—103

1-30- باززایی گیاهان کشت شده 34
1-31- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشه ای 35
1-32- استقرار در محیط کشت 35
1-33- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق کشت های متوالی 35
1-34- ریشه زایی گیاهچه های تولیدشده 35
1-35- تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان در شرایط درون شیشه ای 36
1-36- روش کشت کالوس 36
1-37- روش کشت سوسپانسیون سلولی 37
1-38- اهداف تحقیق 38
فصل دوم: مروری بر منابع 39
2-1- سوابق استفاده از رازیانه در کشت بافت 40
2-2- تحقیقات کشت بافت بر روی گیاهان دیگر 43
فصل سوم: محل انجام آزمایش 46
3-1- مواد شیمیایی 47
3-2- تهیه بذر47
3-3- محیط کشت، ترکیبات و چگونگی آماده سازی آن . . 47
3-4- تهیه محلول مادری MS(غلظت x10) ……… …………… …………………… 47
3-5- مراحل سترون سازی51
3-5-1- سترون سازی بذرها51
3-5-2- سترون سازی محیط و وسایل کار 52
3-5-3- تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف 52
3-6- کشت گیاه در محیط های تیماری به منظور کال زایی 54
3-7- باززایی57
3-8- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت MS مایع 58
3-9- جداسازی ترکیبات فرار 58
3-10- آنالیز آماری 59
فصل چهارم: نتایج و بحث
60
4-1- نتایج کالوس سازی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 61
4-2- نتایج باززایی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 65
4-3- نتایج حاصل از اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه 70
4-4- بررسی ترکیبات شیمیایی گیاه رازیانه تحت تاثیر تیمارهای مختلف هورمونی از طریق
کشت سوسپانسیون سلولی 74………………………………………………………………………….
4-5- مقایسه درصد سطوح ترکیبات شیمیایی مشترک حاصل از کشت سوسپانسیونی گیاه رازیانه در تیمارهای مختلف هورمونی
75
4-6- اشکال طیف گاز کروماتورگراف در اسانس گیاه رازیانه تیمارشده با ترکیبات هورمونی مختلف.........................77
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری کلی
81
بحث 82
پیشنهادات86
منابع 87

چکیده انگلیسی 98……………………………………………………………… ………………….

فهرست شکل ها
عنوان شکلصفحه
شکل 1-4- مراحل رشد جنین های جنسی و غیرجنسی...………………………………………………….……….29
شکل 4-1- کالوسهای بوجود آمده در محیط کشتهای غلظت 4میلی گرم بر لیتر و 1 میلی گرم بر لیتر.................................................................................................................................60
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه
جدول 1-1- . مقایسه مقدار تولید برخی ترکیبات دارویی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی با گیاه کامل................33
جدول 3-1- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در القاء و رشد کالوس در محیط ……………….MS51
جدول 3-2- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در باززایی رازیانه در محیط MS2/1…………..……54
جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان کالوس‌زایی…………..……………………………………………………… 58
جدول 4-2- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد……………………..………………………………………... 58
جدول 4-3- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …………..…………………………………………………..60
جدول 4-4- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ............................................................................................................ 61
HYPERLINK l "_Toc302924107" جدول HYPERLINK l "_Toc302924106" 4-5- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان باززایی...................................................................................................................................................................63

جدول 4-6- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …...............................................................................................................................63جدول 4-7- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد65… ………………………………………………………………
جدول4-8- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ………………………………….. … …….. 66
جدول4-9- نتایج تجزیه واریانس اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ...................................................................................................................... ..........................................................68
جدول4-10- مقایسه میانگین اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ........................................................................................................................................................................................69
جدول 4-11- ترکیبات شیمیایی حاصل از اسانس گیاه رازیانه....................................................................................................71

TOC h z c "شکل"
فهرست نمودارها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی………………..…………… ........59
نمودار4-2- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی61
نمودار4-3- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی 62
نمودار4-4- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی64
نمودار4-5- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی............................................................................................ 65
نمودار4-6- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی.... ...........................................................67
نمودار4-7- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ساقه گیاه رازیانه69
نمودار4-8- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ریشه گیاه رازیانه 70
نمودار4-9- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر تعداد برگ ایجاد شده در گیاه رازیانه............................................70
نمودار 4-10- مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف...................................................................................................................................................72
نمودار 4-11 مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی D-(+)-fenchone در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف....................................................................................................................................................73

فصل اول
مقدمه
مقدمه
گل ها و گیاهان، خاموش ترین موجودات و در عین حال گویاترین مظهر قدرت و عظمت آفرینش هستد. هر برگی از این موجودات زیبا، کتاب بزرگی در وصف توحید است. گلها و گیاهان نه تنها با الوان و اشکال بدیع و بیبدیل خود سفرهی طبیعت را زینت میبخشند بلکه آن را چنان سرشاری از نیروی حیاتی میسازند که هیچ بساطی را یارای رقابت با آن نیست (امیدبیگی، 1377 .( با آن که امروزه درمان بیماریها بیشتر از طریق مصرف داروهایی صورت میگیرد که منشأ صنعتی دارند و اختصاصاً در آزمایشگاهها تهیه میشوند ولی مصرف بعضی از آنها زیانهایی به بدن میرساند و عوارض جانبی بسیاری از آنها ثابت شده است. در اوایل قرن حاضر پیشرفت علم شیمی و کشف سیستمهای پیچیدهی سنتز ارگانیک منجر به توسعهی صنعت داروسازی و جایگزینی شیمی درمانی شد. بدین طریق پزشکی مدرن توانست بسیاری از بیماریها غیرقابل علاج و غالباً مرگآور را درمان کند. با وجود این گیاهان دارویی و داروهایی که از آنها تهیه میشدند هرگز به طور کامل کنار گذاشته نشدند. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی امروزه بیش از 80 درصد مردم جهان (نزدیک به 5 میلیارد نفر)، برای درمان بیماریها هنوز از داروهای گیاهی استفاده میکنند. تقریبا یک چهارم داروهای تهیه شدهی دنیا منشأ گیاهی داشته که یا مستقیماً از گیاهان عصارهگیری شده و یا براساس ترکیب گیاهی، سنتز شدهاند. واژه گیاهان دارویی تنها به تسکین دهنده آلام اطلاق نمیشود بلکه این گیاهان در زیر گروه غذا به عنوان طعم دهندهها، نوشیدنیها، شیرین کنندهها، رنگ طبیعی بوده همچنین به عنوان ماده اولیه محصولات آرایشی و بهداشتی نیز مورد استفاده قرار می گیرند (امیدبیگی، 1376).
درواقع گیاهانی که حداقل دارای صفات زیر باشند،گیاه دارویی نامیده میشوند:
1- در پیکر این گیاهان مواد ویژه ای به عنوان مواد مؤثر یا متابولیتهای ثانویه ساخته و ذخیره میشوند که برای مداوای برخی از بیماریها مورد استفاده قرار میگیرند. مواد مذکور طی فرآیندهای ویژه و پیچیده بیوشیمیایی و به مقدار بسیار کم (به طور معمول کمتر از یک درصد وزن خشک گیاه)، ساخته میشوند.
2- اغلب ممکن است اندام ویژهای چون ریشه، برگها، ساقه، گل، میوه و غیره بیشترین مواد مؤثر را داشته باشند، بنابراین همیشه نمیتوان کل اندام گیاه را منبع ماده دارویی ویژهای دانست.
3- اندام گیاهی برداشت شده، آماده سازی و فرآوری میشوند، یعنی تحت تأثیر عملیات ویژهای مانند جداسازی، خرد شدن، خشک کردن، تخمیر و غیره قرار گرفته و سپس استفاده میشوند. به طور معمول این اندامها به صورت سنتی و فقط با خشک کردن به عنوان کالای عطاری عرضه میشوند.
جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران
رویکرد روز افزون استفاده از گیاهان دارویی و فرآوردههای حاصله از آن نقش این گیاهان را در چرخه اقتصاد جهانی پررنگتر کرده است. طوریکه مصرف روبه تزاید آن تنها به کشورهای در حال توسعه اختصاص نداشته، بلکه یکی از فاکتورهای مهم بهداشتی کشورهای پیشرفته نیز محسوب میگردد. در جهان 130 میلیون تن گیاه دارویی سالانه خرید و فروش میشود و حدود یک میلیون کارخانه دارویی در چند سال اخیر افزایش یافته است. طبق برآوردهای صورت گرفته در سالهای اخیر، ارزش بازارهای جهانی داروهای گیاهی که شامل گیاهان دارویی و فرآوردههای آنها است، رشد قابل توجهی داشته است. بخش اعظم بازار گیاهان دارویی دنیا، به تولید و عرضه متابولیتهای ثانویه مشتق از این گیاهان مربوط میشود. متابولیتهای ثانویه معمولاً از ارزش افزوده بسیار بالایی برخوردارند به طوریکه ارزش فروش برخی از این ترکیبات مانند شیکونین ، دیجیتوکسین و عطرهای همچون روغن جاسمین ، از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر کیلوگرم تغییر می کند. همچنین قیمت هر گرم از داروهای ضد سرطان گیاهی مانند وین بلاستین ، وینکریستین ، آجمالیسین و تاکسول به چند هزار دلار میرسد. تاکسول یکی ازترکیبات دارویی است که از پوست درخت سرخدار به دست میآید و در درمان سرطانهای سینه و تخمدان مورد استفاده قرار میگیرد. ورود دارو بودجه زیادی را به خود تخصیص میدهد این در حالی است که ایران با داشتن خصوصیات اکولوژیکی و اقلیمی متنوع، یکی از کشوهای کم نظیر در تولید گیاهان مختلف میتواند باشد به طوری که ایران از 13 اقلیم موجود در جهان، 11 اقلیم را به خود اختصاص داده است. و به تقریب 8000 گونه گیاهی که معادل 2 برابر فلور کل اروپا است ازدیگر ویژگیهای کشورمان می باشد، که این بانک ژن اهمیت اقتصادی زیادی دارد. برای مثال کشور فلیپین حجم عظیمی از درآمد خود را از فروش گیاهان دارویی و گیاهان وحشی به دیگر کشورها بدست میآورد (میرجلیلی، 1382). بنابراین، اگرچه در زمینه توسعه صنعت گیاهان دارویی در ابتدای راه هستیم، ولی میتوانیم با برنامهریزی صحیح، بخش قابل توجهی از بازارهای جهانی را به خود اختصاص دهیم. شاید در ابتدای کار نتوانیم با کشورهایی که محصولات خود را به تولید انبوه رسانده اند، رقابت نماییم، اما به لحاظ تنوع گونهای و تولید طبیعی گونههایی دارویی رقبای چندانی در جهان نداریم و در مواردی حتی بیرقیب هستیم. همه اینها منوط به این نکته است که داراییهای کشور را بشناسیم و بتوانیم از آنها استفاده بهینه نماییم. در این صورت حتی می توان تا 5 درصد از تولید ناخالص ملی را از این طریق تأمین نمود (امیری،2006).
1-3- ضرورت توجه به پرورش گیاهان دارویی
با ظهور داروهای شیمیایی و بیولوژیک، نقش و اهمیت گیاهان دارویی در تأمین سلامت بشر، در معرض فراموشی قرار گرفت .اما با گذشت زمان، استقبال از گیاهان دارویی با رشد قابل توجهی روبرو شده است. به نظر میرسد مردم جهان از یک سری نارساییهای طب مدرن خسته شده اند و به طور روز افزون به سمت داروهای گیاهی روی میآورند به همین دلیل، امروزه حدود 50 درصد داروهای تولید شده در جهان منشاء طبیعی دارند که با تغییراتی به عنوان دارو مورد استفاده قرار میگیرند که نیمی از این مقدار از منابع معدنی، حیوانی و باکتریایی بهدست میآید و نیمی دیگر منشاء گیاهی دارد. برای مثال، تمام هورمونهای مصرفی گیاهی هستند و از گیاهان مختلفی نظیر سیب زمینی مکزیکی، شنبلیله و غیره به دست میآیند. هم چنیین ترکیباتی مثل وین بلاستین و وین کریستین که از داروهای ضد سرطان هستند از گیاه بدست میآیند و یا گلیکوزیدهای قلبی از جمله این گروه داروها محسوب میشوند (قاسمی دهکردی و طالب، 1380). گیاهان دارویی به دلیل ماهیت طبیعی و وجود ترکیبات همولوگ دارویی در کنار هم، با بدن سازگاری بهتری دارند و معمولا فاقد عوارض ناخواسته هستند لذا به خصوص در موارد مصرف طولانی و در بیماریهای مزمن، بسیار مناسب میباشند. به عنوان مثال، گیاهان دارویی در بسیاری از اختلالات اعصاب و روان به عنوان بهترین انتخاب خواهند بود.
ایرانیان از دیرباز و حتی پیش از دیگران در زمینه گیاهان دارویی و کاربرد درمانی آنها از دانش پیشرفتهای برخوردار بوده است. نمونه بارز آن کتاب باستانی اوستاست. در یکی از پنج کتاب تشکیل دهنده اوستا( که در مجموع دست کم 2500 سال پیشینه دارد)، بخش های پرشماری به گیاه درمانی، معرفی گیاهان دارویی و کاربرد آنها اختصاص یافته است. در قرن هشتم و نهم میلادی، اطباء ایرانی رونق خاصی به طبابت ایران و جهان بخشیدند بهطوریکه با پیدا شدن دانشمندان و نوابغی نظیر ابوعلی سینا و محمد زکریای رازی با انشار کتابهای معروف خود (قانون و الحاوی) پیشرفتهای زیادی نصیب ملت ایران و جهان گردید. این پیشرفتها همچنین در قرون بعد نیز ادامه یافت. در قرن 13 میلادی، ابن بیطار، اختصاصات متجاوز از 1400 گیاه را که خود شخصاً می شناخت را در کتابش شرح داد (دوازده امامی، 1386).
1-4- گیاه شناسی رازیانه:
رازیانه گیاهی است علفی، معطر و چند ساله از تیره چتریانUmbelliferae با نام علمی Foeniculum vulgare که ارتفاع آن حدود 2 متر، ساقههای آن قائم، استوانه ای، منشعب و سبز رنگ است. ریشه غدهای، دوکی شکل و مستقیم، برگهای این گیاه متناوب با پهنک منقسم به قطعات نازک و نخی شکل، گلها زرد رنگ و مجتمع کوچک و منظم به صورت چتر مرکب است. شاخکهای چترهای آن بلند و شامل پایههای نامساوی است؛ به طوریکه تعداد آنها به 15 نیز میرسد. پهنای گل آذین چتری آن در حدود 15 سانتی متر است. گلهای این گیاه عسل دهندههای خوبی محسوب میشوند. میوه آن کوچک، دو فندقه به طول 6 تا 12 و عرض2 تا 4 میلی متر و دارای بوی معطر است)کمالی و همکاران،1380).

فرمانرو: گیاهان
دسته: گیاهان گلداررده: دولپهای
راسته: آپیالس
تیره: چتریان
سرده: رازیانه
گونه: F.vulgare
نام علمی: Foeniculum vulgare
1-5- اندام داروئی:
تمام اجزای رازیانه قابل استفاده است. از آن جمله شکوفهها و دانههای آنرا بلافاصله بعد از رسیدن و برگهای آنرا در تیرماه چیده و در سایه خشک میکنند و همچنین ریشه رازیانه را میتوان در اواخر پائیز برداشت نموده و خشک کرد.(سیکوتی و همکاران، 2008)
1-6- نیازهای اکولوژیکی:
رازیانه بیشتر بر روی شیبهای صخرهای و کوهستانی خشک، آهکی، آفتابگیر، قابل نفوذ و فاقد رطوبت زیاد میروید.
1-7- پراکنش جغرافیائی:
رازیانه گیاهی است مدیترانه ای، هوای گرم برای رشد و نمو آن مطلوب می باشد. به طور کلی کشت این گیاه در مناطق با هوای گرم (تابستان طولانی و زمستان بیش از اندازه سرد نداشته باشد) موفقیت آمیز است (دامژانویک و همکاران، 2005). این گیاه بومی نواحی مدیترانه و آسیا بوده، امروزه در جنوب فرانسه ، ایتالیا و سایر نقاط جهان کشت میشود. در ایران رازیانه به صورت خودرو در مناطقی مثل شمال، تهران، کرمان، کردستان، اصفهان و ... می توان یافت و در اکثر نقاط ایران قابل کشت است. جوانه زنی بذور در دمای 6-8 درجه سانتیگراد انجام میگیرد ولی درجه حرارت مطلوب برای جوانه زنی 16-65 درجه سانتی گراد میباشد. pH مناسب برای این گیاه 8/4 تا 8 است. خاکهای لومی رسی با مواد و عناصر غذائی و ترکیبات هوموسی کافی خاکهای مناسبی برای رویش این گیاه می باشد. دمای مطلوب در طول رویش و در طول زمان تشکیل میوه 20-22 درجه سانتی گراد است. در زمستانهای طولانی و بسیار سرد ریشههای گیاه دچار سرمازدگی میشوند. آبیاری در مراحلی از رشد، رویش اولیه، مرحله تشکیل ساقه و مرحله نمو گلها، تأثیر قابل توجهی بر کمیت و کیفیت مواد مؤثره این گیاه دارد.(باقری و همکاران، 1376)
در شکل زیر قسمتهای آنالیز میکرسکپی پودر رازیانه نشان داده شده است .

Tracheids Vittae Endosperm Endocarp Mesocarp
گرد رازیانه را از میوه های خشک شده گیاهی به نام فینکولوم ولگا را از تیره چتریان بدست می آورند . گردی است سبز مایل به زرد با بوی تند شبیه بوی انتول (معطر) ، مزه آن ابتدا تند و کمی شیرین سپس تلخ و کافوری می شود . در زیر میکرسکوپ شامل قسمتهای زیر می باشد :
الف- تکه هائی از پارانشیم حفره ای (سلولهای دندانه ای شکل) از قسمت مزوکارب ، زیاد و اختصاصی می باشد.
ب- تکه هائی از اپیدرم پوشش داخلی با سلولهای کف پوشش مانند همراه با پارانشیم تحتانی که در طرف راست تصویر قرار دارد و باقیمانده هائی از لوله های روغنی (تکه هائی از لوله های ترشحی شیزوشس که اطراف آن را سلولهای مخاطی احاطه نموده است) ، زیاد و اختصاصی می باشد.
پ- تکه هائی از بافت کلانشیم نزدیک آوندهای هدایت کننده با دیواره های سلولی قرمز مایل به قهوه ای زیاد و اختصاصی می باشد.
ت- قطرات زرد رنگ روغنی ، زیاد و اختصاصی نمی باشد.
ث- تکه هائی از اندوسپرم همراه با بلورهای ریز ستاره ای شکل اکسالات کلسیم ، شفاف ، دیواره های سلولی ضخیم ، خیلی زیاد ولی اختصاصی نبوده و چون در دانه های دیگر گیاهان چتریان نیز دیده میشود.
ج- تکه های شکسته شده از فیبرهای اسکرانشیم شده از کارپوفور (1) کم و اختصاصی نمی باشد.
توجه : این گرد باید فاقد تارو آوندهای بیش از 10 میلی میگرون قطر باشد. امکان مخلوط با گرد زیره نیز مشاهده است. (یاسن و همکاران، 2009)
1-8 - آفات و بیماریها:
رازیانه یک گیاه شته دوست می باشد و در شرایط مناسب به گیاه حمله می کند. آفات در طول رویش ممکن است خسارات سنگینی به رازیانه وارد کنند. خسارت عموماً از جانب سنهای لکه دار(Cygaeus) که متعلق به خانواده میریده(Miridae) هستند وارد می شود. همچنین یکی دیگر از آفات مهم رازیانه شته است. این حشرات با مکیدن شیره گیاه سبب ضعف آن و کاهش عملکرد می گردند برای مبارزه با سنها می توان از سم دیتریفون(Ditrifon). و یا وفاتوکس (Wefatox) برای مبارزه با شته ها می توان از شکارگرهای طبیعی مثل کفشدوزکها و یا سموم شیمیائی سیستماتیک مثل متاسیتوکس استفاده شود)داس و همکاران 2008)
1-9- مهمترین خاصیت درمانی و داروهای ساخته شده:
تسکین دردهای قاعدگی و ضد سرفه از مهمترین خواص داروئی این گیاه است که فرآورده های تولید شده از رازیانه نیز با خواص فراوان دارویی، التیام بخش بسیاری از بیماری ها از جمله سرفه و سرماخوردگی است. رازیانه، نوعی گیاه دارویی است که مصارف مختلفی دارد . تمام بخش های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می تواند منجر به ایجاد دانه های پوستی، مشکلات تنفسی وحالت تهوع گردد. این گیاه دارای طعم تند، تلخ و شیرین است و کمی به طعم نعنا شبیه است. مصرف رازیانه باعث افزایش شیرمادر و نیز کاهش وزن می شود. قابل توجه: مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود. رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین و مواد معدنی است: فیبر، منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین C ، B3 و غیره ویتامین C موجود در پیاز رازیانه، ضد باکتری بوده و برای سیستم ایمنی بدن بسیار مفید است. علاوه برآن، این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول ، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می کند. رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می شود و به این ترتیب فرد، دچار حمله قلبی نمی شود.این گیاه دارویی،سموم بدن راپاک می کند و بیماری التهاب دهان رااز بین می برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط آورش، مفید است. بخار حاصل از جوشاندن برگ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می دهد.مصرف دانه های رازیانه، باعث تسکین دل درد می شود و عمل هضم را آسان تر می کند، کرم روده کودکان را از بین می برد، باعث تقویت چشم می شود، حساسیت های چشم را از بین می برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(سیپوریدیس و تومیریدیس، 2003)
تمام بخش ‌های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه‌ های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می‌ تواند منجر به ایجاد دانه ‌های پوستی، مشکلات تنفسی و حالت تهوع گردد.
اما توجه داشته باشید که مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود.
1-10- پیاز رازیانه
رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین، مواد معدنی و فیبر است. منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین Cو B3 از این موارد می باشند.
این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می ‌کند .رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می‌ شود و به این ترتیب برای افرادی که دچار حمله قلبی می‌ شوند، مفید است.
این گیاه دارویی، سموم بدن را پاک می ‌کند و بیماری‌ التهاب دهان را از بین می ‌برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط‌ آورش، مفید است.(کوبوریس و واسیلاکاکیس، 2006)
1-11- دانه رازیانه
بخار حاصل از جوشاندن برگ‌ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می ‌دهد. مصرف دانه‌ های رازیانه، باعث تسکین دل درد می‌ شود، عمل هضم را آسان ‌تر می ‌کند، کرم روده کودکان را از بین می ‌برد، باعث تقویت چشم می ‌شود، حساسیت ‌های چشم را از بین می‌برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(باقری و همکاران،1376 و دانشور حسینی،1387)

1-12- نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان
کشت بافت سلول گیاهی، روشی است برای تکثیر گیاهان که از طریق آن میتوان تعداد زیادی گیاه تولید کرد. کشت بافت گیاهی گستره وسیعی را در بر میگیرد که شامل کشت پروتوپلاست، سلول، بافت و اندام گیاهی است. کشت بافت همچنین پیش نیاز مهندسی ژنتیک است زیرا از سلول تغییر یافته باید بتوان یک گیاه کامل به وجود آورد. کشت بافت بر مبنای سه توانایی اصلی گیاه استوار است :
*قدرت باززایی یا توانایی ارثی یک سلول گیاهی برای رشد و تبدیل شدن به گیاه کامل در صورت فراهم بودن شرایط محیطی و محرکهای مناسب، اگر چه به لحاظ تئوری توانایی باززایی در تمام سلولهای گیاهی وجود دارد ولی سلولهای مریستمی بهترین سلولهایی هستند که قادر به بروز این قدرت میباشند.
*عدم تمایز یا قابلیت برگشت سلولهای بالغ گیاهی به شرایط مریستمی و تولید یک نقطه رشد جدید که با تمایز مجدد یا قدرت سازماندهی و تشکیل اندام جدید ادامه مییابد.
* شایستگی یا قابلیت درون زاد یک سلول یا بافت مشخص، به رشد در مسیری ویژه (کانلی و تیان ، 2007 و تانگ و همکاران ، 2001).
کشت بافت به عنوان یک روش کاربردی در پیشرفت‌های کشاورزی نقش بارزی داشته است. مثلاً کشت تخمک منجر به تلاقی‌های بین گونه‌ها و حتی جنس‌های مختلف شده است و ریزازدیادی به افزایش سریع جمیعت از یک گیاه برتر منتهی گردیده است. از طرف دیگر، کشت بافت به تنهایی نمی‌تواند پیشرفت‌های سریع مورد نیاز برای اصلاح و بهبود محصولات را فراهم آورد. با این وجود، کشت‌بافت همراه با ژنتیک مولکولی، قابلیت بیشتری برای بهبود سریع محصولات را فراهم می‌آورد. در همان حال که تکنیک‌های ژنتیک مولکولی DNA ژن‌ها را دست‌ورزی می‌نماید، کشت سلول و بافت برای مهندسی ژنتیک ضروری خواهد بود زیرا اطلاعات ژنتیکی خارجی DNA به یک گیاه کامل وارد نمی‌شود بلکه به یک سلول وارد می‌شود. فناوری درون شیشه‌ای واسطه‌ای برای تبدیل تک سلول تغییریافته به یک گیاه کامل می‌باشد (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
ریزازدیادی به عنوان یکی از روش های نوین افزایش انبوه گیاهان به ویژه پایههای درختان میوه در چند دهه اخیر بیشتر مورد توجه بوده است. پایههای رویشی تولیدی غالبا عاری از آلودگی ، دارای خلوص ژنتیکی و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه هستند که برای تولید و احداث باغات یکدست و متراکم استفاده میشوند. استفاده از دورگههای بین گونهای به خصوص برای درختان میوه هستهدار در کشورهای پیشرفته بیشتر معمول شده است. از آنجایی که اساس احداث باغهای مکانیزه بر تولید نهالهای رویشی و یکسان استوار است لذا بررسی روشهای تکثیر رویشی مناسب به خصوص ریز ازدیادی برای تولید انبوه پایهها حائز اهمیت است. (سولوسوگلا، 2002)
اهمیت استفاده از روش کشت بافت گیاهی برای تکثیر گیاهان دارویی در حال افزایش بوده و این روش برای تکثیر بسیاری از گیاهان دارویی استفاده می شود. از جمله مزایای مهم تکثیر از طریق کشت بافت نسبت به روشهای دیگر، ایجاد گیاهان سالم، تکثیر در طول سال، احتیاج به مکان کم و هزینه کمتر است. در مراحل مختلف کشت بافت گیاهی جهت رسیدن به هدف، ممکن است از دما، نور، نوع ریزنمونه، زمان و یا محیط کشتهای مختلف با ترکیبات متفاوت استفاده شود. همچنین مدیریت آلودگی و مواد بازدارنده نیز از مسایل مهم کشت بافت است. بنابراین بدست آوردن بهترین روش برای هر گیاه از اهداف آزمایشات در این علم می باشد و این امر با تغییر فاکتورهای موثر در کشت بافت امکان پذیر میگردد. بهبود حتی چند درصدی در تولید گیاهچه در هر بار کشت میتواند در مقیاس سال برای تولید کننده از اهمیت اقتصادی زیادی برخوردار باشد.(شریفی و همکاران، 1389)
1-13- تاریخچه کشت بافت
در طول قرن 19، ایده تولید کالوس از قطعات ساقه و انتهای ریشه به واقعیت پیوست. کالوس عبارت است از یک توده سلولی از سلولهای در حال تقسیم فعال که تمایز نیافتهاند. بعد کالوس از جوانهها، قطعات ریشه و شاخساره نیز تهیه شد. برای اولین بار هامبرلت در سال 1902 واژه کشت بافت سلول را بکار برد. او تلاش کرد که سلولهای گیاهی جدا شده را بطور درون شیشهای بر روی یک محیط غذایی مصنوعی حاوی محلول Knop (شامل پپتین، آسپارژین، و ساکاروز) کشت کند. واژه کشت بافت میتواند برای هر کشت چند سلولی بر روی محیط غذایی بکار برده شود (شریفی و همکاران، 1388). تکنولوژی کشت بافت گیاهی، کاربردهای متفاوت و فراوانی دارد از آن جمله میتوان از ریزازدیادی که اساس صنعت تولید انبوه گیاهان است نام برد. پیشرفت مطالعه جنبههای متفاوت رشد و تمایز گیاهان در دهه 1960 و 1970 بسیار سریع بوده است. به کمک تکنیک کشت گیاهان مطالعه و تحقیق در زمینههای مختلف از جمله مورفولوژی، فیزیولوژی، بیوشیمی، بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک فراهم شده است. تکثیر سریع ارکیده از طریق کشت کورم اولیه توسط مورل (1960) منجر به تاسیس اولین صنعت تکثیر سریع ارکیده بر اساس کشت بافت شد. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشهای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه میشود، این تکنیک به عنوان یکی از شاخههای زیست فناوری، کاربرد گسترده ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت میشود. در این نوع کشت، شرایط به گونهای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشهای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلولها و بافتها میباشد (شریفی و همکاران، 1389).
1-14- مراحل تکنیک کشت بافت
از زمان تهیه ریز نمونه تا به دست آوردن گیاه جدید مراحلی وجود دارد که ابتدا شامل چهار مرحله شروع و برقراری کشت ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال به خاک بود (موراشیگ ، 1974) . بعدا دبرگ و مین یک مرحله به نام مرحله صفر یعنی مرحله انتخاب گیاه مادری و آماده سازی را ارائه نمودند. در نهایت امروزه برای ریز ازدیادی مراحل زیر را در نظر می گیرند که شامل پنج مرحله ی آمادگی ، آغازی ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال است. در هر یک از این مراحل ، شرایط باید به گونه ای فراهم گردد که امکان دستکاری رشد گیاه در جهت مورد علاقه فراهم گردد. اکثر این عوامل هم آنهایی هستند که رشد و نمو طبیعی گیاهان را تنظیم می کنند. در مرحله صفر یا همان آمادگی هدف به دست آوردن گیاهانی است که به آب و مواد غذایی و شرایط محیطی نظیر نور و درجه حرارت و.. دسترسی داشته و از نظر سلامتی مشکلی نداشته باشند و بتوان از آنها جهت تهیه ریز نمونه استفاده کرد. در مرحله بعدی نیز که مرحله آغازی نام دارد هدف انجام کشت های بدون آلودگی است که ریز نمونه در محیط کشت مستقر می شود.
مرحلهی صفر: مرحله پیش ازدیادی یا انتخاب و پیش تیمار گیاهان مناسب
در این مرحله گیاهان مادری که در شرایط گلخانه ای با کمترین میزان آلودگی هستند انتخاب می شوند. قبل از جمع آوری نمونههای گیاهی برای به حداقل رساندن میزان آلودگی باید گیاهان مادری با قارچ کشها و حشرهکشها سمپاشی شوند تا میزان آلودگی در کشت درون شیشه ای به حداقل برسد، کاهش آلودگی باعث رشد بهتر و تکثیر سریع تر نمونهها در محیط کشت میشود. کنترل آلودگیها به طور معمول با پیش تیمار گیاهان مادری شروع میشود.(دبرگ و مین، 1981)
مرحله ی 1 : مرحله ضد عفونی سطحی و استقرار ریز نمونهها از درخت مادری
اولین مرحله در ریز ازدیادی ضد عفونی سطحی ریز نمونهها می باشد. وقتی نمونهای سالم در شرایط استریل قرار میگیرد، میتواند به سرعت تکثیر شود. این مرحله حساسترین مرحله در ریز ازدیادی است چرا که اغلب نمونهها در این مرحله در بیشتر موارد به علت آلودگیهای میکروبی از بین میروند. در این مرحله ریز نمونهها که به صورت قطعات کوچک تقسیم شده اند با مواد شیمیایی مانند هیپوکلریت سدیم و اتیل الکل ضدعفونی سطحی و بعد از آن چندین بار با آب مقطر استریل آبشویی میکنند. بعد از یک دوره کوتاه 3 تا 5 روزه آلودگی ریزنمونهها در محیط کشت مشخص میشود و نمونههای آلوده حذف شده و نمونههای سالم واکشت میشوند. در مرحله ضد عفونی ریز نمونهها باید دقت شود غلظت مواد ضدعفونی و مدت زمان استفاده از آنها به اندازهای نباشد که به بافت ریز نمونهها صدمه زده و مرگ سلولی را سبب شده و باعث قهوهای شدن و از بین رفتن آنها شود. (جورج، 2008 )
مرحله 2: تکثیر و پرآوری ریز نمونهها


این مرحله که فاز تکثیر است، گیاهچههای حاصل از استقرار در محیط کشت مخصوص تکثیر میشوند. هدف اولیه در این مرحله تکثیر ریز نمونهها بدون از دست دادن ثبات ژنتیکی آنها است. واکشت نمونهها که می توانند به صورت، جوانههای جانبی و انتهایی، جنینهای سوماتیکی و دیگر ارگانها باشند، در محیط مخصوص تکثیر باعث افزایش تعداد نمونهها میشود. گاهی اوقات ضروری است که شاخههای تکثیر شده به محیط کشت دیگری برای طویل شدن منتقل شوند . طی واکشتهای متوالی مقدار مورد نیاز از اندام گیاهی تولید میشود. (موراشیگ ، 1974)
مرحله 3: ریشه دهی زیر شاخهها
شاخههای به دست آمده از مرحله دوم، در این مرحله برای تکمیل فرایند ریز ازدیادی باید ریشهدار شوند. بیشتر گیاهان در مرحله ریشه دهی نیاز به محیط کشتی با نصف عناصر ماکرو دارند. در این مرحله معمولا از تنظیم کنندههای رشد متفاوت از مرحله پرآوری استفاده میشود. برای موفقیت مرحله سازگاری و انتقال به خاک ، گیاهچههای دارای ساختمان ریشه مناسب و قوی ضروری است. این مرحله نیاز به کار زیاد دارد و غالبا گران است. بطوری که محاسبه شده که حدود 35 تا 75 % از کل هزینههای تولید را شامل میشود.(جورج، 1993)
مرحله 4: مرحله سازگاری به شرایط طبیعی
این مرحله آخرین مرحله از کشت درون شیشه ای است که نمونههای تکثیر شده برای انتقال به گلخانه آماده میشوند. نمونههای تکثیر شده در شرایط درون شیشهای ، تمایل به رشد انفرادی و انجام عمل فتوسنتز دارند. نمونهها به تدریج از شرایطی با رطوبت زیاد به رطوبت کم و از شدت نور به شدت نور زیاد و دمای محیطی متغیر منتقل میشوند. اگر نمونهها در محیط کشت جامد باشند، قبل از انتقال باید آگار چسبیده به اندامهای گیاهچه به آرامی توسط آب شسته شود و سپس در خاک مناسب در گلدانهای کوچک کشت شوند. نمونهها به تدریج میتوانند بعد از 3 تا 6 روز به محیط جدید با شرایط نوری طبیعی وارد شوند و بعد از آن گیاهان به مخلوط ماسه، پیت و یا کمپوست منتقل میشوند و به تدریج سازگار میگردند. آبیاری مرتب نمونهها (روزهای اول انتقال به خاک با نصف غلظت محیط کشت) و مبارزه با عوامل بیماری زا و آفات از ضروریات انتقال موفق است (جورج، 1993؛.اهلووالا، 2002).
1-15- انواع ترکیبات محیط کشت
برای انجام موفقیت آمیز کشت بافت لازم است که یک محیط متناسب با رشد گیاه با توجه به نیازهای روزانه آن که عاری از هر گونه آلودگی است تهیه گردد. برای این کار لازم است پژوهشگر با انواع نیازهای یک گیاه آشنایی داشته و بتواند این مواد را با هم ترکیب کرده و یک محیط عالی برای رشد نمونه خود آماده کند. به طور کلی مواد مورد استفاده در محیطها شامل مواد معدنی، ترکیبات آلی، مواد طبیعی و مواد کمکی میباشد که در زیر به طور مختصر در مورد هر کدام توضیحاتی داده خواهد شد.
مواد معدنی
شامل دو گروه ماکروالمنتها (ازت ، فسفر ، پتاسیم ، کلسیم ، منیزیوم و گوگرد) و میکروالمنتها (مس، روی، آهن، منگنز، کبالت، بر و ید) میباشد که به صورت نمک به محیط اضافه می شوند.
منبع هیدرات کربن
چون ریز نمونهها فاقد هیدرات کربن هستند و یا اگر کلروفیل هم داشته باشند، به علت تاریکی و کمبود دی اکسید کربن در محیط قادر به انجام فتوسنتز نیستند، لذا لازم است که ساکارز به عنوان منبع هیدرات کربن به محیط اضافه گردد. شکر از عوامل مهم و ضروری در هر محیط کشت غذایی میباشد و برای رشد و نمو سلولها ، بافتها ، اندام-ها و گیاهچهها ضروری است. وقتی یک ریز نمونه روی محیط غذایی قرار داده می شود. در ابتدا رنگ سبز خود را از دست می دهد و بنابراین نمیتواند غذای خود را فراهم کند چون قادر به فتوسنتز نیست. پس این سلولها باید به نحوی که با منبع خارجی انرژی کربنی، تغذیه شوند. ساکارز معمول ترین منبع انرژی کربن در کشت بافت است. به جز ساکارز ، منو ساکاریدهایی مثل گلوکز و فروکتوز که منابع قابل سوخت و ساز انرژی کربنی هستند میتواند به طور معنیدار ، رشد سلولهای گیاهی را نسبت به ساکارز افزایش دهند. (پیری و نظریان 1380) .
1-16- ویتامینها
ویتامینها نقش کاتالیزوری داشته و در گیاهان سنتز میشوند. در کشت بافت بسیاری از ویتامینها توسط
سلولهای در حال رشد و نمو سنتز میشوند اما مقادیر ساخته شده کمتر از مقادیر مورد نیاز است. از اینرو لازم است ویتامینهای ضروری را به مقدار مورد نیاز به محیط کشت اضافه نمود. ویتامینهای گروه B مانند تیامین، اسید نیکوتینیک، پیریدوکسین، و میواینوزیتول نسبت به بقیه بیشتر مورد نیاز هستند. از بین آنها تیامین نقش مهمتری دارد )پیری و نظریان، 1380).
1-17- اسیدهای آمینه
اسیدهای آمینه و آمینها می توانند اهمیت زیادی در ریختزایی داشته باشند. تمام فرمولهای اسید آمینه، فرم های طبیعی موجود در گیاه هستند این مواد میتوانند شاخهزایی یا ریشهزایی را افزایش دهند. آمینواسیدها هنگام کاهش نیتروژن نقش خود را ایفا میکنند. در صورت ناکافی بودن نیتروژن، مکمل نیتروژن آلی کمپلکس مانند کازئین هیدرولیزات) 5/5گرم بر لیتر( ممکن است افزوده شود. سایر مکملهای آلی عبارتند از شیر نارگیل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو. هرچند محیطهای کشت سنتتیک ترجیح داده میشوند و مکملهای آلی که طبیعت شیمیایی ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروری بکار میروند) جورج و همکاران، 2008) .
1-18- تنظیم کنندههای رشد
هورمونها موادی هستند که در یک بخش گیاه ساخته شده و از خلال بافتها حرکت کرده تا به فعالیت سلولها در بخش دیگری تاثیر بگذارد برای مثال سایتوکنین ساخته شده در ریشه به ساقه منتقل شده و سبب رشد ساقه میگردد. حال اگر رشد متوقف شود تحویل سایتوکنین کاهش یافته و رشد اندامهای هوایی کاهش مییابد. این مقدمه اهمیت هورمونها را مشخص میسازد ولی در کشت بافت هورمونهای زیر بیشتر مورد استفاده قرار میگیرند. این گروه شامل اکسین طبیعی مثل ایندول استیک اسید (IAA) و اکسین های مصنوعی نظیر ایندول بوتریک اسید (IBA) ، نفتالین استیک اسید (NAA) هستند که اکسین های مصنوعی فعال تر از اکسین طبیعی هستند. همچنین اکسین های مصنوعی به وسیله آنزیم های موجود در بافت های گیاهی تجزیه نمی شوند. اکسین معمولا شروع ریشه دهی و رشد کالوس را تحریک می کند ولی رشد ریشه و جوانه های بالینی جلوگیری می کند ، سبب طویل شدن و رشد سلولی و تقسیم سلولی نیز می شوند. در غلظت بالا باعث رشد ریشه های نابجا می شود و در غلظت کم سبب تشکیل ساقه نابجا می شود. (اربنوا و همکاران، 2002)
1-19- سایتوکنین :
کشف سایتوکنینها رابطه نزدیکی با کشت بافت دارد. در مرحله شروع کشت بافت گیاهی مشاهده شد که مالت، عصارههای نارگیل و مخمر، رشد و القای جوانههای درون شیشهای را رونق میبخشند (مشایخی، 1387). سایتوکنینها شامل سایتوکنینهای طبیعی 2ip و زآتین و سایتوکنین مصنوعی نظیر بنزیل آمینو پورین (BAP ) و کینتین هستند. مزیت انواع مصنوعی این هورمون، فعالیت بیولوژیکی بالا و ارزان بودن آنها نسبت به انواع طبیعی است. این هورمون باعث تورم بافتها شده و ازدیاد شاخه و تقسیم سلولی را تحریک کرده ولی از شروع ریشهدهی جلوگیری میکند. این هورمون در تحریک نمو جوانههای جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار اهمیت دارد. به علت پایدار بودن در برابر گرما این هورمون را میتوان قبل از اتوکلاو به محیط کشت اضافه کرد.(کرسا و همکاران، 2012)
1-20- اسید جیبر لیک :
این گروه تاکنون بیش از 100 ترکیب است که رایج ترین نوعی که در کشت بافت استفاده می شود ، GA3 است. ناپایدار در برابر گرما است بنابراین بعد از اتو کلاو و از طریق فیلتراسیون ضد عفونی شده و به محیط افزوده میشود. کاربرد این هورمون نیز طویل شدن ساقهها و رشد طولی میانگرهها است و از پدیده خواب جلوگیری کرده و آن را از بین میبرد. باید این نکته را یادآور شد که اگر میزان نسبت اکسین به سایتوکنین افزایش یابد ریشه زایی صورت میگیرد و اگر این نسبت کاهش یابد سبب ساقهزایی میشود و اگر بینابین باشد کالزایی افزایش پیدا می کند (معینی و کهریزی ، 1382).
1-21- آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل
آگار از رایجترین عوامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده میشود. آگار پلی ساکارید پیچیدهای است که از برخی گونههای نوعی جلبک به دست میآید. غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت و ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی بالای آن منجر به تنش آب در محیط میشود و غلظتهای کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله شده تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریز نمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر میشود. به علاوه کشت ریز نمونه روی محیط کشت مایع میتواند باعث شیشهای شدن کشت شود. تصور میشود آگار دارای توانایی جذب مواد است که این توانایی میتواند در حذف مواد زاید سلولی از محیط کشت به روش مشابه زغال فعال عمل نماید. همچنین این خاصیت میتواند مانع از جذب برخی مواد شیمیایی به بافت کشت شده شود. یکی از موادی که به شدت توسط آگار جذب میشود سیتوکینین است. بنابراین غلظت بیشتر آگار ، جذب سیتوکینین از محیط کشت را برای بافت مشکل میکند. متداولترین جایگزین آگار، ژل رایت است. این ماده یک پلی ساکارید پیچیده خارج سلولی است که توسط باکتری Pseudomonas elodea تولید میشود . ژل رایت نسبت به آگار دارای مواد معدنی آزاد و ناخالصیهای آلی کمتری است. البته دارای غلظتهای بالای پتاسیم و منیزیم میباشد. تنها مشکل ژل رایت این است که بعضی از کشتها در ژل رایت سریع تر از آگار ، شیشهای میشوند. اغلب ژل رایت را همراه با آگار و با نصف غلظت های مورد نیاز هر کدام به کار میبرند. به این وسیله از مزایای هر دو ماده استفاده میشود و معایب آنها نیز کاهش مییابد (باقری و همکاران 1383).
1-22- ترکیبات مورد استفاده در ضد عفونی مواد گیاهی
ضد عفونی یا استریلیزاسیون شیمیایی میتواند به روشهای مختلف انجام شود : (باقری و همکاران 1383 و باقری و صفاری 1376)
1- الکل (اتانل): برای ضد عفونی مواد گیاهی از الکل 70 درصد استفاده میشود ، زیرا الکل 96 درصد باعث دهیدراته شدن بافتها میشود. از الکل 96 درصد اغلب برای ضد عفونی ابزار و میز کار استفاده میشود.
2- هیپوکلریت سدیم (وایتکس): دارای 5 درصد ماده فعال است. معمولا از هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد استفاده می شود. چنانچه گیاهان به هیپوکلریت سدیم حساس باشند از هیپوکلریت کلسیم برای ضد عفونی استفاده میشود.
3- هیپو کلریت کلسیم: این ماده به صورت پودر است و میتوان آن را به خوبی در آب معمولی حل کرد و محلولی شفاف به دست آورد (اغلب صاف میشود). هیپوکلریت کلسیم نسبت به هیپوکلریت سدیم، آهستهتر وارد بافتهای گیاهی میشود.
4- کلرید جیوه: این ماده برای گیاه ، انسان و دام خیلی سمی است و غلظت 01/0 تا 05/0 درصد برای مدت 2 تا 12 دقیقه برای ضد عفونی به کار میرود.
1-23- استفاده از آنتی بیوتیکها در رفع آلودگیهای درون بافتی
آلودگیهای داخلی در کشت درون شیشهای درختان یکی از مشکلات بسیار جدی بوده و اغلب به علت وجود میکرو ارگانیسمهایی اتفاق میافتد که در داخل گیاه هستند و نمیتوان آنها را از طریق مواد ضد عفونی کننده خارجی از بین برد. اگر منشا آلودگی در داخل بافتهای گیاهی باشد، آلودگی معمولا هنگامی ظاهر میشود که محل آلودگی قطع شده و در هنگام واکشت امکان باز شدن و تماس با محیط کشت فراهم میشود. اغلب آلودگیهای داخلی بعد از چند واکشت آشکار میشوند. رشد ضعیف و یا نکروزه شدن بافتها، میتواند نشانه یک نوع آلودگی داخلی، مثلا به باکتری باشد به طور کلی دو راه برای مبارزه با این مسئله وجود دارد: (باقری و صفاری، 1376 و ذوالفقاری نسب، 1382).
1- کشت مریستم (چون سلول های ناحیه مریستم عاری از عوامل بیماریزا هستند)
2- اضافه کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت
اغلب پاتوژنهایی که برای گیاه مادری خطری ندارند وقتی در محیط کشت درون شیشهای قرار میگیرند، باعث ایجاد خسارت جدید و از بین رفتن مواد گیاهی میشوند. در رفع آلودگیهای داخلی گاهی استفاده از آنتیبیوتیکها مهمترین راهکار میباشد. اتوکلاو کردن آنتیبیوتیک و یا اضافه کردن آن در دمای بالا به محیط کشت باعث کاهش اثر آنتیبیوتیک میشود (الیویرا و همکاران، 2010(.
1-24- ضد عفونی محیط کشت
در بیشتر موارد محیطهای کشت با استفاده از اتو کلاو استریل میشوند و استریل در اتو کلاو توسط بخار آب انجام میشود. با قرار دادن اشیا یا مواد در معرض بخار تحت فشار در دمای 121 درجه سانتی گراد و در مدت 10 تا 30 دقیقه کلیه میکروارگانیسمها از بین میروند. موادی که امکان استریل خشک آنها وجود دارد (مثل لولههای آزمایش، فلاسکها، پتریدیشهای خالی ، کاغذ و ابزارکار) به مدت 2 تا 3 ساعت در دمای 180 درجه سانتیگراد به صورت خشک در آون استریل میشوند. برای استریل موادی که در ضمن اتو کلاو کردن به دلیل حساسیت به گرما ، خاصیت خود را از دست میدهند ، از فیلترهای غشایی استفاده می شود که از جنس استات سلولز یا نیترات سلولز ، با منافذی به قطر 22/0 تا 45/0 میکرون بوده و با به کار بردن آنها، میکروارگانیسمهایی که بزرگتر از قطر منافذ هستند، حذف میشوند (باقری و صفاری 1376 ؛ امین و همکاران 2009 ).
1-25- قهوهای شدن بافتهای گیاهی
قهوهای شدن بافتهای گیاهی و در نتیجه آن محیط کشت، از جمله مشکلاتی است که در اغلب کشتهای تک جوانهای در درختان میوه دیده میشود. این پدیده ارتباط با نوع رقم گونه گیاهی دارد و میزان قهوهای شدن در یک رقم، در فصول مختلف و بسته به سن گیاه مادری میتواند متفاوت باشد. قهوهای شدن اغلب در گونههای گیاهی که دارای مقدار زیادی تانن و یا دیگر انواع هیدروکسی فنلها هستند، رخ میدهد. ایجاد زخم در اثر جدا کردن بافتها باعث ایجاد پلی فنل اکسیداز میشود که این عامل اصلی اکسیداسیون ترکیبات فنلی است. آزاد شدن مواد فنلی موجب قهوهای شدن ریز نمونه و محیط کشت شده و باعث توقف رشد ریز نمونهها و یا مرگ آنها میشود. این قهوهای شدن بافتها یک پدیده خود کاتالیزوری است. بطوریکه ترکیبات فنلی آزاد شده باعث صدمه به بافت شده که این عمل باعث افزایش آزاد شدن ترکیبات فنلی میشوند (ایزد پناه، 1380 ؛ سیدهو، 2010).
قهوهای شدن و نکروزه شدن در ریز نمونهها ارتباط معنی داری با روشهای ضد عفونی دارد. نمونههای برگ دار به خاطر حساسیت زیاد به غلظتهای بالاتر مواد ضدعفونی، بیشتر از نمونههای بدون برگ قهوهای و نکروزه میشوند. در این میان دو ماده کلرید جیوه و نیترات نقره از بقیه مواد قویتر میباشند چرا که هر دو از فلزات سنگین بوده و دارای قدرت بالایی در واکنش با پروتئین دارند که سبب تقویت متابولیسم سلولی می شوند. در حالی که هیپو کلرید سدیم و کلسیم به خاطر درجه فعالیت کمتر، میزان خسارت وارد شده به ریز نمونهها در آن کمتر است. البته غلظتهای بالای این دو ماده نیز میتوانند باعث قهوهای شدن و نکروزه در ریز نمونهها شوند ) کمالی، 1378).
میری و همکاران (1382) در مطالعهای که بر روی بررسی کاهش اکسیداسیون فنلی و پرآوری پایههای پا کوتاه سیب انجام دادند، پیشنهاد کردند که نمونههای تازه کشت شده به مدت 6 روز در یخچال نگهداری شوند که این کار در جلوگیری از فنلی شدن بسیار موثر بود. در مرحله پر آوری ترکیب 2ip با کینتین نیز بهتر از بقیه تیمارها جواب داد:
راه حلهایی که برای کاهش فنلی شدن میتوان ارایه داد شامل :
-گرفتن ریز نمونه در زمانهای خاص که میزان ترکیبات فنلی حداقل باشد.
- در مورد سن ریز نمونه، ریز نمونههای حاصل از گیاهان نونهال کمتر از گیاهان بالغ قهوهای میشوند.
-قرار دادن ریز نمونهها در آب مقطر به مدت 3 ساعت قبل از کشت باعث کاهش مواد فنلی میشوند.
- استفاده از تیمارهای ضد اکسیداسیونی
- تکرار واکشتها در فاصله زمانی کوتاه باعث جلوگیری از انتقال مواد فنلی به سلولهای سالم میشود. حذف بخشهای قهوهای و یا تجدید محیط کشت باعث کاهش تجمع مواد فنلی میشوند که علاوه بر سمیت به دلیل خاصیت خود کاتالیزوری باعث ترشح بیشتر مواد فنلی میشوند (کمالی، 1374 ؛ میری و همکاران، 1382).
ذوالفقار نسب (1382) با بررسی بر روی کلروزه و نکروزه شدن بافتها نشان داد که نوع محیط کشت عامل مهمی در ایجاد نکروزه شدن و کلروزه شدن است. عواملی مثل رشد سریع گیاهچهها در محیطی مثل MS به دلیل وجود مقادیر زیادی از نیترات، تماس نوک برگها با دیواره ظروف کشت ، تجمع رطوبت به صورت قطره در انتهای برخی از برگها و واکشت کردن با فواصل طولانی و در نتیجه کمبود برخی عناصر غذایی از جمله عوامل موثر در کلروزه و نکروزه شدن انتهای برگها است. این در حالی است که در محیط WPM این مشکلات کمتر دیده شده است. کلسیم به عنوان عنصر مهمی در دیواره سلولی از تحرک کمتری در بافتهای گیاهی برخوردار است و حرکت آن تابع تعرق گیاه است. در شرایط درون شیشهای ، وقتی میزان رطوبت بالا باشد به علت تعرق کم ، جذب کلسیم پایین میآید و در نتیجه قهوهای شدن و مرده شدن بافتها به علت تخریب سلولها اتفاق میافتد.(حسین و همکاران، 2003)
1-26- روشهای ریزازدیادی
ریزازدیادی عبارت است از تکثیر درون شیشهای گیاه با استفاده از اندامها، بافتها، سلولها، پروتوپلاسم و غیره. اگر چه برخی منابع بیان داشتهاند که جهت ریزازدیادی میتوان از تکنیکهای کشت جوانه، نوک ریشه، برگها، رویان، پرچم و حتی سلول استفاده کرد ولی شناخته شدهترین معنی ریزازدیادی کشت جوانههای منفرد و شاخساره میباشد. از این رو معمولاً کشت شاخساره و ریزازدیادی مترادف هم بکاربرده میشود. کشت نوک شاخساره بطور وسیعی در کشاورزی، باغبانی و جنگل کاری استفاده میشود. (شریفی و همکاران، 1388). در این تحقیق با توجه به اینکه روش جنینزایی غیرجنسی و کشت جوانه انتخاب شده است به توضیح آنها خواهیم پرداخت:
1-27- جنین زایی غیر جنسی
جنینهای غیرجنسی یا مستقیما بر روی ریزنمونه ظاهر میشوند(جنین زایی مستقیم) یا غالبا از کشت کالوسها بوجود میآیند (جنین زایی غیرمستقیم). این روش از نظر حفظ ثبات ژنتیکی صددرصد تایید شده نیست، هر چند جنینزایی غیرجنسی در کشت سلولی جهت توسعه و پیشرفت تکنولوژی تولید انبوه بوسیله راکتورها و همچنین در تولید بذر سنتزی از طریق کپسوله کردن بسیار مفید واقع می شود. بنابراین، این روش زمانی که استاندارد خیلی بالایی در ثبات ژنتیکی مد نظر نیست میتواند مورد استفاده قرار بگیرد. سلولهای گیاهی دارای خاصیت توتی پوتنسی هستند یعنی میتوانند یک گیاه کامل جدید را تحت شرایط مطلوب تولید کنند. استوارد و همکارانش در امریکا و رینرت در آلمان تقریبا بطور همزمان برای اولین بار تشکیل جنین غیرجنسی در کشت سوسپانسیون سلولی هویج را در سال 59- 1958 گزارش کردند. این جنین های غیرجنسی در رشد و ساختار مشابه جنین های جنسی بودند(شکل 1-4).
755650top
شکل 1-4 مراحل رشد جنینهای جنسی و غیرجنسی
این جنینهای غیرجنسی از نظر مورفولوژیکی به ترتیب مراحل زیر را طی میکنند: کروی، قلبی و اژدری. از ظهور لپهها میتوان به تفاوت مرحله لپهای بالغ و جنین مرحله قلبی/ اژدری پی برد. در مرحله اژدری تمایز سلولی منجر به تشکیل مریستم ساقه و ریشه میشود. جنینزایی یک روند دو مرحلهای میباشد. اولین مرحله، القا جنینزایی و دومین مرحله رشد جنین میباشد که در نهایت منجر به جوانه زدن میشود. نیازهای القا جنین و رشد جنین متفاوت هستند بنابراین محیطهای متفاوتی برای هر مرحله بهکار میرود (مارتینز رویز و همکاران، 2002 ). چهار مرحله را توصیف می کند: القا، رشد اولیه، بلوغ جنین و جوانه زدن. این مراحل از نظر ساختار مورفولوژیکی و همچنین در نیازهای فیزیکی- شیمیایی تفاوت دارند.
1-28- کشت مریستم
مریستمها را بر اساس خصوصیاتی از جمله محل استقرار، منشاء، نوع بافتی که ایجاد میکنند، ساختمان سیتولوژیکی و سرانجام رشد و تمایز، تقسیم بندی میکنند. براساس محل استقرار، مریستمها را به سه گروه تقسیم بندی میکنند:
مریستمهای انتهائی که در رأس ساقه و یا نوک ریشه قرار دارند.
مریستمهای جانبی که به موازات سطح اندامِ محل استقرار خود، تمرکز مییابند.
مریستمهای بین سلولی یا مریستمهای بینابینی که در پهنه بافتهای دیگر مستقر میشوند (نجاحی، 1370).1-29- باززایی
باززایی گیاهان از یک سلول یا اندام گیاهی از قابلیت های کشت بافت است که با کشف هورمونهای گیاهی امکانپذیر گردید. توانایی باززایی گیاه از یک سلول منفرد برای دستورزی ژنتیکی موجودات حائز اهمیت است. در گیاهان امکان باززایی یک گیاه کامل از یک سلول منفرد وجود دارد و این نوعی تکثیر غیر جنسی در گیاهان محسوب میشود. علاوه بر این، کشت بافت برای مطالعات پایهای در سلولهای حیوانی و گیاهی و دستورزی میکروارگانیسمها حائز اهمیت میباشد.(شارما و همکاران، 2000)
1-30- باززایی گیاهان کشت شده
اغلب هدف نهایی هر نوع کشت سلولی، باززایی گیاهان مورد نظر است، برخی گیاهان به خوبی در شرایط درون شیشهای باززایی میشوند و برخی دیگر مشکل دارند. درصد باززایی در گیاهان بسته به گونه گیاه، شرایط محیط و ترکیبات هورمونی متفاوت است. باززایی به دو روش مستقیم و غیر مستقیم صورت میگیرد. در روش مستقیم ابتدا بافتهای مریستمی کشت شده و سپس از اندامزایی مستقیم (شاخهزایی و ریشهزایی) برای باززایی گیاهان استفاده میشود. در این نوع کشت، شاخههای فراوانی از بافت ریزنمونه بدون واسطه کالوس تولید میشود. در روش باززایی غیر مستقیم عموماً تولید گیاهان با واسطه کالوس صورت میگیرد. یعنی ابتدا بافت ریزنمونه وادار به تشکیل کالوس میشود و سپس از کالوس اندامزایی صورت میگیرد. مسیر دیگری برای باززایی گیاهان از کالوس، تولید اجسام شبه جنینی در بافت کالوس است که این فرایند جنینزایی سوماتیکی نامیده میشود. در صورتی که هورمون اکسین از محیط کشت حذف شود، برخی سلولهای کالوس به حالت مریستمی در آمده و تولید اجسام شبه جنینی را میکنند. این جنینها به علت اینکه از بافتهای سوماتیکی منشاء میگیرند، به عنوان جنینهای سوماتیکی شناخته میشوند. این جنینهای نابجا قابل انتقال به محیط مناسب بوده و گیاه کامل را تولید میکنند(شریفی و همکاران، 1389).
1-31- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشهای
به طور معمول 4 مرحله جهت تکثیر درون شیشهای گیاهان مدنظر است که شامل استقرار در محیط کشت، ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشتهای متوالی و در نهایت ریشهزایی گیاهچههای تولید شده و سازگار کردن آنها با شرایط گلخانه و بیرون می باشد
1-32- استقرار در محیط کشت
مرحله استقرار از مهمترین مراحل در طی ریزازدیادی می باشددر طی این مرحله، ریزنمونه ها گندزدایی شده و در محیط کشت های استریل و در شرایطی عاری از بیماری زا، کشت می شوند. از اهداف اولیه مرحله استقرار تولید درصد بالایی از ریزنمونههای عاری از آلودگی سطحی است. آلودگیهای درونی و ترشح ترکیبات فنلی از ریزنمونه ها،مرحله استقرار را مشکلساز می کند(استیکلن و اورابی،2005).
1-33- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشتهای متوالی
دومین مرحله از ریزازدیادی محسوب می شود که در آن ریزنمونهها تکثیر یافته و بر تعداد آنها افزوده می شود. بعد از عبور از مرحله استقرار، ریزنمونه ها باید به سمت شاخه زایی هدایت شوند، بنابراین با تغییرات هورمونی می توان به این امر نزدیک شد. همچنین محیط کشت می توان به همان صورت قبل باقی بماند یا اینکه تغییر کند که به نوع گیاه بستگی دارد ( سعادت و هنرتی ، 2002).
1-34- ریشهزایی گیاهچههای تولید شده
مرحله ریشهزایی بستگی زیادی به مرحله پرآوری دارد زیرا نمونه ها بایستی از نظر طول شاخه ها، سطح برگ و توانایی لازم برای شروع یک زندگی اتوتروف مناسب باشند، چرا که شاخساره هایی که در این مرحله ریشه دار می شوند به محیط بیرون انتقال داده خواهند شد. این مرحله نیز با ترکیبات هورمونی متفاوتی همراه است و معمولاً از غلظت سیتوکنین ها کاسته می شود(پراکسی و همکاران، 2005). همچنین ریشه زایی در شرایط درون شیشه ای دارای چندین مزیت است: از جمله این که در مدت ریشه زایی کمتر در معرض بیماری ها و تنشهای محیطی قرار می گیرد و در نتیجه ریشه هایی استریل و گیاهان عاری از بیماری تولید می شود. از معایب این روش می توان از زیادتر بودن قیمت نهال ها برای تولید در سطح تجاری و محدود بودن رشد ریشه ها به فضای داخل شیشه نام برد. در رابطه با فاز ریشهزایی، سعادت و هنری(2001) بالاترین درصد ریزشاخسارهای ریشهدار شده را با IBA در مقایسه با NAA بدست آوردند. آنها همچنـین پیشنهاد کردند که القاء ریشهزایی تحت شرایـط تاریکی(به مدت 9 روز) در حضور اکسین صـورت بگیرد، این عمـل ریشـهدار شدن ریز شاخـسارهها را تا 83% امکانپذیر مـیساخت. از طرف دیگر، سانچز-اولت (1996) نشان داد که راندمان ریشهزایی 85 درصدی از القاء ریزشاخسارهها در محیط کشت MS با عناصر اصلی رقیق شده تا 25% در تاریکی مطلق حاصل میشود. زمان القاء به غلظت اکسین بکار رفته بستگی دارد. برای غلظت 3 میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید حداقل 7 روز، در حالی که برای غلظت 5 میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید 3 روز بطول بی انجامد. وحدتی و همکاران (2004) نشان دادند که اختلاف سرعت ریشهزایی وابسته به نوع رقم استفاده شده است.
1-35- تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان در شرایط درون‌ شیشه‌ای
با ظهور بیوتکنولوژی، شاخه جدیدی از تحقیقات در عرصه متابولیت‌های ثانویه گیاهی شکل گرفته است که به بیوتکنولوژی متابولیت‌های ثانویه معروف است. این شاخه بیوتکنولوژی به تولید درون شیشه‌ای متابولیت‌های ثانویه گیاهی و همچنین دست‌ورزی مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه برای تغییر الگوی تولید متابولیت در یک گیاه و یا تولید یک فرآورده ثانویه جدید در آن می‌پردازد. از اواخر دهه 60 میلادی، فناوری کشت ‌بافت به عنوان ابزاری در جهت مطالعه و تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی معرفی شده است. برخی مزیت‎های تولید متابولیت‎های ثانویه از طریق کشت بافت شامل کنترل بهینه شرایط کشت، افزودن پیشسازهای مورد نیاز برای افزایش بازده و تولید متابولیت‎های ثانویه خاص می‎باشد ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Ramachadra2002" راماچادرا و راویشانکر، 2002). در این رابطه از روش‌های زیر برای تولید متابولیت‌های ثانویه استفاده شده است:
1-36- روش کشت کالوس
تولید متابولیت‌های با ارزش اغلب به بافت‌های تمایزیافته نظیر کرک‌های غده‌ای و مجاری رزینی بستگی دارد. این قبیل ترکیبات را به طور معمول نمی‌توان در کشت‌های سوسپانسیون سلولی القاء کرد. استفاده از کشت‌های کالوس به جای سوسپانسیون سلولی درختان در برخی موارد منجر به تشکیل مجاری و غده‌هایی می‌شود که فرآورده‌هایی چون ترپن‌ها و روغن‌های فرار در آنها تولید می‌شود. البته این کشت‌های کالوس دارای پتانسیل قابل توجهی در راستای تولید متابولیت‌های ثانویه هستند ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Yeoman1987" یومان، 1987).
1-37- روش کشت سوسپانسیون سلولی
استفاده از سیستم‌های کشت سلول گیاهی برای تولید متابولیت‌های ارزشمند، خصوصاً در صنعت مواد دارویی و غذایی ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Nickel1990" نیکل، 1990) ، عموماً یک فناوری مناسب محسوب شده و به سرعت در حال گسترش است (جدول 1-1). پیشرفت در زمینه کشت سلولی با استقرار موفق لاین‎های سلولی برخی از گیاهان دارویی که منتهی ‎به تولید درصد بالایی از ترکیبات ثانویه در شرایط کشت‎های سوسپانسیون سلولی می‌شوند، محقق می‌گردد، که این امر توسط برخی از محققان گزارش شده است ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Tripathi2003" تریپادی، 2003).
جدول 1-1. مقایسه مقدار تولید برخی ترکیبات دارویی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی با گیاه کامل
(اقتباس از HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Misawa1997" میساوا، 1997)
گونه گیاهی نام فارسی گیاه ترکیب دارویی عملکرد (وزن خشک بر حسب درصد)
گیاه کشت سلولی
Lithospermum erythrorhizon سنگ دانه شیکونین 500/1 000/20
Morinda citrifolia توت هندی آنتراکینون‌ها 300/0 000/18
Catharanthus roseus پریوش آجمالیسین 300/0 000/1
Coleus blumei حسن یوسف رزمارینیک اسید 000/3 000/15
Nicotiana tabacum توتون اوبیکینون10 003/0 036/0
Dioscorea deltoids سیب زمینی شیرین دیوزژنین 000/2 000/2
Thalictrum minor برگ سدایی بربرین 010/0 000/10
Coptis japonica فلور چین بربرین 000/4 000/10
Galium verum شیر پنیر آنتراکینون‌ها 200/1 400/5

user8336

اریتروپلاکیا (پلاک قرمز)
اریترولکوپلاکیا (ترکیبی از پلاک قرمز و سفید)
ممکن است زخمی نکروتیک با حاشیه های برجسته و نا منظم همراه با سفتی قاعده و یا یک توده اگزوفیتیک با ویژگی سطحی وروکوز، گرانولر یا زخمی ایجاد شود(3). SCC دهان در اثر تروما به راحتی خونریزی می کند و به طور ثانویه عفونی می شود(3). در اکثر موارد، ضایعات بدون علامت هستند، درد فقط وقتی بروز می کند که عضلات یا اعصاب در مراحل پیشرفته بیماری تحت تهاجم تومور قرار گرفته باشند و این مسئله تاخیر در مراجعه به پزشک را توجیه می کند(2). ضایعات بزرگ ممکن است در تکلم، جویدن یا بلع نرمال تداخل ایجاد
کند(3).
تظاهرات اولیه SCC شامل تغییر رنگ سطحی، ایجاد توده، لنف نودهای بزرگ شده یا تغییر عملکرد ارگان است(8). اختلال عملکرد زبان می تواند بر تکلم و تغذیه اثر بگذارد(1). دیس فاژی، بلع دردناک، گوش درد، محدودیت حرکتی، خونریزی دهانی، توده های گردنی و از دست دادن وزن ممکن است همگام با پیشرفت بیماری رخ دهد(1).
در بررسی حفره دهان هیچ ناحیه ای نباید مورد غفلت واقع شود. اما نواحی با ریسک بالا از نظر بدخیمی شامل: کف دهان، کناره های طرفی زبان و لب پایین بایستی به دقت معاینه شوند. بیمار باید به منظور یافتن هرگونه تغییر بافتی شامل: ضایعات سفید، قرمز، سفید و قرمز، همچنین از نظر هرگونه تغییرات سطحی نظیر ایجاد خشونت سطحی، حالت گرانولر، زخم یا توده کاملأ ارزیابی شود(1). حدود دو سوم SCC های دهان، در زمان تشخیص متاستاز قابل شناسایی از نظر بالینی به لنف نودهای گردنی دارند(10). وقتی اندازه ضایعه بزرگتر از 4 سانتی متر باشد، در 90% موارد درگیری لنف نود وجود دارد(2). لنف نودهای تحت تأثیر قرار گرفته سفت بوده و در لمس حساس نیستند. اگر گسترش خارج کپسولی به بافتهای همبند اطراف رخ داده باشد، چسبیده ( fixed) و به هم پیوسته matted )) خواهند بود(10). حضور گسترش خارج کپسولی لنف نود با میزان بالایی از عود موضعی و ناحیه ای، متاستاز دور دست و مرگ و میر همراه است(11). انتشار لنفاتیک کارسینومای دهانی معمولأ گره های لنفاوی ساب مندیبولر، دیگاستریک، زنجیره گردنی فوقانی و نهایتأ باقیمانده زنجیره گردنی را گرفتار می کند(1).

روشهای تشخیصی رایج و کمک تشخیصی نوین
در حال حاضر استاندارد طلایی تشخیص ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم، تهیه بیوپسی بافتی و بررسی
هیستوپاتولوژی است.
نمای هیستوپاتولوژی SCC:
SCC از اپیتلیوم سطحی دیسپلاستیک منشا می گیرد و از لحاظ بافت شناسی به وسیله جزایر و طناب های مهاجم از سلول های اپیتلیوم سنگفرشی بدخیم مشخص می شود. تهاجم شامل گسترش نامنظم اپیتلیوم ضایعه از میان غشای پایه و به داخل بافت همبندی زیر اپیتلیوم می باشد. ممکن است سلول های مهاجم به عمق بافت چربی، عضلانی یا استخوانی زیرین گسترش یابند و در هنگام پیشرفت، بافت های اصلی را تخریب کنند. اغلب یک واکنش ایمنی سلولی یا آماسی قوی نسبت به اپیتلیوم مهاجم وجود داشته و نواحی کانونی نکروز نیز ممکن است حضور داشته باشد. اپیتلیوم ضایعه قادر است شکل گیری عروق خونی کوچک و جدید را تحریک کند(آنژیوژنز). تهاجم تومور چه سطحی باشد چه عمقی، سلول های ضایعه اغلب سیتوپلاسم فراوان ائوزینوفیلیک به همراه هسته بزرگ هیپرکروماتیک داشته و نسبت هسته به سیتوپلاسم در آنها افزایش یافته است. درجات مختلفی از پلئومرفیسم سلولی و هسته ای مشاهده می شود. از آنجا که محصول طبیعی اپیتلیوم سنگفرشی کراتین می باشد، ممکن است مرواریدهای کراتینی (کانون های گرد از لایه های متحدالمرکز سلول های کراتین) در اپی تلیوم ضایعه تولید شوند (12).
یک ارزیابی هیستوپاتولوژیک از درجه شباهت این تومورها به بافت های منشا (اپیتلیوم سنگفرشی) و توانایی آنها در تولید کراتین، G--ing نامیده می شود و ضایعات به وسیله یک مقیاس سه یا چهار عددی طبقه بندی می شوند، به طوریکه تومورهای کمتر تمایز یافته، اعداد بالاتر را از آن خود می سازند. G--e هیستوپاتولوژیک یک تومور تا حدودی بیانگر رفتار بیولوژیک آن نیز می باشد. به عبارت دیگر توموری که آن قدر بالغ است که شباهت زیادی به بافت منشا خود دارد، با سرعت آهسته تری رشد کرده و دیرتر متاستاز می دهد. چنین توموری Low G--e (G--e I) یا کارسینوم سلول سنگفرشی کاملا تمایز یافته نامیده می شود. بر عکس توموری که پلئومرفیسم سلولی و هسته ای زیادی دارد و فاقد کراتین بوده یا تولید کراتین آن بسیار کم است ممکن است آن قدر نابالغ باشد که تشخیص منشا آن مشکل باشد. چنین توموری اغلب با سرعت زیاد رشد کرده و متاستاز می دهد و به عنوان تومور High G--e (Gg--e III/IV) یا با تمایز اندک یا آناپلاستیک شناخته می شود. توموری که ظاهر میکروسکوپی آن مابین این دو حد باشد کارسینوم با تمایز متوسط خوانده
می شود (G--e II/III)(12).
شناسایی زود هنگام ضایعات بدخیم، یک اصل اساسی است. بنابراین معاینه کامل سر و گردن و داخل دهان یک شرط لازم است. روشهایی که به معاینات کلینیکی دهان کمک می کند شامل: تصویر برداری، تکنولوژی های نوری، رنگ آمیزی بافت های زنده با تلوئیدین بلو ( Toluidine Blue) و تهیه سیتولوژی با کمک کامپیوتر از
نمونه های (Brush Biopsy) دهانی است(1) که در ادامه توضیح داده خواهد شد.
رادیوگرافی معمولی، توموگرافی کامپیوتری(CT)، MRI ، سیتی اسکن هسته ای و اولترا سونوگرافی از جمله تصویر برداری هایی هستند که به بررسی درگیری استخوان و وسعت ضایعات بافت نرم کمک می کنند. CT و MRI در تعیین وضعیت گره های لنفاوی زنجیره گردنی کمک کننده هستند.
اولترا سونوگرافی برای هدایت سوزن طی عمل بیوپسی سوزنی از گره های لنفاوی سودمند است(1).
. Aانواع تکنولوژی های نوری برای کمک به تشخیص SCC شامل انواع زیر می باشد:
Chemiluminescent : در این روش دهانشویه اسید استیک 1% قبل از اعمال نور استفاده می شود تا دبری ها را حذف کند. سپس نور سفید- آبی در محدوده طول موج 580 – 430 نانومتر به بافت تابانده می شود. مخاط نرمال آبی دیده می شوند، در حالیکه مخاط غیرنرمال، نور را منعکس نموده و سفیدتر و شفاف تر دیده می شود. البته این تکنیک توانایی افتراق تغییرات دیسپلاستیک از ضایعات خوش خیم یا التهابی را ندارد. به نظر می رسد نیاز به کارآزمایی های بالینی دقیق برای نشان دادن فواید این تکنیک به عنوان یک ابزار موفق و مؤثر در غربالگری سرطان دهان وجود دارد(2).
در مطالعهای که در سال 2011 در انگلستان در مورد کاربرد Chemiluminescentدر شناسایی ضایعات دهانی بالقوه بدخیم انجام شد، 126 بیمار که ضایعات دهانی از جمله: لکوپلاکیا، اریتروپلاکیا، لیکن پلان، کاندیدای هیپرپلاستیک مزمن و کراتوز اصطکاکی یا فیبروز تحت مخاطی داشتند، تحت تابش Chemiluminescent و سپس انجام بیوپسی قرار گرفتند و نتایج حاکی از افزایش آشکارسازی اکثر لکوپلاکیاها با این تکنیک بود. حساسیت این روش در شناسایی ضایعات دیسپلاستیک مخاط دهان 3/77 % و اختصاصیت آن 8/27 % گزارش شد. بنابراین نتیجه گیری شد این روش دقت کافی برای مشخص کردن ضایعات دیسپلاستیک را نداشته، بلکه می تواند به عنوان یک سیستم معاینه کلی مخاط دهان به ویژه در بهبود آشکار سازی لکوپلاکیا به کار رود(13).
تصویر برداری بافتی با استفاده از فلورسنس: به نظر می رسد فقدان فلورسنس بافت، به عنوان یک پدیده اولیه مرتبط با دژنراسیون بافتی، در تشخیص سرطان دهان نوید بخش باشد. این روش تغییرات ساختمانی و بیوشیمیایی اولیه مخاط دهان که با مشاهده مستقیم دیده نمی شوند را آشکار می سازد(14). در این تکنیک پس از تابش یک نور آبی به مخاط، بافت نرمال، با انعکاس نور سبز روشن پاسخ می دهد، در حالیکه بافت غیرنرمال در مقایسه با بافت های سالم مجاور، نور تیره تری را منعکس می کند(2). نتایج اولیه یک مطالعه در سال 2012 که تست فلورسنس را در 32 بیمار در معرض خطر سرطان دهان انجام داد، حاکی از این بود که این تکنیک یک تست مؤثر برای شناسایی افرادی که در معرض خطر بالای سرطان دهان قرار دارند، می باشد. در این مطالعه، حساسیت فلورسنس 100% و اختصاصیت آن 93% بود(14).
اسپکتروسکوپی: در این روش از یک فیبر نوری کوچک برای ایجاد طیف نور متنوع استفاده شده و اسپکتروسکوپ رکوردهای دریافتی از کامپیوتر را آنالیز می کند. این تکنیک در افتراق مخاط نرمال از ضایعات، بسیار دقیق است. اما به دلیل سایز کوچک فیبر نوری برای اسکن کردن مناطق وسیعی از مخاط دهان، قابلیت استفاده عملی محدودی دارد. همچنین این تکنیک توانایی افتراق ضایعات خوش خیم از بدخیم را ندارد(2).
B. رنگ آمیزی بافت زنده با استفاده از تولوئیدین بلو:
این روش برای کمک به تعیین نواحی نیازمند بیوپسی مفید است(1). تولوئیدین بلو به DNA یا RNA غیرطبیعی باند شده و نواحی با ریسک بالای پیشرفت به سمت سرطان را مشخص می کند(2). اتصال مثبت تولوئیدین بلو (به ویژه در نواحی لکوپلاکیا، اریتروپلاکیا و جذب محیطی آن در یک زخم) ممکن است نیاز به انجام بیوپسی را ثابت کند. اتصال مثبت کاذب رنگ می تواند ناشی از ضایعات زخمی یا وجود التهاب باشد، اما پاسخ منفی کاذب، شایع نمی باشد(1). حساسیت این روش برای ضایعات بدخیم 100% و برای ضایعات دیسپلاستیک 5/79 % و اختصاصیت آن در حد 62% عنوان شده است(2). البته همواره باید تأکید نمود که این روش هرگز جایگزین بیوپسی نبوده و تست قطعی تشخیص تغییرات بدخیمی، همچنان، بیوپسی است(1).
Brush Biopsy . C :
آنالیز کامپیوتری نمونه های Brush Biopsy بر روی سلول های متفلس رنگ آمیزی شده با روش پاپا نیکولائو، نتایج نسبتأ موفقی را نشان داده است(1). در این روش از یک برس استفاده می شود که توانایی نفوذ در ضخامت مخاط را داشته و می تواند نمونه ای را که معرف همه سلول های ضایعه باشد. تهیه کند. با استفاده از این تکنیک سلول های لایه بازال و مجاور بازال جمعآوری شده و با کمک کامپیوتر آنالیز می شوند. حساسیت این روش نسبتأ بالا و در برخی مقالات تا حد 100% هم گزارش شده است(2).
در روش جدیدی به نام Modified Brush Biopsy که نخستین بار در سال 2010 توسط متخصصین گروه بیماری های دهان دانشکده دندانپزشکی مشهد معرفی شد، از ترکیب Brush Biopsy و سیتولوژی بر پایه مایع (LBC) برای تعیین ارزش تشخیصی این روش در شناسایی ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم استفاده شد. در این مطالعه، از 26 بیمار مبتلا به ضایعات دهانی بدخیم یا پیش بدخیم، Brush Biopsy تهیه و در فرمول ساده LBC قرار گرفت و با استفاده از سانتریفیوژ، نمونه ای که معرف همه سلولهای ضایعه باشد، در دسترس قرار گرفت. سپس همه بیماران تحت بیوپسی روتین و بررسی هیستوپاتولوژی هم قرار گرفتند. این روش حساسیت 9/88% و اختصاصیت 100% نشان داد. بنابراین پیشنهاد شد می تواند به عنوان ابزار مؤثری برای غربالگری ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم مورد استفاده قرار گیرد(15).
گر چه در حال حاضر استاندارد طلایی تشخیص ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم تهیه بیوپسی بافتی و بررسی هیستوپاتولوژی است، اما به هر حال این روش نگرانی هایی از جهت خطاهای نمونه برداری و خطاهای تفسیر هیستوپاتولوژی و فقدان حساسیت کافی برای تعیین پیشرفت ضایعه را به همراه دارد. بنابراین نیاز به سیستم های دقیق تر برای پیش بینی پیشرفت ضایعات در مراحل اولیه، کاملأ منطقی به نظر می رسد (2).
بررسی مارکرهای سرمی در سرطان دهان
در حال حاضر تعدادی از مارکرهای سلولی و مولکولی برای کمک به شناسایی تغییرات اولیه در جهت کمک به شناسایی ضایعات دارای پتانسیل بدخیمی در مخاط دهان در حال بررسی هستند (2).
با پیشرفت دانش بشر از درک ژنتیک، تغییرات ژنتیکی ممکن است به عنوان چنین مارکری در نظر گرفته شود. به علاوه شواهدی وجود دارد که نشان می دهد مقادیر سیتوکین های بزاقی می تواند اطلاعات مفیدی از رفتار اپی تلیوم دهان و کارسینوژنر فراهم کرده و توانایی این مارکرها می تواند در آینده ای نزدیک، آنها را تبدیل به ابزاری برای غربالگری سرطان دهان نماید(2). ماتریکس متالوپروتئیناز و مهار کننده بافتی آن نقش مهمی در شروع و پیشرفت سرطان دهان ایفا می کنند(1). آغاز یا پیشرفت سرطان دهان می تواند با پلی مرفیسم ژن فاکتور رشد عروقی اندوتلیال (VEGF) مرتبط باشد(1). افزایش CDK2 و CDK4 در مدل های حیوانی، مرتبط با افزایش خطر ابتلا به SCC دهان و پوست عنوان شده است(9). آنتی بادی بر علیه پروتئین P53 ( یک پروتئین سرکوبگر تومور) در سرم بیماران مبتلا به SCC دهانی شناسایی شده است(16). بنابراین مطالعه بیشتر روی بافت های دهانی همچنین سلولها یا مایعات بدن از جمله سرم و بزاق به منظور کمک به درک بهتر پاتوژنز سرطان دهان و یافتن ابزاری مفید برای غربالگری سرطان دهان در مراحل اولیه، ادامه خواهد یافت (2).
جستجو برای یافتن روش هایی که امکان شناسایی سرطان دهان را در مراحل اولیه امکان پذیر نماید، محققان را به سوی تحقیقات جدی در این زمینه سوق داده است(16). در سالهای اخیر، توجه به بیومارکرهای موجود در سرم برای تشخیص زود هنگام سرطانهای مختلف از جمله سرطان دهان(به ویژه SCC) مورد علاقه بیشتر پژوهشگران قرار گرفته است(17). تغییرات ژنتیکی که در سلولهای سرطانی رخ می دهد، منجر به تغییر پاسخ سلول به محیط اطراف خود می شود که به صورت تغییر در بیان پروتئین های مسیرهای سیگنال دهنده سلولی تظاهر می کند و با مطالعات بررسی پروتئین ها در سرم، قابل ردیابی خواهد بود(17).
گلوتاتیون
یکی از بیومارکرهای قابل اندازه گیری در سرم مبتلایان به SCC گلوتاتیون است که پپتیدی داخل سلولی با اعمال متفاوتی از جمله سم زدایی، دفاع آنتی اکسیدانی و تعدیل نمودن پرولیفراسیون سلولی می باشد(18). فرمول شیمیایی این مولکول عبارتست از: C10H17N3O6S و تری پپتیدی با اتصال پپتیدی گاما بین گروه آمین سیستئین و گروه کربوکسیل گلوتامات است. دریافت گلوتاتیون به عنوان یک ریزمغذی در رژیم غذایی ضروری نیست، زیرا بدن می تواند از آمینواسیدهای سیستئین، گلوتامیک اسید و گلایسین، آن را تولید کند(19). گلوتاتیون در یک فرآیند دو مرحله ای وابسته به آدنوزین تری فسفات (ATP) ساخته می شود: - نخست گاماگلوماتیل سیستئین از گلوتامات و سیستئین با واسطه آنزیم گاماگلوتامیل سیستئین سنتتاز تولید می شود.
سپس، گلایسین به انتهای C - ترمینال گاماگلوتامیل سیستئین از طریق آنزیم گلوتاتیون سنتتاز، اضافه می شود(19).
برخی از ویژگی های مهم گلوتاتیون عبارتند از:
یک آنتی اکسیدان اندوژن(درون زاد) مهم است که توسط سلولها تولید می شود و در خنثی کردن مستقیم رادیکالهای آزاد و ترکیبات واکنشی اکسیژن شرکت می کند. همانگونه که آنتی اکسیدان های اگزوژن( برون زاد) مثل ویتامین C و E در فرم احیاء(که همان فرم فعال آنهاست)، عمل می کنند(20).
چرخه نیتریک اکساید را تنظیم می کند که برای حیات نقش بحرانی( Critical) دارد و در صورت عدم تنظیم، مشکل جدی ایجاد می کند(21).
در واکنش های متابولیک و بیوشیمیایی مثل سنتز و ترمیم DNA ، سنتز پروتئین، سنتز پروستاگلاندین، انتقال آمینو اسید و فعالیت آنزیمی، نیاز به گلوتاتیون وجود دارد. بنابراین هر سیستمی در بدن می تواند تحت تأثیر گلوتاتیون قرار گیرد، به ویژه سیستم ایمنی، سیستم عصبی، سیستم گوارشی و ریه ها (22).
گلوتاتیون نقشی حیاتی در متابولیسم آهن دارد. به طوریکه نشان داده شده سلول های yeast ( مخمر) عاری از آهن یا حاوی مقادیر اندک گلوتاتیون احیا (GSH)، دچار نقص آنزیمهای خارج میتوکندریایی و به دنبال آن مرگ می شود(21).
گلوتاتیون دارای دو فرم احیا یا همان GSH و اکسید یا همان GSSG می باشد. پدیده اکسیداسیون – احیا از خصائص ذاتی سلول بوده و گلوتاتیون در این امر نقش اساسی دارد(23). گلوتاتیون که بیشتر به فرم احیا شده وجود دارد، در واکنش با رادیکالهای آزاد و سموم به فرم اکسید خود یعنی GSSG تبدیل شده با حضور آنزیم گلوتاتیون رودکتاز فاکتور NADPH مجددأ به فرم احیاء خود بازمی گردد. کسر GSH /GSSG از فاکتورهای مهم در رابطه با تغییرات دائم رادیکال های آزاد اکسیژن می باشد. میزان این کسر در سلول های مختلف، متفاوت بوده، نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با فعالیت آن می باشد(23). در حالت عادی نسبت GSH /GSSG برابر 1/3 می باشد. استرس شدید اکسیداتیو سبب انباشتگی GSSG شده و مقدار کسر کاهش می یابد که کاهش مقاومت بدن برای مقابله با رادیکالهای آزاد را در پی دارد(23). منظور از استرس اکسیداتیو زمانی است که تعادل بین تولید مواد اکسیدان و آنتی اکسیدان در بدن به نفع اکسیدان ها دچار اختلال شود(24).

استرس اکسیداتیو
استرس اکسیداتیو منعکس کننده عدم تعادل بین تظاهرات سیستمیک گونه های اکسیژن واکنشی و توانایی سیستم یبولوژیک برای خنثی کردن واسطه های واکنشی یا ترمیم آسیب حاصله است. اختلال در حالت نرمال Redox (Reduction / Oxidation)، می تواند از طریق تولید پراکسیدها و رادیکالهای آزاد – که به اجزای سلولی از قبیل پروتئین ها، لیپیدها و DNA صدمه می زنند- اثرات سمی به دنبال داشته باشد(24). بنابراین استرس اکسیداتیو می تواند باعث قطع مکانیسم های نرمال انتقال پیام سلولی (cellular signaling) شود(24).
منظور از واکنش Redox (Reduction / Oxidation) تمام واکنش های شیمیایی است که شامل تغییر وضعیت اتم های بین حالت اکسیداسیون و احیاء می باشد. تعریف اکسیداسیون و احیاء به این شرح است:
اکسید (Oxidation): فقدان الکترون یا افزایش اکسیداسیون توسط یک مولکول، اتم یا یون.
احیا ( Reduction): به دست آوردن الکترون یا افزایش اکسیداسیون توسط یک مولکول، اتم یا یون(25).
به نظر می رسد استرس اکسیداتیو در انسان در پیشرفت بسیاری از بیماری ها یا تشدید علائم آنها نقش داشته باشد. این بیماریها شامل: سرطان(24)، پارکینسون و آلزایمر(26)، آترواسکلروز و نارسایی قلبی(27)، انفارکتوس میوکارد(28)،اسکیزوفرنی(29)، اختلال شخصیت دوقطبی(30)، بیماری سلولی داسی(31)، لیکن پلان(32) و ویتیلیگو(33) می باشد.
احتمال دخیل بودن استرس اکسیداتیو در پیشرفت وابسته به سن در سرطان وجود دارد. گونه های واکنشی تولید شده در استرس اکسیداتیو می توانند باعث آسیب مستقیم DNA و بنابراین اثرات موتاژنیک (جهش زایی) شوند. این فرآیند ممکن است آپوپتوز( مرگ برنامه ریزی شده سلولی) را سرکوب کرده و تکثیر و تهاجم و متاستاز تومور را پیش ببرد(24).

