین می شود و در نهایت موجب ریلکس شدن عروق و افزایش جریان خون در این عروق می شود
(Queen and Ferro, 2006)و(Chunying LI et al, 2005) و(Robert W et al, 2001) .

شکل 1- 3-سنتز نیتریک اکساید در اندوتلیوم عروقDavid C. Gaze(2012)

1-6- عوامل تعیین کننده فشار شریانیفشار شریانی را می توان به صورت فشار متوسط شریانی تعریف کرد که میانگین فشار در طول زمان است و یا می توان به صورت فشار سیستولی(فشار حداکثر) و فشار دیاستولی(فشار حداقل) در سیکل قلبی تعریف کرد. اختلاف بین فشار سیستولی و دیاستولی را فشار نبض((Pulse pressure گویند. عوامل تعیین کننده ی فشار خون شریانی به دو دسته عوامل فیزیکی و فیزیولوژیکی تقسیم می شوند. دو عامل فیزیکی عبارتند از: حجم مایع(یعنی حجم خون) در سیستم شریانی و ویژگی های ارتجاعی سیستم(کمپلیانس). عوامل فیزیولوژیکی شامل برون ده قلب( که برابر است با ضربان قلب ضربدر حجم ضربه ای) و مقامت محیطی می شود(برن ولوی،2011) و(Khan and Gilani, 2011)
1-7- مشخصات عملکرد دستگاه عصبی اتونوم(سیستم سمپاتیک و پاراسمپاتیک)فیبرهای عصبی سمپاتیک وپاراسمپاتیک یکی از دوماده ی میانجی سیناپسی استیل کولین یا نوراپی نفرین را ترشح می کنند. فیبرهای ترشح کننده استیل کولین را کولینرژیک می نامند و فیبرهای ترشح کننده نوراپی نفرین را آدرنرژیک می گویند که مشتق از آدرنالین یعنی معادل اپی نفرین است(گایتون هال،2011).
نورون هایی که کولینرژیک هستند عبارتند از:1-کلیه نورون های پیش عقده ای، 2-نورون های پس عقده ای پاراسمپاتیک، 3-نورون پس عقده ای سمپاتیک که به غدد عرق عصب می دهند و 4- نورون های سمپاتیک که روی عروق خونی عضلات مخطط ختم شده و هنگام تحریک موجب اتساع عروقی می شوند. باقیمانده نورون های پس عقده ای سمپاتیک نورآدرنرژیک هستند. قسمت مرکزی غده فوق کلیوی در اصل یک عقده سمپاتیک است که در آن سلول های پس عقده ای آکسون های خود را از دست داده و مستقیما نوراپی نفرین، اپی نفرین و مقداری دوپامین را به داخل جریان خون ترشح می کنند. نتیجتا نورون های پیش عقده ای کولینرژیکی که به این سلول ها می روند به صورت اعصاب حرکتی ترشحی این غده درآمده اند.
معمولا هیچ گونه استیل کولینی در گردش خون وجود ندارد و اثرات تخلیه کولینرژیک موضعی به علت غلظت زیاد استیل کولین استراز در انتهاهای عصبی کولینرژیک عموماً محدود، مجزا و کوتاه مدت است. نوراپی نفرین تا مسافت های دورتری انتشار می یابدو عمل طولانی تری از استیل کولین دارد(گانونگ 2010).
1-8- نقش سیستم عصبی اتونوم در تنظیم عملکرد گردش خون:مهمترین قسمت سیستم عصبی خودکار در تنظیم عملکرد گردش خون، سیستم عصبی سمپاتیک است. سیستم عصبی پاراسمپاتیک نیز به خصوص در تنظیم عملکرد قلب نقش دارد.
1-9- سیستم عصبی سمپاتیک:رشته های عصبی وازوموتور سمپاتیک از طریق کلیه ی اعصاب نخاعی توراسیک و اولین یا دومین اعصاب نخاعی کمری از نخاع خارج می شوند. سپس این رشته ها وارد زنجیره سمپاتیک می شوند که در دو طرف ستون مهره ها واقع شده اند. پس از این، رشته های سمپاتیک از دو طریق روی گردش خون اثر می گذارند: 1) از طریق اعصاب سمپاتیک که عمدتا عروق احشای داخلی و قلب را تغذیه می کنند 2) با ورود به بخش محیطی اعصاب نخاعی که به عروق محیطی می روند(گایتون هال، 2011) و (Lin et al, 2003)
1-10- عصب دهی سمپاتیکی عروق خونی:در اکثر بافت ها تمام عروق به جز مویرگ ها، توسط این رشته ها عصب دهی می شوند. اسفنگترهای پیش مویرگی و متارتریول ها در برخی از بافت ها از جمله عروق خونی مزانتر عصب دهی می شوند. با این وجود، عصب دهی سمپاتیکی آن ها بسیار کمتر از شریان ها، شریانچه ها و وریدها می باشد. عصب دهی شریان های کوچک و شریانچه ها این امکان را فراهم می آورد که با تحریک سیستم سمپاتیک مقاومت عروقی در مقابل جریان خون افزایش یافته و در نتیجه سرعت جریان خون بافتی کاهش یابد. عصب دهی عروق بزرگ، به خصوص وریدها، باعث می شود که در موارد تحریک سمپاتیکی، حجم این عروق کاهش یابد. این رخداد موجب می شود که خون به سمت قلب فرستاده شود و بنابراین نقش مهمی در تنظیم عملکرد پمپی قلب داردگایتون هال، 2011) و (Paul and Levy, 1980).
1-11- رشته های سمپاتیک قلب:علاوه بر رشته های سمپاتیکی که عروق خونی را تغذیه می کنند، رشته های عصبی سمپاتیک به طور مستقیم نیز به قلب می روند. تحریک سمپاتیک به طور مشخص فعالیت قلب را افزایش می دهد و این اثر هم از طریق افزایش سرعت ضربان قلب و هم با افزایش قدرت قلب و حجم خون پمپ شده اعمال می شود (L.R.Queen, and A. Ferro, ).
TOC h z t "عنوان;1"

فصل دوم
مروری بر مطالعات پیشین
2-1- مطالعات انجام شده در رابطه با اثرات بومادراندر تحقیقی مکانیسم کاهش فشار خون توسط عصاره های هیدرواتانولی و دی کلرومتانی و اتیل استاتی و بوتانولی و دی کلرومتان-2 و همچنین فلاوونوئید Ar--etin استخراجی از گیاه Achillea millefolium بررسی شده است. در این تحقیق مصرف خوراکی عصاره های هیدرواتانولی و دی کلرومتانی و دی کلرومتان-2 به طور قابل ملاحظه ای فشار میانگین سرخرگی را در موش های با فشار نرمال کاهش داد. آنالیز فیتوشیمیایی این عصاره ها، وجود مقدار زیادی Ar--etin را در این عصاره ها نشان داد که بعد از جداسازی این فلاوونوئید ، هم به صورت خوراکی و هم تزریق داخل وریدی بر روی موش اثر داده شد و در یک روش وابسته به دوز فشار میانگین سرخرگی را کاهش داد. نتایج این آزمایش نشان داد که اثر کاهش فشار خون توسط Achillea millefolium ممکن است بخشی از آن به خاطر وجود میزان بالای فلاوونوئید Ar--etin و توانایی آن در کاهش تولید آنژیوتنسین ΙΙدر شرایط in vivo از طریق ممانعت از عملکرد آنزیم ACE باشد(Desoza et al,2011).
در تحقیقی اثر کاهش فشار خون گیاه Achillea millefolium و هم چنین عملکردهای ممانعتی آن بر روی قلب و عروق و اثر گشادکنندگی آن بر روی نای مشخص شده است. نتایج این پژوهش استفاده دارویی از این گیاه برای درمان بیماری های قلب و عروق و دستگاه تنفسی مثل فشار خون بالا و آسم را نشان داد (Khan et al, 2o11).
محققی به نام Dallacqueو همکاران (2011)، اثرات عصاره ی A. millefolium بر فعالیت Vasoprotective را در شرایط in vitro بررسی کردند. در این تحقیق عصاره این گیاه باعث افزایش رشد سلول های اولیه ی ماهیچه ی صاف عروق در رت گردید. همچنین در این تحقیق اثر عصاره این گیاه بر روی مسیر NF-KB در سلول های اندوتلیال ورید نافی انسان بررسی شد. نتایج نشان داد که عصاره با اثر ممانعتی بر روی NF-KB می تواند از التهاب عروقی جلوگیری کند. یافته های این محققین، استفاده سنتی از این گیاه بر روی بیماری های قلب و عروق را تاییدکرد.
نیازمند وهمکاران (2011)، در تحقیقی اثر عصاره آبی-اتانولی A. wilhelmsiiرا بر روی فشارخون در خرگوش بررسی کردند. نتایج این تحقیق نشان داد که عصاره این گونه به طور قابل ملاحظه ای باعث کاهش فشارخون شد. به گفته این محققین اثرکاهش دهندگی فشارخون عصاره این گیاه ممکن است بخاطر cardiac depressant و یا اثرات گشادکنندگی عروق باشد.
عسگری و همکاران در سال ( 2000 ) اثرات گیاه Achillea wilhelmsii را بر روی فشار خون و ضد چربی خون بررسی کردند. در این مطالعه به صورت تصادفی 120 نفر زن و مرد در سنین بین 60-40 سال انتخاب شدند و به آن ها روزی دو بار و هر مرتبه 20-15 قطره از عصاره ی هیدروالکلی گیاه Achillea wilhelmsii داده شد و این درمان به مدت بیش از شش ماه ادامه داشت. فشار خون و لیپیدهای سرمی (کلسترول ،تری گلیسرید ، LDL، HDL) در طی دو ماه در سه مرحله اندازه گیری شد. نتایج، کاهش قابل ملاحظه ای در میزان تری گلیسریدها، بعد از دو ماه نشان داد، در حالی که کاهش قابل ملاحظه در میزان تری گلیسرید ها، کلسترول(Totalcholesterol) و LDL cholesterol بعد از چهار ماه دیده شد. میزان HDL-cholesterol به طور قابل ملاحظه ای بعد از شش ماه درمان افزایش یافت. کاهش قابل ملاحظه ای در فشار دیاستولی و فشار سیستولی به ترتیب بعد از دو و شش ماه دیده شد.
بومادران (Achillea millefolium) به طور مؤثر می تواند لایه موکوسی معده را محافظت کند و از ترشح اسید معده جلوگیری کند. در تحقیقی عصاره آبی برگ های این گونه از جنس Achillea باعث محافظت از لایه موکوسی معده در مقابل عمل نکروزی مستقیم اتانول شده که این اتانول می تواند باعث آسیب به لایه موکوسی معده از طریق تخریب لایه ژلاتینی متشکله از موکوس و بی کربنات سطح داخلی معده شود که این لایه ژلاتینی از زخم شدن معده جلوگیری می کند. تحریک رسپتورهای موسکارینی M3 سلول های جداری، افزایش سطوح پپتیدهای تنظیمی معده ای، تحریک هیستامین و کاهش میزان جریان خون لایه موکوسی معده، باعث افزایش میزان ترشح معده و کاهش فاکتورهای حفاظتی معده می شود. عصاره این گونه از بومادران، باعث کاهش حجم و اسیدیته شیره معده شد که احتمالاً عصاره با بلاک کردن رسپتورهای موجود در سلول های جداری(M3، رسپتور هیستامینی H2 و رسپتور گاسترینی cckb) باعث این نقش حفاظتی مهم شده است(Baggio et al,2002)
بومادران (Achillea wilhelmsii) باعث تحریک سیستم ایمنی می شود. در مطالعه ای که بر روی موش انجام شد، عصاره آبی این گونه از جنس Achillea باعث تحریک ایمنی سلولی و ایمنی هومورال شدکه این فعالیت می تواند به خاطر حضور فلاوونوئید ها یا ساپونین ها باشد که این ها از طریق تحریک ماکروفاژها و لنفوسیت های B باعث افزایش تولید آنتی بادی و در نتیجه تقویت سیستم ایمنی می شوند(Sharififar et al, 2009).
در طب سنتی از گونه های جنس Achillea برای فرآیند بهبود زخم استفاده می شود. در تحقیقی برای تایید این موضوع از عصاره های یکی از گونه های بومی این جنس در ترکیه به نام Achillea biebersteinii بر روی دو مدل زخم سطحی و عمقی در رت استفاده شد و عصاره های مختلف این گیاه، باعث تسریع فرآیند بهبود زخم شدند و عصاره –n هگزانی این گیاه دارای اثراتی مشابه داروی Madecassol بود که این دارو برای بهبود زخم استفاده می شود. موقعی که یک زخم ایجاد می شود و در معرض محیط خارجی قرار می گیرد احتمال آن وجود دارد که به وسیله میکروب ها مورد تهاجم قرار گیرد که باعث تاخیر در فرآیند بهبود زخم می شوند. علاوه بر این حضور میکروب ها در محل زخم باعث تجمع ماکروفاژها و نوتروفیل ها در آن ناحیه می شوند که این ها باعث تولید ROS می شوند که اگر میزان ROS تولیدی زیاد باشد می تواند باعث القاء آسیب بافتی شدید شود که این هم مانعی برای فرآیند بهبود زخم است. عصاره این گیاه دارای پتانسیل آنتی اکسیدانی و فعالیت ضد میکروبی می باشد که از این طریق می تواند به عنوان یک دارویی مفید برای تسریع در فرآیند بهبود زخم باشد(Akkol et al, 2009).
بومادران دارای فعالیت ضد میکروبی نیز می باشد. در پژّوهشی در شرایط In vitro عصاره اتانولی و روغن فرار Achillea eriophora مانع رشد میکروارگانیسم های بیماریزا شد.در این تحقیق مشخص شد کهStaphylococcus aureus نسبت به روغن فرار Achillea eriophora بسیار حساس است. روغن فرار این گیاه در غلظت های مختلف از رشد میکروب های دیگری مثل Aspergillus niger، Bacillus subtilis، Candida albicans، Pseudomonas aeruginosa، Escherchia coli جلوگیری کرد. بنابراین از این گیاه می توان بر ضد میکروب های فرصت طلبی که باعث بیماریهای دستگاه تنفسی مثل سرماخوردگی می شوند استفاده کرد. همچنین از روغن فرار Achillea eriophoraمی توان به عنوان ضدمیکروب طبیعی و نگهدارنده و محافظت کننده غذایی با خطر کم استفاده کرد (Ghasemi et al, 2008).
گونه های جنس Achillea از التهاب ایجاد شده در اثر عفونت و آسیب نیز جلوگیری می کنند. در تحقیقی از لیپوپلی ساکارید) (LPSجدا شده از دیواره سلولی باکتری های گرم منفی برای فعال کردن ماکروفاژهای RAW264.7 موش در محیط کشت استفاده شد و با فعالیت ماکروفاژها تعداد زیادی واسطه های التهابی مثل NO، COX-2، TNF-α و IL-6تولید شد که روغن فرار گونه Achilleamillefolium L. با کاهش این عوامل التهابی، از پیشرفت پاسخ التهابی در این ماکروفاژها جلوگیری کرد(Chou et al, 2013).
گیاهان جنس Achillea باعث کاهش التهاب عصبی می شوند که این التهاب عصبی، نقش مهمی در پیشرفت بیماری هایی مثل پارکینسون و آلزایمر دارد و در این فرآیند تحریک زیاد سلول های میکروگلیال نقش دارد و با تولید واسطه های التهابی اولیه مثل سایتوکاین ها، MMP(matrixmetallo proteinases) و ROS و NO باعث مرگ سلول های عصبی می شوند. در تحقیقی عصاره Achillea fragrantissima از تولید بیش از حد واسطه های التهابی توسط سلول های میکروگلیال موش در محیط کشت جلوگیری کرد. بنابراین می تواند برای کنترل بیماری های تخریب نورونی در نظر گرفته شود . (Elmann et al, 2011)
بومادران (Achillea millefolium) اثر حفاظتی روی کبد دارد. در تحقیقی از (D-GalN) D-galactosamine و لیپوپلی ساکارید(LPS) برای القاء آسیب کبدی در موش استفاده شد و این آسیب با اندازه گیری میزان آلانین آمینوترانسفراز(ALT) و آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) پلاسما تایید شد. عصاره آبی-متانولی این گونه از بومادران به طور قابل ملاحظه ای میزان ALT و AST را در موش هایی که با این گیاه تحت درمان قرار گرفته بودند کاهش داد واین اثر محافظتی بومادران روی کبد با مشاهدات بافت شناسی نیز تایید شد. (Sheikh Yaeesh et al, 2006)
2-2- هدفاز آن جایی که یکی از گونه های جنس Achillea به نام A. eriophora بومی استان فارس و استان های هم جوار می باشد و با توجه به گزارشاتی که در خصوص اثرات متعدد و متنوع این گیاه موجود است، در تحقیق حاضر بررسی اثر آن بر بعضی از پارامترهای قلب و عروق مد نظر است.
2-3- فرضیاتعصاره آبی الکلی این گونه از بومادران موجب تغییراتی در فشار خون و پاسخ دهی آن به سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و سیستم نیتریک اکساید می شود.
فصل سوممواد و روش ها
3-1- مواد مورد استفادهعصاره آبی الکلی برگ و گل بومادران شیرازی
موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار
غذای موش(خریداری شده از شرکت جوانه خراسان)
ماده بیهوشی (Urethane) ساخت شرکت SIGMA
دی اتیل اتر
اتانول 70 درصد
آب مقطر
کاغذ صافی
سرنگ انسولینی، 5 و 10 سی سی با نیدل G23
سرم فیزیولوژیک
نرمال سالین
هپارین
استیل کولین(Acetylcholine hydrochloride) (تهیه شده از از شرکت Merk آلمان)
اپی نفرین( ساخت شرکت دارو پخش ایران)
داروی ممانعت کننده آنزیم نیتریک اکساید سنتتاز(L-NAME) (ساخت شرکت SIGMA-ALDRCH آلمان)
3-2- وسایل مورد استفادهوسایل تشریح( قیچی جراحی چشم، قیچی معمولی، تشتک تشریح، پنس، کلمپ، Moser)
میکروسکوپ
کانول پلی اتیلن PE 50
سمپلر
وسایل شیشه ای شامل بشر، پیپت، استوانه مدرج،لوله آزمایش
لوله آزمایش
قفس نگهداری حیوان
میز جراحی
یخچال فریزر 20-
ترازو
فشار سنج جیوه ای
ترمومتر مقعدی
کامپیوتر و نرم افزلر chart
دستگاه Power lab مجهز به Pressure transducer، Bridge amplifier
3-3- روش کار
3-3-1- روش عصاره گیریدر ابتدا گیاه بومادران شیرازی از ارتفاعات اطراف باغ ارم شیراز از ارتفاع حدود 1500 متر در ماه خرداد جمع آوری گردید و فوراً علف های هرز و قسمت های غیرقابل استفاده گیاه جدا شد و با انتقال به دانشکده علوم توسط استاد گیاه شناسی دانشکده علوم دانشگاه شیراز، مورد شناسایی علمی قرار گرفت. سپس گیاه جمع آوری شده سالم در محیط سایه و بدون رطوبت خشک گردید. پس از خشک شدن به دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی شیراز منتقل شد و زیر نظر متخصص فارماکوگنوزی به روش پرکولاتور عصاره گیری انجام شد.
ابتدا گل ها و برگ ها از قسمت ساقه جدا شدند و توسط دستگاه آسیاب به پودر تبدیل شدند و وزن پودر یادداشت شد. در سوراخ انتهای قیف پرکولاتور(شکل 3-1) مقداری پنبه طوری قرار داده شد که سوراخ آن کاملا مسدود شود. بعد روی آن پودر گیاه ریخته شد و روی پودر هم یک تکه کاغذ صافی قرار داده شد و روی کاغذ صافی هم وزنه ای قرار داده شد. سپس به میزان کافی اتانول 70 در صد ( 73 میلی لیتر اتانول 96درصد و 27 میلی لیتر آب مقطر) به پودر اضافه شد تا فضای بین پودر بومادران را پرکند و به طور کامل حلال روی پودر قرار گیرد. به محض نفوذ حلال به داخل پودر، دوباره مقداری از اتانول 70 درصد استفاده می شد. دور قیف پرکولاتور و هم چنین روی آن با فویل آلومینیومی پوشانده شد و در زیر قیف هم ظرفی تیره قرار می گرفت که رنگ تیره این ظرف مانع از تاثیر مضر نور بر روی عصاره می شد. روی ظرف هم قیفی قرار داده شد که عصاره خارج شده از قیف به داخل ظرف هدایت شود. حدود 67 ساعت طول کشید تا بومادران به روش پرکولاتور عصاره گیری شود. در طول این مدت با پایین آمدن سطح حلال، به میزان کافی اتانول 70 اضافه می شد و میزان آن هم یادداشت می شد. بعد از آن عصاره رقیق توسط دستگاه روتاری(شکل3-2) تا حد ممکن تغلیظ گردید. به خاطر عدم تبخیر کامل حلال، با نظر استاد فارماکوگنوزی فرآیند تغلیظ عصاره توسط روتاری متوقف شد و ادامه کار توسط دستگاه Freez dryer(شکل 3-3) انجام شد. عصاره در یک بالن کوچک مخصوص ریخته شد و در دستگاه قرار داده شد و دور بالن هم توسط فویل آلومینیومی پوشانده شد. حدود 48 ساعت طول کشید تا عصاره توسط دستگاه Freez dryer در دمای 49- درجه سانتیگراد به حالت پودری تبدیل شود. میزان پودر گل و برگ بومادران 146.66 گرم بود و در نهایت 24 گرم عصاره به دست آمد و راندمان این فرآیند عصاره گیری %16.36بود.
130238581915
شکل 3-1 قیف پرکولاتور
شکل 3-2-روتاری
شکل 3-3- Freez-dryer3-3-2-چگونگی تهیه و نگهداری موش های صحرایی
تعداد 55 سر موش صحرایی نر بالغ از نژاد ویستار با محدوده وزنی 250-220 گرم از موسسه رازی شیراز خریداری و به اتاق حیوانات بخش زیست شناسی دانشکده علوم منتقل گردید. رت ها به مدت یک هفته در شرایط کنترل شده نور (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و درجه حرارت حدود 22 درجه سانتی گراد نگهداری می شدند. در طول مدت نگهداری، غذا و آب به اندازه کافی در اختیار آن ها قرار می گرفت تا به این وسیله از سلامت کامل آن ها مطمئن شویم.
3-3-3-گروه بندی موشهاابتدا بر روی 15 موش اثرات دوز های مختلف محلول عصاره بررسی شد و دوز موثر انتخاب شد. سپس برای بررسی اثرات عصاره و حلال هم حجم آن از 10 سر موش استفاده شد که به صورت تصادفی در دو گروه کنترل(بررسی اثرات حلال)و گروه آزمایش(بررسی اثرات عصاره) قرار می گرفتند.
برای بررسی تداخل اثر عصاره و حلال با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتررژیک 30 رت به صورت تصادفی به شش گروه پنج تایی تقسیم شدند:
1- گروهی که به آن ها حلال هم حجم عصاره(اتانول 70%) و داروی استیل کولین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال استیل کولین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان استیل کولین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر استیل کولین به همراه اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
2- گروهی که به آن ها عصاره (mg/kg60) و داروی استیل کولین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال استیل کولین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان استیل کولین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر استیل کولین به همراه عصاره بومادران تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
3- گروهی که به آن ها حلال هم حجم عصاره(اتانول 70%) و داروی اپی نفرین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال اپی نفرین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان اپی نفرین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر اپی نفرین به همراه اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
4- گروهی که به آن ها عصاره (mg/kg60) و داروی اپی نفرین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال اپی نفرین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان اپی نفرین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر اپی نفرین به همراه عصاره بومادران تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
5- گروهی که اتانول 70درصد و L-NAME دریافت می کردند که در این گروه، حالت پایه فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال L-NAME تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان محلول L-NAME تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد. با توجه به اینکه حدود 20 دقیقه لازم بود که اثرات این دارو کاملا ظاهر شود و پارامترهای قلبی عروقی در یک سطح حدودا ثابتی قرار گیرند، در بررسی نتایج اعداد مربوط به 20 دقیقه اول در نظر گرفته نشد. در مرحله آخر اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
6- گروهی که عصاره و L-NAME دریافت می کردند که در این گرو، حالت پایه فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال L-NAME تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان محلول L-NAME تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد. بعد از آن عصاره تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرقته شد. در این گروه نیز اعداد مربوط به 20 دقیقه اول در مرحله تزریق L-NAME در نظر گرفته نشد.
3-3-4- اجزای سیستم ثبت فشار خون
در این تحقیق، فشار خون و پارامترهای مربوط به آن توسط Pressure transducer ثبت می گردید. این ترانسدیوسر به یک Bridge amplifier که عملکرد آن تقویت سیگنال و فیلتر نمودن نویزهاست متصل می شد. بریج امپلی فایر به Recorder متصل می شد و نتایج ثبت شده بر روی مانیتور مشخص می شد(شکل 3-4).
Bridge amplifier
Recorder

شکل 3-4- دستگاه Power lab
3-4- مراحل انجام آزمایشدوازده ساعت قبل از بیهوش کردن موش ها، غذای آن ها قطع می شد ولی به آب دسترسی داشتند. بعد از دوازده ساعت، ابتدا به وسیله تزریق داخل صفاقی Urethane( دوزg/kg2/1(، حیوان بی هوش شده و سپس برای جلوگیری از آسپیره شدن و خفگی در زمان بی هوشی، تراکئوستومی(شکل 3-5) انجام شده و نای حیوان کانوله می گردید. برای دسترسی به عروق فمورال، برش کوچکی در سطح داخلی ران ایجاد کرده و با پنس مجرای این برش باز و گشاد می شد. سپس با استفاده از قیچی چشم پزشکی سرخرگ و سیاهرگ رانی را شکاف داده و کانول گذاری می شد(شکل 3-6). از کانول سیاهرگی برای انجام تزریقات در حین آزمایش استفاده می شد و کانول سرخرگی به دستگاه پاورلب وصل شده که از این طریق فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستول، فشار دیاستول و ضربان قلب ثبت می گردید(شکل 3-7). در کل زمان آزمایش، سرم فیزیولوژیک به مقدار 1/ . سی سی در هر ده دقیقه از طزیق کانول سیاهرگی به حیوان تزریق می شد و دمای بدن حیوان در محدوده 37 درجه سانتیگراد کنترل می گردید.

شکل 3-5-تراکئوستومی
113792016510

شکل 3-6-کانول گذاری سرخرگ و سیاهرگ رانی

شکل 3-7-اتصال کانول سرخرگی به ترانسدیوسر فشار و نحوه قرار گیری کانول سیاهرگی3-4-1- چگونگی تجویز داروپس از این که سرخرگ و ورید رانی موش کانول گذاری شد، مدت یک ساعت به موش برای به تعادل رسیدن پس از جراحی استراحت داده می شد و بعد از آن به مدت سی دقیقه پارامترهای قلبی عروقی ثبت گردید. بعد از ثبت نرمال در گروه های مختلف، با استفاده از داروهای مقلد کولینرژیک، آدرنرژیک و مهارگر آنزیم نیتریک اکساید سنتاز، چگونگی اثر گذاری آن ها و تداخل اثرشان با عصاره بومادران مورد مطالعه قرار گرفت. تمامی تزریقات به صورت داخل وریدی و از طریق کانول سیاهرگی انجام شد. برای تعیین دوز موثر عصاره، پس از تهیه محلول mg/ml 200 (200 میلی گرم عصاره در یک میلی لیتر اتانول 70)، دوزهای 40،50، 60، 80 و100میلی گرم بر کیلوگرم مورد بررسی قرار گرفتند که بهترین و بیشترین پاسخ با دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم مشاهده گردید. بعد از تعیین دوز mg/kg 60 به عنوان دوز موثر، تداخل اثر این دوز از عصاره بومادران شیرازی و حلال هم حجم آن (اتانول 70 درصد) با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتریک اکساید مورد بررسی قرار گرفت. برای تهیه محلول تمامی داروها از آب مقطر استفاده شد.
3-5- واکاوی آماری
گراف های ثبت شده با استفاده از نرم افزار Lab chart متعلق به سیستم Power lab به اعداد تبدیل شدند و این اعداد به وسیله نرم افزار SPSS و با استفاده از Paired- samples T-test برای تحلیل آماری درون گروهی و برای تحلیل آماری بین گروهی از آزمون آماری Independent T-test با در نظر گرفتن P<0.05 به عنوان سطح معنی دار، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

فصل چهارم
نتایج
4-1-گراف های ثبت شده با دستگاه
شکل 4-1-گراف ثبت شده از ABP , Ps , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه
شکل 4-2-گراف ثبت شده از ABP , PS , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق عصاره

شکل 4-3-گراف ثبت شده از ABP ,PS, Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق حلال عصاره(اتانول 70 درصد)نتایجی که در قالب جدول و یا شکل در این فصل آمده است بر حسب میانگین±خطای میانگینSEM)± (Mean بیان شده است.
4-2- فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به دوز های مختلف عصاره شیرین بیان
با بررسی دوزهای مختلف عصاره بومادران، بهترین و طولانی ترین افت فشار میانگین سرخرگی در دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم اتفاق افتاد.
n=3

شکل 4-4- نمودار تغییرات فشارمیانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره بومادران شیرازی نسبت به حالت پایه4-3- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره4-3-1 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) بر روی فشار خونبا توجه به جدول 4-1 و شکل 4-5 فشار خون( میانگین سرخرگی، سیستولی و دیاستولی) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه تغییرات قابل ملاحظه ای نشان نداده است.
با توجه به جدول 4-2 و شکل 4-6 فشارخون ( میانگین سرخرگی، سیستولی و دیاستولی) در حالت تزریق عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) نسبت به حالت پایه تغییرات معنی داری داشته است.
جدول 4-1- تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درمرحله تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه Mean pressure
(mm Hg) n=5 Diastolic pressure
(mm Hg) n=5 Systolic pressure
(mm Hg) n=5 Stage
Time(min)
Solvent Base Solvent Base Solvent Base 92.7±4.7
93.2±4.3
93.2±4.5
85.7±7.2
95.4±8.1 91.8±4.8
89.2±5.7
96.3±4.5
91.6±6.6
96.1±3.8 74.9±4.4
75.6±3.9
75.4±4.2
68.7±6.5
78.7±8 74±4.7
71.7±5.4
78.3±4.3
74.2±6.4
78.3±3.6
128.4±5.5
128.5±5.4
128.7±5.2
119.9±8.7
128.9±8.6
127.6±5.2
124.4±6.3
132.3±4.9
126.6±7.1
131.7±4.3 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25
جدول 4-2- مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درمرحله تزریق عصاره بومادران نسبت به حالت پایه Mean pressure
(mm Hg) n=5 Diastolic pressure
(mm Hg) n=5 Systolic pressure
mm Hg)n=5) Stage
Time(min)
erio Base erio Base erio Base 91.8±3.4 b
96.1±1.9
93.1±3.2
89.8±.6 b
87.4±1.7 b 99.7±1.7
103±.6
102.1±1
100.1±1
100.1±3.5 76.7±5
81±3.3
77.8±4.1
74.9±1.6 b
72.4±.4 b 86.3±1.5
89.4±.6
87.8±.6
86.2±.7


86.2±2.7 122.2±.2
126.3±.8 b
123.8±1.2
119.6±1.2 b
117.3±4.2 b 126.6±2.1
130.3±.6
130.7±1.7
127.9±1.6
127.9±5 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25
b : اختلاف معنی دار حالت تزریق عصاره(erio) نسبت به حالت پایه(Base)
4-3-2 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) بر روی ضربان قلببا توجه به جدول 4-3 و شکل 4-7 و شکل 4-8، ضربان قلب درحالت تزریق حلال نسبت به حالت پایه در گروه کنترل و در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه در گروه آزمایش تغییرات قابل ملاحظه ای نداشته است.
جدول 4-3-مقایسه تغییرات ضربان قلب درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه و تزریق عصاره نسبت به حالت پایهHeart rate (Beats/min)
n=5 Heart rate (Beats/min)
n=5 Stage
Time(min)
erio Base Solvent Base 410.8±8.8
404.6±7.9
414.4±3.3
414±5.7
400.2±2.6 406.1±12.1
407.1±10.9
403.3±12.5
406.8±9.1
397.7±12 372±22.2
369±22.9
369.6±17.8
352.2±26.2
351.1±27.1 372.5±22.7
366.4±22.4
376.1±23.7
367.6±27.1
372.9±23.5 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25

شکل 4-5- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه
شکل 4-6- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه
b : اختلاف معنی دار حالت تزریق عصاره(erio) نسبت به حالت پایه(Base) p<.05

شکل 4-7-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق حلال نسبت به سطح پایه
شکل 4-8-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق عصاره نسبت به سطح پایه4-4- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره و داروی استیل کولین(دوز 01/0 میلی گرم بر کیلوگرم)4-4-1- با توجه به شکل 4-9 و 4-10، فشار میانگین و ضربان قلب در حالت کنترل دارو و حالت پایه در هر دو گروه، در مقایسه با یکدیگر تغییرات قابل ملاحظه ای نداشته است.
در حالت پایه، حیوان سرم فیزیولوژیک دریافت می کرد.
در حالت کنترل دارو به حیوان، آب مقطر به عنوان حلال داروی استیل کولین تزریق می شد.