درمان
درمان سرطان دهان نیازمند همکاری یک تیم پزشکی است. هدف اولیه درمان، ریشه کنی سرطان، پیشگیری از عود و تا حد امکان بازیابی شکل و عملکرد نواحی تحت تأثیر قرار گرفته می باشد(34).
انتخاب روش درمان، بستگی به عوامل متعددی دارد از جمله: نوع سلول تومورال و میزان تمایز آن، محل و اندازه ضایعه، وضعیت درگیری استخوان و گره های لنفاوی، حضور یا عدم حضور متاستاز و شرایط کلی بیمار از قبیل: سن، وضعیت سلامت عمومی، وجود تاریخچه ای از SCC دهانی قبلی و عادات پر خطر(35).
روشهای درمانی متعددی برای درمان سرطان دهان وجود دارد که شامل: جراحی، رادیوتراپی، شیمی درمانی سیستمیک و مهار EGFR می باشند و می توانند هر یک به تنهایی یا به صورت ترکیبی به کار روند(36). جراحی درمان انتخابی ضایعات کوچک و قابل دسترسی است، اگر چه مراحل پیشرفته SCC معمولأ با ترکیب جراحی، رادیوتراپی و شیمی درمانی درمان می شوند(37).
در موارد عود SCC مهار کننده های EGFR در ترکیب با رادیوتراپی و شیمی درمانی، خط اول درمان خواهند بود(34).
درمان انتخابی درگیری گره های لنفاوی، جراحی است(1).
جراحی برداشت SCC دهان با حاشیه های ناکافی در حد کمتر از 5 میلی متر در 30 – 20 % موارد ممکن است عود و متاستاز دور دست را به همراه داشته باشد و در این شرایط معمولأ تجویز رادیوتراپی و شیمی درمانی بعد از جراحی، ضروری خواهد بود(38). توضیح احتمالی این است که برخی کراتینوسیتهای بدخیم ممکن است در حاشیه های زخم جراحی شده باقی مانده باشند اما به دلیل تعداد بسیار اندک، توسط آزمایشات هیستوپاتولوژی قابل شناسایی نباشند(3).
رادیوتراپی از طریق ایجاد رادیکال های آزاد و آسیب به DNA سلول، اثرات مخرب خود را اعمال می کند. سلول های تحت تابش ممکن است تخریب شوند یا قدرت تقسیم خود را از دست بدهند(1).
انواع SCC به اشعه حساس بوده و ضایعات اولیه به میزان زیادی با رادیوتراپی قابل درمان می باشند. به طور کلی هر چه تمایز تومور بیشتر باشد ( G--e هیستوپاتولوژی پایین تر )، سرعت پاسخ به رادیوتراپی کمتر خواهد بود. تومورهای اگزوفیتیک که اکسیژن رسانی کافی دارند، حساسیت بیشتری به اشعه دارند، در حالیکه تومورهای مهاجم بزرگ کمتر به اشعه پاسخ می دهند. SCC محدود به مخاط دهان با رادیوتراپی تا حد زیادی بهبود پذیرفته است، در حالیکه انتشار تومور به استخوان، احتمال موفقیت رادیوتراپی به تنهایی را کاهش می دهد و در این شرایط نیاز به ترکیب جراحی و رادیوتراپی وجود دارد(1).
شیمی درمانی به سه شکل در درمان سرطان به کار می رود:
به صورت القایی قبل از درمانهای موضعی با هدف تسریع در کاهش اولیه حجم تومور و درمان زود هنگام میکرومتاستازها.
به صورت استفاده همزمان با رادیوتراپی، این روش در حال حاضر برای مراحل پیشرفته بیماری ( مراحل 3 و 4 )
مورد استفاده قرار می گیرد.
شیمی درمانی کمکی ( adjuvant ) پس از درمان موضعی.(1).

پیش آگهی
مهمترین عامل در بقاء بیماران مبتلا به سرطان دهان، مرحله بیماری در هنگام تشخیص می باشد. متأسفانه بیشتر سرطان های دهان در مراحل پیشرفته، پس از علامت دار شدن تشخیص داده می شوند(1). در ایالات متحده میزان بقای 5 ساله در آمریکایی های آفریقایی تبار فقط یک، سوم بقای 5 ساله سفید پوستان که حدود 53% می باشد، گزارش شده است(1). این میزان بقا تحت تأثیر محیط فیزیکی و اجتماعی، کمبود اطلاعات بهداشتی، روش زندگی پر خطر و دسترسی محدود به مراقبت های بهداشتی می باشد(1).
کمیته مشارکتی سرطان آمریکا سیستم تومور، گره لنفاوی و متاستاز(TNM) را برای طبقه بندی سرطان ارائه داده است. T اندازه تومور اولیه، N درگیری گره های لنفاوی و M متاستاز دوردست را بیان می کند. انتشار موضعی یا ناحیه ای SCC دهانی شایع است و بر انتخاب درمان و پیش آگهی تاثیر می گذارد. متاستاز به گره های لنفاوی گردنی نیز شایع بوده ولی متاستاز دوردست به ناحیه زیر ترقوه نادر است. سرطان دهان در بخش خلفی حفره دهان، ناحیه حلق دهانی و کف دهان با پیش آگهی ضعیف تری همراه است، این امر با تشخیص بیماری در مرحله پیشرفته و میزان بیشتر انتشار آن به گره های لنفاوی در زمان تشخیص قابل توجیه می- باشد(1). عوامل موثر عمده ای که اثر منفی بر پیش آگهی سرطان دهان اعمال می کنند عبارتند از: درگیری دو یا تعداد بیشتری لنف نود ناحیه ای، گسترش درگیری لنف نود به خارج از کپسول و اعلام درگیر بودن مارژین های برداشته شده در جراحی تومور(2). معیارهای بافت شناسی مهم مرتبط با پروگنوز ضعیف شامل: افزایش ضخامت تومور و وجود تهاجم عروقی می باشد(2).
از آنجا که ضایعات اولیه اغلب بدون علامت بوده و بیماران در مراحل انتهایی شناسایی می شوند، تشخیص این سرطان در مراحل اولیه، تأثیر قابل توجهی در بهبود پیش آگهی آن دارد(2). جستجو برای یافتن روش هایی که امکان شناسایی سرطان دهان را در مراحل اولیه امکان پذیر نماید، محققان را به سوی تحقیقات جدی در این زمینه سوق داده است(16). در همین راستا، توجه به بیومارکرهای موجود در سرم برای تشخیص زود هنگام سرطان دهان در حال افزایش است.(17).

مروری بر متون
در این قسمت به مرور مطالعات مرتبط با موضوع تحقیق می پردازیم که به ترتیب اهمیت و سال انتشار آورده شده اند.
Sobhakamuri A. و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای با عنوان « استعداد سلول های سرطانی سر و گردن در انسان به مهار ترکیبی متابولیسم گلوتاتیون و تیوردوکسین » با بیان این مطلب که افزایش متابولیسم گلوتاتیون (GSH) و تیوردوکسین (Trx) در مقاومت سلول های سرطانی به شیمی درمانی نقش گسترده ای دارد، به بررسی تأثیر همزمان مهار GSH و Trx در مرگ سلول های سرطانی سر و گردن با مکانیسم استرس اکسیداتیو پرداختند. نتایج حاکی از این بود که مهار همزمان GSH و Trx با القای استرس اکسیداتیو، در مرگ سلول های SCC سر و گردن نقش دارد و این استراتژی ممکن است در حساس کردن SCC سر و گردن به مهار کننده های EGFR به عنوان گامی در درمان SCCمفید باشد(39).
Dzian A . و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای با عنوان « آدنوکارسینوما و SCC ریه و ارتباط آن با پلی مرفیسم ژنتیکی گلوتاتیون S – ترانسفراز در جمعیت اسلوونی» با توجه به اینکه اسنیدانس سرطان ریه در جمعیت اسلوونی بالاست، پلی مرفیسم ژنهای گلوتاتیون S – ترانسفراز شامل: GSTT1 و GSTM1 و GST_ P1 را با تکنیک PCR بررسی کرده و نتیجه گرفتند فقدان ژنوتیپ GSTT1 مرتبط با افزایش ریسک آدنوکارسینومای ریه است. در حالیکه پلی مرفیسم این ژنها با SCC ریه، ارتباط معنی داری ندارد(40).
در مطالعه FU TY . و همکاران در سال 2011 با عنوان « منگناز سوپر اکسید دسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز به عنوان مارکرهای پیش آگهی SCC مخاط باکال » مشاهده شد که بروز بیشتر این مارکرها با بقای بهتر بیماران در ارتباط بوده و در نتیجه حضور این مارکرها بیانگر بقای بهتر SCC مخاط باکال می باشد(41).
Karaman E. و همکاران در سال 2010 در مطالعه ای با عنوان« فعالیت پارا اکسوناز سرم و آسیب اکسیداتیو DNA در بیماران مبتلا به SCC حنجره» با استفاده از روشهای اندازه گیری کالری متریک والایزا بر روی نمونه های سرمی بیماران و مقایسه آنها با گروه کنترل دریافتند تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در بیماران مبتلا به SCC حنجره به نفع اکسیداسیون لیپید و آسیب DNA مختل می شود(42).
Allameh A. و همکاران در سال 2009 در مطالعه ای با عنوان « آنالیز هیستوشیمی مارکرهای مولکولی خاص در ضایعات پیش سرطانی، آدنوکارسینوما و SCC مری در افراد ایرانی» با هدف بررسی تغییرات عوامل مؤثر در پیشرفت سرطان مری در جمعیت در معرض خطر در ایران انجام دادند. آنها نمونه های بیوپسی مری 87 بیمار مبتلا به متاپلازی بارت در مری، آدنوکارسینوما و SCC مری را با روش ایمنوهیستوشیمی از نظر بیان P53 و P21 و نیتروتیروزین و سیکلواکسیژناز 2 و گلوتاتیون S – ترانسفراز بررسی کردند. تغییرات پاتولوژیک در نمونه های آدنوکارسینوما و SCC مری به صورت افزایش نیتروتیروزین و سیکلواکسیژناز 2 بود که شاهدی بر درگیری این فاکتورهای اکتسابی در پیشرفت سرطان مری است. اما در مورد سایر فاکتورها، تغییر معنی داری
مشاهده نشد(43).
Looi ML. و همکاران در سال 2008 در مطالعه ای با عنوان « آسیب اکسیداتیو و وضعیت آنتی اکسیدان در بیماران مبتلا به نئوپلازی داخل اپی تلیالی سرویکال و کارسینوم سرویکس» انجام دادند. آنها برای بررسی وضعیت آسیب اکسیداتیو، مالون دی آلدهید (MDA) پلاسما و 8- هیدروکسی داکسی گوانوزین(HdG) ادرار و برای بررسی وضعیت آنتی اکسیدان مقادیر آنزیم های سوپر اکسید دسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز را در 80 بیمار مبتلا به نئوپلازی سرویکال و کاسینوم سرویکس بررسی و با گروه کنترل مقایسه کردند. نتایج نشان داد مقادیر HdG تغییر معنی داری در هیچکدام از بیماری های مورد مطالعه نسبت به گروه کنترل ندارد. MDA پلاسما و گلوتاتیون پراکسیداز در بیماران، نسبت به گروه کنترل افزایش داشتند، در حالیکه سوپر اکسید دسموتاز و کاتالاز در بیماران نسبت به گروه کنترل کاهش داشتند(44).
مطالعه Giannini P. و همکاران در سال 2008 با عنوان « فعالیت فانکشنال و توزیع ایمنوهیستو شیمیایی سلولی گلوتاتیون S – ترانسفراز در بافت دهانی سالم، دیسپلاستیک و SCC »، فعالیت بیشتر گلوتاتیون S – ترانسفراز در بافت SCC را در مقایسه با مخاط نرمال نشان داد و پیشنهاد شد uperegulation گلوتاتیون S – ترانسفراز حداقل در تعدادی از ضایعات دهانی پیش بدخیم و بدخیم رخ می دهد(45).
در مطالعه Richie JP. و همکاران در سال 2008 با عنوان « مقادیر گلوتاتیون، آهن و ریزمغذی ها و ریسک سرطان دهان» ارتباط ریسک سرطان دهان با مقادیر سرمی آهن، ویتامین های E و C و B2 و A و روی، تیامین و گلوتاتیون (GSH) تعیین شد. محققان با توجه به نتایج این مطالعه پیشنهاد کردند کمبود ضعیف آهن و مقادیر کم GSH که هر دو مرتبط با استرس اکسیداتیو افزایش یافته هستند، ریسک سرطان در حفره دهان را افزایش می دهند(46).
Sharifi R. و همکاران در سال 2008 در مطالعه ای با عنوان « ارتباط پلی مرفیسم ژنتیکی گلوتاتیون S – ترانسفراز P1 و تجمع پروتئین P53 در بیماران ایرانی مبتلا به SCC مری » هیچ ارتباطی بین پلی مرفیسم گلوتاتیون S – ترانسفراز P1 و تجمع پروتئین P53 در سلول های اپی تلیوم مری پیدا نکردند(47).
Prabhu K. و همکاران در سال 2007 با طراحی مطالعه ای با عنوان « مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز تام سرم در سرطان دهان » دریافتند که مقدار این مارکر در مبتلایان به stage چهار سرطان دهان افزایش قابل توجهی نسبت به stage دو و سه داشته و این امر نشان می دهد تغییر مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز تام سرم ممکن است با پیشرفت سرطان دهان ارتباط داشته باشد(48).
Walshe g . و همکاران در سال 2007 در مطالعه ای با عنوان « غیر فعال شدن گلوتاتیون پراکسیداز به عنوان عامل کمک کننده در ایجاد SCC القا شده توسط U.V » بیان کردند SCC مرتبط با اختلال در فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و مقادیر پراکسید است. بطوریکه مشاهده کردند چهار، پنجم SCC های پوستی مرتبط با کاهش فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و افزایش بار پراکسید است. گلوتاتیون پراکسیداز توسط یک مکانیسم پس از ترجمه غیرفعال می شود و افزایش مقادیر پراکسید داخل سلولی می تواند گلوتاتیون پراکسیداز را غیرفعال کند. نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند غیرفعال شدن گلوتاتیون پراکسیداز در پوست انسان ممکن است یک رویداد اولیه در ایجاد SCC القا شده توسط نور UV باشد(49).
Rasmi y. و همکاران در سال 2006 مطالعه ای با عنوان « مقایسه بیان گلوتاتیون S – ترانسفراز pi در سطح mRNA در مخاط مری با استفاده از RT_ PCR_ ELISA در افراد مبتلا به بیماری رفلاکس آدنوکارسینوما و SCC مری » طراحی کردند. آنها از 66 بیوپسی بافت مری که به عنوان بیماری رفلاکس غیر اروزیو (NERD)، بیماری رفلاکس معده ای – مری (GERD)، آدنوکارسینوما و SCC تشخیص داده شده بود، استفاده کردند. نتایج کاربرد تکنیک RT_ PCR_ ELISA نشان داد هیچ تفاوت معنی داری در بیان گلوتاتیون S – ترانسفراز pi (GST- pi) در نمونه های نرمال، NERD و GERD وجود ندارد. بیان بیش از حد GST- pi در بافت های بدخیم (آدنوکارسینوما و SCC ) قابل تشخیص بود. بنابراین محققان اعلام کردند بیان GST- pi در مری مبتلا به GERD و NERD تغییر نمی کند، در حالیکه در آدنوکارسینوما و SCC به شدت بیشتر از بافت نرمال و ملتهب است(50).
Fiaschi Al . و همکاران در سال 2005 در مطالعه ای با عنوان « گلوتاتیون ، آسکوربیک اسید و آنزیم های آنتی اکسیدانت در خون و بافت تومور بیماران SCC » تغییرات آنتی اکسیدانت ها را در این بیماران بررسی کردند. نتایج حاکی از افزایش قابل توجه مقادیر گلوتاتیون و آسکوربیک اسید و در مقابل کاهش قابل توجه فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت در بیماران SCC در مقایسه با افراد سالم بود(51).
مطالعه GUO GF . و همکاران در سال 2005 که « ارتباط بروز گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST- pi) و آنتی ژن هسته ای تکثیر سلول (PCNA) در پیش آگهی SCC پیشرفته سینوس ماگزیلا به روش ایمنوهیستوشیمی » را می سنجید، نشان داد افزایش بروز GST- pi یک فاکتور پیش آگهی مستقل در SCC پیشرفته سینوس ماگزیلاست. اما PCNA خیر، به طوریکه افزایش بروز GST- pi مشاهده شده در این بیماران کاملأ مرتبط با بهبود میزان بقای 5 ساله بود(52).
Geisler SA . و همکاران در سال 2005 در مطالعه ای با عنوان « پلی مرفیسم گلوتاتیون S – ترانسفراز و بقای سرطان سر و گردن » با هدف ارزیابی توانایی پروگنوستیک پلی مرفیسم سه ژن درگیر در مکانیسم کارسینوژنز تنباکو در 190 بیمار مبتلا به SCC سر و گردن، مشاهده کردند افرادی که ژنوتیپ فانکشنال GSTT1 داشتند، احتمال مرگ 3 برابر بیشتر ناشی از SCC نسبت به افراد مبتلا به SCC که فاقد این ژنوتیپ بودند، داشتند. آنها پیشنهاد کردند مارکرهای ژنومیک مکانیسم کارسینوژنز و ترمیم DNA می تواند به عنوان یک شاخص پروگنوستیک در عود بیماری و مرگ ناشی از آن باشد(53).
Rawal RM . و همکاران در سال 1999 در مطالعه ای با عنوان « ارزیابی گلوتاتیون S – ترانسفراز و گلوتاتیون رودکتاز در بیماران مبتلا به SCC با مخاط باکال » با اندازه گیری میزان فعالیت گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST) و گلوتاتیون رودکتاز (GR) به روش اسپکتروفتومتری به این نتیجه رسیدند مقادیر GST سرم در بیماران کاهش قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل دارد و در مقابل مقادیر سرمی GR در بیماران افزایش قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل نشان می دهد. کاهش مقادیر GST سرم ممکن است با افزایش استعداد به آسیب ناشی از کارسینوژن ها در ارتباط باشد(54).
Mulder TP. و همکاران در سال 1998 در مطالعه ای با عنوان « مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز از پلاسما در بیماران مبتلا به SCCسر و گردن » مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST) را در پلاسمای 230 بیمار با روش الایزا اندازه گیری کردند. نتایج افزایش GST پلاسما را فقط در 14% این بیماران نشان داد و پیشنهاد شد احتمالأ ارتباط معنی داری بین مقادیر GST پلاسما و مرحله بالینی تومور وجود ندارد(55).
بیان مسئله و ضرورت انجام تحقیق
SCC شایعترین بدخیمی حفره دهان است، به طوریکه 95 – 90 % همه بدخیمی های دهان را SCC تشکیل می دهد(56)، میزان وقوع آن به خصوص در افراد جوان رو به افزایش است و علی رغم تحقیقات فراوان، میزان مرگ و میر آن تغییر چندانی نکرده است(57). زیرا ضایعات اولیه اغلب بدون علامت بوده و بیماران در مراحل انتهایی شناسایی می شوند. لذا تشخیص این سرطان در مراحل اولیه، تأثیر قابل توجهی در بهبود پیش آگهی آن دارد(2). تا کنون تحقیقاتی بر روی بیومارکرهای مؤثر در پروگنوز SCC صورت گرفته است. سرم بیماران از جمله محیط های بیولوژیکی است که تغییرات میزان بیومارکرها را در خود منعکس می کند(58).یکی از بیومارکرهای قابل اندازه گیری در سرم مبتلایان به SCC ، گلوتاتیون است که پپتیدی داخل سلولی با اعمال متفاوتی از جمله: سم زدایی، دفاع آنتی اکسیدانی و تعدیل نمودن پرولیفراسیون سلولی می باشد(18). گلوتاتیون دارای دو فرم احیا یا همان GSHو اکسید یا همان GSSG می باشد. پدیده اکسیداسیون – احیا از خصائص ذاتی سلول بوده و گلوتاتیون در این امر نقش اساسی دارد(23). گلوتاتیون که خود یک ترکیب احیا شده است، در واکنش با رادیکال های آزاد و سموم به فرم اکسید خود (GSSG) تبدیل شده با حضور آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز و کوفاکتور NADPH مجددأ به فرم احیاء خود باز می گردد. کسر GSH /GSSG از فاکتورهای مهم در ارتباط با تغییرات دائم رادیکال های آزاد اکسیژن می باشد. میزان این کسر در سلول های مختلف، متفاوت بوده، نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با فعالیت آن می باشد(23). در حالت عادی نسبت GSH /GSSG در سرم برابر 1/3 می باشد(23). البته این میزان در داخل سلول می تواند تا 1/100 باشد(23). استرس شدید اکسیداتیو سبب انباشتگی GSSG شده و مقدار کسر کاهش می یابد که کاهش مقاومت بدن برای مقابله با رادیکال های آزاد را در پی دارد(23). منظور از استرس اکسیداتیو زمانی است که تعادل بین تولید مواد اکسیدان و آنتی اکسیدان در بدن به نفع اکسیدان ها دچار اختلال شود(24). اختلال در سنتز گلوتاتیون در آسیب شناسی بسیاری از بیماری ها از جمله سرطان نقش دارد. زیرا گلوتاتیون با اثر بر فاکتور نکروز دهنده تومور (TNF – α) در کاهش مرگ ومیر سلولی مؤثر می باشد، به طوریکه کاهش میزان گلوتاتیون در سلول های سرطانی دلیلی بر این ادعاست(59). در مطالعات مختلف نتایجی در مورد رابطه میزان گلوتاتیون سرم و گسترش SCC به دست آمده است. پیش از این افزایش مقادیر گلوتاتیون سرم در Stage سه و چهار نسبت به Stage یک و دو یافت شده است(48). همچنین در مطالعات ایمنوهیستوشیمی بر روی نمونه های بیوپسی SCC دهانی، میزان گلوتاتیون در بافت SCC اندازه گیری شده است(41). در مطالعه دیگری کاهش میزان گلوتاتیون سرم مرتبط با افزایش ریسک سرطان دهان عنوان شده است(46).
هیچ مطالعه ای که نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان را در سرم بیماران مبتلا به SCC سر و گردن با افراد سالم مقایسه کرده باشد، وجود ندارد. در این مطالعه قصد داریم سطح سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیا و نسبت GSH /GSSG و همچنین تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان را در سرم بیماران مبتلا به SCC سر و گردن اندازه گیری و با افراد سالم مقایسه نموده و ارتباط آن را با مرحله بالینی و درجه هیستوپاتولوژی تومور تعیین کنیم. مزیت این مطالعه بر مطالعات قبلی در بررسی نسبت GSH /GSSG می باشد که منعکس کننده برهم کنش سیستم اکسیدان و آنتی اکسیدان بوده و قدرت نظر دادن در مورد استرس اکسیداتیو را دارد نه اینکه صرفأ فعالیت یک آنزیم درگیر در این پروسه را نشان دهد. در صورت وجود ارتباط بین این موارد با مرحله بالینی و درجه هیستوپاتولوژی تومور و تفاوت معنی دار با افراد سالم، می توان پیشنهاد کرد در مطالعات بعدی از اندازه گیری نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در تشخیص زود هنگام SCC سر و گردن و کنترل بیماران در جلسات فالوآپ جهت بررسی عود بیماری استفاده شود.
اهداف و فرضیات
هدف کلی: تعیین میزان سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیا و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در مبتلایان به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن و مقایسه آن با افراد سالم
اهداف اختصاصی:
تعیین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم افراد سالم
مقایسه میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم
تعیین رابطه بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم و Stage کلینیکی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین رابطه بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم وG--e هیستوپاتولوژی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن
اهداف کاربردی:
در صورت وجود ارتباط بین نسبت سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در مبتلایان به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن با Stage و G--e بیماری، می توان پیشنهاد کرد در مطالعات بعدی از اندازه گیری نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در تشخیص زود هنگام SCC سر و گردن و کنترل بیماران در جلسات فلوآپ جهت بررسی عود بیماری استفاده شود.
فرضیات تحقیق:
میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم تفاوت دارد.
تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم تفاوت دارد.
بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم و Stage کلینیکی تومور در مبتلایان به SCC سر و گردن، ارتباط وجود دارد.
بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم وG--e هیستوپاتولوژی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن ارتباط وجود دارد.
نوع مطالعه
این مطالعه از نوع بررسی مقطعی (Cross Sectional) بود.
محل اجرای طرح
این تحقیق در دانشکده دندانپزشکی مشهد، دانشکده پزشکی مشهد و بیمارستان امید مشهد انجام شد.
جمعیت مورد مطالعه
بیماران مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هستیوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و گروه کنترل از افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392 انتخاب شدند.
روش نمونه گیری
نمونه ها به روش غیر احتمالی از نوع مبتنی بر هدف انتخاب شدند.
حجم نمونه
با توجه به اینکه مطالعه مشابه به این طرح تاکنون انجام نشده است، مطالعه حاضر به صورت پایلوت و با وارد کردن 20 نفر مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد و 20 نفر سالم داوطلب انجام شد.
روش اجرای طرح
برای انجام این طرح که بصورت پایلوت انجام شد، 20 نفر مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هیستوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و 20 نفر سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392که آگاهانه حاضر به شرکت در مطالعه بوده و فرم رضایت نامه را امضا کرده بودند( هر دو گروه بیمار و سالم)، انتخاب شدند. همکار متخصص گوش و حلق و بینی، از انجام رضایت مندانه نمونه گیری بیماران قبل از شروع درمان( جراحی یا رادیوتراپی یا شیمی درمانی) اطمینان حاصل نمودند. سپس 5 میلی لیتر خون از هر شخص گرفته شد. برای جمع آوری نمونه سرم، به خون جمع آوری شده در لوله ها، هیچ ماده ضدانعقادی مثل هپارین یا سیترات اضافه نکرده و اجازه داده می شد خون طی مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد بماند تا لخته تشکیل دهد. سپس خون با دور 2000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفوژ می شد و روی یخ قرار می گرفت و در این مرحله دپروتئینه می شد. با توجه به اینکه اندازه گیری در همان روز نمونه گیری انجام نمی شد( زیرا همه نمونه ها جمع آوری شده و سپس، کیت برای آزمایش مورد استفاده قرار می گرفت) باید سرم دپروتئینه شده در دمای منفی80 درجه سانتی گراد نگهداری می شد. در این صورت نمونه برای حداقل 6 ماه ثابت می ماند. برای اندازه گیری گلوتاتیون، نمونه های سرمی قبل از آزمایش نیازمند دپروتئینه شدن و به غلظت رسیدن هستند. در این آزمایش از سه ماده شیمیایی متافسفریک و تری اتانول آمین( برای دپروتئینه کردن سرم) و وینیل پیریدین( برای به غلظت رساندن گلوتاتیون) استفاده شد.
دپروتئینه شدن:
تقریبأ تمام نمونه های بیولوژیک مورد استفاده برای اندازه گیری GSH ، حاوی مقادیر زیادی پروتئین هستند. لازم است تا آنجا که امکان دارد مقادیر بیشتری پروتئین از نمونه برداشته شود تا از تداخلات ذرات ریز و گروه های سولفیدریل در آزمایش اجتناب شود.
نمونه هایی که کمتر از mg/ml 1 (یک میلی گرم در میلی لیتر) پروتئین داشته و عاری از ذرات ریز هستند، می توانند بی درنگ تحت آزمایش قرار گیرند. به منظور دپروتئینه کردن نمونه های سرم در این طرح به روش زیر عمل می شد:
5 گرم از متافسفریک اسید در 50 میلی لیتر آب حل می شود. این محلول در دمای 25 درجه سانتی گراد برای چهار ساعت با ثبات باقی می ماند.
حجم مساوی با حجم سرم از محلول بالا، به لوله حاوی سرم اضافه می شود.
ورتکس کردن لوله [ ورتکس: ناحیه ای در مایع که بیشترین چرخش و حرکت در آن قسمت وجود داشته و جزء مهمی از جریان گردبادی مایع می باشد.]
لوله حاوی نمونه در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه نگهداری می شود.
لوله در دستگاه سانتریفوژ با دور 3000 برای 5 دقیقه قرار می گیرد.
سوپرناتانت( ماده شناور ) حاصله با دقت جدا و به میکروتیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال می یابد.
در این مرحله سرم های دپروتئینه با محلول تری اتانول آمین مخلوط می شوند.
ماده حاصله در دمای منفی 80 درجه سانتی گراد فریز می شود.
نمونه ها درست قبل از انجام آزمایش توسط کیت مربوطه، طی فرآیند لیوفیلیزه شدن و با استفاده از وینیل پیریدین به غلظت می رسند.
لیوفیلیزه شدن (Lyophilization):
فرآیند خشک کردن یک نمونه ی در معرض نابودی به منظور ایجاد شرایط مناسب برای انتقال آن. در این فرآیند ماده، منجمد شده و سپس فشار احاطه کننده کاهش می یابد تا به آب منجمد موجود در ماده، اجازه تصعید مستقیم از حالت جامد به حالت گاز داده شود(60).
برای انجام آزمایشات این طرح، طبق پروتکل شرکت سازنده کیت آزمایش گلوتاتیون ( (Cayman Chemical Company به روش اسپکتروفتومتری عمل شد(61). در این آزمایش از گلوتاتیون ردوکتاز برای تعیین GSH (فرم احیاء گلوتاتیون) استفاده می شد. گروه سولفیدریل GSH با 5 و 5- دی تیو- بیس-2- نیتروبنزوئیک اسید (DTNB) واکنش داده و ماده زرد رنگ 5- تیو- 2- نیتروبنزوئیک اسید (TNB) را تولید می کند. دی سولفید مخلوط GSTNB (بین GSH و TNB) که به صورت همزمان تولید می شود، به وسیله گلوتاتیون روکتاز احیا شده تا چرخه مجدد GSH را برقرار نموده و TNB بیشتری تولید کند. میزان تولید TNB مستقیمأ به این واکنش چرخه مجدد بستگی دارد که در واقع باید گفت به غلظت GSH در نمونه بستگی دارد. اندازه گیری میزان جذب TNB در طول موج 405 تا 414 نانومتر، تخمین دقیق GSH در نمونه را فراهم می کند. GSH به آسانی به دایمر دی سولفید GSSG (فرم اکسید گلوتاتیون) اکسیده می شود. GSSG طی احیای هیدروپراکسیدها توسط گلوتاتیون پراکسیداز تولید می شود. GSSG توسط گلوتاتیون رودکتاز به GSH احیا می شود، یعنی همان فرمی که عمدتأ در سیستم های بیولوژیک وجود دارد. از آنجایی که گلوتاتیون رودکتاز در آزمایش Cayman Chemical Company مورد استفاده قرار می گیرد، هم GSH و هم GSSG اندازه گیری می شود.
چرخه ی GSH:

برای اندازه گیری تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان، باید مراحل زیر طبق پروتکل شرکت سازنده کیت آزمایش آنتی اکسیدان (Cayman Chemical Company) روی سرم های دپروتئینه و لیوفیلیزه شده انجام می شد:
1) درون هر چاهک ( محل نمونه ) 10 میکرولیتر از ماده مت میوگلوبین و 150 میکرولیتر ماده رنگزا (کروموژن) ریخته شود.
2) برای شروع واکنش میکرولیتر هیدروژن پراکساید به تمام چاهک ها اضافه شود.
3) پلیت با برچسب پوشیده شده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود.
برچسب برداشته شده و میزان جذب نوری نمونه ها در طول موج 450 نانومتر در دستگاه plate reader خوانده شود.

تصویر 2-1: کیت گلوتاتیونGlutathione Assay Kit (Cayman Chemical Company)

تصویر 2-2: کیت آنتی اکسیدان (Antioxidant Assay Kit (Cayman Chemical Company

تصویر 2-3: پلیت آماده شده قبل از قرار گرفتن در دستگاه plate reader

تصویر 2-4: پلیت آماده شده در دستگاه plate reader

تصویر 2-5: نمونه ای از قرائت جذب نوری توسط دستگاه plate reader
اطلاعات پس از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS نسخه 16 شده و آنالیز توصیفی با استفاده از جداول و نمودارها و آنالیز تحلیلی با استفاده از تست مقایسه دو میانگین مناسب انجام گرفت.
معیارهای ورود
بیماران مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هستیوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و گروه کنترل از افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392 که آگاهانه حاضر به شرکت در مطالعه بودند( هر دو گروه سالم و بیمار) انتخاب شدند.
معیارهای خروج
سوء مصرف روزانه الکل در زمان انجام مطالعه(62)
عملکرد کبدی یا کلیوی مختل( در صورت وجود علائم یا سابقه مشکوک بیماری کبدی یا کلیوی در تاریخچه، از مطالعه خارج می شوند) (62).
عدم رضایت از شرکت در مطالعه(62)
وجو هر گونه ضایعه دهانی در گروه کنترل در زمان انجام مطالعه(62)
شیوه گردآوری اطلاعات
اطلاعات به روش میدانی و آزمایشگاهی گردآوری شدند.
ابزار گردآوری اطلاعات
اطلاعات با استفاده از ابزارهای مشاهده و چک لیست گردآوری شدند.

جدول متغیرها
نام متغیر نقش نوع مقیاس تعریف کاربردی واحد اندازه گیری
گلوتاتیون احیا سرم
وابسته کمی پیوسته نسبتی تری پپتیدی با خواص آنتی اکسیدانی که در سرم قابل اندازه گیری است میکرومولار
گلوتاتیون اکسید سرم وابسته کمی پیوسته نسبتی فرمی از گلوتاتیون که در واکنش با اکسیدان ها تولید می شود و در سرم قابل اندازه گیری است میکرومولار
نسبت گلوتاتیون احیا به اکسید در سرم
وابسته کمی پیوسته نسبتی کسری که نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با محیط اطراف آن می باشد تعادل اکسیدان- آنتی اکسیدان در سرم وابسته کمی پیوسته نسبتی به وسیله کاتیون دار نمودن محلول تترا متیل بنزیدین توسط آنزیم پراکسیداز در سرم قابل اندازه گیری است ابتلا به SCC مستقل کیفی اسمی براساس تشخیص بافت شناسی Stage بیماری

وابسته کیفی گسسته رتبه ای I, II, III,IV G--e بیماری وابسته کیفی گسسته رتبه ای I, II, III سن زمینه ای کمی پیوسته نسبتی بر اساس سال شمسی
جنس زمینه ای کیفی اسمی زن/ مرد روش تجزیه و تحلیل داده ها و بررسی آماری
اطلاعات پس از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS نسخه 16 شد و آنالیز توصیفی با استفاده از جداول و نمودارها و آنالیز تحلیلی با استفاده از تست مقایسه دو میانگین مناسب ( بر اساس چگونگی توزیع داده ها که نرمال یا غیرنرمال باشند از تست T-test یا من ویتنی) و تست همبستگی اسپیرمن انجام گرفت که سطح معنی داری در تمام آزمون ها 05/0 بود.

ملاحظات اخلاقی
کلیه بیماران برای شرکت در این طرح به صورت آگاهانه فرم رضایت نامه ( ضمیمه1) را مطالعه و در صورت رضایت شخصی آن را امضا کردند.
کلیه اطلاعات پرونده بیماران محرمانه و گزارش آن به صورت کلی بود.
در این مطالعه هیچگونه مداخله درمانی انجام نگرفته و صرفأ یک مطالعه مقطعی بود. با توجه به اینکه افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون450 میلی لیتر خون اهدا می کنند، با کسب اجازه از بیماران 5میلی لیتر از خون آنها برای انجام آزمایشات به کار رفت. در مورد بیماران نیز 5میلی لیتر خون در صورت رضایت گرفته شد.
از میان کدهای 26 گانه اخلاقی، کد شماره 2 مرتبط با موضوع این پژوهش است.
الف. اطلاعات دموگرافیک و بالینی افراد مورد مطالعه
در این مطالعه 40 نفر شرکت داشته اند که 20 نفر آنها مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن و 20 نفر افراد سالم می باشند.
جنس: در کل افراد مورد مطالعه، 28 نفر مذکر و 12 نفر مونث بودند. در گروه سالم 19 نفر مذکر و 1 نفر مونث بودند. در گروه بیمار 9 نفر مذکر و 11 نفر مونث بودند (جدول3-1).
سن: میانگین سنی بیماران 5/60 سال و میانگین سنی افراد سالم 25/49 سال بود. حداقل و حداکثر سن 35 و 85 سال بود. میانگین سنی کل افراد مورد مطالعه44/11 ± 87/54 سال بود (نمودار3-1) .
محل ضایعه: در بیماران مورد مطالعه محل تومور در 2 نفر کف دهان، 6 نفر زبان، 6 نفر حنجره و 6 نفر سایر نواحی مخاط دهان بود.
مرحله بالینی تومور((stage : 5 نفر از این بیماران در مرحله I ، 7 نفر در مرحله II و 8 نفر در مرحله III بیماری بودند.
درجه هیستوپاتولوژی تومور(g--e) : 2 نفر از این بیماران درجه I ، 16 نفر درجه II و 2 نفردرجه III داشتند.
جدول3-1: توزیع فراوانی جنسیت در گروه های مورد مطالعه
جنسیت گروه های مورد مطالعه نتیجه آزمون
کای دو
سالم بیمار تعداد درصد تعداد درصد مذکر 19 0/95 9 0/45 001/0
مونث 1 0/5 11 0/55 کل 20 0/100 20 0/100 نتیجه آزمون کای دو نشان میدهد که ارتباط معنی داری بین جنسیت و گروه های مورد مطالعه وجود دارد
(001/0=P) و در گروه سالم 0/95 درصد مذکر بوده اند در حالی که این میزان در گروه بیمار 0/45 درصد بوده
است.

نمودار3-1: توزیع سن در گروه های مورد مطالعه
نتیجه آزمون t ی مستقل نشان میدهد که توزیع سن در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری دارند (001/0=P).
ب. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه به تفکیک گروه های بیمار و سالم
نتایج مطالعه نشان داد:
میزان گلوتاتیون توتال در گروه های بیمار(51/1 ± 75/6) و سالم(02/2 ± 92/8) تفاوت معنی داری دارد(001/0> P) (نمودار 3-2).

نمودار 3-2: میزان گلوتاتیون توتال در گروه های بیمار و سالم
.B میزان GSSG در گروه های بیمار(65/0 ± 10/5) و سالم(92/1 ± 22/5) تفاوت معنی داری ندارد
(796/0=P) (نمودار 3-3).

نمودار 3-3: میزان GSSG در گروه های بیمار و سالم
. C میزان GSH در گروه های بیمار(29/1 ± 064/1) و سالم(34/2 ± 069/3) تفاوت معنی داری دارد
(002/0=P) (نمودار 3-4).

نمودار 3-4: میزان GSH در گروه های بیمار و سالم
D . نسبت GSH/GSSG در گروه های بیمار(24/0 ± 322/0) و سالم(94/0 ± 920/0) تفاوت معنی داری
دارد (011/0=P) (نمودار 3-5).

نمودار 3-5: نسبت GSH/GSSG در گروه های بیمار و سالم
.E تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در گروه های بیمار(12/0 ± 11/1) و سالم(07/0 ± 07/1)
تفاوت معنی داری ندارد (266/0=P) (نمودار3-6).

نمودار 3-6: میزان تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در گروه های بیمار و سالم
جدول3-2: توزیع متغیرهای مورد مطالعه به تفکیک گروههای بیمار و سالم
متغیر ها
گروه های مورد مطالعه نتیجه آزمون
بیمار سالم میانگین ± انحراف استاندارد میانگین±انحراف استاندارد Total Glutathion 51/1 ± 75/6 02/2 ± 92/8 001/0> P
GSSG 65/0 ± 10/5 92/1 ± 22/5 796/0= P
GSH 29/1 ± 64/1 34/2 ± 69/3 002/0= P
GSH/GSSG 24/0 ± 322/0 94/0 ± 92/0 011/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 12/0 ± 11/1 07/0 ± 07/1 266/0= P
نتیجه آزمون t ی مستقل نشان میدهد که سطح GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری ندارند(796/0=P و 266/0=P). اما سطح Total Glutathion ، GSH و GSH/GSSG در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری دارند (001/0> P ، 002/0= P و 011/0=P ).
ج. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه در ارتباط با مرحله بالینی و درجه تومور
ارتباط متغیرهای مورد مطالعه و مرحله بالینی تومور(جدول 3-3)
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد:
در بیماران بین میزان گلوتاتیون توتال با مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد
(415/0=P).
در بیماران بین میزان GSSGو مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(077/0=P).
در بیماران بین میزان GSHو مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(907/0=P).
در بیماران بین نسبت GSH/GSSG و مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(994/0=P).
در بیماران بین تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان و مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(907/0=P).
جدول 3-3: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و مرحله بالینی تومور
متغیرهای مورد مطالعه مرحله بالینی سطح معنی داری
I II III میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 98/1 ± 44/7 88/0 ± 23/6 63/1 ± 77/6 415/0= P
GSSG 60/0 ± 58/5 28/0 ± 73/4 77/0 ± 13/5 077/0= P
GSH 85/1 ± 85/1 97/0 ± 50/1 31/1 ± 63/1 907/0= P
GSH/GSSG 32/0 ± 33/0 21/0 ± 32/0 25/0 ± 31/0 994/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 08/0 ± 12/1 14/0 ± 14/1 13/0 ± 07/1 593/0= P
ارتباط متغیرهای مورد مطالعه و درجه هیستوپاتولوژی تومور(جدول 3-4)
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد:
در بیماران بین میزان گلوتاتیون توتال با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(431/0=P).
در بیماران بین میزان GSSG با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(374/0=P).
در بیماران بین میزان GSH با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(302/0=P).
در بیماران بین نسبت GSH/GSSG با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(233/0=P).
در بیماران بین تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(558/0=P).
23812573660جدول 3-4: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و درجه تومور
00جدول 3-4: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و درجه تومور

متغیرهای مورد مطالعه درجه سطح معنی داری
I II III میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 09/1 ± 33/6 56/1 ± 63/6 11/1 ± 08/8 431/0= P
GSSG 18/0 ± 47/4 67/0 ± 18/5 76/0 ± 11/5 374/0= P
GSH 27/1 ± 85/1 31/1 ± 45/1 34/0 ± 96/2 302/0= P
GSH/GSSG 301/0 ± 42/0 24/0 ± 27/0 01/0 ± 58/0 233/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 04/0 ± 08/1 12/0 ± 10/1 19/0 ± 20/1 558/0= P
به جهت تایید نتایج آزمون آنالیز واریانس، آنالیز متغیرهای مورد مطالعه در ارتباط با مرحله بالینی و درجه تومور علاوه بر آنالیز واریانس توسط ضریب همبستگی اسپیرمن نیز انجام شد. نتیجه ضریب همبستگی اسپیرمن نشان می دهد که در گروه بیماران بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با مرحله بالینی و درجه تومور رابطه معنی داری وجود ندارد (جدول 3-5).
جدول 3-5: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه با مرحله بالینی و درجه تومور
متغیرهای مورد مطالعه مرحله بالینی درجه
ضریب همبستگی سطح معنی داری ضریب همبستگی سطح معنی داری
Total Glutathion 067/0- 778/0 291/0 213/0= P
GSSG 143/0- 547/0 272/0 247/0= P
GSH 070/0- 770/0 155/0 514/ 0= P
GSH/GSSG 019/0- 936/0 116/0 625/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 200/0- 398/0 165/0 487/0= P
در نمودار های 3-7 تا 3-16 سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در مقابل مرحله بالینی و درجه تومور رسم شده است که نمودارهای ذیل نیز نشان دهنده عدم وجود ارتباط بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با مرحله بالینی و درجه تومور میباشند.

نمودار3-7: توزیع سطح Total Glutathion بر حسب Stage

نمودار3-8: توزیع GSSG بر حسب Stage

نمودار3-9: توزیع GSH بر حسب Stage

نمودار3-10: توزیع GSH/GSSGبر حسب Stage

نمودار3-11: توزیع سطح تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان بر حسب Stage

نمودار3-12: توزیع سطح Total Glutathion بر حسب G--e

نمودار3-13: توزیع GSSG بر حسب G--e

نمودار3-14: توزیع GSH بر حسب G--e

نمودار3-15: توزیع GSH/GSSG بر حسب G--e

نمودار3-16: توزیع تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان بر حسب G--e
د. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه بر حسب محل تومور


در بیماران بین متغیرهای مورد مطالعه با محل تومور ارتباط معنی داری وجود نداشت (جدول 3-6).
جدول 3-6: توزیع متغیرهای مورد مطالعه بر حسب محل تومور
متغیرهای مورد مطالعه محل تومور نتیجه آزمون
کف دهان زبان حنجره مخاط سایر نواحی دهان میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 31/1 ± 15/6 12/2 ± 85/6 36/1 ± 15/6 907/0 ± 43/7 503/0= P
GSSG 815/0 ± 68/5 76/0 ± 05/5 45/0 ± 00/5 75/0 ± 07/5 669/0= P
GSH 50/0 ± 47/0 66/1 ± 80/1 13/1 ± 14/1 88/0 ± 36/2 220/0= P
GSH/GSSG 07/0 ± 077/0 28/0 ± 34/0 20/0 ± 22/0 19/0 ± 48/0 133/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 054/0 ± 26/1 07/0 ± 08/1 18/0 ± 15/1 057/0 ± 05/1 142/0= P
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان میدهد که بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با محل تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد (503/0=P و 669/0= P ،220/0=P ،133/0=P و 142/0=P).
ه. تعدیل اثر سن و جنس بر متغیرهای مورد مطالعه
با توجه به اینکه سن و جنس در دو گروه تفاوت معنی داری با یکدیگر دارند به منظور تعدیل اثر این متغیرها در بررسی ارتباط بین SCC و سطح اکسیدان-آنتی اکسیدان، GSSG، GSH و GSH/GSSG از مدلهای خطی عمومی استفاده کرده (جدول 3-7) و نتیجه آن نشان میدهد که با تعدیل اثر سن و جنس، ارتباط معنی داری بین SCC با سطح اکسیدان-آنتی اکسیدان، GSSG و GSH وجود ندارد(224/0= P و 084/0= P ،296/0=P). اما بین SCC و GSH/GSSG ارتباط معنی داری وجود دارد (042/0=P).
جدول 3-7: نتیجه مدلهای خطی عمومی به منظور تعدیل اثر متغیرهای سن و جنس در بررسی ارتباط بین SCC و سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان
متغیر وابسته متغیرهای مستقل ضریب مدل فاصله اطمینان 95% سطح معنی داری
Total Glutathion گروه(مورد) 49/2- (037/0-، 140/4- ) 004/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 033/1- (53/0، 59/2- ) 188/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 017/0- (044/0، 079/0- ) 566/0= P
GSSG گروه(مورد) 411/0- (958/0، 779/1- ) 546/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 453/0- (843/0، 749/1- ) 483/0= P

user8300

1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی 11
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب 13
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت 13
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها 14
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس 15
فصل دوم: مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز 18
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم 19
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی 22
اهداف 23
فرضیه 23
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- ابزار 25
عنوان صفحه
3-2- مواد 26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی 26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL 26
3-2-2-1- سوش باکتری 26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون 26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی 26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز 26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE 27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز 27
3-2-4- نرم افزارها 27
3-3- روشها 28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی 28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید 28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات 28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب 29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli 29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli 29
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی 29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد 30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری 31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا 32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL 32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL 33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی 33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین 34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد 34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 34
عنوان صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) 35
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفور 35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز 36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات 38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی 39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا 39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف 39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 40
فصل چهارم: نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا 43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL 44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی 44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز 45
4-3- سنتز مایعات یونی 47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی 48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف 49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی 51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم 51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی 54
فصل پنجم: بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 57
عنوان صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی 61
فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات
6-1- نتیجهگیری 63
6-2- پیشنهادات 63
فهرست منابع 65
چکیده انگلیسی 75
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) 6
شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز 9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب 12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز 18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید 28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL 42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی 45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL 46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL 47
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی 48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون 52
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85 54
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] 55
فصل اول
مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که میتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده زمین لیپیدها هستند و آنزیمهای لیپولیتیک نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیمهای لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلولهای یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیمها مزایای زیادی در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها میتوان اختصاصیت بالای آنها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینهها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیمها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم درBOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).
آنزیمهای میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیمهای میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دستورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن میباشد)، پایداری بیشتر و تولید آسانتر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتریها و بنابراین آسانتر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آنها، باعث تسهیل فرآیندهایی همچون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دستیابی به بیشترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلولها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی میشوند. تنها حدود دو درصد از گونههای میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شدهاند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).
1-2- لیپازها
لیپازها اولین بار در سال 1901 در باکتریهای Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهای امروزی Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسایی شدند (Eijkman et al., 1901). باکتریهای گفته شده هماکنون بیشترین مطالعات لیپازی را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روی آنزیمهای هیدرولیز کننده تریگلیسریدها میگذرد و حدود 70 سال است که توانایی لیپازها در کاتالیز واکنشهای هیدرولیز و سنتز استرها تشخیص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولین آنزیم لیپاز را (آنزیم تجزیه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شیره پانکراس کشف کرد. انسانها در قدیم لیپاز را از پانکراس حیوانات به صورت خالص یا به صورت مخلوط با سایر آنزیمهای پانکراس میگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مینمودند. به دلیل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوری آنزیم از آن، دانشمندان به سراغ لیپازهای میکروبی رفتند. لیپازها از نظر نوع منشأ ( باکتری، قارچ یا پستاندار و غیره) و از نظر خصوصیات متفاوت هستند. این آنزیمها دارای توانایی کاتالیز واکنشهای مختلفی از جمله واکنشهای هیدرولیزی، یا سنتز کربوکسیلیکاسترهای مختلف و تبدیل آنها به اسیدهای آلی و گلیسرول هستند. همه لیپازها اختصاصیت بسیار بالایی برای سوبستراهای گلیسریدی دارند.
آنزیمهای لیپولایتیک به دلیل کاربرد فراوانی که در بیوتکنولوژی دارند ( به عنوان مهمترین گروه بیوکاتالیزورها در بیوتکنولوژی)، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). تولید انبوه لیپازهای میکروبی نیازمند بیان شدید و کارآ از ژنهای مربوطه و فهم دقیق مکانیسم ملکولی نحوه پیچش پروتئین و ترشح آن میباشد. از جمله کاربردهای جدید لیپازها در بیوتکنولوژی میتوان استفاده از این آنزیم در سنتز بیوپلیمر، بیودیزل، داروهای خالص انانتیومری، مواد شیمیایی مورد استفاده در کشاورزی ( مانند انواع آفت کش)، ترکیبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسیاری از مواد شیمیایی مهم صنعتی، به دست آمده از روغنها و چربیها طی فرآیندهای شیمیایی را میتوان به کمک لیپازها با سرعت بیشتر، اختصاصیت بهتر و در شرایط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزینی بالای لیپازها و اختصاصیت بالای شیمیایی و انانتیومری آنها توجه بسیاری از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
لیپازهای گرفته شده از منابع مختلف باکتری، قارچ، گیاه و حیوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصیت به موقعیت پیوند، اختصاصیت به اسیدچرب، پایداری دمایی و pH بهینه و غیره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههای متعددی از باکتریها، مخمرها و قارچهای رشتهای توانایی تولید لیپاز دارند (جدول1) سویه های نزدیک به هم (از نظر تاکسونومی) ممکن است انواع مختلفی از لیپاز ها را تولید کنند (Sharma et al., 2001).
جدول 1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز
منشأ جنس گونه
باکتری Bacillus B. megaterium
B. subtilis
B. thermoleovorans
B. thermocatenulatus
B. cereus
Pseudomonas P. putida 3SK
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. fragi
Staphylococcus S. canosus
S. hyicus
S. haemolyticus
S. aureus


S. warneri
S. xylosus
قارچ Penicillium P. cyclopium
P. simplicissimum
Aspergillus A. niger
A. oryzae
Rhizopus Rhizop. delemar
Rhizop. oryzae
Rhizop. arrhizus
Rhizop. nigricans
Rhizop. nodosus
مخمر Candida C. rugosa
C. tropicalis
C. antarctica
لیپازها را میتوان براساس اختصاصیت به سه گروه تقسیم کرد (Mukherjee et al., 1994). لیپازهای غیر اختصاصی ملکولهای آسیل گلیسرول را در موقعیتهای تصادفی میشکنند و اسیدچرب آزاد و گلیسرول و منوآسیل گلیسرول و دیآسیلگلیسرول را به عنوان حدواسطهای واکنش ایجاد میکنند. محصولات این واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتالیزورهای شیمیایی است. در واکنش آنزیمی محصول در اثر دما کمتر تجزیه میشود و این به دلیل پایینتر بودن دمای واکنش در کاتالیز زیستی است. لیپازهای اختصاصی به موقعیتهای 1و3، آزادسازی اسیدچرب از موقعیتهای 1و3 اسکلت گلیسرولی را کاتالیز میکنند. لیپازهای دارای اسیدچرب اختصاصی، تنها یک اسیدچرب خاص از ملکول آسیل گلیسرول آزاد میکنند (Macrae et al., 1983). لیپازها همچنین تفکیک انانتیومری ترکیبات کایرال و واکنشهای استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون، و اینتراستریفیکاسیون را کاتالیز میکنند. این تواناییهای متنوع کاتالیز، در شکست چربیها، اصلاح چربیها و روغنها، سنتز ترکیبات آلی، تأمین شویندهها و روشهای تجزیهای، کاربرد بسیاری پیدا کرده است (Macrae et al., 1985).
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن
این خصوصیت لیپازها که در سطح بین فضای آبدوست و آبگریز عمل میکنند، وجه تمایز لیپازها از استرازها میباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولی آنزیمهای لیپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون میباشد. این آنزیمها نیز شبیه سرینپروتئازها دارای مجموعه سه تایی کاتالیتیک باقیمانده نوکلئوفیل- باقیمانده هیستیدین- باقیمانده اسیدی هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرین- هیستیدین- آسپارتات یا به صورت مجموعه سه تایی سرین- هیستیدین- گلوتامات میباشد (Noble et al., 1993).
جایگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقیماندههای آبگریز احاطه میشود. یک ساختار مارپیچ پلیپپتیدی همانند یک درپوش مانع از قرارگیری جایگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال میشود. همچنین محافظت از آنزیم در برابر فعالیت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تایی کاتالیتیک پروتئاز ایجاد شود (B--y et al., 1990). سمتی از درپوش که روبروی جایگاه فعال است بیشتر از زنجیرههای جانبی آبگریز آلیفاتیک تشکیل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بیرون قرار گرفته است.
تغییر جهتگیری ساختار α- هلیکس درپوش همراه با افزایش آبگریزی سطوح نزدیک جایگاه فعال و روبروی آن، باعث پدیده "فعال شدن در فضای بینابینی" میشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزیم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهای آبگریز، اتصال زنجیرههای آلیفاتیک سوبسترا به سطح آبدوست آنزیم، به ویژه در حضور یک لایه آبپوشی، بسیار نامطلوب است. فضای بینابینی ایجاد شده در دهانه شیار فعال ممکن است به فراهم سازی یک لایه ناکامل آبپوشی در اطراف ملکول لیپاز و در نتیجه تسهیل پیچش زنجیرههای آلیفاتیک ملکول سوبسترا در سطح آنزیم کمک کند (Petersen et al., 1996). پایدارسازی بیشتر میتواند به کمک محدودههای الکتروستاتیک موضعی در سطح آنزیم و با ایجاد جاذبه دوقطبی به سمت پیوند C-H (با قطبیت ضعیف) زنجیرههای جانبی آلیفاتیک فراهم شود.

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL).
آمینواسیدهای اصلی جایگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.
1-3- آنزیمها در محیط آلی
کلیبانو با انجام تعدادی آزمایش ابتدایی و ساده نشان داد که میتوان از آنزیمها در حلالهای آلی آبگریز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنین محیطهایی سرعت واکنش به شدت پایین میآید (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسیاری از لیپازها و همچنین برخی از پروتئازها و آسیلازها بسیار پایدار هستند، به طوری که حتی در حلالهای آلی بدونآب نیز فعالیت خود را حفظ میکنند. این خصوصیت اساس استفاده موفقیتآمیز از این آنزیمهای هیدرولاز در واکنشهای غیرهیدرولازی است. از جمله این واکنشهای غیرهیدرولازی میتوان آسیلاسیون الکلها و آمینها با اختصاصیت انانتیومری را نام برد که در صنعت کاربرد زیادی دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محیط آلی، که شامل مایعات یونی نیز میشود، با فعالیت آنزیم غالبا از جنبه حذف آب ضروری آنزیم مورد بررسی قرار میگیرد. بسیاری از آنزیمها برای فعال بودن به یک پوشش آبی کامل نیاز دارند، اما تعداد زیادی استثناء نیز وجود دارد مانند لیپاز B کاندیدا آنتراکتیکا (CALB) که فعالیت خود را حتی پس از خشک شدن با پنتوکسید فسفر حفظ میکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتیسیلین که برای فعال ماندن تنها نیاز به تعداد اندکی ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزیم دارد (Dolman et al., 1997). بررسی منابع علمی نشان میدهد که بیان نیاز آنزیم به آب در قالب فعالیت آبی (aW ) مرسومتر از بیان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهای غیرهیدرولازی با آنزیمهای لیپاز یا پروتئاز ممکن است باعث حفظ یا افزایش فعالیت آنزیمی شود. هرچند چنین محیطهایی همیشه باعث افزایش واکنشهای جانبی هیدرولازی میشوند. همچنین اسید حاصل از این واکنشها ممکن است باعث کاهش pH و از دست رفتن فعالیت آنزیمی شود.
حلالهایی که به خوبی توسط این آنزیمها تحمل میشوند – هیدروکربنهای آروماتیک و آلیفاتیک، اترها، و الکلها (بجز متانول)- فقط به صورت ضعیفی با آنزیم برهمکنش میدهند و میتوان حدس زد که این حلالها کم و بیش فقط برای آنزیم یک فضای خالی ایجاد میکنند. تنها الکلها که تشکیل دهنده پیوند هیدروژنی هستند میتوانند لیپازها را غیرفعال کنند. حلالهایی که برهمکنش بسیار قوی با پروتئینها میدهند، مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) و دی متیل فرمآمید (DMF) نیز باعث غیرفعال شدن برگشتناپذیر آنزیمها میشوند. بنابراین آنزیمها برهمکنشهای قوی با هیچ مادهای به جز آب را نمیتوانند تحمل کنند (Van Rantwijk, 2007).
نامشخص بودن pH در محیط بدون آب یک عامل پیچیده در آنزیمشناسی است. آنزیم توزیع بار الکتریکی (pH ظاهری) را مطابق با آخرین محلول آبی، مثلا بافر لیوفیلیز، حفظ میکند (Zaks and Klibanov 1985). البته pH بهینه ظاهری تحت تأثیر نوع حلال و aW تغییر میکند (Yang et al., 1993). چنین اثرات مشابهی در محیط مایعات یونی نیز قابل انتظار است.
در حقیقت بیشترین اطلاعات درباره رفتار آنزیم در محیط غیرآبی، حاصل از مطالعات آنزیمها در حلالهای آلی است. اما حلال های آلی برای طبیعت زیان آور هستند بنابراین در سالهای اخیر تلاش زیادی در جهت یافتن جایگزین پاکتری برای محیطهای واکنش انجام شده است.از جمله محلولهای دوستدار محیط زیست مایعات یونی را میتوان نام برد که میتوانند جایگزین حلالهای آلی شوند.
علاقه عمومی برای افزایش سرعت واکنشهای آنزیمی در حلالهای آلی نیز عامل پیشبرنده دیگر به سمت مایعات یونی بوده است. یکی از دلایل کاهش فعالیت آنزیمی در حلالآلی (در مقایسه با محیط آبی) پایدارسازی مواد واکنش دهنده در حلال است (Klibanov et al., 1997). این اثر که در واقع همان افزایش حلالیت (افزایش Km) است، با به کارگیری غلظتهای بالاتری از ماده واکنشدهنده قابل جبران است (Halling et al., 2004). بقیه کاهش فعالیت، در حد 1 تا 2 برابر، مربوط به اثر مجموعهای از عوامل شامل ناپایدار شدن حالت گذار واکنش (Clark et al., 2004)، تغییرات کنفورماسیون و از دست دادن انعطافپذیری میباشد (Halling et al., 2004, Clark et al., 2004 ). ثابت دیالکتریک پایین محیطهای آلی معمولی باعث افزایش انرژی حالت گذار شدیدا قطبیده در مقایسه با آب میشود و بنابراین ناپایدار شدن حالت گذار را در پی خواهد داشت (Clark et al., 2004).
1-4- مایعات یونی
از میان مایعات مختلفی که میتوان بهعنوان حلال به کار برد تنها تعداد اندکی به طور عمومی مورد استفاده قرار میگیرند. با معرفی تکنولوژیهای سبز یک نگرانی اصلی، ایجاد جایگزینهای مناسب برای حلالهای مخرب است که در صدر جدول مواد شیمیایی زیانآور هستند. زیرا این حلالها در مقادیر بالا استفاده میشوند و به طور معمول مایعات فراری هستند. نمکهای مرکب مایعاتی هستند که فقط یون دارند (مایعات یونی). در صورت انتخاب مواد اولیه مناسب میتوان مایعات یونی ساخت که در دمای اتاق و در دمای پایینتر از دمای اتاق مایع هستند. مایعات یونی مواد جدیدی نیستند. بسیاری از آنها سالهای زیادی است که شناخته شدهاند. برای مثال میتوان [EtNH3][NO3] را نام برد که دمای ذوب 12 درجه سانتیگراد دارد و در سال 1914 معرفی شد. از همان زمان پیشنهاد شد که از مایعات یونی در سنتز شیمیایی به جای حلال استفاده شود. البته تنها در سالهای اخیر تعداد زیادی مقالات در این زمینه به چاپ رسیده است. برخی خصوصیات فیزیکی ساده مایعات یونی که آنها را به عنوان حلالهای بالقوه برای سنتز جالب توجه کرده است توسط ولتون بیان گردیده است (Welton et al., 1999):حلالهای خوبی برای طیف وسیعی از مواد آلی و غیر آلی هستند.
معمولا شامل یونهای نامتناسبی هستند که امکان قطبیت بالا در آنها را ایجاد میکند.
طبق مقیاس قطبیت نرمال شده که در آن تترامتیل سیلان صفر و آب 0/1 در نظر گرفته شده، قطبیت مایعات یونی مرسوم، به طور معمول در محدوده 6/0-7/0 قرار میگیرد ( مانند فرمامید و الکلهای محلول در آب )
(van Rantwijk et al., 2003). همچنین کاهش طول زنجیره آلکیلی متصل به حلقه ایمیدازولیوم و اندازه آنیون در مایعات یونی دارای کاتیون ایمیدازولیومی، با افزایش قطبیت مایع یونی در ارتباط است (Carmichael and Seddon, 2000). مقدار قطبیت مایع یونی گاهی به دما و حضور آب حساس است (Baker et al., 2002). مایعات یونی به دلیل قطبیت بالایی که دارند محیط خوبی برای واکنشهای شیمیایی و بیوشیمیایی ایجاد میکنند. زیرا میتوانند سوبستراهای مختلفی شامل ترکیبات آلی قطبی و غیرقطبی و ترکیبات آلی و غیر آلی و پلیمری را در خود حل کنند.
با تعدادی از حلالهای آلی غیر قابل امتزاج هستند و بنابراین یک جایگزین قطبی غیرآبی برای سیستمهای دو فازی میباشند. همچنین مایعات یونی آبگریز را میتوان به عنوان فاز قطبی غیر قابل امتزاج همراه با آب استفاده کرد (Welton et al., 1999).
مایعات یونی فرار نیستند و این به دلیل یونی بودن ماهیت آنها است که فشار بخار ناچیزی دارند. بنابراین میتوان از آنها بدون ایجاد آلودگی در سیستمهایی با مکش قوی استفاده کرد (Welton et al., 1999).
بنابراین مایعات یونی دارای پایداری دمایی بوده و فاقد فشار بخار میباشند (Gordon et al., 2001, Brennecke et al., 2001). به علاوه داری خصوصیات استثنائی به عنوان حلال هستند و میتوانند هر ماده شیمیایی را در خود حل کنند. با جایگزین کردن کاتیون، آنیون و اجزای متصل به آنها، میتوان خصوصیات این حلالها را تغییر داد و به این صورت مایع یونی مناسب برای واکنش خاصی را ایجاد نمود (Brennecke and Maginn, 2001) (شکل 1-3). گرچه هنوز مشخص نیست که مایع یونی چگونه خصوصیات کاتالایتیک آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهد، آنزیمها در مایعات یونی مانند [C4MIM][PF6] فعال و به شدت پایدار هستند (Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000, Laszlo et al., 2001).

شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز.
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی
دلیل تمایل به انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی در واقع میل به جایگزین کردن مایعات یونی غیرفرار به جای حلالهای آلی فرار بوده است. هرچند این واکنشها در محیط طبیعی آنزیم یعنی محیط آبی قابل انجام است اما حلالهای آلی به طور وسیعی همراه با آنزیمها مورد استفاده قرار گرفتهاند تا از این طریق میزان حلالیت واکنشگرهای آبگریز را بیشتر کرده و تعادل واکنش را از سمت هیدرولیز به سمت سنتز تغییر جهت دهند. همچنین خصوصیات غیرمرسوم مایعات یونی به عنوان حلال، باعث گسترش روشهای متعدد جدید و بسیار کارآ شده است (Van Rantwijk et al., 2007).1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی- آب
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. سری هافمیستر نوعی دستهبندی یونها است که به ترتیب توانایی آنها در حل کردن و رسوبدهی پروتئینها ایجاد شده است.
اخیرا در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. مایعات یونی را به خوبی میتوان براساس موقعیت قرارگیری یونها، در سری هافمیستر به گونهای مرتب نمود که ترتیبی از پایدارکنندهترین تا ناپایدارکنندهترین (کاسموتروپ تا کائوتروپ) ایجاد شود.
نمک های سری هافمیستر با ویژگی های کاسموتروپیک و کائوتروپیک یونها مرتبط هستند. یونهایی که به شدت آب پوشی میشوند به کاسموتروپ ها معروفند و آن دسته از یون هایی که به صورت ضعیف هیدراته می شوند، کائوتروپ خوانده می شوند (Lo Nostro et al., 2005). یونهای حاصل از نمکهای سری هافمیستر به دو گروه تقسیم می شوند: Salting- out و Salting- in (Kunz et al., 2004). یون های out-Salting (آنیون های کاسموتروپ مثل فسفات، سولفات وکاتیون های کائوتروپیک مثل کاتیون های آمونیوم) پروتئین ها را پایدارکرده و نیز باعث رسوب آنها می شوند. در مقابل یون های Salting- in (آنیونهای کائوتروپ مثل آنیون های پرکلرات، برماید و کاتیونهای کاسموتروپ مثل کاتیون لیتیم) پروتئین ها را ناپایدار میکنند (Kunz et al., 2004). درغلظت های پایین نمک (تا سقف 01/0 مولار) یون ها غالبا از طریق برهمکنش های الکترواستاتیک روی آنزیم ها تاثیر می گذارند. هنگامی که در غلظت های زیاد نمک نیروهای انتشار یا پراکندگی یونی بر پتانسیل الکترواستاتیک پیروز میشوند، اثر یونهای هافمیستری اهمیت پیدا میکنند (Lo Nostro et al., 2005).
بسیاری از آنزیمها به خوبی در طیف وسیعی از مایعات یونی در محیط آبی عمل میکنند. به سختی میتوان مایع یونی پیدا کرد که به هیچ عنوان با هیچ آنزیمی سازگاری نداشته باشد. در رابطه با پیشبینی سازگاری آنزیم و مایعات یونی آبی به نظر میرسد که کائوتروپی و کاسموتروپی نمیتوانند به عنوان تنها عوامل پیشبینی کننده استفاده شوند. همچنین بعید به نظر میرسد که بتوان سازگاری آنزیم با مایعات یونی را با در نظر گرفتن تعداد محدودی پارامتر همچون قطبیت یا logP تفسیر نمود. این موضوع در مورد حلالهای ملکولی محلول در آب نیز صدق میکند (Van Rantwijk et al., 2007).
اساس پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی آبی را میتوان این گونه بیان کرد که پروتئین زمانی پایداری خود را از دست میدهد که یونها یا ملکول های حلال اطراف آن با فرم بازشده آنزیم برهمکنش قویتری نسبت به فرم طبیعی آنزیم داشته باشند (Baldwin et al.,1996). چنین برهمکنشهای ناپایدارکنندهای میتوانند حاصل از "Salting in" یونهای دوگانه دوست روی گروههای آبگریز فرو رفته درون ساختار پروتئین یا حاصل از برهمکنشهای قوی آنها با پیوندهای پپتیدی باشد (Kaar et al., 2003, Lou et al., 2006). از جمله مباحث مهمتری که باید به خصوص در مورد آنزیمهای حساس مد نظر قرار داد میتوان تغییرات pH ایجاد شده توسط یونهای اسیدی یا قلیایی برونشتد و فعالیت آبی ترمودینامیکی را نام برد.
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001) و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای MeSO4- (Schofer et al., 2001)، NO3- (Kaar et al., 2003)، AcO-یا lactate- (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است (شکل 1-4). آب نیز چنین عملکردی دارد؛ اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
به نظر میرسد که مایعات یونی بدون آب با روشی مشابه حلالهای آلی مرسوم، آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهند؛ زیرا بسیاری از آنها به خوبی تحمل میشوند اما برخی از آنها نیز سازگاری بسیار کمی دارند که البته این موضوع به نوع آنزیم نیز بسیار وابسته است. برای مثال مایعات یونی حاوی یونهای AcO- و NO3- که به صورت مخلوطهای آبی سازگاری بسیار خوبی دارند، در حالت بدون آب آنزیم بسیار مقاوم CALB را غیر فعال میکنند. بر اساس اطلاعات فعلی، مایعات یونی با آنیونهای BF4- و PF6-، و آنیون مقاوم به هیدرولیز NTf2- و آنیونهای زنجیر متوسط آلکیل سولفات به همراه کاتیونهای دیآلکیلایمیدازولیوم و آلکیلپیریدینیوم گزینههای ایمنتری به نظر میرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون یک اساس نظری برای پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی بیآب ایجاد نشده است. هرچند تعدادی از عوامل سهیم احتمالی مانند قابلیت کاتیون برای ایجاد پیوند هیدروژنی (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکیل نانوساختارهای متصل به هیدروژن، و گرانروی حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر میرسد که میزان هسته دوستی آنیون (Kaar et al., 2003) یا قابلیت پذیرش پیوند هیدروژنی توسط آن (Sheldon et al., 2002) نیز، حداقل در حالتی که میل کاتیون برای تشکیل پیوند هیدروژنی کم است، میتواند یکی از عوامل کنترل کننده باشد. در این مورد یک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنیون H2PO4- است که بدون دناتوره کردن میتواند Cyt C را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء دیگر [HOPMIM][glycolate] است که با داشتن کاتیون و آنیونی با قابلیت بالا در ایجاد پیوند هیدروژنی، آنزیمهای احیاکننده را در فرم فعال در خود حل میکند (Walker and Bruce, 2004).

شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب. الف) شکل شماتیک از نحوه برهمکنش مایع یونی با بخشهای باردار و غیرقطبی آنزیم، ب) ساختار شبیه سازی شده آنزیم CALB در محیط مایع یونی DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقی از سطح آنزیم را نشان میدهد که زنجیرههای آلیفاتیک حضور دارند و رنگ نارنجی نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزیم هستند (Klahn et al., 2011).
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب
پایداری (دمایی) آنزیمها (فعالیت در طی زمان) معمولا در محیطهای آلی به خصوص با فعالیت آبی کم، نسبت به محیطهای آبی، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مایعات یونی نیز میتوانند چنین اثری داشته باشند. پایداری آنزیمی تعریف واضحی ندارد و روشهای متنوعی برای سنجش آن وجود دارد. برای بررسی پایداری در ذخیره سازی، آنزیم در مایع یونی در یک دمای خاص انکوبه شده و میزان فعالیت باقیمانده در نمونهها که با آب رقیق شدهاند بررسی میشود. بازیابی فعالیت بالایی از آنزیم در چنین روشی نشان دهنده این است که تغییرات ایجاد شده در ساختار آنزیم در این چنین محیط ذخیرهسازی برگشت پذیر است. پایداری آنزیم را میتوان با انکوبه کردن آنزیم در مایع یونی در بازههای زمانی مختلف و سنجش فعالیت در همان محیط بررسی نمود. همچنین میتوان ساختار آنزیم را با روشهای اسپکتروسکوپی در محیط مورد نظر بررسی نمود. برای مثال دمای بازشدن ساختار پروتئین شیرین مونولین از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزایش یافت (Baker et al., 2004). نوع دیگر پایداری که میتوان مورد بررسی قرار داد پایداری در شرایط واکنش است.
بهطور کلی آنزیمها در مایعات یونی فعالیت و ساختار خود را در مدت زمان طولانیتر و در دماهای بالاتری نسبت به حلالهای آلی ملکولی حفظ میکنند. دلیل احتمالی این امر گرانروی بالای مایعات یونی است که باعث کند شدن حرکت دمینهای پروتئین از موقعیت خود در فرم فعال پروتئین به موقعیتهای جدید ایجاد کننده فرم غیرفعال میشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت
پیوندهای هیدروژنی عامل پیوستگی ساختار آنزیمهای آبپوشی شده و بدون آب هستند. هر تغییر ساختاری مستلزم فروپاشی تعداد قابل توجهی از پیوندهای هیدروژنی به طور همزمان میباشد؛ این امر سهم قابل توجهی در پایداری آنزیم دارد و گویای اثرات حافظه آبپوشی و اثرات پسماند است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند این است که تعداد ملکولهای آب متصل به آنزیم تنها وابسته به میزان فعالیت آبی نیست، بلکه به حافظه آبپوشی نیز مربوط میباشد.
پژوهشهای مختلفی نشان داده اند حلالهایی که در شرایط آبی یا غیرآبی با آنزیم سازگارند، مانند استونیتریل یا ترت- بوتیل الکل، در غلظتهای پایین باعث غیرفعال شدن آنزیم میشوند (Griebenow et al., 1996). چنین نتایجی را میتوان در پژوهشهای انجام شده در مایعات یونی نیز مشاهده کرد. دلیل این امر کاهش اثر آبگریزی در حضور حلال است. در نتیجه پایداری آنزیم کاهش مییابد تا اینکه در یک غلظت مشخص آنزیم غیرفعال میشود.
پیوندهای هیدروژنی میتوانند توضیح مناسبی برای پایداری آنزیم در مایعات یونی بدون آب باشند. مایعات یونی، بهخصوص آنیون آنها که پیوندهای هیدروژنی قوی ایجاد میکنند، ممکن است باعث از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی شوند که عامل یکپارچگی ساختار α- هلیکسها و صفحات β بودهاند و بنابراین باعث باز شدن کل پروتئین یا بخشی از آن شوند. برای مثال یون لاکتات به راحتی میتواند با اسکلت پلیپپتیدی پیوند هیدروژنی برقرار کند. اندازه یون نیز میتواند مهم باشد زیرا یونهای با اندازه بزرگ برای ایجاد تعداد اندکی پیوند هیدروژنی بین خود و آنزیم، نیاز دارند که تعداد زیادی پیوند هیدروژنی را بشکنند، بنابراین نمیتوانند به سادگی پایداری آنزیم را مختل کنند. در آنزیمهایی که به صورت برگشتپذیر غیرفعال شدهاند احتمالا پیوندهای هیدروژنی توانستهاند کانفورماسیون را حفظ کنند و در ادامه برای بازیابی ساختار آنزیم لازم است این پیوندها فروپاشند و پیوندهای طبیعی دوباره ایجاد شوند. رقیق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مایع یونی دناتوره کننده، میتواند باعث تشکیل دوباره پیوندها شود احتمالا چنین ترکیباتی که پیوند هیدروژنی قوی تشکیل میدهند با تشکیل پیوندهای هیدروژنی ناپایدار، تشکیل دوباره پیوندها را تسهیل میکنند.
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها
کاربرد لیپازها در بیوترانسفورماسیون شامل طیف وسیعی از واکنشهای سالوولایتیک( نوعی از واکنشهای جانشینی هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفیل عمل کرده و جانشین یک اتم یا گروه در ملکول سوبسترا میشود) مربوط به گروه کربوکسیل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله این واکنشها میتوان استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون (الکلولیز)، پرهیدرولیز، و آمینولیز (سنتز آمید) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهای ترانساستریفیکاسیون و سنتز آمید ترجیحا در محیط بیآب و در حضور زئولیت فعال، جهت متوقف ساختن واکنشهای هیدرولازی ناخواسته، انجام میشود. در این واکنشها اغلب از آنزیمهایی همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده میشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتی چنین شرایطی را تحمل میکنند.
جهت دستیابی به بهینهترین حالت تشخیص انانتیومرها لازم است که محیط واکنش، مایع یونی یا محیطهای سنتی، با توجه به نوع ماده واکنش دهنده و نوع آنزیم بهینهسازی شود. در واقع نمیتوان یک مایع یونی را به عنوان بهترین گزینه برای انجام واکنشهای تفکیک مخلوطهای راسمیک نام برد، همانطور که یک حلال آلی را نمیتوان به طور کلی بهترین دانست. با ظهور مایعات یونی، گزینههای حلال انتخابی و بنابراین شانس یافتن محیط مناسب به میزان زیادی افزایش یافته است.
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس
ملکول پروتئین طی فرآیندهای غیرفعال شدن چند فاز مختلف را طی میکند. این پدیده نشاندهنده یک سری وقایع درون ملکولی در کنفورماسیونهای گذرای پروتئین است (De Diego et al., 2004). از روشهای مختلفی جهت بررسی ساختار پروتئین استفاده میشود که از آن جمله میتوان روشهای DSC ، NMR، CD، FTIR، اسپکتروفتومتری UV، کریستالوگرافی اشعه X و اسپکتروسکوپی فلورسانس را نام برد. فلورسانس یک روش در دسترس است که میتوان از آن جهت بررسی ساختار سوم پروتئین استفاده کرد.
در پروتئینهایی که دارای آمینواسیدهای فلوروفور هستند (مثل تریپتوفان، تیروزین یا فنیلآلانین) تغییر در IMax فلورسانس و شیفت قرمز در λMax فرآیند دناتوره شدن پروتئین را نشان میدهند و هر دوی این تغییرات به دلیل افزایش قطبیت باقیماندههای تریپتوفان پروتئین با قرارگیری آن در معرض حلال است. مکانیسم ملکولی پایدار شدن آنزیم در مایعات یونی (در بیوکاتالیز کاربردی) همچنان نامعلوم است و نیاز به بررسیهای بیشتر وجود دارد (De Diego et al., 2004).
پروتئینها پس از برانگیختگی در طول موج nm 280 (مربوط به همگی فلوروفورهای پروتئین) یا nm 295 (بیشتر مربوط به باقیماندههای تریپتوفان)، به طور معمول نور را بین طول موج nm 300 و nm 350 منتشر میکنند. شدت فلورسانس در واقع جمع نور منتشر شده توسط هر کدام از باقیماندههای فلوروفور پروتئین میباشد. باز شدن نسبی ساختار پروتئین باعث افزایش برهمکنش باقیماندههای آمینواسیدی پروتئین با حلال (به طور معمول آب) میشود. همچنین ممکن است حلقه اندولی تریپتوفان با دیگر آمینواسیدهای موجود در ساختار پروتئین وارد برهمکنش شود. هر دوی این پدیدهها سبب کاهش شدت فلورسانس و گاهی سبب ایجاد یک شیفت قرمز در پیک نشر فلورسانس (کاهش λMax) میشود که این پدیده را نشانهای از باز شدن پروتئین در محیط آبی میدانند (Bekhouche et al., 2011).
با ورود مایعات یونی به محیط پروتئینها به عنوان حلالهای جدید، مشکلاتی در بررسی ساختار توسط روشهای مختلف ایجاد میشود. از جمله این مشکلات تداخلهای ایجاد شده در طیفهای CD و فلورسانس را میتوان نام برد که در گزارشات مختلفی به آنها اشاره شده است (Shu et al., 2011, Bekhouche et al., 2011, Attri and Venkatesu, 2013). با این وجود شاید بتوان ساختار پروتئین را بیشتر بر اساس شیفتهای λMax و مقایسه شدت فلورسانس در حالتهای دمادهی مختلف در یک مایع یونی با غلظت مشخص، مورد بررسی قرار داد.
به طور کلی میتوان گفت که طیف وسیعی از آنزیمها میتوانند مخلوطهای آبی مایعات یونی را به عنوان محیط واکنش تحمل کنند. به سختی میتوان مایع یونی را یافت که هیچ آنزیمی نتواند با آن سازگار باشد. عقیده بر این است که مایعات یونی در غلظتهای بالاتری، نسبت به حلالهای ملکولی قابل امتزاج با آب، میتوانند توسط آنزیمها تحمل شوند.
بسیاری از هیدرولازها به خصوص آنهایی که توانایی تحمل حلالهای ملکولی را دارند به میزان قابل توجهی میتوانند واکنشهای غیرهیدرولازی را در مایعات یونی کاتالیز کنند. میزان فعالیت آنزیمها در مایعات یونی در حد فعالیت آنها در حلالهای آلی و یا حتی بالاتر نیز میباشد. به علاوه در بسیاری از موارد افزایش پایداری دمایی و عملکردی و افزایش اختصاصیت انانتیو و ریجیو نیز دیده شده است.
مایعات یونی سازگار با آنزیمها به طور معمول برهمکنش قوی با آنزیم نمیدهند و باعث حل شدن آنزیم نمیشوند. تاکنون اساس نظری برای پیشبینی سازگار بودن یا نبودن مایع یونی با آنزیم ایجاد نشده است هرچند با توجه به علاقه زیادی که در این موضوع وجود دارد انتظار میرود که به زودی یک اساس نظری در این زمینه مطرح گردد.
مایعات یونی قابلیت بالایی در کاربرد به عنوان حلال در واکنشهای بیوترانسفورماسیون مربوط به واکنشدهندههای بسیار قطبی مانند پلیساکاریدها دارند؛ زیرا چنین واکنشهایی به دلیل محدودیتهای تعادل واکنش در آب قابل انجام نیستند. چنین جایگزینی یک محیط فرار با محیط غیرفرار مایعات یونی بدون شک ادامه خواهد یافت و به تدریج توسط صنایع شیمیایی پذیرفته خواهد شد و سهم بزرگی در ایجاد کارآیی بالای واکنشهای مختلف خواهد داشت. توسعه مایعات یونی ارزانتر نیز باعث افزایش استفاده از آنها در بیوترانسفورماسیونهای صنعتی خواهد شد. به علاوه باید این موضوع را در نظر داشت که سیستمهای حلالی که بر پایه مایعات یونی هستند قابلیت بالایی در انجام ترانسفورماسیونهای چند کاتالیزوری دارند. برای دستیابی به این اهداف تلاشهای جدیدی انجام گرفته است.
بدون شک انتظار میرود که مایعات یونی سبز و زیست سازگار به زودی در دسترس باشند؛ زیرا به کارگیری مایعات یونی در ایجاد صنایع شیمیایی سبزتر، امری کاملا ضروری است. اینگونه به نظر میرسد که انجام بیوترانسفورماسیون در مایعات یونی بسیار امید بخش است.
فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز
اولین گزارش از بیوکاتالیز در محیط مایعات یونی مربوط به سال 2000 است (Cull et al., 2000). اولین کارهای انجام شده در این زمینه شامل مایعات یونی متشکل از کاتیونهای 1و3- دی آلکیل ایمیدازولیوم یا N- آلکیل پیریدینیوم و یک آنیون ضعیف کئوردینه کننده بود (شکل2-1و جدول 2-1). این نوع مایعات یونی هنوز نقش اصلی را در واکنشهای آنزیمی ایفا میکنند. هرچند که تحقیقات در حال حاضر بیشتر به سمت مایعات یونی با ساختارهای جدید گرایش یافته است. تاکنون مقالات مروری خوبی در زمینه بیوکاتالیز در مایعات یونی منتشر شده است که از آن جمله پروژه - ریسرچمروری ون رنتویجک و شلدون و مقالات مروری منیرالزمان را میتوان نام برد (Van Rantwijk and Sheldon, 2007, Moniruzzaman, 2010 a& b).

شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی که به طور مرسوم در بیوکاتالیز استفاده میشوند
(Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونیفرمول ساختاری علامت اختصاری نام آنیون
BF4- BF4- Tetrafluoroborate
PF6- PF6- Hexafluorophosphate
(CF3SO2)2N- Tf2N Bis(trifluoromethylsulfonyl)amide
CF3SO3- TfO Trifluoromethanesulfonate
CF3COO- TFA Trifluoroacetate
CH3SO3- MeSO3 Methylsulfite
n-C7H15SO3- HpSO3 Hydrogenthiophosphate
TsO- TsO Toluenesulfonate
CH3OSO3- MeSO4 Methylsulfate
C2H5OSO3- EtSO4 Ethylsulfate
n-C8H17OSO3- OctSO4 Octylsulfate
(HO)2PO2- H2PO4 Dihydrogenphosphate
(CH3O)2PO2- Me2PO4 Dimethyl phosphate
C2H5O(CH2)2OSO13- EtOEtSO4 Ethoxyethylsulfate
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. یک مطالعه اولیه روی آنزیم آلکالین فسفاتاز مربوط به باکتری اشرشیا کلای در مخلوط آبی [EtNH3][NO3] (قدیمیترین مایع یونی (Walden, 1914 )) نشان داد که این مایع یونی در غلظتهای پایین روی آنزیم اثر فعال کننده داشته است و بیشترین اثر گذاری آن (10 درصد افزایش فعالیت) در غلظت 1/1 مولار دیده شده است. با افزایش غلظت مایع یونی تا قبل از غلظت 80 درصد فعالیت آنزیم به طور برگشت پذیر کاهش یافت و پس از آن آنزیم به طور برگشت ناپذیری غیر فعال گردید (Magnuson et al., 1984).
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم
در سالهای اخیر در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. به تازگی آنیونهای α-آمینواسیدها در مایعات یونی مورد استفاده قرار گرفتهاند. این آنیونها کاسموتروپ هستند (Zhao, 2006). مایعات یونی تشکیل شده از α-آمینواسیدهای D و L و ω- آمینوکربوکسیلاتها و کاتیون [C2MIM] در غلظت 5/0 مولار اثر بسیار کمی بر فعالیت آنزیم سوبتیلیسین داشتند. در حالی که [C2MIM][D-GluO] در غلظت 1 مولار سرعت واکنش را بیش از 60 درصد کاهش داد و [C2MIM][L-GluO] باعث کاهش 80 درصدی سرعت شد (Zhao, 2006). مایع یونی [C4MIM][Cl] در غلظتهای کمتر از 20 درصد اثر کمی بر آنزیم پراکسیداز ترب سیاه (HRP) گذاشت در حالیکه در غلظتهای 25 و 30 درصد کاهش شدید فعالیت و پایداری دمایی آنزیم را نشان داد (Machado and Saraiva, 2005).
آنیون نیترات یک آنیون بی ضرر و بی اثر است با این وجود مایعات یونی حاوی این آنیون زیاد مورد مطالعه قرار نگرفتهاند. از معدود مطالعات انجام شده در این زمینه میتوان پژوهشی روی آنزیم پاپائین را نام برد که در حضور 15 درصد [C4MIM][NO3] 50 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. در گزارشی توسط کفتزیک و همکاران دو آنزیم CbFDH و β-گالاکتوزیداز مربوط به باسیلوس سیرکولانس در حضور 25 درصد [PrNH3][NO3] کاملا غیرفعال شدند (Kaftzik et al., 2002). دلیل این غیرفعال شدن را اسیدی شدن pH احتمال دادند.
مایعات یونی حاوی یون [BF4] بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. این آنیون به شدت کائوتروپ است و نسبت به آنیونهایی که قبل از این گفته شد قدرت کمتری در تشکیل پیوند هیدروژنی دارد. اثر [C4MIM][BF4] بر فعالیت HRP توسط ماکادو و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. در غلظتهای کمتر از 20 درصد [C4MIM][BF4] کمترین کاهش فعالیت دیده شد و در غلظت 25 درصد آن 30 درصد کاهش فعالیت دیده شد. ماکادو و همکاران همچنین تغییرات پایداری دمایی HRP را در [C4MIM][BF4] بررسی کردند. در غلظت 10 درصدی مایع یونی، آنزیم HRP با تأخیر بیشتری نسبت به محیط آبی در اثر دمادهی غیرفعال شد. در حالی که در غلظت 25 درصد مایع یونی، پایداری آنزیم به شدت کاهش یافت (Machado and Saraiva, 2005).
اولین بیوترانسفورماسیون موفق در یک محیط مایع یونی حاوی 5 درصد آب مربوط به یک مایع یون آبگریز بود. ترمولایزین، یک آنزیم بسیار پایدار، واکنش سنتز Z- آسپارتام را در محیط [C4MIM][BF4] اشباع از بافر کاتالیز کرد؛ سرعت واکنش در این حالت نسبت به سرعت واکنش در محیط اتیل استات 40 درصد بود (Erbeldinger et al., 2000).
لیپازها به عنوان آنزیمهای مقاوم به حلالهای آلی مسلما اولین گزینه انتخابی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی بودند. در حقیقت لیپازهای میکروبی پایدار مانند CALB (Madeira Lau et al., 2000 , Schofer et al., 2001) و لیپاز سودوموناس کاپاسیا (PCL) (Park and Kazlauskas. 2001, Nara et al., 2002) در مایعات یونی از خانواده 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم، در ترکیب با آنیونهای BF4- ، PF6-، TfO- و NTf2- دارای فعالیت کاتالیتیک هستند. نتایج اولیه در این قبیل کارها معمولا تکرارپذیر نبود و این به دلیل حضور ناخالصی باقی مانده طی فرآیند تهیه مایعات یونی بود. لیپازها واکنشهای ترانساستریفیکاسیون را در این مایعات یونی با بازده قابل مقایسه با واکنشهای انجام شده در ترت- بوتیل الکل (Madeira Lau et al., 2000)، دیاکسان (Nara et al., 2002)، یا تولوئن (Park and Kazlauskas 2001) را کاتالیز کردند.
لیپاز A کاندیدا آنتراکتیکا (CALA) به عنوان یک استثناء در محیط مایعات یونی [C4MPy][BF4] و [C4MIM][NTf2] 10 برابر فعالتر از محیط دیایزوپروپیلاتر (DIPE) (Schofer et al., 2001) بود. مایعات یونی خارج از خانوادههای 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم به ندرت در فرآیند بیوکاتالیز مورد استفاده قرار گرفتهاند.
لیپازهای مختلفی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی مورد بررسی قرار گرفته اند که از این میان میتوان آنزیمهای لیپاز CALB (Lozano et al., 2003)،PCL (Itoh et al., 2003)، ASL (Schofer et al., 2001)، CALA، RML و TLL (Schofer et al., 2001) را نام برد. برای مثال دو آنزیم RML و TLL فعالیت خود را در مایع یونی [C4MIM][NTf2] حفظ کردند در حالی که در دو مایع یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] غیرفعال شدند (Schofer et al., 2001).
لیپاز CRL به طور معمول در محیطهای بدون آب فعالیت کمی دارد. بر اساس مطالعات انجام شده در رابطه با کاتالیز واکنشهای مختلف، این آنزیم در مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] فعالیت خود را حفظ میکند (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003). CRL در [C4MIM][PF6] بهترین فعالیت خود را در حضور حداکثر 4/0 مولار آب (یا 5/0=aw براساس سایر گزارشات (Ulbert et al., 2004) نشان میدهد. همچنین گزارش شده است که CRL واکنش استریفیکاسیون را در محیط بدون آب [C4MIM][PF6] بهتر از محیط ایزواکتان کاتالیز میکند (Yu et al., 2005).
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003)و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای [MeSO4] (Schofer et al., 2001)، [NO3] (Kaar et al., 2003)، [AcO] یا [lactate] (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است. آب نیز چنین عملکردی دارد اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند، و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کوئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی
در گزارشی از لیو و همکاران فعالیت و ساختار آنزیم لیپاز CRL انکوبه شده در 17 نوع مایع یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که انتخاب نوع آنیون اثر مهمتری بر فعالیت آنزیم در واکنش استریفیکاسیون داشته است و مایعات یونی محلول در آب اثر منفی بر فعالیت آنزیمی داشتهاند. مطالعات ساختاری این گروه با روش FTIR تا حدودی تغییرات ساختاری مرتبط با تغییرات فعالیت آنزیم را نشان داد. هرچند افزایش فعالیت دیده شده در برخی موارد را نمیتوان با دادههای تجربی حاصل از بررسی ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسی ساختاری آنزیم لاکاز در مخلوط آبی مایعات یونی [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهای CD و فلورسانس اثر مثبت مایع یونی [C4MA][TfO] بر پایداری ساختاری آنزیم نسبت به دو نوع دیگر نشان داده شد. در این مطالعه نتایج مطالعات ساختاری با نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاری دیگری به کمک فلورسانس و FTIR اثر مایعات یونی ایمیدازولیومی محلول در آب بر ساختار دو آنزیم α- آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس و آمیلولیکوئی فاسینس مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی نشان داد که آنزیم α- آمیلاز در محیط بافری و محلول آبی مایع یونی [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره میشود. در حالیکه محلول آبی مایع یونی [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهای مانع از دناتوره شدن آنزیم میشود (Dabirmanesh et al., 2011).
اهداف
بررسی اثر مایعات یونی مختلف روی پایداری و فعالیت آنزیمهای لیپاز تا حدودی انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهای مختلف زنجیره کاتیونی مایعات یونی روی آنزیم و بررسی چگونگی تغییر ساختار آنزیم و اثر آن بر فعالیت آنزیمی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنین با توجه به اثرات متفاوت مایعات یونی بر روی آنزیمهای مختلف، در این پژوهش اثر مایعات یونی روی آنزیم لیپاز TTL، یک آنزیم گرمادوست با پتانسیل کاربردهای صنعتی، مورد بررسی قرار میگیرد. بنابراین اهداف این پژوهش عبارتند از:
بررسی اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
بررسی اثر مایعات یونی با کاتیون و آنیونهای مختلف بر پایداری دمایی آنزیم TTL
مطالعه پایداری دمایی بر اساس تغییر در ساختار سوم آنزیم TTL در حضور و عدم حضور مایعات یونی
فرضیه
با استفاده از مایع یونی مناسب به عنوان محیط واکنش میتوان به پایداری بیشتر و فعالیت بهتری از آنزیم دست یافت.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- ابزار
انواع ظروف و لوازم آزمایشگاهی (ارلن، بشر، پلیت، بورت، کندانسور و غیره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کیسه دیالیز
استیرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پدیده نوژن پارس)
بن ماری (ریحان طب)
آون خلاء
سیستم تغلیظ پروتئین و فیلتر مربوطه (Amicon)
هود لامینار (ژال تجهیز)
انکوباتور (ریحان طب)
شیکر انکوباتور (Vision)
سانتریفوژ (Sigma 16-P)
سانیکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ریحان طب)
پمپ پریستالتیک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)
3-2- مواد
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی
آلکیل هالید ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متیل ایمیدازولیوم (Merck)
آمونیوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دی اتیل اتر (Panreac)
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL
3-2-2-1- سوش باکتری
باکتریxL1blue E.coli (جهت تکثیر پلازمید حاوی ژن لیپاز)
باکتری E.coli BL21 (جهت بیان پروتئین)
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون
پلازمید حاوی ژن لیپاز درون سلولی TTL (pQE-TTL)
KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استریل
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی
تریپتون، عصاره مخمر، نمک سدیم کلرید (Merck) (جهت تهیه محیط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتی بیوتیک آمپی سیلین
ایزوپروپیل β-D- تیوگالاکتوزید (IPTG) (سیناژن)
آنزیم لیزوزیم (CinnaGen)
بافر تریس (Merck)
سدیم فسفات (Merck)
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز
رزین Q- Sepharose
رزین Gel filtration
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE
رنگ کوماسی بلو G-250 و R-250
فسفریک اسید و استیک اسید گلاسیال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکریل آمید و بیس آکریل آمید (Merck)
TEMED(N,N,N,N'-tetramethylenediamine)
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) (Merck)
آمونیوم پرسولفات (APS)
2- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومین سرم گاو (BSA)
بافر تریس و گلایسین (Merck)
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز
سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (Sigma)
استونیتریل (Merck)
بافر تریس (Merck)
3-2-4- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طیف های فلورسانس)
3-3- روشها
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید
در این پژوهش جهت تهیه مایعات یونی از میزان مول برابر از آلکیل هالید و متیل ایمیدازولیوم استفاده شد. در این روش متیل ایمیدازولیوم قطره قطره در فواصل زمانی مساوی به آلکیل هالید که در حال بهم خوردن شدید بود اضافه شد و محلول نهایی در حال بهم خوردن شدید به مدت 24 ساعت در دمای °C 50 رفلاکس شد (شکل3-1). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دی اتیل اتر شستشو داده شد تا مواد آلی واکنشگر باقیمانده حذف شود. مرحله شستشو 10 تا 15 بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دی اتیل اتر به مایع یونی و بهم زدن شدید آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مایع یونی و دی اتیل اتر از هم جدا شوند. سپس مایع یونی شسته شده به مدت 24 ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دی اتیل اتر آن کاملا تبخیر شود.

شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات
در این مرحله میزان مول مساوی از نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات در مقداری آب حل شد و سپس محلول نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبی مایع یونی دارای آنیون برومید در حال بهم خوردن شدید اضافه گردید. سپس به مدت 24 ساعت در دمای اتاق محلول روی استیرر بهم خورد تا واکنش جایگزینی آنیون به خوبی انجام شود. در مرحله بعد شستشوی مایع یونی جدید با آب جهت جداسازی آنیون برومید انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نیترات نقره نبود یون برمید را در مایع یونی PF6- دار تایید کرد. سپس مایع یونی PF6- دار بدست آمده به مدت 24 ساعت برای حذف آب موجود در محیط در آون خلاء در دمای °C 70 قرار داده شد. مایع یونی ساخته شده در ظرف درب دار نگهداری شد.
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli
در این پژوهش از محیط کشت Luria Bertani (LB) برای رشد سویههای اشرشیاکلی به صورت مایع و جامد (حاوی آگار) استفاده گردید. همچنین در محیط کشت سوشهای حامل ساختار پلاسمید از آنتیبیوتیک آمپیسیلین با غلظت نهایی µg/ml 100 استفاده شد. جدول 3-1 نشان دهنده ترکیبات محیط کشت Luria Bertani است. شایان ذکر است که آنتی بیوتیک پس از استریل شدن محیط کشت توسط اتوکلاو و رسیدن دمای محیط کشت به حدود C° 50 اضافه میگردد.
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani
ترکیب غلظت
عصاره مخمر 5/0 درصد
تریپتون 1 درصد
NaCl 1 درصد
آگار (محیط کشت جامد) 2 درصد
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی:به منظور تهیه سلولهای مستعد برای عمل ترانسفورماسیون (انتقال پلاسمید به داخل سلول)، ابتدا یک کشت خطی از سلولهای ذخیره شده مورد نظر در ازت مایع بر روی پلیت LB تهیه و یک شب در گرمخانه Cº 37 قرار داده میشود. سپس یک کلنی از روی پلیت برداشته و در شرایط استریل به 25 میلی لیتر محیط کشت مایع LB افزوده و به مدت 4 الی 6 ساعت در دمای cº37 با حرکت دورانی rpm180رشد داده میشود تا تراکم سلولها در محیط کشت به جذبی ما بین 4/0 تا 6/0 در طول موج 600 نانومتر برسد. سلولها را در دمای ºC 4 به مدت 10 دقیقه در g4000 سانتریفوژ کرده و آنها را در5/2 میلیلیتر محیط خاص مناسب برای تهیه ی این نوع سلولها به نام محیط TSB که طبق جدول3-2 تهیه گردید، به صورت معلق در میآوریم. لازم به ذکر است که در این حالت غلظت سلولی به میزان 10 برابر افزایش داده میشود. سپس سلولهای معلق شده را به مدت 10 الی 60 دقیقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروی یخ قرار میدهیم. محصول سلولی حاصل را در مقادیر 200-100 میکرولیتری در لولههای اپندروف استریل تقسیم کرده و بلافاصله در ازت مایع قرار میدهیم. این سلولها را میتوان در فریزر cº80- نگهداری کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الی دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها یک بار میتوان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد :بین 1 تا 10 میکرولیتر بسته به غلظت محلولDNA موجود (معادل 1-1/0 میکروگرم) پلاسمید، در شرایط استریل در یک لوله اپندروف ریخته وبه آن پنج میکرولیتر از بافر KCM 5X که طبق جدول3-3 تهیه گردید، افزوده و با آب مقطر استریل به حجم lµ25 میرسانیم. مخلوط در یخ نگهداری میشود. حال سلول مستعد را از فریزر ºC80- خارج و اجازه میدهیم تا ذوب شود . 25 میکرولیتر از سلول مستعد را به محلول حاوی پلاسمید افزوده و به مدت 15 الی 20 دقیقه در دمای ºC4 قرار میدهیم. سپس در دمای ºC 42 به مدت 105 ثانیه گرمادهی شده که در این مرحله، ملکولهای DNA بر روی سطح سلول ها رونشینی شده و به درون سلول منتقل خواهند شد . بلافاصله سلولها را به درون یخ منتقل کرده و به آنها 100 میکرولیتر محیط LB سرد استریل و بدون آنتیبیوتیک،اضافه و به مدت یک ساعت در دمای Cº37 و حرکت دورانی مناسب قرار میدهیم. در نهایت 150 میکرولیتر محیط حاصل را بر روی پلیت حاوی محیط کشت انتخابی برده و با استفاده از لوپ شیشهای استریل به آرامی بر روی تمامی سطح پلیت بطور کامل و یکنواخت پخش میگردد . پس از جذب سلولها بر روی سطح پلیت، پلیتها به صورت وارونه در گرمخانه cº37 به مدت 16 ساعت قرار داده میشوند.
لازم به ذکر است که این پلیتها، حاوی آنتیبیوتیک خاصی است که ژن مقاومت مربوطه بر روی پلاسمید مورد نظر وجود دارد و در نتیجه تنها سلولهایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند قادر به رشد بر روی محیط انتخابی هستند.
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSBترکیبات مورد نیاز مقدار
Luria Bertani 75 (ml) 2X
DMSO 5/7 (ml)
PEG 400 3/13 (ml)
MgSo4 5/1 (ml)
MgCl2 5/1 (ml)
ddH2O 3/51 (ml)
Total valume 150 (ml)
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCMغلظت مناسب برای تهیه محلول 5X ترکیبات مورد استفاده
(M) 5/0 KCl
(M) 15/0 CaCl2
(M) 25/0 MgCl2
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری
برای تهیه استوک از باکتریهای حاوی ساختار پلاسمید، ابتدا از باکتری مورد نظر کشت یک شبه گذاشته شد. سلولها به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند و سوپ رویی دور ریخته شد. سپس به نسبت 1:1 گلیسرول استریل 50% به محیط کشت LB اضافه شد. آنگاه رسوب سلولها در 15 حجم اولیه محیط کشت، از این محلول حل شدند. در آخر آمپیسیلین با غلظت نهایی μg/ml 100 به سلولها اضافه شد و در C°20- ذخیره گردید.
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب
کلنی مورد نظر از بین باکتریهای ترانسفورم شده انتخاب شد و به محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک آمپیسیلین (μg/ml100) انتقال یافت. پس از رشد باکتری به مدت 16 ساعت در دمای °C 37، کشت 1 درصد تلقیح از نمونه باکتری رشد کرده، در حجم ml 20 محیط LB با آمپی سیلین ایجاد شد. پس از گذشت 4 ساعت از کشت اولیه باکتری ها در دمای °C 37، زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، با افزودن IPTG (با غلظت نهایی mM 1) به محیط های کشت بیان پروتئین نوترکیب القا شد و با کاهش دمای انکوباتور به °C 30 شرایط برای تولید آنزیم نوترکیب توسط باکتریها فراهم شد. پس از گذشت 5 ساعت از زمان القا، سلول های باکتری به کمک سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در 110 حجم اولیه، در بافر تریس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت 16 ساعت در °C 20- فریز شدند.
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
در این بخش بهینهسازی بیان پروتئین نوترکیب ابتدا با انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان TTL بر اساس میزان فعالیت آنزیمی عصاره سلولی و سپس بهینه سازی زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
ساختار پلاسمید حاوی ژن آنزیم TTL به روش گفته شده در بخش 3-3-2-2 به درون باکتری منتقل شد. سپس با لیز باکتریها پروتئینهای درون سلول جدا شدند (بخش 3-3-2-5) و سنجش فعالیت آنزیمی در مورد هرکدام از نمونهها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش 3-3-6). از بین 6 کلنی ترانسفورم شده بر اساس میزان توانایی تولید آنزیم 1 کلنی انتخاب شد و به صورت غلیظ شده در دمای°C 20- ذخیره گردید و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمانهای مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئینهای محلول درون سلول و میزان پروتئینهای موجود دراجسام نامحلول و پروتئینهای در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمانهای مختلف پس از القا، میتوان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپیسیلین، 1% تلقیح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتریها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، ابتدا ml1 از باکتریها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونهبرداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداری شد.
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتریها با استفاده از دستگاه سانیکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی 1 دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت 4 دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفوردمواد مورد نیاز مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250 1/0 گرم
اتانول 95% 50 میلیلیتر
فسفریک اسید 85% 100 میلیلیتر
در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیلآلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد میشود که شدت این رنگ در غلظتهای کم پروتئین نزدیک به قهوهای و در غلظتهای بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در 595 نانومتر خوانده میشود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازهگیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههای حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی 100 میکرولیتر، رقتهایی تهیه کرده و یک میلیلیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گردید. طی مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS(SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئینها و پپتیدها بکار میرود. قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلیاکریل آمید در غربال پروتئینهای مختلف است. در این روش پروتئینها بر اساس اندازه از هم جدا میشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرایط احیا، این ملکولها خطی شده و SDS به آنها بار منفی میدهد، که میزان بار منفی بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئینها به این صورت بر اساس اندازهشان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعتهای متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا میشوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفورزمحلول استوک اکریل آمید (8/30 %): 30 گرم اکریل آمید و 8/0 گرم بیس اکریل آمید در حدود 50 میلیلیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به 100 میلیلیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده): این بافر دارای غلظت 5/1 مولار تریس با 8/8~pH است. برای تهیه آن 2/18 گرم تریس- باز در حدود 70 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/8 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده): این بافر دارای غلظت 5/0 مولار تریس با 8/6~pH است. برای تهیه آن 1/6 گرم تریس باز در حدود 50 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/6 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تریس- باز، 2/7 گرم گلیسین و 5/0 گرم SDS در 500 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهیه گردید.
محلول رنگآمیزی: 05/0 گرم کوماسی آبی 250-R در 40 میلیلیتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 50 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول 05/0% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری میشود.
محلول رنگبر: 15 میلیلیتر متانول، 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 75 میلیلیتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگبری را تسریع میکند. با این حال باید توجه داشت که اگر ژل مدت طولانی در محلولهایی با درصد بالای متانول قرار گیرد، باندهای پروتئینی نیز بیرنگ میشوند).
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورزیک قالب شیشهای به کمک صفحات شیشهای کاملاً تمیز و فاصلهاندازها که با توجه به ضخامت مورد نیاز ژل انتخاب شده اند، ایجاد شد و با چند گیره محکم گردید. به انتهای صفحات شیشهای به اندازه 2/0 سانتیمتر آگار مذاب 5/0% اضافه شد.
محلول ژل پایین (ژل جدا کننده): مقادیر مورد نیاز برای تهیه ژل با درصد مشخص در جدول 3-6 آورده شده است. پس از افزودن مواد، محلول را به سرعت بهم زده و با دقت در قالب شیشهای تا ارتفاع مناسبی ریخته شد، به طوریکه حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل بالا باقی ماند. سپس به آرامی از کناره شیشه روی سطح ژل اتانول اضافه گردید (این کار به منظور صاف شدن ژل و جلوگیری از چین خوردن در اثر خشک شدن به دلیل تماس هوا با آن است). انعقاد ژل پایین معمولاً 45-15 دقیقه طول میکشد.

–413

1-4-اهمیت مطالعات خون شناسی در ماهیان26
1-4-1-شاخص های خونی26
1-4-1-1-گلبول های سفید (لکوسیت26
1-4-1-2-گلبول های قرمز (اریتروسیت ، هموسیت )26
1-4-1-3-شاخص های گلبول قرمز یا اندیس های خونی27
1-4-1-4-هماتوکریت27
1-4-1-5-هموگلوبین27
1-5-شاخص های بیوشیمیایی27
1-5-1-پروتئین کل پلاسما و آلبومین27
1-5-2-گلوکز28
1-5-3-گلوتامیک پیرویک ترانس آمیناز28
1-6-رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش28
1-7-باکتری های اسید لاکتیک (LAB)29
1-7-1-رده بندی علمی30
فصل دوم: سابقه ی تحقیق
2- سابقه ی تحقیق32
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-مکان و زمان انجام تحقیق41
3-2-مکان پرورش42
3-3-ذخیره سازی ، سازگاری و تقسیم بچه ماهیان43
3-4-پروبیوتیک مورد آزمایشLactobacillus plantarum44
3-5-نحوه ی آماده سازی جیره غذایی44
3-6-زیست سنجی45
3-7-نحوه ی غذادهی45
3-8-بررسی عوامل فیزیکی و شیمیایی آب46
3-9-بررسی پارامترهای خون شناسی46
3-9-1-خون گیری و تهیه سرم46
3-9-2-شاخص های خونی47
3-9-2-1-شمارش گلبول های قرمز و سفید47
3-9-2-2-اندازه گیری هماتوکریت48
3-9-2-3-اندازه گیری هموگلوبین49
3-9-2-4-شاخص های گلبول قرمز49
3-9-2-5-تشخیص افتراقی گلبول های سفید50
3-10-فاکتورهای ایمنی51
3-10-1-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی اختصاصی51
3-10-1-1-اندازه گیری ایمنو گلوبولینM (IgM)51
3-10-2-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی غیر اختصاصی51
3-10-2-1-اندازه گیری فعلیت لیزوزیم51
3-10-2-2-پروتئین کل سرم52
3-11-روش انجام آزمایشات فلور باکتریایی روده در آزمایشگاه52
3-11-1-روش آماده سازی محیط های کشت52
3-11-2-روش آماده سازی رقت های محلول روده و کشت اولیه53
3-11-3-روش شمارش کلنی ها و تقسیم بندی آنها54
3-12-روش محاسبه شاخص های رشد54
3-12-1-اندازه گیری طول و وزن54
3-12-2-شاخص وضعیت55
3-12-3-درصد افزایش وزن55
3-12-4-ضریب تبدیل غذایی55
3-12-5-ضریب رشد ویژه55
3-12-6-میانگین رشد روزانه55
3-12-7-شاخص کبدی56
3-13-آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی 56
3-14-تجزیه و تحلیل آماری56
فصل چهارم: نتایج
4-نتایج58
4-1-نتایج حاصل از اندازه گیری عوامل محیطی58
4-1-1-دمای آب58
4-1-2-اکسیژن محلول آب58
4-1-3-pH آب محیط پرورش58
4-2-نتایج حاصل از عملکرد رشد بچه ماهیان قزل آلا تحت تاثیر سطوح مختلف پروبیوتیک59
4-2-1-اثر بر وزن نهایی59
4-2-2-اثر بر طول نهایی59
4-2-3-اثر بر ضریب تبدیل غذایی60
4-2-4-ضریب رشد ویژه60
4-2-5-درصد افزایش وزن61
4-2-6-میانگین رشد روزانه61
4-2-7-میزان ضریب چاقی62
4-3-فلور باکتریایی روده ماهیان تیمار و شاهد62
4-3-1-میزان باکتریL.p در فلور روده قزل آلا در محیط کشت MRS62
4-3-2-توتال کانت باکتریایی روده ماهی قزل آلای رنگین کمان در محیط کشتTSA 62
4-4-نتایج حاصل از فاکتورهای خونی63


4-4-1-تعداد گلبول های سفید خون63
4-4-2-تعداد گلبول های قرمز خون64
4-4-3-غلظت هموگلوبین خون64
4-4-4-درصد هماتوکریت خون65
4-4-5-متوسط حجم گلبول قرمز65
4-4-6-متوسط غلظت هموگلوبین سلولی66
4-4-7-متوسط هموگلوبین گلبول قرمز66
4-4-8-درصد لنفوسیت67
4-4-9-مقادیر نوتروفیل67
4-4-10-درصد منوسیت68
4-4-11-درصد ائوزینوفیل68
4-5-نتایج فاکتورهای سرم68
4-5-1-میزان توتال ایمنوگلوبولین سرم خون69
4-5-2-میزان IgM69
4-5-3-میزان لیزوزیم سرم خون70
4-6-نتایج آنالیز لاشه70
4-6-1-درصد رطوبت لاشه70
4-6-2-درصد پروتئین لاشه71
4-6-3-درصد چربی لاشه71
4-6-4-درصد خاکستر لاشه72
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-بحث74
5-1-عملکرد رشد74
5-2-فلور باکتریایی روده77
5-3-شاخص های خونی78
5-4-شاخص های ایمنی خون81
5-4-1-لیزوزیم81
5-4-2-ایمنوگلوبین IgM83
5-5-آنالیز لاشه84
5-6-جمع بندی86
پیشنهادات 87
منابع88
پیوست107
چکیده انگلیسی121
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1: آنالیز تقریبی خوراک استفاده شده در تغذیه بچه ماهیان مورد آزمون44
جدول4-1: میانگین دما، اکسیژن محلول و pH آب در مقاطع زمانی مشخص در طول دوره بررسی58
جدول 4-2- میانگین وزن نهایی (گرم) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-3- میانگین طول نهایی (سانتیمتر) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-4- میانگین ضریب تبدیل غذایی بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-5- میانگین ضریب رشد ویژه بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-6- میانگین درصد افزایش وزن بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف61
جدول 4-7- میانگین رشد روزانه بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف61
جدول 4-8- میانگین میزان ضریب چاقی بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف62
جدول 4-9-میزان پروبیوتیک (لاکتوباسیلوس) در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت MRS62
جدول4-10-شمارش کلی فلور باکتریایی در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت TSA63
جدول 4-11-تعدادگلبول های سفید خونی قزل آلا در تیمارهای شاهد وآزمایشی در پایان60روز63
جدول 4-12-تعدادگلبول های قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60روز64
جدول 4-13- غلظت هموگلوبین g/dl)) خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60
روز64
جدول 4-14- درصد هماتوکریت % خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز65
جدول 4-15- متوسط حجم گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز65
جدول 4-16- متوسط غلظت هموگلوبین سلولی خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول 4-17- متوسط هموگلوبین گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول4-18- درصد لنفوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-19-درصد نوتروفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-20-درصد منوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-21-درصد ائوزینوفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-22-توتال ایمنوگلوبولین سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز69
جدول4-23-میزان IgM سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز69
جدول4-24-میزان لیزوزیم سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-25-درصد رطوبت لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-26-درصد پروتئین لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71
جدول4-27-درصد چربی لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71
جدول4-28-درصد خاکستر لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز72
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل( 1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"13
شکل (1-2) رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش29
شکل (3-1) موقعیت جغرافیایی گارگاه پرورش ماهی سردابی(قزل آلا) اشکرآب سیاهکل41
شکل (3-2) نمایی از کارگاه پرورش ماهی سردابی اشکراب سیاهکل42
شکل (3-3) نمایی از کانال های بتونی پرورش و تیمار و تکرارها43
شکل(3-4) پودر اولیه حاوی1011-101244
شکل(3-5) رقت های مختلف از106-101044
شکل(3-6) غذای آماده و غنی شده با پروبیوتیک45
شکل (3-7) غذادهی روزانه بر اساس محاسبات روزانه46
شکل (3-8) خونگیری از سیاهرگ در محل ساقه دمی46
شکل (3-9) دستگاه سانتریفوژ و نحوه ی جداسازی سرم خون47
شکل (3-10) دستگاه سانتریفیوژ هماتوکریت48
شکل (3-11) دستگاه اسپکتروفتو متر نور مرئی و UV49
شکل(3-12): دستگاه اسپکتروفتومتر مدل 2100-VIS شرکت Unico آمریکا51
شکل(3-13)دستگاه Auto Analyzer مدلBT- 150052
شکل (3-14) نحوه ی آماده سازی محیط کشت TSA و MRS آگار53
شکل (3-15) برداشت روده و تهیه رقت های مختلف و کشت در پلت های TSAو MRS54
شکل (3-16) نگهداری پلت ها در انکوباتور و شمارش باکتری ها54
شکل (3-17) آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی56
چکیده
تحقیق حاضر به منظور ارزیابی تاثیر باکتری اسید لاکتیک Lactobacillu plantarum (KC426951) جداسازی شده از روده قزل آلای رنگین کمان بر فاکتورهای رشد ، فلور باکتریایی روده ،فاکتورهای خونی و ایمنی بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) در بهار و تابستان سال 1392انجام شد. بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن 24/2±56/3 به مدت 2 هفته با شرایط پرورشی محیطی در یک مرکز پرورش خصوصی ماهیان سردآبی (اشکرآب سیاهکل) در استان گیلان قبل از شروع آزمایش سازگار شدند . ماهیان در قالب یک طرح کاملا تصادفی به شش گروه شامل 540 قطعه بچه ماهی تقسیم شدند . پارامترهای کیفی آب شامل درجه حرارت ، مقدار اکسیژن محلول و pH به ترتیب 3/0±3/17 درجه سانتی گراد ،43/0±5/8 میلی گرم و 26/0±4/7 اندازه گیری شد .پنج گروه از ماهیان ( هر گروه شامل 90 ماهی) با جیره حاوی 106 (تیمار1) ، 107 (تیمار2) ، 108 (تیمار3) ، 109 (تیمار4) و1010 (تیمار5) cfu g-1 لاکتو باسیلوس پلانتاروم و گروه کنترل (شاهد) بدون جیره حاوی پروبیوتیک به مدت 60 روز تغذیه شدند . تغذیه ماهیان بر اساس 3 درصد بیوماس وزن بدن بصورت روزانه و برابر صورت پذیرفت. نتایج نشان داد که میزان وزن نهایی ، طول نهایی، ضریب رشد ، درصد افزایش وزن و میانگین رشد روزانه در تیمار 2 بیشترین و در تیمار 5 کمترین مقدار و میزان ضریب تبدیل غذایی در تیمار 2 کمترین و در تیمار 5 بیشترین را به خود اختصاص داده بودند(05/0> P). همچنین بالاترین میزان توتال لاکتیک اسید روده ماهیان قزل آلا در تیمار4 و در حالیکه کمترین مقدار مربوط به تیمار شاهد و بالاترین توتال کانت مربوط به تیمار 2 و کمترین تیمار 5 بدست آمد(05/0> P). فاکتورهای خونی: بالاترین سطوح گلبول های قرمز در تیمار 5 (3/10408±3/898333) ، گلبولهای سفید در تیمار4 (4/702±3/10833) ، حجم گلبول های قرمز در تیمار 1(8/3±7/508) ، غلظت هموگلوبین در تیمار 5 (15/0±2/11) ، هماتوکریت در تیمار 5 (2±42) ،فراوانی لنفوسیت ها در گروه شاهد (53/1±67/69) ، فراوانی نوتروفیل ها در تیمار 5 (1±39) ، بدست آمد (05/0> P).
فاکتورهای ایمنی: بالاترین سطوح توتال ایمنوگلوبولین در تیمار 4 (15/1±33/20) ، IgM در تیمار4 (65/2±39) و لیزوزیم در تیمار4(08/2±67/40) حاصل گردید(05/0> P) .حداکثر رطوبت لاشه مربوط به تیمار 3 ، درصد پروتئین مربوط به تیمار 4 ، و کمترین درصد چربی مربوط به تیمار شاهد می باشد (05/0> P). با توجه به نتایج بدست آمده در خصوص بکارگیری Lactobacillus plantarum می توان از آن به عنوان یک فاکتور مثبت جهت بهبود فلور باکتریایی روده ، عملکرد رشد ، شاخص های خونی ، ایمنی و ترکیب لاشه استفاده نمود.
کلمات کلیدی: قزل آلای رنگین کمان،باکتری اسید لاکتیک ، Lactobacillus plantarum ، رشد ، فلور باکتریایی، شاخص خونی، ایمنی ، لاشه
فصل اول
کلیات

مقدمه
رشد فزاینده و روز افزون جمعیت جهان، تامین غذا و دستیابی به منابع جدید غذایی را به یکی از مهمترین دغدغه های دولت ها مبدل ساخته و موجب شده است تا تاًمین مواد پروتئینی به سمت سایر منابع از جمله آبزیان سوق یابد. در این میان ارزش بالای پروتئین آبزیان باعث گردید که صنعت ماهیگیری و آبزی پروری به صنعتی مهم و شایان توجه تبدیل شود. پرورش آبزیان یک فعالیت با گستره جهانی است که در بهبود تغذیه و کمک به توسعه اقتصادی کشورها موثر است.
صنعت آبزی پروری علیرغم این رشد قابل توجه، همواره با مشکلاتی روبرو بوده است که از عمده مشکلات را می توان ابتلا به بیماری های مختلف ذکر نمود . بیماریها در آبزیان به سه سه عامل مهم بستگی دارد وضعیت ماهی (میزبان) از نظر سلامت و تناسب اندام ظاهری و دارا بودن صفات مقاومتی و ایمنی در مقابل اجرام بیماریزا ، عوامل محیطی اهم از شرایط فیزیکی و شیمیایی نظیر اوضاع جوی ، تغییرات حرارتی ، تابش خورشید ، بارندگی و ... و عوامل پاتوژن یا بیماریزا را می توان نام برد ( آذری تاکامی، 1376). اغلب آبزیان پرورشی تحت تأثیر عفونت های باکتریایی قرار می گیرند که سیستم ایمنی شان توسط شرایط استرس زا به خطر می افتد. یکی از معمول ترین روش های درمان این عفونت ها، استفاده از آنتی بیوتیک ها می باشد این در حالی است که استفاده بیش از حد از این داروها باعث بروز مقاومت باکتریایی در این حیوانات می شود (Teuber, 2001). لذا بکارگیری آنتی بیوتیک ها جهت درمان بیماری های آبزیان پرورشی به طور گسترده مورد انتقاد قرار گرفته است، که دلائل آن علاوه بر افزودن هزینه ها عبارتند از: افزایش توانایی مقاومت باکتری ها در برابر آنتی بیوتیک ها، از بین بردن فلور میکروبی محیط زیست، هزینه بالای این داروها و عوارض جانبی این داروها بر ماهی و میگومی باشد . ثابت شده که برخی از آنتی بیوتیک ها سیستم ایمنی را سرکوب می کنند و موجودات آبزی را بیشتر مستعد پذیرش بیماری های باکتریایی ، ویروسی و انگلی می نمایند.افزایش نگرانی های ناشی از بکارگیری آنتی بیوتیک ها منجر به کاهش استفاده از آنها در صنعت آبزی پروری آمریکا و اروپا گردیده است.
آنتی بیوتیکها به تعادل باکتریهای موجود در روده آسیب وارد می کنند و اکثر باکتریهای مفید را از بین برده و منجر به پیدایش باکتریهای مقاوم به دارو می گردند و همچنین فقط 20 تا 30 درصد آنتی بیوتیک ها بوسیله ماهی هضم می شوند و بقیه وارد محیط زیست می شوند.
مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی علاوه بر ایجاد مقاومت در میکرو ارگانیسمها سبب نفوذ این مواد به خاک و آب گردیده و محیط زیست مجاور مزارع پرورش آبزیان را به شدت آلوده نموده است تثبیت داروها و مواد شیمیایی در بافتهای ماهی و آبزیان بهداشت انسانی را نیز به خاطر ایجاد حساسیتهای مختلف، مقاومت باکتریایی و عوارض کلیوی و کبدی به مخاطره می اندازد(آذری تاکامی، 1376).
در حال حاضر، استفاده از پروبیوتیک ها و سین بیوتیک ها به عنوان جایگزین استفاده از آنتی بیوتیکها در پرورش آبزیان مطرح هستند. آبزیان در مراحل اولیه تکثیر و پرورش از سطح ایمنی کافی برخوردار نبوده و نیازمند تدابیر لازم در خصوص پیشگیری و درمان می باشند و بهره گیری از پروبیوتیک ها نیز می تواند به عنوان یکی از ابزارهای موثر در پیشگیری از بیماریها و همچنین محرک رشد مد نظر قرار گیرد.
استفاده از پروبیوتیک ها بعنوان جایگزینی برای روشهای سابق به نظر می رسد می تواند بسیاری از مشکلات را مرتفع سازد. استفاده از پروبیوتیک ها در واقع تکنولوژی جدید آبزی پروری همگام با محیط زیست به شمار می رود. با استفاده از این مواد هم می توان تولید را افزایش داد، هم کیفیت آب را اصلاح کرد و هم اینکه آنها را به عنوان مبارزه بیولوژیک مد نظر قرار داد (حسینی فر، 1386).
تأثیر پروبیوتیک ها در تغذیه، مقاومت در برابر بیماریها و دیگر فعالیت های مفید به اثبات رسیده که از
جمله اثرات مفیدی که بر سلامتی دارند تأثیر بر روی سیستم ایمنی و تحریک سیستم ایمنی است(کامکار، 1390).
استفاده از زیست یارهای حیاتی (پروبیوتیک ها) به عنوان یک مکمل غذایی که قادر به بهبود دفاع و ایجاد
مقاومت در برابر عوامل بیماری زا در زمان بروز استرس های متفاوت طی دوره پرورش ماهی باشند، مورد
توجه هستند.پروبیوتیک ها بطور سودمندی با بهبود تعادل فلور میکروبی روده به میزبان سود می رسانند Fuller,1989)).پروبیوتیک ها نه تنها اثرات منفی آنتی بیوتیک ها را ندارند بلکه نقش مهمی در افزایش بهره وری ، تولید و کاهش درصد تلفات ماهی و میگو دارا می باشند.
تا کنون سویه های زیادی جهت استفاده در تغذیّه دام، طیور و آبزیان به عنوان پروبیوتیک معرفی شده است و با بهره گیری از مهندسی ژنتیک و دانش بیوتکنولوژی، سویه های مؤثرتر و بهتری نیز تولید خواهد شد. ولی به طور کلی پروبیوتیک ها از لحاظ نوع سویه میکروبی مؤثرشان به سه گروه تقسیم می شوند، پروبیوتیکهای 1- باکتریایی2- قارچی 3- مخمری.
پروبیوتیکهای باکتریایی عمده ترین پروبیوتیک هایی هستند که تاکنون در آبزی پروری استفاده شده اند. استفاده از پروبیوتیکهای حاوی باکتریهای اسید لاکتیک به افزایش میزان زنده مانی میزبان در مواجه با عوامل بیماریزا منجر میشوند که این عملکرد از طرق زیر صورت میگیرد ( Gatesoupe, 1999)
آثار آنتاگونیستی بر ضد عوامل بیماریزا از طریق ترشح مواد باکتری ُکش همانند باکتریوسینها
محدود کردن عوامل بیماریزا از طریق افزایش محل اتصال یا استفاده از ماده و انرژی در دسترس
افزایش سد دفاعی بدن از طریق افزایش سطوح ایمنی
همچنین مشاهده شده است برخی پروبیوتیکها اشتها را افزایش می دهند، سلامتی را بهبود می بخشند و افزایشی کلی را در وزن به وجود می آورند که احتما ً لا به دلیل افزایش قابلیت هضم مواد غذایی است (Gatesoupe and Ringo,1998)
توانایی باکتریهای اسید لاکتیک در تقویت ایمنی غیر اختصاصی ماهی قزل آلای رنگین کمان توسط مطالعات برخی از محققین ثابت شده است. به خصوص تجویز خوراکی بعضی از سویه های باکتری اسید
لاکتیک موجب افزایش پاسخ ایمنی سلولی مثل فعالیت فاگوسیتوز، انفجار تنفسی فاگوسیت ها، تکثیر لنفوسیتها و سنتز سیتوکنین ها می شود. (Austin &Irianto, 2002; Nikoskelainen et al., 2001; Balcazar et al., 2006; Panigrahi et al., 2010)
دفتر مواد غذایی و مطالعه دارویی آمریکا و انجمن رسمی کنترل مواد غذایی، برای متمایز نمودن میکرو ارگانیسم های مفید و مضر، لیست گونه هایی از میکرو ارگانیسم را ارائه نموده است که می توان آنها را با مواد غذایی مصرف نمود. از جمله این مواد می توان به لاکتوباسیلوس پلانتاروم Lactobacillus plantarum اشاره نمود.
در این تحقیق باکتری توسط دکترشناور ماسوله در سال 1391 از فلور باکتریایی روده برداشت و با روش مولکول 16S rRNA مورد شناسایی و در NCBI مورد ثبت قرار گرفت (KC426951) و برای اولین بار در ایران جهت تغذیه بچه ماهی قزل آلا بصورت in vivo مورد مصرف قرار گرفت.
تحقیقات و استفاده های گسترده ای از باکتری های اسید لاکتیک شده است که از آنها می توان به لاکتو باسیلوس اشاره کرد (Kesarcodi-Watson . et al .,2008)
در خصوص تاثیر انواع پروبیوتیکها بر رشد و بازماندگی ماهیان تحقیقات فراوانی بعمل آمده است ولی در زمینه اثرات ایمنی زایی آن در ماهیان اطلاعات بسیار محدودی در دسترس می باشد. لذا در این مطالعه بررسی ایمنی زایی این ترکیب در ماهی قزل آلای رنگین کمان مدنظر می باشد
قزل آلای رنگین کمان نخستین گونه از خانواده آزادماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش یافت. این ماهی از اواخر قرن نوزدهم میلادی به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار پرورش داده شده است. در حال حاضر، ماهی قزل آلا اساس صنعتی را تشکیل می دهد که در حال توسعه است و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند در حال افزایش است.
لذا با توجه به مطالب ذکر شده در نوشتار بالا که بیانگر نقش و اهمیت بسیار زیاد پرورش گونه قزل آلا
در تامین پروتئین جامعه می باشد و مشکلات پیش رو حاصل از تغییر شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط پرورش این گونه با ارزش که منجر به انواع بیماریها و تلفات قابل توجه و در نهایت از دست رفتن سرمایه پرورش دهندگان می گردد و با هدف کاهش مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی در مبارزه با بیماریها ی این آبزی که در نهایت به نحوی وارد چرخه مواد بدن انسان و اثرات سو می شود مطالعه جایگزینی مناسب نظیر پروبیوتیک ها از جمله باکتری لاکتو باسیلوس پلانتاروم بعنوان اولین زیست یار حیاتی ضروری به نظر میرسد لذا مطالعه ای در خصوص تاثیر مقادیر مختلف زیست یار حیاتیباکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم در جیره غذایی قزل آلای رنگین کمان بر رشد ، فلورباکتریایی روده، شاخصهای خونی و ایمنی این گونه مورد مطالعه قرار گرفت که به ضرورت انجام این تحقیق ، فرضیات و اهداف آن در ذیل اشاره شده است.
تاکنون در زمینه افزودن باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم به جیره غذایی قزل آلا، بویژه در سن رشد (بچه ماهی) جهت پرورش آنها در مزارع پرورش، مطالعه علمی و عملی و نیز بررسی اثر غذای حاوی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم روی فلور باکتریایی روده، عوامل خونی و ایمنی خون قزل آلای رنگین کمان به انجام نرسیده است. هرگونه تغییر در شرایط زیستی، تغذیه ای و ... می تواند روی فلور باکتریایی، شاخص های خونی و ایمنی اثر گذار باشد. برآورد این تغییرات جهت دست یابی به وضعیت ایمنی ماهیان تغذیه شده با پروبیوتیک مذکور از روی شاخص های خونی و بیوشیمیایی، از بررسی های علمی نوین در ایران می باشد.
تحقیق حاضر جهت بررسی سطوح مختلف باکتری Lactobacillus plantarum در جیره غذایی روی برخی فاکتورهای خونی ، ایمنی ماهی و فلور باکتریایی و رشد قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) طی60 روز مورد بررسی قرار گرفت. از آنجا که پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان در جهان بسیار رونق دارد، نتایج این تحقیق می تواند در سطوح بین المللی نیز حایز اهمیت بوده و مورد بهره برداری کارگاهها و مراکز دولتی و خصوصی پرورش ماهیان سرد آبی قرار گیرد.
سوالات تحقیق
1-یا مقادیرمختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتور رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
2- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
3- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
فرضیه تحقیق
1-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت ندارد.
2-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum برفاکتورهای رشد و فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت دارد.
3-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum ، شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان(Oncorhynchus mykiss) را بهبود می بخشد.
اهداف تحقیق
1-تعیین مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum یر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
2-تعیین تاثیر مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum بر فلور باکتریایی روده ی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
3-تعیین مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص های خونی و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
در مقایسه با تیمار شاهد.
1-1- مشخصات آزاد ماهیان (Salmonidae)
اکثر آزاد ماهیان گونه هایی با ارزش تجاری بالا هستند. هیچ یک از گونه های این خانواده کاملاً دریایی نیستند. یعنی به صورت آنادرموس ((Andromouse در دریا زندگی کرده و جهت تخم ریزی به آب شیرین مهاجرت می کنند. از مشخصات عمده این خانواده وجود باله چربی ( Fine Adipose) می باشد. این باله فاقد شعاع است و حد فاصل باله پشتی و دمی است. وجود دندان از مشخصات آزاد ماهیان است و در برخی گونه ها دندان ها در تمام محفظه دهان گسترش یافته است و وجه تمایز جنس های نر و ماده در زمان تخم ریزی می باشد. آزاد ماهیان گونه هایی گوشتخوار هستند (Maitland,2000).
به طور کلی آزادماهیان از نژادها و جمعیت های مختلفی برخوردار بوده و در نقاط مختلف جهان پراکنش گسترده ای دارند. این ماهیان در زمره ماهیان سردآبی قرار دارند و اغلب متعلق به مناطق سردسیری و معتدله جهان می باشند. در بین خانواده آزاد ماهیان، گونه های قزل آلای رنگین کمان، قزل آلای خال قرمز، آزاد ماهی دریای خزر و میزان محدودی ماهی آزاد زیبا و ماهی آزاد کتا در آب های ایران یافت میشود. این گونه ها از ارزش اقتصادی و زیستی بسیار بالایی برخوردارند و بایستی مورد توجه جدی تری قرار گیرند (فرزانفر، 1384)
1-1-1- رده بندی ماهی قزلآلا
این ماهیان از راسته آزادماهی شکلان(Salmoniforms) و مشتمل بر شش خانواده که عبارتند از: آزاد ماهیان (Salmonidae)، سفید ماهیان(Coregonidae)، بلند باله ماهیان(Thymalidae) ، نازک فلس ماهیان(Osmeridae) ، اردک ماهیان(Esocidae) و سگ ماهیان(Umberidae) که در این مجموعه تنها خانواده نخست، بطورمختصرتشریح می‌گردد.
از جنس‌های معروف این خانواده می‌توان به جنس Salmo، Hucho، Oncorhynchus ، Salmothymus ، Salvelinus و Stenodus اشاره نمود (فرزانفر، 1384).
در بین خانواده های راسته آزادماهی شکلان بجز خانواده های اردک ماهیان و سگ ماهیان مابقی دارای یک باله چربی کوچک هستند که در حدواسط بین باله پشتی و دمی آنها قرار دارد و فاقد شعاع های استخوانی سخت و نرم می باشند (وثوقی و مستجیر، 1379). در گذشته ماهی قزل آلای رنگین کمان را متعلق به جنس Salmo و Salvelinus قلمداد می کردند، در حالی که ماهی آزاد را مربوط به جنس Oncorhynchus می دانستند. اما در سال 1989 ماهی قزل آلای رنگین کمان را که قبلاً تحت عنوان علمی Salmo gairdneri معروف بود، جزو جنس Oncorhynchus طبقه بندی نمودند. امروزه قزل آلای رنگین کمان با نام علمی O. mykiss معروف است و از لحاظ علمی این ماهی جزو گونه های آزاد ماهیان محسوب می گردد (Stickney, 1991)
1-1-2- برخی ویژگی های مورفولوژیک و بیولوژیک ماهی قزل آلا ی رنگین کمان
این ماهی دارای یک نوار پهن بصورت رنگین کمان در هر طرف بدن بوده، بر روی سر، بدن، پشت، باله چربی و باله دمی آن لکه های تیره رنگی مشاهده می شود (شکل1-1). حداکثر طول این ماهی 70 سانتی متر و وزن آن به 7 کیلوگرم نیز بالغ می گردد. این ماهی را متعلق به گروه ماهیان رودرو((Anadromous Fishes ، میدانند. یعنی کلیه مهاجرت های تولید مثلی خود را درآب شیرین انجام می دهد (وثوقی و مستجیر،1379)این ماهی بطور طبیعی در ایران، در دریاچه های با آب سرد، نهرها و رودخانه های با بستر قلوه سنگی و سنگلاخی به سر می برد. زیستگاه این ماهی تا حدی مشابه قزل آلای خال قرمز (گونه بومی ایران) می باشد. در اغلب رودخانه های حوزه جنوبی دریای خزر بوسیله انسان معرفی شده است (نادری و عبدلی، 1383) این ماهی قابلیت بسیار خوبی برای پذیرش غذای دستی و پرورش مصنوعی را داشته، از سرعت رشد قابل قبولی برخوردار است.
1-1-2-1- دستگاه گوارش و اندام های مرتبط
آزاد ماهیان ، جانورانی گوشتخوار بوده ، دارای سیستم گوارشی کوتاهی می باشند ، دندان های این جانوران به شکلی بوده که قابلیت شکار را بخوبی برای آنها میسر می سازد. دهان در این ماهیان از قسمت های مختلفی مانند فک میانی ، فک فوقانی ، فک تحتانی ، استخوان تیغه ایی Vomer و زبان تشکیل شده است.
در این ماهیان علاوه بر فکین ، دندان ها بر روی سقف دهان و قاعده زبان نیز یافت می شوند (فرزانفر ، 1384). در محوطه معده واکنش های وابسته بع ترشح اسیدمعده ، آنزیم ها و همچنین حرکات معده می تواند موجب له شدن مواد غذایی شده، مراحلی از هضم صورت پذیرد.در بخش انتهایی معده و در محل اتصال به روده حدود 30 الی 80 زوائد انگشتی بنام زوائد باب المعده ای Pyloric caeca قرار گرفته اند که در هضم می توانندنقش موثری داشته باشند. مواد غذایی از سوی معده از طریق یک دریچه یک طرفه به نام پیلور وارد روده شده تا به کمک آنزیم های آن هضم بیشتری بر روی مواد غذایی انجام پذیرد. بعلاوه آب ، املاح و ویتامین ها نیز از طریق جداره روده جذب می گردند. بقیه مواد باقیمانده سپس بصورت مدفوع از مخرج ماهی دفع می شود(Ali,2000) .
غدد گوارشی مانند ، کبد ، کیسه صفرا و پانکراس نقش بسزایی در هضم مواد غذایی دارند. کبد بعلت داشتن اندازه بزرگ و همچنین بافتی نرم براحتی قابل شناسایی می باشد. رنگ این غده از قرمز تیره تا قهوه ایی روشن متفاوت است. در کنار کبد، کیسه صفرا قرار گرفته است که مایع سبز رنگی به نام صفرا را تولید می نماید. عمل اصلی این مایع ، تاثیر بر روی مواد چربی و شکستن مولکول های چربی می باشد. پانکراس در آزاد ماهیان بصورت غدد پراکنده در میان زوائد باب المعده ای ظاهر می گردد . پانکراس با تولید آنزیم های گوناگون به هضم مواد غذایی کمک کرده ، بعلاوه با ترشح هورمون انسولین در کنترل قند خون نقش موثری دارد (Pannell and barton , 1996) .
1-1-3- برخی ویژگی های ماهی قزلآلایرنگینکمان "Oncorhynchus mykiss"
قزل آلای رنگین کمان جز ماهیان پرورشی است که از اواخر قرن نوزدهم میلادی اهلی شد و به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار، پرورش داده شده است. اکنون ماهی قزل آلا اساس یک صنعت در حال توسعه را تشکیل می دهد و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند، در حال افزایش است. این ماهی نخستین ماهی (گونه) از خانواده آزاد ماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش داده شد. در حال حاضر، این ماهی سهم با ارزشی در تامین غذای انسان دارد. علت این امر فقط به دلیل ارزش غذایی بالای این ماهی و کمیاب و گران شدن ماهیان وحشی که از طبیعت صید می شوند، نیست. بلکه بخاطر وجود چربی های اشباع نشده ای هستند که در این ماهی یافت می شوند (فرزانفر، 1384).
جنسهای این خانواده در آب های سرد با اکسیژن فراوان زندگی می کنند که توسط انسان به اقصی نقاط
دنیا برده شد. به خاطر خاصیت سازگاری زیاد آن، هماکنون در بیشتر آب های شیرین که دارای دمای مناسب جهت رشد این گونه هستند، حضور دارد و گونه پرورشی بیشتر مزارع پرورش ماهیان سردآبی دنیا و تقریباً صددرصد مزارع پرورش ماهیان سردآبی ایران را به خود اختصاص میدهد (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-4- پراکنش ماهی قزل آلا در جهان و ایران
محدوده زیستگاه اصلی ماهی قزل آلای رنگین کمان شمال غرب آمریکاست و از رودخانه Kuskokwim در آلاسکا آغاز شده و به سمت جنوب ادامه می یابد و با عبور از بخش British Clombia به منطقه Baja در کالیفرنیا می رسد. در سواحل شرقی انشعاب اصلی در رودخانه Peace در ایالت British Clombia و Athabasca (در آلبرتا) نیز وجود دارد. جمعیتی از این ماهی نیز به صورت بومی در استان Chihuahua در کشور مکزیک وجود دارند. سرعت رشد نژاد مهاجر پولادسر (که به دریا مهاجرت میکند) بیشتر است. ماهیان نژاد مهاجر عموماً از نژاد غیر مهاجر که تمام دوره زندگی خود را در رودخانه سپری می کنند بزرگترند؛ اما بزرگترین ماهیان قزل آلای رنگین کمان را می توان در دریاچه های آب شیرین یافت (مشائی، 1386)این ماهی
در حوضه خزر، دجله ،کارون، نمک، کویر، زاینده رود، تجن (خراسان) و کرمان پراکنش دارد (هدایتی فرد،1382). همچنین در رودخانه پارک ملی گلستان در مناطقی با دمای کمتر از 20 درجه سانتی گراد مشاهده می گردد (عبدلی،1389).قدمت پرورش آن در ایران نیز به چند دهه قبل، یعنی سال 1338 هجری شمسی مربوط می شود (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-5- بررسی آماری تولیدات پرورشی ماهی قزل آلا
براساس سالنامه آماری سازمان خواربار جهانی ملل متحد (FAO) که در سال 2012 منتشر نمود، میزان کل تولید آبزیان پرورشی در سال 2010، بالغ بر 6/63 میلیون تن بوده است.
نرخ رشد صنعت پرورش آبزیان طی سالهای 1960 الی 2009 برابر 2/3 درصد بود در حالیکه طی مدت مشابه نرخ رشد افزایش جمعیت معادل 7/1 درصد بوده است . میزان تولید ماهیان خانواده آزاد ماهیان در سال 2001 برابر 1785121 تن گزارش شده است که این گونه ها در سال 2010 به مقدار 2411136 تن افزایش یافت. بر اساس گزارش در همین منبع میزان پرورش آبزیان در ایران در سال 2010 برابر 220034 تن می باشد که رتبه 14پرورش آبزیان را بین کشورهای جهان دارا می باشد .
آمار ارائه شده در آمارنامه سازمان شیلات ایران میزان تولیدحاصل از آبزی پروری را در سال 1389 معادل 251374 تن و در سال 1379 معادل 66000 تن گزارش نموده است .طی ده سال اخیر، روند صعودی میزان تولید ماهی قزل‌آلای رنگین کمان در ایران پیشرفت بسیار قابل توجهی داشته است. بطوریکه میزان تولید سالانه این ماهی در سال 1379، از مقـدار 9000 تـن، به مـرز 91519 تـن در سـال 1389 رسـیده است. که معادل 8/3 درصد تولیدات ماهیان سردآبی جهان است (FAO,2012).

شکل(1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"
1-2- پروبیوتیک چیست؟
واژه پروبیوتیک، واژه ای یونانی و به معنای "برای زندگی" می باشد (Chukeatirote, 2003). پروبیوتیک نخستین بار توسط Lilly & Stillwell (1965) برای برخی مواد مترشحه بوسیله میکروارگانیسم ها بکار گرفته شد که موجب تحریک رشد سایر میکروارگانیسم ها می شوند. بنابر این، ترکیبات اخیر از لحاظ تاثیر می توانند کاملاً در برابر آنتی بیوتیک ها یا مواد پاد زیست، قرار گیرند. با این وجود، بکارگیری این واژه بدین شکل تداوم نیافت و Sperti (1971) از این واژه تحت عنوان عصاره ی بافتی که موجب تحریک رشد میکروبی می شوند، یاد نمود.
تحقیق Metchinkoff (1907) در آغاز قرن بیستم را می توان نخستین تحقیق انجام شده در زمینه پروبیوتیک ها دانست. وی تاثیر مصرف ماست را مورد بررسی قرار داد و متوجه تأثیر این ماده غذایی روی طول عمر کشاورزان بلغاری شد. در واقع او اصول دستکاری میکروفلور روده را درک نموده بود و این موضوع را این گونه شرح داد: "میکروب هایی که با هدف بهبود سلامتی خورده می شوند". همین تعریف، بعدها توسط Parker (1974) اینگونه اصلاح شد: "موجودات و موادی که در تعادل میکروبی روده تأثیرگذارند".
Fuller (1989) نیز تعریف Parker را اینگونه اصلاح نمود: "مکمل های غذایی حاوی میکروب های زنده که از طریق تعادل میکروفلور روده اثرات مفیدی بر سلامت میزبان می گذارد"، این تعریف امروزه بیشتر متعارف است. اجزای اصلی این تعریف منعکس کننده لزوم زنده بودن میکروارگانیسم و استفاده آن به صورت مکمل غذایی برای میزبان است و ابهامی را که با بکاربردن اصطلاح "مواد" ایجاد می شد را از بین می برد. "اثر بر روی تعادل میکروبی روده" که در تعریف اخیر اشاره شد، در تحقیقات انجام شده کمتر مورد توجه قرار گرفته است. Tannock(1997) به این نکته توجه نمود و این تعریف را به این صورت پیشنهاد کرد: "سلول های میکروبی زنده که با هدف بهبود سلامتی، به صورت مکمل های غذایی بکار می روند".
بسیاری از محققین تعریف Fuller را مورد تجزیه و تحلیل بیشتری قرار داده و تعاریف کامل تری را ارئه نمودند. بعنوان نمونه، Gatesoupe (1999) پروبیوتیک ها را اینگونه تعریف نمود: "سلول های میکروبی که به طریقی وارد دستگاه گوارش می شوند و زنده می مانند تا سلامتی را در میزبان ایجاد نمایند". Gram و همکاران (1999) نیز پیشنهاد کردند که "پروبیوتیک هر نوع مکمل میکروبی زنده است که از طریق بهبود تعادل میکروبی بر میزبان تأثیر مثبت می گذارد". همچنین، Salminen و همکاران (1999) تعریف پروبیوتیک را این گونه ارائه کردند: "پروبیوتیک ها فرآورده هایی از سلول های میکروبی یا اجزایی از سلول های میکروبی هستند که اثرات مفیدی روی سلامت میزبان دارند". در این تعریف لزوم زنده بودن سلول های مرتبط با تغذیه نادیده گرفته شد.
روشن است که اختلافات زیادی در درک واقعی اصطلاح "پروبیوتیک" وجود دارد. از آنجا که پروبیوتیک ها در آبزی پروری هم استفاده می شوند، تعاریف بایستی اصلاح شوند. در جانوران آبزی نه تنها دستگاه گوارش مهم است، بلکه آب محیط پرورش هم دارای اهمیت می باشد (Gomez-Gil et al., 2000).
به طور خلاصه می توان پروبیوتیک را اینگونه تعریف نمود: "پروبیوتیک ها باکتری های بی ضرری هستند که به سلامت جانور میزبان کمک می کنند و بطور مستقیم یا غیر مستقیم، میزبان را در بر ابر عوامل بیماریزای باکتریایی محافظت می نمایند" ( Irianto et al.,2000).
1-2-1- ضرورت استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری
در سیستم های متراکم تولید تخم و لارو، آب با روش های گوناگونی مانند فیلتر کردن تصفیه می شود و با این کار عده ای از باکتری ها از سیستم خارج می شوند که این عمل ممکن است تعادل بین جمعیت میکروب ها را از بین ببرد یا سبب تکثیر باکتری های فرصت طلب گردد و یا باعث توسعه جمعیت باکتری های پیش بینی نشده شود. بنابراین برای کنترل میکروبی سیستم، روش های بهتری مورد نیاز است (Olafsen, 1998).
در طی دوره انکوباسیون یا پرورش لارو، میان کنش های متفاوتی بین باکتری ها و سطوح روده جاندار ممکن است رخ دهد که احتمالاً منجر به تشکیل میکروفلور بومی در موجود می گردد و یا زمینه ساز بروز عفونت می گردد. از این رو برای موفقیت در تولید متراکم و انبوه استفاده از روش هایی برای تقویت سیستم های دفاع طبیعی جاندار ضروری بنظر می رسد ( Olafsen, 1998). از دیگر کاربردهای پروبیوتیک بهبود تعادل میکروبی روده و در نتیجه بهبود جذب غذا می باشد (Parker, 1974 ; Fuller, 1989).
در سیستم های آبزی پروری، میکروب ها از اهمیت ویژه ای برخوردار بوده و بر عملکرد رشد اثرات ویژه ای نشان می دهند. علت این امر تا حدی مربوط به ارتباط مستقیم بیماری ها و کیفیت آب، با عوامل میکروبی است. اخیراً در آبزی پروری بمنظور حفظ شرایط اکولوژیک، از پروبیوتیک به جای آنتی بیوتیک استفاده می شود و تکنیک انتقال باکتری به لارو ضروری است (Skjermo & Vadstein, 1999). احتمالاً در فرایند . بمنظور استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، در نظر گرفتن الزاماتی نظیر وجود باکتری با کیفیت مناسب بعنوان پروبیوتیک هاضمه دوکفه ای ها، باکتری ها آنزیم های خارج سلولی همانند پروتئاز و لیپاز تولید کرده و فاکتورهای لازم را برای رشد فراهم می آورند. همچنین احتمالاً باکتری ها در تغذیه بی مهرگان دریایی و ماهی ها نیز نقش دارند (Olafsen, 1998). این گونه باکتری ها با تولید مواد سلولی یا میکرونوترینت هایی شبیه اسیدهای چرب ضروری (Ringo et al.,1995)، ویتامین ها ( Sugita et al.,1998)، مواد معدنی یا حتی آنزیم ها به تغذیه کمک می نمایند.
حضور باکتری های اسید لاکتیک در دستگاه گوارش دلیلی بر وجود تخمیر در روده می باشد، این باکتری ها روی هیدرات های کربن پیچیده همچون نشاسته و سلولز تاثیر گذاشته و آنها را به ترکیبات ساده تر تبدیل می کنند تا جذب و سنتز ویتامین های خانواده B و ویتامین K در لوله گوارش صورت گیرد (Hansen & Olafsen, 1999). در اکوسیستم های آبی ارتباط بین میکروارگانیسم ها و دیگر واحدهای زنده و همچنین جریان مداوم آب، میان دستگاه گوارش ماهیان و بی مهرگان، همه بر روی میکروفلور بومی تاثیر می گذارد(Olafsen, 1998). ایجاد کلنی های پروبیوتیک در امعا و احشا احتمالاً در اثر مصرف آن از محیط آبی اطراف می باشد که سبب تعدیل فلور امعا و احشا میشود و باعث بهبود رشد و بقای لاروها میگردد.
این امکان وجود دارد که پروبیوتیک ها همانند یک ماده فعال کننده مکانیسم های دفاعی عمل نمایند ( Raa, 1996). باکتری های پروبیوتیک هوازی با مصرف اکسیژن، شرایط لوله گوارش را برای عوامل بیماریزا هوازی سخت می نمایند و برای آنها محدودیت ایجاد می نمایند و از رشد آنها جلوگیری می کنند. همچنین از لحاظ فضا و غذا نیز با آنها رقابت می کنند. در این میان تعدادی از پروبیوتیک ها اجباراً از بین میروند.
در واقع استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، باعث کاهش سطح ترکیبات آنتی میکروبیال (بویژه آنتی بیوتیک ها) بکار رفته، افزایش میزان اشتها و یا مقدار رشد گونه های پرورش یافته می شود)
Irianto & Austin, 2002)). شاید بتوان مهمترین ویژگی پروبیوتیک ها را در این دانست که ضمن کاهش بیماری و بهبود ضریب تبدیل غذایی در دام و طیور، هیچ باقیمانده ای در بافت ها نداشته و بر خلاف پادزیست ها مقاومت میکروبی ایجاد نمی نمایند. مطمئناً، پروبیوتیک ها نبایستی برای میزبان ضرر داشته باشند (Salminen et al., 1999) و آنها غیر بیماریزا و غیر سمی بوده و می توانند موجب پیشگیری از بروز اثرات جانبی نامناسب باشند. آنها بایستی در یک محدوده دمائی و دامنه شوری مشخصی مؤثر باشند ((Fuller, 1989 .
1-2-2- خطرات مصرف آنتی بیوتیک ها
امروزه درمان با مداخله میکروارگانیسم ها به چند دلیل مورد توجه می باشد (رنجبرو میرنژاد، 1380; Rengpipat et al., 1998):
درمان با آنتی بیوتیک بطور موفقیت آمیزی برای کل عوامل عفونی مثمر ثمر واقع نشده است، اگرچه بدون شک بعضی از مسائل را حل نموده ولی بعضاً خود مساله ساز بوده است.
درمان با آنتی بیوتیک وضعیت فلور معمولی محافظت کننده بدن را بر هم می زند و موجود را نسبت به سایر عفونت های فرصت طلب مستعد می نماید و موجب افزایش نگرانی و ترس از ایجاد سویه های میکروبی مقاوم به آنتی بیوتیک در اثر استعمال گسترده آن شده است. با استفاده از آنتی بیوتیک های مشابه، سویه های میکروبی نسبت به آنها مقاومت پیدا می کنند و به سرعت رشد یافته و تکامل می یابند.
1-2-3- نحوه عمل پروبیوتیک ها
1-2-3-1- تولید ترکیبات ممانعت کننده (Inhibitory Component)
باکتری های پروبیوتیکی ترکیبات شیمیایی مختلفی تولید می کنند، که موجب از بین رفتن سایر باکتری ها و یا توقف فعالیت آنها می گردد (Verschuere et al., 1999). به نظر می رسد تولید مواد ممانعت کننده می تواند در داخل و یا سطح روده و حتی در محیط پرورشی، به عنوان سدی موجب جلوگیری از رشد و نمو عوامل بیماری های فرصت طلب گردد. معمولاً اثر ضد باکتریایی باکتری ها می تواند بعلت تولید برخی از عوامل زیر به تنهایی و یا بصورت ترکیبی باشد: تولید آنتی بیوتیک ها ) Williams & Vickers, 1986)، باکتریوسین ها (Bruno & Montville, 1993 و Boyd et al., 1984)، سیدروفورها ( Pybus et al., 1994،
Yoshida et al., 2002 و Braun, & Braun, 2002)، لیزوزیم ها، پروتئازها، هیدروژن پراکساید ها و یا تغییر میزان pH از طریق تولید اسیدهای آلی (Sugita et al., 1997 و Ringo & Gatesoupe, 1998)، دی اکسید کربن (Gill, 2003). تعدادی ازمحققین ترکیباتی کشف و مشاهده نموده اند. بعنوان نمونه، Nair و همکاران (1985) نشان دادند که تعداد قابل توجهی از باکتری های دریایی، آنزیم های باکتریولیتیک علیه باکتری Vibrio parahaemolyticus تولید می کنند. همچنین،Imad و همکاران (1985)، Alteromonas SB-10-31 را از نواحی نزدیک ساحل دریای ژاپن جداسازی نمودند. آنها نشان دادند که این باکتری قادر است یک پروتئاز آلکالینی ممانعت کننده که موناستاتین نامیده می شود، تولید کند. در آزمایش فعالیت ممانعت کنندگی موناستاتین علیه پروتئاز بدست آمده از Aeromonas hydrophila و پروتئاز تیول بدست آمده از Vibrio anguillarum، به اثبات رسید (هر دو باکتری مذکور عوامل بیماریزای ماهی هستند) (Verschuere et al., 1999).
1-2-3-2- رقابت بر سر مکان های اتصال
موجودات پروبیوتیکی برای مکان های اتصال و غذا در سطح مخاطی روده رقابت می کنند و در نتیجه از تشکیل کلونی باکتری های بیماریزا پیشگیری می کنند ( Vanbelle et al., 1990). قدرت اتصال باکتری های پروبیوتیکی ظاهراً طی مرحله سکون رشد بیشتر از مرحله رشد لگاریتمی است (Vine et al., 2004). اتصال ممکن است غیراختصاصی، بر پایه فاکتورهای فیزیکوشیمیایی و یا اختصاصی باشد. محل اتصال می تواند در بر گیرنده مولکول های چسبیده به سطح باکتری های متصل به روده و یا مولکول های گیرنده روی سطح سلول های مخاطی روده باشد (Salminen 1996). توانایی پروبیوتیک ها برای چسبیدن به موکوس روده احتمالاً می تواند ایجاد عفونت روده را توسط برخی از عوامل بیماریزا متوقف می کند. البته اتصال پروبیوتیک ها به دیواره روده یا سایر بافت ها لزوماً نشان دهنده رقابت بر سر مکان های اتصال به عنوان تنها روش عملی اثر پروبیوتیک ها نیست. این نکته که باکتری ها قادر به تشکیل کلونی، مثلاً در دیواره روده ماهی، هستند و نقش حفاظتی شان از طریق ترشح ترکیبات ممانعت کننده اعمال می نمایند، کاملاً پذیرفته شده است (Verschuere et al., 2000). توانایی اتصال و رشد در سطح روده یا درون موکوس خارجی در شرایط آزمایشگاهی در مورد برخی عوامل بیماریزا در ماهی از قبیلV. anguillarum وA. hydrophila ( Krovacek et al., 1987 ; Garcýa de la Banda et al., 1992) و همچنین برای پروبیوتیک های مانند Carnobacterium SK1 و بسیاری از پروبیوتیک های تخلیص شده نشان داده شده است. همچنین نقش ممانعت کنندگی برایV. anguillarum ( Olsson et al., 1992) نیز به اثبات رسیده است. در یکی از این مطالعات، هدف ارزیابی توانایی سویه های پروبیوتیکی در اتصال یا رشد در موکوس روده ای در شرایط آزمایشگاهی بوده تا پتانسیل آنها در تشکیل کلونی در توربوت پرورشی، به عنوان روشی برای پیشگیری از عفونت میزبان باV. anguillarum بررسی گردد (Olsson et al., 1992).
1-2-3-3- رقابت جهت جذب و مصرف مواد مغذی
پروبیوتیک ها از مواد مغذی که توسط میکروب های بیماریزا مصرف می شوند، استفاده می کنند و در نتیجه محیط را از مواد غذایی مورد نیاز برای سایر میکروارگانیسم ها تهیه می نمایند و موجب بروز مشکلاتی برای رشد آنها می شوند .در تئوری، رقابت بر سر مواد مغذی می تواند نقش مهمی در ترکیب توده زنده میکروبی روده یا محیط زیست موجودات آبزی پرورشی، ایفا نماید.(Ringo & Gatesoupe, 1998). اما تاکنون مطالعات جامعی در این زمینه انجام نگرفته است. از اینرو بکارگیری صحیح و بجای اصل رقابت بر سر مواد مغذی در شرایط طبیعی کاری آسان نبوده و وظیفه اصلی اکولوژیست های میکروبی است (Verschuere et al., 1999).
Verschuere و همکاران (1999) سویه های مختلف باکتریایی را که اثر مثبتی بر روی بقاء و رشد آرتمیای جوان داشتند، انتخاب نمودند. آزمایش های آنتاگونیستی در شرایط in vitro و آزمایشات فیلتری نشان داد که هیچ ترکیب ممانعت کننده خارج سلولی در عمل حفاظتی این سویه ها علیهVibrio  proteolytics CW8T2 شرکت نداشته اند. اما سلول های زنده این سویه در حفاظت آرتمیا در برابر عامل بیماریزا ضروری بنظر می رسند یافته های اخیر بر این نکته اشاره دارند که باکتری های انتخاب شده عمل حفاظتی شان را از طریق رقابت با عامل بیماریزا بر سر دسترسی به مواد مغذی و انرژی اعمال می کنند.
1-2-4- معیارها و روشهای انتخاب پروبیوتیک
نخستین و مهمترین هدف ازکاربرد پروبیوتیک ها، حفظ یا ایجاد مجدد رابطه مطلوب بین میکروارگانیسم های بیماریزا و مفید است که فلور موکوس پوست و روده ماهی را تشکیل می دهند. بنابراین یک پروبیوتیک مناسب بایستی برخی خصوصیات خاصی که اثر مثبت آن را تأیید نماید، داشته باشد( Ali, 2000).
اکثر مطالعات انجام گرفته در زمینه اثر پروبیوتیک ها بر جانوران آبزی پرورشی بر کاهش مرگ و میر و بالعکس، افزایش بقاء (Moriarty, 1998 ; Skjermo & Vadstein, 1999 Chang & Liu, 2002 ; ; Irianto & Austin, 2002)، افزایش مقاومت در برابر بیماری (Gatesoupe, 1994)، توانایی چسبندگی و تشکیل کلونی در روده ( Joborn et al., 1997)، توانایی کاهش تعداد سلول های باکتریایی در کلیه، تولید پلی آمین ها و فعالیت آنزیم های گوارشی (Tovar et al., 2002) و تکامل سیستم ایمنی غیر اختصاصی توسط سیستم های داخل سلولی، مثلاً افزایش فاگوسیتوز و فعالیت های لیزوزیمی ( ;Irianto, & Austin, Panigrahi et al., 2004 ; Gullian et al., 2004) بوده است. اثر مثبت پروبیوتیک ها برمیزبان نظیر، سم زدایی از ترکیبات مضر موجود در غذا و بهبود مواد مغذی آن، تجزیه کردن اجزای غیر قابل هضم موجود در جیره غذایی توسط آنزیم های هیدرولیتیک من جمله آمیلاز و پروتئاز، تولید ویتامین ها مثل بیوتین و B12، تولید ترکیباتی که آنتاگونیست عوامل بیماریزا هستند و در نهایت تحریک سیستم ایمنی میزبان تاکنون گزارش شده اند. روشن است که یک پروبیوتیک مفروض می تواند بیش از یک پاسخ حفاظتی را در میزبان القا نماید. همچنین پروبیوتیک های مختلف می توانند اثرات جداگانه و مشخصی را بر میزبان بگذارندIrianto, 2002) Austin &). دوام پروبیوتیک ها در دستگاه گوارش می تواند منعکس کننده شرایط سن و بهداشت و سلامتی ماهی باشد. مثلاً تجویز پروبیوتیک ها درماهیان جوان، در هنگام انجام اولین مراحل تغذیه و در ماهیان بزرگتر پس از مصرف آنتی بیوتیک ممکن است منجر به تشکیل کلونی بلندمدت از باکتری های پروبیوتیکی در دستگاه گوارش گردد. روش های انتخاب باکتری پروبیوتیکی برای استفاده در پرورش موجودات آبزی شامل مراحل زیر می باشد (Gomez-Gil et al., 2000):
1-2-4-1- جمع آوری اطلاعات زمینه ای
پیش از انجام فعالیت های تحقیقاتی در زمینه توسعه پروبیوتیک ها، در مورد فعالیت های پرورشی و توسعه اقتصادی مزارع پرورشی هم باید بررسی شود. مروری بر مقالات علمی در دسترس و اطلاعات گسترده مربوط به نحوه پرورش در مزارع پرورشی هم باید انجام شود تا تعیین گردد که آیا استفاده از پروبیوتیک میسر است یا خیر؟ وضعیت محیط زنده و غیر زنده اشغال شده توسط موجودات پرورشی با تأکید بر میکروب های موجود و ارتباط بین میکروب های محیط و ظرفیت نگهداری میکروب نیز از جمله مواردی است که بایستی مورد بررسی واقع گردد (Verschuere et al. 2000).
1-2-4-2- تهیه پروبیوتیک
تهیه یک پروبیوتیک مناسب از اهمیت ویژه ای بر خوردار است. ضروریست برای سویه های به کار گرفته شده در فرآورده های پروبیوتیک با مصرف خوراکی ، مقاومت در برابر آنزیم های دستگاه گوارش و دهان از مهمترین معیارهای انتخاب و گزینش می باشد ( مطلبی و همکاران ، 1389).
1-2-4-3- ارزیابی توان پروبیوتیک در جهت خارج سازی سویه های بیماریزا
با استفاده از آزمایش های in vitro توانایی سویه های جداسازی شده را می توان ارزیابی نمود(Gram et al.,2001).
1-2-4-4- ارزیابی امکان بیماریزایی پروبیوتیک
پیش از استفاده از یک باکتری به عنوان پروبیوتیک، لازم است که عدم بیماریزایی آن در میزبان تأیید شود. بنابراین موجودات پرورشی بایستی به همراه پروبیوتیک انتخاب شده، تحت شرایط نرمال و استرس مورد آزمایش قرار گیرند. این کار را می توان با تزریق یا غوطه وری میزبان در سوسپانسیون پروبیوتیک انتخاب شده، یا افزودن پروبیوتیک به محیط پرورشی، انجام داد (Gomez-Gil et al., 2000).
1-2-4-5- ارزیابی اثر پروبیوتیک بر میزبان
اثر پروبیوتیک انتخاب شده بایستی به صورت in vivo هم آزمایش شود. وقتی اثر پروبیوتیک به صورت مصرف در غذا در نظر گرفته شود، پروبیوتیک های انتخاب شده را می توان به محیط پرورش گونه آبزی مورد نظر افزوده و اثرشان را بر رشد و باز ماندگی ارزیابی نمود. اگرچه هنگامیکه کنترل زیستی توده میکروبی مورد نظر است، به نظر می رسد آزمایش های in vivo ابزاری مناسب جهت ارزیابی اثر بالقوه پروبیوتیک انتخاب شده بر میزبان باشد(Kesarcodi-Watson et al., 2008).
پروبیوتیک را می توان به روش های مختلف به میزبان یا محیط اطرافش اضافه نمود:
-اضافه کردن به جیره غذایی (Irianto & Austin, 2002)
-افزودن به آب پرورش (Verschuere et al., 2000)
-غوطه وری ( Austin et al. 1995)
-اضافه کردن از طریق غذای زنده (Gomez-Gil et al. 1998 ;Dhert et al. 1990 ; Robles et al. 1998)
1-2-4-6- تولید انبوه، ارزیابی سود اقتصادی
این مرحله، آخرین مرحله انتخاب پروبیوتیک است. آزمایشات اولیه بایستی در محیط یک سالن تفریخ در مزارع پرورشی انجام شود تا اثرات اقتصادی کاربرد پروبیوتیک مورد ارزیابی واقع گردد. فاکتور مهم در ارزیابی اقتصادی، امکان تولید انبوه یک پروبیوتیک است. همچنین، ممکن است قوانین محدودکننده ای در مورد کاربرد آنها در یک کشور وضع شده باشد. از اینرو بایستی پیش از آنکه کاربردهای تجاری در این خصوص آغاز شود، به آنها توجه بیشتری معطوف گردد. در پایان بایستی تعیین شود که آیا پروبیوتیک ها را می توان در عمل بکار برد یا خیر؟ بر اساس تعریف Fuller (1987)، یک پروبیوتیک بایستی برای میزبان سودمند باشد، قادر باشد در دستگاه گوارش باقی بماند، قابلیت تولید به صورت تجاری را داشته باشد، یعنی در سطح وسیع رشد کند و تولید آن اقتصادی بوده و در شرایط طولانی مدت در انبار و مزرعه، پایدار و مؤثر بماند.
به طور خلاصه، انتخاب باکتری های پروبیوتیکی یک فرایند تجربی مبتنی بر شواهد علمی محدود بوده است. بسیاری از تجارب ناموفق در زﻣﻴﻨﺔ تحقیقات در خصوص پروبیوتیک ها را می توان به انتخاب میکروارگانیسم های نامناسب نسبت داد. توسعه پروبیوتیک های قابل استفاده در کاربردهای تجاری در آبزی پروری یک فرایند چند جانبه و چند مرحله ای است، که نیازمند تحقیقات بنیادی و تجربی بوده و نیز مستلزم انجام آزمایشات در مقیاس وسیع و ارزیابی اقتصادی کاربرد آن است. لازم است که مراحل انتخاب برای میزبان های مختلف و محیط های متفاوت تغییر و اصلاح گردند((Verschuere, et al., 2000
1-3- سیستم ایمنی در ماهیان
اختلاف عمده موجود در سیستم ایمنی از نظر تشریحی بین ماهی و پستانداران، فقدان مغز استخوان و گره های لنفاوی در ماهیان است. تیموس، کلیه و طحال بافت های اصلی لنفوییدی در ماهیان استخوانی حقیقی اند. در حالی که تیموس در ماهی یک اندام لنفوییدی اولیه به حساب می آید ، اندام های لنفوییدی ثانویه تنوع قابل توجهی را نشان می دهند. بافت های لنفوییدی اغلب در اندام هایی تشکیل می شوند که جریان سینوزوییدی داشته و سلول های لنفوییدی در آنها جمع شده و به حضور آنتی ژن ها پاسخ دهند. این اندام ها در ماهیان عبارت اند از : کلیه و طحال. کبد پوست و روده نیز از اجزا مهم سیستم های دفاعی ماهیان هستند. کلیه ، طحال و کبد اندام های اصلی و پاکسازی کننده محسوب می شوند ، بطوریکه سلول های اندوتلیال و ماکروفاژها آنها به شدت نسبت به مواد خودی و غیر خودی که باید از گردش خون حذف شوند ، خاصیت آندوسیتوز دارند (سلطانی، 1387).
مهم ترین اندام ها و بافت های سیستم ایمنی ماهیان شامل تیموس، آبشش ها، پوست، کلیه اندام اپی گونال، خون، طحال، بافت مننژی، فلس ها، کبد، اجسام غاری شکل، قلب گره های لنفاوی یا اندام لیدیگ دیواره مری، مجرای گوارشی و ترشحات موکوسی و صفراوی می باشد. ایمنی در ماهیان به دو صورت اختصاصی و غیر اختصاصی تظاهر می یابد (سلطانی، 1387).
1-3-1- ایمنی غیر اختصاصی
سیستم ایمنی غیر اختصاصی، ماهی را به طیف وسیعی از عوامل بیماریزا مصون می سازد و علت مقاومت
یک فرد به یک عامل خاص بیماریزا نیز همین سیستم دفاعی می باشد (جلالی جعفری، 1377). امروزه تحقیقات در زمینه نحوه عملکرد سیستم ایمنی غیر اختصاصی ماهیان و تولید جمعیت های مقاوم به انواع عوامل بیماریزا متمرکز شده است (Galindo-Villegas & Hosokawa, 2004). دفاع غیر اختصاصی بر پایه گیرنده هایی است که الگوهای مولکولی خاصی را شناسایی می کنند. این مولکول ها در سلول های میکروبی (باکتری ها، قارچ ها و ویروس ها) وجود دارند. اما در خود میزبان دیده می شوند و هر مولکول نا آشنایی که باعث بیان ژن گیرنده خود شود محکوم به مرگ خواهد بود. سیستم ایمنی غیر اختصاصی پاسخ های سازشی را سبب شده و در حفظ هموستازی بدن شرکت می کند (Magnadottir, 2006). علاوه بر این، در القا سیستم ایمنی اکتسابی نیز شرکت دارد که از طریق تولید واسطه های خاصی در سلول ها مواجه شده با عامل خارجی صورت می گیرد (Jones, et al., 1993).
مهم ترین اجزا و سیستم ایمنی غیر اختصاصی شامل موارد زیر می باشند (جلالی جعفری،1377 و Magnadottir, 2006):
عوامل فیزیکی: شامل فلس ها، موکوس و پوست است. موکوس علاوه بر به دام اندازی و ریزش و تجدید شدن، واجد لستین، پنتراکسین، لیزوزیم، پروتئین های خنثی کننده و ایمونوگلبولین ها نیز می باشد.
عوامل سلولی: نظیر سلول های فاگوسیتوزی (گرانولوسیت ها، مونوسیت ها و ماکروفاژها) هستند. که به دو دسته ثابت (مثل سلول های موجود در بافت لنفوئیدی دستگاه گوارش) و متحرک (ماکروفاژها، نوتروفیل ها،...) تقسیم می شوند.
عوامل خونی: این تقسیم بندی به دلیل ویژگی های شناسایی عوامل نا آشنا یا نحوه عملکرد آنها می باشد. ترانسفرین از طریق رقابت برای آهن (جذب سطحی) مانع رشد باکتری ها می گردد. انترفرون نیز پروتئین ضد ویروسی است. آنزیم های پروتئازی ممانعت کننده نیز در مایعات بدنی ماهیان شناسایی شده اند.
1-3-1-1- ایمنی غیر اختصاصی ( ترکیبات مایع)
ساز و کارهای ایمنی مایعات بدن در ماهیان نقش مهمی در همه مراحل رفع یک عفونت دارند. دفاع غیر اختصاصی مایعات بدن ماهی شامل پروتئازها ، لیزین ها و آگلوتینین های موجود در ترشحات موکوسی ، به عنوان اولین خط دفاعی عمل می کنند. در حالی که سلول های پوشش مخاطی دومین سد دفاعی در برابر تهاجم میکروارگانیسم ها محسوب می شوند.
مواد گوناگون ضد میکروبی مانند تریپسین، لیزوزیم، آگلوتینین ها، عامل مکمل، پروتئین فاز حاد و دیگر عوامل لیز کننده در سرم و در موکوس پوست، آبشش ها و روده از جمله عواملی بوده که به عنوان اولین خط دفاعی در ماهی عمل کرده و مانع از چسبیدن و تثبیت میکروارگانیسم ها بر سطوح پوششی خارجی (پوست و آبشش ها) و داخلی (مجرای گوارشی) می شوند. این مواد به طور غیر اختصاصی از رشد و تکثیر عوامل عفونی بیماریزا مثل باکتری ها، قارچ ها، انگل ها و ویروس ها جلوگیری می کنند. این ترکیبات اغلب از نوع پروتئینی یا گلیکوپروتئین بوده و ترکیبات مشابه آنها و یا پیش ساز آنها نیز در همولنف بی مهرگان وجود دارد (سلطانی ، 1387).
1-3-1-1-1- لیزوزیم
لیزوزیم نقش مهمی برای مواجهه با عوامل بیماریزای عفونی در ماهیان ایفا می کند.در ماهیان لیزوزیم اغلب در بافت های غنی از گلبول های سفید مانند قسمت قدامی کلیه و بافت های پوست ، آبشش و دستگاه گوارش یافت می شود (سلطانی، 1387).لیزوزیم یک نوع واکنش ایمنی غیر اختصاصی است که توسط گلبول های سفید منتشر و در بافت های مختلف و خون ترشح می شود. (سلطانی، 1387؛ Sakai, 1999).
1-3-1-1-2- سیستم عامل مکمل (کمپلمان) در ماهیان
کمپلمان به صورت یک سیستم پروتئینی سرمی است، که عمل همولیز با واسطه ایمنی را انجام میدهد، و فعالیتهای بیولوژیکی متنوعی را نیز انجام میدهد( سلطانی، 1387).
سیستم کمپلمان نقش کلیدی در ایمنی ذاتی و اکتسابی و هشدار دادن به سیستم ایمنی میزبان در رابطه با حضور عوامل بیماریزا و برداشتن ان مانع (عامل بیماریزا) بازی می کند (Boshra and Sunyer, 2006 ; Sunyer and Lambris, 1999; Gasque, 2004 ).
1-3-1-2- ایمنی غیر اختصاصی (سلولی)
واکنش های التهابی و واکنش های ناشی از فعالیت گرانولوسیت ها ، مونوسیت ها و لنفوسیت ها ساز و کارهای دفاع غیر اختصاصی سلولی را در ماهیان تشکیل می دهند که در پاسخ به شرایط مختلفی مانند عفونت های باکتریایی ، ویروسی ، قارچی ، تک یاخته ای و انگلی به وقوع می پیوندند. (سلطانی، 1387).
سلول های فاگوسیت کننده ماهیان شامل نوتروفیل ها ، ماکروفاژها ، لنفوسیت ها ، منوسیت ها، ترومبوسیت ها ، بازوفیل ها و ائوزینوفیل ها می باشند که بیشترین نقش را ماکروفاژها و بعد نوتروفیل ها بر عهده دارند(سلطانی، 1387).
1-3-1-2-1- لنفوسیت ها
این سلول ها از سلول های مهم ایمنی می باشند و عبارت اند از : سلول های B که در اندام های مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید در کبد و سلول های T در تیموس تمایز می یابند (سلطانی ، 1387).معمولاً تعداد لنفوسیت ها در خون ماهی ، به استثنای گلبول های قرمز از سایر سلول ها بیشتر و در حالات مختلف ماهی و به خصوص در هنگام بیماری ها تفاوت دارد (ستاری، 1381).
1-3-1-2-2- نوتروفیل ها
اکثر ماهیان دارای این نوع سلول می باشند. این نوع سلول ها در ماهیان بیشترین گلبول های سفید چند هسته ای را تشکیل می دهند. (Stoskopf, 1993).
وظیفه نوتروفیل ها دفاع علیه عفونت های باکتریایی است. در اثر تحریکات تورمی به جریان خون مهاجرت
و در مرحله حاد تورمی به نواحی صدمه دیده تورمی نفوذ می کنند. این سلول ها به باکتری به صورت بیگانه خوار حمله نموده توسط فاگوزوم های داخلی آنها کشته و هضم می گردند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-1-2-3- ائوزینوفیل ها
ائوزینوفیل ها از نظر اندازه مشابه نوتروفیل ها یا به مقدار جزئی کوچکتر از آنها هستند. (Stoskopf, 1993). گرانول ها به صورت پراکنده در سلول وجود دارند و اندازه و شکل آنها در گونه های مختلف و گاهی در بین سویه های مختلف یک گونه نیز متغیر است. قدرت بیگانه خواری آنها در مقایسه با نوتروفیل ها محدود تر است (Stoskopf, 1993).
1-3-1-2-4- مونوسیت ها
کمترین تعداد گلبول های سفید متعلق به مونوسیت ها می باشد و تعداد آنها حداکثر 2 درصد در ماهیان گزارش شده است (Kumar and Tembhre, 1998). در ماهیان مونوسیت های خونی عمل ماکروفاژی دارند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994). مواد خارجی که توسط این سلولها گرفته می شوند، با آنزیم های هیدرولیتیک لیزوزیم های آنها کشته شده و سپس هضم می شوند. این سلول ها به عنوان سلول های خنثی کننده آنتی ژن نیز عمل می کنند (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-2- ایمنی اختصاصی
بطور کلی اساس سیستم ایمنی اختصاصی بر این است که ماهیان را بطور انفرادی قادر به بقاء و حفظ تعادل داخلی خودشان در محیط می نماید. اندام هایی که در ایجاد واکنش دفاع اختصاصی نقش دارند شامل بخش قدامی کلیه، طحال و تیموس است (جلالی جعفری، 1377). سیستم ایمنی اختصاصی از نظر سرعت عمل کند بوده و در مراحل ابتدایی زندگی موجود فعال نمی باشد ولی باعث ایجاد ایمنی برای دفعات بعدی مجاورت با عامل بیماریزا می گردد (Magnadottir, 2006). پاسخ های ایمنی اختصاصی بر اساس اجزاء شرکت کننده در پاسخ به دو گروه زیر تقسیم بندی می شوند (عسگری و همکاران، 1386 و Rotllant et al., 1997):
الف - پاسخ های ایمنی همورال: با واسطه ملکول هایی در خون شکل می گیرند که مسئول شناسایی اختصاصی آنتی ژن ها و انهدام آنها می باشند و همانگونه که قبلاً نیز اشاره شد آنتی بادی نام دارند؛ بروز این پاسخ ها با واسطه لنفوسیت های B انجام می گردد.
ب- پاسخ های ایمنی سلولار: با واسطه سلولی که با واسطه لنفوسیت های T ایجاد می گردد.
ایمنی ذاتی که به عنوان ایمنی طبیعی نیز در ماهیان شناخته می شود دارای دو جزئ اصلی ن شامل عوامل طبیعی و سلول های فاگوسیت کننده (ماکروفاژها) می باشند. از این میان عوامل بازدارنده فیزیکی و شیمیایی لیزوزیم ها، از اهمیت و جایگاه ویژه ای برخوردار بوده و به عنوان یکی از شاخص های استرس محسوب می گردند (Fast, et al., 2002).
1-3-2-1- ایمنی هومورال
1-3-2-1-1- ایمونوگلوبولین M(IgM)
ایمونوگلوبولین ها در ماهیان همگی جزو ماکروگلوبولین ها هستند. ماهیان ایمونوگلوبولین مشابه IgG جانوران عالی را نداشته یا کمی از آن را دارند. در ماهیان فاقد فک ایمونوگلوبولین تنها به میزان کمی وجود دارد و به خوبی شناسایی نشده اند. در ماهیان فکدار ایمونوگلوبولین از نوع IgM و دارای یک زنجیره سنگین مشابه μ پستانداران است. هر مولکول ایمونوگلوبولین در ماهیان استخوانی از نظر ساختمانی تترامر بوده و شامل دو ناحیه اتصال به آنتی ژن یعنی انتهای آمینی و ناحیه تاثیر گذار انتهایی کربوکسی است که در مجموع 4 زیر واحد مونومری را تشکیل می دهد (سلطانی، 1387).
ایمونوگلوبولین ها دارای وظایف و عملکرد های مهمی هستند که از آن جمله می توان به موارد ذیل اشاره نمود:
1.خنثی سازی2. رسوب و آگلوتیناسیون و 3.خاصیت اپسونیزاسیون (فعالیت عامل مکمل در طی فاگوسیتوز توسط نوتروفیل ها و ماکروفاژها)فعال کردن عامل مکمل (سلطانی، 1387).
1-3-2-2- ایمنی با واسطه سلولی
لنفوسیت ها به طور واضح مسئول هر دو نوع پاسخ ایمنی اختصاصی هومورال و با واسطه سلولی اند. دو نوع از لنفوسیت ها عبارت اند از : سلول های T که در تیموس تمایز می یابند و مسئول ایمنی با واسطه سلولی اند و سلول های B که در اندام های غیر از تیموس مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید کبد تولید و تمایز می یابند (سلطانی، 1387).
1-4- اهمیت مطالعات خون شناسی در ماهیان
شناخت فاکتورهای خونی علاوه بر شناخت فیزیولوژی آبزی شاخص مهم و منحصر به فرد هر گونه است که آن را از سایر ماهیان متمایز میکند. اهمیت این شناخت نه تنها در تشخیص گونه مهم است بلکه از نظر اقتصادی نیز می تواند در شناسایی بیماری ها و تعیین شرایط بهداشتی و سلامت ماهی مفید باشد (Bahmani et al., 2001; Abdel-Tawwab et al., 2005).
بافت خون شاخص مهمی برای وضعیت فیزیولوژیک اندام های بدن در تشخیص سلامت یا بیماری و کنترل روند زیستی موجودات زنده بوده و تجزیه وتحلیل شاخص های خونی راهنمای ارزشمندی در سنجش وضعیت زیستی آبزیان می باشد (بهمنی، 1377).
1-4-1- شاخص های خونی
1-4-1-1- گلبول های سفید(White Blood Cells = WBC) (لکوسیت)
تعداد این سلول ها بسیار کمتر از گلبول های قرمز است (مشایی،1386). گلبول های سفید در خون ماهیان به دو دسته تقسیم می شوند:
-گرانولوسیت (دانه دار بوده و هسته چند قسمتی دارند) شامل نوتروفیل یا هتروفیل، ائوزینوفیل و بازوفیل
-آگرانولوسیت (فاقد دانه بوده و هسته تک قسمتی دارند) شامل لنفوسیت و مونوسیت (ستاری، 1381).
هر یک اعمال حیاتی متنوعی را بر عهده دارند. گلبول های سفید در برابر عوامل گوناگون بیماریزا در بدن ماهی مقاومت ایجاد می‌کنند و پاسخ های ایمنی مختلفی بوجود می‌آورند. وظیفه اصلی این سلول ها تولید پادتن می‌باشد. مونوسیت‌ها، ماکروفاژها و گرانوسیت‌ها، وظیفه بیگانه خواری دارند، بعلاوه گرانولوسیت ها موادی برای از بین بردن باکتری ها ترشح می‌نمایند.
1-4-1-2- گلبول های قرمز (Red Blood Cells = RBC) (اریتروسیت، هموسیت)
سلولهای گلبول قرمز بیضی شکل بوده و در ماهیان مانند دوزیستان، خزندگان و پرندگان هسته دار هستند. جمعیت گلبول های قرمز در خون محیطی ماهیان را عمدتاً گلبول های قرمز بالغ تشکیل می دهد(تاکاشیما و هایبیا، 1994). تعداد آنها با افزایش سن کمتر و در فصل جفتگیری دوباره افزایش می یابد (وثوقی و مستجیر، 1388). گلبول های قرمز یا اریتروسیت ها بیشترین فراوانی را در بین سلول های خونی دارند (ستاری، 1381).
1-4-1-3- شاخص های گلبول قرمز یا اندیس های خونی
مهم ترین این شاخص ها عبارت اند از: متوسط حجم گلبول قرمز (MCV)، متوسط هموگلوبین گلبول قرمز (MCH) و متوسط غلظت هموگلوبین سلولی (MCHC) که از طریق روابط ریاضی ذیل محاسبه می شوند (Houston, 1990).
1-4-1-4- هماتوکریت
هنگامی که خون کامل دارای ماده ضد انعقاد، سانتریفوژ می شود، فضایی که توسط گلبول های قرمز فشرده شده اشغال می شود را هماتوکریت می گویند که به صورت درصد گلبول های قرمز خون نسبت به خون کامل بیان می شود. (عامری مهابادی، 1378).در صورت وجود عوامل بیماریزا در بدن یا بهم خوردن تعادل تراکم مواد معدنی در خون یا هر دو، میزان هماتوکریت متغیر خواهد بود. بعلاوه، حجم بسیار زیاد هماتوکریت نیز خود می‌تواند بیانگر احتمال وجود شرایط محیطی نامساعد همراه با استرس باشد (Parker, 1974).
1-4-1-5- هموگلوبین
هموگلوبین کروموپروتئینی است که جز اصلی گلبول قرمز را تشکیل می دهد. هر گرم هموگلوبین هنگامی که کاملاً اشباع شده باشد، 34/1 میلی لیتر اکسیژن حمل می کند (عامری مهابادی، 1378).
چندین نوع هموگلوبین مختلف ممکن است در یک ماهی وجود داشته باشد که احتمالاً برای سازگاری سیستم حمل گاز با شرایط متغیر است (کیوانی،1384).
1-5- شاخصهای بیوشیمیایی
1-5-1- پروتئین کل پلاسما و آلبومین
تقریبا بین 5 الی 10 درصد پلاسمای خون را پروتئین های خون تشکیل می دهند. اغلب پروتئین ها توسط کبد و برخی نیز مانند آنتی بادیها توسط سیستم ایمنی ساخته می شوند. اگر چه تغییر در میزان پروتئین کل پلاسمای خون به عنوان یک شاخص اختصاصی مطرح نمی باشد ولی می تواند بیانگر یک تغییر متابولیک و یا آسیب شناسی باشد( کاظمی و همکاران، 1389). آلبومین سرم فراوان ترین پروتئین پلاسما می باشد. آلبومین ها اساساً در کبد ساخته شده و از خارج شدن خون از رگهای خونی جلوگیری می کنند. (دانیال زاده و همکاران، 1385).توتال پروتئین شامل آلبومین و گلوبولین های سرمی است. این ترکیب مانند آلبومین در بیماریهای حاد و مزمن کبدی و کلیوی کاهش می یابد (Densmore, 2001). در ماهیان واجد عفونت این فاکتور نیز بصورت معنی داری نسبت به ماهیان فاقد عفونت کاهش داشته است (Austin, 1993)
1-5-2- گلوکز
گلوکز می تواند به عنوان یکی از شاخصهای مهم در تعیین وضعیت فیزیولوژیک ماهی بکار رود.با افزایش مصرف گلوکز ومتابولیت های دیگر در بعضی گونه ها ذخایر گلیکوژن چربی ها کاهش می یابد و احتمالا پروتئین ها برای تامین انرژی شکسته می شوند ( کاظمی و همکاران، 1389).
1-5-3- گلوتامیک پیرویک ترانس آمیناز (SGPT)=ALT
گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز (SGOT)AST=
دو آنزیم گلوتامیک پیرویت ترانس آمیناز) آلاتین آمینو ترانسقراز یا ALT) و گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز(آسپارات آمینو ترانسفراز یا AST)، نقش بسیار مهمی در خنثی سازی عوامل سمی و نیز فعالیتهای متابولیکی کبد داشته و دو آنزیم کلیدی برای تعیین عملکرد کبد می باشند در عفونتهایی که آسیب کبدی را با خود به همراه دارند مقدار این آنزیم کاهش می یابد(Shariffi et a.l, 2001).
1-6- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارشی
در اکثر موارد، زمانی که صحبت از میکروارگانیسمها میشود، آنها موجوداتی مضر و زیانبار تصور میشوند. چنین تصوری نمیتواند صحیح باشد، چرا که تعداد باکتریهای غیربیماریزا بمراتب بیش از باکتریهای بیماریزا است و بسیاری از گونههای غیربیماریزای باکتریها نه تنها مفیدند، بلکه برای ادامه حیات ضروری هستند. یک دسته از این باکتریها سودمند، آنهایی هستند که در دستگاه گوارش حیوانات زندگی میکنند. این میکروارگانیسمها تحتتأثیر عوامل مختلفی قرار میگیرند (شکل 1-2).
تنشهای محیطی، نوع جیره غذایی، داروها، سموم شیمیایی و همچنین شرایط آب و هوایی از جمله عواملی هستند که بر رشد میکروفلور روده تأثیرگذارند (فولر، 1380).