شکل 4-9-مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش
شکل 4-10-مقایسه میزان تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش4-4-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول های 4-4 و شکل 4-11، فشار سیستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. در حالت تزریق حلال عصاره تواًم با استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین، اختلاف معنی داری دیده نشد.
جدول4-4 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولینStage
Time Systolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 119.7+8.4
117.3+8.1
118.4+8.9 118.7+8.4
124.2+8.4
127.5+11.6
b110.3+9.6
b90.5+4.3
99.3+7.1
93.1+14.4
97.8+15.9 108.4+5.5
94.7+4
89+3.9
94.1+7.1
99.6+9.5
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05

شکل 4-11- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
4-4-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین
با توجه به جدول های 4-5 و شکل 4-12، فشار سیستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار سیستولی در حالت تزریق تواًم عصازه و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین نیز کاهش نشان داد که در بعضی از این دقایق، این کاهش معنی دار بود.
جدول 4-5- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین Stage
Time Systolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) erio +Ach
(n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 119.8+6
117.3+7
123.6+3.6 123+5.3
125.1+5.3
126.8+6.7 b114.1+5
b94.2+10.4
107+5.8
104+7.4
112.8+5.9 c
94.2+9
c81.9+3.9
83.9+4.1
86.5+6.9
94.4+12.3
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05

شکل 4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
4 -4-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول 4-6 و شکل 4-13، فشار دیاستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار دیاستولی در حالت تزریق تواًم حلال عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین تغییرات قابل ملاحظه ای نشان نداد.
جدول4-6- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین Stage
Time Diastolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 70.4+7.1
68.3+5.6
69.5+5.5 70.5+8.8
73.4+7.5
75.4+8.1 64.9+5.7
b52.9+3.1
59.9+4.1
55.3+10.8
57.5+10.7 61.7+3.5
55.6+3.9
52.7+3.7
54.3+4.7
58.9+5.5
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05

شکل4-13- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05
4-4-5- فشار دیاستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین
با توجه به جدول 4-7 و شکل 4-14، فشار دیاستولی در حالت تزریق استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار دیاستولی در حالت تزریق تواًم عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین کاهش بیشتری داشته است که در بعضی از دقایق این کاهش معنی دار است.
جدول4-7- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین Stage
Time Diastolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) erio +Ach
(n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 72.4+2.9
71.6+5.4
74+5.6 75.1+3.6
76.3+4.5
76.4+2.9 b63.8+4
b54.4+7.5
66.5+5
64.4+5.6
70.4+3.3 57.4+4.2
c45.7+4.7
50.2+1.7
51.8+3.4
55.9+5.1
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
b
شکل 4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
4-4-6- فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول 4-8 و شکل 4-15، فشار میانگین سرخرگی در حالت تزریق استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار میانگین سرخرگی در حالت تزریق تواًم حلال عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین تغییرات معنی داری نداشته است.
جدول4-8-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولینStage
Time Mean arterial Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3

user8250

گیرنده های NPW31
توزیع مرکزی NPW32
2-4-3) توزیع محیطی NPW33
توزیع NPBWR1-2 34
تنظیم تغذیه ومتابولیسم انرژی بوسیله NPW35
عملکرد اندوکرین NPW37
کورتیزول38
کورتیزول و فعالیت بدنی39
متابولیسم انرژی در فعالیت ورزشی41
فعالیت ورزشی فزاینده و شدید41
فعالیت ورزشی دراز مدت41
تاثیرات اسمولاریته بروی هورمون ها42
ارتباط کورتیزول با واسطه های متابولیکی43
ارتباط هورمون کورتیزول با اسید لاکتیک44
ارتباط هورمون کورتیزول با کراتینین44
کورتیزول و چاقی45
2-5-5-1) لینک پتانسیل بین کورتیزول و اشتها46
اثرات مضر چاقی ناشی ازکورتیزول46
تیروکسین47
تاثیر تیروکسین بر متابولیسم: 47
بی حرکت حاد و مزمن بر روی هورمون تیروئیدی48
هورمون های تیروئیدی و لپتین50
هورمون های تیروئیدی وگیاهان داروی51
2-7)جمع بندی 52
فصل سوم- روش شناسی پژوهش
3-1) روش پژوهش 54
3-2) طرح پژوهش54
3-3) جمع آوری وشیوه عصاره گیری ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-1) جمع آوری میوه ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-2) عصاره گیری آبی میوه ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-3) مقدار دوز عصاره مصرفی موش ها55
3-4) جامعه و نمونه آماری و روش نمونه گیری56
3-5) محیط پژوهش56
3-6) تغذیه آزمودنی ها57
3-7) دوره و زمان بندی تمرینی57
3-8) وسایل و ابزار استفاده شده در پژوهش59
3-9) متغیرهای پژوهش60
3-9-1) متغیر مستقل60
3-9-2) متغیرهای وابسته60
3-10) روش اندازه گیری متغیرهای پژوهش60
3-10-1) روش اندازه گیری متغییر های وابسته61
3-10-1-1) روش اندازه گیری NPW 61
3-10-1-2) روش اندازه گیری هورمون کورتیزول 61
3-10-1-3) روش اندازه گیری هورمون T461
3-11) روش اندازه گیری ترکیبات سرخ ولیک , سیاه ولیک با استفاده از GC-MS : 62
3-12) روش ها آماری62
فصل چهارم- تجزیه وتحلیل
4-1) مقدمه65
4-2) توصیف داده ها65
4-2-1) مشخصات آزمودنی های حیوانی65
4-2-2) یافتههای مربوط به متغیرهای مورد مطالعه66
4-3) تجزیه و تحلیل استنباطی یافتههای پژوهش66
4-3-1) یافته های مربوط به نوروپپتید W پلاسمایی68
4-3-2) یافته های مربوط به نوروپپتید w کبدی72
4-3-3) یافته های مربوط به کورتیزول پلاسمایی76
4-3-4) یافته های مربوط به هورمون تیروئید T481
فصل پنجم- بحث ونتیجه گیری
5-1) مقدمه88
5-2) خلاصهی پژوهش88
5-3) بحث و بررسی(نوروپپتید w پلاسمایی و کبدی ، هورمون کورتیزول و T489
5-4) نتیجهگیری93
5-5) پیشنهادات برای پژوهشهای بیشتر94
منابع..................................................................................................................................................................................................95
چکیده انگلیسی112
فهرست شکل
عنوان صفحه
شکل 2- 1) تنظیمات جبرانی دریافت و مصرف کالری 15
شکل 2 – 2) طراحی شماتیک ساده از مناطق هیپوتالاموس 17
شکل 2 – 3) گردش هورمون های موثر بر تعادل انرژی از طریق هسته کمانی 20
شکل 2-4 ) تنظیم مصرف غذا 23
شکل 2-5) فعال سازی سلول های عصبی NPY / AGRP 25
شکل 2-6) گرلین قبل و بعد از دریافت غذا28
شکل 2- 7 ) لپتین 30
شکل 2- 8) فرق نوروپتیید 23- w و نوروپتیید 30- w ( انسان ، خوک ، رت ، موش)32
شکل 2- 9 ) تصویر شماتیک بر اساس یافته های مطالعات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تنظیم اشتها در هیپوتالاموس توسط سلول های عصبی NPW و پپتید مرتبط با تغذیه در هیپوتالاموس36
شکل 3-1) مراحل اجرای طرح تحقیق در موش های صحرایی نر58
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول 2-1) مولکول های سیگنالی کاندید در هموستاز انرژی در CNS 22
جدول 3-1) حجم نمونه و مشخصات آزمودنی های هر گروه56
جدول 3- 2) پروتکل تمرین 8 هفته ای59
جدول 3- 3) مقادیر متغیر های مربوطه برای استخراج الکلی روغن سرخ ولیک63
جدول 4-1)، میانگین و انحراف استاندارد وزن موش های مورد پژوهش65
جدول 4-2) شاخص های توصیفی متغیرهای اصلی پژوهش66
جدول (4-3)، نتایج آزمون لون جهت بررسی هم واریانسی گروه های تحقیق67
جدول4-4) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه نوروپپتید W پلاسمایی68
جدول4-5) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه نوروپپتید W کبدی72
جدول4-6) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه کورتیزول پلاسمایی 76
جدول 4-7) نتایج آزمون توکی برای بررسی تفاوت بین گروه ها در کورتیزول پلاسمایی 77
جدول4-8)، آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه هورمون تیروئید T4 81
جدول( 4-9) نتایج آزمون توکی برای بررسی تفاوت بین گروه ها در هورمون تیروئید T482
فهرست نمودار ها
عنوان صفحه
نمودار (4-1)، مقایسه سطوح نوروپپتید w پلاسمایی گروه های تحقیق71
نمودار (4-2)، مقایسه سطوح نوروپپتید w کبدی گروه های تحقیق75
نمودار (4-3)، مقایسه سطوح کورتیزول پلاسمایی گروه های تحقیق80
نمودار (4-4)، مقایسه سطوح هورمون تیروئید T4 گروه های تحقیق85
فصل اول:
طرح پژوهش

1-1: مقدمه
تغییر سبک زندگی و عدم توجه به برنامه های غذایی، جوامع امروزه را به سمت افزایش وزن، چاقی و عدم مدیریت اشتهای کاذب و به همراه آن به سوی بی تحرکی سوق داده است. چاقی و افزایش بیش از حد بافت چربی یکی از مشکلات سلامت در کشورهای مختلف جهان است که به دنبال تغییر شرایط زندگی و کاهش فعالیت فیزیکی و در نتیجه عدم تعادل انرژی دریافتی و مصرفی رخ می دهد. در سالهای اخیر، چاقی شیوع رو به افزایشی داشته است ]2،1[. چاقی، به عنوان بحران سلامت عمومی شناخته می شود ]3[.
شیوع چاقی و پیشرفت سریع آن موجب شده که پژوهش ها به سمت تنظیم و تعادل وزن بدن پیش رود. در اصل، چاقی و اضافه وزن نتیجه عدم تعادل انرژی است که به موجب آن انرژی دریافت شده بیشتر از انرژی مصرف شده است. یکی از عوامل تاثیرگذار بر چاقی میزان دریافت غذاست. دریافت غذا رفتار پیچیده ای است که سطوح مختلف کنترلی و تنظیمی را در بر می گیرد ]4[. افزایش وزن و یا چاقی که خود مقدمه بسیاری از بیماری های انسانی و مرگ و میر شده است. امروزه در حوزه بهداشت، سلامت و شیوع شناسی و به تازگی در حوزه فیزیولوژی ورزش با عنایت بر تاثیر فعالیت بدنی و ورزشی در اشکال مختلف در مدیریت وزن و تنظیم و تعادل انرژی، توجهات در جهت ساز و کارهای اصلی درگیر جلب شده است. اگر چه هنوز معادله انرژی، هزینه کرد و انرژی دریافتی جزء پایه ای پژوهش های حوزه سلامت تلقی می شود. اما تغییرات در نوع منبع بکارگیری جهت تامین انرژی های سلولی در بدن که بخش قابل ملاحظه ای از آن توسط هیپوتالاموس و بخش دیگری که از اهمیت نیز برخوردار است، توسط عوامل محیطی کنترل می شود. در دهه های گذشته تا قبل از کشف و معرفی تعدادی از پروتئین ها و پپتیدهای موثر در تنظیم انرژی، عقیده بر این بوده است که دستگاه عصبی مرکزی، به ویژه هیپوتالاموس تنها اندام درگیر در تنظیم تعادل انرژی و سوخت و ساز است. اکنون دیگر مطلق بودن حاکمیت هیپوتالاموس در کنترل تعادل و تنظیم انرژی جای خود را به همگرایی مرکز و محیط داده است، به همین خاطر پژوهشگران پپتیدهای مرتبط با کنترل و تنظیم انرژی و اشتها، دریچه ای نو را به سوی این دنیای عظیم موثر بر روند زندگی سالم باز کرده اند]7،6،5[.
با این وجود، به نظر می رسد که هنوز هیپوتالاموس محوریت لازم را در کنترل تعادل انرژی، سوخت ساز قند و اشتها داشته باشد. شاید به این خاطر باشد که تعداد زیادی از نورپپتیدهای مترشحه (AGRP،NPY،CART،POMC ، اورکسین، MCH ، گالانین ، پپتید شبه گلوکاکن، عامل رهایی کورتیکوتروپین) از این اندام در مقایسه با اندامهای محیطی دیگر مشارکت بیشتری را در این امر دارند ]8[. نوروپپتید w یکی از این نوروپپیدهاست که نقش مهمی در متابولیسم تغذیه و انرژی دارد ]9[.
1-2: بیان مسئله:
تمرین و فعالیت بدنی به عنوان یکی از عوامل موثر در تحلیل منابع انرژی سلولی از جمله گلوکز و گلیکوژن است، که می تواند تغییراتی در پپتیدهای و هورمون های موثر بر تنظیم و تعادل انرژی بوجود آورد. همچنین اظهار شده است که بازسازی و ریکاوری آنی ذخایر انرژی از جمله گلوکز و گلیکوژن نیز می توانند بر غلظت این پپتیدها اثرگذار باشند. در صورت عدم بازسازی مناسب و به موقع با مشکلاتی چون تغییر در غلظت پپتیدهای موثر بر تنظیم انرژی مواجه خواهیم شد. عدم تعادل بین پپتیدهای مهارگر و تحریک کننده دریافت غذا مانند لپتین، AGRP,NPY,CART,POMC, و گرلین به عنوان عوامل دخیل در روند سازوکاری می تواند به افزایش درصد چربی بدن، چاقی و غلبه روند اشتهاآوری بر ضد اشتهایی شود. اتخاذ راه کاری صحیح و آنی برای مقابله با این عدم تعادل می تواند از اختلالات سوخت و سازی تعادل و تنظیم انرژی (افزایش وزن یا کاهش غیرمنطقی، اتلاف انرژی) جلوگیری نماید. هرچند نوروپپتیدw در انسان اخیرا کشف شده است]10[ اما از زمان کشف نروپپتایدها، دانش ما از تنظیم وزن، اشتها و تعادل انرژی به نحو چشمگیری افزایش یافت. بسیاری از متخصصان حوزه سلامت، بهداشت و به خصوص تنظیم وزن، امیدوارند که با شناسایی جنبه های مهم و ناشناخته این نروپپتایدها و عوامل موثر بر آنها به روش های درمانی کارآمد و کشف داروهای جدیدی را برای امراضی چون چاقی دست یابند .امروزه تقریبا تاثیر نوروپپتیدها بروی هورمون ها ثابت شده است. از طرفی تغییر در هورمون ها نیز باعث تغییر در وزن بدن می شود.گزارش های رسیده نیز نشان می دهد که NPW نه تنها در تنظیم انرژی بلکه در هموستاز هورمونی نیز نقش دارد، ]11[
هورمون ها نقش مهمی در تنظیم اشتها، متابولیسم بدن و تنظیم سطح انرژی دارند]12[. فعالیت و تمرینات ورزشی روی سطوح خونی هورمون ها تاثیر می گذارند و به کاهش یا افزایش سطح برخی از هورمون ها نسبت به حالت استراحت منجر می شوند. در واقع این نوسانات هورمونی را می توان واکنش بدن در برابر فشارهای تمرینی قلمداد کرد، تا حالت هموستاز بدن برقرار شود ]13،14[. عدم تعادل در سطح هورمون ها در گیر در اشتها ( انسولین ، گلوکاگون ، کورتیزول و هورمون‌های غده تیروئید) می تواند به افزایش وزن منجر شود.
هورمون کوتیزول که یک گلوکوکورتیکوئید است ، و از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود، نقش بسزایی در برقراری این هموستاز دارد ]15[ . کورتیزول به طور مستقیم بر ذخیره چربی و افزایش وزن در افراد تاثیر دارد . یکی از اثرات مهم کورتیزول، نقش آن روی سوخت و ساز کربوهیدرات ها، پروتئین ها و چربی ها است.این هورمون فرآیند گلوکونئوژنز را از اسیدهای آمینه تسهیل، لیپوژنز کبد را کاهش و چربی های موجود در بافت چربی را به حرکت در می آورد . کورتیزول سوبسترای لازم را برای عمل گلوکرنئوژنز (اسیدهای آمینه) و سوخت های جایگزین را برای متابولیسم انرژی عضله اسکلتی (اسیدهای چرب) تامین کند]16،17،18،19[
هورمون تیرکسین یکی از هورمون های مهم متابولیسمی بدن است ]20[. که توسط غده ی تیرویید که تحت تاثیر محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- تیرویید ( H-P-T) است ،تنظیم می شود ]21[ . در بررسی های متعدد ، اثر بسیاری از عوامل مانند دمای محیط ، استرس ، هورمون های دیگر ، ترکیبات شیمیایی ، نوسانات شبانه روزی ،... بر محور نامبرده به اثبات رسیده است. هورمون تیرویید ارتباط ویژه ای با رشد ، اشتها ، متابولیسم ، تنظیم اسمزی و تولید مثل دارد ]22[ افزایش میزان سوخت و ساز پایه، اثر اصلی هورمون های تیروئید است. عمل عمده ی این هورمون ها افزایش سوخت و ساز قندها و چربیها است]23[.
از طرفی استفاده از مواد مغذی ، به ویژه مواد قندی،اسیدهای چرب، نوشیدنی های ورزشی حاوی اسیدهای آمینه ، مواد معدنی و ویتامین ها ، آنتی اکسیدنها پس از تمرین و فعالیت بدنی، برای بازسازی سریع و افزون سازی منابع انرژی (گلیکوژن و ATP ) و کنترل وزن و اشتها توسط متخصصین و مربیان آگاه توصیه شده و می شود. در این راستا، استفاده از مکمل های غذایی طبیعی و صناعی بر عملکرد ورزشی، توازن بین اکساینده ها و ضد اکسایش کننده های بدن، توسط ورزشکاران ، مربیان ، متخصصین و پژوهشگران توصیه و بررسی شده است. علاوه بر موارد فوق، تاثیر برخی از گیاهان خوراکی و دارویی از قبیل: شنبلیله ]24[ ، برگ ریحان ]25[، توت هندی ]26[، لئوکاس سفالوتز (نوعی علف هرز خوراکی در هند) ]27[، بر روند بازسازی منابع انرژی به ویژه گلیکوژن در نمونه های حیوانی مطالعه شده است. با این وجود در هیچ یک از پژوهش های انجام شده به تاثیر این گیاهان دارویی و غذایی بر پپتیدهای درگیر در تنظیم تعادل انرژی، سوخت وساز قند، اشتها و وزن، با و یا بدون فعالیت بدنی و تمرین مورد توجه قرار نگرفته است. همچنین ، ولیک به عنوان یک گیاه دارویی منحصر به فرد از حیث ترکیبات و خواص به طور جدی در حوزه ی فیزیولوژی ورزش مورد توجه قرار نگرفته است.
ولیک یکی از قدیمی ترین گیاهان دارویی در طب اروپایی می باشد و برای اولین با توسط دیوسکورید در قرن 1 شرح داده شد]28[. عصاره ولیک از گل، برگ و میوه این گیاه مشتق می شود. مطالعه بالینی کمی به بررسی میوه ولیک به تنهایی پرداخته است ]29[. برگ، گل و میوه ولیک دارای مقادیر زیادی پروسیانیدین الیگومریک ، فلاونوئیدها می باشد، که مسئول اثر دارویی آن است]30[.
گیاه ولیک سرخ با اسامی مختلفی از قبیل هاثرن و از خانواده روزاسه به صورت سنتی به عنوان تونیک قلبی استفاده می شود. ترکیبات مختلفی در ولیک سرخ وجود دارد که شامل: ساپونین های تری ترپن، فلاونوئیدها، کاتیشن، اپی کاتشین می باشد ]31[.
گزارش شده است سرخ ولیک یک گیاه دارویی با ارزش از تیره گل سرخ است که امروزه در درمان ضایعات قلبی و گردش خون و به ویژه به عنوان ضد عفونت ها و آنتی اکسیدان، تب بر قابل استفاده می شو د؛ و اهمیت دارویی آن به دلیل وجود ترکیبات فنلی است که در این رده فلاونوئیدها نقش دارویی مهمی دارند]32[.همچنین مصرف آنتی اکسیدانهای غذایی می تواند از شیوع بیماری های متابولیک کم کند]33[.فلاونوئیدها بخاطر آنتی اکسیدان بودن در تنظیم تغذیه دخیل است و باعث تنظیم چربی خون ،تنظیم متابولیسم گلوکز و کربوهیدارت می شود ]34[ .
بنابراین ، این پژوهش قصد دارد تا تأثیر همزمانی تمرین با شدت بالا را به همراه دو نوع ولیک ( کراتاگوس ) سرخ و سیاه بر شاخص های مربوط به اشتها را در نمونه حیوانی ( مریوط به موش های نر) مورد ارزیابی قرار دهد. آیا تمرین شدید بر سطوح نوروپپتید W ، T4 ، کورتیزول پلاسمایی و بر سطوح نوروپپتید W کبدی درموش های صحرایی نر اثر دارد؟ آیا مکمل سازی آبی ولیک بر سطوح نوروپپتید W ، T4 ، کورتیزول پلاسمایی و بر سطوح نوروپپتید W کبدی درموش های صحرایی نر اثر دارد؟.
1-3: ضرورت و اهمیت تحقیق:
از آنجایی که بررسی و نمونه برداری بافت های انسانی از دشواری های زیادی برخوردار است و پژوهش های انجام شده بر روی مدل های حیوانی که شباهت های عملکردی با انسان دارند، می تواند تا حدودی بیانگر رخدادهای عملکردی در انسان باشند، از این رو در مطالعه حاضر انجام پژوهش روی پلاسما و بافت موش های صحرائی نر صورت پذیرفته است.
همان طور که گفته شد چاقی و اضافه وزن از یک سو و کمبود وزن و بی اشتهایی از سوی دیگر دو انتهای طیفی می باشند که همواره سلامتی جامعه را تهدید کرده و به عنوان یکی از معضلات جوامع امروزی باشند. شیوع گسترش چاقی و بیماری های مرتبط با آن در سطح جهان، شاهدی بر این مدعاست که پیشرفت های علمی در زمینه شناخت عوامل و مکانیسم های تنظیم وزن و به خصوص پیشگیری ، مبارزه و درمان چاقی توفیق چندانی نداشته است]4[. متاسفانه درکشور ما نیز، چاقی شیوع گسترده ای دارد. بر اساس پژوهش های صورت گرفته در ایران، بررسی ۸۹۹۸ فرد سنین 81 – 35 ساله (2005- 2002) نشان داد که 2/62٪ افراد دارای اضافه وزن و 28٪ ان ها چاق بوده اند ]35[. این در حالی است که چاقی با ابتلا به بیماری های بسیاری همراه است ]36[.دلایل ابتلا به چاقی متعدد می باشند، اما از نظر فیزیولوژی، چاقی ناشی از عدم تعادل انرژی است و درمان اولیه ی آن شامل کاهش دریافت غذا یا افزایش مصرف انرژی و یا هر دوی این موارد می باشد ]36،35[.
بنابراین از جنبه سلامت و بهداشت عمومی، شناخت عوامل و مکانیسم های موثر بر تعادل انرژی و تنظیم وزن می تواند به ارتقاء سطیح سلامت جامعه و صرفه جویی در هزینه های درمانی کمک نماید. هم چنین در شماری از بیماری ها، کاهش اشتها و تعادل منفی انرژی باعث بروز مشکلات عدیده و افزایش مرگ و میر می شود. مشخص شده که در این شرایط نیز نروپپتایدها نقش کلیدی دارند. بنابراین می توان امیدوار بود که شناخت مکانیسم این فرآیندها به درمان آنها اقدام کرد. از طرف دیگر نوروپپتید w که به تازگی (حدود یک دهه) کشف شده است و با توجه به نقش کلیدی خود در هموستاز و تنظیم وزن، تحقیقات بسیار کمی درباره این نوروپپتید صورت گرفته است، همچنین تحقیقات زیادی به تمرین به عنوان یک عامل مهم و موثر بر تعادل انرژی و تنظیم وزن و ارتباط آن نوروپپتید w انجام نشده است .همانطور که دیده می شود متخصصینی که در مورد نوروپتیید w و سایر نروپتاییدها مطالعه می کنند به ورزش ، تمرین و فعالیت بدنی عنایتی نداشته اند. برخی شرایط مانند فعالیت بدنی و تمرین می تواند تغییراتی را در پپتیدهای موثر برتنظیم و تعادل انرژی بوجود آورند. تمرین و فعالیت بدنی ، تعادل انرژی در سلول ها را به هم زده و هزینه ی انرژی سلول ها را افزایش می دهد. فعالیت های بدنی منظم ، دستگاه های مختلف انرژی را در گیر کرده و موجب سازگاری های عضلانی ، تنفسی ، قلبی – عروقی ، و سازگار ی متابولیکی می شود ]37[. از آنجایی که تاکنون پژوهشی در مورد تاثیر تمرین ورزشی و عصاره ولیک بر روی نوروپپتیدW پلاسمایی و بافتی صورت نگرفته ، پژوهش حاضر قصد دارد با بررسی اثر فعالیت ورزشی و عصاره میوه ولیک بر روی این نوروپپتید را بررسی نماید.
1-4 – اهداف پژوهش:
1-4-1-هدف کلی:
هدف کلی این پژوهش تعیین اثر8 هفته تمرین شدید بر سطوح نوروپپتید W پلاسمایی و کبدی، پاسخ های هورمون کورتیزول و T4 در موشهای صحرایی نر با و بدون عصاره آبی ولیک (سرخ و سیاه ) می باشد.
1-4-2-اهداف ویژه:
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید با و بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر سطح نوروپپتید w پلاسما
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر سطح نوروپپتید w کبد
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر هورمون کورتیزول
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر هورمون تیروکسین
بررسی ارتباط سطوح نوروپپتید w پلاسما ، با دیگر متغییر ها
1-5 - فرضیه های پژوهش:
فرضیه 1 : هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح نوروپپتید W پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه 2: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح نوروپپتید W کبدی موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه3: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح هورمون کورتیزول پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه 4: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک بر سطح هورمون تیروکسین پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
1-6- محدودیت های پژوهش :
1-6-1- محدودیت های غیر قابل کنترل
ـ عدم کنترل دقیق فعالیت شبانه آزمودنی ها
ـ عدم اندازه گیری مقدار غذای مصرفی برای هر نمونه بدلیل نبودن امکانات کافی
ـ عدم کنترل تاثیر عوامل وراثتی آزمودنی ها
1-7- تعریف واژها و اصطلاحات پژوهش
ولیک (کراتاکوس) cratacgus
ولیک یک گیاه دارویی با ارزش است که امروزه در درمان ضایعات قلبی و گردش خون و به ویژه به عنوان ضد عفونت ها و آنتی اکسیدان، تب بر استفاده می شود؛ و اهمیت دارویی آن به دلیل وجود ترکیبات فنلی است که در این رده فلاونوئیدها نقش دارویی مهمی دارند. همچنین مصرف آنتی اکسیدانهای غذایی می تواند از شیوع بیماری های متابولیک کم کند. فلاونوئیدها بخاطر آنتی اکسیدان بودن در تنظیم تغذیه دخیل است و باعث تنظیم چربی خون ،تنظیم متابولیسم گلوکز و کربوهیدارت می شود .
نوروپپتید w: نوروپپتید W تشکیل شده از 30 اسید آمینه و مشتق شده از یک پری پرو پروتئین 165 آمینو اسید است که ژن آن در انسان توسط تاناکا و هکارانش شناسای شد. NPW به ایفای نقش به عنوان عامل ضد اشتها عمل و باعث افزایش دما و متابولیسم بدن می شود.
کورتیزول: هورمون کوتیزول که یک گلوکوکورتیکوئید است ، و از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود، نقش بسزایی در برقراری هموستاز بدن دارد . هورمون کورتیزول در بدن به صورت دوره ای ترشح می شود، که دامنه و میزان ترشح آن را ریتم شبانه روزی تنظیم می کند. غلظت این هورمون در گردش خون، صبح زود به دلیل افزایش دامنه و میزان ترشح آن در بالاترین سطح است. میزان ترشح کورتیزول به تدریج در طول روز کاهش می یابد و غلظت آن در شب به حداقل میزان خود می رسد .پژوهش ها نشان داده اند که وزن و درصد چربی بدن بر ترشح کورتیزول تاثیر می گذارد.
هورمون تیروکسین یا 4T: تیروکسین به هورمون ترشح شده ازغده تیروئید می‌گویند. هورمون غده تیروئید تری یدوتیرونین 3 Tو تیروکسین 4Tاست .این هورمون از اضافه شدن چهار اتم ید به آمینواسید تیروزین ساخته می‌شود. هورمون های تیروئیدی در سوخت و ساز کلی بدن نقش داشته و نقص در عملکرد غده تیروئید و ترشح نامناسب این هورمون ها عواقب متعدد فیزیولوژیک را به دنبال دارد. برای مثال کاهش غلظت پلاسمایی هورمون های تیروئیدی باعث افزایش وزن و کاهش اشتها می گردد و افزایش آنها کاهش وزن و پرخوری را به دنبال دارد.
تمرین شدید : فعالیت ورزشی دویدن روی نوار گردان ( 5 روز در هفته ، با سرعت 34 متر در دقیقه ، شیب صفر درجه و به مدت 60 دقیقه ) انجام شد.
فصل دوم:
مبانی نظری و پیشینه پژوهش

:2-1مقدمه
در این فصل ابتدا مبانی نظری پژوهش مورد بحث و بررسی قرار خواهد گرفت.پیشنه و مبانی نظری پژوهش ، طیف وسیعی از اطلاعات و نظریه های علمی است که بیان کننده کمیت و کیفت اطلاعات موجود در رابطه با موضوع پژوهشی می باشد و به تشریح پژوهش های مرتبط با موضوع می پردازد . در این فصل پژوهشگر ابتدا به بررسی و مطالعه مفاهیم اساسی که در حوزه پژوهش دارای اهمیت هستند ، نظیر مکمل سازی ، پروتکل تمرینی و ... می پردازدو در پایان اطلاعات ارائه شده ، تحقیقات قبلی انجام شده و نتایج انها بیان می شود.
2-2: مبانی نظری تحقیق
2-2-1:چاقی
چاقی اختلالی است که از عدم تعادل دریافت و هزینه کرد انرژی ناشی می شود. عدم تعادل انرژی به عنوان فیدبکی برای فیزیولوژی و محیط عمل کرده و بر هزینه کرد و دریافت انرژی اثر می گذارد ]38[. ما انرژی را به صورت چربی ذخیره سازی می کنیم، چرا که هم نسبت به کربوهیدرات متراکم تر است و هم برای ذخیره شدن نیاز به مقدار زیادی آب ندارد. پدیده چاقی دو وجهه کاملا متفاوتی داردکه ژنتیک و محیط ]38[.
اطلاعات و آمار نشان می دهد که چاقی در کشورهای غربی در حال افزایش است . و عوامل مختلفی را می توان در این مورد دخیل دانست. از جمله تماشای تلویزیون، غذاهای فوری، کم تحرکی و استفاده از وسایل ماشینی در انجام امور روزمره و ... اشاره کرد. عقیده کلی بر این است که تعادل انرژی و وزن باید به گونه ای تنظیم شود تا اثرات تعادل بین هزینه کرد و دریافت انرژی بر چاقی و وزن بدن کنترل شود . لذا وزن بدن باید به طریقی تنظیم شود، که می دانیم هموستاز انرژی از طریق سیستم عصبی پیچیده ای تنظیم می شود که اثر فراز و نشیبهای کوتاه مدت در تعادل انرژی را بر روی توده بدن به حداقل می رساند. اخیرا مولکول های میانجی و مسیرهای دریافت غذا و تنظیم وزن در مغز شناسایی شده اند ]39[. گزارش کرده اند که با وجود کاهش در مقدار غذای دریافتی روزانه قادر به کاهش وزن نیستند. این ادعا به ایجاد این فرضیه منجر شد که چاقی در اثر اختلال های متابولیکی و نادرست بودن عادت های رفتاری است ، که موجب کاهش انرژی مصرفی در افراد چاق می شود ]40[.
2-2-2:تنظیم تعادل انرژی
عقیده ی کلی بر این است که تعادل انرژی و وزن بدن پدیده ای اند که باید تنظیم شوند. این عقیده از آن جا ناشی می شود که اثر بالقوه عدم تعادل بین هزینه انرژی و دریافت آن بر چاقی وزن بدن مشاهده می شود ]38[. به همین منظور هموستاز انرژی از راه سیستم عصبی پیچیده ای تنظیم می شود که اثر فراز و نشیب های کوتاه مدت در تعادل انرژی را بر روی توده ی چربی بدن به حداقل می رساند. اخیراً مولکول های میانجی و مسیرهای تنظیمی غذا خوردن و تنظیم وزن در مغز شناسایی شده اند ]39[.
محتوای انرژی سلول ها به تعادل بین تولید و مصرف انرژی در سلول ها بستگی دارد. یکی از شرایطی که می تواند تعادل انرژی را در سلول به هم زده و نیازهای هاصی را به سلول تحمیل نماید، ازدیاد هزینه کرد انرژی در اثر فشارهای مختلف روانی و جسمانی از جمله انجام فعالیت بدنی و تمیرن است. به بیان دیگر، در نتیجه تمرین و فعالیت بدنی، تعادل انرژی در سلول به هم خورده و هزینه ی انرژی سلول افزایشمی یابد. سلول در پاسخ به این وضعیت جدید پاسخ های موقتی و لازم را از خود نشان می دهد که در صورت تداوم یافتن این وضعیت، رفته رفته به سازگاری مناسب متابولیکی نایل می شود و در صورت رفع این فشار تدریجاً وضعیت انرژی سلولی به حالت اولیه ی خود برمی گردد. بنابراین گفته می شود که سلول یا اندام یا دستگاه درگیر در مقابل فشار فیزیکی وارده سازگار شده است. تمرین و فعالیت های بدنی منظم، دستگاه های مختلف انرژی را درگیر کرده و موجب سازگاری های عضلانی، تنفسی، قلبی – عروقی و سازگاری متابولیکی می شود که متعاقب فعالیت های بدنی و ورزشی رخ می دهند ]37[.

شکل 2- 1) تنظیمات جبرانی دریافت و مصرف کالری در پاسخ به تغییرات در محتوای چربی بدن است.]47[
2-2-3:کنترل اشتها و هموستاز انرژی
مرکز اصلی هموستاز یا تعادل انرژی در انسان هیپوتالاموس می باشد ، هرچند نواحی مختلفی از مغز از کورتکس گرفته تا ساقه مغز در رفتار دریافت غذا و هموستاز انرژی دخالت دارند . در بیشترین بزرگسالان ذخایر چربی و وزن بدن علیرغم تغییرات بسیار گسترده مصرف غذای روزانه و مصرف انرژی به طور چشمگیری ثابت است. برای برقراری تعادل بین انرژی دریافتی و مصرف غذای روزانه و مصرف انرژی به طور چشمگیری ثابت است. برای برقراری تعادل بین انرژی دریافتی و مصرفی یک سیستم فیزیولوژیکی پیچیده شامل سیگنال های آوران و وابران فعالیت می کند] 1[. این سیستم شامل مسیرهای چندگانه ای است که در تعامل با هم وزن را کنترل می نماید .در گردش خون هورمون هایی وجود دارند که به صورت حاد و موقت غذا خوردن را شروع یا خاتمه می دهند وهم هورمون هایی هستند که منعکس کننده چاقی و تعادل انرژی بدن می باشد. این سیگنال ها به وسیله اعصاب محیطی و مراکز مغری از جمله هیپوتالموس و ساقه مغزی یکپارچه می شوند هنگامی که سیگنال ها یکپارچه شوند ، نوروپتید های مرکزی را ، که غذا خوردن و هزینه انرژی را تغییر می دهند ، تنظیم می کنند ] 1[.
پیچیدگی رفتار دریافت غذا منعکس کننده ی تعداد نواحی در گیر در مغز است. به عنوان مثال ، قشر پیشانی چشمی در گیر در سیری ویژه حسی است در حالی که آمیگدال در ارزیابی مزه و طعم غذا دخالت دارد . بنابراین رفتار دریافت غذا را می توان به فاز های مختلفی از جمله فاز اشتها ، که شامل جستجو برای غذا است ، و فاز مصرف شامل خوردن واقعی غذا است ، تقسیم بندی کرد ]41[.
برای حفظ یک وزن ثابت در یک دوره ی زمانی نسبتا طولانی همواره باید توازنی بین دریافت غذا و هزینه انرژی برقرار باشد . هیپوتالاموس اولین مرکز ی است که حدود 50 سال قبل نقش آن در این فرایند شناخته شد . علیرغم در گیری نقاط مختلفی از مغز در رفتار غذا خوردن ، هیپوتالاموس به عنوان مرکز اصلی غذا خوردن مطرح می باشد .در اوایل دهه 1940 نشان داده شد که تزریق یا تحریک الکتریکی هسته ها ویژه ای در هیپوتالاموس ، رفتار تغذیه ای را تغییر می دهد. هیپوتالاموس شامل چندین هسته می باشد که در دریافت غذا دخالت دارند شامل هسته های کمانی (ARC) ، هسته ای مجاور بطنی (PVN) ، بخش های جانبی هیپوتالاموس (LHA) ، هسته های بطنی میانی (VMH) و هسته های خلفی میانی (DMH). در ARC دو دسته اصلی نورون که به وضعیت تغذیه ای حساس هستند و جود دارند . یکی دسته از ان ها دریافت غذا و اشتها را تحریک و دسته دیگر ان را مهار می کنند ]41[. هسته های بطنی میانی (VM) به عنوان « مرکز سیری» و هسته های جانبی هیپوتالاموس (LH) عنوان «مرکز گرسنگی» شناخته شده اند. هسته های کمانی (ARC) هیپوتالاموس نیز به عنوان محلی که این سیگنال های تنظیمی اشتها را یکپارچه می کند شناخته شده است ]42[ .

شکل 2 – 2) طراحی شماتیک ساده از مناطق هیپوتالاموس که در مصرف مواد غذایی نقش اصلی ایفا می کند.]41[
2-2-4:هیپوتالاموس
برای حفظ یک وزن در یک دوره زمانی نسبتاً طولانی همواره باید توازنی بین دریافت غذا و هزینه انرژی برقرار باشد. هیپوتالاموس اولبین مرکزی است که حدود 50 سال قبل نقش ان در این فرایند شناخته شد. در اوایل دهه 1940 نشان داده شد که تزریق یا ایجاد تحریک در هسته های ویژه ای از هیپوتالاموس باعث تغییر در رفتار تغذیه ای و دریافت غذا می شود. در هیپوتالاموس هسته های بطنی میانی (VMH) ، به عنوان «مرکز گرسنگی» شناخته شده اند. هسته های کمانی (ARC) هیپوتالاموس نیز به عنوان محلی که این سیگنال های تنظیمی اشتها را یکپارچه می کنند شناخته شده است. چرخه های عصبی متعددی در هیپوتالاموس قرار دارد. بر اساس دانسته های ما شبکه های عصبی و انشعابات آنها در داخل هیپوتالاموس قرار دارد. بر اساس دانسته های ما شبکه های عصبی و انشعابات آنها در داخل هیپوتالاموس گسترش پیدا می کنند و اجتماعات عصبی مجزا، نروترانسمیترهای ویژه ای را ترشح کرده که بردریافت غذا و یا هزینه کرد انرژی اثر گذاشته که خود توسط سیگنال های خاص وضعیت تغذیه ای تنظیم می شوند. سیگنال های محیطی درگیر در تهادل انرژی، از قبیل هورمون های روده ای مثل پپتاید YY و GLP-1 از طریق یک مکانیسم فیرقابل اشباع از سد خونی- مغزی گذشته و بنابراین به ARC می رسند. البته سیگنال های دیگری از قبیل لپتین و انسولین از طریق یک مکانیسم قابل اشباع از خون به مغز می رسند. بنابراین سد خونی – مغزی یک نقش تنظیمی پویا در عبور دادن برخی سیگنال های انرژی گردش خون دارد. در ARC دو دسته اصلی نرون که به وضعیت تغذیه ای حساس هستند ، وجود دارند . یک دسته از انها دریافت غذا و اشتها را تحریک و دسته دیگر ان را مهار می کنند عوامل اشتها آور و شد اشتها به ترتیب فعالیت سیستم عصبی سمپاتیک را کاهش و افزایش می دهند و به موجب آن ذخایر چربی بدن و هزینه انرژی را تنظیم می کنند . این عمل از طریق تغییر گرمازایی در BAT و احتمالاً در محل های دیگری از قبیل بافت سفید چربی وعضله، از طریق القاء پروتئین جفت نشده میتوکندریایی یک UCP-1 و UCP-2 و UCP-3، انجام می شود. ارتباط بین دریافت غذا و فعالیت سمپاتیک از طریق مواد انتقال دهنده عصبی متعددی صورت می گیرد. نروپتایدها عناصر مهم سیستم تنظیم کننده دریافت غذا هستند. هورمون ها ، انتقال دهنده های عصبی و نروپتایدهایی که بر دریافت غذا اثر می گذارند. مولکول های تحریک کننده اشتها شامل نوراپی نفرین، گاما آمینو بوتیریک اسید و هفت دسته از نروپتایدها هستند، در حالی که مولکول های مهار کننده غذا اشتها شامل سروتونین، دوپامین و تعداد زیادی از پپپتایدهای روده ای – مغزی هستند ]42[ .
2-2-5:سیگنال های عصبی و هورمونی کنترل اشتها
در موجودات تکامل یافته، نظیر انسان سیستم تنظیم دریافت غذا شامل دو بخش شبکه تنظیم اشتها و سیگنال های عصبی و هورمونی ارسالی از نواحی مختلف بدن به شبکه تنظیم اشتها می باشد که بخش اول از نورون های ایجاد کننده اشتها یا نورون های اورکسیژنیک و نورون های ایجاد کننده بی اشتهایی یا نورون های انورکسیژنیک تشکیل شده است که همگی در هسته های مختلف هیپوتالاموس قرار دارند و این دو دسته نورون شبکه تنظیم اشتها با یکدیگر در ارتباط هستند و بر فعالیت یکدیگر اثر می گذارند ]43[ . بنابراین عوامل تنظیمی متعددی چون هسته های مختلف هیپوتالاموس واقع در سیستم عصبی مرکزی، ذخایر انرژی و هورمون ها در تنظیم اشتها و دریافت غذا بصورت دراز مدت وکوتاه مدت دخالت دارند . در انسان انتقال دهنده های سیستم عصبی و پپتیدهای روده ای متعددی از عوامل مهم تنظیم اشتها می باشند]44[. اکثر مطالعات انجام گرفته در زمینه اشتها و دریافت غذا، روی دو هورمون لپتین و گرلین متمرکز است. این دو هورمون بعنوان تنظیم کننده های اصلی شبکه تنظیم اشتها و دریافت غذا درهسته های مختلف هیپوتالاموس مطرح هستند]45[.
هورمون لپتین محصول ژن چاقی است که در تنظیم فرایندهای متابولیک دخیل است و نمایانگر میزان ذخیره چربی بدن است . این هورمون با گیرنده های ویژه ای در هیپوتالاموس و با مهار باعث کاهش اشتها می شود و از طرف دیگر ترشح نوروپپتید Y با افزایش فعالیت سیستم عصبی سمپاتیک و لیپولیز موجب افزایش میزان متابولیسم بدن، میزان انرژی مورد نیاز و در نتیجه میزان چربی بدن را کنترل می کند]46[.
گرلین به عنوان یک لیگاند درون زاد برای گیرنده ترشح دهنده هورمون رشد مطرح است. سلول های غده اکسینتیک موکوس فوندوس معده منبع اصلی این پپتید اشتها آور است ]47[. مطالعات گذشته نشان داده است درحالی که تزریق انسولین در برخی از هسته های هیپوتالاموس سیستم اعصاب مرکزی دریک روش وابسته به دوز بعد از ورود به فضای بین سلولی درمغز به رسپتورهای خود نظیر نورون های، نوروپپتید Y متصل و آن را مهار می کند و یا از طریق تحریک انتقال دهنده عصبی α –MSH به دلیل افزایش تولید وترشح لپتین سبب کاهش دریافت غذا می شود ولی افزایش سطح سرمی انسولین (به صورت محیطی) در صورتیکه باعث کاهش غلظت گلوکزخون شود می تواند اشتها را تحریک نماید ]48[.

شکل 2 – 3 ) گردش هورمون های موثر بر تعادل انرژی از طریق هسته کمانی ]44[
2-2-6:سیستم کنترل مرکزی
سیگنال های نماینده چاقی در CNS یکپارچه می شوند. در داخل CNS دریافت غذا و تنظیم وزن به طور موثری انجام می شود. در CNS و بطور اختصاصی در هیپوتالاموس دو سیستم موثر آنابولیک و کاتابولیک وجود دارد که وزن بدن و توده چربی را تنظیم می نمایند . مسیرهای که سیگنال های چاقی از لپتین (مترشحه از آدیپوسیت ها) و انسولین (مترشحه از پانکراس ) با چرخه های خودکار مرکزی اندازه غذا را تنظیم می کنند.لپتین و انسولین مسیر کاتابولیک (نرون های POMC/CART ) را تحریک و مسیر آنابولیک (نرون های NPY/AGRP ) که از ARC منشأ می گیرندۀ را مهار می کنند. درون دادهای آوران وابسته به سیری از کبد و مجاری معده ای ـ روده ای و از پپتیدهایی مثل CCK از طریق عصب واگ و تارهای سمپاتیک به NTS ، یعنی جای که با درون دادهای پایین رونده هیپوتالاموس یکپارچه می شوند. برون داد عصبی خالص از NTS و سایر نواحی بصل النخاع و مخچه مغز منجر به خاتمه غذا خوردن می شوند. کاهش درون دادهای از سیگنال های چاقی ( در حین کاهش وزن ناشی از رژیم) بنابراین باعث افزایش اندازه غذا به وسیله کاهش پاسخ های ساقه مغز به سیگنال های سیری می شوند]4[.
مسیر های که سیگنال های جاقی از لپتین (مترشحه از آدیپوسیت ها) و انسولین (مترشحه از پانکراس) با چرخه های خودکار مرکزی اندازه غذا را تنظیم می کنند. لپتین و انسولین مسیر کاتابولیک (نرون های POMC/CART ) را تحریک و مسیر آنابولیک (نرون های NPY/AGRP ) که از ARC منشأ می گیرند ، را مهار می کنند. درون دادهای آوران وابسته به سیری از کبد و مجاری معده ای-روده ای و از پپتیدهایی مثل CCK از طریق عصب واگ و تارهای سمپاتیک به NTS ، یعنی جای که با درون دادهای پایین رونده هیپوتالاموس یکپارچه می شوند. برون داد عصبی خالص از NTS و سایر نواحی بصل النخاع و مخچه مغز منجر به خاتمه غذا خوردن می شوند. کاهش درون دادها از سیگنال های چاقی (درحین کاهش وزن ناشی از رژیم) بنابراین باعث افزایش اندازه غذا به وسیله کاهش پاسخ های ساقه مغز به سیگنال های سیری می شوند. ]4[.

جدول 2-1- مولکول های سیگنالی کاندید در هموستاز انرژی در CNS ]39[.
سیستم موثر آنابولیک باعث افزایش دریافت غذا، اکتساب وزن، کاهش هزینه انرژی و برعکس سیستم موثر کاتابولیک باعث کاهش دریافت غذا ، از دست دادن وزن و افزایش هزینه انرژی می شود .
2-2-7:کنترل محیطی اشتها
سیگنال های محیطی درگیر در تعادل انرژی، از قبیل هورمون های روده ای مثل پپتاید و GLP1 از راه یک مکانیسم غیرقابل اشباع از سدخونی- مغزی گذشته و بنابراین به ARC می رسند. البته سیگنال های دیگر از قبیل لپتین و انسولین از راه یک مکانیسم قابل اشباع از خون به مغز می رسند. بنابراین سد خونی- مغزی یک نقش تنظیمی پویا در عبور دادن برخی سیگنال های انرژی گردش خون دارد ]49[.
گرلین اولین هورمونی است که به دنبال تزریق محیطی موجب افزایش غذا خوردن می شود. در انسان ها گرلین پلاسمایی قبل زا هر وعده غذا افزایش ناگهانی و پس از صرف هر وعده غذایی به صورت کوتاهی سقوط می کند. این یافته ها دلالت بر این دارند که گرلین سممکن است به عنوان یک شاخص تعادل انرژی کوتاه مدت تلقی شود و ممکن است به عنوان یک مولکول سیگنالینگ در طول مدت زمان تخلیه انرژی در نظر گرفته شده است ]49[.

شکل 2-4 ) تنظیم مصرف غذا بوسیله ی هورمون های محیطی و مسیرهای سیگنالینگ مرکزی انها.]45[
2-3 :تنظیم کننده های وزن و متابولیسم بدن
گزارش ها نشان که وزن و متابولیسم بدن توسط نوروپپتید ها و هورمون های متعددی کنترل و تنظیم می شود.که به اختصار به توضیح برخی از مهمترین آنها می پردازیم.
2-3-1:نروپپتایدها
2-3-1-1: نوروپپتید Y (NPY)
NPY یک پپتید 36 اسید آمینه ای و یکی از فراوان ترین و گسترده ترین (از لحاظ توزیع) عوامل انتقال دهنده عصبی در مغز پستانداران می باشد. ARC محل اصلی بیان NPY در داخل نرون های هیپوتالاموس می باشد. هر چند NPY پس از تزریق مرکزی اثرات گوناگونی روی رفتار و عملکرد به جا می گذارد. ولی قابل توجه ترین اثر آن تحریک غذا خوردن است. تزریق چندباره NPY به داخل PVN یا دهلیزهای مغزی باعث چاقی می شود که نشان دهنده آن است که NPY قادر به مهار سیگنال های مهار کننده دریافت غذا می باشد. NPY باعث تعادل مثبت انرژی از طریق افزایش دریافت غذا می شود و همچنین باعث کاهش هزینه انرژی از طریق کاهش گرمازایی در BAT و همچنین تسهیل ذخیره چربی در بافت سفید چربی از طریق افزایش فعالیت انسولین می گردد ]50[. NPY در ARC سنتز شده و به داخل PVN ترشح می شود و توسط سیگنال های مثل لپتین، انسولین (که هر دو مهار کننده) و گلوکورتیکوئیدها (فعال کننده)، تنظیم می شود. سنتز و ترشح NPY در مدل های با شرایط کمبود انژژی یا افزایش نیازهای متابولیکی از قبیل گرسنگی ، دیابت وابسته به انسولین، شیردهی و فعالیت بدنی افزایش می یابد. نقش فیزیولوژیکی اصلی نرون های ARC ، NPY، احتمالا برقراری مجدد تعادل انرژی و ذخایر چربی بدن در شرایطی است که بدن با کمبود انررژی مواجه است. علیرغم شواهد کافی برای نشان دادن نقش کلیدی NPY در هموستاز انرژی، عجیب این است که در موش های که ژن NPY آنها کاملا حذف شده بود دارای فنوتیپ نرمال بودند به جز اینکه مستعد به جمله ناگهانی شده بودند. بنابراین هنوز کاملا مشخص نیست که آیا NPY فقط در شرایط حادی از قبلی موش های تراریخته ob/ob در پراشتهایی یا چاقی نقش دارد یا آیا فنوتیپ نرمال به علت مکانیسم های جبرانی توسط سایر سیگنال های اشتهاآور است که جایگزین NPY می شوند و به حفظ تغذیه طبیعی و تنظیم وزن کمک می کنند ]51[.

شکل 2-5) فعال سازی سلول های عصبی NPY / AGRP دارای یک اثر اشتهاآور، در حالی که فعال سازی سلول های عصبی POMC / CART اثر ضد اشتهای می باشد.
2-3-1-2: ارکسین ارکسین اخیرا به عنوان دسته ای از نروپپتیدها شناخته شده که همچنین تحت عنوان هیپوکرتینز نامگذاری می شود. ارکسین A و B به ترتیب دارای 23 و 28 اسید آمینه بوده و 46 درصد مشابهت دارند. هر دو پپتید توسط یک ژن کدگذاری شده و در نرون های خلفی و جانبی هیپوتالاموس قرار دارند. تزریق ارکسین A به طور معنی داری موثرتر از ارکسین B می باشد. البته اثر ارکسین بر تحریک غذا خورئن از اثر NPY خفیف تر است. ارکسین احتمالا بیشتر درگیر کنترل متابولیسم انرژی است تا دریافت غذا . ناشتایی باعث تظاهر افزایش ژن ارکسین در هیپوتالاموس می شود ]49[.
2-3-1-3: گالانین
گالانین یک پپتید 29 اسیدآمینه ای است که در دسته ی نورونی PVN , DMH , ARC توزیع شده است. گالانین دریافت غذا در موش های صحرایی پس از تزریق به داخل CV و همچنین VMH , LH , PVN و هسته های مرکزی آمیگدال را تحریک می کند. همانند MCH و ارکسین، غذا خوردن ناشی از گالانین ضعیف تر از NPY بوده و تزریق مداوم گالانین اثری بر حفظ چاقی یا پراشتهایی ندارد. از لحاظ آناتومیکی و عملکردی ارتباط نزدیکی بین نرون های تولید کننده گالانین وسایر سیگنال های اشتهاآور وجود دارد. هر چند سیستم NPY ارتباط نزدیکی با مصرف و هضم کربوهیدرات ها دارد، گالانین احتمالا در وهله اول در کنترل مصرف چربی ها و افزایش ذخیره بافت چربی از طریق کاهش در هزینه کرد انرژی دخالت دارند. گالانین در حین دوره میانی چرخه غذایی طبیعی فعال شده و یک رژیم با چربی بالا می تواند تولید گالانین را در PVN افزایش داده که ارتباط نزدیکی با چاقی بدن دارد ]49[.
2-3-1-4: نوروپتیید w-23
نوروپتیید W-23 که در ده اخیر کشف شده از 23آمینو اسید تشکیل شده است.که در تنظیمات تغذیه ای و هورمونی مشارکت دارد. مطالعات نشان می دهد ، تزریق داخل بطن مغزی NPW23 باعث افزایش جذب غذا و تحریک آزادسازی پرولاکتین]52[ و کورتیکوسترون ]53[ در موش صحرایی می شود،همچنین تحقیقات آزمایشگاهی نشان داده که افزایش غلظت NPW23 ، به طور قابل توجهی بر پرولاکتین، هورمون رشد و انتشار ACTH از سلولهای هیپوفیز قدامی را تغییر می دهد ]53[.
2-3-2:هورمون ها
2-3-2-1:گرلین
گرلین برای اولین بار در سال 1999 توسط کوجیما و همکارانش از معده موش جداسازی شد و به عنوان لیگاند درونی برای گیرنده GHS-Ra مطرح گردید. گرلین به هنگام گرسنگی به مقدار زیادی در سلولهای مخاط معده و به مقدار اندکی در سایر اندام ها از جمله مغز، هیپوفیز، سلولهای لایدیگ و سلولهای سرتولی نیز به نسبت کمتر تولید می شود ]54[. مطالعات نشان داده گرلین علاوه بر افزایش هورمون رشد ]55[ سبب افزایش تخلیه معده، افزایش اشتها، افزایش وزن بدن ]56[ تحریک ترشح ACTH ، مهار LH 6 و کاهش غلظت هورمون های تیروئیدی می شود ]57[. تزریق گرلین از طریق افزایش بیان ژن ها ی AgRP و NPY در هستۀ ARC هیپوتالاموس که نورونهای آنها مستقیماً بر روی TRH گیرنده دارند سبب کاهش هورمونهای تیروییدی می شوند ]58[.

شکل 2-6) گرلین قبل و بعد از دریافت غذا
2-3-2-2:ابستاتین
زانگ و همکاران (۲۰۰۵) پپتید ۲۳ اسید آمینه ای دیگری به نام ابستاتین را شناسایی کردند. این پپتید از ژن سازنده ی گرلین مشتق شده که بعد از ترجمه، دستخوش تغییرات متفاوتی شده است. یافته های بررسی ها نشان داد درمان جوندگان با ابستاتین منجر به تعادل انرژی منفی از راه کاهش دریافت غذا و تخلیه ی معده می شود. بنابراین برخی پژوهشگران به این نتیجه رسیدند که گرلین و ابستاتین اثرات متضادی بر تنظیم وزن دارند و ممکن است عملکرد نامطلوب ابستاتین در پاتوفیزیولوژی چاقی درگیر باشد.]59[
پژوهش قنبری نیاکی و همکاران نشان داد کسر و گلیکوژن کبدی ناشی از تزریق اتیونین در موش ها ATP منجر به افزایش سطح گرلین پلاسما می شود که می تواند به عنوان یک آغازگر مهم دریافت غذا مد نظر قرار گیرد؛ هم چنین مشاهده شد سطح ابستاتین پلاسما مورد تاثیر و گلیکوژن کبد نیست و انجام تمرین های ATP کاهش ورزشی نیز نتوانست این نتیجه را مورد تاثیر قرار دهد. پژوهشگران این گونه نتیجه گیری کردند که گرلین نسبت به ابستاتین به کسر انرژی کبد حساس تر است ]60[. گائو و همکاران(2009) انجام پژوهشی روی زنان و مردان چاق دریافتند سطح گرلین و ابستاتین آزمودنی های چاق پایین تر، اما نسبت گرلین به ابستاتین آنها از آزمودنی های با وزن طبیعی بالاتر بود ]61[.
زامرازیلوا و همکاران (۲۰۰9) نیز نسبت سطح گرلین به ابستاتین پلاسما را در زنان با وزن طبیعی، چاق و دچار بی اشتهایی عصبی اندازه گیری نمودند. یافته ها نشان داد نسبت سطح گرلین به ابستاتین در زنان با بی اشتهایی عصبی به طور معنی داری بالاتر از سایر گروه ها بود ]62[. در کل نقش واقعی ابستاتین در سازوکار چاقی هنوز مشخص نیست، اما تعادل بین گرلین و ابستاتین نقش مهمی در سازوکار چاقی و بیماری های متابولیکی ایفا می کند]63[.
2-3-2-3:لپتین
لپتین، پروتئین 167 اسید آمینهای است که در تنظیم فرآیندهای متابولیک دخالت دارد و نمایانگر ذخیره چربی بدن است]64[ برخی از پژوهشگران لپتین را عامل هشدار دهنده در تنظیم محتوای چربی بدن ذکر کرده اند ]65[ لپتین پس از تولید در بافت چربی به داخل خون ریخته می شود . در سد خونی مغز ناقل هایی وجود دارد که باعث ورود لپتین به دستگاه عصبی مرکزی شده و با شرکت در سرکوب سنتز نوروپپتیدهایی از قبیل نوروپپتیدy (عامل افزایش اشتها)، باعث کاهش اشتها می شود]66[ . بنابراین اثر خالص عملکرد لپتین در جهت کاهش وزن است اما کمبود این هورمون و یا مقاومت نسبت به آثار آن، هر دو می تواند سبب افزایش وزن شوند]67[ .
پژوهش استاد رحیمی و همکاران روی زنان چاق، نشان داد توده بافت چربی از پیشگویی کننده های اصلی غلظت لپتین بوده و همبستگی معنی داری بین توده چربی و لپتین وجود دارد ]68[ نتایج پژوهش ضرغامی و همکاران نشان داد که مقادیر سرمی لپتین در زنان چاق حدود 3 برابر زنان با وزن طبیعی بوده و همبستگی مستقیمی بین لپتین و شاخص توده بدن وجود دارد ]69[. همبستگی بین غلظت سرمی لپتین با شاخص توده بدن، درصد و توده چربی بدن، ذخایر مختلف چربی و همچنین ضخامت چربی زیر پوستی در تحقیقات دیگر نیز مشاهده شده است ]70[ این همبستگی در زنان چاق 3 برابر بیش تر از مردان چاق است ]71[.
87630-80645
شکل 2- 7 ) لپتین به عنوان بخشی از یک حلقه بازخورد به حفظ ذخائر ثابت از چربی عمل می کند. از دست دادن چربی بدن منجر به کاهش در لپتین، که مولکول های تغذیه محرک در هیپوتالاموس، مانند NPY را فعال می سازد. در مقابل، افزایش چربی بدن منجر به افزایش لپتین، که مولکول های تغذیه بازدارنده مانند MC را فعال می سازد. ]49[
2-4: نوروپتیید w
نوروپتیید w که اولین بار از هیپوتالاموس خوک جدا شده به دو شکل وجود دارد که شامل نوروپتیید 23- w (NPW23) یا نوروپتیید 30- w (NPW30) که 23 و 30 نشان از تعداد آمینو اسید تشکیل دهنده آن است.این نوروپتییدها به یکی از دو دریافت کننده NPW ، شامل GPR7 (NPBWR1) و GPR8(NPBWR2) متصل می گردد که به خانواده ی گروه پروتیین G تعلق دارند. GPR7 در مغز و قسمت های بیرونی و خارجی بدن انسان و جانوران جونده وجود دارد، در حالیکه GPR8 در جانوران جونده وجود ندارد . mRNA GPR7 در جانوران جونده به شکل گسترده ای در بسیاری از مناطق هیپوتالاموس ، شامل قسمت بطنی ، بصری ، میانی جلویی ، پشتی ، فوقانی وقسمت های قوس داربیان شده است .


مشاهدات نشان می دهد که GPR7 نقش مهم و حیاتی در تعدیل عملکرد غده های درون زا و عصبی ایفا می کند. تزریق بطنی مغزی NPW نشان داده شده که مانع جذب غذا شده و در وزن بدن اختلال ایجاد می نماید و موجب افزایش تولید گرما و حرارت و دمای بدن می شود، این نشان می دهد که NPW به عنوان یک مولکول نشانگر کاتابولیسم درونی عمل می کند ]72[.
2-4-1:گیرنده های NPW
در سال 1995 ، ادد و همکارانش از الیگونکلوتیدهای بر مبنای گیرنده ی اپیوئیدی و همینطور گیرنده ی سوماتواستاتین جهت شناسایی دو ژن GPR7 و GPR8 استفاده کردند.که پیش بینی می شود این دو دریافت کننده مسئول کد گذاری گروه پروتئینی G درون مغز انسان هستند. mRNA GPR7 در مغز انسان و جانوران جونده نشان داده شده ، در حالیکه ژن GPR8 در مغز انسان و خرگوش و نه جانوران جونده شناسایی شده است ]73[. در سال 2002، شیمومورا و همکارانش لیگاندهای درون زا را در مورد-8 GPR7 با در معرض قرار دادن سلول های تخمدان موش های چینی (CHO) با ذره های هیپوتالامیک خوک، تغییراتی در سطح CAMP مشاهده نمودند. علاوه بر این، وقتی بیان سلول GPR7 یا GPR8با عصاره ی هیپوتامیک القا شد تولید CAMP ناشی از فورسکولین متوقف می شود. این دریافت کننده ها به دریافت کننده های گروه پروتیینی Gi متصل بودند ]52[.
تجزیه و تحلیل ساختاری بیشتر در مورد لیگاندهای مسئول مهار تولید cAMP منجر به شناسایی یک پپتید جدید به نام NPW گردید. شیمومورا و همکاران توالی پپتید بالغ 23 و30 آمینو اسید باقی مانده از خوک ، موش و انسان را شناسایی کردند.NPW به دو شکل بالغش : NPW30 (شامل 30 آمینو اسید) و NPW23 (شامل 23 آمینو اسید) نام گذاری شده است که در ژن انسان بوسیله تاناکا و همکاران (2003) شناسای شد ]72[.

شکل 2- 8) فرق نوروپتیید 23- w و نوروپتیید 30- w ( انسان ، خوک ، رت ، موش)].72[
2-4-2: توزیع مرکزی NPW
بر اساس آنالیز RT-PCR ، برزلین و همکارانش (2003)گزارش داده اند که ژن NPW در سیستم عصبی مرکزی انسان مانند جسم سیاه و نخاع ، و در حد متوسط ​​در هیپوکامپ، آمیگدال، جسم پینه ای هیپوتالاموس ، مخچه و ریشه پشتی نخاع بیان شده است. شیمی سلولی هیبریداسیون در جوندگان نشان داده است که ژنNPW در چند مناطق محدود مغزی شامل PAG، هسته EW و هسته پشتی جنین توزیع شده است ]74،53،10 [. در حالی که کیتامورا و همکاران،( 2006) گزارش داده اند که این موضوع به هسته های خاصی در مغز میانی و ساقه مغز محدود می شود. با این حال، بر اساس تجزیه و تحلیل RT-PCR، گزارش داده اند که NPW mRNA در قسمت PVN، VMH ، ARC و LH موش بیان می شود]75[.مطالعه دیگری نیز حاکی از توزیع NPW در قسمت های متعددی از مغز موش صحرایی بوده است ]76[.
مطالعات ایمونوهیستوشیمی نشان داده است که NPW-LI به طور عمده در مناطق هیپوتالاموس، ARC و غده هیپوفیز خلفی ، با یک سطح پایین تر در PVN مشاهده شده است. جالب این است که سلول های NPW-LI هیپوتالاموس نر نسبت به ماده بیشتر است ]76[. در مطالعه دیگری، کیتامورا و همکاران (2006) از استقرار زیادی از NPW-LI را در سلول مغز میانی، شامل PAG و EW خبر داده اند. علاوه بر این، آنها برای اولین بار حضور NPW-LI و فرآیندهای آن را در PVN، VMH و آمیگدال در سطح میکروسکوپ الکترونی شناسایی و بررسی کرده اند]77[. همچنین، رشته های عصبی NPW-LI به وفور در مغز میانی و در دستگاه لیمبیک، از جمله CEA و BST توزیع شده بود، این امر نشان می دهد که NPW ممکن است در فرایند تعدیل ترس و اضطراب و همچنین در رفتار تغذیه نقش مهمی ایفا کند]78،77،76،75[.
2-4-3: توزیع محیطی NPW
در بافت های محیطی، NPW در نای ، در سلول سرطانی لنفوسیت نابالغ کلیه جنین و سرطان روده بزرگ بیان می شود]79[.سلول های وابسته به قشر غده فوق کلیوی نیز NPW تولید می کند]78[.هوکل وهمکاران (2006) گزارشی مبنی بر توزیع NPW در تیروئید و غدد پاراتیروئید، پانکراس، غدد آدرنال، تخمدان و بیضه در موش ارائه کردند.درحالیکه روکینیسکی و همکاران (2007) واکنش پذیری ایمنی NPW در تمام سلول های پانکراس شامل سلول های A ،B وD رانشان داده اند. درمقابل ، دزاکی و همکاران ( 2008) واکنش پذیری ایمنی NPW را در سلول های B ، و نه سلول های A یا D یافتند. بعلاوه NPW mRNA در سیستم ادراری تناسلی از جمله کلیه، بیضه ها، رحم، تخمدان، و جفت توزیع شده است ]80[.
بر اساس انالیز RT-PCR ، از حضور ژنNPW در در غده هیپوفیز، غده فوق کلیوی و معده را تایید کرد ]81[. این مشاهدات نشان می دهد که NPW ممکن است نقش مهمی در تنظیم سیستم غدد درون ریز را در پاسخ به استرس و همچنین در فعال شدن محورهیپوتالاموس هیپوفیز فوق کلیوی (HPA) ایفا کند ]81،82[.
2-4-4: توزیع GPR7-8
تجزیه و تحلیل RT-PCR در انسان نشان داد که ژن GPR7 به شدت در آمیگدال، هیپوکامپ، نئوکورتکس، و هیپوتالاموس بیان می شود ]73[. مطالعات مربوط به شیمی سلولی نشان داده است که ژن GPR7 در هیپوتالاموس موش، از جمله ARC، VMH، PVN و DMH، موجود است .ایشیی و همکاران (2003) گزارش داده اند که از بین بردن NPBW1 باعث پر خوری و توسعه چاقی می شود. سینگ و همکاران (2004) از دریافت کننده ی رادیوگرافی [125I]-NPW استفاده کرده و توزیع قابل توجهی از NPBW1 در آمیگدال موش و هیپوتالاموس، و همچنین در BST، MPA ، PAG ، ارگان سابفورنیکال و سطوح خاکستری رنگ سوپریور کولیکلوس ( قسمتی از مغز میانی) را نشان دادند. به طور کلی، GPR7 در سطح وسیعی در آمیگدال بیان می شود ]84،83،74[. اگر چه BST بالاترین سطح بیان GPR7 در پستانداران کوچک را نشان داده است، این پدیده در انسان ثابت نشده است. کیتامورا و همکاران ( 2006) گزارش کرده اند که GPR7 بیشتر در CeA و BST، موش صحرایی توزیع شده است که این امر ممکن است نشان دهد که GPR7 در تنظیم استرس، احساسات، ترس و اضطراب دخالت دارد. از طرف دیگر ژن های GPR7-8 در غده هیپوفیز و غده فوق کلیوی ( قشری و مرکزی ) بیان شده است ]72[ . این مشاهدات نشان می دهد که GPR7-8 ممکن است در پاسخ به استرس از طریق محور HPA درگیر باشد]82 [.
زیلوکوسکا و همکاران (2009 ) اخیرا آزمایشی مبنی بر توزیع و عملکرد NPW، NPB، و GPR7 در سلول های مانند یاخته ی استخوانی موش صحرایی و همچنین نتایج آن را که حاکی از تاثیر مستقیم بر روی تکثیر سلول ها بود را انجام دادند. NPB در پستانداران بزرگ، و همچنین در خرگوش شناسایی شده است، اما در موش صحرای و هیچ یک از موش ها بیان نشده است. تجزیه و تحلیل RT-PCR نشان داده است که ژن GPR8 است که به شدت در آمیگدال، هیپوکامپ، غده هیپوفیز، غده فوق کلیوی و بیضه ها و همچنین در سلول های قشری در غدد فوق کلیوی بیان شده است ]72[ .
2-4-5: تنظیم تغذیه ومتابولیسم انرژی بوسیله NPW
حذف GPR7 در موش های باعث پرخوری و کاهش مصرف انرژی می شود. این امر نشان می دهد که NPW ممکن است به عنوان یک تعدیل کننده تغذیه عمل کند. تزریق داخل بطن مغزی NPW در موشهای صحرایی نر باعث افزایش جذب غذا طی 2 ساعت اول در فاز نور می شود ]52[. همچنین لوین و همکاران (2005) گزارش کرده اند که تزریق NPW به PVN مصرف مواد غذایی را افزایش می دهد . این نتایج نشان می دهد که NPW به عنوان یک پپتید اشتها آور حاد عمل می کند. با این حال، موندال و همکاران (2003) گزارش کرده اند که هر دو شکل NPW باعث سرکوب تغذیه در فاز تاریک می شود،این نشان می دهد که اثر NPW در مورد تغذیه متفاوت است بسته به اینکه آیا حیوانات در نور و یا فاز تاریک نگهداری می شود]72[.
مطالعات عصبی انجام شده نشان داد که رابطه عصبی بین NPW و دیگر نوروپپتید های درگیر در تنظیم تغذیه باعث فعل و انفعالات عصبی بسیار نزدیک بین رشته های عصبی حاوی NPW و ارکسین یا هورمون MCH و رشته های عصبی در مغز موش های صحرایی می شود ]85[. در حالی که لوین و همکاران (2005) نشان داد که توزیع c-fos در نورون های حاوی ارکسین در منطقه ی پریفورنیکل در LH بعد از تزریق NPW در داخل بطن مغزی (icv) رخ داده است. جالب این است، که آنها همچنین سلول های NPW-LI در VMH، را نیز شناسایی کردند که به عنوان یک مرکز سیری شناخته شده است ]75[.
تاثیر لپتین بر روی عصب در VMH ، باعث کاهش میزان جذب غذا می شود و دیت و همکاران (2010) گزارش داده اند که سلول های عصبی NPW-LI و گیرنده های لپتین در این منطقه از مغز متمرکز شده اند . بیان NPW نیز به طور قابل توجهی در OB / OB و db/db موش تنظیم می شود. بنابراین، NPW ممکن است نقش مهمی در متابولیسم تغذیه و انرژی داشته باشد، و به عنوان یک جایگزین برای لپتین عمل کنید ]9[. علاوه بر این، NPW جذب مواد غذایی را از طریق گیرنده ملانوکورتین – 4 کاهش می دهد ، این بیانگر این است که NPW ممکن است نورون ها حاوی POMC را فعال و نورون های حاوی NPY را در ARC مهار کرده به کنترل و تنظیم در تغذیه بپردازد ]9[.
58420241935
شکل 2- 9 ) تصویر شماتیک بر اساس یافته های مطالعات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تنظیم اشتها در هیپوتالاموس توسط سلول های عصبی NPW و پپتید مرتبط با تغذیه در هیپوتالاموس.]72[
به تازگی، اسکرزبپسکی و همکاران (2012) نشان داده اند که NPB و NPW بیان و ترشح لپتین و رزیستین را تنظیم می کند ، و باعث افزایش لیپولیز چربی در موش می شود]84[ . هنگامی که NPW به موش داده شد، محققان نمی توانستند بالا رفتن فعالیت های حرکتی را شناسایی کنند ، اما افزایش میزان مصرف O2 و افزایش تولید CO2، و همچنین افزایش دمای بدن را مشاهد نمودند ]86[ . جالب توجه است، مندال و همکاران (2006) گزارش کرده اند که سطح NPW جدا شده از سلول های آنترال معده موش در حیوانات که غذا نخورده اند پایین تر است ، و میزان آن در حیواناتی که به آنها غذا داده شد افزایش یافت. در مقابل، GPR7 ( - / - ) موش های ماده فعالیت های پر خوری از خود در مقایسه با موش هایی از نوع وحشی نشان نمی دهند ]87[. علاوه بر این، دان و همکاران (2003) وجود تفاوت بین موش های نر و ماده با توجه به میزان توزیع NPW ارائه داده اند.
2-4-6: عملکرد اندوکرین NPW
مطالعات ایمنوهیستوشیمی نشان داده که GPR7 در PVN، غده هیپوفیز وغدد فوق کلیوی در انسان و موش ]88،79،73،10[، به ویژه درسلول های PVN و هیپوفیز خلفی بیان شده است . با این وجود گزارش نشده است که NPW برای رها سازی دیگر هورمون های هیپوفیز قدامی تاثیر بگذارد. تاثیرات نورواندوکرین NPW به طور مستقیم از طریق GPR7 در سلول های غده هیپوفیز به عنوان واسطه عمل نمی کند ،اما ممکن است به طور غیر مستقیم از طریق کنترل آزاد سازی هورمون هیپوتالاموس و آزاد سازی هورمون محرک قشر غده ی فوق کلیوی عمل کند ]89،73[.
NPW نقش مهمی در پاسخ هیپوتالاموس به استرس ایفا می کند. با این حال، سطوح هورمون رشد در پلاسما بعد از تزریق داخل بطن مغزی این پپتید مهار می شود. این یافته ها نشان می دهد که NPW لیگاند درون زا برای GPR7 و / یا GPR8 است و به عنوان یک میانجی نورواندوکرین عمل می کند ]53،52[.علاوه بر این، تیلور و همکاران (2005) گزارش کرده اند که تزریق NPW محور HPA را فعال می کند، و باعث افزایش در سطح کورتیکوسترون پلاسما در موش های هوشیار می شود. اما باعث تحریک آزادی اکسی توسین و وازوپرسین نمی شود و همچنین در گردش خون محیطی، تغییرات فشار خون و ضربان قلب را نغییر نمی دهد. علاوه بر این، تزریق داخل بطن مغزی آنتاگونیست CRF باعث کاهش قابل توجهی سطح کورتیکوسترون نمی شود، اگر چه قبل از تزریق آنتاگونیست CRF به طور قابل توجهی افزایش مرکزی NPW سطح کورتیکوسترون را کاهش می دهد ]90[.
پرایس و همکاران (2008) گزارش کرده اند که با توجه به اثرات مرکزی NPW از فعال شدن سلول های عصبی سوماتوستاتین کمانی، می تواند بیان هورمون های آزاد کننده هورمون رشد را متوقف کند. این یافته ها نشان می دهد که NPW درون زا ممکن است یک نقش فیزیولوژیک مرتبط در پاسخ نورواندوکرین به استرس در مغز بازی کند]91[.
2-5: کورتیزول
کورتیزول از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود. یکی از اثرات مهم کورتیزول، نقش آن روی سوخت و ساز کربوهیدرات ها، پروتئین ها و چربی ها است. این هورمون فرآیند گلوکونئوژنز را از اسیدهای آمینه تسهیل، لیپوژنز کبد را کاهش و چربی های موجود در بافت چربی را به حرکت در می اورد. دو تاثیر مهم دیگر کورتیزول عبارتند از: حفظ واکنش عروقی به کاتکولامین ها و جلوگیری از واکنش های التهابی و پاسخ طبیعی بافت ها نسبت به آسیب. کورتیزول یکی از مهم ترین هورمون های استروئیدی است که در تنظیم عملکردهای قلبی- عروقی، ایمونولوژیکی، هموستازی و متابولیکی نقش دارد]92[.
2-5-1:کورتیزول و فعالیت بدنی
فعالیت بدنی نشانه تلاش فردی برای حرکت از یک محل به محل دیگر است. توانایی فرد برای اجرای فعالیت معین به نوع تغذیه و تمرین، مقاومت خارجی و متغیرهای دیگر وابسته است. علاوه بر این، فعالیت بدنی می تواند 1)سبک، متوسط و یا سنگین باشد .2) کوتاه مدت یا دراز مدت باشد. 3)گروه خاصی از عضلات و یا عموم عضلات را درگیر کند [93].
در جریان این امر الگویی که نقش هورمون ها به هنگام ورزش، در فعالیت بدنی را می توان به پنج مرحله تقسیم کرد:
1.مرحله قبل از شروع فعالیت
2.مرحله شروع فعالیت
3. مرحله فعالیت
4. مرحله خستگی مفرط (چنان چه فعالیت به اندازه کافی سنگین باشد)
5.مرحله بازیافت
در مرحله اول که در حالت انتظار یا ابتدای اجرای برنامه ورزشی ، یک تغییر شدت متابولیکی از حالت استراحت به حالت فعالیت رخ می دهد. این تغییرات شدت متابولیکی اولیه مهم ترین واکنش هورمونی بدن را به همراه خواهد داشت. هورمون های محرک قشر غدد فوق کلیوی و کورتیزول که نیاز به استرس عمومی به عنوان محرک دارند، ترشح می شوند. در مرحله شروف فعلیت، بدن نسبت به تغییر شدید حالت هومئوستاز به حالت پرتلاش، واکنش نشان می دهد. در این هنگام، ترشح کورتیزول ادامه پیدا می کند . ودر مرحله سازگاری ممکن است ترشح کورتیزول به علت عدم تغییر در روند فعالیت، متوقف شود. در مرحله خستگی مفرط تخلیه هورمون های غدد فوق کلیوی به عنوان یک احتمال و کاهش شدت ترشح کورتیزول، احتمال دیگری در بروز خستگی مفرط عنوان گردیده است. تخلیه (قطع) هورمون های غدد فوق کلیوی یا هیپوفیز به علت بازخورد منفی نسبت به عوامل مختلف، موجب کاهش حضور مواد انرژی زا می شود. در پایان که مرحله بازیافت است فرد به تدریج به حالت استراحت برمی گردد. سطح هورمون ها پس از قطع فعالیت بالا خواهد بود حتی اگر شدت ترشح انها کم شود، سطح آنها برای مدتی بالا است تا این که تمام مولکول های هورمونی فعال تجزیه شوند. مجموع واکنش های هورمونی نسبت به فعالیت بدنی به نظر می رسد که ترشح هورمون ها در هر مرحله متفاوت باشد و متناسب با شدت استرس های هر مرحله تغییر می کند[93].
2-5-2: متابولیسم انرژی در فعالیت ورزشی
تنظیم هورمونی متابولیسم انرژی به مدت و شدت فعالیت ورزشی بستگی دارد، که تاثیر فعالیت ورزشی فزاینده شدید و فعالیت ورزشی دراز مدت بر هورمون کورتیزول مورد بررسی قرار می گیرد.