شکل 1-2- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش (فولر، 1380)
طی سالهای اخیر با استفاده از مواد افزودنی در خوراک دام و طیور بشدت مورد توجه متخصصین تغذیه و دام واقع شده است، یکی از مهمترین افزودنیها محصولاتی است که به طور زنده مستقیم در جیره به مصرف میرسند و در تجارت به نام پروبیوتیک شناخته شدهاند.
1-7- با کتری های اسید لاکتیک (LAB)
باکتریهای اسید لاکتیک به باکتریهایی اطلاق می شود که قادرند از تخمیر قند تولید اسید لاکتیک کنند . پرو بیو تیکها یا باکتریهای سلامت بخش جزو همین نوع باکتری هستند. استفاده از باکتریهای اسید لاکتیک در تولید فرآورده های غذایی تخمیری به حدود 4000 سال پیش بر می گردد . به طوریکه عملا آنها در تولید فرآورده هایی چون ماست و پنیر بکار می رفته اند. تحقیقات نشان می دهد علاوه بر نقش مهار کننده بر باکتریهای غیر مفید روده ، در متابولیسم لاکتوز، کاهش مصرف آنتی بیوتیک، افزایش جذب عناصر و ویتامینها و افزایش رشد و ایمنی نقش دارند(کاظمی و قدس، 1389)
این باکتری گرم مثبت بوده و برای تغذیه نیاز به کربوهیدرات، اسیدهای آمینه، پپتید، مشتقات اسید نوکلئیک و ویتامینها دارند.درک بهتر از بسیاری از عوامل موثر بر سطح جمعیت اسید لاکتیک باکتری های موجود در دستگاه گوارش برای تجارت آبزی پروری ممکن است جالب باشد. استخراج این باکتری ها از جدار روده نسبت به اندامهای دیگر بهتر است چون در آنجا در اکثر ماهی ها، بیشتر از اندام های دیگر ماهی این باکتری ها (LAB) یافت می شوند. عواملی که بر (LAB) تاثیر گذار است شامل دما، شوری، استرس، نوع تغذیه و استفاده از انواع پروبیوتیک می باشد (Ringo and Gatesoupe, 1998).
1-7-1- رده بندی علمی lactobacillus plantarum
سلسله: Bacteria
تقسیمات Firmicutes :
کلاس: Bacilli

–229

1-3-1-4) تونیکا واژینالیسیک غلاف صفاقی دو لایه است که دارای یک لایه ی احشایی و یک لایه ی جداری می باشد. لایه ی جداری آن به فاسیای اسپرماتیک داخلی که داخلی ترین لایه ی اسکروتوم است، متصل شده و لایه ی احشایی آن به تونیکا آلبوژینه می چسبد. کنار خلفی بیضه و اپی دیدیم توسط تونیکا واژینالیس پوشیده نشده اند. در این محل لایه های جداری و احشایی تونیکا واژینالیس در امتداد یکدیگر قرار می گیرند. لایه ی احشایی این غلاف، وارد فضای بین اپی دیدیم و سطح خارجی بیضه شده و سینوس اپی دیدیم را می سازد. تونیکا واژینالیس، انتهای دیستال پروسسوس واژینالیس است. پروسسوس واژینالیس، یک استطاله ی صفاقی است که در هنگام نزول بیضه در دوران جنینی آن را همراهی می کند و پس از ورود بیضه به کیسه بیضه، مسدود می شود. این استطاله ممکن است کاملاً از بین برود و یا بصورت یک نوار لیفی در ضخامت طناب اسپرماتیک باقی بماند(حسن زاده، 1391).
1-3-1-5) تونیکا آلبوژینایک غلاف سفید مایل به آبی است که از جنس بافت همبند متراکم می باشد. این غلاف در طول کنار خلفی بیضه ضخیم تر شده، مدیاستینوم بیضه را بوجود می آورد. عروق و اعصاب بیضه از طریق این ناحیه وارد بیضه می شوند. تعدادی تیغه بنام تیغه های بیضه از مدیاستینوم بیضه وارد بیضه شده وآن را به حدود 250 لبول ناقص تقسیم می کنند. هر لبول بیضه دارای یک تا سه مجرای اسپرم ساز پیچ در پیچ می باشد. مجاری اسپرم ساز به مجاری مستقیمی ختم می شوند که در مدیاستینوم بیضه یک شبکه بنام شبکه ی بیضه تشکیل داده اند. شبکه ی بیضه با مجاری افرنت ارتباط داشته و از این طریق با سر اپی دیدیم مرتبط می شوند(حسن زاده، 1391).
1-3-1-6) تونیکا واسکولوزااز جنس بافت همبند سست بوده و حاوی عروق خونی فراوان می باشد. این غلاف سطح داخلی غلاف آلبوژینه را پوشانده و همراه با تیغه های آن وارد بیضه می شود(حسن زاده، 1391).
1-3-1-7) عصب گیری بیضه
اعصاب بیضه و اپی دیدیم همراه با شریان بیضه نزول می کنند. این اعصاب از شبکه های کلیوی و آئورتیک مشتق می شوند. الیاف سمپاتیک آن از دهمین و یازدهمین سگمان نخاع سینه ای می باشند. دردهای بیضه در قسمت تحتانی جدار شکم حس می شوند.
1-3-2) مجرای دفران مجرایی است به طول 40 تا 50 سانتی متر که از دم اپی دیدیم شروع می شود. این لوله ابتدا در مجاورت کنار خلفی بیضه، در داخل اپی دیدیم صعود می کند. در مجاورت انتهای فوقانی بیضه، مجرای دفران در قسمت خلفی طناب اسپرماتیک قرار گرفته و در ضخامت آن صعود می کند. همراه با طناب اسپرماتیک از کانال اینگوینال عبور کرده و در سوراخ عمقی اینگوینال، طناب را ترک می کند. سپس شریان اپی گاستریک تحتانی را از خارج دور زده و در جلوی شریان ایلیاک خارجی صعود می کند. پس از آن، بطور مایل بطرف عقب و پایین می آید و بعد از تقاطع با عروق ایلیاک خارجی، وارد لگن کوچک می شود. این مجرا در حالیکه نسبت به شریان مسدود شده ی نافی، عروق و عصب ابتراتور و عروق مثانه ای در داخل قرار گرفته، از بین جدار خارجی لگن و صفاق بطرف عقب می رود. سپس با حالب تقاطع کرده و در سطح خلفی مثانه قرار می گیرد. در سطح خلفی مثانه، در حالی که نسبت به سمینال وزیکول در داخل قرار گرفته نزول می کند و بتدریج در مجاورت مجرای طرف مقابل قرار می گیرد. در قاعده ی پروستات مجرای دفران با مجرای سمینال وزیکول پیوند شده، مجرای انزالی ایجاد می شود. مجرای دفران در خلف مثانه متسع و پیچ دار می شود. این قسمت از مجرای دفران را آمپول می نامند. با توجه به اینکه جدار مجرای دفران ضخیم است و مجرای داخلی آن کوچک می باشد، در هنگام لمس این مجرا به شکل طناب است(حسن زاده، 1391).
1-3-2-1) ساختمان مجرای دفرانمجرای دفران شامل سه طبقه ی مخاطی، عضلانی و همبندی است. مخاط آن دارای چینهای طولی بوده و اپی تلیوم آن از نوع مطبق کاذب است که سلولهای منشوری آن فاقد مژه می باشند. طبقه ی عضلانی ضخیم بوده و از دو لایه طولی داخلی و خارجی تشکیل شد ه است که یک لایه حلقوی در بین آن ها قرار می گیرد.
1-3-2-2) عصب گیریمجرای دفران از شبکه هیپوگاستریک عصب گیری می کند.
1-3-3) مجاری ابرنتیک مجرای باریک و بن بست به نام مجرای ابرنت دمی به قسمت دمی اپی دیدیم یا ابتدای مجرای دفران متصل می شود. این مجرا 5 تا 35 سانتی متر طول دارد و فاقد پیچ و خم است.
یک مجرای ابرنت سری نیز بر روی سر اپی دیدیم دیده می شود که با شبکه بیضه ارتباط دارد. مجاری ابرنت از مجاری مزونفریک مشتق می شوند.
1-3-4) پارادیدیممجموعه ی کوچکی از مجاری پیچ و خم دار است که در جلوی طناب اسپرماتیک در بالای سر اپی دیدیم قرار دارند. این مجاری بقایای مزونفروس هستند.
1-3-5) طناب اسپرماتیکطناب اسپرماتیک از سوراخ عمقی کانال اینگوینال تا بیضه امتداد می یابد. این طناب شامل مجرای دفران، شریان مجرای دفران، عروق و اعصاب بیضه می باشد. عناصر فوق توسط سه لایه احاطه شده اند که این سه لایه در اطراف بیضه نیز قرار می گیرند و عبارتند از: فاسیای اسپرماتیک داخلی، فاسیای کرماستریک و فاسیای اسپرماتیک خارجی. در دوران جنینی، هنگامی که بیضه نزول می کند، از داخل کانال اینگوینال عبور کرده، وارد اسکروتوم می شود. در این مرحله عناصری که همراه بیضه هستند (مجرای دفران، عروق مجرای دفران و بیضه و اعصاب بیضه )، لایه هایی از جدار شکم را با خود به طرف اسکروتوم می برند. فاسیای اسپرماتیک داخلی، یک لایه ی نازک و سست است که از فاسیای عرضی شکم مشتق می شود. فاسیای کرماستریک شامل الیاف عضلانی و مقداری بافت همبند سست است که در امتداد عضله مایل داخل شکم قرار می گیرد. فاسیای اسپرماتیک خارجی یک لایه ی متراکم است که در امتداد نیام عضله ی مایل خارجی شکم می باشد. بنابراین مشخص می شود که در داخل کانال اینگوینال، فاسیای اسپرماتیک خارجی وجود ندارد. طناب اسپرماتیک چپ کمی طویل تر از طناب اسپرماتیک راست می باشد. به همین دلیل بیضه ی چپ پایین تر از بیضه ی راست قرار می گیرد. طناب اسپرماتیک در بین سوراخ سطحی کانال اینگوینال و بیضه از جلوی تندون عضله ی آدوکتورلونگوس عبور می کند. شریان پودندال خارجی سطحی از جلو و شریان پودندال خارجی عمقی از عقب با طناب تقاطع می کنند. عناصری که درون طناب اسپرماتیک قرار دارند، عبارتند از: مجرای دفران، شریان بیضه، شریان مجرای دفران، شریان کرماستریک ( شاخه ای از شریان اپی گاستریک تحتانی)، شبکه ی پیچک مانند و وریدهای بیضه، عروق لنفاوی بیضه، شاخه ی ژنیتال عصب ژنیتوفمورال (L2 ) و اعصاب بیضه. در لابلای عناصر فوق مقداری بافت همبند سست قرار می گیرد .
1-3-6) اسکروتوم یا کیسه بیضهکیسه ای است که در پایین سمفیزیس پوبیس، در بین سطوح قدامی داخلی رانها قرار دارد. بیضه ها، اپی دیدیمها و قسمت های تحتانی طنابهای اسپرماتیک درون این کیسه قرار می گیرند. اسکروتوم از دو نیمه ی راست و چپ تشکیل شده است که توسط یک سجاف پوستی به یکدیگر متصل می شوند. این سجاف پوستی در جلو در سطح تحتانی پنیس ودر عقب در خط میانی پرینه تا مقعد امتداد می یابد و بیانگر مبدأ دو طرفه ی اسکروتوم از برجستگیهای لبیواسکروتال است. اسکروتوم در افراد پیر و در هنگام گرما، صاف و آویزان شده ولی در افراد جوان و در هنگام سرما کوتاه و چین خورده است. لایه های کیسه بیضه عبارتند از: پوست، عضله ی دارتوس، فاسیای اسپرماتیک خارجی، فاسیای کرماستیک و فاسیای اسپرماتیک داخلی. پوست اسکروتوم نازک، قابل کشش وتیره رنگ است. این پوست دارای چین های عرضی است که از سجاف میانی به طرف خارج می روند. عضله ی دارتوس یک لایه ی نازک از الیاف عضلانی صاف است که در امتداد لایه ی سطحی فاسیای سطحی شکم قرار می گیرند. عضله ی دارتوس در تشکیل تیغه ی اسکروتال که دو بیضه را از یکدیگر جدا می کند، شرکت می نماید. اتصال عضله ی دارتوس به پوست بسیار محکم ولی به لایه های زیرین سست است. یک نوار لیفی عضلانی بنام رباط اسکروتال از عضله ی دارتوس به انتهای تحتانی بیضه متصل می شود که در تنظیم درجه حرارت بیضه نقش دارد. فاسیای اسپرماتیک داخلی که فاسیای اینفاندیبولیفورم نیز نامیده می شود به سستی به لایه ی جداری تونیکا واژینالیس متصل م
ی گردد(حسن زاده، 1391).
1-3-6-1) عصب گیری
13 قدامی اسکروتوم از طریق عصب ایلیواینگوینال و شاخه ی ژنیتال عصب ژنیتوفمورال از اولین عصب نخاعی کمری (L1) عصب گیری می کند. 23 خلفی اسکروتوم از طریق شاخه های اسکروتال خلفی عصب پودندال و شاخه های پرینه آل عصب جلدی رانی خلفی از سومین عصب نخاعی خاجی (S3) عصب گیری می کند. عضله ی دارتوس از الیاف سمپاتیک همراه با شاخه های ژنیتال عصب ژنیتوفمورال عصب گیری می کند(حسن زاده، 1391).
1-3-7) سمینال وزیکولهاهر سمینال وزیکول لوله ی بن بستی است که به دور خود پیچ خورده و حالت لوبولی دارد. طول این عضو هرمی شکل 5 سانتی متر است و قاعده اش متوجه بالا، عقب و خارج می باشد. سطح قدامی سمینال وزیکول با قاعده ی مثانه مجاورت دارد و سطح خلفی آن به واسطه ی فاسیای رکتووزیکال ( فاسیای دنون ویلیه) از رکتوم جدا می شود. رأس این عضو در پایین، بصورت یک لوله ی مستقیم است که به آن آمپول مجرای دفران متصل شده و در تشکیل مجرای انزالی شرکت می کند. هر سمینال وزیکول در داخل با آمپول مجرای دفران، در خارج با وریدهای شبکه ی پروستاتیک که به ورید ایلیاک داخلی تخلیه می شوند ودر پایین با پروستات مجاورت دارد(Snell ,2008).
1-3-7-1) ساختمان سمینال وزیکولجدار سمینال وزیکول از سه لایه تشکیل می شود: طبقه ی مخاطی، طبقه عضلانی و طبقه آدوانتیس. مخاط دارای چین های متعدد بوده و اپی تلیوم آن مطبق کاذب یا منشوری ساده است. طبقه ی عضلانی نازکتر از طبقه ی عضلانی مجرای دفران می باشد و از یک لایه طولی خارجی و یک لایه حلقوی داخلی تشکیل شده است. بافت همبند آدوانتیس دارای تعدادی الیاف الاستیک می باشد . 70 درصد مایع منی توسط سمینال وزیکولها ترشح می شود(Snell ,2008).
1-3-7-2) عصب گیری
سمینال وزیکول ها از شبکه های لگنی، عصب گیری می کنند. الیاف سمپاتیک که از اولین گانگلیون کمری خارج می شوند، به عنوان عصب حرکتی عضلات جدار سمینال وزیکولها عمل می کنند و تحریک آنها باعث تخلیه ترشحات این عضو می گردد(Snell ,2008)..
1-3-8) مجرای انزالیهر مجرای انزالی، لوله ای است به طول 2 سانتیمتر که از اتصال مجرای دفران به مجرای سمینال وزیکول ایجاد می شود. این مجرا از قاعده ی پروستات شروع شده، از بین لوب میانی و لوب های راست و چپ پروستات به طرف پایین و جلو آمده و در روی کولیکولوس سمینالیس باز می شود. دو مجرای انزالی در ضخامت پروستات به یکدیگر نزدیک شده و در طرفین اوتریکول پروستاتی به کولیکولوس سمینالیس می رسند(Snell ,2008).
1-3-8-1) ساختمان
مخاط مجاری انزالی مشابه مجاری دفران است ولی این ساختمان فاقد لایه ی عضلانی می باشد. مجرای انزالی از خارج توسط بافت همبند احاطه می شود که با استرومای پروستات یکی می شود(Snell ,2008)..
1-3-9) پروستات
عضوی مخروطی شکل یا مشابه شاه بلوط است که در زیر گردن مثانه قرار گرفته، قاعده آن در بالا و رأس آن در پایین می باشد. این عضو، پیشابراه پروستاتی را در بر می گیرد. پروستات دارای یک سطح قدامی، یک سطح خلفی و دو سطح تحتانی خارجی می باشد. قطر عرضی قاعده ی این عضو تقریباً 4 سانتی وقطر قدامی خلفی آن تقریباً 2 سانتی متر است. ارتفاع پروستات تقریبا ً3 سانتیمتر و. وزن این عضو تقریباً 8 گرم می باشد. قاعده پروستات با گردن مثانه مجاورت داشته و پیشابراه از این سطح وارد پروستات می گردد. رأس این عضو در پایین ترین قسمت قرار گرفته و پیشابراه پروستاتی از جلوی آن خارج می شود. سطح قدامی باریک و محدب است و تقریباً 2 سانتی متر عقب تر از سمفیزیس پوبیس قرار می گیرد. پیشابراه از پایین ترین قسمت این سطح، در مجاورت رأس، خارج می شود. سطح خلفی به طور عرضی مسطح و بطور عمودی محدب است و توسط فاسیای رکتووزیکال (فاسیاید نون ویلیه) از رکتوم جدا می شود. مجاری انزالی درست در زیر مثانه وارد این سطح می شوند. سطوح تحتانی خارجی با بخشهای قدامی عضلات لواتورآنی مجاورت دارند(حسن زاده، 1391)..
1-3-9-1) ساختمان پروستات
پروستات از 30 تا 50 غده ی لوله ای حبابی تشکیل شده است و توسط یک کپسول همبندی سرشار از الیاف عضلانی صاف احاطه می شود. آلوئلهای ترشحی و مجاری بسیار نامنظم هستند و اپی تلیوم آنها از نوع منشوری ساده یا مطبق کاذب است. نزدیک به 30 درصد مایع منی توسط پروستات ترشح می شود که این ترشحات به سینوس های پروستات در پیشابراه پروستاتی می ریزند. غالباً در مجرای پروستات اجسام مدور کوچکی از جنس گلیکوپروتئین دیده می شود که به آنها اجسام آمیلاسه می گویند. با افزایش سن بر تعداد اجسام آمیلاسه افزوده می شود(حسن زاده، 1391)..
1-3-9-2) لوب های پروستاتبطور قراردادی پروستات را به 5 لوب تقسیم می کنند که عبارتند از: لوب قدامی، لوب میانی، لوب خلفی و دو لوب خارجی البته بایستی توجه داشت که مرز کاملاً مشخصی بین این لوبها وجود ندارد. لوب قدامی ناحیه ی کوچکی در جلوی پیشابراه است که از نظر ترشحی اهمیت زیادی ندارد. لوب میانی در اطراف پیشابراه پروستاتی قرار داشته و ممکن است در سنین بالای 50 سال دچار هیپرتروفی خوش خیم گردد. بقیه غده مجموعه ای از لوب های خارجی و خلفی می باشد که برای راحتی بیان تحت عنوان لوب های چپ و راست نامگذاری می گردد. اهمیت لوب های چپ و راست از آن جهت است که بیشترین تغییرات سرطانی در این نواحی مشاهده می شود (حسن زاده، 1391).
1-3-9-3) عصب گیری
عصب گیری این عضو از شبکه ی هیپوگاستریک تحتانی می باشد. الیاف سمپاتیک باعث انقباض الیاف عضلانی و تخلیه غده در هنگام انزال می شوند. الیاف پاراسمپاتیک از اعصاب احشایی لگنی می باشند(حسن زاده، 1391).
1-3-10)غدد بولبواورترالغدد بولبواورترال یا غدد کوپر، یک جفت عضو مدور، کوچک و زرد رنگ هستند که تقریباً یک سانتی متر قطر داشته و در طرفین پیشابراه غشایی قرار می گیرند. این غدد در سنین بالا کوچکتر می شوند. مجرای خروجی هر غده تقریباً 3 سانتی متر طول دارد و در خارج مخاط پیشابراه غشایی بطور مایل بطرف جلو می رود. این مجرا پس از سوراخ کردن فاسیای دیافراگماتیک تحتانی (غشاء پرینه آل ) در کف پیشابراه اسفنجی باز می شود. سوراخ مجرای فوق، 5/2 سانتی متر پایین تر از غشاء پرینه آل قرار می گیرد(حسن زاده، 1391)..
1-3-10-1) ساختمان
غدد بولبواورترال از نوع غدد لوله ای – حبابی با اپی تلیوم مکعبی ساده هستند. در جدار این غدد الیاف عضلانی صاف و مخطط دیده می شود. ترشحات موکوسی غدد بولبواورترال به عنوان نرم کننده ی مجرا عمل می کنند(حسن زاده، 1391)..
1-4) سلول های سری اسپرماتوژنزسلول های سری اسپرماتوژنز، سلول های متفاوتی از بافت پوششی لوله های منی ساز هستند که در 4 تا 8 لایه در کنار یکدیگر قرار گرفته و فضای بین لایه قاعده ای تا مجرای لوله را اشغال می کنند. این سلول ها به ترتیب در برگیرنده چند نسل سلول های اسپرماتوگونی با عنوان گروه A وB روی غشای پایه وسپس یک نسل اسپرماتوسیت اولیه، یک نسل اسپرماتوسیت ثانویه، یک نسل اسپرماتید ویک نسل اسپرماتوزوئید است(Eurell and Frappier, 2006).
1-5) سلولهای پشتیبان یا سرتولیسلول های سرتولی، سلولهای هرمی شکل هستند که قاعده آنها به لایه بازال میچسبد، در حالی که انتهای رأسی آنها معمولاً تا مجرای لوله منی ساز امتداد می یابد. این زوائد به عنوان مجراهایی هستند که سلولهای زایا در مراحل مختلف رشد و تکامل دربین آنها قرار داشته و به سمت مجرا حرکت می کنند. بعد از بلوغ اسپرماتوسیت ها، اتصالات محکم جدیدی بین زوائد سلولهای سرتولی در پشت آنها پدید می آید و اتصالات قدیمی جلوی آنها باز می شود و به این ترتیب بدون درهم ریختن جامعیت سد خونی- بیضوی که توسط سیتوپلاسم سلولهای سرتولی ایجاد شده است، اسپرماتوسیتها از بخش قاعده ای به بخش مجرائی عبور میکند. سیتوپلاسم این سلولها به عنوان فیلتر عمل کرده و تنها به مواد خاصی اجازه عبور می دهند(بیگدلی، 1383). این سد در حفظ سلولهای زایای جنس مذکّر در مقابل مواد مضر موجود در خون دارای اهمیت است. در زیر این اتصالات، اسپرماتوگونی ها در یک محوطه قاعده ای قرار می گیرند و در نتیجه به راحتی به مواد درون خون دسترسی می یابند. هنگام اسپرماتوژنز، سلولهای اسپرماتوسیت لپتوتن نهایی و زیگوتن، از این اتصالات گذشته و در محوطه جنب مجرایی قرار می گیرند. از اینجا به بعد، مراحل پیشرفته تر اسپرماتوژنز به کمک سد خونی- بیضوی از دسترس مواد موجود در خون حفظ می شوند. سلول های سرتولی بوسیله اتصالات شکافدار نیز به هم متصل شده اند که خود سبب ایجاد ارتباط یونی و شیمیایی بین سلولها می شود. چنانچه در انسان و حیوانات دیگر شرایط نامطلوبی مانند عفونت، سوء تغذیه و تشعشع اشعه X به سلول های سرتولی آسیب برساند، باعث اختلال سریع در فرایند اسپرماتوژنز می شود و در صورت مرگ سلولهای سرتولی، نا باروری دائمی رخ خواهد داد (Junqueira , 2005).
سلولهای سرتولی با همکاری سد خونی- بیضوی اعمالی همچون؛ پشتیبانی، حفاظت و تغذیه اسپرماتوزوئیدهای درحال تکامل، فاگوسیتوز در حین اسپرمیوژنز را انجام می دهند. سیتوپلاسم باقیمانده اسپرماتیدها به صورت اجسام باقیمانده از آنها جدا گشته و توسط سلولهای سرتولی فاگوسیته و توسط لیزوزوم آنها تجزیه می گردند، علاوه براین چنانچه ذرات خارجی و باکتریها بدینجا رسیده باشند توسط سلولهای سرتولی بیگانه خواری می شوند (جلوگیری از واکنشهای اتوایمن) ترشح سلولهای سرتولی به طور مداوم مایعی به درون لوله های منی ساز ترشّح می کنند که در جهت مجاری تناسلی جریان یافته و برای حمل اسپرم به کار می رود. با کنترل هورمونFSH، یک پروتئین متصل شونده به آندروژن (ABP) ترشح می کند که مسئول تغلیظ تستوسترون در درون لوله های منی ساز می باشد(رجحان، 1376). سلولهای سرتولی قادر به تبدیل تستوسترون به استرادیول هستند. این سلول ها پپتیدی به نام اینهیبین نیز ترشح می کنند که ساخت و آزاد شدن FSH در بخش قدامی غده هیپوفیز را مهار می کند. همچنین تولید هورمون آنتی مولرین، که یک گلیکوپروتئین است و در دوره جنینی، تحلیل مجاری مولر را در جنین مذکر تحریک می کند (Junqueira, 2005).

1-6) اسپرماتوژنزفرآیند تولید اسپرماتوزوئیدها را اسپرماتوژنز می گویند. اسپرماتوژنز در توبول های سمینیفر به طور معمول از ۱۳ سالگی و در نتیجه تحریک هورمون های گنادوتروپیک هیپوفیز قدامی شروع میشود و تا پایان زندگی ادامه مییابد (Guyton and Hall, 2006). تولید اسپرم بطور پیوسته در سرتاسر دوره زندگی تولیدمثلی مرد انجام میشود، تقریبأ ۲۰۰-۱۰۰ میلیون اسپرم روزانه تولید میشود. برای تولید این مقدار انبوه، نیاز است که اسپرماتوگونی ها با تقسیمات سلولی طی چرخه اسپرماتوژنز خود را تجدید کنند (Junqueira, 2005). چرخه اسپرماتوژنز در همه جانوران الگوی یکسان دارد و از سه مرحله مجزا تشکیل میشود:
1-6-1) اسپرماتوسیتوژنزاین فرآیند از یک سلول زایای اولیه (اسپرماتوگونی) که مجاورلایه قاعده ای قرار گرفته است، آغاز میشود. به هنگام بلوغ جنسی، این سلول دستخوش یک سری تقسیم میتوز شده و سلولهایی که تازه تشکیل شدهاند، یکی از این دو راه را انتخاب میکنند: این سلولها ممکن است بعد از یک یا چند تقسیم میتوزی باز به تقسیم ادامه داده و به صورت سلولهای بنیادی تمایز نیافته به نام اسپرماتوگونی نوع A درآیند و یا در حین چرخههای پیش رونده میتوزی به اسپرماتوگونی نوع B تمایز حاصل کنند. اسپرماتوگونی نوع B نیز به نوبت به اسپرماتوسیتهای اولیه تبدیل میشود Junqueira, 2005)).


1-6-2) میوزاسپرماتوسیتهای اولیه، کمی پس از تشکیل در اولین تقسیم میوزی وارد پروفاز میشوند. در این هنگام اسپرماتوسیت دارای ۴۶ کروموزوم وn۴،DNA میباشد. سلول در طی پروفاز یک، از چهار مرحله عبور میکند- لپتوتن، زیگوتن، پاکیتن و دیپلوتن و وارد مرحله دیاکینز میشود که در این مرحله کروموزومها از یکدیگر جدا میشوند. در طی این مراحل از تقسیم میوز، تقاطع ژنهای ۱۶ کروموزومی با یکدیگر صورت میگیرد. پس از آن سلول وارد مرحله متافاز میشود و کروموزومها در مرحله آنافاز به سمت قطبها حرکت میکنند. از آنجائیکه مرحله پروفاز در این تقسیم در حدود ۲۲ روز به طول میانجامد، بیشتر سلولهایی که در مقاطع بافت شناسی مشاهده میشوند، در این مرحله قرار دارند. اسپرماتوسیت های اولیه بزرگترین سلولهای دودمان اسپرماتوژن هستند. از تقسیم اول میوز سلولهای کوچکتری به نام اسپرماتوسیت های ثانویه که تنها دارای ۲۳ کروموزوم (X+۲۲،Y+۲۲) هستند، حاصل میشوند. این کاهش تعداد کروموزوم از ۴۶ به ۲۳ همراه با کاهش مقدار DNA از n۴ به n۲ در هر سلول می باشد. مشاهده اسپرماتوسیتهای ثانویه در برشهای بافتی مشکل است. چون این سلولها دارای عمر کوتاه بوده و مدت زمان بسیار کوتاهی در مرحله اینترفاز باقی مانده (۲ تا ۳ روز) سریعأ وارد دومین مرحله تقسیم میوزی میگردند. از تقسیم اسپرماتوسیتهای ثانویه، اسپرماتیدها به وجود میآیند که دارای ۲۳ کروموزوم هستند. چون مرحله S یعنی مرحله سنتز DNA بین تقسیمات اول و دوم میوزی اسپرماتوسیتها وجود ندارند، لذا مقدار DNA موجود در اسپرماتیدها به نصف مقدار DNA اسپرماتوسیتهای ثانویه تقلیل یافته و شامل n ۱ کروموزوم میشود. بنابراین،فرآیند میوز سبب تشکیل سلولهایی با تعداد کروموزومهای هاپلوئید (n۱) میشود. در هنگام لقاح سلولهای جنسی، این تعداد مجددأ به تعداد دیپلوئید طبیعی میرسد. در واقع فرآیند میوز وجود تعداد ثابتی از کروموزومها را در هرگونه از جانوران تضمین میکند(Junqueira, 2005).
1-6-3) اسپرمیوژنزاسپرماتیدها سلولهایی هستند که در نتیجه تقسیم ثانویه اسپرماتوسیتها به وجود میآیند. این سلولها را میتوان به کمک اندازه کوچک آنها، هسته دارای کروماتین متراکم و قرارگیری در نزدیکی مجرای لوله های منی ساز تشخیص داد. اسپرماتیدها دستخوش یک فرآیند پیچیده تمایز، موسوم به اسپرمیوژنز میشوند که بطور خلاصه شامل مراحل زیر است: تشکیل آکروزوم، متراکم و طویل شدن هسته، تشکیل تاژک و دفع مقدار زیادی از سیتوپلاسم به صورت اجسام باقیمانده نتیجه نهایی این فرآیند تولید اسپرماتوزوئید بالغ است که به واسطه فرآیندی موسوم به اسپرمیاسیون به درون مجرای لولههای منی ساز آزاد میشود. در تقسیم سلولهای اسپرماتوگونیا، عمل سیتوکینزیز غیر کامل است، یعنی سیتوپلاسم آنها از هم جدا نمیشود. حاصل تقسیم یک اسپرماتوگونیا، تعداد زیادی اسپرماتوسیت اولیه، ثانویه و اسپرماتید متصل بهم حاصل می باشد که سیتوپلاسم آنها بوسیله پلی بهم متصل بوده و بصورت سین سی تیوم هستند و بعد از تکامل اسپرماتوزونها، اجسام باقیمانده از آنها جدا شده و هر اسپرم منفردا از زنجیره سین سی تیوم جدا میشود (رجحان، 1376).
1-7) مورفولوژی اسپرماسپرم از لحاظ ساختمانی به دو بخش سر و دم تقسیم میشود. سر اسپرم در بیشتر گونهها از جمله پستانداران عمدتأ به شکل پهن و بیضی شکل است و در جوندگان سر اسپرم داسی شکل می باشند (ضمیری، 1385).
1-7-1) سر اسپرم
ساختار سر اسپرم از دو جزء هسته و آکروزوم تشکیل گشته است:
الف- هسته سر اسپرم واجد کروموزوم هاپلوئیدی است که در هنگام لقاح با هسته n کروموزومی تخمک ادغام گشته و موجب تشکیل تخم 2n کروموزومی میگردد. ویژگیهای هسته اسپرم n کروموزومی بودن و داشتن کروماتین بسیار متراکم و یکنواخت می باشد (Eddy et al, 2004). مهمترین عاملی که باعث این فشردگی شدید شده است، جایگزینی پروتئینهای پروتامین به جای پروتئینهای DNA که هیستونها هستند میباشد. این تراکم و فشردگی باعث محافظت DNA در برابر صدمات فیزیکی و شیمیایی میشود (Knobi and Neills, 2006).
ب- آکروزوم: قسمت قدامی هسته توسط آکروزوم پوشیده شده که واجد دو غشاء داخلی و خارجی است، که این دو غشا در انتهای خلفی به همدیگر متصل میشوند. کلاهک آکروزومی مقادیر متنابهی از آنزیم های هیدرولیتیک و پروتئولیتیک دارد. زمانی که پدیده ظرفیت گیری اسپرماتوزوآ در لوله رحمی صورت می پذیرد، این انزیم ها آزاد شده و برای ایجاد نفوذ پذیری در پرده شفاف اووسیت ها، وارد عمل می شوند. ناحیه خلفی آکروزوم جایی است که کلاهک نازک شده و مواد درون آن متراکم تر می شوند. این ناحیه بخش استوایی آکروزوم اطلاق می شود (Eurell and Frappier, 2006). ازجمله آنزیم های هیدرولیتیک آکروزوم آنزیم هیالورونیداز است که اسپرم توسط این آنزیم اتصالات بین سلول های کومولوس را از بین می برد و خود را به تخمک می رساند. آنزیم مهم دیگر آکروزین است که اسپرم توسط آن زوناپلوسیدا را تجزیه می کند(ضمیری، 1385).
1-7-2) دم اسپرمدم ساختاری تاژک مانند است که موجبات حرکت اسپرم را بوجود آورده و نیروی لازم جهت حرکت اسپرم را نیز فراهم میکند (ضمیری، 1385) و از ۴ قسمت گردن، قطعه میانی- اصلی و انتهایی تشکیل شده است.

تصویر 1-1. ساختمان طبیعی اسپرم انسان (Parsiteb, 2013)1-7-3) اسپرم های غیر طبیعیبین ظاهر طبیعی اسپرم و تحرک آن، رابطه ی مستقیمی وجود دارد. در تمام انزالها، تعدادی اسپرم غیرطبیعی حضور دارد. ارزیابی مورفولوژی اسپرم پس از رنگ آمیزی با ائوزین- نگروزین انجام میگیرد. اسپرمهای غیرطبیعی به ۵ گروه زیر تقسیم میشوند:
الف- بدون دم
ب- سر غیر طبیعی
ج- ساختارهای غیر طبیعی دم
د- ساختارهای غیر طبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پیشین
ه- ساختارهای غیر طبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پسین (Hafez, 2000)

تصویر 2-1 انواع شکل های اسپرم(blogfa, 2013)1-8) سرنوشت و اعمال آندروژن ها1-8-1) آندروژن های داخل بیضه ایتستوسترون حاصل از سلولهای لایدیگ چندین عملکرد و سرنوشت در پیش دارد. به دلیل نزدیکی سلولهای لایدیگ- لوله های سمینیفر مقادیر زیادی از تستوسترون به لوله های سمینیفر انتشار می یابند و در جزء ادولومینال به واسطهABP تغلیط می شوند. سطوح تستوسترون در لوله های سمینیفری در مقایسه با غلظت گردش خون 100 برابر بیشتر است، زیرا برای اسپرماتوژنز طبیعی نیاز مطلق به تستوسترون وجود دارد. سلولهای سرتولی آنزیمی به نام CYP19(آروماتاز) بیان میکنند که مقادیر اندکی تستوسترون را به استروژن بسیار قوی به نام استرادیول 17- بتا تبدیل میکند. سلولهای اسپرم انسان حداقل یک گیرنده استروژن را بیان می کنند (Bern et al, 2010).
1-8-2) تبدیل محیطی استروژندر چندین بافت به ویژه در بافت چربی، تستوسترون به استروژن تبدیل می شود.استروژن محیطی نقشی مهم در بلوغ سازی استخوان و زیست شناسی مردان، پیش برد حساسیت انسولینی، بهبود پروفایل های لیپوپروتئینی(یعنی افزایش HDL، کاهش LDL و تری گلیسرید) و اعمال فیدبک منفی بر گنادوتروپین های هیپوفیز ایفا می کند(Bern et al, 2010).
1-8-3)تبدیل محیطی دی هیدروتستوسترونتستوسترون از طریق آنزیم 5- آلفا- ردوکتاز به آندروژن غیر قابل آرومانیز به نام 5- آلفا- دی هیدروتستوسترون (DHT) تبدیل می شود. دو ایزوفرم برای آنزیم 5-آلفا-ردوکتاز وجود دارد.به نام های 5-آلفا-ردوکتاز نوع 1 و 5-آلفا-ردوکتاز نوع 2. جایگاههای اصلی بیان 5-آلفا-ردوکتاز نوع2 مجرای تناسلی مرد، پوست تناسلی، فولیکول مو وکبد می باشد. 5- آلفا- ردوکتاز نوع 2 هورمون DHT را تولید میکند که برای عضلانی سازی اندام تناسلی خارجی در رحم و برای بروز بسیاری از تغییرات مرتبط با بلوغ از جمله رشد و فعالیت غده پروستات، رشد آلت تناسلی، کدر شدن و چین خوردگی های اسکروتوم، رشد مو در بدن و صورت و افزایش توده عضلانی فرد لازم است. بیان 5-آلفا-ردوکتاز نوع 1 با بلوغ جنسی اتفاق می افتد. این ایزوفرم در پوست بیان شده و در فعالیت غده سباسیوس و بروز آکنه در هنگام بلوغ دخالت دارد (Bern et al, 2010).
1-8-4) اعمال محیطی تستوسترونتستوسترون عملکرد سلولهای سرتولی را تنظیم میکند. این هورمون پیدایش مجرای تناسلی مرد از مجرای مزونفریک را در غیاب آنزیم 5-آلفا-ردوکتاز انجام می دهد.تستوسترون چندین اثر متابولیک شامل افزایش لیپوپروتئین دانسیته پایین LDL را داراست. در مقابل، این هورمون HDL را کاهش می دهد و موجب پیش برد رسوب بافت چربی در ناحیه شکم، افزایش تولید گلبول قرمز خون، پیشروی رشد و سلامت استخوان و اعمال اثر آنابولیک پروتئین در عضله می شود. تستوسترون برای حفظ عملکرد لیبیدو کافی است(Bern et al, 2010).
1-8-5) مکانیسم عمل آندروژنتستوسترون و دی هیدرو تستوسترون از طریق گیرنده آندروژن (AR) عمل میکنند. AR در سیتوپلاسم به صورت متصل به پروتئین های مراقب در غیاب لیگاند قرار دارد. اتصال تستوسترون-AR یا اتصال DHT- AR باعث تفکیک پروتئین های مراقب می شود به دنبال آن کمپلکس AR-آندروژن تشکیل می شود، آنگاه دیمریزاسیون رخ می دهد و در نهایت این مجموعه به هسته می رود و به عنصر پاسخی آندروژن (ARE) متصل می شود و موجب بسیج پروتئین های فعال کننده همراه و فاکتورهای نسخه برداری عمومی برای بسیاری از پروموتورهای خاص ژنی میگردد. این موضوع هنوز ناشناخته باقی مانده است که چگونه تستوسترون و DHT و توانایی آنها برای فعال سازی AR در بین انواع سلول های مختلف تفاوت قائل می شوند، هر چند حضور پروتئین های فعال کننده همراه مختلف احتمالاًًً در انواع سلول های متفاوت درگیر می باشد(Bern et al, 2010).
1-8-6) انتقال و متابولیسم آندروژن هابه مجرد این که تستوسترون وارد گردش خون محیطی می شود، به پروتئین های سرمی متصل می شوند و به سرعت با آنها به تعادل می رسند حدود 60% تستوسترون گردش خونی متصل به گلبولین اتصالی- هورمون جنسی (SHBG)، 38% متصل به آلبومین و حدود 2% به صورت هورمون آزاد هستند. تستوسترون و متابولیت های آن اصولا در ادرار دفع می شوند. تقریبا 50% آندروژن های دفعی به صورت 17- کتواستروئید های ادراری یافت میشوند. بخش اعظم باقیمانده به صورت آندروژن های کونژوگه یا مشتقات دی ال و تری ال هستند. تنهاحدود 30 % سولفات موجود در کبد کونژوگه می شوند و استروئید های کونژوگه در ادرار دفع می شوند(Bern et al, 2010).
1-8-7) محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- بیضهتستوسترون توسط محور اندوکرینی درگیر با نورون های پاروی سلولی هورمون آزاد کننده گنادوتروپین (GnRH) و گنادوتروف های هیپوفیزی که هورمون لوتنینگ (LH)، و محرک فولیکولی (FSH) تولید می کنند تنظیم می شوند(Bern et al, 2010).

تصویر1-3: محور هیپوتالاموسی- هیپوفیزی- بیضه ای (Bern et al, 2010)1-9) بلئومایسین بلئومایسین(N1-[3-(dimethylsulphonio)propyl]bleomycin-amide) آنتی بیوتیکی کموتراپیک است که توسط باکتری Streptomyces Verticillus تولید میگردد (Sánchez et al, 2000). بلئومایسین‌ در درمان‌ سرطان‌ بیضه، سلولهای‌ سنگفرشی‌ سر و گردن‌، گلو، سرویکس‌، پوست و کلیه‌ کاربرد دارد. همچنین‌ این‌ دارو ممکن‌است‌ در افوزیونهای‌ بدخیم‌ پریتونال‌ و پلورال‌ و در درمان‌ لنفوم‌ هوچکینی‌ وغیرهوچکینی‌ موثر باشد(Lewis et al, 2006). این دارو به صورت پودر در ویال های 15و 30 میلی گرمی موجود بوده و به آسانی در آب مقطر به صورت محلول در می آید. بلئومایسین به طرق مختلف؛ عضلانی، داخل وریدی و یا زیر جلدی تزریق می گردد. فرمول مولکولی آن C55H84N17O21S3 • XH2SO4 بوده و وزن مولکولی محاسبه شده 1414 می باشد (Polovich et al, 2005).
1-9-1) تاریخچه و ساختمان شیمیایی بلئومایسینبلئومایسین برای اولین بار در سال 1966 توسط دانشمند ژاپنی به نام Hamao Umezawa کشف شد. وی در طی غربالگری باکتری S. verticillus به خاصیت ضدسرطانی این ماده پی برد . Umezawa در سال1966 اقدام به انتشارکشف خود نمود. Nippon Kayaku اولین فردی بود که در سال 1969 بلئومایسین را مورد استفاده قرار داد. در جولای 1969 تاییده ی FDA به داروی بلئومایسین داده شد و تحت عنوان تجاری Blenoxane توسط Myers در آزمایشگاه بریستول ایالات متحده ساخته و به بازار عرضه گردید. (Umenzawa et al, 1966 ). بلئومایسین خاصیت ضد سرطانی داشته و به صورت آمپولهای 15 واحدی موجود است. مصرف این دارو در دوران حاملگی غیرمجاز است. مگر اینکه در شرایط ویژه و حداقل استفاده گردد بلئومایسین بر روی کروماتین اسپرم و همچنین پروتئین های سر اسپرم تاثیرات قابل توجهی ایجاد میکند. همچنین ممکن است یک تاثیر منفی بر عملکرد باروری ، باروری و همچنین فرزندان افراد تحت درمان داشته باشد(Lambert and Eriksson, 1979).

تصویر 1-4: ساختمان شیمیایی بلئومایسین(Umenzawa et al, 1966 ).1-9-2) مکانیسم اثر بلئومایسین:بلئومایسین‌ آنتی‌بیوتیکی ‌است‌ که‌ اثر خود را هم‌ بر روی‌ سلولهای ‌قابل‌ تقسیم‌ و هم‌ سلولهایی‌ که‌ در حال‌ رشد نیستند، می‌گذارد. مکانیسم‌ احتمالی‌ آن ‌تداخل‌ در فاز2 Gتقسیم‌ سلولی‌ وجلوگیری‌ از رشد سلول‌ سرطانی‌ است‌. در واقع این دارو باعث مهار چرخه سلولی در مرحله 2 Gو سبب قطعه قطعه شدن DNA و تجزیه RNA شده و با پیدایش رادﻳﻜﺎل ﻫﺎی آزاد ﺳـﺒﺐ ﻣـﺮگ و ﺗﺨﺮﻳـﺐ ﺳﻠﻮلﻫﺎی ﺗﻮﻣﻮرال و در ﺣﺎل ﺗﻜﺜﻴﺮ ﻣﻲ ﺷﻮد. (Yamamoto, 2006)

تصویر 1-5: مکانسم عمل بلئومایسین(Nature, 2013)با فعال شدن بلئومایسین، گیرنده های آسیب در دو رشته DNA فعال می شوند، تا کنون همه گیرنده های مستقیم آسیب DNA شناخته نشده اند ولی به احتمال زیاد این سنسورها بسته به نوع آسیب متفاوت هستند. در هر صورت این گیرنده ها سبب فعالسازی انتقال دهنده سیگنال مرکزی(ATM) میشوند.
ATM یک شبه فسفوتیدیل اینوزیتول 3 کیناز می باشد که چندین پروتئین درون سلولی را فسفریله میکند. به طور مثال با فسفریله نمودن NBS1 در کمپلکس نوکلئاز NBS1- MRE11- RAD50 سبب فعالسازی آن شده که در نتیجه انتهاهای تک رشته ای مورد نیاز در مسیر ترمیم نوترکیبی همولوگ تولید می شوند. علاوه بر این ATM با فعالسازی CHK2 که یک عامل کلیدی در تنظیم چرخه سلولی است سبب فعال شدن P53 میشود. P53 یک سرکوب کننده تومور و جز اصلی توقف چرخه سلولی و آپوپتوز می باشد. توقف چرخه سلولی قبل و یا در حین فرایند میتوز در پاسخ به آسیب دورشته ای DNA منجر به مرگ سلول میتوزی و شکست هسته ای و زیر واحدهای کاتالیزی DNA پروتئین کیناز میشود.
1-9-3) کاربردهای بالینی
در طی 50 سال اخیر به منظور پیشگیری از بیماری هایی همچون سرطان از روشهای شیمی درمانی بهره گرفته میشود. دراین روش داروهایی مورد استفاده قرار میگیرند که رشد سلول های سرطانی را متوقف یا آهسته نمایند. شیمی درمانی با تأثیر روی توانایی سلول هایی که رشد بالایی دارند (مثل سلول های سرطانی) مانع از تقسیم یا تولید آن ها می گردد. گرچه مصرف این داروها باعث بقای عمر بیمار و بهبودی بیماری میگردد اما همراه با عوارض جانبی خطرناکی همراه است. این عوارض میتوانند عملکرد طبیعی بدن را دستخوش تغییرات ناخوشایندی نماید. بلئومایسین، دارویی است که بطور گسترده در درمان سرطان بیضه و نئوپلاسم بدخیم در دوران نوجوانی و جوانی استفاده میگردد. تجویز همزمان بلئومایسین، اتوپوزید و سیس پلاتین (BEP) عمر مبتلایان به این سرطان را تا 5 سال افزایش میدهد(Robinson et al, 2007).
1-9-4) عوارض جانبی 
بلئومایسین
بر روی کروماتین اسپرم، پروتئین های سر اسپرم، عملکرد باروری ، باروری و همچنین فرزندان متولد شده افراد تحت درمان تاثیرات نامطلوب قابل توجهی ایجاد نماید(Lambert and Eriksson ,1979). با مصرف طولانی مدت بلئومایسین ایدیوسنکرازی و سمیت ریوی بروز می‎‏نماید. مهمترین عارضه این دارو، ایجاد سوختگی و زخم در محل تزریق است. سندرم رینود نیز در بعضی موارد دیده می‏شود. از دیگر عوارض این دارو میتوان به ایجاد دانه های پوستی، راش، تب و لرز، آثار پوستی بر روی لثه و زبان و فیبروز ریه بویژه در افراد سالمند، خستگی، ریزش مو، حالت تهوع و استفراغ، آسیب به کلیه، آسیب به اعصاب، آسیب به عروق خونیِ قلب ، افزایش احتمال بیماری قلبی عروقی، آسیب ریوی و بروز سرطان ثانویه در جایی جدید، مثل خون (لوکمی)، ریه، رودۀ بزرگ، پانکراس، مثانه، معده یا سایر ارگان ها اشاره نمود (Amato et al, 2004).
1-10) استرس اکسیداتیودر حقیقت استرس اکسیداتیو همان پیروزی رادیکال های آزاد بر دفاع آنتی اکسیدانی بدن موجود زنده می باشد و به نوعی به حمله های بیولوژیک علیه ارگانیزم بدن اطلاق می شود. رادیکال های اکسیژن بطور مداوم در همه ارگانیزم های زنده تولید می شوند و با اثرات مخرب خود، منجر به آسیب سلولی و مرگ می گردند. تولید گونه های اکسیدان در شرایط فیزیولوزیک دارای سرعت کنترل شده ای است اما این تولید در شرایط اکسیداتیو افزایش می یابد. قرار گرفتن در معرض سیستم های بیولوژیک در مقابل زنوبیوتیک ها و یا ایجاد شرایط پاتولوژیک منجر به استرس اکسیداتیو ودرنتیجه افزایش تولید اکسی رادیکال ها می شود(Aitken, 1994; Warren et al, 1987 ).
1-10-1) گونه های فعال اکسیژن(ROS):(ROS) شامل ملکولهای بسیار فعال واجد اکسیژن از جمله رادیکال های آزاد میباشد((Warren et al, 1987. رادیکال هیدروکسیل، رادیکال آنیون سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، اکسیژن تک، رادیکال NO ،رادیکال هیپوکلریت ولیپید پراکسید های مختلف (Aitken et al, 1994) از جمله گونه های فعال اکسیژن هستند. همه این عوامل قادرند با لیپید های غشا، اسید نوکلئیک پروتئین ها ، آنزیم ها و سایر ملکولهای کوچک واکنش داده ومنجر به آسیب سلولی شوند.
1-10-2) پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر:گونه های اکسیژن فعال (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H2O2)، آنیون سوپر اکسید (O2-U)، مولکول و یا رادیکال هیدروکسیل (UOH) برهر دو گامت نر و ماده تاثیر می گذارند(Agarwal et al, 2008). ROS تولید شده توسط اسپرم نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیک مانند ظرفیت یابی اسپرم، واکنش آکروزومی، همجوشی با تخمک و ثبات کپسول میتوکندری در اواسط قطعه بازی می کند(Aitken et al, 2007; Agarwal et al, 2008(a); de Lamirande et al, 2008). تولید (ROS) در دستگاه تولید مثلی نر به دلیل اثرات توکسیک شدید آنها بر روی کیفیت و عملکرد اسپرم، به موضوعی حائز اهمیت در آندرولوژی تبدیل شده است (Saleh and Agarwal, 2002). مطالعات صورت گرفته نشان داده اند که 45 - 25% مردان نابارور دارای سطوح بالایی از ROS در نمونه های مایع منی خود بودها ند (Agarwal et al., 2004). اما با این وجود باید خاطر نشان کرد که وجود مقادیر اندک ROS برای اسپرم جهت لقاح، واکنش آکروزومی، تحرک و ظرفیت یابی لازم است (Agarwal et al.,2004). واژه استرس اکسیداتیو زمانی به کار میرود که میزان اکسیدانتها از آنتی اکسیدانت ها پیشی بگیرد (Sies , 1993). در واقع این رویداد بیانگر نوعی عدم تعادل بین توالی ROS و مکانیسمهای مهاری آن است (Sikka, 2001). اسپرمها حساسیت ویژهای نسبت به آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو دارند چرا که غشای پلاسمای آنها دارای مقادیر بالایی اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (PUFAs) بوده و در سیتوپلاسم آنها میزان اندکی آنزیم مهاری وجود دارد (Sharma and Agarwal, 1996). علاوه بر این، آنزیم های آنتی اکسیدانت داخل سلولی قادر به محافظت از غشای پلاسمایی احاطه کننده آکروزوم و دم اسپرم نیستند، از این روی اسپرمها جهت تقویت سیستم دفاع آنتیاکسیدانتی داخلی محدود خود از مکانیسمهای دفاعی پلاسمایی منی بهره می جویند (Zini et al, 1993). مطالعات متعدد نشان داده اند که از میان انواع سلول های مختلف موجود در مایع منی، اسپرم های غیرطبیعی و نابالغ و لکوسیتها منابع اصلی تولیدROS را تشکیل میدهند
(Aitken and West, 1990; Kessopolou et al, 1992; Garrido et al, 2004).

تصویر 1-6: پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر(Clevelandclinic, 2013)بررسیها نشان داده است که بین کیفیت پایین اسپرم و افزایش تولید ROS ارتباط مستقیمی وجود دارد. در واقع بقایای سیتوپلاسمی اسپرم، حلقه گمشده ارتباطی بین این دو فرایند میباشند (Gomez et al, 1998). در مواردی که اسپرماتوژنز دچار اختلال می شود، مکانیسم های بیرون راندن سیتوپلاسم دچار نقص شده و اسپرم به همراه بقایای سیتوپلاسمی از اپیتلیوم زایا جدا میشود. اسپرمی که تحت این شرایط آزاد میشود، نابالغ بوده و دارای نقص عملکردی میباشد (Huszar et al, 1997). باقی ماندن این قطرات سیتوپلاسمی در اسپرم وابستگی مستقیمی با تولید ROS از طریق مکانیسم هایی دارد که به نظر میرسد به واسطه آنزیم سیتوزولی گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز صورت می گیرد (Aitken, 1999). از سوی دیگر، اسپرمها به سبب نیاز مداوم به انرژی جهت حرکت، دارای میتوکندریهای فراوانی میباشند. از این روی، اختلال در عملکرد میتوکندریها میتواند به افزایش تولید ROS منجر گردد که این امر به نوبه خود مجدداً میتوکندریها را تحت تأثیر قرار میدهد، چرا که ROS موجب آسیب غشای میتوکندریها شده و این غشاهای آسیب دیده موجبات افزایش میزان ROS را فراهم میآورند (Evenson et al, 1982).
از سوی دیگر، کاهش کیفیت اسپرم و نیز نقص عملکردی آنها با افزایش میزان لکوسیتها در مایع منی در ارتباط است. لکوسیتهای پراکسیداز مثبت که یکی از منابع اصلی تولید ROS در مایع منی محسوب میگردند، لکوسیتهای هستند که هسته چند شکلی دارند و 60-50% لکوسیتهای مایع منی را تشکیل می دهند. غده پروستات و کیسههای منی منابع اصلی این لکوسیتهای پراکسیداز مثبت میباشند (Wolff, 1995). لکوسیتها در پاسخ به محرکهای مختلفی نظیر عفونت و آماس، فعال شده و این لکوسیتهای فعال قادر خواهند بود 100 برابر لکوسیتهای غیر فعال ROS تولید نمایند (Plante et al, 1994). این مکانیسم به واسطه افزایش تولید NADPH از مسیر هگزوز منو فسفات صورت میپذیرد که فعال سازی سیستم میلو پراکسیداز لکوسیتهای دارای هسته چند شکلی و ماکروفاژ را در پی داشته، نهایتاً به انفجار تنفسی و تولید مقادیر بالای ROS میانجامد. بنابراین، افزایش غیرطبیعی میزان لکوسیتهای مایع منی و یا جداسازی اسپرم از پلاسمای منی جهت انجام کارهای آزمایشگاهی، میتواند به آسیب دیدن اسپرمها توسط ROS تولیدی لکوسیتها منجر گردد (Shekarriz et al, 1995).
تمامی ترکیبات سلولی نظیر لیپیدها، پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و قندها، اهداف بالقوه استرس اکسیداتیو میباشند. میزان آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو به ماهیت و میزان ROS ، مدت زمان قرار گرفتن در معرض ROS و فاکتورهای خارج سلولی مانند دما و اجزاء محیط ( یونها، پروتئین ها و آنتی اکسیدانت ها ) بستگی دارد(Makker et al, 2009). ROS به اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (PUFAs) که در غشاء سلولی حضور دارند حمله کرده و مجموعهای از واکنش های شیمیایی را که در مجموع پراکسیداسیون لیپیدی نامیده میشود، موجب میگردد (Aitken, 1995; Kodama et al, 1996).
این فرآیند با واکنش رادیکالهای آزاد با زنجیره های اسیدچرب و آزادسازی رادیکالهای آزاد لیپیدی آغاز میگردد. این رادیکالهای آزاد لیپیدی متعاقباً با اکسیژن مولکولی وارد واکنش شده و رادیکالهای پروکسیل لیپیدی را شکل میدهند. رادیکالهای پروکسیل نیز میتوانند با اسیدهای چرب واکنش داده ، رادیکالهای آزاد لیپیدی تولید کنند که این امر موجب تداوم چرخه واکنشها میگردد (Alvares and Storey, 1995). یکی از محصولات جانبی پراکسیداسیون لیپیدی، مالون دی آلدئید میباشد. این محصول جانبی در ارزیابیهای بیوشیمیایی متعددی جهت برآورد میزان آسیب پراکسیداتیو کاربرد دارد (Aitken et al, 1995).
1-11) آنتی اکسیدانت ها و نقش حفاظتی آنها در برابر استرس اکسیداتیو:خوشبختانه تولید رادیکالهای آزاد بوسیله آنتی اکسیدانت ها کنترل می شود. هنگامی که دسترسی به آنتی اکسیدانت ها محدود شود آسیب افزایش یافته و بدن ناتوان میگردد. آنتی اکسیدانت ها قادرند عوامل اکسیدان را قبل از حمله به سلولها پایدار ،غیر فعال ویا بلع کنند. بنابراین آنتی اکسیدانت ها برای نگهداری بدن در حالت سلامت وبهبودی کاملا ضروری هستند. عملکرد آنتی اکسیدانت ها شامل ظرفیت بلع رادیکال های آزاد ،ممانعت از پراکسیداسیون لیپید ها، توانایی غیر فعال نمودن یونهای فلزی وظرفیت احیا کنندگی آنهاست (Jha et al, 1995). به طورکلی آنتی اکسیدانت ها از نظر شکل، خصوصیات فیزیکی وشیمیایی وجایگاه عملشان با هم فرق دارند.
1-آنتی اکسیدانت های آنزیمی: آنزیم هایی هستند نظیر گلوتاتیون احیا، SOD ، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز.این عوامل، تولید گونه های فعال اکسیژن را بوسیله حذف ظرفیت اکسیدانی یا تغییر شکل آنها (ROS&RNS)به اجزا پایدار تقلیل می دهند( Davies, 1995).
2-ساختارهای با وزن ملکولی بالا (پروتئین ها) شامل آلبومین ، سرولوپلاسمین، ترانسفرین، هاپتوگلوبولین که با جایگاه فعال فلزات باند میشوند وتولید فلزات کاتالیز کننده رادیکالهای آزاد را محدود می کنند(Chaudiere et al, 1999)..
3-ساختارهای با وزن ملکولی پائین، شامل دو دسته آنتی اکسیدانت های محلول در چربی (توکوفرول، کاروتنوئید، کوئینین و برخی پلی فنل ها) و آنتی اکسیدانت های محلول در آب (اسکوربیک اسید، اسید اوریک وبرخی پلی فنل ها). (Chaudiere et al, 1999)
4-مینرال ها (سلنیوم، منگنز، مس و روی) آنتی اکسیدانت های همه کاره (Chaudiere et al, 1999)
5-ویتامین ها.(Jha et al, 1995)
6-آنتی اکسیدانت های گیاهی(Jha et al, 1995)
1-11-1) سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در بدن
مطالعات نشان داده اند که آنتی اکسیدانت ها دارای اثرات گسترده ای در آندرولوژی بوده و قادرند از اسپرم ها در برابر ناهنجاری های ناشی از ROS محافظت نمایند. این ترکیبات همچنین موجب مهار ROS تولید شده توسط لکوسیت ها و بهبود کیفیت مایع منی شده و از قطعه قطعه شدن DNA و بلوغ نا بهنگام اسپرم ها جلوگیری می کنند. سه سیستم آنتی اکسیدانتی متفاوت و وابسته به هم که نقش کلیدی در کاهش استرس اکسیداتیو در جنس نر ایفا می کنند عبارتند از: آنتی اکسیدانت های رژیم غذایی، آنتی اکسیدانت های اندروژن و پروتئین های غیرفعال کننده یون های فلزی ( Hughes et al, 1998; Agarwal et al, 2004).
آنتی اکسیدانتهای موجود در پلاسمای منی و اسپرم در گروه آنتی اکسیدانتهای اندروژن قرار میگیرند. پلاسمای منی دارای سه آنتی اکسیدانت آنزیمی اصلی سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز/گلوتاتیون ردوکتاز (GPX/GRD) در کنار طیف وسیعی از آنتی اکسیدانتهای غیرآنزیمی مانند آسکوربات، اورات، ویتامینE، ویتامین A، پیروات، گلوتاتیون، آلبومین، یوبی کوئیتول، تائورین و هایپوتائورین میباشد. اسپرمها علاوه بر SOD که عمده ترین آنتی اکسیدانت موجود در آنها را تشکیل میدهد، دارای آنتی اکسیدانتهای آنزیمی اولیه نیز میباشند. آنتی اکسیدانت های رژیم غذایی غالباً به شکل ویتامین C، ویتامین E، بتاکاروتنها، کاروتنوئیدها و فلاونوئیدها میباشند. پروتئین های غیرفعال کننده یونهای فلزی نظیر آلبومین، سرولوپلاسمین، متالوتیونئین، ترانسفرین، فریتین و میوگلوبولین ، به واسطه غیرفعال کردن انتقال یونهای فلزی که تولید رادیکالهای آزاد را کاتالیز میکنند، عمل میکنند (Sies, 1993; Tarin et al, 1998; Greco et al, 2005a) این ترکیبات همچنین پراکسیداسیون لیپیدی غشاء پلاسمایی اسپرم را کنترل می کنند و موجب حفظ یکپارچگی آن میگردند (Wroblewski et al, 2003).
بررسیهای آزمایشگاهی صورت گرفته نیز نقش آنتیاکسیدانتها را در کاهش تولید ROS توسط اسپرم و بهبود توانایی تکاملی جنین مورد تأیید قرار داده است (Ta--oto et al, 2001; Ali et al, 2003; Esfandiari et al, 2005). در همین راستا ، گزارشات دیگری نیز بر نقش آنتی اکسیدانتها در کاهش آسیب DNA و آپوپتوز در اسپرمها و نیز افزایش میزان بارداری و لانه گزینی بالینی صحهگذاردهاند (Hughes et al, 1998; Greco et al, 2005b). از این روی با توجه به کاربرد روز افزون تکنیک های آزمایشگاهی نظیرIVF، ارزیابی سطوح ROS و وضعیت استرس اکسیداتیو در نمونههای اسپرم پیش از IVF و نیز استفاده از آنتی اکسیدانتهای مؤثر و کارا میتوانند ما را به نتایج بهینه رهنمون سازد . همچنان که تحقیقات صورت گرفته نشان داده است که این ترکیبات قادرند اثرات سمی پراکسید هیدروژن بر روی جنین را به نحو مطلوبی کاهش دهند (Zhang et al, 2005).
1-12) سنجش استرس اکسیداتیو1-12-1) مالون دی آلدئید (MDA)
مالون دی آلدئید (MDA) یکی از محصولات نهایی در پروسه پراکسیداسیون لیپید هاست. پر اکسیداسیون لیپیدها یک روند اتولیزی است که نتیجه معمول مرگ سلولی است. این پروسه می تواند منجر به آسیب پراکسیداتیو بافتها در التهاب ،سرطان ومسمومیت با زنوبیوتیک ها و افزایش سن شود(Oranje and Roundas, 1999). MDA در خلال دژنراسیون اکسیداتیو بعنوان یکی از محصولات حاصل از رادیکالهای آزاد اکسیژن شکل می گیرد و به عنوان شاخصی از پراکسیداسیون لیپیدها پذیرفته می شود(Yagi, 1998).
1-12-2) گلوتاتیون احیا (GSH)
ماده ایست که بطور طبیعی در بسیاری از موجودات زنده و به فراوانی یافت می شود. نقص در مسیر گلوتاتیون در ارگانیزم های زنده می تواند منجر به اختلالات بافتی و آسیب شود. گلوتاتیون یک احیا کننده داخل سلولی است ونقش مهمی در کاتالیزه کردن متابولیسم دارد. گلوتاتیون سلول ها را علیه رادیکال های آزاد ،پراکسید ها وسایر اجزا سمی محافظت می کند. به نطر می رسد که GSH سیستم دفاعی اصلی غیر آنزیمی بر علیه ROS در جنین باشد(Takahashi et al, 1993)
1-12-3) آنزیم کاتالازکاتالاز یک پروتئین واجد آهن است که از چهار واحد پروتئینی تشکیل شده است، هرکدام ازین واحدها شامل یک گروه هم میباشند(Nasr-Esfahani, 1991) و به طور عمده در پراکسی زوم و در مقادیر کمتر در سیتوزول و شکستگی های میکرومازول سلولی گسترش می یابد (Smith et al, 2006). این آنزیم تجزیه H2O2 را به آب و اکسیژن کاتالیز می کند که در نتیجه سلولها را ازآسیب اکسیداتیو ناشی از H2O2 و OH حفظ می کند. در واقع این آنزیم قادر است پراکسید هیدروژن را کاهش دهد. از آنجا که پراکسید هیدروژن هیچ الکترون غیر جفت شده ای در اوربیتال خارج اتمی یا مولکولی-اش وجود ندارد، رادیکال آزاد نیست اما پیش ساز رادیکال هیدروکسیل است که سمی ترین شکل نمونه ی اکسیژن واکنشی می باشد. سمیت بالای رادیکال هیدروکسیل، به خاطر واکنشی بودن بالای آن با تقریبا هر نوع مولکول در سیستم زنده میباشد. (Nasr-Esfahani, 1991 ; Blondin et al, 1997 ; Guérin et al, 2001)
1-13) ژل رویال 
عسل مهمترین محصول زنبور عسل است که توسط زنبورهای کارگر تولید می شود، اما فعالیت زنبورهای کارگر منحصر به تولید عسل نبوده و محصولاتی همچون ژل رویال، موم، بره موم را نیز تولید می کنند.ژل رویال مایعی غلیظ، شیری رنگ وبسیار مغذی از ترشحات زنبور عسل است که به آن شاه انگبین ، شیر زنبور عسل، شهد شاهانه و (royal jelly) غذای ملکه هم می گویند. این ماده بسیار مغذی و نیرو بخش است در واقع به عنوان غنی ترین ماده مغذی بیولوژیک شناخته شده و از گذشته ای دور به عنوان اکسیر جوانی و مایه حیات در طب باستان استفاده می شده و اکنون نیز در کشورهای پیشرفته جهان استفاده طبی از آن بر پایه تحقیقات دانشمندان در دانشگاه ها و موسسه های تحقیقاتی معتبر رایج است.
1-13-1) تولید ژل رویالاین ماده از غدد آرواره ای و زیر حلقی( hypopharyngeal & mandibular)  موجود در طرف سر زنبوران کارگر جوان(6-12 روزه) ترشح می شود و با بزاق دهان آنها مخلوط می گردد(Rosmilah et al, 2008)0. این ژل ،خمیری شکل با رنگ تقریبا سفید تا زرد کمرنگ و طعمی تند و زننده است.این ماده مغذی تا سه روز مورد استفاده همه لاروها قرار میگیرد ولی زنبور ملکه به طور دائم از این ماده تغذیه می شود. بدون ژله رویال هیچ لاروی قادر به رشد نیست و این ماده، ملکه را قادر می سازد که در روزهای تخم ریزی در شبانه روز بیش از 2500 تخم بگذارد که وزن این مقدار بیش از وزن خود ملکه است. همچنین ملکه زنبور عسل به واسطه استفاده از این ماده مغذی حدود 5 تا 6 سال عمر می کند در حالی که زنبور های کارگر در فصول فعالیت خود(بهار و تابستان) حدودا کمتر از 14 تا 24 روز از فعالیت خود میمیرند.(Hassan, 2009)

–256

فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده 1
مقدمه 3
فصل اول: کلیات
1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول 12
1-2-راه انتقال 13
1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست 14
1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی 15
1-2-3-انتقال از طریق جفت 15
1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی 16
1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی 18
1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل 18
1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان 18
1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط 19
1-4-آنتی ژنهای توکسوپلاسما گوندی 19
1-5-واکسیناسیون 21
1-6-بیماریزایی 22
1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی 24
1-8-تظاهرات بالینی 25
1-9-تشخیص توکسوپلاسموز 29
1-9-1- تشخیص مستقیم 29
1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی 29
1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی 30
1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم 30
1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ..................................................................................................................... 31
1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن 34
1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم 34
1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت 35
1-10-الایزا (ELISA) 35
1-10-1- الایزای مستقیم 36
1-10-2- الایزای غیر مستقیم 36
1-10-3- الایزای ساندویچ 37
1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم 37
1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم 37
1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری 37
1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ 38
1-12-تولید پروتئین نوترکیب 39
1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی 39
1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین
اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت 40
1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس 42
1-16-درمان 44
1-17-پیشگیری 47
1-18- بیان مسئله و اهمیت آن 48
1-19- دلایل انتخاب موضوع 50
1-20-اهداف و فرضیا ت 51
فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته
2-1- مروری بر تحقیقات گذشته 53
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59
3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59
3-1-2- تهیه و تخلیص پروتئین های نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7) و
rGRA6(PUET-GRA6 60
3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده 62
3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62
3-2-2- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات 66
3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده 71
3-4- تعیین غلظت پروتئین 71
3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) 71
3-5-1- طراحی سیستم های الایزا 72
3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا 72
3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا 74
3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن
توکسوپلاسموز با روش الایزا 76
3-6-1-برقراری شرایط الایزا 76
3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا 76
3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم 77
3-8-تعیین Cut off در روش الایزا 80
3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun 81
3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun 82
3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG 82
3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و
PUET-GRA6 83
3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN 83
3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen 85
3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index 88
3-16- کنترل کیفی 88
3-16-1- حساسیت 88
3-17-طراحی تحقیق 88
3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری 89


3-18-1- تعداد نمونه 89
3-18-2- روش نمونه گیری 89
فصل چهارم: نتایج آزمایشات
4-1 :تهیه و تخلیص پروتئین های نو ترکیب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6
(PUET-GRA6 92
4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات 93
4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94
4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای
ایرانی با کیت Euroimmun... 95
4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95
4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها
با کیت Euroimmun 96
4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب 100
4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز
عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار 103
4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز
عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران 103
4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت
Euroimmun با استفاده از کیت Microgen 104
فصل پنجم:بحث، پیشنهادات
منابع 121
خلاصه انگلیسی 127
ضمائم 129
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن 87
جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon 97
جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های
GRA6 وGRA7 106
جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7
بر روی سرم های زنان باردار ............................................................................................................... 108
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1- شکل شماتیک یک تاکی زوایت و یک برادی زوایت توکسوپلاسما گوندی 4
شکل1-2- عکس میکروسکوپ الکترونی یک تاکی زوایت، سوش VEGکه در حال
نفوذ به یک نوتروفیل صفاق موش می باشد 7
شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم
اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش 8
شکل1-4- یک کیست بافتی توکسوپلاسما که حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد 9
شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط 16
شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی 25
شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا............................................................................................... 38
شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن............................................................................... 87
شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی 92
شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی 93
شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7
تخلیص شده باروش وسترن بلات 94
شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101
شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101
شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102
شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102
شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای 105
شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن106
شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق
عفونت حاد و مزمن و تحت حاد............................................................................................................... 107
Abbreviations:
AC- Affinity chromatography
ADCC – Antibody – Dependent Cell – Mediated Cytotoxicity
AIDS – acquired immunodeficiency syndrome
APS – Ammonium persulfate
BAG – b--yzoite antigen
BCA – bicinchoninic acid assay
BSA – bovine serum albumin
CSF – Cerebrospinal fluid
CD – cluster of differentiation
DAB – Diamino benzidine
DNA – Deoxyiribonucleic acid
EDTA – Ethylenediaminetraacetic acid
ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay
EI – Enzyme immunoassay
FPLC – Fast protein liquid chromatography
FSH – Follicle – stimulating hormone
FDA – Food and drug Administration
GRA – granule antigen
GST – glutathione S-transferase
HCG – Human chorionic gonadotropin
HIS-TAG – histidine-tag
IEC – Ion-exchange chromatography
IMAC – immobilized – metal affinity chromatography
IPTG – Isoproyl –B-D-thio-galactoside
Ig – immunoglobulin
IFN- Interferon
IL – interleukin
LH- Luteinnizing hormone
MBP – Maltose Binding Protein
MAG – Matrix antigen
MIC – Microneme
NI-NTA – Nikel nitrilotriacetic acid
OD – Optical density
OPD – o – phenylenediaminedihydrochloride
PBS – Phosphate – bufferedsaline
PSA- Prostate – specific antigen
PV – Parasitophorus vacuole
PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis
PCR – Polymerase chain reaction
RAI – Relative avidity index
ROP – Rhoptry protein
RNA – Ribonucleid acid
SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SAG – surface antigen
TBS – Tris buffered Saline
TEMED – Tetramethylenediamine
TMB – Tetra Methyl Benzidine
Th – T –helper
TRX – Thioredoxin
TSH – Thriod – Stimulating hormone
TNF – Tumor necrosis factor
چکیده فارسی
توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخیص صحیح عفونت اخیر (recent) توکسوپلاسما و تمایز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهمیت حیاتی در مراقبتهای درمانی مادر و جلوگیری از بروز عوارض عصبی- مغزی در جنین دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر می رسد ترکیب دو روش الایزای IgM و الایزای آویدیته IgG بهترین و مطمئن ترین نتایج را برای تشخیص عفونت حاد و تمایز آن از عفونت مزمن می دهند. شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئین GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهایت ،کارایی روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق برای تشخیص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراین تحقیق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما که حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست های استاندارد سرولوژیک برای ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئین GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمایش با پروتئین GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آویدیته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آویدیته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.
کلمات کلیدی : توکسوپلاسما،گوندی ،آویدیته الایزا ، GRA7 ،GRA6

مقدمه
تاریخچه و طبقه بندی
انگل توکسوپلاسما گوندی، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.این انگل با گسترش جهانی، قادر به تکثیر در بسیاری از میزبان های مهره دار از جمله انسان است. این ارگانیسم در سال 1908 توسط نیکول و مانسو در یک جونده کوچک به نام کتنوداکتیلوس گوندی در انستیتو پاستور تونس و تقریباً به طور همزمان توسط اسپلندور در برزیل در یک خرگوش آزمایشگاهی کشف شد. ابتدا تصور می شد این ارگانیسم گونه ای از جنس لیشمانیا است ولی یک سال بعد، پس از مطالعات بیشتر آن را به عنوان یک ارگانیسم متفاوت شناختند و نام جنس جدید توکسوپلاسما را برای آن پیشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توکسوپلاسما گوندی عوارض متعددی در انسان بوجود می آورد ولی 15 سال بعد از کشف آن بود که انگل از اتوپسی چشم یک کودک مبتلا به هیدروسفالی جدا شد)3و4(. شیوع توکسوپلاسموزیس تا قبل از ابداع روش تشخیص سرولوژیکی تست رنگی به وسیله سابین و فلدمن در 1948 )5(، به طور دقیق مورد ارزیابی قرار نگرفت. فرنکل در سال 1970 چرخه زندگی را به طور کامل شناسایی و معرفی کرد )1(. موقعیت تاکسونومیک توکسوپلاسما گوندی بر اساس خصوصیات شکل شناسی و چرخه انگلی آن به وسیله ملهورن در سال 1988 به صورت زیر تعریف شده است.
Kingdom: Protozoa
Phylum: Apicomplexa
Class: Sporozoea
Sub-class: Coccidia
Super- order: Eucoccidea
Order: Eucoccidida
Sub- order: Eimeriina
Family: Eimeriidae
Genus: Toxoplasma
Species: gondii
مورفولوژی و ساختار انگل
توکسوپلاسما از دو کلمه توکسون به معنای کمان یا قوس و پلاسما به معنای سلول مشتق شده است، زیرا ارگانیسم شکل هلالی یا قوسی دارد. انگل دارای سه شکل در چرخه زندگی می باشد:
1-تاکی زوایت 2-برادی زوایت 3-اسپوروزوایت
33718534798000هر سه شکل انگل می توانند میزبان نهایی و واسطه را آلوده سازند )7(. ولی نقش بیولوژیک این سه شکل متفاوت است.
شکل 1-1- شکل شماتیک یک تا کی زوایت (چپ) و یک برادی زوایت (راست) توکسوپلاسما گوندی )8(
تاکی زوایت (اندودیوزوایت)
تاکی زوایت شکل آزاد انگل و مربوط به مرحله تکثیر سریع آن است که قوسی شکل، به طول 4-8 وعرض2-4 میکرومتر می باشد. در عکس های حاصل از میکروسکوپ الکترونی سیستم پیچیده ای از اندامک ها شامل غشاء نازک پوشش خارجی، حلقه قطبی، یک مخروط تقریباً تو خالی و بدون رأس به نام کونوئید در انتهای نوک تیز (قدامی)، روپتری ها، میکرونم ها، میتوکندری ها، میکروتوبول های زیر غشایی، رتیکولوم آندوپلاسمی صاف و خشن، دستگاه گلژی، ریبوزومها، یک ارگانل شبیه پلاستید به نام آپیکوپلاست و میکروپور و هسته کاملاً مشخص را مشاهده کرد. )4( (شکل1-1). معمولاً هسته در جهت انتهای خلفی یا در ناحیه مرکزی سلول قرار گرفته است. کروماتین به طور انبوه در تمامی هسته پخش شده و معمولاً هستک در مرکز هسته جا دارد. کروموزوم ها طی میتوز متراکم نمی شوند، بنابراین، تعداد کروموزوم ها که 11 عدد می باشد ، اولین بار با استفاده از PFGE شناسایی شده است )9(. در مقاطع هیستولوژی تاکی زوایت ها اغلب تخم مرغی شکل می باشند )1(. تاکی زوایت ها به شرایط محیطی خیلی حساسند و معمولاً در خارج بدن میزبان سریعاً از بین می روند )6(. تاکی زوایت با هجوم فعالانه به غشاء سلول میزبان و یا به وسیله فاگوسیتوز وارد سلول میزبان می گردد. ابتدا انتهای کونوئید نفوذ نموده ، کونوئید به طرف جلو فرورفته و غشاء روپتری با غشاء واحد در انتهای خلفی توکسوپلاسما گوندی در آمیخته، و سوراخی را تشکیل داده که از طریق آن ترشحات روپتری آزاد می گردد. احتمالاً محتویات روپتری ها غشای پلاسمائی سلول میزبان را در اطراف انتهای قدامی توکسو پلاسما گوندی حل می نماید. زمانی که توکسوپلاسما گوندی وارد سلول میزبان می شود، غشای پلاسمائی پاره شده و گروهی از حفرات ریز یا وزیکول ها (احتمالاً ترشحات روپتری) در نواحی مجاور سیتوپلاسم دیده می شود. غشاء سلول میزبان تنها در انتهای قدامی توکسوپلاسما گوندی پاره می شود. در طی 15 ثانیه انگل در ماکروفاژ دیده شده، و دخول آن به وسیله فاگوسیتوز 120 ثانیه به طول می انجامد. به فاصله کوتاهی پس از نفوذ ، توکسوپلاسما گوندی به وسیله حفره یا واکوئل حامل انگل (PV) از سلول میزبان مجزا می شود. به نظر می رسد PV به طور دو جانبه از انگل و میزبان مشتق شده باشد )8(. تاکی زوایت به طریق غیر جنسی به وسیله آندودیوژنی مکرر در درون سلول میزبان تکثیرمی یابد (شکل1-3). آندودیوژنی شکل اختصاصی تقسیم بوده که در خلال آن دو سلول دختر تشکیل شده و سلول مادری تحلیل می رود. تقسیم تاکی زوایت ها به طریق آندودیوژنی تا پر شدن سلول میزبان از انگل ها ادامه می یابد. سلول های میزبان که حاوی تاکی زوایت های متعدد هستند، کلون ها، کلنی های نهایی یا پزودوسیست (کیست کاذب) نامیده می شوند. ندرتاً انگل های یک گروه به طور همزمان تقسیم شده، به طوری که معمولاًسلول های پروژنی به طور تصادفی یا بی قاعده مرتب می شوند. با این وجود، گاهی ممکن است تقسیم همزمان پروژنی انجام شده و توده رُز مانند تشکیل گردد. گروهی از تاکی زوایت هایی که به وسیله یک PV احاطه شده، کلون نامیده می شوند ) 8و4( . تاکی زوایت های توکسوپلاسما فاقد اندامهای حرکتی مانند تاژک ، مژه یا پای کاذب بوده و حرکت ارگانیسم با تا شدن بدن یا لغزیدن تواءم با چرخش در حول محور طولی بدن ، انقباض یا موج دار شدن انجام می گیرد(8و10). در مراحل اولیه عفونت توکسوپلاسمایی یا مرحله حاد بیماری ممکن است گروههایی از تاکی زوایت های در حال تکثیر در سیتوپلاسم سلولهای انواع بافتها مشاهده گردند که به مجموعه تاکی زوایت های داخل سلول میزبان کیست کاذب یا کلنی نهایی یا تجمعات انتهایی اطلاق می شود(8و10).این کلنی های تاکی زوایتی را می توان بر اساس تفاوت در رنگ پذیری از ارگانیسم های موجود در کیستهای حقیقی توکسوپلاسما متمایز نمود. شکل تاکی زوایت انگل در مرحله حاد عفونت دیده می شود و می تواند تمام سلولهای نسوج پستانداران را مورد حمله قرار دهد . پس از حمله ، انگل هر 4 تا 6 ساعت یک بار تکثیر می یابد و تجمعات شبیه به به آرایش گل تشکیل می دهد و سر انجام در هر سلول آلوده 16-8 و در مواردی تعداد بیشتری تاکی زوایت تجمع می یابد. سر انجام سلول با تعداد 64 تا 124 انگل پر شده و سپس سیتوپلاسم انباشته از تاکی زوایت سلول پاره می شود و ارگانیسم های آزاد شده به سلولهای مجاور حمله می کنند و در آنها به شیوه اندودیوژنی تکثیر می یابند(11).همچنین تاکی زوایت های آزاد شده از طریق جریان خون به بافت های متعددی از جمله سیستم اعصاب مرکزی ، چشم ،عضلات اسکلتی و قلبی راه یافته و سلولهای بافتی را آلوده می کنند. تکثیر انگل باعث ایجاد یک پاسخ التهابی شدید و تخریب بافت شده و بنابر این منجر به تظاهرات بالینی بیماری می گردد(11).