user8251

فصل اولمقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1- مقدمهدر بین حیوانات اهلی گیاهخوار، نشخوارکنندگان سهم بزرگی را در تامین خوراک و سلامت بشر دارند. از طرفی تغذیه نقش اصلی را در بازده اقتصادی و عملکردی این دام‌ها داشته به طوری که تقریبا دوسوم از کل هزینه تولیدات دامی در واحدهای مختلف پرورش دام به هزینه‌های خوراک اختصاص داشته و از طرفی با توجه به مسئله کمبود پروتئین حیوانی و افزایش تولید با منابع علوفه‌ای موجود، لازم است تا از ارزش تغذیه‌ای منابع خوراکی قابل دسترس و مکمل‌های قابل استفاده به منظور افزایش راندمان تولید اطلاع کافی وجود داشته باشد (امیرخانی، 1386). از این رو اهمیت تغذیه مناسب نشخوارکنندگان ایجاب می‌نماید که ارزش غذایی هر یک از مواد خوراکی و اجزای تشکیل دهنده آنها طبق روش‌های صحیح و استاندارد تعیین گردد (قورچی، 1374).
معده حیوانات نشخوارکننده از چهار بخش شکمبه، نگاری، هزارلا و شیردان تشکیل گردیده است (آلاوونگ و همکاران، 2010). سه بخش اول فاقد هر گونه غده بوده و پیش معده نامیده شده و دو بخش آخر جایی است که هضم میکروبی یا تخمیر در آن صورت می‌پذیرد (منصوری و همکاران، 1381). شکمبه دارای انواع باکتری، پروتوزوآ و قارچ است اما باکتری در تمام جنبه‌های تخمیر شکمبه‌ای نقش غالب را بازی می‌کند (راسل و همکاران، 2002).
حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(


4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)
0/1
0/1 Glucose (W/V)
0/1 Cellobiose(W/V)

–238

تقدیم به عشقم
همراه و همرازم، مونس و همدم مهربانم
همسر عزیزم علیرضا
آرام جانم سپاس از وجود پر مهرت که لحظه لحظه عاشقانه کنارم هستی.
تقدیم به عزیز دلم
برادر دوست داشتنیم محسن
حامی مهربانم سپاس از بودنت در کنارم
فهرست مطالب
عنوان صفحه
TOC o "1-3" h z u چکیده PAGEREF _Toc379122424 h 1فصل اول : مقدمه1-1 پیش گفتار PAGEREF _Toc379122427 h 41-2 هدف کلی PAGEREF _Toc379122428 h 51-2-1 اهداف جزئی PAGEREF _Toc379122429 h 62-2 فرضیه ها PAGEREF _Toc379122430 h 61-3 گیاه سنجد PAGEREF _Toc379122431 h 71-3-1 مشخصات گیاه PAGEREF _Toc379122433 h 71-3-2 ترکیبات موجود در گیاه سنجد PAGEREF _Toc379122434 h 81-3-3 خواص و کاربرد: PAGEREF _Toc379122435 h 81-3-4 درمان با داروهای گیاهی رایج در طب سنتی PAGEREF _Toc379122436 h 91-4 معرفی حیوان PAGEREF _Toc379122437 h 101-4-1 علت انتخاب موش صحرایی نر PAGEREF _Toc379122438 h 101-4-2 دستگاه تناسلی موش صحرایی نر PAGEREF _Toc379122439 h 101-4-3 مایع انزالی (Semen) PAGEREF _Toc379122440 h 121-4-4 ساختمان ومورفولوژی اسپرم موش صحرایی نر PAGEREF _Toc379122441 h 131-5 اسپرماتوژنز(spermatogenesis) PAGEREF _Toc379122442 h 13عنوان صفحه
1-5-1 اسپرمیوژنز(Spermiogenesis) PAGEREF _Toc379122443 h 151-6 Busulfan (Myleran) PAGEREF _Toc379122444 h 151- 7 Wi-Fi PAGEREF _Toc379122445 h 161-7-1 تابش یونیزاسیون غیر مستقیم PAGEREF _Toc379122446 h 171-7-2 دستگاه WI-FI PAGEREF _Toc379122447 h 19فصل دوم : روش کار2-1 انتخاب حیوان PAGEREF _Toc379122450 h 222-1-1 گروه بندی حیوان PAGEREF _Toc379122452 h 232-1-2 وزن کردن حیوان PAGEREF _Toc379122453 h 242-2 عصاره سنجد PAGEREF _Toc379122454 h 242-2-1دستگاه های مورد استفاده جهت عصاره گیری PAGEREF _Toc379122455 h 242-2-2 روش تهیه عصاره هیدرو الکلی سنجد PAGEREF _Toc379122459 h 272-2-3 روش دادن عصاره PAGEREF _Toc379122460 h 272-2-4 مبنای انتخاب دوز عصاره PAGEREF _Toc379122461 h 282-3 روش آماده کردن داروی بوسولفان PAGEREF _Toc379122462 h 282-3-1 دوز داروی مورد استفاده PAGEREF _Toc379122463 h 282-3-2 روش دادن دارو PAGEREF _Toc379122464 h 292-4 روش دادن تابش اشعه Wi-Fi PAGEREF _Toc379122465 h 29عنوان صفحه
2-4-1 دستگاه های استفاده شده جهت دادن تابش PAGEREF _Toc379122466 h 292-4-2 طرز چیدمان موش ها جهت دریافت اشعه Wi-Fi PAGEREF _Toc379122467 h 302-6 روش جمع آوری اسپرم و خون گیری PAGEREF _Toc379122469 h 322-6-1 روش تهیه اسمیر PAGEREF _Toc379122471 h 342-6-2 طرز تهیه محلول HBSS PAGEREF _Toc379122472 h 342-6-3 روش استخراج سرم PAGEREF _Toc379122473 h 342-8 پاساژ (Passage) یا گردش بافتی ( Processing) PAGEREF _Toc379122474 h 352-9 شمارش اسپرم PAGEREF _Toc379122475 h 362-10 روش رنگ آمیزی اسمیر های تهیه شده از اسپرم PAGEREF _Toc379122476 h 362-11 مواد و وسایل PAGEREF _Toc379122477 h 37فصل سوم : یافتههای پژوهش3-1- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر تعداد اسپرمها PAGEREF _Toc379122483 h 413-2- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشرونده سریع (GI) PAGEREF _Toc379122486 h 433-3- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای با حرکت درجا (GII) PAGEREF _Toc379122488 h 46عنوان صفحه
3-4- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته (GIII) PAGEREF _Toc379122491 h 483-5- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای بدون حرکت (GIV) PAGEREF _Toc379122494 h 513-6- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر وزن بیضه موشها PAGEREF _Toc379122497 h 543-7- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر میزان هورمون تستوسترون PAGEREF _Toc379122500 h 563-8- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر امواج WiFi و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر تعداد اسپرمها PAGEREF _Toc379122503 h 583-9- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر امواج WiFi و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشرونده سریع (GI) PAGEREF _Toc379122506 h 603-10- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر امواج WiFi و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای با حرکت درجا (GII) PAGEREF _Toc379122509 h 623-11- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر امواج WiFi و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته (GIII) PAGEREF _Toc379122512 h 643-12- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر امواج WiFi و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای بدون حرکت (GIV) PAGEREF _Toc379122515 h 66عنوان صفحه
3-13- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر امواج WiFi و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر وزن بیضه موشها PAGEREF _Toc379122518 h 673-14- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر امواج WiFi و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر میزان هورمون تستوسترون PAGEREF _Toc379122521 h 693-15 یافته های مربوط به بررسی تاثیر امواج Wi-Fi، داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصاره هیدرو الکلی سنجد بر بافت بیضه PAGEREF _Toc379122524 h 70فصل چهارم : بحث و نتیجه گیری4-1 عصاره سنجد PAGEREF _Toc379122530 h 754-2 داروی بوسولفان PAGEREF _Toc379122531 h 764-2-1 تاثیر داروی بوسولفان بر تعداد، تحرک اسپرم ها و وزن بیضه موش و اثر حفاظتی عصاره سنجد بعد از تزریق داروی بوسولفان PAGEREF _Toc379122532 h 764-2-2 تاثیر بوسولفان بر هورمون تستوسترون و اثر حفاظتی عصاره سنجد PAGEREF _Toc379122533 h 774-2-3 تاثیر بوسولفان بر بافت بیضه و اثر حفاظتی عصاره سنجد PAGEREF _Toc379122534 h 784-3 Wi-Fi PAGEREF _Toc379122535 h 814-3-1 تاثیر اشعه Wi-Fi بر تعداد و تحرک اسپرم و وزن بیضه در موش و اثر حفاظتی عصاره سنجد در برابر تابش Wi-Fi PAGEREF _Toc379122536 h 814-3-2 تاثیر امواج Wi-Fi بر هورمون تستوسترون و اثر حفاظتی عصاره سنجد بر آن PAGEREF _Toc379122537 h 834-3-3 تاثیر امواج Wi-Fi بر بافت بیضه موش و اثر حفاظتی عصاره سنجد بر آن PAGEREF _Toc379122538 h 83عنوان صفحه
پیشنهادها PAGEREF _Toc379122539 h 85فهرست منابع و مأخذمنابع فارسی PAGEREF _Toc379122542 h 87منابع انگلیسی PAGEREF _Toc379122543 h 88Abstract PAGEREF _Toc379122544 h 100فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول 2-1: لیست وسایل مصرفی PAGEREF _Toc379122478 h 37جدول 2-2: لیست مواد مصرفی PAGEREF _Toc379122479 h 38جدول 2-3: لیست ابزارها و دستگاه های مورد استفاده PAGEREF _Toc379122480 h 39جـدول 3-1: میانگین و خطای معیار میانگین () تعداد اسپرمها (میلیون بر میلیلیتر) در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122484 h 42جـدول 3-2: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده سریع در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122487 h 44جـدول 3-3: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای با حرکت درجا در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122489 h 47جـدول 3-4: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122492 h 49جـدول 3-5: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای بدون حرکت در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122495 h 52جـدول 3-6: میانگین و خطای معیار میانگین () وزن بیضه موشها در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122498 h 55جـدول 3-7: میانگین و خطای معیار میانگین () هورمون تستوسترون در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122501 h 57جـدول 3-8: میانگین و خطای معیار میانگین () تعداد اسپرمها (میلیون بر میلیلیتر) در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122504 h 58عنوان صفحه
جـدول 3-9: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده سریع در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122507 h 60جـدول 3-10: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای با حرکت درجا در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122510 h 62جـدول 3-11: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122513 h 64جـدول 3-12: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای بدون حرکت در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122516 h 66جـدول 3-13: میانگین و خطای معیار میانگین () وزن بیضه موشها در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122519 h 68جـدول 3-14: میانگین و خطای معیار میانگین () هورمون تستوسترون در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122522 h 69جدول 3-15: PAGEREF _Toc379122525 h 71فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1: میانگین و خطای معیار میانگین () تعداد اسپرمها در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122485 h 43نمودار 3-3: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای با حرکت درجا در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122490 h 48نمودار 3-4: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122493 h 50نمودار 3-5: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای بدون حرکت در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122496 h 53نمودار 3-6: میانگین و خطای معیار میانگین () وزن بیضه موشها در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122499 h 56نمودار 3-7: نمودار باکس- ویسکر (box-and-whisker plots) برای هورمون تستوسترون در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122502 h 57نمودار 3-8: میانگین و خطای معیار میانگین () تعداد اسپرمها در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122505 h 59نمودار 3-9: نمودار باکس- ویسکر (box-and-whisker plots) برای درصد اسپرمهای پیشرونده سریع در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122508 h 61نمودار 3-10: نمودار باکس- ویسکر (box-and-whisker plots) برای درصد اسپرمهای با حرکت درجا در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122511 h 63نمودار 3-11: نمودار باکس- ویسکر (box-and-whisker plots) برای درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122514 h 65عنوان صفحه
نمودار 3-12: نمودار باکس- ویسکر (box-and-whisker plots) برای درصد اسپرمهای بدون حرکت در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122517 h 67نمودار 3-13: میانگین و خطای معیار میانگین () وزن بیضه موشها در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122520 h 68نمودار 3-14: میانگین و خطای معیار میانگین () هورمون تستوسترون در گروههای مختلف PAGEREF _Toc379122523 h 70فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 1-1: درخت سنجد PAGEREF _Toc379122432 h 7شکل 2-1: نمایی از اتاق حیوانات دانشکده علوم پزشکی شیراز PAGEREF _Toc379122451 h 22شکل 2-2: دستگاه دسیکاتور PAGEREF _Toc379122456 h 24شکل 2-3: دستگاه روتاری PAGEREF _Toc379122457 h 25شکل 2-4: دستگاه پرکولاتور PAGEREF _Toc379122458 h 26شکل 2-5: طرز چیدمان موش ها داخل مقید کننده در اطراف مودم Wi-Fi PAGEREF _Toc379122468 h 31شکل 2-6: تشریح موش صحرایی PAGEREF _Toc379122470 h 33شکل 4-1: تصاویر میکروسکوپی مطالعات بافت شناسی گروه های آزمایشی 1 تا 9 PAGEREF _Toc379122526 h 72شکل 4-2: تصاویر میکروسکوپی اسمیرهای اسپرم با رنگ آمیزی ائوزین گروه های آزمایشی 1 تا 9 PAGEREF _Toc379122527 h 73
بررسی مقایسه ای اثر حفاظتی عصاره هیدرو الکلی میوه سنجد بر اسپرماتوژنز موش های سفید بزرگ آزمایشگاهی نر در حضور اشعه ی Wi-Fi و یا تیمار با داروی بوسولفان
بهوسیلهی: زهره حسینی زاده
چکیدهدر این مطالعه تاثیرات داروی بوسولفان و امواج Wi-Fi را بر روند اسپرماتوژنز، بافت بیضه و هورمون تستسترون موش سفید بزرگ آزمایشگاهی نر از نژاد اسپراگوداولی مورد بررسی قرار گرفت و همچنین از عصاره هیدروالکلی میوه سنجد به عنوان یک داروی محافظت کننده در برابر اثرات بوسولفان و امواج Wi-Fi استفاده شد و به صورت مقایسه ای این مطالعه صورت گرفت.برای انجام این تحقیق 100سر موش سفید بزگ آزمایشگاهی نر با وزن 200-250 گرم انتخاب و در شرایط نوری و غذایی مناسب مورد آزمایش قرار گرفتند. موش ها بر حسب متغیر های تزریق بوسولفان، تابش امواج Wi-Fi و دریافت عصاره سنجد به صورت گاواژ، به طور تصادفی به 10 گروه 10 تایی تقسیم شدند.
گروه 1 به عنوان گروه کنترل حقیقی(هیچ دارو و اشعه ای دریافت نکردند)، گروه 2 به عنوان گروه شم (2ml/kg آب مقطر به صورت گاواژ به مدت 48 روز دریافت کردند)، گروه 3 به عنوان گروه تجربی 1 (2ml/kg عصاره هیدرو الکلی سنجد به صورت گاواژ به مدت 48 روز دریافت کردند)، گروه4 به عنوان گروه تجربی 2(یک دوز 5ml/kg بوسولفان به صورت)Intraperitoneal (Ip)داخل صفاقی) دریافت کردند و سپس به مدت 48 روز آب و غذای روزانه دریافت کردند)، گروه5 به عنوان گروه تجربی 3 (یک دوز5mg/kg بوسولفان به صورت (Ip)داخل صفاقی دریافت کردند و سپس به مدت 48 روز 2ml/kg عصاره سنجد، به صورت گاواژ دریافت کردند) گروه 6 به عنوان گروه تجربی 4 (یک دوز 15mg/kg بوسولفان به صورت Ip دریافت کردند و سپس به مدت 48 روز آب و غذای روزانه دریافت کردند )، گروه 7 به عنوان گروه تجربی 5(یک دوز 15mg/kg بوسولفان به صورت Ip دریافت کردند سپس به مدت 48 روز عصاره هیدرو الکلی سنجد2ml/kg)) به صورت گاواژ در یافت کردند)، گروه 8 به عنوان گروه تجربی 6( موش ها در داخل مقیدکننده(Restrainer) قرار داده و روزانه 4ساعت به مدت 48 روز در معرض تابش اشعه Wi-Fi قرار گرفتند). گروه 9 به عنوان گروه تجربی 7 ( موش ها میزان 2ml/kg عصاره هیدرو الکلی سنجد به صورت گاواژ دریافت نموده سپس موش ها داخل مقیدکننده(Restrainer) قرار داده شدند و روزانه 4ساعت به مدت 48 روز در معرض تابش اشعه Wi-Fi قرار داده شدند)، گروه 10 به عنوان گروه کنترل Wi-Fi (موش ها روزانه به مدت 4 ساعت داخل مقیدکننده(Restrainer) به مدت 48 روز بدون دریافت هیچ تابشی قرار داده شدند.)
در روز 50(48 روز پس از تجویز عصاره و تابش Wi-Fi و 49 روز پس از دادن بوسولفان) کلیه موش ها تحت بی هوشی با کلروفرم قرار گرفتند و در ابتدا خون گیری از قلب صورت گرفت برای اندازه گیری هورمون تستوسترون، سپس موش تشریح شده و از یک سانتی متر انتهایی مجرای دفران چپ اسپرم گیری به عمل آمد و ابتدا وضعیت تحرک سپس شمارش اسپرم ها انجام شد. از اسپرم های مزبور اسمیر تهیه شد که با رنگ ائوزین رنگ آمیزی شدند. بافت بیضه چپ نیز جهت مطالعه بافت شناسی برداشته شدند.
نتیجه مطالعات هورمونی کاهش یا افزایش معنا دار سطح تستوسترون را در هیچ کدام گروه ها مشاهده نشد. نتیجه روند اسپرماتوژنز در گروه هایی که بوسولفان دریافت کرده اند، کاهش معنا دار د تعداد اسپرم، وزن بیضه و و تحرک اسپرم ها مشاهده شد و نشان داده شد که هر چه دوز بوسولفان بالاتر رود اثرات تخریبی آن نیز بالا می رود. در بافت بیضه نیز شاهد کاهش اسپرماتوزوا و اسپرماتید بودیم. استفاده از عصاره سنجد با عث بهبود کیفیت اسپرم شده و نیز در مطالعه بافت شناسی گروهی که دوز 5mg/kg بوسولفان دریافت کرده بودند دادن عصاره سنجد باعث شد که مقدار خیلی کمی از اسپرماتید ها باقی بمانند ولی دوز بالتر بوسولفان عصاره سنجد نتوانست کاری در جهت کنترل تخریب انجام دهد. و اما گروه هایی که امواج Wi-Fi دریافت کرده بودند، امواج روی تعداد اسپرم، وزن بیضه، هورمون تستوسترون و بافت بیضه تاثیری نداشته اما باعث کاهش معنا دار تحرک اسپرم های بارور شد و استفاده از عصاره سنجد میتواند اثر حفاظتی در برابر این امواج داشته باشد.با توجه به نتایج این تحقیق می توان این احتمال را داد که عصاره سنجد با ترکیبات آنتی اکسیدانی که دارد میتواند جلوی آثار مخرب امواج که باعث ایجاد رادیکال های آزاد می شود را بگیرد و با داشتن ویتامین C باعث افزایش وزن بیضه و دارا بودن ویتامین E باعث بهبود کیفیت اسپرم می شود.
کلمات کلیدی: اسپرماتوژنز، بوسولفان، امواج Wi-Fi، میوه سنجد
فصل اولمقدمهcenter0400000
1-1 پیش گفتارناباروری مردان، یک وضعیت پریشان آور معمول و رایج است که از میان هر 20 مرد یک نفر را به خود مبتلا می کند(9). در اکثر موارد، مردان، سلولهای اسپرم کافی برای باروری و لقاح تولید می کنند، اما در این سلول ها نقص های وجود دارد که از لقاح آنها با سلول ماده جلوگیری می کند(10).
عوامل شیمی درمانی اختلالات زیادی در روند اسپرماتوژنز ایجاد می کنند و در بین این عوامل، دارو هایی که دارای خاصیت آلکیله کنندگی هستند، بیشترین آثار سوء را بر بیضه دارند(11). بنابر این اختلالات ایجاد شده در باروری به دنبال شیمی درمانی از نظر بالینی اهمیت بالایی دارد. هر چند که حفظ مایع منی به صورت منجمد قبل از شروع شیمی درمانی، روش قابل اطمینانی برای حفظ باروری است، اما کیفیت اسپرم پس از ذوب کردن مایع منی تغییر می کند. از جمله عوامل شیمی درمانی می توان بوسولفان را نام برد که دارای خاصیت آلکیله کنندگی بوده و برای درمان لوسمی مزمن، سرطان تخمدان و همچنین قبل از پیوند مغز استخوان در بیماران سرطانی استفاده می شود(12). مصرف این دارو پس از یک یا دو تزریق داخل صفاقی، عمده اسپرماتوگونی ها را از بین می برد(13)؛ ضمن اینکه بازگشت باروری در موش های تحت درمان با بوسولفان به صورت موءثر صورت نمی گیرد زیرا، بافت بیضه و لوله های سمی نفروس و سلول های زایا به شدت آسیب می بینند(14).
علاوه بر عوامل شیمی درمانی که باعث اختلال در اسپرماتوژنز می شود در تحقیق حاضر اثر امواج الکترومغناطیسی که اثرات سوءیی بر اسپرماتوژنز دارد نیز مورد بررسی قرار گرفته است. امروزه وجود میادین الکترومغناطیس با شدت های گوناگون اجتناب ناپذیر شده است. این میادین در نتیجه حرکت ذرات باردار در محیط رسانا و خلاء به وجود می آیند و دارای نوعی انرژی هستند که بر اتم ها و مولکول ها بر هم کنشی ایجاد می کنند و منجر به جذب یا باز تابش امواج الکترو مغناطیسی می شود. اثرات این میادین بر وظایف و اعمال بیولوژی موجودات زنده، خطر وسیعی را نشان می دهد که در سلامت زندگی بشری محسوس است(15).
اسپرماتوزوئید هادر برابر تنش های اکسیداسیونی بسیار حساس می باشند و علت آن هم دو چیز است: 1- سوبسترا ها، برای حمله رادیکال های آزاد بسیار قابل دسترس هستند. 2- فضای سیتوپلاسمی برای جای دادن آنزیم های آنتی اکسیدانی کم و محدود است(10).
امواج Wi-Fi نیز جزء امواج الکترومغناطیسی غیر یونیزان هستند که امروزه استفاده فراوانی دارد و در این تحقیق می خواهیم اثرات این امواج را بر روی اسپرماتوژنز بررسی کنیم.
بر طبق کتب طب سنتی ایران، برخی از گیاهان می توانند در درمان ناباروری موءثر واقع شوند(16). از جمله آنها می توان به گیاه سنجد اشاره کرد(19و20و21و22و23). این گیاه یک گیاه تثبیت کننده نیتروژن و متعلق به خانواده الگانسه است. میوه های سنجد غنی از ویتامین ها و به ویژه ویتامین C هستند و حاوی روغن گیاهی غنی از ویتامین E و K، همچنین دارای کاروتنوئید ها، فلاونوئید ها، تانن، پروتئین ها و اسیدهای چرب می باشد(24و25و26). در این تحقیق از عصاره هیدرو الکلی میوه سنجد به عنوان یک محافظت کننده در برابر تاثیر داروی بوسولفان و امواج Wi-Fi استفاده شده است که در بخش های بعدی مفصل توضیح داده خواهد شد.
1-2 هدف کلی:بررسی مقایسه ای اثر حفاظتی عصاره هیدرو الکلی میوه سنجد بر اسپرماتوژنز در حضور اشعه Wi-Fi و یا تیمار با داروی بوسولفان.
1-2-1 اهداف جزئی:1-تعیین اثر محافظتی عصاره ی هیدروالکلی میوه سنجد بر روی اسپروماتوژنز
2-تعیین اثر اشعه ی Wi-Fi بر روی اسپرماتوژنز
3- تعیین اثر محافظتی عصاره ی سنجد و اشعه ی Wi-Fi بر روی اسپرماتوژنز
4-تعیین اثر داروی بوسولفان بر روی اسپرماتوژنز
5-تعیین اثر محافظتی عصاره ی سنجد و داروی بوسولفان بر روی اسپرماتوژنز
2-2 فرضیه ها:1-- میدان الکترو مغناطیسی ناشی از اشعه Wi-Fi باعث کاهش تعداد اسپرم ها می شود.
2- میدان الکترومغناطیسی ناشی از اشعه Wi-Fiباعث کاهش تحرک اسپرم ها می شود.
3- میدان الکترو مغناطیسی ناشی از اشعه Wi-Fi باعث کاهش سلولهای اسپرماتوگونی می شود.
4- امواج الکترومغناطیس ناشی از اشعهWi-Fi اثرات سوء خود را روی هورمون های جنسی نر ا ایجاد می کنند.
5- میدان الکترو مغناطیس ناشی از اشعه Wi-Fi بر مرفولوژی اسپرماتوژنز اثرات سوء دارد.
6- عصاره میوه سنجداز بروز اثرات سوء میدان الکترومغناطیس ناشی از اشعه Wi-Fi بر روی اسپرماتوژنز جلوگیری می نماید.
7- داروی بوسولفان باعث تخریب اسپرماتوژنز می شود.
8- عصاره میوه سنجداز بروز اثرات سوء ناشی از داروی بوسولفان بر روی اسپرماتوژنز جلوگیری می نماید.
1-3 گیاه سنجد:درختی است از خانواده خانواده Elaeagnaceae از جنس Elaeagnus که نام علمی آن Elaeagnus angastifolial میباشد. (شکل 1-1)
این گیاه بومی نواحی شمال آسیا تا هیمالیا و اروپا است و در تهران و اطراف آن، قزوین، خراسان، جنوب شرقی ایران ، شیراز ،غرب ایران از جمله باختران ، همدان ، کاشان ، اصفهان ، آذربایجان و ارومیه می روید.
سنجد در مناطق مختلف ایران دارای نام های محلی است، در کردستان آن را سرین چک در آذربایجان ایده-ایکده ودر اطراف تهران پستانک در اصفهان غبیره بادام گفته میشود(1و2و17).

شکل 1-1: درخت سنجد1-3-1 مشخصات گیاه:درخت سنجد که به صورت درختچه بزرگ یا درخت کوچکی دیده میشود. دارای برگهای بیضی شکل نیزه ای است روی برگ ها نقره ای کبود و پشت آن نقره ای است .دارای ساقه های خار دار یا بی خار به ارتفاع 2تا 7 متر میباشد . گل های آن کوچک زرد رنگ معطر با عطر قوی که بوی آن تا فاصله ی زیادی منتشر میشود و اغلب ایجاد حساسیت مینماید . میوه آن به شکل و ابعاد زیتون ، گوشتدار،پوست نازک میوه به رنگ قرمز نارنجی و گوشت آن سفید نخودی با طعمی کمی شیرین و قابض وقابل خوردن است(1و2و3).
1-3-2 ترکیبات موجود در گیاه سنجد:از نظر ترکیبات شیمیایی در پوست آن آلکالوئید Eeagnine و یک آلکالوئید چسبناک روغنی دیگر وجود دارد و از اعضای گیاه و گل آن کمی اسانس روغنی جدا گردیده است.(معارف گیاهی). برگ گیاه دارای فلانوئید ، تانن ها و اسیدهای کلروژنیک و میوه آن دارای مقادیر زیاد کربوهیدراتها است که در برگ نیز دیده میشوند ، همچنین یک ماده رنگی قهوه ای و مواد روغنی و مقادیر زیادی تانن دارد(1و2).
1-3-3 خواص و کاربرد:برگ آن در بیماری های دهان و لثه و همچنین زخم های ناشی از آفت ، اثر بیحس کننده موضعی دارد . ابن سینا سنجد را به دلیل آثار قابض آن در بند آوردن خونریزی توصیه کرده است(1و4و5). در هند از روغن هسته آن شربت غلیظی درست میکنند که در نزله ها و التهاب غشاءهای مخاطی همراه با ترشح، موارد زکام و همچنین در موارد عفونت های برونش ها مصرف مینمایند. در اسپانیا از شیره گل سنجد برای قطع تبهای مهلک و خطرناک استفاده میشود . میوه سنجد از نظر طبیعت طبق نظر حکمای طب سنتی، سرد وخشک است و از نظر خواص عقیده داشتند که مقوی و مفرح است و برای سرفه های گرم مفید است و نیز مقوی معده می باشد. آشفتگی را تسکین میدهد و صفرا را قطع و قمع می نماید و مانع ریختن مواد به معده می باشد. سنجد خصوصا خام آن برای بند آوردن اسهال نافع است. گل سنجد طبق نظر حکمای طب سنتی گرم و خشک وخیلی معطر است . از نظر خواص، مهیج و شهوت آور خصوصا در مورد زنان و دختران جوان می باشد(2).
1-3-4 درمان با داروهای گیاهی رایج در طب سنتی:استفاده از محصولات و اجزاء مختلف گیاه برای درمان مردان نابارور ، از زمان باستان رایج بوده است و معمولا محصولات و گیاهان مورد استفاده در طب سنتی که سرشار از استرول ، مواد آنتی اکسیدان و ویتامین ها هستند میتوانند بر روی اسپرماتوژنز موءثر باشند. که بعضی از آنها عبارتند از :
باقاله، برنج، رازک، جو دوسر، سیب و سبزیها، انار و گیاهان روغنی (Palma oil and soy oil)(18).
داروها یی که ادعا میشوند واکنش سلولها به پرتوها را تعدیل می کنند، محافظت کننده نامیده می شوند(19). تحقیقات جدید معلوم ساخته که اثر محافظت کننده بعضی گیاهان دارویی به خاطر وجود مقدار نسبتا کمی از ترکیبات شیمیایی به نام مواد موثره می باشد که گیاه تولید می کند. برای مثال بعضی از گیاهان دارای انواع مختلف ترکیبات مثل آنتی اکسیدانت ها هستند که باعث کنترل علائم پاتو فیزیولوژیک، رادیکالهای آزاد و یا بیماریهای مرتبط با آنها و غلبه بر تاثیرات منفی محیط می شوند. بسیاری از این گیاهان خواص محافظت کننده در مقابل اشعه را نشان می دهند از جمله آنها می توان به گیاه سنجد اشاره کرد(20و21و22و23و24). این گیاه یک گیاه تثبیت کننده نیتروژن ومتعلق به خانواده الگانسه است. میوه های سنجد غنی از ویتامین ها و به ویژه ویتامین C هستند و حاوی روغن گیاهی غنی از ویتامین E و K می باشند . همچنین دارای کاروتنوئید ها، فلاونوئید ها، تانن، پروتئین ها و اسیدهای چرب می باشد(25و26و27). وجود فلانوئید های پلی فنولی و تانن و فعالیت جذب رادیکال آزاد ممکن است مسئول اثر محافظت کننده رادیو اکتیوی در عصاره سنجد باشد (22). با وجود تحقیقات بسیار، هنوز هم مواد موثره تعداد قابل توجهی از گیاهان ناشناخته مانده است(2).
میوه سنجد دارای اثراتی چون حفظ مقاومت مویرگی، گشادکننده عروق کرونر، آتمی، هیپولیپیدمیک، کنتراسپتیو و اثرات فوق العاده ضد میکروبی است(3).
1-4 معرفی حیوان:موش صحرائی ، اشاره به گروه زیادی از حیوانات خانواده جوندگان (rodentia) دارد که جایگاه اصلی این حیوانات ، جلگه های آسیا بود اما همراه انسان در سراسر دنیا پراکنده شدند. متوسط طول عمر موش های صحرائی 5/3-5/2 سال ، وزن موش صحرایی ماده به طور متوسط 300گرم و وزن موش صحرایی نر 500-400 گرم است.موش صحرایی نر در سن 60-40 روزگی به بلوغ میرسد(28).
1-4-1 علت انتخاب موش صحرایی نر:به علت تشابه زیاد بین دستگاه تولید مثل موش صحرایی نر با انسان ، از نظر آناتومی بافت شناسی و فیزیولوژی(28و29و30)، اسپرماتوژنز(31)، موش صحرایی نر جهت این آزمایش انتخاب شد و با توجه به شباهت های فوق ، نتایج حاصله را میتوان به انسان تعمیم داد.
1-4-2 دستگاه تناسلی موش صحرایی نر :دستگاه تناسلی موش صحرایی نر شامل: بیضه ها ، مجاری ، آلت تناسلی و غدد همراه است(شکل2-3).
بیضه ها(Testis) یک جفت هستند که مانند بیشتر پستانداران در کیسه اسکروتوم قرار دارند. جایگاه آنها در جلو مقعد (anus) و طرفین مجاری ادراری است. بیضه ها بین روز های 40-30 بعد از تولد پایین می آیند ودردو کیسه مجزا قرار می گیرند . کانال اینگوینال در سراسر زندگی باز می ماند. شریان بیضه ای و شبکه نیلوفری به وسیله توده ای از چربی احاطه می شود(32).
کیسه اسکروتوم در تماس با بدن باقی می ماند هر بیضه به وسیله پوششی به نام سفید پرده(Tunica albugina) پوشیده میشود و حاوی لوله های پیچیده می باشدکه به وسیله بافت همبند احاطه می شود.
بیضه ها ، به عنوان غدد درون ریز (Endocrine) و برون ریز(Exocrine) عمل می کنند در نتیجه اسپرم و هورمون های مردانه(Androgen) را به داخل لوله ها رها می کنند. سلولهای برون ریز در داخل بافت همبند پراکنده اند وسلولهای زایا طی پدیده اسپرماتوژنز، اسپرم تولید می کنند. بیضه ها از طریق یک سری لوله ها با پیشابراه ارتباط دارند که این لوله ها شامل :
شبکه بیضه(Rete testis)، اپیدیدیم ومجاری دفران می باشند.
لوله های منی ساز(Seminefrous tubules)، نزدیک ناف بیضه، مستقیم شده وتشکیل یک شبکه به نام، شبکه بیضه می دهند که از آن چند لوله وابران خارج می شود ای لوله ها سفید پرده را سوراخ کرده وسپس به یکدیگر متصل شده وتشکیل یک لوله منفرد به نام اپیدیدیم می دهند که خود به سه قسمت به نام سر، تنه و دم تقسیم می شود.
مجرای دفران از ناحیه دم اپیدیدیم خارج شده و قبل از ورود به دیواره پشتی آلت تناسلی، در ناحیه آمپولا متسع میگردد. پیشابراه موش صحرایی نر از مثانه تا راس آلت تناسلی امتداد داشته و به یک قسمت غشائی و یک قسمت آلتی تقسیم می شود.
مجرای غشائی دارای دیواره نازک و از مثانه تا کمربند لگنی امتداد دارد. قسمت آلتی به وسیله یک چین پوستی (Prepuce or Foreskin) پوشیده می شود.
سه توده بافت نعوذی (یکی کورپوس کاورنوزوم حاوی پیشابراه و دو تا کورپوس کاورنوزوم) تشکیل آلت می دهند که این سه توده داخل یک غشاء از بافت همبند قرار می گیرند.
کیسه منیSeminal Vesicle)): تعداد آنها یک جفت، دارای اندازه بزرگ و به رنگ سفید می باشند. که هر کدام حاوی یک مجرای پهن هستند و همراه با آمپولای دفران، در راس یک برجستگی (Colliculus seminalis) نزدیک گردن مثانه، از طریق دیواره پشتی پیشابراه، وارد مجرا می گردد.
غده آمپولا(Ampullary gland): یک جفت می باشند که لوله ای و منشعب بوده و در قاعده مجرای دفران قرار می گیرند و به طور مستقیم به داخل وستیبول آمپولا تخلیه می شوند.
غده کوپر(Bulbourethral gland) در محل اتصال مجرای غشایی به آلت قرار می گیرد(32).
پروستات: سه قسمت دارد که عبارتند از :
الف) پروستات اولیه (Primary) یا غده Coagulating: اولین جفت غده پروستات می باشد، دارای ظاهری شفاف و چسبیده به لبه مقعر کیسه منی می باشد و از کیسه منی قابل تشخیص است. هر غده دارای دو مجرا است که وارد پیشابراه می شود.
ب) پروستات شکمی(Ventral) : یک جفت می باشد که صورتی رنگ و قابل دید است. این غده ها حاوی چند مجرا می باشند که وارد پیشابراه میگردند.
پ) پروستات پشتی (Dorsal): یک جفت می باشد که در ناحیه پشتی پیشابراه قرار می گیرد و از کنار جانبی پیشابراه وارد مجرا میگردند.
1-4-3 مایع انزالی (Semen):
مایع انزالی طبیعی انسان*، معمولا به رنگ سفید یا خاکستری و گهگاه زرد رنگ است. مایع قرمز یا صورتی رنگ نشانه وجود خون در مایع انزالی است. مایع انزالی از دو بخش تشکیل شده است بخشی از آن سلولهای مایع انزالی (اسپرم، گلبولهای سفید، سلولهای اپیتلیال مجاری تناسلی و....) و بخش دیگر را پلاسمای مایع انزالی تشکیل میدهد که حاصل ترشحات چندین غدد ضمیمه دستگاه تولید مثلی است.
مایع بلافاصله پس از انزال لخته می شود سپس تشکیل مایع چسبنده ژل مانند می دهد. مایع انزالی حاصل ترشح بیضه و اپیدیدیم و چندین غده می باشد که فقط 5% آن، حاصل ترشح بیضه ؟اپیدیدیم است و بقیه از ترشح غدد ضمیمه به وجود می آید که این غدد عبارتند از :
کیسه منی: 46-8% مایع انزالی.
پروستات: 33-13% مایع انزالی.
غددبولبویورترال وغدد مجاری ادراری: 5-2% مایع انزالی.
1-4-4 ساختمان ومورفولوژی اسپرم موش صحرایی نر: سر اسپرم شبیه قلاب (Hook) است. هسته متراکم (Dense) و یک آکروزوم (Acrosome) دارد. قطعه میانی (Middle-peice)، حاوی سانتریولها و یک صفحه مارپیچی از میتوکندری است (Mitochondrial material). دم، حاوی یک فیلامنت محوری دراز است که برای دوره کوتاهی متحرک است(33).
1-5 اسپرماتوژنز(spermatogenesis):اسپرماتوژنز هنگام بلوغ از یک سلول زایای اولیه موسوم به اسپرماتوگونی(Spermatogonium) آغاز می شود ، که سلولی نسبتا کوچک و مدور با قطری حدود 12میکرومتر است. این سلولها در قاعده اپیتلیوم نزدیک غشاء پایه قرار گرفته اند، و مراحل گوناگون تکامل آنها عمدتا از روی شکل و خواص رنگ پذیری هسته هایشان تشخیص داده می شوند.
اسپرماتوگونی های واجد هسته های تیره ی بیضوی به صورت سلول های بنیادی عمل می کنند؛ آنها به ندرت تقسیم می شوند و هم سلولهای بنیادی جدید و هم سلولهای با هسته های کمرنگتر بیضوی ایجاد می کنند که به صورت سلولهای افزاینده بنیادی (Transit amplifying cell: منظور سلولهایی که با سرعت زیاد تقسیم شده و از یک مرحله تکثیر می گذرند.) می باشند این اسپرماتوگونی های نوع A هر یک چندین تقسیم دودمانی را از سر می گذرانند، به صورت یک سنسیتیوم متصل به هم باقی می مانند، و اسپرماتوگونی عای نوع B را تشکیل می دهند که هسته های کروی تر رنگ پریده ای دارند.
هر اسپرماتوگونی نوع B سپس دستخوش یک تقسیم میتوزی نهایی می شود ودو سلول به وجود می آورد که افزایش اندازه می یابند و به اسپرماتوسیت های اولیه تبدیل می شوند، که سلول های کروی با هسته های یوکاریوت هستند. اسپرماتوسیت های اولیه DNAی خود را تکثیر می دهند (به نحوی که هر کرومزوم محتوی کروماتید های مضاعف است) و وارد مرحله تقسیم میوز می شوند که طی آن کرومزوم های مشابه (هومولوگ) در روند سیناپس کنار هم قرار می گیرند، نوترکیبی DNA روی می دهد و دو تقسیم سلولی سریع سلول های هاپلوئید ایجاد می کنند. اسپرماتوسیت های اولیه بزرگترین سلولهای دودمان اسپرماتوژنز هستند، و علامت مشخصه آنها وجود کرومزوم های تا حدی تراکم یافته در مراحل مختلف سیناپس و نو ترکیبی است.
کرومزوم های هومولوگ در نخستین تقسیم میوزی از هم جدا می شوند و بدین ترتیب سلول های کوچکتری به نام اسپرماتوسیت های ثانویه(Secondary spermatocytes) حاصل می شوند؛ اسپرماتوسیت های ثانویه در برش های بیضه به ندرت یافت می شوند، زیرا این سلول ها دارای عمر کوتاه هستند و فقط مدت زمان بسیار کوتاهی در مرحله انترفاز باقی مانده و به سرعت وارد تقسیم دوم میوزی می شوند. با تقسیم هر اسپرماتوسیت ثانویه کروماتید های هر کرومزوم از هم جدا می شوند و دو سلول هاپلوئید به نام اسپرماتید به وجود می آید(7).
1-5-1 اسپرمیوژنز(Spermiogenesis)اسپرمیوژنز مرحله نهایی تولید اسپرم و فرآیندی است که طی آن اسپرماتید ها به اسپرماتوزوئید ها تبدیل می شوند. هیچ گونه تقسیم سلولی در خلال این فرآیند روی نمی دهد.
اسپرماتید ها را می توان به کمک اندازه کوچک آنها، هسته هاپلوئید با کروماتین بسیار متراکم، و موقعیت آنها در نزدیکی مجرای لوله های منی ساز تشخیص داد(7).
1-6 Busulfan (Myleran)بوسولفان یک داروی تجزیه کننده DNA (Alkylating agent) است که نام شیمیایی آن1-4-btanoedioldimethanesulfonate می باشد و فرمول ساختمانی آن CH3SO2(CH2)4OSO2CH3 است. بوسولفان برای درمان Chronic leukemia ( کم خونی مزمن میلوسیتی و گرانولوسیتی) به کار می رود.
بوسولفان یک داروی هسته دوست (Nucleophilic) است که این خاصیت غیر اختصاصی است. به نظر می رسد آلکیلاسیون DNA، یک مکانیسم بیولوژیک مهم برای اثر توکسیک بوسولفان است.
بوسولفان با اثر بر روی اسپرماتوژنز، باعث نازایی، فقدان اسپرم و تحلیل رفتن بیضه ها می گردد(34).
بوسولفان باعث رشد گناد ها، کاهش تعداد سلولهای زایا (Germ cell)، توقف تقسیم میوزی اسپرماتوگونی ها، افزایش استرادیول و کاهش تستوسترون می گردد(35).
1- 7 Wi-Fiناباروری یک مسئله شایع در سر تاسر جهان است که حدود 70ملیون زوج در سن باروری به آن دچار می باشند(36). چنین اظهار شده است که طی چندین دهه اخیر ناباروری در مردان افزایش یافته است(37). و این مسئله به قرار گیری مستقیم یا غیر مستقیم در معرض عوامل محیطی خاص مانند امواج الکترو مغناطیسی ، فرکانس های رادیویی (فرکانس های بالا) یا RF-EMW (Radio frequency electromagnetic waves) نسبت داده می شود(38).
امواج الکترو مغناطیس به طور قابل ملاحضه ای در تشخیص و درمان به کار گرفته می شوند و استفاده از آنها مستلزم چگونگی کاربرد محتوای انرژی آنها می باشد و می توان گفت امواج با طول موج کوتاه ،انرژی بیشتری با خود دارند وبیشتر نفوذ می کنند و می توانند صدمات بیشتری برسانند(39).
تشعشع ها را می توان به دو دسته یونیزاسیون مستقیم و غیر مستقیم تقسیم بندی کرد .ذرات بار دار مانند پروتون و پوزیترون پرتوهای یونیزاسیون مستقیم هستند که می توانند ساختمان اتمی ماده جاذب را بشکنند و از آن عبور کنند و تغییر شیمیایی و بیولوژیکی در آن ایجاد کنند ، ولی تشعشع های الکترو مغناطیس پرتوهای یونیزاسیون غیر مستقیم هستند. این پرتو ها خود ایجاد صدمات شیمیایی و بیولوژیکی نمی کنند بلکه در حین عبور از ماده جاذب، انرژی جنبشی خود رااز دست داده و تولید ذرات باردار می کنند(40). بسیاری از این ذرات قادر به یونیزه کردن اتم های ماده جاذب و شکستن باند های شیمیایی حیاتی هستند و وقایع زنجیره ای را شروع می کنند که منتهی به صدمات بیولوژیکی می شود(41). وقتی پرتو جذب مواد حیاتی می شود، انرژی در بافت ها و سلولها ذخیره می گردد، این انرژی به علت تولید رادیکال های آزاد می تواند یک باند شیمیایی را بشکند و زنجیره ای از وقایع بیولوژیکی از جمله موتاسیون آسیب در غشاء ها را شروع نماید.(42).
زنجیره وقایع از جذب تشعشع تا آخرین مرحله یعنی ظهور آسیب بیولوژیکی را می توان به صورت زیر خلاصه کرد:
جذب تشعشع منتهی به ایجاد ذرات باردار سریع می گردد.
ذرات بار دار در حین عبور از مواد بیولوژیکی تولید تعدادی جفت یون می کنند. این جفت یون ها رادیکال های آزاد (R₀ ) را به وجود می آورند که دارای عمر بسیار کوتاهی در حدود 105ثانیه هستند. این رادیکال های آزاد به علت داشتن یک والانس الکترون تنها، مولکولهای بسیار فعالی می باشند و تا حد وسیعی منجر به پاره شدن باند های شیمیایی شده و موجب تغییرات شیمیایی می شوند که خود باعث شروع زنجیره ای از وقایع می گردندکه نتیجه نهایی آن ظهور آسیب بیولوژیک است.
اگر اکسیژن حضور داشته باشد ، با رادیکال های آزاد (R0) ترکیب شده و در نتیجه این ترکیب ROO2 تولید می شود که یک پراکسید ارگانیک و یک ماده غیر قابل برگشت است، بدون حضور اکسیژن این واکنش روی نمی دهد و بسیاری از مولکول های یونیزه شده مورد هدف می توانند خودشان را ترمیم و قابلیت عمل طبیعی خود را نیز باز یابند. از طرفی مهمتر اینکه اکسیژن موجب تثبیت ضایعات حاصل از تابش اشعه می شود. بدون حضور اکسیژن این واکنش روی نمی دهد و بسیاری از مولکول های یونیزه شده هدف، می توانند خودشان را ترمیم و قابلیت عمل طبیعی خود را باز یابند(43).
1-7-1 تابش یونیزاسیون غیر مستقیم:تا قبل از پایان جنگ جهانی دوم توجه چندانی به خطرات ناشی از تابش های یونیزاسیون غیر مستقیم نمی شد. تا آن زمان درباره صدمات وارده به چشم بر اثر رویت مستقیم کسوف، نور فرابنفش جوشکاری، و انرژی فرو سرخ در کارهای شیشه سازی و فولاد کاری تجربیات زیادی جمع آوری شده بود. همچنین شواهدی مبنی بر صدمات پوستی ناشی از تابش های فرابنفش و فروسرخ در دسترس بود. اما ترقی سریع الکترونیک و ارتباطات در سالهای پس از جنگ که مبنی بر بخش میکرو موج طیف تابش الکترو مغناطیس بود، و به دنبال آن کاربرد فراگیر جنبه های تاثیر احتمالی تابش های یونیزاسیون غیر مستقیم به ویژه تابش های ناشی از این دو چشمه را بر بهداشت عمومی در کانون توجه قرار داد(8).
با وجود اینکه مرزها و حد و حدود های امنی برای حفاظت از ارتباطات در مقابل پرتودهی امواج رادیویی موجود است، اما نگرانی های عمومی در این باره همواره رو به افزایش است(44و45)، به همین دلیل سازمان سلامت جهانی توصیه کرده است که تحقیقاتی در این زمینه انجام گیرد. مطالعات بر روی حیوانات ( در واقع بر روی موش ها ) به منظور تحلیل و آنالیز تاثیرات سیگنال های WI-FI بر پارامتر های سلامتی و نشان گرهای استرس طراحی شده است.
طی سالهای اخیر استفاده از کامپیوترهای قابل حمل (لپ تاپ های که به اینترنت به صورت وایرلس متصل شده اند به عنوان WI-FI شناخته می شوند.) بسیار افزایش یافته است. این روز ها لپ تاپ ها به دلیل قابل حمل بودن و انعطاف پذیری خود تبدیل به یک وسیله لازم وضروری در زندگی روزمره شده اند. افرادی که از سیستم های WI-FI استفاده می کنند در معرض امواج رادیویی قرار خواهند گرفت و برخی از این امواج ساطع شده از طریق بدنشان جذب می شود. لپ تاپ ها معمولا بر روی پاهای فرد نشسته قرار می گیرد(46و47) و به دین تر تیب ناحیه دستگاه تناسلی این افراد در معرض امواج الکترو مغناطیسی، فرکانس های رادیویی و دمای بالا قرار می گیرد(47و48).
میدان های مغناطیسی با فرکانس های بسیار پایین می توانند باعث شروع برخی تغییرات فزیولوژیک و شیمیایی در سیستم های بیولوژیکی گونه های مختلف شوند(49و50). بسیاری از این تاثیرات مرتبط با تولید رادیکال های آزاد است(51و52). رادیکال های آزاد عواملی هستند که باعث ایجاد آسیب اکسیداتیو در ساختار های سلولی و مولکولی مانند لیپید ها، پروتئین ها و اسید های نوکلئیک می شوند(53).
اسپرماتوزوئید ها به طور منحصر به فرد در برابر تنش اکسیداتیو حساس هستند. علت مربوط به این مسئله به صورت زیر می باشد:
اولین دلیل این سلول ها بطور عمده عاری از سیتو پلاسم هستند و سیتو پلاسم هم در سلول های سوماتیک محلی است برای ذخیره و نگهداری آنزیم های آنتی اکسیدان که اولین خط دفاعی در برابر حمله رادیکال های آزاد، می باشند. بنابر این این سلول ها به علت نداشتن سیتوپلاسم و در نتیجه آنزیم های آنتی اکسیدان به راحتی در معرض حمله رادیکال های آزاد قرار می گیرند(54).
دومین دلیل این سلول ها، دارای هدف های مناسب بسیاری برای ایجاد آسیب پراکسداتیو می باشند. از جمله این هدف ها ، می توان به اسید های چرب غیر اشباعی و DNA اشاره کرد(54و55).
سومین دلیل این سلول ها تولید کننده های حرفه ای گو نه های واکنش پذیر اکسیژن هستند که به نظر می رسد به طور وسیعی از میتوکندری های اسپرم و NADPHاکسیداز غشای پلاسمایی منشا می گیرند(56و57).
1-7-2 دستگاه WI-FI:دستگاه Wireless 8.2.Hg یا محیطی که به نام دستگاه Wi-Fi است ، وسیله بی سیم فراهم کننده امکان دسترسی به اینترنت است کهWIADنیز نامیده می شود. او به طور معمول دارای محدوده فرکانس بالاتر و زمان پرتو دهی طولانی تری نسبت به تلفن های بدون سیم است(58). بدین ترتیب، سطح مخاطره سلامت که مربوط به دستگاه های Wi-Fi می باشد نسبت به تلفن های همراه هم متفاوت است و احتمالا بیشتر هم می باشد. به علاوه دستگاه های Wi-Fi به طور معمول کل بدن را در معرض پرتو های خود قرار می دهند، در حالی که تلفن های همراه تنها بخش هایی از بدن را در معرض پرتو دهی قرار می دهند و بیشتر از همه جمجمه هست که مورد آسیب واقع می شود. قرار گیری حیوانات در معرض پرتو های الکترو مغناطیسی امواج رادیویی یا RFEMR (Radio ferequency electromagnetic --iation) منجر به تغییرات گوناگونی در بافت ها می شود. تغییرات مشاهده شده بسته به خصوصیات و ویژگی های پرتو های ساطع شده از دستگاه Wireless، در گونه های مورد مطالعه و متدلوژی آسیب شناسی بافت مورد استفاده برای کشف این اثرات، متفاوت می باشند(59و60).
فصل دومروش کارcenter0400000
2-1 انتخاب حیوان:جهت این آزمایش ، در تاریخ 19/1/91، تعداد 100 عدد موش سفید بزرگ آزمایشگاهی نر از نژاد اسپراگو-داولی(Sprague-Dawley)، با وزن 200- 250گرم، به روش تصادفی ساده، از مرکز حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی شیراز خریداری شد.

شکل 2-1: نمایی از اتاق حیوانات دانشکده علوم پزشکی شیراز2-1-1 گروه بندی حیوان:موش ها به طور تصادفی به 10 گروه 10تایی تقسیم و در قفس های به ابعاد 40ₓ20ₓ15 سانتی متر، به ازای هر قفس 5 موش جای داده شدند. به گونه ای که هر گروه دوقفس پنج تایی داشتند. همه موش ها وزن و شماره گذاری شدند. در تمام طول آزمایش شرایط نوری 12 ساعت روشنایی(6صبح تا 6 عصر) و 12 ساعت تاریکی و درجه حرارت23±2 درجه سانتی گراد رعایت شد. تمام گروه ها از غذای یکسان استفاده کردند.

2-1-2 وزن کردن حیوان:برای وزن کردن موش ها، از ترازوی دیجیتالی(spo51)، استفاده شد. برای اینکار ابتدا ترازو را کالیبره کرده سپس توزین موش ها انجام شد.
2-2 عصاره سنجد:2-2-1 دستگاه های مورد استفاده جهت عصاره گیری:1)دستگاه دیسیکاتور(Descicator)
این دستگاه از یک مخزن شیشه ای و یک پمپ خلاء تشکیل شده است:
الف) مخزن شیشه ای: در قسمت پایین مخزن، مواد جاذب رطوبت ،کلسیم کلراید و در قسمت بالای آن ماده مورد نظر قرار می گیرد. این مخزن، دارای یک سرپوش شیر دار است که شیر آن به پمپ خلا وصل می شود. (شکل2-2)

شکل 2-2: دستگاه دسیکاتورب)پمپ خلاء: این پمپ برای ایجاد خلاء در مخزن شیشه ای استفاده می شود.
2)دستگاه روتاری(Rotary)
این دستگاه شبیه دستگاه تقطیر است. بدین صورت که مواد مورد نظر در داخل مخزن قرار می گیرد. این مخزن، در داخل یک ظرف آب گرم به گردش در می آید در نتیجه آب و رطوبت موجود در ماده، تبخیر شده، و وارد یک فیلتر می گردد. فیلتر در انتهای مخزن قرار دارد. خلاء لازم در داخل مخزن به وسیله یک پمپ، ایجاد می شود. (شکل 2-3)

شکل 2-3: دستگاه روتاری3)دستگاه پرکولاتور(Percolator)
دستگاه عصاره گیری است که با استفاده از فشار کار می کند. این دستگاه حاوی یک مخزن شیشه ای دهان گشاد می باشد که در پایین حاوی شیر کنترل است. مواد مورد نظر در داخل مخزن قرار می گیرد و به علت فشاری که به آن وارد می شود حلال، قطره قطره از آن خارج می شود. (شکل 2-4)

شکل 2-4: دستگاه پرکولاتور2-2-2 روش تهیه عصاره هیدرو الکلی سنجد:سنجدی که از بازار تهیه کردیم (سنجد خراسان) به آزمایشگاه منتقل شد، میوه با هسته آن آسیاب شده بعد به مقدار معینی(100gr) از سنجد آسیاب شده را برداشته و در 700cc هیدروالکل مخلوط کرده و به وسیله دستگاه پرکولاسیون به مدت 3روز (72 ساعت) در هوای آزمایشگاه نگه داری کرده بعد از 3 روز عصاره را به وسیله شیر زیر دستگاه گرفته شد. در ضمن برای اینکه گیاه خشک نشود و عصاره بیشتری به دست بیاید همان اندازه که قطره قطره از شیر دستگاه عصاره خارج می شود به همان اندازه حلال مورد نظر که همان هیدرو الکل می باشد، از بالای دستگاه اضافه کرده تا مادامی که عصاره از پایین دستگاه گرفته می شود دیگر رنگی نداشته باشد. عصاره به دست آمده را به وسیله دستگاه روتاری و یا بن ماری غلیظ کرده تا تمام هیدرو الکل عصاره گرفته شود سپس برای اینکه عصاره رطوبتی نداشته باشد در دستگاه دیگری به نام دیسیکاتور که خلاء قوی ایجاد می کند به مدت 24 ساعت نگه داری کرده راندمان 100gr گیاه پودر شده که برداشتیم 51gr عصاره غلیظ سنجد می باشد .
2-2-3 روش دادن عصاره :یک روز پس از تزریق داروی بوسولفان، تجویز عصاره آغاز و به مدت 48 روز (طول مدت اسپرماتوژنز در موش صحرایی نر)، به گروه های آزمایش 6و7 به صورت گاواژ داده شدو همچنین گروه آزمایش 9 همراه با دریافت اشعه Wi-Fi عصاره نیز به مدت 48 روز و به صورت گاواژ دریافت کردند. گروه آزمایش 3 به مدت 48 روز فقط عصاره به صورت گاواژ داده شد و هیچ دارو و اشعه ای دریافت نکردند. گروه های مزبور، روزانه 70mg به ازای هر یک کیلو گرم دریافت کردند. قابل ذکر است که دوز مزبور در 2 سی سی آب مقطر حل شده بود. گروه شم (گروه2) در تمام مدت آزمایش معادل حجم محلول تجویز شده برای گروه های آزمایش آب مقطر دریافت کرده و گروه کنترل حقیقی (گروه 1) و گروه کنترل Wi-Fi (گروه10)، هیچ گونه دارو، عصاره و اشعه ای دریافت نکردند.
2-2-4 مبنای انتخاب دوز عصاره:با توجه به اختلافات مربوط به پارامتر های قلبی- عروقی و متابولیسم کبدی و میزان بیان شده در کتاب طب سنتی(28) بین انسان و موش صحرایی نر دوز مزبور انتخاب شد.
2-3 روش آماده کردن داروی بوسولفان:الف) طرز تهیه حلال بوسولفان: برای تهیه حلال باید به ازای هر 3/3 گرم N-N-Dimethylacetamid، 7/6 گرم، Polyethylenglycol-400 استفاده شود. در این آزمایش 33/13 گرم ماده اول با 66/26 گرم ماده دوم مخلوط شده و حجم به 40 سی سی رسانده شد.
ب) روش تهیه دارو:
به ازای هر 5mg بوسولفان، نیاز به 2cc حلال است. در این آزمایش 100mg بوسولفان در 40cc حلال حل شد.
2-3-1 دوز داروی مورد استفاده:
با توجه به اینکه دوزهای 10mg/kg و بیشتر از آن، باعث تخریب زیاد سلول های اسپرماتوژنیک می شود(35و61) و در این آزمایش نیاز به ایجاد عقیمی نسبی موش های صحرایی نر بود، بنابراین از دوز 5mg/kg استفاده شد. و برای بررسی مقایسه ای اثر عصاره سنجد از یک دوز بالاتر بوسولفان برای ایجاد تخریب زیاد سلول های اسپرماتوژنیک دوز 15mg/kgبوسولفان استفاده شد. با توجه به محاسبه فوق، برای دادن 5mg دارو، نیاز به تزریق 2ml/kg از محلول حاوی دارو بود. بنابراین برای موشهای با وزن 250gr نیم سی سی از محلول فوق، استفاده شد. و همچنین برای دادن 15mg دارو، نیاز به تزریق 6ml/kg از محلول حاوی دارو بود. به همین دلیل موشهای وزن 250gr یک و نیم سی سی از محلول فوق را دریافت نمودند.
2-3-2 روش دادن دارو:به موش های گروه آزمایش تجربی 4-5-6-7 فقط یک دوز دارو به صورت داخل صفاقی(Ip) ، با رعایت اصول اخلاقی و به صورت استریل، داده شد. گروه های شم و کنترل حقیقی بوسولفان دریافت نکردند.
2-4 روش دادن تابش اشعه Wi-Fi:2-4-1 دستگاه های استفاده شده جهت دادن تابش:الف) دستگاه دوزیمتر :
دستگاه EMF(Electro Magnetic Field) یا دوزیمتر استفاده شده در این آزمایش از شرکت Holaday ومدل HI-3604 بود. از این دستگاه برای اندازه گیری و ثبت میدان های الکتریکی و مغناطیسی محیط استفاده شد.
ب) مودم Wi-Fi :
برای انجام این آزمایش از مودم وایمکس رومیزی ایرانسل(مودم داخلی با امکانات Wi-Fi) مدل WIXFMM-130 استفاده شد. وایمکس سیستم دیجیتال ارتباط بی سیم است که با استفاده از منطقه بسیار وسیع تحت پوشش دکل های وایمکس، کل شهر و شهرک های صنعتی و مناطق راهبردی را پوشش می دهد و اینترنت پر سرعت را برای سازمان ها و موسسات و شرکت های تجاری و همچنین منازل مسکونی و کلیه افراد در هر نقطه ای از مکان های تحت پوشش فراهم می آورد.
ج)لپ تاپ:
در این آزمایش از یک دستگاه لپ تاپ ASUS مدل N43J استفاده شد . از لپ تاپ برای استفاده از اینترنت و دانلود هنگام تابش اشعه Wi-Fi استفاده شد.
2-4-2 طرز چیدمان موش ها جهت دریافت اشعه Wi-Fi:قبل از چیدمان موش ها بایستی میزان امواج الکتریکی و مغناطیسی محیط توسط دستگاه دوزیمتر ثبت شود که چون این آزمایش در مرکز حیوانات آزمایشگاهی دانشکده علوم پزشکی شیراز انجام می شد دستگاه به مرکز منتقل وامواج به قرار زیر ثبت گردید:
Background محیط قبل از روشن کردن مودم وایمکس و لپ تاپ:
میدان مغناطیسی : 14mA/m و میدان الکتریکی: 0.5V/m
لپ تاپ روشن، مودم خاموش:
میدان مغناطیسی: 15mA/m و میدان الکتریکی: 10V/m
لپ تاپ روشن بدون دانلود واستفاده از اینترنت، مودم روشن:
میدان مغناطیسی: 19mA/m و میدان الکتریکی: 11.5V/m
لپ تاپ روشن هنگام دانلود، مودم روشن:
میدان مغناطیسی: 67mA/m و میدان الکتریکی: 17.4V/m
چون امواج به صورت کروی در محط پخش می شوند، دستگاه مودم را در مرکز قرار داده و موشها را داخل مقید کننده گذاشته و به صورت دایره وار دور مودم چیده شد وچون 2 گروه را باید تابش می دادیم (گروه 8و9) یک گروه در زیر وگروه دیگر روی آن قرار داده شد، همانطور که در شکل می بینید وچون مدت تابش 4 ساعت در روز بود بس از گذشت 2 ساعت گروه ها جا به جا کردیم تا به طور مساوی امواج را دریافت کنند. (شکل 2-5)

شکل 2-5: طرز چیدمان موش ها داخل مقید کننده در اطراف مودم Wi-Fi2-5 روش بی هوش کردن حیوان:
در روز 50(48 روز بعد از دادن عصاره وتابش Wi-Fi و 49 روز پس از دادن بوسولفان)، ابتدا موش ها به وسیله ترازوی دیجیتالی، وزن شدند و سپس به طریق زیر تحت عمل بی هوشی قرار گرفتند:
در یک ظرف شیشه ای دهان گشاد در پوش دار، مقداری پنبه تمیز ریخته شد و به پنبه ها، 3-4 سی سی اتر اضافه گردید. سپس هر موش به طور انفرادی داخل شیشه قرار گرفت و درب شیشه پوشانده شد. پس از بیهوشی، موش ها به طریق زیر تشریح و ارگان های لازم برداشته شد لازم به ذکر است که در تمام مدت تشریح، عمل بیهوشی بوسیله یک پنبه آغشته به اتر کنترل می شد.
2-6 روش جمع آوری اسپرم و خون گیری: هر موش پس از بیهوشی، روی یک تخته که از قبل بدین منظور تعبیه شده بود ثابت گردید. به منظور تهیه سرم جهت آزمایشات هورمونی (تستوسترون) با سرنگ 2 سی سی، مقدار 2 سی سی خون از قلب حیوان گرفته و درشیشه کلات ریخته شد (شیشه ها از قبل برچسب زده و شماره گذاری شده بود). بعد از آن ناحیه شکم به وسیله پنبه الکل ضد عفونی گردید. سپس یک برش عمودی (Vertical) در خط وسط پوست شکم داده شد. و با قیچی، عضلات جدار شکم را باز کرده تا حفره شکمی در معرض دید قرار گیرد.(شکل 2-6) به منظور تهیه اسپرم، یک سانتی متر انتهای مجرای دفران چپ را جدا کرده در محلول HBSS(Hank,s Balanced Salt Solution) قرار داده شد و در نهایت بافت بیضه چپ به منظور مطالعه بافت شناسی برداشته و داخل فرمالین 10% قرار داده شد.