شکل 1-2- عکس میکروسکوپ الکترونی یک تاکی زوایت، سوش VEGکه در حال نفوذ به یک نوتروفیل صفاق موش می
باشد )8(.
83820011938000
شکل 1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش .
برادی زوایت (سیستی زوایت)
ماحصل سیکل غیر جنسی انگل در میزبان است که انگل در نسوج میزبان به صورت کیستی در می آید. اندازه آن بین 120-20 میکرومتر متغیر است )1(. کیست نسجی در واقع مرحله در حال استراحت انگل در بدن میزبان است این کیست ها در حقیقت مجموعه ای از برادی زوایت ها ی انگلی هستند که دارای جدار کیستی نازک می باشند(برادی در زبان یونانی به معنای کند و آرام ). برادی زوایت نیز توسط تقسیم دوتایی آندودیوژنی تکثیر می شود که بر خلاف تاکی زوایت به کندی صورت می گیرد )12(. تاکی زوایت تحت تأثیر فشار پاسخ ایمنی به برادی زوایت تبدیل می شود و تشکیل کیست می دهد. کیست های بافتی حاوی صدها و هزاران برادی زوایت می باشند. برادی زوایت های داخل کیست ها مادام العمر در میزبان باقی می مانند )11(. از نظر ساختاری برادی زوایت و تاکی زوایت اندکی متفاوت هستند . در برادی زوایت ها هسته در جهت انتهای خلفی قرار دارد. برادی زوایت باریک تر از تاکی زوایت بوده و در محتوای بالای میکرونم ها و گرانول های آمیلوپکتین (منبع انرژی) با تاکی زوایت متفاوت است )8و12(. دانه های لیپیدی در برادی زوایت دیده نمی شوند ولی گاهاً در تاکی زوایت دیده می شوند. در حضور آنزیم های پروتئولیتیک، برادی زوایت ها 1-2 ساعت پایدار می مانند ولی تاکی زوایت ها در مدت 10 دقیقه از بین می روند. در گربه که میزبان نهایی است، دوره کمون عفونت زایی (فاصله بین عفونت اولیه تا دفع اووسیست ها) برای برادی زوایت کوتاهتر از تاکی زوایت است )12(. علاوه بر سرعت همانند سازی، برادی زوایت ها وتاکی زوایت ها در بیان ژن و متابولیسم نیز متفاوت هستند. بیان بعضی ژن ها اختصاصی مرحله تاکی زوایت یا برادی زوایت می باشد. همچنین متابولیسم در برادی زوایت کندتر است.

شکل 1-4- یک کیست بافتی توکسوپلاسما که حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد)8(.
اسپوروزوایت
از نظر شکل شناسی بسیار نزدیک به تاکی زوایت می باشد. در بررسی میکروسکوپ الکترونی نیز بسیار مشابه تاکی زوایت است، جز اینکه میکرونم ها و روپتری فراوانی در اسپور زوایت وجود دارد. روپتری ها یا متراکم هستند (در برادی زوایت) یا پراکنده هستند (در تاکی زوایت). اسپوروزوایت همانند برادی زوایت، تعداد بسیار زیادی گرانول های متراکم دارد. اسپوروزوایت شکلی از انگل است که مسئول تکثیر جنسی توکسوپلاسما گوندی در گربه (میزبان نهایی) می باشد و اووسیت ها را به وجود می آورد که قطر 10 تا 12 میکرومتر دارند و شکل مقاوم انگل به محیط بیرونی هستند و در مدفوع گربه دفع می شوند. اسپورولاسیون یک اووسیت تولید دو اسپوروسیت می کند که هر کدام حاوی دو اسپوروزوایت هستند )14(.
تغییر اشکال مختلف توکسوپلاسما به یکدیگر و نقش آن در بیماری زایی توکسوپلاسما
مشخصه عفونت اولیه و بیماری حاد، حضور تاکی زوایت های سریع تکثیر شونده می باشد. حدود 10 تا 14 روز بعد از عفونت، تاکی زوایت ها به برادی زوایت ها تمایز می یابند که خیلی آهسته تر تکثیر می شوند و در سراسر بدن تشکیل کیست می دهند. کیست های بافتی مدت زیادی باقی می مانند و باعث بیماری نمی شوند. در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی مثل AIDS و بدخیمی ها، پاره شدن کیست های بافتی و تغییر شکل برادی زوایت به تاکی زوایت منجر به فعال شدن مجدد بیماری می شود. افراد مبتلا شده از طریق انتقال مادر به نوزاد نیز در معرض خطر فعال شدن مجدد بیماری هستند که می تواند چندین بار تکرار شود و بیشتر مغز و چشم های آنها را مبتلا می کند )2(. تغییر شکل تاکی زوایت ها به برادی زوایت ها و بالعکس، نه تنها نقش حیاتی در ایجاد عفونت مزمن دارد بلکه مسئول فعال شدن مجدد بیماری نیز می باشد. فهم این فرایند می تواند همچنین در طراحی داروهای شیمیایی جدید که قادر به از بین بردن کیست های بافتی باشند، کمک کند. همچنین شناسایی مولکول های سطحی اختصاصی هر مرحله (تاکی زوایت یا برادی زوایت) می تواند منجر به یافتن واکسن های مؤثر یا پیشنهاد راه هایی برای جلوگیری از تهاجم انگل منجر شود )8و14(.
1028272238760فصل اول
کلیات
00فصل اول
کلیات

1889760278130
1-1- اتصال و نفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول
به طور کلی، اتصال و نفوذ به سلول های میزبان توسط اشکال مختلف انگل توکسوپلاسما گوندی (تاکی زوایت، برادی زوایت و اسپور زوایت) شبیه به دیگر انگل های کوکسیدی بوده و شامل مراحل زیر است: 1- حرکت کردن انگل 2- شناسایی کردن سلول میزبان با سرکونوئیدال 3- دندانه دار کردن و ایجاد بریدگی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان 4- تشکیل یک محل اتصال متحرک که هنگامی که انگل داخل سلول میزبان نفوذ می کند پشت سر انگل حرکت می کند 5- ترشح جزئی میکرونم ها، روپتری ها و گرانول های متراکم [8]. زوایت های (اشکال مختلف توکسوپلاسما) توکسوپلاسما گوندی می توانند به سلول های مختلفی از میزبانان بسیار متفاوتی نفوذ کنند. وقتی این انگل در آزمایشگاه کشت می شود، تقریباً قادر است که تمام سلول های پستانداران، حشرات و ماهی ها را مورد تهاجم قرار دهد، که نشان می دهد احتمالاً توکسوپلاسما قادر به بیان چندین نوع متفاوت رسپتور برای لیگاندهای مختلف می باشد یا اینکه تعداد کمی از رسپتورها که قادرند به لیگاندهای مشترک از دودمان های سلولی متفاوت متصل شوند. برای شناسایی هر یک از این دو فرضیه کارهای زیادی انجام شده و توصیف های زیادی انجام شده است و تا به امروز متوجه شده اند که گیرنده های سلول میزبان از جمله لامینین و لکتین و رسپتور سطحی توکسوپلاسما به نامSAG1 در اتصال و نفوذ توکسوپلاسما گوندی دخیل هستند [8، 10]. در واقع در اغلب موارد، غشاء دارای یک خانواده از پروتئین ها است که وابسته به آنتی ژن سطحی SAG1می باشند.SAG1 مهمترین این پروتئین ها می باشد و حداقل در قسمتی از اتفاقات اولیه در اتصال به غشاء میزبان بکار می رود. به طور واضحی این پروتئین تنها مولکول انگل که در اتصال به سلول میزبان دخیل باشد نیست به طوری که موتانت هایSag- هنوز قادر به عفونت هستند. اگر چه با مشخصات و صفات متفاوت، این موتانت ها راحت متصل نمی شوند اما به طور میانگین قادرند در مدت زمان بیشتری وارد سلول میزبان شوند. این مدت زمان ورود به داخل سلول های میزبان در این موتانت ها دو برابر تیپ های وحشی می باشد [36]. زوایت های توکسوپلاسما می توانند همچنین به وسیله راه هایی غیر از نفوذ با واسطه رسپتور، وارد سلول های میزبان شوند. اسپیر و همکاران دریافتند که بعد از گذر کامل از غشاء سلولی، بعضی از زوایت های توکسوپلاسما گوندی پوششی از غشاء سلولی و سیتوپلاسم میزبان را همراه دارند ولی هنوز قادر به نفوذ به سلولهای دیگر هستند. زوایت های توکسوپلاسما همچنین می توانند توسط سلول میزبان اندوستیوز شوند و از این مسیر وارد سلول شوند [10].
اخیراً تحقیقات زیادی روی چگونگی تشکیل واکوئل پارازیتوفوروس (PV) انجام شده است. هنگامی که تاکی زوایت ها به سلول های میزبان نفوذ می کنند به وسیله غشایی که واضحاً از پلاسمالما (ولی عاری از پروتئین های میزبان) است احاطه می شوند. این غشاء بعداً تبدیل به غشاءPVM)) می شود و تعدادی از پروتئین های انگل از جمله ROP2، ROP3، ROP4 و ROP7 به آن متصل می شوند ROP2 در قسمتی از PVM قرار می گیرد که منشأ آن از سیتوپلاسم سلول میزبان است که این احتمالاً نشانگر این است کهROP2 در ارتباطات بیوشیمیایی میزبان و انگل نقش دارد [10]. ظرف چند دقیقه بعد از نفوذ،تاکی زوایت ها PV تازه تشکیل داده، PVM را با پروتئین های انگل تغییر می دهند و یک شبکه غشایی توبولووزیکولار داخل PV شکل میدهند. PVM احتیاج به ساختارهای منفذ مانندی دارد که به راحتی مولکول های باردار تا اندازهkDa 1200 بتوانند بین PV و سیتوپلاسم سلول میزبان حرکت کنند. پروتئین های گرانول های متراکم (GRA) بعد از نفوذ تاکی زوایت، به داخل PV ترشح می شوند. GRA3 و GRA5 روی PVM قرار می گیرند و GRA6،GRA4 و GRA2 و GRA1 به TMN می پیوندند. در جمع این تغییرات یک محیط مناسب برای انگل در سیتوپلاسم سلول میزبان فراهم می کنند که به کار تکثیر انگل می آید [10].
1-2-راه انتقال :
توکسوپلاسما گوندی یک انگل تک یاخته ای است که بیش از یک سوم جمعیت جهان به آن آلوده می باشند. عفونت عمدتا" از طریق غذا وآب الوده با اووسیست های دفع شده بوسیله گربه ها یا از طریق خوردن گوشت خام یا نیم پخته حاوی کیست های بافتی ایجاد می گردد (7و11). اما بطور کلی منبع مهم انتقال عفونت در طبیعت گربه ها و گربه سانان می باشند. گربه های آلوده اووسیست های انگل را از طریق مدفوع دفع می کنند که در خارج از بدن انسان در شرایط مناسب محیطی طی یک تا پنج روز هاگ دار و آلوده کننده می شوند و از طریق مدفوع گربه های آلوده ادامه می یابد که مدت زمان دفع اووسیست طی یک تا سه هفته و ندرتا" تکرار می شود .علی رغم اینکه تعداد گربه های دفع کننده اووسیست در هر زمان زیاد نبوده و معمولا" در اکثر کشورها بیش از 2 % نیست ، اما یک گربه آلوده ممکن است روزانه میلیونها اووسیست دفع نماید .میزان شیوع توکسوپلاسما گوندی در گربه ها به قابلیت دسترسی آنها به پرندگان و پستانداران کوچک که خود از طریق بلع اووسیست آلوده می شوند ، بستگی دارد . بدیهی است در چنین شرایطی خطر عفونت در گربه های روستایی بیشتر از گربه های شهری و در گربه های ولگرد بیشتر از گربه های خانگی خواهد بود (1). انتقال مستقیم انسان به انسان بجز انتقال مادر به جنین گزارش نشده (11و20). علاوه بر این در برخی میزبانها ممکن است همچنین تاکی زوایت ها از طریق شیر مادر به نوزاد منتقل گردند(7). روشهای انتقال آلودگی بر حسب نوع آب و هوای منطقه ، عادات بهداشتی و رژیم غذایی افراد متفاوت می باشد(11). در ایالات متحده آمریکا ، فرانسه و کشورهای غربی مصرف گوشت خام یا نیم پخته راه عمده انتقال عفونت است ، در حالی که آلودگی از طریق بلع اووسیست (ناشی از تماس با گربه) در نواحی گرمسیری متداول تر است(21). با توجه به راههای مختلف انتقال عفونت به میزبان های واسطه ، انسان در هر دوره از حیات خود ، از دوران زندگی جنینی در رحم مادر تا سنین کودکی و بزرگسالی در معرض ابتلا به این عفونت انگلی قرار دارد، اما تا کنون مشخص نشده که کدامیک از راههای انتقال انگل نقش اپیدمیولوژیکی مهمتری دارد(7).
به طور کلی انتقال توکسوپلاسما به میزبانهای واسطه از جمله انسان از راههای زیر صورت می پذیرد :
1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست
آلودگی از طریق بلع اووسیست تنها روش انتقال انگل به علفخواران و یکی از روشهای متداول انتقال توکسوپلاسما به همه چیزخواران و گوشتخواران است. گربه ها معمولا" مدفوع خود را زیر خاک پنهان می کنند ،اما اوسیست ها در اثر آب باران ، حرکت کرم خاکی و عوامل دیگر به سطح زمین آورده می شوند. پرندگان و جوندگان در حین خوردن غذا به اووسیست های اسپوردار آلوده شده و مجددا" گربه ها با شکار این حیوانات و تغذیه از آنها به انگل مبتلا می گردند(7).
1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی
وجود کیستهای نسجی زنده ی توکسوپلاسما در بافت های حیوانات اهلی (بویژه خوک و گوسفند) و وحشی که انسان از گوشت آنها جهت تغذیه استفاده می کند، عامل مهمی در آلودگی انسان به این انگل محسوب می گردد. گزارش های متعددی در ارتباط با توکسوپلاسموزیس ناشی از گوشت آلوده منتشر شده است و برخی از بررسی های سرولوژیک نیز نشان می دهند که مصرف گوشت آلوده نقش مهمتری از بلع اووسیستها به عنوان منشاء عفونت در انسان ایفا می کند(7و22). انسان با خوردن گوشت خام یا سایر فراورده های گوشتی که حرارت کافی ندیده اندآلوده به توکسوپلاسما گوندی می شود(23).
از آنجائیکه فراورده های غذایی نظیر سوسیس و کالباس معمولا" به صورت حرارت دیده وارد بازار می شوند از این جهت آلوده کننده بنظر نمی رسد(23).
1-2-3-انتقال از طریق جفت
انتقال عفونت از مادر به جنین هنگامی اتفاق می افتد که مادر برای اولین بار در دوره حاملگی به عفونت توکسوپلاسمایی مبتلا گردد. در این شرایط توکسوپلاسما گوندی در طی دوره حاد بیماری ، زمانی که
پارازیتمی وجود دارد از جفت عبور کرده و جنین را آلوده می نماید (22).در مواردی نیز ممکن است در مادرانی که قبلا" به عفونت مبتلا گردیده اند ، وجود بیماریهای زمینه ای نظیر لوپوس اریتماتوز که جهت درمان آن نیاز به استفاده از کورتیکواستروئید است ، به علت تضعیف سیستم ایمنی توسط دارو ، عفونت خفته قبلی مجددا" فعال گردیده و انگل از طریق جفت جنین را آلوده می سازد. احتمال انتقال توکسوپلاسما در سه ماهه اول کمتر از سه ماهه دوم و سوم حاملگی است ولی عوارض جنینی در سه ماهه اول حاملگی به مراتب بیشتر خواهد بود(24).

شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط )8(
1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی :
عفونت توکسوپلاسما گوندی در انسان انتشار جهانی داشته، و میزان شیوع آن از ناحیه ای به ناحیه دیگر متغیر است. تعداد نمونه ، سن افراد و روش های آزمایش سرمی ممکن است برخی اختلافات در موارد گزارش شده را توجیه نماید. به نظر می رسد که میزان آلودگی انسان از صفر تا 90% متغیر است. در مطالعه ای توسط آسمار و همکاران که روی 13018 نمونه سرم خون تهیه شده از یازده استان کشور را به طور تصادفی نمونه برداری و با روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم از نظر آنتی بادی مورد بررسی قرار دادند 8/51 % نمونه ها مثبت بودند. بر اساس این مطالعه میزان آلودگی به توکسوپلاسما در استان های جنوبی کشور کمتر از مناطق شمالی بوده است)25(. میزان آلودگی بالغین در ایالات متحده امریکا و انگلستان حدود 30% تخمین زده شده، لیکن در سطح قاره اروپا بالاتر و متفاوت از 50 تا 80% بوده است این میزان در آمریکای لاتین در حدود 51-72% ، در کشورهای آفریقای غربی 54-77% ، در جنوب شرقی آسیا (چین و کره)4-39% و در کشورهایی با آب و هوای سرد مثل کشورهای اسکاندیناوی درحدود 11-28% می باشد)7( .روی هم رفته عفونت در شرایط اقلیمی گرم و در نواحی پست متداول تر از شرایط اقلیمی سرد و نواحی کوهستانی است. احتمالاً این تفاوت به شرایط مناسب اسپورولاسیون و بقای اووسیست ها در محیط وابسته است. تمامی بررسی ها افزایش مداوم میزان شیوع آنتی بادی های ضد توکسوپلاسما را در ارتباط با سن نشان می دهند. در آمریکای شمالی افزایش سریع آلودگی در خلال دوره نوجوانی است، در حالی که در آمریکای مرکزی و جنوبی افزایش مداوم در خلال دوره کودکی اتفاق می افتد. شیوع عفونت بین گروه های قومی متفاوت بوده، اما این تفاوت بیشتر از اختلافات ژنتیکی به بهداشت و عادات طبخ غذا مربوط می گردد. اکثر بررسی ها میزان شیوع بالاتر در روستا را نسبت به شهر نشان داده، لیکن برخی نیز فاقد هر گونه اختلاف است. میزان شیوع در افراد تحت تماس زیاد با خاک و حیوانات بالاتر است. در این خصوص، موارد شیوع عفونت در بین کودکانی که با خاک آلوده به مدفوع گربه ها بازی نموده یا آن را خورده اند، مطرح است. همچنین عفونت توکسوپلاسما گوندی در کارکنان کشتارگاه ها بیشتر است )7(. مواردی از بیماری توکسوپلاسموز در پرسنل آزمایشگاه که حیوانات یا لوازم آلوده آزمایشگاهی را جابجا می کرده اند گزارش شده است. در یک مورد آلودگی به عفونت در جریان یک اتوپسی حاصل گردیده است. در مجموع به جز موارد ابتلاء جنین از طریق مادر و مصرف کیست توکسوپلاسما با گوشت، و یا در کارکنان آزمایشگاه که به طور مستقیم با عوامل بیماری زا تماس دارند، در دیگر موارد اثبات منبع اختصاصی که موجب آلودگی می
گردد تقریباً غیر ممکن است. بر اساس نظریه ژاکوب ممکن است مرحله ای از زندگی و تکامل انگل در خاک انجام شود و این مسئله می تواند تا حدی گویای تغییرات در میزان شیوع عفونت در آب و هوا و خاک های
مختلف باشد (11).
1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی :
عوامل مختلفی که در انتشار گسترده توکسوپلاسما نقش دارند عبارتند از عومل مربوط به انگل ، عوامل مربوط به میزبان و محیط.
1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل :
تعداد اشکال عفونت زا و تنوع راههای انتقال
دوام و بقاء اووسیست های رسیده و کیست های نسجی توکسوپلاسما
قابلیت دفع اووسیست ، بطور معمول دوره دفع اووسیست بوسیله گربه تا یک هفته طول می کشد و ندرتا" این دوره تکرار می شود . البته ممکن است دفع اووسیست بر اثر سوء تغذیه ، عفونت ناشی از ایزوسپورا فلیس یا تجویز کورتیزون تحریک شود (26).
جایگزینی کیست های توکسوپلاسما در نسوج مختلف میزبانان واسط و تعدد کیست ها
چرخه زندگی توکسوپلاسما ، توکسوپلاسما قادر است چرخه زندگی خود را فقط در یک میزبان (میزبان نهایی) طی نماید .
1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان :
تعداد میزبانهای واسط
حساسیت و مقاومت میزبانهای واسطه
وفور و پراکندگی گربه
عدات بهداشتی و غذایی ، در مناطقی که گوشت خام به صورت استیک ، جگر ابدار و همبرگر کم پخته و سایر فرآورده های گوشتی که حرارت کافی ندیده اند ، مصرف می شود ، توکسوپلاسما شیوع بیشتری دارد.
تسهیلات تجاری ، امروزه در یک کشور و حتی بین کشورهای مختلف گوشت و سبزیجات به سهولت از نقطه ای به نقطه دیگر منتقل می شود . این عامل می تواند سبب انتشار توکسوپلاسما در نقاطی شود که حتی عاری از گربه ها می باشند.
1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط :
عفونت در شرایط اقلیمی گرم و نواحی پست شایعتر از شرایط اقلیمی سرد و نواحی کوهستانی است. همچنین در نواحی مرطوب شیوع عفونت بیش از نواحی خشک است .رطوبت و گرمای مناسب دو عامل محیطی مطلوب برای هاگ دار شدن اووسیست های توکسوپلاسما محسوب می شوند. از سویی گرمای زیاد ، خشکی و برودت از تکامل اووسیست های توکسوپلاسما جلوگیری می کند (27).
1-4-آنتی ژنهای توکسوپلاسما گوندی :
از سالها پیش آنتی ژنهای مختلف غشایی و سیتوپلاسمی توکسوپلاسما گوندی شناخته شده اند و تفاوت آنها مورد بررسی قرار گرفته است . تحقیقات فراوانی جهت شناسایی آنتی ژنهای تاکی زوایت با استفاده از آنتی بادی های تک دودمانی ،مواد نشاندار رادیواکتیو و ایمنوبلاتینگ بررسی های موتانت های مختلف آن صورت گرفته است . این آنتی ژنها وزن ملکولی بین 10 تا 80 کیلودالتون دارند (28).بیشتر آنها ساختمان پروتئینی و برخی از آنها ساختمان گلیکوپروتئینی و لیپوپلی ساکاریدی دارند. تجزیه وتحلیل های ایمنوشیمیایی با استفاده از روش SDS-PAGE وجود پنج آنتی ژن اصلی سطحی با وزن ملکولی 22 ، 23 ، 30 ، 35 و 43 کیلودالتونی را که بصورت P22,P23,P30,P35,P43 نامگذاری شده اند نشان می دهد. همه این آنتی ژنهای پروتئینی از طریق پیوند های گلیکوزیل – فسفاتیدیل اینوزیتول به غشاء سلولی انگل متصل هستند (29). مشخص شده است که فراوانترین پروتئین سطحی در تاکی زوایت انگل P30 است که وزن ملکولی آن تحت شرایط احیاء 35-30 کیلودالتون و تحت شرایط غیر احیاء 28-27 کیلودالتون می باشد و در بیشتر سویه های انگل وجود دارد و پاسخهای آنتی بادی IgG,IgA ,IgM را سبب می شود .این پروتئین که 5 درصد کل پروتئین تاکی زوایت را تشکیل می دهد بطور یکنواخت بر روی سطح و داخل تاکی زوایت و داخل واکوئل حاوی انگل وجود دارد. با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال و روشهای ایمنوفلورسانس و ایمونوالکترون میکروسکوپی ، آنتی ژن 5-4 کیلودالتونی را در سطح تاکی زوایت توکسوپلاسما تشخیص دادند. این آنتی ژن که دارای وزن ملکولی پایین می باشد ، باعث ایجاد ایمنی سریع و برجسته همراه با تولید IgM می گردد . بنابر این آنتی ژن یک نشانگر مناسب در دوره حاد بیماری توکسوپلاسموزیس محسوب می شود (29). همچنین آنتی ژن ترشحی این انگل نیز شناسایی و توصیف شده است . این آنتی ژن نیز در مرحله حاد بیماری در گردش خون وجود دارد و مقادیر اندک آن (حدود نانوگرم) نیز با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال و روش ELISA قابل تشخیص است و حتی قبل از تولید آنتی بادی در خون وجود دارد بنابر این ردیابی این آنتی ژن در تشخیص مرحله حاد بیماری ارزش دارد (30).
هر یک از اشکال توکسوپلاسما در دیواره خود واجد تعدادی از آنتی ژنهای اختصاصی هستند ، چنانچه دو پروتئین اصلی غشاء یعنی P62 و P72 در اسپوروزوئیت شناسایی شده اند ولی در تاکی زوایت وجود ندارند (31و32). آنتی ژنهای سیتوپلاسمی با وزن ملکولی 10 کیلودالتون نسبت به حرارت مقاوم است و در آزمایش IHA دخالت دارد . تریپسین در مجاورت با تاکی زوایت 2 تا 3 آنتی ژن عمده واکنش دهنده با IgM (32 و 22 کیلودالتون) را از بین برد، اما هیچیک از آنها بر روی ماهیت جزء 6 کیلودالتون اثری نداشتند (33). بر اساس بررسی شرما و همکاران باند قوی و شدیدا" رنگی با آنتی ژن 6 کیلودالتون آشکار شده است . IgA الگویی تقریبا" مشابه IgM نشان داده و باندهای 25 ، 30 ، 32 ، 35 ، 40 و 50 کیلودالتون در مراحل زودرس بیماری آشکار گردید. در این مطالعه در هفته 45 پس از آلودگی هیچ باندی با IgA و IgM آشکار نگردید (33).
1-5-واکسیناسیون :
واکسیناسیون ، بهترین و موفق ترین روش برای جلوگیری از بیماریهای عفونی است . واکسن با القای دگرگونی سلولهای ایمنی به سلولهای اجرایی دارای عمر طولانی و سلولهای خاطره ای ، سبب ایجاد ایمنی حفاظتی در مقابله با عفونت ها می شود . بیشتر واکسنهایی که امروزه در دسترس هستند و کاربرد دارند ، پاسخهای ایمنی هومورال را بر می انگیزند . همچنین تلاش برای برانگیختن پاسخ های ایمنی سلولی با واکسیناسیون ادامه دارد. یک واکسن توکسوپلاسما گوندی می تواند با ایمن کردن انسان از ایجاد بیماری جلوگیری نماید. همچنین در حیوانات واکسن با ممانعت از بیماری از خسارت ناشی از آن جلوگیری می نماید . در اروپا و نیوزیلند از یک سوش S48 زنده توکسوپلاسما گوندی جهت واکسیناسیون گوسفندان استفاده می شود اما این سوش به منظور ایمن سازی انسان مناسب نمی باشد (41).نتیجه واکسیناسیون وابستگی زیادی به نحوه شکل گیری ، دوز و راه تجویز واکسن ، گونه و حتی سوش میزبان دارد . بیشتر کارهای انجام شده بر روی ملکول انگل جهت تولید یک واکسن متعلق به 4 خانواده اصلی پروتئین ها می باشد که شامل : 1- آنتی زنهای سطحی مثل P30 یا انتی ژن سطحی تاکی زوایت (SAG) 2- آنتی ژنهای دفعی ترشحی گرانولهای متراکم 3- آنتی زنهای میکرونم 4- آنتی ژنهای روپتری می باشد (43).بین آنتی ژنهای کیست ، آنتی ژنهای برادی زوایت BAG1 و MAG1 مناسب واکسن بوده و در طی مرحله مزمن عفونت انگلی بطور مشخص وجود دارند.
اخیرا" واکسنهای نوترکیب ژنی (DNA & RNA Vaccine) با بیان چند آنتی ژن همراه با پلاسمید های کد کننده فاکتور محرک کلنی در مدل حیوانی (موش) جهت ایمنی زایی این حیوانات انجام گرفته است که قادر به ایجاد یک محافظت معنی دار بر ضد عفونت حاد و مزمن و یک محافظت مختصر بر ضد توکسوپلاسموزیس مادر زادی می باشد .اگر چه تهیه mRNA مشکل است و از پلاسمید DNA کمتر پابرجاست ، اما ایمنی زایی با cDNA می تواند هر دو پاسخهای ایمنی هومورال و با واسطه سلولی را القاء کند که هر دو آنها در ایجاد ایمنی بر ضد توکسوپلاسما گوندی لازم هستند(44).
1-6- بیماریزایی :
در اکثر موارد عفونت های توکسوپلاسمایی هیچگونه نشانه و تظاهر بالینی مشخصی در بر ندارند یا تعداد اندکی از آنها دارای علاءم مشخصی می باشند که عموما" خود محدود شونده اند و از این رو بسیاری از موارد عفونت بدون تشخیص باقی می ماند . سیر بیماری در افرادی که از نظر سیستم ایمنی طبیعی هستند ، معمولا" خوش خیم است . به هر حال دوره نهفتگی توکسوپلاسموزیس اکتسابی بین 4 تا 21 روز ( بطور متوسط 7 روز ) تخمین زده شده است(44).گزارشات متعددی نشانگر شیوع گسترده عفونت توکسوپلاسمایی در حیوانات اهلی ، وحشی و انسان است ، اما چنانچه ژاکوب در سال 1956 بیان نموده ، علیرغم دریای وسیعی از عفونت توکسوپلاسمایی که اطراف ما را در بر گرفته موارد بالینی نسبتا" اندکی از بیماری اتفاق می افتد . اگر چه توکسوپلاسموزیس حاد بدون علامت نقش بسیار مهمی در ایجاد عفونت های مادرزادی در
انسان و گوسفند ایفاء می کند ، اما نمی توان اهمیت عفونت های توکسوپلاسمایی مزمن بدون علامت در
انسان را نیز نادیده انگاشت زیرا این عفونت ها در صورت تضعیف سیستم ایمنی ، خطر شعله ور شدن
عفونت به صورت " حاد " و در مواردی " فوق حاد" وجود دارد. توکسوپلاسما گوندی به عنوان یک انگل اجباری داخل سلولی از طریق جریان خون به بسیاری از اعضاء و بافت های بدن منتشر می گردد و سر انجام در تمامی آنها به سلولهای بافتی حمله ور می شود و با تکثیر گسترده در این سلولها موجب انهدام سلولهای آلوده می شود . تکثیر تاکی زوایت های توکسوپلاسما در سلولهای بافتی موجب مرگ سلولهای گرفتار و پدید آمدن کانونهای نکروز در بافت می گردد . این کانونها عمدتا" توسط لمفوسیتها ، مونوسیت ها و پلاسماسل ها محصور میگردند . در این مرحله از عفونت پارازیتیسم به اوج خود رسیده و ممکن است موجب از پای درآمدن میزبان گردد . در خلال اوج این مرحله ممکن است ارگانیسم در ترشحات و مواد دفعی نظیر ادرار ، مدفوع ، شیر ترشحات ملتحمه چشم و حتی بزاق نیز یافت شود ، اما این اشکال انگلی توانایی ماندگاری چندانی در محیط های آزاد خارج از بدن را ندارند بطوریکه در مرحله حاد عفونت شواهد چندانی در مورد احتمال انتشار توکسوپلاسموزیس از یک حیوان به حیوان دیگر هنگامی که حیوانات در یک فضای بسته نگهداری می شوند ، وجود ندارد( بعنوان مثال موشهای نگهداری شده در یک قفس ). شکل تحت حاد توکسوپلاسموزیس با پیدایش آنتی بادی های انگلی همراه است . این آنتی بادی ها می توانند موجب پاک سازی خون و بافت ها از تاکی زوایت های انگلی گردند (40و10). غالبا" پس از خون بافت هایی نظیر کبد ، طحال و ریتین از انگل پاک می شود و سپس محو تاکی زوایت های انگلی از مغز و متعاقب آن قلب صورت می پذیرد. در این مرحله از عفونت تحریک سیستم ایمنی توسط انگل موجب ظهور عوامل ایمنی زا گردیده و انگل برای فرار از تاثیرات سیستم ایمنی به اندامها و بافت های مختلفی بویژه عضلات و مغز وارد می شود و در این اندامها کیست های نسجی تشکیل می گردد . تشکیل این کیست ها و جایگزینی برادی زوایت ها در داخل آن نشانه ای بارز از عفونت مزمن توکسوپلاسمایی است . این مرحله از حیات انگل ممکن است تا مدتهای مدیدی در میزبان بدون بروز هر گونه علائم و تظاهرات بالینی پایدار بماند به گونه ای که این زمان در" سگ " تا ده ماه و در " رات ، موش و کبوتر " تا بیش از سه سال بعد از عفونت گزارش شده است . عفونت توکسوپلاسمایی در اکثر بالغینی که از سیستم ایمنی سالم و طبیعی برخوردارند( به علت پیدایش
آنتی بادی های خارج سلولی ، عوامل داخل سلولی وابسته به لمفوسیتهای T و ایجاد ایمنی محافظت کننده موثر) غالبا" بدون علائم و نشانه های اختصاصی است . همچنین به نظر می رسد " اینترفرون گاما با منشاء داخلی " یک واسطه مهم در مقاومت میزبان بر علیه توکسوپلاسما باشد . پایداری عفونت فعال توکسوپلاسمایی در سیستم اعصاب مرکزی و چشم در مقایسه با سایر اندامها و بافتها طولانی تر است . جایگزینی انگل در مغز می تواند منجر به پیدایش کانون های نکروتیک منتشر و بسیار کوچکی گردد که در مراحل بعد به موازات کلسیفیه شدن آنها در کلیشه های رادیوگرافی تصویری قابل روئیت و نسبتا" مشخص ایجاد می نماید. " رتینوکوروئیدیت یا کوریورتینیت " توکسوپلاسمایی یکی از عوارض بسیار مهم توکسوپلاسموزیس است که ممکن است به علت پاسخ " افزایش حساسیت تاخیری " میزبان نسبت به پاره شدن کیست و یا به عنوان یک عارضه مزمن پیشرونده ی ناشی از تکثیر تاکی زوایت ها در شبکیه چشم ( که دارای سیستم دفاعی ضعیفی است) ایجاد گردد.
1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی
مهمترین فرم بیماری ناشی از آلوده شدن به توکسوپلاسما گوندی ، فرم مادرزادی آن می باشد.توکسوپلاسموزیس مادرزادی وقتی اتفاق می افتد که مادر در دوران حاملگی به فرم حاد بیماری مبتلا شود و یا در معرض مخاطره ضعف سیستم ایمنی باشد و به سبب آلودگی قبلی به توکسوپلاسما گوندی انگل در او فعال شده و جنین در خطر ابتلاء به توکسوپلاسموزیس مادرزادی قرار گیرد.زمانی که مادر دچار پارازیتمی است ، در شرایطی که ایمنی سلولی در جنین هنوز کامل نشده است ، جنین به عفونت های داخل سلولی مانند عفونت توکسوپلاسمایی حساس می باشد . بیشتر مادرانی که در حین حاملگی آلوده می شوند بدون علائم بیماری هستند (22).مجموعه تعداد توکسوپلاسموزیس مادرزادی حدود 30%موارد عفونت حاد در دوره بارداری را شامل می شود ، اما نرخ عفونت از 6% در هفته سیزدهم تا 72% در هفته سی و ششم بارداری متغیر است. چنانچه ابتلاء مادر به به عفونت در مراحل اولیه بارداری (در چهار هفته اول ) اتفاق افتد احتمال آلودگی جنین تنها 1% خواهد بود که با پیشرفت دوره بارداری این احتمال افزایش می یابد . به گونه ای که احتمال ابتلای جنین در سه ماهه اول ، دوم و سوم حاملگی به ترتیب 10 تا 25% ،30 تا 54% و 60 تا 65% می باشد ، اما بیشترین عوارض ناشی از توکسوپلاسموزیس در سه ماهه اول حاملگی رخ می دهد که شامل سقط جنین طبیعی ، تولد زود هنگام ، هیدروسفالی ، میکروسفالی می باشد . فراوانترین ناهنجاری های شدید در طی عفونت اکتسابی مادر بین هفته دهم و بیست و چهارم بارداری رخ می دهد (45). شدت آلودگی جنین رابطه عکس با شانس ابتلاء دارد چنانچه مادران در مراحل اولیه بارداری آلوده شوند هر چند شانس ابتلای جنین کم است ولی ضایعاتی که ایجاد می کندبسیار شدید است زیرا سیستم اعصاب مرکزی در حال تشکیل می باشد . بر عکس در سه ماهه سوم بارداری که خطر انتقال به جنین بیشتر است ، تقریبا" غالب نوزادان متولد شده فاقد علائم آشکار بیماری می باشند. شیوع توکسوپلاسموزیس مادرزادی در جهان از 3 تا 8 مورد در 1000 تولد زنده بر حسب راه انتقال ، اقلیم ، رفتار فرهنگی ، عادات غذایی و استانداردهای بهداشتی متغیر می باشد . به طور مثال توکسوپلاسموز مادرزادی در کشور فرانسه بین 2 تا 3 مورد در 1000 تولد زنده و در کشور آمریکا بین 1 در 1000 تا 1 در 10000 تولد زنده رخ می دهد.

1- 6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی
1-8-تظاهرات بالینی
اگر چه معمولا" وقوع عفونت های توکسوپلاسمایی در بالغین و کودکان بدون بروز هر گونه نشانه و تظاهرات بالینی است ، اما بعضی مواقع ممکن است ابتلاء به این انگل موجب بروز یک عفونت حاد سیستمیک و
گسترده گردد. در این شکل در 30-10 درصد از موارد علائم و نشانه های بالینی بیماری ظاهر می شود . در چنین مواقعی شایعترین علامت بالینی بیماری "لنفادنوپاتی" است که ممکن است در 70-30 درصد موارد مشاهده شود و غدد لنفاوی سطحی یا عمقی نواحی مختلف بدن را گرفتار سازد و با دردهای عضلانی ناشی از آماس ماهیچه ها یا آماس پوست و ماهیچه همراه باشد (27).اما عمدتا" تورم غدد لنفاوی بویژه در ناحیه خلف گردن مشهود تر است اما غدد لنفاوی در هر نقطه از بدن ممکن است مبتلا شوند . غدد لنفاوی گرفتار قوامی نرم داشته فاقد ترشحات چرکی می باشند و اندازه آنها بندرت از 3 سانتیمتر تجاوز می نماید . آدنوپاتی های توکسوپلاسمایی غالبا" خود محدود شونده اند و در مدت کمتر از 12 ماه بهبود می یابند ، اما گاهی غدد لنفاوی برای ماهها بزرگ و کوچک شده و ممکن است مدتها متورم باقی بمانند . تب خفیف ، ضعف ، درد عضلات ، عرق شبانه ، گلودرد ، راشهای ماکولوپاپولر ، هپاتواسپلنومگالی و شکم درد به علت گرفتاری غدد لنفاوی مزانتریک و رتروپریتونال و در مواردی کوریورتینیت نیز ممکن است از علائم دیگر این شکل از بیماری باشند. گاه پیدایش تظاهراتی نظیر لرز ، تب ، سردرد ، درد عضلات ، تورم غدد لنفاوی و بی حالی شدید می تواند تصویری مشابه با منو نوکلئوز عفونی ایجاد کند. در مواردی از توکسوپلاسموزیس حاد گاه هپاتیت ، آنسفالومیلیت و میوکاردیت نیز بوقوع می پیوندد (7و11). در بیماران مبتلا به نقص سیستم ایمنی از جمله بیماران مبتلا به ایدز شایعترین تظاهرات بالینی توکسوپلاسموزیس مربوط به گرفتاری مغز، قلب ، ریه و چشم می باشد. شعله ور شدن عفونت های مزمن توکسوپلاسمایی در سیستم اعصاب مرکزی از شایعترین علل انسفالیت در این گروه از بیماران محسوب می شود که یکی از علل عمده مرگ و میر و معلولیت در مبتلایان به ایدز است (34). بر اساس شواهد موجود بیش از 50-10 درصد از بیماران مبتلا به ایدز که واکنش سرمی آنها از نظر ابتلاء به توکسوپلاسما مثبت و شمارش لمفوسیت های T آنها با نشانگرهای (CD4) کمتر از یکصد سلول در هر میکرولیتر است به آنسفالیت توکسوپلاسمایی گرفتار می شوند . این عارضه ممکن است با نشانه هایی نظیر سردرد ، اختلال حواس ، عدم تعادل در هنگام راه رفتن ، فلج نیمی از بدن و کوریورتینیت تظاهر نماید. در چنین شرایطی افزایش لمفوسیت های مایع نخاعی ، وجود آنتی بادیهای ضد انگلی از رده IgG در سرم بیماران و اثبات ضایعاتی در کلیشه های تهیه شده از مغز در " سی تی اسکن " تا حدود بسیاری نشان دهنده ابتلاء فرد به آنسفالیت توکسوپلاسمایی است . علاوه بر این مشاهده کانون های نکروتیک همراه با وجود انگل در مقاطع بافتی تهیه شده از مغز ، اثبات وجود انگل در مایع نخاعی و همچنین افزایش IgG مایع مغزی – نخاعی بدون افزایش سطوح IgG سرمی نشاندهنده ابتلاء فرد به انسفالیت توکسوپلاسمایی است . در اکثریت مبتلایان به این شکل از بیماری فقدان آنتی بادی رده IgM و یا تغییر در سطوح آنتی بادی رده IgG سرمی بیشتر نشانگر آن است که علت بیماری شعله ور شدن یک عفونت خفته مزمن است تا ابتلاء به عفونت اکتسابی اولیه (11). در بیماران مبتلاء به توکسوپلاسموزیس مغزی که دچار نقص سیستم ایمنی هستند و یا بیمارانی که سیستم ایمنی آنها با داروهای مهار کننده تضعیف شده است غالبا" اشکال تاکی زوایتی انگل مشاهده می شود . همچنین در مواردی ، در بیماران مبتلا به ایدز ممکن است توکسوپلاسموزیس با گرفتاری طناب نخاعی همراه باشد که در چنین شرایطی تخریب سلولهای بافت نخاع می تواند منجر به بروز تظاهرات مربوطه گردد (24). چون در افراد مبتلا به ایدز میکروارگانیسم های دیگر مانند کریپتوکوکوس نئوفورمنس ،مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و آسپرژیلوس هم ممکن است باعث مننگوآنسفالیت گردند، لذا تشخیص افتراقی آنها از توکسوپلاسما گوندی حائز اهمیت است. توکسوپلاسموزیس ریوی یکی دیگر از اشکال بیماری است که غالبا" در مبتلایان به نقص سیستم ایمنی ایجاد می گردد و با تظاهرات تنفسی نظیر سرفه ، تنگی نفس و تب طولانی مدت همراه است . یافته های رادیوگرافی و بالینی در توکسوپلاسموزیس ریوی همانند پنومونی ناشی از پنوموسیستیس کارینی بوده و ممکن است از پنوموسیستوزیس غیر قابل تمایز باشد (45 و 42). این عارضه در صورت عدم درمان به موقع در بیش از 35 درصد موارد منجر به مرگ بیمار می گردد. در مواردی توکسوپلاسموزیس با تظاهرات چشمی خود نمایی می کند . غالبا" این تظاهرات ناشی از وقوع کوریورتینیت است که با درد چشم و کاهش قدرت بینایی همراه می باشد . کوریورتینیت یکی از عوارض مهم توکسوپلاسموزیس است که در غالب موارد منشاء مادرزادی دارد . غالبا" این شکل از بیماری در سالهای ابتدایی پس از تولد علائم و تظاهرات مشخصی نداشته ، اما به تدریج طی دهه ی دوم و سوم زندگی آثار آن بروز می نماید . همچنین این فرم از بیماری در شکل اکتسابی هم ممکن است دیده شود . کوریورتینیت حاد می تواند با علائمی چون ضعف بینایی ، اسکوتوماتا ، درد ، آپی فوریا ، ترس از نور و در صورت گرفتاری ماکولا اختلال دید مرکزی همراه باشد و اگر چه درمان بیمار موجب از بین رفتن التهاب و بهبود بینایی می گردد ف اما بیمار هیچگاه بینایی کامل خود را باز نمی یابد . در چنین شرایطی در فوندوسکوپی ضایعات نکروزان متعدد یکطرفه یا دو طرفه مشاهده می گردد و در ده درصد موارد امکان گرفتاری " ویتره " و عصب بینایی وجود دارد . همچنین در 63 درصد از بیماران مبتلا به کوریورتینیت توکسوپلاسمایی احتمال بروز آنسفالیت توکسوپلاسمایی وجود داشته و در 30-13 درصد مبتلایان به این شکل از بیماری احتمال عود کوریورتینیت وجود دارد(11). تورم بیضه یا ارکیت توکسوپلاسمایی یکی از عوارض ابتلاء به توکسوپلاسموزیس است که بطور نادر در برخی از مردان رخ می دهد .این شکل از بیماری غالبا" با پیدایش یک توده ی غیر حساس به لمس در بیضه ها خودنمایی می کند و در مبتلایان به ایدز چندین روز قبل از وقوع آنسفالیت توکسوپلاسمایی ظاهر می گردد (11).توکسوپلاسما گوندی گاه در مبتلایان به ایدز می تواند موجب گرفتاری عضله قلب ، عضلات اسکلتی و یا لایه های عضلانی لامینا پروپریای دستگاه گوارش و یا عضلات اسکلتی گردد. در مواردی ممکن است به علت مهار یا تضعیف سیستم ایمنی عفونت های اولیه توکسوپلاسمایی به شکل فوق حاد بروز نماید . علاوه بر این شعله ور شدن توکسوپلاسموزیس در افرادی که سیستم ایمنی آنها توسط تجویز داروهای مضعف سیستم ایمنی مهار گردیده مکررا" مشاهده شده است . تصویر بالینی توکسوپلاسموزیس مادرزادی تا حدودی با توکسوپلاسموزیس اکتسابی متفاوت است ، بدان معنی که در اکثریت مبتلایان ، بیماری بصورت حاد بروز می نماید . سقط جنین ، مرده زایی ، کوریورتینیت ، آنسفالومیلیت ، هیدروسفالی ، میکروسفالی و بسیاری از عوارض دیگر از پیامدهای این شکل از بیماری است . با مشاهده چنین تظاهراتی در نوزادان می توان ابتلاء آنان به توکسوپلاسموزیس را بسیار محتمل دانست." انسفالیت توکسوپلاسمایی " معمولا" همراه با پیدایش کانونهای کلسیفیکاسیون در سیستم اعصاب مرکزی است . این کانون ها غالبا" در کلیشه های رادیوگرافی مشهود و قابل روءیت می باشند . عفونت توکسوپلاسمایی در نوزادان تازه متولد غالبا" با تب ، پنومونی و بزرگی طحال و کبد خود نمایی می کند . در این موارد بروز تشنج در نوزادان امری معمول بوده و بهبودی بندرت حاصل می گردد . در این گروه از مبتلایان وقوع عفونت های توکسوپلاسمایی در سیستم اعصاب مرکزی غالبا" منجر به کوری یا اختلالات بینایی و عقب افتادگی ذهنی می گردد . تصور می شود درصد اندکی از عفونت های سیستمیک خفیف تر با بهبودی کامل همراه باشد ، اما حتی در این گروه از مبتلایان نیز نشانه های " کوریورتینیت توکسوپلاسمایی " سالها پس از ابتلاء که بیماری تظاهر می یابد . گزارشات نسبتا" زیادی وجود یک ارتباط سبب شناختی بین " پلی میوزیت " و توکسوپلاسموزیس را نشان می دهد ( 11 ).
1-9-تشخیص توکسوپلاسموز
بطور کلی عفونت توکسوپلاسما گوندی یا به طور غیر مستقیم با روش های سرولوژیکی ویا بطور مستقیم به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، جداسازی انگل و مشاهده انگل با روش های هیستولوژی (بافت شناسی) تشخیص داده می‌شود. نشان دادن آنتی ژن در خون و مایعات بدن روش دیگر تشخیصی است که به ندرت استفاده می شود )48و11(.
در چهار گروه از اشخاص تشخیص توکسوپلاسموز حائز اهمیت می باشد که عبارتند از:
-زنان باردار مبتلا به عفونت اولیه
-جنین و نوزادان دارای عفونت مادرزادی
-بیماران دارای نقص ایمنی
-افراد مبتلا به رتینوکورئیدیت )5(.
1-9-1- تشخیص مستقیم
تشخیص مستقیم شامل روش هایی است که مستقیماً خود انگل یا DNA آن را در بافت، خون یا مایعات بدن فرد مبتلا شناسایی می کنند و به منظور تشخیص قطعی در اشخاص دارای نقص سیستم ایمنی و همچنین تشخیص عفونت در مادران باردار استفاده می‌شود (49).

–258

(1-10-1 پروتئین 2B ......................................................................................................................................................................... 27
(2-10-1 پروتئین 2C ......................................................................................................................................................................... 27
(3-10-1 پروتئین 3AB .................................................................................................................................................................. 27.(4-10-1 پروتئین فرعی سلول ........................................................................................................................................................... 28.
(5-10-1 پروتئین متصل کننده پرایمر برای سنتز RNA ........................................................................................................... 28.
(11-1 محل سنتز RNA در سلول ..................................................................................................................................................... 29
(12-1 چگونگی تشخیص RNA ویروسی و سلولی از یکدیگر ..................................................................................................... 31
(13-1 مرحله تجمع و تشکیل ذرات عفونی ...................................................................................................................................... 32
(14-1 پاراکوویروس ................................................................................................................................................................................33
(1-14-1 جداسازی و خصوصیات اولیه پاراکوویروس ...................................................................................................................... 33
(2-14-1 پروتئین های پاراکوویروس .................................................................................................................................................. 34
(3-14-1 پردازش پروتئین در پاراکوویروس ها ................................................................................................................................. 35


(4-14-1 توالی 5´-UTR در پاراکوویروس ها ................................................................................................................................... 36
(5-14-1 ارتباط ژنتیکی پاراکوویروس ها با پیکورنا ویروس های دیگر ....................................................................................... 38
(6-14-1 تداخلات بین HPeV1-2 با سطح سلولهای حساس ...................................................................................................39
(7-14-1 عوارض کلینیکی و اپیدومیولوژی پاراکوویروس ها .......................................................................................................... 41
(8-14-1 ویروس های مرتبط با پاراکوویروس ها در حیوانات ....................................................................................................... 41
جداول:
جدول 1) اعضای خانواده پیکورنا ویریده ............................................................................................................................................ 4
جدول 2) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس .............................................................................. 19
جدول 3) میزان تشابه توالی اسیدهای آمینه بینHPEV-1 وHPEV-2 ....................................................................43…….
جدول 4) تهیه محیط کشت....................................................................................................................................................................55
جدول 5) تهیه محلول های مورد نیاز برای استخراج پلاسمید..........................................................................................................57
جدول 6) توالی و موقعیت پرایمرهای طراحی شده برای ناحیه5´ UTR ................................................................................... 59
جدول 7) نتیجه مقایسه سکانس توالی های 5UTR با بانک ژنی به روش blast............................................................................ 65
جدول 8 )نتایج blast محصول PCR .................................................................................................... ....................................................73
جدول 9- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR...................76
جدول10 - فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب جنس….………...76
جدول11- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب سن..…….………...76
جدول 12- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب فصل…..………....76
نمودار:
نمودار1- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR………..…....77
نمودار-2 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب جنس……………...77
نمودار-3 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب سن……..…….....78.
نمودار4 - فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب فصل……..……...78
اشکال:
شکل 1) نمای شماتیک کپسید ویروس ها ........................................................................................................................................ 9…..
شکل 2) دیاگرام شماتیک 8 زنجیره β ………………………………………………….. ............................................................. 11
شکل 3) مدلی از پولیوویروس تیپ 1 .………………………………………………………………………. .............................. 11
شکل 4) تداخلات میریستات با پروتئین های سطح ویروس ........................................................................................................... 13
شکل 5) تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروس ها ................................................................................................................................ 13
شکل 6) دو تیپ اصلی از IRES در پیکورنا ویروس ها ..................................................................................................................... 15
شکل 7) چرخه تکثیر پیکورناویروس ...................................................................................................................................................... 17
شکل 8) تصویر شماتیکی از Canyon …………………………………………………………………… …… .........................20
شکل 9) شکاف Canyon و نحوه قرار گرفتن دارو در VP1 ............................................................................................................ 20
شکل 10) مدل دخول پیکورنا ویروسها به درون سلول ...................................................................................................................... 22
شکل 11) مکانیسم فرضی برای عبور RNA پیکورنا ویروس ها از عرض غشا .......................................................................... 22
شکل 12) تصویر سه بعدی از 3C pro ویروس هپاتیت A ، 2A pro رینو ویروس و FMDV Lpro ................................. 25…..
شکل 13) نحوه اتصال vpg به ابتدای ژنوم پیکورنا ویروسها، محل کلیواژ vpg.................................................................... 29…...
شکل 14) سنتز RNA و ترجمه پروتئین .............................................................................. ........................................................... 30
شکل 15) مدل سنتز ssRNA پولوویروس ....................................................................................................................................... 31
شکل 16) مراحل ساخته شدن واحدهای ساختمانی و عملکرد 3CD pro در این مرحله ........................................................ 32
شکل 17) مراحل مرفوژنز پیکورنا ویرس ها ....................................................................................................................................... 33
شکل 18) کلیواژ اولیه پروتئین پیکورنا ویروس ها ........................................................................................................................... 36
شکل 19) دیاگرام شماتیک ساختار ثانویه .......................................................................................................................................... 37
شکل 20) دندروگرافی براساس پروتئین VP3 در پیکورنا ویروس ها .......................................................................................... 38
شکل 21) مقایسه توالی اسید آمینه ای در انتهای کربوسیلی از VP1 در بین پاراکوویروس ها و CAV ............................ 39.
شکل 22) نتایج Plaque assay پاراکوویروس انسانی تیپ 1 ..................................................................................................... 40
شکل 23) ارتباط فیلوژنیک بین پاراکوویروس ها و ایزوله های تازه جداشده از ویروس L jungan درحیوانات.................42
فصل اول
کلیات.................................................................................................................................................................................................44
بیان مساله.......................................................................................................................................................................45
(2-1 فرضیه...................................................................................................................................................................................................46 . (3-1اهداف تحقیق................................................................................................................................................................................... 47
1-4)ضرورت انجام تحقیق...........................................................................................................................................................................47

فصل دوم
مروری بر متون گذشته...............................................................................................................................................................................48
فصل سوم
مواد و روش ها..................................................................................................................................................................................51
(1-3آماده سازی میکروتیوب و سرسمپلرها..........................................................................................................................................52
(2-3 مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون ...............................................................................................................................................52
(3-3 جداسازی RNA و ساخت cDNA..............................................................................................................................................53
(4-3سنتز cDNA.......................................................................................................................................................................................54
3-5) Compatent.....................................................................................................................................................................................55
3-6) ترا نسفورم.............................................................................................................................................................................................56
Mini prep protocol ( 7-3 (استخراج پلاسمید)...........................................................................................................................58
PCR (8-3.....................................................................................................................................................................................................58
(9-3 روش تهیه ژل آگارز...........................................................................................................................................................................60
(10-3 روش آماده سازی مارکر 1kb......................................................................................................................................................60
11-3)تکنیک الکتروفورز.............................................................................................................................................................................61
(12-3تهیه بافر الکتروفورز 1x..................................................................................................................................................................61
(13-3روش استخراج DNA‌از ژل .......................................................................................................................................................61
فصل چهارم
نتایج.........................................................................................................................................................................63
مقایسه blast برخی توالی های مثبت با توالی موجود در بانک ژنی...............................................................................................66
فصل پنجم
بحث و نتیجه گیری.......................................................................................................................................................................79
بحث.................................................................................................................................................................................................80
نتیجه گیری....................................................................................................................................................................................84
توصیه ها و پیشنهادات.................................................................................................................................................................85
منابع....................................................................................................................................................................86
خلاصه انگلیسی..............................................................................................................................................100. اختصارات:
+ssRNA:plus sense single stranded RNA
EMCV:Encephalomyocarditis virus
FMDV:Foot and mouth disease virus
HPEV1,2:Human parechovirus type 1 and 2
cDNA:Complementary DNA
PCR:Polymerase chain reaction
HAV:Hepatitis A virus
CPE:Cytopathic effect
ICAM-1:Intercellular adhesion molecule -1
VPG:Viral protein genome linked
mRNA:Messenger RNA
IRES:Internal ribosome entry site
ORE:Open reading frame
PVR:Poliovirus receptor
RE:Restriction enzyme
RI:Replication intermediate
RF: Replication form
IPTG:Isopropyl-β-D-thiogalactoside
DAF:Decay-accelerating factor
WHO:World health organization

خلاصه:
پار اکو ویروس انسانی که به خانواده پیکورنا ویروس ها تعلق دارد, بدون غشا بوده و دارای ژنوم RNAتک رشته با قطبیت مثبت می باشد . اندازه ژنوم این ویروسKb 4/8 - 2 /7می باشد. این ویروس با بروز عفونت های گوارشی و تنفسی و گاهی عفونت های سیستم اعصاب مرکزی مرتبط است. از آنجا یی که هیچ اطلاعات درستی در مورد ژنوتایپ این ویروس در ایران وجود نداشته است این مطالعه به منظور تشخیص سریع , تعیین ژنوتایپ این ویروس در نمونه های مدفوع کودکان ایرانی زیر چهار سال مبتلا به گاستروآنتریت طراحی شده است. RNA از سوسپانسیون مدفوع استخراج شده وcDNA تهیه گردید و nested PCR با پرایمرهای اختصاصی انجام شد و محصول PCRاز ژل آگارز استخراج و تعیین توالی گردید . نتایج نشان داد که تکنیک RT-PCR برای تشخیص مستقیم HPeV در نمونه های کلینیکی کاربردی تر, حساس تر , سریعتر از روش کشت سلولی می باشد. این موضوع تایید میکند که روش RT-PCR روشی برتر برای تشخیص این ویروس درزمانی کوتاهتر و با هزینه کمتر می باشد. همچنین تشخیص سریع می تواند مانع مصرف بی رویه آنتی بیوتیک گردد.
کلمات کلیدی : پیکورناویروس- پاراکوویروس انسانی- گاستروآنتریت

مقدمه

1-1 )تاریخچه پیکورنا ویروس:
پیکورنا ویروس ها دلیل نام آنها کوچکی آنهاست که پیکو(Pico) به زبان آلمانی به معنای کوچک است یعنی ویروسهای کوچک RNA دار, و پاراکوویروس از خانواده پیکورنا ویروس ها می باشد.
پیکورنا ویروس ها، ویروس های کروی شکلی هستند که دارای ژنوم RNA ی تک زنجیره با قطبیت مثبت (+ssRNA) می باشند.اندازه این ویروس ها از kb 7.2 در (ردیف ویروس انسانی) تا Kb 7.4 در (پولیوویروس، هپاتیتA) و تا kb8.4 در (آفتو ویروس ها) متغیر است (1).
پیکورنا ویروس ها نقش شگرفی در پیشرفت ویروس شناسی مدرن داشته اند، به طوریکه FMDV اولین ویروس حیوانی بود که در سال 1898 توسط Frosch , Loeffler کشف گردیده. ده سال بعد در اواخر قرن بیستم، با ظهور اپیدمی پولیومیلیت شاهد ایزوله شدن عامل این عفونت (پولیوویروس) توسط popper , landsteinerk بودیم. 40سال بعد دریافتند که پولیوویروس قادر است در کشت سلولی رشد نماید. این یافته آغاز راهی برای مطالعه تکثیر ویروسها بود. سپس اندازه گیری پلاک (Plaque assay) به عنوان یک روش استاندارد در اندازه گیری عفونت زایی پولیوویروس به کار گرفته شد (3,2).
اولین RNA پلیمراز مرتبط با RNA در مننگوویروس (Mengovirus) شناسایی گردید (1) .
با انجام مطالعات بیشتر مشخص شد که ویروس ها برای ورود به سلول از یکسری گیرنده های خاص استفاده می کنند که مختص آن ویروس ها بوده و برای ورود ویروس به سلول ضروری می باشند.
پروتئین های پیکورنا ویروس ها به صورت یک پارچه سنتز شده و توسط یک یا دو پروتئین که خاصیت پروتئازی دارند بصورت آبشاری ودنبال هم می شکند و بسته به نوع ویروس12,11,10 پروتئین مجزا دارند. این پیش سازهای پروتئینی شامل2A , 3C , 3D است که نقش مهمی در همانندسازی و تکثیر ویروس دارند. به طورکلی این پروتئین ها غیر ساختمانی بوده. و فعالیتهای آنزیمی او شبه آنزیمی دارند.
بسیاری از پیکورنا ویروسها بیماریهای مختلفی در انسان ایجاد می کنند. از فلج شدید تا مننژیت اسپتیک، میوکاردیت، ضایعات وزیکولر و گزانتمی پوستی، ضایعات جلدی مخاطی، بیماری های تنفسی، بیماری های چشمی و... جدی ترین بیماری که توسط پیکورنا ویروس ها در انسان به وجود می آید پولیومیلیت است که اشکال تحت بالینی این بیماری از بیمارهای بالینی آن شایع تر می باشد (1).
1-2) تقسیم بندی پیکورناویروس ها :
این ویروس ها بر اساس خصوصیات فیزیکی، دانسیته شناوری، حساسیت به PH ، نزدیکی سرولوژیکی و اکنون بیشتر براساس خصوصیات مولکولی تقسیم بندی شده اند. براساس تجدید نظر جدید توکسونومی به 9 جنس تقیسم شده اند که البته هر جنس هم شامل زیر گروه هایی می شود (2). (جدول شماره یک)
جدول 1 )- اعضای خانواده پیکورنا ویریده.
Members of the Family Picornaviridae Species
Aphtovirus Foot – and – mouth disease virus
Equine rhinitis A virus
Equine rhinitis B virus
Avihepatovirus Duck hepatitis A virus
Cardiovirus Encephalomycarditis virus
Theilovirus
Enterovirus Bovine enterovirus
Human enterovirus A
(Coxsackievirus,enterovirus)
Human enterovirus B
(Coxsackievirus,echovirus,enterovirus)
Human enterovirus C
(poliovirus,coxsackievirus,enterovirus)
Human enterovirus D
(enterovirus)
Porcine enterovirus B
Simian enterovirus A
Human rhinovirus A
Human rhinovirus B
Human rhinovirus C
Erbovirus Equine rhinitis B virus
Hepatovirus Hepatitis A virus
Kobuvirus Aichi virus
Bovine kobuvirus
Parechovirus Human parechovirus
Ljungan virus
Sepelovirus Porcine *elovirus
Simian *elovirus
Avian *elovirus
Senecavirus Seneca valley virus
Tremovirus Avian encephalomyelitis virus
Teschovirus Porcine teschovirus
Refrance: Fields, B., 2013, Virology book, Vol .13
I) آفتوویروسها :مهمترین ویروس این خانواده FMDV می باشد که حیوانات سم دار نظیر گاو، بز، گوسفند و خوک را آلوده میکند.و بندرت انسانها را نیز آلوده می نماید. هفت سروتیپ از آفتوویروسها شناسایی شده است(سروتیپAsial , SAT 1,2,3 , C , A , O ). در بین هر سروتیپ، زیرگروه های زیادی وجود دارد. این ویروس ها خیلی حساس هستند و عفونت زایی آنها در PH کمتر از 7 کاهش می یابد( 1و9و8).
II) کاردیو ویروس ها :دارای دو شاخه مستقل است.
الف : ویروس های شبه انسفالومیوکاردیت که شامل انسفالومیوکاردیت ویروس و کلمبیا ویروس SK و مننگوویروس است. که ویروس های پاتوژن در موش هستند, البته می توانند در انسان، میمون، خوک، فیل، سنجاب هم بیماری بدهند.
ب : در این گروه ویروس هایی هستند که در سیستم عصبی تولید بیماری می کنند و شامل طیف و سیعی از ویروس ها هستند که شاخص آنها Theleris murin encephalomyelitis viruse می باشد. (5)
III) هپاتوویروسها :ویروس هپاتیت A (HAV) که قبلاً عضوی از جنس انتر و ویروسها بود اکنون در جنس مجزایی به نام هپاتوویروس قرار گرفته است دلیل این طبقه بندی مجدد خصوصیات ویژه مولکولی HAV می باشد.
توالی نوکلئوتیدی و اسیدآمینه ای HAV با پیکورنا ویروس های دیگر تشابه کمی دارد.
تکثیر آن در کشت سلولی بدون ایجاد CPE می باشد و انتقال بیماری مدفوع- دهانی و عامل هپاتیت می شود(1و6و7و8).
IV) رینوویروس ها :علت نامگذاری این ویروس ها به محل رشد و تکثیر آنها یعنی نازوفارنکس مربوط می شود این گروه متداول ترین عوامل سرماخوردگی در کودکان و بزرگسالان هستند. این جنس دارای اعضای بسیار زیادی است که سه تیپ و 103 سروتیپ دارد.
این ویروس به محیط اسیدی حساس بوده و در دستگاه تنفسی قدرت رشد دارند و این خاصیت آنها را از انتروویروس ها متمایز می گرداند (1و 2).
V)انتروویروسها :
این ویروسها در دستگاه گوارش تکثیر می شوند و به PH اسیدی معده مقاوم هستند. این جنس در بر گیرنده پولیوویروس (3 سروتیپ)، کوکساکی ویروس(23سروتیپ)، اکوویروس(28 سروتیپ)، انتروویروس های انسانی(4 سروتیپ) و شماری از ویروسهای غیرانسانی می باشد.
V-1/پولیوویروس ها :قدیمی ترین ویروس شناخته شده است که شامل سه سروتیپ مجزا می باشد و سبب بیماری فلج می گردد. راه ورود ویروس مدفوعی- دهانی می باشد. ویروس بیشتر به سلول های لنفوئیدی اپی تلیال و نرون ها در سیستم عصبی مرکزی تمایل دارد. ایمنی نسبت به ویروس پولیو دائمی و جلوگیری از عفونت وابسته به واکسیناسیون است و گیرنده اختصاصی ویروس پولیو ، CD155 می باشد (1 و 2).
V-2/ اکو ویروس ها :دلیل نامگذاری این است که ایجاد بیماری مشخص نمی کند و اولین بار از مدفوع جدا شده و بیشتر از 32 سروتیپ از آن شناخته شده است. بیماری هایی که ایجاد می کند مننژیت غیر چرکی، انسفالیت، بیماری تب دار و سرماخوردگی است و در انسان هم سبب اگلوتیناسیون اریتروسیت های گروهO می شود (1 و 4).
V-3 / کوکساکی ویروس ها :براساس ایجاد بیماری در نوزاد موش شیرخوار به 2 گروه A , B تقسیم بندی شده اند.
گروهA : سبب بیماری فارنژیت و زیکولی، التهاب خونریزی دهنده چشم و ... می شوند.
گروهB : سبب میوکاردیت، پریکاردیت، انسفالیت و پلاک های فاسد شونده در ماهیچه و مغز می شوند و راه ورود ویروس دهانی می باشد (1).
این ویروس ها از رسپتورهای مختلف مانند vitronecti receptor , I-Cam1 , CD55 جهت اتصال به سلول استفاده می کنند.(2)
VI) پاراکوویروس ها :این جنس به تازگی طبقه بندی شده است و شامل 2 سروتیپ پاراکوویروس انسانی تیپ 1 و 2 است. این دو ویروس قبلاً به عنوان اکوویروس تیپ 22 و 23که جز گروه انتروویروسها طبقه بندی شده بودند. پس از مطالعه مولکولی ژنوم این ویروس ها مشخص گردید که این دو ویروس تنها 30% با پیکورناویروس های دیگر تشابه اسید آمینه ای دارند. از طرف دیگر کپسیداین ویروس ها تنها سه پروتئین دارد و کلیواژ (cleavage) پپتید VPO به VP2 و4VP صورت نمی گیرد. این موضوع منجر به طبقه بندی مجدد این ویروس ها و قرار دادن آنها در جنس جداگانه ای به نام پاراکوویروس گردید. (10)
1-3) خصوصیات فیزیکی و شیمیایی پیکورنا ویروس ها:
1-3-1)حساسیت به PHاسیدی :
انترو ویروسها ، هپاتوویروسها، کاردیوویروسها و پاراکو ویروسها به اسید معده مقاومند و عفونت زایی آنها در PHکمتر از 3 از بین نمی رود. در صورتیکه رینوویروسها و آفتوویروسها بهPH کمتر از 6 حساس اند به همین دلیل محل طبیعی تکثیر این ویروسها در بدن متفاوتند. از طرف دیگر حساس بودن رینوویروسها و آفتوویروسها به PHاسیدی در مرحله پوشش برداری (Uncoating) نقش دارد (2).
1-3-2)دانسیته:
کاردیو و آنتروویروس دانسیته 34/1 گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارند و FMDV دانسیته 45/1 گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارد. رینوویروس دانسیته 40/1 گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارد که دلیل این اختلاف حرکت نفوذپذیری کپسیدویروس نسبت به سزیم است. کپسیدپولیو نسبت به سزیم غیر قابل نفوذ است و ویروس در چگالی شناوری سبک تری باند می شود ولی کپسیدآفتوویروسها منافذی دارد که سزیم می تواند به درون ویریون نفوذ نماید (11و 12و 13).
(3-3-1حساسیت نسبت به حلال های لیپیدی:
پیکورنا ویروس فاقد پوشش لیپیدی است و به کلروفرم، دتر جنت واتر مقاوم بوده و از بین نمی رود (6 و 14).
1-4) ساختمان پیکورناویروس:
(1-4-1کپسید:
کپسید از چهار پروتئین ساختمانی به نام vp1 ، vp2 ، vp3 ، vp4 ، تشکیل شده است. ولی در میان اعضای پاراکوویروس ها استثناء می باشند. زیرا که کپسید آن ها تنها دارای سه پروتئین VPO ، VP2 و VP4 می باشد و کلیواژهایVPO، به VP2وVP4انجام نمیشود (10).
در سال 1960 دو دانشمند به نام casper and klug مبنای ساختمانی ویروسها را تشریح کردند و نشان دادند که کپسید این ویروسها دارای ساختمان ایکوزاهدرال (Icosahedral )، تقارن بیست وجهی است که از چهار پروتئین VP4 – VP1 تشکیل شده (به استثنای پاراکوویروس) (14). یک 20 وجهی از 20 مثلث متساوی الاضلاع و 12 گوشه تشکیل یافته است (شکل 1 ). نتایج حاصل از مطالعات اشعه X و بررسی های بیوشیمیایی نشان داد که کپسید پیکورنا ویروسها واجد 60 پروتئین ساختمانی است که به صورت یک شبکه 20 وجهی استوار یافته اند. در سال 1985 ساختار اتمی پولیوویروس و رینوویروس انسانی تیپ 14 به کمک کریستالوگرافی با اشعه Xمشخص گردید (15و14).

شکل 1- نمای شماتیک کپسید ویروسها.در این شکل حالت 20 وجهی، پروتومرها و پپتیدهای شکل دهنده کپسید مشخص می باشد.شکاف کانیون (Canyon) نیز در گوشه سمت راست مشخص می باشد.
اصلی ترین جزء سازنده در کپسید پیکورنا ویروسها را پروتومر (protomer) نامیدند. هر پروتومر از 4 پروتئین VP4–VP1 تشکیل شده است. سه پروتئین VP1، VP2 ، VP3 در سطح خارجی کپسید قرار دارند ولی VP4در سطح داخلی کپسید و در تماس با ژنوم قرار دارد. این پروتئین ها با هم شبکه ای استوانه ای را تشکیل داده که از 8 رشته زنجیره موازی و در خلاف جهت هم قرار دارند و به نام -barreljellyrollβ می نامند (16و8) (شکل 2).
این دومن یک ساختمان گوه ای شکل است که از دو روقه β موازی و در خلاف جهت هم ساخته شده اند یک ورقه β دیواره گوه را می سازد و ورقه دیگر که در مرکز قرار دارد، هم دیواره و هم کف گوه را شکل می دهد. گوه ای شکل بودن این ساختمان باعث فشرده شدن واحدهای ساختمانی شده و ایجاد یک پوسته سخت و فشرده را تسهیل می نماید. فشردگی دومن های β- barrel توسط شبکه ای از تداخلای پروتئین- پروتئین در روی کپسید داخلی بویژه در اطراف گوشه های 5 ضلعی تقویت می گردد (8و16).
پروتئین های کپسید از نظر سکانس متفاوت و از نظر توپولوژی یکسان هستند و مهمترین تفاوت پروتئین های VP1، VP2 ، VP3در لوبهای صفحات بتا(β) و در قسمتهای انتهای آمینی (N- Terminal ) و انتهای کربوکسیلی (C- Terminal) می باشد. انتهای کربوکسیلی در سطح خارجی و انتهای آمینی در سطح داخل ویروس قرار دارد (16).
دومن های β- barrelدقیقاً مشابه با ویروسهای گیاهی نظیر Southem bean mosaicوTomato bushy stunt می باشد. پروتئین های این دسته از ویروسها هیچ گونه همولوژی توالی با پیکورناویروسها ندارند. فرضیه ای که مطرح است این است که 1- پلی پپتیدها از یک جد مشترکی تکامل یافته اند. 2- دومن β- barrelیکی از محدود راههایی است که به پروتئین ها اجازه می دهد تا به فرم یک کره فشرده تجمع یابند (18 و 17).
(2-4-1 سطح خارجی ویریون:
سطح ویریون پیکورناویروس های که شیاردار است و توسط یک شکاف عمیق بنام کانیون ( Canyon ) احاطه می گردد .
(3-4-1 کانیون(Canyon):
پروتئین های VP3- VP1 شیارهای باریکی را تشکیل می دهند که کا نیون گویند. کانیون یک ناحیه بسیار فشرده و باریک است که مانع نفوذ عمقی مولکول های آنتی بادی می شود. در بعضی از پیکورنا ویروسها کانیون به عنوان محل اتصال به گیرنده عمل می کند مثل راینووپولیوویروس سطح آفتوویروس و کاردیو فاقد کا نیون است و ویریون آنها صاف تر از پیکورنا ویروس های دیگر است (20) (شکل3).

شکل 2- دیاگرام شماتیک 8 زنجیرهβ که ساختار گره ای شکل را بوجود می آورند.در اینجا لوپ هایی وجود دارد که رابطی بین ورقه های زنجیرهβ می باشد.این لوپ ها سطح ویریون را می پوشاند و به هر زیر واحد vp1-4 مورفولوژی و آنتی ژنیسیته ویژه ای می بخشند. در اکثر پیکورنا ویروس ها محل های آنتی ژنیک خنثی نوترالیزان در لوپ هایBC از VP1و VP3 یا لوپ EF درVP2 واقع شده اند.

شکل 3- مدلی از پولیوویروس تیپ 1- تاج ستاره ای شکل و ناحیه کانیون در اطراف آن مشخص است.
(4-4-1سطح داخلی ویریون:
شبکه ای که توسط انتهای آمین پروتئین های کپسیدی در سطح داخلی ویریون شکل می گیرد و نقش آن در پایداری کپسید و ویریون می باشد. در تقارن چرخشی 5 انتهای آمینی از 5´ مولکول VP3 یک ورقه بتای موازی و سیلندری شکل را بوجود می آورند. این ساختار توسط پنج ورقه بتای سه زنجیره ای احاطه شده است. ارتباط بین این دو ساختار از طریق گروه میریستات ( Myristate) متصل شده به انتهای آمینی ازVP4برقرار می گردد (4).
(5-4-1نقش پاکت هیدروفوبیک:
در کف کانیون ناحیه ای بنام پاکت ( pocket ) وجود دارد که در این منطقه لیپیدهای مختلف قرار دارند و این پاکت در پوشش برداری ویروس نقش دارد و بعضی از داروهای ضد ویروسی روی این پاکت اثر و مانع از پوشش برداری ویروس می گردند (20).
(6-4-1 نقش میرستیک اسید:
در اغلب ویروسهای خانواده پیکورنا ویروس، اسید میریستیک توسط پیوندهای کووالانسی به اسید آمینه گلیسین در انتهای آمینی VP4 متصل می شود (18). گروههای مریستیل سبب واکنش اسیدهای آمینه موجود در پروتئین VP3 و VP4شده و این مریستیه شدن در تجمع (Assembley) و پایداری کپسید نقش دارد(19 ).

شکل 4- تداخلات میریستات با پروتئنی های سطح ویروس.
1-5) ساختار ژنوم در پیکورنا ویروس ها:
ژنوم پیکورنا ویروسها بصورت RNA تک رشته با پلاریته مثبت ( +SSRNA) می باشد. این ژنوم عفونت زا بوده و پس از ترانسفکت نمودن سلول می تواند به پروتئین های لازم برای تکثیر ویروس ترجمه گردد. ساختار ژنوم شامل قسمتهای زیر می باشد.(شکل5)

شکل 5- تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروسها: در ابتدای 5´ ژنوم پروتئین Vpgو بعد از آن ناحیه 5´- UTR (بخش5´ غیر کد کننده) واقع شده است. در انتهای 3´ هم توالی 3´-UTR و دنباله PolyAقرار دارد در بین این نواحی غیر قابل ترجمه بخش کد کننده پروتئین های ساختمانی P1 و غیر ساختمانی P2 / P3 واقع می شود. این توالی تنها در ژنوم کاردیوویروسها و آفتوویروسها مشاهده شده است.
( Vpg ) viral protein genome linked (1-5-1 :
در ابتدای 5´ژنوم پیکورنا ویروسها، پروتئینی به نام Vpg قرار دارد (21). در ژنوم همه پیکورناها Vpg وجود دارد ولی طول آن از 22 تا 24 اسید آمینه متفاوت است. Vpgبا پیوند کووالانسی به نیمه5´یوریدیلات از RNA ی ویروسی توسط یک پیوند 5´-0-4´یوریدنیل- تیروزین متصل می شود. معمولاً تیروزینی که به RNAویروس متصل می شود، سومین اسید آمینه از انتهای آمینی Vpo می باشد در همه پیکورنا ویروسها Vpgتوسط یک ژن منفرد( 3B) کد می گردد، در حالیکه در FMDV سه ژن مسئول کد کردن Vpgهستند اگر Vpgرا از ابتدای ژنوم حذف کنیم عفونت زایی اختصاصی ویروس کاهش نمی یابد. Vpgفقط در RNAدیده می شود و در mRNAدیده نمی شود این پروتئین توسط Un linking enzyme سلول های میزبان از ژنوم برداشته می شود (23و22). تنها تفاوت بین RNAژنومی و mRNA پولیوویروس ، عدم وجود Vpgدر MRNAمی باشد. Vpgدر زنجیره RNA حد واسط و RNA زنجیره منفی وجود دارد و عنوان می گردد که احتمالاً Vpg به عنوان پرایمر در سنتز RNAدخالت داشته باشد (24).
5´- UTR(2-5-1 :
(5´- UTR) منطقه ای بلند و حاوی 624 تا 1199 نوکلئوتید است که بعد از Vpg قرار دارد. این ناحیه در روند تکثیر و ترجمه ژنوم مؤثر است (25).
IRES(3-5-1 :
در 5´- UTR، ناحیه ای به نام IRES وجود دارد که حاوی 2400- 2100 نوکلئوتید است. ریبوزوم برای ترجمه به این قسمت چسبیده و سنتز پروتئین را شروع می کند. دو تیپ اصلی از IRESوجود دارد. این عناصر در جهت دهی عمل ترجمه دخالت می کنند. در آفتوویروس ها و کاردیوویروسها قسمت 5´- UTRواجد یک ناحیه POLY (C)می باشد که تعداد بازهای آن ( 80 تا 250 نوکلئوتید در کاردیوویروسها و 100 تا 170 نوکلئوتید در آفتوویروسها ) متفاوت است. برخی از محققین طول بیشتر قطعه POLY (C)در کاردیو را مرتبط با ویرولانس بیشتر آنها در حیوانات می دانند (25).

شکل6: دو تیپ اصلی از IRESدر پیکورنا ویروسها: تصویر سمت چپ بخش 5´- UTRپولیوویروس (تیپ I نامیده می شود و در انتروویروس ها و رینوویروس ها نیز دیده می شود) و تصویرسمت راست بخش 5´- UTRانسفالومیوکاردیتیس ویروس تیپ II نام دارد و در آفتوویروسها و کاردیوویروسها مشاهده می شود) را نشان می دهد. ناحیه IRESدر داخل مستطیل مشخص می باشد. IRESهپاتو ویروسها با این دو شکل فرق دارند و برخی مقالات آنرا بعنوان تیپ سوم IRESمطرح می کنند.(ORF) open Reading Frame(4-5-1 :
بعد از ناحیه 5´- UTR، ناحیه ORF قرار دارد که بعد از آلودگی توسط ویروس ORFبه یک پلی پروتئین بزرگ ترجمه شده و سپس توسط پروتئازهای ویروسی به 11 تا 12 پروتئین شکسته می شود و عملکرد آن جهت تهیه پروتئین های ساختمانی و غیر ساختمانی ویروس مورد استفاده قرار می گیرد.
3´- UTR(5-5-1:
در پیکورنار ویروس ها 3´- UTRکوتاه تر از 5´- UTR می باشد. این ناحیه در رینویروسها 47 نوکلئوتید و در EMCV بین 14 تا 125 نوکلئوتید طول دارد. در ناحیه 3´- UTRیک ساختار ثانویه بنام pseudo knot وجود دارد که سنتز RNA ویروس را کنترل می نماید (26 و 27).
Poly (A) (6-5-1 :به انتهای 3´ژنوم یک قطعه Poly (A)اتصال می یابد که طول متوسط آن از 35 نوکلئوتید درEMCVتا 100 نوکلئوتید در FMDV متغیر است و اگر دنباله Poly (A)حذف گردد عفونت زایی ویروس از بین می رود.
در پیکورنا ویروس ها، بخش کد کننده پروتئین های ساختمانی و غیر ساختمانی را به صورت p3, p2, p1مشخص می کنند. آفتو ویروس و کاردیوویروسها یک پروتئین رهبر (L) را قبل از قسمت P1کد می کنند. قسمت P1 ,پروتئین های ساختمانی را کد می کند ولی P2 و P3 پروتئین های غیر ساختمانی را کد می کنند. پروتئین های غیر ساختمانی در پردازش پروتئین های دیگر (2A pro,3c pro, 3cd pro )و تکثیر ( 2B, 2C, 3AB, 3B vpg, 3D pol ) مشارکت دارند (1).
1-6) سیکل تکثیر پیکورنا ویروسها:
تکثیر به طور کامل به مدت 10-6 ساعت در سیتوپلاسم سلول آلوده به ویروس صورت می گیرد.
مراحل تکثیر به صورت خلاصه و به ترتیب عبارتند از:
1-اتصال به رسپتور Attachment
2- ورود و پوشش برداری Enterance and uncoating
3- ترجمه ژنوم Translation and synthesis
4- پردازش پلی پروتئین Polyprotein processing
5- تولید ذرات جدید ویروسPyogen viruses
86614046990

شکل 7- چرخه تکثیر پیکورناویروس : 1- اتصال به گیرنده 2- مرحله پوشش برداری 3- Vpg از ابتدای ژنوم حذف و سپس RNA ترجمه می گردد 4- پلی پروتئین حاصل از ترجمه توسط پروتئازهای ویروسی به پلی پپتید مجزا کلیواژ می گردد. 5- سنتز RNA بر روی غشاء وزیکول روی می دهد. ژنوم ویروس توسط RNAپلیمراز به RNAکامل زنجیر منفی (آنتی ژنوم) تبدیل می شود. 6- از روی آنتی ژنوم تعداد زیادی RNAزنجیره مثبت ساخته می شود. 7- این زنجیره های مثبت در ابتدای سیکل عفونت به پروتئین های مورد نیاز جهت تکثیر ویروس تبدیل می شوند و در اواخر سیکل عفونی به عنوان پروژنوم جهت تولید ویروس مورد استفاده قرار می گیرند. 8و9- مراحل اسمبلی و خروج ویروسها از سلول آلوده.
1-61-)اتصال Attacment :
پیکورنا ویروسها برای عفونت زایی نیازمند اتصال به غشاء سلول میزبان می باشد تا از این طریق داخل سلول میزبان گردد. این عمل توسط یک سری مولکولهای سطحی غشاء انجام می شود، این مولکولها از سال 1989 با شناخت رسپتورهای سطحی بر علیه پولیوویروس و رینوویروس تشخیص داده شدند (28).
در زمینه رسپتورهای پیکورنا ویروس ها سه نکته مهم مشخص گردیده است:
الف) پیکورنا ویروس ها از رسپتورهای متفاوتی برای ورود به سلول استفاده می کنند.
ب) قسمتی از رسپتورها درون سلول قرار دارند مانند رسپتور کوکساکی ویروس B و A و انتروویروس .
ج) در بعضی از پیکورنا ویروس ها وجود یک رسپتور برای عفونت زایی ویروس کافی است ولی در بعضی دیگر نیاز به دو یا چند رسپتور است برای مثال، در کوکساکی ویروس A21 که رسپتور آن CD55 است برای ورود به درون سلول نیاز به ICAM-1 دارند (29). بعضی از کوکسا کی ویروس های گروه B علاوه بر رسپتور CD55 از α V β6 Integrinنیز به عنوان کورسپتور جهت اتصال به سلول استفاده می کنند (4). بر اساس اینکه ویروس از کجا منشاء می گیرد ویروسهای مشخص به رسپتورهای سطحی متفاوتی متصل می شوند به طور مثال FMDV – A12 به اینتگرین α Vβ3اتصال می یابد. ولی استرین O- FMDVکه به مدت طولانی در کشت سلولی رشد کرده است نمی تواند به این رسپتور متصل شود و بجایش هپاران سولفات به سطح سلول متصل می شود. استرین FMDV – A12نمی تواند سلولهای راکه فاقد β6 Integrin α هستند را آلوده کند حتی اگر هپارین سولفات در سطح سلول باشد. این موضوع نشان می دهد که ویروس خود را در آزمایشگاه سازگار نکرده است و در نبود رسپتور اصلی, خود بتدریج قادر به استفاده از رسپتورهای دیگر شده است (9).
(جدول 2) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس.