شکل 2-6: تشریح موش صحرایی2-6-1 روش تهیه اسمیر:پس از گذشت 5 دقیقه و خروج اسپرم ها از مجرای دفران، با استفاده از سمپلر، یک قطره از محلول HBSS که حاوی اسپرم بود بر روی لام گذاشته و بالبه لام دیگر با زاویه 45 درجه روی آن کشیده شد سپس اسلاید ها در هوای اتاق خشک شدند.
2-6-2 طرز تهیه محلول HBSS :برای تهیه 500 سی سی محلول HBSS، مواد زیر با دوز های مشخص شده استفاده شد.
Cacl2.2H2o: 92/5mg
Kcl: 200mg
KH2PO4: 30mg
Mgso4.7H2o: 100mg
Nacl: 4g
NaHco3: 175mg
Dextrose: 550mg
Distilled water: 500cc
2-6-3 روش استخراج سرم:لوله های کلات حاوی خون، داخل دستگاه سانتریفیوژ قرار داده و به مدت 10 دقیقه با دور200G در دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس توسط سمپلر، سرم جدا شده خون را برداشته و در لوله های اپندورف ریخته شد. سرم ها تا زمان انجام آزمایشات هورمونی در حالت فریز (دمای 20- درجه سانتیگراد ) نگهداری شدند.
2-7 روش اندازه گیری هورمون تستوسترون:
این اندازه گیری توسط دستگاه Elecsysمدل 2010 انجام شد. پس از جدا سازی سرم آنهه را در cup های مخصوص دستگاه ریخته و نتایج توسط دستگاه خوانده شد.
2-8 پاساژ (Passage) یا گردش بافتی ( Processing)از بافت بیضه چپ، طی مراحل زیر اسلاید تهیه شد:
الف) مرحله تثبیت: بافت های فوق در فرمالین 10% فیکس شد و با فاصله 2، 4، 8، 12، 24، 48 ساعت از نقطه شروع، فرمالین آنها تعویض شد. مقدار فرمالین استفاده شده برای هر ظرف 50 برابر حجم بافت بود.
ب) مرحله آب گیری (Dehydration): این عمل با الکل های 70، 80، 96 وسه ظرف الکل 100درصد، هر کدام به مدت 2 ساعت انجام شد.
پ) مرحله الکل گیری و شفاف کردن(Clearing): برای این منظور از دو ظرف گزیلل-زیلول)، هر کدام به مدت یک ساعت استفاده شد تا گزیلل-زیلول جانشین الکل شود. شایان ذکر است که دو مرحله اخیر توسط دستگاه اتوتکنیکون لایکا (LEICA TP 1010) به طور اتوماتیک انجام شد.
ت) مرحله جایگزینی: بافت ها در دو ظرف پارافین مذاب با درجه حرارت 65 درجه سانتی گراد و با حجمی معادل 50 برابر حجم نمونه بافتی، قرار داده شده تا پارافین جایگزین گزیلل =زیلول شود مدت زمان در نظر گرفته شده برای هر ظرف 2 ساعت بود.
ث) مرحله قالب گیری: ابتدا یک لایه نازک از پارافین مذاب بر روی شیشه و قالب های روی آن چسبانده شد، سپس قالب ها را با پارافین مذاب پر کرده و بافت ها را در داخل آنها قرار داده شد پس از سرد شدن در دمای اتاق، بلوک ها را از قالب ها جدا کرده و در سرد خانه یخچال نگهداری شدند.
ج) برش بافتی یا مقطع گیری: برای این منظور از میکروتوم لایکا استفاده شد و برش های 5 میکرونی از بافت تهیه شد.
چ)مرحله رنگ آمیزی: در این مطالعه از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین،(H&E ) استفاده شد.
2-9 شمارش اسپرم:برای شمارش اسپرم ابتدا یک سانتیمتر انتهایی مجران دفران را جدا کرده و در 5/2 سی سی محلول HBSS با حرارت 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد سپس به روش Jennifer (51)، یک قطره از محلول فوق را روی لام نئوبار ریخته و پس از قرار دادن لامل روی آن از خانه های شماره، 9،7،3،1(خانه های مربوط به شمارش گلبول سفید) جهت شمارش اسپرم استفاده شد. پس از شمارش، میانگین اعداد حاصل از خانه های مزبور محاسبه گردید. به منظور محاسبه تعداد اسپرم موجود در یک میلی لیتر محلول HBSS، میانگین به دست آمده در ضرایب زیر ضرب گردید:
با توجه به اینکه عمق لام نئوبار 0.1 میلی لیتر می باشد جهت محاسبه تعداد اسپرم در یک میلی لیتر مکعب، میانگین تعداد اسپرم در عدد 10 ضرب شد. همچنین جهت محاسبه تعداد اسپرم در واحد میلی لیتر، تعداد اسپرم به دست آمده در یک میلی متر مکعب در عدد 1000 ضرب گردید. با توجه به اینکه مجرای دفران در 5/2 سی سی (فاکتور رقت) محلول HBSS قرار داده شده بود عدد حاصله در عدد 5/2 ضرب گردید.
2-10 روش رنگ آمیزی اسمیر های تهیه شده از اسپرم:اسمیر های تهیه شده توسط رنگ ائوزین، رنگ آمیزی شدند.
2-11 مواد و وسایلجدول 2-1: لیست وسایل مصرفیشماره نام وسایل شرکت سازنده کشور
1 لامل M.MG آلمان
2 لام Menzel آلمان
3 آپندروف 5/1 گروه صنعتی حقیقت ایران
4 دستکش جراحی سوپا ایران
5 سرنگ 2cc سوپا ایران
6 سرنگ 5cc سوپا ایران
7 ماسک سه لایه یکبار مصرف آرمان ماسک ایران
8 گاز - ایران
9 پنبه - ایران
10 برچسب - ایران
11 دستکش یکبار مصرف - ایران
12 سرم فیزیولوژی داروسازی شهید قاضی ایران
جدول 2-2: لیست مواد مصرفیکشور شرکت سازنده نام مواد شماره
آلمان Merck اسید سیتریک 1
آلمان Merck الکل متانول مطلق 2
آلمان Merck الکل اتانول مطلق 3
آلمان Merck فرمالین 10% 4
آلمان Merck گلیسیرین 5
آلمان Merck هماتوکسیلین 6
آلمان Merck گزیلل 7
آلمان Merck پارافین 8
آلمان زیگما بوسولفان 9
ایران پارسیان الکل 96 درجه 10
انگلستان BDH ائوزین 11
ایران لانه حیوانات دانشگاه علوم پزشکی شیراز موش صحرایی نر 12
ایران از درختان استان خراسان میوه سنجد 13
جدول 2-3: لیست ابزارها و دستگاه های مورد استفادهکشور نام شرکت سازنده نام دستگاه شماره
آلمان فاکسل ست جراحی 1
ایران - دستگاه عصاره گیری 2
ایران - دستگاه سانتریفیوژ 3
ژاپن Niko میکروسکوپ نوری E200 4
ژاپن Sony CCDcamera 5
آلمان Spo51 ترازو دیجیتالی 6
ایران - سمپلر 7
ایران - بشر مدرج 8
ایران - پیپت 9
سوئد Heraeus دستگاه آب گرم (Water Bath) 10


آلمان Leica 820 میکروتوم Leica 11
آلمان Profile-c تیغه میکروتوم Leica 12
آلمان Zeis میکروسکوپ نوری 13
ایران - لوله کلات 14
آلمان - نیدل گاواژ 15
چین هووایی مودم Wi-Fi 16
چین ایسوس لپ تاپ 17
فصل سومیافتههای پژوهشcenter0400000
یافتههای پژوهش
در این فصل، نتایج تحلیلهای آماری مربوط به آزمایشات انجام شده آورده شده است. دادهها با استفاده از آمارههای توصیفی میانگین، انحراف استاندارد، نمودار میلهای و آمارههای استنباطی t مستقل، t همبسته و تجزیه و تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) به همراه آزمون پیگیری LSD مورد تجزیه و تحلیل واقع شدند. همچنین لازم به ذکر است که در کلیه تحلیلها مرز استنتاج آماری در سطح معناداری 05/0>P در نظر گرفته شده است.
3-1- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر تعداد اسپرمها
جهت بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر تعداد اسپرمها از روش آماری تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) به همراه آزمون پیگیری LSD استفاده شد. در جدول 3-1 میانگین و خطای معیار میانگین () تعداد اسپرمها در گروههای مختلف ارائه شده است. نتایج نشان میدهند که بین میانگین تعداد اسپرمها در گروههای شاهد، تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد) با گروههای تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد.
جـدول 3-1: میانگین و خطای معیار میانگین () تعداد اسپرمها (میلیون بر میلیلیتر) در گروههای مختلفخطای معیار میانگین±میانگین تعداد اسپرمها
گـــروههای مختلف
81/0±13/12 کنتـرل
*65/0±22/8 شاهد
99/0±16/11 تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد)
*21/1±54/8 تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)
,#**69/0±31/2 تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15)
34/1±34/9 تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5)
**71/0±60/4 تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15)
* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.** نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 0005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 001/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.همانگونه که در نمودار 3-1 ملاحظه میگردد، بین میانگین تعداد اسپرمها در گروههای شاهد، تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد) با گروههای تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) تفاوت معناداری مشاهده میگردد.

* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.** نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 0005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 001/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.نمودار 3-1: میانگین و خطای معیار میانگین () تعداد اسپرمها در گروههای مختلف3-2- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشرونده سریع (GI)
جهت بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشرونده سریع (GI) از روش آماری غیرپارامتری کروسکال- والیس و در صورت معنیدار بودن از آزمون یو من- ویتنی استفاده شد. در جدول 3-2 میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده سریع (GI) در گروههای مختلف ارائه شده است. نتایج نشان میدهند که بین گروههای شاهد، تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل و بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد)، تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه شاهد و بین گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه تجربی1 تفاوت معناداری مشاهده میگردد.
جـدول 3-2: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده سریع در گروههای مختلفخطای معیار میانگین±میانگین درصد اسپرمهای پیشرونده سریع
گـــروههای مختلف
20/2±32/13 کنتـرل
*92/1±29/5 شاهد
##36/2±90/16 تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد)
$,##,**38/0±38/0 تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)
$,#,**0±0 تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15)
55/5±26/15 تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5)
$,*76/0±28/1 تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15)
* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P و ** نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P با گروه کنترل میباشد.
## نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P و # نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P با گروه شاهد میباشد.
$ نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.
همانگونه که در نمودار 3-2 ملاحظه میگردد، بین گروههای شاهد، تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل و بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد)، تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه شاهد و بین گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه تجربی1 تفاوت معناداری مشاهده میگردد.

* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P و ** نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P با گروه کنترل میباشد.
## نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P و # نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P با گروه شاهد میباشد.
$ نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.
نمودار 3-2: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده سریع در گروههای مختلف
3-3- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای با حرکت درجا (GII)
جهت بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای با حرکت درجا (GII) از روش آماری تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) به همراه آزمون پیگیری LSD استفاده شد. در جدول 3-3 میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای با حرکت درجا (GII) در گروههای مختلف ارائه شده است. نتایج نشان میدهند که بین میانگین درصد اسپرمهای با حرکت درجا (GII) در گروه تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد) با گروه تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) تفاوت معناداری مشاهده میگردد.
جـدول 3-3: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای با حرکت درجا در گروههای مختلفخطای معیار میانگین±میانگین درصد اسپرمهای با حرکت درجا
گروههای مختلف
54/3±76/18 کنتـرل
79/4±86/27 شاهد
37/2±88/18 تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد)
69/2±14/9 تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)
98/5±98/5 تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15)
,#*41/5±20/33 تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5)
50/9±84/17 تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15)
* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.همانگونه که در نمودار 3-3 ملاحظه میگردد، بین میانگین درصد اسپرمهای با حرکت درجا (GII) در گروه تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد) با گروه تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) تفاوت معناداری مشاهده میگردد.

* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.نمودار 3-3: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای با حرکت درجا در گروههای مختلف3-4- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته (GIII)
جهت بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای پیشروند با حرکت آهسته (GIII) از روش آماری تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) به همراه آزمون پیگیری LSD استفاده شد. در جدول 3-4 میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته (GIII) در گروههای مختلف ارائه شده است. نتایج نشان میدهند که بین میانگین درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته (GIII) در گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد) با گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) تفاوت معناداری مشاهده میگردد.
جـدول 3-4: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته در گروههای مختلفخطای معیار میانگین±میانگین درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته
گـــروههای مختلف
09/4±83/27 کنتـرل
67/6±48/38 شاهد
83/3±32/35 تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد)
,#**52/8±58/54 تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)
, ##*98/5±98/5 تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15)
72/4±92/21 تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5)
00/5±31/16 تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15)
* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.** نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.## نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.همانگونه که در نمودار 3-4 ملاحظه میگردد، بین میانگین درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته (GIII) در گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد) با گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) تفاوت معناداری مشاهده میگردد.

* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.** نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.## نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.نمودار 3-4: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای پیشرونده با حرکت آهسته در گروههای مختلف3-5- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای بدون حرکت (GIV)
جهت بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر درصد اسپرمهای بدون حرکت (GIV) از روش آماری غیرپارامتری کروسکال- والیس و در صورت معنیدار بودن از آزمون یو من- ویتنی، استفاده شد. در جدول 3-5 میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای بدون حرکت (GIV) در گروههای مختلف ارائه شده است. نتایج نشان میدهند که بین میانگین درصد اسپرمهای بدون حرکت (GIV) در گروههای شاهد، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروههای تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه شاهد و همچنین نسبت به گروه تجربی1 تفاوت معناداری مشاهده میگردد.
جـدول 3-5: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای بدون حرکت در گروههای مختلفخطای معیار میانگین±میانگین درصد اسپرمهای بدون حرکت گروههای مختلف
52/4±40/39 کنتـرل
*05/2±36/28 شاهد
66/1±91/28 تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد)
31/9±91/35 تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)
,##,$*95/11±04/88 تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15)
*92/3±62/29 تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5)
#,$91/13±56/64 تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15)
* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P و ## نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P با گروه شاهد میباشد.$ نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.
همانگونه که در نمودار 3-5 ملاحظه میگردد، بین میانگین درصد اسپرمهای بدون حرکت (GIV) در گروههای شاهد، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروههای تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه شاهد و همچنین نسبت به گروه تجربی1 تفاوت معناداری مشاهده میگردد.

* نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P بین گروه مورد نظر با گروه کنترل میباشد.# نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 05/0>P و ## نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 005/0>P با گروه شاهد میباشد.$ نشان دهنده تفاوت معنادار در سطح 01/0>P بین گروه مورد نظر با گروه تجربی1 میباشد.
نمودار 3-5: میانگین و خطای معیار میانگین () درصد اسپرمهای بدون حرکت در گروههای مختلف3-6- یافتههای مربوط به بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر وزن بیضه موشهاجهت بررسی تأثیر داروی بوسولفان و اثر حفاظتی عصارهی هیدروالکلی سنجد بر وزن بیضه موشها از روش آماری تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) به همراه آزمون پیگیری LSD استفاده شد. در جدول 3-6 میانگین و خطای معیار میانگین () وزن بیضه موشها در گروههای مختلف ارائه شده است. نتایج نشان میدهند که بین میانگین وزن بیضه موشها در گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15)، تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15) نسبت به گروه کنترل تفاوت معناداری مشاهده میگردد. همچنین نتایج نشان میدهند که بین گروه تجربی1 (عصاره هیدروالکلی سنجد) با گروههای تجربی2 (بوسولفان mg/kgBW5)، تجربی3 (بوسولفان mg/kgBW15)، تجربی4 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW5) و تجربی5 (عصاره هیدروالکلی سنجد+بوسولفان mg/kgBW15)، تفاوت معناداری مشاهده میگردد.

–219

اهداف و انگیزه........................................................................................................................................5
1-1.گیاه کرفس...7
1-1-1. نام های گیاه...7
1-1-2. آثار فارماکولوژیکی......................................................................................................................8
1-1-3. ریخت شناسی............................................................................................................................8
1-1-4. ترکیبات شیمیایی.......................................................................................................................8
1-1-5. ترکیبات آنتی اکسیدان................................................................................................................9
1-1-6. دلایل استفاده از گیاه به عنوان منابع آنتی اکسیدان.....................................................................9
1-1-7. اعمال مهم آنتی اکسیدان ها10
1-1-8. آنزیم های آنتی اکسیدان.10
1-1-8-1.سوپراکسید دیسموتاز (SOD)10
1-1-8-2.کاتالاز11
1-1-8-3.گلوتاتیون پراکسیداز(GSH)11
1-1-9. پلی فنول12
1-1-9-1-گروه های اصلی ترکیبات فنولی13
1-1-10. فلاونوئیدها13
1-1-10-1.خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها13
1-1-10-2. شیمی گیاه فلاونوئیدها15
1-1-10-3. آپیژنین16
1-1-10-4. فلاوونوئید ها معمولا به روش های زیر عمل می کنند16
1-1-10-5. فارماکودینامی فلاونوئیدها17
1-1-10-6. جهش زایی و سمیّت ژنی مصرف زیاد فلاونوئیدها17
1-1-11. رادیکال های آزاد18
1-1-11-1. استرس اکسیداتیو18
1-1-11-2. واکنش های رادیکال های آزاد20
1-1-11-3. تقسیم بندی انواع رادیکال های آزاد21
1-1-11-4. انواع گونه های رادیکالی اکسیژن و نیتروژن22
1-1-11-5. روش های مختلف تولید گونه های اکسیژن و نیتروژن22
1-1-11-6. اثر رادیکال های آزاد بر روی چربی ها23
1-1-11-7. سیستم های مقابله با آسیب رادیکال های آزاد23
1-2. کبد24
1-2-1. ساختمان کبد24
1-2-2. تشریح و آناتومی کبد25
1-2-3. بافت شناسی کبد27
1-2-4. سلول های کبدی27
1-2-5. نقش سیستم لنفاوی در عملکرد کبد30
1-2-6. ترمیم بافت در کبد افراد بزرگسال31
1-2-7. اعمال ترشّحی و دفع کبد31
1-2-7-1. متابولیسم و دفع گزنوبیوتیک ها32
1-2-8. متابولیسم کربوهیدرات ها33
1-2-9. متابولیسم لیپید ها34
1-2-10. اختلال هموستاز در بیماری های کبدی35
1-2-10-1. آنزیم های رها شده از بافت کبدی بیمار36
1-2-10-2. ویژگی بافتی37
1-2-10-3. توزیع داخل سلولی آنزیم ها38
1-2-10-4. فعایت نسبی در کبد و پلاسما38
1-2-10-4. مکانیسم آزاد سازی39
1-2-10-5. سرعت پاکسازی آنزیم ها از پلاسما40
1-2-11. انواع بیماری های کبد40
1-2-11-1. مکانیسم ها و الگو های آسیب41
1-2-12. آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) (GPT) (SGPT) (ALAT)42
1-2-13. آنزیم آسپارات آمینوترانسفراز (AST)43
1-2-14. آنزیم الکالین فسفاتاز (ALP)44
1-2-15. پروتئین تام46
1-2-15-1. میزان پروتئین های خون46
1-2-16. اندازه گیری آلبومین پلاسما48
1-2-17. بیلی روبین پلاسما48
1-2-17-1. بیلی روبین و انواع آن49
1-2-18. وظایف عملی پروتئین های پلاسما49
1-2-19. ساخت پروتئین های پلاسما50
1-2-20. ازت اوره خون51
1-2-21. کراتینین51
1-3. تتراکلرید کربن و سمّیت آن53
1-3-1. مکانیسم ها ی فعال سازی متابولیکی تتراکلرید کربن54
1-3-2. پراکسیداسیون چربی ها56
1-3-3. نقص در ساخت پروتئین57
1-3-4. به هم خوردن تعادل کلسیم57
فصل دوم: مواد و روش ها
2-1. دستگاه‌ها و لوازم و تجهیزات مورد استفاده60
2-2. ترکیبات شیمیایی و مواد مصرفی61
2-3.دستگاه پرکولاتور...........................................................................................................................62
2-4. روش تهیه عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس63
2-5. حیوانات مورد استفاده و نحوه ‌نگهداری آنها65
2-6. گروه بندی حیوانات66
2-7. روش دادن عصاره68
2-8. روش تجویز دارو68
2-9. خونگیری از قلب 69
2-10. روش تعیین فعالیت آنزیم آسپارتات آمنیوترانسفراز (AST/GOT) و آنزیم الانین آمینوترانسفراز (GPT/ALT)70
2-11. روش تعیین فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز (ALP)71
2-12. روش تعیین میزان ‌ آلبومین و بیلی روبین در سرم خون71
2-12. روشهای تجزیه و تحلیل آماری73
فصل سوم: نتایج
3-1. نتایج مربوط به غلظت آنزیم AST در گروه های آزمایشی75
3-2. نتایج مربوط به غلظت آنزیم ALT در گروه های آزمایشی78
3-3. نتایج مربوط به غلظت آلکالین فسفاتاز در گروه های آزمایشی82
3-4. نتایج مربوط به غلظت آلبومین در گروه های آزمایشی85
3-5. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین توتال (T.Billi) در گروه های آزمایشی88
3-6. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین مستقیم (D.Billi) در گروه های آزمایشی91
3-7. مقایسه نتایج مربوط به وزن موشهای صحرایی در پایان آزمایش در گروه های آزمایشی93
فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری
4-1. بحث98
4-2. نتیجه گیری107
4-3.پیشنهادات108
فهرست منابع
منابع فارسی110
منابع لاتین...........................................................................................................................................112
Abstract122
فهرست جداول
عنوان صفحه جدول2 -1: گروه بندی نمونه ها بر اساس مصرف عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس و تتراکلرید کربن66
جدول 3-1 مقایسه میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد...............................................76
جدول 3-2: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز77
جدول 3-3 : مقایسه میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد............................................79
جدول3-4: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصارههیدروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آلانین آمینوترانسفراز80
جدول 3-5: مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز در گروه کنترل و شاهد..............................82
جدول 3-6: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز.....83
جدول 3-7: مقایسه میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد....................................................85
جدول 3-8: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آلبومین86
جدول 3-9: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین توتال در گروه کنترل و شاهد......................................88
جدول3-10: اثر تزریق درن صفاقی(IP) عصاره هیدروالکی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت بیلی روبین توتال89
جدول 3-11: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم در گروه کنترل و شاهد................................91
جدول3-12: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان بیلی روبین مستقیم92
جدول 3-13: مقایسه میانگین وزن موش های صحرایی در گروه کنترل و شاهد.................................94
جدول3-14: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان وزن95
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار (3-1): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد..............................76
نمودار (3-2): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST....................................................................78
نمودار(3-3): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد...............................80
نمودار (3-4): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT................................................................81
نمودار(3-5): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALP در گروه کنترل و شاهد............................83
نمودار (3-6): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلکالین فسفاتاز...............................................................84
نمودار(3-7): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد.......................................86
نمودار (3-8): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین...........................................................................87
نمودار(3-9): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال در گروه کنترل و شاهد......................89
نمودار (3-10): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال.........................................................90
نمودار(3-11): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم در گروه کنترل و شاهد.................92
نمودار (3-12): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم.......................................................93
نمودار(3-13): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی در گروه کنترل و شاهد.................95
نمودار (3-14): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی در پایان آزمایش.............................96
فهرست شکل ها
عنوان صفحه شکل (1-1): گیاه کرفس........................................................................................................................7
شکل (1-2-): ساختار فلاونوئیدها........................................................................................................16
شکل (1-3-): آسیب بافتی توسط رادیکال ها.......................................................................................21
شکل (1-4): ساختمان هپاتوسیت ها و سلول های کبدی.....................................................................29
شکل (1-5): کبد اندامی است که متابولیسم کربوهیدرات را انجام می دهد..........................................34
شکل (1-6): متابولیسم لیپیدها...............................................................................................................35
شکل(2-1):دستگاه پرکولاتور.................................................................................................................63
شکل (2-2): نحوه عصاره گیری............................................................................................................64
شکل (2-3): تصویر قفس های نگهداری مو.........................................................................................65
شکل (2-4): طرز گاواژ.........................................................................................................................67
شکل (2-5): نحوه تزریق تتراکلریدکربن و روغن زیتون.......................................................................69
بررسی اثرات محافظت کبدی گیاه کرفس بر سمیّت القا شده توسط تترا کلریدکربن در موش های سفید بزرگ آزمایشگاهی نر نژاد اسپراگوداولی
به وسیله: زهرا طالبان پور بیات
چکیده:
مشکلات استفاده از داروهای شیمیایی و آثار بجامانده از عوارض جانبی بعضی از داروها منجر به فزونی استفاده از گیاهان دارویی شده است. یافتن دارویی موثر در درمان این اختلالات مورد توجه محققین و پزشکان می باشد. گیاه کرفس (Apium graveolens) از خانوادهApiaceae) ) است که در ایران از این گیاه استفاده غذایی می نمایند و بر این باورند که خواص دارویی مفیدی نیز دارد. لذا این مطالعه با هدف بررسی اثرات محافظت کبدی گیاه کرفس بر مسمومیت القایی ناشی از مصرف تتراکلریدکربن (CCl4) درموش های سفید بزرگ آزمایشگاهی نر از نژاد اسپیراگوداولی انجام شد. بنابراین تعداد 40 سر موش به تعداد مساوی به پنج گروه هشت تایی تقسیم شدند. یک گروه به عنوان کنترل و در چهار گروه دیگر توسط CCl4 سمیت کبدی (هپاتوتوکسیک) ایجاد شد. از این چهار گروه، یک گروه به عنوان شاهد و در سه گروه دیگر روزانه به ترتیب 200، 400 و 600 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن حیوان از عصاره هیدروالکلی کرفس به صورت دهانی (گاواژ) داده شد. چهل روز بعد از شروع مطالعه در کلیه گروه ها آنزیم های آلانین آمینوترانسفراز (ALT)، آسپارتات امینوترانسفراز (AST) و آلکالین فسفاتاز (ALP) و همچنین غلظت های سرمی آلبومین، بیلی روبین توتال و مستقیم که از شاخص های آسیب های کبدی هستند اندازه گیری و با استفاده از آزمون آماری ANOVA و T-testتجزیه و تحلیل گردید. تزریق درون صفاقی تتراکلریدکربن باعث افزایش فعالیت های AST ,ALT ,ALP و کاهش غلظت آلبومین و افزایش غلظت بیلی روبین توتال و مستقیم در مقایسه باگروه کنترل شد. مصرف عصاره گیاه کرفس سبب گردید این فاکتور به طور معنی داری(05/0P≤) به وضعیت نرمال نزدیک شود. نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس در برابر آسیب های کبدی ایجاد شده توسط تتراکلریدکربن دارای اثرات محافظتی است، که احتمالاً بواسطه اثر آنتی اکسیدانی ترکیبات پلی فنلی آن در مهار فعالیّت CCl4 و در نتیجه مهار فعالیّت سیتوکروم P450 و اثر خنثی کنندگی رادیکال های آزاد می باشد.
کلید واژه ها: محافظت کبدی، کرفس، تتراکلریدکربن، آنتی اکسیدان، فلاونوئید.
مقدمه
کبد بزرگترین اندام بدن است که حدود3-5 درصد توده بدن را تشکیل می دهد. یکی از مهم ترین اعمال کبد علاوه بر سوخت و ساز مواد مختلف، سم زدایی مواد آلوده کننده محیطی و داروهای شیمیایی می باشد. در اکثر موارد در طی عمل سم زدایی، فعال سازی متابولیکی توسط آنزیم های سیتوکروم P450 میکروزوم های کبدی باعث ایجاد متابولیت های سمی و فعال می شود که این می تواند موجب آسیب بافت های مختلف از جمله کبد شود. تیواستامید، تتراکلریدکربن، اتانول و استامینوفن از جمله موادی هستند که بعد از ورود به بدن توسط آنزیم های سیستم سم زدایی سیتوکروم P450 متابولیزه می شود (93). اما با توجه به عوارض جانبی داروهای شیمیایی بر روی بعضی از بافت های بدن به خصوص کبد، مسئله بازگشت به استفاده از داروهای گیاهی و طبیعی مد نظر قرار گرفته است.
در این تحقیق از عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس Apium graveolens)) که در طب سنتی از این گیاه برای درمان برخی اختلالات مانند: رماتیسم، سرماخوردگی، سرفه، فشار خون، چربی خون و دل درد استفاده میشود. مطالعات آزمایشگاهی انجام شده روی این گیاه نشان داد که این گیاه دارای خواص فیبر ینولیتیک، ضد درد، ضد التهاب، ضد اضطراب، خواب آور و پایین آورنده قند خون است. همچنین مشخص شده است که این گیاه اثرات آنتی اکسیدانی و آرام بخشی دارد، و از تشکیل پلاک های چربی در رگها جلوگیری می کند. مطالعه حاضر به منظور بررسی اثر محافظت کبدی گیاه کرفس انجام شده است (20).
775970447675فصل اول:
کلیات
00فصل اول:
کلیات

اهداف وانگیزه:
از ابتدای تاریخ و حتی پیش از آن منبع اصلی درمان بیماران، گیاهان دارویی بوده است. پیشرفت علم شیمی و ساخت داروهای شیمیایی در قرن اخیر و دوران معاصر، موجب شد برای مدتی پزشکان وبیماران، از این منابع دور شوند. بخاطر عوارض جانبی زیاد داروهای شیمیایی، استقبال مجدد مردم و پزشکان به گیاهان دارویی در سال های اخیر را موجب شده است. مصرف میوه و سبزی همراه با کاهش ابتلا به سرطان می باشد که توسط بلوک و همکاران با انجام 200 مطالعه به اثبات رسید و در 82 درصد از مطالعات آن ها اثر حفاظتی میوه و سبزی از ارگان های بدن به خوبی روشن شده است. همچنین در مطالعه دیگری مشخص شده که ارتباط تنگاتنگی بین مصرف میوه و سبزی و کاهش ابتلا به بیماری های قلبی، عروقی، دیابت، پیری و سرطان وجود دارد (42و65).
بر همین اساس استفاده از گیاهان دارویی پیوسته مورد توجه بوده است و از آنجایی که کبد یکی از ارگان های کلیدی در اعمال متابولیکی و ترشحی است و باید مخلوط مناسبی را از گردش خون برای تمام اعضاء فراهم سازد و همچنین خارج کردن تمام سموم از بدن نیز بر عهده کبد می باشد، همواره با مواد سمی و متابولیت های فراوانی مواجه هست و اختلالاتی که در کبد ممکن است پیش آید فراوان و متنوع است و در حال حاضر، تعداد داروهای شیمیایی که برای درمان اختلالات کبدی استفاده می شوند بسیار کم هستند که عوارض زیادی نیز از خود برجای می گذارند. لذا این موضوع بر اهمیت استفاده از گیاهان دارویی در درمان کبد می افزاید (20). یکی از مهمترین منابع آنتی اکسیدان های طبیعی، ترکیبات فنلی موجود درگیاهان می باشند. ترکیبات فنلی یا پلی فنلی که به طور گسترده در گیاهان وجود دارند، بالغ بر 8000 نوع گزارش شده است (31و38).این ترکیبات دارای خاصیت ضد اکسیدانی، ضد التهابی، ضد ترومبوز، ضد میکروبی، ضد آلرژی و دارای پتانسیل محافظت قلبی و گشاد کنندگی عروق می باشند(31، 34، 89).
از آن جایی که در کشورمان عوامل دارویی محافظت کننده کبدی کمتری در دسترس بوده و از طرفی بیمار‌های کبدی ناشی از عواملی همچون هپاتیت ویروسی و داروها تا حدی شایع است، لازم است داروهای گیاهی موجود در کشور که به طریق سنتی برای این موارد مصرف می شوند بررسی گردند . با توجه به شواهدی که وجود دارد چه از نظر طب عامه وچه از نظر مقالات علمی در این زمینه، گیاه کرفس به عنوان تنظیم کننده ومقوی کبد ی در نظر گرفته شده است (20). لذا این گیاه برای بررسی اثرات حفاظتی روی کبد انتخاب شده است (19).
اثرات آنتی اکسیدانی عصاره بسیاری از گیاهان از جمله خارمریم، کاسنی، شیرین بیان، همیشه بهارئ، شاتره و برگ بامبو اثبات شده است (33، 44،55). برخی عصاره های خام گیاهی مورد استفاده در طب سنتی، منبعی غنی از ترکیباتی با خواص پیشگیری کننده و حفاطت کننده، به ویژه در کبد هستند (43و56). Hinneburg و همکاران در سال 2006 فعالت آنتی اکسیدانی برخی از سبزی ها و ادویه ها (ریحان، برگ بو، جعفری، سرو کوهی، تخم بادیان، رازیانه، زیره سبز، هل و زنجبیل) را بررسی کردند و گزارش نمودند که عصاره ریحان قدرت آنتی اکسیدانی قابل مقایسه تورولوکس (معادل ویتامین E) دارد (55). این نتایج را می توان به گیاه کرفس نیز تعمیم دارد، زیرا خواص آنتی اکسیدانی وآنتی باکتریال آن گزارش شده است (29).
1-1-گیاه کرفس
میوه رسیده خشک شده گیاه Apium graveolens L. از خانواده چتریان (Apiaceae ) است که حداقل دارای 2در صد اسانس می باشد (9).
1-1-1-نام های گیاه
لاتین: Apium graveolens
فارسی: کرفس
عربی: کرفس نیطی
انگلیسی:Celery,marsh parsley آلمانی: Echter Sellerie فرانسه:Celeri, Ache, Ache des marais

شکل1-1: گیاه کرفس (9).
3
1-1-2-آثار فارماکولوژیکی
اسانس گیاه ضد اسپاسم، بادشکن، خواب آور، محرک و مقوی است. ریشه در شربت برای سفتی کبد و طحال کاربرد دارد. افشره به شکل های مختلف تهیه می شود و برای سرطان های بدون زخم، سختی کبد و طحال، توده های پستان، تومورهای چشم و معده، تومورهای سرد و سرطان های توام با زخم کاربرد دارد. گیاه برای آثار قاعده آوری، سقط آوری، کاهنده قند خون و افت فشار خون مورد استفاده قرار می گیرد (20).
1-1-3-ریخت شناسی
گیاهApium graveolens ، گیاهی است دو ساله، به ارتفاع تا 100 سانتی متر با رایحه ای قوی و شاخص و ساقه گوشتی و توپر. برگ ها یک یا دو بار شانه ای؛ قطعات برگ ها 5 تا 50 میلی متر، مثلثی، لوزی یا سر نیزه ای در حاشیه لب دار و دندان ارهای یا دال بر. چتر ها با پایه ای کوتاه یا بدون پایه و غالبا قرار گرفته در برابر یک برگ تعداد انشعابات چتر 4 تا 12 عدد بدون برگک و یا برگچه و میوه 5/1 تا 2 میلی متر و تخم مرغی پهن می باشد (9).
1-1-4-ترکیبات شیمیایی
از نظر ترکیبات شیمیایی کرفس طبق بررسی های دانشمندان شیمی و آزمایشگاه ها دارای کمی اسانس روغنی فرّار و آپیئین است. میوه آن در حدود 3-2 درصد اسانس زرد رنگ مایل به سفید دارد که شامل دی-لیمونن 60، دی سلینن و 3-5/2 درصد سدانولید و 5/0 درصد از سدانوئیک اسید انیدرید می باشد. به علاوه در تخم آن در حدود 10 درصد مواد غیر محلول وجود دارد (9).
از جمله ترکیبات موجود در گیاه کرفس فلاونوئیدهایی از جمله آپیجنین7- o- آپیوسیلگلوکوزید و لوتئولین 7- o- آپیوسیلگلوکوزید می باشد(22).
1-1- 5-ترکیبات آنتی اکسیدان
ترکیباتی که قادر هستند در مقادیر کم نسبت به مقدار سوبسترا، از اکسیداسیون سوبسترا جلو گیری کنند و یا آن را به تأخیر بیاندازند. مانع اثر مخرب رادیکال های آزاد می شوند و نقش مهمی در محافظت بدن انسان ایفا می کنند (81). فلاونوئیدهای موجود در گیاهان از جمله فلاونوئید آپیژنین و لوتئولین موجود در کرفس جزء منابع آنتی اکسیدانی این گیاه می باشند. این ترکیبات می توانند هم در پیشگیری و هم در درمان بیماری‌های حاصل از آسیب‌های مواد اکسیدان استفاده شوند (104و105).
1-1-6-دلایل استفاده از گیاه به عنوان منابع آنتی اکسیدان
گیاهان در معرض میزان زیادی از اکسیژن قرار دارند و بنابراین سرشار از سیستم های آنتی اکسیدان هستند. همچنین گیاهان محدوده وسیعی از ضد اکسیدان ها را برای انسان ها فراهم می کنند. همچنین رژیم های غنی از گیاهان همراه با کاهش خطر بیماری های وابسته به سن مانند انواع سرطان ها، دیابت، آترواسکلروز و فراموشی می باشد و در صورتی که مردم کشورهای پیشرفته میوه و سبزی بخورند سلامتی بیشتری خواهند داشت (55(.
1-1-7-اعمال مهم آنتی اکسیدان ها
باند شدن با کاتالیزورهای فلزی
تجزیه کردن پراکسیدها
کاهش غلظت اکسیژن موضعی
جلوگیری از آغاز واکنش های زنجیره ای
شکستن زنجیره واکنش با هدف جلوگیری از جداشدن هیدروژن توسط رادیکال های فعال(22و51).
1-1-8-آنزیم های آنتی اکسیدان
1-1-8-1-سوپراکسید دیسموتاز (SOD)
سوپراکسید دیسموتاز، رادیکال آنیون سوپر اکسید (O2-) را به پراکسید هیدروژن و اکسیژن مولکولی تبدیل می کند، در سلول دو فرمSOD وجود دارد: یک نوع آنزیم حاوی فلزات مس/ روی می باشد که در سیتوزول یافت می شود. نوع دیگر که دارای منگنز می باشد که در میتوکندری قرار دارد (1و45).
1166495144780002O2 - + 2H+ H2 O2 + O2
در بسیاری از واکنش های بیولوژیک که اکسیژن احیاء می شود، رادیکال های سوپراکسید تولید می شوند (85).

1-1-8-2-کاتالاز
کاتالاز آنزیمی است که واکنش تبدیل هیدروژن پراکسید به آب و مولکول اکسیژن را کاتالیز کرده و با این عمل سم زدایی H2O2 را انجام می دهد. کاتالاز آنزیمی است که در اکثر سلول های هوازی وجود دارد و دارای تنوع زیادی است. این آنزیم در بسیاری از سلول های گیاهی و حیوانی، در غشا جداکننده ارگانل‌هایی به نام پراکسی زوم ها، وجود دارد. در بافت های انسانی، غلظت بسیار بالایی از این آنزیم در کبد و اریتروسیت ها و به میزان کمتر، در مغز، قلب و عضلات اسکلتی وجود دارد (85).
1-1-8-3-گلوتاتیون پراکسیداز((GSH
ترکیب تیولی غیر پروتئینی است، این آنزیم قادر است احیاء H2O2 را کاتالیز کند:
128143012954000H2O2 +2 GSH 2H2O + GSSG
این آنزیم علاوه بر ایفای نقش کاتالیزوری در واکنش احیای H2O2، دارای نقش مهم تری در ارتباط با احیای لیپید هیدروکسی پراکسید و تبدیل آن به الکل می باشد . گلوتاتیون به دو حالت احیا (GSH) و فرم اکسید شده (GSSG) وجود دارد. سیستم احیاء گلوتاتیون پراکسیداز بزرگترین مکانسیم دفاعی بر علیه ROS است و در اثر فقدان یا کمبود این آنزیم، سطح پراکسید ها و اکسید ها در سرم بالا می رود (83). بنابراین عملکرد بیولوژیکی آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز به این صورت است که می تواند سیستم بیولوژیکی را از اثرات مخرب رادیکال های مشتق از اکسیژن، با کاتالیز کردن احیا هیدروژن پراکسید حفظ کند (83) .
1-1-9-پلی فنول
پلی فنول‌ها متابولیت‌های ثانویه گیاهان هستند که به عنوان فیتوآلکسین، ضد حشره، جذب کننده گرده، رنگ گیاه، ضد اکسیدان و محافظت کننده در برابر نور UV عمل می کنند. این گستره فعالیت زیستی باعث می شود که این ترکیبات در تکثیر و رنگ گیاه و محافظت بر علیه پاتوژن‌ها نقش مهمی داشته باشند (71و85).
پلی فنول‌ها فراوانترین آنتی اکسیدانت رژیم غذایی هستند (57). پلی فنول‌ها به عنوان ضد اکسیدان، ریسک بیماری ناشی از استرس‌های اکسیداتیو را کاهش می‌دهند (85). مطالعات تجربی نقش پلی فنول ها را در جلوگیری از بیماری های قلبی-عروقی، سرطان، دیابت و بیماری های تخریبی عصب را اثبات کرده است (87). تحقیقات نشان داده است مصرف فلاوونوئید به میزان زیاد، مرگ و میر ناشی از بیماری های عروق کرونر را بیش از 65% کاهش می دهد و همچنین ریسک سکته سرطان ریه، آسم، و بیمار های انسداد ریوی را کاهش می دهد (21).
1-1-9-1-گروه های اصلی ترکیبات فنولی
پلی فنول‌ها بر اساس تعداد حلقه فنولی و استخلاف‌هایی که به این حلقه ها متصل می شوند به چندین دسته تقسیم می شوند. گروه های اصلی شامل فلاونوئید، فنولیک اسید، تانن، لیگنان و استیلبن است (87).
1-1-10-فلاونوئیدها
1-1-10-1خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها
فلاونوئیدها خانوادهای از آنتیاکسیدان هایی هستند که در میوه ها و سبزیجات ونیز نوشیدنیهایی مانند چای یافت میشوند هرچند فواید فیزیولوژیکی فلاونوئیدها به مقدار زیادی متوجه خواص آنتی اکسیدانی آن ها بر پلاسما شده است، فلاونوئیدها ممکن است سلول ها را از خطرهای گوناگونی محافظت کنند (7و21). همراهی طولانی فلاونوئیدهای گیاهی با گونههای مختلف حیوانات و سایر موجودات زنده طی تکامل، ممکن است عامل طیف وسیعی از فعالیتهای بیوشیمیایی و داروشناسی این ترکیبات شیمیایی در پستانداران و سایر سیستمهای زیستی باشد. مثالهای شاخص عبارتند از:
مهار اتصال غشاء گامت طی باروری تخم بوسیله کوئرستین در جوجه تیغی دریایی
تنظیم حرکت اسپرم پستانداران بوسیله کوئرستین
تاثیر بر تمایز جنسی
بیش از 40000 فلاونوئید منحصر به فرد از نظر ساختاری در منابع گیاهی شناسایی شدند (21). فلاونوئیدها نیز دارای قوی ترین قدرت آنتی اکسیدانی در بین ترکیبات فنلی می باشند که این خاصیت نیر تحت تاثیر نوع هیدروکسیلاسیون (قرار گرفتن عوامل هیدروکسیل در موقعیت های ارتو، پارا، متا ) می باشد، همچنین قرار گرفتن ترکیبات قندی بر روی ساختار فلاونوئید ها می تواند باعث افزایش قدرت آنتی اکسیدانی آن ها شود (50).
فلاونوئیدها، ترکیباتی با وزن مولکولی کماند که در تمام گیاهان آوندی یافت میشوند، فنیل بنزو-پیرونها (فنیل کرومون ها) با ردهبندی ساختاری بر اساس هستههای سه حلقهای عادی هستند. بر اساس استخلافشان به فلاوا نولها، آنتوسیانیدینها، فلاون ها، فلاوانونها و چالکونها تقسیم بندی می شوند. مدت هاست که فلاونوئیدها به دلیل دارا بودن فعالیت های ضد التهابی، آنتی اکسیدانی، ضدحساسیت، محافظتکنندگی کبد، ضد لخته، ضد ویروس و ضد سرطانی شناخته شده است (9و21).
1-1-10-2-شیمی گیاه فلاونوئیدها
فلاونوئیدها در قلمرو گیاه بسیار عمومی و گسترده هستند. آنها نقش رنگدانه های گیاهی را دارند، مسئول رنگ گل ها و میوه ها می باشند. لغت فلاونوئید از لغت لاتین flavus به معنای زرد مشتق شده است و بسیاری از فلاونوئیدها دارای رنگ زرد هستند (22).
فلاونوئید ها از یک حلقه بنزنی متصل به ساختمان بنزو گاما پیرون تشکیل می شود. آنها از 3 واحد استات و یک واحد فنیل پروپان ساخته شده اند (22).
تقریباً 500 فلاونوئید به صورت آگلیکون آزاد و بقیه به صورت o یا c گلیکوزید وجود دارند. گلیکوزیدهای فلاونوئیدی معمولاً محلول در آب هستند.3گروه اصلی از آن ها بر طریق اکسیژناسیون در محل کربن 3 طبقه بندی شده اند، عبارتند از: فلاون ها، فلاونول ها و فلاونون ها (شکل1-2) (22).

شکل (1-2) ساختار فلاونوئیدها (22).
1-1-10-3-آپیژنین
یک فلاونوئید آنتی اکسیدان طبیعی است که در الکل گرم وهیدروکسیدپتاسیم رقیق حل می شود ولی در
آب غیرمحلول است (87). آپیژنین به صورت کریستال های جامد زرد رنگ است که در برگها وساقه های گیاهان آوندی وجود دارد و دارای خواص ضدالتهابی، ضداسپاسمی، ضدتوموری، ضدسرطان وآنتی اکسیدانی است .به آپیژنین -Trihydroxy Flavone 7و5 و4 می گویند (87).
1-1-10-4-فلاوونوئید ها معمولا به روش های زیر عمل می کنند
1-فعال کردن آنزیم های آنتی اکسیدان
2-بازدارندگی اکسیداز
3-کاهش رادیکال های α-توکوفرول
4-پاکسازی مستقیم رادیکال های آزاد اکسیژن
5-شلات کردن فلزات
6-کاهش استرس های اکسیداتیو ایجاد شده توسط نیتریک اکسیداز
7-افزایش ظرفیت ضد اکسیدانی، ضد اکسیدان های با وزن مولکولی کم (32).
1-1-10-5-فارماکودینامی فلاونوئیدها
پروتئین کیناز C (PKC) آنزیم همه جا حاضر وابسته بهca+2 و فسفولیپید چند کاره فسفوریله کننده سرین و ترئونین، در طیف وسیعی از فعالیتهای سلولی شرکت دارد که شامل پیشرفت تومور، میتوژنز، فرآیندهای ترشحی، عمل ضد التهاب سلول و عملکرد لنفوسیت T می باشد. نشان داده شده PKC در شرایط برون تنی به وسیله برخی فلاونوئید ها مهار می شود (21).
1-1-10-6-جهش زایی و سمیّت ژنی مصرف زیاد فلاونوئیدها
فلاونوئیدهای گیاهی مشتقات دی فنیل پروپان هستند که طیف وسیعی از آثار بیوشیمیایی و دارویی رانشان می دهند. خواص آنتی اکسیدانی، اثر توقف سلولی در تومورزایی و توانایی آن ها در مهار طیف وسیعی از آنزیم ها نظیر پروتئین کیناز c، تیروزین پروتئین کیناز و توپوایزومراز 2، منجر به هدایت محققان جهت در نظر گرفتن این ترکیبات به عنوان ترکیبات ضد سرطان زا و محافظ قلب شده است (21).
علی رغم آثار سودمند ظاهری فلاونوئیدها بر سلامت، مطالعات متعدد جهش زایی و سمیّت ژنی آن ها را در پستانداران مشخص کرده است و ممکن است حاصل فعالیت آن ها به عنوان پیش اکسیدان در تولید رادیکال های آزاد که DNA را تخریب می کنند یا مهار آنزیم های مربوط به DNA مانند توپوایزومراز باشد. تخریب DNA اکسیداتیو تصحیح نشده و یا درست تصحیح نشده می تواند منجر به شکست های رشته DNA و جهش شود که ممکن است باعث آسیب های پیش نئوپلاستی غیرقابل برگشت شود. به علاوه، مصرف زیاد این ترکیبات ممکن است آثار حذفی دیگر را در نتیجه خواص داروشناسی متفاوت آن ها فعال کند که ممکن است متابولیسم دارو و اسید آمینه را تغییر دهد، فعالیت سم های ژنی محیطی را تعدیل کند و فعالیت دیگر آنزیم های متابولیز کننده کلیدی را تغییر دهد. هرچند شواهد زیادی وجود دارد که رژیم غذایی غنی از فلاونوئید ممکن است سلامت را پیش ببرد وحفاظت علیه بیماری های وابسته به سن ایجاد کند، در ارتباط با حالات و مقدار مصرف لازم فلاونوئید جهت ایجاد خطر بالقوه برای سلامت اطمینان وجود دارد (21).
1-1-11-رادیکال های آزاد
1-1-11-1-استرس اکسیداتیو
رادیکال های آزاد و سایر (Ros) برای زندگی لازم هستند. چرا که در پیام رسانی سلولی شرکت می کنند و عمل فاگوسیتوزی آن ها جهت از بین بردن باکتری ها لازم است. به علاوه با توجه به عملکردهای لازم و کنترل شده، Ros در تمام موجودات هوازی نیز به عنوان پیامد تنفس میتوکندریایی که اکسیژن را در فرآیند تولید ATP از طریق همراه کردن انتقال الکترون و فسفریله کردن اکسیداتیو مصرف می کند، تولید می شود (21).
محصولات غیر ضروری ROS، یعنی اکسیداتیو می تواند به وسیله فاکتور های برون زاد نظیر داروها و سم های محیطی القا شود (23).
استرس اکسیداتیو به طور بلقوه برای سلول ها مضر بوده وROS در علت شناسی و پیشرفت بسیاری از فرآیند های بیماری مانند سرطان درگیر هستند. هرچند مکانیسم های اکسیداتیو که ROS را جمع آوری می کنند، به وسیله سیستم های آنزیمی اکسیداتیو با وزن مولکولی کم، اندام را از آثار مخرب استرس اکسیداتیو محافظت می کند. در شرایط طبیعی این سیستم های دفاعی آنتی اکسیدانی قادر هستند کهROS راسمیّت زدایی کنند و ماکرومولکول های سلولی و اندامک ها را از تخریب محافظت کنند. اگرچه تحت شرایط اکسیداتیوی بیش از حد، آنتی اکسیدان های سلولی کاهش می یابند وROS می تواند ترکیبات سلولی را تخریب و با فعالیت های بحرانی سلولی تداخل ایجاد کند (1و21).
زمانی که تعادل حیاتی بین نسل رادیکال آزاد و دفاع آنتی اکسیدانی نامطلوب شود. میتواند منجر به آسیب اکسیداتیو شود، این آسیب اکسیداتیو می تواند توسط سیستم های دفاعی endogenous مانند: کاتالاز، سوپراکسیددسموتاز، سیستم گلوتاتیون پراکسیداز، امّا این سیستم ها کاملاً کار آمد نیستند (21و48).
اگرچه پاتوژنز فیبروزیس کبدی کاملاً مشخص نشده است اما بدون شک نمونه های واکنشگر اکسیژن(Reactive Oxygen Species=ROS) نقش مهمی در تغیرات پاتولوژی کبد دارند (48).
آسیب اکسیداتیو فرضیه ارائه شده است به ایفای نقش کلیدی در بیماری های قلبی و عروقی، شروع سرطان، تشکیل آب مروارید، روند پیری، بیماری های التهابی و انواع اختلالات عصبی (21و98).
1-1-11-2-واکنش های رادیکال های آزاد
واکنش های رادیکال های آزاد واکنش های زنجیره ای خود تکرار شونده اند. رادیکال های آزاد مولکول های شدیداً فعال اند که دارای یک الکترون منفرد می باشد. پایداری رادیکال های آزاد بسیار اندک است (12-10 تا 9-10 ثانیه). رادیکال های آزاد با سایر مولکول های واکنش داده و الکترون خود را به آن ها منتقل نموده و یا با کسب الکترون از آن ها به پایداری می رسند. در این روند رادیکال های آزاد جدید تشکیل می شوند شکل (1-3). تنها راه برای پایان بخشیدن به واکنش های زنجیری تولید رادیکال های آزاد، این است که دو رادیکال آزاد با یکدیگر واکنش دهند. در این واکنش الکترون های جفت نشده رادیکال های آزاد باهم جفت می شوند. لکن به دلیل غلظت بسیار کم رادیکال های آزاد و نیز نیمه عمر بسیار کوتاه آن ها، این واکنش بسیار به ندرت رخ می دهد. رادیکال های اکسیژن مخرب ترین رادیکال های موجود در سیستم زیستی هستند. سوپر اکسید (O20)، هیدروکسیل (OH0) و پروهیدروکسیل (O2H0) از جمله مهمترین رادیکال های اکسیژن هستند. رادیکال های آزاد را گاه فرم های فعال اکسیژن نیز می نامند. آسیب بافتی که توسط رادیکال های اکسیژن ایجاد می شود غالباً آسیب اکسیداتیو می نامند و فاکتور های که بدن را در مقابل آسیب های ناشی از رادیکال های اکسیژن محافظت می نماید آنتی اکسیدان نامیده می شود (23).

شکل (1-3): آسیب بافتی توسط رادیکال ها. تغییرات شیمیایی ایجاد شده در پروتئین ها با لیپیدهای موجود در لیپوپروتئین با چگالی کم (LDD) منجر به تشکیل LDL غیر طبیعی می شود (23).
1-1-11-3-تقسیم بندی انواع رادیکال های آزاد
رادیکال های آزاد نیتروژن دار
رادیکال های آزاد اکسیژن دار
رادیکال های آزاد کلردار
یون های فلزات واسطه
رادیکال های آزاد اکسیژن و نیتروژن دو گونه از مهم ترین رادیکال های آزاد هستند (15) .
1-1-11-4-انواع گونه های رادیکالی اکسیژن و نیتروژن
گونه‌های‌رادیکالی اکسیژن شامل سوپر اکسید (O20)، هیدروکسیل (OH0) و پروهیدروکسیل (O2H0) است (23). نیتریک اکسید (NO) و نیتروژن پراکسید (ONOO) دو رادیکال آزاد نیتروژن هستند (15و72).
1-1-11-5-روش های مختلف تولید گونه های اکسیژن و نیتروژن
در شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن با روش های مختلفی تولید می شوند شامل:
آلودگی محیط زیست
واکنش های ایمنی توسط ماکرو فاژ ها و نوتروفیل ها
واکنش های کاتالیز شده توسط فلزات
داروها
سیگار
لامپ های UV، اشعه گاما،X (30).
1-1-11-6-اثر رادیکال های آزاد بر روی چربی ها
اغلب چربی های موجود در بدن غیر اشباع هستند. در ساختمان این چربی ها باند دو گانه وجود دارد تا بتواند حالت سیال بودن غشا را حفظ کند. این اسید های چرب غیر اشباع، نسبت به حمله رادیکال های آزاد و پر اکسید شدن بسیار حساس هستند. این پر اکسیداسیون، با آسیب به چربی ها و پروتئین های غشا و فقدان آنتی اکسیدان ها همراه است (1).RO ،ROO، OHکه هر سه رادیکال های آزاد فعال هستند، می توانند اتم هیدروژن موجود در اسید های چرب غیر اشباع را به سوی خود جذب کنند. در نتیجه باند دو گانه از بین می رود و زنجیره اشباع می شود و کربنی که هیدروژن خود را از دست داده به صورت رادیکال آزاد در می آید. واکنش های پراکسیداسیون در چربی ها، یک واکنش زنجیره ای است که با تولید مداوم رادیکال های آزاد، زمینه تداوم پر اکسیداسیون را فراهم می کند (1). سلول ها مکانیسم های تدافعی آنتی اکسیدانی وسیعی را در مقابل آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد دارند. این مکانیسم ها شامل آنزیم هایی هستند که برای غیر فعال کردن پراکسیدها و برای نقل و انتقال الکترون ها وترکیبات دیگر، برای به دام انداختن رادیکال های آزاد به کار گرفته می شوند (23).
1-1-11-7-سیستم های مقابله با آسیب رادیکال های آزاد
سیستم های حفاظتی آنزیماتیک: شامل آنزیم های سوپر اکسید دیسموتاز،کاتالاز و گلوتاتیون پر اکسیداز می باشد.
سیستم های حفاظتی غیر آنزیماتیک: ویتامین های آنتی اکسیدان، آنتی اکسیدان های با وزن مولکولی پایین مثل گلوتاتیون، پروتین های که به مقدار کم در بدن وجو دارند و از عملکرد یون های آهن و مس جلوگیری می کنند مثل ترانسفرین (1).
1-2-کبد
1-2-1-ساختمان کبد
کبد ، بزرگترین غده بدن است، که در حدود 1800 گرم در مردان و1400 در زنان وزن دارد (2) و در زیر دیافراگم قرار دارد و در محل خود توسط لیگمان هایی به دیافراگم، پریتوئن، عروق بزرگ و احشاء گوارش فوقانی متصل شده است (18). کبد برای انجام اعمال خود دارای ذخایر زیادی است، و برای این که آثار درمانی اختلال اعمال آن ظاهر شود، باید سه چهارم پارانشیم بافت کبد از فعالیّت بازبماند (19).عروق خونی وابران روده وارد کبد می شود، و در نتیجه کبد تمامی مواد جذب شده در روده را دریافت می کند. عمل کبد شامل ذخیره مواد، خاصیت سم زدایی، ترشح، دفع، سنتز مواد و کنترل متابولیسم است. کبد عضوی که درآن مواد غذایی جذب شده در دستگاه گوارش، برای استفاده درسایرقسمت های بدن آماده می شود. بدین ترتیب این عضو حد واسطی میان دستگاه گوارش و خون است (8). کبد بهترین موقعیت را در سیستم گردش خون دارد تا متابولیت ها را جمع کرده، تغییر داده و انباشته کند و همچنین مواد سمی را خنثی و برداشت نماید تخلیه کبد از طریق صفرا صورت می گیرد (16،17،18).
1-2-2-تشریح و آناتومی کبد
پس از پوست، کبد بزرگترین عضو بدن و در عین حال بزرگ ترین غدّه بدن است (17). وزن کبد با سن نژاد، حالت مزاجی وحتی با جنس حیوان تفاوت می کند (16و17). شکل آن مانند نیمه طولی و مایل یک تخم مرغ است. غیر از قسمت کوچکی که منطقه برهنه نامیده می شود، سایر قسمت های سطح بیرونی آن از صفاق پوشیده شده است. این پوشش صفاقی کبد را از یک طرف به وسیله رباط داسی شکل به دیافراگم و دیواره جلویی شکم واز طرف دیگر به وسیله چادرینه کوچک به انحنای کوچک معده و دوازدهه وصل می کند. کبد علاوه بر پوشش صفاقی بوسیله کپسول همبندی نیز احاطه شده است.
کبد از طریق شکاف های موجود در خود به لب راست، لب چپ 16، لب دم دار17 و لب مربعی تقسیم می شود. گودی عمیقی که ناشی از فشار کلیه است، در لب راست دیده می شود. لب دم دار دارای دو زایده است. یکی بزرگتر بوده و به نام زایده دم دار و دیگری کوچک تر بوده، به نام زایده پاپیلاری معروف است (15و46). واحد های فعال و عملی کبد لوبول نامیده می شود. از کنار هم قرار گرفتن چند لوبول ناحیه ای حاصل می شود که به آن ناحیه باب می گویند (15،16،77).
کبد دارای دو سری عصب است: 1-اعصاب خودکار 2-اعصاب حسی که بطور عمده از عصب واگ وشبکه کبدی دستگاه عصبی سمپاتیک منشأ می گیرند (17،18،49).
خون رسانی کبد به دو طریق صورت می گیرد:
1-شریان کبدی خون حاوی اکسیژن را به کبد می آورد.
2-سیاهرگ باب مملو از مواد غذایی بوده و حدود 70 تا 80 در صد خون رسانی به کبد توسط این سیاهرگ انجام می گیرد (15و62).
مجاری کبد از دو مجرای چپ و راست شروع و از اتصال این دو مجرا، مجرای کبد مشترک حاصل می گردد، ودر ورود به کیسه صفرا به ان مجرای سیستیک می گویند، و زمانی که از کیسه صفرا خارج می شود، ایجاد مجرای صفراوی مشترک می کند، که از این طریق صفرا به فاصله 60 سانتیمتر باب المعده وارد دوازدهه می شود (84).
کبد توسط رباط حلقوی ، رباط برگی شکل، رباط مثلثی شکل راست و چپ، رباط تاجی و رباط کبدی کلیوی و به احشای مجاور و دیواره شکم متصل می باشد (84).
1-2-3-بافت شناسی کبد
کبد بزرگترین غده بدن است، و با کپسول ضخیمی از بافت همبند به نام گلیسون پوشیده شده است. این کپسول در ناحیه ناف کبد ضخیم تر می شود. این کپسول ورید باب و شریان کبدی و مجرای صفراوی مشترک را احاطه کرده، و این رگ ها و مجاری در تمامی مسیر خود در کبد توسط رشته های سلول های بافت همبند در بر گرفته شده است (3و49).


1-2-4-سلول های کبدی
سلول های کبدی چند وجهی هستند، یعنی دارای شش یا تعداد بیشتری سطحی باشند (97). سلول های کبدی را به دو دسته پارانشیمی و غیر پارانشیمی تقسیم می کنند. هر سلول پارانشیمی کبد دارای یک یا دو هسته گرد، و یک یا دوهستک مشخّص می باشد. منظور از سلول های پارانشیم همان هپاتوسیتهاست وسلول های غیر پارانشیمی شامل سایر سلول های کبدی می شوند که سلول های کوپفر و اندوتلیال هستند. هپاتوسیت ها 60 تا 65 درصد سلولی را تشکیل می دهند اما آنجا که اندازه آنها بزرگتر از سایر سلول هاست، 80 درصد حجم کبد را اشغال می کنند (96).
هپاتوسیت حاوی شبکه اندوپلاسمی فراوان، به هر دو صورت خشن و صاف می‌باشد. شبکه اندوپلاسمی خشن اجتماعاتی پراکنده در سیتوپلاسم تشکیل می‌دهد، که چندین پروتئین مثل آلبومین و فیبرینوژن خون در این جا ساخته می‌شود.گلیکوژن در شبکه اندوپلاسمی صاف انباشته می گردد، سلول‌های کبدی دارای تعداد زیادی میتوکندری به اشکال کروی و یا بیضوی است. تعداد میتوکندری‌ها در سلول محیطی لوبول در مقایسه با اطراف مرکز لوبول بیشتر است (84). لیزوزوم های هپاتوسیت در تغییر و تحوّل و تجزیه ارگان‌های داخلی سلولی حائز اهمیّت‌اند. این لیزوزوم‌ها نقش اساسی، در اندوسیتوز با واسطه گیرنده برای بسیاری از ماکرومولکول‌های قابل جذب دارند. پراکسیزم ها به مقدار فراوان در هپاتوسیت ها وجود دارند، که عمل آن ها در سلول های مذبور کماکان مورد تردید است (16). دستگاه گلژی در کبد بسیار زیاد است، و هر دستگاه گلژی شامل قنات های پهن، وزیکول های کوچک و واکوئل های وسیع است، که نزدیک کانالیکول های صفراوی قرار دارند.عمل این ارگان ها تشکیل لیزوزم ها، ترشّح پروتئین های پلاسما،گلیکو پروتئین ها مانند ترانسفرین و لیپوپروتئین ها با وزن ملکولی بسیار پایین می باشد (10و11).

شکل(1-4): ساختمان هپاتوسیت ها و سلول های کبدی (1).
هپاتوسیت ها سلول های بیش از حد پیچیده ای می باشند. کیسه صفرا معمولاً با دو هپاتوسیت پوشیده شده است و از طریق اتصالات محکمی از فضای پری سلولی جدا می شود. این اتصالات مانع از ترکیب محتویات درون کیسه صفرا و فضای پیش سلولی می گردند. صفرای درون کیسه ی صفرا به درون یک سری از مجاری ریخته می شود و در نهایت به نزدیکترین مجرای لوزالمعده در محل ورود به اثنی عشر وارد می شود. اسفنکتر واقع در اتصال میان مجرای صفراوی و اثنی عشر، اسفنکتر اودی، تا حّدی ترشح صفرا به درون اثنی عشر را تنطیم می کند. فضای پری سلولی، فضای میان دو هپاتوسیت، تا فضای پری سینوزوئیدی ادامه می یابد. لایه ای از سلول های اندوتلیالی سینوزوئیدی فضای پری سینوزوئیدی، که معمولاً فضای دیس نامیده می شود، را از سینوزوئید جدا می سازند (84 و92).
سلول های کوپفر در سینوزوئید های کبدی وجود دارند و بخشی از سیستم رتیکول اندوتلیال به حساب می آیند. این سیستم بخشی از سیستم ایمنی است و تا حّد زیادی در بدن گسترش می یابد و شامل سلول هایی است که قادر به جذب باکتری یا ذرّات کلوئیدی می باشد. این سلول ها ماکروفاژ های ساکن سیستم مونوسیت-ماکروفاژ هستند که نقش مهمی در جداسازی ذرّات بی مصرف از خون ایفا می کنند. آندوسیتوز مکانیسمی است که طی ان این مواد جدا می شوند (84).
1-2-5-نقش سیستم لنفاوی در عملکرد کبد
سیستم لنفاوی در سه ناحیه مهم وجود دارد:
در نزدیکی رگ های مرکزی
در نزدیکی رگ های باب
در طول سرخرگ کبدی
غلظت پروتئین در لنف کبد در بالاترین میزان و بزرگترین فضایی که توسط سیستم لنفاوی خشک می شود فضای پیش سینوزوئیدی می باشد (84).
1-2-6-ترمیم بافت در کبد افراد بزرگسال
از میان اندام های بدن، کبد بزرگسال تنها عضوی است که می تواند دوباره بازسازی شود. به نظر می رسد که تناسبی میان عملکرد کبد و بدن وجود داشته باشد. فاکتورهای رشد پپتیدی (TGF)، فاکتورهای رشد هپاتوسیت (HGF)، فاکتورهای رشد اپیدرمی (EGF) از مهم ترین عوامل محرک سنتز DNA هپاتوسیت می باشند. پس از این که این پپتید ها به گیرنده های موجود در هپاتوسیت های باقیمانده می پیوندند و کار خود را از طریق فاکتور های نسخه برداری آغاز می کنند و منجر به افزایش تعداد سلول و افزایش حجم کبد می گردد (84).
1-2-7-اعمال ترشّحی و دفع کبد
متابولیسم بسیاری از داروها توسط کبد انجام می شود.کلیّه سلول های کبدی به طور مداوم مقدار کمی ترشّح موسوم به صفرا تولید می کنند. صفرای تولید شده، از طریق مجاری یا مستقیماً به داخل دوازدهه تخلیه، یا به داخل کیسه صفرا هدایت می شود. داروها، سموم و مواد زیادی از طریق صفرا دفع می شوند وسپس به همراه مدفوع از بدن خارج می گردند (87). کبد در بسیاری از مسیر های متابولیک وتنظیم کننده، نقش اساسی دارد. برای مثال، نمود عملکردی این مجموعه، یعنی ساختار یکپارچه این عضو، شامل متابولیسم دارو ها (فعال کردن و سم زدایی) و دفع مواد برون زاد و درون زاد نظیر آمونیاک است (1).
1-2-7-1-متابولیسم و دفع گزنوبیوتیک ها
گزنوبیوتیک ها موادی هستند که توسط کبد پاکسازی و متابولیزه می شوند و بعضی از آن ها به عنوان تست های عملکردی کبد مورد استفاده قرار می گیرند. برای مثال، بعضی از مواد لیپوفیل نظیر 1) برم سولفوفتالئین (BSD )، 2) ایندوسیانین سبز (ICG)، 3) آمینوپرین، 4) کافئین، 5) لیدوکائین، 6) رز بنگال، به صورت دست نخورده، کنوژوگه، یا به هر دو شکل در صفرا دفع می شوند. پاکسازی این گزنوبیوتیک ها توسط کبد، در حالت عادی بسیارسریع است و تصور می شود که جذب آن ها توسط هپاتوسیت ها یک فرآیند انتقال فعال، با واسطه یک ناقل است. مقدار ناچیزی از آن ها (در صورت وجود) توسط سایر بافت ها پاکسازی می شود. دفع این مواد به داخل صفرا آهسته است. بنابراین، حذف این ترکیبات از جریان خون، به 1) جریان خون کبدی، 2) باز بودن مجاری صفراوی، 3) عملکرد پارانشیم کبدی بستگی دارد (1).
هپاتوسیت ها نقش مهمی در متابولیسم داروها و ترکیبات زینوبیوتیکی که در بدن بیگانه هستند ایفا می کنند. اغلب داروها و زینو بیوتیک ها همراه با خون به بدن انتقال می یابند. نهایتاً، کلیه ها مملو از این ذرات می گردند و داروها یا متابولیت های آن ها باید عوض شوند. بسیاری از داروها و متابولیت ها هیدروفوبیک بوده و کبد آن ها را به هیدروفیلی تبدیل می سازد (84).
محیط شیمیایی بسیار فعال کبد از نظر توانایی سمّیت زدایی بسیاری از داروها مانند سولفانامیدها، پنی سیلین، اریترومایسین یا دفع آن ها از طریق صفرا بسیار مناسب است (97و100).
به روش مشابهی چندین هورمون مختلف شامل تیروکسین و کلیه هورمون های استروئیدی از قبیل استروژن، آلدسترون، کورتیزول و غیره، یا دچار تغییر شکل شیمیایی شده ویا دفع می گردند. یکی از راه های عمده برای دفع کلسیم از خون، ترشح آن به داخل صفرا و از آن جا به داخل مدفوع است (19).
1-2-8-متابولیسم کربوهیدرات ها
گلیکوژن مهمترین کربوهیدرات ذخیره شده در کبد است که حدود 7 تا10 درصد از وزن معمولی کبد را تشکیل می دهند. مولکول گلیکوژن همانند درختی پر شاخه است. واحد های گلوکز از طریق باندهای گلیکوسیدی با هم مرتبط می شوند. مزیت یک چنین ترکیب بندی این است که زنجیره گلیکوژن را می توان به چند بخش تقسیم نمود و این باعث می شود که رهایی گلوکز بسیار مؤثر تر ازیک پلیمر زنجیره مستقیم باشد (84). هنگامی که گلوکز خون کاهش پیدا می کند این زنجیره می شکند و گلوکز را به خون باز می گرداند. کبد سبب تبدیل گالاکتوز و فروکتوز به گلوکز می شود و فرایند گلیکونئوژنز که تبدیل اسید های آمینه وگلیسرول چربی ها به گلوکز می باشد، نیز در کبد انجام می گیرد (15، 16).

شکل(1-5): گلیکوژن مهمترین کربوهیدراتیست که به وسیله کبد ذخیره می شود. هپاتوسیت ها گلوکز را از طریق روند متعادل شده با ناقل جذب می کنند و به گلوکز 6-فسفات و متعاقباً گلوکز دی-فسفات (UDP-گلوکز) تبدیل می شود که میتواند برای بیوسنتز گلیکوپروتئین و گلیکولیپید استفاده شود (84).
1-2-9-متابولیسم لیپیدها
کبد نقش مهمی در متابولیسم لیپید ایفا می کند و اسید های چرب آزاد و لیپوپروتئین ها را از پلاسما جذب و در طول گرسنگی، اسیدهای چرب بافت چربی توسط کبد جذب می شوند. هپاتوسیت ها برای کسب انرژی از طریق اکسیداسیون استفاده می کنند تا بتوانند تری گلیسرید لازم را برای تشکیل لیپوپروتئین (VLDL) سنتز نمایند. اسیدچرب مشتق از تری گلیسیرید از بقایای چیلومیکرون است (84).

شکل(1-6): متابولیسم لیپوپروتئین دارای چگالی بالا(HDL) در مسیر انتقال معکوس کلسترول. (LACT، لستین- کلسترول آسیل ترانسفراز؛ C، کلسترول؛ CE، کلسترول استریفه؛ PL، فسفولیپید؛ A-I، آپولیپوپروتئین A-I، SR-BI، رسپتورپاک سازی B1؛ ABC-1، ترانسپورتر کاستی متصل شونده به ATP). آندروژن ها فعال لیپاز کبدی را افزایش داده و استروژن ها فعالیت این آنزیم را کاهش داده(9).
1-2-10-اختلال هموستاز در بیماری های کبدی
فاکتورهای انعقادی متعددی توسط کبد تولید می شوند. بنابراین، در بیماری های کبدی، ( به ویژه سیروز و نارسایی حاد کبدی)، هموستاز غیر عادی شایع است. اختلالات فیبرینوژن، نظیر دیس فیبرینوژنمی ممکن است در بیماری های حاد و مزمن کبدی دیده شود، که منجر به طولانی شدن زمان نسبی ترمبوپلاسین می شود (80). انعقاد منتشر داخل عروقی در نکروز حاد کبدی رخ می دهد، و دلیل احتمالی آن آزاد شدن ترمبوپلاسمین بافتی و نقص در پاکسازی مهار کننده های نظیر آنتی ترومبین و پروتئین C است. ترمبوسیتوپنی (که در افراد مبتلا به سیروز شایع است) ممکن است در انعفاد ناکارآمد داخل عروقی نقش داشته باشد. اگر چه تخریب پلاکت ها عموماً به گیر افتادن آن ها در طحال (هیپر اسپلنیم) نسبت داده می شود، ولی شواهدی دال بر تخریب آن ها با واسطه آنتی بادی وجود دارد. بیمارانی که مبتلا به هپاتیت خودایمن هستند ممکن است آنتی بادی ضد کاردیولیپین و آنتی بادی بر علیه پلاکت داشته باشند (1).
1-2-10-1-آنزیم های رها شده از بافت کبدی بیمار
از آنجا که عملکرد کبد در اغلب بیماران مبتلا به بیماری های کبدی، طبیعی می باشد، فعالت پلاسمایی چندین آنزیم سیتوزولی، میتوکندریایی، و آنزیم های مرتبط با غشاء اندازه گیری می شود زیرا این آنزیم ها در انواع متعددی از بیماری های کبدی افزایش می یابند. از آنجا که الگو شدت بالا رفتن فعالیت آنزیمی، با نوع بیماری کبدی تغییر می کند، اندازه گیری آن ها در شناسایی وتشخیص افتراقی بیماری های کبدی بسیار مفید است. توانایی آنزیم های کبدی برای کمک به تشخیص بیماری، تابع فاکتورهای متعددی است، از جمله :
اختصاصی بودن آنزیم برای بافت
توزیع آنزیم در سلول
شدت نسبی فعالیت آنزیم درکبد و پلاسما
الگوهای آزاد شدن آنزیم
پاکسازی آن از پلاسما (1).
1-2-10-2-ویژگی بافتی
پنج آنزیمی که به صورت متداول در بیماری های کبدی اندازه گیری می شوند و در تشخیص این بیماری ها به کار می روند عبارتند از:
آسپارتات آمینو ترانسفراز ( AST; EC 2.6.1.1)
آلانین آمینو ترانسفراز ( ALT; EC 2.6.1.2 )
آلکالن فسفاتاز ( ALP; EC 3.1.3.1 )
گاما –گلوتامیل ترانسفراز ( GGT; EC 2.3.2.2 )
لاکتاز دهیدروژناز ( LD; EC 1.1.1.27 ) (1).
GGT وALT در بافت های متعددی وجود دارند ولی فعالت پلاسمایی آن ها اساساً منعکس کننده آسیب کبدی است. AST، در کبد، عضله (قلبی و اسکلتی)، و تا اندازه کمی در گلبول های قرمز یافت می شود. توزیع بافتی LD گسترده است و بنابراین، نسبتآً غیر اختصاصی است.ALP در تعدادی از بافت ها یافت می شود ولی در افراد سالم، اساساً منعکس کننده منبع استخوانی و کبدی است. بدین ترتیب ALT و GGT، بر اساس توزیع بافتی، شاخص اختصاصی آسیب کبدی به حساب می آیند (1).
1-2-10-3-توزیع داخل سلولی آنزیم ها
آنزیم ها در داخل سلول ها در مکان های مختلفی یافت می شوند. AST، ALT و LD آنزیم های سیتوزولی هستند. به همین دلیل، هنگام آسیب سلولی آزاد می شوندو نسیتاً سریع در پلاسما ظاهر می گردنند.AST و ALT، ایزوآنزیم های میتوکندریایی و سیتوزولی در هپاتوسیت ها و سایر سلول های حاوی این آنزیم ها می باشند. مقدار نسبی ایزوآنزیم میتوکندریایی ALT کم است و نیمه عمر پلاسمایی آن بسیار کوتاه می باشد که باعث می شود این آنزیم، اهمیت تشخیصی نداشته باشد. ایزوآنزیم میتوکندریایی AST، بخش عمده ای از AST کل را در داخل هپاتوسیت ها تشکیل می دهد. برخلاف آن، ALP و GGT آنزیم های گلیکوپروتئینی متصل به غشاء هستند. مهمترین محل این دوآنزیم، بر روی غشای کانالچه های هپاتوسیت ها است (1).
1-2-10-4-فعایت نسبی آنزیم ها در کبد و پلاسما
در مورد آنزیم های سیتوپلاسمی، مقدار نسبی آنزیم در کبد نسبت به پلاسما، یک شاخص مهم برای استفادۀ بالینی می باشد. فعالیت AST در داخل هپاتوسیت ها در داخل پلاسما در حدود دو برابر ALT است، هر چند که فعالیت پلاسمایی آن ها یکسان می باشد. بر خلاف آن فعالیت LD در هپاتوسیت ها نسبت به پلاسما بسیار کمتر از فعالیت دو آنزیم فوق می باشد، و فعالیت پلاسمایی آن چندین برابر فعالیت پلاسمایی AST و ALT است. این مسئله نشان می دهد که در آسیب کبدی، افزایشLD بسیار کمتر از AST و ALT است. مقدار نسبی این آنزیم در بافت، ضرورتاً با مقدار نسبی آن در بیماری یکسان نیست: در سیروز و سوءتغذیه، کاهش سیتوپلاسمیALT نسبت به کاهش سیتوپلاسمیAST بیشتر است (1).
1-2-10-4-مکانیسم آزاد سازی آنزیم ها
به نظر می رسد که مکانیسم های متعددی در رها سازی آنزیم ها از هپاتوسیت ها درگیر هستند. آسیب سلولی، ساده ترین مکانیسم است و به نظر می رسد که امکان نشت آنزیم های سیتوپلاسمی را میسر می سازد ولی سایر انواع آنزیم ها به میزان حداقل آزاد می شوند. به نظر می رسد که الکل باعث ظهور AST میتوکندریایی بر روی سطح هپاتوسیت ها می شود. تعجبی ندارد که هپاتیت الکلی با افزایش فعالیت پلاسمایی این ایزوآنزیم همراه است. مکانیسم آزاد شدن آنزیم های متصل به غشاء نظیر GGT و ALP به داخل گردش خون، به خوبی شناخته نشده است ولی به نظر می رسدکه علل زیر در آن نقش داشته باشند:
افزایش سنتز
قطعه قطعه شدن غشاء توسط اسید های صفراوی
به صورت محلول در آمدن آنزیم های متصل به غشاء توسط عمل اسید های صفراوی (11و23).
1-2-10-5-سرعت پاکسازی آنزیم ها از پلاسما
سرعت پاکسازی آنزیم های کبدی از پلاسما متغیر است. نیمه عمر ALT، 47 ساعت و نیمه عمرAST، 17 ساعت است. بدین ترتیب، اگرچه AST باعث می شود که فعالیت آن نسبت به AST در اکثر انواع صدمات هپاتوسلولار بیشتر باشد. نیمه عمر ایزوآنزیم کبدی ALT از 1 تا 10 گزارش شده است. به نظر می رسد که نیمه عمر کوتاه تر، با تغییرات دیده شده پس از برداشتن سنگ های صفراوی مطابقت بهتری داشته باشد. نیمه عمرGGT 1/4 روز گزارش شده است. مکانیسم حذف این آنزیم ها از گردش خون، کاملاً شناخته نشده است، هر چند که احتمال دارد اندوسیتوز به واسطه ی گیرنده توسط ماکروفاژهای کبدی در این امر نقش داشته باشند (1و23).
1-2-11-انواع بیماری های کبد
بیماری های کبد بسیارند، از جمله آن ها می توان به هپاتیت (مزمن و حاد )، هپاتیت برق آسا، هپاتیت کلستاتیک، هپاتیت ناشی از داروها و سموم، کبد چرب الکلی، یرقان، سیروز، نئوپلاسم های کبدی اشاره کرد ( 1). شیوه های پاسخ کبد به آسیب، محدود است. آسیب حاد به کبد ممکن است بدون علامت باشد ولی اغلب به صورت یرقان ظاهر می شود. دو بیماری مهم حاد کبدی، هپاتیت حاد و کلستاز هستند. تظاهر بالینی آسیب مزمن کبدی عموماً به صورت هپاتیت مزمن است و عوارض طولانی مدت آن شامل سیروز و HCC می باشد) 52،62،63).
1-2-11-1-مکانیسم ها و الگو های آسیب
سلول هدف، تعین کننده الگوی آسیب است بدین صورت که آسیب هپاتوسیت منجر به بیماری هپاتوسلولار می شود و آسیب سلول صفراوی منجر به کلستاز می گردد. تمام آسیب های سلول ممکن است به عنوان یک واکنش التیام بخش یا انطباقی باعث فیبروز بشوند، مدت زمان آسیب و عوامل ژنتیکی، تعین می کنند که این آسیب نهایتاً به سمت سیروز می رود یا کارسینوم پدید می آید (1).
مرگ سلول توسط نکروز یا آپوپتوز یا هر دوی آن ها رخ می دهد. نکروز سلولی، که به آن "قاتل" گفته می شود، در نتیجه ی وجود یک محیط آسیب زا رخ می دهد.آسیب سمی ناشی از ترکیباتی مثل تتراکلرید کربن، آسپرین و استامینوفن در اکثر قسمت ها به صورت نکروز رخ می دهند. آپوپتوز در نتیجه ی تسریع مرگ برنامه ریزی شده رخ می دهد که در آن سلول، در مرگ خودش نقش دارد و بدین ترتیب، ملزم به "خودکشی" می شود. صرف نظر از علت، مرگ سلولی بطور بارزی منجر به نشت آنزیم های سیتوپلاسمی می گردد (1).
تست های آزمایشگاهی در تمایز موارد زیر مفید هستند:
الگوی آسیب(هپاتوسلولار در برابر کلستاتیک)
مدت طول کشیدن آسیب(حاد در برابر مزمن)
شدت آسیب(خفیف در برابر شدید) (1).
1-2-12-آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) (GPT) (SGPT) (ALAT)
این آنزیم قبلاً به نام گلوتامیک پیروویک ترانس آمیناز (GPT) شناخته شده بود. اسامی اختصاری دیگر آن SGPT و ALATمی باشد. این آنزیم ترانس آمیناسیون قابل برگشت ال-آلانین و 2-اکسوگلوتارات را به پیروات وگلوتامات درسیتوپلاسم سلول تسریع می کند. پیریدوکسال 5- فسفات یک کوفاکتور است، که به طور محکم به ALT و تعداد دیگری از ترانس آمینازها متصل می شود (95).
ALT به طور طبیعی در سرم و مایع نخاعی یافت شده، و در ادرار وجود ندارد. این آنزیم به مدّت دو روز در دمای اتاق و به مدّت یک هفته در دمای 4 درجه سانتی گراد و به مدّت یک ماه در حالت یخ زده، در سرم ثابت می ماند (10) .
چون سطح آنزیم ALT در سیتوپلاسم سلول های کبدی چندین مرتبه بیشتر از مایع خارج سلولی است، زمانی که صدمه ای به غشاء وارد می شود، ALT از آن خارج گشته، و غلظت سرمی آن افزایش می یابد، و میزان این افزایش نشانه ای از درجه وسعت ضایعه کبدی است. در ضایعه کبدی مزمن به علّت مسمومیّت های شیمیایی میزان آن به حداکثر می رسد (84).
توقف خون محیطی منتج به کمبود اکسیژن هپاتوسیت‌ها شده، و با آن که سلول‌های کبدی نکروز نشده‌اند، میزان آلانین آمینوترانسفراز سرم افزایش می یابد (103).
1-2-13- آنزیم آسپارات آمینوترانسفراز (AST)
نام دیگر آن گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز (GOT) می‌باشد (100). این آنزیم ترانس آمیناسیون اِل-آسپارتات و2-اکسوگلوتارات را به اکسالواستات و گلوتامات تسریع می کند.AST تعدادی از خصوصیّات ALT نظیر داشتن کوفاکتور پریدوکسال 5-فسفات را دارا است (61).
AST دارای دو ایزوآنزیم سیتوزولی و میتوکندریایی می باشد. این آنزیم در شرایط دمای اتاق به مدّت سه روز در دمای یخچال به مدّت یک هفته و در شرایط یخ زده به مدّت یک ماه در سرم ثابت باقی می ماند، چون AST در تمام بافت های بدن وجود دارد، از این رو به عنوان یک تست اختصاصی کبد محسوب نمی شود. غلظت این آنزیم در عضلات اسکلتی و قلبی زیاد است (61).
سطحAST سرم ممکن است، در بیماری های کبدی تمام گونه های حیوانی افزایش یابد (95).
در تفسیر نتایج اندازه گیری AST بایستی از سالم بودن قلب و عضلات بدن مطمئن بود. چون بیماری های قلبی و عضلانی سبب افزایش مقدار ASTسرم خواهند شد (10). در نشخوار کنندگان افزایش AST، نشانه خوبی برای نکروز سلول های پارانشیم کبد است (64).
ترانس آمینازها با بیماری حاد کبدی، نکروز قلبی و ضایعات ماهیچه حرکتی افزایش می یابند (11). میزان آسپارتات آمینو ترانسفراز به هنگام ضایعه اعضاء یا عضلات، به خصوص در تخریب عضلانی، به شدّت افزایش پیدا می کند. این آنزیم در هپاتیت حاد و گاهی امراض مزمن کبدی هم افزایش می یابد (10).
1-2-14- آنزیم الکالین فسفاتاز (ALP)
آلکالین فسفاتاز نخستین آنزیم های سرم بودند، که ارزش کلینکی آن ها شناخته شد و در سال 1920 دریافتند، که آنزیم با بیماری های کبدی و استخوان افزایش می یابد (61).
فسفاتازها آنزیم هایی هستند، که استرهای فسفریک را هیدرولیز کرده و فسفر غیرآلی را آزاد می سازند (8). چون آلکالین فسفاتازها، دی فسفوزیلاسیونATP را تسریع کرده، و در اکثر سلول های بدن وجود دارند، و از طرفی در حاشیه مسواکی اپیتلیوم ترشّحی و استخوان فعالیّت ویژه ای را به خود اختصاص داده‌اند. اعتقاد بر آن است، که بخشی از فعالیّت آن ها مربوط به عیب های غشایی وابسته به ATP و فرآیندآهکی شدن می باشد. علاوه بر این آلکالین فسفاتازها در سنتز فسفولیپیدهای غشاء دخالت دارند، چون در افرادی که به طور ارثی مبتلا به کمبود آلکالین فسفاتاز می باشند، مقدار زیادی اتانول امین ترشّح می شود. واژه آلکالین به pH ایده آل برای بهترین فعالیّت این رده از فسفاتازها در شرایط آزمایشگاهی اطلاق می گردد، که حدود pH = 10 می باشد، و شکل گیری اینpH در بدن غیر معمول می باشد (61).
این آنزیم در دمای اتاق و دمای 4 درجه سانتی گراد به مدّت 2 الی 3 روز و در حالت یخ زده به مدّت یک ماه در سرم ثابت می ماند، و قابل نگهداری است (61).
سطح الکالین فسفاتاز سرم به طور طبیعی در دام های جوان بالاتر از دام های مسن است، در افراد بالغ الکالین فسفاتاز به طور عمده از کبد سرچشمه می گیرد.در صورتی که در کودکان در حال رشد، مهمترین منشأ این آنزیم، سلول های استخوانی است (61).
مقدار این آنزیم در بیماری های افراد مجاری کبدی، صفراوی و گسترش ضایعات کبدی، ضایعات ناشی از استئوبلاست های استخوانی، در زمان ترمیم استخوان، ضایعات دستگاه گوارش نظیر سوء جذب، نکروز شش ها و کلیه ها، انفارکتوس طحال و هیپرپاراتیروئیدیسم افزایش می یابد (10).
به دلیل آن که ماده‌ی زمینه‌ای طبیعی موجود در آلکالین فسفاتاز تا کنون شناخته نشده است، جهت اندازه‌گیری آن از ماده‌ی زمینه‌ای سنتزی مانند آلفا- نیتروفنیل فسفات استفاده می شود (61 و 90). آلکالین فسفاتاز یک آنزیم گلیکوپروتئینی متّصل به غشاء می باشد، و در بالاترین غلظت در سینوزوئیدها و اندوتلیومسیاهرگ های مرکزی و محیط بابی وجود داشته، و غلظت پایینی از آن، در مجاری صفراوی یافت می شود (10).
آلکالین فسفاتاز در امتداد مجاری صفراوی، هپاتیت، سیروز و انباشتگی و رسوب چربی در کبد افزایش می یابد (10).
مادامی که هنوز یک سوم پارانشیم کبد فعّال است، و در جریان صفرا نقصی وجود ندارد، آزمون های متداول آزمایشگاهی در رابطه با عمل کبد، نمی تواند به خوبی نارسائی کبد را مشخّص کند (10). علاوه بر این بیماری های کبدی به سادگی تنها با یافته های فیزیکی در بیمار تظاهر پیدا نمی کند، معمولاً در چنین مواردی با افزایش آنزیم های سرمی مشخّص می گردد ( 93).
یکی از انواع هپاتیت های کبدی، هپاتیت سمّی است، که ناشی از گیاهان سمّی و انواع موّاد شیمایی و داروها و نیز سموم حاصل از باکتری ها در خون می باشد ( 10).
1-2-15-پروتئین تام
1-2-15-1- میزان پروتئین های خون
آلبومین توسط کبد ساخته می شود. لذا کاهش میزان آن مبین وجود بیماری کبدی مزمن است، ولی کاهش میزان آلبومین خون ممکن است، در اثر کاهش پروتئین جیره‌ی غذایی، نشت پروتئین، کاهش قابلیّت هضم و جذب اسید های آمینه و اختلالات کلیوی حادث شود. هرگاه اختلالات کبدی باعث کاهش آلبومین شود، این کاهش در واقع حاصل چندین هفته سوء تغذیه، قبل از ظهور علائم بیماری است. اگر میزان هموگلوبین و آلبومین به صورت توأم کاهش یابد، ولی مقدار گلبولین ها طبیعی باقی بماند، به احتمال قوی جانور دچار اختلال کبدی شده است (10). سنتز پروتئین 20% درصد کلّ محصول پروتئین بدن است و در واقع کبد محلی برای سنتز اکثریّت پروتئین های پلاسما و محل احیاء و تنظیم بیشتر آنهاست. بنابراین هرگونه اختلالی که باعث کاهش یا توقّف فعالیّت طبیعی کبد گردد ، غلظت کلی پروتئین پلاسما را تحت تأثیر قرار می دهد، و باعث اختلالات مختلفی از جمله اختلالات انعقادی می گردد. از مهّم ترین پروتئین های پلاسما که در جریان ضایعات کبدی دست خوش تغییر و اختلال می گردند، می توان به آلبومین اشاره نمود (99).
آلبومین تنظیم کننده مهم اسمزی خون می باشد، و حدود 55 درصد از فشار انکوتیک پلاسما را تأمین می کند. به علاوه در نقل و انتقال ملکول های گوناگون دخیل است. از جمله موّاد اسیدهای چرب، اسیدهای آمینه، ویتامین ها، اسیدهای صفراوی، هورمون ها، برخی فلزّات، داروها و ... می باشند. به طور کلّی آلبومین شاخص فعالیّت کبد به شمار می رود، ولی نشانه اختصاصی نیست، در سیروز کبدی و آب آوردگی شکم ممکن است کاهش آلبومین سرم دیده شود (8).
بیشتر گلبولین غیر ایمونوگلبولین در کبد تجزیه و ذخیره می گردد، که شامل 70 الی 90 درصد الفا گلبولین، 50 درصد بتاگلبولین است. بیشتر غیر ایمونوگلبولین ها به عنوان پروتئین مرحله حاد شناخته می شوند، و ساخت آن ها سریعاً در واکنش به بافت صدمه دیده، یا ملتهب افزایش می یابد. برّرسی و تغییرات غلظت گلبولین سرم شاخص خوبی برای برّرسی فعالیّت کبد نیست، چرا که ایمونوگلبولین از منابع دیگر نیز تأمین می گردد. جداسازی آن ها در بیماران مبتلا به ناراحتی کبدی استفاده از روش الکتروفورز استات سلولز انجام می گیرد (94). الفافتوپروتئین بزرگ ترین پروتئین پلاسماست، که به وسیله کبد و کیسه زرده تجزیه می شود، و در هنگام نوزادی به داخل خون ترشّح می شود. این پروتئین در بیماران مبتلا به کارسینوم سلول کبدی و بیماری های گوناگون کبدی شامل هپاتیت ویروس التهاب مزمن کبدی و سیروز ، در طیّ روند ترمیم پس از برداشت 70 درصد از بافت کبد افزایش می یابد (10).
1-2-16- اندازه گیری آلبومین پلاسما
اندازه گیری آلبوین پلاسما در بررسی شدت و مدت بیماری کبدی مفید است، برای مثال غلظت آلبومین پلاسما در بیماری های مزمن کبدی کاهش می یابد. با این وجود، کاربرد آن بدین منظور تا اندازه ای محدودیت دارد زیرا غلظت آلبومین پلاسما در بیماری های زیر نیز کاهش می یابد:
بیماری حاد کبدی شدید
بیماری های التهابی
سوء تغذیه
سندرم نفروتیک
اندازه گیری متوالی آلبومین پلاسما نیز برای بررسی شدّت بیماری کبدی استفاده می شود (1).
1-2-17-بیلی روبین پلاسما
اندازه گیری متوالی بیلی روبین، در تعیین شدت بیماری حاد و مزمن کبدی مفید است. جزءجزء کردن بیلی روبین، تنها در یرقان دوران نوزادی یا در افزایش منفرد بیلی روبین در غیاب سایر اختلالات تست های کبدی ( که نشان دهنده یک اختلال ارثی در متابولیسم بیلی روبین هستند) مفید است(1و13).
1-2-17-1-بیلی روبین و انواع آن
عمر گلبول های قرمز در حیوانات 90 الی 140 روز به طور متوسط 120 روز می باشد. گلبول های پیر در آخر عمر خود توسط سیتم رتیکواندوتلیال گرفته شده و پس از شکسته شدن، هموگلوبین خود را آزاد کنند. هموگلوبین آزاد فاگوسیتی سلول های طحال، کبد و مغز استخوان به بیلی روبین تبدیل می گردد، که این 80 درصد کل بیلی روبین تولید شده را تشکیل می دهد. هموگلوبین از یک جزء پروتئینی به نام گلوبین و یک جزء غیر پروتئینی به نام هم ساخته شده است. خود هم دارای یک اتم آهن و چهار حلقه پیرول بوده، که بوسیله باند متینبه هم متصل گردیده اند، و اتم آهن نیز توسط باندهایی به انتهای ازت حلقه ها می پیوندد (23). بعد از تخریب هموگلوبین، گلوبین آن یا به همین صورت مجدداً مورد استفاده قرار گرفته، یا به اسید های آمینه تشکیل دهنده ی خود تجزیه شده و ذخیره می گردد، تا مجدداً مورد استفاده واقع شود. آهن موجود در هم به ذخیره آهن بدن روانه شده، تا مجدداً مورد استفاده واقع شود (23و40).
1-2-18- وظایف عملی پروتئین های پلاسما
انواع عمده پروتئین های موجود در پلاسما عبارتند از: آلبومین، گلوبولین و فیبرینوژن. وظیفه اصلی آلبومین ایجاد فشار اسمزی کلوییدی پلاسماست که جلوی از دست رفتن پلاسما از مویرگها را می گیرد. گلوبولین ها تعدادی عمل آنزیمی در پلاسما انجام می دهند. اما وظیفه دیگری که به همان اندازه اهمیّت دارد این است که آن ها مسئول اصلی هر دو نوع ایمنی ذاتی واکتسابی هستند و از فرد در برابر ارگانیسم های مهاجم محافظت می کنند. فیبرینوژن در جریان انعقاد خون به صورت رشته های بلند فیبرینی پلیمریزه می شود و بدینوسیله لخته‌های خونی را می سازد که به ترمیم نشتی های دستگاه گردش خون کمک می کنند (1و13).
1-2-19- ساخت پروتئین های پلاسما
تقریباً تمام آلبومین فیبرینوژن پروتئینهای پلاسما و نیز 50 تا 80 درصد از گلبولینها در کبد ساخته می شوند. تقریباً بقیه گلبولینها در بافت های لنفویید ساخته می شوند . آنها عمدتاً گاماگلبولینها هستند که آنتی بادی های مورد استفاده در دستگاه ایمنی را تشکیل می دهند. سرعت کبدی ساخت پروتئین های پلاسما می تواند فوق العاده بالا باشد، ‌یعنی تا 30 گرم در روز گاهی برخی بیماریهای خاص باعث از دست رفتن سریع پروتئین های پلاسما می شوند، ‌سوختگی های شدیدی که نواحی وسیعی از پوست را از بین می برند می توانند سبب از دست رفتن روزانه چند لیتر پلاسما از نواحی بدون پوست شوند. در این حالات،‌ تولید سریع پروتئین های پلاسما در کبد ارزش زیادی در جلوگیری از مرگ دارد. به علاوه‌گاهی فرد مبتلا به بیماری شدید کلیوی ، به مدت چند ماه روزانه قریب 20 گرم از پروتئین‌های پلاسما را از دست می دهد و این مقدار پیوسته با تولید کبدی پروتئین های لازم جایگزین می شود تیروکسین سرعت متابولیسم تمام سلول‌ها را افزایش می دهد و در نتیجه به طور غیرمستقیم بر متابولیسم پروتئین تأثیر می گذارد. اگر کربوهیدرات‌ها و چربیهای موجود برای تولید انرژی کافی نباشند، ‌تیروکسین سبب تجزیه سریع پروتئین‌ها می شود و آنها را صرف تولید انرژی می کند. اما اگر مقدار کربوهیدارت‌ها و چربی های موجود کافی باشد و اسید‌‌های آمینه هم به مقدار اضافی در مایع خارج سلولی موجود باشند، تیروکسین می تواند سرعت ساخت پروتئین را به شدت افزایش دهد. کمبود تیروکسین در حیوانات یا انسان‌های در حال رشد به علت عدم ساخت پروتئین باعث وقفه زیاد در رشد می شود. اصولاً معتقدند که تیروکسین تأثیر مستقیم و خاص ناچیزی بر متابولیسم پروتئین دارد،‌ ولی دارای اثری عمومی و مهم در افزایش سرعت هر دو نوع واکنش‌های طبیعی و آنابولیک و کاتابولیک پروتئین ها می باشد (84 و1).
1-2-20-ازت اوره خون
اوره ترکیب شیمیایی است که در کبد تولید می شود، و محصول نهایی کاتابولیسم پروتئین در بدن است. همچنین در نوشخوارکنندگان، آمونیاک جذب شده از شکمبه در کبد به اوره تبدیل می شود. به طور طبیعی این ماده در بدن عمل مفیدی ندارد مگر خاصیت مدری متوسطی را که می توان به آن نسبت داد، و تقریباً به طور کامل توسط کلیه به داخل ادرار ترشح می شود، کلیه توسط گلومرول، اوره پلاسما را تصفیه کرده، و در شرایط طبیعی تقریباً 25 تا 45 درصد اوره تصفیه شده در حین عبور از لوله های ادراری بازجذب می شود (14و53).
1-2-21-کراتینین
کراتینین یک ماده دفعی حاصل از متابولیسم کراتین است، که اندازه گیری آن شاخص مفیدی برای پیش بینی عمل کرد کلیوی است (23). کراتین در کلیه، کبد و لوزالمعده توسط واکنش های آنزیمی ساخته می شود. در واکنش اول ترانس آمیدیناسیون آرژنین و گلیسین موجب تشکیل گوانیدینو و استیک اسید می گردد، و واکنش دوم، متیلاسیون اسید گوانیدینواستیک با اس آدنوزیل متیونین به عنوان دهنده متیل اتفاق می افتد. پس کراتین در واقع اسید گوانیدینواستیک می باشد. سپس کراتین به خون انتقال یافته، و به سمت اعضای دیگر نظیر ماهچه و مغز حمل می شود. یعنی جایی که به فسفوکراتین که یک شکل ذخیره ای مهم فسفات با انرژی بالا است، فسفریله می گردد. مقداری از کراتین آزاد ماهیچه ها به طور خود به خود به کراتینین که شکل بدون آب است، تبدیل می گردد (18). حدود 2 درصد کراتین در ظرف 24 ساعت تبدیل به کراتینین می شود، در نتیجه میزان کراتینین ساخته شده، ارتباط مستقیم با میزان توده عضلانی بدن دارد (1و18).
پس از شناخت کبد و ساختمان و کارکردهای آن و عنایت به این موضوع که داروهای شیمیایی موجود در بازار نه تنها جوابگوی نیازهای انسانی در جهت رفع عارضه های کبدی نیستند بلکه ممکن است عوارض جانبی آن ها بسی خطرناک تر باشد لذا می بایست در این راستا به سمت داروهایی رفت که از یک طرف هزینه های کمتری را داشته باشد و از طرف دیگر عوارض جانبی را به حداقل برساند، بدین منظور استفاده از گیاهان دارویی که بعضاً در تمام نقاط دنیا یافت می شودو در طب سنتی نیز استفاده می شود و دارای مقادیری ویتامین C و آنتی اکسیدان های طبیعی که خاصیت محافظت کبدی را دارند مورد توجه قرار گرفته است (27،34،36).