1-62-) مکانیسم اتصال به گیرنده های سطح سلولی:
کپسید پیکورنا ویروس از 4 پروتئین تشکیل شده است که این پروتئین ها بصورت یک 20 وجهی اسمبل می شوند در بین اعضای پیکورنا ویریده، پروتئین های کپسید بطور مشابه ای چیده می شوند (7و8).
در سطح کپسید پولیوویروس ها، رینو ویروس ها و کوکساکی ها یک شکاف بنام Canyon می باشد که در اطراف محور تقارن پنج وجهی قرار می گیرد. (شکل8) ولی در کاردیوویروسها، آفتوویروسها و پاراکوویروسها Canyonوجود ندارد. این محل در پولیوویروس و رینوویروس، بعنوان جایگاهی برای تداخل با گیرنده های سلول می باشد و ایجاد موتاسیون در اسیدهای آمینه این ناحیه تغییراتی در افینیتی اتصال به گیرنده ها ایجاد می کند (30و31).
شکاف پیکورنا ویروس ها باریک و عمیق است و مولکولهای آنتی بادی می توانند به درون آن نفوذ نمایند (31و30).
داروهای ضد ویروسی مانند محصولات win جای لیپید را در کف کینون گرفته و به پاکت اتصال می یابند و مانع از اتصال ویروس به گیرنده های سلولی می شوند. اتصال این دارو به رینوویروس تیپ 14 سبب تغییر شکل کنیون شده و مانع از اتصال به گیرنده های سلولی می شود. ولی اتصال دارو به رینوویروس تیپ های 1A ، 3 و 16 و پولیوویروس سبب تغییرات ساختاری کمتری می شود (32).

شکل 8- تصویر شماتیکی از Canyonنحوه متصل شدن گیرنده ، آنتی بادی به ناحیه Canyon در VP1

شکل 9- شکاف Canyonو نحوه قرار گرفتن دارو در VP1
در FMDV موتاسیون در توالی ) RGDآرژنین-گلایسین-آسپارتیک اسید)سبب ممانعت از اتصال ویروس به گیرنده سلولی می گردد ولی در کوکساکی ویروس9A توالی RGD در 17 اسید آمینه از انتهای کربوکسیی VP1واقع شده است و تغییرات در این توالی سبب عدم اتصال به گیرنده سلول نمی شود (34).
ویروس هایی مثل کوکساکی ویروس 9 Aو FMDV از طریق لوپ های سطحی خود به گیرنده های سلولی متصل می شوند. در FMDVتوالیRGDِ ( آرژنین- گلایسین- آسپارتیک اسید) در لوپ βG-βHاز پروتئین VP1کپسید قرار دارد و توسط گیرنده هایی از جنس اینتگرین شناسایی می شودو ویروس از طریق این گیرنده ها به سلول ها متصل می گردد (33و34).
1-63-)ورود به سلول و پوشش برداری ویروس:
پس از اینکه ویروس به گیرنده های سطح سلولی متصل شد باید پوشش برداری انجام شود و ژنوم ویروس به داخل سیتوپلاسم رها شده و در آنجا تکثیر می گردد که این عمل از طریق کاهش PH و یا فعالیت کمک گیرنده ها صورت می گیرد. به طور مثال در پولیوویروس بعد از اتصال به گیرنده PVr تغییرات اساسی در ساختار ویروس روی می دهد و پارتیکل های A بوجود می آیند و این پارتیکل ها تغییر شکل یافته و پروتئین داخلی VP4و انتهای آمینی VP1 را از دست می دهند. ذره A هیدروفوبیک است و بعد از اتصال به ممبران سلولی کانالی را برای عبور ژنوم به درون سیتوپلاسم سلولی ایجاد و RNA ویروس وارد سیتوپلاسم سلولی می شود (36 و 35) .
نظریات متفاوتی درباره مرحله دخول پیکورنا ویروسها وجود دارد یک نظریه بیان می کند که اتصال ویروس به گیرنده باعث تغییرات ساختمانی در ویریون می گردد در این حالت انتهای آمینی VP1 به طرف بیرون کپسید رانده می شود و در داخل غشاء سلولی نفوذ می کند و ایجاد سوراخ (Pore) در سطح غشاء سلول های آلوده ایجاد شده و RNA ویروس از این راه به درون سیتوپلاسم رها می گردد. (شکل 5 و 6) به عنوان مثال FMDVو رینوویروس بعد از اتصال به سلول سبب ایجاد اندوزوم در غشاء سلولی می گردد و توسط اندوسیتوز وارد سلول می شوند که در این ویروس (FMDV) پوشش برداری وابسته به PH است یعنی در PH معادل 5/6 کپسید ویروس جدا شده و RNAویروس آزاد می گردد (38و37).

شکل 10)مدل دخول پیکورنا ویروس ها به درون سلول. پارتیکل های 160 S به گیرنده های سطح سلول متصل می شوند .در دمای بالای 33 درجه سانتیگراد تغییرات وابسته به گیرنده در آنها روی می دهد که منجر به تولید پارتیکل هایA (تغییر یافته) می شود . این ذرات هیدروفوب بوده , VP4 و انتهای آمینی از VP1 را از دست داده اند. مرحله Uncoating به دو طریق (غشای پلاسمایی یا غشای اندوزوم ها) صورت می کیرد و RNA ی ویروسی به درون سیتوپلاسم رها می گردد.

شکل 11)ممکانیسم فرضی برای عبور RNA ی پیکورنا ویروسها از عرض غشا. (سمت چپ) اتصال ویروس به گیرنده را نشان می دهد. RNA در داخل کپسید قرار دارد و لیپید ها نیز درون پاکت هیدروفوب را می پوشاند. گیرنده نیز به کانیون (در بالای پاکت) متصل می شود .(سمت راست) تغیرات ساختمانی در کپسید روی می دهد. حرکت گیرنده در کانیون باعث خروج لیپید از پاکت می گردد و اجازه می دهد که تغییرات ساختاری در کپسید روی دهد. انتهای آمینی VP1 کشیده می شود و در داخل غشای سلولی منفذی ایجاد می کند که RNA از طریق آن به درون سیتوپلاسم رها می گردد.
1-7) ترجمه ژنوم پیکورنا ویروسها :
وقتی ژنوم +SSRNA ویروس به درون سیتوپلاسم سلول میزبان رها می گردد لازم است که به پروتئین های غیر ساختمانی (nsp) و پروتئین های ساختمانی (sp) ترجمه گردد (39). در درون ویریون پیکورنا ویروسها همانند ویروسهای پلارتیه مثبتRNA polymerase RNA dependent وجود ندارد از طرف دیگر RNApolymerase سلولی نیز قادر به رونویسی از ژنهای این ویروس نمی باشد. در ابتدای5´ ژنوم پیکورنا ویروسها کلاهک 5´-cap وجود ندارد ولی دارای یک پروتئین کوچک به نام Vpgاست که بعد از ورود ژنوم به سلول میزبان توسط آنزیم سلولی Unlinking Enzyme برداشته می شود (39). تعیین توالی ژنوم پیکورنا ویروسها نشان داد که 741 نوکلئوتید در ابتدای ناحیه ژنوم 5´ وجود دارد این ناحیه را 5´- UTR نامیدند در این ناحیه توالی های IRES، بخش غنی از بازهای پریمیدنی و کدون شروع ترجمه AUG قرار دارد (41و40).
با اتصال زیر واحد 40S ریبوزوم به IRES ترجمه آغاز می گردد و بلافاصله elf3 به انتهای کربوکسیلی elF4G اتصال می یابد و ترجمه شروع می گردد. البته این عمل توسط پروتئین 2Aتقویت می گردد پس برای شروع ترجمه نیاز به قسمتی از elF4Gکه توسط 2A فراهم شده, می باشد. (هپاتوویروسها نیاز به elF4Gبه صورت کامل دارند.) (42).
1-1-7)اتو آنتی ژن La :
پروتئین سلولی است که در بلوغ RNA polymerase III نقش دارند و سبب فعالیت IRES در پولیوویروس می شود. این اتو آنتی ژن برای فعالیت IRESدر EMCV لازم است (45و44).
1-2-7)پروتئین متصل شونده به پلی پیریمیدین (PTB) :
در تنظیم Splicing (بازآرایی) mRNAنقش دارد و حذف آن مانع از فعالیت IRES در EMCVمی شود (43).
1-8) پردازش پلی پروتئین در پیکورنا ویروسها:
با انجام فرایند ترجمه یک پیش ساز پلی پروتئین تولید می شود که توسط پروتئازهای ویروسی شکسته می شود. پیکورنا ویروس ها سه پروتئاز را کد می کنند که شامل Lpro, 2Apro, 3Cpro می باشد و معمولاً اولین کلیواژ در ابتدای این پروتئازها روی می دهد و با آزاد شدن آنها بقیه پلی پپتیدها شکسته می شوند (16و8و7).
1-8-1) پروتئین L :
در آفتو ویروس اولین کلیواژ در پروتئین L انجام می شود. این پروتئین سبب برش در انتهای کربوکسی خودش و انتهای آمین VP4 می گردد و با این کار از ابتدای پلی پروتئین رها می شود و بعد از آن با شکستن elF4Gاز ترجمه ماکرو مولکولهای سلولی جلوگیری می کند (46و47).
در کاردیو ویروسها پروتئین L فعالیت پروتئولیتیکی ندارد.
1-8-2) پروتئین 2A :
در کاردیو ویروس پروتئین 2A ، 150 اسید آمینه طول دارد و 19 اسید آمینه آخری به اضافه اولین اسید آمینه از پروتئین 2B (برولین) برای جدایی از پروتئین 2B لازم است (50). در سلولهای آلوده به انترو ویروسها و رینو ویروسها اولین کلیواژ توسط 2Aproو در محل اتصال P1/P2 روی می دهد. محل اثر پروتئین 2A بین دو اسید آمینه تیروزین و گلیسین می باشد ولی در بعضی از کوکساکی و اکوویروسها هم محل اثر 2A بین ترئونین و گلایسین و یا بین آلانین و گلایسین می باشد. 2Apro مانند پروتئیناز A در باکتری استرپتومایسس گریوس می باشد (48).(شکل 12)
در بین پیکورنا ویروسها، تنها دو جنس هپاتوویروسها و پاراکوویروس هستند که 2Aproدر آنها فعالیت پروتئولیتیکی ندارد (49). 2Apro برای عملکرد نیازمند به یون روی (ZN) است.1-8-3) پروتئین 3C :
تمام پیکورنا ویروسها 3Cpro را کد می کنند و عملکرد آن ایجاد شکست ما بین 2C/3A می باشد البته استثناهایی هم وجود دارد مثلاً در هپاتو ویروس سبب برش بین 2A/2B نیز می شود. در پولیو ویروس این پروتئین سبب برش در ناحیه دی پپتیدی Gly- Gly می شود ولی در بقیه پیکورنا ویروسها عمل برش در مناطق Gln-Ala- Gln- ser , Gln- Ile,Gln,Asn, Gln-Thr, Gln, Val انجام می گیرد (8).
با تعیین توالی اسیدهای آمینه 3C pro مشخص گردید که مشابه سرین پروتئینازهای شبیه کیموتریپسین می باشد (شکل 8). 3C proحاوی 2 مکان فعال است که یک قسمت به RNAمتصل می گردد و قسمت دیگر مسئول اعمال پروتئولیتیکی می باشد (51).3C pro و 2A pro با عمل اتوکاتالیتیکی خود موجب آزاد شد نشان از رشته پلی پروتئینی می شوند و بعد از جدا شدن سبب شکسته شدن پلی پروتئین به صورت ترانس می شود و به صورت آبشاری پپتیدها را کلیواژ می کنند.در سلول های آلوده با رینوویروسها و انترو ویروسها، ابتدا با عمل پروتئازی 2A pro ناحیه p1/ p2 – p3 کلیواژ می گردد سپس 3CD pro خودش را می شکند و از قسمت P3 جدا می شود و سپس P1 /P2 را کلیواژ می کند (51).

شکل12) : تصویر سه بعدی از 3C pro ویروس هپاتیت A ، 2A pro رینو ویروس و FMDV L pro ، در پائین هم پروتئازهای سلولی مشابه با هر کدام آمده است
1-9) تکثیر ژنوم و سنتز :mRNA
تا سال 1950 بر این اعتقاد بودند که سنتز RNA ویروس توسط RNA پلی مر از وابسته به DNA است که تکثیر ویروس هم در داخل هسته انجام می گیرد. در اوایل سال 1960 بود که یک مطالعه روی مننگو ویروس انجام گرفت و مشاهده کردند که اگر اکتینو مایسن D ( یک داروی متوقف کننده سنتز RNA در هسته) به سلول های آلوده به ویروس اضافه شود قادر نیست که از تکثیر ویروس جلوگیری نماید و از این موضوع نتیجه گرفتند که برای تکثیر ویروس آنزیم RNA پلی مراز باید در سیتوپلاسم وجود داشته باشد که یک آنزیم RNAپلیمراز وابسته به RNA است (52).
در سلول های آلوده پولیو سه شکل از ژنوم را می توانیم مشاهده می کینم:
1-+SSRNA ( RNAتک رشته ای با پولاریته مثبت)
2- RI( حد واسط تکثیری با پولاریته منفی Replication intermediate )
3- RF ( شکل تکثیری با پولاریته مثبت Replication form ) (53).
سنتز RNAویروسی بصورت نامتقارن (Asymmetric)است بدین صورت که زنجیره مثبت 25 تا 65 برابر بیشتر از زنجیره منفی سنتز می گردد (54).
1-9-1) RNAپلیمر از وابسته به RNA ویروسها (3D pol) :
در بررسی از غشاء سلولی به مجموعه ای از غشاء سلولی برخوردند که در امر سنتزدخا لت داشتند و به نام کمپلکس تکثیر RNA نامیده شد. یکی از مهمترین اجزاء این کمپلکس یک پروتئین kd63 به نام RNAپلی مراز وابسته به RNA ویروس بود علاوه بر این تعداد دیگری از پروتئین های ویروسی و سلولی نیز در این کمپلکس حضور داشتند مانند 3Cو 2BC, 2C, 3ABکه پروتئین 3Dمهمترین پروتئین کمپلکس تکثیر بود (55).
1-9-2) پروتئین 3D :
3D proیا (p63)مهمترین پروتئین در تکثیر ژنوم ویروس می باشد این پروتئین یک پلیمراز است از طرف دیگر dsRNAرا نیز باز می کند و به ssRNA متصل می کند و برای شروع تکثیر لازم است که یک پرایمر oligo(U)در اختیار آن قرار گیرد (56).
دو ناحیه در این پروتئین خاصیت RNA پلی مرازی دارند. 1- inter faceو شامل یک زنجیره 23 اسید آمینه ای است که در دو سطح مختلف پروتئین قرار داشته و به دو سر رشته متصل شده، و یک رشته بلند پلی مراز را می سازد. 2- inter face II– یک پلی پپتید N ترمینالی است که احتمالاً از یک مولکول پلی مراز دیگر مشتق می شود و با ترکیب inter face Iباعث رونویسی توسط پلی مراز می گردد. پس در مجموع نقش این پروتئین در سنتز RNAاست (57).
1-10) نقش پروتئین های کمکی در تکثیر ژنوم:
پروتئین های کپسید برای سنتز RNA ضروری نیست و با حذف این بخش عمل سنتز و تکثیر RNA صورت می گیرد اما ناحیه کد کننده کپسید در رینو ویروس، s‘Theilerو در مننگو ویروس یک سکانس –Cis وجود دارد که برای تکثیر ژنوم مورد استفاده قرار می گیرد و معادل کار این ناحیه را در پولیوویروس پروتئین 2C به عهده دارد (8).
1-10-1) پروتئین 2B :
با انجام موتاسیون در ناحیه 2B pro پولیو ویروس و کوکساکی ویروس در سنتز RNA نقص بوجود می آید. انتهای کربوکسیلی 2B یک ناحیه آب گریز و به صورت مارپیچ (α - Helix) است که عمل پروتئین 2B به این ناحیه بر می گردد. نقش پروتئین 2Bدر سنتز RNAبه خوبی مشخص نیست اما باعث افزایش نفوذپذیری غشا می گردد و ممکن است که در آزاد شدن ویروس از سلول نقش داشته باشد و موجب افزایش ویزیکولهای غشایی نیز می گردد و به نظر می رسد 3A pro نیز همین نقش را داشته باشد (58).
1-10-2) پروتئین 2C :
با انجام موتاسیون در ناحیه 2C پولیو ویروس و اکو ویروس، مشاهده گردید که این ویروسها موتاسیون یافته به اثر گوانیدین هیدروکلراید مقاوم هستند. 2C pro به RNA متصل شده و دارای فعالیت NTpase می باشد. بخشی از اسیدهای آمینه 2C دارای فعالیت RNA هلیکازی هستند و این ناحیه برای باز کردن پیچ های دو رشته ای در حین تکثیر RNAضروری می باشد. تغییر در 2C pro موجب کاهش عفونت زایی می شود (59).
1-10-3) پروتئین 3AB :
این پروتئین سبب استحکام پروتئین Vpg در روی غشاء می شود. پروتئین خالص شده 3AB فعالیت پلیمرازی پروتئین 3D را تحریک می کند موتاسیون در این ناحیه مانع از اتصال آن به 3D شده و در تولید پروتئین و سنتز RNA اختلال بوجود می آورد. کمپلکس 3AB- 3CD به انتهای ′3 ژنوم متصل می گردد (60).
1-10-4) پروتئین های فرعی سلول:
با انجام مطالعات اولیه روی سیکل تکثیر در پولیو ویروس مشخص شد که پروتئین های سلول میزبان برای کپی کردن RNA ویروس با استفاده از 3D در زمانی که ویروس فاقد پرایمراولیگو (U) است مورد نیاز می باشد. این فاکتور های سلولی بسیار گسترده بوده و اغلب ناشناخته می باشد (61).
زمانیکه RNAخالص پولیو ویروس را به کشت سلولی و درون سیتوپلاسم وارد نمودند RNA تکثیر شده و ذرات جدید ویروس به وجود آمد اما زمانیکه گوانیدن به کشت سلولی اضافه گردید، مشاهده شد که کمپلکس تکثیر تشکیل می شود، اما سنتز RNA صورت نمی گیرد ولی به محض اضافه کردن عصاره سیتوپلاسمی سنتز RNA شروع می شود این نتایج نشان می دهد که ترکیبات محلول سلولی برای سنتز RNA مورد نیاز می باشد. نتایج مشابهی با بررسی Poly (c)بدست آمد. این پروتئین به ساختار برگ شبدری شکل در 108 نوکلئوتید اولیه رشته +ssRNAمتصل می گردد. این اتصال موجب چسبیدن 3CD proدر جهت مخالف اتصال به ساختار برگ شبدری می شود (8).
شکل گیری کمپلکس ریبونکلئوتید پروتئین (شامل 5 قسمت برگ شبدری و 3CD و یک سری پروتئین های سلولی) برای شروع سنتز RNAویروس ضروری است. یک مثال دیگر برای نشان دادن نقش پروتئین های سلولی در سنتز RNA ویروس پروتئین sam 68 می باشد این پروتئین همراه با 3D pro در سلول آلوده به پولیو ویروس دیده می شود. این پروتئین در هسته دیده می شود. اما در طول عفونت با پولیو ویروس به سیتوپلاسم منتقل می شود (62).
1-10-5) پروتئین متصل کننده پرایمر برای سنتز RNA:
3D pro یک آنزیم وابسته به پرایمر است که بدون یک پرایمر(u) oligoنمی تواند RNA ی ویروس را سنتز کند. پروتئین vpg به ابتدای ′5 رشته تازه سنتز شده RNAمثبت و منفی متصل می گردد و به نظر می رسد که در شروع سنتز RNAنقش داشته باشد.پروتئین ( vpg- pupu)در غشاء سلول آلوده به پولیوویروس سنتز می گردد. پیش ساز پروتئین vpg پروتئین 3AB می باشد و زمانی که پروتئنی 3AB را با موتاسیون در ویروس حذف نمائیم در شروع سنتز RNAو سنتز (vpg- pupu)در رشته مثبت RNA ویروسی نقص به وجود می آید (63) .
3AB یک پلی پپتید متصل شونده به غشاء می باشد. 3AB pro توسط 3C pro کلیواژ شده و Vpg رها می گردد , سپس به کمپلکس تکثیری متصل می شود (16و63).

شکل 13)نحوه اتصال vpgبه ابتدای ژنوم پیکورناویروسها، محل کلیواژ vpg در شکل مشخص است.
1-11) محل سنتز RNA در سلول:
سنتز mRNAو سنتز RNA ی ژنومی پیکورنا ویروسها در سیتوپلاسم اتفاق می افتد. در سیتوپلاسم سلول های آلوده با پولیوویروس وزیکولهای غشاء دار کوچک زیاد می شود این وزیکولها محل سنتز RNA ی پیکورنا ویروسها می باشند. تجمع این وزیکولها در نتیجه جلوگیری از انتقال آنها از رتیکولوم آندوپلاسمیک (ER)به سطح سلول است. وجود پروتئین های 3A و 2B از انتقال گلیکو پروتئین ها به سطح سلول جلوگیری می کند (64).
دو یافته مهم دیگر در سلول که بر سنتز RNA در این وزیکول تأثیر دارد:
I– جلوگیری از سنتز پولیو ویروس با سرولنین (Cerulenin)
II–داروی برفلدین A(Brefeldin A ) که یک متابولیت قارچی است, با مسدود کردن انتقال پروتئین از ER به سطح سلول، از سنتز RNA ویروس جلوگیری می کند (65). این دارو از حرکت وزیکولهای غشایی از ER به فضا و درون غشاهای گلژی ممانعت می کند در حضور این ماده وزیکولهای غشایی تجمع نمی یا بند و از سنتز RNAویروس جلوگیری می شود. دو پروتئین 3AB و 2C در کمپلکس تکثیر وزیکولهای غشایی قرار می گیرند که پیش ساز 3ABپروتئین است که Vpgرا به غشاء متصل می نماید و 2C pro نیز RNA را به غشاء در کمپلکس تکثیر متصل می کند (66).
1-11-1)ترجمه و تکثیر مولکول RNA :
ژنوم پیکورنا ویروسها +ssRNAمی باشد و بعنوان mRNAعمل می کند اما یک سوال مهم بوجود می آید. چگونه RNA پلیمراز ویروسی از′ 5 <....′3 در روی رشته مثبت حرکت می کند در حالیکه ریبوزوم در جهت مخالف حرکت می کند؟
هنگامی که در ریبوزوم RNA ویروسی حضور دارد تکثیر رخ نمی دهد در مقابل هنگامی که RNA ویروسی از ریبوزوم خارج می گردد سنتز RNA افزایش پیدا می کند و این نشان می دهد که ترجمه و تکثیر همزمان رخ نمی دهد (67).

شکل 14)- سنتز RNA و ترجمه پروتئین به جهت سنتز RNA و پروتئین دقت شود.در پیکورنا ویروسها این دو مرحله همزمان نیستند لذا برخورد بین ریبوزوم ها و RNA پلیمراز روی نمی دهد.
به نظر می رسد که ساختار برگ شبدری شکل در 5´- UTRرشته مثبت می تواند بر این موضوع که آیا ترجمه انجام شود یا تکثیر انجام شود نشان داده شده که پروتئین های متصل شونده به Poly ( c) ساختار برگ شبدری شکل پولیو ویروس سبب تحریک سنتز پروتئین می شود (68و69).

شکل 15- مدل سنتز ssRNA پولیوویروس:تصویر شماتیکی از کمپلکس RNA که در108 نوکلوتید ابتدایی از +ssRNA یک ساختار برگ شبدری را به وجود می اورد . به منظور باند شدن 3CD ویروس به s---loop D ابتدا باید پروتئین متصل شونده به poly r(C) به s---loop B بچسبد(این کمپلکس برای سنتز dsRNA ± ضروری می باشد.
1-12) چگونگی تشخیص RNA ویروسی و سلولی از یکدیگر:
در پیکورنا ویروس ها آنزیمRNA پلی مراز وابسته به RNA یک آنزیم خاص الکو می باشد. پروتئاز 3D تنها می تواند RNA ویروسی را کپی کند و قادر به کپی RNA سلولی در سلول آلوده نمی باشد. البته آنزیم خاص می تواند بخوبی هر نوع RNA پلی آدنیلی را در صورت وجود یک پرایمر اولیگو کپی کند. بخش 3´- UTRدر رشته مثبت دارای یک RNA pseudoknotاست که عنوان می شود نقش خاصی در اختصاصی بودن محل کپی برداری RNA توسط 3D polایفا می نماید. ایجاد موتاسیون در این ناحیه منجر به تولید ویروسهایی می گردد که در آنها سنتز RNAمختل می شود این موضوع دلالت بر اهمیت pseudoknot سنتزRNAهایزنجیره ای منفی دارد (26). زمانیکه میزان 3ABزیاد است پلی مراز 3D یا 3CD نمی تواند به انتهای RNAپولیو ویروس متصل گردد و به نظر می آید کمپلکس 3AB- 3D به طور اختصاصی به 3´این شبه گره متصل می گردد. علی رغم این نتایج که دلالت بر اهمیت pseudoknot در سنتز RNA دارد. پولیو ویروس های فاقد 3´- UTRقادر به تکثیر هستند (26). به نظر می رسد که تشخیص اولیه و انتخاب الگو توسط پلی مراز صورت می گیرد.
1-13) مرحله تجمع و تشکیل ذرات عفونی:
در این مرحله RNA وارد کپسید شده، ویریون با کلیواژ نهایی بالغ می شود. در طی سنتز پروتئین های کپسید دومن های β- barrelمرکزی شکل می گیرد و تداخلات درون مولکولی در سطح این دومن ها منجر به تشکیل واحدهای ساختمانی می گردد. پس از اینکه پیش ساز P1 از 2Aجدا شد اتصال بین Vpo- Vp3 و Vp3-Vp1 توسط 3CD pro کلیواژ می گردد. جایگاه کلیواژ در بخش های انعطاف پذیر بین دومن های β- barrel واقع شده اند. در کپسید بالغ، انتهای کربوکسیلی سه پروتئین Vp1, Vp2, Vp3 در سطح کپسید قرار می گیرد. در حالیکه انتهای آمینی آنها در سطح داخلی ویریون است و شبکه ای وسیع از تداخلات در بین پروتومرها بوجود می آید. این مرحله اولین مرحله تجمع در پیکورنا ویروس ها است و ایجاد پروتومرهای 5s می نماید.(شکل 16)
واحدهای ساختاری نابالغ دارای یک کپی از Vp1, Vp2, Vp3 هستند سپس 5 پروتومر به صورت یک پنتامر تجمع می یابند و ذرات 14s شکل می گیرد این ذرات می توانند به طور خود به خودی به 80s (کپسید خالی) تبدیل شوند. کپسیدهای توخالی که در سلول های آلوده یافت می شوند به عنوان مخزنی برای پنتامرهای 14sمی باشند (70و16و14).
در آخرین مرحله مرفوژنز اغلب مولکولهای VP0 به VP4 , VP2کلیواژ می شوند (شکل 17) (16و14).

شکل 16) مراحل ساخته شدن واحدهای ساختمانی و عملکرد 3CD pro..

شکل 17) مراحل مرفوژنز پیکورنا ویروسها. ابتدا پیش ساز p1 از p2 جدا شده , سپس توسط 3CDpro به vp2 وvp1 وvp3 کلیواژ می گردد.پروتومرهای5S به طور خودبخودی به شکل 14S درمی ایند و پنتامرهای کپسید های خالی 80 S را به وجود می اورند در دو مسیر ذرات پیش ویریون 150S تشکیل میگردد ودر نهایت کلیواژ نهایی انجام شده VP0 به VP4 و VP2 می شکند.
1-14) پاراکو ویروسها Parechoviruss :
پاراکو ویروس شامل 2 تیپ یک و دو (HPEV1 , 2) می باشد. این دو تیپ قبلاً به عنوان اکوویروس تبپ 22 و 23 طبقه بندی شدند. مطالعات ژنومیک این ویروسها نشان داد که این دو ویروس تنها 30درصد از لحاظ اسید آمینه ای با پیکورنا ویروسهای دیگر تشابه دارند. از طرف دیگر کپسید این ویروسها تنها سه پروتئین دارد و Cleavageپپتید Vpo به Vp2و Vp4 صورت نمی گیرد. این موضوع منجر به طبقه بندی مجدد این ویروسها و قرار دادن آنها در جنس جداگانه ای به نام پاراکو ویروس گردید (10).
1-14-1) جداسازی و خصوصیات اولیه پاراکوویروسها:
در سال 1956 در طی مطالعه اسهال تابستانی Sabinو Wigandمشخص کردند که عامل آن دو تا ویروس جدید است که پیش از آن جدا نگردیده بود و از روی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی تحت نام اکو ویروس 22 و اکوویروس 23 نامگذاری گردیدند (71) که اخیراً نام پاراکوویروس تیپ 1و2 نامیده شده اند.
HPEV1 و HPEV2 با انواع دیگر انتروویروس ها متفاوت هستند برای مثال کشت دادن و سازگار کردن این ویروسها در سلول های کلیه مشکل است و میزان CPE در کشت سلولی تک لایه محدود می باشد (71). ظاهراً سلولهای آلوده در زیر میکروسکوپ نوری و الکترونی با سلول های آلوده با پیکورنا ویروسهای دیگر فرق داشتند که در این میان، از بین هستک وکروماتین هسته ای گزارش شده است (73و72) و بعداً مشخص گردید که ساختار ثانویه ژنوم پاراکو ویروسها با RNA پولیو ویروس تفاوت دارد (74).
یکی دیگر از فرق های مهم این دو ویروس با بقیه انترو ویروسها عدم جلوگیری از سنتز پروتئین سلولی میزبان است، و با اینکه سلول با ویروس آلوده شده است ولی همچنان قدرت سنتز پروتئین های سلولی خود را دارد ولی انترو ویروسها از سنتز پروتئین سلول میزبان با شکستن مولکول پروتئین P220 (فاکتور لازم برای سنتز پروتئین) جلوگیری می کنند (75و76).
پروب های cDNA که در روشهای هیبریداسیون جهت تشخیص پیکورنا ویروسها بکار می رفت، قادر به اتصال و شناسایی ژنوم پاراکوویروسها نمودند. این یافته ها موجب شد اندازه گیری های دقیق تری بر روی (HPEV1 , 2)صورت بگیرد (77و78و79). ماحصل این مطالعات منجر به رده بندی جدیدی در خانواده پیکورنا ویریده گردیده و نهایتاً جنس جدیدی به نام پاراکوویروس بوجود آمد (8).
1-14-2) پروتئین های پاراکوویروسها:
وقتی (HPEV1) توسط PAGE مورد بررسی قرار گرفت طرح پروتئینی متفاوت از انترو ویروسهای تیپیک نشان داد. به منظور تشخیص پروتئین های کپسید سه باند اصلی با وزن مولکولی 38، 5/30، 30 کیلو دالتون با کمک روش N- terminal sequencing آنالیز گردید (76). در آنالیزهای اولیه هیچ نتیجه ای از پلی پپتید 38 کیلو دالتونی حاصل نگردید. سپس این پروتئین تخلیص شد و به کمک تریپسین هضم گردید و به دنبال آن پپتیدهای مجزا سکانس شدند در نهایت مشخص گردید که این پلی پپتید دارای هر 2 بخش Vp4و Vp2 می باشد و محل کلیواژ Vp4 / Vp2 نیز در توالی آن وجود دارد. از این مشاهدات نتیجه گرفتند که در اغلب پارتیکل های HPEV1 مولکولهای VPO دستخوش پردازش به Vp4 وVp2 نمی گردند (8).
HPEV1و هر دو استرین HPEV2 توالی ها و ساختار بسیار مشابهی دارند و وجود این لوپ ها باعث می شود که 2 تیپ 1و2 ظاهری مسطح به خود بگیرند (80).پروتئین های غیر ساختمانی پاراکو ویروس ها شبیه بقیه پیکورنا ویروس ها است پروتئین 3D که RNA پلی مراز وابسته به RNA است و پروتئین 3c که یک پروتئاز و از خانواده تریپسین می باشد و مسئول اغلب مکانیسم های شکست پروتئینی در پیکورنا ویروس ها می باشد و فکر می کنند که این دو درگیر در فعالیت های کاتالیتیکی هستند (به ترتیب GxcGGو YGDD) و پروتئین 2C که فعالیت هلیکازی در پیکورنا ویروس ها داردو به نظر می رسد که همین نقش را در پاراکوویروس ها نیز داشته باشند. در عوض 3A , 2B , 2A پاراکوویروس ها تشابه کمتری با پیکورنا ویروس های دیگر دارد (76و81).
1-14-3) پردازش پروتئین در پاراکو ویروسها:
پردازش پروتئولیپتیک نقش مهمی در بیان ژنهای پیکورنا ویروسها ایفا می کنند بعلاوه پروتئازها نقش های دیگری از جمله,متوقف نمودن سنتز ماکرومولکول های سلول میزبان و ممانعت نمودن از رونویسی , ژن های سلولی بعهده دارند. اولین کلیواژ در پیکورنا ویروسها سریع اتفاق می افتد و منجر به جداشدن پیش سازما نهای ساختمانی و غیر ساختمانی (P1 – P2- P3) می گردد. در انترو ویروسها این عمل توسط 2A pro انجام می شود و انتهای آمینی 2A کلیواژ می گردد تا پیش سازهای پروتئین های کپسید (P1) جدا گردد. 2A pro درآفتو ویروسها کوتاه می باشد. در این جنس انتهای کربوکسیلی از 2A کلیواژ می گردد. 2A در کاردیو ویروسها طویل تر است و با همان روش کلیواژ می گردد. در عوض 2A هپاتو ویروسها با 4 گروه قبلی متفاوت است و فاقد خاصیت پروتئولیپتیکی می باشد (82و83).
در افتو ویروسها و کاردیو ویروسها یک پروتئاز دیگر هم وجود دارد که پروتئین L نامیده می شود. این Lproبا اثر خودش از پلی پروتئین جدا می گردد اما در این عمل وجود 3C نیز ضروری است. فعالیت پروتئولیتیکی پروتئین L را در ردیف ویروس تیپ 2 اسبی نیز می بینیم (80).
پروتئین L ، 2A هر یک عملکرد مشخص دارند و با ید در پاراکو ویروس ها هم عمل آن مشخص گردد. در پاراکو ویروس ها یک پلی پپتید کوتاه به طول 12 اسید آمینه پروتئین L را می سازد دقیقاً مانند هپاتو ویروس ها. (80) این قسمت برای میریستیله شدن انتهای N ضروری است و این قسمت در هپاتو ویروس ها فاقد فعالیت پروتئولیتیک بوده است. Lproکه در ابتدای ژنوم کاردیو و آفتو ویروسها قرار دارد خاصیت پروتئازی دارد و خودش را از ابتدای پلی پروتئین آزاد میکند . در ابتدا عقیده داشتند که HPEV1,2 دارای Lpro کوتاهی می باشد. این حالت در مورد هپاتو ویروسها نیز پیشنهاد شده بود ولی همه این فرضیات رد شد و معلوم نگردید که تنها کاردیو و آفتو ویروسها واجد Lproدر ابتدای ژنوم خود هستند (80).
در پاراکو ویروسها تنها 3C pro خاصیت پروتئازی دارد مانند هپاتو ویروسها (شکل18)

(شکل18) کلیواژ اولیه پروتئین پیکورنا ویروسها : در سلولهای آلوده با انتروویروسها و رینو ویروسها با عمل پروتئازی 2Apro بخش p1 از بخشp2 جدا می گردد. در سلولهای آلوده با کاردیو ویروسها و آفتو ویروسها توسط 3Cpro اتصال P1-P2 قطع می گردد. در این ویروسها پروتئین 2A , پروتئاز نمی باشد . اما اتصال خودش(2A ) با 2B را قطع میکند. در تمام این ویروسها اتصال P2-P3 با عمل پروتئازی 3Cpro قطع می گردد. از طرفی در هپاتو ویروسها 3Cpro اتصال 2A-2B را نیز قطع می نماید. Lpro در FMDV باعث آزاد شدن پروتئین L از ابتدای ژنوم می گردد.1-14-4) 5´- UTRدر پاراکو ویروسها :
این قسمت در پیکورنا ویروسها بسیار مورد مطالعه قرار گرفته است و مشخص گردید که 5´- UTRدر ترجمه پروتئین و همانند سازی RNA دخالت دارد و با انجام موتاسیون در این ناحیه 5´- UTRمشخص گردیدکه 5´-UTRدر تعیین سلول هدف و بیماریزایی نیز نقش دارد. در این ناحیه تعدادی از عناصر ساختمان ثانویه و ساختار سوم به چشم می خورد موتاسیون در این نقطه با تغییراتی در پاتوژ نیسیتی همراه می باشد این ناحیه در طبقه بندی پیکورنا ویروسها نیز بکار می رود. تاکنون سه طرح از این ساختار گزارش شده 1- در رینو وانترو ویروسها 2- در کاردیو و آفتو ویروسها 3- در هپاتو ویروسها (8) (شکل19) نیمه انتهای ´3 از 5´- UTR پاراکو ویروسها مشابه نواحی 5´- UTRآفتو و کاردیو ویروسها می باشد. در این قسمت دومن هایی نظیرساختار چکشی شکل برجسته، نواحی پلی پیریمیدنی و کدون AUG که در شروع ترجمه دخالت دارد موجود است (81و84) .

شکل19: دیاگرام شماتیک ساختار ثانویه
5´- UTRدر پاراکو ویروس (A) درEMCV (B) و پولیوویروس .(C) همه پیکورنا ویروسها 20 نوکلوتید پائین دست نقطه شروع (AUG ) واجد Polypyrimidine tract هستند. در کاردیو ویروسها و آفتو ویروسها پس از این ناحیه یک ORF بزرگ وجود دارد; در حالیکه در انترو ویروسها و رینو ویروسها پائین تر از AUG یک توالی دیگر AUG نیز وجود دارد و پس از دومین AUG یک ORF وجود دارد. اتصال کوالانت VPg به ابتدای 5΄ ژنوم در شکل مشخص است.
1-14-5) ارتباط ژنتیکی پاراکوویروسها با پیکور نا ویروسهای دیگر:
با مشخص شدن سکانس ژنومی در پاراکوویروس معلوم شد که 5´- UTRاین ویروس متفاوت از دیگر پیکورنا ویروس ها است. (در تصویر 16) ارتباط ژنتیکی پاراکوویروس ها را با ویروس های این خانواده بر پایه پروتئین VP3نشان می دهد. در این قسمت انترو ویروس ها و رینو ویروس ها به همدیگر شباهت بیشتری دارند و پاراکوویروس ها و هپاتو ویروس ها دو دسته کاملاً مجزا هستند که ارتباط مولکولی کمتری با دیگر پیکورنا ویروسها دارند ولی آفتو ویروسها و کاردیو ویروسها در یک محدوده قرار می گیرند (8و81) .(شکل20)
26035061595

(شکل20) – دندروگرامی بر اساس پروتئین VP3در پیکورنا ویروسها.در این تصویر ارتباط ژنتیکی پیکورنا ویروسها و میزان شباهت های بین آنها مشخص شده است.
1-14-6) تداخلات بین HPEV1 و HPEV2 با سطح سلولهای حساس :
با تعیین توالی ژنوم پاراکو ویروس ها در قسمت انتهای کربوکسیلی پروتئین VP1یک سکانس ویژه به نام RGD ( آرژنین- گلایسین- اسید اسپارتیک) معلوم گردید (76و80). که در تشخیص سلول میزبان فعال است و این سکانس RGD در تماسهای سلول به سلول و سلول به ماتریکس فعالیت دارد. از این سکانس برای اتصال و ورود پاتوژنها زیاد استفاده می کنند. و در بین پیکورنا ویروسها FMDV و کوکساکی ویروس A9 که یک انتروویروس است از این سکانس RGD برای ورود استفاده می کنند. RGD در تماس اولیه ویروس با رسپتورهای سطح سلول واکنش می دهد (16و10و8). (شکل21)

(شکل21)– مقایسه توالی اسید آمینه ای در انتهای کربوکسیلی از VP1 در بین پاراکوویروسها CAV9
در HPEV1 با کمک پپتیدهای سنتتیک واجد RGD می توان این ناحیه را بلوک نمود. از طرف دیگر مشاهده شده که تیپ 1 برای اتصال به سطح سلول با کوکساکی ویروس A9 رقابت می کند. گیرنده این دو ویروس همان گیرنده ویترونکتین ( اینتگرین α vβ3) است. در مورد کوکساکی ویروس A9. توالی RGD برای حیات ویروس ضروری نیست و می توان بدون از دست رفتن کامل عفونت زایی این ناحیه را با کمک ایجاد موتاسیون یا هضم با تریپسین تخریب نمود. ولی، حذف توالی RGDدر تیپ 1 پاراکوویروس کشنده است که این موضوع دلالت بر نقش حیاتی RGD در چرخه تکثیری HPEV1دارد. (شکل 22)

(شکل 22) نتایج Plaque assay پاراکو ویروس انسانی تیپ 1 :سلولCHOαvβ1 (فلاسک A ), سلول CHOαvβ3 (فلاسک B), و CHOwt (فلاسک C ). سلولهای تخمدان هامستر چینی با پلاسمیدهای حاوی ژن 1,2αvβ ترانسفکت گردید و سپس این دو سلول ترانس ژن به همراه سلول وحشی توسط HPEV-1 آلوده شد. تعداد پلاک و مورفولوژی آنها توسط تست Plaque assay مورد ارزیابی قرار گرفت.
عفونت با پاراکو ویروس ها را می توان با استفاده ازAnt α i و Anti β1 بلوک کرد و با استفاده از آنتی بادی) آنتی (MM-Matrix metalloproteinase- 9 به کمترین حد ممکن می رساند (76). در نتیجه پیشنهاد می کنند که ویروس ممکن است از اینتگرینα βاستفاده بکند و معلوم گردید که این تماس بینRGD و اینتگرین αβ برای ورود ویروس ضروری است و این تنها راه ورود ویروس برای داخل به سلول است. در حالی که کوکساکی ویروس A9از دو راه متفاوت با سطح سلول تماس پیدا کرده و داخل می گردد در مورد بعضی گونه های ویروس الزاماً از تماس RGD – اینتگرین αβ برای ورود استفاده می کنند ولی تعدادی از گونه ها توانایی تماس با هپارین سولفات را نیز دارند (10و8و76).
1-14-7) عوارض کلینیکی و اپیدمیولوژی پاراکوویروسها:
HPEV-1 اولین بار در طی یک اپیدمی اسهال تابستانی در سال 1956 ایزوله شد.WHOدر سالهای 1967 تا 1974 ، 60 درصد از عفونتهای تیپ 1 در کودکان کمتر از یک سال دیده می شود و این آمار در مورد سایر اکوویروسها 15 درصد می باشد (85). میزان گرفتاری CNS در عفونتهای HPEV-1حدود 12 درصد است که این میزان کمتر از عفونتهای انتروویروسی می باشد در حالیکه علائم گاسترو آنتریت (29%) و علائم تنفسی (26%) بیشتر دیده می شود (86و87).
در فنلاند یک مطالعه سرواپیدمیولوژی بر روی 110 عفونت انجام شد و معلوم گردید که 95 درصد نوزادان آلوده دارای آنتی بادی علیه HPEV-1 هستند در حالیکه تنها 20 درصد از بچه های بین 2 تا 12 ماه سرم مثبت می باشند (86). اما درصد افراد سرم مثبت بعد از اولین سال زندگی افزایش می یابد. بطوریکه 97 درصد از بالغین از لحاظ HPEV-1 سرم مثبت هستند که در این میان تنها 30 درصد آنها دارای آنتی بادی علیه اکوویروس تیپ 30 می باشند. این موضوع دلالت بر شیوع زیاد عفونت های HPEV-1 دارد (10).
یافته های خودمان (دکتر قاضی) در ایران نشان داد که مهمترین فصل شیوع در نوزادان کمتر یک سال , فصل بهار و پائیز می باشد و در این مطالعه نشان داده شد که پسر ها بیشتر از دختران دجار علائم بالینی اسهال بودند( 124). مهمترین فصل شیوع در تابستان و پاییز است و متداول ترین نشانه بالینی وجود اسهال می باشد و بعد از آن عوارض تنفسی مشاهده می شود و عوارض جسمی به میزان کمتری شیوع داشته است و کمتر آنسفالومیلیت و انواع دیگر عوارض عصبی گزارش گردیده است. ایزوله های تیپ 2 پاراکوویروس به میزان کمتری شیوع داشته در عفونت با این تیپ از ویروس نیز علائم ناراحتی گوارشی دیده می شود (90و88و89).
1-14-8) ویروس های مرتبط با پاراکوویروسها در حیوانات:
در کشور سوئد از یک موش ساحلی اروپایی یک پاراکوویروس جدیدی به نام L jungan virus ایزوله نمودند (91). که موجب میوکاردیت در موش ها می شود و با بررسی سکانس این ویروس معلوم گردید که به جنس پاراکوویروس شباهت داد (8)، توالی اسیدهای آمینه VP3 در این ویروس حدود 70 درصد به پاراکوویروس شباهت دارد. قبلاً این توالی فقط در پاراکوویروس انسانی مشاهده شده بود و جدا سازی این ویروس یک نظریه مهم را شدت بخشید که جدا سازی پاراکوویروس از یک موش ساحلی اروپایی دلیل مهمی برای زنونوز (zeonoz)بودن این ویروسها می باشد (8 و 91).

–261

نتیجه گیری : با استفاده از یافته های حاصل از این تحقیق می توان گفت در ولوواژینیت کاندیدایی حاد یا مزمن شاید فلوکونازول تأثیر روی سویه های کاندیدا آلبیکنس داشته باشد ولی در ولوواژینیت کاندیدایی عودکننده یا باید از فلوکونازول با دوز بالا استفاده شود یا از داروهای دیگر ضد قارچی استفاده شود.
واژگان کلیدی: ولوواژینیت کاندیدایی عودکننده، فلوکونازول، کاندیدا آلبیکنس.

فصل اولمقدمه
عفونت های فرصت طلب ناشی از مخمرها در دهه های اخیر اهمیت زیادی یافته است(30).علت این مسئله روند رو به تزاید این عفونت ها از لحاظ بروز و شیوع در جامعه و در بین عفونت های بیمارستانی است .
کاندیدیازیس طیفی از بیماری های قارچی فرصت طلب است که در افراد مستعد به شکل عفونت های سطحی ساده تا عفونت های سیستمیک ایجاد می شود(45).
امروزه کاندیدیازیس از بیماری های مهم عفونی مطرح در جهان است و در حدود 25 تا 50 درصد عفونت های بیمارستانی در بخش مراقبت های ویژه و 8 تا 15 درصد کل عفونت های بیمارستانی را کاندیدیازیس تشکیل می دهد(69).
ولوواژینیت کاندیدیایی دومین عفونت شایع دستگاه تناسلی زنان پس از واژینوز ناشی از باکتری های بی هوازی است. حدود 75 درصد از خانم ها حداقل یک بار در طول عمر خود دچار عفونت کاندیدیایی واژن می شوند. این بیماری ممکن است به صورت حاد، مزمن و یا عود کننده تظاهر نماید. اغلب زنان به فرم حاد بیماری مبتلا می گردند (49.50). میزان بروز ولوواژینیت کاندیدیایی عود کننده (RVVC) توسط گونه های کاندیدا روند رو به افزایشی را نشان می دهد. (RVVC) حالتی است که در آن علایم بیماری در طول یک سال حداقل 3 بار و یا بیشتر تکرار گردد(34.35). این علایم ممکن است شدید و همراه با تحمل رنج و ناراحتی قابل ملاحظه ای برای آنان باشد(51.49).
علایم محلی ولواژینال شامل ترشحات زرد شیری، غلیظ و غشا کاذب خاکستری در سطح مخاط واژن همراه است(19). در این بیماری سوزش ادرار بسیار شایع بوده و ترشحات واژن افزایش می یابد، اما شایع ترین علامت خارش ناحیه واژن است که اغلب در طول دوره قبل از قاعدگی شدیدتر می شود(100).
شایع ترین مخمرهای جدا شده از واژن شامل کاندیدا آلبیکنس (۸۵ تا ۹۰ درصد) کاندیدا گلابراتا (۵ تا10 درصد) وکاندیدا تروپیکالیس (۱ تا ۳ درصد) می‌باشد. سایر گونه‌های مخمری که از شیوع کمتری برخوردارند عبارتند از کاندیدا دابلینینسیس، کاندیدا کروزه‌یی، کاندیدا فاماتا (۵/۰ تا ۲ درصد) می باشند.
عامل بیماری قارچی فرصت طلب از جنس کاندیدا می باشد که به صورت همزیست در دستگاه گوارش، مخاطات، پوست انسان و سایر حیوانات بوده و حتی در محیط نیز یافته می شود. این عامل در شرایطی که مقاومت میزبان به صورت موضعی یا سیستمیک به صورت اولیه و یا ثانویه در اثر عوامل مستعد کننده بیماری کاهش یابد، قادر به ایجاد بیماری در هر ناحیه از بدن خواهد بود. وجود محدودیت هایی همچون تعداد کم داروهای ضد قارچی، سمی بودن آنها برای سلول های بدن یا کاهش حساسیت یک سری از گونه های کاندیدا به این داروها، همواره به عنوان معضلات اساسی در درمان بیماری مطرح بوده اند(38).
از دلایل مهم ایجاد بیماری واژینیت کاندیدایی عودکننده، حذف ناقص کاندیدا از واژن پس از درمان ضدقارچی است، هر چند ممکن است علایم بالینی و التهابات بیمار کم شود، اما ارگانیسم به تعداد کم در واژن میماند و منجر به ناقل شدن بیمار می گردد(76).
بر اساس مطالعات، بعضی از گونه های کاندیدا نسبت به داروهای ضد قارچی مثل فلوکونازول مقاومت نشان می دهند. بنابراین با جداسازی و شناسایی گونه های کاندیدای مسبب فرم عود کننده ولوواژینال و تعیین حساسیت آنها به داروی فلوکونازول می توان الگوی مناسبی از بیماران و مقاومت دارویی آنرا در منطقه جغرافیایی مورد پژوهش گزارش کرد.
اهداف این تحقیق:
تعیین گونه های کاندیدایی مقاوم به داروی فلوکونازول در درمان بیماران مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدیایی عود کننده ( RVVC ) شهرستان گناباد می باشد.
تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی ( MIC ) داروی فلوکونازول روی نمونه های کاندیدایی مبتلایان به ولوواژینیت عود کننده.
تعیین حداقل غلظت قارچ کشی ( MFC ) داروی فلوکونازول روی نمونه های کاندیدایی مبتلایان به ولوواژینیت عود کننده.

فصل دوممروری بر تحقیقات انجام شده


1-1 ) قارچ شناسی پزشکی :قارچ شناسی به معنای مطالعه قارچ ها است. بیش از 50000 گونه قارچ وجود دارد، که اکثر آنها برای انواع انسان سودمند هستند. این قارچ ها در طبیعت یافت می شوند و وجود آنها برای تجزیه و بازیافت مواد آلی ضروری است (36).
برخی از قارچ ها با ایفای نقش در تولید مواد غذایی و نوشابه های الکلی، تا حدود زیادی کیفیت زندگی ما را بهبود می بخشند. عده دیگری از قارچ ها با تهیه متابولیسم های ثانویه مفید و فعال از نظر زیستی، نظیر آنتی بیوتیک ها (مثل پنی سیلین) و داروهای سرکوب کننده ایمنی ( مثل سیکلوسپورین) ، خدمت عظیمی به علم پزشکی کرده اند(9).
همه قارچ ها ارگانیسم هایی یوکاریوک هستند و هر سلول قارچی حداقل یک هسته و غشای هسته ای ، شبکه آندوپلاسمی ، میتوکندری و دستگاه ترشحی دارد. اکثر قارچ ها هوازی اجباری یا اختیاری هستند. آنها کموتروفیک هستند، آنزیم هایی ترشح می کنند که انواع بسیاری از مواد آلی را به مواد مغذی محلول تجزیه می کنند و سپس این مواد مغذی به صورت غیر فعال جذب سلول قارچ شده و یا به روش انتقال فعال وارد آن می گردند. عفونت قارچی را مایکوزها می نامند(9).
اکثر قارچ های بیماری زا برونزاد هستند و زیستگاه طبیعی آنها در آب، خاک و بقایای مواد آلی است. مایکوزهایی که میزان بروز آنها از همه بیشتر است، یعنی کاندیدیاز و درماتوفیتوزها ، به وسیله قارچ هایی ایجاد می شوند که بخشی از فلور میکروبی طبیعی انسان هستند و یا برای بقاء در بدن انسان به عنوان میزبان، تا حدود زیادی تطابق پیدا کرده اند. به منظور سهولت میکوزها را می توان با عناوین سطحی ، جلدی ، سیستمیک و فرصت طلب رده بندی کرد(10).
درمان اکثر میکوزها مشکل است. خوشبختانه ، هم اکنون توجه و علاقه فرآیندها به قارچ های مهم از نظر پزشکی و همچنین نسبت به جستجو برای یافتن عوامل بیماری زایی قارچ ها و اهداف درمانی بالقوه آنها جلب شده است(10).
1-2 ) عفونت های قارچی :عفونت های قارچی اگرچه در گذشته شیوع کمتری نسبت به عفونت های باکتریایی و ویروسی داشته اند، ولی در چند دهه اخیر مسؤول افزایش چشمگیری در میزان بروز بیماری بوده اند. در بررسی انجام شده مابین سا لهای 1979 الی 2000 در آمریکا بروز عفونت های قارچی 207 درصد افزایش داشته است(35).
در یک بررسی دیگر انجام شده در آمریکا مابین سال های 1980 تا 1997 نشان داده شده که میزان مرگ و میرناشی از عفونت های قارچی افزایش یافته و به عنوان یکی از متداول ترین علل مرگ و میر از رتبه دهم به رتبه هفتم ارتقاء یافته است (36).
عوامل مستعدکننده ای مانند استفاده وسیع و طولانی مدت از آنتی بیوتیک ها، کورتون ها، داروهای سرکوب گر ایمنی و بیماری های زمینه ایی همچون دیابت، ایذر و بدخیمی ها و ... سبب شده اند که بیماری های قارچی خصوصاً کاندیدیازیس نسبت به گذشته رو به افزایش باشند. در طی یک تحقیق گونه های کاندیدا به عنوان چهارمین عامل از عوامل مرگ و میر ناشی از عفونت های گردش خون به حساب آمده و 35 درصد از موارد عفونت های خونی منجر به مرگ را، شامل شده اند . (36.37).
عامل بیماری قارچی فرصت طلب از جنس کاندیدا می باشد که به صورت همزیست در دستگاه گوارش، مخاطات، پوست انسان و سایر حیوانات بوده و حتی در محیط نیز یافته می شود. این عامل در شرایطی که مقاومت میزبان به صورت موضعی یا سیستمیک به صورت اولیه و یا ثانویه در اثر عوامل مستعد کننده بیماری کاهش یابد، قادر به ایجاد بیماری در هر ناحیه از بدن خواهد بود. وجود محدودیت هایی همچون تعداد کم داروهای ضد قارچی، سمی بودن آنها برای سلول های بدن یا کاهش حساسیت یک سری از گونه های کاندیدا به این داروها، همواره به عنوان معضلات اساسی در درمان بیماری مطرح بوده اند(38).
عفونتهای قارچی واژن در 95-85 درصد موارد در اثر کاندیداآلبیکنس بوجود می آیند . کاندیدا آلبیکنس را میتوان از واژن 20 درصد زنان بدون علامت جدا کرد(74.75).
عفونت های فرصت طلب ناشی از مخمرها در دهه های اخیر اهمیت زیادی یافته است(39).علت این مسئله روند رو به تزاید این عفونت ها از لحاظ بروز و شیوع در جامعه و در بین عفونت های بیمارستانی است . بیماری های ناتوان کننده ای مثل ایدز، دیابت ملیتوس و بدخیمی ها و نیز افزایش کاربرد کاتترهای وریدی، پیوند اعضاء، داروهای ضد سرطان، آنتی بیوتیک های وسیع الطیف و درمان با کورتیکو استروئیدها از جمله زمینه های مساعد کننده ابتلا به عفونت های مخمری است (38).
اهمیت شناسائی عوامل قارچی متنوع این عفونت ها را در چند جهت می توان خلاصه نمود : 1) برخی از اشکال بالینی خاص با برخی از عوامل خاص مرتبط هستند. به عنوان مثال بیماران مبتلا به لوسمی بیشتر به کاندیدا آلبیکنس مبتلا می شوند در صورتی که بیماران واجد تومورهای سخت در معرض خطر بیشتری برای ابتلا به عفونت های ناشی از کاندیدا گلابراتا هستند. 2) ویرولانس هر کدام از گونه های مخمری با یکدیگر متفاوت بوده و شرط لازم درک پاتوژنز عفونت ها،تعیین هویت عامل علیتی بیماری است .3) گونه های مختلف نسبت به داروهای ضد قارچی حساسیت متفاوتی دارند. به عنوان مثال حساسیت کاندیدا تروپیکالیس کمتر از کاندیدا گلابراتا نسبت به فلوکونازول 32-4 برابر کاندیدا آلبیکنس است. همچنین کاندیدا لوزیتانیا دارای مقاومت نسبی ذاتی به آمفوتریسین B است، پیدا کردن منابع عفونت و درک راه های انتقال بیماری به ویژه در طغیان های بیمارستانی مستلزم شناسائی گونه ها است. (40.41).
1-3 ) مخمرها (Yeasts) :مخمرها قسمت عمده ای از فلور نرمال پوست و سطوح مخاطی را شامل می شوند و هنگامی که میزبان به هر علتی دچار نقص ایمنی شود، موجب عفونت های قارچی فرصت طلب سطحی، جلدی، مخاطی و یا سیستمیک می شوند. عفونت های مخمری از جمله کاندیدیازیس از مهم ترین و شایع ترین عفونت های قارچی فرصت طلب هستند که به صورت حاد، تحت حاد و مزمن در پوست، ناخن، سطوح مخاطی واژن، برونش، ریه و دستگاه گوارش ایجاد می شوند گاهی نیز منتشر شده و کلیه، کبد، ریه و قلب را گرفتار می سازند(11). واکنش میزبان در برابر بیماری از یک التهاب مختصر تا بروز ضایعات چرکی و گرانولوماتوز در تغییر است. در چند دهه اخیر افزایش چشمگیری در عفونت های ایجاد شده توسط این ارگانیسم ها اتفاق افتاده است و افزایش بروز عفونت های فرصت طلب مخاطی و سیستمیک توسط مخمرها با افزایش جمعیت بیماران با سیستم ایمنی ناکارآمد و هم چنین پیشرفت در علم پزشکی و استفاده از روش های درمانی جدید در ارتباط بوده است(42.43).
1-3-1 ) روشهای شناسایی مخمرها :شناسایی مخمرها برای درک روابط اپیدمیولوژیک عفونت - محیط و شناخت مخازن، منابع و منشأ بیماری ضروری است. روش های متعددی از گذشته تا حال برای تعیین هویت مخمرها و در رأس آنها کاندیداها به کار رفته است. این روش ها را کلاً می توان به دو گروه فنوتیپیک و ژنوتیپیک تقسیم نمود. از جمله روشهای گروه اول عبارت است از: مرفولوژی مخمرها در محیط عصاره مالت آگار، روش های جذب و تخمیر قندها ) اجرای این روش ها بسیار متنوع بوده از متدهای قدیمی کشت در لوله های حاوی محیط مایع) روش ویکرهام( تا استفاده از دیسک ها ی قندی)اگزانوگرافی( ، استفاده از کیتهای تجارتی مثل API و بالاخره روش های جدید اتومات مثل سیستم Vitek در تغییر است، روشهای سرولوژی ) مثل سیستم تجارتی (Candida Check، روش کشت روی محیط های رنگ زا مثل (CHROMagar Candida) و روش های دیگر(107.108).
روش های ژنوتیپی نیز متنوع بوده، از جمله می توان به استفاده از پرایمرهای اختصاصی در PCR و
multiplex- PCR ، استفاده از پروب های اختصاصی هرگونه، ،PCR-RFLP ، تعیین توالی نواحی ژنی خاص و real-time PCR اشاره نمود (109).
1-4 ) عفونت فرصت طلب :
اکثر بیمارانی که به عفونت های فرصت طلب مبتلا می شوند به بیماری های زمینه ای وخیم و اختلال دفاع های میزبان دچار هستند. عفونت های فرصت طلب در افراد واجد کفایت ایمنی هم مشاهده می شوند. در حین عفونت ، اکثر بیماران پاسخ های ایمنی سلولی و همورال قابل ملاحظه ای نسبت به آنتی ژن های قارچی نشان می دهند (74).
عفونت کاندیدا می تواند سطحی یا تهاجمی باشد. عفونت سطحی اغلب در پوست یا غشای مخاطی تأثیر می گذارد و می تواند با موفقیت با داروهای ضد قارچی موضعی درمان شوند. با این حال عفونت های قارچی تهاجمی اغلب تهدید کننده زندگی هستند، که احتمالاً به علت روش های تشخیصی ناکارآمد و نامناسب اولیه در درمان داروهای ضد قارچ است(34).
عوامل خطر برای کاندیدیازیس تهاجمی شامل : عمل جراحی ( به خصوص جراحی شکم ) ، سوختگی ، اقامت طولانی مدت در بخش مراقبت های ویژه ، آنتی بیوتیک های وسیع الطیف و سرکوب کننده های سیستم ایمنی هستند(34).
پیشرفت در عملکردهای پزشکی به عنوان مثال : شیمی درمانی ، پیوند عضو ، دیالیز ، تغذیه تزریقی و کاتاتر وریدی مرکزی همچنین به تهاجم و کلونیزاسیون قارچ ها کمک می کنند. (34).
1-5 ) کاندیدا و کاندیدیازیس :-5-1 ) تاریخچه : در حدود 200 سال زمان نیاز بود تا عامل بیماری تراش، اولین شکل بیماری کاندیدیازیس که توصیف شده است، بدرستی تشخیص داده شود. اولین اشاره به لفظ تراش در سال 1665 میلادی توسط Pepys بوده است، هرچند منبع اصلی و نسخه اصلی اولین توصیف از این بیماری مربوط به بقراط است که در چهارصد سال قبل از میلاد مسیح در دو بیمار آنرا توصیف کرده است(77). در سال 1846 میلادی Berg در یک مطالعه علمی بر روی بیماری، ارتباط بیماری را با قارچها نشان داد. در سال 1839 میلادی Langenbeck عامل بیماری را برای اولین بار جدا کرد و در سال 1847 میلادی، Robin آنرا تحت عنوان Oidium albicans طبقه بندی کرد. این اولین بار بود که لفظ آلبیکنس(به معنای سفید کردن یا سفید شدن) درباره عامل تراش بکار برده شد. در سال 1888 Hansen عامل بیماری در گروه مونیلیا قرار داد. در سال 1923 Berkhout بدلیل آنکه این موجود زنده به وضوح با گونه های مونیلیا تفاوت داشت، نام ژنریک کاندیدا (بر گرفته از یک لغت لاتین به معنای لباس سفیدی که کاندیدا های مجلس سنا در روم باستان بر تن میکردند)، را برای آن پیشنهاد داد. در سال 1931 Benham بدنبال ملاک های تشخیص این قارچ، خصوصیات تشخیصی آنرا تشریح کرد. و در سال 1954 میلادی در هشتمین کنگره گیاه شناسی رسماً کاندیدا آلبیکنس به عنوان عامل بیماری پذیرفته شد. در سالهای 1950 تا 1990مطالعات اغازین انجام شده خصوصا در زمینه تاکسونومی،بیوشیمی و میکروسکوپی بسط یافت(112).
جنبه های بیولوژی مولکولی در طی دهه 80 میلادی با کشف دیپلوئید بودن ژنوم کاندیدا آلبیکنس و وجود هتروزیگوسیتی طبیعی در بین جدایه ها انتشار یافت(113).روشهای ترانسفورماسیون، جداسازی ژنها، حذف ژنها، تایپینگ سوشها و آنالیز کروموزومها گسترش یافت. تعیین توالی اسید های نوکلئیک در ژنوم کاندیدا آلبیکنس کامل شده است و مدارک جدیدی دال بر وجود مرحله جنسی در آن بدست آمده است(114).
کاندیدیازیس بعنوان یک معضل بالینی ، اصولا در بیمارانی که سیستم ایمنی شان به مخاطره افتاده است همچنان باقی مانده است. این اتفاق ناگهانی نبوده است - در حالیکه توجه به کاندیدا آلبیکنس به عنوان مهمترین گونه بیماریزا بیشتر بوده است - اکنون سایر گونه ها از قبیل کاندیدا گلابراتا ، کاندیدا کروزئی و کاندیدا دابلی نینسیس نیز از نظر بالینی اهمیت پیدا کرده باشند. تا حدی این مسئله مربوط به پیشرفت های علمی در این زمینه است. استفاده از فلوکونازول که به عنوان یک داروی جایگزین برای آمفوتریسین B توجهات را به خود جلب کرد، منجر به ظهور برخی از گونه ها به عنوان گونه بیماریزا شد که مقاومت ذاتی یا اکتسابی به این دارو داشتند(115).
1-5-2 ) بیولوژی :جنس کاندیدا شامل حدود 200 گونه متفاوت است ، اما تنها تعداد کمی از گونه ها پاتوژن های فرصت طلب انسان هستند و سبب عفونت میزبان ناتوان یا دارای نقص ایمنی می شوند(115).در واقع 65% از گونه های کاندیدا توان رشد در 37 سانتی گراد را ندارند؛ خصوصیاتی که در واقع برای بیماریزایی یک عامل عفونی لازم است(116).
کاندیدا یک مخمر تخم مرغی کوچک با دیواره نازک و قطرm 4,6 % است و جوانه تولید می کند. ارگانسیم های این جنس درون بافت به 3 فرم هستند. بلاستوپور ، سودوهیف و هیف. کاندیدا به آسانی بر روی محیط کشت ساده رشد می کند. لیز سانترفیوژنی به جدا کردن آن از خون کمک می کند. گونه ها توسط آزمایش بیو شیمیایی ( در حال حاضر توسط وسایل اتوماتیک )یا بر روی آگارهای خاص شناسایی می شوند(116).
از نکات قابل توجه این است که تعداد عوامل بیماریزای کاندیدایی رو به افزایش است که تغییر در طبقه بندی و نیز کشف گونه های جدید نیز در آن دخیل بوده است. بطور مثال کاندیدا گلابراتا در ابتدا در خانواده کاندیدا قرار نداشت و کاندیدا دابلی نینسیس از گونه آلبیکنس جدا شده است. برخی گونه نیز بالقوه برای بیماران درگیر از نظر سیستم ایمنی بیماریزا هستند. گونه های کاندیدا اغلب برای انسان غیر بیماریزا اند و بصورت ساپروفیت در محیط وجود دارند، اما گونه های بیماریزا معمولا از بیماران و یا میزبانهای انسانی و حیوانی گزارش شده اند، بنابراین اعتقاد بر این است کاندیدیازیس منشأ درونی دارد(84).
جنس کاندیدا متشکل از اجرام قارچی هتروژنی است که به شکل مخمری رشد می کنند و اغلب گونه ها در کنار فرم مخمری اشکال فیلامنتی مثل هایف کاذب نیز ایجاد می کنند( جدول -1). اما در
این بین کاندیدا آلبیکنس و کاندیدا دابلینینسیس ایجاد میسلیومهای حقیقی می کنند و به آنها پلی مورفیک می گویند. در آزمایشگاهها از روی خصوصیات میکروسکوپی و عوامل موثر بر رشد برای تشخیص استفاده می کنند(جدول-2).
بطور معمول از آزمایش ایجاد لوله زایا در محیط سرم، و بررسی ایجاد کلامیدوکونیدی در محیط کورن میل آگار، رشد در محیط کروم آگار کاندیدا و الگوی جذب کربوهیدراتها برای تشخیص گونه ها استفاده می شود.
1-5-3 ) تاکسونومی کاندیدا :در گذشته گونه های جنس کاندیدا بدلیل فقدان مرحله جنسی (تلئومورف) در دسته قارچهای ناقص قرار می گرفتند، از سوی دیگر مرحله جنسی برخی گونه های مختلف بیماریزا و غیر بیماریزا بتدریج توصیف شد اما با این وجود همچنان از نظر تاکسونومیک در دسته قارچهای ناقص قرار می گیرند و با نام آنامورف (مرحله غیر جنسی) نامیده می شوند. اغلب گونه های کاندیدا از نظر جنسی جزء آسکومیستها طبقه بندی می شوند و بررسی توالی ها DNA مراحل جنسی و غیر جنسی ارتباط با آسکومیستها را ثابت می کند. همچنین برخی از خصوصیات درباره گونه های کاندیدا وجود دارد که نشان می دهد به آسکومیستها تعلق دارند. برای مثال، اوره آز منفی، فاقد کپسول، تخمیر کننده، اینوزیتول منفی هستند؛ در دیواره سلولی بتا گلوکان می سازند و توانایی تولید نشاسته و پیگمان کاروتنوئید را بر خلاف بازیدیومیستها ندارند. مرحله جنسی(کونژوگاسیون) در محیط های مثل V8 اگار، محیط عصاره مخمر مالت آگار و محیط McClary’s استات در گونه های هتروتالیک قابل القاء است(115).
1-5-4 ) ژنتیک و بیولوژی مولکولی کاندیدا :مطالعه در سطح ژنوم و DNA کاندیدا آلبیکنس به دلیل این حقیقت که این مخمر بطور ثابت دارای ژنوم دیپلوئید و بدون مرحله جنسی است، دچار اشکال است زیرا ایجاد یک موتانت نیازمند تخریب با حذف ژن یا ژنهای مشابه و همسان در هر دو آلل در ژنوم است، که باعث مشکلات و پیچیدگی در تمام مطالعات بیان ژن و تنظیم ژنی در این موجود زنده شده است. علیرغم این معظلات اطلاعات کاملی درباره بیولوژی این مخمر بدست آمده است و در سایتهای مختلف مربوطه موجود است. صدها توالی DNA در Gene bank database ثبت شده است. پیچیدگی های زیادی در ژنوم کاندیدا وجود دارد؛ کدون سه تایی CUG که بطور نرمال یک رزیدوی لوسین را کد می کند در گونه های کاندیدا سرین را کد می کند. این اختلاف در اثر تغییرات در ساختارهای حلقوی tRNA سرین در کاندیدا می باشد و ممکن است در خاصیت ترموتولرانسی گونه های کاندیدا دخیل باشد. همچنین کدون CTG به لوسین ترجمه می شود در کاندیدا آلبیکنس به سرین ترجمه می شود. با وجود آنکه مرحله جنسی در کاندیدا آلبیکنس شناخته نشده است اما ژنهای همولوگ با ساکارومایسس سرویسیه که در تولید عوامل جفت گیری و سایر عملکرد های مرتبط با میوز دخیل اند یافت شده اند. نقش این ژنها در کاندیدا آلبیکنس شناخته نشده است. البته محتمل بنظر نمی رسد که کاندیدا آلبیکنس دارای مرحله جنسی پنهان یا شناخته نشده ای باشد زیرا ژنوم کاندیدا آلبیکنس بسیاری جهش های ژنی کشنده منفرد است که با یک الل دیپلوئید عملکردی و اصلی به توازن رسیده اند. در واقع یک سازماندهی مجدد ژنی جایگرین مرحله جنسی حقیقی در کاندیدا آلبیکنس شده است (117.118).
کاندیدا آلبیکنس دارای هشت کروموزموم دوتایی است که از یک تا 7 نامگذاری شده اند، بعلاوه یک کروموزم R که از نظر اندازه بسیار متغیر است. تعداد کروموزوم در برخی از گونه های دیگر نیز شناسایی شده است، در کاندیدا گلابراتا و کاندیدا پاراپسیلوزیس 14، در کاندیدا گیلرموندی و کاندیدا کروزئی 8، کاندیدا کفیر 18 و در کاندیدا تروپیکالیس 12 می باشد. کاندیدا تروپیکالیس نیز همانند کاندیدا آلبیکنس ژنوم دیپلوئید دارد ولی کاندیدا گلابراتا هاپلوئید است. اندازه کروموزموم ها از Mb 0.5 تا 4.5 است و در تمام گونه ها بجز گلابراتا اندازه آنها از ساکارومایسس بزرگتر است(119).
1-5-5 ) ریخت شناسی و شناسایی کاندیدا :
گونه های کاندیدا در محیط کشت یا بافت به صورت سلول های مخمری بیضی شکل ( به اندازه 6-3 میکرومتر ) رشد می کنند. همچنین هنگامی که جوانه های آنها به رشد خود ادامه می دهند ولی از یکدیگر جدا نمی شوند، ریسه های کاذب تشکیل می شوند، و زنجیره هایی از سلول های دراز به وجود می آورند که در محل تیغه های بین سلولی، فشرده یا منقبض شده اند. (119).
1-5-6 ) ایمنی در مقابل کاندیدا :
اساس مقاومت در مقابل کاندیدا پیچیده است و به طور کامل شناخته نشده است. پاسخ های ایمنی با واسطه سلولی، به ویژه سلول های CD در کنترل و مهار کاندیدا جلدی - مخاطی اهمیت فراوانی دارند و احتمالاً نوتروفیل ها برای مقاومت در برابر کاندیدیاز سیستمیک ضروری و حیاتی هستند (115).
1-5-7 ) کاندیدیازیس :کاندیدیازیس طیفی از بیماری های قارچی فرصت طلب است که در افراد مستعد به شکل عفونت های سطحی ساده تا عفونت های سیستمیک ایجاد می شود(26). این عفونت به صورت حاد، تحت حاد و مزمن در پوست، ناخن، مخاط دهان و واژن، برنش، ریه و دستگاه گوارش ظاهر می گردد و در حالت سیستمیک، سایر اعضای بدن از قبیل کلیه، کبد، قلب و سایر قسمت های دیگر بدن را آلوده می نماید (68). این ارگانیسم همه جا در طبیعت حضور دارند و بر روی اشیاء بی جان ، درون غذاها و بر روی حیوانات یافت می شوند و همزیست های نرمال انسان هستند (68). گستره این بیماری ها از عفونت های سطحی و مخاطی ساده تا عفونت های سیستمیک خطرناک و حتی عفونت های منتشره کشنده ، کشیده شده است .عوامل علیتی بیماری ، قارچ های مخمری متعلق به جنس کاندیدا می باشند.
اگرچه موارد کاندیدیاز از زمان های گذشته در بیماران ناتوان توصیف شده است، اما ظهور گونه های کاندیدا به عنوان پاتوژن های شایع انسانی مربوط به زمان، معرف رویکردهای درمانی مدرن است که مکانیسم های دفاعی طبیعی میزبان را سرکوب می کنند. از میان این پیشرفت های نسبتاً اخیر، مهمترین آنها مصرف مواد آنتی باکتریال است که فلور میکروبی نرمال انسان را تغییر می دهد (45).
امروزه کاندیدیازیس از بیماری های مهم عفونی مطرح در جهان است و در حدود 25 تا 50 درصد عفونت های بیمارستانی در بخش مراقبت های ویژه و 8 تا 15 درصد کل عفونت های بیمارستانی را کاندیدیازیس تشکیل می دهد (69).
در حقیقت سیستم نظارت عفونت های بیمارستانی ملی ( NNISS ) گزارش داده اند گونه های کاندیدا به عنوان پاتوژن های جریان خون بیمارستانی هستند. تخمین زده اند که میزان مرگ و میر بالاتر از 45% است که احتمالاً به دلیل تشخیص ناکارآمد و درمان ضد قارچی نامناسب اولیه است (34).
اغلب افراد) نه همه ( این قارچ را در زمان تولد در طی عبور از کانال زایمان کسب می کنند. قارچ در بدن فقط بصورت کلنی و در تعادل با سایر میکروارگانیسمها زندگی میکند و بصورت ساپروفیت شایع روی سطوح مخاطی بویژه دهان، دستگاه گوارشی و واژن دیده می شود، اما عوامل مختلف می توانند این تعادل را بهم زده و منجر به بروز بیماری علامت دار پیشرونده فعال گردند (70.71).
عوامل متعددی نظیر چسبندگی، مداومت تماس، دیمورفیسم، تشکیل جرم تیوب، حساسیت تماسی، تغییرشکل فنوتیپی، تداخل با سیستم میزبان، سینرژیسم با باکتری ها و تولید هیدرولازها یا سایر متابولیت ها به عنوان عوامل ویرولانس کاندیدا آلبیکنس اشاره شده اند (72).
اگرچه کاندیدا آلبیکنس شایع ترین عامل کاندیدایی مسئول عفونت در اشکال بالینی مختلف کاندیدیازیس بوده و هست، ولی گونه های دیگر متعلق به جنس کاندیدا از جمله کاندیدا
تروپیکالیس، کاندیدا گلابراتا، کاندیدا پاراپسیلوزیس، کاندیدا کروزه ای، کاندیدا گیلیرموندی و غیره نیز کم و بیش از بیماران جدا می شوند. اهمیت گونه های غیر آلبیکنس در سال های اخیر به واسطه بروز مقاومت نسبی در بعضی از این گونه ها نظیر کاندیدا تروپیکالیس و کاندیدا گلابراتا نسبت به برخی از داروهای ضد قارچی زیادتر شده است (39.44.46).
با معرفی داروهای ضد قارچی، علل عفونت های کاندیدا از غلبه بودن تقریباً کامل کاندیدا آلبیکنس گفته می شود. در حال حاضر گونه های غیر کاندیدا آلبیکنس تقریباً نیمی از همه موارد کاندیدمی و کاندیدیاز منتشر شده از طریق هماتوژن را تشکیل می دهند، تشخیص این تغییر از نظر بالینی حائز اهمیت است چرا که گونه های مختلف از نظر حساسیت به گونه های ضد قارچ جدیدتر با هم تفاوت دارند (32).
شواهدی وجود دارد که کاندیدا پاراپسیلوزیس مقاوم به عوامل ضد قارچی امکان انتقال عفونت های بیمارستانی را در محیط های بیمارستانی از طریق دستان پرسنل بیمارستان، وسایل داخل رگی و مایعات، افزایش می دهد(30.21).این موضوع باعث افزایش وفور نسبی این گونه ها می گردد، ضمن این که تعیین فراوانی گونه های مسئول عفونت ها از نقطه نظر اپیدمیولوژیک و کنترل عفونت ها به خصوص در عفونت های بیمارستانی ناشی از کاندیداها حائز اهمیت است.
گونه های کاندیدا به عنوان چهارمین عامل عفونت زای بیمارستانی در آمریکا گزارش شده اند (28.29).در کشورهای توسعه یافته، که تجهیزات درمانی به طور رایج مورد استفاده قرار می گیرند گونه های کاندیدا در حال حاضر از شایع ترین پاتوژن های بیمارستانی هستند (46). بیماری کاندیدیازیس سیستمیک در حال حاضر یکی از بیماری هایی است که دارای میزان مرگ و میر بالایی بوده (48). و هم چنین باعث اقامت طولانی افراد مبتلا در بیمارستان ها و تحمیل هزینه های سنگین درمان می شود.
جدول 1- برخی از گونه های بیماریزای کاندیدا و نام مرحله جنسی آنهاSexual(teleomorph) Species(anamorph)
Not described C. albicans
Not described C. tropicalis
Not described C. glabrata
Not described C. parapsilosis
Issatchenkia orientalis C. krusei
Pichia guilliermondii(ohmerii) C. guilliermondii
Kluyveomyces marxianus C. kefyr
Not described C. viswanathii
Clavisopora lusitaniae C. lusitaniae
Not described C. dubliniensis
Debaryomyces hansenii C. famata
Not described C. inconspicua
Pichia jadanii C. utilis
Pichia norvegensis C. norvegensis
Yarrowia lipolytica C. lipolytica
جدول2- مشخصات مورفولوژیک گونه های بیماریزای پر اهمیت کاندیدا
CHROM agar Pseudohyphae 1 Germ tube Chlamydospore Species
Green/blue + + + C. albicans
Dark blue/ blue grey, with dark halo + - -/+ C. tropicalis 2
White, pink-purple 4_ - - C. glabrata
White, pale pink + - - C. parapsilosis
Pale pink, purple, rough +/- - - C. krusei 3
Dark green + + + C. dubliniensis
Pale pink, purple Primitive - - C. guilliermondii
Pink, grayish purple Variable - - C. lusitaniae
Pink, purple + - - C. kefyr
White pink Primitive - - C. inconspicua
White, light pink, purple Primitive - - C. famata
بررسی وجود هایف بر روی محیط کورن میل اگار حاوی توئین 80
در شرایط خاص توانایی ایچاد کلامیدوکونیدی دارد.
کاندیدا کروزئی و کاندیدا اینکانس پیکوآ از نظر فنوتیپی به هم بسیار نزدیک هستند.
کاندیدا گلابراتا در صورتیکه در محیط سنتتیک low-ammonium dextrose agar رشد داده شود ایجاد سودوهایف می کند.
در بین گونه های مخمری با اهمیت از نظر پزشکی، کاندیدا آلبیکنس قادر است در اشکال و فرم های مختلف رشد یابد. کاندیدا آلبیکنس قادر است اشکال مخمری گرد، بلاستوکونیدی جوانه دار، میسلیوم کاذب کوتاه و یا بلند و میسلیوم حقیقی ایجاد می کند بطوریکه اصطلاح پلئومورفیسم را درباره آن بکار می برند. همچنین کاندیدا آلبیکنس تحت شرایط رشد مناسب قادر به ایجاد کلامیدوکونیدی است (120).
1-5-7-1 ) عفونتهای ایجاد شده در اثر گونه های کاندیدا :گونه های کاندیدا مسبب انواع عفونتهای قارچی در بدن انسان و حیوانات می شوند. جدول- 3 عفونتهای کاندیدایی و عوامل مستعد کننده آن را آورده است.
جدول- 3 مروری بر انواع عفونتهای کاندیدایی و عوامل مستعدکننده آنهانوع بیماری فاکتور مستعد کننده نوع بیماری فاکتور مستعد کننده
ولوواژنیت
داروهای ضدبارداری خوراکی، دیابت، حاملگی
آنتی بیوتیک درمانی
کورتیکوستروئید درمانی عفونت مجاری ادراری سوند های ادراری
انسداد ادراری
جراحی مجاری ادراری
دیابت ملیتوس
ازوفاژیت کورتیکوستروئید درمانی سیستمیک، ایدز، سرطان
پیوند های بافتی و سلول بنیادی اندوکاردیت جراحی وسیع
اندوکاردیت یا بیماری دریچه ای باکتریایی قبلی، اعتیاد تزریقی
کاتتر اعصاب مرکزی بلند مدت
عفونتهای تحتانی دستگاه گوارش سرطان، جراحی پریکاردیت جراحی تروماتیک،سرکوب ایمنی
عفونتهای دهانی و حلقی افزایش سن، دندان مصنوعی
دیابت، آنتی بیوتیک درمانی
رادیوگرافی سزطان سر و گردن
کورتیکوستروئید درمانی استنشاقی یا سیستمیک شیمی درمانی، ایدز
بدخیمی های خونی، سوءتغذیه
پیوند های بافتی و سلول بنیادی عفونت منتشره از خون پیوند عضو، کلونیزاسیون
استفاده بلند مدت آنتی بیوتیک
جراحی شکمی، تغدیه تزریقی، همودیالیز، سرکوب ایمنی بستری بودن در ICU، پیوند کبد و سلول بنیادی
عفونت پوست و ناخن رطوبت موضعی، شستشو و برخورد زیاد با آّببیماری عروق محیطی عفونت دستگاه اعصاب مرکزی جراحیCNS ، شانت ونتریکو پریتونئال
کاندیدیازیس جلدی مادرزادی اجسام خارجی داخل رحمی، نارس بودن نوزاد عفونت استخوان و مفاصل تروما، پای دیابتیک، تزریق درون مفصلی
کاندیدیازیس جلدی و مخاطی مزمن نقص در سلولهای T لنفوسیت عفونت شکمی جراحی شکمی، پانکراتیت
دیالیز پریتونئال گردشی مداوم
پرفوراسیون عودکننده
پنومونی آسپیراسیون عفونت چشمی تروما و جراحی
1-5-7-2 ) کاندیدا آلبیکنس :کاندیدا آلبیکنس یک قارچ طبیعی ساکن حیوان های خو نگرم و انسان ها است (110). کاندیدا آلبیکنس از مهم ترین قارچ های پاتوژن فرصت طلب است که معمولاً به عنوان یک کامنسال ( هم غذا ) در دستگاه گوارش، دستگاه تناسلی و در دهان و فلور ملتحمه مستقر است، و وقتی که میزبان ناتوان یا تسلیم بیماری می شود سبب عفونت می شوند (34). این قارچ بسته به طبیعت میزبان، دو گروه عفونت را به وجود می آورد: عفونت های سطحی) مانند: دهانی، مهبلی وکاندیدیازیس جلدی ( که در افراد سالم هم دیده می شود، عفونت های عمقی) مانند: ریوی، گوارشی، ادراری و کاندیدمی( که در افراد با اختلال شدید ایمنی رخ می دهد. عوامل مهارکنندۀ سیستم ایمنی مثل : شیمی درمانی در بیماران سرطانی، پرتودرمانی، استفاده ازآنتی بیوتیک های وسیع الطیف، ایدز، دیابت شیرین و... موجب مهاجم شدن این قارچ ها می شوند (111).
کاندیدا آلبیکنس یک قارچ دو شکلی هست که به هر دو شکل مخمری بلاستوپور که مسئول انتقال و کلونیزاسیون بی علامت بوده و میسلیا ( فیلامنتسوسی) یا به عنوان هیف و یا هیف کاذب که از جوانه زدن بلاستوپور تولید و کولونیزاسیون را تشدید و تهاجم بافتی را تسهیل می نماید، رشد می کند. برای ایجاد بیماری، چسبندگی به سلول های اپی تلیال ضروری است و کاندیدا آلبیکنس بیشترین میزان چسبندگی را نسبت به همه مخمرها دارد (5).
کاندیدا آلبیکنس می تواند در مدت زمان کوتاهی از آغاز رشد و تنها در یک سیکل سلولی، تغییرات آشکاری را در مورفولوژی خود به وجود آورد و اشکالی مثل کروی، بلاستوکونیدی، هیف حقیقی و هیف کاذب تولید کند(1). دیمورفیسم به کاندیدا آلبیکنس توانایی تبدیل از شکل کومنسال به بیماری زا را می دهد، چنان که شکل میسلیومی آن باعث بیماری زایی بیشتر و ظهور ترکیبات آنتی ژنی خاص می شود. البته شکل مخمر کاندیدا نیز همانند شکل میسلیومی قادر به نفوذ در سلول های پوششی واژن است (36).
تغییرات فنوتیپی کاندیدا آلبیکنس که در نتیجه جهش ژنی صورت می گیرد، باعث تطابق بیشتر با محیط اطراف می شود. این تغییرات فنوتیپی همچنین باعث تبدیل کلونی سفید به کلونی کدر در کاندیدا آلبیکنس می شود. در چنین استرین هایی، ژن های تنظیم کننده ای کشف شده اند که نسخه برداری از DNA خاصی را کنترل کرده، باعث دیمورفیسم می شوند (36).
1-6 ) ولوواژینیت کاندیدائی :ولوواژینیت کاندیدائی یک عفونت شایع دستگاه تناسلی زنان است که توسط گونه های کاندیدا ایجاد شده و پس از واژینوز ناشی از باکتری های بی هوازی در مقام دوم قرار دارد. 75 درصد زنان حداقل یکبار در طول عمرشان این بیماری را تجربه می کنند. این بیماری ممکن است به صورت حاد، مزمن و یا عود
کننده تظاهر نماید. اغلب زنان به فرم حاد بیماری مبتلا می گردند (49.50). این عفونت در دختر بچه ها و خانم های مسن نادر است و بیشتر در زنان جوان و میان سال دیده می شود.
تعدادی از زنان ، به موارد مزمن و عودکننده واژینیت کاندیدائی مبتلا می شوند که بر کیفیت زندگی آنها مؤثر بوده و تأثیر بسیار زیادی در انتقال بیماری به شرکای جنسی خود دارند . با وجود تعدادی از فاکتورهای حائز اهمیت در عفونت مزمن، دو نظریه مهم در پاسخ به این سوال که چرا بعضی از زنان مبتلا به اشکال مزمن بیماری می شوند، نیز وجود دارد:
-1 کسب عفونت مجدد از شریک جنسی یا از منبع دیگر عفونت در بدن.
-2 عود مجدد عفونت واژینال در نتیجه درمان ناکامل (103).
در حالی که در 15-5 درصد موارد بیماری به فرم عود کننده آن " Recurrent vulvovaginal candidiasis" دیده می شود (RVVC). RVVC به حالتی گفته می شود که علایم بیماری در طول یک سال حداقل 3 بار یا بیشتر تکرار گردد(34.35).علایم بالینی این بیماران ممکن است شدید و همراه با تحمل رنج و ناراحتی قابل ملاحظه ای برای آنان باشد (49.51).
تا سن 25 سالگی، تقریباً نیمی از تمامی زنان جوان دست کم یک بار به واژینیت کاندیدائی مبتلا می شوند (99).
ولوواژینیت کاندیدایی به عنوان یک بیماری مهم در زنان باردار، مبتلایان به دیابت، استفاده کنندگان از آنتی بیوتیکهای وسیع الطیف و داروهای ضد بارداری بروز می کند و مقاومت نسبتاً بالایی به داروهای رایج از خود نشان می دهد(8).
1-6-1 ) علایم ولوواژینال :علایم محلی ولواژینال شامل ارتیم و ادم لابیا و پوست فرج و احتمالا" ضایعات پوستولر پاپولر محیطی نیز مشاهده می گردد . واژن ممکن است ارتیماتوز و دارای ترشح سفید و چسبناک باشد و در بیش از 80 درصد موارد اشکال جوانه ای یا ملیسیوم قارچ وجود دارد(12).
این بیماری در اثر رشد غیر طبیعی مخمرها در مخاط دستگاه تناسلی زنان ایجاد می شود . این بیماری یکی از مشکلات زنان در سنین باروری می باشد (83). اگر چه علایم و نشانه های ولوواژینیت کاندیدیایی معمولاً غیراختصاصی می باشد، اما شایع ترین علامت خارش ناحیه واژن است که اغلب در طول دوره قبل از قاعدگی شدیدتر می شود (84.85). خارش وسیع و التهاب با تهاجم جزئی به سلولهای اپیتلیال مطرح کننده این است که توکسین های خارج سلولی یا آنزیم های مترشحه از قارچ ممکن است ایجاد کننده علائم تحریکی در ولوواژینیت کاندیدیایی باشد.
در این بیماری سوزش ادرار بسیار شایع بوده و ترشحات واژن افزایش می یابد (100). ترشحات گاهی می توانند حالت آبکی داشته باشند. مقاربت دردناک و سوزش ادرار به علت تماس ادرار با ولو ملتهب از علایم دیگر می باشد.
این بیماری با ترشحات زرد شیری، غلیظ و غشا کاذب خاکستری در سطح مخاط واژن همراه است(15). میزان ترشحات در بیماران مختلف، متفاوت است ومعمولاً ترشحات به صورت تکه های سفید و پنیری شکل دیده می شود (84.86). از علائم بالینی ادم، قرمزی و شقاق ولو بوده و دیواره واژن قرمز رنگ با پلاک های چسبنده خشک و سفید و دلمه ای دیده می شود (101.102).
هرچند وجود علا یم خارش و سوزش را حدس قوی بر وجود عفونت ولوواژینیت کاندیدایی می دانند با این وجود این علا یم قادر به افتراق نوع عودکننده و حاد بیماری تنها بر اساس علا یم بالینی و به طبع انتخاب پروتکل درمانی مناسب نیست (98). لذا تشخیص به موقع و صحیح بیماری و عوامل آن علاوه بر رفع علائم بالینی بیماری و آسایش جسمی و روانی بیمار می تواند از درمان های تجربی بیمار که باعث بروز مقاومت دارویی و صرف هزینه بیشتر برای بیماران می شود جلوگیری نماید.
pH واژن در این بیماری معمولاً نرمال بوده5 ) (pH=4 -4/ و بیماران معمولا از بوی نامطبوع شاکی نیستند (84).
1-6-2 ) مراحل بیماری زایی کاندیدا :جهت پاتوژن بودن کاندیدا باید سه مرحله زیر طی شود (83).
الف – مرحله چسبندگی به غشاء سلول های اپی تلبوم مهبل
ب - مرحله جوانه زدن ، بلاستواسپور ، میسیلیوم و یا گسترش هیف ها
پ - تهاجم به اپی تلیوم
ارگانیسم های کاندیدا قادر به شناسایی گیرنده های روی غشای سلولهای اپی تلیوم مهبل هستند و می توانند به گیرنده فسفولیپید – فیبرونکتین متصل شوند. چسبندگی یا اتصال بلاستواسپور به علت وجود پروتئینی در غشای سلول قارچ است که قبلا" به نام ادهسین ( مشابه اینتگرین ) خوانده می شد. این پروتئین قادر است خودش را به گیرنده روی سطح سلول های اپی تلیوم مهبل متصل کند . بر اساس تحقیقات آزمایشگاهی ، در چسبندگی و یا اتصال کاندیدا به سلول های اپی تلیال مهبل تفاوت های فردی دیده شده است و این نشان می دهد که برخی زنان نسبت به برخی دیگر استعداد بیشتری برای ابتلاء به عفونت کاندیدای مهبلی دارند (83).
پس از آن که میسلیوم گسترش یافت، کاندیدا قادر به نفوذ و تهاجم به سلولهای سطح مهبل می باشد و تهاجم به اپی تلیوم، باعث آزاد شدن چند ماده از جمله پروستاگلاندین ها و برادی کینین می شود و تغییرات التهابی را ایجاد می کند که این مرحله ممکن است منجر به ادم، قرمزی و افزایش ترشحات و ریزش سلولی شود عامل دیگری که باعث تهاجم بافتی می شود، افزایش بلاستواسپورها می باشد (83). کاندیدا به ندرت در بافت های عمیق تر نفوذ می کند و باعث عفونت سیستمیک می شود و معمولا" به سلولهای اپی تلیال مهبل یا اپیدرمیس فرج حمله می کند (131).
عوامل مختلفی ممکن است در رشد بیش از حد این ارگانیسم و پاتوژن شدن آن نقش داشته باشد که به شرح آن پرداخته می شود .
1-6-3 ) عوامل مربوط به پاتوژن :در موارد حاد بیماری، کاندیدا آلبیکنس عامل بیش از 80 درصد موارد عفونت است و نقش گونه های غیر آلبیکنس در ایجاد بیماری کمتر است. در حالی که در مبتلایان به RVVC در مقایسه با فرم حاد بیماری گونه های غیر آلبیکنس دارای نقش بارزتری هستند (35.36).
کاندیدا برای کلونیزاسیون، ابتدا نیاز دارد که به سلول های پوششی واژن بچسبد. ژرمیناسیون کاندیدا باعث کلونیزاسیون بیشتر و افزایش تهاجم به بافت واژن می شود. از جمله فاکتورهای بیماری زایی کاندیدا می توان از آنزیم های پروتئولیتیک، سموم قارچی، فسفولیپاز و توانایی استفاه از آهن نام برد(2).
افزایش سن، خود درمانی و استفاده ناصحیح از ترکیبات ضد قارچی، از عوامل مؤثر در ایجاد واژینیت های عود کننده غیر آلبیکنسی با عوامل کاندیدا گلابراتا و کاندیدا تروپیکالیس هستند که این انواع غیر آلبیکنسی معمولا به درمان های متداول، مقاوم هستند (84).
براساس مطالعات بعمل آمده بعضی از گونه های غیرآلبیکنس خصوصاً گونه گلابراتا نسبت به داروهای ضدقارچی مقاومت نشان می دهند (22.35.37). این امر لزوم تعیین گونه عامل بیماری را در کنترل و درمان صحیح بیماری نشان می دهد. از طرف دیگر مطالعات اپیدمیولوژیکی نیز نشان دهنده توزیع متفاوت گونه های آلبیکنس و غیر آلبیکنس در مناطق مختلف جغرافیایی است (38). بنابراین با توجه به غیراختصاصی بودن علایم بالینی و وجود گونه های مقاوم و مشکلات درمانی در بیماران مبتلا به واژینیت کاندیدایی و به خصوص در مبتلایان به RVVC و نیز محدود بودن مطالعات انجام شده در این زمینه در ایران، این مطالعه با هدف تعیین نحوه توزیع گونه های آلبیکنس و غیرآلبیکنس در بیماران مبتلا به واژینیت حاد و RVVC جهت دستیابی به یک روش تشخیصی سریع و قطعی گونه های درگیر صورت گرفته است تا بتوان با تشخیص صحیح و درمان مناسب واژینیت های کاندیدایی از مشکلات و عوارض این بیماری شایع زنان تا حد امکان جلوگیری به عمل آورد.
از دلایل مهم ایجاد بیماری واژینیت کاندیدایی عودکننده، حذف ناقص کاندیدا از واژن پس از درمان ضدقارچی است، هر چند ممکن است علایم بالینی و التهابات بیمار کم شود، اما ارگانیسم به تعداد کم در واژن میماند و منجر به ناقل شدن بیمار می گردد (76). هنگامی که شرایط هورمونی و فیزیولوژیک نرمال میزبان تغییر یابد، کلنیزاسیون ارگانیسم افزایش پیدا کرده و باعث بروز علایم بالینی جدید در فرد می گردد (77).
1-6-4 ) عوامل مربوط به میزبان :الف - آنتی ژن لوئیس :
زنانی که حامل آنتی ژن لوئیس ( گلیکو پروتئینی که ممکن است مانع باند شدن کاندیدا به موکوس مهبل شود ) نیستند در معرض خطر بیشتری برای ابتداء به عفونت کاندیدای مهبلی و فرج راجعه هستند (132).
ب - عوامل پزشکی :
بیماری دیابت یا متابولیسم غیر طبیعی گلوکز :
افزایش سطح گلوکز در ترشحات مهبل و ادرار پیشگویی کننده کاندیدیاز در زنان می باشد . زنان با کاندیدایاز راجعه ، سطح قند ادرار بالاتری را نسبت به زنان سالم دارند (133).
از طرفی دیگر دیابت باعث کاهش کیفی ایمنی سلولی و شیوع بیشتر ابتلاء به کاندیدیازیس می شود(135).
برخی زنان با ولوواژنیت کاندیدایی راجعه ، عود آن را به بی احتیاطی در رژیم غذایی مانند شیرینی جات ، نوشیدنی های شیرین که به طور گذرا باعث گلیکوزوری می شود نسبت می دهند (103). گر چه نقش رژیم کربوهیدرات کم در اداره عفونت کاندیدایی مهبل و فرج هنوز مورد بحث است . بیماران دیابتی به درمان های ضد قارچی ، پاسخ کمتری می دهند و نوع عفونت آنها بیشتر کاندیداگلابرتا می باشد (132).
آنتی بیوتیکهای وسیع الطیف :
یکی از علل افزایش میزان عفونت و کلونیزاسیون کاندیدا آلبیکنس آنتی بیوتیک های وسیع الطیف است (133). این داروها چه به صورت سیستمیک و یا موضعی فلور طبیعی لاکتوباسیل را ریشه کن کرده و به این ترتیب باعث رشد قارچ و اتصال و جوانه زدن آن می شود . تراکی لاکتوباسیل ها مانع چسبندگی اسپورها (هاگ ها ) به گیرنده های سطح سلولهای اپی تلیوم مهبل می شود . بنابراین با کاهش سطح طبیعی لاکتوباسیل های مهبل ، عفونت کاندیدای مهبلی افزایش دارد . به طوری که در نمونه ترشحات مهبلی این بیماران کاهش تعداد لاکتوباسیل گزارش شده است (83). همچنین درمان با آنتی بیوتیک با مخدوش کردن فلور طبیعی مدفوع ممکن است باعث افزایش پرو لیفراسیون قارچ های روده ای شود و افزایش این منبع ذخیره ای قارچی ممکن است باعث کلونیزاسیون قارچ مهبل شود (134).
آنتی بیوتیک هایی که بیشتر باعث کلونیزاسیون می شوند شامل آمپی سیلین تتراسیکلین ، سفالو سپورین ها و آنهایی که کمتر باعث کلونیزاسیون می شوند سولفونامیدها هستند (133.135).
عوامل کاهش دهنده سیستم ایمنی ( اولیه یا القا شده توسط دارو ) :
بیمارانی که کاهش سطح ایمنی دارند کاندیدیاز عود کننده شدیدی را نشان می دهند . به نظر می رسد که آنتی بادی های در جلوگیری از رشد و گسترش ارگانیسم های ساپروفیت نقش داشته باشند. اثرات محافظت کننده آنتی بادی های هومورال سیستمیک به خوبی شناخته نشده است . احتمالا" آنتی بادی های موضعی از نوع LgG مهم باشند . چرا که در عفونت های کاندیدایی فعال کاهش سطح این نوع آنتی بادی ها دیده شده است .
ایمنی سلولی نقش مهمی را در مکانیسم های دفاعی میزبان در برابر کاندیدا بازی می کند .کاهش اینترفرون Y تولید شده توسط لنفوسیت ها مانع جوانه زدن میسلیا می شود این یافته نشان می دهد که عامل کلیدی در موارد کاندیدیازیس راجعه ، کاهش ایمنی سلولی است (83).
مکانیسم دیگری که در عفونت کاندیدایی مهبل و فرج نقش دارد مربوط به مصونیت ذاتی میزبان و یا نقصان های دیگر می باشد .بنا بر یک نظریه فروکش کردن مکانیسم تنظیمی ایمنی موضعی و سیتوکینین ، منجر به افزایش حساسیت به عفونت راجعه کاندیدایی مهبل و فرج می شود . این یافته که سلولهای اپی تلیال مهبلی جمع شده از زنان سالم فعالیت ضد کاندیدایی را در آزمایشگاه نشان می دهد و این فعالیت در سلولهای زنان با عفونت راجعه کاندیدایی مهبل و فرج کاهش دارد نشان می دهد که فاکتورهای ذاتی دیگر میزبان نقش مهمی را در پیشگیری از عفونت قارچی بازی می کند (132).
از آنجایی که ایمنی طبیعی عفونت کاندیدایی ، به طور بر جسته ایمنی سلولی تعدیل شده است . استفاده از داروهای کورتیکوستروئید و سایر داروهای مشابه ، حساسیت به کاندیدیاز مهبل را افزایش می دهند (133). سایر عواملی که باعث تضعیف سیستم ایمنی می شوند مانند بیماری لوپوس اریتماتوز ، سرطان ، مریض ناتوان در بستر خوابیده ، پیوند کلیه یا سایر اعضاء ، سابقه چند بار ترانسفوزیون خون ، شیمی درمانی ، مصرف آنتی هیستامین ها ، استفاده از مشروبات الکلی و همچنین نیکوتین موجود در خانیات ، کمبود آهن ، ویتامین B12، روی و فولات، نامنظم بودن دوره قاعدگی، می توانند سبب عفونت کاندیدایی شوند (40.132).
نامنظم بودن دوره قاعدگی ، از دو جهت خطر ابتلاء به عفونت کاندیدایی را افزایش می دهد اول اینکه به علت تغییرات هورمونی شخص می تواند در معرض عفونت قرار بگیرد . دوم اینکه عوارض و ناراحتی های همراه با قاعدگی از جمله خستگی ، درد کمر ، خونریزی های زیاد و کاهش مقاومت بدن در ابتلاء به عفونت کاندیدا موثر خواهد بود (136.138).
ج- عوامل رفتاری :
رفتارهای جنسی :
میزان ابتلاء به عفونت کاندیدایی مهبل با شروع فعالیت جنسی افزایش دارد. همچنین بین عفونت کاندیدایی مهبل و تماس جنسی از طریق دهان ارتباط وجود دارد (137). مقاربت های خشن، تحریک جنسی در حین قاعدگی از علل مساعد کننده و رشد قارچ می باشند. مقاربت خشن و آسیب به مخاط مهبل و خراشیدگی این ناحیه باعث تغییر PH این ناحیه شده و زمینه را برای رشد قارچ فراهم می سازد (49).
در مطالعه کار آزمایی بالینی اخیر که توسط فوکس من بر روی 85 دانش آموز با عفونت کاندیدایی مهبل و فرج انجام شد و گزارش شد که نزدیکی های مکرر (7 بار یا بیشتر در هفته ) قویترین عامل خطر بوده است که طبق گزارش آدز نسبت آنها در مقابل با دانشجویان مرکز تندرستی که نزدیکی نداشته اند 3/4 برابر بوده است (48).
روش های پیشگیری از بارداری :
استفاده از وسایل جلوگیری از بارداری داخل رحمی استفاده از دیافراگم و اسپرم کش ها و مصرف داروهای ضد بارداری خوراکی ممکن است ابتلاء به عفونت کاندیدایی مهبل نقش داشته باشند (132).
شیوع عفونت کاندیدایی مهبل در بین استفاده کنندگان وسایل جلوگیری از بارداری داخل رحمی افزایش دارد که ممکن است به علت افزایش ترشحات ناشی از آلودگی جسم خارجی و افزایش کلونیزاسیون قارچی باشد (134).
مطالعات زیادی نشان داده است که شیوع عفونت کاندیدای مهبل در زنانی که از قرص های جلوگیری از بارداری استفاده می کنند افزایش دارد (135).
همچنین بیان شده است که قرص های ضد بارداری ، باعث تغییر سیستم ایمنی و افزایش پادتن ها و کاهش تجمع لنفوسیست ها در دهانه رحم میشود و به این ترتیب منجر به کاهش مقاومت نسبت به عفونت های کاندیدایی می شود (69).
درمان با استروژن نیز ممکن است در ابتلاء زنان یائسه به عفونت راجعه کاندیدایی مهبل و فرج اثر داشته باشد به خصوص زمانی که همراه با مصرف آنتی بیوتیک ها باشد در معرض خطر بیشتری برای ابتلاء هستند (132). استروژن بر روی سطح کربو هیدرات و سلولهای پوششی مهبل اثر گذاشته و منجر به افزایش چسبندگی کاندیدا به سلولهای پوششی مهبل می شود (83).
دوش های مهبلی و عوامل بهداشتی :
اسپینلو و همکاران (1995) بیان کردند که دوش مهبلی عامل خطری است برای ابتلاء به عفونت کاندیدای مهبلی راجعه که به وسیله کاندیدا گلابرتا ایجاد شده است (132).
به نظر می رسد که افزایش رطوبت سطح خارجی دستگاه تناسلی ، پیشگویی کننده عفونت قارچی و عود بیماری و تاخیر در درمان عفونت قارچی زنان باشد (133). ارگانیسم کاندیدا فقط وقتی به طور طبیعی قادر به نفوذ در پوست می باشد که پوست مرطوب باشد (134).
لباس زیر تنگ و نایلونی از عوامل دیگری هستند که باعث ابتلاء و عود عفونت کاندیدایی مهبل و فرج می شود (83). عقیده بر این است که پوشیدن شلوارهای تنگ ، جریان هوا را در اطراف فرج شدیدا" محدود می کند بنابراین باعث ایجاد یک محیط گرم و مرطوب می شود که برای رشد کاندیدا ایده آل است (134). پوشیدن 1 لایه لباس زیر زنانه نایلونی ، معادل پوشیدن 3 لایه جداگانه لباس نخی می باشد که این امر باعث محدود شدن تبخیر و رطوبت ناشی از فعالیت روزانه می شود (133).
مطالعات نشان داده است که استفاده از پدهای بهداشتی در دوران قاعدگی ، میزان کشت مثبت را افزایش می دهد . نگهداری طولانی مدت تامپون در مهبل نیز ممکن است سبب پیدایش این عفونت شود (133).
کلر داخل استخرهای شنا ، مخاط مهبل را تحریک و باعث افزایش شدت علایم می شود . صابون های معطر ، نرم کننده های کارخانه ای ، سفید کننده های شیمیایی و اسپری های خوشبو کننده به علت داشتن مواد شیمیایی باعث تخریب اپی تلیوم و ایجاد عفونت کاندیدایی می شوند . همچنین سفید کننده ها ممکن است به باکتری های مفیدی که مانع رشد کاندیدا می شوند آسیب رسانند (103).
عوامل تغذیه ای :
از جمله این موارد می توان به رژیم غذایی شکر و مصرف میوه جات اشاره نمود . میزان گلوکز ، آرابینوز و ریبوز موجود در ادرار افراد مبتلا به عفونت کاندیدایی مهبل بیشتر از زنان سالم است . تغییر در رژیم غذایی مثل مصرف بیشتر مواد لبنیاتی و کاهش مصرف ساکارز منجر به کاهش قند ادرار و کاهش ابتلاء به عفونت کاندیدایی مهبل می شود . بنابراین بهتر است این بیماران از خوردن شیرینی جات ، نوشیدنی های شیرین ، میوه های خشک شده ، پرهیز نمایند . خوردن ماست حداقل3 بار در هفته سطح موثر لاکتوباسیل را نگه می دارد (135).
همچنین بهتر است از خوردن غذاهایی که حاوی قارچ است مانند گوشت قرمز ، قارچ خوراکی خودداری شود (103).
استرس :
استرس می تواند باعث افزایش سطح آدرنالین شود ، که می تواند بر روی هورمون های جنسی اثر گذاشته و منجر به تغییرات دوره قاعدگی و افزایش خطر ابتلاء به عفونت کاندیدایی مهبل شود(139).
د- عوامل دیگر :
حاملگی :
به طور کلی در حاملگی با تغییر فلور مهبل ، در دسترس بودن گلیکوژن ، افزایش استرس مادر و کاهش ایمنی سلولی خطر رشد کاندیدا در مهبل افزایش می یابد . به دنبال زایمان ، بابرگشت اپی تلیوم مهبل و عدم حضور گلیکوژن ، رشد کاندیدا از بین می رود (134).
سن :
عفونت کاندیدایی در تمام سنین ایجاد می شود اما حداکثر آن در سنین باروری است .
چاقی :
به علت عدم تهویه کافی ، ابتلاء به عفونت کاندیدایی مهبل در این افراد افزایش دارد (139).
1-6-5 ) ایمنی در ولوواژینیت کاندیدیایی :اولین سد دفاعی در برابر میکروارگانیسم ها، پوست و نواحی مخاطی می باشند که دارای مواد ضدمیکروبی هستند. این مواد توسط سلول های اپی تلیال و اندوتلیال تولید می شوند. هم چنین آن ها دارای میکروفلورهایی از ارگانیسم های ساپروفیت هستند که مانع از تجمع میکروارگانیسم های دیگر می شوند (87).
ایمنی سلولی در دفاع علیه کاندیدا در نواحی جلدی مخاطی نقش اصلی را ایفا می کند(88).
در یک فرد نرمال، نوتروفیل ها، مونوسیت ها و Tسل های CD8+,CD4+ در دفاع علیه عفونت های
مخاطی با یکدیگر همکاری می کنند(89.90). ایمنی ذاتی، ایمنی همورال و ایمنی سلولی هر سه بر علیه عفونت های کاندیداآلبیکنس وارد عمل می شوند.
ایمنی ذاتی توسط لکوسیت های پلی مورفونوکلئر و ماکروفاژها ایجاد می شود که نقش اصلی را در دفاع کاندیدیازیس سیستمیک بازی می کنند، در حالی که ایمنی سلولی در سطوح مخاطی بیشتر نقش دارد(91.92). تحقیقات انجام شده نشان می دهد که لنفوسیت ها CMI موضعی مهم تر ین نقش دفاعی را بر علیه واژینیت بازی می کنند(93). طبق مطالعات انجام شده توسط Fidel در سال 1995 به نظر می رسد، CMI سیستمیک نقش ، محافظتی بر علیه واژینیت های کاندیدیایی ندارد(94).
1-6-6 ) تشخیص RVVC :تشخیص بر اساس تاریخچه معاینه فیزیکی و معاینه میکروسکوپیک و کشت می باشد (121).
این بیماری باید توسط یک پزشک با تجربه ، معمولا" یک متخصص زنان تشخیص داده شود تشخیص توسط بیمار آسان نیست و اغلب اشتباه است . از آنجا که علایم یکسان یا مشابه ممکن است علل دیگری داشته باشد .
تست میکروسکوپی سریع می تواند برای حضور مخمر بررسی گردد و همچنین اندازه گیری PH واژن می تواند به حذف دیگر علل کمک شایان توجهی داشته باشد . با این حال حتی حضور کاندیدا به تنهایی برای تشخیص بیماری کافی نمی باشد ، زیرا کاندیدا معمولا" در فلورواژن از زنان سالم نیز وجود دارد . ارتباط حضور کاندیدا با علایم بالینی و سابقه عود ضروری است (3).
1-6-7 ) درمان :بیمارانی که دارای علایم بالینی عفونت کاندیدایی مهبل هستند و کشت ترشحات مهبلی آنها از نظر کاندیدا مثبت است و یا در نمونه میکروسکوپی آنها کاندیدا مشاهده میشود، درمان باید صورت بگیرد. با توجه به راهنمای مطالعات و مقالات علمی انجام شده، پاسخ رضایت بخش به درمان ( موفقیت درمانی ) زمانی است فرد هم از نظر بالینی و هم از نظر آزمایشگاهی درمان شده باشد.پاسخ درمانی بر اساس علایم بالینی شامل کاهش شدت علایم و نشانه های عفونت کاندیدای مهبلی از شدید به خفیف یا هیچ از خفیف یا متوسط به هیچ می باشد و پاسخ درمانی بر اساس نتایج آزمایشگاهی زمانی مطرح است که نتیجه کشت ترشحات مهبل 2 – 1 هفته پس از اتمام درمان منفی باشد(104).
1-6-8 ) عوامل مؤثر بر روی درمان :
عوامل مختلفی مانند مقدار دارو، مدت اثر دارو، مدت درمان، شکل دارو، روش نگه داری دارو، نوع میکروارگانیسم در درمان عفونت کاندیدایی مهبل مؤثر هستند (22).
1-7 ) تعاریف اولیه ‌از شیمی ‌دارویی :شیمی ‌دارویی ، جنبه‌ای از علم شیمی ‌است که درباره کشف ، تکوین ، شناسایی و تغییر روش اثر ترکیبات فعال زیستی در سطح مولکولی بحث می‌کند و تاثیر اصلی آن بر داروهاست، اما توجه یک شیمی‌دان دارویی تنها منحصر به دارو نبوده و بطور عموم ، دیگر ترکیباتی که فعالیت زیستی دارند، باید مورد توجه باشند. شیمی ‌دارویی ، علاوه بر این ، شامل جداسازی و تشخیص و سنتز ترکیباتی است که می‌توانند در علوم پزشکی برای پیشگیری و بهبود و درمان بیماریها بکار روند(17).
1-7-1 ) سیر تاریخی شیمی ‌دارویی :آغاز درمان بیماریها با دارو ،‌ در قدمت خود محو شده ‌است. اولین داروها منشاء طبیعی داشته و عمدتا از گیاهان استخراج می‌شدند و برای درمان بیماریهای عفونی بکار رفته‌اند. قرنها پیش از این ، چینی‌ها ، هندی‌ها و اقوام نواحی مدیترانه ، با مصارف درمانی برخی گیاهان و مواد معدنی آشنا بوده‌اند. به عنوان مثال ، برای درمان مالاریا از گیاه چه‌انگشان در چین استفاده می‌شد. اکنون ثابت شده ‌است که ‌این گیاه ، حاوی آلکالوئیدهایی نظیر فبریفوگین است(17).
سرخپوستان برزیل ، اسهال و اسهال خونی را با ریشه‌های اپیکا که حاوی آستن است، درمان می‌کردند. اینکاها از پوست درخت سین کونا ، برای درمان تب مالاریا استفاده می‌کردند. در سال 1823 ، کینین از این گیاه ‌استخراج شد. بقراط در اواخر قرن پنجم قبل از میلاد استفاده ‌از نمکهای فلزی را توصیه کرد و درمانهای طبی غرب را نزدیک به 2000 سال تحت نفوذ خود قرار داد(17).
1-7-2 ) تاریخ معرفی شیمی ‌دارویی به عنوان علم :اولین فارماکوپه در قرن 16 و قرنهای بعد منتشر شد. گنجینه عوامل دارویی سرشار از داروهای جدید با منشاء گیاهی و معدنی معرفی شدند. در اواخر قرن 19 ، شیمی ‌دارویی با کشف "پل ارلیش" که ‌او را پدر شیمی ‌درمانی جدید می‌نامند، در ارتباط با اینکه ترکیبات شیمیایی در برابر عوامل عفونی ویژه‌ای از خود سمیت انتخابی نشان می‌دهند، دچار یک تحول شگرف شد(17).
در همین دوران ، "امیل فیشر" ، نظریه قفل و کلید را که یک تغییر منطقی برای مکانیسم عمل داروها بود، ارائه داد. تحقیقات بعدی ارلیش و همکارانش ، منجر به کشف تعداد زیادی از عوامل شیمی ‌درمانی جدید شد که ‌از آن میان ، آنتی بیوتیک‌ها و سولفامیدها ، از همه برجسته‌تر بودند(17).
1-7-3 ) جنبه‌های بنیادی داروها :سازمان بهداشت جهانی ، دارو را به عنوان ( هر ماده‌ای که در فرایندهای دارویی بکار رفته و سبب کشف یا اصلاح فرایندهای فیزیولوژیک یا حالات بیماری در جهت بهبود مصرف کننده شود. ) تعریف نموده ‌است و فراورده‌های دارویی را تحت عنوان ( یک شکل دارویی که حاوی یک یا چند دارو همراه با مواد دیگری که در فرایند تولید به آن اضافه می‌شود. ) معرفی می‌کند(8).
1-7-4 ) کاربرد داروها :داروها بر اساس مقاصد خاصی بکار می‌رود که عبارتند از :
تامین مواد مورد نیاز بدن ، مثل ویتامینها
پیشگیری از عفونتها ، مثل سرمهای درمانی و واکسنها
سمیت‌زدایی ، مانند پادزهرها
مهار موقتی یک عملکرد طبیعی ، مانند بیهوش کننده‌ها
تصحیح اعمالی که دچار اختلال شده‌اند و ... . (17).
1-8 ) داروهای ضد قارچی :
تقریباً ده درصد بیماران مبتلا به واژینیت کاندیدایی به درمان آغازین پاسخ نمیدهند .در عرض سالهای اخیر کشف دارو و ترکیبات جدید ضد قارچی نسبت به بعضی از داروها از سوی دیگر موجب تغییر عقیده بسیاری از قارچ شناسان شده و بیش از پیش نیاز به آزمایش تعیین حساسیت دارویی جهت قارچها احساس گشته است، به طوری که امروزه معتقدند که حداقل برای درمان ایده آل بیمارانی که به عفونتهای سیستمیک و نیز عودکننده قارچی مبتلا هستند، این آزمایش ضروری است (95.96.97).
مبنای تأیید سوش مقاوم در قارچ ها، انجام تست حساسیت دارویی و در کنار آن ارزیابی بالینی و ژنتیک قارچ ها است. ارزیابی تست حساسیت دارویی ساده ترین راه ارزیابی مقاومت دارویی در سویه های قارچی است. بیشتر ین مقاومت های دارویی در مورد کاندیدا به آزول ها گزارش شده است (122.123).
تعیین حساسیت عامل ایجاد بیماری قبل از شروع درمان جهت درمان مناسب و ریشه کنی و حذف عوامل قارچی روش بسیار سودمندی می باشد تا بدین ترتیب از مصرف بی رویه داروها و بالطبع از ایجاد مقاومت های دارویی ثانویه و ناخواسته جلوگیری شود (127).
عوامل بسیار متعددی نظیر میزان قارچ کشت داده شده) میزان تلقیح (، نوع محیط کشت، درجه حرارت و مدت زمان انکوباسیون بر روی نتایج تست تعیین حساسیت دارویی موثر می باشد لذا برای به دست آوردن شرایط استاندارد و نتایج مناسب بایستی همه شرایط یکسان باشند(15).
مطالعات اپیدمیولوژیک نشان داده است که عفونت های مهم قارچی توسط گو نه های مقاوم به داروهای ضد قارچی ایجاد می شود. این موضوع به خصوص در مورد گونه های کاندیدا و مقاومت آن ها نسبت به داروی فلوکونازول مورد تأکید قرار گرفته است (124).
در این رابطه مشخص شده که نتایج یک درمان ضد قارچی به عوامل مختلفی نظیر ویژگی های قارچ عامل عفونت، ویژگی های داروی ضد قارچی و فاکتورهای میزبان وابسته است (125).
گونه های مختلف کاندیدا نه تنها از جنبه عفونت زایی بلکه از جنبه مقاومت دارویی نیز دارای اهمیت زیادی هستند. عمده داروهای پر مصرف در درمان کاندید یازیس آزول ها و پلی ان ها هستند (121).
1-8-1 ) آزول ها :بزرگترین خانواده از داروهای ضد قارچی خانواده آزول است.
آزول ها توسط مهار فعالیت Lanosterol 14-α-Demethlase غشای سلولی را مختل می کنند. و با تغییرات غشای سلول موجب مرگ سلول یا جلوگیری از رشد سلول می شوند. آنزیم مورد هدف وابسته به سیتوکروم P450است و آزول ها همچنین سایر آنزیم های وابسته به P450 در چرخه تنفسی قارچ، مهار می کنند(34).
آزول ها در برابر قارچ ها، توکسیسیته انتخابی دارند، زیرا در سنتز ارگوسترول، که استرول منحصر به فرد غشای سلولی قارچ ها می باشد، تداخل می نمایند و با غشای سلول های بدن کاری ندارند. آزول ها با مهار تولید ارگوسترول، نفوذپدیری غشای قارچ را مختل می کنند(23).
ارگوسترول مشابه کلسترول در سلول های حیوانی است، بزرگترین جزء استرولی غشای سلولی سلول های قارچ است. از آنجا که ارگوسترول و کلسترول تفاوت ساختاری کافی دارند، بسیاری از عوامل ضد قارچی ساختمان ارگوسترول را هدف قرار می دهند(23).
خانواده آزول ها شامل:
ایمیدازول ها: میکونازول ، اکونازول ، کلوتریمازول ، کتوکونازول
تری آزول ها: فلوکونازول ، ایتراکونازول و آخرین عامل وری کونازول ( نسل دوم تری آزول مصنوعی مشتق شده از فلوکونازول ) و پوزاکونازول ( آنالوگ هیدروکسیله از ایتراکونازول ) (34).
1-8-2 ) آنتی بیوتیک های پلی اِن :
آنتی بیوتیک های پلی ان گروهی از ترکیبات آنتی میکروبیال هستند که توسط تعدادی از جنس های
استرپتومایسس تولید می شوند. توجه به اثر دارو درمانی، مشکلات سمی بودن آنها، حلالیت، ثبات و جذب آنها سبب شده است که فقط تعداد کمی از این ترکیبات برای درمان مناسب باشند(130).
گونه های کاندیدا به تعدادی از داروهای ضد قارچی پلی اِن و آزول حساس هستند. پلی اِن ها نظیر آمفوتریسین B و نیستاتین با اتصال به ارگسترول در دیواره سلولی قارچ و با ایجاد منافذی در آن ( با برهم زدن بالانس یونی غشاء سلول قارچی ) قارچ را از بین می برند. در حالی که آزول ها مانع از سنتز ارگوسترول می شوند(104).
پلی ان ها) نیستاتین (و آزولها ) میکونازول (که بطور موضعی استفاده می شوند فراوان ترین داروهای مورد استفاده برای کاندیدیازیس سطحی هستند. در هر صورت درمان ضد قارچی آزول سیستمیک ) فلوکونازول یا ایتراکونازول( نیز می توانند برای درمان کاندیدیازیس سطحی و شکلهای مزمن عفونت استفاده شوند(73).
1-8-3 ) مقاومت گونه های مختلف کاندیدا علیه داروهای ضد قارچی :امروزه موارد شکست درمان و مقاومت گونه های مختلف کاندیدا نسبت به ترکیبات دارویی آزولی به دنبال استفاده وسیع از این داروها در درمان ضایعات جلدی، جلدی - مخاطی و سیستمیک کاندیدایی در حال افزایش است که منجر به انتخاب و ظهور گونه های مقاوم در جامعه می شود(65.66).
آمفوتریسین B در درمان عفونت کاندیدیازیس جلدی و مخاطی کاربرد دارد. قبل از ورود فلوکونازول و ایتراکونازول به بازار دارویی، کتوکونازول داروی انتخابی در درمان کاندیدیازیس مزمن جلدی مخاطی و یک درمان جایگزین موثر کاندیدیازیس واژینال بود. داروهایی که برضد کاندیداها در بازار وجود دارد از نظر تعداد محدود هستند و این خود ممکن است باعث ایجاد مقاومت در آنها گردد(105.106).

–278

کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf.........40
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................41
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا...................................................................................42
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین.............................43
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا......................................................................................44
کشت سلولهای مخمری....................................................................................................................44
بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE........................................................................44
تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش.....................................................................................................45
ایمونوبلاتینگ...................................................................................................................................46
فصل سوم نتایج
سنتز ژن gcsf...................................................................................................................................49
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf...................................................................................................49
طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf...........................................................................................49
بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf...........................................................................................50
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.................................................................................51
هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan.......................................................51
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf.............................................................................................52
بررسی کلونها به روش سریع...........................................................................................................52
انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf............................................................52
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf......................................................................................53
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.....................................................54
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble).............................................................54
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy..........................................................55
تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin.......................................................................................55
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................55
هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII.....................................................................56
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf......................................................57
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin..............................................................................57
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................57
بررسی کلونها به روش Colony-PCR.............................................................................................58
برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo.................................................................................58
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................59
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا........................................59
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین..............................................59
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا.....................................................................................60
تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting.......................................................61
فصل چهارم :بحث و پیشنهادات
رویکرد کلی پژوهش........................................................................................................................63
فصل پنجم : منابع و پیوست
فهرست منابع و مواخذ......................................................................................................................66
پیوست‌ها..........................................................................................................................................75
مقدمه
تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.
هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.
مواد و روش ها
cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده مربوط به هانسونلا پلی مورفا که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.
نتایج
ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با استفاده از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.
بحث
پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.
کلید واژه ها
هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک
فصل اول : مقدمه
در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:
رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،
تحمل دماهای بالا (توانایی رشد در دمای °C49)،
تبادل آسان محتوای ژنتیکی بین سلولهای هاپلوئید و دیپلوئید ( (Teunisson, 1960.
1-1میکروبیولوژی هانسونلا
این مخمر برای اولین بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوی 50% قند در فلوریدای آمریکا جداسازی شد.
سلولهای هانسونلا به هر دو صورت سلولهای دیپلوئیدی و هاپلوئیدی رشد می کنند. کلنی ها بر روی محیط کشت جامد دارای طیف رنگی صورتی هستند که به علت آسکوسپورها می باشد. کلنی سلولهای هاپلوئیدی و دیپلوئیدی از نظر رنگ، اندازه، چیدمان سلولی و سایر ویژگیها با یکدیگر متفاوت می باشند.
تاکنون اطلاعاتی در مورد توانایی هانسونلا پلی مورفا در تشکیل میسلیوم کاذب پیدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).

شکل 1-1 مخمر H. polymorpha
هانسونلا پلی مورفا میتواند در دمای بالا و در °C42 رشد کند. به نظر می رسد در این مخمر سنتز تره هالوز قسمتی از پاسخ به قحطی منبع کربن و شوک حرارتی است و پیشنهاد شده که این ترکیب، فاکتور مهمی در مقاومت دمایی است (Reinders, 1999).
مطالعات انجام شده بر روی هانسونلا پلی مورفا به طور عمده به بررسی پروتئین های سلولی، ساختار سلولهای مخمر در حال رشد و یا بررسی متابولیسم مخمر پرداخته اند.
در سویه هایی از این مخمر که از متانول به عنوان منبع انرژی استفاده می کنند، آنزیمهای متانول اکسیداز و کاتالاز، به فرم کریستالی درون اندامکی به نام پراکسی زوم قرار گرفته اند (Van Dijken, 1975).
هانسونلا پلی مورفا بعنوان یک ارگانیسم متیلوتروف، یک مدل مطلوب برای تحقیق در مورد عملکرد پراکسی زم ها و تکامل حیات می باشد. همچنین به منظور بررسی ژنتیکی جنبه های مختلف متابولیسم سلولی از جمله متابولیسم متانول، جذب نیترات و مقاومت به فلزات سنگین مورد مطالعه قرار می گیرد ( (Mannazzu, 2000.
با وجود این ویژگیها، هنوز قابلیت های ژنتیکی و طبیعی سویه های مورد استفاده از این مخمر کاملاً مشخص نیست و کنترل ژنتیکی فرایندهای سلولی پایه از جمله کنترل تقسیم سلولی، تولید مثل و اسپورزایی هنوز با سؤالات زیادی مواجه می باشد.
با اینحال هانسونلا پلی مورفا به عنوان یک میزبان برای تولید پروتئین های خارجی(ترشحی به خارج از سلول) توجه زیادی را به خود جلب کرده است ( (Gellissen, 2000.
1-2مطالعات ژنتیکی
تحقیقات ژنتیکی تاکنون تنها بر روی سه سویه از این مخمر انجام شده است که شامل سویه های DL-1، CBS 4732 و NCYC 495 می باشند.
پیدایش سویه های هانسونلا پلی مورفا از سویه های جهش یافته اکسوتروف شروع شده است.این موتانت ها از سویه هایی که در بالا نام برده شد با استفاده از ترکیب شیمیایی N-متیل-N-نیترونیتروزو گوانیدین یا اتیل متان سولفونات به دنبال یک مرحله غنی سازی با نیستاتین به دست آمده اند.
از طرف دیگر اشعه ماوراء بنفش نیز یک موتاژن بسیار قوی است که طیف موتانت های ایجاد شده بوسیله آن در مقایسه با موتانت های حاصل از مواد شیمیایی متفاوت و گسترده تر می باشد (Roggenkamp, 1986).
بطور کلی فرایندهای جهش زایی متعددی در این مخمر انجام شده است که یکی از این فرایندها، جهش های ژنتیکی است که منجر به سنتز اسیدآمینه های آروماتیک می شود که به مخمر اجازه رشد در محیط غنی YPD را نمی دهند (Krappmann, 2000).
از جمله انواع جهش یافته های اکسوتروف میتوان به موارد زیر اشاره نمود:
سویه هانسونلا پلی مورفای جهش یافته ای که برای رشد بر روی محیط های معدنی الزاماً به ریبوفلاوین نیاز دارد و محدود نمودن منبع ریبوفلاوین تأثیر شدیدی بر روی سنتز مجموعه الکل اکسیداز و تکثیر پروکسی زومهای سلولی دارد (Evers, 1994).
نوع دوم جهشهای ایجاد شده در ژن FAD1 است که اسید چرب دلتا را کد می کند. کاربرد این سلولهای جهش یافته در بررسی ژنتیکی سنتز اسیدهای چرب غیراشباع می باشد ( (Anamnart, 1998.
تحقیقات اخیر نشان داده است که هانسونلا پلی مورفا میتواند برای بررسی مقاومت به فلزات سنگین مورد استفاده قرار گیرد چراکه توانایی رشد در حضور تجمع فلزات سنگین متفاوت را که برای سایر موجودات سمی است دارا می باشد (Mannazzu, 1997).
در طی رشد در محیط حاوی vanadate، سلول ها افزایش قابل توجهی از پلی فسفات های واکوئلی پیدا میکنند. احتمالاً نقش این واکوئل ها در فعال کردن مکانیسم های اتوفاژی است که شاید برای جبران کمبود مواد مغذی و یا حذف ساختارهای سلولی ناهنجار القاء شده توسط این یون فلزی لازم باشند (Mannazzu, 1998).
سلول های هانسونلا پلی مورفا در مقایسه با S. cerevisiae به یون های کادمیوم(cd2+) بسیار مقاومند )این مقاومت به شدت به ماهیت منبع کربن استفاده شده بستگی دارد. سلول ها اغلب زمانیکه بر روی محیط حاوی گلوکز رشد میکنند به کادمیم مقاومتراند اما در طی رشد بر روی محیط حاوی متانول، به عنوان منبع کربن و انرژی، به این یون بسیار حساس می باشند. سویه های جهش یافته مقاوم به کادمیوم به سه گروه cds1، cds2 و cds3 تقسیم میشوند ( (Lahtchev, unpublished data.
جهش در ژنهای کدکننده آنزیم های پراکسی زومی یا سیتوپلاسمی درگیر در متابولیسم متانول
ژن AOX1 (MOX)، کدکننده آنزیم الکل اکسیداز (AO) موجود در ماتریکس پروکسی زوم است و یکی از بهترین ژن های هانسونلا پلی مورفا در تحقیقات می باشد (Ledeboer, 1985). الکل اکسیداز یک آنزیم فلاووهومواکتامری است که اولین مرحله در متابولیسم متانول را کاتالیز میکند. مونومر این آنزیم در سیتوپلاسم سنتز شده و به صورت هومواکتامر فعال، تجمع یافته و در داخل پراکسی زوم قرار میگیرد. حدود 210 نوع جهش یافته از ژن AO وجود دارد ( (Titorenko, 1995. بیان این ژن در مرحله رونویسی تنظیم میشود.

شکل 1-2 مورفولوژی سلولهای H. polymorpha جهش یافته
در هانسونلا پلی مورفا وقایع مربوط به مهار و القاء ژنهای کد کننده آنزیم های اختصاصی متانول و یا آنزیمهای پراکسی زومی به شدت کنترل می شوند. تنظیم در سطح رونویسی با مکانیسم های کنترلی قابل ملاحظه ای انجام میشود. عناصر تنظیمی به فرم سیس در بالادست ژنهای DAS، CAT و FMD با نقش مهاری برای گلوکز شناسایی شده اند.
1-3 نقشه ژنتیکی
آنالیز تتراد در هانسونلا پلی مورفا امکان پذیر است اما اندازه کوچک اسپورها روند این آنالیز را کند می نماید. در کشت سلول های دیپلوئیدی تفکیک مندلی نرمال در مورد بیشتر مارکرهای ژنتیکی مشاهده شده است.
الکتروفورز DNA کروموزومی هانسونلا پلی مورفا به روش pulse field، 3 تا 7 باند را نشان داده است که به نوع سویه وابسته است (Mari, 1993)اما بطور کلی مشخص شده است که هانسونلا پلی مورفا حداقل 7 کروموزوم دارد که بعضی از آنها مضاعف (دو تایی) هستند (Naumov, 1992).
1-4 تولیدمثل و اسپورزایی
فاکتورهایی در تولیدمثل و اسپورزایی هانسونلا پلی مورفا درگیرند که هنوز بطور کامل شناسایی نشده اند. از القاء کننده های قوی تولیدمثل جنسی میتوان به مالتوز، گلیسرول و سوربیتول اشاره کرد (Lahtchev, unpublished data).
سلول های هاپلوئید بر اساس نوع فنوتیپشان به چهار گروه تقسیم میشوند:
سویه های گروه 1 و 2 میتوانند هیبریداسیون متقاطع داشته باشند. این سویه ها سریع الرشد و تهاجمی بوده و پس از گذشت یک روز در محیط انتخابی، دیپلوئیدی می شوند. سویه های گروه 3 توانایی جفتگیری با اعضای گروه 1 و 2 را دارند و سویه های مثبت (+) نامگذاری می شوند. سویه های گروه 4 تنها میتوانند با گروه مثبت جفتگیری کنند و گروه منفی (-) را تشکیل دهند.
1-4-1 اسپورزایی
در هانسونلا پلی مورفا سلولهای هاپلوئیدی توانایی اسپورزایی دارند. اسپورزایی هاپلوئیدها بعد از گذشت 8 روز در محیط حاوی 3% مالتوز در دماهای پائین قابل تشخیص است. اسپورزایی با ظاهر شدن کلنی های دیپلوئیدی به رنگ صورتی روشن همراه می باشد.
در اواخر دهه 1960 کشف شد که مخمرها توانایی رشد بر روی محیط حاوی متانول به عنوان منبع کربن و انرژی را دارند (Ogata, 1969). اخیراً در تحقیقات پایه، متیلوتروف ها به عنوان منبع پروتئین های تک سلولی (SCP) ((Cooney and Levine, 1976) و آنزیم های غیرمعمول و متابولیت ها توجه بسیاری را به خود جلب کرده اند. با استفاده از روشهای جدید کلونینگ، ژن های کد کننده آنزیم های کلیدی در متابولیسم متانول شناسایی شده اند (Wegner, 1990).
پروموترهای MOX و FMD بعد از القاء، بسیار قوی عمل می نمایند. این مطلب با مشاهده میزان بالای بیان محصولات تحت تأثیر این پروموترها قابل انتظار است.
این یافته ها استفاده از هانسونلا پلی مورفا، به عنوان یک میزبان مناسب برای بیان به میزان زیاد ژنهای هترولوگ با استفاده از این پروموترها، به عنوان اجزاء کنترل کننده بیان، را قابل قبول نماید (Roggenkamp, 1984; Hollenberg and Janowicz, 1988).
سیستم بیانی شامل هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 و پلاسمیدهای حاوی توالی های URA3و HARS1 است که به دنبال هم قرار گرفته اند. استفاده از پروموترهای FMD یا MOX و ترمیناتور MOX همراه با جایگاههای برش آنزیمی کوتاه مربوط به کلونینگ (MSC) بین این دو واحد، کلونینگ و بیان ORFهای هترولوگ را ممکن ساخته است.
آنالیز سویه های بیانی، پایداری میتوزی قابل توجه پلاسمید های الحاق شده به درون ژنوم را نشان می دهد که در بعضی موارد بیانگر سرعت بیان بالای ORF هترولوگ می باشد.
از طرف دیگر، سویه RB11، اغلب دستکاری های ژنتیکی به صورت نوترکیبی را به راحتی نمی پذیرد که شاید ناشی از پایداری میتوزی فوق باشد. به نظر می رسد سویه DL-1 نسبت به سویه RB11 توانایی پذیرش بیشتری را دارد (Gellissen, 1992).
1-6 پروموترهای مورد استفاده در سیستم های بیانی هانسونلا پلی مورفا RB11
یکی از پروموترهای مورد استفاده برای تولید پروتئینهای هترولوگ در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11، پروموتر ژن MOX می باشد که طول آن بیش از 5/1 کیلوباز بوده و در حضور منبع کربن تنظیم می شود. به این صورت که در حضور گلوکز، پروموتر MOX مهار می شود ولی در حضور متانول، القاء می گردد.
پروموتر سایر ژن های کدکننده آنزیم های کلیدی در کاتابولیسم متانول از جمله FMD، DAS و CAT نیز مشابه با پروموتر ژن MOX کنترل می شوند اما سطح تنظیمی بعضی از آنها همچون CAT مشخص نیست (Veenhuis, 1983).
اگرچه پروموترهای FMD و MOX به طور واضحی مقایسه نشده اند اما بعضی مقایسه ها نشان داده است که مزایای پروموتر FMD از پروموتر MOX بیشتر است. بعنوان مثال، هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 بیان کننده ژن فیتاز تحت کنترل پروموتر FMD، بازده زیادی در تخمیر در شرایط قحطی گلوکز دارد.
1-6-1 HARS1
پلاسمیدهای بیانی مورد استفاده در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 دارای عنصر HARS1 به طول تقریبی 5/0 کیلوباز می باشند. این قطعه ژنی در سالهای اخیر در طراحی وکتورهای مناسب برای انتقال به هانسونلا پلی مورفا مورد توجه قرار گرفته است Roggenkamp, 1986)). پلاسمیدهای حامل توالی HARS1 در 30-20 نسل ابتدایی رشد سلولها به صورت اپی زومال باقی می مانند اما پس از آن در ژنوم سلول مزبان به صورت تکرارهای متوالی به تعداد زیاد الحاق می شوند. این در حالی است که ناحیه ای که این پلاسمیدها دقیقاً در ژنوم ادغام می شوند هنوز مشخص نیست Gellissen, 1990)). چهار عنصر دیگر از خانواده قطعه ژنی HARS در سویه های DL-1 به دست آمده است اما تعداد کپی آنها از تعداد عناصر HARS1 در سویه RB11 کمتر است.
جزئیات مکانیسم ادغام شدن پلاسمیدهای حاوی توالی HARS1 در ژنوم این مخمر هنوز مشخص نیست. تنها ویژگی شناخته شده، توانایی ادغام شدن به صورت توالیی تکراری و غیرتصادفی است که قسمت خاصی از ژنوم را انتخاب می کند (Sohn, 1996).

شکل 1-3 تصویر پلاسمید بیانی مخمر H. polymorpha
1-7 بیان همزمان:
با چنین سیستم هایی، مجموعه های پروتئینی هترومری تولید می شود. یک مثال قابل توجه از این نوع بیان، بیان همزمان آنتی ژن های S و Lویروس هپاتیت B است.
از دیگر موارد بیان همزمان میتوان به بیان ژن های کد کننده گلیکولات اکسیداز (GO) اسفناج و کاتالاز (CTT1) T ساکارومیسس سرویزیه در هانسونلا پلی مورفا اشاره نمود.
بیان، پردازش، تغییر و تبدیل و یا ترشح مؤثر پروتئینهای نوترکیب خاص در هانسونلا پلی مورفا ممکن است دچار تغییر شود. این محدودیت می تواند با بیان همزمان ژن مورد نظر با یک ژن دوم (یا بیش از یک ژن دیگر) برطرف شود به همراه می آورد. به عنوان مثال فرآیند پردازش نادرست اینترفرون آلفا 2a، می تواند با بیان همزمان ژن KEX2 ساکارومیسس سرویزیه بهبود یابد.
1-8 ترشح پروتئین های هترولوگ الیگومری و فعال
هانسونلا پلی مورفا مقدار کمی پروتئین درونی (خودی) ترشح می کند و در نتیجه این ویژگی، پروتئین های هترولوگ ترشح شده به محیط کشت، عموماً خالص هستند. بنابراین استفاده از این میزبان بیانی، روش مناسبی جهت تولید پروتئین های نوترکیب خارجی به فرم محلول می باشد. ترشح پروتئین ها توسط توالیهای نشانه (سیگنال) قابل جداسازی انجام می شود. اگرچه گاهاً مستقل از سیگنال ترشحی، در مواردی ترشح خودبخودی پروتئین هترولوگ نیز مشاهده شده است (Gellissen, 2000).
برای درک توانایی هانسونلا پلی مورفا در تولید و ترشح پروتئین های هترولوگ، سویه هایی از این مخمر به منظور ترشح الکل اکسیداز (AOX) مهندسی گردیدند. الکل اکسیداز، یک پروتئین هومواکتامر کوفاکتوری است که هر زیرواحد آن دارای یک مولکول FAD می باشد (van der Klei et al, 1991). زمانیکه هانسونلا پلی مورفا بر روی محیط حاوی متانول رشد می کند فعالیت پروتئین AOX در ماتریکس پراکسی زومی، جائیکه اکثر پروتئین های اصلی وجود دارند، محدود می شود.
از طرف دیگر، برای فهم چگونگی ترشح الکل اکسیداز، سویه هایی از هانسونلا پلی مورفا مهندسی گردید که ژن اندوژن AOX با ژن AOX به دنبال سیگنال ترشحی در انتهای N، جایگزین شد. به دنبال کشت این سویه در محیط کشت حاوی متانول، حضور AOX فعال شناسایی گردید که این بیان نشان می دهد هانسونلا پلی مورفا قادر به تولید و ترشح کمپلکسهای پروتئینی دارای کوفاکتور و ساختارهای الیگومری می باشد (van der Heide and Veenhuis, Unpublished results).
1-9 تولید واکسن نوترکیب
در بسیاری از کشورها واکسن های علیه هپاتیت در اوایل دهه 1980 در دسترس عموم قرار گرفت. این واکسن ها با جداسازی آنتی ژن HBs از سرم افراد ناقل تولید شده بود که اگرچه مؤثر بودند اما به دلیل مشتق شدن از سرم، گران بوده و مدت زمان کوتاهی به سیستم ایمنی عرضه می شوند. به همین دلیل، تولید آنتی ژن HBS هترولوگ در سیستم های بیانی مختلف از جمله مخمر، باکتری، سلولهای گیاهی یا جانوری و نیز حیوانات تراریخته توسعه پیدا نمود. (Billman-Jacobe, 1996, Makrides, 1996).
1-10 مخمرها به عنوان میکروارگانیسم های تولیدی
سیستم های مخمری دارای مزایایی از جمله توانایی دستکاری ژنتیکی آسان، فرآیند های پس از ترجمه یوکاریوتی با میزان بالای تولید محصول و فرآیندهای تخمیری ارزان قیمت هستند. بنابراین تعجب آور نیست که ساکارومیسس سرویزیه به عنوان یکی از میزبانهای مطلوب در تولید پروتئین های هترولوگ شناخته شده است (Hinnen et al, 1995; Barr et al, 2000).
تاکنون دو روش در سیستم بیانی هانسونلا پلی مورفا به منظور تولید زیرواحدهای adw2 و adr از آنتی ژن HBs ابداع شده است که یکی از آنها توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) تأیید شده است (Gregg et al, 1985; Gregg and Madden, 1987).
1-10 ساخت سویه هانسونلا پلی مورفا بیان کننده آنتی ژن HBs
به طور کلی تولید سویه های هانسونلا پلی مورفا نوترکیب نیازمند دنبال کردن پروتکل استاندارد زیر است:
تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
انتقال وکتور طراحی شده به سلول هانسونلا پلی مورفا
جداسازی سویه های نوترکیب
1-10-1 تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
تولید سویه H415 بیان کننده آنتی ژن HBs بوسیله گروهی از محققین یک مثال از این فرآیند است. توالی کدکننده آنتی ژن به طول 683 نوکلئوتید از پلاسمید pRIT10616 جدا گردید (Harford et al, 1987) و قطعه پروموتریMOX به عنوان سیگنال برای رونویسی از ژن MOX هانسونلا پلی مورفا مشتق شد (Ledeboer et al, 1985; Eckart 1988). این سه عنصر ترکیب شده و قطعه MOX promoter-HBsAg gene-MOX terminator را تشکیل می دهند که اساس کاست بیانی می باشند (Stinchcomb et al, 1980). سپس این کاست دارای عملکرد بیانی درون وکتور پلاسمیدی حاوی عناصر زیر قرار داده شد. ژن مقاومت به کلرامفنیکل به منظور تکثیر در باکتری E. coli، توالی همانند سازی هانسونلا پلی مورفا (HARS1) و ژن URA3 از ساکارومیسس سرویزیه به عنوان مارکر انتخابی در بررسی انتقال پلاسمید به هانسونلا پلی مورفا می باشند.
پلاسمیدهای دارای توالی HARS1 توانایی بالایی برای ادغام در ژنوم میزبان دارند. امروزه سویه هایی شناسایی شده که دارای بیش از 60 کپی از کاست بیانی خارجی اند که این مطلب به دلیل وجود این توالی می باشد.
1-11 انتقال (ترانسفرم) وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا
1-11-1 روش پلی اتیلن گلیکول
پلاسمیدpRBS-269 با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول به سویه RB10 انتقال یافت و برای مشخص شدن ادغام پلاسمید به درون ژنوم، غربالگری صورت گرفت (Gregg et al, 1985).
تاکنون چندین سویه ترانسفرم شده با کاست های بیانی الحاقی بطور پایدار تولید شده است و سویه H415 یکی از این سویه هاست که برای بیان آنتی ژن HBs تحت شرایط خاص مورد آزمایش قرار گرفته است (Janowicz et al, 1991).
1-12 جداسازی سویه های نوترکیب
تشخیص بیان پروتئین با رشد سویه های ترنسفورم شده بر روی محیط های تقریباً مغذی حاوی گلوکز، گلیسرول و یا متانول بررسی می شود. در این راستا، مقدار آنتی ژنHBs تولید شده در این سیستم بیانی در مقایسه با مقدار استاندارد آنتی ژن خالص با روش ایمونوبلاتینگ کمی اندازه گیری شد. میزان تولید د ر سویه H415 در محیط کشت حاوی متانول mg100 بود. زمانیکه سلول ها در محیط حاوی گلیسرول قرار گرفتند سنتز آنتی ژن HBs 70% کاهش پیدا کرد و زمانیکه سلول ها به محیط حاوی گلوکز منتقل شدند آنتی ژنی تولید نگردید که این مطلب نشان دهنده تولید این آنتی ژن به طور طبیعی تحت کنترل ژن MOX میباشد (Rutgers et al, 1988).
1-13 تنظیم متابولیسم متانول
تنظیم آنزیم های احیاکننده به روش مهاری و نه القاء صورت می پذیرد. در طی فرایند رشد، در شرایط کمبود گلوکز این آنزیم ها افزایش پیدا می کنند (Egli, 1980). تجزیه و تحلیل منطقه پروموتر ژن کد کننده AOD نشان داده است که در H. polymorpha بیان ژن MOX نیز توسط یک مکانیسم مهاری تنظیم می شود (Roggenkamp, 1984; Sakai and Tani, 1992).
1-14 فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (G-CSF)
در دهه 60 میلادی، دو گروه به طور همزمان روش هایی را برای توسعه و بهبود رشد کلنی های گرانولوسیتی و مونوسیتی مغز استخوان موش و یا سلول های طحال بر روی آگار نیمه جامد مورد بررسی قرار دادند. رشد کلنی این سلولها به حضور فاکتورهایی بستگی دارد که اصطلاحاً آنها را فاکتورهای محرک رشد کلنی(CSF) می نامند. تلاش برای شناخت بیولوژیکی و بیوشیمیایی این محرکها آزمایشگاههای زیادی را تا اواسط دهه 80 میلادی درگیر کرده بود (Metcalf, 2010). این تحقیقات نشان دادند که CSF ها عملکردی اختصاصی و مجزا ندارند بلکه چهار CSF که از نظر بیوشیمیایی کاملاً متفاوت هستند با هم همکاری می کنند. این چهار CSF با توجه به نوع فعالیت شان بر روی کلنی های متفاوت، نامگذاری شدند. به طور مثال GM-CSF که محرک رشد کلنی ماکروفاژها و گرانولوسیت ها می باشد.M-CSF محرک تولید کلنی ماکروفاژها و G-CSF محرک رشد کلنی گرانولوسیتی می باشد.
1-15 ژن gcsf
این ژن بر روی کروموزوم 17 قرار گرفته و دارای 4 اینترون است. دو نوع پلی پپتید متفاوت در نتیجه پردازش های مختلف از این ژن ایجاد می شود. تفاوت این دو پلی پپتید در وجود و یا عدم وجود 3 اسید آمینه می باشد. مطالعات انجام گرفته بر روی بیان این دو نشان می دهد که هر دوی آنها دارای فعالیت های مربوط به GCSF می باشند.
1-16 پروتئین GCSF
فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF)که فاکتور محرک کلنی3 هم نامیده می شود، یک سیتوکین وهورمون محرک رشد و دارای 175 اسید آمینه می باشد. گلیکوپروتئین های طبیعی انسانی در دو فرم وجود دارند. 174 آمینو اسیدی و 180 آمینو اسیدی که پروتئینی طویل با وزن مولکولی 19600 دالتون می باشد. فرم 174 آمینو اسیدی بیشترین فعالیت را دارد که در محصولات دارویی به کمک تکنولوژی DNA نوترکیب ساخته می شود. این فاکتور در بافت های مختلف اثربخشی خود را از طریق تحریک مغز استخوان برای ساخت گرانولوسیت و سلولهای بنیادی انجام می دهد.GCSF همچنین توسط اندوتلیوم، ماکروفاژها و تعدادی از سلولهای ایمنی تولید می شود.

شکل 1-4 ساختار کریستالی از 3 مولکول G-CSF انسانی
1-17 عملکرد پروتئین GCSF
G-CSF مغز استخوان را برای انتشار گرانولوسیت و سلولهای بنیادی در خون تحریک می کند. این پروتئین همچنین باعث تحریک بقاء، تکثیر، تمایز و عملکرد پیش سازه های نوتروفیلی و نوتروفیل های بالغ می شود که تنظیم این واکنش ها از طریق Janus kinase (JAK)، مبدل سیگنال و فعال کننده رونویسی STAT، پروتئین کیناز میتوژنی فعال (MAPK) و فسفاتیدیل اینوزیتول-3-کیناز انجام میشود.
شکل 1-5 مکانیسم عملکرد GCSF
گیرنده های GCSF بر روی سلول های پیش ساز مغز استخوان قرار دارند و در پاسخ به GCSF تحریک می شوند و این باعث رشد و تمایز این سلول ها به گرانولوسیت بالغ می شود. این پروتئین همچنین یک القاء کننده قوی برای انتقال سلول های بنیادی خون ساز هماتوپویتیک از مغز استخوان به درون خون می باشد (Wonganu, 2008).
GCSF همچنین محرک تولید گلبولهای سفید خون نیز می باشد و در انکولوژی و هماتولوژی، در بعضی سرطان های خاص برای افزایش سرعت بهبودی افراد نوتروپنی بعد از شیمی درمانی از شکل نوترکیب آن استفاده می شود. شیمی درمانی سبب تولید سطح غیر قابل قبول (کم) سلولهای سفید خون می شود که این مورد بیماران را در مقابل حملات میکروبی و عفونت ها حساس می نماید.
به نظر میرسدGCSF برای یک بارداری امن در طی مرحله لانه گزینی مؤثر باشد که این امر در بارداری های دوم و سوم بیشتر می شود (Strife, 2013).
در کنار تاثیر بر روی سیستم خون سازی، GCSF همچنین می تواند بر روی سلول های عصبی به عنوان مثال فاکتور نوتروفیک تأثیر بگذارد. در واقع گیرنده های این گلیکوپروتئین بر روی نورون های مغز و نخاع ظاهر می شوند (Cooper, 2011).
همچنین از GCSF برای درمان تخریب بافت قلب از طریق تزریق در خون محیطی به همراهSDF stromal) (cell-derived factor استفاده می شود (Anderlini, 2005) .
امروزهGCSF نوترکیب انسانی در سیستم بیانی باکتری E. coli تولید می شود که با نام فیلگراستیم شناخته شده است. فیلگراستیم از لحاظ ساختاری تفاوت کمی با گلیکوپروتئین طبیعی GCSF دارد. فیلگراستیم (Neupogen) و فیلگراستیم پگیله شده (Neulasta) (PEG-filgrastim) دو نوع تجاری متداول فرم نوترکیب GCSF انسانی rhG-CSF هستند. فرم پگیله، نیمه عمر طولانی تری دارد و این موضوع سبب کاهش ضرورت تزریق روزانه این دارو می شود.
شکل دیگر GCSF نوترکیب انسانی در سلولهای تخمدان هامستر چینی (CHO cells) ساخته می شود که با نام لنوگراستیم شناخته می شود. از آنجا که این سیستم بیانی در سلول پستانداران می باشد، لنوگراستیم تولیدی تفاوت بسیار کمی (غیر قابل تشخیص) در 174 آمینو اسید با GCSF طبیعی انسان دارد.
برای اولین بار در سال 1999 در آکادمی بیوتکنیک چین، ژنوم انسان به عنوان رشته الگو برای کلونینگ و بیان GCSF در غدد پستانی موش استفاده شد و قطعه ای به طول 5/1 کیلوباز با PCR بدست آمد(Lu, 1999).
در سال 2009 محققین به بیان پروتئین نوترکیب GCSF در مخمرPichia Pastoris پرداختند که نتیجه این تلاش بیان این پروتئین تحت پروموتور AOX1 بوده که در نتیجه القاء با متانول میزان پروتئین شده به 2 میلی گرم در لیتر رسید (Apte-Deshpande, 2009).
در سال 1387 محققین ایرانی به جهش زایی هدفمند در فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیت انسانی و کلونینگ و بیان آن در باکتری E. coli پرداختند و نتایج آنها نشان داد که پروتئین نوترکیب مورد نظر با موفقیت در سیستم پروکاریوتی کلون و بیان شده است (حامد ناقوسی، 1387).
به دلیل اهمیت بالینی بالا و نیز نیاز گسترده به GCSF در مراقبت های بهداشتی، تلاش های زیادی به منظور تولید مولکولهای مشابه با فرم طبیعی انسانی آن که دارای عملکرد باشند در حال انجام است.
در سالهای گذشته محققین ایرانی سعی در بیان آن در کاهوی تراریخته داشتنه اند چراکه در این سالها گیاهان تراریخته برای تولید انواع داروی نوترکیب و واکسن ها مورد استفاده قرار گرفته اند (مهدی شریفی تبار،1392).
فصل دوم مواد و روش ها
2-1 میکروارگانیسم های مورد استفاده
از باکتری E. coli سویه ' TOP10F به منظور کلونینگ و تکثیر پلاسمیدها و از مخمر Hansenula polymorpha سویه RB11 به عنوان میزبان بیانی مخمری استفاده شد.
2-2 محیط های کشت مورد نیاز
جهت رشد باکتری‌ E. coli از محیط کشت LB جامد یا مایع و جهت رشد مخمر از محیطهای کشت YPD جامد یا مایع، BMMY و BMGY استفاده شد (پیوست 1).
پس از آماده نمودن محیط¬های کشت میکروبی مورد نیاز، این محیط ها در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه در فشار یک اتمسفر اتوکلاو گردیدند. محلول‌های قندی یا محلولهای حساس به اتوکلاو با استفاده از فیلترهای 22/0 میکرون استریل شدند.
2-3 پلاسمیدهای مورد استفاده
وکتور کلونینگ pGH برای کلون نمودن ژن سنتز شده gcsf توسط شرکت مربوطه مورد استفاده قرار گرفت (شکل 3-1). وکتور بیانی مورد نیاز برای سلولهای مخمری به صورت سنتتیک و با درج عناصر ضروری جهت بیان پروتئین های هترولوگ در این سلولها با استفاده از وکتور کلونینگ pGH به عنوان وکتور اولیه ساخته شده است.

شکل 3-1. وکتور کلونینگ pGH
2-4 آنزیم ها و کیت‌ها
آنزیم Taq DNA polymerase، آنزیم های محدودالأثر، RNaseA و آنزیم T4 DNA ligase از شرکت Fermentas تهیه شدند.
کیت استخراج محصول PCR یا DNA از ژل آگارز از شرکت Roche تهیه گردید.
2-5 آنتی بیوتیکها
آنتی بیوتیک ها (آمپی سیلین، تتراسایکلین و زئوسین) با غلظت مناسب (پیوست 2) تهیه و در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2-6 روش های عمومی
2-6-1 الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز
به منظور بررسی نتایج PCR و یا کیفیت هرنوع مولکول DNA، از ژل آگارز استفاده می شود. به همین جهت ابتدا ژل آگارز با غلظت متناسب با سایز مولکول مورد بررسی تهیه می شود. با توجه به ظرفیت کاست ژل، ابتدا پودر آگارز وزن شده و سپس در حجم مشخصی از بافر TAE (پیوست 3) با رقت X1 حل می گردد. این مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق باقی مانده و سپس مخلوط به مدت 1 دقیقه جوشانده می شود تا به خوبی حل شده و محلول یکنواختی حاصل شود. پس از کاهش دمای محلول تا حدود °C40، به میزان لازم از محلول رنگی DNA Safety Stain به آن اضافه کرده و به آرامی به درون کاست ژل ریخته شده و شانه روی آن قرار داده می شود. پس از چند دقیقه و پس از بستن کامل ژل، شانه به آرامی و به صورت عمودی از داخل آن خارج ‌شده و ژل به همراه کاست در داخل تانک الکتروفورز افقی حاوی بافر TAE (X1) قرار داده می شود. در ادامه نمونه های DNA همراه با حجم مشخصی از بافر بارگذاری ، با ترتیب مشخص به آرامی به درون چاهک ها ریخته می شود. سپس الکترودهای تانک به منبع تغذیه متصل می شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص با توجه به اندازه قطعه، جریان برق قطع گشته و ژل از درون کاست خارج می گردد. ژل را در معرض نور فرابنفش قرار داده و باندها را مشاهده می نماییم.
نکته: در صورتی که قرار است DNA از ژل تخلیص شود، به هیچ‌وجه نمی‌بایست به مدت طولانی در معرض اشعه فرابنفش قرار گیرد زیرا این اشعه طول موج پایینی داشته و قادر است در توالی DNA جهش ایجاد کند.
2-6-2 تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز
جهت انجام کلونینگ، تخلیص محصول هضمهای آنزیمی فوق با استفاده از کیت تخلیص از ژل (Roche) و بر اساس پروتوکل موجود در کیت به شرح زیر انجام ‌شد:
1.به ازای هر mg100 ژل آگارز بریده شده ، µl300 بافر 1 (Binding buffer) به هر تیوب اضافه گردید.
2.تیوب ها به مدت 30-15 ثانیه ورتکس شده و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای C°56 گرماگذاری شدند.
3.در این مرحله به ازای هر mg100 ژل اولیه، µl150 ایزوپروپانول به تیوب ها اضافه شده وسپس ورتکس گردیدند.
4.محتویات هر تیوب به یکی از ستون های کیت افزوده شده و این مجموعه را با بالاترین سرعت (rpm13000) به مدت 30-60 ثانیه سانتریفوژ نمودیم.
5.مایع زیرین دور ریخته شده و سپس µl500 بافر شستشو به هر ستون اضافه گردید.
6.پس از سانتریفوژ در بالاترین سرعت به مدت 1 دقیقه، مایع زیرین دور ریخته شده و در این مرحله µl250 بافر شستشو مجدداً اضافه گردید.
7.پس از سانتریفوژ به مدت 1 دقیقه (در بالاترین سرعت)، هریک از ستون ها را به تیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال داده و µl35 آب دیونیزه به فیلتر ستون ها اضافه کرده و پس از انکوباسیون 5 دقیقه ای در دمای اتاق، هریک از تیوبها را مشابه با مراحل قبلی سانتریفیوژ نمودیم.
2-6-3 واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده
واکنش لیگاسیون پس از تعیین غلظت وکتور و قطعه الحاقی تخلیص شده از ژل آگارز، بر طبق واکنش مندرج در جداول مربوطه انجام گرفت. در نمونه کنترل منفی، وکتور خطی شده به تنهایی در یک واکنش لیگاسیون وارد گردید. به عبارت دیگر، در این واکنش به جای قطعه DNA، آب دیونیزه به مخلوط واکنش اضافه گردید. تمامی تیوب ها به مدت 16 ساعت (ON) در دمای °C4 گرماگذاری شدند. این دما کمک می‌کند تا تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین انتهاهای چسبنده آسان‌تر و با پایداری بیشتری انجام شود و آنزیم لیگاز نیز زمان کافی برای تشکیل پیوند فسفودی‌استری را خواهد داشت.
2-6-4 تهیه سلول‌ های مستعد 'E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم
باکتری مستعد، سلولی است که توانایی لازم برای وارد نمودن پلاسمید به درون خود را پیدا کرده است.
1.یک کلنی از باکتری مورد نظر به مدت 3-2 ساعت در حضور تتراسایکلین در محیط LB مایع و در دمای °C37 بر روی شیکر با سرعت rpm 150 کشت داده شد تا جذب نوری محیط کشت در طول موج nm600 (OD600nm) به 6/0-4/0 رسید.
2.محیط کشت در شرایط استریل (در کنار شعله) به میکروتیوپ استریل منتقل شده و با سرعت rpm9000 به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شد.
3.محیط کشت دور ریخته شده و رسوب سلولی در µl720 کلرید سدیم mM100 سرد استریل، حل شده و به مدت 20 دقیقه در یخ گذاشته شد.
4.پس از گذشت این مدت، سوسپانسیون باکتریایی با دور rpm9000 و به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شده و مراحل 3 و 4 تکرار شدند.
5.رسوب باکتریایی حاصل در µl300 محلول کلرید کلسیم حل گردید.
2-6-5 انتقال پلاسمید به سلول های مستعد (ترانسفورماسیون)
1.µl100 از سوسپانسیون سلول های مستعد به تیوپ استریل انتقال داده شد.
2.حجم مشخصی از پلاسمید و یا محصول لیگاسیون به سوسپانسیون باکتریایی اضافه شده و تیوب ها به مدت 30 دقیقه درون یخ قرار داده می شوند.
3.بلافاصله تیوب ها به حمام آبی دمای °C42 منتقل شده و به مدت 90 ثانیه گرماگذاری شدند. پس از اتمام این زمان سریعاً تیوب ها را به ظرف یخ منتقل نمودیم.
4.ml 1 محیط کشت مایع LB به محتویات هر یک از تیوبها اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در °C37 گرماگذاری گردیدند.
5.100 تا 150 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی بر روی محیط کشت LB جامد حاوی آنتی بیوتیک های مناسب (آمپی سیلین، تتراسایکلین یا زئوسین) کشت داده شد و پلیت ها به مدت 16 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری شدند.
6.پس از گذشت این مدت، از کلنی های تشکیل شده بر روی محیط کشت جامد، ماتریکس سلولی تهیه گردید.
2-6-6 بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع
1.مقدار µl50 از محلول EDTA(10 میلی مولار) به تیوبها اضافه کرده و حدود 70% از ماتریکس باکتریایی را در آن حل نموده و سوسپانسیون را ورتکس نمودیم.
2.مقدارµl 50 از محلول NSS (پیوست 4) را به هر تیوب افزوده و به مدت 30 ثانیه ورتکس نمودیم.
3.تیوب ها را به مدت 5 دقیقه در حمام آبی°C 70 گرماگذاری نمودیم.
4.مقدار µl 5/1 از محلول KCl (4 مولار) به تیوب ها اضافه کرده و هر تیوب به مدت 30 ثانیه ورتکس گردیده و سپس به مدت 5 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد.
5.محتویات هر سلول در دمای 4 درجه به مدت 3 دقیقه در g3000 سانتریفوژ گردید.
6.مایع رویی هر تیوب به تیوب جدید منتقل شد و میزان µl25 از آن بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
2-6-7 PCR بر روی کلنی های باکتریایی/ مخمری
با رعایت شرایط استریل، از کلنی های رشد یافته بر روی پلیت ماتریکس، مقداری باکتری برداشته و در مقداری آب دیونیزه استریل حل نموده و به مدت 5 دقیقه در بن ماری در حال جوش (100 درجه سانتی گراد) جوشانده و سپس از این محلول بعنوان الگوی DNA برای انجام PCR بر اساس پروتوکل مندرج در قسمت مربوطه استفاده می شود.

2-6-8 استخراج پلاسمید در مقیاس کم
1.باکتری E. coli حاوی پلاسمید مورد نظر را به لوله ml5 محیط کشت LB مایع حاوی آنتی بیوتیک مناسب تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) درون شیکر انکوباتور در دمای C°37 با دور 140 rpm قرار می دهیم.
2.سلولهای باکتریایی را با سرعت rpm10000 به مدت 3 دقیقه جمع آوری می نماییم.
3.در این مرحله رسوب باکتریایی را می توان در دمای °C20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصله از مرحله 3 را در µl100 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5. µl200 از محلول شماره 2 (پیوست 5) را به محلول حاصل از مرحله قبل اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.µl150 استات سدیم به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون ظرف یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول فوق را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
8.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
9.هم حجم مایع بدست آمده از مرحله قبل به آن مخلوط فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل به نسبت 25، 24، 1 اضافه می کنیم.
10.محلول را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
11.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
12.به میزان ml1 اتانول 96% سرد به مایع رویی اضافه کرده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C20- نگهداری می نماییم.
13.نمونه را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
14.به میزان µl750 اتانول 70% سرد به رسوب مرحله قبل اضافه کرده و مشابه با مرحله قبل سانتریفوژ می نماییم.
15.رسوب بدست آمده را در µl30-20 آب دیونیزه استریل حل می نماییم.
2-6-9 استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد
برای این کار از روش لیز قلیایی استفاده شد. مراحل انجام این روش به شرح زیر می باشد:
1.میزان µl450 از محلول آنتی بیوتیکی تتراسایکلین (غلظت نهاییml / µg15) را به ml300 محیط کشت مایع LB اضافه نموده و سپس سلول E. coli TOP10F' حاوی پلاسمید مورد نظر را به این محیط تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) بر روی شیکر انکوباتور C°37 قرار می دهیم.
2.محیط کشت به لوله های 50 میلی لیتری منتقل شده و با سرعت rpm10000 به مدت 4 دقیقه سانتریفوژ می گردد.
3.پس از انجام سانتریفوژ، محیط کشت رویی تخلیه شده و رسوب سلولی جمع آوری می گردد. در این مرحله می توان رسوب سلولی را در دمای °C 20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصل از مرحله 3 را در ml6 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5.به مقدار ml12 از محلول شماره 2 (پیوست 5) به تیوب فوق اضافه نموده و 10 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.سی میلی لیتر از محلول استات سدیم M3 (2/5pH) به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه درون یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول را به مدت 15 دقیقه در rpm12000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ می نماییم.
8.مایع رویی را از گاز استریل عبور داده و به محلول فیلتر شده، ml16 ایزوپروپانول اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری می کنیم. سپس این محلول را در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ نموده، مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک می کنیم.
9.رسوب خشک شده را در ml1 آب دیونیزه استریل حل کرده و به آن µl40 از محلول RNaseA (mg/ml10) اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری می نماییم.
10. به محلول فوق به نسبت 1:1 از فنل و کلروفرم اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ می نماییم.
11.فاز رویی (فاز آبی) را به تیوپ جدید منتقل کرده و دو برابر حجم این فاز، به آن اتانول 96% سرد اضافه نموده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C 20- قرار داده و سپس به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژمی نماییم.
12.مایع رویی را دور ریخته و به رسوب حاصل ml1 اتانول 70% سرد اضافه نموده و مجدداً سانتریفوژ می نماییم.
13.مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک نموده و سپس در µl150-100 آب دیونیزه حل می کنیم.
2-6-10 الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید (SDS-PAGE)
مقدمه
الکتروفورز در واقع همان حرکت ذرات باردار تحت تأثیر میدان الکتریکی، می باشد. خصوصیات مولکول ها (اندازه، شکل، میزان بار الکتریکی)، شرایط محیطی (قدرت یونی، pH، درجه حرارت و نوع ژل) و فاکتورهای الکتریکی (اختلاف پتانسیل، شدت جریان و ولتاژ) میتوانند در این فرایند مؤثر باشند. از متداول ترین محیط های نیمه جامد برای الکتروفورز پروتئین ها پلی اکریل آمید می باشد که پروتئین ها را در محدوده وزنی 500 تا 250000 دالتون از هم جدا می کند. این ماتریکس، پلیمری از مولکول های خطی اکریل آمید و N و N- متیلن بیس اکریل آمید می باشد. مولکول های بیس اکریل آمید پل های عرضی را بین مولکول های خطی اکریل آمید ایجاد می کنند و تشکیل یک شبکه رشته ای را می دهند که قادرند پروتئین ها را از هم جدا کنند. پلیمریزاسیون این ترکیبات در حضور آمونیوم پرسولفات آغاز می شود و به دلیل سرعت کم این واکنش، از ماده TEMED بعنوان کاتالیزور واکنش پلیمریزاسیون استفاده می شود. عامل اصلی حرکت مولکول های باردار در الکتروفورز، اختلاف پتانسیل (V) بین قطب های مثبت و منفی می باشد. در روش SDS-PAGE پروتئین ها در حضور شوینده یونی SDS، الکتروفورز می شوند. این ماده به اسید های آمینه هیدروفوب پروتئین ها متصل شده و ساختمان طبیعی پروتئین ها را واسرشته کرده و به ازای طول زنجیره پپتیدی بار منفی ثابتی به آن ها اضافه می کند. بنابر این در این نوع الکتروفورز، به دلیل خنثی شدن اثر بار پروتئین ها توسط SDS، پروتئین ها تنها بر اساس اندازه و شکل از هم جدا می شوند(Sambrook, 2001).
مواد لازم
-اکریل آمید
-N,N متیلن بیس اکریل آمید
-سدیم دو دسیل سولفات (SDS)
-تریس بازی
-TEMED
-آمونیوم پرسولفات (APS)
-آب مقطر
-رنگ کوماس بلو (شامل کوماسی بریلینت بلو G250، متانول، اسید استیک گلاسیال می باشد)
-بافر نمونه x6 ( شامل تریس بازی، گلیسرول، SDS، برومو فنل بلو و 2-مرکاپتو اتانول (2-ME) می باشد)
-بافر تانک X1 (شامل تریس، گلایسین،SDS و آب مقطر می باشد، پیوست 6).
-الکل 96%
وسایل لازم
•سیستم الکتروفورز (منبع تغذیه، تانک، شیشه ها، فضا سازها و شانه )
•سرنگ هامیلتون
روش انجام کار
روش تهیه ژل تحتانی یا جدا کننده (پیوست 6)
•ژل تحتانی بر اساس جدول (3-1) تهیه می شود. درصد ژل بستگی به وزن مولکولی پروتئین دارد. هر چه وزن مولکولی نمونه، بیشتر باشد از درصد پائین تر ژل استفاده می شود تا پروتئین بهتر بتواند در ژل حرکت کند.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه نموده و خوب مخلوط نمایید.
2-6-10-1روش تهیه ژل فوقانی (پیوست 6)
•از این ژل به منظور متراکم کردن نمونه پروتئینی استفاده می شود و عموماً از ژل 4% استفاده می شود. این ژل بر اساس مقادیر جدول(3-1) تهیه می گردد.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه و به خوبی مخلوط نمایید.
•صفحات شیشه ای را با آب و الکل 70% کاملاً تمیز کرده و دو فضا ساز بین صفحات شیشه ای قرار دهید و با گیره محکم کنید. در ظرفی جداگانه به 1 تا 2 میلی لیتر از محلول ژل تحتانی کل TEMED لازم برای ژل تحتانی را اضافه کرده وتوسط آن سریعاً اطراف قالب شیشه ای و به ویژه انتهای ژل را پوشانده تا از نشت احتمالی جلوگیری شود. قالب شیشه ای بطور عمودی روی سطح صاف قرار داده شود.
•پس از تهیه ژل تحتانی، TEMED را به آن اضافه کرده و پس از اینکه کاملاً مخلوط شد، داخل قالب شیشه ای تا ارتفاعی که حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل فوقانی باقی بماند، بریزید.
• سپس مقداری اتانول 96% را به گونه ای که سطح ژل بهم نخورد، به آرامی در بالای ژل ریخته و صبر کنید تا ژل ببندد.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل تحتانی، الکل روی ژل را خالی و سطح ژل را چند بار با آب مقطر شستشو دهید.
•شانه را بین دو شیشه در بالای ژل قرار دهید و سپس به ژل فوقانی تهیه شده، TEMED را اضافه نموده و پس از خوب مخلوط کردن بر روی ژل تحتانی بریزید.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل فوقانی، شانه را به آرامی خارج و داخل چاهک ها را چندین بار با آب مقطر شستشو دهید. قالب شیشه ای را با گیره به سیستم الکتروفورز وصل کرده و محفظه بالا و پائین سیستم را با بافر تانک پرکنید.

جدول 2-1 نحوه تهیه درصدهای مختلف ژل های فوقانی و تحتانی در SDS-PAGE

2-6-10-2 آماده سازی نمونه
•بر اساس نوع و غلظت نمونه، از بافر نمونه به آن اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار دهید.
•نمونه ها را با استفاده از سرنگ هامیلتون در داخل چاهک ها بریزید. مقدار نمونه قرار داده شده در هر چاهک بستگی به اندازه چاهک، میزان خلوص نمونه، روش رنگ آمیزی و نوع بافر نمونه (X2و X6) دارد.
•سیستم الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل نمایید و در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، هنگامیکه نمونه داخل ژل فوقانی است از ولتاژ V60 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل تحتانی ولتاژ به V130 رسانده شود.
•پس از اتمام الکتروفورز (رسیدن رنگ نشانه به انتهای ژل)، منبع تغذیه را خاموش کنید. قالب شیشه ای را خارج کرده و فضا سازها بیرون آورده شود. با قرار دادن یکی از فضا سازها بین دو صفحه شیشه ای، شیشه بالایی را جدا نمایید.
• سپس ژل رنگ آمیزی گردد.
2-6-10-3 رنگ آمیزی ژل SDS-PAGE
به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، لازم است ژل را رنگ آمیزی نمود. روشهای مختلفی برای رنگ آمیزی ژل های SDS-PAGE وجود دارد که متداولترین آنها روش رنگ آمیزی با کوماسی بلو و یا نیترات نقره می باشد. عموماً از روش کوماسی بلو استفاده می شود زیرا که یک روش سریع و ارزان بوده و ثبات رنگ طولانی است.
استفاده از کوماسی بلو
مواد لازم
-رنگ کوماسی بلو
-الکل 96% (برای رنگ بری)
-آب مقطر
روش انجام رنگ آمیزی
•ژل را در داخل ظرف رنگ آمیزی قرار می دهیم و مقداری رنگ به آن اضافه و به مدت10 دقیقه بر روی شیکر می گذاریم.
•رنگ را خالی کرده و ژل را داخل محلول رنگ بر (آب مقطر حاوی اتانول) بر روی شیکر قرار می دهیم تا زمینه ژل شفاف شده و باندهای پروتئینی آبی رنگ نمایان شوند.
2-6-10-4 رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (پیوست 7)
•قرار دادن ژل در بافر فیکساسیون به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر.
•دور ریختن بافر فیکساسیون و اضافه نمودن بافر شستشو سه بار و هر بار به مدت 20 دقیقه.
•اضافه کردن بافر sensitizing به مدت 2 دقیقه.
•دور ریختن بافر sensitizing و شستشو با آب مقطر سه بار و هر بار 5 دقیقه.
•اضافه کردن بافر رنگزا به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر.
•شستشوی ژل در آب مقطر و اضافه کردن بافرdeveloping تا ظهور باندهای پروتئینی.
•اضافه کردن بافر متوقف کننده به مدت 15 دقیقه.
•شستشوی ژل در آب مقطر.

2-7 روشهای اختصاصی
2-7-1 سنتز ژن gcsf
توالی cDNA کد کننده پروتئین GCSF به طول bp 615 از بانک ژنومی (شماره 172219.1) استخراج و به منظور سنتز به یکی از شرکتهای فعال در این زمینه سفارش داده شد. این توالی به منظور بیان در سلولهای مخمری از نظر کدونهای مورد استفاده در سنتز پروتئین، بهینه سازی شده و پس از بررسی های نهایی از نظر جایگاه های برش آنزیم های محدودالأثر، ساخته شده و در وکتور کلونینگ pGH کلون گردید. در دو انتهای این ژن، دو جایگاه برش آنزیمی برای آنزیمهای محدودالأثر HpaI و BamHI در نظر گرفته شد تا برای جدا نمودن این قطعه و کلون کردن آن در وکتور بیانی مخمر استفاده شوند. لازم به ذکر است که جایگاه برش این آنزیم ها بر روی قطعه ژنی سنتز شده، وکتور pGH و وکتور بیانی هانسونلا وجود ندارد.
2-7-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
2-7-1-1-1 طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
به منظور انجام PCR بر روی ژن gcsf در وکتورهای بدست آمده در مراحل مختلف، پرایمرهای اختصاصی این ژن با استفاده از برنامه genrunnr سنتز گردید (جدول 2-2).

پرایمر F 'gtagatcttgcggatccccc-3-'5
پرایمر R 'gtagatcttggtctccagcttgc-3-'5
جدول 2-2: توالی پرایمرهای ژن gcsf
2-7-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
با انجام گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها به منظور بهینه سازی شرایط این واکنش مشخص گردید. این واکنش بر اساس مواد ذکر شده در جدول2-3 و بر طبق برنامه مندرج در جدول 2-4 انجام شد.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-3 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش gcsf PCR
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-4 برنامه PCR گرادیان مربوط به ژن gcsf

2-7-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
به منظور کلون نمودن قطعه ژنی gcsf، این قطعه با برش آنزیمی از وکتور کلونینگ حامل قطعه (pGH-gcsf) جدا شده و در وکتور بیانی برش خورده با همان آنزیمها وارد گردید.
2-7-2-1 هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
با توجه به جایگاههای برشی که در دو انتهای این قطعه (ژن gcsf) در نظر گرفته شد (جایگاه برش BamHI در انتهای ´5 و جایگاه‌ برش HpaI در انتهای ´۳)، این قطعه از وکتور مورد نظر (pGH-gcsf) بر اساس واکنش مندرج در جدول 2-5 در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 5 ساعت مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-5 واکنش هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
2-7-2-2 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan
وکتور pHan نیز با آنزیمهای BamHI و HpaI بر طبق جدول 2-6 مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-6 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan
2-7-2-3 کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan
واکنش لیگاسیون قطعات هضم و تخلیص شده پس از تعیین غلظت، بر طبق واکنش مندرج در جدول 2-7 انجام گرفت. تیوب ها به مدت 16 ساعت در یخچال قرار گرفته و پس از آماده سازی سلولهای مستعد از E. coli TOP10F'، به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های حاوی آمپی سیلین و تتراسایکلین کشت داده شدند.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan خطی شده (ng/µl100) 1 1
قطعه gcsf (ng/µl15) 16 -
بافر T4 DNA ligase (10X) 2 2
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 17
جدول 2-7 واکنش لیگاسیون ژن gcsf در وکتور بیانی pHan

کلنی های ظاهر شده بر روی پلیت ها، به صورت ماتریکس کشت داده شده و به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند.
2-7-2-4 بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf
•بررسی کلون ها به روش سریع
مقداری از هر کلنی بر اساس پروتوکل موجود (2-6-6) آماده سازی شده و بر روی ژل آگارز برده شد. وکتورهای سنگین تر از وکتور بیانی pHan (بدون ژن الحاقی)، به عنوان وکتورهای مشکوک گزارش گردید.
•استخراج پلاسمید در مقیاس کم
از کلنی هایی که gcsf PCR آنها مثبت گردید، بر اساس پروتوکل2-6-8 به لوله های ml5 حاوی محیط LB مایع کشت داده و پس از گرماگذاری در °C37 به مدت 16 ساعت، استخراج پلاسمید در مقیاس کم انجام گردید.
•gcsf PCR بر روی پلاسمیدهای استخراج شده pHan-gcsf
پلاسمیدهای استخراج شده در واکنش PCR ژن gcsf بر اساس پروتوکل 2-7-1-1 وارد شده و محصول PCR بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
•هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf
پلاسمید تأیید شده در مراحل قبل، مورد هضم آنزیمی با آنزیم های محدودالأثر BamHI، EcoRI و HpaI بر طبق جدول2-8 قرار گرفته و پس از گرماگذاری در C °37 به مدت 3 ساعت، محصول واکنشها بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 2
بافر آنزیمی (10X) 2
آنزیم محدودالأثر (units/µl10) 75/0
آب دیونیزه 25/15
جدول 2-8 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf
•استخراج پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf در مقیاس زیاد
پلاسمید تأیید شده با تست های فوق، بر اساس پروتوکل های2-6-9 منظور استفاده در مراحل بعدی، به مقیاس انبوه استخراج گردید.
2-7-3 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-3-1 PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)
در این تحقیق، به منظور غربالگری کلونهای هانسونلا بر آن شدیم تا ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble) را در وکتور بیانی pHan که حاوی ژن gcsf می باشد کلون نماییم. برای این منظور، توالی این ژن در وکتور pPICZα (Invitrogen, USA) موجود در بخش بیوتکنولوژی بررسی گردید و پرایمرهای لازم جهت تکثیر این ژن طراحی گردید (جدول 2-9) و جهت سنتز سفارش داده شد. پس از دریافت پرایمرها، دمای بهینه برای تکثیر این ژن، به روش PCR گرادیان، در محدوده 65-50 درجه سانتی گراد (جدول2-10) بر طبق جدول 2-11 انجام شد.
پرایمر F 5'-gtagatcttgcggatccccc-3'
پرایمر R 5'-gtagatcttggtctccagcttgc-3'
جدول 2-9 پرایمرهای طراحی شده جهت تکثیر ژن zeocin
تعداد چرخه مدت زمان (دقیقه) دما (°C)
واسرشتی اولیه 1 '5 ˚94
واسرشتی
اتصال پرایمرها
طویل شدن 35 '1
"30
"30 ˚94
60-50
˚72
طویل شدن نهایی 1 '5 ˚72
جدول 2-10 برنامه PCR گرادیان ژن zeocin
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (پلاسمید pPICZα) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-11 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش zeocin PCR
2-7-3-2 کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy
قطعه تکثیر شده zeocin با استفاده از کیت از ژل آگارز بر اساس پروتوکل 2-6-2 استخراج شده و پس از تعیین غلظت،واکنش لیگاسیون آن در وکتور کلونینگ pGEM بر طبق جدول 2-12 صورت گرفت.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pGEM-T Easy خطی (ng/µl50) 1 1
ژن zeocin (ng/µl50) 2 -
بافر T4 DNA ligase (X4) 5 5
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه 11 13
جدول 2-12 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور pGEM-T Easy

واکنشهای فوق به صورت ON در دمایC ˚4 قرار داده شدند و پس از تهیه سلولهای مستعد از سلولهای ' E. coli TOP10F ، به این سلول ها منتقل شده و بر روی محیط LB آگار با غلظت پایین NaCl (پیوست 1) و حاوی زئوسین، تتراسایکلین، IPTG و X-gal (پیوست 5) کشت داده شد. پس از گرماگذاری در 37 درجه به مدت 16 ساعت، کلنی های سفید تشکیل شده، بر روی پلیت ماتریکس حاوی ترکیبات فوق کشت داده شدند.
2-7-3-3 بررسی کلونهای نوترکیب pGEM-Zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
70% هر یک از کلنی های سفید به روش quick check (پروتوکل 2-6-6) مورد بررسی قرار گرفت.
•استخراج پلاسمید pGEM-Zeo در مقیاس کم
از کلون نوترکیب تأیید شده با دو روش قبل، استخراج پلاسمید در مقیاس کم (2-6-8) انجام گردید.
•هضم آنزیمی وکتور pGEM-Zeo
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده از مراحل قبل با آنزیم BglII به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد بر اساس جدول 2-13 صورت گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pGEM-Zeo 2
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/15
جدول 2-13 واکنش هضم آنزیمی pGEM-Zeo با BglII
2-7-4 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-4-1 هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo
برای کلون نمودن قطعه ژنی مقاومت به زئوسین در وکتور pHan-gcsf، این دو وکتور با آنزیم BglII که جایگاه برش آن در دو انتهای قطعه ژنی زئوسین و نیز بر روی وکتور pHan-gcsf در نظر گرفته شده بود، مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند (جدول 2-14).
مواد مقدار (µl)
پلاسمید 20
بافر آنزیمی (X10) 20
BglII (units/µl10) 5
آب دیونیزه 155
جدول 2-14 واکنش هضم آنزیمی pGEM-zeo و pHan-gcsf با BglII
وکتور pHan-gcsf هضم و تخلیص شده، بر اساس جدول 2-15 به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی گراد تحت تیمار با آلکالین فسفاتاز قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 60
بافر آنزیمی (X10) 8
آنزیم آلکالین فسفاتاز (units/µl10) 2
آب دیونیزه -
جدول 2-15 تیمار وکتور هضم شده pHan-gcsf با آلکالین فسفاتاز
2-7-4-2 کلون نمودن قطعه ژنی zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
پس از هضم آنزیمی، قطعه مورد نظر (ژن مقاومت به زئوسین، حدوداً bp1100( از روی ژل جدا شده و پس از تخلیص با کیت، بر طبق واکنشهای لیگاسیون جدول 2-16 در درون وکتور بیانی pHan-gcsf تیمار شده با آلکالین فسفاتاز کلون گردید.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan-gcsf خطی شده (ng/µl100) 5/1 5/1
قطعه zeocin (ng/µl15) 25 -
بافر T4 DNA ligase (X2) 3 3
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 5/24
جدول 2-16 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
واکنش‌های فوق به صورتON در دمای C˚4 قرار داده شدند و روز بعد پس از تهیه سلولهای مستعد از E. coli TOP10F' به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های LB آگار با غلظت پایین NaCl و حاوی زئوسین با غلظت µg/ml25 کشت داده شدند. پس از گذشت 16 ساعت در دمای C˚37، از کلنی های رشد یافته، پلیت ماتریکس تهیه گردید.
2-7-4-3 بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
کلونهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی زئوسین به منظور بررسی الحاق قطعه ژنی مقاومت به زئوسین بر روی ژل آگارز برده شدند.
•بررسی کلونها به روش Colony-PCR
کلونهایی که با روش سریع سنگینتر تشخیص داده شدند، برای انجام PCR اختصاصی ژن زئوسین مورد استفاده قرار گرفتند.
•برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
به منظور تأیید نهایی وکتور نوترکیب فوق، با توجه به سایت‌های برشی موجود، وکتور بر اساس جدول 2-17 با آنزیم BglII برش داده شد. مخلوط این واکنش به مدت 3 ساعت در دمای C˚37 گرماگذاری شد و سپس بر روی ژل 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 3
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/14
جدول 2-17 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با BglII
2-7-5 انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا
2-7-5-1 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin
پس از اطمینان از قرار گرفتن ژنهای مورد نظر در پلاسمید هانسونلا، انتقال این پلاسمید به درون میزبان مخمری (هانسونلا پلی مورفا) با روش الکتروپوریشن صورت گرفت. برای این منظور، به مولکول DNA خطی شده با غلظت بالا نیاز می باشد. برای تهیه DNA خطی، وکتور نوترکیب تأیید شده در مراحل قبل با آنزیم EcoRI بر طبق جدول 2-18 مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و پس از استخراج از ژل، در پروسه الکتروپوریشن مورد استفاده قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 15
بافر آنزیمی (X1) 20
EcoRI (units/µl10) 5
آب دیونیزه 160
جدول 2-18 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با EcoRI
2-7-5-2 الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا
1.ابتدا میزان مناسبی از کلنی تازه رشد یافته مخمر را به درون ml200 محیط کشت مایع YPD تلقیح نموده و محیط را بر روی شیکر در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری میکنیم تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر (OD600nm) به 2/1-8/0 برسد.
2.محیط کشت فوق را در rpm5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نموده و به میزان 2/0 برابر، بافر فسفات پتاسیم mM50 ولرم (C°37( با 5/7pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهایی mM25 به آن اضافه نمایید.
3.سلولها را به مدت 15 دقیقه در دمای C°37 قرار می دهیم.
4.سلول ها را با سانتریفوژ در rpm5000 به مدت 5 دقیقه جمع آوری نموده و دو بار با بافر STM (پیوست 7) درحالیکه سلولها بر روی یخ قرار دارند شستشو می دهیم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اولیه).
5.رسوب سلولی نهایی را در 005/0 حجم اولیه از بافر STM حل کرده و این سوسپانسیون سلولی مستعد را در حجم های کم در دمای C°70- نگهداری میکنیم.
6.به منظور ترانسفورم نمودن سلولهای مستعد، سوسپانسیون های سلولی (حجم µl60) را بر روی یخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطی شده را به آن اضافه میکنیم.
7.سپس سلولها به کووت الکتروپوریشن 2 میلی متری سرد منتقل می شوند.
8.بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوریشن قرار داده و به آن پالسی با مشخصات 2 کیلوولت، 25 میکروفاراد و 200 اهم وارد مینماییم.
9.بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محیط کشت YPD به تیوب حاوی سلولها اضافه کرده و به مدت 1ساعت در دمای °C 37 در شیکر انکوباتور قرار می دهیم.
10.محیط را سانتریفوژ نموده (rpm5000, 5دقیقه( و سلولها را بر روی محیط کشت YPD جامد حاوی زئوسین با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت 5-3 روز در دمای °C37 قرار میدهیم.
11.سلولهای رشد یافته در غلظت بالای زئوسین (µg/ml400)، به صورت ماتریکس بر روی پلیت حاوی 800 و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.
12.پس از گذشت مدت زمان لازم (3 روز) از کلونهای رشد یافته برای انجام PCR اختصاصی ژنهای کلون شده در وکتور بیانی استفاده گردید.
2-7-5-3 تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین
PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلونهای نوترکیب رشد یافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل 2-7-3-1 و جدول 2-13 انجام گردید.
2-7-6 بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
2-7-6-1 کشت سلولهای مخمری
1.سلول مخمری تأیید شده با PCR ژن زئوسین و نیز سلول مخمری فاقد پلاسمید در ml5 محیط کشت BMGY (پیوست 1) کشت داده شده و بر روی شیکر در دمای С °30 با دور rpm200 قرار داده شد تا OD600 محیط به 6-2 برسد (حدود 18-16 ساعت).
2.محیط کشت فوق را در g3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نمودیم.
3.رسوب سلولی را در 30 میلی لیتر محیط BMMY (پیوست 1)، اختصاصی جهت بیان پروتئین های نوترکیب با اتانول حل نموده و مجدداً برای ادامه رشد در انکوباتور قرار دادیم.
4.پس از گذشت 24 ساعت، از متانول 100% به غلظت نهایی 5/0% به محیط اضافه نمودیم تا بیان پروتئین القاء گردد.
5.پس از گذشت مدت زمان 96 ساعت از شروع کشت، محیط بیانی را در دور rpm6000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوز مینماییم.
6.محلول رویی را به تیوب جدید منتقل نموده و پس از اندازه گیری غلظت پروتئینی در 280 نانومتر، اقدام به تغلیظ این محلول به منظور بررسی با SDS-PAGE می نماییم.
7.محلول فوق را با عبور از فیلترهای Centriprep YM50 بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده تغلیظ می نماییم.
2-7-6-2 بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE
•ژل SDS-PAGE 15% بر اساس روش ذکر شده در بخش2-6-10 تهیه گردید.
•پس از انجام الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل، میزان بیان پروتئین نوترکیب با روش کوماسی بلو بر اساس شدت باند حاصله مورد بررسی قرار گرفت.
2-7-7 تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش
تولید آنتی بادی پلی کلونال به روشهایی برای معرفی یک ایمونوژن به حیوان و خونگیری برای سنجش میزان آنتی بادی نیاز دارد. انتخاب حیوان بستگی به امکانات موجود در نگهداری حیوان، میزان آنتی سرم مورد نیاز و میزان ایمونوژن موجود، دارد. پاسخ ایمنی بهتر، عموماً زمانی بدست می آید که از یک ادجوان مناسب در اولین ایمنی زایی استفاده گردد. برای این منظور، ایمونوژن بصورت یک امولسیون آب و روغن آماده می شود که حاوی میکوباکتریوم کشته شده با حرارت می باشد که تحت عنوان آدجوان کامل فروند معرفی می گردد. استفاده از این امولسیون فرد را مطمئن می کند که آنتی ژن به آرامی در جریان خون حیوان آزاد می شود و از طرفی باکتریهای کشته شده میکوباکتریوم، سیستم ایمنی حیوان را تحریک می کنند. ایمن سازی های بعدی، برای افزایش سطح آنتی بادی لازم اند و در بافر فسفات سالین (PBS) یا در امولسیون روغنی (ادجوان ناقص فروند ) مصرف می شوند (Johnstone, 1996).
روشهای مختلفی برای تزریق ایمونوژن وجود دارد (Johnstone, 1996) که عبارتند از :
1)درون ماهیچه ای (i.m=Intra muscular)
2)درون رگی (i.v = Intra venous)
3)درون پوستی (i.d = Intra dermal)
4)درون صفاقی (i.p = Intra peritoneal)
5)زیر پوستی (s.c = Sub cutaneous)
ایمن سازی درون پوستی یک روش مؤثر در ایجاد پاسخ اولیه است. روشهای i.m و i.d و یا s.c بهتر است در چندین محل مختلف صورت گیرند.
در مورد خرگوشها، در اولین ایمن سازی به μg200-50 پروتئین در FCA نیاز است که باید به صورت درون پوستی به 8-6 جای مختلف از پشت حیوان تزریق گردد. تزریقهای بعدی با فاصله 28 روز یا بیشتر، با 200-50 میکروگرم پروتئین آماده شده در PBS یا FIA به فرم i.m یا i.v یا s.c صورت می گیرد (Johnstone, 1996).
1) اولین تزریق:
•براساس غلظت نمونه پروتئینی مورد نظر (پروتئین GCSF نوترکیب موجود در بازار دارویی (ساخت شرکت پویش دارو)، l85 از ویال (200 میکروگرم) را برداشته و با l415 از PBS استریل مخلوط کرده و آن را با μl500 ادجوان کامل فروند مخلوط کرده و با emulsifier آنقدر این دو ماده را مخلوط کردیم تا شیری رنگ و سفت شد.
•قبل از اولین تزریق،ml 1 خون از حیوان گرفته شد تا به عنوان کنترل منفی (قبل از تزریق) از آن استفاده شود.
•این نمونه در rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید و سرم از گلبول های قرمز جدا گردید. سرم را در تیوب جدید ریخته و در 20- درجه سانتیگراد نگهداشتیم.
•محلول آماده شده از آنتی ژن در FCA به 8 جای مختلف از پشت خرگوش به صورت درون پوستی تزریق گردید.
2) دومین تزریق:
•سی روز پس از اولین تزریق، دومین تزریق به خرگوش باμl 85 از نمونه پروتئینی (200 میکروگرم) در μl415 PBS استریل با μl 500 ادجوان ناقص فروند مجدداً به صورت درون پوستی صورت گرفت.
•30 روز بعد، ml1 خون از حیوان گرفته شد تا از نظر ایمنی زایی تزریقهای فوق با روش ایمونوبلاتینگ، مورد بررسی قرار بگیرد.
2-7-8 ایمونوبلاتینگ
برای شناسایی پروتئین های اختصاصی از طریق آنتی بادی های پلی کلونال یا مونو کلونال، از لکه گذاری ایمنی استفاده می شود. در روش لکه گذاری ایمنی نمونه های پروتئینی در حضور ماده SDS و عوامل احیاء کننده (مانند 2- مرکاپتواتانول) الکتروفورز شده و سپس از روی ژل به غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی منتقل می گردند و با استفاده از آنتی بادی های نشاندار شده شناسایی می شوند. برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء از روش هایی مانند روش تانک و یا روش نیمه خشک استفاده می شود. در روش انتقال با تانک، از بافر حاوی تریس -گلایسین و متانول استفاده می شود که متانول علاوه بر اینکه از تورم ژل جلوگیری می کند، باعث جدا شدن SDS از پروتئین ها شده و بازده اتصال پروتئین به غشاء را افزایش می دهد. در روش انتقال نیمه خشک، ساندویچ انتقال پس از خیس شدن در بافر انتقال، بین دو الکترود بزرگ گرانیتی قرار گرفته و عمل انتقال انجام می گیرد (Sambrook, 2001).
در اینجا روش انتقال با روش نیمه خشک توضیح داده می شود.
مواد لازم
-غشاء نیتروسلولز با منافذ 45/0 میکرومتری
-کاغذ واتمن
-بافر انتقال (شامل تریس بازی، گلایسین، متانول و آب مقطر می باشد، پیوست 8).
-دستگاه Semidry
-رنگ پانسوS
روش انجام کار
•نمونه پروتئینی در مجاورت مارکر پروتئینی با روش SDS-PAGE، الکتروفورز شد.
•به مدت 30 دقیقه ژل در بافر انتقال قرار داده شد تا از تغییر حجم ژل در هنگام انتقال جلوگیری شود.
•غشای نیترو سلولزی را به اندازه ژل برش زده و در بافر انتقال قرار می دهیم.
•چندین لایه کاغذ واتمن (هم اندازه با ژل) را در ظرف حاوی بافر انتقال، مرطوب کرده و سپس کاغذ ها روی صفحه گرانیتی دستگاه بلاتینگ با سیستم نیمه خشک گذاشته شد ( با غلتاندن یک میله شیشه ای حباب های احتمالی بین کاغذها خارج گردید).
•غشای نیترو سلولز خیس شده به آرامی به گونه ای که حبابی تشکیل نگردد بر روی کاغذ های واتمن قرار داده شد. سپس ژل مورد نظر را را به گونه ای که حباب تشکیل نگردد به آرامی روی کاغذ قرار دادیم.


•مجدداً چند لایه کاغذ واتمن خیس شده در بافر انتقال، روی ژل قرار داده شد و با غلتاندن میله شیشه ای، حباب های احتمالی را خارج نمودیم.
•درب دستگاه را بسته و دستگاه را به جریان برق متصل نمودیم و با توجه به اندازه پروتئین، ولتاژ ثابت و زمان انتقال دستگاه تنظیم شد.
•پس از اتمام زمان انتقال، کاغذ نیتروسلولز با رنگ پانسوS رنگ آمیزی شد تا باندهای پروتئینی ظاهر گردند. از طرفی باندهای مارکر پروتئینی نیز علامت گذاری گردیدند. سپس غشاء با آب مقطر شسته شد تا رنگ پانسوS آن از بین برود.
•غشاء نیتروسلولز به مدت 1 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر در بافر بلوکه کننده قرار گرفت. سپس به مدت 16 ساعت در 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
نکته: به منظور بلوکه کردن غشاء در نواحی که فاقد پروتئین است می توان از شیر خشک بدون چربی و یا آلبومین سرم گاوی (BSA) محلول در بافر PBS دارای توئین20 استفاده کرد.
•آنتی بادی اولیه، سرم خرگوشی رقیق شده به نسبت 1 به 500 در PBS بود. این آنتی بادی به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•غشاء 5 بار 10 دقیقه ای در TTBS بر روی شیکر شسته شد.
•آنتی بادی دوم، Goat anti Rabbit IgG کونژوگه با HRP بود که به نسبت 1 به 1000 در PBS رقیق شده بود. این آنتی بادی به مدت 1 ساعت بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•بعد از اتمام زمان انکوباسیون در آنتی بادی ثانویه، کاغذ پنج بار 10 دقیقه ای با PBS حاوی 05/0% توئین 20 شستشو داده شد.
•کاغذ به مدت 10 دقیقه با بافر PBS بدون توئین شستشو داده شد.
•کاغذ نیتروسلولز در محلول سوبسترای آنزیم نشاندار (DAB) گذاشته شد تا باندهای مورد نظر نمایان گردند.
•پس از نمایان شدن باندها، کاغذ با آب مقطر چند بار شستشو داده شد و سپس کاغذ را خشک کرده و در جای تاریک نگهداری گردید.
فصل سوم نتایج
3-1 سنتز ژن gcsf
cDNA کد کننده پروتئین GCSF پس از بهینه سازی کدونها برای بیان در سلول مخمری به یکی از شرکت های مرتبط سفارش داده شد و توالی سنتز شده در وکتور کلونینگ pGH به گروه تحویل داده شد (شکل 3-1).

شکل 3-1 طرح شماتیک وکتور کلونینگ حاوی ژن gcsf
3-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
3-1-1-1طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
با توجه به این که جایگاه برش آنزیم‌های BamHΙ و HpaI در توالی ژن هدف، gcsf، و نیز وکتور بیانی طراحی شده وجود ندارد، این دو جایگاه بر روی توالی پرایمرهای F و R تعبیه شدند. طراحی پرایمرها با بررسی نکات کلیدی در زمینه عدم تشکیل فرم سنجاق سری ، دایمرهای پرایمری و سایر ساختارهای ثانویه با استفاده از نرم‌افزار genrunnr انجام شد. نتایج حاصل از بررسی پرایمرها در این نرم‌افزار در شکل‌های 3-2 الف و ب آورده شده است.

(الف) (ب)
شکل3-2 بررسی توالی پرایمرهای F (الف) و R (ب) ژن gcsf.
3-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها و تکثیر ژن gcsf را 60 درجه سانتی گراد نشان داد (شکل 3-3).
17856203187708 7 6 5 4 3 2 1
008 7 6 5 4 3 2 1

شکل 3-3 PCR گرادیان ژن مقاومت به gcsf
چاهک 7-1: محصول PCR در دماهای 50 تا 60 درجه سانتی گراد
چاهک 5: مارکر DNA (kb1)
چاهک 8: کنترل منفی PCR
3-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
3-2-1 هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan
به دنبال هضم آنزیمی این وکتورها با آنزیمهای BamHI و HpaI، در مورد وکتور کلونینگ، بر روی ژل آگارز قطعه ژنی gcsf به طول تقریبی bp615 و وکتور کلونینگ pGH به طول تقریبی bp2900 مشاهده شد در حالیکه در مورد وکتور بیانی، وکتور خطی شده ای به طول حدوداً 6500 نوکلئوتید بر روی ژل ظاهر گردید (شکل 3-4).
191262065405 5 4 3 2 1
00 5 4 3 2 1

شکل 3-4 هضم آنزیمی وکتورهای pGH-gcsf و pHan با آنزیم های HpaI و BamHI
چاهک 1: مارکر DNA (kb1)

–142

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب ...............................................................................................................................................29
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده ....................................................................................................................30
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه...........................................................................................................................................30
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM ......................................................30
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته............................................................................................................................................30
3-4-1-1 مواد و محلول ها.......................................................................................................................................................30
3-4-1-2 روش کار..................................................................................................................................................................30
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli.. ..........................................................................31
3-4-2-1 روش کار.................................................................................................................................................................31
3-4-3 ارزیابی کلونی ها...........................................................................................................................................................32
3-4-4 استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه C2................................................................................33
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده.............................................................................................................................35
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion........................................................................................................35
3-4-5-2 الکتروفورز................................................................................................................................................................35
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM.............................................................................................................37
3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2 از ژل..................................................................................................................................37
3-5-2 لایگیشن.........................................................................................................................................................................38
3-5-3 ترانسفورماسیون.............................................................................................................................................................39
3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته.................................................................................................................................39
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن................................................40
3-5-4 ارزیابی کلونی ها...........................................................................................................................................................40
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM..............................................................41
3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده.............................................................................................................................42
3-6 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM................................................................................................................................43
3-6-1 القاء بیان پروتئین...........................................................................................................................................................43
3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page...................................................................................................................43
3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها.............................................................................................................................44
3-6-2-2 Run کردن نمونه ها...............................................................................................................................................45
3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی................................................................................................................45
فصل چهارم:نتایج
4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی ...........................................................................................................................................47
................................................................................................................50..........................C2ناحیهDNA4-2 سنتز شیمیایی
4-3کلونینگ پلاسمید AMP+ -pBSK حاویDNA ناحیهC2.................................................................................................52
4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2.................................................................................................................................................54
4-5بیان پروتئینC2 و تایید آن به کمک تکنیک SDS_page........................................................................................................57
فصل پنجم:
بحث...................................................................................................................................................................................................59
نتیجه گیری.........................................................................................................................................................................................69
منابع....................................................................................................................................................................................................71
چکیده انگلیسی...........................................................................................................................................................................................74
فهرست شکل ها:
شکل 1-1 تصویر بخش های مختلف روده بزرگ.....................................................................................................................5
شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده.............................................................................................................6
شکل1-3 درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال .....................................................................................................7
شکل1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال.................................................................................................................12
شکل1-5 نقشه ژنتیکی پروتئین ALCAM............................................................................................................................15
شکل1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری...............................................................................17
شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a.....................................................................................................................................24
شکل3-2 دستگاه انکوباتور......................................................................................................................................................25
شکل3-3 دستگاه اتوکلاو.........................................................................................................................................................26
شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژو تانک الکتروفورز.......................................................................................................................26
شکل3-5 شیکر انکی باتور.......................................................................................................................................................27
شکل3-6 سانتریفیوژ.................................................................................................................................................................27
شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل.............................................................................................................................................27
شکل3-8 ترموسایکلر...............................................................................................................................................................28
شکل3-9 بن ماری ..................................................................................................................................................................28
شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید..........................................................................................................................................33
شکل3-11 کیت استخراج DNA از ژل فرمانتاز.....................................................................................................................37
شکل4-1 شاخص سازی کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی.........................................48
شکل4-2 میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی سمت راست:بعد از بهینه سازی ..........................48
شکل4-3 شاخص سازی محتوای G-C سمت راست:قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی.............................49
شکل4-4ترادف ناحیهC2 مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli...........................49
شکل4-5 مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.......................................................50
شکل4-6 تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی......................................................................................................51
شکل4-7 نقشه ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2 پروتئینALCAM...........................................................................53
شکل4-8 تائید حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 در محصول استخراج پلاسمید.............................................................53
شکل4-9 هضم دوگانه آنزیمی پلاسمید تکثیر یافتهPBSK....................................................................................................54
شکل4-10 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a..................................................................................................................................55
شکل4-11 باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با Pet28a حاوی ژن ناحیه C2....................................................55
شکل4-12 تائید حضور پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) ......................56
شکل4-13 نتیجه حاصلهاز هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2......................................................57
شکل4-14 بررسی بیان پروتئین ناحیه C2 به کمک تکنیک SDS-Page...................................................................58
چکیده:
همه سرطان ها از سلول ها شروع می شوند به طور طبیعی‌، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می کنند و تقسیم می شوند. سلول های جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.
سرطان کولورکتال یکی از شایع ترین سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد که میزان ابتلا به آن حدود 6/0 می باشد که منجر به مرگ600 هزار نفر در سال می گردد. .CD166 به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی و معرفی شده است.که با توجه به بیان آن بر سطح سلول های سرطان کولورکتال در مراحل مختلف بیماری می توان از آن جهت کارهای درمانی و تشخیصی استفاده نمود.
ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند.ALCAM معمولا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد که بر اهمیت ان در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.در این مطالعه ما ابتدا سعی بر آن داشتیم توالی مورد نظر را از بانک های اطلاعاتی ژنی استخراج نماییم و سپس از طریق آنالیز بیوانفورماتیکی توالی مورد نظر را از نظر بهترین بیان در میزبان باکتریایی آماده نماییم.ژن مورد نظر از طریق شیمیایی سنتز شده و سپس با استفاده از فرایند کلونینگ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال داده و تکثیرنموده. در انتها نیز بیان ناحی C2در باکتری های نوترکیب با القاگر مناسب القا می نماییم و وجود پروتئین مورد نظر را به کمک تکنیک SDS-page مورد بررسی قرار می دهیم.
ناحیه C2 می تواند به مانند پروتئین اصلی خاصیت ایمنی زائی داشته باشد. این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین مورد نظر را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت نمود.
واژه های کلیدی:
سرطان کولورکتال، ALCAM، ناحیه C2 پروتئینALCAM ،کلونینگ
فصل اول
مقدمه
1-1سرطان چیست
اصطلاح سرطان به تومورهای اطلاق می شود که می توانند به بافت های مجاور خود که از سلولهای سالم تشکیل میشوند حمله کنند توانایی مجاورت و هجوم سلول های توموری عامل طبقه بندی تومورها به دو دسته خوش خیم و بدخیم است اگر یک تومور بدخیم به یک رگ خونی یا لنفی برسد می تواند متاستاز دهد ودر بافت های دیگری رشد کند. نئوپلاسم(که معنی آن رشد جدید است) شکل غیر طبیعی رشد سلولها است و تومور، نئپلاسمی است که با وضعیت بیمار گونه همراه است، تومور ها بیماری هایی هستند که در آنها جمعیتی از سلول های، که به لحاظ ژنتیکی هم خانواده هستند توانایی رشد نا به هنجار را کسب می کنند(نخعی سیستانی وهمکاران 1389). همه سرطان ها از سلول ها شروع می شوند که واحد سازنده بدن و اساس زندگی محسوب می شوند. سلول ها بافت را می سازند و بافت های بدن، اندام ها را تشکیل می دهند. به طور طبیعی‌، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می کنند و تقسیم می شوند. سلول های پیر می میرند وسلول های جدید جای آنها را می گیرند. گاهی نظم مراحل رشد به هم می خورد. سلول های جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.
تومورها خوش خیم یا بد خیم می باشند.
تومورهای خوش خیم سرطانی نیستند.
این نوع تومورها به ندرت زندگی فرد را تهدید می کنند.
بیشتر تومورهای خوش خیم قابل جراحی بوده و معمولا عود نمی کنند.
تومورهای خوش خیم، به بافت های اطراف و سایر قسمت های بدن گسترش نمی یابند.
تومورهای بدخیم سرطانی هستند.
عموما این تومورها بسیار خطرناک تر از تومورهای خوش خیم بوده و زندگی فرد را تهدید می کنند.
تومورهای بدخیم قابل جراحی بوده ولی در مواردی بعد از عمل جراحی مجددا عود می کنند.
تومورهای بدخیم انتشار یافته و به بافت ها و اعضای مجاور، آسیب می رسانند.
سلول های سرطانی از بافت توموری جدا شده و با وارد شدن در جریان خون یا سیستم لنفاوی، تومورهای جدیدی درسایراعضاء بدن تشکیل می دهند. گسترش و انتشار سلول های سرطانی به سایر بافت های بدن را متاستاز می نامند.
زمانی که سرطان از بافت اصلی به سایر قسمت های بدن گسترش پیدا می کند، تومور جدید شبیه همان نوع سلول های غیر طبیعی تومور اولیه بوده و به همان اسم تومور اولیه خوانده می شود. برای مثال اگر سرطان کولورکتال به کبد متاستاز دهد سلول های سرطانی کبد همان سلول های سرطانی کولورکتال بوده و بیماری سرطان متاستاتیک کولورکتال نامیده شده و همانند سرطان کولورکتال، درمان می شود (کاظمی اسکندانی 1388).
دانش کنونی از مکانیسم های سرطان پیشنهاد کننده این مطلب است که علت ایجاد همهی سرطان ها ناشی از هر دو عامل محیطی و ژنتیکی است(clapp et at 2005).
عوامل ژنتیکی، هورمونی و ویروسی روی سرطان تاثیر می گذارند باقی ماندن تغییراتی مانند آسیب بافتی، تغییرات ژنتیکی و اپیژنتیک(مثل جهش،از دست دادن هتروزیگوسیتی و متیلاسیون پروموتور)و تغییرات ترانسکریپتوم(مثل التهاب و مسیر های آپاپتوز) در دراز مدت منجر به فعال شدن مسیر ها و عملکرد های سلولی نابجا گشته و در نهایت منجر به تغییرات پیش سرطانی می گردد(Roy et el 2008).
انکوژن ها کد کننده پروتئین های هستند که کنترل کنندهی تقسیم سلولی، آپاپتوز و یا هر دوی آنها هستند. آنها می توانند به وسیله تغییرات ساختمانی، که حاصل جهش یا اتصال ژن ها توسط کنار هم نشینی عناصر تحریک کننده و یا به وسیله تحریک فعال شوند. جا به جای و جهش می تواند به عنوان وقایع اولیه یا در طی پیشرفت تومور اتفاق بیفتد در حالی که تکثیر معمولا در طی پیشرفت اتفاق می افتد هنگامی که یک
انکوژن توسط جهش فعال می شود ساختار پروتئین کد شده توسط آن در مسیر افزایش فعالیت تغییر می کند(croce2008).
جهش های که پروتوانکوژن ها را به انکوژن ها تبدیل می کند شامل:تغییرات تک نوکلئوتیدی،تکثیر یا ازدیاد ژنی، ترکیب ژنی و سایر بازآرایی های کروموزومی است که فعالیت پروتئین های ساخته شده توسط پروتوانکوژن ها را افزایش می دهند. جهش های تغییر دهنده قالب، جهش های بی معنی و جهش هایی که در جایگاه پردازش روی می دهند عموما موجب فعال شدن انکوژن ها نمی شوند(Thomas et al 2007).
سرطان بوسیلهی تغییر در انکوژن ها، ژن های سرکوب گر تومور و ژن های microRNA ایجاد می شود
یک تغییر ژنتیکی به ندرت برای توسعه یک تومور بدخیم کافی است. بیشتر شواهد به یک فرآیند چند مرحله ای از تغییرات پی در پی در انکوژن های مختلف، ژن های سرکوب گر تومور یا ژن های microRNA در سلول های سرطانی اشاره دارند(croce 2008).
انکوژن ها شکل جهش یافتهی یک ژن طبیعی سلولی به نام پروتوانکوژن ها است که در گسترش سرطان شرکت می کند انکوژن های که اغلب در رشد و گسترش سرطان های انسانی شرکت دارند به وسیلهی ویروس ها منتقل نمی شوند بلکه در نتیجه جهش های سوماتیک در پروتوانکوژن ها ایجاد می گردند (نخعی سیستانی و همکاران1389). پروتئین های حاصل از پروتوانکوژن ها در شرایط عادی عملکرد حیاتی در پیام رسانی سلول، رشد و تمایز بر عهده دارند اما بیان غیر طبیعی آنها قادر به القای تومور زایی است(pappou 2010).
یک ژن سرکوب کننده تومور نوعی ژن است که بوسیلهی جهش های حذف عملکرد ایجاد می شود، ژن های سرکوب کننده تومور فرآیند های اصلی مسئول حفظ بخش های پایدار بافتی را کنترل می کنند این فرآیند ها شامل تمامیت ژنتیکی، پیشرفت چرخه سلولی،تمایز، برهمکنش های سلولی و مرگ می باشند. غیر فعال شدن این ژن ها موجب حذف هموستازی بافتی می شود که مشخصه یک تومور در حال گسترش است(نخی سیستانی و همکاران1389).
1-2 آناتومی روده بزرگ:
روده بزرگ از دریچه ایلئوسکال روده کوچک تا آنوس گسترش یافته است و شامل آپاندیس، کولون، رکتوم و کانال آنال می باشد بنا به موقعیت کولون به قسمت های مختلف تقسیم شده است: سکوم، کولون
صعودی، زاویهی کبدی، کولون عرضی، زاویه طحالی، کولون نوزولی و کولون سیگموئید (میبدی و همکاران 1382، ACS 2010).

شکل 1-1 تصویر و بخشهای مختلف روده بزرگ (کاظمی اسکندانی 1388)
کولون از انتهای ایلئوم شروع می شود و در پرومونتوری ساکروم جایی که تیناکولی ها حالت باند های مشخص و مجزای خود را از دست می دهند پایان می یابد.تیناکولی ها سه نوار عضله طولی هستند که در فواصل 120 درجه از هم در محیط کولون قرار گرفته اند رکنوم در سطح پرومونتوری ساکروم جایی که سه تنیا ها پخش می شوند و یک لایه عضلانی طولی صاف تشکیل می دهند شروع می شود. رکتوم به پایین تا
سطح عضلات بالابرنده مقعد ادامه پیدا می کند و طول آن از 12 تا 15 سانتی متر ادامه پیدا می کند.کانال جراحی آنال که حدودا 4 سانتی متر می باشد، قسمت انتهای روده بزرگ است که از بین عضلات بالا رونده مقعد عبور می کند و به لبه مقعد باز می شود(میبدی و همکاران 1382).
دیواره روده بزرگ شامل شش لایه است: مخاط، موسکولاریس موکوزا، زیر مخاط، موسکولاریس پروپریا، چربی زیر سروزی و سروز، رکتوم نیز بافت مشابهی دارد ولی سروز ندارد(میبدی و همکاران 1382).
1-3جنین شناسی روده بزرگ:
در طول هفته چهارم حاملگی، روده اولیه که شامل پیش روده، میان روده و پس روده می باشد تشکیل می شود. میان روده به روده کوچک(که از نقطهی ورودی مجرای صفراوی شروع می شود) و بخشی از روده بزرگ که پیش از نقطه میانی کولون عرضی قرار گرفته تبدیل می شود. خون این بخش از روده توسط شریان مزانتریک فوقانی تامین می گردد. پس روده به بخشی از روده بزرگ که پس از نقطه میانی کولون عرضی قرار گرفته نیز قسمت پرگزیمال مقعد و مجرای ادراری تناسلی تحتانی تبدیل می شود.
در طول هفته ششم حاملگی میان روده به خارج از حفره شکمی منتقل می گردد بیش از آنکه میان روده موقعیت نهایی خود را در حفره شکمی به دست آورد. در طول چهار هفتهی بعدی در خلاف جهت عقربه های ساعت حول شریان مزانتریک فوقانی 270 درجه می چرخد.
انتهای پس روده به کلواک ختم می شود که در هفته ششم توسط دیواره اتورکتال به دو بخش شکمی و پشتی یعنی سینوس ادراری تناسلی و رکتوم تقسیم می شود. تکمیل مجرای آنال در انتهای هفته هشتم است یعنی هنگامی که غشاء نازک آنال پاره می شود خط دندانه ای در قسمت تحتانی مجرای آنال مشخص کننده مرز بین پس روده اندودرمی و بافت اکتودرمی می باشد(میبدی و همکاران1382).
1-4سرطان کولورکتال:
سرطان کولون و رکتوم را سرطان کولورکتال گویند(kang et at 2011). سرطان کولورکتال سومین عامل مرگ از سرطان ها در جهان محسوب می شود(پارکین 2001 ) این بیماری در ایران به عنوان چهــارمین سرطان شایع در هر دو جنس به شمار می رود(بویل و لانگمان 2000). سرطان کولورکتال سومین سرطان شایع در بین مردان و چهارمین سرطان شایع در بین زنان در ایران می باشد(کلاهدوزان 2009).تخمین زده می شود سالانه در ایران 3641 نفر به این بیماری مبتلا می شوند(ملک زاده 2009).
سرطان کولورکتال به دو شکل عمده وجود دارد سرطان کولورکتال موردی(spo--ic) و سرطان کولورکتال ارثی(kang et at2011).

شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده (کاضمی اسکندانی 1388)
سرطان کولورکتال دارای سه زیر گروه بر اساس عمده ژنتیکی یا تغییرات اپی ژنتیک است:
1.تومور با بی ثباتی کروموزومی
2.کسانی با ناپایداری میکروستلایت
3.تومورهای با جزایر CpG متیلاتور
آسیب شناسی مولکولی سرطان کولورکتال یکی از برجسته ترین موارد مطالعه در سال های اخیر بوده است(kang et al-2001) .و به دلیل اثرات جانبی شدید شیمی درمانی استراتژی های جدید بر مبنای مکانیسم های مولکولی به شدت احساس می گردد(hisayuki and Gazdar 2005).
هم چنین یکی از معظلات اساسی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز آن به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.

1-3درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال (دکتر سید مهدی جلالی و همکاران با تحقیق بر روی بیماران از سال 1360تا 1380 )1-4-1چه کسانی در معرض خطر قرار دارند (ریسک فاکتورها یا عوامل خطر ):
علت دقیق بروز سرطان کولورکتال شناخته شده نیست. پزشکان به ندرت می توانند علت ابتلا و یا عدم ابتلای افراد به سرطان کولورکتال را بیان کنند. به هر حال آنچه مشخص است این است که این بیماری مسری نبوده و هیچ فردی این بیماری را از فرد دیگری نمی گیرد.تحقیقات نشان داده اند که افراد با عوامل خطر معین، نسبت به سایر افراد در معرض خطر بالای ابتلا به سرطان کولورکتال قرار دارند. وجود عامل خطر یا ریسک فاکتور، شانس ابتلا و پیشرفت بیماری را در یک فرد افزایش می دهد(کاظمی اسکندانی1388).
فاکتور های مختلفی در تبدیل موکوس رودهی بزرگ به سرطان دخالت دارند عوامل محیطی و ژنتیکی هر دو از عوامل مهم در ایجاد این بیماری هستند(caseito and lowitz 2001).
1-4-2عوامل محیطی:
سن بالای 50 سالگی: احتمال بروز سرطان کولورکتال در افراد مسن بیشتر است. بیش از 90% مبتلایان، بالای50 سال سن دارند و متوسط سن مبتلایان در زمان تشخیص، بالای 72 سال می باشد.
رژیم غذایی: مطالعات نشان داده است که رژیم های پر چرب (بخصوص چربی های حیوانی)، کم فیبر، کم کلسیم و کم فولات خطر ابتلا را افزایش می دهند. هم چنین خطر ابتلا به سرطان کولورکتال در افرادی که از میوه جات و سبزیجات کمتراستفاده می کنند، بیشتر است.
مصرف سیگار : خطر بروز پولیپ و سرطان کولورکتال در افراد سیگاری بیشتراست(کاظمی اسکندانی 1388).
1-4-3عوامل ژنتیکی:
کشف انکوژن ها در سال 1910 زمانی که پیتون رویس(Peyton Rous) نشان داد یک عصاره عبور داده شده از فیلتر که فاقد سلول و باکتری است می تواند باعث ایجاد فیبروسارکوما در جوجه ها شود آغاز شد(pappou 2010). بعد از آن او دریافت که سارکومای جوجه می تواند به دفعات به وسیله عصاره توموری فاقد سلول، از حیوانی به حیوان دیگر منتقل شود.عامل این بیماری در عصاره سلولی ویروسRouse sarcoma Virus بود. کشف انکوژن های ویروسی برای اولین بار باعث شد که یک عامل ایجاد کننده سرطان از منظر ژنتیک مورد مطالعه قرار گیرد(نخعی سیستانی 1389).
از دست دادن ثبات ژنومی از طریق تسهیل دستیابی به جهش های مرتبط با تومور در توسعه سرطان روده بزرگ دخالت دارد. در این بیماری بی ثباتی ژنومی اشکال مختلفی دارد که هر کدام علل متفاوتی دارند.متداول ترین بی ثباتی ژنومی در سرطان کولورکتال بی ثباتی کروموزومی است که منجر به تغییرات زیاد در تعداد رونوشت و ساختار کروموزوم می شود. بی ثباتی کروموزومی مکانیسم موثری در فقدان فیزیکی رونوشت های نوع وحشی ژن های سرکوب کننده تومور مانند APC و P53 است (Sanford and bertagnolli 2009).
1-4-4عوامل دیگر در بروز سرطان کولورکتال:
پولیپ های کولورکتال: پولیپ ها در دیواره داخلی روده بزرگ یا رکتوم رشد می کنند.
سابقه خانوادگی ابتلا به سرطان کولورکتال: سابقه ابتلا به سرطان درفامیل نزدیک ( والدین،برادران و خواهران و یا فرزندان ) به ویژه در سنین پایین، احتمال بروز سرطان را افزایش می دهد.
داشتن سابقه ابتلا به سرطان : سرطان کولورکتال ممکن است مجددا در فرد دارای سابقه ابتلای قبلی به این بیماری، بروز نماید
بیماری های التهابی روده یا بیماری کرون: خطر بروز سرطان کولون ، در فردی که سابقه بیماری های التهابی زخم شونده روده و بیماری کرون را برای چندین سال دارند، بیشتر می باشد(کاظمی اسکندانی 1388).
1-4-5علائم و نشانه ها
علائم و نشانه های شایع عبارتند از :
اسهال، یبوست
احساس عدم تخلیه کامل روده
مشاهده خون (قرمز روشن یا خیلی تیره) در مدفوع
باریک شدن بیش از حد معمول مدفوع
کاهش وزن بدون علت مشخص
احساس خستگی مداوم
تهوع و استفراغ
ناراحتی های عمومی شکم (احساس پری شکم، درد، پیچش شکم و شکم نفاخ)
در اغلب موارد، این علائم ناشی از سرطان نمی باشند. سایر بیماری ها نیز این نشانه ها را ایجاد می کنند. بایستی در صورت وجود این علائم ، جهت تشخیص و درمان هر چه سریع تر به پزشک مراجعه نمود(کاظمی اسکندانی 1388).
1-5غربالگری
بررسی های انجام شده حاکی از این است که در صورت شناسایی سرطان کولورکتال در مراحل ابتدایی شانس بهبودی کامل مبتلایان به این بدخیمی در حدود 90% می باشد ولی در صورتی که در تشخیص و درمان این سرطان تعویق ایجاد شود بدخیمی وارد مرحله پیشرفته و غیر قابل درمان می شود (ma et at 2009). غربالگری سرطان قبل از بروز علائم و نشانه های بیماری، به پزشک در شناسایی پولیپ ها یا سرطان اولیه کمک می کند. شناسایی وخارج نمودن پولیپ ها، از بروز سرطان کولورکتال پیشگیری می کند.
برای شناسایی سرطان و پولیپ در مراحل اولیه بایستی:
افراد 50 سال و به بالا، غربالگری شوند.
افرادی که احتمال بروز بیماری در آنها بیشتر است ، با پزشک خود در مورد انجام آزمایشات غربالگری قبل از 50 سالگی ، نوع آزمایشات و فواید و مضرات هرکدام از آزمایشات صحبت نمایند.
از آزمایشات غربالگری زیر برای تشخیص سرطان، پولیپ ها و سایر موارد غیر طبیعی کولون و رکتوم استفاده می شود:
وجود خون مخفی در مدفوع: اغلب اوقات سرطان ها یا پولیپ ها دچار خونریزی می شوند و این آزمایش قادر به شناسایی کمترین مقادیر خون در مدفوع می باشد. در صورت شناسایی وجود خون در مدفوع سایر آزمایشات برای شناسایی منبع خون مورد نیاز می باشد. البته لازم به ذکر است که موارد خوش خیم همانند بواسیر( هموروئید ) نیز موجب بروز خون در مدفوع می شوند.
سیگموئیدوسکپی: پزشک با سیگموئیدوسکپ ( لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد) داخل رکتوم و قسمت تحتانی کولون (سیگموئید) را بررسی می کند و در صورت وجود پولیپ، آنها را خارج می کند. به خارج کردن پولیپ، پولیپکتومی گفته می شود.
کولونوسکپی: پزشک با استفاده از کولونوسکپ (لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد) داخل کولون و رکتوم را بررسی نموده و در صورت وجود پولیپ، آنها را خارج می کند.
تنقیه با محلول باریم : پس از تنقیه بیمار با محلول باریم، هوا داخل رکتوم پمپ شده و توسط اشعه ایکس از کولون و رکتوم ، عکس برداری های متعدد انجام می شود. توسط باریم و هوا، پولیپ ها در عکس برداری مشخص می شوند.
معاینه انگشتی رکتوم : معاینه رکتوم یکی از روش های معمول معاینه بدنی است. پزشک پس از پوشیدن دستکش و مالیدن ژل، با داخل کردن انگشت داخل رکتوم نواحی غیر طبیعی موجود در قسمت های تحتانی رکتوم را بررسی می کنند (کاظمی اسکندانی1388).
1-6تعیین مرحله بیماری
زمانی که نمونه برداری نشانگر وجود سرطان کولورکتال باشد، لازم است پزشک وسعت بیماری( درجه بیماری) را بداند تا بهترین روش درمانی را طرح ریزی کند.
مرحله بیماری به تهاجم تومور به بافت های مجاور و انتشار سرطان بستگی دارد و اینکه در صورت انتشار، به کدام قسمت از بدن منتشر شده است. برای تعیین مرحله بیماری آزمایشات و اقدامات زیر انجام می شود:
آزمایشات خون: پزشک میزان CEA (آنتی ژن کارسینومای امبریونیک) و سایر مواد موجود در خون را کنترل می کند. در اغلب مبتلایان به سرطان کولورکتال، میزان CEA بالا می باشد.
کولونوسکپی: پزشک با کولونوسکپی داخل کولون و رکتوم را از نظر وجود نواحی غیرطبیعی بررسی می کند.
سونوگرافی داخل مقعدی: پروب سونوگرافی داخل رکتوم قرار داده می شود. پروب، امواج صوتی را که افراد قادر به شنیدن آن نیستند به داخل رکتوم و بافت های اطراف می فرستد. کامپیوتر با استفاده از انعکاس صوت(اکو) تصویر ایجاد می کند. تصویر ایجاد شده، نشان میدهد که تا چه عمقی تومور رکتوم رشد کرده است و همچنین انتشارسرطان به گره های لنفاوی یا سایر بافت های مجاور را نشان می دهد.
عکس برداری توسط اشعه ایکس از قفسه سینه: عکس برداری از قفسه سینه، نشان دهنده انتشار سرطان به ریه است.
سی تی اسکن: دستگاه عکسبرداری توسط اشعه ایکس که به کامپیوتر متصل می باشد، یک سری تصاویر با جزئیات بیشتر را از نواحی داخل بدن در دسترس قرار می دهد. ممکن است ماده حاجب تزریق گردد. این روش انتشار تومور به کبد، ریه ها و یا سایر نواحی بدن را نشان می دهد(کاظمی اسکندانی 1388).
مراحل سرطان کولورکتال به شرح زیر می باشد:
مرحله I : سرطان درون دیواره داخلی رکتوم و کولون رشد کرده است ولی هنوز به دیواره خارجی کولون نرسیده و یا به بیرون از کولون گسترش نیافته است .
مرحلهII : تومور به قسمت های عمقی و یا سرتاسرعمق دیواره کولون و رکتوم انتشار یافته و ممکن است بافت های مجاور را نیز درگیر کند اما سلول های سرطانی هنوز به گره های لنفاوی انتشار نیافته اند.
مرحله III : سرطان به گره های لنفاوی مجاور انتشار پیدا کرده اما به سایر قسمت های بدن منتشر نشده است.
مرحلهIV : سرطان در سایر قسمت های بدن همانند کبد و ریه ها منتشر شده است(کاظم اسکندانی 1388).
در مراحل 1و2 سرطان کولورکتال امکان درمان این سرطان با عمل جراحی وجود دارد ولی احتمال بهبودی در مرحله 4 بسیار ضعیف است(ma et at 2009).
سرطان عود کرده : سرطانی است که درمان شده است ولی پس از یک دوره زمانی مجددا عود نموده است. این بیماری ممکن است در کولون، رکتوم و یا سایر قسمت های بدن عود کند (کاظمی اسکندانی1388).

1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال(دکتر سید مهدی جلالی و همکاران با تحقیق بر روی بیماران از سال 1360تا 1380 )
1-7روش های درمانی:
اساسا انتخاب نوع درمان به محل تومور در رکتوم و کولون و مرحله بیماری بستگی دارد. برای درمان سرطان کولورکتال از جراحی، رادیوتراپی (پرتودرمانی)، شیمی درمانی و یا ترکیبی از این درمان ها استفاده می شود درمان سرطان به صورت درمان موضعی یا درمان سیستمیک است(کاضمی اسکندانی 1388)..
کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. )محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از 90% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ میدهند.تومورهای اولیه میتوانند توسط جراحی یا درمانهای مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطانهایی که به مرحله متاستاز رسیده اندبه درمان مقاوماند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ را در میان افراد دارای
متاستاز نشان میدهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایندهای ایجادکننده متاستاز و فراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن میباشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).
1-7-1درمان موضعی:
جراحی و پرتودرمانی جزء درمان های موضعی هستند. در جراحی، تومور خارج شده و پرتودرمانی، سلول های سرطانی را نابود می کند. در صورت انتشار سرطان کولورکتال به سایر قسمت های بدن ، از درمان موضعی برای کنترل بیماری در آن مناطق خاص، استفاده می شود. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-2درمان سیستمیک:
شیمی درمانی و درمان بیولوژیکی از سایر روش های درمانی سیستمیک هستند و برای کنترل سرطان، دارو وارد جریان خون می شود.
بروز عوارض جانبی به علت تاثیر درمان روی سلول ها و بافت های سالم، شایع است. عوارض جانبی به نوع و وسعت درمان بستگی داشته و در تمام افراد یکسان نمی باشد. ممکن است عوارض جانبی، در هر جلسه از درمان متفاوت باشد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-3کولونوسکپی:
یک پولیپ سرطانی کوچک موجود در کولون یا قسمت فوقانی رکتوم ممکن است توسط کولونوسکوپ خارج گردد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-4لاپاراسکپی:
ممکن است سرطان کولون در مراحل اولیه با استفاده از لاپاراسکوپ ( لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد ) برداشته شود. سه الی چهار برش کوچک در شکم داده می شود. جراح با لاپاراسکوپ داخل شکم را مشاهده کرده و تومور و قسمتی از نواحی سالم کولون را خارج می کند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-6جراحی باز:
رایج ترین درمان سرطان کولورکتال، جراحی است. جراح برای خارج نمودن تومور و قسمتی از نواحی سالم رکتوم و کولون، روی شکم برش بزرگی ایجاد می کند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-7شیمی درمانی
شیمی درمانی استفاده از داروهای ضد سرطان برای از بین بردن سلول های سرطانی است. داروهای شیمی درمانی وارد گردش خون شده و بر سلول های سرطانی تمام بدن اثر می کنند.
عوارض شیمی درمانی:
سلول های خونی: این سلول ها با عفونت مقابله نموده و به لخته شدن خون کمک می کنند، هم چنین اکسیژن را به تمام بافت های بدن حمل می کنند. ممکن است به علت تاثیر دارو روی سلول های خونی، عفونت و خونریزی های خودبخودی و کبودی، احساس ضعف و خستگی ایجاد شود.
سلول های ریشه مو: شیمی درمانی موجب ریزش مو می شود. باید دانست که موها مجدد رشد می کنند ولی ممکن است از نظر بافت و رنگ متفاوت باشد.
سلول های دستگاه گوارشی: شیمی درمانی موجب کاهش اشتها، تهوع و استفراغ، اسهال یا زخم های دهان و لب ها می شود. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-8درمان بیولوژیکی:
.برخی از مبتلایان به سرطان کولورکتال انتشار یافته، نوعی درمان بیولوژیکی به نام آنتی بادی مونوکلونال دریافت می کنند. آنتی بادی های مونوکلونال به سلول های سرطانی کولورکتال می پیوندند و رشد و انتشار آن ها را مهار می کنند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-9پرتودرمانی ( درمان با اشعه )
دراین روش از اشعه های پرانرژی جهت از بین بردن سلول های سرطانی استفاده می شود. پرتودرمانی تنها در ناحیه تحت درمان، بر سلول های سرطانی تاثیر می گذارد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-9-1 انواع درمان با اشعه:
پرتو درمانی خارجی : دستگاهی بزرگ، اشعه هایی را به سمت موضع هدایت می کند.
پرتودرمانی داخلی: اشعه، توسط ماده رادیواکتیو قرار داده شده در لوله باریکی که مستقیما در داخل و یا نزدیک تومور کار گذاشته است، تابانده می شود.
پرتودرمانی حین جراحی: در برخی موارد، پرتو درمانی خارجی در طول جراحی داده می شود (کاضمی اسکندانی 1388).
CD166 یا ALCAM 8-1
ALCAM یا CD166 به عنوان مارکر های سلول های بنیادی سرطان کولورکتال عمل کرده و همچنین در تومور زایی سرطان کولورکتال نقش دارند و از آن می توان به عنوان یک مارکر جهت تشخیص زود هنگام و هم درمان سرطان کولورکتال استفاده کرد.دومین C2 پروتئین ALCAM یک دومین ایمونوگلوبولین می باشد که در بخش خارج سلولی قرار دارد.
همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،2013)
1- 9 ویژگی های عمومی ALCAM
ALCAM یک عضو از خانواده ایمونوگلوبولین است و بر اساس توانایی آن در باند شدن با cd6 شناسایی میشود و از سلولهای cos به همراه DNA آزمایشی استفاده میشود Bowen et al1995, Pate et al 1995)). ALCAM قادر است که واکنش متقابل هموفیلیک را همانند هتروفیلیک به کار اندازد. ژن انسانی برای ALCAM روی کروموزم 3 قرار گرفته است(3q33، 1q132) و از 16 اگزون تشکیل شده است که دارای اندازه ای بیش از kb 200 است. ALCAM یک نوع مولکول غشایی تیپ 1 است و دارای 500 اسید آمینه در ناحیه خارج سلول و 22 اسید آمینه در ناحیه گذرنده از غشا ، 34 اسید آمینه در ناحیه سیتوپلاسمیک و یک ناحیه مولکولی KDa 105 است.

شکل 1-5 نمای کلی پروتئین ALCAM (اولریج و همکاران ،2010)
1- 10 شناسایی ALCAM به عنوان یک هدف مرتبط با آنکولوژی
روشهای مختلف ژنومیک و پروتئومیک مختلف اشاره کرده اند که ALCAM به عنوان یک هدف مرتبط با آنکولوژی است. همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،2013) کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. روش های متداول شیمی درمانی سلول ها تمایز یافته یا درحال تمایز را که قسمت عمده ی توده تومور را شکل می دهند هدف قرار می دهند اما باید توجه داشت که این سلول ها تنها حجم تومور را می سازند و  قادر به تولید سلول های جدید نیستند و در پیشرفت بیماری و رشد تومور نقشی ندارند در حالیکه جمعیت سلول های سرطانی که سرطان و رشد تومور را سبب می شوند، دست نخورده و دور از چشم باقی مانده و باعث عود کردن بیماری می شوند.برخی محققان بر این باورند که در مرکز هر توموری تعداد کمی سلول های بنیادی نابهنجار قرار گرفته اند که رشد بافت های بدخیم و ناهنجار را تداوم می بخشند.اگر این نظر درست باشد، می تواند توضیح دهد که چرا تومورها اغلب حتی پس از اینکه به وسیله داروهای ضدسرطان تقریباً تخریب شده اند دوباره بازسازی می شوند. این حالت همچنین یک راهکار متفاوت برای ایجاد داروهای ضدسرطان را نشان می دهد و دال بر آن است که این داروها می بایستی برای از بین بردن سلول های بنیادی سرطانی و نه برای توانایی شان در از بین بردن هر سلولی و کوچک کردن تومورها، انتخاب شوند.چندین روش مبتنی بر روش های ژنومیکو پروتئومیکس این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.
این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان آنتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010 ) آنتی ژن ها مارکر های سطح سلولی اند و می توانند برای شناسایی گروه های سلولی که تشکیل دهنده یک ارگان هستند مورد استفاده قرار گیرند.این مارکرها را می توان جهت پیش بینی پاسخ به درمان ،مرتب سازی سلول های بنیادی سرطان، درمان سرطان و مرتب سازی رده های سلولی مورد استفاده قرار داد.(الوین لیو و همکاران، 2004).
این پروتئین نقش مهمی در تهاجم و پیشرفت تومور در سرطان کولورکتال دارد(جیایی وانگ و همکاران،2011).

1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری(مرته تونه وایجر و همکاران،2010)
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از 90% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ میدهند.تومورهای اولیه میتوانند توسط جراحی یا درمانهای مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطانهایی که به مرحله متاستاز رسیدهاند به درمان مقاوماند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ را در میان افراد دارای متاستاز نشان میدهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایندهای ایجاد کننده متاستاز و فراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن میباشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).هم چنین یکی از
معظلات اساسی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز آن به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.
در طول شکل گیری ضایعات توده ، سلول های سرطانی باید به یکدیگر متصل شوند بنابراین از مولکولهای چسبنده برای اینکه با هم بمانند استفاده می کنند.تومور می تواند از طریق افزایش حجم خود به ساختارهای مجاور به طور مستقیم هجوم برده و یا اینکه می توانند به سایت های دور متاستاز شوند.متاستاز هنگامی رخ می دهد سلول ها از تومور اولیه جدا شده و محیط خودشان را ترک کرده ، به رگ های خونی یا لمفاتیک حمله کرده و به مکان های دور مهاجرت کنند.با توجه به اهمیت این پروتئین در چسبندگی
سلول ها می توان نقش مهمی را برای این پروتئین در ایجاد متاستاز در سرطان کولورکتال قائل بود(سالمون اوفوری و جودی کینگ،2008).
مساله تحقیق:
در این مطالعه سعی بر آن داریم که با آنالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان یک دومین اختصاصی (دومینC2) پروتئین غشایی ALCAM که در سطح سلول های سرطانی کولورکتال است و پتانسیل موجود برای بهبود روشهای تشخیصی(تولید کیت های تشخیصی) قبل از وارد شدن به فاز بدخیمی، و گشایشی در تولید واکسن برای تقویت سیستم ایمنی فرد جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان کولورکتال، را بررسی می کنیم.
با استفاده از فرآیند کلونینگ قطعه ژن اپتیمایز شده پروتئین ALCAM را به کمک وکتور وارد باکتری کامپتنت کرده و سپس باکتری حاوی ژن مورد نظر خود را از دیگر سلول ها جدا می کنیم و از آن ها استخراج پلاسمید انجام داده و سپس از طریق ساب کلونینگ ژن مورد نظر خود را وارد یک وکتور بیانی کرده و از سلول های ترنسفکت شده استخراج پروتئین انجام داده و سپس بیان پروتئین مورد نظر خود را بررسی می کنیم.
در این مطالعه فرضیه ای مطرح شد که مولکول دومین سنتز شده می تواند در میزبان پروکاریوتی کلون و بیان شود.
فصل 2:مروری بر تحقیقات انجام شده
کلونینگ و بیان این پروتئین در سال 1995 توسط مایک بوون و همکارانش شرح داده شد.آنها نشان دادند که آنتی بادی های CD166 به عنوان یک پروتئین ایمنوگلوبولین به CD6متصل می گردد.(مایکل بوون و همکاران ،1995؛ مایکل بوون و اروفو،1999).
CD166 نقش بسیار مهمی در تهاجم توموری دارد.(جیاجی وانگ و همکاران،2011)
چندین روش مبتنی بر روش های ژنومیک و پروتئومیکس این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان آنتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010)
در آزمایشات صورت گرفته مرته تونه و همکارانش در شرایط آزمایشگاهی و هم چنین محیط زنده، آنتی بادی های ضد این مارکر اثر مهارکننده ایی بر سرطان کولورکتال از خود نشان دادند.در آزمایش آنها رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی برای این مارکر در تومور مثبت بود در صورتی که در اکثر تست هایی که بروی بافت های طبیعی انسان صورت گرفته بودALCAMمشاهده نشد. با توجه به منفی بودن رنگ آمیزی بافت نرمال انسان و مشاهده فعالیت ضد توموری این مارکر بر سرطان کولورکتال در داخل بدن آنتی بادی scFvیک کاندیدای بالقوه جهت درمان سرطان کولورکتال معرفی گردید(مرته تونه و همکاران، 2010).
هم چنین الگوی بیان این مارکر در بافت نرمال و توموری ، روده انسان و موش با استفاده از روش های ایمنوهیستوشیمی،فلوسیتومتری و واکنش زنجیره ایی پلی مراز ترانس کریپتاز معکوس مورد بررسی قرار
گرفت.در نهایت پس از بررسی صورت گرفته ALCAM را به عنوان یک مارکر بالقوه جهت اهداف درمانی برای سرطان کولورکتال معرفی کردند.(لوین و همکاران ،2010)
بیان ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند .افزایش بیان در تومورهای با تمایز بالا ممکن است مشخص کننده نقش بالقوه این مارکر در مراحل اولیه تومورزایی باشد،از دست دادن این پروتئین نیز ممکن است با کاهش چسبندگی سلولی همراه شود ، نتیجه پتانسل بالقوه بالای
تومور در متاستاز خواهد بود.این نتایج از طریق آنالیز ایمونوهیستوشیمیایی ALCAM که بروی نمونه بافتی بیماران تحت درمان صورت گرفته بود بدست آمد.(مایکل تاچزی و همکاران، 2010؛سالمون اوفوری و جودی کینگ،2008)
همچنین مشخص شده است که ریزش ALCAM در مراحل اولیه بیماری می تواند به عنوان یک مارکر تشخیصی دقیق برای شناسایی سریع بیمارانی که در معرض خطر پیشرفت بیماری هستند مورد استفاده قرار گیرد.(اماندا هنسن و همکاران ، 2013)
این نکته مشخص گردیده است ALCAM در دو نوع تعامل سلول –سلول هموفیلیک و هتروفیلیک به عنوان میانجی عمل می کند. مشخص شده گلیکوزیلاسیون پس از ترجمه هیچ اثری بروی خاصیت اتصالی هموفیلیک ندارد.(گیادو اسوارت،2002)
در مطالعاتی که جهت تهیه نقشه خانواده مولکلوهای ایمونوگلوبولین چسبنده سلولی ((Igfs صورت گرفته مشخص شده است که دومین های ناحیه C2 نقش بسیار مهمی در اتصال به لیگاند ایفا می کنند.) گیادو اسوارت و همکاران ،2002 ؛ کوین زن وهمکاران،1999)
تجزیه و تحلیل سلول هایی با مجموعه مولکول های سطحی EpCAMhigh/CD44+ منجر شناسایی CD166 به عنوان مارکر بیانی اضافی متفاوت، که جهت جداسازی سلول های بنیادی به شناسایی سرطان در سرطان کولورکتال مفید می باشد شد.(پیه رو دالربا و همکاران ،2006)
هم چنین پیشنهاد شده است که CD166 به همراه CD44 نیز می تواند نقش بالقوه ایی در سرطان کولورکتال انسانی ایفا کند زیرا سلول های موشی که برای هر دوی این ماکر ها مثبت بودند تومورزایی بسیار بیشتری در مقایسه با سلول هایی که تنها برای CD44 مثبت بودند داشتند.(کاترینا فانالی و همکاران ،2014)
در بیشتر مطالعاتی که اخیرا بروی بافت های سرطان کولورکتال صورت گرفته گزارش شده است که از دست دادن غشایی CD166 و CD44 استاندارد(CD44s) با تهاجم و بدتر شدن وضعیت بقا در ارتباط می باشد.(توماس برونر و همکاران ،2012)
هم چنین ترکیب مارکرهایCD166،CD44 و CD133 می تواند به طور موفق آمیزی جهت شناسایی بیمارانی که خطر متاستاز و عود بیماری در انها کم،متوسط و یا زیاد است در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال استفاده گردد.(یوسوکه شینوزووا و همکاران،2013)
همچنین در طی آزمایشی دیگری مشخص شد که ALCAM غالبا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد ، که بر اهمیت آن در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.( ویچرت و همکاران،2004)
بر اساس تحقیقی دیگری که بروی بیان CD166 صورت گرفت مشخص شد که موقعیت های مختلف سلولی این پروتئین ارزش تشخیصی متفاوتی دارند و بیان سیتوپلاسمی آن با نتایج تشخیصی بدتری همراه می باشد.هم چنین اینها متوجه شدند که بیان CD166 به صورت خاصی در انواع رده های توموری افزایش پیدا می کند.(چائو نی و همکاران،2013)
بیان بالای CD166 به همراه P21 در نمونه برداری های قبل درمان با عود تومور و پیش بینی ضعیف در بیماران درمان شده با 5-FU بر پایه شیمورادیوتراپی قبل عمل ارتباط داشت.البته برای تعیین نقش CD166 وP21 به عنوان نشانگرهای پیش بینی به پاسخ شیمورادیوتراپی قبل از عمل جراحی به مطالعات بزرگتر و کابردی تری در آینده نیاز می باشد.(سانگ هون سیم و همکاران،2014)
در تحقیقی بروی نمونه های کولکتومی به دست آمده از سرطان کولون به منظور بررسی ماکر CD166 صورت گرفت مشخص شد که بیش از دو سوم نمونه ها CD166 را بیان می کنند.هم چنین بیان غشایی CD166 مرتبط با سرطان کولورکتال در قسمت کولون این سرطان بیشتر می باشد. (شهریار صفایی و همکاران،2013)
فصل 3 : مواد و روش ها:
3-1 مواد مورد استفاده:
3-1-1 باکتری مورد استفاده
برای این مطالعه در مرحله کلونینگ ژن دومینC پروتئین ALCAM از باکتری E.coli سویه TOP10 و در مرحله ی ساب کلونینگ از باکتری E.coli سویه BL21(DE3)استفاده شد . این باکتری ها ابتدا بصورت لیوفیلزه بوده و سپس برای استفاده از آن، پودر باکتری را به 5 میلی لیتر محیط کشت مایع LB اضافه کرده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شبانه روز کشت می دهیم.
3-1-2 آنزیم ها
از آنزیم های NcoI و XhoI که از شرکت فرمنتازخریداری و تهیه شدند و همچنین از آنزیم اتصال دهنده T4 DNA Ligase هم در مرحله ی Ligation استفاده شد. این آنزیم ها در دمایی 20- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
3-1-3 پلاسمید
برای مرحله ی ساب کلونینگ از پلاسمید بیانی (pet-28a ) استفاده شد . این پلاسمید دارای جایگاه های مختلف برای انواع آنزیم های محدود کننده می باشد که می توان ژن مورد نظر را به کمک آنها وارد پلاسمید کرد. این پلاسمید دارای پارامترهای بیان کننده و همچنین جایگاه های برش آنزیمی دلخواه است و همچنین ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین را دارا بوده که به باکتری ترانسفورم شده امکان زنده بودن و بقاء در محیط کشت حاوی کانامایسین را می دهد. جهت بیان قطعه ژن کلون شده در آن هم دارای پارامتر های بیانی مانند پروموتر lac می باشد که در حضور القاگرIPTG شروع به بیان ژن مورد نظر می کند. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a در شکل 3-1 نشان داده شده است.

شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید pet28
3-1-4 آنتی بیوتیک ها
از آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و کانامایسین استفاده شد. که ابتدا این آنتی بیوتیک ها به غلظت مناسب رسانده شد و در تیوب های 5/1 میلی لیتری تقسیم گردید و سپس در شرایط دمایی20- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
3-1-5 کیت های آزمایشگاهی
از کیت های استخراج DNA از ژل و استخراج پلاسمید که از شرکت فرمنتاز تهیه و خریداری شدند استفاده شد. که این کیت ها در شرایط دمایی 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
3-1-6 ژل الکتروفورز
برای ساختن ژل الکتروفورز از پودر آگارز Low که از شرکت هیسپانلب تهیه شد استفاده گردید و همچنین در ساختن ژل از رنگ اتیدیوم برماید و بافر TAE50X که آن را به یک ایکس رقیق نموده استفاده شد.
3-1-7 مواد شیمیایی
کلیه مواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان با درجه ی خلوص بیولوژی مولکولی تهیه گردید و در مراحل مختلف مطالعه از جمله تولید ژل الکتروفورز (SDS-page ) مورد استفاده قرار گرفت.


3-1-8 محیط کشت باکتری
در این مطالعه از محیط کشت های آگار و محیط کشت LBآگار جهت تکثیر و رشد باکتری استفاده شد.
3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی استفاده شده در این مطالعه
1- میکروتیوب های 2/0 ، 5/0 و 5/1
2- لوله ی آزمایش 160 × 16 سیماکس
3- پلیت یکبار مصرف 10 سانتیمتری
4- سمپلر در سایزهای مختلف
5- نوک سمپلر آبی، زرد، کریستالی
6- انکوباتور ساخت شرکت ممرت ایالات متحده امریکا (شکل 3-2 )

شکل3-2 دستگاه انکوباتور
7- اتوکلاو جهت ضد عفونی کردن وسایل پلاستیکی و محیط کشت ها(شکل 3-3)

شکل3-3 دستگاه اتوکلاو
8- دستگاه فور جهت ضد عفونی کردن وسایل شیشه ای
9- تانک الکتروفورز (SDS-Page )
10- تانک الکتروفوز افقی
11- دستگاه مولد ولتاژ (شکل 3-4 )

شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژ و تانک الکتروفورز
12- شیکرانکوباتور ساخت (شکل 3-5 )

شکل 3-5 شیکر انکو باتور
14- سانتریفیوژ ساخت شرکت اپندور آلمان (شکل 3-6 )

شکل 3-6 سانتریفیوژ
14- گرماساز
16- دستگاه تصویر ساز ژل ( شکل3-7)

شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل
17- انکی باتور شانزده درجه ( شکل 3-8 )

شکل3-8 انکی باتور شانزده درجه
18- بن ماری (شکل 3-9 )

شکل3-9 بن ماری
19.سانتریفیوژ یخچال دار
3-2 آنالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
توالی مورد نظر از طریق سایت های Swiss-port / Uniprot KB و مرکز ملی اطلاعات ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite Hidden="1"><Author>Online</Author><RecNum>84</RecNum><record><rec-number>84</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="vpp0ad9pgwdrfoefffjxvv9er2zwf0z0ep5z">84</key></foreign-keys><ref-type name="Online Database">45</ref-type><contributors><authors><author>Server Online</author></authors></contributors><titles><title>National Center for Biotechnology Information</title></titles><dates></dates><pub-location>www.ncbi.nlm.nih.gov</pub-location><urls><related-urls><url>www.ncbi.nlm.nih.gov</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote> بیوتکنولوژی (NCBI) بدست آورده شد. سپس در انتهای 3' توالی مورد نظر ، 6 اسید آمینه ی هیستیدین (His-Tag ) قرار داده شد و کدون پایان (TAA ) هم بعد از آن قرار گرفت. در انتها نیز جایگاه های برش آنزیمی برای آنزیم های محدود کننده NcoI در سر '5 توالی و جایگاه برش آنزیمی برای آنزیم محدود کننده XhoI در سر '3 توالی قرار داده شد.
3-2-2 بهینه سازی یا Optimization توالی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
از آنجای که ثابت شده فرآیند گلیکوزیلاسیون به نحوه اتصال این پروتئین در واکنش های هموفیلیک تاثیری ندارد میزبان پروکاریوتی E.coli برای فرآیند کلونینگ انتخاب شد. برای دستیابی به بیشترین میزان بیان صحیح در E.coli توالی 792 نوکلئوتیدی ناحیه C2 پروتئیینALCAM طراحی شده توسط شرکت Genscript ایالات متحده آمریکا بهینه سازی شد.
پارامترهایی که توسط این شرکت برای فرآیند بهینه سازی در نظر گرفته شد، شامل موارد زیر می شود :
codon usage میزبان
محتوای CG
ساختار دوم mRNA پیش بینی شده .
از بین بردن نواحی برش ناخواسته .
جایگاه های آنزیمی آنزیم های محدودالاثر که ممکن است در فرآیند کلونینگ اختلال ایجاد کنند.
6.به حداقل رساندن نواحی تکرار شونده مستقیم یا غیر مستقیم.
3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده ناحیه C2 پروتئین ALCAM توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد.
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده
DNA لیوفیلیزه شده را می توان توسط بافر TE استریل یا آب بدون نوکلئاز در PH طبیعی و با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول در آورد. و سپس می توان آن را در دمای بین20- تا 80- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد. DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TE می تواند به مدت 6 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود در صورتی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در 4 درجه سانتیگراد وجود ندارد.
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا بهتر است به مدت چند ثانیه تیوب را سانتریفیوژ کنیم تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند. در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیرهی DNA در هنگام برداشتن آن به دیواره های سر سمپلر بچسبد و از دسترس خارج شود.
1.استوک اصلی: µg 10 از DNA لیوفیلیزه در µl 100 از بافر TE حل شد.
2. استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگرµl 1 از استوک اصلی در µl10 از بافر TE حل شد. ( غلظت نهایی به ng/ µl10 رسید.)
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهC2پروتئین ALCAM
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته
جهت آماده سازی باکتری Top 10 برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید آن را کامپتنت یا شایسته سازی کرد.
3-4-1-1 مواد و محلول ها
- محلول کلرید کلسیم 0.1 مولار
- LB براث بدون آنتی بیوتیک
- LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن آن بعد از اتوکلاو کردن، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد. غلظت آمپی سیلین باید حدود 100 میکروگرم در هر میلی لیتر باشد )
- LB آگار حاوی آمپی سیلین ( روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است ).
3-4-1-2 روش کار
باکتری را در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده.
2- برای مدت24 ساعت (over night) محیط کشت را در انکوباتور قرار داده، یک تک کلون از آن را انتخاب کرده و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
3- 400 میکرو لیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB براث تازه تلقیح نموده و مجددا آن را به مدت 2تا 3 ساعت در شیکرانکوباتور قرار می دهیم. تا محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را به ما می دهد در این حالت باکتری در فاز رشد لگاریتمی خود قرار دارد.
4- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم.
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
9- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
10- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
12- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا 72 ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli
بدین منظور از سویه E.coli Top10 که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم. این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است و نمی تواند در محیط حاوی آمپی سیلین رشد نماید ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین رشد می کند .3-4-2-1 روش کار:
1- 50 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته را ابتدا روی یخ ذوب می کنیم.
2- 2 میکرولیتر از پلاسمید AMP+-pBSK حاوی DNA ناحیه C2پروتئینALCAM را به آن اضافه می کنیم .
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار می دهیم .
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و 5 دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB فاقد آمپی سیلین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 700 میکرولیتر از مایع رویی را دور ریخته و رسوب را در 250 میکرولیتر باقی مانده خوب حل می کنیم.
8- 100 میکرولیتر را روی یک پلیت LB آگار و150 میکرولیتر را روی یک پلیت دیگر دارای LB آگار آمپی سیلین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
9. 100 میکرولیتر از باکتری شایسته شده که عمل ترانسفوماسیون را روی آن انجام نداده ایم برای کنترل منفی روی پلییتLB آگار کشت می دهیم به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم.
3-4-3 ارزیابی کلونی ها
پس از 18 تا 20 ساعت پلیت ها را ارزیابی می کنیم، پلیت داری باکتری ترانسفورم شده تشکیل کلونی داد و پلیت حاوی باکتری ترانسفورم نشده نباید تشکیل کلونی دهد چون ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را دریافت نکرده است. پس از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود 1 تا 2 میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر LB براث آمپی سیلین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم . با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری، پلاسمید حاوی ژن ما را دریافت کرده است.

3-4-4 استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK حاوی DNA ، C2 پروتئین ALCAM
اساس استخراج پلاسمید مبتنی بر لیز قلیایی و متعاقب آن جذب DNA توسط سیلیکا است و سپس جداسازی پلاسمید از ستون می باشد. برای استخراج پلاسمید از کیت تهیه شده از شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد . ( شکل 3-10 )

شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید
روش کار :
1- از محیط کشتLB مایع حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تا اتمام محیط کشت5 میلی لیتری تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را 4 تا 6 بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول رویی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله12و13 را یک بار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.ستون را به مدت 15 دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم تا الکل آن به طور کامل تبخیر شود.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور ستون را در درون میکروتیوب5/1 سانتریفیوژ می کنیم .
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK که حاوی ژن C2 پروتئین ALCAM سنتز شده توسط کمپانی می باشد، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن سنتز شده می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion
با توجه به سازه ی طراحی شده از دو آنزیم محدود کننده ی Nco1 و XhoI جهت تایید آنزیمی استفاده شد. مراحل انجام کار به شکل زیر است:
1- ابتدا باید بافر مناسب برای هضم دوگانه آنزیم های NcoI و XhoI را انتخاب کنیم که این کار را با کمک سایت شرکت تولید کننده آنزیم ها یعنی فرمنتاز لیتوانی انتخاب می کنیم . بهترین شرایط بافری برای این واکنش بافرx2 تانگو می باشد .
2- یک میکروتیوب 2/0 برمی داریم و محتویات واکنش که توسط سایت فرمانتاز انتخاب کردیم را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید : 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
3- میکروتیوب را به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیموم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
3-4-5-2 الکتروفورز
جهت جداسازی قطعات حاصل از هضم دو گانه آنزیمی از الکتروفورز استفاده می شود.
3-4-5-2-1 تهیه بافر 50x TAE
برای تهیه بافر TAE 50x از موارد زیر استفاده می بریم:
Tris : 5/60 گرم
EDTA 5/0 مولار ( در 8 PH = ) : 25 میلی لیتر
اسید استیک: 28/14 میلی لیتر
آب استریل: به مقداری که حجم نهایی به 250 میلی لیتر برسد.
حجم نهایی:250 میلی لیتر
نکته: برای اینکه بافر 50x TAE را به بافر TAE 1x مورد استفاده دربیاوریم آن را در حجم مناسب رقیق می کنیم .
3-4-5-2-2 تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از ژل آگارز Low استفاده می کنیم . برای تهیه ی ژل 1.5 درصد آگارز، 0.45 گرم آگارز را در 30 میلی لیتر از بافر TAE 1x حل می کنیم و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی آن را مخلوط می کنیم . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت می دهیم تا کاملا ذوب شود. این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد ولی نباید به مرحله جوشیدن برسد. باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده و محلول کاملا شفاف شود.
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای 50 تا 60 درجه سرد شد(زمانی که دست را نسوزاند) ، رنگ گرین ویوئریا اتیدیوم برماید را به میزان 2 میکرولیتر به آن اضافه می کنیم و به ظرف مناسب شانه دار منتقل می کنیم و در دمای محیط قرار می دهیم تا ژل سفت شود و ببندد(تقریبا 15 دقیقه) . این ژل در حضور بافر TAE 1x تا یک هفته در دمای 4 درجه قابل نگه داری است.
3-4-5-2-3 Run کردن نمونه
پس از بسته شدن کامل ژل، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند . تانک الکتروفورز را با بافر TAE 1x پر می کنیم تا حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را با 2میکرولیتر (loading dye) مخلوط کرده و در درون چاهک ریخته ومقدار 2میکرولیتر از یک مارکر با وزن مولکولی kb 1 هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهک ها استفاده می کنیم .
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ 120 ولت و 55 آمپر الکتروفورز را انجام می دهیم .
وقتی رنگ تا حدود 3/2 ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه Gel) (documentation مورد بررسی قرار می دهیم .
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM
جهت بیان ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM از باکتری E.coli BL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از روی ژل اگارز مرحله الکتروفورز با استفاده از کیت خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد.
3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAMاز ژل
برای تخلیص از کیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل 3-11 )

شکل 3-11. کیت استخراج DNA از ژل فرمنتاز
روش انجام آن بصورت زیر می باشد:
1- به کمک یک اسکالپل استریل، ناحیه ای از ژل که DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM در آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم می کنیم برای راحت ذوب شدن ژل .
2- به ژل حاوی DNA نوترکیب ، 400 میکرولیتر Binding Buffer در داخل یک میکروتیوب اضافه می کنیم.
3- مخلوط را به داخل بن ماری 55 درجه انتقال داده و به مدت 5 دقیقه انکوبه می کنیم برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر 2 دقیقه هم می زنیم .
4- 5 میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه می کنیم .
5- 5 دقیقه در بن ماری 55 درجه قرار می دهیم تا سیلیکا به خوبی حل شود.
6- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند . محلول رویی را دور می ریزیم.
7- 500 میکرولیتر washing buffer به میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط می کنیم.
8- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را دور می ریزیم.
9- مرحله ی 7 و 8 را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود ( الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
10- 30 میکرولیتر بافر TE به رسوب اضافه کرده و ورتکس می کنیم تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود .
11- میکروتیوب را به مدت 5 دقیقه در 55 درجه قرار می دهیم.
12- به مدت 1 دقیقه میکروتیوب را در 000/15 دور سانتریفیوژ کرده تا تمامی ترکیبات جامد ته نشین شود . اینک محلول رویی حاوی DNA تخلیص شده است.
3-5-2 لایگیشن
برای اتصال DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM استخراج شده از ژل، با پلاسمید بیانی pet-28a در آزمایشگاه از آنزیم لیگاز استفاده می شود که می تواند اتصالات فسفودی استری شکسته شده را ترمیم کند. این آنزیم از فاژ T4 استخراج شده است و انرژی لازم برای فعالیت خود را از ATP تامین می کند و می تواند هم انتهاهای صاف و هم چسبنده را به هم متصل کند.
روش انجام این عمل به شکل زیر است:
1- محتویات واکنش را بصورت زیر مخلوط می کنیم.
بافر لایگیشن x 10 : 3 میکرولیتر
آب استریل: 9 میکرولیتر
DNA لیگاز T4 : 1 میکرولیتر
پلاسمید Pet-28a : 2 میکرولیتر
Insert (DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM) : 15 میکرولیتر
حجم نهایی: 30 میکرولیتر
نکته : در آخرین مرحله آنزیم T4، DNA لیگاز اضافه شود. چون اگر بعد از اضافه کردن آنزیم T4 ، محلول برای مدت طولانی در محیط بماند با توجه به قدرت بالای اتصال T4 اتصال های که مورد نظر ما نیست اتفاق خواهد افتاد.
2- به کمک دستگاه ترموسایکلر میکروتیوب حاوی مخلوط واکنش را به مدت 4 ساعت در 16 درجه سانتیگراد سپس به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار می دهیم .
3-5-3 ترانسفورماسیون
برای این مرحله از سویه E.coli BL21(DE3) که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم . این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب می کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین رشد، و تشکیل کلونی می دهد .
3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته
1- باکتری در محیط کشت فاقد کانامایسین کشت داده شد.
2- پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را برداشته و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون کانامایسین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح(over night) در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
3- 400 میکرولیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB مایع تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار می دهیم . 2 تا 3 ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را به ما می دهد.در این حالت باکتری ها در مرحله فاز رشد لگاریتمی قرار دارد.
4- باکتری هایی که تازه شده و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل تقسیم کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم .
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8.سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
9- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
10- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
11- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
12- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
13- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها را می توان برای مدت 72 ساعت روی یخ در یخچال نگهداری کرد و همچنین می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
1- ابتدا 100 میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) را روی یخ ذوب می کنیم.
2- 30 میکرولیتر از محصول لایگیشن را به 100 میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه می کنیم به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه بر روی یخ انکوبه می کنیم.
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار می دهیم، بدون حرکت و کاملا ثابت.
5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB مایع فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 800 میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در 230 میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل می کنیم .
8- 230 میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
3-5-4 ارزیابی کلونی ها
پس از مدت18 تا 20 ساعت در انکوباتور باکتری BL21 بر روی محیط کشت تشکیل کلونی می دهد. یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر محیط LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت
یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب در شیکر انکوباتور قرار می دهیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3) ، پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه آلودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت.
1- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را چند بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله 12 و 13 را یکبار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- ستون را در داخل میکروتیوپ 5/1 قرار داده و به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم