Neda Bathaei

1-2 تاریخچه ................................................................ ...................................................................................... 20
2-2 انواع میکسر ................................................................ ................................................................................ 21

و
1-2-2 میکسرهای غیر فعال ................................................................................................ 22 .........................
2-2-2 میکسر گیلبرت ................................................................................................................................... 24
3-2 کاربرد میکسر ............................................................................................................................................. 28
4-2 عملکرد میکسر ........................................................................................................................................... 29
1-4-2 میکسر به عنوان یک ضرب کننده .................................................................................................. 29
2-4-2 عملکرد میکسر به کمک یک سوئیچ .............................................................................................. 30
.3 فصل سوم: بررسی میکسرهای توزیع شدهی فراپهن باند ............................................................ 32
1-3 مقدمه .......................................................................................................................................................... 33
2-3 مدارات توزیع شده ..................................................................................................................................... 34
3-3 بررسی عملکرد سیگنال بزرگ میکسر گیلبرت به عنوان یک عنصر غیر خطی ............................... 35
4-3 میکسر سلول گیلبرت توزیع شده ........................................................................................................... 39
1-4-3 بهرهی تبدیل ...................................................................................................................................... 40
2-4-3 تکنیک تزریق جریان ......................................................................................................................... 40
3-4-3 تکنیک پیکینگ سلفی ...................................................................................................................... 42
5-3 مروری بر چند ساختار میکسر پهن باند ارایه شده ............................................................................... 44
1-5-3 ساختار میکسر .....................................................................................................................[18] 1 44
2-5-3 ساختار میکسر .....................................................................................................................[12] 2 45
3-5-3 ساختار میکسر .....................................................................................................................[19] 3 45
4-5-3 ساختار میکسر .....................................................................................................................[20] 4 46
5-5-3 ساختار میکسر .....................................................................................................................[21] 5 47
6-5-3 ساختار میکسر .....................................................................................................................[22] 6 48
7-5-3 ساختار میکسر .....................................................................................................................[23] 7 49
8-5-3 مقایسه ساختار های متفاوت میکسرهای فراپهن باند ................................................................ 51
.4 فصل چهارم: تحلیل اعوجاج و نویز در میکسر فراپهن باند .......................................................... 52
1-4 مقدمه .......................................................................................................................................................... 53
2-4 میکسر یک عنصر غیر خطی .................................................................................................................... 53
3-4 مدل غیر خطی گیرنده ............................................................................................................................. 54
4-4 اثرات اعوجاج در سیستمهای فراپهن باند ............................................................................................. 54
1-4-4 تولید هارمونیک .................................................................................................................................. 55
2-4-4 فشردگی بهره ...................................................................................................................................... 55
3-4-4 اینترمدولاسیون .................................................................................................................................. 56
4-4-4 اینترمدولاسیون مرتبهی دوم .......................................................................................................... 56
ز
5-4-4 اینترمدولاسیون مرتبهی سوم ......................................................................................................... 57
6-4-4 اعوجاج در سیستمهای متوالی ........................................................................................................ 59
7-4-4 مشخصات خطی گیرنده ................................................................................................................... 59
5-4 بررسی نویز میکسر به عنوان یک عنصر غیر خطی .............................................................................. 60
1-5-4 پردازش نویز متغیر با زمان .............................................................................................................. 60
2-5-4 نویز طبقهی راهانداز (طبقهی ................................................................................................(RF 61
3-5-4 نویز طبقهی سوئیچ (طبقهی ................................................................................................(LO 62
4-5-4 نویز طبقهی ..................................................................................................................................IF 63
.5 فصل پنجم: مدار پیشنهادی، طراحی مخلوط کنندهی فرکانسی فراپهن باند توزیع شده .......... 64
1-5 مقدمه .......................................................................................................................................................... 65
2-5 مدل المانهای مورد استفاده ................................................................................................................... 65
3-5 تحلیلگرهای استفاده شده در نرمافزار .....................................................................................ADS 67
1-3-5 تحلیلگر ..............................................................................HARMONIC BALANCE 68
2-3-5 تحلیلگر ............................................................................................................................... LSSP 68
4-5 طراحی میکسر توزیع شده با سلولهای میکسر تک بالانس .............................................................. 69
1-4-5 طراحی میکسر .................................................................................................................................... 69
2-4-5 بایاس مدار ........................................................................................................................................... 70
3-4-5 پارامترهای قابل تغییر و طراحی ..................................................................................................... 71
4-4-5 تحلیل و شبیهسازی .......................................................................................................................... 72
5-5 طراحی میکسر توزیع شده با سلولهای میکسر سلول گیلبرت ......................................................... 74
1-5-5 طراحی میکسر .................................................................................................................................... 74
2-5-5 بایاس مدار ........................................................................................................................................... 75
3-5-5 تحلیل و شبیهسازی .......................................................................................................................... 76
6-5 طراحی میکسر توزیع شده با سلولهای میکسر گیلبرت و با استفاده از تکنیک پیکینگ سلفی.. 78
1-6-5 تکنیک پیکینگ سلفی ...................................................................................................................... 78
2-6-5 بایاس مدار ........................................................................................................................................... 80
3-6-5 طراحی میکسر توزیع شدهی نهایی ................................................................................................ 80
4-6-5 مقادیر المانهای مدار میکسر پس از طراحی .............................................................................. 84
5-6-5 تحلیل و شبیه سازی ......................................................................................................................... 86
7-5 نتیجهگیری و مقایسه ............................................................................................................................... 90
.6 فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات ........................................................................................... 92
1-6 نتیجهگیری ................................................................................................................................................. 93
ح
2-6 پیشنهادات .................................................................................................................................................. 94
.7 فصل هفتم: منابع و ماخذ ................................................................................................................ 95
منابع لاتین ..................................................................................................................................................................... 96
چکیده انگلیسی: ................................................................................................................................................................ 98
ط
فهرست جدول ها:
عنوانشماره صفحه

جدول 1- 1 قابلیت UWB در مقایسه با سایر استانداردهای 14..[2] IEEE
جدول 1- 3 مقایسهی ساختارهای مختلف میکسرهای فراپهن باند51
جدول 1- 5 مقادیر سلفهای مدار نهایی85
جدول 2- 5 عرض ترانزیستورهای مدار نهایی85
جدول 3- 5 مقادیر پارامترهای DC ترانزیستورهای میکسر توزیع شده نهایی85
جدول 4-5 مقدار نشت پورت های مختلف میکسر پیشنهادی در یکدیگر بعد از مدل سازی اثر عدم تطبیـق ابعـاد
ترانزیستورها، روی ولتاژ آستانه88
جدول 5- 5 مقایسهی سه ساختار به دست آمده طول طراحی90
جدول 6- 5 مشخصات مدار میکسر توزیع شدهی پیشنهادی90
جدول 7- 5 مقایسه میکسر طراحی شده در این پایان نامه با کارهای انجام شدهی قبلی91
ی
فهرست شکلها:
عنوانشماره صفحه

شکل 1-1 تاریخچهی تکنولوژی فراپهن باند6
شکل 2-1 طرح ماسک توان برای سیستم UWB بر حسب فرکانس 7[3]
شکل 3-1 سیگنال باند باریک در حوزهی (a) زمان و (b) فرکانس8
شکل 4-1 یک پالس با Duty Cycle کم8
شکل 5-1 پالس UWB در حوزههای((a زمان و (b) فرکانس9
شکل 6-1 همزیستی سیگنالهای فراپهن باند با سیگنالهای باند باریک و باند پهن در طیف فرکانسی 10RF
شکل (a) 7-1 پدیدهی چند مسیره در انتقال بیسیم (b) اثر پدیدهی چند مسیره بر سیگنال های بانـد باریـک
(c) اثر پدیدهی چند مسیره بر سیگنالهای باند فرا پهن11
شکل 8-1 رفتار حوزههای زمان و فرکانس سیگنالهای UWB (a) و (b) باند باریک13
شکل 9-1 طیف فرکانسی UWB به همراه سیستمهای تداخلی داخل و خارج باند14
شکل 10-1 سیگنالهای (a) باند باریک، (b) طیف گسترده و (c) فراپهن باند در حوزههای زمان و فرکانس .. 16
شکل 11-1 روش دسترسی 16TDMA
شکل 12-1 عملیات کد کردن در 17[5] DS-CDMA
شکل 13-1 نحوهی استفاده از پهنای باند در سیستم 17DS-CDMA
شکل 14-1 گروه بندی طیف فرکانسی 18MB-OFDM
شکل 15-1 طیف فرکانسی 18[7] MB-OFDM
شکل 1-2 ساختار گیرنده سوپر هترودین20
شکل 2-2 میکسر به عنوان یک عنصر سه دهانه21
شکل 3-2 میکسر غیرفعال با تعادل دوگانه با 22..CMOS
شکل 4-2 میکسر گیلبرت ساده24
شکل 5-2 میکسر گیلبرت با تعادل دوگانه25
شکل 6-2 منحنی بهرهی سوئیچ میکسر گیلبرت با تعادل دوگانه26
شکل 7-2 میکسر گیلبرت با تعادل دوگانه با تکنیک ربودن جریان 27DC
شکل 8-2 میکسر به عنوان یک ضرب کننده 29[3]
شکل 9-2 میکسر با ساختار تکی31
شکل 10-2 میکسر با ساختار متوازن تکی31
شکل 1-3 بلوک دیاگرام مدار ترکیبی توزیع شده (a) موجبر هم محور واقعی (b) مدارات LC مصنوعی33[11]
شکل 2-3 مدل خطوط انتقال مصنوعی34
شکل 3-3 شمای نحوهی قرار گیری سلولهای مدار توزیع شده بین دو خط انتقال35
شکل 4-3 میکسر گیلبرت 36CMOS
شکل 5-3 یک میکسر فعال CMOS با تعادل تکی36
ک
شکل 6-3 شکل موجهای p0(t) و 38p1 (t)
شکل 7-3 مدار معادل خط انتقال40
شکل 8-3 شماتیک مدار میکسر گیلبرت با تکنیک تزریق جریان41
شکل 9-3 شماتیک مدار میکسر گیلبرت با طبقهی ترارسانایی مکمل41
شکل 10-3 مدل مدار ساده شده برای (a) میکسر متداول (b) میکسر با تکنیک پیکینگ سلفی سری43
شکل (a) 11-3 مدل سیگنال کوچک یک تقویت کننده (b) شـبکهی پسـیو اضـافه شـده بـرای ایزولـه کـردن
خازنهای پارازیتی (c) پیاده سازی این شبکه با سلف43
شکل 12-3 مدار میکسر ساختار 441
شکل 13-3 مدار میکسر ساختار 452
شکل 14-3 مدار میکسر ساختار 463
شکل 15-3 مدار میکسر ساختار 474
شکل 16-3 مدار تطبیق UWB برای سیگنال ورودی 47RF
شکل 17-3 مدار میکسر ساختار 485
شکل 18-3 مدار میکسر ساختار 496
شکل 19-3 مدار میکسر ساختار 507
شکل 1-4 طیف فرکانسی MB-OFDM به همراه سیستمهای تداخلی داخل و خارج باند 53[7]
شکل (a) 2-4 مدار سوئیچ ساده (b) سیستم غیر خطی متغیر با زمان (c) سیستم خطی متغیر با زمان54
شکل 3-4 طیف خروجی سیستم غیرخطی با درجهی دو و سه54
شکل 4-4 نقطه تراکم 561dB
شکل 5-4 مولفههای اینترمدولاسیون در خروجی یک سیستم غیرخطی درجهی 562
شکل 6-4 نحوهی تداخل اینترمدولاسیون مرتبهی 2 با سیگنال مطلوب 57[7]
شکل 7-4 مولفههای اینترمدولاسیون در خروجی یک سیستم با خاصیت غیرخطی مرتبهی سوم58
شکل 8-4 تداخل اینترمدولاسیون مرتبهی 3 با سیگنال مطلوب 58[7]
شکل (a) 9-4 دامنهی نقطه تقاطع مرتبهی سوم ورودی (b) نقطه تقاطع مرتبـهی سـوم ورودی و خروجـی بـه
صورت لگاریتمی 59[5] (IIP3,OIP3)
شکل 10-4 میکسر فعال تک بالانس 61CMOS
شکل 11-4 شکل موج 62p1 (t)
شکل 1-5 بلوک دیاگرام مدار توزیع شده (a)خطوط انتقال واقعی (b) پیاده سازی با مدارات LC (خـط انتقـال
مصنوعی)65
شکل 2-5 مدل ترانزیستور 66TSMC
شکل 3-5 مدل مدار معادل برای یک ترانزیستور 66[26] RF nMOS
شکل 4-5 مدل سلف 67TSMC
شکل 5-5 نمای Layout سلف در تراشه67
شکل 6-5 مدار معادل یک سلف استاندارد 67[26]
ل
شکل 7-5 تحلیلگر HARMONIC BALANCE در نرم افزار 68ADS
شکل 8-5 تحلیلگر LSSP در نرم افزار 68ADS
شکل 9-5 ساختار میکسر توزیع شدهی تک بالانس69
شکل 10-5 شماتیک میکسر توزیع شدهی تک بالانس در نرم افزار 70ADS
شکل 11-5 مدار بایاس طبقهی 70RF
شکل 12-5 مدار بایاس گیت ترانزیستورهای طبقهی 71LO
شکل 13-5 مدار بایاس درین ترانزیستورهای طبقهی 71LO
شکل 14-5 روابط به کار رفته در نرمافزار ADS برای محاسبهی 72IIP3
شکل 15-5 نمودار عدد نویز میکسر طراحی شده با سلول تک بالانس72
شکل 16-5 نمودار IIP3 میکسر طراحی شده با سلول تک بالانس73
شکل 17-5 نمودار IIP2 میکسر طراحی شده با سلول تک بالانس73
شکل 18-5 نمودار بهرهی تبدیل میکسر طراحی شده با سلول تک بالانس73
شکل 19-5 نمودار ضریب انعکاس ورودی میکسر طراحی شده با سلول تک بالانس74
شکل 20-5 نمودار ضریب انعکاس خروجی میکسر طراحی شده با سلول تک بالانس74
شکل 21-5 ساختار میکسر توزیع شدهی گیلبرت75
شکل 22-5 شماتیک میکسر توزیع شدهی گیلبرت در نرم افزار 75ADS
شکل 23-5 نمودار بهرهی تبدیل میکسر طراحی شده با سلول گیلبرت76
شکل 24-5 نمودار ضریب انعکاس ورودی میکسر طراحی شده با سلول گیلبرت77
شکل 25-5 نمودار ضریب انعکاس خروجی میکسر طراحی شده با سلول گیلبرت77
شکل 26-5 نمودار عدد نویز میکسر طراحی شده با سلول گیلبرت77
شکل 27-5 نمودار IIP3 میکسر طراحی شده با سلول گیلبرت78
شکل 28-5 ساختار میکسر توزیع شدهی گیلبرت با تکنیک پیکینگ سلفی79
شکل 29-5 ساختار میکسر توزیع شدهی گیلبرت با تکنیک پیکینگ سلفی در نرم افزار 79ADS
شکل 30-5 مدار بایاس درین ترانزیستورهای طبقهی 80LO
شکل 31-5 نمودار جریان مصرفی میکسر بر حسب تغییرات عرض ترانزیستورها81
شکل 32-5 نمودار تطبیق ورودی میکسر بر حسب تغییرات عرض ترانزیستورها در فرکانس 8210 GHz
شکل 33-5 نمودار بهرهی تبدیل میکسر بر حسب تغییرات عرض ترانزیستورها82
شکل 34-5 نمودار IIP3 میکسر بر حسب تغییرات عرض ترانزیستورها83
شکل 35-5 نمودار بهرهی تبدیل میکسر بر حسب تغییرات سلفهای پیکینگ در سه فرکانس83
شکل 36-5 بهرهی تبدیل میکسر بر حسب فرکانس و مقادیر مختلف سلفهای پیکینگ84
شکل 37-5 نمودار IIP3 میکسر بر حسب تغییرات سلفهای پیکینگ در سه فرکانس84
شکل 38-5 نمودارضرایب انعکاس ورودی و خروجی میکسر توزیع شدهی پیشنهادی86
شکل 39-5 نمودار بهره میکسر طراحی شده با دو سلول گیلبرت و با تکنیک پیکینگ سلفی86
شکل 40-5 نمودار نشت پورت LO در 87RF
م
شکل 41-5 نمودار نشت پورت LO در 87IF
شکل 42-5 نمودار نشت پورت RF در 87LO
شکل 43-5 نمودار نشت پورت RF در 88IF
شکل 44-5 عدد نویز میکسر طراحی شده با دو سلول گیلبرت و با تکنیک پیکینگ سلفی88
شکل 45-5 نقطه تقاطع مرتبه سوم ورودی (IIP3) میکسر طراحـی شـده بـا دو سـلول گیلبـرت و بـا تکنیـک
پیکینگ سلفی89
شکل 46-5 نقطه تقاطع مرتبه دوم ورودی (IIP2) میکسـر طراحـی شـده بـا دو سـلول گیلبـرت و بـا تکنیـک
پیکینگ سلفی89
شکل 47-5 نمودار P1dB میکسر طراحی شده با دو سلول گیلبرت و با تکنیک پیکینگ سلفی90
ن
فهرست رابطهها:
عنوانشماره صفحه

رابطهی 81- 1
رابطهی 92- 1
رابطهی 103-1
رابطهی 114-1
رابطهی 125-1
رابطهی 221-2
رابطهی 232-2
رابطهی 233-2
رابطهی 234-2
رابطهی 235-2
رابطهی 256-2
رابطهی 267-2
رابطهی 268-2
رابطهی 279-2
رابطهی 2710-2
رابطهی 2811-2
رابطهی 2912-2
رابطهی 2913-2
رابطهی 2914-2
رابطهی 351-3
رابطهی 362-3
رابطهی 373-3
رابطهی 374-3
رابطهی 375-3
رابطهی 376-3
رابطهی 377-3
رابطهی 378-3
رابطهی 379-3
رابطهی 3710-3
رابطهی 3811-3
س
رابطهی 3812-3
رابطهی 3813-3
رابطهی 3814-3
رابطهی 3915-3
رابطهی 3916-3
رابطهی 4017-3
رابطهی 4018-3
رابطهی 4119-3
رابطهی 4120-3
رابطهی 4221-3
رابطهی 4222-3
رابطهی 4223-3
رابطهی 4224-3
رابطهی 4225-3
رابطهی 4226-3
رابطهی 4327-3
رابطهی 4428-3
رابطهی 541-4
رابطهی 552-4
رابطهی 563-4
رابطهی 564-4
رابطهی 575-4
رابطهی 576-4
رابطهی 577-4
رابطهی 588-4
رابطهی 599-4
رابطهی 5910-4
رابطهی 6011-4
رابطهی 6112-4
رابطهی 6113-4
رابطهی 6114-4
رابطهی 6115-4
رابطهی 6216-4
رابطهی 6217-4
ع
رابطهی 6218-4
رابطهی 6219-4
رابطهی 6220-4
رابطهی 6321-4
رابطهی 6322-4
رابطهی 6323-4
رابطهی 6324-4
رابطهی 6325-4
رابطهی 6326-4
رابطهی 691-5
رابطهی 812-5
رابطهی 853-5
رابطهی 854-5
رابطهی 865-5
ف
چکیده:
رشد سریع تکنولوژی و پیشرفت موفق تجاری مخابرات بی سیم روی زنـدگی روزمـره ی مـا تـاثیر قابل توجهی گذاشته است. امروزه بهکار بردن میکسرهای فرکانس بالا در سیستم های ارتباطاتی بیسـیم، دارای اهمیت خاصی میباشد. میکسرها یکی از اجزای اساسـی گیرنـده در مخـابرات بـیسـیم محسـوب میشوند. اجرای میکسرهای پایین آورنده1 در گیرنده ها به لحاظ وجود نویز و تضعیف در سیگنال دریافتی از اهمیت بیشتری برخوردار است.
هدف اصلی این پایان نامه، تحلیل و طراحـی میکسـر بـرای کـاربرد در بانـد فرکانسـی فـراپهن (UWB) و با استفاده از تکنولوژی CMOS می باشد. ابتدا عملکرد یک میکسر توزیع شده بررسی شده، سپس مدار میکسر پیشنهادی توزیع شده، ارایه می گردد. میکسر پیشنهادی دارای بهـره ی تبـدیل 3dB، IIP3 برابر 5/5dBm، عدد نویز 7dB، پهنـای بانـد 3 تـا 10 گیگـاهرتز و تـوان مصـرفی 52 میلـی وات میباشد. میکسر فراپهن باند توزیع شدهی پیشنهادی با استفاده از تکنولوژی CMOS 0/18μm با منبع تغذیه 1/8 ولت طراحی شده است.

1 down conversion
1
مقدمه:
رشد سریع تکنولوژی و گذار از مخابرات آنالوگ به دیجیتال، ترقی سیستم های رادیویی بـه نسـل سوم و چهارم و جانشینی سیستم های سیمی با Wi-Fi و Bluetooth مشـتریان را قـادر مـی سـازد بـه گستره ی عظیمی از اطلاعات از هرجا و هر زمان دسترسی داشته باشند. مخابرات UWB برای اولین بـار در دهــهی 1960 معرفــی شــد و در ســال 2002، FCC1 رنــج فرکانســی 3.1~10.6GHz را بــرای کاربردهای UWB معرفی و توان انتقال آنرا به -41.3dBm محدود کرد، بدین معنا کـه سیسـتمهـای
UWB روی فراهم کردن: توان کم، قیمت کم و عملکرد باند وسیع در مساحت کوتـاه تمرکـز کردنـد. در مقایسه با کاربردهای باند باریک طراحی المانها در سیستمهای UWB بسیار متفاوت و مشکل است.
یکی از بلوکهای مهم در گیرندههای UWB میکسرها هستند کـه بـرای تبـادل اطلاعـات بـین تعداد زیادی کانال مشابه UWB نقش کلیدی دارند. اهمیـت عملکـرد میکسـر بـه عنـوان یـک مبـدل فرکانس، در تامین فرکانسهای کاری مناسب با پایداری و نـویز مطلـوب اسـت. میکسـر مـیبایسـتی: (1
بهرهی تبدیل بالا، که اثرات نویز در طبقات بعدی را کاهش دهـد، (2 عـددنویز کوچـک، کـه LNA را از داشتن یک بهرهی بالا راحت کند و (3 خطی بودن بالا، که رنج دینامیک گیرنده را بهبود بخشد و سطوح اینترمدولاسیون2 را کاهش دهد. هر کارایی بایستی توسط مصالحه در طراحی میکسر بهدست آید. میکسر سلول گیلبرت با برخی تغییرات در ساختار آن نتایج قابل قبـولی بـرای کـاربرد در سیسـتمهـای UWB
بهدست میدهد.
دستیابی همزمان به بهره ی تبدیل و خطی بودن بـالا کـه افـزایش یکـی باعـث کـاهش دیگـری می گردد یکی از چالش های طراحی میکسر می باشد، در کارهایی کـه تـا کنـون انجـام شـده تمرکـز روی دستیابی یکی از این دو بوده به طوریکه یا میکسری غیر فعال با خطی بودن قابل قبـول و یـا میکسـری فعال با خطی بودن کم ارائه شده است. تطبیق امپدانس در کل رنج فرکانسی 7 گیگا هرتـزی و همچنـین عدد نویز پایین از دیگر پارامترهای مهم طراحی میکسر میباشد.
 اهداف پایان نامه
در این پایان نامه با بررسی میکسرهای فراپهن باند و مقایسهی آنها از نظر ساختار، بهرهی مدار، عدد نویز، تطبیق در ورودی و خروجی و خطی بودن، سـاختار مناسـب بـرای یـک میکسـر فـراپهن بانـد پیشنهاد شده و از لحاظ کارکرد در سیستمهای UWB بررسی گشته است.

Federal Communications Commission inter-modulation

1
2
2
بر خلاف کارهایی که تا کنون در این زمینه صورت گرفته که بر بهبود یکی از پارامترهای بهـره ی تبدیل یا خطی بودن میکسر تاکید شده، در اینجا سعی شـده اسـت تـا ضـمن دسـتیابی بـه هـر دو ایـن پارامترها در اندازههای قابل قبول برای گیرندهها، کل پهنای باند سیستمهای UWB پوشش داده شود.
بر این اساس در فصل اول سیستم های فراپهن باند بطور کامل معرفـی و بررسـی مـی گـردد، در فصل دوم به بررسی انواع میکسر، نحوهی عملکرد و کاربرد آنها پرداختـه شـده، در فصـل سـوم سـاختار میکسرهای توزیع شده، مشخصات و تکنیکهای بهبود کارایی آنها و در فصل چهارم اعوجـاج و نـویز در میکسر بررسی گردیدهاند. در فصل پنجم ساختار میکسر فراپهن باند طراحی شده بـه طـور مفصـل شـرح داده شده است. در فصل ششم نتیجهگیری و پیشنهادات و فصل هفتم نیز منابع و مأخذ مورد استفاده بـه تفکیک درج شدهاند.
3
.1 فصل اول: سیستمهای فراپهن باند (UWB)
4
1-1 تاریخچه تکنولوژی فراپهن باند UWB
در طول دهههای اخیر پیشرفت سریع ارتباطات باعث ایجاد تقاضا برای قطعات بهتـر و ارزانتـر و همچنین تکنولوژیهای پیشرفتهتر شده است. افزایش تقاضا برای انتقال سریع و افزایش نرخ اطلاعـات در عین مصرف کم توان تاثیرات شگرفی را بر تکنولوژی ارتباطات ایجاد کرده است. در هر دو بخش مخابرات بیسیم و سیمی این گرایش منجر به استفادهی هرچه بیشتر از مدولاسیونهایی با استفادهی بهینـهتـر از طیف فرکانسی و یا افزایش پهنای کانالها گشته است. این روشها به همـراه روشهـای مهندسـی بـرای کاهش توان، به منظور تولید تراشه های ارزان و با مصرف توان کم در صنعت استفاده میشود.
افزایش و گسترش استانداردها نه تنها باعث شده که سیستمها با طیفهای شلوغتری از لحاظ فرکانسی روبرو باشند بلکه باعث شده است تا سیستمها به سوی چند استاندارده بودن سوق داده شده و قابلیت انطباق با استانداردهای مختلف را داشته باشند. در حقیقت این پیشرفت تکنولوزی منجر به طراحی و تولید دستگاههایی شده است که قابلیت کارکرد در باندهای وسیعتری را داشته باشند، مانند تکنولوژی فرا پهن باند . (UWB)
تکنولوژی فراپهن باند (UWB) در دهه های اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفتـه اسـت. مـیتـوان گفت که شروع استفاده از دانش UWB مربوط به انتهای قرن نوزدهم می باشد. اولین سیستم بی سیم که توسط گاگلیرمو مارکونی1 در سال 1987 نمایش داده شد، خصوصیات رادیوی فـراپهن بانـد را دارد. رادیـو ساخته شده توسط مارکونی از پهنای باند وسیعی برای انتقال اطلاعات بهره می گرفت. اولین فرستنده های جرقه ای مارکونی فضای زیادی از طیف (از فرکانس هـای بسـیار پـایین تـا فرکـانس هـای بـالا) را اشـغال می کردند. همچنین این سیستم ها به طور غیراتوماتیک از پردازش زمان اسـتفاده مـی نمودنـد. چـون کـد مورس توسط اپراتورهای انسانی ارسال و دریافت می شد. پس از آن مفهوم UWB مجدداً در دهـه 1960
برای ساخت رادارهای ایمن در برابر تداخل با مصرف توان کم مورد توجه قرار گرفت .[1]
در اوایل پیدایش ، UWB به نامهای Carrier free ، باند پایه یا ضربه رایج بود که در حقیقت متضمن این نکته بود که استراتژی تولید سیگنال نتیجه یک پالس با Rise time بسیار سریع و یـا یـک ضربه میباشد که یک آنتن باند پهن را تحریک میکند. در اوایل سال 2002 میلادی تکنولوژی باند بسیار پهن (UWB) برای کاربردهای تجاری تصویب شد. این تکنولوژی جدید شـیوه ی جدیـدی در ارتباطـات بدون سیم ابداع کرد:"استفاده از حوزه زمان به جای حوزه فرکانس".
تکنولوژی فرا پهن باند (UWB) به شیوهی کاملاً متفاوتی از سایر تکنولوژی ها از بانـد فرکانسـی استفاده میکند. این سیستمها از پالسهای باریک و پـردازش سـیگنال در حـوزهی زمـانی بـرای انتقـال

1 Guglielmo Marconi
5
اطلاعات استفاده میکنند، بدین صورت سیستمهـای فـرا پهـن بانـد (UWB) قادرنـد در بـازهی زمـانی مشخص اطلاعات بیشتری را نسبت به سیستمهای قدیمیتر منتقل کنند زیرا حجـم انتقـال اطلاعـات در سیســتمهــای مخــابراتی بــه صــورت مســتقیم بــا پهنــای بانــد تخصــیص یافتــه و لگــاریتم SNR (Signal to Noise Ratio) متناسب است. استفاده از یک پهنای بانـد خیلـی وسـیع چنـدین مزیـت دارد: ظرفیت بالا، مخفی بودن، مقاومت در برابر مسدود شدن و همزیستی با سایر سیستم های رادیویی.
پایه و اساس سیستم های نوین فراپهن باند در دهه 80 توسط راس و با کار انجـام شـده در مرکـز تحقیقاتی Sperry بنیان گذاشته شد. تأکید بر استفاده از UWB بـه عنـوان یـک ابـزار تحلیلـی بـرای کشف خصوصیات شبکه های مایکروویو و خصوصیات ذاتی مـواد بـود. ایـن تکنیـک هـا بـه طـور منطقـی گسترش یافتند تا تحلیل و تولید تجربی المان های آنتن را انجام دهند. موفقیـتهـای اولیـه باعـث تولیـد سیستمی خانگی شد تا خصوصیات پاسخ ضربه اهداف یا موانع را اندازهگیری کند.
با افزایش درخواست کاربران برای ظرفیت بالاتر، سرویس های سریعتر و مخابرات بی سیم امن تـر، تکنولوژی های جدید مجبورند جایگاه خود را در طیف فوق العاده شلوغ و امن رادیـویی بیابنـد. بـه دلیـل اینکه هر تکنولوژی رادیویی یک بخش خاص از طیف را اشغال میکند و با معرفی سـرویس هـای جدیـد رادیویی محدودیت دسترسی طیف RF سخت گیرانه تر شده است. در این شرایط تکنولـوژی UWB یـک راه حل نوید بخش برای محدودیت دسترسی به طیف RF با اجازه به سرویس های جدید برای هم زیستی با سیستمهای رادیویی جاری با تداخل حداقل یا بدون تداخل است.
در فوریه ی سال 2002، FCC اولین طراحی و استاندارد مربوط بـه بانـدها و تـوان مجـاز بـرای کاربران UWB را صادر کرد. بدین ترتیب باند فرکانسی 3.1GHz تا 10.6GHz به UWB اختصـاص یافت. در همین زمان FCC مجوزی صادر کرد که حدود و میزان تشعشع عمدی یا سهوی دسـتگاه هـای مخابراتی در باندهای مختلف را مشخص نمود. این تشعشع مجاز در باندهای مورد استفاده، مبنـایی بـرای طراحی دستگاه های UWB شد. با گسترش تحقیقات در این زمینه، IEEE کمیتـه ی مخصوصـی بـرای استاندارد سازی این سیسـتم هـا تحـت عنـوان 802.15.3.x تشـکیل داد. شـکل 1-1 تاریخچـه ی ایـن تکنولوژی را به اختصار نشان میدهد .[2]

شکل 1-1 تاریخچهی تکنولوژی فراپهن باند
6
در اولین گام FCC توان خروجی سیستم های UWB را به -41.3dBm/MHz محدود کرد، این محدودیت این امکان را برای سیستم های UWB ایجاد میکند که بدون اینکه توان سیگنال خروجی آنها توسط سیستمهای باند باریک مجاور احساس شود از پهنای باند وسیعی برای انتقال اطلاعات خود استفاده کنند. محدودیت هایی که برای توان انتشار این سیستم ها ایجاد شد ، عمدتاً محدودیتهایی بودند که برای حفاظت از سیستم GPS و سایر سیستم های دولتی که در باند فرکانسی 690MHZ~1610MHz کار میکنند مطرح شده بود. همانطور که در شکل 2-1 نشان داده شده است این ماسک توان همچنین برای سایر سیستمهای دولتی که عملکرد آنها در فاصلهی 3.1GHz~10.6GHz
یعنی باندی که برای کاربرد داخلی UWB تعریف شده است نیز کاربرد دارد.

شکل 2-1 طرح ماسک توان برای سیستم UWB بر حسب فرکانس [3]
بنا به تعریف FCC پهنای باند -10dB یک سیگنال UWB بزرگتر از %25 فرکانس مرکزی یا بزرگتر از 1.5GHz میباشد. سیستمهای فرا پهـن بانـد بـا عـرض بانـد بـیش از 7GHz در بـازه فرکانسـی
3.1GHz~10.6GHz با سطح توان مجاز -41.3dBm/MHz فعالیت مـیکننـد. هـر کانـال رادیـویی در ایـن سیستمها بسته به فرکانس مرکزی خود میتواند عرض بانـدی بـیش از 500MHz داشـته باشـد. طـرح
انتقال OFDM1 به عنوان اولین کاندیـدا بـرای UWB در مـارچ 2003 در جلسـهی گروهـی IEEE 802.15.3a مطرح شد.

1 Orthogonal Frequency-Division Multiplexing
7
2-1 مفهوم UWB
سیستم های مخابراتی باند باریک متـداول سـیگنال هـای RF مـوج پیوسـته (CW)1 را بـا یـک فرکانس حامل خاص برای ارسال و دریافت اطلاعات مدوله می کنند. یک موج پیوسته یک انرژی سـیگنال تعریف شده در باند فرکانسی بانـد باریـک دارد کـه آن را بـرای آشکارسـازی و نفـوذ خیلـی آسـیب پـذیر میسازد. شکل 3-1 سیگنال باند باریک را در حوزههای زمان و فرکانس نشان میدهد.

شکل 3-1 سیگنال باند باریک در حوزهی (a) زمان و (b) فرکانس
سیستمهای UWB از پالسهای کوتاه بدون حامل (پیکو ثانیه تا نانو ثانیـه ) بـا Duty Cycle خیلی کم (کمتر از (%5 برای انتقال اطلاعات استفاده میکنـد. یـک تعریـف سـاده بـرای Duty Cycle
نسبت زمان حضور پالس به کل زمان انتقال است. (رابطهی (1-1

شکل 4-1 یک پالس با Duty Cycle کم رابطهی 1-1 T T Duty Cycle T Duty Cycle کم، متوسط توان انتقالی خیلی کمی در سیستمهـای UWB ایجـاب مـیکنـد.
متوسط توان انتقالی یک سیستم UWB در حد میکرو وات است، یعنی هزار بـار کمتـر از تـوان انتقـالی تلفن موبایل. به هر حال پیک یا توان لحظه ای پالس های UWB مستقل می تواند نسبتاً بزرگ باشـد، امـا چون آنها برای یک زمان خیلی کوتاه انتقال می یابند (Ton<1ns) توان متوسط به طـور قابـل ملاحظـه ای کم میشود، در نتیجه ادوات UWB به توان انتقال کم در اثر کنترل روی Duty Cycle نیاز دارند، کـه مستقیماً روی طول عمر باتری در تجهیزات قابل حمل تاثیر دارد.
از آنجایی که فرکانس با زمان نسبت عکس دارد پالس های UWB کوتاه مـدت، انـرژی را روی رنج عریضی از فرکانس ها، از نزدیک DC تا چندین گیگاهرتز با چگالی طیف توان (PSD)2 خیلـی کـم، پخش میکنند. شکل 5-1 پالس UWB را در حوزههای زمان و فرکانس نشان میدهد.

1 Continous Waveform 2 Power Spectral Density
8

شکل 5-1 پالس UWB در حوزههای((a زمان و (b) فرکانس
3-1 تعریف سیستم فراپهن باند
به طور کلی به سیستمی فراپهن باند (UWB) اطلاق میگردد که پهنای بانـد مـورد اسـتفادهی آن برای انتقال اطلاعات بیشتر از 500MHz باشد و یا پهنای باند نسبی آن در تمام زمانها بیشـتر از %20
باشد. پهنای باند کسری معیاری برای طبقهبندی سیگنال ها به بانـد باریـک، بانـد پهـن و فـرا پهـن بانـد می باشد و به وسیله ی نسبت پهنای باند در نقاط -10dB به فرکانس مرکزی توسط رابطهی 2-1 تعریـف میشود .[4]
رابطهی 2-1 100% f L fH 100% BW fL 2 fH fC با استفاده از این پهنای باند وسیع، چگالی طیف توان ارسالی این سیستم بسیار پایین اسـت و در نتیجه در مقابل شنود دارای مصونیت بالایی می باشـد. بـه منظـور جلـوگیری از تـاثیر نـامطلوب سیسـتم
UWB بر سیستم هایی که قبلاً در این باند وجود داشته اند، همان طور که قبلاً عنوان شـد FCC ماسـک مربوط به چگالی طیف توان این سیستمها را با سطح توان مجاز -41.3dBm/MHz مشخص نمود.
4-1 مزایای تکنولوژی فراپهن باند UWB
1-4-1 توانایی اشتراک طیف توانی
FCC سطح توان مجاز سیستم هـای UWB را -41.3dBm/MHz برابـر بـا 75nWatt/MHz تعریـف کرده و آنها را در ردهی تشعشعات غیر عمدی گذاشته است، چنین محـدودیت تـوانی بـه سیسـتم هـای
UWB اجازه می دهد که زیر سطح نویز یک گیرنده ی باند باریک نوعی قرار گیرند و سـیگنال UWB را قادر می سازد که با سرویس های رادیویی کنونی بدون تداخل و یا با تداخل حداقل همزیستی داشته باشد.
شکل 6-1 سطح توان مجاز تکنولوژیهای مختلف روی طیف فرکانسیRF را نشان میدهد .[2]
9

شکل 6-1 همزیستی سیگنالهای فراپهن باند با سیگنالهای باند باریک و باند پهن در طیف فرکانسی RF
2-4-1 ظرفیت بالای کانال
ظرفیت کانال یا میزان تغییرات داده ها، به صورت مینیمم میزان داده هایی که مـی تواننـد در هـر ثانیه روی یک کانال مخابراتی انتقال یابند تعریف می شود. فرمول هارتلی-شنون)1رابطـهی (3-1 ظرفیـت بالای کانال برای سیستم UWB را نشان میدهد .[2]
رابطهی 3-1 1 log C بیشترین ظرفیت کانال می باشد و به صورت خطی با پهنای باند (B) افـزایش مـی یابـد. پـس داشتن چندین گیگا هرتز پهنای باند برای سیگنال های UWB، نرخ انتقال داده ها در حد چند گیگا بیت بر ثانیه می تواند مورد انتظار باشد. در نتیجه ی محدودیت توان اعمال شـده از طـرف FCC بـرای انتقـال داده های UWB، این نرخ بالای انتقال داده فقط در فواصل کوتاه (تا 10 متر) در دسـترس اسـت، و ایـن باعث می شود سیستم های UWB کاندید مناسبی برای کاربردهای بی سـیم فواصـل کوتـاه و نـرخ بـالای اطلاعات مانند شبکه های WPAN باشند.
3-4-1 توانایی کار با SNR پایین
فرمول هارتلی-شنون برای ظرفیت حداکثر همچنین نشان میدهد که ظرفیت کانـال بـه صـورت لگاریتمی به SNR وابسته است، پس سیستم های مخابراتی UWB قابلیت کار در کانال هـای مخـابراتی خشن با SNR پایین را دارند و هنوز ظرفیت کانال بالایی در نتیجه پهنای باند بزرگ خود ارایه میدهند.
4-4-1 احتمال تشخیص و آشکارسازی کم
به دلیل میانگین توان انتقال پایین سیستم های UWB، این سیستم ها مصونیت ذاتی نسبت بـه تشخیص دارند. پالس های UWB در زمان با کدهای منحصر به فرد بـرای هـر جفـت فرسـتنده-گیرنـده

1 Hartley-Shannon
10
مدوله شدهاند. زمان مدولاسـیون پـالس هـای خیلـی باریـک بـه امنیـت انتقـال UWB مـی افزایـد زیـرا آشکارسازی پالسهای پیکو ثانیهای بدون دانستن اینکه چه زمانی میرسند غیر ممکن است.
5-4-1 مقاومت در برابر مسدود شدن
برخلاف طیف فرکانسی باند باریک شناخته شده، طیـف UWB رنـج وسـیعی از فرکـانس هـا از نزدیک DC تا چند گیگا هرتز را پوشش می دهد و بهره ی پردازش بالا برای سـیگنال هـای UWB ارایـه می کند. بهره ی پردازش (PG) یک معیار مقاومت سیستم ها در برابـر مسـدود شـدهگـی اسـت و توسـط رابطهی 4-1 تعریف میشود.
رابطهی 4-1

6-4-1 کارایی بالا در کانالهای چند مسیره
پدیده ی چند مسیره در کانال های مخابرات بی سیم اجتناب ناپذیر است و به علـت انعکـاس هـای چندگانه ی سیگنال انتقالی از سطوح متفاوت مانند ساختمان ها، درخـت هـا و غیـره روی مـی دهـد. خـط مستقیم بین فرستنده و گیرنده LOS و سیگنال های انعکاسی از سطوح NLOS هسـتند (شـکل (7-1،
اثر چند مسیره بر روی سیگنال های باند باریک نسبتاً شدید است که باعث تخریب سـیگنال تـا 40dB بـه خاطر ناهمفازی شکل موج های LOS و NLOS می شود. اما پالس های UWB خیلی کوتاه مدت کمتـر به اثر چند مسیره حساسند زیرا طول پالس های UWB کمتر از نانو ثانیه است و سیگنال بازتابی شـانس خیلی کمی برای برخورد با سیگنال LOS و تخریب آن دارد .[2]

شکل (a) 7-1 پدیدهی چند مسیره در انتقال بیسیم (b) اثر پدیدهی چند مسیره بر سیگنالهای باند باریک (c) اثر
پدیدهی چند مسیره بر سیگنالهای باند فرا پهن
11
5-1 چالشهای تکنولوژی فراپهن باند UWB
1-5-1 انحراف شکل پالس
پالس های UWB ضعیف و کم توان با انتقال می تواننـد بـه طـور قابـل تـوجهی تخریـب شـوند، میتوانیم این مطلب را با فرمول انتقال فریس1 (رابطهی (5-1 نشان دهیم.
رابطهی P PG G 4πdf5-1

که Pt و Pr به ترتیب توان های ارسالی و دریافتی، Gt و Gr به ترتیب بهرهی آنتنهای فرستنده و گیرنده، C سرعت نور و f فرکانس است. ملاحظه می شود که تـوان سـیگنال دریـافتی بـا مربـع فرکـانس کاهش می یابد. در سیستم های باند باریک که تغییر در فرکانس کم است، تغییـرات تـوان دریـافتی قابـل صرفه نظر است. اما به دلیل طیف فرکانسی وسیع سیستم های UWB تغییرات توان شدید بـوده و شـکل پالس را خراب می کند، که این امر کارایی گیرنده های UWB، که با پالس های دریافتی بـا یـک قالـب از پیش تعریف شده مثل فیلترهای تطبیق کلاسیک همبستگی دارد را محدود میکند.
2-5-1 تخمین کانال
تخمین کانال یک مبحث اساسی برای طراحی سیستم های مخابرات بی سیم اسـت. انـدازه گیـری همه ی مشخصات کانال مانند تضعیف و تاخیر مسیر انتشار، در میدان غیر ممکن است. اکثر گیرنـده هـای
UWB سیگنال دریافتی را با یک قالب سیگنال از پیش تعریف شده مرتبط میکننـد. اطلاعـات قبلـی از پارامترهای کانال بی سیم برای پیشگویی شکل قالب سیگنال، که سیگنال دریافتی را تطبیق میدهـد لازم است. به هرحال به خاطر پهنای باند زیاد و کاهش انرژی سیگنال، پالس های UWB دسـتخوش اعوجـاج شده، پس تخمین کانال در سیستمهای مخابرات UWB پیچیده است .[2]
3-5-1 تطبیق2 فرکانس بالا
انطباق زمانی یکی از چالش های اساسی در سیستم های مخابرات UWB است. نمونـه بـرداری و انطباق پالس های نانو ثانیه ای یک محدودیت اساسی در طراحی سیستم های UWB اسـت. بـرای نمونـه برداری این پالسهای باریک ADC(Analog-to-Digital converter) خیلـی سـریع در حـد گیگـا هرتز لازم است، به علاوه محدودیت های توان شدید و طول پالس کوتاه کارایی سیستم های UWB را بـه شدت به خطاهای زمانی حساس میکند.

1 Friis 2 Synchronization
12
4-5-1 تداخل دستیابی چندگانه1
در سیستم مخابره ی چند کـاربره یـا دسـتیابی چندگانـه، چنـدین کـاربر اطلاعـات را مسـتقل و همزمان روی یک خط واسط انتقال اشتراکی (مثل هوا در مخابرات بی سیم) می فرستند. در انتهـا یـک یـا چند گیرنده بایستی قادر به جداکردن و آشکارسازی اطلاعـات کاربرهـا از هـم باشـند. تـداخلات از سـایر کاربران با کاربر مورد علاقه تداخل دستیابی چندگانه (MAI) نامیده می شـود کـه یـک فـاکتور محـدود کننده ی ظرفیت کانال و کارایی گیرنده است، به علاوه MAI به همراه نویز غیر قابل پیشـگیری کانـال و تداخل باند باریک می تواند به طور موثری پالسهای کم توان UWB را تنزل دهد و مراحل آشکار سـازی را خیلی سخت کند.
UWB 6-1 در مقایسه با سایر استانداردهای IEEE
شکل 8-1 مقایسه ای بین مخابرات فراپهن باند و باند باریـک در حـوزه هـای زمـان و فرکـانس را نشان می دهد. همان طور که ملاحظه می شود سیستم های UWB مبتنی بر مدولاسیون پالسـی در زمـان دارای پالس های بسیار باریک می باشـد کـه در حـوزه ی فرکـانس، بانـد فرکانسـی 3-10GHz را اشـغال می کنند در حالیکه سیستم های باند باریک که در زمان دارای شکل موج پیوسته مـی باشـند در حـوزه ی فرکانس، باند فرکانسی بسیار کوچکتری را به خود اختصاص میدهند.

شکل 8-1 رفتار حوزههای زمان و فرکانس سیگنالهای UWB (a) و (b) باند باریک
در جدول 1-1 مقایسه ای بین مخابرات UWB و سایر اسـتانداردهای IEEE از نظـر بیشـترین نرخ داده ها، فاصله ی عملکرد و فرکانس کاری را نشان می دهد. می توان دید که UWB بـه دلیـل پهنـای

1 Multiple-Access Interference
13
باند وسیعی که دارد قابلیت انتقال نرخ بالایی از اطلاعات را در هر ثانیه در مقایسه با سـایر اسـتانداردهای
این جدول دارا میباشد.
جدول 1-1 قابلیت UWB در مقایسه با سایر استانداردهای [2] IEEE
استاندارد IEEE WLAN Bluetooth WPAN UWB
802.11a 802.11b 802.11g 802.15.1 802.15.3 802.15.3a
فرکانس کاری 5GHz 2.4GHz 2.4GHz 2.4GHz 2.4GHz 3.1-10.6GHz
بیشترین نرخ داده 54Mbps 11Mbps 54Mbps 1Mbps 55Mbps >100Mbps
حداکثر فاصله 100m 100m 100m 10m 10m 10m
به دلیل پهنای باند وسیع سیستم فراپهن باند، گیرنده های این سیسـتم بایسـتی قابلیـت کـار در محیط های پر تداخل را دارا باشند. در یک محیط کار معمولی سیستم های بی سیم مختلفی در حـال کـار هستند. گیرنده ی فراپهن باند همواره در معرض تـداخل و مسـدود شـده گـی توسـط سـایر سیسـتمهـای مخابراتی بی سیم که در باند فرکانسی 3-10GHz و یـا نزدیـک بـه آن قـرار دارنـد ماننـد Bluetooth، WLAN و غیره همانطور که در شکل 9-1 ملاحظه میشود قرار دارد.

شکل 9-1 طیف فرکانسی UWB به همراه سیستمهای تداخلی داخل و خارج باند
14
7-1 تفاوت بین UWB و طیف گسترده1
تعداد زیادی از افراد، مخابرات UWB را بـا تکنیـک هـای طیـف گسـترده ی پهـن بانـد اشـتباه می گیرند، هرچند هر دو خاستگاه مخابرات امن نظامی دارند لازم است تا یک تفاوت اساسـی میـان آن دو را روشن کنیم. برای این منظور لازم است تا دو روش متداول تکنیک طیف گسترده را معرفی کنیم.
1-7-1 رشتهی پیوستهی طیف گسترده(DSSS) 2
در DSSS یک کد شبه تصادفی برای گسترده کردن هر بیت از اطلاعـات بـا اسـتفاده از تعـداد زیادی از بیت ها که به مراتب کوچکتر از بیت اصـلی هسـتند اسـتفاده مـی شـود ایـن کـدها پهنـای بانـد اطلاعات را به پهنای باند بزرگتری گسترش میدهند.
2-7-1 جهش فرکانسی طیف گسترده(FHSS) 3
تکنیک FHSS در مفهوم شبیه DSSS است ولی در این روش گسترده کردن انـرژی سـیگنال در حوزهی فرکانس صورت میگیرد و مزایایی از مخابرات پهن باند را ارایه میدهد. به هر حال پهنای بانـد زیاد نتیجهی گسترده کردن اطلاعات مانند تکنیک DSSS نیست.
3-7-1 تفاوتهای اساسی بین UWB و طیف گسترده
هر دو تکنیک DSSS و FHSS منجر به وسیع شدن طیف فرکانس میگردند و مزایایی نسـبت به مخابرات باند باریک مانند چگالی طیف توان کمتر، ناهمپوشانی، تنوع فرکانسی بـرای کـارایی بهتـر در کانال های چند مسیره و مقاومت در برابر مسدود شده گی عمـدی و غیـر عمـدی دارنـد. امـا تفـاوت بـین
UWB و طیف گسترده چیست؟ هرچند هر دو تکنیک UWB و طیف گسترده همان مزایـای گسـترده کردن پهنای باند را دارند، روش دستیابی به پهنای باند بزرگ تفاوت اصلی بین این دو تکنیک است.
در تکنیک های متداول طیف گسترده سیگنال ها موج های سینوسی پیوسته اند که بایک فرکـانس حامل ثابت مدوله شده اند. در مخابرات UWB فرکانس حاملی وجـود نـدارد، پـالس هـای UWB کوتـاه مستقیماً پهنای باند گسترده تولید می کنند. فاکتور اختصاصی دیگر در UWB پهنای باند خیلـی بـزرگ است. در حالیکه تکنیک های طیف گسترده پهنای باند مگاهرتزی عرضه می کنند، UWB چندین گیگـا هرتز پهنای باند دارد. شکل 10-1سیگنال های باند باریک، پهن بانـد و UWB را در حـوزه هـای زمـان و فرکانس نشان میدهد .[2]

1 Spread Spectrum 2 Direct-Sequence Spread Spectrum 3 Frequency-Hopping Spread Spectrum
15

شکل 10-1 سیگنالهای (a) باند باریک، (b) طیف گسترده و (c) فراپهن باند در حوزههای زمان و فرکانس
8-1 روشهای پیاده سازی سیستم فراپهن باند
در حال حاضر دو روش برای پیاده سازی سیستم های فراپهن باند در باندهای اختصاص داده شده توسط FCC وجود دارد که در ادامه پس از معرفـی آنهـا بـه بررسـی نحـوهی بـه کـار گیـری آنهـا در سیستمهای فراپهن باند میپردازیم.
1-8-1 سیستم (Code Division Multiple Access) CDMA
در روش های قبلی مانند FDMA باند فرکانسی موجود به تعداد زیادی کانال تقسیم و هر کـدام به یک کاربر اختصاص می یافت. در روش TDMA همان مقدار باند فرکانسی برای هر کـاربر وجـود دارد ولی در زمان های متفاوت TDMA به تناوب یکی از فرستنده-گیرنـده هـا را بـه مـدت TSL ثانیـه فعـال می کند. کل پریود شامل تمام مقطع های زمانی را قاب (فریم) TF میگویند. در هر TF ثانیه هر کـاربر بـه اندازهی TSL ثانیه به کانال دسترسی دارد. شکل 11-1 این مطلب را نشان میدهد.

شکل 11-1 روش دسترسی TDMA
16
ولی در روش CDMA که برای استفاده ی بهینه تر از باند فرکانسی به کار می رود، سیگنال ها هم می توانند در فرکانس و هم در زمان با هم همپوشانی داشته باشند ولی با استفاده از پیـام هـای متعامـد از تداخل جلوگیری می شود. در شروع ارتباط به هر زوج فرستنده- گیرنـده یـک کـد معـین اختصـاص داده می شود و هر بیت اطلاعات باند پایه قبل از مدولاسیون با آن کد تغییر می کند (شـکل .(12-1 عمـل کـد کردن پهنای باند طیف داده را به اندازه ی تعداد پالس های موجود در کد افزایش می دهد ولی از آنجـا کـه
CDMA امکان می دهد طیف گسترده کاربران روی یک باند فرکانسی بیفتنـد، پـس CDMA ظرفیـت بالقوهی بیشتری نسبت به دو روش قبل دارد.

شکل 12-1 عملیات کد کردن در [5] DS-CDMA1
شکل 13-1 شیوه ی استفاده از باند فرکانسی UWB را توسط سیستم DS-CDMA که یکـی از پرکاربردترین انواع CDMA می باشد و بر مبنای انتشار سیگنال ها از- به کاربران مختلف بـا کـدهـای متفاوت می باشد را نشان می دهد. همان طور که ملاحظه می شود از دو باند فرکانسی بالا و پـایین اسـتفاده می کند. باند پایین از 3/1GHz تا 5/15GHz را می پوشاند و باند بـالا از 5/825GHz تـا 10/6GHz را در برمی گیرد. به دلیل تداخل با سیسـتم 802.11a از فاصـله ی فرکانسـی 5/15GHz تـا 5/825GHz
استفاده نمیشود.

شکل 13-1 نحوهی استفاده از پهنای باند در سیستم DS-CDMA

1 Direct -Sequence Code Division Multiple Access
17
2-8-1 سیستم (Orthogonal Frequency Division Multiplexing) OFDM
در سیستمهای چند حاملی قدیمی، پهنای باند به N زیر کانـال نـاهم پوشـان تقسـیم مـیشـد و اطلاعات باند پایه روی هر حامل مدوله می گردید. فاصله ی فرکانسی بین حامل ها کـه بـرای جلـوگیری از تداخل در نظر گرفته می شود سبب از بین رفتن مقداری از پهنای بانـد مـی شـود. در OFDM اطلاعـات ارسالی به تعدادی زیر باند تقسیم شده و پس از محاسبهی عکس تبدیل فوریه اطلاعات روی مجموعـه ای از زیر حامل ها ارسال می گردد و از آنجایی که این حامل ها بر هم عمودند به فاصله ی فرکانسی کمـی نیـاز دارند. خرد کردن سیگنال در زیر باندها مقاومت سیستم در برابر محو سیگنال و از بین رفتن اطلاعـات را افزایش میدهد. در گیرنده با تبدیل فوریه بیتهای هر زیر باند استخراج میگردد.
سیسـتم MB-OFDM1 کـل بانـد فرکانسـی UWB را بـه 4 گـروه و 14 بخـش 528MHz
تقسیم میکند .[6] شکل 14-1 این تقسیم بندی فرکانسی را نشان میدهد.

شکل 14-1 گروه بندی طیف فرکانسی MB-OFDM
همان طور که در شکل 15-1مشاهده می شود هر باند 528MHz از 128 زیر حامل بـا فاصـله ی فرکانسی 4/125MHz تشکیل میشود.

شکل 15-1 طیف فرکانسی [7] MB-OFDM

1 Multiband OFDM
18
.2 فصل دوم: مخلوطکنندههای فرکانسی
Mixer
19
1-2 تاریخچه
مبدع مخلوط کنندهی فرکانسـی (Frequency Mixer) دانشـمند بـزرگ مخـابرات رادیـویی ادوین آرمسترانگ1 میباشد. قبل از او تلاشهایی برای انتقال مستقیم فرکانس به باند پایه2 صورت گرفتـه بود، اما چون نوسان کنندههای محلی از پایداری (Stability) کافی برخوردار نبودند موفقیت چندانی در برنداشت. ایدهی آرمسـترانگ در اسـتفاده از فرکـانس واسـطه( IF) 3 کـه منجـر بـه طـرح گیرنـده هـای سوپرهترودین شکل 1-2 گردید امروزه در بسیاری از گیرندههای رادیویی مورد استفاده است.

شکل 1- 2 ساختار گیرنده سوپر هترودین
آرمسترانگ با استفاده از واسطهی لامپ خلاء (Vacuum Tube) مخلوطکنندهای سـاخت کـه فرکانس رادیویی RF را به یک فرکانس واسطه IF انتقال مـی داد در ایـن فرکـانس واسـطه، سـیگنال بـا کیفیت خوب، بهرهی زیاد و نویز کم، تقویت شده و در نهایت دمودله میگردید.
تا قبل از سال 1940 کارهای تئوری اندکی بر روی میکسـرها (کـه تـا آن زمـان از نـوع دیـودی بودند) انجام گرفته بود. دیودهای به کار رفته در این میکسرها از کیفیت و دقت پـایینی برخـوردار بودنـد.
در مدت کمتر از ده سال پیشرفت های زیادی در طراحی میکسرها و افزایش کیفیت دیودهـای مـایکروویو انجام گرفته به طوریکه افت تبدیل4 در میکسرهای مایکروویو از 20dB در 1940 بـه 10dB در 1945 بهبود یافت و در 1950 به حول و حوش 6dB رسید. امروزه با پیشرفت هایی که در ایـن زمینـه صـورت گرفته علاوه بر بهبود در افت تبدیل میتوان از بهرهی تبدیل5 میکسرها بهرهمند شد .[8]
امروزه بهکار بردن میکسرهای فرکانس بالا در سیسـتمهـای ارتباطـاتی بـدون سـیم، از اهمیـت خاصی برخورداراست. طراحی، ساخت و اندازهگیری مشخصات میکسرهای فرکانس بالا، باند مـایکروویو و باند میلیمتری، جزء تجربه های جدید مدارات مایکروویو بهشمار میآید.

1 Major Edwin Armstrong 2 Base Band 3 Intermediate Frequency 4 Conversion Loss 5 Conversion Gain
20
2-2 انواع میکسر
میکسرهای مایکروویو غیرفعال1 به طور معمول با دیودهای شاتکی صورت می پـذیرد. اسـتفاده از عناصر فعال نظیر ترانزیستورهای اثر میدانی برای ساخت میکسرها می توانـد سـبب بهبـود افـت تبـدیل و حتی ایجاد بهره ی تبدیل گردد. چنین میکسرهایی در مقایسه بـا میکسـرهای غیرفعـال سـاخته شـده بـا دیودهای شاتکی دارای معایبی نیز می باشند از جمله: احتمال ناپایداری و پیچیدگی مـدار میکسـر اشـاره کرد. چنانچه از ناحیه ی مقاومتی ترانزیستور اثر میدانی برای ساخت میکسر استفاده شود علاوه بر اینکـه مدارهای بایاس ساده تر شده احتمال ناپایداری نیز بسیار کاهش می یابد، از طرف دیگر به علت اسـتفاده از خاصیت غیرخطی ضعیف مقاومت کانال ترانزیستور، چنـین میکسـرهایی از مولفـه هـای اینترمدولاسـیون ضعیف توان اشباع 1dB بالا و درنتیجه محدودهی دینامیکی وسیعی برخوردار میباشند .[9]
میکسر، در واقع یک مبدل فرکانس است که در مدارات مخابراتی وظیفهی تبدیل (و یا ترکیـب)
سیگنال از یک فرکانس به فرکانس (های) دیگر را به عهده دارد. اهمیت ایـن عملکـرد در تهیـه و تـامین فرکانسهای کاری مناسب با پایداری و نویز مطلوب است. بنابراین باید تلف تبدیل کم و سطح نویز پایین سیگنال تولید شده را از مشخصات مطلوب و مورد نظر در طراحی دانست (هرچند تحقق همزمان ایـن دو مهم در طراحی و ساخت میکسر عملاً کار چندان سادهای نمی باشد.) میکسر را می توان یک مـدار سـه دهانه شامل دهانهی پمپ2 و یا همـان نوسـان کننـدهی محلـی (LO)، دهانـهی سـیگنال ورودی RF و
دهانهی سیگنال IF دانست. (شکل (2-2

شکل 2- 2 میکسر به عنوان یک عنصر سه دهانه
عمل ترکیب سیگنالها را عنصر غیر خطی (مانند دیود ویا ترانزیستور) انجام میدهد. بر همـین اساس میکسرها به دوگروه میکسرهای غیرفعال و فعال تقسیم مـیشـوند. تفـاوت مشخصـات میکسـرها بهطور عمده وابسته به عملکرد عنصر غیرخطی آنهاست. وظیفـه سـیگنال LO کـه معمـولاًدارای تـوان بالاتری نسبت به سیگنال RF است راهاندازی3 عنصر غیرخطی مدار میکسر است تا عملکـرد متغییـر بـا

1 Pasive 2 Pump 3 Driving
21
زمان میکسر را تامین کند. فرکانس سیگنال خروجی IF ترکیبی از هارمونیکهـای سـیگنالهـای RF و LO است که میتوان آنرا بهصورت mfRF+nfLO=fIF نوشت که m و n اعداد صحیح هستند.
1-2-2 میکسرهای غیر فعال
میکسرهای پسیو ساده ترین، شناخته شده ترین و اولین مدارات میکسر هستند. یک ترانسفورماتور و دو دیود، ساده ترین میکسرهای غیر فعال را تشکیل می دهند. ایـن نـوع از میکسـرها دارای ایزولاسـیون خوب بین LO و RF و نیز بین LO و IF می باشند اما سیگنال RF را مستقیماً به خروجی IF می برند. چون سوییچ می تواند با یک MOSFET ساده تحقق یابد میکسر غیر فعال می تواند با مـدارات CMOS
اجرا شود. (شکل ( 3- 2

شکل 3-2 میکسر غیرفعال با تعادل دوگانه1 با CMOS
با توجه به دامنهی مثبت و منفی LO سیگنال RF از مسیرهای مختلف بـه پـورت خروجـی IF
می رسد. با تولید سیگنال مخلوط شده ی IF هارمونیک های دیگری نیز در خروجی ظاهر می شوند. در یک طراحی متعادل تمامی هارمونیکهای زوج حذف میشوند.
بهرهی تبدیل
به صورت توان یا ولتاژ خروجی IF تقسیم بر توان یا ولتاژ ورودی RF تعریف میشود.
رابطهی ,1-2یا , AP

,,
خروجی این میکسر پایین آورندهی غیرفعال میتواند توسط رابطهی 2-2 بهدست آید.

1 Double Balanced
22
رابطهی 2-2 . . . رابطهی 3-2

که در روابط بالا gT(t) رسانایی معادل تونن متغییر با زمان دیده شده از سر خروجـی IF ، m(t)
تابع میکس (رابطهی (3-2 و TLO دوره تناوب سیگنال LO است .[10]
در این میکسر درایو بزرگ LO لازم است تـا ترانزیسـتورهای پسـیو بتواننـد متناوبـاً خـاموش و روشن شوند. توان DC بالایی مصرف می کند که این توان در خود میکسر مصرف نمیشـود ولـی مـدارات درایو LO مقدار زیادی توان برای فراهم کردن سویینگ کافی LO مصرف میکنند.
نویز:
چون قبل از میکسر LNA قرار دارد پس عدد نویز (NF) مـورد نیـاز میکسـر خیلـی بیشـتر از
LNA است زیرا عدد نویز LNA با NF کل مستقیماً جمع میشود ولی NF میکسر بـر بهـرهی LNA
تقسیم میشود. (رابطهی ( 4- 2
رابطهی 4-2 1 NFM 1 NFLNA 1 ALNA در یک قطعهی غیر فعال NF به افت توان نزدیک است.
خطی بودن:
خطی بودن یکی از مشخصات اصلی میکسر پایین آورنده است، سیگنال اصـلی و تـداخل هـردو قبل از ورود به میکسر توسط LNA تقویت می شوند. خیلی از تداخل ها بیش از اندازه به سـیگنال اصـلی نزدیک هستند که توسط فیلتر داخل چیپ فیلتر شوند و این تداخل ها می توانند خیلی قوی تر از سـیگنال مطلوب باشند، بنابراین میکسر به خطی بودن خیلی بیشتری از LNA نیاز دارد. همانطور که در رابطهی
5-2 دیده می شود اعوجاج سهیم شده توسط میکسر به انـدازه ی بهـره ی LNA از اعوجـاج سـهیم شـده توسط LNA بزرگتر است.
رابطهی 5-2 ALNA 1 1 IIP3M IIP3LNA IIP3 اگر سوئیچ های میکسر ایده آل باشند هیچ اعوجاجی توسط میکسر تولید نمی شود. به هر حال بـه خاطر مقاومت سوئیچ ها که نه تنها به ولتاژ درایو LO بلکه به ولتاژ ورودی نیز وابستهاند، سـیگنال توسـط سوئیچها دچار اعوجاج میشود.
23
2-2-2 میکسر گیلبرت
این میکسر به جای تبدیل سیگنال RF به ولتاژ، سیگنال RF را به جریان تبدیل می کنـد. یـک ترانزیستور وظیفه ی تبدیل سیگنال RF را به جریان را به عهـده دارد و سـپس یـک جفـت دیفرانسـیلی جریان را به خروجی های IF متمم در هر دوره ی تناوب LO تبدیل مـی کنـد. در ایـن میکسـر چـون بـه سوئینگ بزرگ بین گیت های جفت دیفرانسیلی برای تبدیل جریـان نیـاز نیسـت درایـو LO مـورد نیـاز کاهش قابل ملاحظهای مییابد.
میکسـر گیلبـرت سـاده (شـکل (4-2 نسـبت بـه میکسـر غیـر فعـال ایزولاسـیون بهتـری بـین سیگنال های RF و LO دارد، زیرا هیچ مسیر مستقیمی بین RF و LO وجود ندارد، اما هنوز نشت LO
به پورت IF از طریق خازنهای پارازیتی بین گیت و درین سوئیچها هست.

شکل 4-2 میکسر گیلبرت ساده
شکل 5-2 یک میکسر با تعادل دوگانه در تکنولوژی CMOS را نشان می دهـد. ایـن میکسـر از سه بخش زیر تشکیل شده است:
مبدل ولتاژ به جریان (ترارسانا)
ترانزیستورهای ضرب کننده (سوئیچها)
مبدل جریان به ولتاژ (بار)
این میکسر مشکل فوق را با اتصال سیگنال هـای LO دیفرانسـیلی بـه همـان خروجـی IF حـل کرده است، هر طرف خروجی IF به دو سوئیچ با سیگنالهای LO با 180˚ اختلاف فاز متصل اسـت پـس
24
نشت LO از دو سوئیچ یکدیگر را خنثی می کنند پس تنها میکس سیگنال هـای RF و LO در خروجـی
IF ظاهر میشود.

شکل 5-2 میکسر گیلبرت با تعادل دوگانه
بهرهی تبدیل:
بهره ی تبدیل میکسر گیلبرت شامل سه جزء )Asw (2 gm,rf (1بهره یا افـت سـوئیچ هـا) RO (3
(امپدانس خروجی)
رابطهی 6-2 , که در رابطهی Asw 6-2 تـابع شـیب و دامنـهی ولتـاژ درایـو LO و ولتـاژ over drive جفـت
سوئیچ هاست . (Vod,sw ) اگر سیگنال LO موج مربعی باشد و دامنهی آن بیشـتر از Vod,sw باشـد، آنگـاه -3.9dB یا Asw=2/π است، اگر سیگنال LO سینوسی باشد و دامنه ی آن به اندازه ی کـافی بزرگتـر از
Vod,sw باشد آنگاه Asw نزدیک به مقدار آن در مورد موج مربعی اسـت. شـکل 6-2 بهـره ی سـوئیچینگ میکسر گیلبرت با تعادل دوگانه ی نوعی را نمایش می دهد. Asw تابع دامنه ی ولتاژ LO اسـت وقتـی کـه دامنهی ولتاژ LO کوچکتر از ولتاژ over drive است، و مقدار ثابتی کمـی کـوچکتر از 2/π (بـه خـاطر افت پارازیتیک) دارد وقتی که دامنهی ولتاژ LO به اندازهی کافی بزرگ است.
25

شکل 6- 2 منحنی بهرهی سوئیچ میکسر گیلبرت با تعادل دوگانه
ولتـاژ over drive ترانزیسـتورهای سـوئیچ بـه جریـان دریـن ترانزیسـتور ورودی RF و ابعـاد ترانزیستورهای سوئیچ وابسته است. Vod,sw می تواند با رابطه ی I-V یک قطعه ی کانال بلند تخمـین زده شود. (رابطهی (7-2
,

رابطهی ,7-2

وقتی کانال ترانزیستورهای سوئیچ به اندازه ی کـافی کوتـاه باشـد معادلـه ی کانـال کوتـاه اعمـال میگردد. (رابطهی (8-2
2 1 2 V , ,
رابطهی 8-2 ρ ρ که در رابطهی 8-2، ρ0 برابر است با:
ρ V ,

به هر حال درایو LO بزرگ می تواند بهره ی سوئیچ Asw بزرگتری فراهم کند. درایو LO خیلـی بزرگ بهره ی تبدیل را کاهش میدهد. هارمونیک بزرگ LO میتوانـد ولتـاژ دریـن ترانزیسـتور ورودی را کاهش دهد و نهایتاً به ناحیهی ترایود هدایت کند.
به جای افزایش درایو LO، کاهش ولتاژ over drive جفت دیفرانسیلی میتواند بهرهی تبـدیل را افزایش دهد. برای این منظور از یک منبع جریان DC که به سورس مشـترک ترانزیسـتورهای سـوئیچ وصل می شود تا بخشی از جریان DC از درین ترانزیستور ورودی را بکشد، استفاده مـی شـود و درنتیجـه
26
ولتاژ over drive کاهش مییابد. تکنیک تزریق جریـان DC در شـکل 7-2 بـا دوایـری بـه دور منـابع جریان مشخص شده است .[10]

شکل 7-2 میکسر گیلبرت با تعادل دوگانه با تکنیک ربودن جریان DC
نویز:
سه منبع اساسی نویز در میکسر پایین آورنده داریم: (1 نویز تولید شده در ترانزیستور ورودی RF
(2 نویز سوئیچینگ
(3 نویز بارهای خروجی
نویز ترانزیستور ورودی RF شامل دو بخش است: (1 نویز گرمایی درین
رابطهی 9-2 , 8 , i و (2 نویز القایی گیت که تا حدودی به نویز گرمایی درین وابسته است. kTg 3 رابطهی 10-2 4 i , جفت دیفرانسیلی جریان RF را بین دو ترانزیستور با فرکانس LO سوئیچ می کنـد، کـه نـویز را نیز در مسیر سیگنال شرکت می دهد. یکی از سـهم هـای نـویز از افـت سـوئیچ هـا و دیگـری از نـویز روی سیگنال های LO است. نویز در گیت جفت دیفرانسیلی شامل نویز فاز و نویز حرارتـی روی سـیگنالهـای LO و نویز القایی گیت است. وقتی دامنهی LO خیلی بزرگتر از ولتاژ over drive جفـت دیفرانسـیلی باشد ( به این مفهوم که فاصله ای که هر دو ترانزیستور جفت دیفرانسیلی روشنند خیلی کـوچکتر از دوره تناوب LO باشد) هر دو نویز حرارتی LO و نویز القایی گیت شدت خیلی کمتری از نویز فاز LO دارند.
27
خطی بودن
خطی بودن میکسر گیلبرت با gm ترانزیستورهای ورودی RF محدود می شـود. یکـی از راه هـای افزایش خطی بودن میکسر گیلبرت بدون کاهش بهره ی تبدیل آن، افزایش جریان دریـن ترانزیسـتورهای ورودی RF و سپس ربودن جریان DC غیر ضروری از مسیر سیگنال است. (شکل (7-2
ادوات سوئیچ کننده خیلی در اعوجاج خروجی شرکت نمی کنند. میکسر گیلبرت بـه جـای ولتـاژ جریان را سوئیچ میکند، هنگامیکه ولتاژ درایو LO خیلـی بزرگتـر از ولتـاژ over drive باشـد، جفـت دیفرانسیلی جریان را به طور کامل سوئیچ میکند و در نتیجـه بهـرهی تبـدیل روی جریـان ورودی ثابـت است. به هر حال با چنین هدایت ناگهانی جریان، سیگنالهای RF با هارمونیکهای مراتب بلاتـر LO در خروجی میکسر تولید میشوند. فرکانسهای سیگنال خروجی میتواند توسط رابطهی 11-2 بیان گردد.
رابطهی 11-2 : , | | یک فیلتر پایین گذر بعد از میکسـر فرکـانس هـای تولیـد شـده ی بـالاتر از ǀfRF±fLOǀ را حـذف می کند. در یک میکسر گیلبرت با تعدل دوگانه همه ی هارمونیـک هـای زوج هـر دو سـیگنال RF و LO
حذف میشوند.
3-2 کاربرد میکسر
همانطور که گفته شد از میکسرها جهت انتقال فرکانس موج حامل به پایین یعنی از RF به IF
در گیرنده ها استفاده می شود، تا سیگنال حاصله با کیفیت خوب و نویز کم قابل پردازش و تقویـت باشـد.
در این انتقال فرکانسی هیچ تغییری در نوع مدولاسیون موج حامل ایجاد نمی شود، به ایـن معنـی کـه در دامنه، فاز یا انحراف فرکانس لحظه ای موج نباید تغییـری بـه وجـود آیـد. عـلاوه بـر ایـن از میکسـرها در فرستنده ها جهت انتقال فرکانس موج حامل به بالا یعنی از IF به RF استفاده می شـود. بـر ایـن اسـاس میکسرهایی که عمل انتقال فرکانس از بالا به پایین را انجام میدهند (پـایین برنـده(1 و میکسـرهایی کـه فرکانس پایین را به بالا انتقال میدهند (بالا برنده(2 نامیده میشوند.
غیر از پارامترهای تلف (و یا گین) و سطح نویز، حداکثر ایزولاسیون بین دهانههـا و فیلترکـردن مناسب برای انتخاب هارمونیک مـورد نظـر (از بـین هارمونیـکهـای تولیـد شـده) در خروجـی، حـذف سیگنالهای ناخواسته، حذف فرکانس تصویر و تطبیق امپدانسی دهانهها (بهویژه در میکسرهای فعال) از سایر مشخصاتی است که در طراحی میکسر مورد نظر است. نخستین گـام در طراحـی میکسـر، انتخـاب مناسب عنصر غیرخطی برای داشتن عملکرد مناسب در باند فرکانسی مورد نظر است.

1 Down Convert 2 Up Convert
28
بر همین اساس برای طراحی و ساخت میکسر در باند فرکانسی خـاص و بـا مشخصـات مطلـوب، ملاحظات تئوری و عملی زیادی باید در نظرگرفته شوند.
4-2 عملکرد میکسر
هرگاه یک سیگنال سینوسی به ورودی یک مدار خطی اعمال شـود شـکل مـوج خروجـی شـبیه شکل مـوج ورودی خواهـد بـود، ولـی اگـر سـیگنال سینوسـی بـه یـک مـدار غیـر خطـی اعمـال شـود هارمونیک های ورودی در خروجی ظاهر می شوند. حال اگر دو سیگنال بـا فرکـانس هـای f1,f2 بـه ورودی یک مدار غیر خطی اعمال شوند نه تنها هارمونیک های هریک از فرکانس های بلکه هارمونیک های دیگـری به شکل m) mf1+nf2وn اعداد صحیح هستند) در خروجی خواهیم داشت.
مشخصه ی یک مدار غیر خطی را با اسـتفاده از تـوان سـری بـه صـورت رابطـهی 12-2 در نظـر میگیریم:
رابطهی 12-2
با فرض ورودی V=V1+V2 خواهیم داشت:
رابطهی 13-2
از بسط رابطهی 13-2 میتوان نوشت:
رابطهی
14-2 3 3 2 در رابطـهی 14-2، V1m تولیـد کننـدهی فرکـانس mf1 و V2n تولیدکننـدهی فرکـانس nf2 و V1mV2n تولیدکنندهی فرکانسهای mf1+nf2 هستند. با توجـه بـه روابـط بـالا معلـوم اسـت کـه یـک مشخصهی غیرخطی میتواند فرکانس های خیلی زیادی تولید کند، که در تحلیل کلی دو دسـته فرکـانس خواهیم داشت، یکی از هارمونیکهای دو فرکانس اعمال شـده و دیگـری یـک دسـته مجمـوع و تفاضـل هارمونیکهای فرکانسهای اعمال شده است.
1-4-2 میکسر به عنوان یک ضرب کننده
به طور کلی میتوان یک میکسر را به عنوان یک ضربکننده در نظرگرفت. (شکل (8-2

شکل 8-2 میکسر به عنوان یک ضرب کننده [3]
29
در این شکل یک ضربکنندهی ایدهآل با دو ورودی RF و LO دیده میشود شامل یـک Tone
حامل در فرکانس ωRF و یک شکل موج مدوله شدهARF 1 میباشد، ورودی دیگری که بـه دهانـهی LO
اعمال میشود یک سینوسی خالص در فرکانس ωLO است.
با ضرب دو سیگنال سینوسی و تبدیل آن به مجموع دو سینوسی که یکی حاصل جمع و دیگری تفاضل دو فرکانس را میدهد، فرکانس مجموع را فیلتر کرده و فقط سیگنال تفاضـل بـاقی مـیمانـد کـه حاصل مخلوط کردن دو فرکانس میباشد، در واقع سیگنال خارج شده از فیلتر شکل موج ARF است کـه اکنون بر Tone حاصل دو فرکانس ωRF-ωLO سوار میباشد.
اگرچه ضربکنندهی ایدهآل دردسترس نیست اما هر عنصـر غیـر خطـی دارای خاصـیت ضـرب کنندهگی است. عملکرد عناصر غیرخطی از آن جهت با ضربکنندهی ایدهآل متفاوت است که این عناصر هارمونیکهای مختلف RF و LO و ترکیب آنها را تولید کرده و خروجیهایی با این هارمونیکها ایجـاد میکنند، حال اگر ورودی مدوله شده ی RF از ورودی غیر مدوله شدهی LO خیلی کوچکتـر باشـد کـه در عمل چنین نیز هست خروجی میکسر شامل ترم های فرکانسی زیر است:
ωn =ωRF+nωLO
پس در خروجی IF فرکانس ωRF به علاوه ی هارمونیکهای مختلف LO را خواهیم داشـت کـه خروجی دلخواه بهوسیلهی فیلتر در دسترس خواهد بود.
2-4-2 عملکرد میکسر به کمک یک سوئیچ
میکسر را میتوان به عنوان یک سوییچ نیز مطرح نمود که با فرکانس LO قطع و وصل میگردد.
شکل 9-2 یک میکسر با ساختار تکی2 را نشان میدهد که به صورت یک سوئیچ مدل شده است.
سیگنال IF حاصلضرب سیگنال RF در شکل موج سوئیچ شدهی S(t) میباشد. در برخی مـوارد ممکـن است شکل موج سوئیچ شده دارای زمان قطع و وصل% 50 3 نباشـد، بـه هرحـال همـهی هارمونیـکهـای فرکانس اصلی به علاوهی یک جـزء DC حاصـل مـیشـود. بنـابراین سـیگنال IF شـامل تعـداد زیـادی هارمونیکهای ناخواسته میباشد که با فیلتر کردن میتوان آنها را جدا ساخت.

1 Modulation Waveform 2 Single ended 3 Duty Cycle
30

شکل 9- 2 میکسر با ساختار تکی
شکل 10-2 نشان دهندهی نوع دیگری از ساختار میکسر است که به آن سـاختار متـوازن تکـی1 گفته میشود، که با استفاده از شکل موج دیگری برای S(t) مدل شدهاست.
در اینجا بهجای قطع و وصل سادهی سیگنال RF قطبهای مثبت و منفی سیگنال بـا فرکـانس سوئیچینگ LO عوض میشوند. مزیت اصلی این حالت حذف ترم DC در شکل موج S(t) اسـت (البتـه به شرط آنکه Duty Cycle، %50 داشته باشیم) و به تبع آن، دیگـر در طیـف خروجـی IF از فرکـانس
RF اثری نخواهد بود، در نتیجه یک ایزولاسیون ذاتی بین دریچههای RF و LO وجـود خواهـد داشـت
.[8]

شکل 10-2 میکسر با ساختار متوازن تکی

1 Single Balanced
31
.3 فصل سوم: بررسی میکسرهای توزیع شدهی
فراپهن باند
32
1-3 مقدمه
توپولوژی توزیع شده در ترکیب خطوط انتقال1 در ابتدا توسط گینزتون2 پیشنهاد شد.[11] به علـت عـدم پیشرفت تکنولوژی در طراحی و ساخت مدارت توزیع شده، اسـتفاده از ایـن مـدارات بـرای مـدت زیـادی متوقف شد. این مدارات دوباره در سال 1980 با پروسههای مختلفی شروع شد که از جمله آنها GsAs و
اخیراً تکنولوژی CMOS را میتوان نام برد. شروع دوباره به کارگیری مدارات توزیع شده اساساً ناشـی از قابلیت طراحی خطوط انتقال روی تراشه3 و سلفهای high-Q بود.
شکل 1-3 بلوک دیاگرام کلی شامل خطوط انتقال و طبقات بهره که روی خطوط انتقال توزیـع شـدهانـد، میباشد که هر طبقه میتواند یک ساختار مشخص میکسر در تکنولوژی دوقطبی4 باشـد. خطـوط انتقـال نیز میتوانند مطابق شکل (a)1-3 توسط موجبرهای هم محور یا مطابق شـکل (b) 1-3 توسـط مـدارات
LC تحقق یابند. در این شکل Ci خازنهای پارازیتی ورودی طبقه به اضـافهی همـه خـازنهـای خـارجی میباشد. همچنین Co خازنهای پارازیتی خروجی طبقات به اضافهی همه خازنهای خارجی میباشد.

شکل 1-3 بلوک دیاگرام مدار ترکیبی توزیع شده (a) موجبر هم محور واقعی (b) مدارات LC مصنوعی[11]
یکی از مشخصات بارز مدارات مجتمع این است که خطوط انتقـال روی تراشـه را بـرای افـزایش پهنای باند به کار میگیرند. در حوزهی فرکانس، خازنهای پارازیتی ترانزیستورها که در شـکل 1-3 دیـده می شود، جذب ثابتهای خطوط انتقال میشوند. بنابراین پهنای باند مدار توسـط فرکـانس قطـع خطـوط انتقال تعیین میشود.

1 Transmission Line 2 Ginzton 3 On chip 4 bipolar
33
نکتهی مهم در خصوص توپولوژی توزیع شده در مقایسه با سایر توپولوژیها، توان مصرفی بـالا و سطح اشغالی زیاد آنها است. توان مصرفی و سطح اشغالی با افزایش تعداد طبقات زیاد میشوند. بهتـرین راه، ایجاد مصالحه بین توان مصرفی و حاصلضرب بهره در پهنای باند یعنی 1GBW میباشد.
توان مصرفی مدارات توزیع شده با n طبقه، n برابر توان مصـرفی یـک مـدار یـک طبقـه اسـت.
مدرارت توزیع شده نسبت به مدارات فشرده مصـالحه ی بهتـری بـین تـوان مصـرفی و عـدد نـویز برقـرار میکنند.
2-3 مدارات توزیع شده
در ساختارهای توزیع شده که اخیراً استفاده از آنها در طراحی سیستمهای فـرا پهـن بانـد رشـد چشمگیری داشته است، معمولاً از چند سلول یکسان که بصورت موازی بین دو خط انتقال (بـا امپـدانس ذاتی معادل 50 اهم) ورودی و خروجی قرار گرفتهاند، استفاده می گردد. این خطوط انتقال مجازی کـه در شکل 2-3 ملاحظه می شوند، از مدل T معادل خط انتقال ناشی شده و اساساً دربرگیرندهی تعدادی سلف میباشند که در کنار خازنهای پارازیتیک ترانزیسـتور، تشـکیل خـط انتقـال بـا امپـدانس مـورد نظـر را میدهند .[12]

شکل 2-3 مدل خطوط انتقال مصنوعی
یکی از نکات مهم در استفاده از ساختار توزیع شده، در نظر گرفتن اختلاف فاز بین سیگنالهـای رسیده از هر کدام از سلولها با یکدیگر در خروجی میباشد. بدین معنی که اگر سـاختار توزیـع شـده بـا چهار سلول را به صورت شکل 3-3 در نظر بگیریم، آنگـاه مـثلاً سـیگنال ورودی A1 پـس از طـی مسـیر مشترک L1 به ورودی اولین سـلول رسـیده، سـپس بـا طـی مسـیرهای L4, L3, L2 و L5 بـه خروجـی میرسد. از طرف دیگر سیگنال A2 از مسیر دیگر بـا طـی مسـیر L1 وL2 بـه ورودی سـلول 2 رسـیده و سپس با طی مسیرهای L3 ، L4 و L5 به خروجی میرسد که این مساله به همین نحو برای سایر سلولها نیز ادامه دارد. با توجه به این که سلولها کاملاً یکسان میباشند، بنـابراین بایـد اخـتلاف فـاز طـی شـده

1 gain-bandwidth
34
توسط سیگنال عبوری از هر یک سلولها از ورودی تا خروجی تا حد ممکن یکسان باشد که در غیـر ایـن صورت باعث تاثیر منفی سیگنالهای سلولها بر یکدیگر و کاهش بازدهی از مقدار ایدهآل میشود. به این منظور باید مقادیر سلف های موجود در خط انتقال ورودی و خروجی و خـازنهـای پارازیتیـک بـه نحـوی انتخاب شوند که علاوه بر تامین امپدانس 50 اهم برای رسیدن به ضریب انعکاس قابل قبـول در ورودی و خروجی، بتوانند این هماهنگی در اختلاف فاز را نیز میسر سازند .[11]

شکل 3-3 شمای نحوهی قرار گیری سلولهای مدار توزیع شده بین دو خط انتقال
3-3 بررسی عملکرد سیگنال بزرگ میکسر گیلبرت به عنوان یک عنصر غیر خطی
در شکل 4-3 یک سلول گیبرت که به طور گسترده به عنوان میکسر مورد استفاده قرار می گیـرد و یک میکسر با تعادل دوگانه1 است مشاهده می شود. تعادل دوگانه به این مفهـوم کـه اگـر فقـط یکـی از سیگنال های ورودی یا LO اعمال شود، خروجی به طور ایـده آل صـفر مـی گـردد. در ایـن تحلیـل فـرض می کنیم که سیگنال خروجی به طور ایده آل هیچ جزئی در فرکانس LO و هارمونیـک هـایش نـدارد، کـه وجود ایزولاسیون بالای پورت به پوررت بین پایانه های ورودی، LO و خروجـی ایـن خواسـته را بـرآورده می کند. سلول گیلبرت شامل طبقهی ترارسانایی یا راهانداز، که یک جفت دیفرانسـیلی اسـت کـه در یـک نقطه کار ثابت بایاس شده است، دو جفت سوئیچ که با سیگنال قوی LO راه می افتند و بارهای مقـاومتی یا مدارات تانک در خروجی است.
رابطهی 1- 3 I I I I IO IO
1 Double Balanced
35

شکل 4-3 میکسر گیلبرت CMOS
نصف سلول گیلبرت خودش یک میکسر تک بالانس است که در شکل 5-3 نمـایش داده شـده و بدین گونه درنظر گرفتن آن، به تحلیل مدار کمک میکند.

شکل 5-3 یک میکسر فعال CMOS با تعادل تکی
هنگامی که ولتاژ ac سیگنال بزرگ به سوئیچ ها اعمال می شـود، بایـاس M1 و M2 ثابـت نیسـت ولی به صورت متناوب با زمان تغییر می کند. وقتی ولتاژ دیفرانسیلی بزرگتر از مقدار مطمـئن Vx، کـه در شکل 6-3 آمده، بین گیت های ترانزیستورها اعمال می شود یکی از آن ها خـاموش مـی شـود، ولـی وقتـی مقدار مطلق ولتاژ لحظه ای VLO کمتر از Vx باشد، جریان طبقه ی راه انداز بین دو قطعه تقسیم می شـود.
میخواهیم جریان درین هر ترانزیستور را برای یک مقدار VLO و جریان بایاس طبقهی راهانداز بدانیم.
رابطهی 2- 3 V k VG V 36 ID 1 θ VGS
در رابطــهی 2-3 کــه رابطــهی جریــان-ولتــاژ ترانزیســتور MOS کانــال کوتــاه مــیباشــد،
θ فــــــــاکتور تنــــــــزل1 قابلیــــــــت حرکــــــــت میــــــــدان نرمــــــــال و k برابــــــــر است .[13]
ترانزیستور M3 را با یک منبع جریان ایده آل مدل می کنیم و فرض می کنیم ترانزیستورهای M1
و M2 در ناحیه ی اشباع باقی مـی ماننـد. در قسـمتی از دوره تنـاوب LO کـه ایـن ترانزیسـتورها روشـن هستند، رفتار سیگنال بزرگ جفت سوئیچها با روابط زیر مدل بیان میشود.
رابطهی 3- 3 I V VGS k V V VGS k و V 1 θ VGS 1 θ VGS IB رابطهی 4- 3 - نرمال میکنیم. GS که جریان و ولتاژ VLO را به صورت رابطهی 5 3 VLO VGS رابطهی -5-3 - θVLO - ULO IB- θ JB و در نتیجه رابطهی 3 3 و رابطهی 4 3 به صورت رابطهی 6 3 و رابطهی 7 3 درkمیآیند. و رابطهی 6- 3 JB U U 1 U U 1 رابطهی 7- 3
هنگامیکه همهی جریان بایاس از M1 میگذرد داریم:
JB 4 2 θ
رابطهی 8- 3 JB JB
gm ترانزیستورها نیاز می شود و می تواند از مشتق I نسبت به V یا در فرم نرمال شده می تواند از مشتق J نسبت به U محاسبه شود. رفتار جفت سوئیچ ها از Vt مستقل است و این به ما اجازه میدهد که gmbs را حذف کنیم. اگر از اثر خازنی صرفه نظر شود جریان خروجی میکسـر تـک بـالانس (شـکل (5-3
تابعی از ولتاژ پیوستهی LO و جریان طبقهی راهانداز است.
رابطهی 9- 3 , I I IO بسط اول تیلور رابطهی 9-3، رابطهی 10-3 را نتیجه میدهد:
رابطهی 10-3 . , , IO که میتوان آنرا به صورت زیر نوشت:

1 Degeneration
37
رابطهی 11-3 . در رابطهی p0(t) 11-3 و p1(t) توابع پریودیک هستند که در شکل 6-3 ملاحظه میشوند.

شکل 6-3 شکل موجهای p0(t) و p1(t)
در ساختار دوبل بالانس با تطبیق خوب تابع p0(t) حذف میشود.
در فاصله زمانی که -Vx<VLO<Vx است هر دو ترانزیستور سوئیچ روشن هسـتند و p0(t) و p1(t) به VLO و IB و مشخصات I-V ترانزیستورها وابستهاند. جریان سیگنال کوچـک در هـر شـاخه بـه وسیلهی تقسیم جریان تعیین میشود و به صورت رابطهی 12-3 دیده میشود .[14]
رابطهی 12-3

مطابق رابطهی 11-3 یک جزء سیگنال is(t) که آن را با x(t) نشان مـی دهـیم، در شـکل مـوج
p1(t) ضرب میشود پس طیف فرکانسی خروجی به صورت رابطهی 13-3 در میآید.
رابطهی 13-3 , که fLO فرکانس LO، p1,n سری فوریه ی p1(t) و X(f) طیف فرکانسی x(t) است. p1(t) فقط مولفههای فرکانسی فرد را دارا میباشد. (p1(t)= -p1(t+TLO/2)) توجه کنیم که ترمهای شـامل n=1
یا n=-1 بهره را معرفی می کنند و در این صورت رابطهی 14-3 بهره ی تبدیل جفت سوئیچ ها به تنهـایی را نشان میدهد.
رابطهی 14-3 , | . | 38
از آنجاییکه x(t)=gm3vin(t) که در آن vin(t) سیگنال ولتاژ ورودی در گیت ترانزیستور M3 و
gm3 ترارسانایی ترانزیستور M3 است، بهره ی تبدیل میکسر تک بالانس در فرم ترارسانایی رابطهی 15-3
است.
رابطهی g .15-3
برای دامنه های بزرگ LO، p1(t) به صورت مـوج مربعـی درمـی آیـد و c بـه 2/π مـیرسـد. در
شرایطی که VO>Vx است یعنی حالتی که برای کارکرد میکسر لازم است و بـا فـرض p1(t) یـک خـط مستقیم رابطهی 16-3 به عنوان تقریب خوبی برای c حاصل میشود .[14]
2 sin ∆
رابطهی 16-3


و برای LO سینوسی داریم: πΔfLO=arcsin(Vx/VO)
4-3 میکسر سلول گیلبرت توزیع شده
میکسر سلول گیلبرت توزیع شده تعداد یکسانی از ایـن میکسـرها مـی باشـد، کـه ترمینـالهـای ورودی و خروجی هر میکسر به نقاط اتصال وسط1 خطوط انتقال مصنوعی وصل شده است. اگر ثابت فـاز خطوط انتقال مصنوعی به درستی طراحی شده باشد خروجی IF هر سلول با سایر اجزاء IF کـه از سـایر سلولها میآیند هم فاز2 خواهد بود. این میکسر به یک بهرهی تبدیل بهتر در طول رنج فرکانسی پهـن در مقایسه با میکسر گیلبرت متداول دست مییابد.
مدارات با خطوط انتقال تاخیر انتشار را فدای پهنای باند سیگنال می کنند، در سیستم هـای بانـد وسیع تاخیر از پهنای باند محدود قابل تحمل تر است زیرا می تواند توسط مدارات پیشبینی تاخیر کالیبره گردد، که استفاده از مدارات توزیع شده در این کاربرد را توجیح مـی کنـد. پهنـای بانـد ایـن مـدارات بـه خصوص در پورت های RF و LO توسط ثابت زمانی RC محدود می شود. در حوزه ی فرکانس، یک منبع محدودیت پهنای باند در مدارات آنالوگ متداول، هنگامیکه فرکانس افزایش مـییابـد افـت در امپـدانس ورودی مدار است. در یک مدار توزیع شده که از شبکهی نردبانی LC بـرای بهبـود پهنـای بانـد اسـتفاده می شود، خازن ورودی ترانزیستور در داخل خطوط انتقال جذب (کشیده) میشود، از اینرو تـا زمـانیکـه فرکانس قطع خطوط انتقال نزدیک شود امپدانس ورودی و پهنای باند تا یک درجهی مطمئن ثابت بـاقی میمانند.
در اثر استفاده از خطوط انتقال مصنوعی بهبود تخت بودن بهره به دست میآید، هرچند طبیعـت مکانیسم اضافه کردن سلف در توپولوژی توزیع شده بهرهی تبدیل میکسر فعال را کاهش میدهد.

tap point in-phase

1
2
39
1-4-3 بهرهی تبدیل
با فرض رفتار سوئیچ جریان ایده آل برای طبقه ی سوئیچ جریان تفاضـلی خروجـی مـی توانـد بـه عنوان نتیجه ی ضرب جریان درین M1 با یک موج مربعی با دامنه ی واحد در نظر گرفته شود. هنگامی که دامنه ی جزء اصلی موج مربعی 4/π برابر دامنه ی موج مربعی است، ترارسـانایی کـل بـه صـورت رابطـهی
17-3 بیان میشود. در این رابطه 2/π به جای 4/π آمـده اسـت زیـرا سـیگنال IF بـین اجـزا مجمـوع و
تفاضل به طور مساوی تقسیم میشود .[15]
2
رابطهی G πg17-3
حال برای میکسر توزیع شده با n سلول بیشترین بهره ی تبدیل به صورت رابطهی 18-3 تعریـف
میشود.
رابطهی 18-3

برای افزایش بهره ی تبدیل می توان تعداد طبقات n، یا ترارسانایی gmRF را افزایش داد که هر دو موجب مصرف توان اضافی می شوند. راه دیگر افزایش ZIF است هنگامی که فرکانس قطع خـط انتقـال IF
) ) حفظ شود. شکل 7-3 مدار معادل خطوط انتقال IF را نشان می دهد که i2 تا
in مدل تاخیری i1 هستند .[11]

شکل 7-3 مدار معادل خط انتقال
2-4-3 تکنیک تزریق جریان
از رابطهی 18-3 نتیجه می شود که بهره ی تبدیل میکسر گیلبرت قویاً به بارهای مقاومتی وابسته است و برای بهره ی تبدیل بالا، مقاومت بار بزرگ نیاز است. با توجه به شکل 8-3، برای یـک جریـان ISS
مشخص خطی بودن میکسر ناشی از اضافه ولتاژ افت کرده روی RL رو به کاهش میگذارد. با ایجـاد یـک مسیر جریان بای پس IB جریان بایاس از مسیر RL به طور موثری کاهش می یابـد، هنگـامی کـه جریـان
DC کافی برای طبقهی ترارسانایی حفظ میشود.
40

شکل 8-3 شماتیک مدار میکسر گیلبرت با تکنیک تزریق جریان
تزریق جریان با یک مقاومت موازی یا منبع جریان فعال پیاده سازی میشود. برای تقویت بیشـتر ترارسانایی برای بهره ی تبدیل کمکی بدون مصرف جریان اضافی، یـک توپولـوژی تزریـق جریـان بـا یـک طبقه ی ترارسانایی مکمل که در شکل 9-3 ملاحظه می شود به کـار مـی بـریم. در ایـن توپولـوژی جفـت تفاضلی pMOS با ترارسانایی ورودی ترکیب شده اند. با انتخاب نسبت جریـان طبقـات مکمـل ماننـد α بهرهی تبدیل توسط رابطهی 19-3 داده میشود .[12]
αISS L µ C L I SS µ C CG 2 π RL
رابطهی 19-3 W W
شکل 9-3 شماتیک مدار میکسر گیلبرت با طبقهی ترارسانایی مکمل
می خواهیم خطی بودن مدار جدید را بررسی کنیم. معادله ی جریان سیگنال کوچک دریـن را بـه صورت رابطهی 20-3 مینویسیم:
رابطهی 20-3
41
و اگر -VOD VGS‐Vt باشد، آنگاه رابطهی 21-3 تا رابطهی 23-3را برای ضرایب g داریم. رابطهی 21 3 kVOD 2 θVOD ∂ID و θVOD 1 ∂VGS رابطهی 22-3 k 1 ∂ ID 1 و θVOD 2!∂VGS رابطهی 23-3 kθ 1 ∂ ID 1 θVOD 3!∂VGS بر اساس روابط بالا اینترمدولاسیونهای مرتبهی دوم و سوم به صورت زیر تعریف میشوند .[16]
رابطهی , ,24- 3

,,
رابطهی , ,25- 3

,,

4

3
از رابطهی 24-3 واضح است که با تکنیک تزریق جریان پیشنهادی بـرای میکسـر IIP2 بزرگتـر به دست می آید. هرچند به هرحال در نتیجه ی استفاده از طبقه ی ترارسانایی pMOS، IIP3 ممکن است کاهش یابد. بنابراین تعامل بین IIP3 و CG برای کارایی بهتر میکسر بایستی به دست آید.
3-4-3 تکنیک پیکینگ سلفی1
محدودیت دیگر پهنای باند کاری میکسر بانـد وسـیع خـازن هـای پـارازیتی در گـره ی خروجـی طبقه ی ترارسانایی هستند مخصوصاً وقتی که تکنیک تزریق جریان برای بالا بردن بهره استفاده می شـود.
یک مدل مدار ساده که در شکل (a)10-3 ملاحظه می شود برای تحلیل به کار رفته و تابع رابطهی 26-3
بهدست میآید.
رابطهی 26-3

1

1 Inductive Peaking
42

شکل 10-3 مدل مدار ساده شده برای (a) میکسر متداول (b) میکسر با تکنیک پیکینگ سلفی سری
برای کم کردن تاثیر قطب فرکانس پایین اضافی در پهنای باند کـاری میکسـر تکنیـک پیکینـگ سری که در اصل برای تقویت کننده های باند وسیع ایجاد شده به کار می رود. شکل (b)10-3 یـک مـدل ساده ی پیکینگ سلفی سری را نشان می دهد. اعمال یک سلف سری Lm بین طبقات ترارسانایی و سوئیچ برای جداکردن خازن های پارازیتی، با وارد کردن یک شبکه ی غیر فعال بـا مشخصـات پهـن بانـد صـورت میگیرد.

شکل (a) 11-3 مدل سیگنال کوچک یک تقویت کننده (b) شبکهی پسیو اضافه شده برای ایزوله کردن خازنهای
پارازیتی (c) پیاده سازی این شبکه با سلف
یک شبکه ی دو پورتی غیر فعال می تواند بین اجزاء ترانزیسـتور (R1,C1) و بـار (R2,C2) بـرای افزایش پهنای باند وارد شود(شکل .((b)11-3 اگر GBW1 شکل (a)11- 3 با رابطهی 27-3 بیان شود.
رابطهی 27-3

2

1 Gain-Bandwidth
43
GBW برای شکل (b)11-3 یا (c) که شبکه ی غیـر فعـال اعمـال شـده و در نتیجـه C1 تنهـا خازنی است که در پورت ورودی شبکه روی GBW اثر دارد، بنابراین برای این حالت GBW با رابطهی
28-3 محاسبه میشود .[17]
g
رابطهی GBW28-3
π
ملاحظه میشود که این تکنیک پهنای باند مدار را به طور قابل ملاحظهای افزایش میدهد.
5-3 مروری بر چند ساختار میکسر پهن باند ارایه شده
در این قسمت شماتیک مدار چندین ساختار میکسر پهن باند، که از بـه روزتـرین سـاختارها بـه شمار میروند، مرور شده است. در پایان بخش، این ساختارها از لحاظ فرکانس کار، بهـره ی تبـدیل، عـدد نویز و خطی بودن در یک جدول مقایسه شدهاند.
1-5-3 ساختار میکسر [18] 1


شماتیک مدار در شکل 12-3 دیده میشود. در طراحـی ایـن میکسـر از توپولـوژی توزیـع شـده استفاده شده و تعداد طبقات به طور دلخواه چهار انتخاب شده است. هر سلول یـک میکسـر تـک بـالانس است. ترانزیستورهای طبقه ی ترارسانایی (M31-M34) به طور یکسان تطبیق یافتـهانـد. در ایـن میکسـر خطوط انتقال مصنوعی در طول خطوط LO,RF وIF با شبکه ی نردبانی LC تحقق یافتهاند، که سلفها با استفاده از ماپیچهای داخل چیپ اجرا شدهاند و خازنها، خـازنهـای پـارازیتی ترانزیسـتورهای MOS
هستند که به خطوط تاخیر LC متصل شدهاند، امپدانس بار با امپدانس مشخصـه ی خطـوط تـاخیر LC
تطبیق یافتهاند.
پارامترهای بهره، عدد نویز، IIP3 این مدار در جدول 1-3 آمده است.

شکل 12-3 مدار میکسر ساختار 1
44
2-5-3 ساختار میکسر [12] 2
شماتیک مدار در شکل 13-3 دیده میشود. این میکسر با استفاده از توپولوژی توزیع شده ی غیر همسان طراحی شده، با ترکیب کردن طبقات سلف و خطوط انتقال مصنوعی با میکسـر گیلبـرت بهـره ی تبدیل بالا و تخت و نیز پهنای باند وسیع به دست می آید. در این سـاختار تزریـق جریـان بـرای افـزایش بهره ی تبدیل میکسر با تاثیر کمتر بـر خطـی بـودن آن بـه کـار رفتـه اسـت. همچنـین از تکنیـک هـای Degeneration خازنی و پیکینگ سلفی برای تقویت بهره و پهنای باند در فرکانس های بـالاتر اسـتفاده شده است.
پارامترهای بهره، عدد نویز، IIP3 این مدار در جدول 1-3 آمده است.

شکل 13-3 مدار میکسر ساختار 2

=27

4. اسیدهای نوکلئیک DNA یا RNA
5. میکرو ارگانیسم یا سلول کامل
6. بافت
7. گیرنده های سنتتیک
آشکارساز و مبدل: که پس از واکنشِ ماده‌ای خاص با پذیرنده‌هایِ زیستی، وارد عمل می‌شوند و می‌توانند نوع و مقدارِ واکنش را با روش‌هایِ مختلفِ فیزیکی-شیمایی کرده (مثلاً با بررسیِ تغییرهایِ الکتروشیمیایی، نوری، جرمی یا حرارتیِ قبل و بعد از واکنش) و به وسیله‌ی سیگنال‌هایِ مناسب به پردازنده ارسال کنند.
انواع متداول مبدل های مورد استفاده در بیوسنسورها شامل:
سنسورهای الکتروشیمیایی
مبدل های الکتروشیمیایی به سه دسته پتانسیومتری تقسیم می شوند (این روش مبتنی بر اندازه گیری پتانسیل یک پیل در جریان صفر است). این پتانسیل با لگاریتم غلظت ماده مورد سنجش متناسب است، (ولتامتری) یک پتانسیل به پیل اعمال می شود تا اکسایش (یا کاهش) ماده مورد سنجش اتفاق افتد و یک افزایش یا کاهش در جریان پیل ایجاد شود. این روش به آمپرمتری معروف است و رسانایی سنجی محلول های حاوی یون هادی الکترون هستند. بزرگی این رسانایی در اثر واکنش شیمیایی تغییر می یابد.رابطه بین رسانایی و غلظت به طبیعت واکنش وابسته است.
سنسور های نوری( لومینسانس، جذب و تشدید پلاسمون سطح )
روش های مورد استفاده در بیوسنسورهای نوری شامل طیف سنجی جذب، طیف سنجی فلورسانس، طیف سنجی انعکاس داخلی، پراش نور است.
این سنسورها دارای دو نوع حساس به تغییر جرم و حرارتی می باشند.
تمام فرایندهای شیمیایی با تولید یا جذب انرژی همراه هستند. این حرارت را می توان با یک ترمیستور حساس اندازه گیری کرد و آن را به میزان واکنش نسبت داد.
پردازنده های سیگنال که عمدتا مسئول برای نمایش نتایج و انجام محاسبات حسگر هستند.
حسگرهای زیستی طی سالهای اخیر مورد توجه بسیاری از مراکز تحقیقاتی قرار گرفته است. حسگرهای زیستی یا سنسورهای بر پایه مواد بیولوژیکی اکنون گستره ی وسیعی از کاربردها نظیر صنایع دارویی، صنایع خوراکی، علوم محیطی، صنایع نظامی بخصوص شاخه Biowar و ... را شامل می شود.
به طور کلی میتوان گفت حسگر های زیستی یک گروه از سیستمهای اندازه گیری می باشند و طراحی آنها بر مبنای شناسایی انتخابی آنالیتها بر اساس اجزا بیولوژیک وآشکارسازهای فیزیکی و شیمیایی صورت می پذیرد
از آنجا که حسگر های زیستی ابزاری توانمند جهت شناسایی مولکول های زیستی می باشند، امروزه از آنها در علوم مختلف پزشکی، صنایع شیمیایی، صنایع غذایی، مانیتورینگ محیط زیست، تولید محصولات دارویی، بهداشتی و غیره بهره می گیرند.در واقع این حسگرها ابزاری توانمند جهت شناسایی مولکولهای زیستی می باشند. حواس بویایی و چشایی انسان که به شناسایی بوها و طعمهای مختلف می پردازد و یا سیستم ایمنی بدن که میلیونها نوع مولکول مختلف را شناسایی می کند، نمونه هایی از حسگرهای زیستی طبیعی می باشند. بیشترین کاربرد حسگرهای زیستی در تشخیص های پزشکی و علوم آزمایشگاهی است، در حال حاضر بیوسنسور های گلوکز از موفق ترین بیوسنسور های موجود در بازار بوده که برای اندازه گیری غلظت گلوکز خون بیماران دیابتی استفاده می شود.
در پانکراس بیماران دیابتی به میزان کافی انسولین تولید نمی‌شود. در این گونه موارد برای تنظیم مصرف انسولین، سنجش مداوم میزان گلوکز خون ضروری است. این ابزار به بیماران مبتلا به دیابت کمک می کند تا در طول روز به سنجش سطح گلوکز خون خود پرداخته و در زمان های مورد نیاز انسولین تزریق کنند.
کاربردهای مختلفی برای حسگرهای زیستی در پزشکی و بالین متصور است که در ذیل اشاره می شود:
**تشخیص ودرمان بیماریها ( سرطان، دیابت و ......)
** تشخیص بیماریها در سطح ژن( سرطان، دیابت و ......)
**تشخیص عوامل بیماریزا
**اندازه گیری داروها و متابولیتهای آنها، کشف داروهای جدید و ارزیابی فعالیت آنها
** ارزیابی و اندازه گیری آنالیتها ی موجود در نمونه بیولوژیک
** تشخیص سریع بیماریها با استفاده از تستهای سریع یا Point-of- care ، ویژگی این تستها سرعت و ارزان بودن روش آزمایش است.
نانوحسگرهای زیستی
با ورود علوم و فناوری نانو و فراهم شدن امکان ساخت الکترودهایی در مقیاس بسیار کوچک، ساخت حسگرهای نانومتری نیز میسر شد. این حسگرها به لحاظ دارا بودن سایز نانومتری و کاربردشان در محیط های زیستی، نانوبیوسنسور (نانوحسگر زیستی) نامگذاری شدند. نانوحسگرهای زیستی الکترودهای بسیار کوچکی در اندازهء نانومتری و ابعاد سلولی هستند که از طریق تثبیت آنزیم های خاصی روی سطح آنها، نسبت به تشخیص گونه های شیمیایی یا بیولوژیک مورد نظر در سلول ها حساس شده اند. از این حسگرها برای آشکارسازی و تعیین مقدار گونه ها در سیستم های بیولوژیک استفاده می شود. این تکنیک، روش بسیار مفیدی در تشخیص عبور بعضی ملکول ها از دیواره یا غشای سلولی است.
در طی دههء گذشته، با پیشرفت فناوری ساخت فیبر نوری و ساخت نانوفیبرها، در پژوهش های پزشکی و بیولوژیک نیز تحول عظیمی صورت گرفته و فناوری ساخت حسگرهای زیستی و دانش تولید نانومتریِ این ابزارها روزبه روز گسترش یافته است. این حسگرها به لحاظ استفاده از فیبر نوری در ساختارشان «حسگرهای نوری» نامیده شده اند و به دو دستهء شیمیایی و بیولوژیکی تقسیم می شوند. بسته به اینکه بخواهیم این حسگر را برای تجزیهء گونهء داخل سلول، مایع بیولوژیک بین سلولی یا داخل خون به کار ببریم، ابعاد نوک حسگر، زاویهء مخروطی شدن نوک آن و میزان نرمی پوشش روی فیبر متفاوت خواهد بود.
تولید نانوحسگرهای زیستی نوری
برای تهیهء این فیبر به عنوان نوک حسگر، می توانیم از دستگاه های مورد استفاده برای کشش فیبرهای نوری استفاده نماییم.
در این دستگاه از لیزر دی اکسید کربن برای گرم کردن فیبر و از وسیله ای برای کشش فیبر در جهت محور اصلی آن استفاده می شود. محققان موفق شده اند با تغییر دما و میزان نیروی کششیِ اعمال شده به فیبر، نوک هایی برای حسگرهای زیستی بسازند که قطرشان بین 20 تا 500 نانومتر است. این تکنیک سرعت بالا (حدود 3 ثانیه) و روند تولید نسبتاً ساده ای دارد.
حسگرهای زیستی انواع مختلفی دارند اما مستقل از نوعشان همگی دارای سازو کاری مشترک اند. هر حسگر زیستی شامل دو بخش اصلی است: ۱/ عنصر تشخیص دهنده (recognition element) که برقراری پیوند شیمیایی با هدف را توسط ligand میسر می‌سازد، ۲/ انتقال دهنده (transducer) که وظیفه تبدیل سیگنال‌ها را بر عهده دارد.
حسگرهای زیستی به دو دسته مستقیم و غیر مستقیم تقسیم می‌شوند. در حسگرهای زیستی مستقیم هدف بدون هیچ واسطه‌ای با لیگاند پیوند برقرار کرده و شناسایی می‌شود. اما در حسگر غیرمستقیم این کار توسط یک عنصر واسطه انجام می‌گیرد.
در انتخاب حسگر مناسب باید دقت داشت که سرعت و سادگی حسگرهای مستقیم نسبت به غیرمستقیم بیشتر بوده و هم چنین قابلیت استفاده در حالت غیر مستقیم را نیز دارد و می توان برای اندازه گیری تغییرات فیزیکی (خواص اپتیکی، الکتریکی و شیمیایی) از آن استفاده کرد.
حسگرهای زیستی به دو دسته اپتیکی و مکانیکی تقسیم می‌شوند که از انواع اپتیکی می توان به SPR(Surface Plasmon Resonator), LSPR, … اشاره کرد که به شکل‌های فیبری (tip & taper) وجود دارند و مورد بحث ما هستند. از انواع مکانیکی نیز می توان از MEMS, quartz plasmon resonator یاد کرد، که در ابعاد نانو کاربردهای بسیار زیادی دارند.
این حسگرها از سه بخش تشکیل شده‌اند.
1.پذیرندهی زیستی یا عنصرِ زیستیِ حساس: یک مادهٔ زیستی (پادتن‌ها، اسید نوکلئیکها، آنزیم‌ها، سلول‌ها و دیگر ماده‌هایِ زیستی) که می‌تواند به صورتِ انتخابی تنها با مادهٔ خاصی واکنش نشان دهد.
2.آشکارساز و مبدل: که پس از واکنشِ ماده‌ای خاص با پذیرنده‌هایِ زیستی، وارد عمل می‌شوند و می‌توانند نوع و مقدارِ واکنش را با روش‌هایِ مختلفِ فیزیکی-شیمایی کرده (مثلاً با بررسیِ تغییرهایِ الکتروشیمیایی، نوری، جرمی یا حرارتیِ قبل و بعد از واکنش) و به وسیلهٔ سیگنال‌هایِ مناسب به پردازنده ارسال کنند.
بخشِ پردازنده که همچنین مسئولیتِ نمایشِ نتیجهٔ فعالیتِ حسگر را نیز بر عهده دارد. به طور کلی می‌توان گفت حسگر زیستیها (زیست حسگرها) یک گروه از سیستمهای اندازه گیری می‌باشند و طراحی آنها بر مبنای شناسایی انتخابی آنالیتها بر اساس اجزا بیولوژیک وآشکارسازهای فیزیکو شیمیایی صورت می‌پذیرد. حسگرهای زیستی متشکل از سه جزء عنصر بیولوژیکی، آشکار ساز و مبدل می‌باشند. طراحی حسگرهای زیستی در زمینه‌های مختلف علوم بیولوژی، پزشکی در دو دهه گذشته گسترش چشمگیری داشته‌است.
فناوری حسگر زیستی در حقیقت نشان دهنده ترکیبی از علوم بیوشیمی، بیولوژی مولکولی، شیمی، فیزیک، الکترونیک و کامپیوتراست. یک حسگر زیستی در حقیقت شامل یک حسگر کوچک و ماده بیولوژیک تثبیت شده بر آن می‌باشد. از آنجا که حسگرهای زیستی ابزاری توانمند جهت شناسایی مولکول‌های زیستی می‌باشند، امروزه از آنها در علوم مختلف پزشکی، صنایع شیمیایی، صنایع غذایی، مانیتورینگ محیط زیست، تولید محصولات دارویی، بهداشتی و غیره بهره می‌گیرند. در واقع این حسگرها ابزاری توانمند جهت شناسایی مولکولهای زیستی می‌باشند.
حواس بویایی و چشایی انسان که به شناسایی بوها و طعمهای مختلف می‌پردازد و یا سیستم ایمنی بدن که میلیونها نوع مولکول مختلف را شناسایی می‌کند، نمونه‌هایی از حسگرهای زیستی طبیعی می‌باشند. در حقیقت حسگرهای زیستی ابزارهای آنالیتیکی بشمار می‌روند که می‌توانند با بهره گیری از هوشمندی مواد بیولوژیک، ترکیب یا ترکیباتی را شناسایی نموده، با آنها واکنش دهند. و بدین ترتیب یک پیام شیمیایی، نوری و یا الکتریکی ایجاد نمایند. بیشترین کاربرد حسگرهای زیستی در تشخیص‌های پزشکی و علوم آزمایشگاهی است، در حال حاضر حسگرهای زیستی گلوکز از موفق ترین حسگرهای زیستیی موجود در بازار بوده که برای اندازه گیری غلظت گلوکز خون بیماران دیابتی استفاده می‌شود. همانگونه که ذکر گردید، اساس کار یک حسگر زیستی تبدیل پاسخ بیولوژیکی به یک پیام است. حسگرهای زیستی مرکب از سه بخش ۱)دریافتگر زیستی یا بیورسپتور ۲) آشکارساز و ۳) مبدل می‌باشند.
دریافتگرهای زیستی که در حسگرهای زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرند به شرح ذیل می‌باشند:
۱. آنزیم
۲. پادتن
۳. گیرنده‌های سلولی
۴. اسیدهای نوکلئیک DNA یا RNA
۵. میکروارگانیسم یا سلول کامل
۶. بافت
۷. گیرنده‌های سنتتیک
در این سیستمها اندازه گیری تغییرات فیزیکی وشیمیایی انجام شده در سطح بیورسپتور و تبدیل آن به انرژی قابل اندازه گیری توسط مبدل انجام می‌شود. همچنین هدایت سیگنالهای فرستاده شده از مبدل به پرداشگر، تقویت، آنالیز و در نهایت تبدیل آن به واحد غلظت توسط آشکار ساز انجام می‌گیرد. انواع متداول مبدل‌های مورد استفاده در حسگر زیستیها شامل:
۱) الکتروشیمیایی ۲) نوری (تابناکی، جذب و تشدید پلاسمون سطح) ۳) حساس به تغییر جرم و ۴) حرارتی می‌باشند.
به عبارتی دیگر یک حسگر زیستی به طور کلی شامل یک سیستم بیولوژیکی تثبیت شده می‌باشد که در حضور آنالیت مورد اندازه گیری باعث تغییر خواص محیط اطراف می‌شود. وسیله اندازه گیری که به این تغییرات حساس است، سیگنالی متناسب با میزان و یا نوع تغییرات تولید می‌نماید که متعاقباً به سیگنالی قابل فهم برای دستگاههای الکترونیکی تبدیل می‌گردد. اختصاصیت و قدرت شناسایی یک آنالیت از میان دیگر آنالیتهای موجود در نمونه مورد آزمایش از ویژگی‌های یک حسگر زیستی می‌باشد. قابلیت انتخاب یک حسگر زیستی توسط بخش پذیرنده و مبدل آن تعیین می‌شود. بدین ترتیب مزایای حسگرهای زیستی بر سایر سامانه‌های اندازه‌گیری موجود را می توان در ۳ مورد زیر خلاصه نمود:
سیستم‌های اندازه گیری موجود توانایی سنجش مولکولهای غیرقطبیی که در بافتهای حیاتی تشکیل می‌گردند را ندارند در حالی که حسگر زیستیها می‌توانند این ترکیبات را شناسایی و سنجش کنند.
از آنجایی که مبنای کار حسگرهای زیستی بر اساس سامانه بیولوژیکی تثبیت و تعبیه شده در خود آنهاست، بنابراین آنها اثرات جانبی بر سایر بافتها ندارند.
کنترل پیوسته و بسیار سریع فعالیتهای متابولیسمی توسط این حسگرها امکان پذیر است.
حسگرهای زیستی بر اساس نحوه شناسایی آنالیت به دو گروه عمده تقسیم می‌گردند:
۱. حسگر زیستی با اساس شناسایی مستقیم پادگن (آنتی‌ژن): که واکنش پذیرنده با آنالیت مستقیما توسط حسگر شناسایی می‌گردد. عناصر بیولوژیک مورد استفاده در این گروه، گیرنده‌های سلولی و آنتی بادی‌ها می‌باشند.
۲. حسگر زیستی با اساس شناسایی غیر مستقیم پادگن: واکنش پذیرنده با آنالیت به طور غیر مستقیم توسط حسگر شناسایی می‌گردد. عناصر بیولوژیک مورد استفاده در این گروه ترکیبات نشاندار، مثل آنتی بادیها ی نشاندار شده و یا ترکیباتی با خاصیت کاتالیتیکی مانند آنزیم‌ها می‌باشند. توسعه حسگر زیستیها ازسال ۱۹۶۲ با ساخت الکترود اکسیژن توسط لی لند کلارک در سین سیناتی آمریکا برای اندازه گیری غلظت اکسیژن حل شده در خون آغاز شد. این حسگر همچنین بنام سازندهٔ آن گاهی الکترود کلارک نیز خوانده می‌شود. بعداً با پوشاندن سطح الکترود با آنزیمی که به اکسیده شدن گلوکز کمک می‌کرد از این حسگر برای اندازه گیری قند خون استفاده شد. بطور مشابه با پوشاندن الکترود توسط آنزیمی که قابلیت تبدیل اوره به کربنات آمونیوم را داراست در کنار الکترودی از جنس یون NH4 + زیست‌حسگری ساخته شده که می‌توانست میزان اوره در خون یا ادرار را اندازه گیری کند. این دو حسگر زیستی از مبدل‌های متفاوتی در بخش تبدیل سیگنال خویش استفاده می‌کردند. بطوریکه در نوع اول میزان قند خون با اندازه گیری جریان الکتریکی تولید شده اندازه گیری می‌شد (آمپرسنجانه=آمپرومتریک). و درنوع دوم اندازه گیری غلظت اوره بر اساس میزان بار الکتریکی ایجاد شده در الکترودها صورت می‌پذیرفت (پتانسیل‌سنجانه=پتانسیومتریک).
ویژگی‌های حسگرهای زیستی عناصر بیولوژیکی
همانطور که ذکر گردید حسگرهای زیستی سیستمهای اندازه گیری بسیار دقیق، حساس و اختصاصی می‌باشند و وجود بیورسپتورهای خاص علت ویژگیهای منحصر به فرد این سیستمهای اندازه گیری می‌باشد. در حقیقت اساس شناسایی وسنجش ترکیبات در این سیستمها، اتصال ویژه آنالیت مورد اندازه گیری به حسگر توسط بیورسپتورها می‌باشد. اهمیت این اجزا در عملکرد بسیار اختصاصی آنها نسبت به آنالیت خاصی است که بدین وسیله از مداخلهٔ مواد مزاحم که موجب عدم کارایی بسیاری از روشهای اندازه گیری است، جلوگیری می‌کند. جزء بیولوژیک ممکن است واکنش سوبسترا را کاتالیز کند(آنزیم) یا به طور انتخابی به سوبسترا متصل شود. آنزیم‌ها یکی از متداولترین عناصر بیولوژیکی هستند که در این سیستمها مورد استفاده قرار می‌گیرند. عناصر بیولوژیکی عامل اصلی گزینش در زیست‌حسگر محسوب می‌شوند که عمدتا در سه گروه تقسیم بندی میگردندکه به شرح زیر می‌باشد:
پادتن
آنزیم
اسید نوکلئیک
ساختارهای سلولی/ سلول‌ها
روش‌های تثبیت اجزای زیستی:به منظور ساخت یک حسگر زیستی پایدار، باید جزء بیولوژیکی به طرز خاصی به مبدل‌ها متصل گردد، چنین فرآیندی را تثبیت گویند. برای این منظور پنج روش به شرح زیر ارائه شده‌است:
جذب سطحی
ریزپوشینه‌سازی
محبوس‌سازی
پیوند عرضی
پیوند کووالانسی
مبدل:، تغییر قابل مشاهده فیزیکی یا شیمیایی را به یک پیغام قابل اندازه گیری، که بزرگی آن متناسب با غلظت ماده یا گروهی از مواد مورد سنجش است، تبدیل می‌نماید، چنین عملی ازتلفیق دو فرایند متفاوت حاصل می‌شود؛ این وسیله ویژگی و حساسیت مواد بیولوژیکی را با قدرت محاسبه گری ریزپردازشگر ترکیب می‌نماید. بیشتر حسگر زیستیها از مبدل‌های الکتروشیمیایی ساخته شده‌اند. مبدل‌ها را می‌توان به انواع زیر تقسیم بندی نمود:
مبدل‌های نوری
مبدل‌های الکتروشیمیایی
مبدل‌های پیزوالکتریک
مبدل‌های گرمایی
حسگر زیستی سیستمی با اندازه کوچک، حساسیت بالا وقابل حمل بوده که می‌تواند آنالیت مورد نظررا درغلظتهای بسیار کم در نمونه‌های بیولوژیک اندازه گیری کند. دو عامل در طراحی یک حسگر زیستی مناسب نقش ایفا می‌کند:
1-روش مناسب تثبیت دریافتگر زیستی در سطح جامد که موجب افزایش طول عمر، حساسیت و پایداری آن می‌گردد.
2-انتخاب مبدل مناسب.
استفاده از حسگرهای زیستی به دلیل دقت و حساسیت روش‌و همچنین در مواردی به دلیل عدم نیاز به وسایل پیشرفته و صرف زمان و هزینه زیاد برای تشخیص آنالیت‌ها در مراکز کوچک و در مراکز با امکانات کم و حتی در منزل نیز کاربرد دارد. این روشها می‌توانند در شناخت مکانیسم برخی بیماریها و اختلالات، در امر تشخیص و درمان بیماریها و عوارض آنها و شناسایی علل و زمینه‌های به وجود آورنده آنها و نیز در سایر علوم مرتبط نظیر داروسازی، سامانه‌های پیشرفته دارورسانی و شناسایی داروهای جدید و ارزیابی فعالیت بیولوژیک آنها فعالیّت نماید.
جزئیات فنی حسگر اپتیکی تشدیدگر پلاسمون سطح:حسگر تشدید پلاسمون سطح (SPR)‌مناسب‌ترین ابزار برای تحلیل برهمکنش‌های انواع مختلفی از مولکولهاست. ساده ترین و متداول ترین این برهم‌کنش‌ها، برهم‌کنش پادتن-پادگن است.
این سامانه‌ها بر اساس آشکارسازی مدولاسیون مکانی فاز (SMPD) است. در این سیستم نور تکفام موازی به منظور برانگیختن SPR استفاده می‌شود و فاز نور بازتابی به صورت مکانی مدوله شده تا یک طرح تداخلی ایجاد کند. در روابط پرتوهای تداخلی φ اختلاف فاز بین پرتوها، I شدت پرتوها، و f فرکانس فضایی خطوط تداخلی است.
نمونه‌های تجاری امروزی این نوع حسگرها بر اساس شدت آشکارسازی نور کار می‌کنند که بسیار مکانیزم ساده‌ای دارد، اما خطاهای موجود در منبع نوری، آشکار ساز نور و تقویت کننده موجب کاهش دقت حسگر شده و بیشتر از چیزی در حدود 10^-6 (RIU) نخواهد بود. به منظور افزایش دقت حسگر به جای اندازه گیری شدت، تغییرات فازی را اندازه گیری می‌کنند. همچنین برانگیختن حسگر باعث افزایش سرعت تغییر شدت و فاز می‌گردد.(دقت: 10^-4 (RIU))
اجزای SPR
لیزر He-Ne، 632.8nm ۲. دریچه ۱۰ میکرومتری(واقع در فاصله کانونی لنزها)، آلمینیومی ۳. بسط دهندهٔ پرتو ۴. صفحه موج ½ ۵. دیافراگم مثلثی ۶. منشور متساوی الاضلاع کریشمان (شیشه ZF5، ضریب شکست 1.740) ۷. تراشه حسگر ۸. سلول جریان ۹. منشور ولاتسون (زاویه جدایی.۳ درجه) ۱۰. منشور قطبنده ۱۱. لنز تصویرساز ۱۲. دوربین CCD متصل به رایانه ۱۳. رایانه
اساس کار حسگرهای اپتیکی بر پایه تغییر ضریب شکست نور در مرز منشور(فیبر) که در تماس با لیگاند است می‌باشد. به منظور افزایش جذب انرژی نور و دقت بیشتر یک لایه فلز (معمولا طلا) بر روی سطح منشور (فیبر) استفاده می‌کنند. حسگر فیبری SPR:در حسگر فیبری به جای استفاده از منشور از فیبر استفاده می‌شود. مزیت این نوع حسگر اندازه کوچک آن است. عملکرد فیبر نیز به همان شکل تغییر در ضریب شکست و فاز پرتوی بازگشتی است. در این شکل فیبر از قسمت نازک تر در تماس محلول مورد بررسی قرار گرفته، نور عبوری از فیبر (که دائما در حال بازتاب داخلی در فیبر است) در اثر وجود ویروس مورد نظر در محلول و قرار گرفتن بر روی لیگاند، دچار تغییر ضریب شکست شده و پرتو خروجی تغییر فاز نشان می‌دهد. با اندازه گیری شیفت در طول موج نور خروجی، به میزان غلظت ویروس و یا وجود یا عدم وجود ویروس پی می‌بریم. همچنین در قسمت زیرین فیبر از یک کره استفاده شده که باعث رفت و برگشت بیشتر نور و در نتیجه تقویت پرت می‌گردد.
برای ساختن تیپ فیبر را به مدت حدودا ۴۵ دقیقه در 1400ml اسید HF %48 به همراه 800 ml روغن قرار داده و سپس توسط NaOH اسید را خنثی و تیپ را می‌شویند. هرچه تیپ متقارن تر باشد پرتوی خروجی از آن دارای شکل متقارن تری است و در اندازه گیری دقت بیشتری به دست می‌دهد.
کاربردهای SPR
بررسی DNA به منظور کشف هرگونه نقص ژنتیکی و یا ابتلا به سرطان‌ها در بدو تولد.
در این روش با مقایسه طیف DNA با طیف ناشی از DNA دارای نقص در ترتیب که منجر به ایجاد سرطان می‌شود، از بدو تولد می‌توان از ابتلا به سرطان و یا سایر بیماریهای ژنتیکی اطلاع یافت.
به دست آوردن غلظت محلولی (گلوکز خون):
در این روش مخصوصا با تلفیقی از MEMSاز کپسول‌هایی استفاده می‌شود که با کاشت در بدن می‌توانند اطلاعات مربوط به بیمار را به طور لحظه‌ای به رایانه شخصی وی ارسال کنند.
حسگرهای زیستی نانومکانیکی
اگر چه استفاده از حسگرها قدمت زیادی دارد، اما در سال های اخیر نانوفناوری نقش مهم و فزاینده ای در توسعه آنها ایفا کرده است. نانوحسگرهایی که بخش اصلی حسگر در آنها ماهیت زیستی داشته باشند، با اسم نانوحسگر زیستی(Nano-biosensor) شناخته می شوند. نانوحسگرهای زیستی به دلیل دارا بودن اندازه نانومتری می توانند سنجش در محیط های زیستی را آسانتر، حساس تر و سریعتر انجام دهند.
حسگرهای زیستی ابزارهای تجزیه ای هستند که دارای سه جزء اصلی عنصر زیستی، مبدل و سیستم قرائت می باشند. عضو زیستی از گزینش‌پذیری بالایی برای برهم کنش زیستی و آشکارسازی آنالیت (ماده مورد تجزیه) برخوردار است. مبدل فیزیکی (Transducer) پدیده شناسایی را به یک اثر قابل اندازه گیری مانند سیگنال الکتریکی، نشر نوری یا حرکت مکانیکی تبدیل می کند. این اثر در نهایت توسط سیستم قرائت اندازه گیری می شود. نانوکانتیلورها و میکروکانتیلورها می توانند تعدادی از پدیده ها نظیر تغییرات جرم، دما، گرما، فشار و رطوبت را به انحراف (شیوه استاتیک) یا تغییر در فرکانس رزونانسی (شیوه دینامیک) تبدیل کنند. کانتیلورها در ساختمان زیست حسگرها بعنوان مبدل سیگنال شیمیایی به حرکت مکانیکی با حساسیت بالا بکار می روند. کلید استفاده از میکروکانتیلورها برای آشکارسازی گزینشی مولکول ها قدرت عاملدار کردن سطح کانیتلور است.
میکروکانیتلورها در آشکارسازی مواد شیمیایی مانند ترکیبات فرار، مواد منفجره، گونه های یونی، سموم، آلاینده های غذا و محیط، آفت کش ها و مواد زیستی مانند آشکارسازی DNA و پروتئین و گلوکز و ... بکار می روند.
نانوساختارهای مختلفی در ساخت نانوحسگرهای زیستی استفاده می شوند که بعضی از آنها عبارتند از: نانوذرات، نقاط کوانتومی، نانولوله ها، نانوفیبرها و نانو سیم ها.
اجزای اصلی زیست حسگر
حسگرهای زیستی ابرازهای تجزیه ای هستند که دارای سه جزء اصلی عنصر زیستی(به عنوان جزء اصلی تشخیص دهنده یونها یا مولکولهای هدف)، مبدل (Transducer) و سیستم قرائت(Read out Sys--) می باشند. در حسگرهای زیستی، عضو زیستی با روش های مختلف روی مبدل تثبیت(Immobilize) شده است . این عضو زیستی از گزینش پذیری بالایی برای برهم کنش های زیستی و آشکارسازی آنالیت برخوردار است (در سیستم های زیستی بین گیرنده و لیگاند مربوط به آن ارتباط اختصاصی وجود دارد که نمونه جالب آن رابطه کاملا اختصاصی بین آنزیم و پیش‌ماده (Substrate) آن می باشد. بدین معنا که آنزیم فقط پیش‌ماده خاص خود را می پذیرد و واکنش موردنظر را تنها بر روی پیش‌ماده ویژه کاتالیز می کند. این ویژگی از تطابق ساختار جایگاه فعال آنزیم (Active site) با ساختار پیش‌ماده ناشی می شود. مبدل فیزیکی پدیده شناسایی را به یک اثر قابل اندازه گیری مانند سیگنال الکتریکی، نشر نوری یا حرکت مکانیکی تبدیل می کند. این اثر در نهایت توسط سیستم قرائت اندازه گیری می شود.
معمولترین عضو زیستی در زیست حسگرها آنزیم ها، آنتی بادی ها، اندامک ها، گیرنده ها و اسیدهای نوکلئیک هستند که با اتصال ویژه به آنالیت موردنظر امکان تجزیه کمی و کیفی آن را فراهم می آورند.
مبدل های معمول در ساخت زیست حسگرها شامل انواع نوری، الکتروشیمیایی، ترمومتری، پیزوالکتریک و ... می باشند که به ترتیب سیگنال ایجاد شده را به علایم نوری،الکترونیکی، تغییرات گرمایی و نوسانی تبدیل می کنند.
این حسگرها بر مبنای نوع جزء زیستی، نحوه کار مبدل یا کاربرد آنها تقسیم بندی می شوند .
امتیازات و عوامل پیشرفت زیست حسگر ها
در اوایل 1960 کلارک و لایونز و آپدایک و هیکز اولین زیست حسگرها را بر مبنای برهمکنش کاتالیتیکی ویژه آنزیم گلوکز اکسیداز با گلوکز توسعه دادند. بعد از آن رشد سریعی در مطالعه فعالیت ها در این زمینه اتفاق افتاد که باعث پیشرفت بزرگی در توسعه ابزارهای حسگر برای اندازه گیری مولکول های زیستی در زمینه های مختلف صنعتی، دارویی، بالینی و کنترل های محیطی گردید.
پیشرفت در میکروفناوری و نانوفناوری پیشرفت حسگرهای بسیار حساس (با توانایی آشکارسازی خمیدگی های در حد نانومتر)، با امتیاز کوچک بودن (امکان سنجش آسانتر محیط های زیستی) را منجر شد. توانمندی بالا، قابلیت اطمینان، صرف انرژی کم، صرفه جویی در زمان و قیمت و آنالیت از مزایای استفاده از این نانو زیست حسگرهاست. سهولت و سرعت بالای اندازه گیری، تکرارپذیری، عملکرد اختصاصی، قابلیت حمل، امکان ساخت آرایه های چند عنصری برای اندازه گیری همزمان و قرائت چندین نمونه، حساسیت بالا و امکان جمع شدن با فناوری میکروالکترونیک از دیگر مزایا می‌باشند. این روش آشکارسازی نیاز به نشاندار کردن (Labeling) ندارد.
معرفی زیست حسگرهای نانومکانیکی
میکروکانتیلورها برای میکروزیست حسگرها و نانوزیست حسگرها بسیار امیدبخش هستند و از کانتیلورهای مورد استفاده در میکروسکوپ نیروی اتمی Atomic Force Microscopy-AFM)) مشتق می شوند. کانتیلورها سکوهای فنری در اندازه های نانو و میکرو می باشند و بر مبنای انحراف سکو و یا تغییر فرکانس رزونانسی حاصل از حضور آنالیت در سطح کانتیلور عمل می کنند.
زمانیکه یک برهمکنش زیست مولکولی در سطح آنها اتفاق می افتد میکروکانتیلور شناسایی مولکولی زیست مولکول ها را به اشارات نانومکانیکی ترجمه می کند که بطور رایج به یک سیستم قرائت نوری (Optical Readout Sys--) یا پیزورسیستیو (Piezo-Resistive Readout Sys--) بعنوان مبدل نیروی مکانیکی به جریان الکتریکی کوپل می شود. میکروکانتیلور مثال جالبی از همراهی نانوفناوری و زیست فناوری است . حسگرهای مبتنی بر کانتیلوردر محیط هوا, خلا و مایع عمل می کنند.
توسعه زیست حسگرهای مجتمع (Integrated) برای آشکاسازی همزمان گونه های مهم زیستی منجر به مفهوم زیست تراشه ها (Biochip) شده است که به عنوان بسترهای دارای میکرو آرایه های زیست پذیرنده ها (Bioreceptor) تعریف می شوند. زیست تراشه های حاوی نانو و میکروکانتیلورها بعنوان عناصر حسگر به نیروی خارجی، نشان دار کردن (Labling) و مولکول های فلورسان نیاز ندارند .
امروزه طیفی از حسگرهای فیزیکی، شیمیایی و زیستی قرار گرفته روی سکوی کانتیلور مورد مطالعه هستند. اگر چه آشکارسازهای منفرد بر مبنای کانتیلورها توسعه یافته اند ولی یک آرایه (Array) از چنین حسگرهایی می تواند اطلاعات فزاینده ای فراهم کند که توسط ابزارهای منفرد قابل دسترسی نیستند. حسگرهای میکروکانتیلور چندعاملی (Multifunctional) با تنوعی از پوشش ها امکان اندازه-گیری مخلوطی از بخارات را با حساسیت بالا فراهم می کنند. تنوعی از پوشش ها و ضخامت ها می توانند برای آشکارسازی بخارات شیمیایی بکار روند. پاسخ آرایه می-تواند برای شناسایی مخلوطی از اجزای شیمیایی بکار رود. استفاده از آرایه ها روی یک تراشه و بدست آوردن مجموعه ای از اطلاعات سبب سهولت نصب و ساخت، استفاده سیار از سیستم، کاهش هزینه و نیرو در طیف وسیعی از کاربردها از صنعت تا محیط زیست را فراهم می کند .
پیشرفت های آینده بهینه سازی ابعاد و شکل کانتیلور را برای رسیدن به کارایی های ویژه شامل می‌شود. حساسیت فشاری، جرمی و دمایی حداکثری، استفاده از آرایه کانتیلورهای موازی که با معدل گیری از نتایج آنها نسبت S/N (نسبت پاسخ حسگر به مولکول هدف (سیگنال) به پاسخ های بی هدف (نویز) که هرچه بیشتر باشد کارآیی حسگر مطلوب تر است)افزایش می یابد، آنالیزهای چندگانه با کانتیلورهای با پذیرنده‌های مختلف, ساده تر کردن قسمتهای مختلف و تجمع آنها از این دسته‌اند.
استفاده های جاری از زیست حسگرها به دنبال ابزارهایی است که قادر باشند توسط هر کس در هر جایی و برای آزمایش هر چیزی در زمان واقعی و با هزینه جزئی عمل کنند. برای قابل حمل بودن زیست حسگرها، حذف اثرات محیط و خودکارسازی عملکرد زیست حسگر ضروری است .
عملکرد کانتیلورها
کانتیلورها می توانند تعدادی از پدیده ها نظیر تغییرات جرم، دما، گرما، فشار و رطوبت را به انحراف (شیوه استاتیک) یا تغییر در فرکانس رزونانسی (شیوه دینامیک) تبدیل کنند و در ساختمان زیست حسگرها بعنوان مبدل سیگنال شیمیایی به حرکت مکانیکی با حساسیت بالا بکار می روند . جذب سطحی مولکول ها وقتی به یکی از سطوح کانتیلور محدود می شود فشار سطحی اختلافی تولید می کند که کانتیلور را خم می کند و همزمان فرکانس رزونانسی کانتیلور به خاطر بارگذاری تغییر می کند. خمیدگی و تغییر در فرکانس رزونانسی می تواند توسط چندین تکنیک: خمیدگی محور نوری (Optical Beam Deflection)، مقاومت پیزو (Piezoresistivity) ، پیزوالکتریستی (Piezoelectricity)، تداخل سنجی (Interferometry) ، تغییرات ظرفیت خازنی (Capacitance) و ... نمایش داده شوند.
اساس حسگری با توجه به وسیله، مولکول های آنالیت و دقت مورد نیاز متنوع است . بطور کلی حسگرهای شیمیایی اغلب بر مبنای شیوه تبدیل، به چهار زمینه عمده الکتروشیمیایی (Electrochemical)، نوری (Optical)، حساس به گرما (Thermosensitive) و حساس به جرم (Mass Sensitive) طبقه بندی می شوند. پاسخ حسگرهای حساس به جرم، با جرم آنالیت بر همکنش کننده با سطح عنصر حسگر متناسب است . حسگرهای میکروکانتیلور به هیچ برچسبی (Label) جهت پاسخ به حضور مولکول روی سطح زیست حسگر نیاز ندارند. در روش های بدون برچسب می توان از نمونه های اصلاح نشده استفاده کرد، در نتیجه امکان قرائت پاسخ در زمان واقعی فراهم می شود. حسگرهای نانومکانیکی حساسیت بالایی در یک ناحیه کوچک (100μm2) در مقایسه با زیست حسگرهای بدون برچسب دیگر نظیر تشدید پلاسمون سطحی (SPR) و ریز ترازوی بلور کوارتز (Quarrtz Crystal Microbalance-QCMB)دارند . زمانیکه اتم های سطح کانتیلور تحت بازآرایی ناشی از جذب سطحی گونه های شیمیایی قرار می گیرند، تغییرات مهمی در فشار روی سطح اتفاق می افتد. این تغییرات کششی یا تراکمی به طبیعت گونه جذب شده بستگی دارد . روش استاتیک یک تکنیک آشکارسازی dc (جریان مستقیم) است که انحراف ناشی از فشار اتصال مولکول هدف به پذیرنده در سطح میکروکانتیلور را آشکارسازی می کند. روش دینامیک آشکارسازی ac (جریان متناوب) است که تغییرات جرم کانتیلور را با استفاده از جابه جایی فرکانس رزونانسی آشکارسازی می-کند .
رایج ترین سیستم های قرائت
تکمیل یک سیستم قرائت با ظرفیت نشان دادن تغییرات با دقت nm ضروری است. برای این منظور روشهای آشکارسازی استاتیک و دینامیک تأیید شده اند که بسیار حساس اند .
روش استاتیک
انعطاف پذیری کانتیلور در این روش سبب می شود تا اتصال مولکول هدف به پذیرنده که بر سطح کانتیلور تثبیت شده منجر به انحراف و خمیدگی در کانتیلور شود. این شیوه اجازه می دهد حسگر تغییرات بینهایت کوچک ناشی از جذب سطحی مولکولی را اندازه بگیرد. به این علت کانتیلورها زیست‌حسگرهای بسیار حساسی هستند و با تکنیک کانتیلور، آشکارسازی فشار سطحی تا حد4-10 N/m ممکن است. چنین اندازه گیری همچنین کمی و مرتبط با غلظت آنالیت موردنظر است. چندین تکنیک برای آشکارسازی خمیدگی کانتیلور بکار می روند که تکنیک های نوری و مقاومت پیزو و روش‌های خازنی معمولترین روش ها هستند. تحت شرایط واقعی حسگرها باید در طولانی مدت پایدار و نسبت به مولکول هدف حساس و انتخابگر باشند .
روش های نوری
الف- نور لیزر بر انتهای آزاد کانتیلور که به عنوان آیینه عمل می کند متمرکز می شود. به منظور افزایش انعکاس کانتیلورهای تجاری عمدتاً با لایه نازکی از طلا پوشش داده می شوند. نور منعکس شده به آشکارساز نوری برخورد می کند. وقتی کانتیلور خم می شود نور لیزر بر روی آشکارساز نوری حرکت می کند. فاصله طی شده توسط محور لیزر با انحراف کانتیلور متناسب بوده و با فاصله کانتیلور- آشکارساز نوری افزایش می یابد که باید در کالیبراسیون لحاظ شود. نکته قابل توجه در این روش این است که شیب در نقطه برخورد لیزر به کانتیلور جهت تعیین نسبت خمیدگی کانتیلور به جابه جایی تنظیم شود.
-این روش، تفکیک در حد آنگسترم را فراهم می کند که به آسانی انجام می گیرد. مشکل عمده این تکنیک این است که نیاز به ابزارهای خارجی برای اندازه گیری انحراف دارد. بنابراین چینش متوالی و کالیبره کردن آن بسیار وقت گیر است.
برای بدست آوردن پاسخ آرایه ها به این روش یک چالش تکنولوژیکی وجود دارد چرا که به آرایه ای از منابع لیزر به تعداد آنالیت های مورد شناسایی نیاز است. در این تکنیک ترتیب on و off هر منبع لیزر برای اجتناب از همپوشانی محورهای منحرف شده روی آشکارساز نوری ضروری است. این مشکل عمدتاً با استفاده از روبش منبع لیزر حل می شود و محور لیزر مرتباً طول آرایه را اسکن می کند.
ب- برای مینیاتوری کردن (Miniaturization)، کانتیلور باید بصورت تجمعی با یک سیستم قرائت ساخته شود تا از تنظیمات خارجی و اثرات محیطی اجتناب شود. یک راه برای تأمین چنین هدفی استفاده از نوعی سیستم های مجتمع نوری است که در آن میزان خمیدگی از طریق نشان دادن تغییرات در شدت نور انتقال یافته از طریق کانتیلور که بعنوان انتقال دهنده موج عمل می کند تعیین می شود. نور پس از ورود به سیستم از طریق انتقال دهنده موج، ورودی عرض شکاف را به سمت کانتیلور طی می کند و پس از کوپل به کانتیلور مسیر خود را ادامه می دهد و از طریق موج بر خروجی از سیستم خارج می شود. وقتی کانتیلور خم می شود مقداری از نوری که می تواند به موج بر کانتیلور کوپل شود کاهش می یابد و شدت نور خروجی افت می کند. از تغییرات شدت نور می توان به میزان خمیدگی کانتیلور پی برد . زیست حسگرهای نوری نسبت به انواع دیگر زیست حسگرها از امتیازاتی چون آشکارسازی های چندآنالیتی و مونیتورینگ پیوسته برخوردارند .
کانتیلورهای پیزو
حسگرهای مبتنی بر میکروکانتیلور مقاومتی پیزور، تغییرات مقاومت ناشی از فشار قرار گرفتن در معرض آنالیت موردنظر را اندازه می گیرند. این فشار زمانی اتفاق می افتد که آنالیت جذب سطحی یا متصل به ماده حسگر پوشش یافته روی کانتیلور می شود. در این سیستم کانتیلور بطور کامل یا جزئی داخل مواد حسگر قرار می گیرد.
قسمتی از ماده حسگر که در معرض آنالیت ها است آنالیت را بطور انتخابی جذب می کند و در نتیجه تغییر حجم کوچکی در ماده حسگر ایجاد می شود که به عنوان تغییر مقاومت در کانتیلور اندازه گیری می شود. به این ترتیب آنالیت آشکارسازی می شود. عنصر کلیدی در طراحی این نوع کانتیلور ساخت ترکیبی است که در معرض آنالیت موردنظر متورم شده یا ابعادش تغییر کند. از پلیمرهای آلی رایج بعنوان ماده حسگر برای آشکارسازی حضور بخار آب و بسیاری ترکیبات آلی فرار مانند استون، تولوئن، اتانول، هگزان و .... استفاده شده است. مولکول های آنالیتی که پارامترهای انحلال آنها نزدیک و متناسب با پلیمر باشد به آسانی روی آن پلیمر توزیع می شوند. بنابراین از آرایه هایی از حسگرها با پارامترهای انحلال پذیری مختلف می توان برای شناسایی دامنه وسیعی از گونه های آنالیت استفاده کرد. هیدروژل های سنتزی (Synthetic Hydrogels) می توانند تغییرات حجمی بزرگی را در پاسخ به تغییرات دما، pH، رطوبت و فاکتورهای دیگر تحمل کرده و مواد مناسبی جهت طراحی کانتیلورهای مقاومتی پیزو برای ثبت تغییرات این پارامترها محسوب می شوند. مواد زیستی خالص نیز که در اثر اتصال به آنالیت تغییرات حجم سنجی قابل اندازه گیری با کانتیلور را داشته باشند می توانند به عنوان حسگر استفاده شوند. مولکولهای لایه حسگر ممکن است آنالیت را جذب سطحی کنند یا با آن مخلوط شوند و یا پیوند شیمیایی ایجاد کنند.
برای اینکه مقاومت پیزو قابل مشاهده باشد، هدایت الکتریکی در طول ضخامت کانتیلور باید نامتقارن باشد که اغلب توسط اختلاط (Dopping) اختلافی ماده صورت می گیرد. وقتی ماده مقاومتی پیزور مانند سیلیکون مختلط شده (Dopped) تحت شرایط مکانیکی قرار می گیرد، هدایت الکتریکی آن تغییر می کند. برای اندازه گیری تغییر در مقاومت، کانتیلورهای سیلیکون باید در شرایط بایاس (Bias) مستقیم پل وتستون قرار گیرند. در پل وتستون یک زوج کانتیلور قرار می گیرد که یکی بعنوان رفرانس عمل می کند. خروجی سیستم، سیگنال تفاضلی بین دو کانتیلور است. نسبت سیگنال به نویز در این روش قویاً بهبود می یابد و نویز حاصل از اتصالات غیرویژه، نوسانات حرارتی و لرزش ها حذف می شود. اتصالات غیرویژه به سطح مشکلی عمومی است که باید در تمام آنالیزها به حداقل برسد. اگر چه حذف کامل این پارامترها غیرممکن است می توان تأثیر آن روی آشکارسازی را با استفاده از کانتیلور رفرانس کنترل کرد.
کانتیلورهای پیزورسیستیو در مقایسه با نوع نوری چندین امتیاز دارند:
- آشکارسازی پیزورسیستیو می تواند در محلول های غیرشفاف و مایعات آشفته صورت گیرد.
- نیازی به چینش وقت گیر لیزر نیست.
- این سیستم قرائت می تواند بصورت ائتلافی روی ورق سیلیکون قرار گیرد.
- کنترل دما به آسانی انجام می گیرد.
- با کوچک کردن و ساخت آرایه ها سازگار است و هزینه کمتری دارد.
ضعف عمده، سطح نویز ذاتی است که در مقایسه با کانتیلورهای نوری مستقیماً بر تفکیک و حساسیت اثر می گذارد . کنترل دما می تواند بعنوان ابزاری برای شکستن پیوندهای لیگاند- پذیرنده بکار رود. بنابراین لایه حسگر بازتولید می-شود .
روش دینامیک
در روش دینامیک، کانتیلور بطور مکانیکی در فرکانس رزونانسی خود تحریک می شود که اتصال آنالیت موجب جابه جایی این فرکانس رزونانسی می شود و توسط پل وتستون مجتمع با پیزورسیسیتو حس می شود .
تغییرات در فرکانس رزونانسی می تواند با اندازه گیری نویز گرمایی کانتیلور آشکارسازی شود. هنگام کار در مایعات پیک رزونانس بسیار کمتر از هوا انتقال پیدا می کند که از اثر میرایی مایعات ناشی می شود. این فاکتور اندازه گیری های بر مبنای روش دینامیک را به شدت متاثر می کند. در نتیجه این روش برای نشان دادن فرآیندهای بیوشیمیایی در محیط آبی نسبت به روش استاتیک کارآمدی کمتری دارد. حسگرهای کانتیلور که در روش استاتیک عمل می کنند بعنوان شیوه ای برای سنجش های نانومکانیکی زیست مولکولی مفید ترند. برای رسیدن به حساسیت بالا هنگام کار با مایعات در روش دینامیک پیش فعالسازی کانتیلور با استفاده از تغییر زمینه الکتریکی، مغناطیسی یا صوتی ضروری است . بطور کلی حساسیت روش استاتیک دو تا سه برابر از روش دینامیک بیشتر است .
پل وتستون پیزو رسیستیو برای تشخیص نوسان رزونانسی در لبه کانتیلور جایی که ماکزیمم فشار مکانیکی وجود دارد جاگذاری می شود. در حالیکه در مورد سیستم استاتیک حیطه اندازه گیری در طول کانتیلور بوده و منطقه وسیعتری را پوشش می دهد .
در بررسی مولکول های پیچیده مثل پروتئین ها چند منبع فشار احتمالی دیگر غیر از اثر جذب سطحی آنالیت روی کانتیلور وجود دارد. برهمکنش الکترواستاتیک جذب سطحی شده های مجاور، تغییرات در آبگریزی سطح و تغییرات ساختاری مولکول های جذب شده همگی می توانند عامل فشار باشند. در نتیجه تغییرات در فشار می‌تواند مستقیماً به انرژی پیوند لیگاند- پذیرنده مرتبط نباشد .این مسئله مخصوصاً برای جذب سطحی زیستی به خاطر پیچیدگی برهمکنش های مربوطه مطرح است. بعنوان مثالی از پیچیدگی این مسئله مشاهده نحوه جذب سطحی DNA مکمل روی سطح کانتیلور است که می تواند بسته به نیروی یونی بافری که هیبریداسیون در آن اتفاق می افتد منجر به فشار کششی یا تراکمی شود که ناشی از برهمکنش دو نیروی مخالف است. کاهش آنتروپی ناشی از جذب سطحی DNA بعد از هیبریداسیون که منجر به کاهش فشار تراکمی است و دافعه الکتروستاتیک بین DNA جذبی که منجر افزایش فشار تراکمی است . از اثر پیوندهای غیرویژه مولکول ها و منابع نویز مانند لرزش و تغییرات دما با استفاده از کانتیلور رفرنس می توان اجتناب کرد .
در کانتیلورها با افزایش نسبت طول به ضخامت حساسیت بالا می رود و نویز مکانیکی خارجی مستقیماً حداقل انحراف قابل آشکارسازی را متأثر می کند. حساسیت بالا و بطور همزمان نویز پایین با استفاده از کانتیلورهای کوچکتر فراهم می شود. کانتیلورهای کوچکتر همچنین به خاطر فرکانس رزونانسی بالا دارای قدرت پاسخ‌دهی بالا می باشند .
حساسیت آشکارسازی انحراف کانتیلور ناشی از جذب سطحی و تغییر فرکانس رزونانسی ناشی از بارگذاری می تواند در حد ppb و ppt باشد .میکروکانتیلورهای بسیار نازک تا نیروی N18-10 را اندازه می گیرند .
لیزر دی اکسید کربن
لیزر وسیله‌ای برای تولید پرتوی تکفام و همدوس در نواحی نور فرابنفش ، مرئی و یا فروسرخ از طیف امواج الکترومغناطیسی است. کلمه لیزر در حقیقت از حروف اول کلمه‌های عبارت انگلیسی زیر گرفته شده است:
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
این عبارت به معنی "تقویت نور با روش گسیل القایی تابش" گرفته شده است، که همه آنها اصطلاحهایی فیزیکی هستند. از آنجا که باریکه نور لیزر همدوس است (یعنی امواج آن همفاز هستند و به عبارت دیگر مانند سربازانی هستند که باهم پا می‌کوبند، با واگرایی بسیار کم پیش می‌رود و مانند نور معمولی نبوده و کمتر پخش می‌شود) و در نتیجه چگالی و یا تراکم آن در فضا ثابت می‌باشد. پرتو لیزر همچنین مزیت تمرکز زیاد انرژی در واحد سطح را دارد.
مبانی نظری
اتمها در حالتهای گسسته‌ای از انرژی وجود دارند. وقتی یک اتم که در حالت پایه (پایین‌ترین حالت انرژی) است انرژی جذب کند، به حالت انرژی برانگیخته‌ای صعود می‌کند. به دنبال آن در بازگشت به حالت پایه چه بطور مستقیم و چه از طریق حالتهای انرژی میانی ، فوتونهای تابشی با بسامد و طول موجی گسیل می‌دارد که بستگی به اختلاف انرژی بین حالتهای انرژی "شبه پایدار" می‌باشند.گسیل فوتون از اتمها در حالتهای انرژی شبه پایدار گاه به تأخیر می‌افتد تا در نهایت به گسیل تابش فلورسانسی یا فسفرسانسی منجر شود.
اتمهایی که برای عملکرد لیزر مناسب می‌باشند، باید حداقل دارای چنین حالت شبه پایداری باشند. وقتی یک فوتون که از حالت شبه پایدار اتمی گسیل شده ، از نزدیکی یک اتم دیگر که در همان حالت است عبور کند می‌تواند آن اتم را ترغیب کند تا یک فوتون تابشی گسیل دارد که دارای انرژی (و طول موج) ، جهت ، قطبش و فاز یکسان مانند خودش باشد. هر یک از چنین فوتونهای ترغیب شده‌ای خود نیز می‌توانند باز هم فوتون مشابه دیگری را ترغیب کنند. این فرآیند که اساس عملکرد لیزر است یک فرآیند جمع شونده و پیوسته است و می‌توان با ایجاد شرایط مناسب آن را تقویت کرد.
تهیه تعداد لازم از اتمهایی که در حالت انرژی شبه پایدار صحیح باشند، ضرورت اساسی برای عملکرد لیزر است. عملکرد لیزر بستگی به ایجاد یک "وارونی تعداد" دارد که در آن بیشتر اتمها در حالت شبه پایدار می‌باشند. انرژی را باید به این تعداد "پمپ کرد" تا وارونی لازم را ایجاد کنند. بنابراین حالت شبه پایدار مستقیما و یا با تنزل از یک حالت بالاتر بوجود می‌آید.
لیزرهای دی اکسیدکربن
لیزر دی اکسیدکربن (CO2) نمونه‌ای از یک لیزر گاز مولکولی پر قدرت است. باریکه خروجی وقتی کانونی شود می‌تواند صفحات الماس و فولاد ضخیم را در عرض چند ثانیه برش دهد. نمودار تراز انرژی یک گاز مولکولی بطور قابل توجهی پیچیده‌تر از آن برای یک اتم است. حالتهای انرژی که قبلا توضیح داده شده بصورت ترازها منجر به گسیل نور مرئی می‌شوند. هر تراز الکترونی در یک مولکول گاز بطور کلی دارای زیر ترازهایی مربوط به ارتعاشات مجاز مولکولی می‌باشد و هر یک از این ترازهای ارتعاشی نیز زیر ترازهایی بر اساس دوران مجاز مولکولی دارند.
عملکرد لیزر از طریق گذارهای بین ترازهای ارتعاشی - دورانی مختلف امکان پذیر می‌شود و تابش خروجی به صورت فرو سرخ (فوتونهای کم انرژی) می‌باشد. لیزر CO2 با استفاده از این نوع گذار یک باریکه خروجی مثلا به طول موج 10.6 میکرومتر در عملکرد موج پیوسته (CW) می‌دهد. طراحی لیزر ، CO2 شبیه He - Ne است، با این تفاوت که مخلوط گاز (9% دی اکسید کربن ، 15% نیتروژن ، 76% هلیوم) پیوسته و بطور یکنواخت از داخل لوله عبور می‌کند. پمپ کردن این لیزر مانند لیزر هلیوم- نئون با برانگیزش dc انجام می‌گیرد. لوله را باید خنک کرد، این کار معمولا با جریان آب بطور یکنواخت از میان یک پوشش به دور لوله صورت می گیرد.
لیزر زایی در CO2
عمل لیزر کنندگی در لیزر CO2 بواسطه انتقال انرژی از اتمهای نیتروژن برانگیخته به ترازهای انرژی مجاور مولکولهای CO2 صورت می‌گیرد. بهره توان بالای لیزر CO2 (حدود 15%) به دلیل پایین قرار داشتن حالتهای انرژی ارتعاشی و دورانی دی اکسیدکربن که انرژی کمی برای برانگیختگی لازم دارند. با قرار دادن یک Q - سوئیچ می‌توان لیزر CO2 را از عملکرد موج پیوسته به عملکرد پالسی (ضربه‌ای) تبدیل کرد. با استفاده از این شیوه یک لیزر 100 واتی CW می‌تواند پالسهای 100 کیلو واتی در عرض 150 نانو ثانیه و با 400 پالس در ثانیه ایجاد کند.
لیزر CO2 نمونه‌ای از یک نوع طیفی غنی از منبع انرژی است، زیرا تعداد بسیار زیادی از انتقالهای لیزری امکان پذیر می‌باشند. لیزرهای با چنین مشخصه‌ای را لیزرهای قابل تنظیم می‌گویند. لیزرهای CO2 جدید بعضا روی بیش از 85 طول موج مختلف قابل تنظیم هستند. تنظیم ممکن است با شیوه خوش ساختی از طیف نگار "لیترو" که در آن از یک منشور و یا از یک توری پراش برای پراکندگی استفاده می‌شود، انجام گیرد. در یک انتهای لیزر ، منشور تمام نقره اندودی که قابل چرخش است قرار دارد و نور را طوری پراکنده (پاشنده) می‌کند که فقط خط طیف با محور لیزر هم خط می‌شود و به دنبال آن تقویت می‌گردد و امواج ایستاده بجای می‌گذارد.
فیبر نوری
دسته‌ای از تارهای نوری فیبر نوری یا تار نوری (Optical Fiber)‏ رشته ی باریک و بلندی از یک ماده ی شفاف مثل شیشه یا پلاستیک است که می‌تواند نوری را که از یک سرش به آن وارد شده، از سر دیگر خارج کند. فیبر نوری داری پهنای باند بسیار بالاتر از کابل‌های معمولی می‌باشد، با فیبر نوری می‌توان داده‌های تصویر، صوت و داده‌های دیگر را به راحتی با پهنای باند بالا تا ۱۰ گیگابایت انتقال داد.
تاریخچه ی ساخت فیبر نوری
رونمایی از پروژه - ریسرچطبیعت در سال ۱۸۸۴ توسط ژان دانیل کلادوناولین کسانی که در قرون اخیر به فکر استفاده از نور افتادند، انتشار نور را در جو زمین تجربه کردند. اما وجود موانع مختلف نظیر گرد و خاک، دود، برف، باران، مه و... انتشار اطلاعات نوری در جو را با مشکل مواجه ساخت. بعدها استفاده از لوله و کانال برای هدایت نور مطرح گردید. نور در داخل این کانالها بوسیله آینه‌ها و عدسی‌ها هدایت می‌شد، اما از آنجا که تنظیم این آینه‌ها و عدسی‌ها کار بسیار مشکلی بود این کار نیز غیر عملی تشخیص داده شد و مردود ماند.
.شاید اولین تلاش در سیر تکاملی سیستم ارتباط نوری به وسیله الکساندر گراهام بل صورت گرفت که در سال ۱۸۸۰، درست ۴ سال پس از اختراع تلفن، اختراع تلفن نوری (فوتوفون) یا سیستمی که صدا را تا فواصل چندین صد متر منتقل می کرد، به ثبت رساند. تلفن نوری بر مبنای مدوله کردن نور خورشید بازتابیده با به ارتعاش در آوردن آینه ای کار می کرد. گیرنده یک فتوسل بود. در این روش نور در هوا منتشر می شد و بنابراین امکان انتقال اطلاعات تا بیش از ۲۰۰ متر میسر نبود. به همین دلیل، اگرچه دستگاه بل ظاهراً کار می کرد اما از موفقیت تجاری برخوردار نبود.
ایده استفاده از انکسار (شکست) برای هدایت نور (که اساس فیبرهای نوری امروزی است) برای اولین بار در سال ۱۸۴۰ توسط Daniel Colladon و Jacques Babinet در پاریس پیشنهاد شد. همچنین John Tyndall در سال ۱۸۷۰ در کتاب خود ویژگی بازتاب کلی را شرح داد: «وقتی نور از هوا وارد آب می شود به سمت خط عمود بر سطح خم می‌شود و وقتی از آب وارد هوا می شود از خط عمود دور می شود. اگر زاویه ی پرتو نور با خط عمود در تابش از داخل آب بزرگتر از ۴۸ درجه شود هیچ نوری از آب خارج نمی شود در واقع نور به طور کامل از سطح آب منعکس می شود. زاویه ای که انعکاس کلی آغاز می شود را زاویه بحرانی می نامیم»
کاکو و کوکهام انگلیسی برای اولین بار استفاده از شیشه را بعنوان محیط انتشار مطرح ساختند. آنان مبنای کار خود را بر آن گذاشتند که به سرعتی حدود ۱۰۰ مگابیت بر ثانیه و بیشتر بر روی محیط‌های انتشار شیشه دست یابند. این سرعت انتقال با تضعیف زیاد انرژی همراه بود. این دو محقق انگلیسی، کاهش انرژی را تا آنجا می‌پذیرفتند که کمتر از ۲۰ دسی بل نباشد. اگر چه آنان در رسیدن به هدف خود ناکام ماندند، اما شرکت آمریکائی (کورنینگ گلس) به این هدف دست یافت. در اوایل سال ۱۹۶۰ میلادی با اختراع اشعه لیزر ارتباطات فیبرنوری ممکن گردید. در سال ۱۹۶۶ میلادی، دانشمندان در این نظریه که نور در الیاف شیشه‌ای هدایت می‌شود پیشرفت کردند که حاصل آن از کابلهای معمولی بسیار سودمندتر بود. چرا که فیبرنوری بسیار سبکتر و ارزانتر از کابل مسی است و در عین حال ظرفیت انتقالی تا چندین هزار برابر کابل مسی دارد.


توسعه فناوری فیبرنوری از سال ۱۹۸۰ میلادی به بعد باعث شد که همواره مخابرات نوری بعنوان یک انتخاب مناسب مطرح باشد. تا سال ۱۹۸۵ میلادی در دنیا نزدیک به ۲ میلیون کیلومتر کابل نوری نصب شده و مورد بهره برداری قرار گرفته‌است.
فیبر نوری از پالس‌های نور برای انتقال داده‌ها از طریق تارهای سیلیکون بهره می‌گیرد. یک کابل فیبر نوری که کمتر از یک اینچ قطر دارد می‌تواند صدها هزار مکالمه ی صوتی را حمل کند. فیبرهای نوری تجاری ظرفیت ۲٫۵ گیگابایت در ثانیه تا ۱۰ گیگابایت در ثانیه را فراهم می‌سازند. فیبر نوری از چندین لایه ساخته می‌شود. درونی‌ترین لایه را هسته می‌نامند. هسته شامل یک تار کاملاً بازتاب کننده از شیشه خالص (معمولاً) است. هسته در بعضی از کابل‌ها از پلاستیک کا ملاً بازتابنده ساخته می‌شود، که هزینه ساخت را پایین می‌آورد. با این حال، یک هسته پلاستیکی معمولاً کیفیت شیشه را ندارد و بیشتر برای حمل داده‌ها در فواصل کوتاه به کار می‌رود. حول هسته بخش پوسته قرار دارد، که از شیشه یا پلاستیک ساخته می‌شود. هسته و پوسته به همراه هم یک رابط بازتابنده را تشکیل می‌دهند که با عث می‌شود که نور در هسته تا بیده شود تا از سطحی به طرف مرکز هسته باز تابیده شود که در آن دو ماده به هم می‌رسند. این عمل بازتاب نور به مرکز هسته را (بازتاب داخلی کلی) می‌نامند.
فیبر نوری قطر هسته و پوسته با هم حدود ۱۲۵ میکرون است (هر میکرون معادل یک میلیونیم متر است)، که در حدود اندازه یک تار موی انسان است. بسته به سازنده، حول پوسته چند لایه محافظ، شامل یک پوشش قرار می‌گیرد.
یک پوشش محافظ پلاستکی سخت لایه بیرونی را تشکیل می‌دهد. این لایه کل کابل را در خود نگه می‌دارد، که می‌تواند صدها فیبر نوری مختلف را در بر بگیرد. قطر یک کابل نمونه کمتر از یک اینچ است.
از لحاظ کلی دو نوع فیبر وجود دارد:
تک حالتی single-mode
چند حالتی multi-mode
فیبر تک حالتی یک سیگنال نوری را در هر زمان انتشار می‌دهد. (نظیر تلفن)
فیبر چند حالتی می‌تواند صدها حالت نور را به طور هم‌زمان انتقال بدهد . (نظیر شبکه‌های کامپیوتری)
فیبرهای تک حالته دارای یک هسته کوچک (تقریباً ۹ میکرون قطر) بوده و قادر به ارسال نور لیزری مادون قرمز (طول موج از ۱۳۰۰ تا ۱۵۵۰ نانو متر )می باشند.
فیبرهای چند حالته دارای هسته بزرگتر (تقریباً ۶۲.۵ میکرون قطر) و قادر به ارسال نور مادون قرمز از طریق LED می باشند.
فیبر چند مدی با ضریب شکست پله ای :
ضریب شکست هسته: ۴۸/۱ =n۱
ضریب شکست غلاف: ۴۵۶/۱ =n۲
قطر هسته: ۵۰ الی ۴۰۰ میکرون
قطر غلاف: ۱۲۵ الی ۵۰۰ میکرون
قطر روکش: ۲۵۰ الی ۱۰۰۰ میکرون
تضعیف: ۱db/km الی ۵۰db/km
پهنای باند: ۶MHZ.km الی ۲۵MHZ.km
روزنه عددی: ۰.۱۶الی ۰.۵
فیبر تک مدی با ضریب شکست پله ای :
ضریب شکست هسته: ۴۶۰/۱ = n۱
ضریب شکست غلاف: ۴۵۶/۱ = n۲
قطر هسته: ۳ الی ۱۲ میکرون
قطر غلاف: ۵۰ الی ۱۲۵ میکرون
قطر روکش محافظ: ۲۵۰ الی ۱۰۰۰ میکرون
تضعیف: ۲db/km الی ۵db/km
پهنای باند: ۵۰۰MHZ.km و تا حدود ۲۰۰GHZ.km
روزنه عددی: ۰۸/۰ الی ۱۵/۰ (معمولاً حدود ۱/۰)
فیبر چند مدی با ضریب شکست مرحله ای :
ضریب شکست هسته: ۴۸/۱ = n۱
ضریب شکست غلاف: ۴۶/۱ = n۲
قطر هسته: ۳۰ الی ۱۰۰ میکرون(در مخابرات ۵۰ میکرون)
قطر غلاف: ۱۰۰ الی ۱۵۰ میکرون (در مخابرات ۱۲۵ میکرون کاربرد دارد)
قطر روکش محافظ: ۲۵۰ الی ۱۰۰۰ میکرون
تضعیف: ۷db/km الی ۱۰db/km
پهنای باند: ۱۵۰MHZ.km الی ۲GHZ.km
روزنه عددی: ۲/۰ الی ۳/۰
دی ان ای و ساختار آن
ساختار دی‌ان‌ای
دی‌ان‌ای یک ساختار دو رشته ایی متشکل از ۴ نوکلئوتید است. این نوکلئوتیدها عبارتند از (A) آدنین، (G) گوانین، (C) سیتوسین و تیمین (T). ساختار شیمیایی دی‌ان‌ای به صورت پیوند مشخصی از دو دنباله خطی از این ۴ نوکلئوتید می‌باشد. که این اتصال‌ها فقط به صورت (A-T) , (T-A) , (C-G) , (G-C) وجود دارند.
کشف ساختار دی‌ان‌ای
در پایان سده نوزدهم یک بیوشیمی‌دان آلمانی بنام اسوالد اوری نشان داد که اسیدهای نوکلئیک دارای قند، اسید فسفریک و چند باز نیتروژن‌دار می‌باشند. اندکی بعد مشخص شد که قند موجود در اسیدهای نوکلئیک می‌تواند ریبوز یا دئوکسی ریبوز باشد. پس، اسیدهای نوکلئیک به دو دسته DNA DeoxyriboNucleic Acid)) که قند موجود در آنها دئوکسی ریبوز است و RNA RiboNucleic Acid)) که قند موجود در آنها ریبوز است تقسیم می‌شوند.
در سال ۱۹۴۸ لینوس پاولینگ کشف کرد که بسیاری از مولکول‌های پروتئینی به شکل یک مارپیچ هستند، و کم و بیش شکلی همانند فنر دارند. در سال ۱۹۵۰ نیز اروین شارگاف نشان داد که اگرچه آرایش بازهای موجود در ساختار DNA بسیار گوناگون است، ولی همواره نسبت باز آدنین و باز تیمین موجود در آن با هم برابر است و همین طور نسبت باز سیتوزین با باز گوانین. این دو یافته نقش مهمی را در آشکار شدن ساختار مولکول DNA داشتند. در دهه ۱۹۵۰ همچنان رقابت برای یافتن ساختار DNA ادامه داشت. در دانشگاه کمبریج فرانسیس کریک و جیمز واتسون برپایه کارهای پاولینگ کوشش داشتند تا با آرایه مدل‌های فیزیکی ساختارهای احتمالی ممکن برای DNA را محدود کنند تا سرانجام به ساختار درست دست یابند. گروه دیگری در برگیرنده موریس ویلکینز و رزالین فرانکلین نیز در کالج کینگ لندن همزمان سرگرم مطالعه DNA بوند. روش کار این گروه با گروه پیشین متفاوت بود. آنها کوشش داشتند تا با روش آزمایشگاهی به ویژه با بکارگیری تصاویر پراش اشعه X از مولکول DNA، ساختار آن را معین کنند. رزالین الیس فرانکلین دانشمند زن انگلیسی در بیست وپنجمین روز ژوئیه 1920 در ناتینگ هیل لندن متولد شد.رزالین در 15 سالگی و درحالی که اروپا از زنان و دختران جز خانه داری انتظار دیگری نداشت تصمیم می گیرد دانشمند شود اما با مخالفت پدر روبرو می شود با اینحال او در 18 سالگی وارد دانشگاه کمبریج لندن می شود و سه سال بعد در رشته شیمی از کالج نینونهام در کمبریج فارغ التحصیل میشود. وی برای تحقق بخشیدن به اهدافش وارد مرکز تحقیقات زغال لندن شد وبررسی های خود را برای اخذ مدرک دکترادر زمینه ریز ساختمان گرافیت وکربن ادامه داد. رزالین فرانکلین جوان 4سال بعد و در 25 سالگی موفق به اخذ مدرک دکترا در زمینه بیوفیزیک ملکولی از دانشگاه کمبریج گردید.وی پس از جنگ جهانی دوم به مدت سه سال به فرانسه رفت ودر یک آزمایشگاه دولتی شیمی در پاریس مشغول به کار شد در آنجا با تکنیک پراش اشعه ایکس آشنا شد و در سال1950 مجدداً به انگلستان و به کمبریج برگشت تا مقامی درآزمایشگاه فیزیک شیمی کینگزکالج که بخشی از دانشگاه کمبریج لندن است به دست آورد. در دانشگاه همزمان با موریس ویلکینز اما در دو گروه جداگانه اقدام به بررسی روی مولکول DNA نمود. وی بعد از آزمایشات سخت و طولانی سرانجام مجموعه‌ای از تصویر پراش پرتوی ایکس با کیفیت بالا، از بلور DNAتهیه کرد که البته هیچگاه به نام او به ثبت نرسید. 3 سال بعد به آزمایشگاه کالج بریک بک رفت و در آنجاشروع به مطالعه روی ویروس موزائیک تنباکو کرد . او ثابت کرد که RNAویروس یک مارپیچ یگانه است وی همچنین روی پولیو ویروسها کار دیگری را آغاز کرد به عنوان مثال پس از آن او به مطالعه ی بسیار خطرناک روی ویروس های زنده ی فلج اطفال پرداخت در همان زمان بود که دو محقق انگلیسی یعنی واتسون و کریک معروف با استفاده از عکس هایی که رزالین تهیه کرده بود مدل ساختار دورشته ای مولکول DNAرا بدون اینکه اسمی از رزالین ببرند ارائه دادند. رزالین الیس فرانکلین جوان پس از سالها تلاش در راه علم زیست شناسی به علت قرار گرفتن به طور مستقیم در معرض اشعهx و کریستالو گرافی مبتلا به سرطان شد و سرانجام در سال1958 در16 آوریل در چلسی بعد از دوسال دست و پنجه نرم کردن با سرطان و در38 سالگی درگذشت. 4سال بعد از مرگ فرانکلین واتسون و کریک و موریس ویلکینز جایزه نوبل فیزیولوژی و پزشکی را ازآن خود کردند.
در سال ۱۹۵۱، فرانکلین دریافت که DNA با نگرش به میزان نم هوای پیرامون، می‌تواند دو شکل متفاوت داشته باشد و بنابراین نتیجه گیری کرد که بخش فسفات مولکول در سمت بیرونی آن قرار دارد. اندکی بعد او با بکارگیری تصاویر اشعه X فهمید که DNA در حالت «نمناک» از همگی ویژگی‌های یک مارپیچ برخوردار است؛ این احتمال که حالت دیگر مولکول DNA نیز به شکل مارپیچی باشد به ذهن او خطور کرد، ولی نمی‌خواست تا زمانی که شواهد پایانی برای این حدس پیدا کند آن را اعلام نماید. در ژانویه ۱۹۵۳ ویلکینز که از به نتیجه رسیدن تحقیقات ناامید شده بود، نتایج تحقیقات فرانکلین را بدون اطلاع و خشنودی او، با واتسون در میان گذاشت. واتسون و کریک با بکارگیری این نتایج مدلی بسیار شگفت انگیز را برای ساختار DNA پیشنهاد نمودند. آنها مولکول را به گونه دو زنجیر مارپیچی در برگیرنده نوکلئوتیدها تصور کردند که یکی از آنها بالا می‌رفت و دیگری پایین می‌آمد. کریک که به تازگی یافته‌های شارگاف را هم مطالعه کرده بود کوشش کرد با بکارگیری آنها روش قرار گرفتن بازها را در مولکول DNA مشخص کند. او اظهار کرد که بازها در میانه این مارپیچ دوتایی دو به دو به هم متصل می‌شوند تا فاصله میان دو مارپیچ ثابت بماند. آنها ادعا کردند که هر یک از این دو مارپیچ مولکول DNA می‌تواند به نام قالبی برای ایجاد دیگری بهره گیری شود. در تقسیم سلولی این دو رشته از هم جدا می‌شوند و بر روی هر یک از آنها یک نمونه جدید همانند رشته مقابل پیشین ساخته می‌شود. با این روش بدون اینکه ساختار DNA عوض شود، یک DNA همانند آن فرآوری می‌شود. در اندک مواردی که در این روند خطایی پیش بیاید، گواه «جهش» خواهیم بود. مدل آنها چنان با اطلاعات برآمده از آزمایش‌ها مطابقت داشت که بی درنگ مورد قبول همه واقع شد. کشف ساختار DNA را می‌توان مهمترین یافته زیستی در صد سال گذشته دانست. در سال ۱۹۶۲ واتسون، کریک و ویلکینز موفق به دریافت پاداش نوبل شدند، ولی فرانکلین در گذشته بود.
فصل دوم
روش SPR(Surface Plasmon Resonance)
تشدید پلاسمونی سطح،جمع آوری نوسانات الکترونی در یک سطح جامد یا مایع بوسیله ی پرتو نور فرودی است.شرایط تشدید وقتی ایجاد می شود که فرکانس فوتون های نور با فرکانس طبیعی الکترون های نوسان کننده یکی باشد.الکترون هایی که علی رغم وجود نیروی بازگرداننده ی هسته های مثبت نوسان می کنند. SPRاندازه ای نانومتری دارد و به آن تشدید پلاسمونی نقطه ای سطح نیز گویند.این روش پایه ی بسیاری از ابزارهای اندازه گیری میزان absorption مواد در سطوح فلزی مانند طلا و نقره و یا سطوح نانو ذرات فلزی است.همچنین این روش اساس کار بسیاری از بیو سنسورها با پایه ی رنگی است.

ساختار پلاسمونی سطح شامل امواج الکترومغناطیسی هستند که به صورت موازی با سطح مقطع فلز- دی الکتریک یا فلز خلا منتشر می شوند.از آنجایی که این امواج مرز بین فلز و محیط خارجی (آب یا هوا)هستند این نوسانات به تغییرات این مرز بسیار حساس است. شرایطی مانند جذب مولکولها در سطح فلز و ...
برای توصیف وجود و مشخصات این ساختارها می توان از روش های گوناگونی مانند مدل نظریه ی کوانتومی،مدل دروده و... استفاده کرد.ساده ترین راه برای دست یابی به مسئله این است که رفتار هر ماده را به صورت همگن و پیوسته و با احتساب گذردهی نسبی مستقل از فرکانس بین سطح ماده و سطح خارجی بررسی کنیم.این پارامتر همان ثابت دی الکتریک سطح است زیرا این پارامتر نمایانگر توصیف وجود پلاسمون های الکترونی سطح است.
قسمت حقیقی ثابت دی الکتریک برای فلز باید منفی باشد و مقدار آن نیز از آنچه برای یک عایق در نظر گرفته می شود بزرگتر است.
مثلا این شرایط در سطح جدایی فلز و هوا و یا آب در محدوده ی امواج مادون قرمز قرار دارد.(که در آن بخش حقیقی ثابت دی الکتریک فلز منفی بوده و ثابت دی الکتریک آب و هوا مثبت است.)LSPR یا همان SPRنقطه ای نیز جمع شدن بار الکترونهای نوسان کننده روی نانوذرات فلزی است که بوسیله ی نور بر انگیخته شده اند.این میدان کاملا روی سطح نانو ذره متمرکز شده و به دلیل پراکندگی بلند برد ذرات به سرعت از سطح مقطع نانوذره –عایق به سمت زیر لایه ی عایق پراکنده می شود.شدت نور یکی از مهمترین پارامترها در این روش است.متمرکز بوده یعنی اینکه LSPR دقت و کیفیت بسیار بالایی دارد که فقط اندازه ی نانو ذره روی آن اثر می گذارد.
به دلیل امکان اندازه گیری دامنه ی میدان اثراتی که مربوط به تغییر دامنه هستند مانند اثرات اپتیکی- مغناطیسی به روش LSPR و SPRبررسی می شوند.
روش تشدید کرشمان(kretchmann configuration) برای بر انگیختن پلاسمون های سطحی به کار می رود که در آن از یک پرتو الکترونی یا نوری (طیف مریی یا مادون قرمز)استفاده می شود.تکانه ی پرتو ورودی طوری انتخاب می شود که از تکانه ی پلاسمون ها بیشتر باشد و این در حالتی است که از نور پلاریزه ی p استفاده شود.(پلاریزاسیون موازی با سطح صفحه ی فرودی).
ممکن است با عبور نور از داخل تیغه ی شیشه ای طول موج یا تکانه افزایش پیدا کند وپدیده ی تشدید در طول موج در زاویه ی خاصی اتفاق بیفتد.نور پلاریزه ی s (پلاریزاسیون عمودی بر سطح صفحه ی فرودی)نمی تواند پلاسمون های الکترونی سطح را بر انگیخته کند.پلاسمون های الکتریکی و مغناطیسی سطح با روابط زیر توصیف می شوند:
K(ω)=ω/c(ε1μ1ε2μ2/ ε1μ1 + ε2μ2)1/2
که در آن ε ثابت دی الکتریک و μ. ثابت گذر دهی مغناطیسی فلز،بلور شیشه ای و سطح لایه ی نازک فلزی هستند.
موادی که وجود پلاسمون های سطحی را تضمین می کنند عبارتند از نقره و طلا اما فلزاتی مانند مس ، تیتانیوم و کروم نیز مورد استفاده قرار می گیرند.
وقتی از نور برای بر انگیخته کردن امواج SP استفاده می شود معمولا دو حالت اتفاق می افتد.در ساختار OHO روشنایی نور سطح دیواره ی بلوک را روشن می کند و معمولا بازتابش داخلی اتفاق می افتد. یک لایه ی نازک فلزی از جنس طلا نیز تا حد امکان نزدیک دیواره ی بلوک قرار می گیرد به طوری که امواج بازتابشی با امواج پلاسمای سطح بر هم کنش کنند و به این ترتیب پلاسمون ها بر انگیخته شوند.در ساختار کریشمان فیلم فلزی روی سطح دیواره ی بلوک لایه نشانی شده است. نور دوباره سطح بلوک را روشن می کند و امواج بازتابشی در فیلم فلزی نفوذ می کنند.به این ترتیب پلاسمون ها در سطح دیگر لایه ی نازک فلزی بر انگیخته می شوند. این روشی است که در اکثر کاربرد ها مورد استفاده قرار می گیرد.
تابش SPR
وقتی امواج پلاسمونی سطح با یک ذره یا نقص ساختاری برخورد می کنند(چیزی شبیه زبری های سطحی)مقداری از انرژی آنها دوباره به صورت نور تابش می شود.این نور تابشی را می توان در پشت لایه ی نازک فلزی و در جهات مختلف مشاهده کرد.
کاربرد ها
پلاسمون های سطحی برای محاسبه ی درجه ی حساسیت سطوح در چندین اندازه گیری اسپکتروسکوپی شامل اثر فلورسانس،پراکندگی رامان و تولید هارمونیک های دوم مورد استفاده قرار می گیرد.به هر حال در ساده ترین کاربرد از اندازه گیری بازتابش SPR می توان برای مشاهده ی جذب مولکولی موادی مانند پلیمر ها،DNAیاپروتئین های متصل به آن استفاده کرد.
از لحاظ عملی معمول است که زاویه ی کمترین بازتابش (بیشترین جذب)را اندازه گیری کنند.این زاویه در طی اندازه گیری جذب یک لایه ی ضخیم(در حد نانو متر)از مرتبه ی 1/0 درجه تغییر می کند.در بعضی روش ها نیز تغییر در طول موج جذب بررسی می شود.مکانیسم آشکار سازی اینگونه است که مولکولهای جذب شده باعث ایجاد تغییرات موضعی در ضریب بازتابش سطح شده و تغییر در شرایط تشدید در امواج پلاسمونی سطح را بوجود می آورند.
اگر سطح از چند نوع بیو پلیمر تشکیل شده باشد با استفاده از سنسورهای تصویر برداری و ادوات اپتیکی کافی این روش را می توان به تصویر برداری تشدید پلاسمونی SPRIبسط داد.این روش تصاویری با وضوح بالا را بر اساس جذب مولکول ها بدست می دهند که مشابه میکروسکوپ های زاویه ی بروستر است.
برای نانو ذرات نوسانات پلاسمونی نقطه ای سطح می تواند تا ایجاد پرتو های نوری شدید رشد کند.نانو ذرات و نانو سیم ها توانایی جذب زیادی در محدوده ی بین نور مریی و فرابنفش از خود نشان می دهند. که در فلزات حجمی وجود ندارد.این جذب دور از انتظار با افزایش جذب نور افزایش می یابد.درست همان پدیده ای که در سلول های فوتو ولتایی اتفاق می افتد.انرژی(رنگ)این جذب وقتی پلاریزاسیون نور عمودی یا موازی با سطح نانو سیم باشد متفاوت است.جابجایی در این تشدید ناشی از تغییرات موضعی در ضریب پراش و جذب نانو ذرات می تواند برای تشخیص بیو پلیمرهایی مانند DNAو پروتئین های متصل به آنها مورد استفاده قرار گیرد.
مهمترین اصل اپتیکی مورد استفاده برای مدل سازی این سیستم اصل فرنل است که در آن لایه های ضخیم به صورت نا محدود در نظر گرفته می شود.همچنین لایه های دی الکتریک به صورت پیوسته فرض میشوند.این توصیف ممکن است شامل ضریب پراش چندگانه و ضخامت های مختلف باشد.به هر حال معمولا فقط یک حل در محدوده ی داده های منطقی وجود خواهد داشت.
پلاسمون های ذرات فلزی معمولا بال استفاده از نطریه ی پراکندگی MIEمدل سازی می شوند.در بسیاری از حالت ها مدلی که تمام جزییات را در نظر بگیرد وجود ندارد . سنسورهای مورد استفاده برای کاربرد های خاص کالیبره شده و با استفاده از منحنی کالیبراسیون دقت آنها تعیین می شود.
بیو سنسورهای فیبر نوری
سنسورها طوری توسعه پیدا می کنند تا پاسخ گوی نیاز تحلیل همزمان با اندازه گیری باشند.کار در عمل بسیار ساده است.رابطه ی مستقیمی بین زمان و مقدار اندازه گیری سنسور و تحلیل داده ها برقرار می شود.سنسورهای بیو شیمیایی که بر پایه ی فیبر نوری عمل می کنند نمونه ای از این سنسورها هستند.همانطور که از اسم آنها مشخص است این سنسورها وسایلی برای انتقال اطلاعات شیمیایی از یک نمونه ی در حال اندازه گیری به واحد پردازش و تحلیل و ایجاد یک سیگنال مفید هستند.تمامی این قسمت ها در ارتباط با هم و کاملا فشرده و در ارتباط مستقیم با نمونه ی اندازه گیری شده هستند.بیو سنسورهای فیبر نوری از یک فیبر نوری برای ایجاد و انتقال اطلاعات استفاده می کنند.
این سنسورها بر اساس نوع مولفه ی مورد استفاده برای اندازه گیری طبقه بندی می شوند.و بر همین اساس به 5 دسته قابل تقسیم هستند:
1-بیو سنسورهای فیبر نوری آنزیمی:
که ازیک آنزیم خالص و یا مخلوطی از چند جزبیولوژیکی مانند سلول و یا visideاستفاده می کنند.آنزیم ها واکنش ها را به طور ویژه ای کاتالیز می کنند. و محصولات واکنش ها را به طور مستقیم و یا با انجام واکنش با معرف ها تعیین و آشکارسازی می کنند.
2- بیو سنسورهای فیبر نوریimmunoassay:
این بیو سنسورها از پیوند بین آنتی بادی ها و آنتی ژن ها استفاده می کنند.این پیوند به طور غیر مستقیم و با استفاده از نشانه های نوری فلوروسنس و یا به طور مستقیم اندازه گیری و تغییرات ضریب پراش را تعیین می کنند.
3- بیو سنسورهای فیبر نوری اسید های نوکلئیک:
که از تمایل تبدیل SSDNA(single-standed DNA) به DSDNA(double- standed DNA)استفاده می کنند. این سنسورها معمولا از نشانه گذاری یک عضو SSDNA توسط شناساگرهای نوری استفاده کرده و به همین دلیل به سنسورهای DNAیا genosensorsنیز معروف شده اند.
4- بیوسنسورهای فیبرنوری تمام سلولی:
این سنسورها اثرات تاثیر یک analyte را روی ریز ساختارها بررسی می کنند.آشکارسازی اپتیکی بوسیله ی یک معرف یا خواص اپتیکی خود سلول ها انجام می شود.باکتری های بیو لومینسانس (bioluminescent) که به روش مهندسی ژنتیک ساخته شده است نیز مورد استفاده قرار می گیرد.
5- بیو سنسورهای فیبر نوری biomimetic:
که از مواد غیر بیولوژیکی برای انجام انتخاب های بیولوژیکی استفاده می کنند.
تمام انواع این سنسورها تقریبا شرایط فیزیکی کارکرد مشابهی دارند. یعنی از لحاظ ساختار عملی و ابزار مورد استفاده می توان یک مدل کلی برای آنها در نظر گرفت مثلا شرایط ساخت و اساس کار آنها مشابه است.
در طی دهه‌ی گذشته، با پیشرفت فناوری ساخت فیبر نوری و ساخت نانوفیبرها، در پژوهش‌های پزشکی و بیولوژیکی نیز تحولات عظیمی صورت گرفته و فناوری ساخت حسگرهای زیستی و دانش تولید نانومتریِ این ابزارها روزبه‌روز گسترش یافته است. این حسگرها به لحاظ استفاده از نانو فیبر نوری در ساختارشان "نانو حسگرهای نوری" نامیده شده‌ و به دو دسته ی شیمیایی و بیولوژیکی تقسیم می‌شوند. بسته به اینکه بخواهیم این حسگر را برای تجزیه‌ی گونه‌ی داخل سلول، مایع بیولوژیک بین سلولی یا داخل خون به کار ببریم، ابعاد نوک حسگر، زاویه‌ی مخروطی شدن نوک آن و میزان نرمی پوشش روی فیبر متفاوت خواهد بود.برای نمونه، در (شکل زیر)نحوه تهیه‌ی نوک حسگر از روش کشش فیبرهای نوری آورده شده است.

الف ـ شیوه کشیدن فیبر برای ساخت نانوفیبرها از نمای بالا. ب ـ نمای جانبی از یک فیبر کشیده‌شده
در این دستگاه از لیزر دی‌اکسیدکربن برای گرم‌کردن فیبر و از وسیله‌ای برای کشش فیبر در جهت محور اصلی آن استفاده می‌شود. محققان موفق شده‌اند با تغییر دما و میزان نیروی کششیِ اعمال‌شده به فیبر، نوک‌هایی برای حسگرهای زیستی بسازند که قطرشان بین 20 تا 500 نانومتر است. این تکنیک سرعتی بالا (حدود 3 ثانیه) و روند تولید نسبتاً ساده‌ای دارد. در تصویر زیر یک نانوفیبر تولیدشده به شیوه‌ی کشش لیزری در سمت راست و عبور آن از غشای سلولی در سمت چپ نشان داده شده‌‌است.

نانوفیبر تولیدشده به شیوه‌ی کشش لیزری(سمت راست) و عبور نوک حسگر از غشای سلولی (سمت چپ)
حسگرهای فیبر نوری متراکم، سبک، مقرون به صرفه و مقاوم در برابر خوردگی، پرتوهای تشعشعی، حرارت بالا و تداخل‌های الکترومغناطیسی می‌باشند. داشتن این ویژگی‌ها باعث شده است تا فیبرهای نوری، در حوزه انتقال چندتایی به منظور تبادل داده‌های سنسورها کارایی زیادی داشته باشد. همچنین در بافت‌های زنده، دریافت علائم حیاتی درون‌سلولی جهت شناسایی هدف‌های بیوشیمیایی همچون تترول بنزوپیرین، سیتوکروم C، دنباله‌های DNA و ترکیباتی نظیر اینها، به مرحله‌ی کاربردی شدن سوق پیدا کرده‌اند.

—85

3-3-4- قطر گل‌ها26
3-3-5- کاهش مواد جامد محلول در آب (TSS)27
3-3-6- محتوای پروتئین گلبرگ27
3-3-7- رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ28
3-3-8- جذب آب28
3-3-9- شمارش باکتری ساقه و محلول گلجای28
3-3-10- فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)28
3-3-11- فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز (SOD)29
3-4- تجزیه و تحلیل داده‌ها29
فصل چهارم: نتیجه گیری
4-1- عمر گلجایی31
4-2- کاهش وزن تازه گل32


4-3- درصد ماده خشک33
4-4- قطر گل34
4-5- کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS)35
4-6- میزان پروتئین گلبرگ36
4-7- میزان کاروتنوئید گلبرگ37
4-8- جذب آب38
4-9- جمعیت باکتریایی در ته ساقه39
4-10- جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌ها40
4-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز41
4-12- فعالیت آنزیم پراکسیداز42
فصل پنجم: بحث
5-1- بحث45
5-2- نتیجه‌گیری50
5-3- پیشنهادها50
منابع51

فهرست شکل‌ها
عنوانصفحه
شکل 1-1- گل ژربرا3
شکل 1-1-2- روند رشد و اثرات بروز پیری در مراحل نمو گل9
شکل 3-1- گل‌های شاخه بریده‌ی ژربرا در مرحله‌ی برداشت22
شکل 3-2- چیدمان طرح آزمایشی23
شکل 3-3- اندازه‌گیری وزن تر شاخه گل25
شکل 3-4- اندازه‌گیری قطر گل‌ها26
شکل 3-5- رفراکتومتر دستی (مدل N-1)27
شکل 3-6- اندازه‌گیری پروتئین گلبرگ27
شکل 3-7- اندازه‌گیری رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ28
شکل 4-1- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا31
شکل 4-2- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر کاهش وزن تر گل‌های شاخه بریده ژربرا32
شکل 4-3- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر وزن درصد ماده خشک گل‌های شاخه بریده ژربرا33
شکل 4-4- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا34
شکل 4-5- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر روی کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS) هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا35
شکل 4-6- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان پروتئین گلبرگ گل‌های شاخه بریده ژربرا36
شکل 4-7- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان کاروتنوئید گل‌های شاخه بریده ژربرا37
شکل 4-8- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان جذب آب گل‌های شاخه بریده ژربرا38
شکل 4-9- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در ته ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا39
شکل 4-10- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا40
شکل 4-11- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز گل‌های شاخه بریده ژربرا41
شکل 4-12- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل فعالیت آنزیم پراکسیداز گل‌های ساقه بریده ژربرا42

فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول 4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازه‌گیری شده در گل‌های‌شاخه‌بریده‌ژربرا43

چکیده
این مطالعه به منظور بررسی اثر نیکل بر عمر پس از برداشت گل ژربرا در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. گلهای سالم ژربرا ((Gerbera jamesonii cv. ‘Intense’ از یک تولید کننده تجاری خریداری گردید و فوراً به آزمایشگاه بخش باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد رشت منتقل شد. گلها روی ارتفاع 50 سانتیمتری باز برش شد و در گلدان پلاستیکی دو لیتری محتوی محلول های مختلف نیکل برای 24 ساعت قرار گرفت. تیمار پالس شامل محلول نیکل ( 10، 20 و 30 میلی گرم بر لیتر)، سولفات و نیترات نیکل (10، 30 و 50 میلی گرم بر لیتر) بود. برای شاهد از آب مقطر استفاده شد. بعد از این دوره محلول پالس با 500 میلی لیتر محلول 3% ساکارز به علاوه 200 میلی گرم در لیتر 8-هیدروکسی کینولین سولفات جایگزین گردید. عمر گلجایی، کاهش وزن تر، درصد وزن خشک، جذب آب، شمارش باکتری های ته ساقه و محلول نگه دارنده، ، کاهش درجه بریکس و قطر گل ها، پروتئین و کارتنوئید گلبرگ ها و فعالیت آنزیم های سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز اندازه گیری شد. نتایج نشان می دهد که نیترات نیکل سبب ایجاد بیشترین میزان از عمر گلجایی (11 روز)، پروتئین ( 14%)، فعالیت سوپر اکسید دسموتاز (21/135میکرومول بر گرم ‎وزن تر) و پراکسیداز (3/6میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) گردید. سولفات و نیترات نیکل به ویژه در غلظت‌های 30 و 50 میلی‌گرم بر لیتر اثرات مفید مشابه بر عمر پس از برداشت گل‌ها داشتند. بنابراین نیکل این پتانسیل را دارد که به عنوان یک عامل نگهدارنده عمر پس از برداشت عمل کند. مطالعات بیشتر می‌تواند به روشن‌تر شدن جنبه‌های مختلف این تأثیر کمک کند.
واژگان کلیدی: عمرگلجایی، ژریرا، نیکل، سولفات نیکل، نیترات نیکل (II)

فصل اول
کلیات

1-1- مقدمهژربرا (Gerbera jamesonii) از خانواده آستراسه یکی از معروف‌ترین گلهای شاخه بریده، در جهان محسوب می‌شود. ژربرا اولین بار توسط گیاه شناسی به نام روبرت جیمسن در سال 1884 در آفریقای جنوبی کشف گردید. جنس ژربرا در حدود 30 گونه وحشی دارد که در مناطق آفریقا، آمریکای جنوبی و قسمت‌های گرمسیری آسیا گسترده اند (بنایی و همکاران،2013). به طور کلی ژربرا گیاهی است حساس به سرما با ریشه هایی عمیق که چند ساله محسوب می‌شود. گل آذین ژربرا از سه نوع گلچه، گلچه‌های شعاعی (در قسمتهای حاشیهای گل)، گلچههای موجود در قسمت صفحه مرکزی و گلچههای حد واسط تشکیل شده است. این گلچه‌ها به صورت شعاعی و فشرده کنار یکدیگر قرار گرفتهاند (شکل1-1). امروزه بیشتر ارقام تجاری ژربرا از تلاقی مصنوعی گونه‌های G.jamesonii و G.viridifiolia بدست آمده‌اند که هر دوگونه بومی آفریقای جنوبی می باشند. شهرت این گل به علت تنوع رنگ گلبرگ‌هایش و اندازه بزرگ گل‌هایش (در واقع گل آذین) می‌باشد. در صنعت گل‌کاری به صورت تک‌شاخه بریده و یا به صورت دسته گل و هم به صورت گل خشک کاربرد و طرفدار دارد (نایر و همکاران 2003). بیشتر برنامه‌های بهنژادی این گل در کشور هلند انجام می‌شود (برمر، 1994).
1086817671167گل ژربرا در رنگ‌های مختلف; زرد، صورتی، نارنجی، قرمز، سفید، کرم و بنفش یافت میشود. قطر گل‌ها 5 تا 12 سانتی متر و طول ساقه حدود 25 تا 60 سانتی متر و دارای انواع کم پَر و پُر پَراست(کافی و قهساره، 1390).
شکل 1-1- گل ژربرا

1-1-1-تاریخچه ژربرازیستگاه گونههای مهم این گل محدود به قسمت‌های شرقی آمپومالانگا و بخش‌های ایالت لیمپوپو در آفریقای جنوبی است. ژربرا در سال 1878 نزدیک منطقه باربرتون کشف شد و به همین دلیل در زبان انگلیسی به آن مینای باربرتون یا مینای ترانسوال می گویند. روبرت جیمسون این گیاه را به باغ گیاه شناسی کمبریج در انگلستان فرستاد و فردی به نام لینچ آن را کشت کرد. بر اساس گزارشات موجود این گیاه ابتدا در باغ نورویچ و سپس در باغ کیو توسط آقای تیلت به گل نشست اما اولین کسی که در اروپا موفق به دورگه‌گیری این گیاه شد، لینچ بود او این گیاه را با; Gerbera virdifolia تلاقی داد در نتیجه این تلاقی اولین ژربرا فلوریست خلق شد، این ژربرا Gerbera cantabrigiensis نام گذاری شد، لینچ واریته Brilliant را از تلاقی Natal معروف به Sir Michael Forster و Gerbera jamesonii تولید کرد، البته دو رگه‌گیری این گونه تاریخچه ای طولانی دارد با این حال به دلیل ویژگی‌های هتروزیگوتی بالا هنوز بذرهای تثبیت شده‌ای از این گیاه به دست نیامده است. لینچ، آدنت و ویل مورین هریک به طور جداگانه توانستند تغییراتی در رنگ گلهای Gerbera jamesonii که به طور وحشی می‌رویید، ایجاد کند. طبق گزارشات هیبرید های رنگی اصلاح شده توسط لینچ نسبت به واریته های فرانسوی اصلاح شده توسط آدنت بذرهای بیشتری تولید می کرد. این دو محقق در سال 1891 اولین گواهی بذر پایه را از انجمن باغبانی سلطنتی انگلستان دریافت کرداند و در سال 1904 نمونه ای از واریته‌های تولیدی را در لندن عرضه نمودند. آدنت در ریویرای فرانسه تعداد زیادی رقم به دست آورد و لینچ نیز بذرها و گیاهان خود را با وی مبادله کرد قبل از این رویداد آدنت تقریبا کارهای اصلاحی خود را با Gerbera jamesonii آغاز کرده بود و گیاهانی به رنگ قرمز کم رنگ در آفریقا تولید کرده بود وی به نتایج تلاش‌های خود اطمینان داشت و کارهای اصلاحی خود را در ریویرا مشابه باربرتون زیستگاه ژربرا ادامه داد. دییم آلمانی به همراه آدنت عهده‌دار کارهای دو رگه‌گیری شد که موفقیت آمیز بود، تا سال 1909 تلاقی های اصلاحی توسط آدنت با بیش از 3000 بار گرده افشانی هیبریدهای انگلیسی و تلاقی با گونههای آفریقایی اصلاح شده انجام شد. این ادعا با معرفی گیاهان والد و ویژگی‌های آن‌ها قابل استناد است به این ترتیب تا بهار سال 1909 تحت شرایط سخت گزینش کشت 25000 هیبرید انتخاب شده بود، در این زمان آدنت امیدوار بود حداقل پس از چند نسل بذرهای پایداری تولید شود وی در همان زمان تاکید کرد که گیاهان به طور قابل ملاحظه‌ای از نظر رنگ و شکل متنوع هستند این ویژگی امروزه کاملا مستدل شده است، بنابراین به طور قابل توجهی مانع از تولید ژربرا از طریق کشت بذر می‌شود.
در سال 1909 والتر در نشریه جدیدترین ارقام آدنت را به صورت گلهایی با اختلاف بسیار زیاد در رنگ به قطر 13 سانتی متر و طول ساقه‌هایی به اندازه 50 تا 60 سانتی متر با ماندگاری شش تا هشت روز معرفی می‌کنند، طبق گزارشات دییم عملکرد قلمه بین 36 و 60 گل در گیاه با قابلیت نگه‌داری تقریبا دو هفته ارزیابی شده است. در سال 1906 برای اولین ژربرا به خودی خود از طریق جوانه زنی بذر تکثیر شد. جینک در سال 1897 فرصتی برای ازدیاد و اصلاح ژربرا در نیویورک یافت. در پاییز 1908 رقمی به نام Gigantea به بازار معرفی شد، این گل قطری به اندازه 12 سانتی متر به رنگ سرخ و ساقه‌هایی به طول یک متر داشت تناوب گلدهی در این رقم بسیار زیاد بود و برای اولین بار در سال 1909 موفق به دریافت گواهی بذر پایه شد در این دوره زمانی ژربرا همواره به دلیل دریافت جوایز ارزشمند ملی و بین المللی توسط انجمن‌های باغبانی برای مثال در سال 1904 در شهر دوسلدرف آلمان در همان سال و 1907 در لندن، 1909 در برلین و پاریس بسیار مورد توجه قرار گرفت بیشترین جوایز در تاریخ صنعت گل کاری به اصلاح این گل اختصاص داشته است (هانسن، 1999).
1-2- تکثیر
طریقه تکثیر گل ژربرا عمدتا به سه روش انجام می‌شود: تکثیر بوسیله بذر، تقسیم بوته و کشت بافت. تقسیم بوته در اواخر بهار یا پاییز صورت می‌گیرد. نکته مهم این است که قسمت مریستمی روی خاک قرار گیرد و زیر خاک مدفون نشود. افزایش با بذر هم امکان‌پذیر است. بذرها باید تازه باشند زیرا زیوایی بذرهای مانده کاهش می‌یابد. از آنجا که ژربرا بومی مناطق گرمسیری است و حساس به سرما، بذرها برای تندش نیاز به دمای حداقل 15 درجه سانتیگراد دارند. بذرها در طی دو هفته تندش می یابند. مشکل افزایش بذری تفرقه صفات و عدم یکنواختی گل‌های تولیدی است. امروزه یکی از پرکاربردترین روش‌های افزایش ژربرا از طریق کشت بافت است (راویانت، 2009). مشاهده شده که کاشت ژربرا از اواخر اردیبهشت تا اواخر تیر ماه، گل بریدهی زیادی تولید میکند اما محصول زمستانه خوبی میتواند از طریق کاشت از مهر تا اسفند در شرایط حفاظت شده حاصل شود. برای ارقام گل درشت تراکم کاشت بهینه هشت تا ده گیاه در مترمربع است. این تراکم، نور کافی را برای گیاهان فراهم میکند. اما کاشت متراکمتر بعد از دو سال باعث کاهش عملکرد، کاهش اندازه گل و طول ساقهی گل میشود. در زمان کاشت طوقه گیاه باید در سطح خاک و کمی بالای آن قرار گیرد چون ژربرا به مقدار زیادی در سطح خاک منشعب میشود. کاشت خیلی عمیق باعث بیماری قارچی و کاشت سطحی باعث سست شدن سیستم ریشهای میشود (رشیدی، 1389).
گلدهی گیاهچههای کشت بافتی 11 تا 16 هفته بعد از انتقال آن‌ها صورت می گیرد. اولین جوانه‌های گل هنگامی که 14- 10 برگ تشکیل شدند نمایان می‌شوند. القا و تمایزیابی گلها به میزان زیادی توسط شدت نور و دما تاثیر می‌پذیرند. تقریبا در تمام طول سال گل می دهند اما روز کوتاه طبفه بندی می‌شوند. دوره گلدهی این گیاه اواخر بهار تا اواخر پاییز و اوایل زمستان است (بروهولم و همکاران ، 2008).
1-3- عملکردمیانگین متوسط تولید در حدود 160- 130 گل به ازای هر متر مربع در سال است (شرایط سایه). در گلخانه تا 200 شاخه گل هم می‌توان تولید نمود اگر همه شرایط بهینه باشد. از هر بوته می‌توان 15- 10 شاخه گل در سال برداشت کرد (راویانات، 2009).1-4- نابسامانی های فیزیولوژیک1-4-1- خمیدگی و شکستن ساقه گل این نابسامانی نتیجه رشد و بلوغ ناکافی ساقه گل می‌باشد که نهایتاً سبب افتادن ساقه می‌شود. دلایل مختلفی می‌تواند سبب بروز این حالت گردد از جمله کمبود عناصر غذایی و نسبت نامناسب آن‌ها از جمله کلسیم گاهی اوقات کاهش آبیاری و تنش خشکی یا افزایش دما به ویژه با تابش آفتاب ممکن است سبب پژمردگی و شکستن ساقه شود. آبیاری بهینه، توجه به نیازهای تغذیه‌ای گل‌ها و دمای مناسب پرورش می‌تواند سبب بهبود این حالت و جلوگیری از آن گردد.
1-4-2- پژمردگی گل نابالغپژمردگی قبل از بلوغ گل در حالیکه شاخه هنوز به گیاه متصل است و اغلب درست زمانیکه بهطور کامل توسعه یافته است، اتفاق میافتد. دلیل این مشکل احتمالا، نبود کربوهیدراتهای لازم برای دستیابی به نمو سریع گل است. این عارضه اغلب پس از یک دوره از روزهای ابری با شدت پایین نور یک روز آفتابی اتفاق میافتد. در صورت امکان باید ارقام مقاوم به این عارضه غربالگری و کشت شود (هنسان، 1985).

1-5- آفات و بیماری‌ها لارو برخی حشرات که از برگ تازه تغذیه می‌کنند، کنه (Cyclamen mite و Spider mite)، حلزون و لیسه، تریپس و شته‌ها از جمله آفات این گیاه می باشند. بیماری‌های قارچی متداول مانند: بوتریتیس، سفیدک پودری، فایتوفتورا و ریزوکتونیا هم از جمله بیماری‌های مرسوم و تهدید کننده می‌باشند (رشیدی، 1389).1-6- بیان مسالهگل‌های شاخه بریده سهم مهمی از صنعت تولید و پرورش گل‌ها و گیاهان زینتی را تشکیل می‌دهند. آنچه در رابطه با این قسمت از صنعت گل‌کاری بسیار اهمیت دارد عمر گلجایی (Vase-life) است. هر چه این ویژگی طولانی تر باشد احتمال سود دهی تولید و پرورش آن گل بیشتر می‌شود. عمر گلجایی به عوامل متعددی در طول دوره کاشت، داشت و برداشت وابسته است. اما از دیدگاه پس از برداشت، در صورت بهینه بودن شرایط تولید و همچنین تأمین دما و رطوبت مناسب برای نگهداری گل‌های شاخه بریده عمر گلجایی آن‌ها به چند عامل از جمله وجود منابع در دسترس کربوهیدرات به میزان کافی، گاز اتیلن و جمعیت باکتریایی موجود در محلول نگهداری گل‌ها بستگی دارد (رید و جیانگ، 2012). اگرچه تمام گونه‌ها به صورت یکسان تحت تاثیر این عوامل قرار نمی‌گیرند اما تمامی آن‌ها از نقطه نظر پس از برداشت مهم اند. منابع کربوهیدرات از این نظر که منبع تامین انرژی گیاه اند چون گل‌های شاخه بریده، از گیاه مادری تامین کننده جدا شده اند، گاز اتیلن از این دیدگاه که محرک و تسریع‌کننده فرآیند پیری است اگرچه ژربرا حساسیت زیادی به آن ندارد و جمعیت باکتری‌های موجود در محلول نگهدارنده و ته ساقه گل‌ها، به این خاطر که می توانند سبب گرفتگی آوندها و مرگ زودرس سلول‌های گیاهی شوند (گوپینادهان و همکاران، 2008). از طرف دیگر عنصر نیکل اثر بازدارنده بر متابولیسم کربو هیدرات‌ها، ترکیبات نیتروژن‌دار، گاز اتیلن و پاتوژن‌ها دارد (وود و ریلی، 2007).
هدف از انجام این پژوهش این بود که اثر نمک‌های مختلف نیکل بر عمر گلجایی و شاخص‌های پس از برداشت گل‌های شاخه بریده ژربرا بررسی شود و بهترین نمک با بالاترین اثر تعیین گردد.
فصل دوم
بررسی منابع

2-1- استانداردها و عوامل موثر بر عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریدهپس از برداشت گل‌های شاخه بریده آنچه اهمیت حیاتی دارد حفظ کیفیت گل میباشد. برای عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده استانداردهایی موجود است که بین نقاط مختلف دنیا مثلا در آسیا یا در اروپا متفاوت است. به هر حال، رنگ، اندازه، عطر و ظاهر گلهای شاخه بریده این استانداردها را می‌سازند که آنها هم به شرایط کشت، زمان مناسب برداشت، شرایط حمل و نقل و نگهداری پس از برداشت وابستهاند. جذب آب به میزان مناسب توسط گل شاخه بریده، تبخیر و تعرق، هدایت هیدرولیکی در آوندها همگی بر عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریده موثراند. (سیلوا، 2003).
2-1-1- متابولیسم و مسیرهای متابولیکیمتابولیسم سلولی، مجموعه واکنشها و فعالیتهای شیمیایی است که در درون سلولها رخ میدهد جذب کربن و ذخیره انرژی (فتوسنتز) و استفاده از این انرژی ذخیره شده و سوختن آن (تنفس) دو فرآیند مرکزی هستند که به طور کلی در گیاهان متابولیسم را کنترل می‌کنند (سیلوا، 2003).
پیری و ریزش
(PCD)مرگ برنامه‌ریزی شده سلول
آغازش
مرگ
رشد
بلوغ
بلوغ فیزیولوژیکی
رسیدن
تخریب غشاء
نکروزه شدن وعلایم قابل مشاهده
(پژمردگی و چروکیدگی)
آسیب سرمازدگی
1)برفرایندهای متابولیک(تنفس، سنتز پروتئینها و ...
2)نشت یونها از طریق غشاء
3)جاری شدن پروتوپلاسم
تغییرات فیزیکی در لیپیدهای غشاء
تجزیه آنزیمها و پروتئینها
اثرات
پیامدها

شکل 1-1-2- روند رشد و اثرات بروز پیری در مراحل نموگل

2-1-2- پیری، ریزش و مرگ سلولیپیری و مرگ دو فرآیند مهم در چرخه زندگی یک موجود زنده محسوب می‌شوند؛ فرآیندهایی که در طی آن مواد و ساختارهای سلولی می‌شکنند و از درون بافت در حال پیری خارج و متابولیزه می‌شوند. پیری ارگآن‌هایی مثل برگ با مرگ برنامه ریزی شده سلولی متفاوت است. سلولها در ارگانهای پیر شونده یک سری تغییرات تدریجی منظم و فروپوشاننده را تجربه می‌کنند هستهها حداقل تا آخرین مراحل تغییرات ساختاری نشان نمی‌دهند (نودن، 1997). پیری کل گیاهی، پیچیدهترین نوع پیری است که اغلب به وسیله ساختارهای زایشی القا می‌شوند. هورمون‌ها به ویژه سایتوکنین در کنترل این نوع پیری بسیار موثراند. جبرلین کنترل کننده پیری در نوک مریستم است در حالی که اتیلن باعث پیری برگ و گلبرگ‌ها می‌شوند و نهایتا سبب خشک شدن گلبرگ‌ها، ریزش گلچهها، پژمردگی و تغییرات رنگ می‌شوند (دیویس،2002).
2-1-3- پیری گلبرگهادر گلبرگ، گلهای شاخه بریده که در حال پیر شدن هستند میزان پروتئین کاهش می یابد، فعالیت آنزیم شکننده پروتئین ها یعنی پروتئاز افزایش می یابد، سیالیت غشا تغییر پیدا می کند و شدت تنفس افزایش می‌یابد (ون دورن و استید، 1997). پیری گلبرگها همراه با کاهش کیفیت مرفولوژیک، بیوشیمیایی و بیوفیزیولوژیک است. گلهای میخک در حال پیری، یک افزایش فراز گرا در تولید اتیلن نشان می دهد و قرار دادن آنها در برابر اتیلن سبب پیچیده شدن گلبرگ‌ها، آغاز افزایش سنتز اتیلن و تغییرات فیزیکی و شیمیایی در چربیهای غشای سلولی گلبرگها می‌شود (بارتولی و همکاران، 1996). داوودی یک گونه نافرازگرا است، اتیلن نقش پر رنگی در پیری گل ندارد و سبب تغییرات جزیی در غلظت پروتئین و نسبت پلی پپتیدهای غالب می‌گردد، همین موضوع علت عمر پس از برداشت طولانی داوودی می‌باشد. واکنش گل ژربرا نیز مشابه داوودی است و اتیلن تاثیر شگرفی بر پیری آن ندارد. شرایطی که سبب جلوگیری از عمل اتیلن (مثلا: کاربرد نمک‌های نقره، بنزئات سدیم، اسید بوریک) و یا سنتز آن مثلا آمینوکسی استیک اسید (AoA) و نمک‌های نیکل گردد می تواند به طور بالقوه سبب افزایش عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریده و به ویژه گونههای فراز گرا گردد (سیلوا، 2003).
2-1-4- آب و نقش آن در عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریدهکیفیت آب، برای نگهداری گلهای شاخه بریده بسیار اهمیت دارد. تأمین دایمی آب، که در زمان برداشت گل منقطع می‌شود، برای نمو فیزیکی گل شاخه بریده موثر است. بخشی از نمو فیزیکی، به وسیله فشار تورژسانس مثبت میسر می گردد که سبب انبساط سلول و پشتیبانی آن‌ها می‌شود. پتانسیل آب از فشار تورژسانس و پتانسیل اسمزی تشکیل می‌شود. در گیاهان در شرایط عادی (در حال رشد روی ریشه‌های خود) آب موجود در آوند چوبی تحت تنش است به علت کشش حاصل از تبخیر و تعرق که آن هم حاصل افزایش دما و کاهش رطوبت نسبی می‌باشد. آب از آوند چوبی در اثر شیب اسمزی به درون سلول‌ها وارد می‌شود. اگر پتانسیل آب سلول از پتانسیل آب سلول‌های مجاور کمتر باشد از این سلول‌ها آب بیرون کشیده می‌شود که نتیجه آن چروکیدن و جمع شدن سلول است (سیلوا، 2003). در سطح مولکولی/ بیوشیمیایی پروتئین‌های آکواپورین که سبب جریان دو طرفه آب در غشای سلول بافت‌ها و حتی ارگان‌ها می‌شوند در عمر پس از برداشت گلها موثراند (تایرمن، 1999). آب تمیز و خالص از پیش نیازهای عمر پس از برداشت بهینه گلهای شاخه بریده است. کاهش کیفیت و عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده ممکن است به وسیله انسداد آوندهای چوبی رخ دهد. از دلایل آن موارد زیر می‌باشد: رشد میکروبی، رسوب موادی مثل ترکیبات موسیلاژی در حفرات دستجات آوند چوبی، ایجاد تیلوز (ساختاری شبیه بالون که به وسیله رشد سلول‌ها در مکانهای ارتباط سلول‌های آوندی ایجاد می‌شوند)، وجود حباب هوا درون سیستم آوندی، پاسخ‌های فیزیولوژیک ساقه به برش و مرگ برنامه‌ریزی شده سلول (ون دورن و کروز،2000).

2-1-5- میکرو ارگانیسم ها در محلول نگهداری گلها
آب خالصی که در گلدان نگهداری وجود دارد بعد از مدتی به وسیله باکتری‌ها یا قارچ‌ها که روی بافت گیاهی وجود دارد و تکثیر می‌شوند، آلوده می‌گردد. ارگانیسم‌ها سبب تولید یا القای ترکیباتی مثل تانن‌ها در آوندها می‌شود که همین موضوع سبب انسداد آوندی می گردد. برای جلوگیری از چنین پدیده‌ای، در پژوهشهای مختلف مواد متفاوتی آزمایش شدهاست. از جمله مواد تست شده که سبب بهبود عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده از جمله ژربرا میشوند شامل: تیوسولفات نقره، دیکلروفن، ترکیبات آمونیوم چهارظرفیتی، 8- هیدروکسی کینولین سیترات و ترکیبات کلاته کننده می‌باشد (ایشیمورا، 1999).
لیو و همکاران (2000) نشان دادند که کاربرد 2/0 میلی مولار از تیو سولفات نقره STS)) برای دو ساعت در حدود ده روز طول عمر گلهای شاخه بریده رز را افزایش داد. محمودی و همکاران (2012) نشان دادند که کاربرد کلرید کبالت در غلظت‌های 200، 300 و 400 میلی گرم بر لیتر می‌تواند سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای مریم شود آن‌ها نتیجه گرفتند که کاربرد کلرید کبالت در غلظت 300 میلی گرم بالاترین اثر را بر افزایش عمر پس از برداشت گلها، جذب آب و کاهش وزن تر داشت. منشی‌زاده و همکاران (2011) گزارش کرده‌اند که کلرید کبالت می‌تواند سبب کاهش زردی گلچههای گل مریم و پژمردگی آنها شود.
کاربرد نمک سیلیسیم (K2SiO3) با غلظت‌های 100، 150 و 200 میلی گرم بر لیتر سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده میخک گردید (جمالی و راحمی،2011 ). یکی از دلایل، شاید افزایش مقاومت غشای سلولی به وسیله ته نشین شدن سیلیسیم در آن باشد. این عنصر این توانایی را دارد که با ترکیبات آلی درون دیواره سلولی کمپلکس تشکیل بدهد و به این وسیله غشای سلولی در برابر آنزیم های تخریب کننده مقاومت بیشتری می‌یابند (سیندر و همکاران، 2007). کتسا و همکاران (1994) گزارش کردند که استفاده از نیترات نقره درمحلول نگه دارنده گل شاخه بریدهارکیده بهعنوان عامل ضد میکرب عمل میکند. اضافه نمودن نیترات کلسیم به محلولهای محافظ طول عمر دو رقم رز را یک تا سه روز افزایش داده و شکوفایی غنچهها را بهبود بخشید. همچنین محلول های حاوی دو میلی مول در لیتر کلسیم از هر دو منبع کلرید کلسیم و نیترات کلسیم باعث افزایش ماندگاری رز رقم ایلوانا گردید (ادریسی،1387). مقایسه اثر نمک های معدنی مختلف نشان داد که ترکیبات مس بویژه نیترات مس بیشترین تاثیر را روی کیفیت وماندگاری میخک دارد (ادریسی، 1384). استفاده از تیمارهای موقت سولفات مس، هیدروکسی کینولین سولفات و کلرید کبالت بیشترین تاثیر را بر کیفیت گل شاخه بریده میخک داشتند و تیمار کلرید کبالت بیشترین طول عمر را نیز به دنبال داشت (ادریسی و همکاران، 1382). کاظمی و همکاران (2012) تاثیر سیلیکون و نیکل و استیل استیک را بر عمرگلجایی رز بررسی کردند و نتیجه گرفتند که بر افزایش طول عمر گل شاخه بریده تاثیر مثبت دارد و باعث افزایش طول عمر می‌شود. مورالی و ردی، (1992) نشان دادند که کاربرد عناصر کبالت، کلسیم، روی و نیکل به همراه محلول ساکاروز دار سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده گلایول می‌گردد. تیمار کوتاه مدت جیبرلیک اسید با غلظت 50 میلیگرم بر لیتر به همراه محلول نگهدارنده اتانول 5/2 درصد و ساکارز سه درصد بیشترین تأثیر را بر خصوصیات کیفی و دوام عمر گل ژربرا داشت. همچنین، کاربرد مکرر اتانول نسبت به کاربرد اتانول فقط در ابتدای آزمایش، نتایج بهتری را درخصوص افزایش دوام عمر و خصوصیات کیفی گل ژربرا به همراه داشت (دانایی و همکاران، 1390). گلهای شاخه بریده مریم که در محلول ساکارز و کلرید نیکل قرار گرفته بودند عمر پس از برداشت طولانی تری نسبت به نمونه های کنترل داشتند (ردی و همکاران، 1997(.
2-2- نیکلحدود ششصد میلیون سال پیش، عناصر اصلی تشکیل‌دهنده اتمسفر کره زمین گازهای احیا کننده مانند هیدروژن، آمونیاک و متان بود. در این دوره، نیکل نقش مهمی در سوخت و ساز و موفقیت پروکاریوت‌های اولیه داشته است اما شرایط به آرامی به سمت ایجاد یک اتمسفر اکسنده تغییر یافت. این تغییر باعث جایگزین شدن عناصر روی، آهن، منگنز و مس به جای نیکل، وانادیوم و تیتانیوم گردید (وود و رایلی، 2007). در سال‌های اولیه قرن بیستم، نیکل به صورت جزئی از خاکستر گیاهی کشف گردید و شک و تردیدها در رابطه با این موضوع که نیکل نقشی در فرآیندهای متابولیکی گیاه دارد، به طور دائم وجود داشته است (بایی و همکاران، 2006). بین عناصر ضروری برای گیاهان، منحصر به فرد است به این دلیل که نقش‌های متابولیکی آن مدتی قبل از اثبات ضروری بودن این عنصر برای گیاهان مشخص شد (براون، 2007). احتمال ضروری بودن نیکل برای رشد گیاه زمانی مشخص گردید که در سال ١٩٧۵ پژوهشگران متوجه شدند که اوره آز، آنزیمی که به صورت عمومی درون گیاهان وجود دارد، برای فعال شدن نیازمند عنصر نیکل است. در واقع نیکل جزئی از آنزیم اوره آز است. به زودی مشخص شد که نیکل، برای حبوبات ضروری است (اسکیو و همکاران، 1984) و سپس برای برخی از غلات مناطق معتدله نیز ضروری بودن نیکل به اثبات رسید (براون و همکاران ، 1990). ضروریت این عنصر برای گیاهان عالی به وسیله براون و همکاران (1987) پیشنهاد شد. امروزه این عنصر به عنوان یکی از عناصر ضروری برای زندگی گیاهان شناخته می‌شود (مارشنر، 1999 ؛ سیرکو وبردزیک، 2000 ؛ گرداس و همکاران، 1999).
2-2-1- نقش نیکل در متابولیسم گیاه
در گذشته اوره آز تنها آنزیمی بود که برای نیکل، درون گیاه نقش یک عنصر "ضروری" را توجیه می‌کرد در حال حاضر هفت آنزیم نیکل‌دار مشخص شده است که دو عدد از این آنزیم‌ها (اوره آز و گلوسیلاز) فعالیت اکسایش/ احیا ندارند و پنج آنزیم دیگر در واکنش‌های اکسایش/احیا دخالت دارند شامل: متیل کوانزیم، ام ردوکتاز، نیکل سوپر اکسید دسموتاز، کربن مونو اکسید دهیدروژن، استیل کوانزیم آ سنتازو هیدروژناز (براون، 2007). این پیشنهاد که آنزیم‌های دیگری که حاوی نیکل هستند یا پروتئین‌های نیکل‌دار، درون گیاهان عالی وجود دارد با توجه به مشاهداتی بیان شده است که برخی از آنزیم‌های باکتریایی مشابه‌های موازی در گیاهان و حیوانات دارند، اما بر عکس علم آنزیم‌شناسی در باکتری‌ها، این شاخه علمی درون گیاهان هنوز در مراحل ابتدایی به سر می‌برد، پس به احتمال زیاد در آینده نزدیک آنزیم‌های دیگری درون گیاهان عالی کشف می‌شود که حاوی نیکل‌اند یا دست کم به نیکل نیازمند هستند.
2-2-1-1- یوروید
گیاهان عالی قسمت قابل توجهی از ترکیبات نیتروژن‌دار خود را به صورت یوروید یا آمید نقل و انتقال می‌دهند (شوبرت و بولوند، 1990). داده‌ها نشان می‌دهد که گونه‌های انتقال دهنده یوروید مانند گردوی آمریکایی نسبت به آنهایی که ترکیبات آمید انتقال می‌دهند نیاز به نیکل بالاتری دارند (وود ، 2006)، بنابراین این احتمال افزایش می‌یابد که گونه‌های انتقال دهنده یوروید ممکن است آنزیم‌های دیگری داشته باشند که نیازمند حضور نیکل باشد. حبوبات نواحی گرمسیری مانند سویا و همچنین گیاهانی مثل گردوی آمریکایی از جمله گیاهان انتقال دهنده یوروید هستند. اگرچه، اطلاعات چندانی در مورد کاتابولیسم و آنابولیسم یوروید درون گیاه موجود نیست (بایی و همکاران، 2006).
به نظر می‌رسد که متابولیسم یوروید در درجه اول درون تاج گیاه و میوه‌ها رخ می‌دهد (پیت و آتکینسن،1983). نتیجه نهایی کاتابولیسم یوروید تشکیل اوره و گلی اکسالیت است. پس با توجه به تولید این دو ماده، به نظر می‌رسد که حضور نیکل روی دسترسی گیاه به منابع نیتروژن ذخیره خود اثر گذار و حیاتی است. به طور کلی مسیر یوروید مهمترین مسیر برای حرکت نیتروژن از ریشه‌ها به نقاط رشد گیاه است پس نیکل برای تبدیل شکل ذخیره شده نیتروژن در دوران قبل از خفتگی ضروری است (بایی و همکاران ، 2006). مثال‌هایی از چندین جنس انتقال‌‌دهنده یورید: افرا ، توس، ممرز، گردوی امریکایی، ارغوان، چنار و بید.
2-2-2- افزایش شاخص‌های رشدپژوهش‌های ابتدایی برای مشخص کردن پاسخ‌های رشدی در گندم، سیب‌زمینی و باقلا با محلول پاشی برگی نیکل انجام گرفت که این تیمار اثرهای مثبت و افزایش‌دهنده‌ای بر فرآیندهای کلی رشد داشت (ولچ،1981 ؛ دوبرولیوبسکیو اسلاو ، 1957 ؛ روچ و بارکلی، 1946). بعد از کشف نیکل به عنوان جزئی از آنزیم اوره آز پژوهش‌های زیادی انجام شد که نشان‌دهنده نقش مثبت کاربرد نیکل بر رشد گیاه، افزایش سلامت غذایی، تندش بذر و عملکرد نهایی بوده است. موردی و آلی، (1999) در پژوهش خود نشان دادند که افزودن ٢۵ و ۵٠ میلی‌گرم نیکل به هر کیلوگرم خاک رس به صورت معناداری سبب افزایش عملکرد سبزی جعفری و کیفیت آن (سطح برگ٬ غلظت عناصر معدنی، عملکرد روغن و مزه) گردید و همچنین برگ‌ها برای مصرف توسط انسان سالم‌ترند زیرا غلظت نیترات و آمونیوم کمتری دارند. نیکل می‌تواند باعث افزایش عملکرد میوه و کیفیت آنها در گوجه فرنگی گردد (اوزو و همکاران ، 1999 ؛ پالاکویز و همکاران 1999، راو و شانتارون، 2000) نیکل اثر مثبتی بر افزایش وزن خشک گیاه گوجه فرنگی و غلظت آهن، روی و منگنز دارد.
گاد و همکاران (2007) نشان دادند که ٣٠ میلی‌گرم نیکل به ازای هر کیلوگرم خاک باعث افزایش عملکرد گوجه فرنگی می‌گردد، همچنین کیفیت ظاهری، در صد مواد جامد محلول و پارامترهای فیزیکی (طول، قطر،وزن، وزن خشک) را بهبود بخشید افزون بر این میوه‌ها میزان نیترات کمتری داشتند که باعث سلامت بیشتر میوه‌ها می‌گردد. شواهد موجود نشانگر اثر مثبت نیکل روی تندش بذرهاست؛ اندروود (1971) نشان داد که خیساندن بذرها پیش از کشت در محلول سولفات نیکل اثر معناداری بر افزایش تندش بذرهای نخود، لوبیا، گندم و کرچک دارد. ولف و برتراند (1973) نشان دادند که سولفات نیکل، اثرات مفیدی بر تندش بذر لوپن سفید دارد. غلظت‌های پایین نیکل می‌تواند تندش بذر ارقام جنس ارغوان را تحریک کنند و روی رشد دانهال حاصل از آن اثر مثبت دارد (سین، 1984). براون و همکاران، (1987) نشان دادند که بذرهای جو که در آنها نیکل حذف شده بود توانایی تندش را حتی در حضور منبع نیتروژنی به غیر از اوره نداشتند. تندش بذرهای تیموتی به وسیله غلظت‌های پایین نیترات نیکل تحریک می‌گردد (ویر، 1998). گزارش شده است که برگ گیاهان جنس آلیسوم که انباشتگر نیکل هستند هنگامی که خزان می‌کنند و می‌ریزند مانع از رشد گیاهان رقابت کننده می‌گردند (لان‌ژان و همکاران، 2007). مشاهده شده است که ٢ میلی‌گرم بر لیتراز نیترات نیکل یا سولفید نیکل باعث سرعت بخشیدن به تندش بذرهای گندم گردیده است (سنگار و همکاران، 2008).

2-2-3-تاثیر نیکل بر عمر پس از برداشتیون‌های نیکل اثر ممانعت کنندگی بر 1- آمینو سیکلوپروپان-1-کربوکسیلیک اسیداکسیداز (آ- سی-سی اکسیداز) دارد به این صورت که Ni2+ یک کمپلکس فلز- آنزیم می‌سازد (اسمیت و وودبرن، 1984). در یک مطالعه دیگر، محلول یک دهم درصد وزن در حجم از کلرید نیکل روی کاسه گل خرمالو رقم ‘Saijo’ دو مرتبه قبل از برداشت، محلول پاشی گردید. تیمار نیکل به گونه‌ای موثر جلوی نرم شدن میوه را گرفت و عمر انباری آن را افزایش داد که علت آن جلوگیری از تجمع ACC و تشکیل اتیلن بود (ژن و همکاران، 2006). اثر محدودکننده‌ای که نیکل بر تولید اتیلن درون گیاهان دارد، از این عنصر انتخابی مناسب برای بهبود عمر پس از برداشت محصولات باغبانی می‌سازد به ویژه در گل‌های بریدنی، که بدون نگرانی از تجمع این عنصر در غلظت‌های سمی می‌توان آن را به کار برد.
تیمار گل‌های میخک سولفات نیکل با غلظت 45 میلی گرم بر لیتر، توانست به گونه ای معنادار سبب بهبود عمر پس از برداشت آن‌ها در مقایسه با نمونه های شاهدگردید. بررسی ها نشان دادند که این گل‌ها به گونه ای معنادار اتیلن کمتری تولید کرده بودند و همین موضوع سبب بهبود عمر پس از برداشت آن‌ها گردید (جمالی و راحمی، 2011). همچنین کاظمی وعامری، (2012) گزارش کردند که کاربرد عنصر نیکل بر روی گلهای سوسن، سبب بهبود عمر پس از برداشت و شاخص‌هایی مثل نشت آنتوسیانین در آن‌ها گردید. از طرف دیگر عنصر نیکل اثر ممانعت کنندگی بر رشد پاتوژن ها دارد (کار و میشرا، 1974؛ گراهام و همکاران، 1985). پس به طور کلی نیکل با تاثیر گذاری بر عوامل مهمی مثل غلظت کربوهیدرات‌ها، تولید اتیلن و جمعیت پاتولوژی می تواند سبب بهبود عمر پس از برداشت گل‌ها شود.
2-2-4- علائم کمبود عنصرنیکل در گیاهان
بر اساس گونه، نیاز گیاه به نیکل جهت تکمیل چرخه رشد طبیعی در خاک‌های بدون آلودگی در حدود ٠۵/٠ تا ۵ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک گیاهی متغییر است (براون، 2007)، اما گیاهان انتقال دهنده یوروید نیاز بالاتری دارند تا حد ۵٠ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک (بایی و همکاران، 2006). در کمتر از این غلظت‌ها، نکروزه شدن نوک برگ‌ها به ویژه در خانواده لوبیا ممکن است رخ بدهد علت آن هم کاهش فعالیت آنزیم اوره آز و تجمع اوره در سطوح سمی در داخل گیاه است (اسکیو و همکاران، 1984). در برخی موارد، علائم کمبود می‌تواند شامل کاهش رشد ریشه و شاخساره باشد. کمبود نیکل می‌تواند باعث القای بیماری (گوش موشی) در درختان گردوی آمریکایی (پیکان) گردد، این بیماری یک نابسامانی فیزیولوژیکی است که در اثر کمبود نیکل در درختان گردوی آمریکایی ایجاد می‌شود. علائم این نابسامانی شامل تاخیر در باز شدن و کاهش سطح برگ، شکفتن جوانه‌ها به صورت ضعیف، زرد شدن برگ‌ها، ایجاد حالت کپه‌ای و بافت مردگی در نوک برگ‌ها. استفاده از کودهای حاوی نیکل در زمان مناسب (اواخر پاییز یا در اوایل بهار) با غلظت کافی سبب درمان این ناهنجاری و همچنین فرم شدید این بیماری که به نام بیماری واکاری باغ نامیده می‌شود می‌گردد (وود و همکاران، a2004). شیوع بیماری در نسل دوم باغ‌های جنوب شرق ایالات متحده افزایش یافته است، این بیماری هنگامی ظاهر می‌شود که نشاهای جوان در مکان‌هایی که قبلا باغ گردوی آمریکایی بوده است دوباره کشت می‌شوند. احتمال دارد وجود مقادیر زیادی عنصر روی و مس در خاک نیز سبب ایجاد این بیماری گردد. تجمع این فلزات در طی سال‌ها می‌تواند سبب از دسترس خارج شدن نیکل گردد و فرم شدید یا متداول این نابسامانی را سبب گردد. در حالت شدید، درخت دارای رشد بسیار کند، تاج کم پشت است و در نهایت مرگ درخت نیز ممکن است رخ دهد (وود و ریلی، 2007). همچنین از آن‌جا که نیکل اثر مستقیم یا غیر مستقیم روی متابولیت‌های ثانویه گیاه دارد، روشن است که احتمال حمله عوامل بیماری‌زا و آفت‌ها در کمبود نیکل گسترش می‌یابد. کمبود نیکل می‌تواند به صورت غیر مستقیم روی نقل و انتقال انرژی درون گیاهان موثر باشد (بایی و همکاران، 2006؛ وود و همکاران،b 2004).
2-2-5 - تجمع و سمیترشد بسیاری از گیاهان در غلظت‌های بیش از ۵٠ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک گیاهی نیکل صدمه می‌بیند. این اثرات در سطوح مرفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی بروز می‌کند و ممکن است به علت اثر مستقیم سمیت این عنصر باشد یا ممکن است ناشی از رقابت نیکل با سایر عناصر ضروری مانند کلسیم، منیزیم، آهن، و روی باشد و در نهایت موجب ایجاد کمبود مصنوعی و ثانویه آن‌ها گردد (اندرسون و همکاران، 1973). در مراحل ابتدایی سمیت نیکل نشانه‌های چشمگیر و روشن بروز نمی‌کند اما رشد ریشه و شاخساره ممکن است کند گردد (براون،2007). در حالت سمیت شدیدتر نیکل، زرد شدن برگ‌ها از گوشه‌ها که به سمت مرکز پیش می‌رود رخ می‌دهد که سپس قسمت‌های زرد نکروزه می‌شوند و در نهایت احتمال دارد گیاه از بین برود (براون، 2007). نیکل می‌تواند درون گیاهان تجمع یابد که در اغلب موارد کمتر از ١/٠ درصد وزن خشک گیاه است اگرچه گیاه Sepertia accuminata می‌تواند بیش از این میزان نیکل را تجمع بدهد (لی و همکاران، 1987).
در طی دوران رویشی، بیشتر نیکل به سمت برگ‌ها منتقل می‌شود و در آن‌ها تجمع می‌یابد اگرچه در زمانی که برگ‌ها به سمت پیری می‌روند بیشتر نیکل به علت خاصیت تحرک دوباره به سمت بذرها منتقل می‌شوند این مورد برای سویا (کاتاکلو و همکاران، 1987) و میمولوس (تیلستون و مکنیر، 1991) گزارش شده است. پراساد و همکاران، (1997) نشان دادند که نیکل درسنبل آبی قابلیت تجمع دارد. همچنین گیاه خردل هندی به عنوان یک گیاه انباشتگر مهم نیکل در نظر گرفته می‌شود (سین و همکاران، 2001). گیاهان دیگری نیز به عنوان تجمع‌دهنده نیکل در نظر گرفته می‌شوند مانند: گیاه سوییس وآلیسوم (کانینگهام و همکاران، 1995)، Sepertia acuminata (انسلس و همکاران، 1997) و سنبل آبی (سین و همکاران، 2001).
مرحله رشد و اندام در امر تجمع نیکل درون گیاهان موثراند. در درخت بلوط، در طی ٧٠ روز بعد از تندش بذر میزان نیکل به سرعت در طی ٣٠ روز اول افزایش یافت اما بعد از آن دچار کاهش آرام گردید (جم، 1968). دلیل دیگر این نوسان در تجمع نیکل، احتمالاً به علت فعالیت ریشه‌ها می‌باشد؛ سیستم جذب کننده نیکل و یا فعالیت متابولیکی بافت تجمع دهنده فلز درون بافت گیاهی نیز می‌توانند روی این امر تاثیرگذار باشد. در گیاه ذرت، برگ‌های جوان‌تر نسبت به برگ‌های پیرتر حاوی نیکل بالاتری هستند (مکلین و دکر، 1978). در گیاهان پامچال، شبدر سفید، الودیاو برگ عبائیعنصر نیکل در ابتدا در برگ‌ها و بعد در گل‌ها تجمع می‌یابد (راف و همکاران، 1991). تغییر فصلی در تجمع نیکل درون گیاه نیز گزارش شده است به عنوان مثال در گیاه پیچک نیلوفر (سنگارو همکاران، 2008).

فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- مواد گیاهیدر خرداد ماه سال 1392 گلهای شاخه بریدهی ژربرا که در مرحلهی تجاری (دارای دو ردیف گلچهی خارجی باز شده) برداشت شده بودند، از گلخانهای در تهران تهیه و بلافاصله برای انجام تیمار و ارزیابی صفات به آزمایشگاه پس از برداشت دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت منتقل شدند (شکل 3-1). گلها روی ارتفاع 50 سانتیمتری باز برش شده و هر چهار شاخهی گل در گلدانهای پلاستیکی به حجم دو لیتر قرارداده شدند، سپس به مقدار مورد نیاز تحت تیمار قرار گرفتند.

شکل 3-1- طریقه بسته‌بندی گلهای شاخه بریدهی ژربرا پس از برداشت
3-2- نوع طرح آزمایشیاین مطالعه بر پایه طرح کامل تصادفی با 10 تیمار شامل نیکل در سه سطح (10، 20 و 30 میلی گرم در لیتر)، سولفات نیکل و نیترات نیکل هر کدام در سه سطح (10، 30 و50 میلی گرم در لیتر) و شاهد (آب‌مقطر) با سه تکرار و در مجموع 30 پلات و در هر پلات 4 شاخه گل و در مجموع 120 شاخه گل انجام شد. تیمار به صورت پالس (به مدت 24 ساعت) و در شرایط فوتوپریود 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی بود که که توسط نور لامپهای فلورسنت سفید تامین میشد. شدت نور 12 میکرومول بر ثانیه متر مربع ، دمای 2±20 و رطوبت نسبی 60 تا 70 درصد بود و صفاتی از قبیل عمر گلجایی، کاهش وزن تر، درصد وزن خشک، جذب آب شمارش باکتریهای ته ساقه و محلول نگه دارنده، کاهش مواد جامد محلول در آب ((TSS و قطر گلها، پروتئین و کارتنوئید گلبرگ‌ها و فعالیت آنزیم های سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز اندازه‌گیری شد.
شکل3-2- چیدمان طرح آزمایشی
3-2-1- نحوه آمادهسازی گلها و انجام تیمارابتدا شاخه‌های ژربرا به طول 52 سانتی‌متر به صورت مورب در داخل آب 38 درجه سانتی‌گراد بریده شدند. گل‌ها با برچسب، کدگذاری شده و پس از توزین با ترازوی دیجیتال، در گلدان‌های پلاستیکی حاوی 250 میلی لیتر از تیمار های محلول نیکل با 3 سطح (10 و 20 و 30 میلی گرم در لیتر ) و نیترات نیکل در سه سطح (10 و 30 و 50 میلی گرم در لیتر) و سولفات نیکل در 3 سطح (10 و 30 و 50 میلی گرم در لیتر) به حالت پالس قرار گرفتند).برای تهیه محلول نیکل مقدار مورد نظر را در یک سی سی حلال اسید نیتریک غلیظ بر روی گرمکن با هم زدن مداوم حل شد. سه گلدان نیز به عنوان شاهد با 250 سی سی آب مقطر خالص در هر تکرار یکی قرار دادیم. پس از 24 ساعت گلها به گلدآن‌های محلول های تیمار مداوم حاوی 500 میلی لیتر محلول 3% ساکارز و 200 میلی گرم در لیتر هیدروکسی کینولین منتقل شدند .
در طول دوره آزمایش به منظور جلوگیری از انسداد آوندی هر سه روز یک بار عمل باز برش انتهای ساقه به اندازه یک سانتی‌متر درون آب 38 درجه سانتی‌گراد انجام شد.
3-2-2- معرفی تیمارهاده تیمار مورد استفاده به قرار زیر بودند:
شاهد یا (کنترل) : آب مقطر (10):Ni عنصر نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر N1
(20):Ni عنصر نیکل با غلظت 20 میلی گرم در لیتر N2
(30):Niعنصر نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر N3
(10)4:NiSOسولفات نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر SN1
(30)4:NiSO سولفات نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر SN2
(50)4:NiSOسولفات نیکل با غلظت 50 میلی گرم در لیتر SN3
(10)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر NN1
(30)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر NN2
(50)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 50 میلی گرم در لیتر NN3

3-3- اندازهگیری صفات3-3-1- طول عمر گلجاییبرای ارزیابی طول عمر گلجایی و پایان نگهداری گلهای بریده ژربرا، معیار اصلی پیچش گلبرگها و پژمردگی ظاهری گلها بود. بنابراین طول عمر هر یک از چهار شاخه گل موجود در محلول گلجا که طول عمرهای متفاوتی داشتند، اندازهگیری شده و از آنها میانگین گرفته شد. این عدد به عنوان طول عمر گلجایی آن تیمار در نظر گرفته شد.
3-3-2- کاهش وزن تر با توجه به میزان وزن تر اولیه گل‌ها، وزن تر نهایی گل‌ها، وزن باز برش‌ها و وزن ریزش‌گلبرگ‌ها، مقدار کاهش وزن تر بر حسب گرم به ازای هر شاخه گل طبق رابطه زیر محاسبه شد(شکل 3-2):
(وزن ریزش‌ها + وزن باز برش‌ها + وزن تر نهایی) – وزن تر اولیه = کاهش وزن تر

شکل 3-3- اندازه گیری وزن تر شاخه گل
3-3-3- درصد ماده خشکپس از پایان عمر گلجایی هر گل، وزن تر آن اندازه گیری شد و دو شاخه در آون در دمای 70 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. پس از اطمینان یافتن از خشک شدن، گل‌ها با ترازوی دیجیتال توزین شدند. درصد ماده خشک از رابطه زیر محاسبه شد:
100 × (وزن تر گل‌ها در روز آخر ÷ وزن خشک) = درصد ماده خشک
3-3-4- قطر گلها با کمک کولیس دیجیتال یک روز در میان اندازه گیری شد.
43561088265
شکل 3-4- اندازه گیری قطر گلها3-3-5-کاهش مواد جامد محلول در آب (TSS)برای اندازه گیری میزان مواد جامد محلول در آب از باز برش های انتهای ساقه استفاده شده است. یک یا دو قطره از عصاره باز برش‌ها روی صفحهی شیشهای رفراکتومتر دستی (مدل N-1α ساخت شرکت ATAGO کشور ژاپن) ریخته و میزان قند آن هر دو روز یک بار اندازه گیری شد. تفاضل بین اعداد به دست آمده از اندازه گیری میانگین درصد قند روز دوم و میانگین درصد قند روز آخر عمر گلجایی به عنوان میزان کاهش درصد قند در ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا در نظر گرفته شد.

شکل3-5- رفراکتومتر دستی (مدل N-1)3-3-6- محتوای پروتئین گلبرگ949960677545برای اندازه گیری میزان پروتئین در گلبرگ‌های گل شاخه بریده ژربرا در تیمارهای مختلف در روز پنجم آزمایش یک شاخه از هر پلات خارج شده و جهت استخراج پروتئین، از روش برادفورد ( 1976) استفاده شد.
شکل 3-6- اندازه گیری پروتئین گلبرگ3-3-7 - رنگیزه کاروتنوئید گلبرگدر روز پنجم آزمایش یک شاخه گل از هر پلات جهت اندازه گیری کاروتنوئید خارج شد. گلبرگ‌ها را خشک کرده و رنگیزه کاروتنوئید از روش مزومدار و مجومدار(2003) اندازه گیری شد.

شکل 3-7- اندازه گیری رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ3-3-8- جذب آب
با توجه به حجم اولیه محلول گلجای (500 میلیلیتر) و میزان تبخیر اتاق و کاهش حجم محلول گلجای، جذب آب از فرمول زیر میباشد:
(مقدار تبخیر اتاق در همان روز+ محلول باقیمانده در پایان عمر گلجایی) – 500 = جذب آب3-3-9- شمارش باکتری ساقه و محلول گلجاینمونهگیری از انتهای ساقه و محلول گلجایی 24 ساعت پس ازشروع آزمایش انجام و شمارش باکتری به روش لویی و همکاران (2009) انجام شد.
3-3-10- فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)برای سنجش فعالیت سینتیکی آنزیم POD از روش یین و همکاران (2007) استفاده گردید. 450 میکرولیتر محلول H2O2(225 میلیمولار) و 450 میکرولیتر محلول گایاکول (225 میلیمولار) با هم مخلوط گردید و به آن 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه و تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر دنبال شد. در محلول بلانک به جای عصاره آنزیمی، 100 میکرولیتر از بافر فسفات 50 میلی مولار (7pH=) استفاده شد.
3-3-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز (SOD)
فعالیت SOD به روش اسپکتروفتومتری و با استفاده از روش ژیا نوپلتیس و رایس(1977) و با کمی تغییر اندازه‌گیری شد. نمونه‌های بافت در داخل یک هاون و در حضور نیتروژن مایع آسیاب شد و به دمای 80- منتقل شد. مقدار 5/0 گرم از بافت منجمد شده‌ با یک میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 5/0 مول، 1/0 گرم پلی‌وینیل پولی‌پیرولیدین (PVPP) و pH 7 رقیق شد. پس از هموژنایز کردن، نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با دور 14000 در دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول رویی به آرامی برداشته شد و با ریختن در تیوب بلافاصله به دمای 80- تا اندازه‌گیری فعالیت منتقل شد.
محلول واکنش شامل EDTA 1/0 میلی مولار، بافر فسفات 50 میلی مولار، متیونین13 میلی مولار وNBT 75 میکرومولار و ریبوفلاوین دو میکرومولار (مجموعا به یک میلی‌لیتر) و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. تیوب‌های حاوی محلول واکنش به مدت 15 دقیقه درحالی‌که به آرامی شیکر می‌شدند در معرض نور فلورسانس (یک عدد لامپ فلورسانس حدود 400 لوکس) و دمای 22 درجه‌سانتی‌گراد قرار گرفتند. واکنش با انتقال تیوب‌ها به شرایط تاریکی متوقف شد و سپس جذب نمونه‌ها در طول موج 560 نانومتر قرائت شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم علاوه بر کووت‌های نمونه و بلانک از کووت شاهد نیز استفاده شد، که محتوای واکنشی نمونه بلانک و شاهد مشابه نمونه‌ی اصلی است با این تفاوت که هر دو نمونه مذکور فاقد آنزیم بودند. لازم به ذکر است که نمونه‌ی کنترل به همراه نمونه‌ها در معرض نور قرار می‌گیرد و نمونه‌ی بلانک در تاریکی قرار داده می‌شود. میزان جذب نمونه‌ها در طول موج 560 نانومتر خوانده شد.
3-4- تجزیه و تحلیل داده‌هاداده‌ها ابتدا در نرم افزار Excel ثبت شدند، سپس تجزیه و تحلیل آن‌ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و مقایسه میانگین‌ها بر اساس آزمون Tukey در سطح پنج درصد، انجام شد. رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel انجام گرفت.
فصل چهارم
نتایج

4-1- عمر گلجاییبررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارها اثر معناداری در سطح یک درصد برعمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول 4-1). نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌ها نشان می‌دهد که کاربرد عنصر نیکل به تنهایی نتوانست سبب افزایش معناداری در عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا گردد، در حالی که کاربرد سولفات نیکل و نیترات نیکل سبب بهبود عمر گلجایی و افزایش معنادار این شاخص نسبت به نمونه‌های شاهد گردید همان طور که ملاحظه می‌شود حداکثر عمر گلجایی (11 روز) در کاربرد نیترات نیکل به غلظت 50 میلی گرم در لیتر به دست آمد. اگر چه تیمار سولفات نیکل سبب افزایش معناداری در عمر گلجایی گل‌های ژربرا گردید اما تفاوت معناداری بین سطوح مختلف سولفات نیکل وجودنداشت (شکل 4-1).
7.61c
6.89c
7.05c
7.22c
9.72b
10b
10.32ab
10.5ab
11a
9.92b
عمر گلجایی(روز)
32385125095
تتیما
تیمارها
نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
شکل 4-1- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا
4-2-کاهش وزن تازه گل133352436495همان طور که در شکل 4-2 آمده است، سطوح مختلف تیمار نیکل به تنهایی سبب افزایش یا کاهش معناداری در تغییر وزن تازه در گل‌های ژربرا نگردیدند. اما به طور کلی براساس نتایج حاصل از تجزیه واریانس، تیمارها اثر معناداری در سطح یک درصد بر میزان کاهش وزن تازه گل‌های شاخه بریده ژربرا نسبت به شاهد داشته‌اند (جدول 4-1) سطوح مختلف تیمارهای سولفات و نیترات نیکل سبب کاهش کمتر در این شاخص گردیدند. یا به عبارت دیگر کاربرد هر یک از نمک‌های نامبرده سبب ثبات بالاتر وزن تازه گل‌ها شدند. بهترین نتیجه از کاربرد نیترات نیکل به غلظت 30 میلی‌گرم بر لیتر به دست آمد که حداقل کاهش وزن تازه گل را نشان می‌دهد (شکل 4-2).
2.482a
2.55a
2.485a
2.477a
2.176bc
2.231b
2.021d
1.772e
1.99d
2.035cd
کاهش وزن تازه گل (گرم)

تیمارها
شکل4-2- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر کاهش وزن تر گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-3- درصد ماده خشک
984252147570آنالیز واریانس نشان داد که تیمارهای مختلف درسطح یک درصد بردرصد ماده خشک موثر بوده‌اند(جدول4-1) نتایج مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که در گل‌های شاخه بریده ژربرا که تیمارهای نیترات و سولفات نیکل را دریافت کرده بودند، بیشینه وزن خشک را داشتند به گونه‌ای که حداکثر درصد ماده خشک (02/16%) هنگامی به دست آمد که گل‌ها با نیترات نیکل با غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر تیمار شدند. تیمارهای عنصر نیکل به تنهایی تاثیر معناداری بر این شاخص نداشتند (شکل 4-3).
12.73d
13.71cd
12.2d
13.16cd
15.71a
14.05bc
16.02a
15.57ab
15.91a
14c
ماده خشک (درصد)

تیمارها
شکل 4-3- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر وزن درصد ماده خشک گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-4- قطر گلها
1386512783785بررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارهای نیکل، سولفات و نیترات نیکل از نظر آماری اثر معناداری در سطح پنج درصد نسبت به شاهد (آب مقطر) بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول 4-1). نتایج حاصل از مقایسه میانگین ها نشان داد که قطر گل‌هایی که تیمار30 میلی گرم بر لیتر از عنصر نیکل را دریافت کرده بودند و همچنین در گل‌هایی که توسط نمک‌های سولفات و نیترات نیکل تیمار شده بودند به گونه معنادار بیشتر از نمونه‌های شاهد بودند. حداکثر قطر گل‌ها (39/111 میلی‌متر) در ژربراهایی که توسط نیترات نیکل با غلظت 50 میلی گرم بر لیتر تیمار شده بودند به دست آمد. تفاوت معناداری بین نمونه‌هایی که تیمار سولفات نیکل دریافت کرده بودند موجود نبود (شکل 4-4).
105.53e
107.61cde
106.43de
108.42bcd
109.07abc
110.17ab
109.92abc
110.31ab
111.39a
110.22ab
قطر گل (میلی‌متر)

تیمارها
شکل 4-4- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-5- کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS)
1847852084070بررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان می‌دهد که استفاده از نیکل، سولفات و نیترات نیکل در محلول نگهدارنده نسبت به شاهد (آب مقطر) اثر معناداری در سطح پنج درصد بر روی میزان قند (TSS) موجود در ساقه گل بریده ژربرا داشته است (جدول 4-1) مقایسه میانگین داده ها نشان داد که تیمارهای30 میلی‌گرم بر لیتر عنصر نیکل و نمک‌های سولفات و نیترات نیکل همگی سبب کمترین کاهش درصد قند (TSS) شده‌اند. بهترین پاسخ‌ها در بالاترین سطح کاربردی نیترات و سولفات نیکل (50 میلی گرم بر لیتر ) به دست آمد.
1.05a
0.97ab
0.95ab
0.9b
0.75c
0.61de
0.77c
0.45f
0.51ef
0.66cd
کاهش مواد جامد محلول(درصد)

تیمارها
شکل 4-5- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر روی کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (Tss) هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-6- پروتئین گلبرگ
نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان می‌دهد که تیمارهای استفاده شده در این آزمایش در ارتباط با حفظ میزان پروتئین در گلبرگ‌های شاخه بریده ژربرا نسبت به شاهد اثر مثبت و معناداری در سطح یک درصد داشته است جدول (4-1) نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده ها نشان داد که تیمارهای سولفات نیکل و تمام غلظت‌های نیترات نیکل سبب بهبود این پارامتر گردید به گونه‌ای که گل‌هایی که تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر از نیترات نیکل را دریافت کرده بودند بالاترین غلظت پروتئین را داشتند (14%) که در حدود سه درصد بالاتر نسبت به نمونه‌های شاهد بود شکل (4-6).
8001027368511e
11.05de
11.75cde
12.01bcde
12.53abcd
13.09abc
13.81a
13.61a
14a
13.21ab
پروتئین گلبرگ (درصد)

تیمارها
شکل 4-6- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان پروتئین گلبرگ گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-7- کاروتنوئید گلبرگ
همان‌طور که در جدول آنالیز واریانس مشاهده می‌شود، تیمارها عنصر نیکل و نیز سولفات و نیترات نیکل نسبت به شاهد اثر معناداری در سطح یک درصد بر روی میزان کاروتنوئید گلبرگ در گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند جدول (4-2). نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که غلظت30 میلی‌گرم بر لیتر از عنصر نیکل و تمام غلظت‌های دو نمک سولفات و نیترات نیکل سبب افزایش معنادار کاروتنوئید گلبرگ نسبت به نمونه‌های شاهد گردد. براساس نتایج که در شکل (4-7) آورده شده است، بیشینه کاروتنوئید (92/1میکروگرم در گرم وزن تر) از گل‌هایی به دست آمد که تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر سولفات نیکل را دریافت کرده بودند که بیش از سه برابر از نمونه شاهد بود.
222885121285
0.53f
0.71ef
0.61ef
0.95de
1.13cd
1.92a
1.37bc
1.56ab
1.77ab
1.56ab
کاروتنوئید گلبرگ (میکروگرم در گرم وزن تر)

تیمارها
شکل4-7- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میران کاروتنوئید گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-8- جذب آب
نتایج تجربه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارها اثر معناداری در سطح پنج درصد بر میزان جذب آب در گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول4-2) بررسی مقایسه میانگین داده‌ها نشان می‌دهد که غلظت30میلی گرم بر لیتر از عنصر نیکل به تنهایی و تمام غلظت‌های به کار رفته از نمک‌های سولفات و نیترات نیکل سبب بهبود و افزایش جذب آب نسبت به نمونه‌های شاهد گردید. بیشترین میزان جذب آب (61/95 میلی لیتر به ازای هر گل) از گل‌هایی به دست آمده که تیمار30 میلی‌گرم بر لیتر از نیترات نیکل را دریافت کرده بودند و کمینه جذب آب هم در نمونه‌های شاهد مشاهده گردیده است (شکل4-8).
127403174253
67.21f
70f
70.7f
77d
85.5c
89.26bc
91.74ab
95.61a
92.52ab
90.18b
جذب محلول (میلی‌لیتر)

تیمارها
شکل 4-8- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میران جذب آب گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-9-جمعیت باکتریایی در ته ساقه
2228852503170آنالیز واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارهای مختلف عنصر نیکل، سولفات و نیترات نیکل نسبت به شاهد از نظر آماری در سطح یک درصد برکاهش جمعیت باکتریایی در ته ساقه موثر بوده‌اند (جدول4-1). براساس مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که، کاربرد عنصر نیکل به تنهایی با غلظت‌های20 و30 میلی گرم بر لیتر و تمام غلظت‌های دو نمک سولفات و نیترات نیکل سبب کاهش معنی‌دار کلونی‌های باکتریایی حاصل از ته ساقه گل‌ها نسبت به شاهد (آب مقطر) گردیده است. کمترین تعداد کلونی باکتریایی از ته ساقه گل‌هایی به دست آمد که بالاترین سطح (50 میلی گرم بر لیتر) از دو نمک سولفات نیکل و نیترات نیکل را دریافت کرده بودند که تقریباً 50 درصد پایین تر از نمونه هایی شاهد بود.
110.11a
(log10CFU.ml-1)شمارش باکتری ساقه
105.81a
92.5b
88.5b
75.63c
61.4e
70.43cd
62.57e
57.53f
65.22de

تیمارها
شکل 4-9- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در ته ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-10- جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌ها
همان طور که در جدول (4-1) آنالیز واریانس دیده می‌شود، تیمارهای مختلف نیکل نسبت به شاهد (آب مقطر) اثر معناداری در سطح یک درصد بر این شاخص در هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند. تمام تیمارها سبب کاهش معنادار کلونی‌های باکتریایی گردیدند و بیشینه تعداد کلونی‌های از محلول نگهدارنده گل‌هایی به دست آمد که بالاترین سطح نمک‌های سولفات و نیترات نیکل (50 میلی گرم بر لیتر) را دریافت کرده بودند که در حدود 40 درصد پایین تر از نمونه‌های شاهد بود (شکل4-10).
125.88a
90.25b
95.27b
85.18bc
70.05de
60.82ef
75.11cd
61.05ef
58.03f
60.91ef
شاهد
N1
N2
N3
SN1
SN2
SN3
NN1
NN2
NN3
(log10CFU. ml-1)شمارش باکتری محلول نگهدارنده
28237154310
تیمارها
شکل 4-10- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسیددسموتاز
همان‌طور که در شکل (4-11) مشاهده میشود، تمام تیمارها سبب افزایش فعالیت این آنزیم نسبت به شاهد گردیدند به گونهای که کمینه فعالیت این آنزیم از نمونه های شاهد به دست آمده است (61/60 واحد در گرم وزن تر) همچنین آنالیز واریانس داده ها نشان میدهدکه اثر تیمارها از نظر آماری در سطح یک در صد بر این شاخص در گلهای شاخه بریده ژربرا معنی دار بوده است. کاربرد 30 و 50 میلی گرم سولفات نیکل و همچنین تمام غلظت‌های نیترات نیکل سبب افزایش بیش از دو برابر این آنزیم نسبت به نمونههای شاهد گردیده است. بالاترین سطح فعالیت آنزیم سوپر اکسیددسموتاز (21/135 واحد در گرم وزن تر) از گلهایی به دست آمد که بالاترین سطح نیترات نیکل را دریافت کرده بودند (50 میلی گرم در لیتر).
7048521590
60.61e
81.05d
88.56d
85.85d
100.01c
125.22ab
125.31ab
129.61ab
135.21ab
120.11b
فعالیت آنزیم SOD (IU/g.FW)

تیمارها
شکل 4-11- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-12- فعالیت آنزیم پراکسیداز
همان طور که در جدول آنالیز واریانس مشخص شده است تیمارها اثر معنی داری در سطح یک در صد بر فعالیت آنزیم پراکسیداز گلهای شاخه بریده ژربرا داشتهاند (جدول 4-1).تیمارهای عنصر نیکل به جز تیمار 30 میلی گرم بر لیتر سبب افزایش یا کاهش فعالیت این آنزیم نسبت به نمونه های شاهد نگردید اما کاربرد دو نمک دیگر یعنی سولفات نیکل و نیترات نیکل در تمام سطحوح سبب افزایش معنی دار فعالیت این آنزیم نسبت به نمونه های شاهد گردید. حداقل فعالیت (02/4 میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) از نمونه‌های شاهد به دست امد و حداکثر فعالیت در حدود(3/6 میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) از نمونه‌هایی به دست آمد که بیشینهسطح سولفات و نیترات نیکل یعنی50 میلیگرم برلیتر را دریافتکرده بودند (شکل4-12).
4.02e
4.24de
4.32de
4.53d
5.56c
6.37a
5.78bc
6.28ab
6.36a
6.17ab
فعالیت آنزیم POD(MoL/g.FW.min)
175260130810
تیمارها
شکل 4-12- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل فعالیت آنزیم پراکسیداز گل‌های ساخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10 mgl NN1=10 mgl-1
N2=20mgl-10 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50 mgl-1 NN3=50 mgl-1
جدول4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازهگیری شده در گل‌های شاخه بریده ژربراکاهش بریکس پروتئین
گلبرگ قطر گل‎ها وزن خشک کاهش وزن تازه گل عمر گلجایی درجه آزادی 0/40* **63 18/82* 15/48** 1/281** 6/73** 9 تیمار
0/028 3/ 63 13/88 3/ 78 0/ 301 1/17 20 خطا
- - - - - - 29 کل
33 43 35 40 27 35 ضریب تغییرات (درصد)
* معنا دار در سطح 5 درصد
** معنا دار در سطح 1 درصد
ns عدم معنا دار بودن
ادامه جدول4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازهگیری شده در گل‌های شاخه بریده ژربرا فعالیت
POD فعالیت
SOD تعداد باکتری محلول تعداد باکتری ته ساقه جذب آب کاروتنوئید درجه آزادی 921/09** 5058/99** 2638/98** 1245/32** 155/36* 1/53** 9 تیمار
26/01 168/63 168/30 83/86 36/73 0/28 20 خطا
- - - - - - 29 کل
33 33 40 27 37 29 ضریب تغییرات (درصد)
* معنا دار در سطح 5 درصد
** معنا دار در سطح 1 درصد
ns عدم معنا دار بودن

فصل پنجم
بحث
5-1- بحثدر این مطالعه کاربرد سطوح مختلف سولفات و نیترات نیکل سبب افزایش بهبود عمر گلجایی گلهای شاخه بریده ژربرا به مدت دو الی چهار روز نسبت به شاهد گردیده است. عمر گلجایی گلهای شاخه بریده در صورت بهینه بودن شرایط نگهداری آنها به چند عامل بستگی دارد، وجود منابع در دسترس انرژی مثل کربوهیدرات‌ها، غلظت گاز اتیلن به ویژه اگر فرازگرا باشند و غلظت باکتری های موجود در محلول نگهدارنده یا در انتهای ساقه آنها که تمام این عوامل می توانند توسط یون نیکل تحت تاثیر قرار بگیرند. چرخه کربس یک مسیر بسیار مهم تولید کننده انرژی است که مقادیر مورد نیاز و کافی انرژی را جهت فرآیندهای تخصصی رشد و نمو گیاهی تامین می کند. هرگونه ایراد در این راکتور انرژی گیاهی میتواند بر قدرت عمومی گیاه و توانایی آن در جهت ادامه زندگی گیاهی تاثیر گذار باشد. نیکل کوفاکتور کوانزیم آ سنتاز است که آنزیم کوآنزیم آ تولید می کند. غیبت مقادیر کافی کوآنریم آ به این معنا است که پیرووات که از این چرخه بیرون می آید نمیتواند استیل کوآنزیم آ تولید کند و چرخه کربس را تغذیه کند این مسئله سبب کاهش تولید انرژی میگردد و باعث تجمع لاکتیک اسید در سطوح سمی میگردد (بایی و همکاران، 2006؛ وود و ریلی، 2007). بنابراین تامین نیکل کافی می تواند تضمینی برای تولید انرژی کافی و عدم تجمع مقادیر سمی لاکتیک اسید باشد.
١٢

—103

3-5- مراحل سترون سازی51
3-5-1- سترون سازی بذرها51
3-5-2- سترون سازی محیط و وسایل کار 52
3-5-3- تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف 52
3-6- کشت گیاه در محیط های تیماری به منظور کال زایی 54
3-7- باززایی57
3-8- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت MS مایع 58
3-9- جداسازی ترکیبات فرار 58
3-10- آنالیز آماری 59
فصل چهارم: نتایج و بحث
60
4-1- نتایج کالوس سازی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 61
4-2- نتایج باززایی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 65
4-3- نتایج حاصل از اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه 70
4-4- بررسی ترکیبات شیمیایی گیاه رازیانه تحت تاثیر تیمارهای مختلف هورمونی از طریق
کشت سوسپانسیون سلولی 74………………………………………………………………………….
4-5- مقایسه درصد سطوح ترکیبات شیمیایی مشترک حاصل از کشت سوسپانسیونی گیاه رازیانه در تیمارهای مختلف هورمونی
75
4-6- اشکال طیف گاز کروماتورگراف در اسانس گیاه رازیانه تیمارشده با ترکیبات هورمونی مختلف.........................77
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری کلی
81
بحث 82
پیشنهادات86
منابع 87

چکیده انگلیسی 98……………………………………………………………… ………………….

فهرست شکل ها
عنوان شکلصفحه
شکل 1-4- مراحل رشد جنین های جنسی و غیرجنسی...………………………………………………….……….29
شکل 4-1- کالوسهای بوجود آمده در محیط کشتهای غلظت 4میلی گرم بر لیتر و 1 میلی گرم بر لیتر.................................................................................................................................60
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه
جدول 1-1- . مقایسه مقدار تولید برخی ترکیبات دارویی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی با گیاه کامل................33
جدول 3-1- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در القاء و رشد کالوس در محیط ……………….MS51
جدول 3-2- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در باززایی رازیانه در محیط MS2/1…………..……54
جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان کالوس‌زایی…………..……………………………………………………… 58
جدول 4-2- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد……………………..………………………………………... 58
جدول 4-3- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …………..…………………………………………………..60
جدول 4-4- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ............................................................................................................ 61
HYPERLINK l "_Toc302924107" جدول HYPERLINK l "_Toc302924106" 4-5- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان باززایی...................................................................................................................................................................63

جدول 4-6- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …...............................................................................................................................63جدول 4-7- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد65… ………………………………………………………………
جدول4-8- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ………………………………….. … …….. 66
جدول4-9- نتایج تجزیه واریانس اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ...................................................................................................................... ..........................................................68
جدول4-10- مقایسه میانگین اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ........................................................................................................................................................................................69
جدول 4-11- ترکیبات شیمیایی حاصل از اسانس گیاه رازیانه....................................................................................................71

TOC h z c "شکل"
فهرست نمودارها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی………………..…………… ........59
نمودار4-2- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی61
نمودار4-3- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی 62
نمودار4-4- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی64
نمودار4-5- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی............................................................................................ 65
نمودار4-6- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی.... ...........................................................67
نمودار4-7- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ساقه گیاه رازیانه69
نمودار4-8- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ریشه گیاه رازیانه 70


نمودار4-9- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر تعداد برگ ایجاد شده در گیاه رازیانه............................................70
نمودار 4-10- مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف...................................................................................................................................................72
نمودار 4-11 مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی D-(+)-fenchone در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف....................................................................................................................................................73

فصل اول
مقدمه
مقدمه
گل ها و گیاهان، خاموش ترین موجودات و در عین حال گویاترین مظهر قدرت و عظمت آفرینش هستد. هر برگی از این موجودات زیبا، کتاب بزرگی در وصف توحید است. گلها و گیاهان نه تنها با الوان و اشکال بدیع و بیبدیل خود سفرهی طبیعت را زینت میبخشند بلکه آن را چنان سرشاری از نیروی حیاتی میسازند که هیچ بساطی را یارای رقابت با آن نیست (امیدبیگی، 1377 .( با آن که امروزه درمان بیماریها بیشتر از طریق مصرف داروهایی صورت میگیرد که منشأ صنعتی دارند و اختصاصاً در آزمایشگاهها تهیه میشوند ولی مصرف بعضی از آنها زیانهایی به بدن میرساند و عوارض جانبی بسیاری از آنها ثابت شده است. در اوایل قرن حاضر پیشرفت علم شیمی و کشف سیستمهای پیچیدهی سنتز ارگانیک منجر به توسعهی صنعت داروسازی و جایگزینی شیمی درمانی شد. بدین طریق پزشکی مدرن توانست بسیاری از بیماریها غیرقابل علاج و غالباً مرگآور را درمان کند. با وجود این گیاهان دارویی و داروهایی که از آنها تهیه میشدند هرگز به طور کامل کنار گذاشته نشدند. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی امروزه بیش از 80 درصد مردم جهان (نزدیک به 5 میلیارد نفر)، برای درمان بیماریها هنوز از داروهای گیاهی استفاده میکنند. تقریبا یک چهارم داروهای تهیه شدهی دنیا منشأ گیاهی داشته که یا مستقیماً از گیاهان عصارهگیری شده و یا براساس ترکیب گیاهی، سنتز شدهاند. واژه گیاهان دارویی تنها به تسکین دهنده آلام اطلاق نمیشود بلکه این گیاهان در زیر گروه غذا به عنوان طعم دهندهها، نوشیدنیها، شیرین کنندهها، رنگ طبیعی بوده همچنین به عنوان ماده اولیه محصولات آرایشی و بهداشتی نیز مورد استفاده قرار می گیرند (امیدبیگی، 1376).
درواقع گیاهانی که حداقل دارای صفات زیر باشند،گیاه دارویی نامیده میشوند:
1- در پیکر این گیاهان مواد ویژه ای به عنوان مواد مؤثر یا متابولیتهای ثانویه ساخته و ذخیره میشوند که برای مداوای برخی از بیماریها مورد استفاده قرار میگیرند. مواد مذکور طی فرآیندهای ویژه و پیچیده بیوشیمیایی و به مقدار بسیار کم (به طور معمول کمتر از یک درصد وزن خشک گیاه)، ساخته میشوند.
2- اغلب ممکن است اندام ویژهای چون ریشه، برگها، ساقه، گل، میوه و غیره بیشترین مواد مؤثر را داشته باشند، بنابراین همیشه نمیتوان کل اندام گیاه را منبع ماده دارویی ویژهای دانست.
3- اندام گیاهی برداشت شده، آماده سازی و فرآوری میشوند، یعنی تحت تأثیر عملیات ویژهای مانند جداسازی، خرد شدن، خشک کردن، تخمیر و غیره قرار گرفته و سپس استفاده میشوند. به طور معمول این اندامها به صورت سنتی و فقط با خشک کردن به عنوان کالای عطاری عرضه میشوند.
جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران
رویکرد روز افزون استفاده از گیاهان دارویی و فرآوردههای حاصله از آن نقش این گیاهان را در چرخه اقتصاد جهانی پررنگتر کرده است. طوریکه مصرف روبه تزاید آن تنها به کشورهای در حال توسعه اختصاص نداشته، بلکه یکی از فاکتورهای مهم بهداشتی کشورهای پیشرفته نیز محسوب میگردد. در جهان 130 میلیون تن گیاه دارویی سالانه خرید و فروش میشود و حدود یک میلیون کارخانه دارویی در چند سال اخیر افزایش یافته است. طبق برآوردهای صورت گرفته در سالهای اخیر، ارزش بازارهای جهانی داروهای گیاهی که شامل گیاهان دارویی و فرآوردههای آنها است، رشد قابل توجهی داشته است. بخش اعظم بازار گیاهان دارویی دنیا، به تولید و عرضه متابولیتهای ثانویه مشتق از این گیاهان مربوط میشود. متابولیتهای ثانویه معمولاً از ارزش افزوده بسیار بالایی برخوردارند به طوریکه ارزش فروش برخی از این ترکیبات مانند شیکونین ، دیجیتوکسین و عطرهای همچون روغن جاسمین ، از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر کیلوگرم تغییر می کند. همچنین قیمت هر گرم از داروهای ضد سرطان گیاهی مانند وین بلاستین ، وینکریستین ، آجمالیسین و تاکسول به چند هزار دلار میرسد. تاکسول یکی ازترکیبات دارویی است که از پوست درخت سرخدار به دست میآید و در درمان سرطانهای سینه و تخمدان مورد استفاده قرار میگیرد. ورود دارو بودجه زیادی را به خود تخصیص میدهد این در حالی است که ایران با داشتن خصوصیات اکولوژیکی و اقلیمی متنوع، یکی از کشوهای کم نظیر در تولید گیاهان مختلف میتواند باشد به طوری که ایران از 13 اقلیم موجود در جهان، 11 اقلیم را به خود اختصاص داده است. و به تقریب 8000 گونه گیاهی که معادل 2 برابر فلور کل اروپا است ازدیگر ویژگیهای کشورمان می باشد، که این بانک ژن اهمیت اقتصادی زیادی دارد. برای مثال کشور فلیپین حجم عظیمی از درآمد خود را از فروش گیاهان دارویی و گیاهان وحشی به دیگر کشورها بدست میآورد (میرجلیلی، 1382). بنابراین، اگرچه در زمینه توسعه صنعت گیاهان دارویی در ابتدای راه هستیم، ولی میتوانیم با برنامهریزی صحیح، بخش قابل توجهی از بازارهای جهانی را به خود اختصاص دهیم. شاید در ابتدای کار نتوانیم با کشورهایی که محصولات خود را به تولید انبوه رسانده اند، رقابت نماییم، اما به لحاظ تنوع گونهای و تولید طبیعی گونههایی دارویی رقبای چندانی در جهان نداریم و در مواردی حتی بیرقیب هستیم. همه اینها منوط به این نکته است که داراییهای کشور را بشناسیم و بتوانیم از آنها استفاده بهینه نماییم. در این صورت حتی می توان تا 5 درصد از تولید ناخالص ملی را از این طریق تأمین نمود (امیری،2006).
1-3- ضرورت توجه به پرورش گیاهان دارویی
با ظهور داروهای شیمیایی و بیولوژیک، نقش و اهمیت گیاهان دارویی در تأمین سلامت بشر، در معرض فراموشی قرار گرفت .اما با گذشت زمان، استقبال از گیاهان دارویی با رشد قابل توجهی روبرو شده است. به نظر میرسد مردم جهان از یک سری نارساییهای طب مدرن خسته شده اند و به طور روز افزون به سمت داروهای گیاهی روی میآورند به همین دلیل، امروزه حدود 50 درصد داروهای تولید شده در جهان منشاء طبیعی دارند که با تغییراتی به عنوان دارو مورد استفاده قرار میگیرند که نیمی از این مقدار از منابع معدنی، حیوانی و باکتریایی بهدست میآید و نیمی دیگر منشاء گیاهی دارد. برای مثال، تمام هورمونهای مصرفی گیاهی هستند و از گیاهان مختلفی نظیر سیب زمینی مکزیکی، شنبلیله و غیره به دست میآیند. هم چنیین ترکیباتی مثل وین بلاستین و وین کریستین که از داروهای ضد سرطان هستند از گیاه بدست میآیند و یا گلیکوزیدهای قلبی از جمله این گروه داروها محسوب میشوند (قاسمی دهکردی و طالب، 1380). گیاهان دارویی به دلیل ماهیت طبیعی و وجود ترکیبات همولوگ دارویی در کنار هم، با بدن سازگاری بهتری دارند و معمولا فاقد عوارض ناخواسته هستند لذا به خصوص در موارد مصرف طولانی و در بیماریهای مزمن، بسیار مناسب میباشند. به عنوان مثال، گیاهان دارویی در بسیاری از اختلالات اعصاب و روان به عنوان بهترین انتخاب خواهند بود.
ایرانیان از دیرباز و حتی پیش از دیگران در زمینه گیاهان دارویی و کاربرد درمانی آنها از دانش پیشرفتهای برخوردار بوده است. نمونه بارز آن کتاب باستانی اوستاست. در یکی از پنج کتاب تشکیل دهنده اوستا( که در مجموع دست کم 2500 سال پیشینه دارد)، بخش های پرشماری به گیاه درمانی، معرفی گیاهان دارویی و کاربرد آنها اختصاص یافته است. در قرن هشتم و نهم میلادی، اطباء ایرانی رونق خاصی به طبابت ایران و جهان بخشیدند بهطوریکه با پیدا شدن دانشمندان و نوابغی نظیر ابوعلی سینا و محمد زکریای رازی با انشار کتابهای معروف خود (قانون و الحاوی) پیشرفتهای زیادی نصیب ملت ایران و جهان گردید. این پیشرفتها همچنین در قرون بعد نیز ادامه یافت. در قرن 13 میلادی، ابن بیطار، اختصاصات متجاوز از 1400 گیاه را که خود شخصاً می شناخت را در کتابش شرح داد (دوازده امامی، 1386).
1-4- گیاه شناسی رازیانه:
رازیانه گیاهی است علفی، معطر و چند ساله از تیره چتریانUmbelliferae با نام علمی Foeniculum vulgare که ارتفاع آن حدود 2 متر، ساقههای آن قائم، استوانه ای، منشعب و سبز رنگ است. ریشه غدهای، دوکی شکل و مستقیم، برگهای این گیاه متناوب با پهنک منقسم به قطعات نازک و نخی شکل، گلها زرد رنگ و مجتمع کوچک و منظم به صورت چتر مرکب است. شاخکهای چترهای آن بلند و شامل پایههای نامساوی است؛ به طوریکه تعداد آنها به 15 نیز میرسد. پهنای گل آذین چتری آن در حدود 15 سانتی متر است. گلهای این گیاه عسل دهندههای خوبی محسوب میشوند. میوه آن کوچک، دو فندقه به طول 6 تا 12 و عرض2 تا 4 میلی متر و دارای بوی معطر است)کمالی و همکاران،1380).

فرمانرو: گیاهان
دسته: گیاهان گلداررده: دولپهای
راسته: آپیالس
تیره: چتریان
سرده: رازیانه
گونه: F.vulgare
نام علمی: Foeniculum vulgare
1-5- اندام داروئی:
تمام اجزای رازیانه قابل استفاده است. از آن جمله شکوفهها و دانههای آنرا بلافاصله بعد از رسیدن و برگهای آنرا در تیرماه چیده و در سایه خشک میکنند و همچنین ریشه رازیانه را میتوان در اواخر پائیز برداشت نموده و خشک کرد.(سیکوتی و همکاران، 2008)
1-6- نیازهای اکولوژیکی:
رازیانه بیشتر بر روی شیبهای صخرهای و کوهستانی خشک، آهکی، آفتابگیر، قابل نفوذ و فاقد رطوبت زیاد میروید.
1-7- پراکنش جغرافیائی:
رازیانه گیاهی است مدیترانه ای، هوای گرم برای رشد و نمو آن مطلوب می باشد. به طور کلی کشت این گیاه در مناطق با هوای گرم (تابستان طولانی و زمستان بیش از اندازه سرد نداشته باشد) موفقیت آمیز است (دامژانویک و همکاران، 2005). این گیاه بومی نواحی مدیترانه و آسیا بوده، امروزه در جنوب فرانسه ، ایتالیا و سایر نقاط جهان کشت میشود. در ایران رازیانه به صورت خودرو در مناطقی مثل شمال، تهران، کرمان، کردستان، اصفهان و ... می توان یافت و در اکثر نقاط ایران قابل کشت است. جوانه زنی بذور در دمای 6-8 درجه سانتیگراد انجام میگیرد ولی درجه حرارت مطلوب برای جوانه زنی 16-65 درجه سانتی گراد میباشد. pH مناسب برای این گیاه 8/4 تا 8 است. خاکهای لومی رسی با مواد و عناصر غذائی و ترکیبات هوموسی کافی خاکهای مناسبی برای رویش این گیاه می باشد. دمای مطلوب در طول رویش و در طول زمان تشکیل میوه 20-22 درجه سانتی گراد است. در زمستانهای طولانی و بسیار سرد ریشههای گیاه دچار سرمازدگی میشوند. آبیاری در مراحلی از رشد، رویش اولیه، مرحله تشکیل ساقه و مرحله نمو گلها، تأثیر قابل توجهی بر کمیت و کیفیت مواد مؤثره این گیاه دارد.(باقری و همکاران، 1376)
در شکل زیر قسمتهای آنالیز میکرسکپی پودر رازیانه نشان داده شده است .

Tracheids Vittae Endosperm Endocarp Mesocarp
گرد رازیانه را از میوه های خشک شده گیاهی به نام فینکولوم ولگا را از تیره چتریان بدست می آورند . گردی است سبز مایل به زرد با بوی تند شبیه بوی انتول (معطر) ، مزه آن ابتدا تند و کمی شیرین سپس تلخ و کافوری می شود . در زیر میکرسکوپ شامل قسمتهای زیر می باشد :
الف- تکه هائی از پارانشیم حفره ای (سلولهای دندانه ای شکل) از قسمت مزوکارب ، زیاد و اختصاصی می باشد.
ب- تکه هائی از اپیدرم پوشش داخلی با سلولهای کف پوشش مانند همراه با پارانشیم تحتانی که در طرف راست تصویر قرار دارد و باقیمانده هائی از لوله های روغنی (تکه هائی از لوله های ترشحی شیزوشس که اطراف آن را سلولهای مخاطی احاطه نموده است) ، زیاد و اختصاصی می باشد.
پ- تکه هائی از بافت کلانشیم نزدیک آوندهای هدایت کننده با دیواره های سلولی قرمز مایل به قهوه ای زیاد و اختصاصی می باشد.
ت- قطرات زرد رنگ روغنی ، زیاد و اختصاصی نمی باشد.
ث- تکه هائی از اندوسپرم همراه با بلورهای ریز ستاره ای شکل اکسالات کلسیم ، شفاف ، دیواره های سلولی ضخیم ، خیلی زیاد ولی اختصاصی نبوده و چون در دانه های دیگر گیاهان چتریان نیز دیده میشود.
ج- تکه های شکسته شده از فیبرهای اسکرانشیم شده از کارپوفور (1) کم و اختصاصی نمی باشد.
توجه : این گرد باید فاقد تارو آوندهای بیش از 10 میلی میگرون قطر باشد. امکان مخلوط با گرد زیره نیز مشاهده است. (یاسن و همکاران، 2009)
1-8 - آفات و بیماریها:
رازیانه یک گیاه شته دوست می باشد و در شرایط مناسب به گیاه حمله می کند. آفات در طول رویش ممکن است خسارات سنگینی به رازیانه وارد کنند. خسارت عموماً از جانب سنهای لکه دار(Cygaeus) که متعلق به خانواده میریده(Miridae) هستند وارد می شود. همچنین یکی دیگر از آفات مهم رازیانه شته است. این حشرات با مکیدن شیره گیاه سبب ضعف آن و کاهش عملکرد می گردند برای مبارزه با سنها می توان از سم دیتریفون(Ditrifon). و یا وفاتوکس (Wefatox) برای مبارزه با شته ها می توان از شکارگرهای طبیعی مثل کفشدوزکها و یا سموم شیمیائی سیستماتیک مثل متاسیتوکس استفاده شود)داس و همکاران 2008)
1-9- مهمترین خاصیت درمانی و داروهای ساخته شده:
تسکین دردهای قاعدگی و ضد سرفه از مهمترین خواص داروئی این گیاه است که فرآورده های تولید شده از رازیانه نیز با خواص فراوان دارویی، التیام بخش بسیاری از بیماری ها از جمله سرفه و سرماخوردگی است. رازیانه، نوعی گیاه دارویی است که مصارف مختلفی دارد . تمام بخش های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می تواند منجر به ایجاد دانه های پوستی، مشکلات تنفسی وحالت تهوع گردد. این گیاه دارای طعم تند، تلخ و شیرین است و کمی به طعم نعنا شبیه است. مصرف رازیانه باعث افزایش شیرمادر و نیز کاهش وزن می شود. قابل توجه: مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود. رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین و مواد معدنی است: فیبر، منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین C ، B3 و غیره ویتامین C موجود در پیاز رازیانه، ضد باکتری بوده و برای سیستم ایمنی بدن بسیار مفید است. علاوه برآن، این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول ، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می کند. رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می شود و به این ترتیب فرد، دچار حمله قلبی نمی شود.این گیاه دارویی،سموم بدن راپاک می کند و بیماری التهاب دهان رااز بین می برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط آورش، مفید است. بخار حاصل از جوشاندن برگ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می دهد.مصرف دانه های رازیانه، باعث تسکین دل درد می شود و عمل هضم را آسان تر می کند، کرم روده کودکان را از بین می برد، باعث تقویت چشم می شود، حساسیت های چشم را از بین می برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(سیپوریدیس و تومیریدیس، 2003)
تمام بخش ‌های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه‌ های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می‌ تواند منجر به ایجاد دانه ‌های پوستی، مشکلات تنفسی و حالت تهوع گردد.
اما توجه داشته باشید که مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود.
1-10- پیاز رازیانه
رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین، مواد معدنی و فیبر است. منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین Cو B3 از این موارد می باشند.
این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می ‌کند .رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می‌ شود و به این ترتیب برای افرادی که دچار حمله قلبی می‌ شوند، مفید است.
این گیاه دارویی، سموم بدن را پاک می ‌کند و بیماری‌ التهاب دهان را از بین می ‌برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط‌ آورش، مفید است.(کوبوریس و واسیلاکاکیس، 2006)
1-11- دانه رازیانه
بخار حاصل از جوشاندن برگ‌ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می ‌دهد. مصرف دانه‌ های رازیانه، باعث تسکین دل درد می‌ شود، عمل هضم را آسان ‌تر می ‌کند، کرم روده کودکان را از بین می ‌برد، باعث تقویت چشم می ‌شود، حساسیت ‌های چشم را از بین می‌برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(باقری و همکاران،1376 و دانشور حسینی،1387)

1-12- نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان
کشت بافت سلول گیاهی، روشی است برای تکثیر گیاهان که از طریق آن میتوان تعداد زیادی گیاه تولید کرد. کشت بافت گیاهی گستره وسیعی را در بر میگیرد که شامل کشت پروتوپلاست، سلول، بافت و اندام گیاهی است. کشت بافت همچنین پیش نیاز مهندسی ژنتیک است زیرا از سلول تغییر یافته باید بتوان یک گیاه کامل به وجود آورد. کشت بافت بر مبنای سه توانایی اصلی گیاه استوار است :
*قدرت باززایی یا توانایی ارثی یک سلول گیاهی برای رشد و تبدیل شدن به گیاه کامل در صورت فراهم بودن شرایط محیطی و محرکهای مناسب، اگر چه به لحاظ تئوری توانایی باززایی در تمام سلولهای گیاهی وجود دارد ولی سلولهای مریستمی بهترین سلولهایی هستند که قادر به بروز این قدرت میباشند.
*عدم تمایز یا قابلیت برگشت سلولهای بالغ گیاهی به شرایط مریستمی و تولید یک نقطه رشد جدید که با تمایز مجدد یا قدرت سازماندهی و تشکیل اندام جدید ادامه مییابد.
* شایستگی یا قابلیت درون زاد یک سلول یا بافت مشخص، به رشد در مسیری ویژه (کانلی و تیان ، 2007 و تانگ و همکاران ، 2001).
کشت بافت به عنوان یک روش کاربردی در پیشرفت‌های کشاورزی نقش بارزی داشته است. مثلاً کشت تخمک منجر به تلاقی‌های بین گونه‌ها و حتی جنس‌های مختلف شده است و ریزازدیادی به افزایش سریع جمیعت از یک گیاه برتر منتهی گردیده است. از طرف دیگر، کشت بافت به تنهایی نمی‌تواند پیشرفت‌های سریع مورد نیاز برای اصلاح و بهبود محصولات را فراهم آورد. با این وجود، کشت‌بافت همراه با ژنتیک مولکولی، قابلیت بیشتری برای بهبود سریع محصولات را فراهم می‌آورد. در همان حال که تکنیک‌های ژنتیک مولکولی DNA ژن‌ها را دست‌ورزی می‌نماید، کشت سلول و بافت برای مهندسی ژنتیک ضروری خواهد بود زیرا اطلاعات ژنتیکی خارجی DNA به یک گیاه کامل وارد نمی‌شود بلکه به یک سلول وارد می‌شود. فناوری درون شیشه‌ای واسطه‌ای برای تبدیل تک سلول تغییریافته به یک گیاه کامل می‌باشد (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
ریزازدیادی به عنوان یکی از روش های نوین افزایش انبوه گیاهان به ویژه پایههای درختان میوه در چند دهه اخیر بیشتر مورد توجه بوده است. پایههای رویشی تولیدی غالبا عاری از آلودگی ، دارای خلوص ژنتیکی و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه هستند که برای تولید و احداث باغات یکدست و متراکم استفاده میشوند. استفاده از دورگههای بین گونهای به خصوص برای درختان میوه هستهدار در کشورهای پیشرفته بیشتر معمول شده است. از آنجایی که اساس احداث باغهای مکانیزه بر تولید نهالهای رویشی و یکسان استوار است لذا بررسی روشهای تکثیر رویشی مناسب به خصوص ریز ازدیادی برای تولید انبوه پایهها حائز اهمیت است. (سولوسوگلا، 2002)
اهمیت استفاده از روش کشت بافت گیاهی برای تکثیر گیاهان دارویی در حال افزایش بوده و این روش برای تکثیر بسیاری از گیاهان دارویی استفاده می شود. از جمله مزایای مهم تکثیر از طریق کشت بافت نسبت به روشهای دیگر، ایجاد گیاهان سالم، تکثیر در طول سال، احتیاج به مکان کم و هزینه کمتر است. در مراحل مختلف کشت بافت گیاهی جهت رسیدن به هدف، ممکن است از دما، نور، نوع ریزنمونه، زمان و یا محیط کشتهای مختلف با ترکیبات متفاوت استفاده شود. همچنین مدیریت آلودگی و مواد بازدارنده نیز از مسایل مهم کشت بافت است. بنابراین بدست آوردن بهترین روش برای هر گیاه از اهداف آزمایشات در این علم می باشد و این امر با تغییر فاکتورهای موثر در کشت بافت امکان پذیر میگردد. بهبود حتی چند درصدی در تولید گیاهچه در هر بار کشت میتواند در مقیاس سال برای تولید کننده از اهمیت اقتصادی زیادی برخوردار باشد.(شریفی و همکاران، 1389)
1-13- تاریخچه کشت بافت
در طول قرن 19، ایده تولید کالوس از قطعات ساقه و انتهای ریشه به واقعیت پیوست. کالوس عبارت است از یک توده سلولی از سلولهای در حال تقسیم فعال که تمایز نیافتهاند. بعد کالوس از جوانهها، قطعات ریشه و شاخساره نیز تهیه شد. برای اولین بار هامبرلت در سال 1902 واژه کشت بافت سلول را بکار برد. او تلاش کرد که سلولهای گیاهی جدا شده را بطور درون شیشهای بر روی یک محیط غذایی مصنوعی حاوی محلول Knop (شامل پپتین، آسپارژین، و ساکاروز) کشت کند. واژه کشت بافت میتواند برای هر کشت چند سلولی بر روی محیط غذایی بکار برده شود (شریفی و همکاران، 1388). تکنولوژی کشت بافت گیاهی، کاربردهای متفاوت و فراوانی دارد از آن جمله میتوان از ریزازدیادی که اساس صنعت تولید انبوه گیاهان است نام برد. پیشرفت مطالعه جنبههای متفاوت رشد و تمایز گیاهان در دهه 1960 و 1970 بسیار سریع بوده است. به کمک تکنیک کشت گیاهان مطالعه و تحقیق در زمینههای مختلف از جمله مورفولوژی، فیزیولوژی، بیوشیمی، بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک فراهم شده است. تکثیر سریع ارکیده از طریق کشت کورم اولیه توسط مورل (1960) منجر به تاسیس اولین صنعت تکثیر سریع ارکیده بر اساس کشت بافت شد. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشهای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه میشود، این تکنیک به عنوان یکی از شاخههای زیست فناوری، کاربرد گسترده ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت میشود. در این نوع کشت، شرایط به گونهای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشهای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلولها و بافتها میباشد (شریفی و همکاران، 1389).
1-14- مراحل تکنیک کشت بافت
از زمان تهیه ریز نمونه تا به دست آوردن گیاه جدید مراحلی وجود دارد که ابتدا شامل چهار مرحله شروع و برقراری کشت ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال به خاک بود (موراشیگ ، 1974) . بعدا دبرگ و مین یک مرحله به نام مرحله صفر یعنی مرحله انتخاب گیاه مادری و آماده سازی را ارائه نمودند. در نهایت امروزه برای ریز ازدیادی مراحل زیر را در نظر می گیرند که شامل پنج مرحله ی آمادگی ، آغازی ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال است. در هر یک از این مراحل ، شرایط باید به گونه ای فراهم گردد که امکان دستکاری رشد گیاه در جهت مورد علاقه فراهم گردد. اکثر این عوامل هم آنهایی هستند که رشد و نمو طبیعی گیاهان را تنظیم می کنند. در مرحله صفر یا همان آمادگی هدف به دست آوردن گیاهانی است که به آب و مواد غذایی و شرایط محیطی نظیر نور و درجه حرارت و.. دسترسی داشته و از نظر سلامتی مشکلی نداشته باشند و بتوان از آنها جهت تهیه ریز نمونه استفاده کرد. در مرحله بعدی نیز که مرحله آغازی نام دارد هدف انجام کشت های بدون آلودگی است که ریز نمونه در محیط کشت مستقر می شود.
مرحلهی صفر: مرحله پیش ازدیادی یا انتخاب و پیش تیمار گیاهان مناسب
در این مرحله گیاهان مادری که در شرایط گلخانه ای با کمترین میزان آلودگی هستند انتخاب می شوند. قبل از جمع آوری نمونههای گیاهی برای به حداقل رساندن میزان آلودگی باید گیاهان مادری با قارچ کشها و حشرهکشها سمپاشی شوند تا میزان آلودگی در کشت درون شیشه ای به حداقل برسد، کاهش آلودگی باعث رشد بهتر و تکثیر سریع تر نمونهها در محیط کشت میشود. کنترل آلودگیها به طور معمول با پیش تیمار گیاهان مادری شروع میشود.(دبرگ و مین، 1981)
مرحله ی 1 : مرحله ضد عفونی سطحی و استقرار ریز نمونهها از درخت مادری
اولین مرحله در ریز ازدیادی ضد عفونی سطحی ریز نمونهها می باشد. وقتی نمونهای سالم در شرایط استریل قرار میگیرد، میتواند به سرعت تکثیر شود. این مرحله حساسترین مرحله در ریز ازدیادی است چرا که اغلب نمونهها در این مرحله در بیشتر موارد به علت آلودگیهای میکروبی از بین میروند. در این مرحله ریز نمونهها که به صورت قطعات کوچک تقسیم شده اند با مواد شیمیایی مانند هیپوکلریت سدیم و اتیل الکل ضدعفونی سطحی و بعد از آن چندین بار با آب مقطر استریل آبشویی میکنند. بعد از یک دوره کوتاه 3 تا 5 روزه آلودگی ریزنمونهها در محیط کشت مشخص میشود و نمونههای آلوده حذف شده و نمونههای سالم واکشت میشوند. در مرحله ضد عفونی ریز نمونهها باید دقت شود غلظت مواد ضدعفونی و مدت زمان استفاده از آنها به اندازهای نباشد که به بافت ریز نمونهها صدمه زده و مرگ سلولی را سبب شده و باعث قهوهای شدن و از بین رفتن آنها شود. (جورج، 2008 )
مرحله 2: تکثیر و پرآوری ریز نمونهها
این مرحله که فاز تکثیر است، گیاهچههای حاصل از استقرار در محیط کشت مخصوص تکثیر میشوند. هدف اولیه در این مرحله تکثیر ریز نمونهها بدون از دست دادن ثبات ژنتیکی آنها است. واکشت نمونهها که می توانند به صورت، جوانههای جانبی و انتهایی، جنینهای سوماتیکی و دیگر ارگانها باشند، در محیط مخصوص تکثیر باعث افزایش تعداد نمونهها میشود. گاهی اوقات ضروری است که شاخههای تکثیر شده به محیط کشت دیگری برای طویل شدن منتقل شوند . طی واکشتهای متوالی مقدار مورد نیاز از اندام گیاهی تولید میشود. (موراشیگ ، 1974)
مرحله 3: ریشه دهی زیر شاخهها
شاخههای به دست آمده از مرحله دوم، در این مرحله برای تکمیل فرایند ریز ازدیادی باید ریشهدار شوند. بیشتر گیاهان در مرحله ریشه دهی نیاز به محیط کشتی با نصف عناصر ماکرو دارند. در این مرحله معمولا از تنظیم کنندههای رشد متفاوت از مرحله پرآوری استفاده میشود. برای موفقیت مرحله سازگاری و انتقال به خاک ، گیاهچههای دارای ساختمان ریشه مناسب و قوی ضروری است. این مرحله نیاز به کار زیاد دارد و غالبا گران است. بطوری که محاسبه شده که حدود 35 تا 75 % از کل هزینههای تولید را شامل میشود.(جورج، 1993)
مرحله 4: مرحله سازگاری به شرایط طبیعی
این مرحله آخرین مرحله از کشت درون شیشه ای است که نمونههای تکثیر شده برای انتقال به گلخانه آماده میشوند. نمونههای تکثیر شده در شرایط درون شیشهای ، تمایل به رشد انفرادی و انجام عمل فتوسنتز دارند. نمونهها به تدریج از شرایطی با رطوبت زیاد به رطوبت کم و از شدت نور به شدت نور زیاد و دمای محیطی متغیر منتقل میشوند. اگر نمونهها در محیط کشت جامد باشند، قبل از انتقال باید آگار چسبیده به اندامهای گیاهچه به آرامی توسط آب شسته شود و سپس در خاک مناسب در گلدانهای کوچک کشت شوند. نمونهها به تدریج میتوانند بعد از 3 تا 6 روز به محیط جدید با شرایط نوری طبیعی وارد شوند و بعد از آن گیاهان به مخلوط ماسه، پیت و یا کمپوست منتقل میشوند و به تدریج سازگار میگردند. آبیاری مرتب نمونهها (روزهای اول انتقال به خاک با نصف غلظت محیط کشت) و مبارزه با عوامل بیماری زا و آفات از ضروریات انتقال موفق است (جورج، 1993؛.اهلووالا، 2002).
1-15- انواع ترکیبات محیط کشت
برای انجام موفقیت آمیز کشت بافت لازم است که یک محیط متناسب با رشد گیاه با توجه به نیازهای روزانه آن که عاری از هر گونه آلودگی است تهیه گردد. برای این کار لازم است پژوهشگر با انواع نیازهای یک گیاه آشنایی داشته و بتواند این مواد را با هم ترکیب کرده و یک محیط عالی برای رشد نمونه خود آماده کند. به طور کلی مواد مورد استفاده در محیطها شامل مواد معدنی، ترکیبات آلی، مواد طبیعی و مواد کمکی میباشد که در زیر به طور مختصر در مورد هر کدام توضیحاتی داده خواهد شد.
مواد معدنی
شامل دو گروه ماکروالمنتها (ازت ، فسفر ، پتاسیم ، کلسیم ، منیزیوم و گوگرد) و میکروالمنتها (مس، روی، آهن، منگنز، کبالت، بر و ید) میباشد که به صورت نمک به محیط اضافه می شوند.
منبع هیدرات کربن
چون ریز نمونهها فاقد هیدرات کربن هستند و یا اگر کلروفیل هم داشته باشند، به علت تاریکی و کمبود دی اکسید کربن در محیط قادر به انجام فتوسنتز نیستند، لذا لازم است که ساکارز به عنوان منبع هیدرات کربن به محیط اضافه گردد. شکر از عوامل مهم و ضروری در هر محیط کشت غذایی میباشد و برای رشد و نمو سلولها ، بافتها ، اندام-ها و گیاهچهها ضروری است. وقتی یک ریز نمونه روی محیط غذایی قرار داده می شود. در ابتدا رنگ سبز خود را از دست می دهد و بنابراین نمیتواند غذای خود را فراهم کند چون قادر به فتوسنتز نیست. پس این سلولها باید به نحوی که با منبع خارجی انرژی کربنی، تغذیه شوند. ساکارز معمول ترین منبع انرژی کربن در کشت بافت است. به جز ساکارز ، منو ساکاریدهایی مثل گلوکز و فروکتوز که منابع قابل سوخت و ساز انرژی کربنی هستند میتواند به طور معنیدار ، رشد سلولهای گیاهی را نسبت به ساکارز افزایش دهند. (پیری و نظریان 1380) .
1-16- ویتامینها
ویتامینها نقش کاتالیزوری داشته و در گیاهان سنتز میشوند. در کشت بافت بسیاری از ویتامینها توسط
سلولهای در حال رشد و نمو سنتز میشوند اما مقادیر ساخته شده کمتر از مقادیر مورد نیاز است. از اینرو لازم است ویتامینهای ضروری را به مقدار مورد نیاز به محیط کشت اضافه نمود. ویتامینهای گروه B مانند تیامین، اسید نیکوتینیک، پیریدوکسین، و میواینوزیتول نسبت به بقیه بیشتر مورد نیاز هستند. از بین آنها تیامین نقش مهمتری دارد )پیری و نظریان، 1380).
1-17- اسیدهای آمینه
اسیدهای آمینه و آمینها می توانند اهمیت زیادی در ریختزایی داشته باشند. تمام فرمولهای اسید آمینه، فرم های طبیعی موجود در گیاه هستند این مواد میتوانند شاخهزایی یا ریشهزایی را افزایش دهند. آمینواسیدها هنگام کاهش نیتروژن نقش خود را ایفا میکنند. در صورت ناکافی بودن نیتروژن، مکمل نیتروژن آلی کمپلکس مانند کازئین هیدرولیزات) 5/5گرم بر لیتر( ممکن است افزوده شود. سایر مکملهای آلی عبارتند از شیر نارگیل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو. هرچند محیطهای کشت سنتتیک ترجیح داده میشوند و مکملهای آلی که طبیعت شیمیایی ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروری بکار میروند) جورج و همکاران، 2008) .
1-18- تنظیم کنندههای رشد
هورمونها موادی هستند که در یک بخش گیاه ساخته شده و از خلال بافتها حرکت کرده تا به فعالیت سلولها در بخش دیگری تاثیر بگذارد برای مثال سایتوکنین ساخته شده در ریشه به ساقه منتقل شده و سبب رشد ساقه میگردد. حال اگر رشد متوقف شود تحویل سایتوکنین کاهش یافته و رشد اندامهای هوایی کاهش مییابد. این مقدمه اهمیت هورمونها را مشخص میسازد ولی در کشت بافت هورمونهای زیر بیشتر مورد استفاده قرار میگیرند. این گروه شامل اکسین طبیعی مثل ایندول استیک اسید (IAA) و اکسین های مصنوعی نظیر ایندول بوتریک اسید (IBA) ، نفتالین استیک اسید (NAA) هستند که اکسین های مصنوعی فعال تر از اکسین طبیعی هستند. همچنین اکسین های مصنوعی به وسیله آنزیم های موجود در بافت های گیاهی تجزیه نمی شوند. اکسین معمولا شروع ریشه دهی و رشد کالوس را تحریک می کند ولی رشد ریشه و جوانه های بالینی جلوگیری می کند ، سبب طویل شدن و رشد سلولی و تقسیم سلولی نیز می شوند. در غلظت بالا باعث رشد ریشه های نابجا می شود و در غلظت کم سبب تشکیل ساقه نابجا می شود. (اربنوا و همکاران، 2002)
1-19- سایتوکنین :
کشف سایتوکنینها رابطه نزدیکی با کشت بافت دارد. در مرحله شروع کشت بافت گیاهی مشاهده شد که مالت، عصارههای نارگیل و مخمر، رشد و القای جوانههای درون شیشهای را رونق میبخشند (مشایخی، 1387). سایتوکنینها شامل سایتوکنینهای طبیعی 2ip و زآتین و سایتوکنین مصنوعی نظیر بنزیل آمینو پورین (BAP ) و کینتین هستند. مزیت انواع مصنوعی این هورمون، فعالیت بیولوژیکی بالا و ارزان بودن آنها نسبت به انواع طبیعی است. این هورمون باعث تورم بافتها شده و ازدیاد شاخه و تقسیم سلولی را تحریک کرده ولی از شروع ریشهدهی جلوگیری میکند. این هورمون در تحریک نمو جوانههای جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار اهمیت دارد. به علت پایدار بودن در برابر گرما این هورمون را میتوان قبل از اتوکلاو به محیط کشت اضافه کرد.(کرسا و همکاران، 2012)
1-20- اسید جیبر لیک :
این گروه تاکنون بیش از 100 ترکیب است که رایج ترین نوعی که در کشت بافت استفاده می شود ، GA3 است. ناپایدار در برابر گرما است بنابراین بعد از اتو کلاو و از طریق فیلتراسیون ضد عفونی شده و به محیط افزوده میشود. کاربرد این هورمون نیز طویل شدن ساقهها و رشد طولی میانگرهها است و از پدیده خواب جلوگیری کرده و آن را از بین میبرد. باید این نکته را یادآور شد که اگر میزان نسبت اکسین به سایتوکنین افزایش یابد ریشه زایی صورت میگیرد و اگر این نسبت کاهش یابد سبب ساقهزایی میشود و اگر بینابین باشد کالزایی افزایش پیدا می کند (معینی و کهریزی ، 1382).
1-21- آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل
آگار از رایجترین عوامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده میشود. آگار پلی ساکارید پیچیدهای است که از برخی گونههای نوعی جلبک به دست میآید. غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت و ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی بالای آن منجر به تنش آب در محیط میشود و غلظتهای کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله شده تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریز نمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر میشود. به علاوه کشت ریز نمونه روی محیط کشت مایع میتواند باعث شیشهای شدن کشت شود. تصور میشود آگار دارای توانایی جذب مواد است که این توانایی میتواند در حذف مواد زاید سلولی از محیط کشت به روش مشابه زغال فعال عمل نماید. همچنین این خاصیت میتواند مانع از جذب برخی مواد شیمیایی به بافت کشت شده شود. یکی از موادی که به شدت توسط آگار جذب میشود سیتوکینین است. بنابراین غلظت بیشتر آگار ، جذب سیتوکینین از محیط کشت را برای بافت مشکل میکند. متداولترین جایگزین آگار، ژل رایت است. این ماده یک پلی ساکارید پیچیده خارج سلولی است که توسط باکتری Pseudomonas elodea تولید میشود . ژل رایت نسبت به آگار دارای مواد معدنی آزاد و ناخالصیهای آلی کمتری است. البته دارای غلظتهای بالای پتاسیم و منیزیم میباشد. تنها مشکل ژل رایت این است که بعضی از کشتها در ژل رایت سریع تر از آگار ، شیشهای میشوند. اغلب ژل رایت را همراه با آگار و با نصف غلظت های مورد نیاز هر کدام به کار میبرند. به این وسیله از مزایای هر دو ماده استفاده میشود و معایب آنها نیز کاهش مییابد (باقری و همکاران 1383).
1-22- ترکیبات مورد استفاده در ضد عفونی مواد گیاهی
ضد عفونی یا استریلیزاسیون شیمیایی میتواند به روشهای مختلف انجام شود : (باقری و همکاران 1383 و باقری و صفاری 1376)
1- الکل (اتانل): برای ضد عفونی مواد گیاهی از الکل 70 درصد استفاده میشود ، زیرا الکل 96 درصد باعث دهیدراته شدن بافتها میشود. از الکل 96 درصد اغلب برای ضد عفونی ابزار و میز کار استفاده میشود.
2- هیپوکلریت سدیم (وایتکس): دارای 5 درصد ماده فعال است. معمولا از هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد استفاده می شود. چنانچه گیاهان به هیپوکلریت سدیم حساس باشند از هیپوکلریت کلسیم برای ضد عفونی استفاده میشود.
3- هیپو کلریت کلسیم: این ماده به صورت پودر است و میتوان آن را به خوبی در آب معمولی حل کرد و محلولی شفاف به دست آورد (اغلب صاف میشود). هیپوکلریت کلسیم نسبت به هیپوکلریت سدیم، آهستهتر وارد بافتهای گیاهی میشود.
4- کلرید جیوه: این ماده برای گیاه ، انسان و دام خیلی سمی است و غلظت 01/0 تا 05/0 درصد برای مدت 2 تا 12 دقیقه برای ضد عفونی به کار میرود.
1-23- استفاده از آنتی بیوتیکها در رفع آلودگیهای درون بافتی
آلودگیهای داخلی در کشت درون شیشهای درختان یکی از مشکلات بسیار جدی بوده و اغلب به علت وجود میکرو ارگانیسمهایی اتفاق میافتد که در داخل گیاه هستند و نمیتوان آنها را از طریق مواد ضد عفونی کننده خارجی از بین برد. اگر منشا آلودگی در داخل بافتهای گیاهی باشد، آلودگی معمولا هنگامی ظاهر میشود که محل آلودگی قطع شده و در هنگام واکشت امکان باز شدن و تماس با محیط کشت فراهم میشود. اغلب آلودگیهای داخلی بعد از چند واکشت آشکار میشوند. رشد ضعیف و یا نکروزه شدن بافتها، میتواند نشانه یک نوع آلودگی داخلی، مثلا به باکتری باشد به طور کلی دو راه برای مبارزه با این مسئله وجود دارد: (باقری و صفاری، 1376 و ذوالفقاری نسب، 1382).
1- کشت مریستم (چون سلول های ناحیه مریستم عاری از عوامل بیماریزا هستند)
2- اضافه کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت
اغلب پاتوژنهایی که برای گیاه مادری خطری ندارند وقتی در محیط کشت درون شیشهای قرار میگیرند، باعث ایجاد خسارت جدید و از بین رفتن مواد گیاهی میشوند. در رفع آلودگیهای داخلی گاهی استفاده از آنتیبیوتیکها مهمترین راهکار میباشد. اتوکلاو کردن آنتیبیوتیک و یا اضافه کردن آن در دمای بالا به محیط کشت باعث کاهش اثر آنتیبیوتیک میشود (الیویرا و همکاران، 2010(.
1-24- ضد عفونی محیط کشت
در بیشتر موارد محیطهای کشت با استفاده از اتو کلاو استریل میشوند و استریل در اتو کلاو توسط بخار آب انجام میشود. با قرار دادن اشیا یا مواد در معرض بخار تحت فشار در دمای 121 درجه سانتی گراد و در مدت 10 تا 30 دقیقه کلیه میکروارگانیسمها از بین میروند. موادی که امکان استریل خشک آنها وجود دارد (مثل لولههای آزمایش، فلاسکها، پتریدیشهای خالی ، کاغذ و ابزارکار) به مدت 2 تا 3 ساعت در دمای 180 درجه سانتیگراد به صورت خشک در آون استریل میشوند. برای استریل موادی که در ضمن اتو کلاو کردن به دلیل حساسیت به گرما ، خاصیت خود را از دست میدهند ، از فیلترهای غشایی استفاده می شود که از جنس استات سلولز یا نیترات سلولز ، با منافذی به قطر 22/0 تا 45/0 میکرون بوده و با به کار بردن آنها، میکروارگانیسمهایی که بزرگتر از قطر منافذ هستند، حذف میشوند (باقری و صفاری 1376 ؛ امین و همکاران 2009 ).
1-25- قهوهای شدن بافتهای گیاهی
قهوهای شدن بافتهای گیاهی و در نتیجه آن محیط کشت، از جمله مشکلاتی است که در اغلب کشتهای تک جوانهای در درختان میوه دیده میشود. این پدیده ارتباط با نوع رقم گونه گیاهی دارد و میزان قهوهای شدن در یک رقم، در فصول مختلف و بسته به سن گیاه مادری میتواند متفاوت باشد. قهوهای شدن اغلب در گونههای گیاهی که دارای مقدار زیادی تانن و یا دیگر انواع هیدروکسی فنلها هستند، رخ میدهد. ایجاد زخم در اثر جدا کردن بافتها باعث ایجاد پلی فنل اکسیداز میشود که این عامل اصلی اکسیداسیون ترکیبات فنلی است. آزاد شدن مواد فنلی موجب قهوهای شدن ریز نمونه و محیط کشت شده و باعث توقف رشد ریز نمونهها و یا مرگ آنها میشود. این قهوهای شدن بافتها یک پدیده خود کاتالیزوری است. بطوریکه ترکیبات فنلی آزاد شده باعث صدمه به بافت شده که این عمل باعث افزایش آزاد شدن ترکیبات فنلی میشوند (ایزد پناه، 1380 ؛ سیدهو، 2010).
قهوهای شدن و نکروزه شدن در ریز نمونهها ارتباط معنی داری با روشهای ضد عفونی دارد. نمونههای برگ دار به خاطر حساسیت زیاد به غلظتهای بالاتر مواد ضدعفونی، بیشتر از نمونههای بدون برگ قهوهای و نکروزه میشوند. در این میان دو ماده کلرید جیوه و نیترات نقره از بقیه مواد قویتر میباشند چرا که هر دو از فلزات سنگین بوده و دارای قدرت بالایی در واکنش با پروتئین دارند که سبب تقویت متابولیسم سلولی می شوند. در حالی که هیپو کلرید سدیم و کلسیم به خاطر درجه فعالیت کمتر، میزان خسارت وارد شده به ریز نمونهها در آن کمتر است. البته غلظتهای بالای این دو ماده نیز میتوانند باعث قهوهای شدن و نکروزه در ریز نمونهها شوند ) کمالی، 1378).
میری و همکاران (1382) در مطالعهای که بر روی بررسی کاهش اکسیداسیون فنلی و پرآوری پایههای پا کوتاه سیب انجام دادند، پیشنهاد کردند که نمونههای تازه کشت شده به مدت 6 روز در یخچال نگهداری شوند که این کار در جلوگیری از فنلی شدن بسیار موثر بود. در مرحله پر آوری ترکیب 2ip با کینتین نیز بهتر از بقیه تیمارها جواب داد:
راه حلهایی که برای کاهش فنلی شدن میتوان ارایه داد شامل :
-گرفتن ریز نمونه در زمانهای خاص که میزان ترکیبات فنلی حداقل باشد.
- در مورد سن ریز نمونه، ریز نمونههای حاصل از گیاهان نونهال کمتر از گیاهان بالغ قهوهای میشوند.
-قرار دادن ریز نمونهها در آب مقطر به مدت 3 ساعت قبل از کشت باعث کاهش مواد فنلی میشوند.
- استفاده از تیمارهای ضد اکسیداسیونی
- تکرار واکشتها در فاصله زمانی کوتاه باعث جلوگیری از انتقال مواد فنلی به سلولهای سالم میشود. حذف بخشهای قهوهای و یا تجدید محیط کشت باعث کاهش تجمع مواد فنلی میشوند که علاوه بر سمیت به دلیل خاصیت خود کاتالیزوری باعث ترشح بیشتر مواد فنلی میشوند (کمالی، 1374 ؛ میری و همکاران، 1382).
ذوالفقار نسب (1382) با بررسی بر روی کلروزه و نکروزه شدن بافتها نشان داد که نوع محیط کشت عامل مهمی در ایجاد نکروزه شدن و کلروزه شدن است. عواملی مثل رشد سریع گیاهچهها در محیطی مثل MS به دلیل وجود مقادیر زیادی از نیترات، تماس نوک برگها با دیواره ظروف کشت ، تجمع رطوبت به صورت قطره در انتهای برخی از برگها و واکشت کردن با فواصل طولانی و در نتیجه کمبود برخی عناصر غذایی از جمله عوامل موثر در کلروزه و نکروزه شدن انتهای برگها است. این در حالی است که در محیط WPM این مشکلات کمتر دیده شده است. کلسیم به عنوان عنصر مهمی در دیواره سلولی از تحرک کمتری در بافتهای گیاهی برخوردار است و حرکت آن تابع تعرق گیاه است. در شرایط درون شیشهای ، وقتی میزان رطوبت بالا باشد به علت تعرق کم ، جذب کلسیم پایین میآید و در نتیجه قهوهای شدن و مرده شدن بافتها به علت تخریب سلولها اتفاق میافتد.(حسین و همکاران، 2003)
1-26- روشهای ریزازدیادی
ریزازدیادی عبارت است از تکثیر درون شیشهای گیاه با استفاده از اندامها، بافتها، سلولها، پروتوپلاسم و غیره. اگر چه برخی منابع بیان داشتهاند که جهت ریزازدیادی میتوان از تکنیکهای کشت جوانه، نوک ریشه، برگها، رویان، پرچم و حتی سلول استفاده کرد ولی شناخته شدهترین معنی ریزازدیادی کشت جوانههای منفرد و شاخساره میباشد. از این رو معمولاً کشت شاخساره و ریزازدیادی مترادف هم بکاربرده میشود. کشت نوک شاخساره بطور وسیعی در کشاورزی، باغبانی و جنگل کاری استفاده میشود. (شریفی و همکاران، 1388). در این تحقیق با توجه به اینکه روش جنینزایی غیرجنسی و کشت جوانه انتخاب شده است به توضیح آنها خواهیم پرداخت:
1-27- جنین زایی غیر جنسی
جنینهای غیرجنسی یا مستقیما بر روی ریزنمونه ظاهر میشوند(جنین زایی مستقیم) یا غالبا از کشت کالوسها بوجود میآیند (جنین زایی غیرمستقیم). این روش از نظر حفظ ثبات ژنتیکی صددرصد تایید شده نیست، هر چند جنینزایی غیرجنسی در کشت سلولی جهت توسعه و پیشرفت تکنولوژی تولید انبوه بوسیله راکتورها و همچنین در تولید بذر سنتزی از طریق کپسوله کردن بسیار مفید واقع می شود. بنابراین، این روش زمانی که استاندارد خیلی بالایی در ثبات ژنتیکی مد نظر نیست میتواند مورد استفاده قرار بگیرد. سلولهای گیاهی دارای خاصیت توتی پوتنسی هستند یعنی میتوانند یک گیاه کامل جدید را تحت شرایط مطلوب تولید کنند. استوارد و همکارانش در امریکا و رینرت در آلمان تقریبا بطور همزمان برای اولین بار تشکیل جنین غیرجنسی در کشت سوسپانسیون سلولی هویج را در سال 59- 1958 گزارش کردند. این جنین های غیرجنسی در رشد و ساختار مشابه جنین های جنسی بودند(شکل 1-4).
755650top
شکل 1-4 مراحل رشد جنینهای جنسی و غیرجنسی
این جنینهای غیرجنسی از نظر مورفولوژیکی به ترتیب مراحل زیر را طی میکنند: کروی، قلبی و اژدری. از ظهور لپهها میتوان به تفاوت مرحله لپهای بالغ و جنین مرحله قلبی/ اژدری پی برد. در مرحله اژدری تمایز سلولی منجر به تشکیل مریستم ساقه و ریشه میشود. جنینزایی یک روند دو مرحلهای میباشد. اولین مرحله، القا جنینزایی و دومین مرحله رشد جنین میباشد که در نهایت منجر به جوانه زدن میشود. نیازهای القا جنین و رشد جنین متفاوت هستند بنابراین محیطهای متفاوتی برای هر مرحله بهکار میرود (مارتینز رویز و همکاران، 2002 ). چهار مرحله را توصیف می کند: القا، رشد اولیه، بلوغ جنین و جوانه زدن. این مراحل از نظر ساختار مورفولوژیکی و همچنین در نیازهای فیزیکی- شیمیایی تفاوت دارند.
1-28- کشت مریستم
مریستمها را بر اساس خصوصیاتی از جمله محل استقرار، منشاء، نوع بافتی که ایجاد میکنند، ساختمان سیتولوژیکی و سرانجام رشد و تمایز، تقسیم بندی میکنند. براساس محل استقرار، مریستمها را به سه گروه تقسیم بندی میکنند:
مریستمهای انتهائی که در رأس ساقه و یا نوک ریشه قرار دارند.
مریستمهای جانبی که به موازات سطح اندامِ محل استقرار خود، تمرکز مییابند.
مریستمهای بین سلولی یا مریستمهای بینابینی که در پهنه بافتهای دیگر مستقر میشوند (نجاحی، 1370).1-29- باززایی
باززایی گیاهان از یک سلول یا اندام گیاهی از قابلیت های کشت بافت است که با کشف هورمونهای گیاهی امکانپذیر گردید. توانایی باززایی گیاه از یک سلول منفرد برای دستورزی ژنتیکی موجودات حائز اهمیت است. در گیاهان امکان باززایی یک گیاه کامل از یک سلول منفرد وجود دارد و این نوعی تکثیر غیر جنسی در گیاهان محسوب میشود. علاوه بر این، کشت بافت برای مطالعات پایهای در سلولهای حیوانی و گیاهی و دستورزی میکروارگانیسمها حائز اهمیت میباشد.(شارما و همکاران، 2000)
1-30- باززایی گیاهان کشت شده
اغلب هدف نهایی هر نوع کشت سلولی، باززایی گیاهان مورد نظر است، برخی گیاهان به خوبی در شرایط درون شیشهای باززایی میشوند و برخی دیگر مشکل دارند. درصد باززایی در گیاهان بسته به گونه گیاه، شرایط محیط و ترکیبات هورمونی متفاوت است. باززایی به دو روش مستقیم و غیر مستقیم صورت میگیرد. در روش مستقیم ابتدا بافتهای مریستمی کشت شده و سپس از اندامزایی مستقیم (شاخهزایی و ریشهزایی) برای باززایی گیاهان استفاده میشود. در این نوع کشت، شاخههای فراوانی از بافت ریزنمونه بدون واسطه کالوس تولید میشود. در روش باززایی غیر مستقیم عموماً تولید گیاهان با واسطه کالوس صورت میگیرد. یعنی ابتدا بافت ریزنمونه وادار به تشکیل کالوس میشود و سپس از کالوس اندامزایی صورت میگیرد. مسیر دیگری برای باززایی گیاهان از کالوس، تولید اجسام شبه جنینی در بافت کالوس است که این فرایند جنینزایی سوماتیکی نامیده میشود. در صورتی که هورمون اکسین از محیط کشت حذف شود، برخی سلولهای کالوس به حالت مریستمی در آمده و تولید اجسام شبه جنینی را میکنند. این جنینها به علت اینکه از بافتهای سوماتیکی منشاء میگیرند، به عنوان جنینهای سوماتیکی شناخته میشوند. این جنینهای نابجا قابل انتقال به محیط مناسب بوده و گیاه کامل را تولید میکنند(شریفی و همکاران، 1389).
1-31- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشهای
به طور معمول 4 مرحله جهت تکثیر درون شیشهای گیاهان مدنظر است که شامل استقرار در محیط کشت، ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشتهای متوالی و در نهایت ریشهزایی گیاهچههای تولید شده و سازگار کردن آنها با شرایط گلخانه و بیرون می باشد
1-32- استقرار در محیط کشت
مرحله استقرار از مهمترین مراحل در طی ریزازدیادی می باشددر طی این مرحله، ریزنمونه ها گندزدایی شده و در محیط کشت های استریل و در شرایطی عاری از بیماری زا، کشت می شوند. از اهداف اولیه مرحله استقرار تولید درصد بالایی از ریزنمونههای عاری از آلودگی سطحی است. آلودگیهای درونی و ترشح ترکیبات فنلی از ریزنمونه ها،مرحله استقرار را مشکلساز می کند(استیکلن و اورابی،2005).
1-33- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشتهای متوالی
دومین مرحله از ریزازدیادی محسوب می شود که در آن ریزنمونهها تکثیر یافته و بر تعداد آنها افزوده می شود. بعد از عبور از مرحله استقرار، ریزنمونه ها باید به سمت شاخه زایی هدایت شوند، بنابراین با تغییرات هورمونی می توان به این امر نزدیک شد. همچنین محیط کشت می توان به همان صورت قبل باقی بماند یا اینکه تغییر کند که به نوع گیاه بستگی دارد ( سعادت و هنرتی ، 2002).
1-34- ریشهزایی گیاهچههای تولید شده
مرحله ریشهزایی بستگی زیادی به مرحله پرآوری دارد زیرا نمونه ها بایستی از نظر طول شاخه ها، سطح برگ و توانایی لازم برای شروع یک زندگی اتوتروف مناسب باشند، چرا که شاخساره هایی که در این مرحله ریشه دار می شوند به محیط بیرون انتقال داده خواهند شد. این مرحله نیز با ترکیبات هورمونی متفاوتی همراه است و معمولاً از غلظت سیتوکنین ها کاسته می شود(پراکسی و همکاران، 2005). همچنین ریشه زایی در شرایط درون شیشه ای دارای چندین مزیت است: از جمله این که در مدت ریشه زایی کمتر در معرض بیماری ها و تنشهای محیطی قرار می گیرد و در نتیجه ریشه هایی استریل و گیاهان عاری از بیماری تولید می شود. از معایب این روش می توان از زیادتر بودن قیمت نهال ها برای تولید در سطح تجاری و محدود بودن رشد ریشه ها به فضای داخل شیشه نام برد. در رابطه با فاز ریشهزایی، سعادت و هنری(2001) بالاترین درصد ریزشاخسارهای ریشهدار شده را با IBA در مقایسه با NAA بدست آوردند. آنها همچنـین پیشنهاد کردند که القاء ریشهزایی تحت شرایـط تاریکی(به مدت 9 روز) در حضور اکسین صـورت بگیرد، این عمـل ریشـهدار شدن ریز شاخـسارهها را تا 83% امکانپذیر مـیساخت. از طرف دیگر، سانچز-اولت (1996) نشان داد که راندمان ریشهزایی 85 درصدی از القاء ریزشاخسارهها در محیط کشت MS با عناصر اصلی رقیق شده تا 25% در تاریکی مطلق حاصل میشود. زمان القاء به غلظت اکسین بکار رفته بستگی دارد. برای غلظت 3 میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید حداقل 7 روز، در حالی که برای غلظت 5 میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید 3 روز بطول بی انجامد. وحدتی و همکاران (2004) نشان دادند که اختلاف سرعت ریشهزایی وابسته به نوع رقم استفاده شده است.
1-35- تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان در شرایط درون‌ شیشه‌ای
با ظهور بیوتکنولوژی، شاخه جدیدی از تحقیقات در عرصه متابولیت‌های ثانویه گیاهی شکل گرفته است که به بیوتکنولوژی متابولیت‌های ثانویه معروف است. این شاخه بیوتکنولوژی به تولید درون شیشه‌ای متابولیت‌های ثانویه گیاهی و همچنین دست‌ورزی مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه برای تغییر الگوی تولید متابولیت در یک گیاه و یا تولید یک فرآورده ثانویه جدید در آن می‌پردازد. از اواخر دهه 60 میلادی، فناوری کشت ‌بافت به عنوان ابزاری در جهت مطالعه و تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی معرفی شده است. برخی مزیت‎های تولید متابولیت‎های ثانویه از طریق کشت بافت شامل کنترل بهینه شرایط کشت، افزودن پیشسازهای مورد نیاز برای افزایش بازده و تولید متابولیت‎های ثانویه خاص می‎باشد ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Ramachadra2002" راماچادرا و راویشانکر، 2002). در این رابطه از روش‌های زیر برای تولید متابولیت‌های ثانویه استفاده شده است:
1-36- روش کشت کالوس
تولید متابولیت‌های با ارزش اغلب به بافت‌های تمایزیافته نظیر کرک‌های غده‌ای و مجاری رزینی بستگی دارد. این قبیل ترکیبات را به طور معمول نمی‌توان در کشت‌های سوسپانسیون سلولی القاء کرد. استفاده از کشت‌های کالوس به جای سوسپانسیون سلولی درختان در برخی موارد منجر به تشکیل مجاری و غده‌هایی می‌شود که فرآورده‌هایی چون ترپن‌ها و روغن‌های فرار در آنها تولید می‌شود. البته این کشت‌های کالوس دارای پتانسیل قابل توجهی در راستای تولید متابولیت‌های ثانویه هستند ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Yeoman1987" یومان، 1987).
1-37- روش کشت سوسپانسیون سلولی
استفاده از سیستم‌های کشت سلول گیاهی برای تولید متابولیت‌های ارزشمند، خصوصاً در صنعت مواد دارویی و غذایی ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Nickel1990" نیکل، 1990) ، عموماً یک فناوری مناسب محسوب شده و به سرعت در حال گسترش است (جدول 1-1). پیشرفت در زمینه کشت سلولی با استقرار موفق لاین‎های سلولی برخی از گیاهان دارویی که منتهی ‎به تولید درصد بالایی از ترکیبات ثانویه در شرایط کشت‎های سوسپانسیون سلولی می‌شوند، محقق می‌گردد، که این امر توسط برخی از محققان گزارش شده است ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Tripathi2003" تریپادی، 2003).
جدول 1-1. مقایسه مقدار تولید برخی ترکیبات دارویی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی با گیاه کامل
(اقتباس از HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Misawa1997" میساوا، 1997)
گونه گیاهی نام فارسی گیاه ترکیب دارویی عملکرد (وزن خشک بر حسب درصد)
گیاه کشت سلولی
Lithospermum erythrorhizon سنگ دانه شیکونین 500/1 000/20
Morinda citrifolia توت هندی آنتراکینون‌ها 300/0 000/18
Catharanthus roseus پریوش آجمالیسین 300/0 000/1
Coleus blumei حسن یوسف رزمارینیک اسید 000/3 000/15
Nicotiana tabacum توتون اوبیکینون10 003/0 036/0
Dioscorea deltoids سیب زمینی شیرین دیوزژنین 000/2 000/2
Thalictrum minor برگ سدایی بربرین 010/0 000/10
Coptis japonica فلور چین بربرین 000/4 000/10
Galium verum شیر پنیر آنتراکینون‌ها 200/1 400/5
Galium aparine شیر پنیر آنتراکینون‌ها 000/2 800/3
Nicotiana tabacum توتون نیکوتین 000/2 400/3
یکی از موارد استفاده از فن‌آوری کشت بافت گیاهی در کشاورزی تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی است، غالباً مطالعات بسیاری بر روی تولید آنها از طریق کشت سلول‎های گیاهی متمرکز شده است. در حال حاضر با استفاده از کشت سوسپانسیون، امکان تولید برخی از متابولیت‎های ثانویه نظیر ترکیبات آلکالوئیدی ضدسرطان، ویتامین‎ها، آنزیم‎ها، طعم‎دهنده‎ها، رنگدانه‎ها، محرک‎ها و حشره‎کش‎ها که از نظر صنعتی بسیار مورد توجه می‎باشند، وجود دارد. در سال‎های اخیر تولید این فرآورده‎ها از طریق کشت سلول‎های گیاهی به صورت یک رویکرد مهم در تحقیقات کشت سوسپانسیون سلولی درآمده است ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "اورمزدی1384" اورمزدی و چلبیان، 1384). در بعضی موارد میزان متابولیت‎های موجود در سلول‎های کشت شده خیلی بیشتر از میزان آن در گیاه کامل بوده است و یا گاهی این سلول‎ها متابولیت‎هایی تولید می‎کنند که در گیاه اولیه تولید نمی‎شود ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "حسنلو1387" حسنلو و همکاران، 1387). با توجه به آنکه سرعت تولید متابولیت‎های ثانویه در طبیعت آهسته است، بنابراین میزان تولید آن اقتصادی نبوده و لذا ایجاد شرایطی برای تولید سریع و انبوه آنها از طریق کشت بافت گیاهی ضروری به نظر می‌رسد. در حال حاضر صنعت بدنبال آن است که استفاده از تکنیک‎های کشت درون شیشه‌ای گیاهی را آن چنان توسعه دهد که تولید متابولیت‎های ثانویه نسبت به استحصال آنها از گیاه کامل یا سنتز آزمایشگاهی ارزان‎تر شود ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "حسنلو1387" حسنلو و همکاران، 1387).
1-38- اهداف تحقیق:

—d1926

فهرست شکل‌ها
TOC h z t "شکل,5" شکل 1-2 کراسینگ‌آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف‌شدگی یا الحاق می‌شود]23.[ PAGEREF _Toc409965913 h 17شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد [23]. PAGEREF _Toc409965914 h 18شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد [62]. PAGEREF _Toc409965915 h 21شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای STR[26]. PAGEREF _Toc409965916 h 23شکل 1-6 مراحل انگشت‌نگاری ژنتیکی [38]. PAGEREF _Toc409965917 h 28شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ DNA[36]. PAGEREF _Toc409965918 h 30شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم‌های انسان[25]. PAGEREF _Toc409965919 h 32شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه [44]. PAGEREF _Toc409965920 h 35شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد[45]. PAGEREF _Toc409965921 h 36شکل2-2 استفاده از Multiplex PCR در روش پروفایلینگ[36] PAGEREF _Toc409965922 h 44شکل 2-3 دستگاه الکتروفورز موئینه ای[51] PAGEREF _Toc409965923 h 46شکل 2-6ladder به‌کاررفته در کیت ABI[25] PAGEREF _Toc409965924 h 50شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی میان سیزده جمعیت مختلف[46] PAGEREF _Toc409965925 h 71شکل 4-2.درخت فیلوژنتیکی میان نه جمعیت مختلف[46] PAGEREF _Toc409965926 h 71

فهرست نمودار‌ها
TOC h z t "نمودار,6" نمودار3-1 پارامترهای ژنتیکی جمعیت استان کرمانشاه برحسب درصد PAGEREF _Toc409966026 h 60نمودار3-2 پارامترهای ژنتیک جمعیت استان یزد برحسب درصد PAGEREF _Toc409966027 h 64

چکیده
بررسی تنوع ژنتیکی اقوام ایرانی با استفاده از STR
مونا داودبیگی
بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها با استفاده ار تعیین فراوانی آللی و پارامترهای ژنتیکی روش نوینی است که در سال‏های گذشته در بسیاری از جمعیت‏های جهان صورت گرفته و با استفاده از آن شباهت بسیاری از جمعیت‏ها به یکدیگر مشخص گردیده. شباهت جمعیت‏ها نشان‌دهنده‏ی همسان‌بودن خزانه‏ی ژنتیکی آنها و احتمالا یکسان‌بودن آن جمعیت‏ها در گذشته است. پس این احتمال وجود دارد که این جمعیت‏ها در گذشته یک جمعیت بوده باشند و بعد‏ها به دلایل جغرافیایی و یا مهاجرت‏ها از یکدیگر جدا شده باشند. یکی از راه‏های بررسی تنوع‌ ژنتیکی در جمعیت‏ها استفاده از توالی‏های کوتاه تکراری می‏باشد .هدف این مطالعه بررسی تنوع ژنتیکی در دو قوم یزد و کرد (کرمانشاه) از ایران بود. بدین منظور پروفایل ژنتیکی پنجاه فرد غیر‌خویشاوند از هر یک از جمعیت‏های کرمانشاه و یزد با استفاده از کیت ABIتهیه شد. این کیت حاوی پانزده جایگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت افراد) می‏باشد. نتایج نشان‌دادند که به جز دو جایگاه D7S820 وD19S433 در جمعیت کرمانشاه و سه جایگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در یزد سایر جایگاه‏ها در تعادل هاردی‏واینبرگ بودند. همچنین پارامترهای پزشکی‌قانونی شامل PIC,PD,PE,MP در این مطالعه بررسی شدند. سپس دو جمعیت با جمعیت‏های کشورهای همسایه مقایسه شدند. این مطالعه نشان داد که این جایگاه‏ها، جایگاه‏های مناسب برای استفاده در تست‏های تعیین هویت و مطالعات جمعیتی می‏باشند. در نتیجه‏‏ی مقایسات هم دیده شد که هر دو جمعیت یزد و کرمانشاه شباهت زیادی به جمعیت کشور ترکیه داشتند ولی با سایر کشورها متفاوت بودند. از طرفی یزد نسبت به کرمانشاه دارای جمعیت همگن‌تری بود که این مسئله می‏تواند به‌علت بکر بودن این جمعیت در طول سالیان مختلف باشد.
کلمات کلیدی: توالیهای کوتاه تکراری، نشانگرهای مولکولی، ژنتیک جمعیت
Abstract
Genetic variation in two Iranian population with STR
Mona Davood Beigi
In recent years studying genetic variation among population by determination of allele frequencies and genetic parameters became a new method that it has been done in different population all around the world. By using this method lots of similarities has been founded among population around the world. These similarities represent the same genetic pool and also it may show the same population in the past as well. So it seems that different population were one at the first and geographical situations or migrations were the reasons that caused its separation.
Studying short tandem repeats (STR) in genome is the best way to founding genetic variation in population. The aim of this study was to investigate the genetic variation of two population of Iran, Yazd and Kermanshah people.
For this purpose the genetic profile of 50 unrelated individual from each population prepared by using ABI kit. This kit contains fifteen str loci (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX, D18S51, D5S818 and FGA) and also amylogenin gene for sex determination. The result showed all the loci were in Hardy Weinberg equilibrium except two loci(D19s433 , D2s820) in Kermanshah and three loci (D19s433, D21s11 and VWA) in Yazd population. More over forensic parameters including PIC, PD, PE and MP have been calculated. After all the results have been compared with other population in neighbor countries.
This study revealed that these loci were the suitable loci for identification people and studying genetic population variation. Also the comparison showed that both of Yazd and Kermanshah people were similar to Turkish genetically, but were different from other countries. In addition Yazd has more homogeneous population than Kermanshah, that it could be due to pristine gene pool of this population in the past centuries.
Keywords: Short tandem repeats; Microsatellite markers; Population genetic
فصل اول
مقدمه
1-1 مقدمهدرگذشته مطالعه‏ی تکامل و مهاجرت‏ها از طریق کشف و بررسی بقایای اسکلتی و فسیل‏ها انجام می‏شد. اما از حدود سه دهه‏ی پیش، باستان‏شناسان و زیست‏شناسان با به‌کار‏گیری آنالیز‏های DNA موفق به کشف‏های بسیار دقیقی شدند که کمک فراوانی به ردیابی تاریخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. یکی از پر‏کاربرد‏ترین راه‏های آنالیز DNA، بررسی نشان‌گرهای ژنتیکی افراد است، که از مهم‌ترین آنها می‏توان به توالی‏های کوتاه تکراری موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالی‏هایی به طول یک تا سیزده نوکلئوتید هستند که در ژنوم موجودات در نواحی غیر‌کد‏کننده موجود می‏باشند. هر فرد توالی‏های منحصر به فردی دارد و هیچ دو نفری در جهان نیستند که توالی‏های یکسانی داشته باشند. به همین دلیل ازSTR ‏ها می‏توان در مطالعات جمعیتی و بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‏ها سود جست [1].
علاوه بر مطالعات جمعیتی ازSTR ‏ها می‏توان در موارد تعیین هویت‏، تعیین ابویت، تست‏های پزشکی‏قانونی و سایر موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهایی که برای تعیین هویت و مطالعات ژنتیکی جمعیت به‌کار می‏روند، یکسان هستند و شامل پانزده جایگاه به نام‏های D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOXو TH01 می‏باشند [1].
هم‌چنین از روش مشترکی موسوم به تعیین الگوی DNA در این زمینه‏ها استفاده می‏شود. هر فرد دارای الگوی DNA منحصر به فرد است که تا پایان عمر تغییر نخواهد کرد. محققان دریافتند که افراد یک جمعیت در الگوهای ژنتیکی خود دارای تشابهاتی هستند که منحصر به همان جمعیت است و با الگوی افراد جمعیت‏های دیگر متفاوت است. از این تفاوت‏ها می‏توان برای ردیابی تاریخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).
1-2 نشان‌گر چیست؟
صفاتی را که می‏توانند به عنوان نشانه‏ای برای شناسایی افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گیرند، نشان‌گر می‏نامند. مندل نخستین کسی بود که از نشان‌گرهای ظاهری برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود‌فرنگی استفاده کرد. اما گاهی صفات به سادگی و با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند، مانند گروه خونی. برای مشاهده چنین صفاتی باید آزمایش‏های خاصی صورت گیرد. به طور کلی هر صفتی که بین افراد متفاوت باشد، ناشی از تفاوت موجود میان محتوای ژنوم آنها می‏باشد. حتی بروز صفات به صورت متفاوت در میان افراد (در شرایط محیطی یکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. این تفاوت‏ها می‏توانند به عنوان نشانه یا نشان‌گر ژنتیک به کار گرفته شوند. به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد، باید دست کم دو ویژگی داشته باشد‌:
1-در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی)
2-به توارث برسد (2).
1-3 انواع نشان‌گرهای ژنتیکینشان‌گرهای ژنتیکی عبارتند از:
1-نشان‌گرهای مورفولوژیک
2-نشان‌گرهای پروتئینی
3-نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA و RNA
1-3-1 نشان‌گرهای مورفولوژیک
کاربرد نشان‌گرهای مورفولوژیک به ده‏ها سال پیش از کشف DNA مربوط می‏شود. نشان‌گرهای مورفولوژیکی که پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی هسته، از ابتدای این سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژیکی که عمدتا توسط یک ژن کنترل می‏شوند، می‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گیرند. این نشان‌گرها شامل دامنه وسیعی از ژن‏های کنترل‌کننده صفات فنوتیپی هستند و جز نخستین نشان‌گرها به شمار می‌آیند و از زمان‏های بسیار دور یعنی از زمانی که محل ژن‏ها روی کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار می‏گرفتند (2).
معایب نشان‌گرهای مورفولوژیک
اغلب دارای توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند.
تحت تاثیر شرایط محیطی و مرحله رشد موجود قرار می‏گیرند.
فراوانی و تنوع کمی دارند.
گاهی برای مشاهده و ثبت آنها باید منتظر ظهور آنها ماند.
اساس ژنتیک بسیاری از نشان‌گرهای مورفولوژیک هنوز مشخص نشده است‌(2).
1-3-2 نشان‌گرهای پروتئینی
در دهه‌ی 1950، نشان‌گرهای پروتئینی قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئین‏ها تحول شگرفی را ایجاد نمودند. برخی از تفاوت‏های موجود در ردیفDNA بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‏هایی با اندازه‏های مختلف تجلی کنند، که به روش‏های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و مطالعه می‏گردند. این قبیل نشان‌گرها را نشان‌گرهای مولکولی در سطح پروتئین می‏نامند که از آن جمله می‏توان به سیستم آیزوزایم/آلوزایم اشاره کرد. معمول‏ترین نوع نشان‌گرهای پروتئینی آیزوزایم‏ها هستند که فرم‏های مختلف یک آنزیم را نشان می‏دهند. آیزوزایم‏ها به‏ طور گسترده در بررسی تنوع ژنتیکی به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهای هم‌بارز نشان می‏دهند. اما این دسته از نشان‌گرها هم دارای معایبی هستند. برخی از معایب آن‏ها عبارت‌اند از:
محدود بودن فراوانی این نوع نشان‌گرها؛
تعداد آیزوزایم‏های قابل ثبت و مشاهده که می‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به یکصد عدد نمی‏رسد؛
محدود بودن تنوع ژنتیکی قابل ثبت در آیزوزایم‏ها‌(نداشتن چند شکلی)؛
پیچیدگی فنوتیپ‏های الکتروفورزی آیزوزایم‏ها به دلیل دخیل بودن آنزیم‏های مرکب از چند پلی‌پپتید مستقل در ترکیب برخی از آیزوزایم‏ها‌(3).
اما پیشرفت‏هایی که در زمینه‏ی الکتروفورز دو‏بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده، تجزیه تحلیل هم‌زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوری پیشتاز در عرصه نشان‌گر‏های مولکولی مطرح شده‏اند. تاثیرپذیری نشان‌گرها از محیط که به‌طور معمول به‌عنوان یکی از محدودیت‏ها و نکات منفی نشان‌گرهای مولکولی یاد می‏شود، در مورد این نشان‌گر‏ها تبدیل به برتری شده و جایگاه متمایزی را در بین سایر نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئومیکس‌(مطالعه سراسری کل پروتئین‏های موجود در یک سلول یا یک ارگانیسم) می‏تواند به‌طور هم‌زمان برای مطالعه بیان ژن و هم‌چنین برای شناسایی پروتئین‏های واکنش دهنده به شرایط محیطی مورد استفاده قرار گیرد(3).
1-3-3 نشان‌گرهای مولکولیDNA وRNA
دسته‌ای دیگر از تفاوت‏های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند. نه صفت خاصی را کنترل می‏کنند و نه در ردیف اسید‏های آمینه پروتئین‏ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‏ها را می‏توان با روش‏های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار داد. این نشان‌گر‏ها که تعدادشان تقریبا نا‏محدود است، فقط از راه تجزیه و تحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند. بنابراین به آنها نشان‌گرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‏شود. نشان‌گرهای مولکولی فراوان و در هر موجود زنده‌ای می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. تاکنون تعداد زیادی از نشان‌گرهای DNA معرفی شده‌اند. این نشان‌گرها از نظر بسیاری از ویژگی‏ها مانند درجه‏ی چندشکلی، غالب یا هم‌بارز بودن، تعداد جایگاه‏های تجزیه شده در هر آزمایش DNA، توزیع در سطح کروموزوم، تکرار‌پذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‏یابی DNA الگو و هزینه‏ی مورد نیاز با همدیگر متفاوت‌اند. انتخاب بهترین نشان‌گر به هدف مطالعه (انگشت نگاری، تهیه نقشه پیوستگی، ژنتیک جمعیت و روابط تکاملی) و سطح پلوئیدی موجود مورد مطالعه بستگی دارد‌(4).
مزایای کاربرد نشان‌گرهای مولکولی
عدم تاثیرپذیری آنها از شرایط محیطی خارجی و داخلی موجود؛
امکان به‌کارگیری آنها در مراحل نخستین رشد جنینی حیوانات و مراحل نخستین رشد موجودات؛
فراهم نمودن امکان مطالعه موجودات در خارج از فصل و محیط کشت؛
دقت و قابلیت مطلوب تفسیر نتایج؛
هم‌بارز بودن بسیاری از این نشان‌گرها؛
امکان استفاده از آنها در مورد گونه‏های منقرض شده؛
سهولت تشخیص افراد ناخالص از خالص؛
سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل نتایج؛
دسترسی به برنامه‏های رایانه‏ای قوی برای تجزیه و تحلیل و تفسیر سریع نتایج‌(4)
انواع نشان‌گرهای مولکولی
نشان‌گرهای DNA گروه بزرگی از نشان‌گرها را تشکیل می‏دهند. این نشان‌گرها سیر تحول و تکامل خود را به پایان نرسانده‏اند و ابداع و معرفی روش‏های متنوع و جدیدتر ثبت و مشاهده‏ی تفاوت‏های ژنتیک بین موجودات از طریق مطالعه‏ی مستقیم تفاوت‏های موجود در بین ردیف‏های DNA هم‌چنان ادامه دارد. نشان‌گر‏های DNA در مدت یک دهه تکاملی شگرف و تحسین‌برانگیز داشته‏اند‌(5).
ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR یک روش سریع تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعه‌های مورد نظر DNA است. در واقع PCR روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون در کم‌تر از نیم‌روز امکان‌پذیر می‏سازد. اما این فرایند هنگامی امکان‌پذیر است که دست‌کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانندسازی DNAدر طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه‏ی مورد‌نظرDNA هستند، به‌عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‏گیرند تا واکنش آنزیمی همانندسازی DNA درون لوله‌ی آزمایش امکان‌پذیر شود. این همانند‏سازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‏های پلی‌مراز صورت می‏گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‏ها به صورت تجاری دردسترس هستند‌(6).
واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز (PCR) در سال 1983 توسط کری‌مولیس در حالیکه در یک نیمه شب تابستانی در حال رانندگی بود، ابداع گردید و سبب انقلاب عظیمی در زیست شناسی مولکولی شد(6).
همان‌گونه که در شکل 1-1 نشان داده شده است، نشان‌گرهای DNAبه دو دسته‏ی کلی طبقه‌بندی می‏شوند.
نشان‌گرهای DNAمبتنی بر PCR
نشان‌گرهای DNA غیر مبتنی PCR(6).

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهای ژنتیکی‌(10)
1-3-3-1 نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCRاین دسته از نشان‌گرهای DNA بدون استفاده از روشPCR تولید می‌شوند و مورد استفاده قرار می‌گیرند.
انواع نشان‌گرهای غیر مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر(RFLP)
پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)
ماهوارک‏ها
1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودگر( (RFLPسرگروه نشان‌گرهای غیر‌مبتنی برPCR ، همان تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم DNA توسط آنزیم‏های محدودگر یا RFLP است. از بین نشان‌گرهای مولکولی DNA، RFLP ها اولین نشان‌گرهایی بودند که برای نقشه‌یابی ژنوم انسان توسط بوتستین و همکاران در سال 1980 و پس از آن برای نقشه‌یابی ژنوم گیاهان توسط بر و همکاران در سال 1983 مورد استفاده قرار گرفتند. در اوایل دهه 1980 بوتستین و همکاران استفاده از تفاوت طول قطعه‏های حاصل از هضم یا RFLP را برای مطالعه‏ی مستقیم DNA و یافتن نشان‌گر‏های ژنتیک جدید معرفی کردند. این تحول از پیامد‏های منطقی کشف آنزیم‏های محدودگر بود. این آنزیم‏ها که بسیار اختصاصی‏ هستند، ردیف‏های ویژه‏ای را روی مولکولDNA شناسایی کرده و آنها را از محل خاصی (نقطه‏ی برش) برش می‏دهند‌(7).
RFLP الزاما مختص ژن‏های خاص نیست، بلکه در کل ژنوم پراکنده است. ازاین رو، از نشان‌گرهای RFLP برای نقشه‌یابی تمام ژن‌ها در ژنوم انسان استفاده می‏شد(5). علاوه برRFLP که هنوز هم از قدرتمندترین و معتبرترین نشان‌گرهایDNA است، انواع مختلف نشان‌گرهایDNA با تفاوت‌های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه‌ی کاربرد، امتیاز‌بندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع ومعرفی شده‌اند‌(7).
مهم‌ترین مزایای RFLP
تکرارپذریری، دقت و قابلیت اعتماد این نشان‌گر فوق‌العاده زیاد است؛
این نشان‌گر هم‌بارز است و امکان تشخیص افراد خالص را از افراد ناخالص فراهم می‏آورد؛
فراوانی این نشان‌گر در حد بالایی است؛
RFLP تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد در صد ژنتیکی است(8).
برخی معایب RFLP
دشواری، پیچیدگی و وقت‌گیر بودن؛
RFLP ژنوم‌های بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روش‌های پیچیده‏تر و گران‏تر بیوشیمیایی است؛
RFLP نیازمند نگه‌داری میکروارگانیسم‌ها به‌منظور تهیه‏ی کاوشگر است که خود بر پیچیدگی این روش می‏افزاید؛
هزینه‏ی اولیه و نگه‏داری کاوشگر‏ها و کاربرد آنها بسیار زیاد است؛
نیازمندی به مقدار نسبتا زیاد DNA از محدودیت‏های دیگر روش RFLPاست به‌طوری که ده‏ها میکروگرم از DNAبرای هر فرد به منظور تجزیه‏ی ژنوم مورد نیاز است؛
از دیگر محدودیت‏های این نشان‌گر آن است که در گونه‏های بسیار نزدیک به یکدیگر این نوع نشان‌گر‏ها آلل‏های مشابهی را نشان می‏دهند(8).
1-3-3-1-2 پویش ژنومی نشانه‏های هضم (RLGS)در سال1991، هاتادا و همکاران روشی را برای شناسایی و انگشت‌نگاری موجودات عالی ابداع و معرفی کردند. پیش از ابداع این روش که بر مبنای نشان‌دار کردن هم‌زمان انتهای هضم شده‏ی هزاران قطعه‌ی DNA است، ردیابی و ثبت موجودات عالی با روش نشان‌دار کردن انتهای هضم شده غیر ممکن می‌نمود. دو دلیل اصلی برای این تصور ذکر شده است:
ژنوم موجودات عالی بسیار بزرگ و پیچیده است برای مثال ژنوم انسان 109×3 جفت باز دارد و در نتیجه‏ی هضم آن با آنزیمی مانند EcoRI بیش از یک میلیون قطعه‌ی DNA به وجود می‌آید. تفکیک این تعداد مولکولDNA حتی با الکتروفورز دو بعدی نیز غیر ممکن است.
معمولا DNA ژنومی در هنگام استخراج به صورت تصادفی و غیر‌اختصاصی شکسته می‌شود و ایجاد مولکول‏هایی با انتهای تصادفی می‏کند. این امر سبب ایجاد پس‌زمینه‌ی ناشی از نشان‌دار شدن این انتهاها طی فرایند نشان‌دارکردن می‏شود‌(9).
برای رفع این دو نقص تدابیری پیش‏بینی شد و روش RLGS ابداع گردید. این روش جدید که برای تجزیه و تحلیلDNA ژنومی به‌کار می‌رود، بر مبنای این فرضیه است که نقاط برش اختصاصی آنزیم‏های محدودگر می‌توانند به‌عنوان نشانه و وجهه تمایز ارقام و افراد به کار گرفته‌شوند.
در این روش انتهای آزاد مولکول‌های DNA که در اثر صدمات مکانیکی در طی استخراج به وجود آمده‏اند، مسدود می‏شود. سپس برای کاهش پیچیدگی، DNA ژنومی توسط آنزیم‏های محدودگر، با محل برش نادر، هضم و نقاط برش به‌طور مستقیم با فسفر پرتوزا نشان‌دار می‏شوند. آنزیم‏های با محل برش نادر معمولا هزاران قطعه DNA به وجود می‏آورند. سپس با الکتروفورز دو‌بعدی، قطعه‏های هضم‌شده‏یDNA از هم جدا شده و خودپرتونگاری صورت می‏گیرد. این روش یک الگوی دو بعدی با هزاران نقطه‏ی پراکنده (قطعه‏های نشان‌دارDNA) ایجاد می‏کند که هر یک می‏توانند به عنوان یک نشان‌گر به کار گرفته شوند(10)
برخی از مزایای روشRLGS
در هر آزمایش هزاران نشان‌گر به‌دست می‌آید؛
مقدار کمی DNAمورد نیاز است؛
در صورت استفاده از آنزیم‌های محدودگر متفاوت، تفاوت‏های بیشتری ظاهر و ثبت خواهند شد[10].
برخی از معایب روش RLGS
DNA مورد نیاز برای این روش باید از کیفیت مطلوبی برخوردار باشد؛
هضم ناقص DNA توسط آنزیم‏های محدودگر نتایج تکرار ناپذیر و گمراه کننده‏ای خواهد داشت؛
این روش پیچیدگی فوق العاده‏ای داشته و تفسیر نتایج حاصل از آن دشوار است(10).
1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها
ماهوارک‏ها نخستین بار در سال 1985 توسط جفری و همکاران گزارش شدند. پس از آن در سال 1988 تکثیر جایگاه‏های ژنی خاص نواحی تکرارشونده، روی ماهوارک‏ها در ژنوم انسان انجام شد.
این دسته از نشان‌گرها از نظر تکنیکی مبتنی بر استفاده از کاوشگرهای مصنوعی و کاربرد مواد پرتوزا و روش ساترن هستند.
ماهوارک‌ها واحدهایی 10 تا 100 جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. آنها معمولا یک هسته مشترک 10 تا 15 جفت بازی دارند که احتمالا در تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها موثرند. ماهوارک‌ها بیش‌تر در نواحی یوکروماتین ژنوم پستانداران، قارچ‌ها و گیاهان متمرکز‌ند. تنوع‌پذیری ماهوارک‌ها در حدی است که گاهی در انگشت‌نگاریDNA انسان مورد استفاده قرار می‏گیرند. از جمله‌ی ماهوارک‌ها می‏توان به تکرارهای پشت سر هم با فراوانی بالا (VNTR) اشاره کرد[11]. VNTR ها به دو دسته‌ی کلی تقسیم می‌شوند: VNTR تک مکانی و VNTR چند مکانی.
دسته‏ی نخست، تعداد متفاوت ردیف‌های تکراری در یک جایگاه ژنی و دسته‏ی دوم تعداد متفاوت ردیف‌های تکرار‌شونده در چندین جایگاه ژنی را نشان می‌دهند. الگوی بانددهی به‌دست آمده با استفاده از کاوشگر‌های VNTR تک مکانی ساده‏تر و قابل فهم‌تر است، زیرا هر فرد تعداد کمی باند واضح را نشان می‏دهد. در حالی‌که تعداد باندهای به دست آمده از کاوشگرهای مخصوص VNTRچند‌مکانی بیش‌تر است، به‌طوری که به‌طور هم‌زمان تا بیش از 30 باند به دست می‏آید(12).
در نخستین نشان‌گرهای مبتنی بر ماهوارک‌ها، از الیگونوکلئوتید‏های حاوی ریزماهواره به عنوان کاوشگر استفاده گردید و توسط علی و همکاران انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی نام‌گذاری شد.
از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی نشان‏دار‌شده مکمل با موتیف‌های کوتاه تکرار‌شونده در هیبریداسیون در ژل، با به کارگیری DNAژنومی برش داده شده با آنزیم‌های برشی خاص و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شده است. گوبتا و وارشنی در سال2000 طی تحقیقات خود مراحل زیر را برای انگشت‌نگاری الیگونوکلئوتیدی مطرح کردند:
جداسازیDNA ژنومی با وزن مولکولی زیاد
هضم DNAژنومی با یک آنزیم محدودگر مناسب
تفکیک قطعه‌های حاصل از هضم روی ژل آگارز
انتقال ساترن قطعه ها به غشا
دو ‏رگ‏گیری غشا با کاوشگر‏های(نشاندار با مواد پرتوزا یا غیر پرتوزا) الیگونوکلئوتیدی دربردارنده‏ی ردیف‌های دو یا سه تایی تکراری
خودپرتونگاری یا رنگ آمیزی برای مشاهده‏ی قطعه‌های دو رگ‌شده.
به‌کمک این روش می‌توان تنوع نواحی تکرار‌شونده‏ی مورد نظر را آشکار کرد. قطعه‌هایی از DNA که با الیگونوکلئوتیدها دو ‌رگ می‌شوند، در دامنه‌ای از اندازه‏ی چند صد جفت تا ده کیلو جفت باز قرار می‏گیرند. هم‌چنین گاهی بیش از یک نوع ماهواره در داخل یک قطعه‏ی برش داده شده قرار می‌گیرد. تفاوت‏هایی که این نوع نشان‌گرها نشان می‏دهند، به دلیل تفاوت در طول قطعه‌های برش داده‌شده‌ای است که در بردارنده‏ی ماهوارک‌ها هستند. از این روش برای شناسایی ژنوتیپ‌ها و همچنین در ژنتیک جمعیت استفاده می‌شود(12).
پس از مدتی، لیت و لوتی و سه گروه دیگر همین روش را برای ریزماهواره‏ها(عمدتا از نوع (CA)n) به‌کار بردند و دریافتند که ریز ماهواره‏ها به دو دلیل به مراتب آسانتر از ماهوارک‌ها با روش PCR تکثیر می‏شوند:
1-ریزماهواره‏ها کوچکتر از ماهوارک‏ها هستند؛
2-ردیف‌های تکرار‌شونده ریز ماهواره‏ای فراوانتر و توزیع آنها در کل ژنوم یکنواخت‌تر ازماهوارک‏هاست(13).
1-3-3-2 نشان‌گرهای مبتنی بر PCRنشان‌گرهای مبتنی بر PCR نشان‌گرهایی هستند که از توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر برای تکثیر قطعه‏ی خاصی از DNA استفاده می‌کنند. روش‏های مختلف در این گروه، در طول و توالی آغازگرها، سختی شرایط PCR و روش‏های جداسازی و آشکار کردن قطعات با همدیگر فرق دارند.
انواع نشان‌گرهای مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر(AFLP)
DNA چند شکل تکثیر‌شده‏ی تصادفی(RAPD)
تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)
نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف (STS)
1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌های حاصل از تکثیر (AFLP)
در سال 1995 نشان‌گرهای جدیدی ابداع و معرفی شدند که به نظر می‌رسد بسیاری از محدودیت‌های نشان‌گر‌های پیشین را نداشته باشند. در این روش که AFLP نامیده می‏شود نشان‌گرهایی تولید می‏شوند که علاوه بر دارا بودن مزایایRFLP مانند دقت و تکرار‌پذیری ویژگی‌های مثبت روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز را نیز دارند. پایه‌ی این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‌ها از بین تمام قطعه‌های هضم شده‌ی DNA است و سه مرحله‌ی مجزا دارد:
هضمDNA با یه جفت آنزیم محدودگر و اتصال آنها به آداپتور‌های اولیگونوکلئوتیدی؛
طراحی، ساخت آغازگر و تکثیر انتخابی دسته‌ای از قطعه‌های حاصل از هضم .با استفاده از ردیف بازی آداپتور‌ها و نیز ردیف بازی نقاط برش، طراحی و ساخت آغازگر انجام می‌شود، اما برای تکثیر انتخابی قطعه‌های حاصل از هضم دو، سه یا چند نوکلئوتید به انتهای’3 ردیف آغازگر اضافه می‌شود که موجب می‌گردد فقط قطعه‌هایی تکثیر‌شوند که ردیف بلافصل آنها در مجاورت نقطه‌ی برش ،مکمل نوکلئوتیدهای یاد شده باشد؛
جداسازی قطعه‌های حاصل از تکثیر روی ژل‌های توالی‌یابی(پلی‌اکریل‌آمید) و خودپرتونگاری یا رنگ‌آمیزی نقره برای ثبت نتیجه‌ها.
با استفاده از این روش تعداد زیادی از قطعه‌های حاصل از هضم، تکثیر و قابل رویت می‌شوند. این در حالی است که نیازی به دانش اولیه در مورد توالی‌بازی قطعه‌هایی که تکثیر می‌شوند، وجود ندارند. هر یک از این قطعه‌هایی که به صورت باند روی ژل ظاهر می‌شوند، می‌توانند به عنوان یک نشان‌گر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرند.
تعداد قطعه‌هایی که با این روش تکثیر می‌شوند، به دقت و توانمندی روش‌های جداسازی (الکتروفورز)، ثبت نتایج و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولا در این روش بین پنجاه تا صد قطعه‌ی حاصل از هضم تکثیر و با استفاده از ژل‌های پلی‌اکریل‌امید واسرشت ساز ثبت می‏شوند(19)
مزایای AFLP
این روش در مقایسه یا سایر روش‌ها بیشترین تعدا نشان‌گر‌ها به ازای هر ژل را ایجاد می‌کند؛
در این روش نیازی به تهیه و تدارک و نگه‌داری کاوشگر نیست .دقت و تکرار‌پذیری این نشان‌گر به دلیل انتخاب دمای زیاد هم رشته‌سازی و اتصال آغازگر به DNA الگو بیشتر از RAPD است(20).
معایب AFLP
پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش‌های میتنی برPCR ؛
عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشان‌گر‌ها؛
غالب بودن این نشان‌گر موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می‏گردد؛
تکثیر قطعه‌های غیر‌واقعی در AFLP موجب کاهش قابلیت اعتماد این روش می‏گردد(20).
1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثیرشده‏ی تصادفی(RAPD)در این روش از تک آغازگرهایی به طول هشت تا ده نوکلئوتید که ردیف بازی آن به طور قراردادی تعیین می‌گردد، استفاده می‏شود. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روی دو رشته‏ی DNA ژنومی می‌یابد و در آن نقاط به رشته‌های DNAمتصل می‌شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته‏ی مقابل به هم نزدیک باشند(فاصله‏ای که DNA قابل تکثیر باشد)، ردیف بین آن دو نقطه طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. فراورده‌های واکنش PCRروی ژل آگارز از هم جدا می‏شوند. تولید هر باند بیانگر وجود شباهت زیاد بین ردیف بازی آغازگرها و ردیف بازی محل اتصال درDNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را درDNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل های RAPD بیانگر جهش نقطه‌ای در محل اتصال آغازگرها و یا حذف یا (اضافه) شدن در ناحیه قابل تکثیر است. بنابراین چند شکلی در RAPDمعمولا به شکل حضور و غیاب یک باند پدیدار می‏شود. بدین معنی که نشان‌گرهای RAPD از نوع غالب‌اند و افرادی که دو نسخه از یک آلل دارند، به طور کمی از افرادی که یک نسخه از آن آلل را دارند، قابل تشخیص نیستند. تفاوت طول قطعه‏ها در RAPD از طریق تکثیر قطعه‌های DNA مکمل با ردیف‌های آغازگرهای اختیاری (ردیف مشخص ولی تصادفی) به‌دست می‌آیند. قطعه‏های تکثیر شده به صورت نوارهایی با وزن مولکولی متفاوت به‌طور مستقیم روی ژل قابل مشاهده‌اند (15).
مزایای RAPD
عدم نیاز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غیره؛
امکان بررسی هم زمان چندین جایگاه در ژنوم؛
عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ریف DNA برای ساخت آغازگر(16).
معایب RAPD
عدم تکرار پذیری؛
حساسیت بسیار به آلودگی؛
در صورت تغییر شرایط محیطی ظهور باندهای جدید؛
نامعلوم بودن جایگاه نشان‌گر RAPD روی نقشه‌ی ژنتیکی(16).
1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتیدی(SNP)تنوع‌ها و تفاوت‌هایی که به واسطه‏ی اختلاف در یک جایگاه نوکلئوتیدی(به علت جایگزینی، حذف یا ازدیاد) اتفاق می‌افتند، با عنوان تفاوت تک نوکلئوتیدی نامیده می‏شوند. این نوع از تنوع به‌وفور در ژنوم انسان اتفاق می‏افتد به طوری که مطالعات انجام گرفته توسط کاتانو-آنولز و گرس هوف (1998) در ژنوم انسان و اسب نشان می‏دهد که در فاصله‏ی هر دویست و پنجاه تا چهارصد نوکلئوتید یک SNP وجود دارد(17).
با اینکه‌SNP ها به وفور در ژنوم انسان یافت می‌شوند، ولی ایجاد و توسعه‌ی نشان‌گرهای SNP چندان آسان نیست. تهیه نشان‌گر‏های SNP شامل مراحل زیر است:
تعیین ردیف DNA اطراف SNP؛
تکثیر قطعه‌ای منحصر به فرد از DNA به کمک PCR به منظور غربال SNP؛
شناسایی SNP که شامل مشاهده‌ی دو آلل در افراد مختلف می‌باشد؛
مکان‌یابی نشان‌گر SNP و تعیین جایکاه خاص کروموزومی آن؛
تعیین فراوانی دو آلل در جمعیت؛
بررسی SNP در افراد و ژنوتیپ‌های مختلف(17).
برخی از معایب نشاگرهای SNP
SNPها به دلیل داشتن فقط دو آلل در یک جایگاه ژنی نسبت به نشان‌گر‌های چند آللی، اطلاعات کمتری را در نقشه‌های پیوستگی نشان می‌دهند؛
شناسایی نشان‌گرSNP بسیار پر‌هزینه و هم‌چنین زمان‌بر است(17).
1-3-3-2-4 نشان‌گرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف(STS)هر نشان‌گری که مبتنی بر واکنش PCR باشد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (معمولا بیش از بیست نوکلئوتید) ایجاد شود، یک نقطه‌ی نشانمند از ردیف نامیده می‏شود، زیرا پیش از طراحی آغازگر، بی‏شک در یک مرحله ردیف‌یابی صورت گرفته است. نشان‌گرهایی همچون تفاوت طول قطعه‌های قابل تکثیر (ALP) و ریزماهواره‏ها از آن جهت که مستلزم ردیف‏یابی برای طراحی آغازگر به منظور تکثیر DNA در یک نقطه‌ی خاص هستند، ذیل STS دسته‌بندی می‌شوند:
-تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
-ریز ماهواره‌ها (18).
1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏های قابل تکثیر(ALP)
ALP یکی از ساده‏ترین و سریع‏ترین نشان‌گرهای مبتنی بر PCR است. اگر ردیف باز‏های قطعه‏ای از DNA در یک موجود مشخص باشد (یا دست کم بخشی از دو انتهای آن قطعه معلوم باشد)، براساس آن می‏توان به طراحی و ساخت مصنوعی آغازگرهایی به طول بیست تا سی نوکلئوتید اقدام کرد. چنان‌چه نمونه‏های مختلف DNA توسط این آغازگرها و از طریق واکنش زنجیره‏ای پلی‌مراز تکثیر و سپس روی ژل الکتروفورز از هم جدا شوند، در صورت وجود اختلاف در طول قطعه‏ی قابل تکثیر، باندهایی به اندازه‏های مختلف تولید خواهند شد که بیانگر وقوع پدیده‏ی حذف یا اضافه در بین نمونه‏های مورد مطالعه است. این تفاوت در اندازه‏ی قطعه‏های قابل تکثیر که جهش‏های ژنتیک را نشان می‏دهد به عنوان نشان‌گرهای ژنتیک مورد استفاده قرار می‏گیرد(14).
مزایای ALP
از نظر کاربردی در بین نشان‌گرهای DNA،یکی از سریع ترین و ارزان‌ترین‌ها است؛
به‌کاربرد مواد پرتوزا یا بیوشیمیایی پیچیده نیاز ندارد؛
به‌تدارک، نگهداری و کاربرد کاوشگرها نیاز ندارد؛
بسیار اختصاصی عمل می‌کند، تکرار پذیری آن خوب است و تا حد بسیار زیادی می‌توان به نتایج آن اعتماد داشت؛
به‌مقدار خیلی کمی از DNA نیاز است؛
هم‌بارز بودن این نشان‌گر امکان تشخیص افراد خالص از هر یک از انواع افراد ناخالص را فراهم می‌آورد(14).
معایب ALP
طراحی و ساخت آغازگرها، به اطلاعات اولیه در مورد ردیف DNAژنوم مورد مطالعه نیاز دارد که با توجه به اینکه ژنوم بسیاری از موجودات به طور کامل در دسترس نیست این روش استفاده بسیار کمی دارد؛
هزینه‌ی اولیه مورد نیاز به منظور تولید تعداد کافی نشان‌گر ژنتیک با توزیع مناسب در سرتاسر ژنوم بسیار زیاد و مستلزم صرف وقت است(14).
1-3-3-2-4-2 ریزماهواره‌هاریزماهواره‏ها شامل واحدهای یک الی شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت‏ها پراکنده‏شده‏اند. به طوری که در هر ده کیلو جفت باز از ردیف DNA دست کم یک ردیف ریزماهواره‏ای دیده می‏شود. طول ریز‌ماهواره‏ها معمولا کمتر از 100 جفت باز بوده و توسط دو ردیف منحصر به فرد در دو طرف محدود شده‏اند. ریزماهواره‏ها به سه گروه عمده‌ی تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولا توسط بازهای غیرتکرارشونده قطع می‌شوند) و تکرارهای مرکب(دو یا تعداد بیشتری از واحدهای مجاور یکدیگر) تقسیم می‏شوند. تعداد تکرارها در هر واحد بسیار متفاوت است. حداقل تعداد واحد تکرار‌شونده برای ریز ماهواره‏های دو نوکلئوتیدی به ترتیب ده و هفت بار تکرار تعیین شده است(21).
مزایای ریزماهواره‏ها
کاربرد آنها و تفسیر نتایج نسبتا ساده است؛
سیستم چند آللی(تا 11 آلل) از ویژگی‌های بارز این نوع نشان‌گر است؛
ریزماهواره‌ها بسیار متنوعند؛
به وفور در ژنوم یوکاریوت‏ها یافت می‏شوند؛
بیشتر ریزماهواره‏ها غیر‏عملکردی هستند؛
همبارز هستند [22].
1-4 فراوانی، توزیع و سازماندهی ریزماهواره‏ها در داخل ژنومریزماهواره‌ها بسیار فراوان بوده و در کل ژنوم موجودات به صورت تصادفی پراکنده اند. فراوانی ریزماهواره ها در بین موجودات زنده متفاوت است. برای مثال تخمین زده شده است که ژنوم انسان به طور میانگین ده برابر بیشتر از گیاهان ریزماهواره دارد. علاوه برDNA کروموزومی تعداد زیادی ریزماهواره در DNA کلروپلاست ها نیز گزارش شده است. به کمک روش‏هایی از قبیل دورگه‏گیری در ژل، نقشه‏یابی ژنتیکی و فیزیکی و هم چنین دورگه‏گیری در محل فلورسنت، ثابت شده است که ریزماهواره ها به طور یکنواخت در ژنوم پراکنده‏اند. اگرچه در برخی موارد می توانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند(12).
1-5 مکانیسم ایجاد تنوع در طول توالی‏های تکراریچنین فرض می‏شود که جهش در تعداد واحدهای تکرار شونده در هر یک ازDNA های تکرار شونده با یکی از دو سازوکار کراسینگ آور نامساوی(uco) یا جفت نشدن ناشی از سرخوردن در طول رشته (خطای همانندسازی DNA ) صورت می‏گیرد. بیشتر عقیده بر این است که ریزماهواره‏ها و ماهواره‏ها توسط سازوکار کراسینگ آور نامساوی ایجاد می‏شوند، ولی در مورد ریزماهواره‏ها برخی افراد یکی از دو سازوکار و برخی دیگر هر دو سازوکار را موثر می‏دانند(23).
1-5-1 کراسینگ اور نابرابرگاهی کراسینگ اور نابرابر در داخل تکرارهای ریزماهواره‏ای بین کروموزوم های مشابه یا خواهری اتفاق می‏افتد و سبب تغییر در تعداد واحدهای تکرار شونده می‏شود.(شکل 1-2).کراسینگ اور نابرابر می‏تواند هم در میوز و هم میتوز اتفاق بیفتد. چنین توجیه می‏شود که وجود نواحی تکرارشونده احتمالا مانع از ردیف شدن کامل در همولوگ یا کروموزوم‏های خواهری می‏شود. به نظرمی‏رسد که این نوترکیبی مکانیزم اصلی ایجاد تنوع مینی‏ستلایتی است(23).

شکل 1-2 کراسینگ آور و مبادلات نابرابر بین کروماتیدهای خواهری سبب ایجاد حذف شدگی یا الحاق می‌شود(23.)
1-5-2 عدم جفت شدن ناشی از سرخوردن DNA در طول رشته(خطاهای همانند سازی)گاهی DNA پلی‌مراز در طول همانند سازی در نواحی تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای سر می‏خورد و موجب تغییر در تعداد واحد تکرار شونده می‏شود. در حقیقت سر خوردن پلی‌مراز در طول نواحی تکراری موجب عدم جفت شدن کامل دو رشته‏ی DNA شده و در نهایت حلقه‌هایی در رشته‌ی الگو یا رشته‏ی جدید ایجاد می‏شود(شکل1-3). این امر مکانیسم اصلی به وجود آورنده‏ی چندشکلی در میکروستلایت‌هاست(23).

شکل 1-3 متزلزل بودن پلی‌مراز حین همانندسازی DNA می‏تواند طول تکرار را به اندازه یک یا دو واحد تغییر دهد(23).اگر نتیجه‏ی همانند سازی ایجاد واحد های تکرار شونده‏ی اضافی باشد، حلقه در رشته ی جدید و اگر نتیجه‌ی همانند سازی کاهش در تعداد واحد‏های تکرار شونده باشد، حلقه در رشته‏ی الگو تشکیل خواهد شد(23).
گلدستین و شلوترر فرضیه‏ی عدم جفت شدن ناشی از سر‏خوردن در طول رشته را نسبت به فرضیه کراسینگ آور نامساوی به دلایل زیر به واقعیت نزدیکتر دانسته‏اند:
الف)‌در انسان بسیاری از تغییرات ریز ماهواره‏ای موجب تغییر در نشان‌گر های مجاور ناحیه ی ریز ماهواره‏ای نمی‌شود. بنابراین در ایجاد چنین تغییراتی نوترکیبی بی‏تاثیر است. از آنجا که جهش در فرضیه کراسینگ اور نامساوی، وابسته به نوترکیبی است، تغییرات ریز ماهواره ای و عدم تغییر نقاط مجاور با این فرضیه قابل توجیه نیست.
ب)‌نقصان در ژن‏هایی که در نوترکیبی نقش اساسی دارند تاثیری در پایداری ریز ماهواره‏ها ندارد.
ج)‌مطالعات انجام گرفته در ساکارومایسزسرویزیه نشان می‏دهد که پایداری ریز ماهواره‏ها در سلول‏هایی که تقسیم میوز را انجام می‏دهند مشابه با یاخته ها در تقسیم میتوز است. با توجه به اینکه نوترکیبی در میوز بیشتر از میتوز است، پس اگر فرضیه‏ی کراسینگ اور نامساوی صادق باشد، باید ریز ماهواره‏ها در میوز ناپایدارتر از میتوز باشد(23).


1-6 دامنه تنوع واحدهای تکرارشوندهدو مدل متفاوت برای توصیف دامنه‏ی تنوع تعداد واحدهای تکرار شونده‏ی ریز ماهواره‏ای وجود دارد:
1.مدل جهش گام به گام
2. مدل آللی نا محدود
1-6-1 مدل جهش گام به گاماگر فرض کنیم در ریزماهواره‏ها یک گام معادل تغییر در یک واحد تکرار شونده باشد، بنابر این مدل ریز ماهواره‏ها از نظر اندازه فقط در تعداد محدودی گام تفاوت دارند، به‌طوری که هر گام از گام بعدی به وسیله‏ی یک واحد تکرار شونده جدا می‏شود. در این مدل چنین فرض می‏شود که بسیاری از جهش‏های با فراوانی زیاد، فقط ریزماهواره‏ها را در یک گام یا دو گام‌(در یک زمان) تغییر می‏دهند. طرفداران این نظریه معتقدند که در بیشتر آزمایش‏ها، بیشترین تغییر در ساختار ریزماهواره‏ها مربوط به افزایش یا کاهش در یک واحد تکرار شونده بوده است(10).
1-6-2 مدل آللی نا‏محدودبر اساس این مدل هیچگونه محدودیتی در اندازه‏ی پتانسیل ریزماهواره‏ها وجود ندارد. از این رو تعداد نا محدودی از انتخاب‏ها می‌توانند اتفاق بیفتند که تمامی آنها احتمال یکسان را داشته باشند.
بسیاری از پژوهشگران معتقدند که ترکیبی از این دو مدل(عموما تغییر در یک یا دو واحد تکرار شونده و به مقدار کمتر تغییرات بزرگتر) بهتر می‌تواند تغییرات جهشی در ریزماهواره‏ها را توضیح دهد(10).
1-7 مارکرهای STRتوالی‏های تکراری کوتاه پشت سر هم(STRS) ، توالی‏های تکرارشونده کوتاه با طول 1-13 نوکلئوتید هستند که به شکل سر به دم قرار می‏گیرند. در ژنوم انسان، معمول‏ترینSTR ، توالی دو نوکلئوتیدی [CA]n است،که در این فرمول n تعداد تکرارهاست که معمولا بین 5 تا 20 بار متغیر است(24).
1-8 کاربرد مارکرهای STRمارکرهایSTR کاربردهای فراوانی دارد که از مهمترین آنها تعیین هویت افراد است(25). تعیین هویت در موارد بسیاری کاربرد دارد که از جمله‏ی آنها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
1- مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلی
2- شناسایی هویت قربانیان حوادث
3- تعیین هویت در موارد جنایی
4- ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتی(26).
1-8-1 مطالعات شجره‏ای و روابط فامیلیاز مارکرهایSTR می توان برای بررسی خویشاوندی دو یا چند نفر استفاده کرد. این نوع مطالعه را آنالیز فامیلی می‌گویند و کاربرد متداول آن در بررسی رابطه والدین ـ فرزندی است(27).
هرساله بیش از 300000 مورد تست ابویت به منظور تعیین رابطه پدر فرزندی در ایالات متحده انجام می‏شود. این تست‏ها معمولا شامل یک مادر، یک کودک و یک یا چند پدر مدعی است. همانطور که می‏دانیم هر فرد دارای دو سری آلل می‏باشد که یک سری آن را از پدر و سری دیگر را از مادر دریافت کرده است. بدین منظور آلل‏های پدر و فرزند برای یافتن تعدادی از جایگاه‏هایSTR مورد بررسی قرار می‏گیرند. اساس این تست بر این است که در فقدان جهش، آلل‏های کودک باید مطابقت کاملی با آلل‏های پدری و مادری داشته باشد(28-29-30).

شکل 1-4 آلل‏های فرزندان مجموعه‏ای از آلل‏های والدین آنها می‏باشد(26).علاوه بر این بسیاری از افراد برای شناسایی اقوام خود از مارکرهایSTR استفاده می‏کنند. برای مثال با آنالیز STR های کروموزومY می توان نسبت فامیلی میان مردان یک خانواده را مشخص کرد. زیرا همان‌طور که می‏دانید کروموزومY توارث پدری دارد و از پدر به تمام پسران به ارث می‌رسد. پس طبیعی است که تمام پسران خانواده در همه‏ی نسل‌هاSTR های یکسانی روی کروموزوم Y خود داشته باشند. آزمایشی که بدین منظور انجام می‏گیرد آزمایش Y-filer نامیده می‏شود. به کمک این آزمایش می‏توان روابط میان برادرها، عمو و برادرزاده و... را مشخص نمود(27-31).
1-8-2 شناسایی هویت قربانیان حوادثفجایع بزرگ، طبیعی یا بدست بشر، می‌تواند جان افراد بسیاری را بگیرد، تست‏‏‏هایی که برای شناسایی قربانیان حادثه انجام می‏شود، تست تعیین هویت قربانیان حادثه نامیده می‏شود. از این تست در مواردی مانند سقوط هواپیما ،آتش سوزی‏های بزرگ و حوادث تروریستی استفاده می‏شود. در این قبیل حوادث با استفاده از اسامی افراد، خانواده‏های آنها شناسایی می‏شوند و پس از مراجعه‏ی خانواده‌ها، از اعضای خانواده شامل پدر، مادر، فرزند، خواهر و برادر نمونه‏ی DNA گرفته می‏شود و نواحی STR آنها بررسی می‏شود. پس از این مرحله با استفاده از DNAبه دست آمده از بقایای اجساد پروفایل ژنتیکی آنها تهیه می‏شود و در نهایت با مقایسه‏ی پروفایل‏های تهیه شده هویت قربانیان شناسایی می‏شود(32).
1-8-3 تعیین هویت در موارد جناییتعیین هویت در موارد جنایی شامل دو بخش می‏باشد:
شناسایی افراد مجهول الهویه
ردیابی مجرمین(25).
1-8-3-1 شناسایی افراد مجهول الهویههر ساله میلیون‏ها نفر در سراسر جهان تحت شرایط مشکوکی مفقود می‏شوند. بسیاری از این افراد قربانی فعالیت‏های مجرمانه از قبیل تجاوز و قتل می‏شوند و هویت آنها ناشناس باقی می‏ماند. در این موارد هم می‏توان از مارکرهای ژنتیکی موجود در DNA افراد برای تعیین هویت آنها استفاده کرد(33).
سه دسته نمونه در مورد افراد قربانی وجود دارد:
1-نمونه مستقیم از فرد قربانی
2-نمونه خانواده قربانی
3-نمونه‌های ناشناس باقی مانده از انسان در صحنه‏ی جرم
این نمونه‏ی باقی مانده می‏تواند استخوان، دندان، بافت، تار مو، لکه ی خون و یا هر چیز دیگری باشد(34).
1-8-3-2 ردیابی مجرمینعلاوه بر این می‏توان از آنالیز DNA برای ردیابی و شناسایی مجرمین استفاده کرد. این که فردی مرتکب جرم و جنایتی بشود و نمونه‌ای از DNA خود را به جا نگذارد، تقریبا غیرممکن است. مو، لکه‌های خون و حتی اثر انگشت، مقادیر بسیار جزئی از DNA را دارند که برای مطالعه با PCR کافی هستند. این بررسی‌ها لازم نیست که بلافاصله انجام شوند، زیرا در سال‌های اخیر، با آزمایش DNA روی مواد بایگانی شده، تعدادی از جنایات گذشته ـ با عنوان پرونده‌های مختومه ـ نیز روشن شده است(35).
باید به خاطر داشته باشیم که یک پروفایل DNA به تنهایی فاقد اعتبار است و کاربردی ندارد. همیشه برای بررسی یک پروفایل DNA نیاز است که یک مقایسه‏ای انجام شود:
1-نمونه ی مورد بررسی که با Q مشخص می شود
2-نمونه شناخته شده که با K نمایش داده می شود
در موارد جنایی، نمونه ی صحنه ی جرم (Q) با نمونه ی فرد مظنون (K) و یا مظانین (K1,K2,K3,K...) مقایسه می شود . در یک مورد بدون مظنون، نمونه ی صحنه ی جرم با نمونه هایی که در اطلاعات کامپیوتری از افراد سابقه دار وجود دارد، بررسی می شود . (K1,K….,KN)(34).

شکل 1-5 شناسائی مجرمین به کمک مارکرهای STR(26).1-8-4 ردیابی تاریخ بشر و مطالعات جمعیتیباستان شناسان با بررسی و مقایسه توالی DNA انسان‌های امروزی با افراد مرده، به کشف منشأ تکاملی انسان امروزی و مسیرهای استقرار انسان در کره زمین می‌پردازند. این زمینه تحقیقاتی آرکئوژنتیک نامیده می‌شود(35).
ردیابی مهاجرت انسانی در طول تاریخ با استفاده از آنالیز DNA روش نوینی است. هدف از این کار تخمین ارتباط میان جمعیت ها بر اساس شباهت‏ها و تفاوت‏هایDNA آنها است. به همین منظور پروژه‏ی عظیمی در سال2005 به منظور ردیابی تاریخ بشر انجام شد که در آن از ده ها هزار نفر از افراد در سراسر جهان آزمایش به عمل آمد. اساس کار بر این مطلب است که اگر تکامل ژنوم‏ها به دلیل انباشتگی جهش ها رخ داده باشد، بنابراین میزان اختلاف در توالی نوکلئوتید های دو ژنوم می تواند زمان حضور جد مشترک آنها را مشخص نماید. انتظار می رود دو ژنومی که اخیرا از یکدیگر جدا شده اند در مقایسه با دو ژنومی که جد مشترک آنها قدیمی‏تر است، اختلاف کمتری داشته باشند(36).
در مطالعه روی یافتن مبدا انسان‏های امروزی و الگوی جغرافیایی مهاجرت‏های بشر از مطالعه‏ی ژن‏ها در جمعیت‏ها می‏توان استفاده کرد. بدین منظور ژن‏های انتخابی جهت بررسی باید دارای گوناگونی باشند. در صورت فقدان گوناگونی ژن‏ها، اطلاعات فیلوژنتیکی بدست نمی‏آید، زیرا همه‏ی افراد حتی اگر به جمعیت‏های مجزایی تقسیم شده باشند که تنها به صورت متناوب با یکدیگر آمیزش داشته‏اند، همچنان دارای همانندی‏های بسیاری خواهند بود. بدین معنی که توالی DNA مورد استفاده در آنالیز فیلوژنتیکی باید از متنوع ترین توالی‏های متغیر باشد(36).
در انسان از سه نوع توالی استفاده می‏شود :
ژن های چند آللی مانند اعضای خانواده‏ی HLA، که اشکال بسیار متفاوتی دارند .
ریز ماهواره‏ها که STR ها نیز جز این گروه به حساب می‏آیند .
DNA میتوکندریایی که به دلیل فقدان سیستم‏های ترمیمی موجود در هسته‌های سلول انسان که نسبتا به سرعت دچار انباشتگی نوکلئوتیدی می‏شوند. انواع مختلف DNA میتوکندریایی موجود در یک گونه را هاپلوگروه می‏نامند(36).
باید توجه نمود که آلل‌ها و هاپلوگروه‌های مختلف به طور هم‌زمان در جمعیت‌ها وجود دارند. به این ترتیب این لوکوس‏ها چند شکلی بوده و به کمک مقایسه ترکیب آلل‌ها و یا هاپلوگروه‌های آنها می‌توان اطلاعات مربوط به وابستگی بین افراد مختلف را بدست آورد. به دلیل جهش‌های ایجاد شده در سلول‏های تولید مثلی هر یک از موجودات، آلل‏ها و هاپلوگروه‏های جدیدی در جمعیت ظاهر می‏شوند. هر یک از آلل‏ها، فراوانی آللی خود را دارند که در طول زمان به دلیل انتخاب طبیعی و تغییر ژنتیکی اتفاقی تغییر می‌کند. انتخاب طبیعی به دلیل تغییر در تناسب (توانائی یک موجود جهت بقا و تولید نسل) رخ می‌دهد و بنابر نظریه‌ی داروین منجر به حفظ انواع مناسب و از بین رفتن انواع زیان آور می‏گردد. به این ترتیب انتخاب طبیعی، فراوانی آلل‏های کاهنده‏ی تناسب را کم کرده و فراوانی آلل‏های افزاینده‌‌ی تناسب را افزایش می‏دهد. در حقیقت در یک جمعیت آلل‏های اندکی ایجاد می‏شوند که تاثیر قابل توجهی بر تناسب موجود داشته باشند، اما هم‌چنان فراوانی آنها به دلیل تغییر ژنتیکی اتفاقی که جز جدا نشدنی طبیعت تولد،تولید مثل و مرگ است در حال تغییر می‏باشد. به دلیل انتخاب طبیعی یا تغییر ژنتیکی اتفاقی ممکن است یک آلل در جمعیت غالب شده و فراوانی آن به صد در صد نیز برسد، به طوریکه این آلل در جمعیت تثبیت شود. اگر یک گونه به دو جمعیت تقسیم شود به طوریکه آمیزش‌های فراوانی بین دو جمعیت رخ ندهد، فراوانی آلل در دو جمعیت به طور مختلف تغییر می‌کند. بنابراین پس از چند ده نسل این دو جمعیت ویژگی‏های ژنتیکی مجزایی را کسب می‏کنند. سرانجام جایگزینی ژنی متفاوتی در این دو جمعیت اتفاق می‏افتد ولی حتی قبل از آن نیز می‏توان از روی اختلاف فراوانی آللی در دو جمعیت، آن دو را از هم باز شناخت(36).
محققان طی سال‏ها تحقیقات در سراسر جهان با استفاده از اصول تئوری اطلاعات، پارامترهای عمومی برای هر جمعیت را به منظور تعیین مقدار اطلاعاتی که مارکرهای STR در جمعیت‏ها به ما می‏دهند، تعریف کردند. در یک نمونه‏گیری از مارکرهای افراد از سراسر جهان، مارکرهایی که بیشترین چندشکلی را در میان جمعیت‏های مختلف داشتند و منحصر به جمعیت‏های خاص بودند، انتخاب شدند .امروزه از این مارکرها برای بررسی تنوع و تفاوت میان جمعیت‏ها استفاده می‏شود(37).
1-9 سایر کاربردهای مارکرهای STRمارکرهای مختلف STR تحت عنوان کیت های تجاری مختلف در کنار تست‏های تعیین هویت کاربردهای گسترده‏ی دیگری دارند که از مهم ترین آنها می‏توان به موارد زیر اشاره کرد:
جمع آوری سلول های جنینی از خون مادر؛
بیماری های نقشه‏ی ژنومی؛
مشخص نمودن خطوط سلولی؛
تعیین هویت افراد استفاده کننده‏ی سرنگ مشترک؛
تشخیص کلون‏های موفق؛
بررسی و نظارت بر روی پیوند عضو؛
تشخیص کایمرهای ژنتیکی؛
تشخیص تومورهای سرطانی(26).
1-9-1 جمع آوری سلول های جنینی از خون مادرهنگامی که یک خانم باردار است تعدادی از سلول‌های جنینی می‏توانند از راه جفت وارد جریان خون مادر شوند. جمع‌آوری این سلول ها که تحت عنوان micro chimerism خوانده می‏شود و بررسی آنها با مارکرهای STR یک روش غیر تهاجمی برای تعیین رابطه‌ی پدر فرزندی است. همچنین با استفاده از این روش می‏توان جنسیت جنین را نیز تعیین نمود(26).
1-9-2 نقشه‏ی ژنوم بیماری‏ها
اسکن ژنوم انسان برای شناسایی نقشه ژنوم بیماری‏ها به طور معمول با استفاده از حدود چهارصد نشان‌گر STR در سراسر ژنوم در فواصل 10 سانتی مورگان انجام می‏شود. مرکز تحقیقات بیماری‏های ارثی در طول سال ها مطالعات و آزمایشات بسیاری را روی صدها نفر با استفاده از مارکرهای STR انجام داده است. هدف از این آزمایشات یافتن ارتباط میان فراوانی آللی در جمعیت های مختلف و بیماری های ژنتیکی بود. در پژوهش‌های صورت یافته ارتباط میان برخی مارکرها و بیماری‏ها مشخص شد. پس از آن از مارکر‏های مذکور می‏توان برای شناسایی تعیین دقیق محل ناشناخته‏ی ژن بیماری استفاده کرد(26).
1-9-3 تعیین هویت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترکیکی دیگر از کاربردهای مارکرهایSTR نشان دادن به اشتراک گذاری سرنگ در میان مصرف کنندگان مواد مخدر است. با این روش و با استفاده ازجایگاه D8 آزمایشگاه قادر به تشخیص هویت فرد و یا افرادی است که از یک سرنگ مشترک برای تزریق مواد مخدر استفاده کرده‏اند. با این روش می‏توان هویت شخصی را که منشا انتقال بیماری عفونی بوده و از سرنگ مشترک با سایر افراد استفاده می‏کرده تعیین نمود(26).
1-9-4 تشخیص کلون‏های موفقهنگامی که یک موجود کلون می‏شود ازSTR Typing برای آزمایش آن موجود استفاده می‏شود. برای مثال در کلون کردن موجوداتی مانند سگ و گربه. این روش برای آزمودن میزان موفقیت در کلون کردن به کار می‏رود. اگر یک پروفایل STR یکسان میان موجود کلون شده و سلول‎های مادری اولیه مشاهده نشود، در این صورت کلون کردن موفقیت آمیز نبوده(26).
1-9-5 بررسی و نظارت روی پیوند عضواز کاربردهای دیگر مارکرهای STR، نظارت پیوند سلول‏های پیوند شده بعد از پیوند مغز استخوان است، آزمایش STR از فردی که پیوند گرفته می‏تواند در تشخیص نارسایی پیوند مفید واقع شود(26).
1-9-6 تشخیص کایمرهای ژنتیکیChimerism حضور دو خط سلولی ژنتیکی متفاوت در یک ارگانیسم است که می‏تواند از طریق پیوند سلول‏های بنیادی خونی و یا انتقال خون و یا به طور ارثی در شخص اتفاق بیفتد. در سال 2004 آزمایشی روی افراد دهنده و گیرنده‏ی پیوند انجام شد که توانایی بالای 27 نشان‌گر STR به کار گرفته شده، ازجمله نشان‌گرهای CODIS در تشخیص کایمرها شگفت انگیز بود(26).
1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولیدر آزمایشگاه خطوط سلولی می‏توانند با سایر خطوط سلولی آلوده شوند. در نتیجه ممکن است با هم مخلوط و یا به یکدیگر تبدیل شوند احراز هویت خط سلولی انسان در حال حاضر به وسیله ی سازمانی در آمریکا انجام شده است. به کمک مارکرهای STR می‏توان آلودگی متقاطع بین خطوط سلولی مختلف را به سرعت کشف کرد و همچنین می‏توان برای مشخص کردن خطوط سلولی انسان به عنوان یک مرجع جهانی سود جست. در طول چند سال گذشته بیش از 500 خط سلولی از انسان به کمک این روش و با استفاده از 8 جایگاه STR بدست آمده است(26).
1-9-8 تشخیص تومورهای سرطانیفقدان هتروزیگوسیتی (LOH) پدیده‏ای است که در آن حذف در یک ناحیه‏ی لوکوس منجر به عدم تکثیر در PCR می‏شود، به طوری که یک هتروزیگوت واقعی به عنوان یک هموزیگوت به نظر می رسد. این پدیده در بسیاری از افراد مبتلا به تومورهای سرطانی دیده می‏شود. بررسی روی بافت های سرطانی با بافت نرمال با استفاده از STR نشان می‏دهد که جایگاه های مختلف در بافت سالم ارتفاع بلندتری نسبت به بافت های سرطانی نشان می دهند؛چرا که LOH سبب حذف در آن ناحیه شده است(26).
1-10 روش‏های کلی شناسایی هویت افراد در سطح مولکولیدو روش کلی برای شناسایی هویت افراد در سطح مولکولی عبارتند از:
اثر انگشت ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگر
تعیین الگوی DNA با PCR توالی‌های کوتاه تکراری(38).
1-10-1 روش انگشت‌نگاری ژنتیکی از طریق هیبرید کردن با DNA جستجوگراولین روشی که در آنالیز DNA با هدف شناسایی افراد به کار رفت، روشی بود که در اواسط دهه 1980 توسط سر آلک جفری از دانشگاه لیستر ارائه شد . این روش براساس نوع دیگری از تنوع ژنوم انسان، موسوم به توالی تکراری بسیار متغیر پراکنده بود. همانگونه که از نام این توالی‌ها بر می‌آید، این توالی‌ها عبارتند از یک توالی تکراری که در جایگاه مختلفی‌(به‌طور پراکنده) از ژنوم انسان وجود دارد. نکته کلیدی این توالی‌ها این است که جایگاه ژنتیکی آنها متنوع است و در افراد مختلف در جایگاه‌های مختلفی از ژنوم قرار دارند(38).
توالی که در ابتدا برای انگشت‌نگاری ژنتیکی بکار رفت، توالی GGGCAGGANG (N: هریک از چهار نوکلئوتید) بود. برای تهیه اثر انگشت یک نمونه، DNA آن را با آنزیم محدودگر برش می‌دهند و قطعات حاصل را با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم تفکیک کرده و با آزمون ساترن بلات مورد بررسی قرار می‌دهند. هیبریداسیون با جستجوگری که دارای این توالی بود چند سری از نوارها را مشخص کرد. هریک از این نوارها مربوط به قطعه‌ای از DNA هضم شده بود که دارای این توالی تکراری بود. به دلیل تنوع جایگاه‌های این توالی اگر این آزمون با نمونه DNA فرد دیگری تکرار شود، نتیجه متفاوتی به دست می‌آید و می‌توان نتایج حاصل را انگشت‌نگاری ژنتیک این افراد محسوب نمود . در شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی نشان داده شده است(38).

شکل 1-6 مراحل انگشت نگاری ژنتیکی(38)
1-10-1-1 محدودیت‏های روش انگشت نگاریاین روش در کارهای جنایی خود را بسیار ارزشمند نشان داد اما سه محدودیت داشت:
مقادیر بالایی از DNA برای انجام آزمون مورد نیاز است، زیرا این روش نیازمند آنالیز هیبریداسیون است. برای انگشت‌نگاری نمی‌توان از مقادیر اندک DNA موجود در مو و لکه‌های خون استفاده کرد.
بحث کردن در مورد الگوهای حاصل از انگشت‌نگاری مشکل است، زیرا نوارهای حاصل شدت و ضعف‌های متفاوتی دارند. از نظر قانونی، کوچک‌ترین اختلاف شدت در انگشت‌نگاری ژنتیکی یک متهم برای برائت او کافی است.
با وجود اینکه جایگاه‌های تکراری پراکنده بسیار متنوع هستند، اما اندک احتمالی نیز برای یکسان بودن یا حداقل تشابه الگوی حاصل از دو فرد وجود دارد. این موضوع می‌تواند منجر به برائت یک متهم شود(38).
1-10-2 روش پروفایلینگ
روش قدرتمند پروفایلینگ DNA چنین مشکلاتی را ندارد. در پروفایلینگ از توالی‌های معروف به توالی‌های چند شکلی STR استفاده می‌شود. در این روش، به وسیله PCR با پرایمرهایی که به توالی‌های جانبی STR می‌چسبند، به سرعت می‌توان مقادیر بسیار اندک DNA را افزایش داد. بعد از PCR، محصولات از نظر اندازه نوارها یا وجود نوارهایی که الل‌ یا آلل‌های موجود در نمونه DNAی مورد آزمون هستند، با الکتروفورز ژل آگارز بررسی می‌شوند. روش پروفایلینگ DNA، به دلیل استفاده از PCR بسیار حساس است و امکان انجام آزمون روی مو و دیگر نمونه‌هایی که مقادیر اندکی DNA دارند، فراهم می‌آورد. در نتایج حاصل نیز شکی وجود ندارد و مقایسه میان پروفایل‌های DNA معمولا به عنوان یک مدرک پذیرفته می‌شود. با استفاده از این روش امکان اینکه دو نفر، البته بجز دوقلوهای یکسان، دارای پروفایل‌ مشابهی باشند برابر یک در 1015 می‌باشد. با توجه به جمعیت کره زمین که حدود 109×6 می‌باشد، امکان تشابه آماری پروفایل مربوطه در دو نفر به قدری اندک است که می‌تواند غیرممکن تلقی گردد. نوع هر STR با PCR بوسیله پرایمرهایی که با فلورسنت نشاندار شده‌اند و به دو طرف نواحی تکرار شونده متصل می‌گردند، تعیین می‌شود. سپس الل‌های موجود در STRها با تعیین اندازه به وسیله ژل الکتروفورز موئینه‌ای مشخص می‌شوند. دو یا چند STR می‌تواند با PCR چندگانه مشخص گردد، مشروط به اینکه محصولات از لحاظ اندازه همپوشانی نداشته باشند یا هر جفت پرایمر با فلورسانت متفاوتی نشاندار شده باشند تا امکان تشخیص در ژل الکتروفورز موئینه را داشته باشند. در شکل 1-7 مراحل روش پروفایلینگ نشان داده شده است‌(38).

شکل 1-7 مراحل پروفایلینگ ‌DNA(36).1-11 تاریخچه استفاده از مارکرهایSTR
مارکرهای STRبرای اولین بار به عنوان ابزاری قوی در تست تعیین هویت انسانی در سال 1990 به‌کار گرفته شدند. دستگاه پزشکی قانونی ((FSS مطالعه برای شناسایی جایگاه‌های جدید و ارتباط جایگاه های شناخته شده با تنوع در جمعیت‏ها را آغاز کرد. پس از آن پلیس سلطنتی کانادا (RCMP) به همراه تعدادی از آزمایشگاه‌های اروپا تلاش‌های اولیه را در رابطه با جایگاه های STR آغاز کردند. اولین جایگاه‏های مورد استفاده شامل چهار جایگاه TH01،VWA ، FES/FPS و.F13A1 نسل دوم کیت‌ها ((SGM شامل جایگاه‌های TH01، VWA‌، FGA ،D8S1179 ،D18S51 و D21S11 بود. پایگاه داده‌های ملی DNA انگلستان ((NDNAD در سال 1995 جایگاه ژن آمیلوژنین (برای تعیین جنسیت) را به کیت SGM اضافه کرد. با توجه به تکنولوژی STR Typingو موفقیت‏هایی که در این زمینه در انگلستان به‌دست آمد، FBI درصدد برآمد که با استفاده از لوکوس‌های STR، بنیان CODIS را شکل دهد(41).
1-12 CODIS چیست؟سیستم شاخص اندیس‌دهی ترکیبی CODISشامل سیزده جایگاه STRاست. در شکل 1-8 محل قرارگیری این جایگاه‌ها روی کروموزوم‌های انسان نشان داده شده‌اند. نرم افزار CODIS در سال 1990 به عنوان نرم افزاری برای FBI تاسیس گردید. این نرم افزار در صورت اولیه برای آنالیز پروفایل‏های RFLP مورد استفاده قرار می‏گرفت که در بانک اطلاعاتی قابل جستجو بود. تکنولوژی DNA پزشکی قانونی و تکنولوژی کامپیوتری با یکدیگر ادغام گردیدند و باعث بهبود این نرم افزار شدند و این بهبود در جهت نیاز‌های پزشکی قانونی صورت گرفت. در سال 1997نرم افزار CODIS بر اساس مارکرهای STR طراحی شد. سیزده جایگاه STRکه امروزه تحت عنوان CODIS خوانده می‏شوند، عبارتند‌از:
D8S2179
D21S11
D7S820
CSF1PO
D3S1358
TH01
D13S317
D16S539
VWA
TPOX
D18S51
D5S818
FGA (42).

شکل 1-8 جایگاه‌های CODIS روی کروموزوم های انسان(25).1-13 کیت مورد استفاده در تعیین هویت
برای تعیین هویت از کیتAmp FI STR Identifiler PCR Amplification استفاده می‌شود، که حاوی 15 جایگاه تترانوکلئوتید STRبه همراه مارکر آمیلوژنین که برای تشخیص جنسیت به کار می‏رود می‏باشد. از این پانزده جایگاه، سیزده جایگاه، جایگاه‌های شناخته شده‏ی سیستم اندیس دهی ترکیبی‌(CODIS) هستند، اما علاوه بر آنها دو جایگاه دیگر هم در این کیت گنجانده شده است. جدول(۱-1) نشان دهنده‌ی نام جایگاه‏های موجود در CODIS، به همراه موقعیت کروموزومی هر یک از جایگاه‏ها و آلل‏های موجود در هر جایگاه است(43).
جدول 1-1 جایگاه‏های موجود در کیت ABIآلل‌های موجود در هر جایگاه موقعیت کروموزومی نام جایگاه
8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 8 D8S2179
24,24.2,25,26,27,28,28.2,29,29.2,
30,30.2,31,31.2,32,32.2,33,33.2,
34,34.2,35,35.2,36,37,38 21q11.2-q21 D21S11
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 7q11.21-22 D7S820
6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 5q33.3-34 CSF1PO
12,13,14,15.16,17,18,19 3p D3S1358
4,5,6,7,8,9,9.3,10,11,13.3 11p15.5 TH01
8,9,10,11,12,13,14,15 13q22-31 D13S317
5,8,9,10,11,12,13,14,15 16q24-qter D16S539
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,
26,27,28 2q35-37.1 D2S1338
9,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15,
15.2,16,16.2,17,17.2 19q12-13.1 D19S433
11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,
22,23,24 12p12-pter VWA
6,7,8,9,10,11,12,13 2p23-2per TPOX
7,9,10,10.2,11,12,13,13.2,14,14.2,
15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25
26,27 18q21.3 D18S51
X,Y Amelogenin
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 5q21-31 D5S818
17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,26.2
27,28,29,30,30.2,31.2,32.2,33.2,
42.2,43.2,44.2,45.2,46.2,47.2,48.2
50.2,51.2 4q28 FGA
1-14 معرفی استان‏ها1-14-1 استان کرمانشاه
کرمانشاه یکی از باستانی‌ترین شهرهای ایران است و بر اساس افسانه ها توسط طهمورث دیوبند - پادشاه افسانه‌ای پیشدادیان ساخته شده است. برخی از مورخین بنای آن را به بهرام پادشاه ساسانی نسبت می‌دهند. کرمانشاه در زمان قباد اول و انوشیروان ساسانی به اوج عظمت خود رسید. در اوایل حکومت شاه اسماعیل صفوی سلطان مراد آق قویونلو با 70 هزار نفر کرمانشاه و همدان را اشغال کرد. صفویه برای جلوگیری از تجاوز احتمالی امپراطوری عثمانی این شهر را مورد توجه قرار داد. در زمان شیخ علیخان زنگنه صدر اعظم صفوی به آبادانی و رونق کرمانشاه افزوده شد. تاورنیه، جهانگرد و بازرگان فرانسوی، درباره کرمانشاه چنین نوشته‌ است: ” هم زمان با حمله افغان و سقوط اصفهان که طومار فرمانروایی خاندان صفوی در نوردیده شد، کرمانشاه به جرم قرب جوار، با تهاجم عثمانی‌ها مواجه گردید و بار دیگر شهر رو به خرابی نهاد.“ نادر شاه به منظور آمادگی در مقابل تجاوز عثمانی‌ها، به این شهر توجهی خاص مبذول داشت. در زمان نادر شاه این شهر مورد هجوم عثمانی‌ها قرار گرفت. اما نادرشاه عثمانی‌ها را به عقب راند، ولی در اواخر زندگی نادرشاه، کرمانشاه با محاصره و تاراج عثمانی‌ها مواجه شد. کرمانشاه در عهد زندیه دستخوش آشوب فراوانی گردید. به طوری‌که درکتاب ”تحفه العالم“ عبدالصیف جزایری از کرمانشاه به عنوان خرابه نام برده شده است. در دوره قاجار تا حدی از حملات عثمانی‌ها به ناحیه کرمانشاه کاسته شد. در سال 1267ه.ق، امام قلی میرزا از طرف ناصرالدین شاه به سرحدداری کرمانشاه منصوب شد و مدت 25 سال در این شهر حکومت کرد و در همین دوره بناهایی را احداث و به یادگار گذاشت. این شهر در جنبش مشروطه سهمی به سزا داشت و در جنگ جهانی اول و دوم به تصرف قوای بیگانه درآمد و پس از پایان جنگ تخلیه شد. در نتیجه جنگ تحمیلی عراق علیه ایران، این شهر خسارات زیادی دید و پس از جنگ اقدامات مؤثری در جهت بازسازی آن صورت گرفت. در حال حاضر شهر کرمانشاه، مرکز استان کرمانشاه یکی از هفت کلانشهر کشور(تهران، مشهد، اصفهان، تبریز، شیراز، کرمانشاه و اهواز) است‌(44).
1-14-1-1 موقعیت جغرافیایی
استان کرمانشاه در موقعیت ۳۴ درجه شرقی و ۴۷ درجه شمالی شمالی قرار دارد. از شمال به کردستان، از غرب به کشور عراق، از شرق به استان لرستان و همدان و از جنوب به استان ایلام محدود می گردد. شهرستان‌های این استان عبارت‌اند از: اسلام‌آباد غرب، سنقر، پاوه، صحنه، ثلاث باباجانی، قصر شیرین، جوانرود، دالاهو، روانسر، کرمانشاه، کنگاور، گیلان غرب، سر‌پل ذهاب، هرسین. در شکل1-13 استان کرمانشاه به همراه شهرستان‌های آن دیده می‌شود(44).

شکل 1-9 موقعیت جغرافیائی استان کرمانشاه)44.(1-14-2 استان یَزدیزد سرزمینی کهن با پیشینه‌ای در خور توجه، در تاریخ پر فراز و نشیب ایران است. نام یزد برای اولین بار در آثار دوره‌ی ماد‌ها (701 تا 550 قبل از میلاد) دیده می‌شود که گواهی بر قدمت سه هزار ساله‌ی این سرزمین است. در دوره‌های هخامنشی، اشکانی و ساسانی نیز در اسناد و کتیبه‌ها بار‌ها به نام یزد برمی‌خوریم(45).
حسن پیر‌نیا، در کتاب خود،"ایران باستان"،به نقل از تاریخ هرودوت، مورخ یونانی(484 تا 420 قبل از میلاد)، بر مبنای کتیبه‌های داریوش، یزد را بنا بر رسم یونانیان، به نام ایساتیس می‌خواند. وی می‌افزاید: یزد در عصر اشکانی در قلمرو حکومت مهرداد اول بود و در این شهر به نام او سکه ضرب می‌کردند. در دوره‌ی پادشاهی اردشیر بابکان، (241-224‌م) بنیان‌گذار سلسله‌ی ساسانی، یزد زیر نفوذ او بود. پس از ظهور اسلام و فروپاشی دولت ساسانی، در زمان خلافت عمر، و به روایت برخی، در دوران عثمان (دهه ی سوم هجری)، شهر یزد و نواحی آن فتح شد. از آن زمان تا پایان حکومت امویان، فرمانروایان عرب بر این ولایت حکم‌رانی می‌کردند. چنان‌که آمده است، در دوران خلافت حضرت علی(ع)، مسلم ابن زیاد، والی فارس، مالیات یزد را هم می‌گرفت. چنین بود تا هنگامی‌که به‌دست خود ایرانیان، حکومت های مستقل و نیمه مستقلی تشکیل شد و فرمانروایان ایرانی بر ولایت یزد حاکم شدند(45).
مرکز این استان، شهر یزد است. یزد منطقه‌ای خشک و بیابانی است. گروه بزرگی از زرتشتیان ایران در استان یزد و بویژه شهر یزد زندگی می‌کنند. زبان مردم استان یزد فارسی با لهجه یزدی است. آبادی نشینی در این منطقه از قدمت طولانی برخوردار است. این سرزمین از گذرگاه‌های مهم در ادوار تاریخی محسوب می‌شده‌ است. این ناحیه در دوره هخامنشیان از راه‌های معتبر موسسه‌های راهداری، مراکز پستی و چاپاری برخوردار بوده‌است. راهداری در یزد قدیم چنان اهمیتی داشت که خاندان آل مظفر از منصب راهداری ناحیه میبد به پادشاهی رسیدند. با این‌همه این استان از درگیری‌ها و جنگ‌های تاریخ کشور ایران تا حدودی ایمنی داشته‌است. سخت‌گذر بودن راه‌ها به همراه محدودیت منابع آبی مانع عمده تسخیر این منطقه توسط بعضی از حکومت های بزرگ و کوچک حاشیه و پیرامون این منطقه در طول تاریخ بوده‌است. همان طور که در شکل 1-14 دیده می شود استان یزد دارای شهرستان های ابرکوه، اردکان، بافق، بهاباد، تفت، خاتم، صدوق، طبس، مهریز، میبد و یزد می باشد که شهرستان های مهریز و تفت از آب و هوای خوبی برخوردار می باشد (45).
1-14-2-1 موقعیت جغرافیایی
استان یزد در مرکز ایران در قلمرو سلسله جبال مرکزی ایران بین عرض های جغرافیایی 29 درجه و 48 دقیقه تا 33 درجه و 30 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 52 درجه و 45 دقیقه تا 56 درجه و 30 دقیقه شرقی از نصف النهار مبدا قرار گرفته است. استان یزد از سرزمین‌های تاریخی است که در میان ایالت های قدیمی و بزرگ پارس، اصفهان، کرمان و خراسان قرار داشته‌است(45).

شکل 1-10 موقعیت جغرافیائی استان یزد(45).1-15 هدف از تحقیق:آنچه که باعث استفاده از مارکرهای STR در جمعیت شناسی شده است، این واقعیت است که درجه فراوانی آللی هر مارکر STR در هر جمعیت منحصر به فرد است. در حقیقت طبق مطالعات انجام شده فراوانی آلل‏های STR در نژاد‏های مختلف و حتی در مناطق جغرافیایی خاص، تفاوت‏هایی را نشان داده است. بنابراین بررسی هر یک از لوکوس های STR در هر نژاد یا جمعیت خاص برای تفسیر صحت نتایج حاصل از انجام آزمایش های تعین الگوی ژنتیکی به کمکSTR و انجام محاسبات آماری مربوطه امری ضروری است. برای بهره گیری از فواید این فناوری نوپا در زمینه‏ی تشخیص افراد، ضروری است تا فراوانی آللی لوکوس‏هایSTR مختلف در جمعیت بومی کشور مورد بررسی قرار گیرند (45).
مطالعات گذشته روی جمعیت های ایرانی، حضور تعدادی از آلل‏ها را با پلی مورفیسم بالا نشان می‏دهد‌(37-46.)
هدف از این مطالعه به دست آوردن پارامترهای جمعیتی بر اساس فراوانی آللی به دست آمده از شانزده جایگاه STR، در جمعیت‏های کرمانشاه و یزد به منظور بررسی تفاوت ژنتیکی میان این دو جمعیت و سایر جمعیت‏ها می‏باشد.

فصل دوم
2-1 نمونه‌گیریبرای نمونه‌گیری از اقوام کرد و یزد از نمونه هایی که به آزمایشگاه ژنتیک پزشکی تهران رجوع می‌کردند، استفاده شد. پس ازکسب رضایت نامه 4 میلی لیتر خون محیطی از افراد غیر خویشاوند بر اساس محل تولد و اطلاعات مربوط به سه نسل گذشته (پدری و مادری) تهیه شد و در لوله‌های حاوی ماده ضد انعقاد (EDTA) ریخته شد برای تکمیل نمونه‌های یزدی از همکاری آزمایشگاهی در یزد استفاده گردید و برای نمونه‌های کرد به استان کرمانشاه رفته و از آزمایشگاه بیمارستان طالقانی نمونه‌گیری به عمل آمد.
2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباعاستخراج DNA با استفاده از روش استاندارد نمک اشباع طبق مراحل زیر انجام شد:
۱- ۳ میلی لیتر از نمونه‌ی خون محیطی حاوی ماده‌ی ضد انعقاد EDTA، داخل فالکون ۱۵ میلی لیتری ریخته شد و با استفاده از آب مقطر سرد به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس فالکون به شدت حرکت داده شد این کار جهت لیز بهتر گلبول‌های قرمز از طریق فرآیند تورژسانس می‌باشد. سپس نمونه را در دستگاه EBA 20 Hettich zentrifugen به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۵۰۰۰ سانتریفیوژ شد و محلول رویی خارج گردید و رسوب انتهایی فالکون نگه داشته شد.
۲- با افزودن آب مقطر سرد به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد و مجدداً با همان شرایط ذکر شده آن را سانتریفیوژ گردید و رسوب حاصل که حاوی گلبول‌های سفید است نگه داشته شد.
۳- پس از افزودن ml10 محلول I استخراج DNA به رسوب، حجم آن به ۱۰ میلی لیتر رسانده شد. سپس در شرایط ذکر شده آن را سانتریفوژ کرده و محلول رویی آن دور ریخته شد.
جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های قرمز)غلظت مواد
10 mM Tris-Hcl: pH:7.5
0.32 mM Sacarose
5 mM MgCl2
%1 Triton X-100
4-5/۱ میلی لیتر از محلول II استخراج DNA(از قبل تهیه شده به شرح زیر)، lμ ۲۵ سدیم دو دسیل سولفات ‌ SDS و lμ ۲۰ پروتئیناز K به رسوب سفید رنگ انتهای فالکون افزوده شد.
جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول لیز کننده گلبول‌های سفید)غلظت مواد
10 mM Tris-HCl: pH:8.2
2mM EDTA: pH:8
0.45mM NaCl
۵- نمونه‌ها به مدت ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در دمایc° ۵۶ و یا به مدت یک شب در دمایc° ۳۷ در انکوباتور قرار داده شد تا رسوب حل شود.
۶- پس از افزودن lμ ۵۰۰ نمک اشباع به نمونه، به آرامی تکان داده شد و به مدت ۱۰ دقیقه در ۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی به یک فالکون حاوی ۲ میلی لیتر اتانول خالص (۱۰۰ درصد) انتقال یافت و به آرامی حرکت داده شد تا کلاف DNA شکل بگیرد.
۷- کلاف DNA توسط سمپلر به درون یک ویال حاوی ۱ میلی لیتر الکل ۷۰ درصد انتقال یافت تا الکل 100 خارج شود. در مرحله‌ی بعدی ویال را به مدت ۳ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دستگاه 20 Hettich zentrifugen Mikro سانتریفیوژ گشت.
۸- محلول رویی دور ریخته شد و ویال حاوی DNA به مدت ۵ دقیقه در انکوباتور قرار داده شد تا اتانول کاملاً تبخیر گردد.
۹- بر حسب میزان DNA بین ۵۰ تا ۳۰۰ ماکرولیتر TE به آن افزوده و به مدت یک شب در انکوباتور C°۳۷ قرار داده شد تا DNA به طور کامل حل شود.
جدول 2-3 ترکیبات TEغلظت محتویات
10mM Tris-Hcl, PH:7.6
1mM EDTA, PH:8
2-3 آماده‌سازی نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typingدر هر واکنش Multiplex PCR بهتر است از lμ ۵ نمونه‌ی DNA انسانی با غلظت ng ۱۰۰-50 استفاده شود. اگر‌چه حساسیت آنالیزی این روش در حد ng۵۰-20 از DNA می‌باشد. روش استخراج و نگهداری DNA می‌تواند روی نتایج PCR تأثیر گذار باشد. این روش نیاز به کیت خاصی برای استخراج DNA ندارد با این وجود توجه به این مسئله که در نمونه‌ها غلظت بالایی از آلودگی با نمک وجود نداشته باشد حائز اهمیت است. در این روش نباید از خون هپارینه استفاده شود زیرا هپارین می‌تواند ممانعت کننده‌ی مرحله‌ی PCR باشد. نمونه‌ی DNA را باید در TE حل کرد. pH نمونه‌ی DNA باید بین ۸ تا ۵/۸ باشد تا از دپوریناسیون در طی مرحله‌ی حرارت دادن اولیه جلوگیری شود. بهتر است در صورتی‌که قصد نگهداری طولانی مدت نمونه‌های DNA را داشته، نمونه را در دمای C°۲۰- نگهداری کرد. اگرچه DNA پس از حل شدن در TE به شدت پایدار است اما نگهداری طولانی مدت آن در دمای C °۴ ممکن است منجر به آلودگی آن با میکروارگانیسم‌ها شود .
۲-3-1 رسوب گذاری با اتانولبا توجه به این مسئله که نتایج مربوط به روش STR در نهایت با یکدیگر مقایسه می‌شوند، بهتر است نمونه‌های انتخاب شده از یک نوع بافت گرفته شوند و با روش یکسانی استخراج شوند. در مواردی که از نمونه‌های DNA قدیمی یا نمونه‌هایی با کیفیت نامناسب استفاده می‌شود و یا مواقعی که غلظت DNA مورد استفاده کمتر از ng/µl۴ است، روش‌های خالص سازی DNA مانند روش رسوب گذاری با اتانول، می‌تواند سبب بهبود کیفیت نمونه‌ها و ایجاد نتایج بهتر و مطمئن‌تری شود. استفاده از روش رسوب گذاری با اتانول آلودگی‌های ناشی از یون‌ها، نمک‌ها، اتانول و... را کاهش می‌دهد. غلظت نمک (NaCl)، نباید بیشتر از mM ۶۰ باشد تا دناتوراسیون به طور کامل انجام شود. هم‌چنین غلظت EDTA نباید بیش از mM۱ باشد زیرا EDTA به منیزیوم متصل شده و مانع انجام مرحله‌ی PCR می‌گردد. ناخالصی‌های یونی مانند آهن، اتانول و فنل نیز باعث کاهش فعالیت پلی‌مراز می‌گردند.
رسوب‌گذاری با اتانول به شیوه زیر بر روی نمونه‌ها انجام گرفت.
به میزان ۱/۰ حجم اولیه‌ی نمونه‌ی DNA استات سدیم M ۳ با 5/4:pH به نمونه‌ها اضافه شد.
به اندازه‌ی ۳ برابر حجم (پس از افزودن سدیم استات) به نمونه‌ها اتانول سرد خالص افزوده شد.
نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند و سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دور rpm14۰۰۰ سانتریفوژ گشتند.
محلول رویی به آرامی خارج شد و به رسوب DNA نصف حجم اتانول اولیه،اتانول ۷۰ درصد افزوده شد.
نمونه‌ها به مدت ۱۵ دقیقه در دور ۱4۰۰۰ سانتریفیوژ شدند.
محلول رویی خارج شد و پس از اینکه اتانول کاملاً تبخیر شد رسوب در مقدار مناسبی از TE حل گردید.

—d1522

2-3-2-2)ابستاتین28
2-3-2-3)لپتین29
نوروپتیید w30
گیرنده های NPW31
توزیع مرکزی NPW32
2-4-3) توزیع محیطی NPW33
توزیع NPBWR1-2 34
تنظیم تغذیه ومتابولیسم انرژی بوسیله NPW35
عملکرد اندوکرین NPW37
کورتیزول38
کورتیزول و فعالیت بدنی39
متابولیسم انرژی در فعالیت ورزشی41
فعالیت ورزشی فزاینده و شدید41
فعالیت ورزشی دراز مدت41
تاثیرات اسمولاریته بروی هورمون ها42
ارتباط کورتیزول با واسطه های متابولیکی43
ارتباط هورمون کورتیزول با اسید لاکتیک44
ارتباط هورمون کورتیزول با کراتینین44
کورتیزول و چاقی45
2-5-5-1) لینک پتانسیل بین کورتیزول و اشتها46
اثرات مضر چاقی ناشی ازکورتیزول46
تیروکسین47
تاثیر تیروکسین بر متابولیسم: 47
بی حرکت حاد و مزمن بر روی هورمون تیروئیدی48
هورمون های تیروئیدی و لپتین50
هورمون های تیروئیدی وگیاهان داروی51
2-7)جمع بندی 52
فصل سوم- روش شناسی پژوهش
3-1) روش پژوهش 54
3-2) طرح پژوهش54
3-3) جمع آوری وشیوه عصاره گیری ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-1) جمع آوری میوه ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-2) عصاره گیری آبی میوه ولیک (سرخ وسیاه) 55
3-3-3) مقدار دوز عصاره مصرفی موش ها55
3-4) جامعه و نمونه آماری و روش نمونه گیری56
3-5) محیط پژوهش56
3-6) تغذیه آزمودنی ها57
3-7) دوره و زمان بندی تمرینی57
3-8) وسایل و ابزار استفاده شده در پژوهش59
3-9) متغیرهای پژوهش60
3-9-1) متغیر مستقل60
3-9-2) متغیرهای وابسته60
3-10) روش اندازه گیری متغیرهای پژوهش60
3-10-1) روش اندازه گیری متغییر های وابسته61
3-10-1-1) روش اندازه گیری NPW 61
3-10-1-2) روش اندازه گیری هورمون کورتیزول 61
3-10-1-3) روش اندازه گیری هورمون T461
3-11) روش اندازه گیری ترکیبات سرخ ولیک , سیاه ولیک با استفاده از GC-MS : 62
3-12) روش ها آماری62
فصل چهارم- تجزیه وتحلیل
4-1) مقدمه65
4-2) توصیف داده ها65
4-2-1) مشخصات آزمودنی های حیوانی65
4-2-2) یافتههای مربوط به متغیرهای مورد مطالعه66
4-3) تجزیه و تحلیل استنباطی یافتههای پژوهش66
4-3-1) یافته های مربوط به نوروپپتید W پلاسمایی68
4-3-2) یافته های مربوط به نوروپپتید w کبدی72
4-3-3) یافته های مربوط به کورتیزول پلاسمایی76
4-3-4) یافته های مربوط به هورمون تیروئید T481
فصل پنجم- بحث ونتیجه گیری
5-1) مقدمه88
5-2) خلاصهی پژوهش88
5-3) بحث و بررسی(نوروپپتید w پلاسمایی و کبدی ، هورمون کورتیزول و T489
5-4) نتیجهگیری93
5-5) پیشنهادات برای پژوهشهای بیشتر94
منابع..................................................................................................................................................................................................95
چکیده انگلیسی112
فهرست شکل
عنوان صفحه
شکل 2- 1) تنظیمات جبرانی دریافت و مصرف کالری 15
شکل 2 – 2) طراحی شماتیک ساده از مناطق هیپوتالاموس 17
شکل 2 – 3) گردش هورمون های موثر بر تعادل انرژی از طریق هسته کمانی 20
شکل 2-4 ) تنظیم مصرف غذا 23
شکل 2-5) فعال سازی سلول های عصبی NPY / AGRP 25
شکل 2-6) گرلین قبل و بعد از دریافت غذا28
شکل 2- 7 ) لپتین 30
شکل 2- 8) فرق نوروپتیید 23- w و نوروپتیید 30- w ( انسان ، خوک ، رت ، موش)32
شکل 2- 9 ) تصویر شماتیک بر اساس یافته های مطالعات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تنظیم اشتها در هیپوتالاموس توسط سلول های عصبی NPW و پپتید مرتبط با تغذیه در هیپوتالاموس36
شکل 3-1) مراحل اجرای طرح تحقیق در موش های صحرایی نر58
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول 2-1) مولکول های سیگنالی کاندید در هموستاز انرژی در CNS 22
جدول 3-1) حجم نمونه و مشخصات آزمودنی های هر گروه56
جدول 3- 2) پروتکل تمرین 8 هفته ای59
جدول 3- 3) مقادیر متغیر های مربوطه برای استخراج الکلی روغن سرخ ولیک63
جدول 4-1)، میانگین و انحراف استاندارد وزن موش های مورد پژوهش65
جدول 4-2) شاخص های توصیفی متغیرهای اصلی پژوهش66
جدول (4-3)، نتایج آزمون لون جهت بررسی هم واریانسی گروه های تحقیق67
جدول4-4) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه نوروپپتید W پلاسمایی68
جدول4-5) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه نوروپپتید W کبدی72
جدول4-6) آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه کورتیزول پلاسمایی 76
جدول 4-7) نتایج آزمون توکی برای بررسی تفاوت بین گروه ها در کورتیزول پلاسمایی 77
جدول4-8)، آزمون تحلیل واریانس یک طرفه برای مقایسه هورمون تیروئید T4 81
جدول( 4-9) نتایج آزمون توکی برای بررسی تفاوت بین گروه ها در هورمون تیروئید T482
فهرست نمودار ها
عنوان صفحه
نمودار (4-1)، مقایسه سطوح نوروپپتید w پلاسمایی گروه های تحقیق71
نمودار (4-2)، مقایسه سطوح نوروپپتید w کبدی گروه های تحقیق75
نمودار (4-3)، مقایسه سطوح کورتیزول پلاسمایی گروه های تحقیق80
نمودار (4-4)، مقایسه سطوح هورمون تیروئید T4 گروه های تحقیق85
فصل اول:
طرح پژوهش

1-1: مقدمه
تغییر سبک زندگی و عدم توجه به برنامه های غذایی، جوامع امروزه را به سمت افزایش وزن، چاقی و عدم مدیریت اشتهای کاذب و به همراه آن به سوی بی تحرکی سوق داده است. چاقی و افزایش بیش از حد بافت چربی یکی از مشکلات سلامت در کشورهای مختلف جهان است که به دنبال تغییر شرایط زندگی و کاهش فعالیت فیزیکی و در نتیجه عدم تعادل انرژی دریافتی و مصرفی رخ می دهد. در سالهای اخیر، چاقی شیوع رو به افزایشی داشته است ]2،1[. چاقی، به عنوان بحران سلامت عمومی شناخته می شود ]3[.
شیوع چاقی و پیشرفت سریع آن موجب شده که پژوهش ها به سمت تنظیم و تعادل وزن بدن پیش رود. در اصل، چاقی و اضافه وزن نتیجه عدم تعادل انرژی است که به موجب آن انرژی دریافت شده بیشتر از انرژی مصرف شده است. یکی از عوامل تاثیرگذار بر چاقی میزان دریافت غذاست. دریافت غذا رفتار پیچیده ای است که سطوح مختلف کنترلی و تنظیمی را در بر می گیرد ]4[. افزایش وزن و یا چاقی که خود مقدمه بسیاری از بیماری های انسانی و مرگ و میر شده است. امروزه در حوزه بهداشت، سلامت و شیوع شناسی و به تازگی در حوزه فیزیولوژی ورزش با عنایت بر تاثیر فعالیت بدنی و ورزشی در اشکال مختلف در مدیریت وزن و تنظیم و تعادل انرژی، توجهات در جهت ساز و کارهای اصلی درگیر جلب شده است. اگر چه هنوز معادله انرژی، هزینه کرد و انرژی دریافتی جزء پایه ای پژوهش های حوزه سلامت تلقی می شود. اما تغییرات در نوع منبع بکارگیری جهت تامین انرژی های سلولی در بدن که بخش قابل ملاحظه ای از آن توسط هیپوتالاموس و بخش دیگری که از اهمیت نیز برخوردار است، توسط عوامل محیطی کنترل می شود. در دهه های گذشته تا قبل از کشف و معرفی تعدادی از پروتئین ها و پپتیدهای موثر در تنظیم انرژی، عقیده بر این بوده است که دستگاه عصبی مرکزی، به ویژه هیپوتالاموس تنها اندام درگیر در تنظیم تعادل انرژی و سوخت و ساز است. اکنون دیگر مطلق بودن حاکمیت هیپوتالاموس در کنترل تعادل و تنظیم انرژی جای خود را به همگرایی مرکز و محیط داده است، به همین خاطر پژوهشگران پپتیدهای مرتبط با کنترل و تنظیم انرژی و اشتها، دریچه ای نو را به سوی این دنیای عظیم موثر بر روند زندگی سالم باز کرده اند]7،6،5[.
با این وجود، به نظر می رسد که هنوز هیپوتالاموس محوریت لازم را در کنترل تعادل انرژی، سوخت ساز قند و اشتها داشته باشد. شاید به این خاطر باشد که تعداد زیادی از نورپپتیدهای مترشحه (AGRP،NPY،CART،POMC ، اورکسین، MCH ، گالانین ، پپتید شبه گلوکاکن، عامل رهایی کورتیکوتروپین) از این اندام در مقایسه با اندامهای محیطی دیگر مشارکت بیشتری را در این امر دارند ]8[. نوروپپتید w یکی از این نوروپپیدهاست که نقش مهمی در متابولیسم تغذیه و انرژی دارد ]9[.
1-2: بیان مسئله:
تمرین و فعالیت بدنی به عنوان یکی از عوامل موثر در تحلیل منابع انرژی سلولی از جمله گلوکز و گلیکوژن است، که می تواند تغییراتی در پپتیدهای و هورمون های موثر بر تنظیم و تعادل انرژی بوجود آورد. همچنین اظهار شده است که بازسازی و ریکاوری آنی ذخایر انرژی از جمله گلوکز و گلیکوژن نیز می توانند بر غلظت این پپتیدها اثرگذار باشند. در صورت عدم بازسازی مناسب و به موقع با مشکلاتی چون تغییر در غلظت پپتیدهای موثر بر تنظیم انرژی مواجه خواهیم شد. عدم تعادل بین پپتیدهای مهارگر و تحریک کننده دریافت غذا مانند لپتین، AGRP,NPY,CART,POMC, و گرلین به عنوان عوامل دخیل در روند سازوکاری می تواند به افزایش درصد چربی بدن، چاقی و غلبه روند اشتهاآوری بر ضد اشتهایی شود. اتخاذ راه کاری صحیح و آنی برای مقابله با این عدم تعادل می تواند از اختلالات سوخت و سازی تعادل و تنظیم انرژی (افزایش وزن یا کاهش غیرمنطقی، اتلاف انرژی) جلوگیری نماید. هرچند نوروپپتیدw در انسان اخیرا کشف شده است]10[ اما از زمان کشف نروپپتایدها، دانش ما از تنظیم وزن، اشتها و تعادل انرژی به نحو چشمگیری افزایش یافت. بسیاری از متخصصان حوزه سلامت، بهداشت و به خصوص تنظیم وزن، امیدوارند که با شناسایی جنبه های مهم و ناشناخته این نروپپتایدها و عوامل موثر بر آنها به روش های درمانی کارآمد و کشف داروهای جدیدی را برای امراضی چون چاقی دست یابند .امروزه تقریبا تاثیر نوروپپتیدها بروی هورمون ها ثابت شده است. از طرفی تغییر در هورمون ها نیز باعث تغییر در وزن بدن می شود.گزارش های رسیده نیز نشان می دهد که NPW نه تنها در تنظیم انرژی بلکه در هموستاز هورمونی نیز نقش دارد، ]11[
هورمون ها نقش مهمی در تنظیم اشتها، متابولیسم بدن و تنظیم سطح انرژی دارند]12[. فعالیت و تمرینات ورزشی روی سطوح خونی هورمون ها تاثیر می گذارند و به کاهش یا افزایش سطح برخی از هورمون ها نسبت به حالت استراحت منجر می شوند. در واقع این نوسانات هورمونی را می توان واکنش بدن در برابر فشارهای تمرینی قلمداد کرد، تا حالت هموستاز بدن برقرار شود ]13،14[. عدم تعادل در سطح هورمون ها در گیر در اشتها ( انسولین ، گلوکاگون ، کورتیزول و هورمون‌های غده تیروئید) می تواند به افزایش وزن منجر شود.
هورمون کوتیزول که یک گلوکوکورتیکوئید است ، و از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود، نقش بسزایی در برقراری این هموستاز دارد ]15[ . کورتیزول به طور مستقیم بر ذخیره چربی و افزایش وزن در افراد تاثیر دارد . یکی از اثرات مهم کورتیزول، نقش آن روی سوخت و ساز کربوهیدرات ها، پروتئین ها و چربی ها است.این هورمون فرآیند گلوکونئوژنز را از اسیدهای آمینه تسهیل، لیپوژنز کبد را کاهش و چربی های موجود در بافت چربی را به حرکت در می آورد . کورتیزول سوبسترای لازم را برای عمل گلوکرنئوژنز (اسیدهای آمینه) و سوخت های جایگزین را برای متابولیسم انرژی عضله اسکلتی (اسیدهای چرب) تامین کند]16،17،18،19[
هورمون تیرکسین یکی از هورمون های مهم متابولیسمی بدن است ]20[. که توسط غده ی تیرویید که تحت تاثیر محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- تیرویید ( H-P-T) است ،تنظیم می شود ]21[ . در بررسی های متعدد ، اثر بسیاری از عوامل مانند دمای محیط ، استرس ، هورمون های دیگر ، ترکیبات شیمیایی ، نوسانات شبانه روزی ،... بر محور نامبرده به اثبات رسیده است. هورمون تیرویید ارتباط ویژه ای با رشد ، اشتها ، متابولیسم ، تنظیم اسمزی و تولید مثل دارد ]22[ افزایش میزان سوخت و ساز پایه، اثر اصلی هورمون های تیروئید است. عمل عمده ی این هورمون ها افزایش سوخت و ساز قندها و چربیها است]23[.
از طرفی استفاده از مواد مغذی ، به ویژه مواد قندی،اسیدهای چرب، نوشیدنی های ورزشی حاوی اسیدهای آمینه ، مواد معدنی و ویتامین ها ، آنتی اکسیدنها پس از تمرین و فعالیت بدنی، برای بازسازی سریع و افزون سازی منابع انرژی (گلیکوژن و ATP ) و کنترل وزن و اشتها توسط متخصصین و مربیان آگاه توصیه شده و می شود. در این راستا، استفاده از مکمل های غذایی طبیعی و صناعی بر عملکرد ورزشی، توازن بین اکساینده ها و ضد اکسایش کننده های بدن، توسط ورزشکاران ، مربیان ، متخصصین و پژوهشگران توصیه و بررسی شده است. علاوه بر موارد فوق، تاثیر برخی از گیاهان خوراکی و دارویی از قبیل: شنبلیله ]24[ ، برگ ریحان ]25[، توت هندی ]26[، لئوکاس سفالوتز (نوعی علف هرز خوراکی در هند) ]27[، بر روند بازسازی منابع انرژی به ویژه گلیکوژن در نمونه های حیوانی مطالعه شده است. با این وجود در هیچ یک از پژوهش های انجام شده به تاثیر این گیاهان دارویی و غذایی بر پپتیدهای درگیر در تنظیم تعادل انرژی، سوخت وساز قند، اشتها و وزن، با و یا بدون فعالیت بدنی و تمرین مورد توجه قرار نگرفته است. همچنین ، ولیک به عنوان یک گیاه دارویی منحصر به فرد از حیث ترکیبات و خواص به طور جدی در حوزه ی فیزیولوژی ورزش مورد توجه قرار نگرفته است.
ولیک یکی از قدیمی ترین گیاهان دارویی در طب اروپایی می باشد و برای اولین با توسط دیوسکورید در قرن 1 شرح داده شد]28[. عصاره ولیک از گل، برگ و میوه این گیاه مشتق می شود. مطالعه بالینی کمی به بررسی میوه ولیک به تنهایی پرداخته است ]29[. برگ، گل و میوه ولیک دارای مقادیر زیادی پروسیانیدین الیگومریک ، فلاونوئیدها می باشد، که مسئول اثر دارویی آن است]30[.
گیاه ولیک سرخ با اسامی مختلفی از قبیل هاثرن و از خانواده روزاسه به صورت سنتی به عنوان تونیک قلبی استفاده می شود. ترکیبات مختلفی در ولیک سرخ وجود دارد که شامل: ساپونین های تری ترپن، فلاونوئیدها، کاتیشن، اپی کاتشین می باشد ]31[.
گزارش شده است سرخ ولیک یک گیاه دارویی با ارزش از تیره گل سرخ است که امروزه در درمان ضایعات قلبی و گردش خون و به ویژه به عنوان ضد عفونت ها و آنتی اکسیدان، تب بر قابل استفاده می شو د؛ و اهمیت دارویی آن به دلیل وجود ترکیبات فنلی است که در این رده فلاونوئیدها نقش دارویی مهمی دارند]32[.همچنین مصرف آنتی اکسیدانهای غذایی می تواند از شیوع بیماری های متابولیک کم کند]33[.فلاونوئیدها بخاطر آنتی اکسیدان بودن در تنظیم تغذیه دخیل است و باعث تنظیم چربی خون ،تنظیم متابولیسم گلوکز و کربوهیدارت می شود ]34[ .
بنابراین ، این پژوهش قصد دارد تا تأثیر همزمانی تمرین با شدت بالا را به همراه دو نوع ولیک ( کراتاگوس ) سرخ و سیاه بر شاخص های مربوط به اشتها را در نمونه حیوانی ( مریوط به موش های نر) مورد ارزیابی قرار دهد. آیا تمرین شدید بر سطوح نوروپپتید W ، T4 ، کورتیزول پلاسمایی و بر سطوح نوروپپتید W کبدی درموش های صحرایی نر اثر دارد؟ آیا مکمل سازی آبی ولیک بر سطوح نوروپپتید W ، T4 ، کورتیزول پلاسمایی و بر سطوح نوروپپتید W کبدی درموش های صحرایی نر اثر دارد؟.
1-3: ضرورت و اهمیت تحقیق:
از آنجایی که بررسی و نمونه برداری بافت های انسانی از دشواری های زیادی برخوردار است و پژوهش های انجام شده بر روی مدل های حیوانی که شباهت های عملکردی با انسان دارند، می تواند تا حدودی بیانگر رخدادهای عملکردی در انسان باشند، از این رو در مطالعه حاضر انجام پژوهش روی پلاسما و بافت موش های صحرائی نر صورت پذیرفته است.
همان طور که گفته شد چاقی و اضافه وزن از یک سو و کمبود وزن و بی اشتهایی از سوی دیگر دو انتهای طیفی می باشند که همواره سلامتی جامعه را تهدید کرده و به عنوان یکی از معضلات جوامع امروزی باشند. شیوع گسترش چاقی و بیماری های مرتبط با آن در سطح جهان، شاهدی بر این مدعاست که پیشرفت های علمی در زمینه شناخت عوامل و مکانیسم های تنظیم وزن و به خصوص پیشگیری ، مبارزه و درمان چاقی توفیق چندانی نداشته است]4[. متاسفانه درکشور ما نیز، چاقی شیوع گسترده ای دارد. بر اساس پژوهش های صورت گرفته در ایران، بررسی ۸۹۹۸ فرد سنین 81 – 35 ساله (2005- 2002) نشان داد که 2/62٪ افراد دارای اضافه وزن و 28٪ ان ها چاق بوده اند ]35[. این در حالی است که چاقی با ابتلا به بیماری های بسیاری همراه است ]36[.دلایل ابتلا به چاقی متعدد می باشند، اما از نظر فیزیولوژی، چاقی ناشی از عدم تعادل انرژی است و درمان اولیه ی آن شامل کاهش دریافت غذا یا افزایش مصرف انرژی و یا هر دوی این موارد می باشد ]36،35[.
بنابراین از جنبه سلامت و بهداشت عمومی، شناخت عوامل و مکانیسم های موثر بر تعادل انرژی و تنظیم وزن می تواند به ارتقاء سطیح سلامت جامعه و صرفه جویی در هزینه های درمانی کمک نماید. هم چنین در شماری از بیماری ها، کاهش اشتها و تعادل منفی انرژی باعث بروز مشکلات عدیده و افزایش مرگ و میر می شود. مشخص شده که در این شرایط نیز نروپپتایدها نقش کلیدی دارند. بنابراین می توان امیدوار بود که شناخت مکانیسم این فرآیندها به درمان آنها اقدام کرد. از طرف دیگر نوروپپتید w که به تازگی (حدود یک دهه) کشف شده است و با توجه به نقش کلیدی خود در هموستاز و تنظیم وزن، تحقیقات بسیار کمی درباره این نوروپپتید صورت گرفته است، همچنین تحقیقات زیادی به تمرین به عنوان یک عامل مهم و موثر بر تعادل انرژی و تنظیم وزن و ارتباط آن نوروپپتید w انجام نشده است .همانطور که دیده می شود متخصصینی که در مورد نوروپتیید w و سایر نروپتاییدها مطالعه می کنند به ورزش ، تمرین و فعالیت بدنی عنایتی نداشته اند. برخی شرایط مانند فعالیت بدنی و تمرین می تواند تغییراتی را در پپتیدهای موثر برتنظیم و تعادل انرژی بوجود آورند. تمرین و فعالیت بدنی ، تعادل انرژی در سلول ها را به هم زده و هزینه ی انرژی سلول ها را افزایش می دهد. فعالیت های بدنی منظم ، دستگاه های مختلف انرژی را در گیر کرده و موجب سازگاری های عضلانی ، تنفسی ، قلبی – عروقی ، و سازگار ی متابولیکی می شود ]37[. از آنجایی که تاکنون پژوهشی در مورد تاثیر تمرین ورزشی و عصاره ولیک بر روی نوروپپتیدW پلاسمایی و بافتی صورت نگرفته ، پژوهش حاضر قصد دارد با بررسی اثر فعالیت ورزشی و عصاره میوه ولیک بر روی این نوروپپتید را بررسی نماید.
1-4 – اهداف پژوهش:
1-4-1-هدف کلی:
هدف کلی این پژوهش تعیین اثر8 هفته تمرین شدید بر سطوح نوروپپتید W پلاسمایی و کبدی، پاسخ های هورمون کورتیزول و T4 در موشهای صحرایی نر با و بدون عصاره آبی ولیک (سرخ و سیاه ) می باشد.
1-4-2-اهداف ویژه:
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید با و بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر سطح نوروپپتید w پلاسما
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر سطح نوروپپتید w کبد
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر هورمون کورتیزول
تعیین اثر 8 هفته تمرین شدید باو بدون عصاره آبی سرخ و سیاه ولیک بر هورمون تیروکسین
بررسی ارتباط سطوح نوروپپتید w پلاسما ، با دیگر متغییر ها
1-5 - فرضیه های پژوهش:
فرضیه 1 : هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح نوروپپتید W پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه 2: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح نوروپپتید W کبدی موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه3: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک برسطح هورمون کورتیزول پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
فرضیه 4: هشت تمرین شدید همراه با مصرف عصاره آبی (سرخ و سیاه) ولیک بر سطح هورمون تیروکسین پلاسما موشهای صحرایی نر اثر دارد
1-6- محدودیت های پژوهش :
1-6-1- محدودیت های غیر قابل کنترل
ـ عدم کنترل دقیق فعالیت شبانه آزمودنی ها
ـ عدم اندازه گیری مقدار غذای مصرفی برای هر نمونه بدلیل نبودن امکانات کافی
ـ عدم کنترل تاثیر عوامل وراثتی آزمودنی ها
1-7- تعریف واژها و اصطلاحات پژوهش
ولیک (کراتاکوس) cratacgus
ولیک یک گیاه دارویی با ارزش است که امروزه در درمان ضایعات قلبی و گردش خون و به ویژه به عنوان ضد عفونت ها و آنتی اکسیدان، تب بر استفاده می شود؛ و اهمیت دارویی آن به دلیل وجود ترکیبات فنلی است که در این رده فلاونوئیدها نقش دارویی مهمی دارند. همچنین مصرف آنتی اکسیدانهای غذایی می تواند از شیوع بیماری های متابولیک کم کند. فلاونوئیدها بخاطر آنتی اکسیدان بودن در تنظیم تغذیه دخیل است و باعث تنظیم چربی خون ،تنظیم متابولیسم گلوکز و کربوهیدارت می شود .
نوروپپتید w: نوروپپتید W تشکیل شده از 30 اسید آمینه و مشتق شده از یک پری پرو پروتئین 165 آمینو اسید است که ژن آن در انسان توسط تاناکا و هکارانش شناسای شد. NPW به ایفای نقش به عنوان عامل ضد اشتها عمل و باعث افزایش دما و متابولیسم بدن می شود.
کورتیزول: هورمون کوتیزول که یک گلوکوکورتیکوئید است ، و از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود، نقش بسزایی در برقراری هموستاز بدن دارد . هورمون کورتیزول در بدن به صورت دوره ای ترشح می شود، که دامنه و میزان ترشح آن را ریتم شبانه روزی تنظیم می کند. غلظت این هورمون در گردش خون، صبح زود به دلیل افزایش دامنه و میزان ترشح آن در بالاترین سطح است. میزان ترشح کورتیزول به تدریج در طول روز کاهش می یابد و غلظت آن در شب به حداقل میزان خود می رسد .پژوهش ها نشان داده اند که وزن و درصد چربی بدن بر ترشح کورتیزول تاثیر می گذارد.
هورمون تیروکسین یا 4T: تیروکسین به هورمون ترشح شده ازغده تیروئید می‌گویند. هورمون غده تیروئید تری یدوتیرونین 3 Tو تیروکسین 4Tاست .این هورمون از اضافه شدن چهار اتم ید به آمینواسید تیروزین ساخته می‌شود. هورمون های تیروئیدی در سوخت و ساز کلی بدن نقش داشته و نقص در عملکرد غده تیروئید و ترشح نامناسب این هورمون ها عواقب متعدد فیزیولوژیک را به دنبال دارد. برای مثال کاهش غلظت پلاسمایی هورمون های تیروئیدی باعث افزایش وزن و کاهش اشتها می گردد و افزایش آنها کاهش وزن و پرخوری را به دنبال دارد.
تمرین شدید : فعالیت ورزشی دویدن روی نوار گردان ( 5 روز در هفته ، با سرعت 34 متر در دقیقه ، شیب صفر درجه و به مدت 60 دقیقه ) انجام شد.
فصل دوم:
مبانی نظری و پیشینه پژوهش

:2-1مقدمه
در این فصل ابتدا مبانی نظری پژوهش مورد بحث و بررسی قرار خواهد گرفت.پیشنه و مبانی نظری پژوهش ، طیف وسیعی از اطلاعات و نظریه های علمی است که بیان کننده کمیت و کیفت اطلاعات موجود در رابطه با موضوع پژوهشی می باشد و به تشریح پژوهش های مرتبط با موضوع می پردازد . در این فصل پژوهشگر ابتدا به بررسی و مطالعه مفاهیم اساسی که در حوزه پژوهش دارای اهمیت هستند ، نظیر مکمل سازی ، پروتکل تمرینی و ... می پردازدو در پایان اطلاعات ارائه شده ، تحقیقات قبلی انجام شده و نتایج انها بیان می شود.
2-2: مبانی نظری تحقیق
2-2-1:چاقی
چاقی اختلالی است که از عدم تعادل دریافت و هزینه کرد انرژی ناشی می شود. عدم تعادل انرژی به عنوان فیدبکی برای فیزیولوژی و محیط عمل کرده و بر هزینه کرد و دریافت انرژی اثر می گذارد ]38[. ما انرژی را به صورت چربی ذخیره سازی می کنیم، چرا که هم نسبت به کربوهیدرات متراکم تر است و هم برای ذخیره شدن نیاز به مقدار زیادی آب ندارد. پدیده چاقی دو وجهه کاملا متفاوتی داردکه ژنتیک و محیط ]38[.
اطلاعات و آمار نشان می دهد که چاقی در کشورهای غربی در حال افزایش است . و عوامل مختلفی را می توان در این مورد دخیل دانست. از جمله تماشای تلویزیون، غذاهای فوری، کم تحرکی و استفاده از وسایل ماشینی در انجام امور روزمره و ... اشاره کرد. عقیده کلی بر این است که تعادل انرژی و وزن باید به گونه ای تنظیم شود تا اثرات تعادل بین هزینه کرد و دریافت انرژی بر چاقی و وزن بدن کنترل شود . لذا وزن بدن باید به طریقی تنظیم شود، که می دانیم هموستاز انرژی از طریق سیستم عصبی پیچیده ای تنظیم می شود که اثر فراز و نشیبهای کوتاه مدت در تعادل انرژی را بر روی توده بدن به حداقل می رساند. اخیرا مولکول های میانجی و مسیرهای دریافت غذا و تنظیم وزن در مغز شناسایی شده اند ]39[. گزارش کرده اند که با وجود کاهش در مقدار غذای دریافتی روزانه قادر به کاهش وزن نیستند. این ادعا به ایجاد این فرضیه منجر شد که چاقی در اثر اختلال های متابولیکی و نادرست بودن عادت های رفتاری است ، که موجب کاهش انرژی مصرفی در افراد چاق می شود ]40[.
2-2-2:تنظیم تعادل انرژی
عقیده ی کلی بر این است که تعادل انرژی و وزن بدن پدیده ای اند که باید تنظیم شوند. این عقیده از آن جا ناشی می شود که اثر بالقوه عدم تعادل بین هزینه انرژی و دریافت آن بر چاقی وزن بدن مشاهده می شود ]38[. به همین منظور هموستاز انرژی از راه سیستم عصبی پیچیده ای تنظیم می شود که اثر فراز و نشیب های کوتاه مدت در تعادل انرژی را بر روی توده ی چربی بدن به حداقل می رساند. اخیراً مولکول های میانجی و مسیرهای تنظیمی غذا خوردن و تنظیم وزن در مغز شناسایی شده اند ]39[.
محتوای انرژی سلول ها به تعادل بین تولید و مصرف انرژی در سلول ها بستگی دارد. یکی از شرایطی که می تواند تعادل انرژی را در سلول به هم زده و نیازهای هاصی را به سلول تحمیل نماید، ازدیاد هزینه کرد انرژی در اثر فشارهای مختلف روانی و جسمانی از جمله انجام فعالیت بدنی و تمیرن است. به بیان دیگر، در نتیجه تمرین و فعالیت بدنی، تعادل انرژی در سلول به هم خورده و هزینه ی انرژی سلول افزایشمی یابد. سلول در پاسخ به این وضعیت جدید پاسخ های موقتی و لازم را از خود نشان می دهد که در صورت تداوم یافتن این وضعیت، رفته رفته به سازگاری مناسب متابولیکی نایل می شود و در صورت رفع این فشار تدریجاً وضعیت انرژی سلولی به حالت اولیه ی خود برمی گردد. بنابراین گفته می شود که سلول یا اندام یا دستگاه درگیر در مقابل فشار فیزیکی وارده سازگار شده است. تمرین و فعالیت های بدنی منظم، دستگاه های مختلف انرژی را درگیر کرده و موجب سازگاری های عضلانی، تنفسی، قلبی – عروقی و سازگاری متابولیکی می شود که متعاقب فعالیت های بدنی و ورزشی رخ می دهند ]37[.

شکل 2- 1) تنظیمات جبرانی دریافت و مصرف کالری در پاسخ به تغییرات در محتوای چربی بدن است.]47[
2-2-3:کنترل اشتها و هموستاز انرژی
مرکز اصلی هموستاز یا تعادل انرژی در انسان هیپوتالاموس می باشد ، هرچند نواحی مختلفی از مغز از کورتکس گرفته تا ساقه مغز در رفتار دریافت غذا و هموستاز انرژی دخالت دارند . در بیشترین بزرگسالان ذخایر چربی و وزن بدن علیرغم تغییرات بسیار گسترده مصرف غذای روزانه و مصرف انرژی به طور چشمگیری ثابت است. برای برقراری تعادل بین انرژی دریافتی و مصرف غذای روزانه و مصرف انرژی به طور چشمگیری ثابت است. برای برقراری تعادل بین انرژی دریافتی و مصرفی یک سیستم فیزیولوژیکی پیچیده شامل سیگنال های آوران و وابران فعالیت می کند] 1[. این سیستم شامل مسیرهای چندگانه ای است که در تعامل با هم وزن را کنترل می نماید .در گردش خون هورمون هایی وجود دارند که به صورت حاد و موقت غذا خوردن را شروع یا خاتمه می دهند وهم هورمون هایی هستند که منعکس کننده چاقی و تعادل انرژی بدن می باشد. این سیگنال ها به وسیله اعصاب محیطی و مراکز مغری از جمله هیپوتالموس و ساقه مغزی یکپارچه می شوند هنگامی که سیگنال ها یکپارچه شوند ، نوروپتید های مرکزی را ، که غذا خوردن و هزینه انرژی را تغییر می دهند ، تنظیم می کنند ] 1[.
پیچیدگی رفتار دریافت غذا منعکس کننده ی تعداد نواحی در گیر در مغز است. به عنوان مثال ، قشر پیشانی چشمی در گیر در سیری ویژه حسی است در حالی که آمیگدال در ارزیابی مزه و طعم غذا دخالت دارد . بنابراین رفتار دریافت غذا را می توان به فاز های مختلفی از جمله فاز اشتها ، که شامل جستجو برای غذا است ، و فاز مصرف شامل خوردن واقعی غذا است ، تقسیم بندی کرد ]41[.
برای حفظ یک وزن ثابت در یک دوره ی زمانی نسبتا طولانی همواره باید توازنی بین دریافت غذا و هزینه انرژی برقرار باشد . هیپوتالاموس اولین مرکز ی است که حدود 50 سال قبل نقش آن در این فرایند شناخته شد . علیرغم در گیری نقاط مختلفی از مغز در رفتار غذا خوردن ، هیپوتالاموس به عنوان مرکز اصلی غذا خوردن مطرح می باشد .در اوایل دهه 1940 نشان داده شد که تزریق یا تحریک الکتریکی هسته ها ویژه ای در هیپوتالاموس ، رفتار تغذیه ای را تغییر می دهد. هیپوتالاموس شامل چندین هسته می باشد که در دریافت غذا دخالت دارند شامل هسته های کمانی (ARC) ، هسته ای مجاور بطنی (PVN) ، بخش های جانبی هیپوتالاموس (LHA) ، هسته های بطنی میانی (VMH) و هسته های خلفی میانی (DMH). در ARC دو دسته اصلی نورون که به وضعیت تغذیه ای حساس هستند و جود دارند . یکی دسته از ان ها دریافت غذا و اشتها را تحریک و دسته دیگر ان را مهار می کنند ]41[. هسته های بطنی میانی (VM) به عنوان « مرکز سیری» و هسته های جانبی هیپوتالاموس (LH) عنوان «مرکز گرسنگی» شناخته شده اند. هسته های کمانی (ARC) هیپوتالاموس نیز به عنوان محلی که این سیگنال های تنظیمی اشتها را یکپارچه می کند شناخته شده است ]42[ .


شکل 2 – 2) طراحی شماتیک ساده از مناطق هیپوتالاموس که در مصرف مواد غذایی نقش اصلی ایفا می کند.]41[
2-2-4:هیپوتالاموس
برای حفظ یک وزن در یک دوره زمانی نسبتاً طولانی همواره باید توازنی بین دریافت غذا و هزینه انرژی برقرار باشد. هیپوتالاموس اولبین مرکزی است که حدود 50 سال قبل نقش ان در این فرایند شناخته شد. در اوایل دهه 1940 نشان داده شد که تزریق یا ایجاد تحریک در هسته های ویژه ای از هیپوتالاموس باعث تغییر در رفتار تغذیه ای و دریافت غذا می شود. در هیپوتالاموس هسته های بطنی میانی (VMH) ، به عنوان «مرکز گرسنگی» شناخته شده اند. هسته های کمانی (ARC) هیپوتالاموس نیز به عنوان محلی که این سیگنال های تنظیمی اشتها را یکپارچه می کنند شناخته شده است. چرخه های عصبی متعددی در هیپوتالاموس قرار دارد. بر اساس دانسته های ما شبکه های عصبی و انشعابات آنها در داخل هیپوتالاموس قرار دارد. بر اساس دانسته های ما شبکه های عصبی و انشعابات آنها در داخل هیپوتالاموس گسترش پیدا می کنند و اجتماعات عصبی مجزا، نروترانسمیترهای ویژه ای را ترشح کرده که بردریافت غذا و یا هزینه کرد انرژی اثر گذاشته که خود توسط سیگنال های خاص وضعیت تغذیه ای تنظیم می شوند. سیگنال های محیطی درگیر در تهادل انرژی، از قبیل هورمون های روده ای مثل پپتاید YY و GLP-1 از طریق یک مکانیسم فیرقابل اشباع از سد خونی- مغزی گذشته و بنابراین به ARC می رسند. البته سیگنال های دیگری از قبیل لپتین و انسولین از طریق یک مکانیسم قابل اشباع از خون به مغز می رسند. بنابراین سد خونی – مغزی یک نقش تنظیمی پویا در عبور دادن برخی سیگنال های انرژی گردش خون دارد. در ARC دو دسته اصلی نرون که به وضعیت تغذیه ای حساس هستند ، وجود دارند . یک دسته از انها دریافت غذا و اشتها را تحریک و دسته دیگر ان را مهار می کنند عوامل اشتها آور و شد اشتها به ترتیب فعالیت سیستم عصبی سمپاتیک را کاهش و افزایش می دهند و به موجب آن ذخایر چربی بدن و هزینه انرژی را تنظیم می کنند . این عمل از طریق تغییر گرمازایی در BAT و احتمالاً در محل های دیگری از قبیل بافت سفید چربی وعضله، از طریق القاء پروتئین جفت نشده میتوکندریایی یک UCP-1 و UCP-2 و UCP-3، انجام می شود. ارتباط بین دریافت غذا و فعالیت سمپاتیک از طریق مواد انتقال دهنده عصبی متعددی صورت می گیرد. نروپتایدها عناصر مهم سیستم تنظیم کننده دریافت غذا هستند. هورمون ها ، انتقال دهنده های عصبی و نروپتایدهایی که بر دریافت غذا اثر می گذارند. مولکول های تحریک کننده اشتها شامل نوراپی نفرین، گاما آمینو بوتیریک اسید و هفت دسته از نروپتایدها هستند، در حالی که مولکول های مهار کننده غذا اشتها شامل سروتونین، دوپامین و تعداد زیادی از پپپتایدهای روده ای – مغزی هستند ]42[ .
2-2-5:سیگنال های عصبی و هورمونی کنترل اشتها
در موجودات تکامل یافته، نظیر انسان سیستم تنظیم دریافت غذا شامل دو بخش شبکه تنظیم اشتها و سیگنال های عصبی و هورمونی ارسالی از نواحی مختلف بدن به شبکه تنظیم اشتها می باشد که بخش اول از نورون های ایجاد کننده اشتها یا نورون های اورکسیژنیک و نورون های ایجاد کننده بی اشتهایی یا نورون های انورکسیژنیک تشکیل شده است که همگی در هسته های مختلف هیپوتالاموس قرار دارند و این دو دسته نورون شبکه تنظیم اشتها با یکدیگر در ارتباط هستند و بر فعالیت یکدیگر اثر می گذارند ]43[ . بنابراین عوامل تنظیمی متعددی چون هسته های مختلف هیپوتالاموس واقع در سیستم عصبی مرکزی، ذخایر انرژی و هورمون ها در تنظیم اشتها و دریافت غذا بصورت دراز مدت وکوتاه مدت دخالت دارند . در انسان انتقال دهنده های سیستم عصبی و پپتیدهای روده ای متعددی از عوامل مهم تنظیم اشتها می باشند]44[. اکثر مطالعات انجام گرفته در زمینه اشتها و دریافت غذا، روی دو هورمون لپتین و گرلین متمرکز است. این دو هورمون بعنوان تنظیم کننده های اصلی شبکه تنظیم اشتها و دریافت غذا درهسته های مختلف هیپوتالاموس مطرح هستند]45[.
هورمون لپتین محصول ژن چاقی است که در تنظیم فرایندهای متابولیک دخیل است و نمایانگر میزان ذخیره چربی بدن است . این هورمون با گیرنده های ویژه ای در هیپوتالاموس و با مهار باعث کاهش اشتها می شود و از طرف دیگر ترشح نوروپپتید Y با افزایش فعالیت سیستم عصبی سمپاتیک و لیپولیز موجب افزایش میزان متابولیسم بدن، میزان انرژی مورد نیاز و در نتیجه میزان چربی بدن را کنترل می کند]46[.
گرلین به عنوان یک لیگاند درون زاد برای گیرنده ترشح دهنده هورمون رشد مطرح است. سلول های غده اکسینتیک موکوس فوندوس معده منبع اصلی این پپتید اشتها آور است ]47[. مطالعات گذشته نشان داده است درحالی که تزریق انسولین در برخی از هسته های هیپوتالاموس سیستم اعصاب مرکزی دریک روش وابسته به دوز بعد از ورود به فضای بین سلولی درمغز به رسپتورهای خود نظیر نورون های، نوروپپتید Y متصل و آن را مهار می کند و یا از طریق تحریک انتقال دهنده عصبی α –MSH به دلیل افزایش تولید وترشح لپتین سبب کاهش دریافت غذا می شود ولی افزایش سطح سرمی انسولین (به صورت محیطی) در صورتیکه باعث کاهش غلظت گلوکزخون شود می تواند اشتها را تحریک نماید ]48[.

شکل 2 – 3 ) گردش هورمون های موثر بر تعادل انرژی از طریق هسته کمانی ]44[
2-2-6:سیستم کنترل مرکزی
سیگنال های نماینده چاقی در CNS یکپارچه می شوند. در داخل CNS دریافت غذا و تنظیم وزن به طور موثری انجام می شود. در CNS و بطور اختصاصی در هیپوتالاموس دو سیستم موثر آنابولیک و کاتابولیک وجود دارد که وزن بدن و توده چربی را تنظیم می نمایند . مسیرهای که سیگنال های چاقی از لپتین (مترشحه از آدیپوسیت ها) و انسولین (مترشحه از پانکراس ) با چرخه های خودکار مرکزی اندازه غذا را تنظیم می کنند.لپتین و انسولین مسیر کاتابولیک (نرون های POMC/CART ) را تحریک و مسیر آنابولیک (نرون های NPY/AGRP ) که از ARC منشأ می گیرندۀ را مهار می کنند. درون دادهای آوران وابسته به سیری از کبد و مجاری معده ای ـ روده ای و از پپتیدهایی مثل CCK از طریق عصب واگ و تارهای سمپاتیک به NTS ، یعنی جای که با درون دادهای پایین رونده هیپوتالاموس یکپارچه می شوند. برون داد عصبی خالص از NTS و سایر نواحی بصل النخاع و مخچه مغز منجر به خاتمه غذا خوردن می شوند. کاهش درون دادهای از سیگنال های چاقی ( در حین کاهش وزن ناشی از رژیم) بنابراین باعث افزایش اندازه غذا به وسیله کاهش پاسخ های ساقه مغز به سیگنال های سیری می شوند]4[.
مسیر های که سیگنال های جاقی از لپتین (مترشحه از آدیپوسیت ها) و انسولین (مترشحه از پانکراس) با چرخه های خودکار مرکزی اندازه غذا را تنظیم می کنند. لپتین و انسولین مسیر کاتابولیک (نرون های POMC/CART ) را تحریک و مسیر آنابولیک (نرون های NPY/AGRP ) که از ARC منشأ می گیرند ، را مهار می کنند. درون دادهای آوران وابسته به سیری از کبد و مجاری معده ای-روده ای و از پپتیدهایی مثل CCK از طریق عصب واگ و تارهای سمپاتیک به NTS ، یعنی جای که با درون دادهای پایین رونده هیپوتالاموس یکپارچه می شوند. برون داد عصبی خالص از NTS و سایر نواحی بصل النخاع و مخچه مغز منجر به خاتمه غذا خوردن می شوند. کاهش درون دادها از سیگنال های چاقی (درحین کاهش وزن ناشی از رژیم) بنابراین باعث افزایش اندازه غذا به وسیله کاهش پاسخ های ساقه مغز به سیگنال های سیری می شوند. ]4[.

جدول 2-1- مولکول های سیگنالی کاندید در هموستاز انرژی در CNS ]39[.
سیستم موثر آنابولیک باعث افزایش دریافت غذا، اکتساب وزن، کاهش هزینه انرژی و برعکس سیستم موثر کاتابولیک باعث کاهش دریافت غذا ، از دست دادن وزن و افزایش هزینه انرژی می شود .
2-2-7:کنترل محیطی اشتها
سیگنال های محیطی درگیر در تعادل انرژی، از قبیل هورمون های روده ای مثل پپتاید و GLP1 از راه یک مکانیسم غیرقابل اشباع از سدخونی- مغزی گذشته و بنابراین به ARC می رسند. البته سیگنال های دیگر از قبیل لپتین و انسولین از راه یک مکانیسم قابل اشباع از خون به مغز می رسند. بنابراین سد خونی- مغزی یک نقش تنظیمی پویا در عبور دادن برخی سیگنال های انرژی گردش خون دارد ]49[.
گرلین اولین هورمونی است که به دنبال تزریق محیطی موجب افزایش غذا خوردن می شود. در انسان ها گرلین پلاسمایی قبل زا هر وعده غذا افزایش ناگهانی و پس از صرف هر وعده غذایی به صورت کوتاهی سقوط می کند. این یافته ها دلالت بر این دارند که گرلین سممکن است به عنوان یک شاخص تعادل انرژی کوتاه مدت تلقی شود و ممکن است به عنوان یک مولکول سیگنالینگ در طول مدت زمان تخلیه انرژی در نظر گرفته شده است ]49[.

شکل 2-4 ) تنظیم مصرف غذا بوسیله ی هورمون های محیطی و مسیرهای سیگنالینگ مرکزی انها.]45[
2-3 :تنظیم کننده های وزن و متابولیسم بدن
گزارش ها نشان که وزن و متابولیسم بدن توسط نوروپپتید ها و هورمون های متعددی کنترل و تنظیم می شود.که به اختصار به توضیح برخی از مهمترین آنها می پردازیم.
2-3-1:نروپپتایدها
2-3-1-1: نوروپپتید Y (NPY)
NPY یک پپتید 36 اسید آمینه ای و یکی از فراوان ترین و گسترده ترین (از لحاظ توزیع) عوامل انتقال دهنده عصبی در مغز پستانداران می باشد. ARC محل اصلی بیان NPY در داخل نرون های هیپوتالاموس می باشد. هر چند NPY پس از تزریق مرکزی اثرات گوناگونی روی رفتار و عملکرد به جا می گذارد. ولی قابل توجه ترین اثر آن تحریک غذا خوردن است. تزریق چندباره NPY به داخل PVN یا دهلیزهای مغزی باعث چاقی می شود که نشان دهنده آن است که NPY قادر به مهار سیگنال های مهار کننده دریافت غذا می باشد. NPY باعث تعادل مثبت انرژی از طریق افزایش دریافت غذا می شود و همچنین باعث کاهش هزینه انرژی از طریق کاهش گرمازایی در BAT و همچنین تسهیل ذخیره چربی در بافت سفید چربی از طریق افزایش فعالیت انسولین می گردد ]50[. NPY در ARC سنتز شده و به داخل PVN ترشح می شود و توسط سیگنال های مثل لپتین، انسولین (که هر دو مهار کننده) و گلوکورتیکوئیدها (فعال کننده)، تنظیم می شود. سنتز و ترشح NPY در مدل های با شرایط کمبود انژژی یا افزایش نیازهای متابولیکی از قبیل گرسنگی ، دیابت وابسته به انسولین، شیردهی و فعالیت بدنی افزایش می یابد. نقش فیزیولوژیکی اصلی نرون های ARC ، NPY، احتمالا برقراری مجدد تعادل انرژی و ذخایر چربی بدن در شرایطی است که بدن با کمبود انررژی مواجه است. علیرغم شواهد کافی برای نشان دادن نقش کلیدی NPY در هموستاز انرژی، عجیب این است که در موش های که ژن NPY آنها کاملا حذف شده بود دارای فنوتیپ نرمال بودند به جز اینکه مستعد به جمله ناگهانی شده بودند. بنابراین هنوز کاملا مشخص نیست که آیا NPY فقط در شرایط حادی از قبلی موش های تراریخته ob/ob در پراشتهایی یا چاقی نقش دارد یا آیا فنوتیپ نرمال به علت مکانیسم های جبرانی توسط سایر سیگنال های اشتهاآور است که جایگزین NPY می شوند و به حفظ تغذیه طبیعی و تنظیم وزن کمک می کنند ]51[.

شکل 2-5) فعال سازی سلول های عصبی NPY / AGRP دارای یک اثر اشتهاآور، در حالی که فعال سازی سلول های عصبی POMC / CART اثر ضد اشتهای می باشد.
2-3-1-2: ارکسین ارکسین اخیرا به عنوان دسته ای از نروپپتیدها شناخته شده که همچنین تحت عنوان هیپوکرتینز نامگذاری می شود. ارکسین A و B به ترتیب دارای 23 و 28 اسید آمینه بوده و 46 درصد مشابهت دارند. هر دو پپتید توسط یک ژن کدگذاری شده و در نرون های خلفی و جانبی هیپوتالاموس قرار دارند. تزریق ارکسین A به طور معنی داری موثرتر از ارکسین B می باشد. البته اثر ارکسین بر تحریک غذا خورئن از اثر NPY خفیف تر است. ارکسین احتمالا بیشتر درگیر کنترل متابولیسم انرژی است تا دریافت غذا . ناشتایی باعث تظاهر افزایش ژن ارکسین در هیپوتالاموس می شود ]49[.
2-3-1-3: گالانین
گالانین یک پپتید 29 اسیدآمینه ای است که در دسته ی نورونی PVN , DMH , ARC توزیع شده است. گالانین دریافت غذا در موش های صحرایی پس از تزریق به داخل CV و همچنین VMH , LH , PVN و هسته های مرکزی آمیگدال را تحریک می کند. همانند MCH و ارکسین، غذا خوردن ناشی از گالانین ضعیف تر از NPY بوده و تزریق مداوم گالانین اثری بر حفظ چاقی یا پراشتهایی ندارد. از لحاظ آناتومیکی و عملکردی ارتباط نزدیکی بین نرون های تولید کننده گالانین وسایر سیگنال های اشتهاآور وجود دارد. هر چند سیستم NPY ارتباط نزدیکی با مصرف و هضم کربوهیدرات ها دارد، گالانین احتمالا در وهله اول در کنترل مصرف چربی ها و افزایش ذخیره بافت چربی از طریق کاهش در هزینه کرد انرژی دخالت دارند. گالانین در حین دوره میانی چرخه غذایی طبیعی فعال شده و یک رژیم با چربی بالا می تواند تولید گالانین را در PVN افزایش داده که ارتباط نزدیکی با چاقی بدن دارد ]49[.
2-3-1-4: نوروپتیید w-23
نوروپتیید W-23 که در ده اخیر کشف شده از 23آمینو اسید تشکیل شده است.که در تنظیمات تغذیه ای و هورمونی مشارکت دارد. مطالعات نشان می دهد ، تزریق داخل بطن مغزی NPW23 باعث افزایش جذب غذا و تحریک آزادسازی پرولاکتین]52[ و کورتیکوسترون ]53[ در موش صحرایی می شود،همچنین تحقیقات آزمایشگاهی نشان داده که افزایش غلظت NPW23 ، به طور قابل توجهی بر پرولاکتین، هورمون رشد و انتشار ACTH از سلولهای هیپوفیز قدامی را تغییر می دهد ]53[.
2-3-2:هورمون ها
2-3-2-1:گرلین
گرلین برای اولین بار در سال 1999 توسط کوجیما و همکارانش از معده موش جداسازی شد و به عنوان لیگاند درونی برای گیرنده GHS-Ra مطرح گردید. گرلین به هنگام گرسنگی به مقدار زیادی در سلولهای مخاط معده و به مقدار اندکی در سایر اندام ها از جمله مغز، هیپوفیز، سلولهای لایدیگ و سلولهای سرتولی نیز به نسبت کمتر تولید می شود ]54[. مطالعات نشان داده گرلین علاوه بر افزایش هورمون رشد ]55[ سبب افزایش تخلیه معده، افزایش اشتها، افزایش وزن بدن ]56[ تحریک ترشح ACTH ، مهار LH 6 و کاهش غلظت هورمون های تیروئیدی می شود ]57[. تزریق گرلین از طریق افزایش بیان ژن ها ی AgRP و NPY در هستۀ ARC هیپوتالاموس که نورونهای آنها مستقیماً بر روی TRH گیرنده دارند سبب کاهش هورمونهای تیروییدی می شوند ]58[.

شکل 2-6) گرلین قبل و بعد از دریافت غذا
2-3-2-2:ابستاتین
زانگ و همکاران (۲۰۰۵) پپتید ۲۳ اسید آمینه ای دیگری به نام ابستاتین را شناسایی کردند. این پپتید از ژن سازنده ی گرلین مشتق شده که بعد از ترجمه، دستخوش تغییرات متفاوتی شده است. یافته های بررسی ها نشان داد درمان جوندگان با ابستاتین منجر به تعادل انرژی منفی از راه کاهش دریافت غذا و تخلیه ی معده می شود. بنابراین برخی پژوهشگران به این نتیجه رسیدند که گرلین و ابستاتین اثرات متضادی بر تنظیم وزن دارند و ممکن است عملکرد نامطلوب ابستاتین در پاتوفیزیولوژی چاقی درگیر باشد.]59[
پژوهش قنبری نیاکی و همکاران نشان داد کسر و گلیکوژن کبدی ناشی از تزریق اتیونین در موش ها ATP منجر به افزایش سطح گرلین پلاسما می شود که می تواند به عنوان یک آغازگر مهم دریافت غذا مد نظر قرار گیرد؛ هم چنین مشاهده شد سطح ابستاتین پلاسما مورد تاثیر و گلیکوژن کبد نیست و انجام تمرین های ATP کاهش ورزشی نیز نتوانست این نتیجه را مورد تاثیر قرار دهد. پژوهشگران این گونه نتیجه گیری کردند که گرلین نسبت به ابستاتین به کسر انرژی کبد حساس تر است ]60[. گائو و همکاران(2009) انجام پژوهشی روی زنان و مردان چاق دریافتند سطح گرلین و ابستاتین آزمودنی های چاق پایین تر، اما نسبت گرلین به ابستاتین آنها از آزمودنی های با وزن طبیعی بالاتر بود ]61[.
زامرازیلوا و همکاران (۲۰۰9) نیز نسبت سطح گرلین به ابستاتین پلاسما را در زنان با وزن طبیعی، چاق و دچار بی اشتهایی عصبی اندازه گیری نمودند. یافته ها نشان داد نسبت سطح گرلین به ابستاتین در زنان با بی اشتهایی عصبی به طور معنی داری بالاتر از سایر گروه ها بود ]62[. در کل نقش واقعی ابستاتین در سازوکار چاقی هنوز مشخص نیست، اما تعادل بین گرلین و ابستاتین نقش مهمی در سازوکار چاقی و بیماری های متابولیکی ایفا می کند]63[.
2-3-2-3:لپتین
لپتین، پروتئین 167 اسید آمینهای است که در تنظیم فرآیندهای متابولیک دخالت دارد و نمایانگر ذخیره چربی بدن است]64[ برخی از پژوهشگران لپتین را عامل هشدار دهنده در تنظیم محتوای چربی بدن ذکر کرده اند ]65[ لپتین پس از تولید در بافت چربی به داخل خون ریخته می شود . در سد خونی مغز ناقل هایی وجود دارد که باعث ورود لپتین به دستگاه عصبی مرکزی شده و با شرکت در سرکوب سنتز نوروپپتیدهایی از قبیل نوروپپتیدy (عامل افزایش اشتها)، باعث کاهش اشتها می شود]66[ . بنابراین اثر خالص عملکرد لپتین در جهت کاهش وزن است اما کمبود این هورمون و یا مقاومت نسبت به آثار آن، هر دو می تواند سبب افزایش وزن شوند]67[ .
پژوهش استاد رحیمی و همکاران روی زنان چاق، نشان داد توده بافت چربی از پیشگویی کننده های اصلی غلظت لپتین بوده و همبستگی معنی داری بین توده چربی و لپتین وجود دارد ]68[ نتایج پژوهش ضرغامی و همکاران نشان داد که مقادیر سرمی لپتین در زنان چاق حدود 3 برابر زنان با وزن طبیعی بوده و همبستگی مستقیمی بین لپتین و شاخص توده بدن وجود دارد ]69[. همبستگی بین غلظت سرمی لپتین با شاخص توده بدن، درصد و توده چربی بدن، ذخایر مختلف چربی و همچنین ضخامت چربی زیر پوستی در تحقیقات دیگر نیز مشاهده شده است ]70[ این همبستگی در زنان چاق 3 برابر بیش تر از مردان چاق است ]71[.
87630-80645
شکل 2- 7 ) لپتین به عنوان بخشی از یک حلقه بازخورد به حفظ ذخائر ثابت از چربی عمل می کند. از دست دادن چربی بدن منجر به کاهش در لپتین، که مولکول های تغذیه محرک در هیپوتالاموس، مانند NPY را فعال می سازد. در مقابل، افزایش چربی بدن منجر به افزایش لپتین، که مولکول های تغذیه بازدارنده مانند MC را فعال می سازد. ]49[
2-4: نوروپتیید w
نوروپتیید w که اولین بار از هیپوتالاموس خوک جدا شده به دو شکل وجود دارد که شامل نوروپتیید 23- w (NPW23) یا نوروپتیید 30- w (NPW30) که 23 و 30 نشان از تعداد آمینو اسید تشکیل دهنده آن است.این نوروپتییدها به یکی از دو دریافت کننده NPW ، شامل GPR7 (NPBWR1) و GPR8(NPBWR2) متصل می گردد که به خانواده ی گروه پروتیین G تعلق دارند. GPR7 در مغز و قسمت های بیرونی و خارجی بدن انسان و جانوران جونده وجود دارد، در حالیکه GPR8 در جانوران جونده وجود ندارد . mRNA GPR7 در جانوران جونده به شکل گسترده ای در بسیاری از مناطق هیپوتالاموس ، شامل قسمت بطنی ، بصری ، میانی جلویی ، پشتی ، فوقانی وقسمت های قوس داربیان شده است .
مشاهدات نشان می دهد که GPR7 نقش مهم و حیاتی در تعدیل عملکرد غده های درون زا و عصبی ایفا می کند. تزریق بطنی مغزی NPW نشان داده شده که مانع جذب غذا شده و در وزن بدن اختلال ایجاد می نماید و موجب افزایش تولید گرما و حرارت و دمای بدن می شود، این نشان می دهد که NPW به عنوان یک مولکول نشانگر کاتابولیسم درونی عمل می کند ]72[.
2-4-1:گیرنده های NPW
در سال 1995 ، ادد و همکارانش از الیگونکلوتیدهای بر مبنای گیرنده ی اپیوئیدی و همینطور گیرنده ی سوماتواستاتین جهت شناسایی دو ژن GPR7 و GPR8 استفاده کردند.که پیش بینی می شود این دو دریافت کننده مسئول کد گذاری گروه پروتئینی G درون مغز انسان هستند. mRNA GPR7 در مغز انسان و جانوران جونده نشان داده شده ، در حالیکه ژن GPR8 در مغز انسان و خرگوش و نه جانوران جونده شناسایی شده است ]73[. در سال 2002، شیمومورا و همکارانش لیگاندهای درون زا را در مورد-8 GPR7 با در معرض قرار دادن سلول های تخمدان موش های چینی (CHO) با ذره های هیپوتالامیک خوک، تغییراتی در سطح CAMP مشاهده نمودند. علاوه بر این، وقتی بیان سلول GPR7 یا GPR8با عصاره ی هیپوتامیک القا شد تولید CAMP ناشی از فورسکولین متوقف می شود. این دریافت کننده ها به دریافت کننده های گروه پروتیینی Gi متصل بودند ]52[.
تجزیه و تحلیل ساختاری بیشتر در مورد لیگاندهای مسئول مهار تولید cAMP منجر به شناسایی یک پپتید جدید به نام NPW گردید. شیمومورا و همکاران توالی پپتید بالغ 23 و30 آمینو اسید باقی مانده از خوک ، موش و انسان را شناسایی کردند.NPW به دو شکل بالغش : NPW30 (شامل 30 آمینو اسید) و NPW23 (شامل 23 آمینو اسید) نام گذاری شده است که در ژن انسان بوسیله تاناکا و همکاران (2003) شناسای شد ]72[.

شکل 2- 8) فرق نوروپتیید 23- w و نوروپتیید 30- w ( انسان ، خوک ، رت ، موش)].72[
2-4-2: توزیع مرکزی NPW
بر اساس آنالیز RT-PCR ، برزلین و همکارانش (2003)گزارش داده اند که ژن NPW در سیستم عصبی مرکزی انسان مانند جسم سیاه و نخاع ، و در حد متوسط ​​در هیپوکامپ، آمیگدال، جسم پینه ای هیپوتالاموس ، مخچه و ریشه پشتی نخاع بیان شده است. شیمی سلولی هیبریداسیون در جوندگان نشان داده است که ژنNPW در چند مناطق محدود مغزی شامل PAG، هسته EW و هسته پشتی جنین توزیع شده است ]74،53،10 [. در حالی که کیتامورا و همکاران،( 2006) گزارش داده اند که این موضوع به هسته های خاصی در مغز میانی و ساقه مغز محدود می شود. با این حال، بر اساس تجزیه و تحلیل RT-PCR، گزارش داده اند که NPW mRNA در قسمت PVN، VMH ، ARC و LH موش بیان می شود]75[.مطالعه دیگری نیز حاکی از توزیع NPW در قسمت های متعددی از مغز موش صحرایی بوده است ]76[.
مطالعات ایمونوهیستوشیمی نشان داده است که NPW-LI به طور عمده در مناطق هیپوتالاموس، ARC و غده هیپوفیز خلفی ، با یک سطح پایین تر در PVN مشاهده شده است. جالب این است که سلول های NPW-LI هیپوتالاموس نر نسبت به ماده بیشتر است ]76[. در مطالعه دیگری، کیتامورا و همکاران (2006) از استقرار زیادی از NPW-LI را در سلول مغز میانی، شامل PAG و EW خبر داده اند. علاوه بر این، آنها برای اولین بار حضور NPW-LI و فرآیندهای آن را در PVN، VMH و آمیگدال در سطح میکروسکوپ الکترونی شناسایی و بررسی کرده اند]77[. همچنین، رشته های عصبی NPW-LI به وفور در مغز میانی و در دستگاه لیمبیک، از جمله CEA و BST توزیع شده بود، این امر نشان می دهد که NPW ممکن است در فرایند تعدیل ترس و اضطراب و همچنین در رفتار تغذیه نقش مهمی ایفا کند]78،77،76،75[.
2-4-3: توزیع محیطی NPW
در بافت های محیطی، NPW در نای ، در سلول سرطانی لنفوسیت نابالغ کلیه جنین و سرطان روده بزرگ بیان می شود]79[.سلول های وابسته به قشر غده فوق کلیوی نیز NPW تولید می کند]78[.هوکل وهمکاران (2006) گزارشی مبنی بر توزیع NPW در تیروئید و غدد پاراتیروئید، پانکراس، غدد آدرنال، تخمدان و بیضه در موش ارائه کردند.درحالیکه روکینیسکی و همکاران (2007) واکنش پذیری ایمنی NPW در تمام سلول های پانکراس شامل سلول های A ،B وD رانشان داده اند. درمقابل ، دزاکی و همکاران ( 2008) واکنش پذیری ایمنی NPW را در سلول های B ، و نه سلول های A یا D یافتند. بعلاوه NPW mRNA در سیستم ادراری تناسلی از جمله کلیه، بیضه ها، رحم، تخمدان، و جفت توزیع شده است ]80[.
بر اساس انالیز RT-PCR ، از حضور ژنNPW در در غده هیپوفیز، غده فوق کلیوی و معده را تایید کرد ]81[. این مشاهدات نشان می دهد که NPW ممکن است نقش مهمی در تنظیم سیستم غدد درون ریز را در پاسخ به استرس و همچنین در فعال شدن محورهیپوتالاموس هیپوفیز فوق کلیوی (HPA) ایفا کند ]81،82[.
2-4-4: توزیع GPR7-8
تجزیه و تحلیل RT-PCR در انسان نشان داد که ژن GPR7 به شدت در آمیگدال، هیپوکامپ، نئوکورتکس، و هیپوتالاموس بیان می شود ]73[. مطالعات مربوط به شیمی سلولی نشان داده است که ژن GPR7 در هیپوتالاموس موش، از جمله ARC، VMH، PVN و DMH، موجود است .ایشیی و همکاران (2003) گزارش داده اند که از بین بردن NPBW1 باعث پر خوری و توسعه چاقی می شود. سینگ و همکاران (2004) از دریافت کننده ی رادیوگرافی [125I]-NPW استفاده کرده و توزیع قابل توجهی از NPBW1 در آمیگدال موش و هیپوتالاموس، و همچنین در BST، MPA ، PAG ، ارگان سابفورنیکال و سطوح خاکستری رنگ سوپریور کولیکلوس ( قسمتی از مغز میانی) را نشان دادند. به طور کلی، GPR7 در سطح وسیعی در آمیگدال بیان می شود ]84،83،74[. اگر چه BST بالاترین سطح بیان GPR7 در پستانداران کوچک را نشان داده است، این پدیده در انسان ثابت نشده است. کیتامورا و همکاران ( 2006) گزارش کرده اند که GPR7 بیشتر در CeA و BST، موش صحرایی توزیع شده است که این امر ممکن است نشان دهد که GPR7 در تنظیم استرس، احساسات، ترس و اضطراب دخالت دارد. از طرف دیگر ژن های GPR7-8 در غده هیپوفیز و غده فوق کلیوی ( قشری و مرکزی ) بیان شده است ]72[ . این مشاهدات نشان می دهد که GPR7-8 ممکن است در پاسخ به استرس از طریق محور HPA درگیر باشد]82 [.
زیلوکوسکا و همکاران (2009 ) اخیرا آزمایشی مبنی بر توزیع و عملکرد NPW، NPB، و GPR7 در سلول های مانند یاخته ی استخوانی موش صحرایی و همچنین نتایج آن را که حاکی از تاثیر مستقیم بر روی تکثیر سلول ها بود را انجام دادند. NPB در پستانداران بزرگ، و همچنین در خرگوش شناسایی شده است، اما در موش صحرای و هیچ یک از موش ها بیان نشده است. تجزیه و تحلیل RT-PCR نشان داده است که ژن GPR8 است که به شدت در آمیگدال، هیپوکامپ، غده هیپوفیز، غده فوق کلیوی و بیضه ها و همچنین در سلول های قشری در غدد فوق کلیوی بیان شده است ]72[ .
2-4-5: تنظیم تغذیه ومتابولیسم انرژی بوسیله NPW
حذف GPR7 در موش های باعث پرخوری و کاهش مصرف انرژی می شود. این امر نشان می دهد که NPW ممکن است به عنوان یک تعدیل کننده تغذیه عمل کند. تزریق داخل بطن مغزی NPW در موشهای صحرایی نر باعث افزایش جذب غذا طی 2 ساعت اول در فاز نور می شود ]52[. همچنین لوین و همکاران (2005) گزارش کرده اند که تزریق NPW به PVN مصرف مواد غذایی را افزایش می دهد . این نتایج نشان می دهد که NPW به عنوان یک پپتید اشتها آور حاد عمل می کند. با این حال، موندال و همکاران (2003) گزارش کرده اند که هر دو شکل NPW باعث سرکوب تغذیه در فاز تاریک می شود،این نشان می دهد که اثر NPW در مورد تغذیه متفاوت است بسته به اینکه آیا حیوانات در نور و یا فاز تاریک نگهداری می شود]72[.
مطالعات عصبی انجام شده نشان داد که رابطه عصبی بین NPW و دیگر نوروپپتید های درگیر در تنظیم تغذیه باعث فعل و انفعالات عصبی بسیار نزدیک بین رشته های عصبی حاوی NPW و ارکسین یا هورمون MCH و رشته های عصبی در مغز موش های صحرایی می شود ]85[. در حالی که لوین و همکاران (2005) نشان داد که توزیع c-fos در نورون های حاوی ارکسین در منطقه ی پریفورنیکل در LH بعد از تزریق NPW در داخل بطن مغزی (icv) رخ داده است. جالب این است، که آنها همچنین سلول های NPW-LI در VMH، را نیز شناسایی کردند که به عنوان یک مرکز سیری شناخته شده است ]75[.
تاثیر لپتین بر روی عصب در VMH ، باعث کاهش میزان جذب غذا می شود و دیت و همکاران (2010) گزارش داده اند که سلول های عصبی NPW-LI و گیرنده های لپتین در این منطقه از مغز متمرکز شده اند . بیان NPW نیز به طور قابل توجهی در OB / OB و db/db موش تنظیم می شود. بنابراین، NPW ممکن است نقش مهمی در متابولیسم تغذیه و انرژی داشته باشد، و به عنوان یک جایگزین برای لپتین عمل کنید ]9[. علاوه بر این، NPW جذب مواد غذایی را از طریق گیرنده ملانوکورتین – 4 کاهش می دهد ، این بیانگر این است که NPW ممکن است نورون ها حاوی POMC را فعال و نورون های حاوی NPY را در ARC مهار کرده به کنترل و تنظیم در تغذیه بپردازد ]9[.
58420241935
شکل 2- 9 ) تصویر شماتیک بر اساس یافته های مطالعات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی تنظیم اشتها در هیپوتالاموس توسط سلول های عصبی NPW و پپتید مرتبط با تغذیه در هیپوتالاموس.]72[
به تازگی، اسکرزبپسکی و همکاران (2012) نشان داده اند که NPB و NPW بیان و ترشح لپتین و رزیستین را تنظیم می کند ، و باعث افزایش لیپولیز چربی در موش می شود]84[ . هنگامی که NPW به موش داده شد، محققان نمی توانستند بالا رفتن فعالیت های حرکتی را شناسایی کنند ، اما افزایش میزان مصرف O2 و افزایش تولید CO2، و همچنین افزایش دمای بدن را مشاهد نمودند ]86[ . جالب توجه است، مندال و همکاران (2006) گزارش کرده اند که سطح NPW جدا شده از سلول های آنترال معده موش در حیوانات که غذا نخورده اند پایین تر است ، و میزان آن در حیواناتی که به آنها غذا داده شد افزایش یافت. در مقابل، GPR7 ( - / - ) موش های ماده فعالیت های پر خوری از خود در مقایسه با موش هایی از نوع وحشی نشان نمی دهند ]87[. علاوه بر این، دان و همکاران (2003) وجود تفاوت بین موش های نر و ماده با توجه به میزان توزیع NPW ارائه داده اند.
2-4-6: عملکرد اندوکرین NPW
مطالعات ایمنوهیستوشیمی نشان داده که GPR7 در PVN، غده هیپوفیز وغدد فوق کلیوی در انسان و موش ]88،79،73،10[، به ویژه درسلول های PVN و هیپوفیز خلفی بیان شده است . با این وجود گزارش نشده است که NPW برای رها سازی دیگر هورمون های هیپوفیز قدامی تاثیر بگذارد. تاثیرات نورواندوکرین NPW به طور مستقیم از طریق GPR7 در سلول های غده هیپوفیز به عنوان واسطه عمل نمی کند ،اما ممکن است به طور غیر مستقیم از طریق کنترل آزاد سازی هورمون هیپوتالاموس و آزاد سازی هورمون محرک قشر غده ی فوق کلیوی عمل کند ]89،73[.
NPW نقش مهمی در پاسخ هیپوتالاموس به استرس ایفا می کند. با این حال، سطوح هورمون رشد در پلاسما بعد از تزریق داخل بطن مغزی این پپتید مهار می شود. این یافته ها نشان می دهد که NPW لیگاند درون زا برای GPR7 و / یا GPR8 است و به عنوان یک میانجی نورواندوکرین عمل می کند ]53،52[.علاوه بر این، تیلور و همکاران (2005) گزارش کرده اند که تزریق NPW محور HPA را فعال می کند، و باعث افزایش در سطح کورتیکوسترون پلاسما در موش های هوشیار می شود. اما باعث تحریک آزادی اکسی توسین و وازوپرسین نمی شود و همچنین در گردش خون محیطی، تغییرات فشار خون و ضربان قلب را نغییر نمی دهد. علاوه بر این، تزریق داخل بطن مغزی آنتاگونیست CRF باعث کاهش قابل توجهی سطح کورتیکوسترون نمی شود، اگر چه قبل از تزریق آنتاگونیست CRF به طور قابل توجهی افزایش مرکزی NPW سطح کورتیکوسترون را کاهش می دهد ]90[.
پرایس و همکاران (2008) گزارش کرده اند که با توجه به اثرات مرکزی NPW از فعال شدن سلول های عصبی سوماتوستاتین کمانی، می تواند بیان هورمون های آزاد کننده هورمون رشد را متوقف کند. این یافته ها نشان می دهد که NPW درون زا ممکن است یک نقش فیزیولوژیک مرتبط در پاسخ نورواندوکرین به استرس در مغز بازی کند]91[.
2-5: کورتیزول
کورتیزول از بخش قشری غدد فوق کلیوی ترشح می شود. یکی از اثرات مهم کورتیزول، نقش آن روی سوخت و ساز کربوهیدرات ها، پروتئین ها و چربی ها است. این هورمون فرآیند گلوکونئوژنز را از اسیدهای آمینه تسهیل، لیپوژنز کبد را کاهش و چربی های موجود در بافت چربی را به حرکت در می اورد. دو تاثیر مهم دیگر کورتیزول عبارتند از: حفظ واکنش عروقی به کاتکولامین ها و جلوگیری از واکنش های التهابی و پاسخ طبیعی بافت ها نسبت به آسیب. کورتیزول یکی از مهم ترین هورمون های استروئیدی است که در تنظیم عملکردهای قلبی- عروقی، ایمونولوژیکی، هموستازی و متابولیکی نقش دارد]92[.
2-5-1:کورتیزول و فعالیت بدنی
فعالیت بدنی نشانه تلاش فردی برای حرکت از یک محل به محل دیگر است. توانایی فرد برای اجرای فعالیت معین به نوع تغذیه و تمرین، مقاومت خارجی و متغیرهای دیگر وابسته است. علاوه بر این، فعالیت بدنی می تواند 1)سبک، متوسط و یا سنگین باشد .2) کوتاه مدت یا دراز مدت باشد. 3)گروه خاصی از عضلات و یا عموم عضلات را درگیر کند [93].
در جریان این امر الگویی که نقش هورمون ها به هنگام ورزش، در فعالیت بدنی را می توان به پنج مرحله تقسیم کرد:
1.مرحله قبل از شروع فعالیت
2.مرحله شروع فعالیت
3. مرحله فعالیت

user8328

تقدیم می کنم
سپاسگزاری
حال که در سایه الطاف پروردگار یکتا، تحقیق در مورد این پژوهش به اتمام رسیده است، برخود واجب می دانم که از زحمات کلیه کسانی که از آغاز تا به امروز ، مرا راهنمایی نموده اند کمال تشکر و قدردانی را به عمل آورم.
از استاد راهنمای گرامی ام، جناب آقای دکتر امین اله بهاءالدینی به خاطر راهنمایی های بسیار مفیدشان، تشکر می کنم و خیلی خوشحالم که دو سال شاگرد این استاد بزرگوار بودم. همچنین ازاساتید مشاور ارجمندم، جناب آقای دکتر جعفر وطن پرست، جناب آقای دکتر احمدرضا خسروی و جناب آقای دکتر محمودرضا معین به خاطر همه راهنمایی هاشون، تشکر می کنم. از نماینده محترم تحصیلات تکمیلی جناب آقای دکتر مرادشاهی و هم چنین از داور ارزیابی پایان نامه ام، جناب آقای دکتر صادقی هم کمال تشکر را دارم. از کلیه دانشجویان محترم سال های قبل رشته فیزیولوژی جانوری دانشگاه شیراز و هم چنین کلیه کارکنان بخش زیست شناسی دانشکده علوم سپاس گزاری می نمایم.

چکیده
اثر عصاره آبی- الکلی برگ و گل گیاه بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.) بر سیستم قلب و عروق و بررسی تداخل اثر آن با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتریک اکساید در موش صحرایی نر
به کوشش:
سهراب انوری حاجی محمدلو
گیاه بومادران شیرازی، گونه بومی جنس بومادران در ایران است. به منظور بررسی اثرات عصاره هیدروالکلی آن بر روی سیستم قلب و عروق و مکانیسم احتمالی آن، تحقیق حاضر به صورت زیر انجام شده است: 55 سر موش صحرایی نر بالغ از نژاد ویستار با محدوده وزنی 250-220 گرم به مدت یک هفته در شرایط نرمال 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی در حیوان خانه نگهداری شدند. تعداد 15 سر موش برای بررسی اثرات دوز های مختلف عصاره بومادران( دوز های 40، 50، 60، 80 و 100 میلی گرم بر کیلوگرم، 3=n) بر روی فشارخون سرخرگی مورد استفاده قرار گرفتند و تعداد 40 سر موش به منظور بررسی اثرات عصاره(دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) و حلال عصاره) اتانول 70 درصد) با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتررژیک به صورت تصادفی به هشت گروه پنج تایی تقسیم شدند. هر رت به وسیله تزریق داخل صفاقی یورتان بی هوش شد، سپس یک سیاهرگ و یک سرخرگ رانی به ترتیب برای انجام تزریقات و اندازه گیری فشارخون سرخرگی کانوله شدند. فشارخون سرخرگی و ضربان قلب، به وسیله ترانسدیوسر فشار متصل به دستگاه پاورلب ثبت گردید. فشارخون سرخرگی و ضربان قلب، قبل و بعد از تزریق عصاره بومادران(دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم، در گروه یک) و حلال عصاره(در گروه دو) ثبت شد. در گروه سوم (گروه کنترل سیستم کولینرژیک)، پارامترهای بالا قبل و بعد از تزریق آب مقطر(حلال دارو)، استیل کولین و حلال عصاره به همراه استیل کولین ثبت گردید. در گروه چهارم، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، استیل کولین و عصاره به همراه استیل کولین ثبت گردید. در گروه پنجم(گروه کنترل سیستم آدرنرژیک)، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، اپی نفرین و اپی نفرین به همراه حلال عصاره ثبت گردید. در گروه ششم، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، اپی نفرین و اپی نفرین به همراه عصاره بومادران ثبت شد. پارامترها در گروه هفتم(گروه کنترل سیستم نیتررژیک) قبل و پس از تزریق آب مقطر، L-NAME و حلال عصاره و در نهایت در گروه هشتم، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، L-NAME و عصاره ثبت گردید. داده ها به کمک نرم افزار SPSS و با استفاده از آزمون Independent T-test برای بررسی تفاوت های بین گروه ها و آزمون Paired sample T-test برای بررسی تفاوت های بین مراحل مختلف یک گروه با در نظر گرفتنp<0.05 به عنوان سطح معنی دار، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج نشان داد که تزریق داخل سیاهرگی دوزهای مختلف عصاره بومادران باعث کاهش فشار میانگین سرخرگی در یک روش وابسته به دوز شد. عصاره(دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) به طور قابل ملاحظه ای فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی و دیاستولی را کاهش داد، در حالی که حلال هم حجم آن اثر قابل ملاحظه ای بر روی فشارخون سرخرگی نداشت. ضربان قلب در حضور عصاره و حلال آن در مقایسه با حالت پایه خود، تغییر قابل ملاحظه ای نداشت. نتایج کاهش قابل ملاحظه فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی و فشاردیاستولی و افزایش ضربان قلب را در حضور عصاره به همراه استیل کولین در مقایسه با مرحله تزریق استیل کولین نشان داد. عصاره فشار دیاستولی را در رت هایی که اپی نفرین دریافت کرده بودند کاهش داد، در حالی که ضربان قلب تغییر چشمگیری نداشت. در آخر تزریق داخل وریدی عصاره به طور چشمگیری باعث کاهش فشار میانگین سرخرگی و فشاردیاستولی در رت هایی شد که به آن ها L-NAME تزریق شده بود. می توان نتیجه گرفت که عصاره هیدروالکلی بومادران شیرازی اثر کاهش دهندگی فشار خون دارد و این اثر هم سو با سیستم کولینرژیک و احتمالاً مستقل از سیستم آدرنرژیک است. اثر کاهش فشارخون این گیاه، عمدتاً به خاطر اثرگذاری آن بر عروق و مستقل از سیستم نیتررژیک می باشد.
کلمات کلیدی: عصاره بومادران شیرازی، سیستم کولینرژیک، سیستم آدرنرژیک، سیستم نیتررژیک، فشارخون، موش صحرایی
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه TOC f h z t "عنوان;1"
1-1بومادران21-2-بومادران شیرازی PAGEREF _Toc398906150 h 21-3ترکیبات موجود در گیاهان جنس Achillea PAGEREF _Toc398906151 h 31-4خواص درمانی بومادران PAGEREF _Toc398906152 h 41-5- نقش سیستم نیتررژیک در دستگاه قلب و عروق: PAGEREF _Toc398906158 h 51-6- عوامل تعیین کننده فشار شریانی PAGEREF _Toc398906159 h 71-7- مشخصات عملکرد دستگاه عصبی اتونوم(سیستم سمپاتیک و پاراسمپاتیک) PAGEREF _Toc398906160 h 71-8- نقش سیستم عصبی اتونوم در تنظیم عملکرد گردش خون: PAGEREF _Toc398906162 h 81-9- سیستم عصبی سمپاتیک: PAGEREF _Toc398906163 h 81-10- عصب دهی سمپاتیکی عروق خونی: PAGEREF _Toc398906164 h 81-11- رشته های سمپاتیک قلب: PAGEREF _Toc398906165 h 9فصل دوم:مروری بر تحقیقات پیشین
2-1- مطالعات انجام شده در رابطه با اثرات بومادران PAGEREF _Toc398906167 h 112-2- هدف PAGEREF _Toc398906168 h 15عنوان صفحه
2-3- فرضیات PAGEREF _Toc398906169 h 15فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- مواد مورد استفاده PAGEREF _Toc398906170 h 173-2- وسایل مورد استفاده PAGEREF _Toc398906171 h 183-3- روش کار PAGEREF _Toc398906172 h 193-3-1-روش عصاره گیری PAGEREF _Toc398906173 h 213-3-2- چگونگی تهیه و نگهداری موش های صحرایی PAGEREF _Toc398906174 h 213-3-3-گروه بندی موش ها213-3-4- اجزای سیستم ثبت فشار خون PAGEREF _Toc398906176 h 233-4- مراحل انجام آزمایش PAGEREF _Toc398906177 h 243-4-1- چگونگی تجویز دارو PAGEREF _Toc398906178 h 263-5- واکاوی آماری PAGEREF _Toc398906179 h 27فصل چهارم: نتایج
4-1-گراف های ثبت شده با دستگاه PAGEREF _Toc398906180 h 294-2- فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به دوز های مختلف عصاره شیرین بیان PAGEREF _Toc398906181 h 314-3- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره PAGEREF _Toc398906182 h 32عنوان صفحه
4-3-1 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) به عنوان گروه آزمایش با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) به عنوان گروه کنترل بر روی فشار خون PAGEREF _Toc398906183 h 324-3-2 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) به عنوان گروه آزمایش با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) به عنوان گروه کنترل بر روی ضربان قلب PAGEREF _Toc398906184 h 334-4- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره و داروی استیل کولین(دوز 01/0 میلی گرم بر کیلوگرم) PAGEREF _Toc398906185 h 364-4-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906186 h 374-4-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906187 h 384 -4-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906188 h 394-4-5- فشار دیاستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906189 h 404-4-6- فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906190 h 414-4-7- فشار میانگین سرخرگی در حضور عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906191 h 424-4-8- ضربان قلب در حضورحلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906192 h 444-4-9- ضربان قلب در حضور عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906193 h 454-5- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره و داروی اپی نفرین(دوز 04/0 میلی گرم بر کیلوگرم) PAGEREF _Toc398906194 h 464-5-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906195 h 474-5-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906196 h 494-5-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906197 h 504-5-6- فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906198 h 52عنوان صفحه
4-5-7- فشار میانگین سرخرگی در حضور عصاره بومادران و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906199 h 534-5-8- ضربان قلب در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906200 h 544-5-9- ضربان قلب در حضور عصاره بومادران و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906201 h 554-6- فشار میانگین و فشار سیستولی و دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره بومادران، حلال عصاره و داروی L-NAME (دوز 5 میلی گرم بر کیلوگرم) PAGEREF _Toc398906202 h 564-6-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906203 h 574-6-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و L-NAME PAGEREF _Toc398906204 h 584-6-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و داروی L-NAME PAGEREF _Toc398906205 h 594-6-5- فشار دیاستولی در حضور عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906206 h 604-6-6-فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906207 h 614-6-7- فشار میانگین سرخرگی در حضور عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906208 h 624-6-8- ضربان قلب در حضور حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906209 h 644-6-9-ضربان قلب در حضور عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906210 h 65 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- بررسی اثر عصاره آبی الکلی برگ و گل بومادران شیرازی بر فشار خون(فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی و دیاستولی) و ضربان قلب PAGEREF _Toc398906212 h 675-2- تداخل اثر عصاره آبی –الکلی برگ و گل بومادران شیرازی با سیتم کولینرژیک در سیستم قلب و عروق موش صحرایی نر PAGEREF _Toc398906213 h 69عنوان صفحه
5-3- تداخل اثر عصاره آبی –الکلی برگ وگل بومادران شیرازی با سیستم آدرنرژیک در سیستم قلب و عروق موش صحرایی نر PAGEREF _Toc398906214 h 705-4- تداخل اثر عصاره آبی –الکلی برگ وگل بومادران شیرازی با سیستم نیتررژیک PAGEREF _Toc398906215 h 725-5- نتیجه گیری PAGEREF _Toc398906216 h 745-6- پیشنهادات PAGEREF _Toc398906217 h 74فهرست منابع PAGEREF _Toc398906218 h 75منابع فارسی PAGEREF _Toc398906219 h 75منابع انگلیسی PAGEREF _Toc398906220 h 76

عنوان صفحه
فهرست جدول ها
TOC h z t "جدول ها;1" جدول 4-1-مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه در گروه کنترل PAGEREF _Toc398906551 h 32جدول 4-2- مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درحالت تزریق عصاره بومادران نسبت به حالت پایه در گروه آزمایش PAGEREF _Toc398906552 h 33جدول 4-3-مقایسه تغییرات ضربان قلب درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه(گروه کنترل) و تزریق عصاره نسبت به حالت پایه(گروه آزمایش) PAGEREF _Toc398906553 h 33جدول4-4 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906554 h 37جدول 4-5- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906555 h 38جدول4-6- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906556 h 39جدول4-7- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906557 h 40جدول4-8-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906558 h 41جدول4-9-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906559 h 43عنوان صفحه
جدول4-10-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906560 h 44جدول4-11- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906561 h 45جدول4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906562 h 48جدول 4-13 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906563 h 49جدول4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906564 h 50جدول 4-15- تغییرات فشاردیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906565 h 51جدول4-16- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906566 h 52جدول4-17- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906567 h 53جدول4-18-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906568 h 54جدول4-19-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره (erio)و اپی نفرین(Epi) PAGEREF _Toc398906569 h 55جدول4-20- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906570 h 57جدول4-21- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906571 h 58عنوان صفحه
جدول4-22- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906572 h 59جدول4-23- تغییرات فشاردیاستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906573 h 61جدول4-24- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و PAGEREF _Toc398906574 h 62L-NAME PAGEREF _Toc398906575 h 62جدول4-25- تغییرات فشارمیانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906576 h 63جدول4-26- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906577 h 64جدول4-27- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906578 h 65

فهرست شکل ها
عنوان صفحه
TOC h z t "شکلا;1" شکل 1-1- بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.) PAGEREF _Toc398906078 h 3شکل(1-2) ساختار برخی از فلاوونوئید های موجود در گونه های مختلف جنسAchillea PAGEREF _Toc398906079 h 4شکل 1- 3-سنتز نیتریک اکساید در اندوتلیوم عروق PAGEREF _Toc398906080 h 6شکل 3-1قیف پرکولاتور PAGEREF _Toc398906081 h 20شکل 3-2-روتاری PAGEREF _Toc398906083 h 20شکل 3-3- Freez-dryer PAGEREF _Toc398906084 h 21 شکل 3-4- دستگاه Power lab PAGEREF _Toc398906085 h 24شکل 3-5-تراکئوستومی PAGEREF _Toc398906086 h 25شکل 3-7-اتصال کانول سرخرگی به ترانسدیوسر فشار و نحوه قرار گیری کانول سیاهرگی PAGEREF _Toc398906087 h 26شکل 3-6-کانول گذاری سرخرگ و سیاهرگ رانی PAGEREF _Toc398906088 h 25شکل 4-1-گراف ثبت شده از ABP , Ps , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه PAGEREF _Toc398906089 h 29شکل 4-2-گراف ثبت شده از ABP , PS , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق عصاره PAGEREF _Toc398906090 h 29شکل 4-3-گراف ثبت شده از ABP ,PS, Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق حلال عصاره(اتانول 70 درصد) PAGEREF _Toc398906091 h 30عنوان صفحه
شکل 4-4- مقایسه میزان افت فشارمیانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره بومادران شیرازی نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906101 h 31شکل 4-5- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906102 h 34شکل 4-6- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906103 h 34شکل 4-7-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق حلال نسبت به سطح پایه PAGEREF _Toc398906104 h 35شکل 4-8-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق عصاره نسبت به سطح پایه PAGEREF _Toc398906105 h 35شکل 4-9-مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906106 h 36شکل 4-10-مقایسه میزان تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906107 h 37شکل 4-11- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906108 h 38شکل 4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906109 h 39شکل4-13- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906110 h 40عنوان صفحه
شکل 4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906111 h 41شکل 4-15- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906112 h 42شکل 4-16- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906113 h 43شکل 4-17- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906114 h 454-18- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906115 h 46شکل 4-19- مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی اپی نفرین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906116 h 47شکل 4-20-مقایسه تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی اپی نفرین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906117 h 47شکل 4-21- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906118 h 48شکل 4-22- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906119 h 49شکل 4-23- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906120 h 50شکل 4-24- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906121 h 51شکل 4-25- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906122 h 52شکل 4-26- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906123 h 53عنوان صفحه
شکل 4-27- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906124 h 54شکل 4-28- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین(erio+Epi) PAGEREF _Toc398906125 h 55شکل 4-29- مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی L-NAME(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906126 h 56شکل 4-30- مقایسه تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی L-NAME(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906127 h 57شکل 4-31- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906128 h 58شکل 4-32- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906129 h 59شکل 4-33- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906130 h 60شکل 4-34- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906131 h 61شکل 4-35- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906132 h 62شکل 4-36- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906133 h 63شکل 4-37- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906134 h 64شکل 4-38- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906135 h 65

فصل اولمقدمه

1-1بومادرانگیاه بومادران متعلق به جنس Achillea L. و تیره Asteraceae می باشد. جنس Achillea در ایران 19 گونه گیاه علفی چندساله و غالبا معطّر دارد. گونه های بومی آن عبارتند از:
A. Aucheri Boiss. A. eriophora DC.A.callichroa Boiss. Boiss. A. talagonica
A. kellalensis Boiss. Rech.f.A. pachycephala
Oxyodonata Bioss.
دیگر گونه های این جنس علاوه بر ایران در عراق، آناتولی، سوریه، قفقاز، لبنان، فلسطین، روسیه مرکزی، ماورای قفقاز، ترکمنستان، افغانستان، آسیای جنوب غربی و آسیای مرکزی نیز می رویند)1(.
بومادران ساقه ای به ارتفاع 20 تا 90 سانتیمتر و حتّی بیشتر دارد. در دشت ها و دامنه های بعضی از نواحی کوهستانی اروپا و آسیا، منجمله ایران به حالت خودرو می روید. برگ های آن عاری از دمبرگ، پوشیده از کرک و منقسم به بریدگی های بسیار باریک است. کاپیتول های کوچک و متعدد آن، وضع مجتمع به صورت گل آذین دیهیم دارد(2).
از کلیه قسمت های این گیاه، بوی قوی استشمام می شود به طوریکه به مجرد دست زدن به اعضاء گیاه، این بو احساس می گردد. قسمت های مورد استفاده این گیاه، سرشاخه های گلدار و برگ آن است که طعم تلخ و بوی قوی دارند(3).
1-2-بومادران شیرازیAchillea eriophora DC. (شکل1 -1)یکی از گیاهان بومی جنس Achillea در ایران می باشد و در زبان فارسی به آن بومادران جنوبی، سرزردو، بومادران شیرازی گفته می شود. پراکندگی این گیاه در استان های جنوبی و در ارتفاع 700 تا 3000 متر می باشد.( Peter et al ,1997)

شکل 1-1- بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.)1-3ترکیبات موجود در گیاهان جنس Achillea با تحقیقات فیتوشیمیایی بر روی گونه های مختلف جنس Achillea مشخص شده که ترکیبات موجود در گیاهان این جنس، از نظر زیستی ترکیبات بسیار فعالی هستند. از ترکیبات مهم موجود در در این گیاهان فلاوونوئیدها(شکل 1-2)، ترپنوییدها، لیگنان ها، مشتقات آمینواسیدی، اسیدهای چرب،آلکامیدها می باشند(Saeidnia et al, 2011).

شکل(1-2) ساختار برخی از فلاوونوئید های موجود در گونه های مختلف جنسAchilleaSaeidnia et al (2011)
1-4خواص درمانی بومادرانبومادران، گیاهی است دارویی و ارزنده که مصرف آن از قرن اول میلادی بین مردم معمول بوده است به طوری که در آن زمان برای برای بند آوردن خون و علاج زخم هایی که با خونروی همراه بوده استفاده می شده و به آن اعتقاد زیاد داشته اند. ضمناً از این گیاه در مراسم سحر و جادو استفاده می کرده اند. در قرون وسطی، بومادران را برای بند آوردن خونروی های بینی، اختلالات قاعدگی، بی خوابی، اختلالات بینایی، وجود خون در ادرار، اخلاط خونی، صرع و غیره به کار می برده اند. استفاده از آن برای مصارف درمانی از این زمان به بعد رو به افزایش یافت به طوری که تدریجاً علاوه بر موارد مذکور، از آن در رفع بیماری هایی نظیر بیماری های کبدی و کلیوی، بواسیر و غیره استفاده می شده است و با آن که در قرن حاضر، تدریجاً استفاده از آن کاهش یافت، با این حال، بررسی های جدید، ضمن تأیید برخی از اثرات درمانی بومادران، جای آن را در ردیف گیاهان دارویی مفید، محفوظ نگهداشت. دم کرده سرشاخه های گلدار بومادران، در رفع گاستریت های حاد و مزمن، رفع نفخ اثر نافع دارد. ضمناً سوء هاضمه های ناشی از نفخ را از بین می برد.
بومادران ، در رفع ترشحات زنانگی، بند آورندن خون، بواسیرهای خونی و اسهال های ساده اثر معالج دارد و چون در این گونه موارد به طور قاطع عمل می کند، اعتقاد مردم به آن در طی قرون متمادی همواره زیاد بوده است. بررسی ها نشان داد که با مصرف بومادران، از ترشحات مخاط رکتوم نیز که موجب پرخونی و تورم ناحیه دردناک بواسیر می شود، جلوگیری می شود. اثر قاعده آور بومادران باعث آن شد که در طی قرون متمادی، مردم از آن پیوسته استفاده کنند و چون با تکرار مصرف آن، اثر سویی در بیمار به وجود نمی آید، از آن برای تنظیم قاعدگی در مواقعی که به صورت ناکافی به وقوع می پیوندد و هم چنین برای جلوگیری از درد و ناراحتی در مواقع اشکال وقوع قاعدگی استفاده می شود. بومادران به علت اثر مدر خود در ازدیاد حجم ادرار و دفع سنگ کلیه نیز موثر است، به علاوه باد شکن و تب بر می باشد(2و3).
1-5- نقش سیستم نیتررژیک در دستگاه قلب و عروق:در سال 1980 ، Furchgott و Zawadski در تحقیقات خود بر روی عروق متوجه شدند که استیل کولین در آئورتی که دارای اندوتلیوم سالم می باشد اثر شل کنندگی دارد. این محققین به این نتیجه رسیدند که استیل کولین سبب تحریک آزاد شدن ماده ای از اندوتلیوم می گردد که باعث اتساع عروقی می شود و آن ها این ماده را ، فاکتور متسع کننده ی مشتق شده از اندوتلیوم (EDRF) نامیدند. چند سال بعد محققینی دیگر متوجه شدند که این ماده که باعث اتساع عروقی می شود همان گاز NO (نیتریک اکساید) است که این مولکول ، یکی از مهمترین مولکول ها در فیزیولوژی پستانداران است. در سلول های پستانداران، NO از آمینواسید L-arginine تولید می شود که از اکسید شدن این آمینواسید، L-Citruline و گاز NO تولید می شود(شکل 1-3). این واکنش به وسیله آنزیم های خانواده NOS کاتالیز می شود که تا به حال سه ایزوفرم از آن شناسایی شده است. نیتریک اکساید به عنوان یک مولکول سیگنالینگ در سیستم های قلب و عروق ودستگاه عصبی عمل می کند و در سیستم ایمنی و بهبود زخم هم نقش دارد. در سیستم قلب و عروق، NO عمدتا از سلول های اندوتلیال عروق و به میزان کمتری توسط پلاکت ها تولید می شود و مهمترین عملکرد آن خاصیت Vasodilation آن است. این مولکول همچنین از تجمع پلاکت ها و تکثیر بیش از حد سلول های اندوتلیال عروق جلوگیری می کند. از ایزوفرم های مختلف آنزیم NOS ، ایزوفرم eNOS در سلول های اندوتلیالی وجود دارد که با افزایش غلظت کمپلکس کلسیم-کالمودولین و فعال سازی آنزیم eNOS باعث تولید نیتریک اکساید می شود. نیتریک اکساید بسیاری از اثرات خود را بر روی مولکول هدف از طریق گوانیلیل سیکلاز(sGC) اعمال می کند که این آنزیم باعث تبدیل GTP به cGMP می شود که مهمترین پیام بر ثانویه داخل سلولی برای NO است که cGMP باعث فعال ساز ی پروتئین کیناز G) (PK می شود که این پروتئین کیناز باعث کاهش غلظت کلسیم داخل سلولی می شود که این باعث کاهش فسفریلاسیون وابسته به کلسیم زنجیره سبک میوزین می شود و در نهایت موجب ریلکس شدن عروق و افزایش جریان خون در این عروق می شود
(Queen and Ferro, 2006)و(Chunying LI et al, 2005) و(Robert W et al, 2001) .

شکل 1- 3-سنتز نیتریک اکساید در اندوتلیوم عروقDavid C. Gaze(2012)

1-6- عوامل تعیین کننده فشار شریانیفشار شریانی را می توان به صورت فشار متوسط شریانی تعریف کرد که میانگین فشار در طول زمان است و یا می توان به صورت فشار سیستولی(فشار حداکثر) و فشار دیاستولی(فشار حداقل) در سیکل قلبی تعریف کرد. اختلاف بین فشار سیستولی و دیاستولی را فشار نبض((Pulse pressure گویند. عوامل تعیین کننده ی فشار خون شریانی به دو دسته عوامل فیزیکی و فیزیولوژیکی تقسیم می شوند. دو عامل فیزیکی عبارتند از: حجم مایع(یعنی حجم خون) در سیستم شریانی و ویژگی های ارتجاعی سیستم(کمپلیانس). عوامل فیزیولوژیکی شامل برون ده قلب( که برابر است با ضربان قلب ضربدر حجم ضربه ای) و مقامت محیطی می شود(برن ولوی،2011) و(Khan and Gilani, 2011)
1-7- مشخصات عملکرد دستگاه عصبی اتونوم(سیستم سمپاتیک و پاراسمپاتیک)فیبرهای عصبی سمپاتیک وپاراسمپاتیک یکی از دوماده ی میانجی سیناپسی استیل کولین یا نوراپی نفرین را ترشح می کنند. فیبرهای ترشح کننده استیل کولین را کولینرژیک می نامند و فیبرهای ترشح کننده نوراپی نفرین را آدرنرژیک می گویند که مشتق از آدرنالین یعنی معادل اپی نفرین است(گایتون هال،2011).
نورون هایی که کولینرژیک هستند عبارتند از:1-کلیه نورون های پیش عقده ای، 2-نورون های پس عقده ای پاراسمپاتیک، 3-نورون پس عقده ای سمپاتیک که به غدد عرق عصب می دهند و 4- نورون های سمپاتیک که روی عروق خونی عضلات مخطط ختم شده و هنگام تحریک موجب اتساع عروقی می شوند. باقیمانده نورون های پس عقده ای سمپاتیک نورآدرنرژیک هستند. قسمت مرکزی غده فوق کلیوی در اصل یک عقده سمپاتیک است که در آن سلول های پس عقده ای آکسون های خود را از دست داده و مستقیما نوراپی نفرین، اپی نفرین و مقداری دوپامین را به داخل جریان خون ترشح می کنند. نتیجتا نورون های پیش عقده ای کولینرژیکی که به این سلول ها می روند به صورت اعصاب حرکتی ترشحی این غده درآمده اند.
معمولا هیچ گونه استیل کولینی در گردش خون وجود ندارد و اثرات تخلیه کولینرژیک موضعی به علت غلظت زیاد استیل کولین استراز در انتهاهای عصبی کولینرژیک عموماً محدود، مجزا و کوتاه مدت است. نوراپی نفرین تا مسافت های دورتری انتشار می یابدو عمل طولانی تری از استیل کولین دارد(گانونگ 2010).
1-8- نقش سیستم عصبی اتونوم در تنظیم عملکرد گردش خون:مهمترین قسمت سیستم عصبی خودکار در تنظیم عملکرد گردش خون، سیستم عصبی سمپاتیک است. سیستم عصبی پاراسمپاتیک نیز به خصوص در تنظیم عملکرد قلب نقش دارد.
1-9- سیستم عصبی سمپاتیک:رشته های عصبی وازوموتور سمپاتیک از طریق کلیه ی اعصاب نخاعی توراسیک و اولین یا دومین اعصاب نخاعی کمری از نخاع خارج می شوند. سپس این رشته ها وارد زنجیره سمپاتیک می شوند که در دو طرف ستون مهره ها واقع شده اند. پس از این، رشته های سمپاتیک از دو طریق روی گردش خون اثر می گذارند: 1) از طریق اعصاب سمپاتیک که عمدتا عروق احشای داخلی و قلب را تغذیه می کنند 2) با ورود به بخش محیطی اعصاب نخاعی که به عروق محیطی می روند(گایتون هال، 2011) و (Lin et al, 2003)
1-10- عصب دهی سمپاتیکی عروق خونی:در اکثر بافت ها تمام عروق به جز مویرگ ها، توسط این رشته ها عصب دهی می شوند. اسفنگترهای پیش مویرگی و متارتریول ها در برخی از بافت ها از جمله عروق خونی مزانتر عصب دهی می شوند. با این وجود، عصب دهی سمپاتیکی آن ها بسیار کمتر از شریان ها، شریانچه ها و وریدها می باشد. عصب دهی شریان های کوچک و شریانچه ها این امکان را فراهم می آورد که با تحریک سیستم سمپاتیک مقاومت عروقی در مقابل جریان خون افزایش یافته و در نتیجه سرعت جریان خون بافتی کاهش یابد. عصب دهی عروق بزرگ، به خصوص وریدها، باعث می شود که در موارد تحریک سمپاتیکی، حجم این عروق کاهش یابد. این رخداد موجب می شود که خون به سمت قلب فرستاده شود و بنابراین نقش مهمی در تنظیم عملکرد پمپی قلب داردگایتون هال، 2011) و (Paul and Levy, 1980).
1-11- رشته های سمپاتیک قلب:علاوه بر رشته های سمپاتیکی که عروق خونی را تغذیه می کنند، رشته های عصبی سمپاتیک به طور مستقیم نیز به قلب می روند. تحریک سمپاتیک به طور مشخص فعالیت قلب را افزایش می دهد و این اثر هم از طریق افزایش سرعت ضربان قلب و هم با افزایش قدرت قلب و حجم خون پمپ شده اعمال می شود (L.R.Queen, and A. Ferro, ).
TOC h z t "عنوان;1"

فصل دوم
مروری بر مطالعات پیشین
2-1- مطالعات انجام شده در رابطه با اثرات بومادراندر تحقیقی مکانیسم کاهش فشار خون توسط عصاره های هیدرواتانولی و دی کلرومتانی و اتیل استاتی و بوتانولی و دی کلرومتان-2 و همچنین فلاوونوئید Ar--etin استخراجی از گیاه Achillea millefolium بررسی شده است. در این تحقیق مصرف خوراکی عصاره های هیدرواتانولی و دی کلرومتانی و دی کلرومتان-2 به طور قابل ملاحظه ای فشار میانگین سرخرگی را در موش های با فشار نرمال کاهش داد. آنالیز فیتوشیمیایی این عصاره ها، وجود مقدار زیادی Ar--etin را در این عصاره ها نشان داد که بعد از جداسازی این فلاوونوئید ، هم به صورت خوراکی و هم تزریق داخل وریدی بر روی موش اثر داده شد و در یک روش وابسته به دوز فشار میانگین سرخرگی را کاهش داد. نتایج این آزمایش نشان داد که اثر کاهش فشار خون توسط Achillea millefolium ممکن است بخشی از آن به خاطر وجود میزان بالای فلاوونوئید Ar--etin و توانایی آن در کاهش تولید آنژیوتنسین ΙΙدر شرایط in vivo از طریق ممانعت از عملکرد آنزیم ACE باشد(Desoza et al,2011).
در تحقیقی اثر کاهش فشار خون گیاه Achillea millefolium و هم چنین عملکردهای ممانعتی آن بر روی قلب و عروق و اثر گشادکنندگی آن بر روی نای مشخص شده است. نتایج این پژوهش استفاده دارویی از این گیاه برای درمان بیماری های قلب و عروق و دستگاه تنفسی مثل فشار خون بالا و آسم را نشان داد (Khan et al, 2o11).
محققی به نام Dallacqueو همکاران (2011)، اثرات عصاره ی A. millefolium بر فعالیت Vasoprotective را در شرایط in vitro بررسی کردند. در این تحقیق عصاره این گیاه باعث افزایش رشد سلول های اولیه ی ماهیچه ی صاف عروق در رت گردید. همچنین در این تحقیق اثر عصاره این گیاه بر روی مسیر NF-KB در سلول های اندوتلیال ورید نافی انسان بررسی شد. نتایج نشان داد که عصاره با اثر ممانعتی بر روی NF-KB می تواند از التهاب عروقی جلوگیری کند. یافته های این محققین، استفاده سنتی از این گیاه بر روی بیماری های قلب و عروق را تاییدکرد.
نیازمند وهمکاران (2011)، در تحقیقی اثر عصاره آبی-اتانولی A. wilhelmsiiرا بر روی فشارخون در خرگوش بررسی کردند. نتایج این تحقیق نشان داد که عصاره این گونه به طور قابل ملاحظه ای باعث کاهش فشارخون شد. به گفته این محققین اثرکاهش دهندگی فشارخون عصاره این گیاه ممکن است بخاطر cardiac depressant و یا اثرات گشادکنندگی عروق باشد.
عسگری و همکاران در سال ( 2000 ) اثرات گیاه Achillea wilhelmsii را بر روی فشار خون و ضد چربی خون بررسی کردند. در این مطالعه به صورت تصادفی 120 نفر زن و مرد در سنین بین 60-40 سال انتخاب شدند و به آن ها روزی دو بار و هر مرتبه 20-15 قطره از عصاره ی هیدروالکلی گیاه Achillea wilhelmsii داده شد و این درمان به مدت بیش از شش ماه ادامه داشت. فشار خون و لیپیدهای سرمی (کلسترول ،تری گلیسرید ، LDL، HDL) در طی دو ماه در سه مرحله اندازه گیری شد. نتایج، کاهش قابل ملاحظه ای در میزان تری گلیسریدها، بعد از دو ماه نشان داد، در حالی که کاهش قابل ملاحظه در میزان تری گلیسرید ها، کلسترول(Totalcholesterol) و LDL cholesterol بعد از چهار ماه دیده شد. میزان HDL-cholesterol به طور قابل ملاحظه ای بعد از شش ماه درمان افزایش یافت. کاهش قابل ملاحظه ای در فشار دیاستولی و فشار سیستولی به ترتیب بعد از دو و شش ماه دیده شد.
بومادران (Achillea millefolium) به طور مؤثر می تواند لایه موکوسی معده را محافظت کند و از ترشح اسید معده جلوگیری کند. در تحقیقی عصاره آبی برگ های این گونه از جنس Achillea باعث محافظت از لایه موکوسی معده در مقابل عمل نکروزی مستقیم اتانول شده که این اتانول می تواند باعث آسیب به لایه موکوسی معده از طریق تخریب لایه ژلاتینی متشکله از موکوس و بی کربنات سطح داخلی معده شود که این لایه ژلاتینی از زخم شدن معده جلوگیری می کند. تحریک رسپتورهای موسکارینی M3 سلول های جداری، افزایش سطوح پپتیدهای تنظیمی معده ای، تحریک هیستامین و کاهش میزان جریان خون لایه موکوسی معده، باعث افزایش میزان ترشح معده و کاهش فاکتورهای حفاظتی معده می شود. عصاره این گونه از بومادران، باعث کاهش حجم و اسیدیته شیره معده شد که احتمالاً عصاره با بلاک کردن رسپتورهای موجود در سلول های جداری(M3، رسپتور هیستامینی H2 و رسپتور گاسترینی cckb) باعث این نقش حفاظتی مهم شده است(Baggio et al,2002)
بومادران (Achillea wilhelmsii) باعث تحریک سیستم ایمنی می شود. در مطالعه ای که بر روی موش انجام شد، عصاره آبی این گونه از جنس Achillea باعث تحریک ایمنی سلولی و ایمنی هومورال شدکه این فعالیت می تواند به خاطر حضور فلاوونوئید ها یا ساپونین ها باشد که این ها از طریق تحریک ماکروفاژها و لنفوسیت های B باعث افزایش تولید آنتی بادی و در نتیجه تقویت سیستم ایمنی می شوند(Sharififar et al, 2009).
در طب سنتی از گونه های جنس Achillea برای فرآیند بهبود زخم استفاده می شود. در تحقیقی برای تایید این موضوع از عصاره های یکی از گونه های بومی این جنس در ترکیه به نام Achillea biebersteinii بر روی دو مدل زخم سطحی و عمقی در رت استفاده شد و عصاره های مختلف این گیاه، باعث تسریع فرآیند بهبود زخم شدند و عصاره –n هگزانی این گیاه دارای اثراتی مشابه داروی Madecassol بود که این دارو برای بهبود زخم استفاده می شود. موقعی که یک زخم ایجاد می شود و در معرض محیط خارجی قرار می گیرد احتمال آن وجود دارد که به وسیله میکروب ها مورد تهاجم قرار گیرد که باعث تاخیر در فرآیند بهبود زخم می شوند. علاوه بر این حضور میکروب ها در محل زخم باعث تجمع ماکروفاژها و نوتروفیل ها در آن ناحیه می شوند که این ها باعث تولید ROS می شوند که اگر میزان ROS تولیدی زیاد باشد می تواند باعث القاء آسیب بافتی شدید شود که این هم مانعی برای فرآیند بهبود زخم است. عصاره این گیاه دارای پتانسیل آنتی اکسیدانی و فعالیت ضد میکروبی می باشد که از این طریق می تواند به عنوان یک دارویی مفید برای تسریع در فرآیند بهبود زخم باشد(Akkol et al, 2009).
بومادران دارای فعالیت ضد میکروبی نیز می باشد. در پژّوهشی در شرایط In vitro عصاره اتانولی و روغن فرار Achillea eriophora مانع رشد میکروارگانیسم های بیماریزا شد.در این تحقیق مشخص شد کهStaphylococcus aureus نسبت به روغن فرار Achillea eriophora بسیار حساس است. روغن فرار این گیاه در غلظت های مختلف از رشد میکروب های دیگری مثل Aspergillus niger، Bacillus subtilis، Candida albicans، Pseudomonas aeruginosa، Escherchia coli جلوگیری کرد. بنابراین از این گیاه می توان بر ضد میکروب های فرصت طلبی که باعث بیماریهای دستگاه تنفسی مثل سرماخوردگی می شوند استفاده کرد. همچنین از روغن فرار Achillea eriophoraمی توان به عنوان ضدمیکروب طبیعی و نگهدارنده و محافظت کننده غذایی با خطر کم استفاده کرد (Ghasemi et al, 2008).
گونه های جنس Achillea از التهاب ایجاد شده در اثر عفونت و آسیب نیز جلوگیری می کنند. در تحقیقی از لیپوپلی ساکارید) (LPSجدا شده از دیواره سلولی باکتری های گرم منفی برای فعال کردن ماکروفاژهای RAW264.7 موش در محیط کشت استفاده شد و با فعالیت ماکروفاژها تعداد زیادی واسطه های التهابی مثل NO، COX-2، TNF-α و IL-6تولید شد که روغن فرار گونه Achilleamillefolium L. با کاهش این عوامل التهابی، از پیشرفت پاسخ التهابی در این ماکروفاژها جلوگیری کرد(Chou et al, 2013).
گیاهان جنس Achillea باعث کاهش التهاب عصبی می شوند که این التهاب عصبی، نقش مهمی در پیشرفت بیماری هایی مثل پارکینسون و آلزایمر دارد و در این فرآیند تحریک زیاد سلول های میکروگلیال نقش دارد و با تولید واسطه های التهابی اولیه مثل سایتوکاین ها، MMP(matrixmetallo proteinases) و ROS و NO باعث مرگ سلول های عصبی می شوند. در تحقیقی عصاره Achillea fragrantissima از تولید بیش از حد واسطه های التهابی توسط سلول های میکروگلیال موش در محیط کشت جلوگیری کرد. بنابراین می تواند برای کنترل بیماری های تخریب نورونی در نظر گرفته شود . (Elmann et al, 2011)
بومادران (Achillea millefolium) اثر حفاظتی روی کبد دارد. در تحقیقی از (D-GalN) D-galactosamine و لیپوپلی ساکارید(LPS) برای القاء آسیب کبدی در موش استفاده شد و این آسیب با اندازه گیری میزان آلانین آمینوترانسفراز(ALT) و آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) پلاسما تایید شد. عصاره آبی-متانولی این گونه از بومادران به طور قابل ملاحظه ای میزان ALT و AST را در موش هایی که با این گیاه تحت درمان قرار گرفته بودند کاهش داد واین اثر محافظتی بومادران روی کبد با مشاهدات بافت شناسی نیز تایید شد. (Sheikh Yaeesh et al, 2006)
2-2- هدفاز آن جایی که یکی از گونه های جنس Achillea به نام A. eriophora بومی استان فارس و استان های هم جوار می باشد و با توجه به گزارشاتی که در خصوص اثرات متعدد و متنوع این گیاه موجود است، در تحقیق حاضر بررسی اثر آن بر بعضی از پارامترهای قلب و عروق مد نظر است.
2-3- فرضیاتعصاره آبی الکلی این گونه از بومادران موجب تغییراتی در فشار خون و پاسخ دهی آن به سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و سیستم نیتریک اکساید می شود.
فصل سوممواد و روش ها
3-1- مواد مورد استفادهعصاره آبی الکلی برگ و گل بومادران شیرازی
موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار
غذای موش(خریداری شده از شرکت جوانه خراسان)
ماده بیهوشی (Urethane) ساخت شرکت SIGMA
دی اتیل اتر
اتانول 70 درصد
آب مقطر
کاغذ صافی
سرنگ انسولینی، 5 و 10 سی سی با نیدل G23
سرم فیزیولوژیک
نرمال سالین
هپارین
استیل کولین(Acetylcholine hydrochloride) (تهیه شده از از شرکت Merk آلمان)
اپی نفرین( ساخت شرکت دارو پخش ایران)
داروی ممانعت کننده آنزیم نیتریک اکساید سنتتاز(L-NAME) (ساخت شرکت SIGMA-ALDRCH آلمان)
3-2- وسایل مورد استفادهوسایل تشریح( قیچی جراحی چشم، قیچی معمولی، تشتک تشریح، پنس، کلمپ، Moser)
میکروسکوپ
کانول پلی اتیلن PE 50
سمپلر
وسایل شیشه ای شامل بشر، پیپت، استوانه مدرج،لوله آزمایش
لوله آزمایش
قفس نگهداری حیوان
میز جراحی
یخچال فریزر 20-
ترازو
فشار سنج جیوه ای
ترمومتر مقعدی
کامپیوتر و نرم افزلر chart
دستگاه Power lab مجهز به Pressure transducer، Bridge amplifier
3-3- روش کار
3-3-1- روش عصاره گیریدر ابتدا گیاه بومادران شیرازی از ارتفاعات اطراف باغ ارم شیراز از ارتفاع حدود 1500 متر در ماه خرداد جمع آوری گردید و فوراً علف های هرز و قسمت های غیرقابل استفاده گیاه جدا شد و با انتقال به دانشکده علوم توسط استاد گیاه شناسی دانشکده علوم دانشگاه شیراز، مورد شناسایی علمی قرار گرفت. سپس گیاه جمع آوری شده سالم در محیط سایه و بدون رطوبت خشک گردید. پس از خشک شدن به دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی شیراز منتقل شد و زیر نظر متخصص فارماکوگنوزی به روش پرکولاتور عصاره گیری انجام شد.
ابتدا گل ها و برگ ها از قسمت ساقه جدا شدند و توسط دستگاه آسیاب به پودر تبدیل شدند و وزن پودر یادداشت شد. در سوراخ انتهای قیف پرکولاتور(شکل 3-1) مقداری پنبه طوری قرار داده شد که سوراخ آن کاملا مسدود شود. بعد روی آن پودر گیاه ریخته شد و روی پودر هم یک تکه کاغذ صافی قرار داده شد و روی کاغذ صافی هم وزنه ای قرار داده شد. سپس به میزان کافی اتانول 70 در صد ( 73 میلی لیتر اتانول 96درصد و 27 میلی لیتر آب مقطر) به پودر اضافه شد تا فضای بین پودر بومادران را پرکند و به طور کامل حلال روی پودر قرار گیرد. به محض نفوذ حلال به داخل پودر، دوباره مقداری از اتانول 70 درصد استفاده می شد. دور قیف پرکولاتور و هم چنین روی آن با فویل آلومینیومی پوشانده شد و در زیر قیف هم ظرفی تیره قرار می گرفت که رنگ تیره این ظرف مانع از تاثیر مضر نور بر روی عصاره می شد. روی ظرف هم قیفی قرار داده شد که عصاره خارج شده از قیف به داخل ظرف هدایت شود. حدود 67 ساعت طول کشید تا بومادران به روش پرکولاتور عصاره گیری شود. در طول این مدت با پایین آمدن سطح حلال، به میزان کافی اتانول 70 اضافه می شد و میزان آن هم یادداشت می شد. بعد از آن عصاره رقیق توسط دستگاه روتاری(شکل3-2) تا حد ممکن تغلیظ گردید. به خاطر عدم تبخیر کامل حلال، با نظر استاد فارماکوگنوزی فرآیند تغلیظ عصاره توسط روتاری متوقف شد و ادامه کار توسط دستگاه Freez dryer(شکل 3-3) انجام شد. عصاره در یک بالن کوچک مخصوص ریخته شد و در دستگاه قرار داده شد و دور بالن هم توسط فویل آلومینیومی پوشانده شد. حدود 48 ساعت طول کشید تا عصاره توسط دستگاه Freez dryer در دمای 49- درجه سانتیگراد به حالت پودری تبدیل شود. میزان پودر گل و برگ بومادران 146.66 گرم بود و در نهایت 24 گرم عصاره به دست آمد و راندمان این فرآیند عصاره گیری %16.36بود.
130238581915
شکل 3-1 قیف پرکولاتور
شکل 3-2-روتاری
شکل 3-3- Freez-dryer3-3-2-چگونگی تهیه و نگهداری موش های صحرایی
تعداد 55 سر موش صحرایی نر بالغ از نژاد ویستار با محدوده وزنی 250-220 گرم از موسسه رازی شیراز خریداری و به اتاق حیوانات بخش زیست شناسی دانشکده علوم منتقل گردید. رت ها به مدت یک هفته در شرایط کنترل شده نور (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و درجه حرارت حدود 22 درجه سانتی گراد نگهداری می شدند. در طول مدت نگهداری، غذا و آب به اندازه کافی در اختیار آن ها قرار می گرفت تا به این وسیله از سلامت کامل آن ها مطمئن شویم.
3-3-3-گروه بندی موشهاابتدا بر روی 15 موش اثرات دوز های مختلف محلول عصاره بررسی شد و دوز موثر انتخاب شد. سپس برای بررسی اثرات عصاره و حلال هم حجم آن از 10 سر موش استفاده شد که به صورت تصادفی در دو گروه کنترل(بررسی اثرات حلال)و گروه آزمایش(بررسی اثرات عصاره) قرار می گرفتند.
برای بررسی تداخل اثر عصاره و حلال با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتررژیک 30 رت به صورت تصادفی به شش گروه پنج تایی تقسیم شدند:
1- گروهی که به آن ها حلال هم حجم عصاره(اتانول 70%) و داروی استیل کولین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال استیل کولین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان استیل کولین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر استیل کولین به همراه اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
2- گروهی که به آن ها عصاره (mg/kg60) و داروی استیل کولین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال استیل کولین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان استیل کولین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر استیل کولین به همراه عصاره بومادران تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
3- گروهی که به آن ها حلال هم حجم عصاره(اتانول 70%) و داروی اپی نفرین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال اپی نفرین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان اپی نفرین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر اپی نفرین به همراه اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
4- گروهی که به آن ها عصاره (mg/kg60) و داروی اپی نفرین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال اپی نفرین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان اپی نفرین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر اپی نفرین به همراه عصاره بومادران تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
5- گروهی که اتانول 70درصد و L-NAME دریافت می کردند که در این گروه، حالت پایه فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال L-NAME تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان محلول L-NAME تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد. با توجه به اینکه حدود 20 دقیقه لازم بود که اثرات این دارو کاملا ظاهر شود و پارامترهای قلبی عروقی در یک سطح حدودا ثابتی قرار گیرند، در بررسی نتایج اعداد مربوط به 20 دقیقه اول در نظر گرفته نشد. در مرحله آخر اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
6- گروهی که عصاره و L-NAME دریافت می کردند که در این گرو، حالت پایه فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال L-NAME تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان محلول L-NAME تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد. بعد از آن عصاره تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرقته شد. در این گروه نیز اعداد مربوط به 20 دقیقه اول در مرحله تزریق L-NAME در نظر گرفته نشد.
3-3-4- اجزای سیستم ثبت فشار خون
در این تحقیق، فشار خون و پارامترهای مربوط به آن توسط Pressure transducer ثبت می گردید. این ترانسدیوسر به یک Bridge amplifier که عملکرد آن تقویت سیگنال و فیلتر نمودن نویزهاست متصل می شد. بریج امپلی فایر به Recorder متصل می شد و نتایج ثبت شده بر روی مانیتور مشخص می شد(شکل 3-4).
Bridge amplifier
Recorder

شکل 3-4- دستگاه Power lab
3-4- مراحل انجام آزمایشدوازده ساعت قبل از بیهوش کردن موش ها، غذای آن ها قطع می شد ولی به آب دسترسی داشتند. بعد از دوازده ساعت، ابتدا به وسیله تزریق داخل صفاقی Urethane( دوزg/kg2/1(، حیوان بی هوش شده و سپس برای جلوگیری از آسپیره شدن و خفگی در زمان بی هوشی، تراکئوستومی(شکل 3-5) انجام شده و نای حیوان کانوله می گردید. برای دسترسی به عروق فمورال، برش کوچکی در سطح داخلی ران ایجاد کرده و با پنس مجرای این برش باز و گشاد می شد. سپس با استفاده از قیچی چشم پزشکی سرخرگ و سیاهرگ رانی را شکاف داده و کانول گذاری می شد(شکل 3-6). از کانول سیاهرگی برای انجام تزریقات در حین آزمایش استفاده می شد و کانول سرخرگی به دستگاه پاورلب وصل شده که از این طریق فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستول، فشار دیاستول و ضربان قلب ثبت می گردید(شکل 3-7). در کل زمان آزمایش، سرم فیزیولوژیک به مقدار 1/ . سی سی در هر ده دقیقه از طزیق کانول سیاهرگی به حیوان تزریق می شد و دمای بدن حیوان در محدوده 37 درجه سانتیگراد کنترل می گردید.

شکل 3-5-تراکئوستومی
113792016510

شکل 3-6-کانول گذاری سرخرگ و سیاهرگ رانی

شکل 3-7-اتصال کانول سرخرگی به ترانسدیوسر فشار و نحوه قرار گیری کانول سیاهرگی3-4-1- چگونگی تجویز داروپس از این که سرخرگ و ورید رانی موش کانول گذاری شد، مدت یک ساعت به موش برای به تعادل رسیدن پس از جراحی استراحت داده می شد و بعد از آن به مدت سی دقیقه پارامترهای قلبی عروقی ثبت گردید. بعد از ثبت نرمال در گروه های مختلف، با استفاده از داروهای مقلد کولینرژیک، آدرنرژیک و مهارگر آنزیم نیتریک اکساید سنتاز، چگونگی اثر گذاری آن ها و تداخل اثرشان با عصاره بومادران مورد مطالعه قرار گرفت. تمامی تزریقات به صورت داخل وریدی و از طریق کانول سیاهرگی انجام شد. برای تعیین دوز موثر عصاره، پس از تهیه محلول mg/ml 200 (200 میلی گرم عصاره در یک میلی لیتر اتانول 70)، دوزهای 40،50، 60، 80 و100میلی گرم بر کیلوگرم مورد بررسی قرار گرفتند که بهترین و بیشترین پاسخ با دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم مشاهده گردید. بعد از تعیین دوز mg/kg 60 به عنوان دوز موثر، تداخل اثر این دوز از عصاره بومادران شیرازی و حلال هم حجم آن (اتانول 70 درصد) با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتریک اکساید مورد بررسی قرار گرفت. برای تهیه محلول تمامی داروها از آب مقطر استفاده شد.
3-5- واکاوی آماری
گراف های ثبت شده با استفاده از نرم افزار Lab chart متعلق به سیستم Power lab به اعداد تبدیل شدند و این اعداد به وسیله نرم افزار SPSS و با استفاده از Paired- samples T-test برای تحلیل آماری درون گروهی و برای تحلیل آماری بین گروهی از آزمون آماری Independent T-test با در نظر گرفتن P<0.05 به عنوان سطح معنی دار، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

فصل چهارم
نتایج
4-1-گراف های ثبت شده با دستگاه
شکل 4-1-گراف ثبت شده از ABP , Ps , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه
شکل 4-2-گراف ثبت شده از ABP , PS , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق عصاره

شکل 4-3-گراف ثبت شده از ABP ,PS, Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق حلال عصاره(اتانول 70 درصد)نتایجی که در قالب جدول و یا شکل در این فصل آمده است بر حسب میانگین±خطای میانگینSEM)± (Mean بیان شده است.
4-2- فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به دوز های مختلف عصاره شیرین بیان
با بررسی دوزهای مختلف عصاره بومادران، بهترین و طولانی ترین افت فشار میانگین سرخرگی در دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم اتفاق افتاد.
n=3

شکل 4-4- نمودار تغییرات فشارمیانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره بومادران شیرازی نسبت به حالت پایه4-3- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره4-3-1 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) بر روی فشار خونبا توجه به جدول 4-1 و شکل 4-5 فشار خون( میانگین سرخرگی، سیستولی و دیاستولی) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه تغییرات قابل ملاحظه ای نشان نداده است.
با توجه به جدول 4-2 و شکل 4-6 فشارخون ( میانگین سرخرگی، سیستولی و دیاستولی) در حالت تزریق عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) نسبت به حالت پایه تغییرات معنی داری داشته است.
جدول 4-1- تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درمرحله تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه Mean pressure
(mm Hg) n=5 Diastolic pressure
(mm Hg) n=5 Systolic pressure
(mm Hg) n=5 Stage
Time(min)
Solvent Base Solvent Base Solvent Base 92.7±4.7
93.2±4.3
93.2±4.5
85.7±7.2
95.4±8.1 91.8±4.8
89.2±5.7
96.3±4.5
91.6±6.6
96.1±3.8 74.9±4.4
75.6±3.9
75.4±4.2
68.7±6.5
78.7±8 74±4.7
71.7±5.4
78.3±4.3
74.2±6.4
78.3±3.6
128.4±5.5
128.5±5.4
128.7±5.2
119.9±8.7
128.9±8.6
127.6±5.2
124.4±6.3
132.3±4.9
126.6±7.1
131.7±4.3 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25
جدول 4-2- مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درمرحله تزریق عصاره بومادران نسبت به حالت پایه Mean pressure
(mm Hg) n=5 Diastolic pressure
(mm Hg) n=5 Systolic pressure
mm Hg)n=5) Stage
Time(min)
erio Base erio Base erio Base 91.8±3.4 b
96.1±1.9
93.1±3.2
89.8±.6 b
87.4±1.7 b 99.7±1.7
103±.6
102.1±1
100.1±1
100.1±3.5 76.7±5
81±3.3
77.8±4.1
74.9±1.6 b
72.4±.4 b 86.3±1.5
89.4±.6
87.8±.6
86.2±.7
86.2±2.7 122.2±.2
126.3±.8 b
123.8±1.2
119.6±1.2 b
117.3±4.2 b 126.6±2.1
130.3±.6
130.7±1.7
127.9±1.6
127.9±5 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25
b : اختلاف معنی دار حالت تزریق عصاره(erio) نسبت به حالت پایه(Base)
4-3-2 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) بر روی ضربان قلببا توجه به جدول 4-3 و شکل 4-7 و شکل 4-8، ضربان قلب درحالت تزریق حلال نسبت به حالت پایه در گروه کنترل و در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه در گروه آزمایش تغییرات قابل ملاحظه ای نداشته است.
جدول 4-3-مقایسه تغییرات ضربان قلب درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه و تزریق عصاره نسبت به حالت پایهHeart rate (Beats/min)
n=5 Heart rate (Beats/min)
n=5 Stage
Time(min)
erio Base Solvent Base 410.8±8.8
404.6±7.9
414.4±3.3
414±5.7
400.2±2.6 406.1±12.1
407.1±10.9
403.3±12.5
406.8±9.1
397.7±12 372±22.2
369±22.9
369.6±17.8
352.2±26.2
351.1±27.1 372.5±22.7
366.4±22.4
376.1±23.7
367.6±27.1
372.9±23.5 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25

شکل 4-5- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه
شکل 4-6- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه
b : اختلاف معنی دار حالت تزریق عصاره(erio) نسبت به حالت پایه(Base) p<.05

شکل 4-7-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق حلال نسبت به سطح پایه
شکل 4-8-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق عصاره نسبت به سطح پایه4-4- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره و داروی استیل کولین(دوز 01/0 میلی گرم بر کیلوگرم)4-4-1- با توجه به شکل 4-9 و 4-10، فشار میانگین و ضربان قلب در حالت کنترل دارو و حالت پایه در هر دو گروه، در مقایسه با یکدیگر تغییرات قابل ملاحظه ای نداشته است.
در حالت پایه، حیوان سرم فیزیولوژیک دریافت می کرد.
در حالت کنترل دارو به حیوان، آب مقطر به عنوان حلال داروی استیل کولین تزریق می شد.

شکل 4-9-مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش
شکل 4-10-مقایسه میزان تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش4-4-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول های 4-4 و شکل 4-11، فشار سیستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. در حالت تزریق حلال عصاره تواًم با استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین، اختلاف معنی داری دیده نشد.
جدول4-4 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولینStage
Time Systolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 119.7+8.4
117.3+8.1
118.4+8.9 118.7+8.4
124.2+8.4
127.5+11.6
b110.3+9.6
b90.5+4.3
99.3+7.1
93.1+14.4
97.8+15.9 108.4+5.5
94.7+4
89+3.9
94.1+7.1
99.6+9.5
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05

شکل 4-11- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
4-4-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین
با توجه به جدول های 4-5 و شکل 4-12، فشار سیستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار سیستولی در حالت تزریق تواًم عصازه و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین نیز کاهش نشان داد که در بعضی از این دقایق، این کاهش معنی دار بود.
جدول 4-5- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین Stage
Time Systolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) erio +Ach
(n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 119.8+6
117.3+7
123.6+3.6 123+5.3
125.1+5.3
126.8+6.7 b114.1+5
b94.2+10.4
107+5.8
104+7.4
112.8+5.9 c
94.2+9
c81.9+3.9
83.9+4.1
86.5+6.9
94.4+12.3
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05

شکل 4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
4 -4-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول 4-6 و شکل 4-13، فشار دیاستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار دیاستولی در حالت تزریق تواًم حلال عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین تغییرات قابل ملاحظه ای نشان نداد.
جدول4-6- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین Stage
Time Diastolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 70.4+7.1
68.3+5.6
69.5+5.5 70.5+8.8
73.4+7.5
75.4+8.1 64.9+5.7
b52.9+3.1
59.9+4.1
55.3+10.8
57.5+10.7 61.7+3.5
55.6+3.9
52.7+3.7
54.3+4.7
58.9+5.5
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05

شکل4-13- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05
4-4-5- فشار دیاستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین
با توجه به جدول 4-7 و شکل 4-14، فشار دیاستولی در حالت تزریق استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار دیاستولی در حالت تزریق تواًم عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین کاهش بیشتری داشته است که در بعضی از دقایق این کاهش معنی دار است.
جدول4-7- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین Stage
Time Diastolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) erio +Ach
(n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 72.4+2.9
71.6+5.4
74+5.6 75.1+3.6
76.3+4.5
76.4+2.9 b63.8+4
b54.4+7.5
66.5+5
64.4+5.6
70.4+3.3 57.4+4.2
c45.7+4.7
50.2+1.7
51.8+3.4
55.9+5.1
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
b
شکل 4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
4-4-6- فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول 4-8 و شکل 4-15، فشار میانگین سرخرگی در حالت تزریق استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار میانگین سرخرگی در حالت تزریق تواًم حلال عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین تغییرات معنی داری نداشته است.


جدول4-8-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولینStage
Time Mean arterial Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3

user8336

این روش برای کمک به تعیین نواحی نیازمند بیوپسی مفید است(1). تولوئیدین بلو به DNA یا RNA غیرطبیعی باند شده و نواحی با ریسک بالای پیشرفت به سمت سرطان را مشخص می کند(2). اتصال مثبت تولوئیدین بلو (به ویژه در نواحی لکوپلاکیا، اریتروپلاکیا و جذب محیطی آن در یک زخم) ممکن است نیاز به انجام بیوپسی را ثابت کند. اتصال مثبت کاذب رنگ می تواند ناشی از ضایعات زخمی یا وجود التهاب باشد، اما پاسخ منفی کاذب، شایع نمی باشد(1). حساسیت این روش برای ضایعات بدخیم 100% و برای ضایعات دیسپلاستیک 5/79 % و اختصاصیت آن در حد 62% عنوان شده است(2). البته همواره باید تأکید نمود که این روش هرگز جایگزین بیوپسی نبوده و تست قطعی تشخیص تغییرات بدخیمی، همچنان، بیوپسی است(1).


Brush Biopsy . C :
آنالیز کامپیوتری نمونه های Brush Biopsy بر روی سلول های متفلس رنگ آمیزی شده با روش پاپا نیکولائو، نتایج نسبتأ موفقی را نشان داده است(1). در این روش از یک برس استفاده می شود که توانایی نفوذ در ضخامت مخاط را داشته و می تواند نمونه ای را که معرف همه سلول های ضایعه باشد. تهیه کند. با استفاده از این تکنیک سلول های لایه بازال و مجاور بازال جمعآوری شده و با کمک کامپیوتر آنالیز می شوند. حساسیت این روش نسبتأ بالا و در برخی مقالات تا حد 100% هم گزارش شده است(2).
در روش جدیدی به نام Modified Brush Biopsy که نخستین بار در سال 2010 توسط متخصصین گروه بیماری های دهان دانشکده دندانپزشکی مشهد معرفی شد، از ترکیب Brush Biopsy و سیتولوژی بر پایه مایع (LBC) برای تعیین ارزش تشخیصی این روش در شناسایی ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم استفاده شد. در این مطالعه، از 26 بیمار مبتلا به ضایعات دهانی بدخیم یا پیش بدخیم، Brush Biopsy تهیه و در فرمول ساده LBC قرار گرفت و با استفاده از سانتریفیوژ، نمونه ای که معرف همه سلولهای ضایعه باشد، در دسترس قرار گرفت. سپس همه بیماران تحت بیوپسی روتین و بررسی هیستوپاتولوژی هم قرار گرفتند. این روش حساسیت 9/88% و اختصاصیت 100% نشان داد. بنابراین پیشنهاد شد می تواند به عنوان ابزار مؤثری برای غربالگری ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم مورد استفاده قرار گیرد(15).
گر چه در حال حاضر استاندارد طلایی تشخیص ضایعات دهانی بدخیم و پیش بدخیم تهیه بیوپسی بافتی و بررسی هیستوپاتولوژی است، اما به هر حال این روش نگرانی هایی از جهت خطاهای نمونه برداری و خطاهای تفسیر هیستوپاتولوژی و فقدان حساسیت کافی برای تعیین پیشرفت ضایعه را به همراه دارد. بنابراین نیاز به سیستم های دقیق تر برای پیش بینی پیشرفت ضایعات در مراحل اولیه، کاملأ منطقی به نظر می رسد (2).
بررسی مارکرهای سرمی در سرطان دهان
در حال حاضر تعدادی از مارکرهای سلولی و مولکولی برای کمک به شناسایی تغییرات اولیه در جهت کمک به شناسایی ضایعات دارای پتانسیل بدخیمی در مخاط دهان در حال بررسی هستند (2).
با پیشرفت دانش بشر از درک ژنتیک، تغییرات ژنتیکی ممکن است به عنوان چنین مارکری در نظر گرفته شود. به علاوه شواهدی وجود دارد که نشان می دهد مقادیر سیتوکین های بزاقی می تواند اطلاعات مفیدی از رفتار اپی تلیوم دهان و کارسینوژنر فراهم کرده و توانایی این مارکرها می تواند در آینده ای نزدیک، آنها را تبدیل به ابزاری برای غربالگری سرطان دهان نماید(2). ماتریکس متالوپروتئیناز و مهار کننده بافتی آن نقش مهمی در شروع و پیشرفت سرطان دهان ایفا می کنند(1). آغاز یا پیشرفت سرطان دهان می تواند با پلی مرفیسم ژن فاکتور رشد عروقی اندوتلیال (VEGF) مرتبط باشد(1). افزایش CDK2 و CDK4 در مدل های حیوانی، مرتبط با افزایش خطر ابتلا به SCC دهان و پوست عنوان شده است(9). آنتی بادی بر علیه پروتئین P53 ( یک پروتئین سرکوبگر تومور) در سرم بیماران مبتلا به SCC دهانی شناسایی شده است(16). بنابراین مطالعه بیشتر روی بافت های دهانی همچنین سلولها یا مایعات بدن از جمله سرم و بزاق به منظور کمک به درک بهتر پاتوژنز سرطان دهان و یافتن ابزاری مفید برای غربالگری سرطان دهان در مراحل اولیه، ادامه خواهد یافت (2).
جستجو برای یافتن روش هایی که امکان شناسایی سرطان دهان را در مراحل اولیه امکان پذیر نماید، محققان را به سوی تحقیقات جدی در این زمینه سوق داده است(16). در سالهای اخیر، توجه به بیومارکرهای موجود در سرم برای تشخیص زود هنگام سرطانهای مختلف از جمله سرطان دهان(به ویژه SCC) مورد علاقه بیشتر پژوهشگران قرار گرفته است(17). تغییرات ژنتیکی که در سلولهای سرطانی رخ می دهد، منجر به تغییر پاسخ سلول به محیط اطراف خود می شود که به صورت تغییر در بیان پروتئین های مسیرهای سیگنال دهنده سلولی تظاهر می کند و با مطالعات بررسی پروتئین ها در سرم، قابل ردیابی خواهد بود(17).
گلوتاتیون
یکی از بیومارکرهای قابل اندازه گیری در سرم مبتلایان به SCC گلوتاتیون است که پپتیدی داخل سلولی با اعمال متفاوتی از جمله سم زدایی، دفاع آنتی اکسیدانی و تعدیل نمودن پرولیفراسیون سلولی می باشد(18). فرمول شیمیایی این مولکول عبارتست از: C10H17N3O6S و تری پپتیدی با اتصال پپتیدی گاما بین گروه آمین سیستئین و گروه کربوکسیل گلوتامات است. دریافت گلوتاتیون به عنوان یک ریزمغذی در رژیم غذایی ضروری نیست، زیرا بدن می تواند از آمینواسیدهای سیستئین، گلوتامیک اسید و گلایسین، آن را تولید کند(19). گلوتاتیون در یک فرآیند دو مرحله ای وابسته به آدنوزین تری فسفات (ATP) ساخته می شود: - نخست گاماگلوماتیل سیستئین از گلوتامات و سیستئین با واسطه آنزیم گاماگلوتامیل سیستئین سنتتاز تولید می شود.
سپس، گلایسین به انتهای C - ترمینال گاماگلوتامیل سیستئین از طریق آنزیم گلوتاتیون سنتتاز، اضافه می شود(19).
برخی از ویژگی های مهم گلوتاتیون عبارتند از:
یک آنتی اکسیدان اندوژن(درون زاد) مهم است که توسط سلولها تولید می شود و در خنثی کردن مستقیم رادیکالهای آزاد و ترکیبات واکنشی اکسیژن شرکت می کند. همانگونه که آنتی اکسیدان های اگزوژن( برون زاد) مثل ویتامین C و E در فرم احیاء(که همان فرم فعال آنهاست)، عمل می کنند(20).
چرخه نیتریک اکساید را تنظیم می کند که برای حیات نقش بحرانی( Critical) دارد و در صورت عدم تنظیم، مشکل جدی ایجاد می کند(21).
در واکنش های متابولیک و بیوشیمیایی مثل سنتز و ترمیم DNA ، سنتز پروتئین، سنتز پروستاگلاندین، انتقال آمینو اسید و فعالیت آنزیمی، نیاز به گلوتاتیون وجود دارد. بنابراین هر سیستمی در بدن می تواند تحت تأثیر گلوتاتیون قرار گیرد، به ویژه سیستم ایمنی، سیستم عصبی، سیستم گوارشی و ریه ها (22).
گلوتاتیون نقشی حیاتی در متابولیسم آهن دارد. به طوریکه نشان داده شده سلول های yeast ( مخمر) عاری از آهن یا حاوی مقادیر اندک گلوتاتیون احیا (GSH)، دچار نقص آنزیمهای خارج میتوکندریایی و به دنبال آن مرگ می شود(21).
گلوتاتیون دارای دو فرم احیا یا همان GSH و اکسید یا همان GSSG می باشد. پدیده اکسیداسیون – احیا از خصائص ذاتی سلول بوده و گلوتاتیون در این امر نقش اساسی دارد(23). گلوتاتیون که بیشتر به فرم احیا شده وجود دارد، در واکنش با رادیکالهای آزاد و سموم به فرم اکسید خود یعنی GSSG تبدیل شده با حضور آنزیم گلوتاتیون رودکتاز فاکتور NADPH مجددأ به فرم احیاء خود بازمی گردد. کسر GSH /GSSG از فاکتورهای مهم در رابطه با تغییرات دائم رادیکال های آزاد اکسیژن می باشد. میزان این کسر در سلول های مختلف، متفاوت بوده، نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با فعالیت آن می باشد(23). در حالت عادی نسبت GSH /GSSG برابر 1/3 می باشد. استرس شدید اکسیداتیو سبب انباشتگی GSSG شده و مقدار کسر کاهش می یابد که کاهش مقاومت بدن برای مقابله با رادیکالهای آزاد را در پی دارد(23). منظور از استرس اکسیداتیو زمانی است که تعادل بین تولید مواد اکسیدان و آنتی اکسیدان در بدن به نفع اکسیدان ها دچار اختلال شود(24).

استرس اکسیداتیو
استرس اکسیداتیو منعکس کننده عدم تعادل بین تظاهرات سیستمیک گونه های اکسیژن واکنشی و توانایی سیستم یبولوژیک برای خنثی کردن واسطه های واکنشی یا ترمیم آسیب حاصله است. اختلال در حالت نرمال Redox (Reduction / Oxidation)، می تواند از طریق تولید پراکسیدها و رادیکالهای آزاد – که به اجزای سلولی از قبیل پروتئین ها، لیپیدها و DNA صدمه می زنند- اثرات سمی به دنبال داشته باشد(24). بنابراین استرس اکسیداتیو می تواند باعث قطع مکانیسم های نرمال انتقال پیام سلولی (cellular signaling) شود(24).
منظور از واکنش Redox (Reduction / Oxidation) تمام واکنش های شیمیایی است که شامل تغییر وضعیت اتم های بین حالت اکسیداسیون و احیاء می باشد. تعریف اکسیداسیون و احیاء به این شرح است:
اکسید (Oxidation): فقدان الکترون یا افزایش اکسیداسیون توسط یک مولکول، اتم یا یون.
احیا ( Reduction): به دست آوردن الکترون یا افزایش اکسیداسیون توسط یک مولکول، اتم یا یون(25).
به نظر می رسد استرس اکسیداتیو در انسان در پیشرفت بسیاری از بیماری ها یا تشدید علائم آنها نقش داشته باشد. این بیماریها شامل: سرطان(24)، پارکینسون و آلزایمر(26)، آترواسکلروز و نارسایی قلبی(27)، انفارکتوس میوکارد(28)،اسکیزوفرنی(29)، اختلال شخصیت دوقطبی(30)، بیماری سلولی داسی(31)، لیکن پلان(32) و ویتیلیگو(33) می باشد.
احتمال دخیل بودن استرس اکسیداتیو در پیشرفت وابسته به سن در سرطان وجود دارد. گونه های واکنشی تولید شده در استرس اکسیداتیو می توانند باعث آسیب مستقیم DNA و بنابراین اثرات موتاژنیک (جهش زایی) شوند. این فرآیند ممکن است آپوپتوز( مرگ برنامه ریزی شده سلولی) را سرکوب کرده و تکثیر و تهاجم و متاستاز تومور را پیش ببرد(24).

درمان
درمان سرطان دهان نیازمند همکاری یک تیم پزشکی است. هدف اولیه درمان، ریشه کنی سرطان، پیشگیری از عود و تا حد امکان بازیابی شکل و عملکرد نواحی تحت تأثیر قرار گرفته می باشد(34).
انتخاب روش درمان، بستگی به عوامل متعددی دارد از جمله: نوع سلول تومورال و میزان تمایز آن، محل و اندازه ضایعه، وضعیت درگیری استخوان و گره های لنفاوی، حضور یا عدم حضور متاستاز و شرایط کلی بیمار از قبیل: سن، وضعیت سلامت عمومی، وجود تاریخچه ای از SCC دهانی قبلی و عادات پر خطر(35).
روشهای درمانی متعددی برای درمان سرطان دهان وجود دارد که شامل: جراحی، رادیوتراپی، شیمی درمانی سیستمیک و مهار EGFR می باشند و می توانند هر یک به تنهایی یا به صورت ترکیبی به کار روند(36). جراحی درمان انتخابی ضایعات کوچک و قابل دسترسی است، اگر چه مراحل پیشرفته SCC معمولأ با ترکیب جراحی، رادیوتراپی و شیمی درمانی درمان می شوند(37).
در موارد عود SCC مهار کننده های EGFR در ترکیب با رادیوتراپی و شیمی درمانی، خط اول درمان خواهند بود(34).
درمان انتخابی درگیری گره های لنفاوی، جراحی است(1).
جراحی برداشت SCC دهان با حاشیه های ناکافی در حد کمتر از 5 میلی متر در 30 – 20 % موارد ممکن است عود و متاستاز دور دست را به همراه داشته باشد و در این شرایط معمولأ تجویز رادیوتراپی و شیمی درمانی بعد از جراحی، ضروری خواهد بود(38). توضیح احتمالی این است که برخی کراتینوسیتهای بدخیم ممکن است در حاشیه های زخم جراحی شده باقی مانده باشند اما به دلیل تعداد بسیار اندک، توسط آزمایشات هیستوپاتولوژی قابل شناسایی نباشند(3).
رادیوتراپی از طریق ایجاد رادیکال های آزاد و آسیب به DNA سلول، اثرات مخرب خود را اعمال می کند. سلول های تحت تابش ممکن است تخریب شوند یا قدرت تقسیم خود را از دست بدهند(1).
انواع SCC به اشعه حساس بوده و ضایعات اولیه به میزان زیادی با رادیوتراپی قابل درمان می باشند. به طور کلی هر چه تمایز تومور بیشتر باشد ( G--e هیستوپاتولوژی پایین تر )، سرعت پاسخ به رادیوتراپی کمتر خواهد بود. تومورهای اگزوفیتیک که اکسیژن رسانی کافی دارند، حساسیت بیشتری به اشعه دارند، در حالیکه تومورهای مهاجم بزرگ کمتر به اشعه پاسخ می دهند. SCC محدود به مخاط دهان با رادیوتراپی تا حد زیادی بهبود پذیرفته است، در حالیکه انتشار تومور به استخوان، احتمال موفقیت رادیوتراپی به تنهایی را کاهش می دهد و در این شرایط نیاز به ترکیب جراحی و رادیوتراپی وجود دارد(1).
شیمی درمانی به سه شکل در درمان سرطان به کار می رود:
به صورت القایی قبل از درمانهای موضعی با هدف تسریع در کاهش اولیه حجم تومور و درمان زود هنگام میکرومتاستازها.
به صورت استفاده همزمان با رادیوتراپی، این روش در حال حاضر برای مراحل پیشرفته بیماری ( مراحل 3 و 4 )
مورد استفاده قرار می گیرد.
شیمی درمانی کمکی ( adjuvant ) پس از درمان موضعی.(1).

پیش آگهی
مهمترین عامل در بقاء بیماران مبتلا به سرطان دهان، مرحله بیماری در هنگام تشخیص می باشد. متأسفانه بیشتر سرطان های دهان در مراحل پیشرفته، پس از علامت دار شدن تشخیص داده می شوند(1). در ایالات متحده میزان بقای 5 ساله در آمریکایی های آفریقایی تبار فقط یک، سوم بقای 5 ساله سفید پوستان که حدود 53% می باشد، گزارش شده است(1). این میزان بقا تحت تأثیر محیط فیزیکی و اجتماعی، کمبود اطلاعات بهداشتی، روش زندگی پر خطر و دسترسی محدود به مراقبت های بهداشتی می باشد(1).
کمیته مشارکتی سرطان آمریکا سیستم تومور، گره لنفاوی و متاستاز(TNM) را برای طبقه بندی سرطان ارائه داده است. T اندازه تومور اولیه، N درگیری گره های لنفاوی و M متاستاز دوردست را بیان می کند. انتشار موضعی یا ناحیه ای SCC دهانی شایع است و بر انتخاب درمان و پیش آگهی تاثیر می گذارد. متاستاز به گره های لنفاوی گردنی نیز شایع بوده ولی متاستاز دوردست به ناحیه زیر ترقوه نادر است. سرطان دهان در بخش خلفی حفره دهان، ناحیه حلق دهانی و کف دهان با پیش آگهی ضعیف تری همراه است، این امر با تشخیص بیماری در مرحله پیشرفته و میزان بیشتر انتشار آن به گره های لنفاوی در زمان تشخیص قابل توجیه می- باشد(1). عوامل موثر عمده ای که اثر منفی بر پیش آگهی سرطان دهان اعمال می کنند عبارتند از: درگیری دو یا تعداد بیشتری لنف نود ناحیه ای، گسترش درگیری لنف نود به خارج از کپسول و اعلام درگیر بودن مارژین های برداشته شده در جراحی تومور(2). معیارهای بافت شناسی مهم مرتبط با پروگنوز ضعیف شامل: افزایش ضخامت تومور و وجود تهاجم عروقی می باشد(2).
از آنجا که ضایعات اولیه اغلب بدون علامت بوده و بیماران در مراحل انتهایی شناسایی می شوند، تشخیص این سرطان در مراحل اولیه، تأثیر قابل توجهی در بهبود پیش آگهی آن دارد(2). جستجو برای یافتن روش هایی که امکان شناسایی سرطان دهان را در مراحل اولیه امکان پذیر نماید، محققان را به سوی تحقیقات جدی در این زمینه سوق داده است(16). در همین راستا، توجه به بیومارکرهای موجود در سرم برای تشخیص زود هنگام سرطان دهان در حال افزایش است.(17).

مروری بر متون
در این قسمت به مرور مطالعات مرتبط با موضوع تحقیق می پردازیم که به ترتیب اهمیت و سال انتشار آورده شده اند.
Sobhakamuri A. و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای با عنوان « استعداد سلول های سرطانی سر و گردن در انسان به مهار ترکیبی متابولیسم گلوتاتیون و تیوردوکسین » با بیان این مطلب که افزایش متابولیسم گلوتاتیون (GSH) و تیوردوکسین (Trx) در مقاومت سلول های سرطانی به شیمی درمانی نقش گسترده ای دارد، به بررسی تأثیر همزمان مهار GSH و Trx در مرگ سلول های سرطانی سر و گردن با مکانیسم استرس اکسیداتیو پرداختند. نتایج حاکی از این بود که مهار همزمان GSH و Trx با القای استرس اکسیداتیو، در مرگ سلول های SCC سر و گردن نقش دارد و این استراتژی ممکن است در حساس کردن SCC سر و گردن به مهار کننده های EGFR به عنوان گامی در درمان SCCمفید باشد(39).
Dzian A . و همکاران در سال 2012 در مطالعه ای با عنوان « آدنوکارسینوما و SCC ریه و ارتباط آن با پلی مرفیسم ژنتیکی گلوتاتیون S – ترانسفراز در جمعیت اسلوونی» با توجه به اینکه اسنیدانس سرطان ریه در جمعیت اسلوونی بالاست، پلی مرفیسم ژنهای گلوتاتیون S – ترانسفراز شامل: GSTT1 و GSTM1 و GST_ P1 را با تکنیک PCR بررسی کرده و نتیجه گرفتند فقدان ژنوتیپ GSTT1 مرتبط با افزایش ریسک آدنوکارسینومای ریه است. در حالیکه پلی مرفیسم این ژنها با SCC ریه، ارتباط معنی داری ندارد(40).
در مطالعه FU TY . و همکاران در سال 2011 با عنوان « منگناز سوپر اکسید دسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز به عنوان مارکرهای پیش آگهی SCC مخاط باکال » مشاهده شد که بروز بیشتر این مارکرها با بقای بهتر بیماران در ارتباط بوده و در نتیجه حضور این مارکرها بیانگر بقای بهتر SCC مخاط باکال می باشد(41).
Karaman E. و همکاران در سال 2010 در مطالعه ای با عنوان« فعالیت پارا اکسوناز سرم و آسیب اکسیداتیو DNA در بیماران مبتلا به SCC حنجره» با استفاده از روشهای اندازه گیری کالری متریک والایزا بر روی نمونه های سرمی بیماران و مقایسه آنها با گروه کنترل دریافتند تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در بیماران مبتلا به SCC حنجره به نفع اکسیداسیون لیپید و آسیب DNA مختل می شود(42).
Allameh A. و همکاران در سال 2009 در مطالعه ای با عنوان « آنالیز هیستوشیمی مارکرهای مولکولی خاص در ضایعات پیش سرطانی، آدنوکارسینوما و SCC مری در افراد ایرانی» با هدف بررسی تغییرات عوامل مؤثر در پیشرفت سرطان مری در جمعیت در معرض خطر در ایران انجام دادند. آنها نمونه های بیوپسی مری 87 بیمار مبتلا به متاپلازی بارت در مری، آدنوکارسینوما و SCC مری را با روش ایمنوهیستوشیمی از نظر بیان P53 و P21 و نیتروتیروزین و سیکلواکسیژناز 2 و گلوتاتیون S – ترانسفراز بررسی کردند. تغییرات پاتولوژیک در نمونه های آدنوکارسینوما و SCC مری به صورت افزایش نیتروتیروزین و سیکلواکسیژناز 2 بود که شاهدی بر درگیری این فاکتورهای اکتسابی در پیشرفت سرطان مری است. اما در مورد سایر فاکتورها، تغییر معنی داری
مشاهده نشد(43).
Looi ML. و همکاران در سال 2008 در مطالعه ای با عنوان « آسیب اکسیداتیو و وضعیت آنتی اکسیدان در بیماران مبتلا به نئوپلازی داخل اپی تلیالی سرویکال و کارسینوم سرویکس» انجام دادند. آنها برای بررسی وضعیت آسیب اکسیداتیو، مالون دی آلدهید (MDA) پلاسما و 8- هیدروکسی داکسی گوانوزین(HdG) ادرار و برای بررسی وضعیت آنتی اکسیدان مقادیر آنزیم های سوپر اکسید دسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز را در 80 بیمار مبتلا به نئوپلازی سرویکال و کاسینوم سرویکس بررسی و با گروه کنترل مقایسه کردند. نتایج نشان داد مقادیر HdG تغییر معنی داری در هیچکدام از بیماری های مورد مطالعه نسبت به گروه کنترل ندارد. MDA پلاسما و گلوتاتیون پراکسیداز در بیماران، نسبت به گروه کنترل افزایش داشتند، در حالیکه سوپر اکسید دسموتاز و کاتالاز در بیماران نسبت به گروه کنترل کاهش داشتند(44).
مطالعه Giannini P. و همکاران در سال 2008 با عنوان « فعالیت فانکشنال و توزیع ایمنوهیستو شیمیایی سلولی گلوتاتیون S – ترانسفراز در بافت دهانی سالم، دیسپلاستیک و SCC »، فعالیت بیشتر گلوتاتیون S – ترانسفراز در بافت SCC را در مقایسه با مخاط نرمال نشان داد و پیشنهاد شد uperegulation گلوتاتیون S – ترانسفراز حداقل در تعدادی از ضایعات دهانی پیش بدخیم و بدخیم رخ می دهد(45).
در مطالعه Richie JP. و همکاران در سال 2008 با عنوان « مقادیر گلوتاتیون، آهن و ریزمغذی ها و ریسک سرطان دهان» ارتباط ریسک سرطان دهان با مقادیر سرمی آهن، ویتامین های E و C و B2 و A و روی، تیامین و گلوتاتیون (GSH) تعیین شد. محققان با توجه به نتایج این مطالعه پیشنهاد کردند کمبود ضعیف آهن و مقادیر کم GSH که هر دو مرتبط با استرس اکسیداتیو افزایش یافته هستند، ریسک سرطان در حفره دهان را افزایش می دهند(46).
Sharifi R. و همکاران در سال 2008 در مطالعه ای با عنوان « ارتباط پلی مرفیسم ژنتیکی گلوتاتیون S – ترانسفراز P1 و تجمع پروتئین P53 در بیماران ایرانی مبتلا به SCC مری » هیچ ارتباطی بین پلی مرفیسم گلوتاتیون S – ترانسفراز P1 و تجمع پروتئین P53 در سلول های اپی تلیوم مری پیدا نکردند(47).
Prabhu K. و همکاران در سال 2007 با طراحی مطالعه ای با عنوان « مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز تام سرم در سرطان دهان » دریافتند که مقدار این مارکر در مبتلایان به stage چهار سرطان دهان افزایش قابل توجهی نسبت به stage دو و سه داشته و این امر نشان می دهد تغییر مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز تام سرم ممکن است با پیشرفت سرطان دهان ارتباط داشته باشد(48).
Walshe g . و همکاران در سال 2007 در مطالعه ای با عنوان « غیر فعال شدن گلوتاتیون پراکسیداز به عنوان عامل کمک کننده در ایجاد SCC القا شده توسط U.V » بیان کردند SCC مرتبط با اختلال در فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و مقادیر پراکسید است. بطوریکه مشاهده کردند چهار، پنجم SCC های پوستی مرتبط با کاهش فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و افزایش بار پراکسید است. گلوتاتیون پراکسیداز توسط یک مکانیسم پس از ترجمه غیرفعال می شود و افزایش مقادیر پراکسید داخل سلولی می تواند گلوتاتیون پراکسیداز را غیرفعال کند. نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند غیرفعال شدن گلوتاتیون پراکسیداز در پوست انسان ممکن است یک رویداد اولیه در ایجاد SCC القا شده توسط نور UV باشد(49).
Rasmi y. و همکاران در سال 2006 مطالعه ای با عنوان « مقایسه بیان گلوتاتیون S – ترانسفراز pi در سطح mRNA در مخاط مری با استفاده از RT_ PCR_ ELISA در افراد مبتلا به بیماری رفلاکس آدنوکارسینوما و SCC مری » طراحی کردند. آنها از 66 بیوپسی بافت مری که به عنوان بیماری رفلاکس غیر اروزیو (NERD)، بیماری رفلاکس معده ای – مری (GERD)، آدنوکارسینوما و SCC تشخیص داده شده بود، استفاده کردند. نتایج کاربرد تکنیک RT_ PCR_ ELISA نشان داد هیچ تفاوت معنی داری در بیان گلوتاتیون S – ترانسفراز pi (GST- pi) در نمونه های نرمال، NERD و GERD وجود ندارد. بیان بیش از حد GST- pi در بافت های بدخیم (آدنوکارسینوما و SCC ) قابل تشخیص بود. بنابراین محققان اعلام کردند بیان GST- pi در مری مبتلا به GERD و NERD تغییر نمی کند، در حالیکه در آدنوکارسینوما و SCC به شدت بیشتر از بافت نرمال و ملتهب است(50).
Fiaschi Al . و همکاران در سال 2005 در مطالعه ای با عنوان « گلوتاتیون ، آسکوربیک اسید و آنزیم های آنتی اکسیدانت در خون و بافت تومور بیماران SCC » تغییرات آنتی اکسیدانت ها را در این بیماران بررسی کردند. نتایج حاکی از افزایش قابل توجه مقادیر گلوتاتیون و آسکوربیک اسید و در مقابل کاهش قابل توجه فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت در بیماران SCC در مقایسه با افراد سالم بود(51).
مطالعه GUO GF . و همکاران در سال 2005 که « ارتباط بروز گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST- pi) و آنتی ژن هسته ای تکثیر سلول (PCNA) در پیش آگهی SCC پیشرفته سینوس ماگزیلا به روش ایمنوهیستوشیمی » را می سنجید، نشان داد افزایش بروز GST- pi یک فاکتور پیش آگهی مستقل در SCC پیشرفته سینوس ماگزیلاست. اما PCNA خیر، به طوریکه افزایش بروز GST- pi مشاهده شده در این بیماران کاملأ مرتبط با بهبود میزان بقای 5 ساله بود(52).
Geisler SA . و همکاران در سال 2005 در مطالعه ای با عنوان « پلی مرفیسم گلوتاتیون S – ترانسفراز و بقای سرطان سر و گردن » با هدف ارزیابی توانایی پروگنوستیک پلی مرفیسم سه ژن درگیر در مکانیسم کارسینوژنز تنباکو در 190 بیمار مبتلا به SCC سر و گردن، مشاهده کردند افرادی که ژنوتیپ فانکشنال GSTT1 داشتند، احتمال مرگ 3 برابر بیشتر ناشی از SCC نسبت به افراد مبتلا به SCC که فاقد این ژنوتیپ بودند، داشتند. آنها پیشنهاد کردند مارکرهای ژنومیک مکانیسم کارسینوژنز و ترمیم DNA می تواند به عنوان یک شاخص پروگنوستیک در عود بیماری و مرگ ناشی از آن باشد(53).
Rawal RM . و همکاران در سال 1999 در مطالعه ای با عنوان « ارزیابی گلوتاتیون S – ترانسفراز و گلوتاتیون رودکتاز در بیماران مبتلا به SCC با مخاط باکال » با اندازه گیری میزان فعالیت گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST) و گلوتاتیون رودکتاز (GR) به روش اسپکتروفتومتری به این نتیجه رسیدند مقادیر GST سرم در بیماران کاهش قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل دارد و در مقابل مقادیر سرمی GR در بیماران افزایش قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل نشان می دهد. کاهش مقادیر GST سرم ممکن است با افزایش استعداد به آسیب ناشی از کارسینوژن ها در ارتباط باشد(54).
Mulder TP. و همکاران در سال 1998 در مطالعه ای با عنوان « مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز از پلاسما در بیماران مبتلا به SCCسر و گردن » مقادیر گلوتاتیون S – ترانسفراز (GST) را در پلاسمای 230 بیمار با روش الایزا اندازه گیری کردند. نتایج افزایش GST پلاسما را فقط در 14% این بیماران نشان داد و پیشنهاد شد احتمالأ ارتباط معنی داری بین مقادیر GST پلاسما و مرحله بالینی تومور وجود ندارد(55).
بیان مسئله و ضرورت انجام تحقیق
SCC شایعترین بدخیمی حفره دهان است، به طوریکه 95 – 90 % همه بدخیمی های دهان را SCC تشکیل می دهد(56)، میزان وقوع آن به خصوص در افراد جوان رو به افزایش است و علی رغم تحقیقات فراوان، میزان مرگ و میر آن تغییر چندانی نکرده است(57). زیرا ضایعات اولیه اغلب بدون علامت بوده و بیماران در مراحل انتهایی شناسایی می شوند. لذا تشخیص این سرطان در مراحل اولیه، تأثیر قابل توجهی در بهبود پیش آگهی آن دارد(2). تا کنون تحقیقاتی بر روی بیومارکرهای مؤثر در پروگنوز SCC صورت گرفته است. سرم بیماران از جمله محیط های بیولوژیکی است که تغییرات میزان بیومارکرها را در خود منعکس می کند(58).یکی از بیومارکرهای قابل اندازه گیری در سرم مبتلایان به SCC ، گلوتاتیون است که پپتیدی داخل سلولی با اعمال متفاوتی از جمله: سم زدایی، دفاع آنتی اکسیدانی و تعدیل نمودن پرولیفراسیون سلولی می باشد(18). گلوتاتیون دارای دو فرم احیا یا همان GSHو اکسید یا همان GSSG می باشد. پدیده اکسیداسیون – احیا از خصائص ذاتی سلول بوده و گلوتاتیون در این امر نقش اساسی دارد(23). گلوتاتیون که خود یک ترکیب احیا شده است، در واکنش با رادیکال های آزاد و سموم به فرم اکسید خود (GSSG) تبدیل شده با حضور آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز و کوفاکتور NADPH مجددأ به فرم احیاء خود باز می گردد. کسر GSH /GSSG از فاکتورهای مهم در ارتباط با تغییرات دائم رادیکال های آزاد اکسیژن می باشد. میزان این کسر در سلول های مختلف، متفاوت بوده، نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با فعالیت آن می باشد(23). در حالت عادی نسبت GSH /GSSG در سرم برابر 1/3 می باشد(23). البته این میزان در داخل سلول می تواند تا 1/100 باشد(23). استرس شدید اکسیداتیو سبب انباشتگی GSSG شده و مقدار کسر کاهش می یابد که کاهش مقاومت بدن برای مقابله با رادیکال های آزاد را در پی دارد(23). منظور از استرس اکسیداتیو زمانی است که تعادل بین تولید مواد اکسیدان و آنتی اکسیدان در بدن به نفع اکسیدان ها دچار اختلال شود(24). اختلال در سنتز گلوتاتیون در آسیب شناسی بسیاری از بیماری ها از جمله سرطان نقش دارد. زیرا گلوتاتیون با اثر بر فاکتور نکروز دهنده تومور (TNF – α) در کاهش مرگ ومیر سلولی مؤثر می باشد، به طوریکه کاهش میزان گلوتاتیون در سلول های سرطانی دلیلی بر این ادعاست(59). در مطالعات مختلف نتایجی در مورد رابطه میزان گلوتاتیون سرم و گسترش SCC به دست آمده است. پیش از این افزایش مقادیر گلوتاتیون سرم در Stage سه و چهار نسبت به Stage یک و دو یافت شده است(48). همچنین در مطالعات ایمنوهیستوشیمی بر روی نمونه های بیوپسی SCC دهانی، میزان گلوتاتیون در بافت SCC اندازه گیری شده است(41). در مطالعه دیگری کاهش میزان گلوتاتیون سرم مرتبط با افزایش ریسک سرطان دهان عنوان شده است(46).
هیچ مطالعه ای که نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان را در سرم بیماران مبتلا به SCC سر و گردن با افراد سالم مقایسه کرده باشد، وجود ندارد. در این مطالعه قصد داریم سطح سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیا و نسبت GSH /GSSG و همچنین تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان را در سرم بیماران مبتلا به SCC سر و گردن اندازه گیری و با افراد سالم مقایسه نموده و ارتباط آن را با مرحله بالینی و درجه هیستوپاتولوژی تومور تعیین کنیم. مزیت این مطالعه بر مطالعات قبلی در بررسی نسبت GSH /GSSG می باشد که منعکس کننده برهم کنش سیستم اکسیدان و آنتی اکسیدان بوده و قدرت نظر دادن در مورد استرس اکسیداتیو را دارد نه اینکه صرفأ فعالیت یک آنزیم درگیر در این پروسه را نشان دهد. در صورت وجود ارتباط بین این موارد با مرحله بالینی و درجه هیستوپاتولوژی تومور و تفاوت معنی دار با افراد سالم، می توان پیشنهاد کرد در مطالعات بعدی از اندازه گیری نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در تشخیص زود هنگام SCC سر و گردن و کنترل بیماران در جلسات فالوآپ جهت بررسی عود بیماری استفاده شود.
اهداف و فرضیات
هدف کلی: تعیین میزان سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیا و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در مبتلایان به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن و مقایسه آن با افراد سالم
اهداف اختصاصی:
تعیین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم افراد سالم
مقایسه میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم
تعیین رابطه بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم و Stage کلینیکی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن
تعیین رابطه بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم وG--e هیستوپاتولوژی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن
اهداف کاربردی:
در صورت وجود ارتباط بین نسبت سرمی گلوتاتیون اکسیده و احیاء و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در مبتلایان به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن با Stage و G--e بیماری، می توان پیشنهاد کرد در مطالعات بعدی از اندازه گیری نسبت GSH /GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در تشخیص زود هنگام SCC سر و گردن و کنترل بیماران در جلسات فلوآپ جهت بررسی عود بیماری استفاده شود.
فرضیات تحقیق:
میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم تفاوت دارد.
تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در سرم مبتلایان به SCC سرو گردن با افراد سالم تفاوت دارد.
بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم و Stage کلینیکی تومور در مبتلایان به SCC سر و گردن، ارتباط وجود دارد.
بین میزان گلوتاتیون اکسیده و احیاء سرم وG--e هیستوپاتولوژی تومور در مبتلایان به SCC سرو گردن ارتباط وجود دارد.
نوع مطالعه
این مطالعه از نوع بررسی مقطعی (Cross Sectional) بود.
محل اجرای طرح
این تحقیق در دانشکده دندانپزشکی مشهد، دانشکده پزشکی مشهد و بیمارستان امید مشهد انجام شد.
جمعیت مورد مطالعه
بیماران مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هستیوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و گروه کنترل از افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392 انتخاب شدند.
روش نمونه گیری
نمونه ها به روش غیر احتمالی از نوع مبتنی بر هدف انتخاب شدند.
حجم نمونه
با توجه به اینکه مطالعه مشابه به این طرح تاکنون انجام نشده است، مطالعه حاضر به صورت پایلوت و با وارد کردن 20 نفر مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد و 20 نفر سالم داوطلب انجام شد.
روش اجرای طرح
برای انجام این طرح که بصورت پایلوت انجام شد، 20 نفر مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هیستوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و 20 نفر سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392که آگاهانه حاضر به شرکت در مطالعه بوده و فرم رضایت نامه را امضا کرده بودند( هر دو گروه بیمار و سالم)، انتخاب شدند. همکار متخصص گوش و حلق و بینی، از انجام رضایت مندانه نمونه گیری بیماران قبل از شروع درمان( جراحی یا رادیوتراپی یا شیمی درمانی) اطمینان حاصل نمودند. سپس 5 میلی لیتر خون از هر شخص گرفته شد. برای جمع آوری نمونه سرم، به خون جمع آوری شده در لوله ها، هیچ ماده ضدانعقادی مثل هپارین یا سیترات اضافه نکرده و اجازه داده می شد خون طی مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد بماند تا لخته تشکیل دهد. سپس خون با دور 2000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفوژ می شد و روی یخ قرار می گرفت و در این مرحله دپروتئینه می شد. با توجه به اینکه اندازه گیری در همان روز نمونه گیری انجام نمی شد( زیرا همه نمونه ها جمع آوری شده و سپس، کیت برای آزمایش مورد استفاده قرار می گرفت) باید سرم دپروتئینه شده در دمای منفی80 درجه سانتی گراد نگهداری می شد. در این صورت نمونه برای حداقل 6 ماه ثابت می ماند. برای اندازه گیری گلوتاتیون، نمونه های سرمی قبل از آزمایش نیازمند دپروتئینه شدن و به غلظت رسیدن هستند. در این آزمایش از سه ماده شیمیایی متافسفریک و تری اتانول آمین( برای دپروتئینه کردن سرم) و وینیل پیریدین( برای به غلظت رساندن گلوتاتیون) استفاده شد.
دپروتئینه شدن:
تقریبأ تمام نمونه های بیولوژیک مورد استفاده برای اندازه گیری GSH ، حاوی مقادیر زیادی پروتئین هستند. لازم است تا آنجا که امکان دارد مقادیر بیشتری پروتئین از نمونه برداشته شود تا از تداخلات ذرات ریز و گروه های سولفیدریل در آزمایش اجتناب شود.
نمونه هایی که کمتر از mg/ml 1 (یک میلی گرم در میلی لیتر) پروتئین داشته و عاری از ذرات ریز هستند، می توانند بی درنگ تحت آزمایش قرار گیرند. به منظور دپروتئینه کردن نمونه های سرم در این طرح به روش زیر عمل می شد:
5 گرم از متافسفریک اسید در 50 میلی لیتر آب حل می شود. این محلول در دمای 25 درجه سانتی گراد برای چهار ساعت با ثبات باقی می ماند.
حجم مساوی با حجم سرم از محلول بالا، به لوله حاوی سرم اضافه می شود.
ورتکس کردن لوله [ ورتکس: ناحیه ای در مایع که بیشترین چرخش و حرکت در آن قسمت وجود داشته و جزء مهمی از جریان گردبادی مایع می باشد.]
لوله حاوی نمونه در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه نگهداری می شود.
لوله در دستگاه سانتریفوژ با دور 3000 برای 5 دقیقه قرار می گیرد.
سوپرناتانت( ماده شناور ) حاصله با دقت جدا و به میکروتیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال می یابد.
در این مرحله سرم های دپروتئینه با محلول تری اتانول آمین مخلوط می شوند.
ماده حاصله در دمای منفی 80 درجه سانتی گراد فریز می شود.
نمونه ها درست قبل از انجام آزمایش توسط کیت مربوطه، طی فرآیند لیوفیلیزه شدن و با استفاده از وینیل پیریدین به غلظت می رسند.
لیوفیلیزه شدن (Lyophilization):
فرآیند خشک کردن یک نمونه ی در معرض نابودی به منظور ایجاد شرایط مناسب برای انتقال آن. در این فرآیند ماده، منجمد شده و سپس فشار احاطه کننده کاهش می یابد تا به آب منجمد موجود در ماده، اجازه تصعید مستقیم از حالت جامد به حالت گاز داده شود(60).
برای انجام آزمایشات این طرح، طبق پروتکل شرکت سازنده کیت آزمایش گلوتاتیون ( (Cayman Chemical Company به روش اسپکتروفتومتری عمل شد(61). در این آزمایش از گلوتاتیون ردوکتاز برای تعیین GSH (فرم احیاء گلوتاتیون) استفاده می شد. گروه سولفیدریل GSH با 5 و 5- دی تیو- بیس-2- نیتروبنزوئیک اسید (DTNB) واکنش داده و ماده زرد رنگ 5- تیو- 2- نیتروبنزوئیک اسید (TNB) را تولید می کند. دی سولفید مخلوط GSTNB (بین GSH و TNB) که به صورت همزمان تولید می شود، به وسیله گلوتاتیون روکتاز احیا شده تا چرخه مجدد GSH را برقرار نموده و TNB بیشتری تولید کند. میزان تولید TNB مستقیمأ به این واکنش چرخه مجدد بستگی دارد که در واقع باید گفت به غلظت GSH در نمونه بستگی دارد. اندازه گیری میزان جذب TNB در طول موج 405 تا 414 نانومتر، تخمین دقیق GSH در نمونه را فراهم می کند. GSH به آسانی به دایمر دی سولفید GSSG (فرم اکسید گلوتاتیون) اکسیده می شود. GSSG طی احیای هیدروپراکسیدها توسط گلوتاتیون پراکسیداز تولید می شود. GSSG توسط گلوتاتیون رودکتاز به GSH احیا می شود، یعنی همان فرمی که عمدتأ در سیستم های بیولوژیک وجود دارد. از آنجایی که گلوتاتیون رودکتاز در آزمایش Cayman Chemical Company مورد استفاده قرار می گیرد، هم GSH و هم GSSG اندازه گیری می شود.
چرخه ی GSH:

برای اندازه گیری تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان، باید مراحل زیر طبق پروتکل شرکت سازنده کیت آزمایش آنتی اکسیدان (Cayman Chemical Company) روی سرم های دپروتئینه و لیوفیلیزه شده انجام می شد:
1) درون هر چاهک ( محل نمونه ) 10 میکرولیتر از ماده مت میوگلوبین و 150 میکرولیتر ماده رنگزا (کروموژن) ریخته شود.
2) برای شروع واکنش میکرولیتر هیدروژن پراکساید به تمام چاهک ها اضافه شود.
3) پلیت با برچسب پوشیده شده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شود.
برچسب برداشته شده و میزان جذب نوری نمونه ها در طول موج 450 نانومتر در دستگاه plate reader خوانده شود.

تصویر 2-1: کیت گلوتاتیونGlutathione Assay Kit (Cayman Chemical Company)

تصویر 2-2: کیت آنتی اکسیدان (Antioxidant Assay Kit (Cayman Chemical Company

تصویر 2-3: پلیت آماده شده قبل از قرار گرفتن در دستگاه plate reader

تصویر 2-4: پلیت آماده شده در دستگاه plate reader

تصویر 2-5: نمونه ای از قرائت جذب نوری توسط دستگاه plate reader
اطلاعات پس از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS نسخه 16 شده و آنالیز توصیفی با استفاده از جداول و نمودارها و آنالیز تحلیلی با استفاده از تست مقایسه دو میانگین مناسب انجام گرفت.
معیارهای ورود
بیماران مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن مراجعه کننده به بیمارستان امید مشهد از آبان ماه 1391 تا اردیبهشت ماه 1392 که بیماری آنها از طریق هستیوپاتولوژی ثابت شده و هنوز هیچ درمانی دریافت نکرده بودند و گروه کنترل از افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون مشهد در اردیبهشت ماه 1392 که آگاهانه حاضر به شرکت در مطالعه بودند( هر دو گروه سالم و بیمار) انتخاب شدند.
معیارهای خروج
سوء مصرف روزانه الکل در زمان انجام مطالعه(62)
عملکرد کبدی یا کلیوی مختل( در صورت وجود علائم یا سابقه مشکوک بیماری کبدی یا کلیوی در تاریخچه، از مطالعه خارج می شوند) (62).
عدم رضایت از شرکت در مطالعه(62)
وجو هر گونه ضایعه دهانی در گروه کنترل در زمان انجام مطالعه(62)
شیوه گردآوری اطلاعات
اطلاعات به روش میدانی و آزمایشگاهی گردآوری شدند.
ابزار گردآوری اطلاعات
اطلاعات با استفاده از ابزارهای مشاهده و چک لیست گردآوری شدند.

جدول متغیرها
نام متغیر نقش نوع مقیاس تعریف کاربردی واحد اندازه گیری
گلوتاتیون احیا سرم
وابسته کمی پیوسته نسبتی تری پپتیدی با خواص آنتی اکسیدانی که در سرم قابل اندازه گیری است میکرومولار
گلوتاتیون اکسید سرم وابسته کمی پیوسته نسبتی فرمی از گلوتاتیون که در واکنش با اکسیدان ها تولید می شود و در سرم قابل اندازه گیری است میکرومولار
نسبت گلوتاتیون احیا به اکسید در سرم
وابسته کمی پیوسته نسبتی کسری که نشان دهنده موقعیت محیط سلول متناسب با محیط اطراف آن می باشد تعادل اکسیدان- آنتی اکسیدان در سرم وابسته کمی پیوسته نسبتی به وسیله کاتیون دار نمودن محلول تترا متیل بنزیدین توسط آنزیم پراکسیداز در سرم قابل اندازه گیری است ابتلا به SCC مستقل کیفی اسمی براساس تشخیص بافت شناسی Stage بیماری

وابسته کیفی گسسته رتبه ای I, II, III,IV G--e بیماری وابسته کیفی گسسته رتبه ای I, II, III سن زمینه ای کمی پیوسته نسبتی بر اساس سال شمسی
جنس زمینه ای کیفی اسمی زن/ مرد روش تجزیه و تحلیل داده ها و بررسی آماری
اطلاعات پس از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS نسخه 16 شد و آنالیز توصیفی با استفاده از جداول و نمودارها و آنالیز تحلیلی با استفاده از تست مقایسه دو میانگین مناسب ( بر اساس چگونگی توزیع داده ها که نرمال یا غیرنرمال باشند از تست T-test یا من ویتنی) و تست همبستگی اسپیرمن انجام گرفت که سطح معنی داری در تمام آزمون ها 05/0 بود.

ملاحظات اخلاقی
کلیه بیماران برای شرکت در این طرح به صورت آگاهانه فرم رضایت نامه ( ضمیمه1) را مطالعه و در صورت رضایت شخصی آن را امضا کردند.
کلیه اطلاعات پرونده بیماران محرمانه و گزارش آن به صورت کلی بود.
در این مطالعه هیچگونه مداخله درمانی انجام نگرفته و صرفأ یک مطالعه مقطعی بود. با توجه به اینکه افراد سالم داوطلب مراجعه کننده به سازمان انتقال خون450 میلی لیتر خون اهدا می کنند، با کسب اجازه از بیماران 5میلی لیتر از خون آنها برای انجام آزمایشات به کار رفت. در مورد بیماران نیز 5میلی لیتر خون در صورت رضایت گرفته شد.
از میان کدهای 26 گانه اخلاقی، کد شماره 2 مرتبط با موضوع این پژوهش است.
الف. اطلاعات دموگرافیک و بالینی افراد مورد مطالعه
در این مطالعه 40 نفر شرکت داشته اند که 20 نفر آنها مبتلا به کارسینوم سلول سنگفرشی سر و گردن و 20 نفر افراد سالم می باشند.
جنس: در کل افراد مورد مطالعه، 28 نفر مذکر و 12 نفر مونث بودند. در گروه سالم 19 نفر مذکر و 1 نفر مونث بودند. در گروه بیمار 9 نفر مذکر و 11 نفر مونث بودند (جدول3-1).
سن: میانگین سنی بیماران 5/60 سال و میانگین سنی افراد سالم 25/49 سال بود. حداقل و حداکثر سن 35 و 85 سال بود. میانگین سنی کل افراد مورد مطالعه44/11 ± 87/54 سال بود (نمودار3-1) .
محل ضایعه: در بیماران مورد مطالعه محل تومور در 2 نفر کف دهان، 6 نفر زبان، 6 نفر حنجره و 6 نفر سایر نواحی مخاط دهان بود.
مرحله بالینی تومور((stage : 5 نفر از این بیماران در مرحله I ، 7 نفر در مرحله II و 8 نفر در مرحله III بیماری بودند.
درجه هیستوپاتولوژی تومور(g--e) : 2 نفر از این بیماران درجه I ، 16 نفر درجه II و 2 نفردرجه III داشتند.
جدول3-1: توزیع فراوانی جنسیت در گروه های مورد مطالعه
جنسیت گروه های مورد مطالعه نتیجه آزمون
کای دو
سالم بیمار تعداد درصد تعداد درصد مذکر 19 0/95 9 0/45 001/0
مونث 1 0/5 11 0/55 کل 20 0/100 20 0/100 نتیجه آزمون کای دو نشان میدهد که ارتباط معنی داری بین جنسیت و گروه های مورد مطالعه وجود دارد
(001/0=P) و در گروه سالم 0/95 درصد مذکر بوده اند در حالی که این میزان در گروه بیمار 0/45 درصد بوده
است.

نمودار3-1: توزیع سن در گروه های مورد مطالعه
نتیجه آزمون t ی مستقل نشان میدهد که توزیع سن در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری دارند (001/0=P).
ب. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه به تفکیک گروه های بیمار و سالم
نتایج مطالعه نشان داد:
میزان گلوتاتیون توتال در گروه های بیمار(51/1 ± 75/6) و سالم(02/2 ± 92/8) تفاوت معنی داری دارد(001/0> P) (نمودار 3-2).

نمودار 3-2: میزان گلوتاتیون توتال در گروه های بیمار و سالم
.B میزان GSSG در گروه های بیمار(65/0 ± 10/5) و سالم(92/1 ± 22/5) تفاوت معنی داری ندارد
(796/0=P) (نمودار 3-3).

نمودار 3-3: میزان GSSG در گروه های بیمار و سالم
. C میزان GSH در گروه های بیمار(29/1 ± 064/1) و سالم(34/2 ± 069/3) تفاوت معنی داری دارد
(002/0=P) (نمودار 3-4).

نمودار 3-4: میزان GSH در گروه های بیمار و سالم
D . نسبت GSH/GSSG در گروه های بیمار(24/0 ± 322/0) و سالم(94/0 ± 920/0) تفاوت معنی داری
دارد (011/0=P) (نمودار 3-5).

نمودار 3-5: نسبت GSH/GSSG در گروه های بیمار و سالم
.E تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان در گروه های بیمار(12/0 ± 11/1) و سالم(07/0 ± 07/1)
تفاوت معنی داری ندارد (266/0=P) (نمودار3-6).

نمودار 3-6: میزان تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در گروه های بیمار و سالم
جدول3-2: توزیع متغیرهای مورد مطالعه به تفکیک گروههای بیمار و سالم
متغیر ها
گروه های مورد مطالعه نتیجه آزمون
بیمار سالم میانگین ± انحراف استاندارد میانگین±انحراف استاندارد Total Glutathion 51/1 ± 75/6 02/2 ± 92/8 001/0> P
GSSG 65/0 ± 10/5 92/1 ± 22/5 796/0= P
GSH 29/1 ± 64/1 34/2 ± 69/3 002/0= P
GSH/GSSG 24/0 ± 322/0 94/0 ± 92/0 011/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 12/0 ± 11/1 07/0 ± 07/1 266/0= P
نتیجه آزمون t ی مستقل نشان میدهد که سطح GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری ندارند(796/0=P و 266/0=P). اما سطح Total Glutathion ، GSH و GSH/GSSG در گروه های بیمار و سالم تفاوت معنی داری دارند (001/0> P ، 002/0= P و 011/0=P ).
ج. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه در ارتباط با مرحله بالینی و درجه تومور
ارتباط متغیرهای مورد مطالعه و مرحله بالینی تومور(جدول 3-3)
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد:
در بیماران بین میزان گلوتاتیون توتال با مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد
(415/0=P).
در بیماران بین میزان GSSGو مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(077/0=P).
در بیماران بین میزان GSHو مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(907/0=P).
در بیماران بین نسبت GSH/GSSG و مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(994/0=P).
در بیماران بین تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان و مرحله بالینی تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(907/0=P).
جدول 3-3: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و مرحله بالینی تومور
متغیرهای مورد مطالعه مرحله بالینی سطح معنی داری
I II III میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 98/1 ± 44/7 88/0 ± 23/6 63/1 ± 77/6 415/0= P
GSSG 60/0 ± 58/5 28/0 ± 73/4 77/0 ± 13/5 077/0= P
GSH 85/1 ± 85/1 97/0 ± 50/1 31/1 ± 63/1 907/0= P
GSH/GSSG 32/0 ± 33/0 21/0 ± 32/0 25/0 ± 31/0 994/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 08/0 ± 12/1 14/0 ± 14/1 13/0 ± 07/1 593/0= P
ارتباط متغیرهای مورد مطالعه و درجه هیستوپاتولوژی تومور(جدول 3-4)
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد:
در بیماران بین میزان گلوتاتیون توتال با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(431/0=P).
در بیماران بین میزان GSSG با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(374/0=P).
در بیماران بین میزان GSH با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(302/0=P).
در بیماران بین نسبت GSH/GSSG با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(233/0=P).
در بیماران بین تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با درجه تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد(558/0=P).
23812573660جدول 3-4: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و درجه تومور
00جدول 3-4: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه و درجه تومور

متغیرهای مورد مطالعه درجه سطح معنی داری
I II III میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 09/1 ± 33/6 56/1 ± 63/6 11/1 ± 08/8 431/0= P
GSSG 18/0 ± 47/4 67/0 ± 18/5 76/0 ± 11/5 374/0= P
GSH 27/1 ± 85/1 31/1 ± 45/1 34/0 ± 96/2 302/0= P
GSH/GSSG 301/0 ± 42/0 24/0 ± 27/0 01/0 ± 58/0 233/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 04/0 ± 08/1 12/0 ± 10/1 19/0 ± 20/1 558/0= P
به جهت تایید نتایج آزمون آنالیز واریانس، آنالیز متغیرهای مورد مطالعه در ارتباط با مرحله بالینی و درجه تومور علاوه بر آنالیز واریانس توسط ضریب همبستگی اسپیرمن نیز انجام شد. نتیجه ضریب همبستگی اسپیرمن نشان می دهد که در گروه بیماران بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با مرحله بالینی و درجه تومور رابطه معنی داری وجود ندارد (جدول 3-5).
جدول 3-5: بررسی ارتباط بین متغیرهای مورد مطالعه با مرحله بالینی و درجه تومور
متغیرهای مورد مطالعه مرحله بالینی درجه
ضریب همبستگی سطح معنی داری ضریب همبستگی سطح معنی داری
Total Glutathion 067/0- 778/0 291/0 213/0= P
GSSG 143/0- 547/0 272/0 247/0= P
GSH 070/0- 770/0 155/0 514/ 0= P
GSH/GSSG 019/0- 936/0 116/0 625/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 200/0- 398/0 165/0 487/0= P
در نمودار های 3-7 تا 3-16 سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان در مقابل مرحله بالینی و درجه تومور رسم شده است که نمودارهای ذیل نیز نشان دهنده عدم وجود ارتباط بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با مرحله بالینی و درجه تومور میباشند.

نمودار3-7: توزیع سطح Total Glutathion بر حسب Stage

نمودار3-8: توزیع GSSG بر حسب Stage

نمودار3-9: توزیع GSH بر حسب Stage

نمودار3-10: توزیع GSH/GSSGبر حسب Stage

نمودار3-11: توزیع سطح تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان بر حسب Stage

نمودار3-12: توزیع سطح Total Glutathion بر حسب G--e

نمودار3-13: توزیع GSSG بر حسب G--e

نمودار3-14: توزیع GSH بر حسب G--e

نمودار3-15: توزیع GSH/GSSG بر حسب G--e

نمودار3-16: توزیع تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان بر حسب G--e
د. نتایج آنالیز متغیرهای مورد مطالعه بر حسب محل تومور
در بیماران بین متغیرهای مورد مطالعه با محل تومور ارتباط معنی داری وجود نداشت (جدول 3-6).
جدول 3-6: توزیع متغیرهای مورد مطالعه بر حسب محل تومور
متغیرهای مورد مطالعه محل تومور نتیجه آزمون
کف دهان زبان حنجره مخاط سایر نواحی دهان میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد میانگین ± انحراف استاندارد Total Glutathion 31/1 ± 15/6 12/2 ± 85/6 36/1 ± 15/6 907/0 ± 43/7 503/0= P
GSSG 815/0 ± 68/5 76/0 ± 05/5 45/0 ± 00/5 75/0 ± 07/5 669/0= P
GSH 50/0 ± 47/0 66/1 ± 80/1 13/1 ± 14/1 88/0 ± 36/2 220/0= P
GSH/GSSG 07/0 ± 077/0 28/0 ± 34/0 20/0 ± 22/0 19/0 ± 48/0 133/0= P
تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان 054/0 ± 26/1 07/0 ± 08/1 18/0 ± 15/1 057/0 ± 05/1 142/0= P
نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان میدهد که بین سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان-آنتی اکسیدان با محل تومور ارتباط معنی داری وجود ندارد (503/0=P و 669/0= P ،220/0=P ،133/0=P و 142/0=P).
ه. تعدیل اثر سن و جنس بر متغیرهای مورد مطالعه
با توجه به اینکه سن و جنس در دو گروه تفاوت معنی داری با یکدیگر دارند به منظور تعدیل اثر این متغیرها در بررسی ارتباط بین SCC و سطح اکسیدان-آنتی اکسیدان، GSSG، GSH و GSH/GSSG از مدلهای خطی عمومی استفاده کرده (جدول 3-7) و نتیجه آن نشان میدهد که با تعدیل اثر سن و جنس، ارتباط معنی داری بین SCC با سطح اکسیدان-آنتی اکسیدان، GSSG و GSH وجود ندارد(224/0= P و 084/0= P ،296/0=P). اما بین SCC و GSH/GSSG ارتباط معنی داری وجود دارد (042/0=P).
جدول 3-7: نتیجه مدلهای خطی عمومی به منظور تعدیل اثر متغیرهای سن و جنس در بررسی ارتباط بین SCC و سطح Total Glutathion ، GSSG، GSH ، GSH/GSSG و تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان
متغیر وابسته متغیرهای مستقل ضریب مدل فاصله اطمینان 95% سطح معنی داری
Total Glutathion گروه(مورد) 49/2- (037/0-، 140/4- ) 004/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 033/1- (53/0، 59/2- ) 188/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 017/0- (044/0، 079/0- ) 566/0= P
GSSG گروه(مورد) 411/0- (958/0، 779/1- ) 546/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 453/0- (843/0، 749/1- ) 483/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 006/0 (057/0، 045/0- ) 816/0= P
GSH گروه(مورد) 079/2- (295/0-، 863/3- ) 024/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 58/0- (109/1، 270/2- ) 491/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 023/0- (043/0، 090/0- ) 478/0= P
GSH/GSSG گروه(مورد) 553/0- (104/0، 209/1-) 097/0= P
گروه(شاهد) 0 - -
جنسیت(مذکر) 031/0- (591/0، 653/0- ) 920/0= P
جنسیت(مونث) 0 - -
سن 006/0- (018/0 ، 030/0- ) 622/0= P
تعادل اکسیدان – آنتی اکسیدان گروه(مورد) 058/0- (154/0، 037/0-) 224/0= P
گروه(شاهد) 0 - -

user8300

1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس 15
فصل دوم: مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز 18
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم 19
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی 22
اهداف 23
فرضیه 23
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- ابزار 25
عنوان صفحه
3-2- مواد 26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی 26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL 26
3-2-2-1- سوش باکتری 26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون 26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی 26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز 26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE 27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز 27
3-2-4- نرم افزارها 27
3-3- روشها 28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی 28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید 28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات 28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب 29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli 29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli 29
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی 29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد 30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری 31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا 32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL 32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL 33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی 33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین 34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد 34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 34
عنوان صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) 35
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفور 35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز 36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات 38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی 39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا 39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف 39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 40
فصل چهارم: نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا 43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL 44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی 44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز 45
4-3- سنتز مایعات یونی 47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی 48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف 49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی 51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم 51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی 54
فصل پنجم: بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 57
عنوان صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی 61
فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات
6-1- نتیجهگیری 63
6-2- پیشنهادات 63
فهرست منابع 65
چکیده انگلیسی 75
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) 6
شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز 9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب 12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز 18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید 28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL 42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی 45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL 46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL 47
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی 48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون 52
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85 54
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] 55
فصل اول
مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که میتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده زمین لیپیدها هستند و آنزیمهای لیپولیتیک نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیمهای لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلولهای یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیمها مزایای زیادی در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها میتوان اختصاصیت بالای آنها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینهها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیمها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم درBOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).
آنزیمهای میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیمهای میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دستورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن میباشد)، پایداری بیشتر و تولید آسانتر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتریها و بنابراین آسانتر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آنها، باعث تسهیل فرآیندهایی همچون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دستیابی به بیشترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلولها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی میشوند. تنها حدود دو درصد از گونههای میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شدهاند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).
1-2- لیپازها
لیپازها اولین بار در سال 1901 در باکتریهای Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهای امروزی Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسایی شدند (Eijkman et al., 1901). باکتریهای گفته شده هماکنون بیشترین مطالعات لیپازی را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روی آنزیمهای هیدرولیز کننده تریگلیسریدها میگذرد و حدود 70 سال است که توانایی لیپازها در کاتالیز واکنشهای هیدرولیز و سنتز استرها تشخیص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولین آنزیم لیپاز را (آنزیم تجزیه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شیره پانکراس کشف کرد. انسانها در قدیم لیپاز را از پانکراس حیوانات به صورت خالص یا به صورت مخلوط با سایر آنزیمهای پانکراس میگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مینمودند. به دلیل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوری آنزیم از آن، دانشمندان به سراغ لیپازهای میکروبی رفتند. لیپازها از نظر نوع منشأ ( باکتری، قارچ یا پستاندار و غیره) و از نظر خصوصیات متفاوت هستند. این آنزیمها دارای توانایی کاتالیز واکنشهای مختلفی از جمله واکنشهای هیدرولیزی، یا سنتز کربوکسیلیکاسترهای مختلف و تبدیل آنها به اسیدهای آلی و گلیسرول هستند. همه لیپازها اختصاصیت بسیار بالایی برای سوبستراهای گلیسریدی دارند.
آنزیمهای لیپولایتیک به دلیل کاربرد فراوانی که در بیوتکنولوژی دارند ( به عنوان مهمترین گروه بیوکاتالیزورها در بیوتکنولوژی)، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). تولید انبوه لیپازهای میکروبی نیازمند بیان شدید و کارآ از ژنهای مربوطه و فهم دقیق مکانیسم ملکولی نحوه پیچش پروتئین و ترشح آن میباشد. از جمله کاربردهای جدید لیپازها در بیوتکنولوژی میتوان استفاده از این آنزیم در سنتز بیوپلیمر، بیودیزل، داروهای خالص انانتیومری، مواد شیمیایی مورد استفاده در کشاورزی ( مانند انواع آفت کش)، ترکیبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسیاری از مواد شیمیایی مهم صنعتی، به دست آمده از روغنها و چربیها طی فرآیندهای شیمیایی را میتوان به کمک لیپازها با سرعت بیشتر، اختصاصیت بهتر و در شرایط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزینی بالای لیپازها و اختصاصیت بالای شیمیایی و انانتیومری آنها توجه بسیاری از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
لیپازهای گرفته شده از منابع مختلف باکتری، قارچ، گیاه و حیوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصیت به موقعیت پیوند، اختصاصیت به اسیدچرب، پایداری دمایی و pH بهینه و غیره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههای متعددی از باکتریها، مخمرها و قارچهای رشتهای توانایی تولید لیپاز دارند (جدول1) سویه های نزدیک به هم (از نظر تاکسونومی) ممکن است انواع مختلفی از لیپاز ها را تولید کنند (Sharma et al., 2001).
جدول 1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز
منشأ جنس گونه
باکتری Bacillus B. megaterium
B. subtilis
B. thermoleovorans
B. thermocatenulatus
B. cereus
Pseudomonas P. putida 3SK
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. fragi
Staphylococcus S. canosus
S. hyicus
S. haemolyticus
S. aureus
S. warneri
S. xylosus
قارچ Penicillium P. cyclopium
P. simplicissimum
Aspergillus A. niger
A. oryzae
Rhizopus Rhizop. delemar
Rhizop. oryzae
Rhizop. arrhizus
Rhizop. nigricans
Rhizop. nodosus
مخمر Candida C. rugosa
C. tropicalis
C. antarctica
لیپازها را میتوان براساس اختصاصیت به سه گروه تقسیم کرد (Mukherjee et al., 1994). لیپازهای غیر اختصاصی ملکولهای آسیل گلیسرول را در موقعیتهای تصادفی میشکنند و اسیدچرب آزاد و گلیسرول و منوآسیل گلیسرول و دیآسیلگلیسرول را به عنوان حدواسطهای واکنش ایجاد میکنند. محصولات این واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتالیزورهای شیمیایی است. در واکنش آنزیمی محصول در اثر دما کمتر تجزیه میشود و این به دلیل پایینتر بودن دمای واکنش در کاتالیز زیستی است. لیپازهای اختصاصی به موقعیتهای 1و3، آزادسازی اسیدچرب از موقعیتهای 1و3 اسکلت گلیسرولی را کاتالیز میکنند. لیپازهای دارای اسیدچرب اختصاصی، تنها یک اسیدچرب خاص از ملکول آسیل گلیسرول آزاد میکنند (Macrae et al., 1983). لیپازها همچنین تفکیک انانتیومری ترکیبات کایرال و واکنشهای استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون، و اینتراستریفیکاسیون را کاتالیز میکنند. این تواناییهای متنوع کاتالیز، در شکست چربیها، اصلاح چربیها و روغنها، سنتز ترکیبات آلی، تأمین شویندهها و روشهای تجزیهای، کاربرد بسیاری پیدا کرده است (Macrae et al., 1985).
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن
این خصوصیت لیپازها که در سطح بین فضای آبدوست و آبگریز عمل میکنند، وجه تمایز لیپازها از استرازها میباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولی آنزیمهای لیپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون میباشد. این آنزیمها نیز شبیه سرینپروتئازها دارای مجموعه سه تایی کاتالیتیک باقیمانده نوکلئوفیل- باقیمانده هیستیدین- باقیمانده اسیدی هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرین- هیستیدین- آسپارتات یا به صورت مجموعه سه تایی سرین- هیستیدین- گلوتامات میباشد (Noble et al., 1993).
جایگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقیماندههای آبگریز احاطه میشود. یک ساختار مارپیچ پلیپپتیدی همانند یک درپوش مانع از قرارگیری جایگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال میشود. همچنین محافظت از آنزیم در برابر فعالیت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تایی کاتالیتیک پروتئاز ایجاد شود (B--y et al., 1990). سمتی از درپوش که روبروی جایگاه فعال است بیشتر از زنجیرههای جانبی آبگریز آلیفاتیک تشکیل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بیرون قرار گرفته است.
تغییر جهتگیری ساختار α- هلیکس درپوش همراه با افزایش آبگریزی سطوح نزدیک جایگاه فعال و روبروی آن، باعث پدیده "فعال شدن در فضای بینابینی" میشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزیم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهای آبگریز، اتصال زنجیرههای آلیفاتیک سوبسترا به سطح آبدوست آنزیم، به ویژه در حضور یک لایه آبپوشی، بسیار نامطلوب است. فضای بینابینی ایجاد شده در دهانه شیار فعال ممکن است به فراهم سازی یک لایه ناکامل آبپوشی در اطراف ملکول لیپاز و در نتیجه تسهیل پیچش زنجیرههای آلیفاتیک ملکول سوبسترا در سطح آنزیم کمک کند (Petersen et al., 1996). پایدارسازی بیشتر میتواند به کمک محدودههای الکتروستاتیک موضعی در سطح آنزیم و با ایجاد جاذبه دوقطبی به سمت پیوند C-H (با قطبیت ضعیف) زنجیرههای جانبی آلیفاتیک فراهم شود.

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL).
آمینواسیدهای اصلی جایگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.
1-3- آنزیمها در محیط آلی
کلیبانو با انجام تعدادی آزمایش ابتدایی و ساده نشان داد که میتوان از آنزیمها در حلالهای آلی آبگریز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنین محیطهایی سرعت واکنش به شدت پایین میآید (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسیاری از لیپازها و همچنین برخی از پروتئازها و آسیلازها بسیار پایدار هستند، به طوری که حتی در حلالهای آلی بدونآب نیز فعالیت خود را حفظ میکنند. این خصوصیت اساس استفاده موفقیتآمیز از این آنزیمهای هیدرولاز در واکنشهای غیرهیدرولازی است. از جمله این واکنشهای غیرهیدرولازی میتوان آسیلاسیون الکلها و آمینها با اختصاصیت انانتیومری را نام برد که در صنعت کاربرد زیادی دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محیط آلی، که شامل مایعات یونی نیز میشود، با فعالیت آنزیم غالبا از جنبه حذف آب ضروری آنزیم مورد بررسی قرار میگیرد. بسیاری از آنزیمها برای فعال بودن به یک پوشش آبی کامل نیاز دارند، اما تعداد زیادی استثناء نیز وجود دارد مانند لیپاز B کاندیدا آنتراکتیکا (CALB) که فعالیت خود را حتی پس از خشک شدن با پنتوکسید فسفر حفظ میکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتیسیلین که برای فعال ماندن تنها نیاز به تعداد اندکی ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزیم دارد (Dolman et al., 1997). بررسی منابع علمی نشان میدهد که بیان نیاز آنزیم به آب در قالب فعالیت آبی (aW ) مرسومتر از بیان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهای غیرهیدرولازی با آنزیمهای لیپاز یا پروتئاز ممکن است باعث حفظ یا افزایش فعالیت آنزیمی شود. هرچند چنین محیطهایی همیشه باعث افزایش واکنشهای جانبی هیدرولازی میشوند. همچنین اسید حاصل از این واکنشها ممکن است باعث کاهش pH و از دست رفتن فعالیت آنزیمی شود.
حلالهایی که به خوبی توسط این آنزیمها تحمل میشوند – هیدروکربنهای آروماتیک و آلیفاتیک، اترها، و الکلها (بجز متانول)- فقط به صورت ضعیفی با آنزیم برهمکنش میدهند و میتوان حدس زد که این حلالها کم و بیش فقط برای آنزیم یک فضای خالی ایجاد میکنند. تنها الکلها که تشکیل دهنده پیوند هیدروژنی هستند میتوانند لیپازها را غیرفعال کنند. حلالهایی که برهمکنش بسیار قوی با پروتئینها میدهند، مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) و دی متیل فرمآمید (DMF) نیز باعث غیرفعال شدن برگشتناپذیر آنزیمها میشوند. بنابراین آنزیمها برهمکنشهای قوی با هیچ مادهای به جز آب را نمیتوانند تحمل کنند (Van Rantwijk, 2007).
نامشخص بودن pH در محیط بدون آب یک عامل پیچیده در آنزیمشناسی است. آنزیم توزیع بار الکتریکی (pH ظاهری) را مطابق با آخرین محلول آبی، مثلا بافر لیوفیلیز، حفظ میکند (Zaks and Klibanov 1985). البته pH بهینه ظاهری تحت تأثیر نوع حلال و aW تغییر میکند (Yang et al., 1993). چنین اثرات مشابهی در محیط مایعات یونی نیز قابل انتظار است.
در حقیقت بیشترین اطلاعات درباره رفتار آنزیم در محیط غیرآبی، حاصل از مطالعات آنزیمها در حلالهای آلی است. اما حلال های آلی برای طبیعت زیان آور هستند بنابراین در سالهای اخیر تلاش زیادی در جهت یافتن جایگزین پاکتری برای محیطهای واکنش انجام شده است.از جمله محلولهای دوستدار محیط زیست مایعات یونی را میتوان نام برد که میتوانند جایگزین حلالهای آلی شوند.
علاقه عمومی برای افزایش سرعت واکنشهای آنزیمی در حلالهای آلی نیز عامل پیشبرنده دیگر به سمت مایعات یونی بوده است. یکی از دلایل کاهش فعالیت آنزیمی در حلالآلی (در مقایسه با محیط آبی) پایدارسازی مواد واکنش دهنده در حلال است (Klibanov et al., 1997). این اثر که در واقع همان افزایش حلالیت (افزایش Km) است، با به کارگیری غلظتهای بالاتری از ماده واکنشدهنده قابل جبران است (Halling et al., 2004). بقیه کاهش فعالیت، در حد 1 تا 2 برابر، مربوط به اثر مجموعهای از عوامل شامل ناپایدار شدن حالت گذار واکنش (Clark et al., 2004)، تغییرات کنفورماسیون و از دست دادن انعطافپذیری میباشد (Halling et al., 2004, Clark et al., 2004 ). ثابت دیالکتریک پایین محیطهای آلی معمولی باعث افزایش انرژی حالت گذار شدیدا قطبیده در مقایسه با آب میشود و بنابراین ناپایدار شدن حالت گذار را در پی خواهد داشت (Clark et al., 2004).
1-4- مایعات یونی
از میان مایعات مختلفی که میتوان بهعنوان حلال به کار برد تنها تعداد اندکی به طور عمومی مورد استفاده قرار میگیرند. با معرفی تکنولوژیهای سبز یک نگرانی اصلی، ایجاد جایگزینهای مناسب برای حلالهای مخرب است که در صدر جدول مواد شیمیایی زیانآور هستند. زیرا این حلالها در مقادیر بالا استفاده میشوند و به طور معمول مایعات فراری هستند. نمکهای مرکب مایعاتی هستند که فقط یون دارند (مایعات یونی). در صورت انتخاب مواد اولیه مناسب میتوان مایعات یونی ساخت که در دمای اتاق و در دمای پایینتر از دمای اتاق مایع هستند. مایعات یونی مواد جدیدی نیستند. بسیاری از آنها سالهای زیادی است که شناخته شدهاند. برای مثال میتوان [EtNH3][NO3] را نام برد که دمای ذوب 12 درجه سانتیگراد دارد و در سال 1914 معرفی شد. از همان زمان پیشنهاد شد که از مایعات یونی در سنتز شیمیایی به جای حلال استفاده شود. البته تنها در سالهای اخیر تعداد زیادی مقالات در این زمینه به چاپ رسیده است. برخی خصوصیات فیزیکی ساده مایعات یونی که آنها را به عنوان حلالهای بالقوه برای سنتز جالب توجه کرده است توسط ولتون بیان گردیده است (Welton et al., 1999):حلالهای خوبی برای طیف وسیعی از مواد آلی و غیر آلی هستند.
معمولا شامل یونهای نامتناسبی هستند که امکان قطبیت بالا در آنها را ایجاد میکند.
طبق مقیاس قطبیت نرمال شده که در آن تترامتیل سیلان صفر و آب 0/1 در نظر گرفته شده، قطبیت مایعات یونی مرسوم، به طور معمول در محدوده 6/0-7/0 قرار میگیرد ( مانند فرمامید و الکلهای محلول در آب )
(van Rantwijk et al., 2003). همچنین کاهش طول زنجیره آلکیلی متصل به حلقه ایمیدازولیوم و اندازه آنیون در مایعات یونی دارای کاتیون ایمیدازولیومی، با افزایش قطبیت مایع یونی در ارتباط است (Carmichael and Seddon, 2000). مقدار قطبیت مایع یونی گاهی به دما و حضور آب حساس است (Baker et al., 2002). مایعات یونی به دلیل قطبیت بالایی که دارند محیط خوبی برای واکنشهای شیمیایی و بیوشیمیایی ایجاد میکنند. زیرا میتوانند سوبستراهای مختلفی شامل ترکیبات آلی قطبی و غیرقطبی و ترکیبات آلی و غیر آلی و پلیمری را در خود حل کنند.
با تعدادی از حلالهای آلی غیر قابل امتزاج هستند و بنابراین یک جایگزین قطبی غیرآبی برای سیستمهای دو فازی میباشند. همچنین مایعات یونی آبگریز را میتوان به عنوان فاز قطبی غیر قابل امتزاج همراه با آب استفاده کرد (Welton et al., 1999).
مایعات یونی فرار نیستند و این به دلیل یونی بودن ماهیت آنها است که فشار بخار ناچیزی دارند. بنابراین میتوان از آنها بدون ایجاد آلودگی در سیستمهایی با مکش قوی استفاده کرد (Welton et al., 1999).
بنابراین مایعات یونی دارای پایداری دمایی بوده و فاقد فشار بخار میباشند (Gordon et al., 2001, Brennecke et al., 2001). به علاوه داری خصوصیات استثنائی به عنوان حلال هستند و میتوانند هر ماده شیمیایی را در خود حل کنند. با جایگزین کردن کاتیون، آنیون و اجزای متصل به آنها، میتوان خصوصیات این حلالها را تغییر داد و به این صورت مایع یونی مناسب برای واکنش خاصی را ایجاد نمود (Brennecke and Maginn, 2001) (شکل 1-3). گرچه هنوز مشخص نیست که مایع یونی چگونه خصوصیات کاتالایتیک آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهد، آنزیمها در مایعات یونی مانند [C4MIM][PF6] فعال و به شدت پایدار هستند (Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000, Laszlo et al., 2001).

شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز.
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی
دلیل تمایل به انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی در واقع میل به جایگزین کردن مایعات یونی غیرفرار به جای حلالهای آلی فرار بوده است. هرچند این واکنشها در محیط طبیعی آنزیم یعنی محیط آبی قابل انجام است اما حلالهای آلی به طور وسیعی همراه با آنزیمها مورد استفاده قرار گرفتهاند تا از این طریق میزان حلالیت واکنشگرهای آبگریز را بیشتر کرده و تعادل واکنش را از سمت هیدرولیز به سمت سنتز تغییر جهت دهند. همچنین خصوصیات غیرمرسوم مایعات یونی به عنوان حلال، باعث گسترش روشهای متعدد جدید و بسیار کارآ شده است (Van Rantwijk et al., 2007).1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی- آب
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. سری هافمیستر نوعی دستهبندی یونها است که به ترتیب توانایی آنها در حل کردن و رسوبدهی پروتئینها ایجاد شده است.
اخیرا در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. مایعات یونی را به خوبی میتوان براساس موقعیت قرارگیری یونها، در سری هافمیستر به گونهای مرتب نمود که ترتیبی از پایدارکنندهترین تا ناپایدارکنندهترین (کاسموتروپ تا کائوتروپ) ایجاد شود.
نمک های سری هافمیستر با ویژگی های کاسموتروپیک و کائوتروپیک یونها مرتبط هستند. یونهایی که به شدت آب پوشی میشوند به کاسموتروپ ها معروفند و آن دسته از یون هایی که به صورت ضعیف هیدراته می شوند، کائوتروپ خوانده می شوند (Lo Nostro et al., 2005). یونهای حاصل از نمکهای سری هافمیستر به دو گروه تقسیم می شوند: Salting- out و Salting- in (Kunz et al., 2004). یون های out-Salting (آنیون های کاسموتروپ مثل فسفات، سولفات وکاتیون های کائوتروپیک مثل کاتیون های آمونیوم) پروتئین ها را پایدارکرده و نیز باعث رسوب آنها می شوند. در مقابل یون های Salting- in (آنیونهای کائوتروپ مثل آنیون های پرکلرات، برماید و کاتیونهای کاسموتروپ مثل کاتیون لیتیم) پروتئین ها را ناپایدار میکنند (Kunz et al., 2004). درغلظت های پایین نمک (تا سقف 01/0 مولار) یون ها غالبا از طریق برهمکنش های الکترواستاتیک روی آنزیم ها تاثیر می گذارند. هنگامی که در غلظت های زیاد نمک نیروهای انتشار یا پراکندگی یونی بر پتانسیل الکترواستاتیک پیروز میشوند، اثر یونهای هافمیستری اهمیت پیدا میکنند (Lo Nostro et al., 2005).
بسیاری از آنزیمها به خوبی در طیف وسیعی از مایعات یونی در محیط آبی عمل میکنند. به سختی میتوان مایع یونی پیدا کرد که به هیچ عنوان با هیچ آنزیمی سازگاری نداشته باشد. در رابطه با پیشبینی سازگاری آنزیم و مایعات یونی آبی به نظر میرسد که کائوتروپی و کاسموتروپی نمیتوانند به عنوان تنها عوامل پیشبینی کننده استفاده شوند. همچنین بعید به نظر میرسد که بتوان سازگاری آنزیم با مایعات یونی را با در نظر گرفتن تعداد محدودی پارامتر همچون قطبیت یا logP تفسیر نمود. این موضوع در مورد حلالهای ملکولی محلول در آب نیز صدق میکند (Van Rantwijk et al., 2007).
اساس پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی آبی را میتوان این گونه بیان کرد که پروتئین زمانی پایداری خود را از دست میدهد که یونها یا ملکول های حلال اطراف آن با فرم بازشده آنزیم برهمکنش قویتری نسبت به فرم طبیعی آنزیم داشته باشند (Baldwin et al.,1996). چنین برهمکنشهای ناپایدارکنندهای میتوانند حاصل از "Salting in" یونهای دوگانه دوست روی گروههای آبگریز فرو رفته درون ساختار پروتئین یا حاصل از برهمکنشهای قوی آنها با پیوندهای پپتیدی باشد (Kaar et al., 2003, Lou et al., 2006). از جمله مباحث مهمتری که باید به خصوص در مورد آنزیمهای حساس مد نظر قرار داد میتوان تغییرات pH ایجاد شده توسط یونهای اسیدی یا قلیایی برونشتد و فعالیت آبی ترمودینامیکی را نام برد.
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001) و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای MeSO4- (Schofer et al., 2001)، NO3- (Kaar et al., 2003)، AcO-یا lactate- (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است (شکل 1-4). آب نیز چنین عملکردی دارد؛ اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
به نظر میرسد که مایعات یونی بدون آب با روشی مشابه حلالهای آلی مرسوم، آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهند؛ زیرا بسیاری از آنها به خوبی تحمل میشوند اما برخی از آنها نیز سازگاری بسیار کمی دارند که البته این موضوع به نوع آنزیم نیز بسیار وابسته است. برای مثال مایعات یونی حاوی یونهای AcO- و NO3- که به صورت مخلوطهای آبی سازگاری بسیار خوبی دارند، در حالت بدون آب آنزیم بسیار مقاوم CALB را غیر فعال میکنند. بر اساس اطلاعات فعلی، مایعات یونی با آنیونهای BF4- و PF6-، و آنیون مقاوم به هیدرولیز NTf2- و آنیونهای زنجیر متوسط آلکیل سولفات به همراه کاتیونهای دیآلکیلایمیدازولیوم و آلکیلپیریدینیوم گزینههای ایمنتری به نظر میرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون یک اساس نظری برای پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی بیآب ایجاد نشده است. هرچند تعدادی از عوامل سهیم احتمالی مانند قابلیت کاتیون برای ایجاد پیوند هیدروژنی (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکیل نانوساختارهای متصل به هیدروژن، و گرانروی حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر میرسد که میزان هسته دوستی آنیون (Kaar et al., 2003) یا قابلیت پذیرش پیوند هیدروژنی توسط آن (Sheldon et al., 2002) نیز، حداقل در حالتی که میل کاتیون برای تشکیل پیوند هیدروژنی کم است، میتواند یکی از عوامل کنترل کننده باشد. در این مورد یک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنیون H2PO4- است که بدون دناتوره کردن میتواند Cyt C را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء دیگر [HOPMIM][glycolate] است که با داشتن کاتیون و آنیونی با قابلیت بالا در ایجاد پیوند هیدروژنی، آنزیمهای احیاکننده را در فرم فعال در خود حل میکند (Walker and Bruce, 2004).

شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب. الف) شکل شماتیک از نحوه برهمکنش مایع یونی با بخشهای باردار و غیرقطبی آنزیم، ب) ساختار شبیه سازی شده آنزیم CALB در محیط مایع یونی DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقی از سطح آنزیم را نشان میدهد که زنجیرههای آلیفاتیک حضور دارند و رنگ نارنجی نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزیم هستند (Klahn et al., 2011).
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب
پایداری (دمایی) آنزیمها (فعالیت در طی زمان) معمولا در محیطهای آلی به خصوص با فعالیت آبی کم، نسبت به محیطهای آبی، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مایعات یونی نیز میتوانند چنین اثری داشته باشند. پایداری آنزیمی تعریف واضحی ندارد و روشهای متنوعی برای سنجش آن وجود دارد. برای بررسی پایداری در ذخیره سازی، آنزیم در مایع یونی در یک دمای خاص انکوبه شده و میزان فعالیت باقیمانده در نمونهها که با آب رقیق شدهاند بررسی میشود. بازیابی فعالیت بالایی از آنزیم در چنین روشی نشان دهنده این است که تغییرات ایجاد شده در ساختار آنزیم در این چنین محیط ذخیرهسازی برگشت پذیر است. پایداری آنزیم را میتوان با انکوبه کردن آنزیم در مایع یونی در بازههای زمانی مختلف و سنجش فعالیت در همان محیط بررسی نمود. همچنین میتوان ساختار آنزیم را با روشهای اسپکتروسکوپی در محیط مورد نظر بررسی نمود. برای مثال دمای بازشدن ساختار پروتئین شیرین مونولین از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزایش یافت (Baker et al., 2004). نوع دیگر پایداری که میتوان مورد بررسی قرار داد پایداری در شرایط واکنش است.
بهطور کلی آنزیمها در مایعات یونی فعالیت و ساختار خود را در مدت زمان طولانیتر و در دماهای بالاتری نسبت به حلالهای آلی ملکولی حفظ میکنند. دلیل احتمالی این امر گرانروی بالای مایعات یونی است که باعث کند شدن حرکت دمینهای پروتئین از موقعیت خود در فرم فعال پروتئین به موقعیتهای جدید ایجاد کننده فرم غیرفعال میشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت
پیوندهای هیدروژنی عامل پیوستگی ساختار آنزیمهای آبپوشی شده و بدون آب هستند. هر تغییر ساختاری مستلزم فروپاشی تعداد قابل توجهی از پیوندهای هیدروژنی به طور همزمان میباشد؛ این امر سهم قابل توجهی در پایداری آنزیم دارد و گویای اثرات حافظه آبپوشی و اثرات پسماند است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند این است که تعداد ملکولهای آب متصل به آنزیم تنها وابسته به میزان فعالیت آبی نیست، بلکه به حافظه آبپوشی نیز مربوط میباشد.
پژوهشهای مختلفی نشان داده اند حلالهایی که در شرایط آبی یا غیرآبی با آنزیم سازگارند، مانند استونیتریل یا ترت- بوتیل الکل، در غلظتهای پایین باعث غیرفعال شدن آنزیم میشوند (Griebenow et al., 1996). چنین نتایجی را میتوان در پژوهشهای انجام شده در مایعات یونی نیز مشاهده کرد. دلیل این امر کاهش اثر آبگریزی در حضور حلال است. در نتیجه پایداری آنزیم کاهش مییابد تا اینکه در یک غلظت مشخص آنزیم غیرفعال میشود.
پیوندهای هیدروژنی میتوانند توضیح مناسبی برای پایداری آنزیم در مایعات یونی بدون آب باشند. مایعات یونی، بهخصوص آنیون آنها که پیوندهای هیدروژنی قوی ایجاد میکنند، ممکن است باعث از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی شوند که عامل یکپارچگی ساختار α- هلیکسها و صفحات β بودهاند و بنابراین باعث باز شدن کل پروتئین یا بخشی از آن شوند. برای مثال یون لاکتات به راحتی میتواند با اسکلت پلیپپتیدی پیوند هیدروژنی برقرار کند. اندازه یون نیز میتواند مهم باشد زیرا یونهای با اندازه بزرگ برای ایجاد تعداد اندکی پیوند هیدروژنی بین خود و آنزیم، نیاز دارند که تعداد زیادی پیوند هیدروژنی را بشکنند، بنابراین نمیتوانند به سادگی پایداری آنزیم را مختل کنند. در آنزیمهایی که به صورت برگشتپذیر غیرفعال شدهاند احتمالا پیوندهای هیدروژنی توانستهاند کانفورماسیون را حفظ کنند و در ادامه برای بازیابی ساختار آنزیم لازم است این پیوندها فروپاشند و پیوندهای طبیعی دوباره ایجاد شوند. رقیق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مایع یونی دناتوره کننده، میتواند باعث تشکیل دوباره پیوندها شود احتمالا چنین ترکیباتی که پیوند هیدروژنی قوی تشکیل میدهند با تشکیل پیوندهای هیدروژنی ناپایدار، تشکیل دوباره پیوندها را تسهیل میکنند.
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها
کاربرد لیپازها در بیوترانسفورماسیون شامل طیف وسیعی از واکنشهای سالوولایتیک( نوعی از واکنشهای جانشینی هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفیل عمل کرده و جانشین یک اتم یا گروه در ملکول سوبسترا میشود) مربوط به گروه کربوکسیل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله این واکنشها میتوان استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون (الکلولیز)، پرهیدرولیز، و آمینولیز (سنتز آمید) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهای ترانساستریفیکاسیون و سنتز آمید ترجیحا در محیط بیآب و در حضور زئولیت فعال، جهت متوقف ساختن واکنشهای هیدرولازی ناخواسته، انجام میشود. در این واکنشها اغلب از آنزیمهایی همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده میشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتی چنین شرایطی را تحمل میکنند.
جهت دستیابی به بهینهترین حالت تشخیص انانتیومرها لازم است که محیط واکنش، مایع یونی یا محیطهای سنتی، با توجه به نوع ماده واکنش دهنده و نوع آنزیم بهینهسازی شود. در واقع نمیتوان یک مایع یونی را به عنوان بهترین گزینه برای انجام واکنشهای تفکیک مخلوطهای راسمیک نام برد، همانطور که یک حلال آلی را نمیتوان به طور کلی بهترین دانست. با ظهور مایعات یونی، گزینههای حلال انتخابی و بنابراین شانس یافتن محیط مناسب به میزان زیادی افزایش یافته است.
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس
ملکول پروتئین طی فرآیندهای غیرفعال شدن چند فاز مختلف را طی میکند. این پدیده نشاندهنده یک سری وقایع درون ملکولی در کنفورماسیونهای گذرای پروتئین است (De Diego et al., 2004). از روشهای مختلفی جهت بررسی ساختار پروتئین استفاده میشود که از آن جمله میتوان روشهای DSC ، NMR، CD، FTIR، اسپکتروفتومتری UV، کریستالوگرافی اشعه X و اسپکتروسکوپی فلورسانس را نام برد. فلورسانس یک روش در دسترس است که میتوان از آن جهت بررسی ساختار سوم پروتئین استفاده کرد.
در پروتئینهایی که دارای آمینواسیدهای فلوروفور هستند (مثل تریپتوفان، تیروزین یا فنیلآلانین) تغییر در IMax فلورسانس و شیفت قرمز در λMax فرآیند دناتوره شدن پروتئین را نشان میدهند و هر دوی این تغییرات به دلیل افزایش قطبیت باقیماندههای تریپتوفان پروتئین با قرارگیری آن در معرض حلال است. مکانیسم ملکولی پایدار شدن آنزیم در مایعات یونی (در بیوکاتالیز کاربردی) همچنان نامعلوم است و نیاز به بررسیهای بیشتر وجود دارد (De Diego et al., 2004).
پروتئینها پس از برانگیختگی در طول موج nm 280 (مربوط به همگی فلوروفورهای پروتئین) یا nm 295 (بیشتر مربوط به باقیماندههای تریپتوفان)، به طور معمول نور را بین طول موج nm 300 و nm 350 منتشر میکنند. شدت فلورسانس در واقع جمع نور منتشر شده توسط هر کدام از باقیماندههای فلوروفور پروتئین میباشد. باز شدن نسبی ساختار پروتئین باعث افزایش برهمکنش باقیماندههای آمینواسیدی پروتئین با حلال (به طور معمول آب) میشود. همچنین ممکن است حلقه اندولی تریپتوفان با دیگر آمینواسیدهای موجود در ساختار پروتئین وارد برهمکنش شود. هر دوی این پدیدهها سبب کاهش شدت فلورسانس و گاهی سبب ایجاد یک شیفت قرمز در پیک نشر فلورسانس (کاهش λMax) میشود که این پدیده را نشانهای از باز شدن پروتئین در محیط آبی میدانند (Bekhouche et al., 2011).
با ورود مایعات یونی به محیط پروتئینها به عنوان حلالهای جدید، مشکلاتی در بررسی ساختار توسط روشهای مختلف ایجاد میشود. از جمله این مشکلات تداخلهای ایجاد شده در طیفهای CD و فلورسانس را میتوان نام برد که در گزارشات مختلفی به آنها اشاره شده است (Shu et al., 2011, Bekhouche et al., 2011, Attri and Venkatesu, 2013). با این وجود شاید بتوان ساختار پروتئین را بیشتر بر اساس شیفتهای λMax و مقایسه شدت فلورسانس در حالتهای دمادهی مختلف در یک مایع یونی با غلظت مشخص، مورد بررسی قرار داد.
به طور کلی میتوان گفت که طیف وسیعی از آنزیمها میتوانند مخلوطهای آبی مایعات یونی را به عنوان محیط واکنش تحمل کنند. به سختی میتوان مایع یونی را یافت که هیچ آنزیمی نتواند با آن سازگار باشد. عقیده بر این است که مایعات یونی در غلظتهای بالاتری، نسبت به حلالهای ملکولی قابل امتزاج با آب، میتوانند توسط آنزیمها تحمل شوند.
بسیاری از هیدرولازها به خصوص آنهایی که توانایی تحمل حلالهای ملکولی را دارند به میزان قابل توجهی میتوانند واکنشهای غیرهیدرولازی را در مایعات یونی کاتالیز کنند. میزان فعالیت آنزیمها در مایعات یونی در حد فعالیت آنها در حلالهای آلی و یا حتی بالاتر نیز میباشد. به علاوه در بسیاری از موارد افزایش پایداری دمایی و عملکردی و افزایش اختصاصیت انانتیو و ریجیو نیز دیده شده است.
مایعات یونی سازگار با آنزیمها به طور معمول برهمکنش قوی با آنزیم نمیدهند و باعث حل شدن آنزیم نمیشوند. تاکنون اساس نظری برای پیشبینی سازگار بودن یا نبودن مایع یونی با آنزیم ایجاد نشده است هرچند با توجه به علاقه زیادی که در این موضوع وجود دارد انتظار میرود که به زودی یک اساس نظری در این زمینه مطرح گردد.
مایعات یونی قابلیت بالایی در کاربرد به عنوان حلال در واکنشهای بیوترانسفورماسیون مربوط به واکنشدهندههای بسیار قطبی مانند پلیساکاریدها دارند؛ زیرا چنین واکنشهایی به دلیل محدودیتهای تعادل واکنش در آب قابل انجام نیستند. چنین جایگزینی یک محیط فرار با محیط غیرفرار مایعات یونی بدون شک ادامه خواهد یافت و به تدریج توسط صنایع شیمیایی پذیرفته خواهد شد و سهم بزرگی در ایجاد کارآیی بالای واکنشهای مختلف خواهد داشت. توسعه مایعات یونی ارزانتر نیز باعث افزایش استفاده از آنها در بیوترانسفورماسیونهای صنعتی خواهد شد. به علاوه باید این موضوع را در نظر داشت که سیستمهای حلالی که بر پایه مایعات یونی هستند قابلیت بالایی در انجام ترانسفورماسیونهای چند کاتالیزوری دارند. برای دستیابی به این اهداف تلاشهای جدیدی انجام گرفته است.
بدون شک انتظار میرود که مایعات یونی سبز و زیست سازگار به زودی در دسترس باشند؛ زیرا به کارگیری مایعات یونی در ایجاد صنایع شیمیایی سبزتر، امری کاملا ضروری است. اینگونه به نظر میرسد که انجام بیوترانسفورماسیون در مایعات یونی بسیار امید بخش است.
فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز
اولین گزارش از بیوکاتالیز در محیط مایعات یونی مربوط به سال 2000 است (Cull et al., 2000). اولین کارهای انجام شده در این زمینه شامل مایعات یونی متشکل از کاتیونهای 1و3- دی آلکیل ایمیدازولیوم یا N- آلکیل پیریدینیوم و یک آنیون ضعیف کئوردینه کننده بود (شکل2-1و جدول 2-1). این نوع مایعات یونی هنوز نقش اصلی را در واکنشهای آنزیمی ایفا میکنند. هرچند که تحقیقات در حال حاضر بیشتر به سمت مایعات یونی با ساختارهای جدید گرایش یافته است. تاکنون مقالات مروری خوبی در زمینه بیوکاتالیز در مایعات یونی منتشر شده است که از آن جمله پروژه - ریسرچمروری ون رنتویجک و شلدون و مقالات مروری منیرالزمان را میتوان نام برد (Van Rantwijk and Sheldon, 2007, Moniruzzaman, 2010 a& b).

شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی که به طور مرسوم در بیوکاتالیز استفاده میشوند
(Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونیفرمول ساختاری علامت اختصاری نام آنیون
BF4- BF4- Tetrafluoroborate
PF6- PF6- Hexafluorophosphate
(CF3SO2)2N- Tf2N Bis(trifluoromethylsulfonyl)amide
CF3SO3- TfO Trifluoromethanesulfonate
CF3COO- TFA Trifluoroacetate
CH3SO3- MeSO3 Methylsulfite
n-C7H15SO3- HpSO3 Hydrogenthiophosphate
TsO- TsO Toluenesulfonate
CH3OSO3- MeSO4 Methylsulfate
C2H5OSO3- EtSO4 Ethylsulfate
n-C8H17OSO3- OctSO4 Octylsulfate
(HO)2PO2- H2PO4 Dihydrogenphosphate
(CH3O)2PO2- Me2PO4 Dimethyl phosphate
C2H5O(CH2)2OSO13- EtOEtSO4 Ethoxyethylsulfate
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. یک مطالعه اولیه روی آنزیم آلکالین فسفاتاز مربوط به باکتری اشرشیا کلای در مخلوط آبی [EtNH3][NO3] (قدیمیترین مایع یونی (Walden, 1914 )) نشان داد که این مایع یونی در غلظتهای پایین روی آنزیم اثر فعال کننده داشته است و بیشترین اثر گذاری آن (10 درصد افزایش فعالیت) در غلظت 1/1 مولار دیده شده است. با افزایش غلظت مایع یونی تا قبل از غلظت 80 درصد فعالیت آنزیم به طور برگشت پذیر کاهش یافت و پس از آن آنزیم به طور برگشت ناپذیری غیر فعال گردید (Magnuson et al., 1984).
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم
در سالهای اخیر در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. به تازگی آنیونهای α-آمینواسیدها در مایعات یونی مورد استفاده قرار گرفتهاند. این آنیونها کاسموتروپ هستند (Zhao, 2006). مایعات یونی تشکیل شده از α-آمینواسیدهای D و L و ω- آمینوکربوکسیلاتها و کاتیون [C2MIM] در غلظت 5/0 مولار اثر بسیار کمی بر فعالیت آنزیم سوبتیلیسین داشتند. در حالی که [C2MIM][D-GluO] در غلظت 1 مولار سرعت واکنش را بیش از 60 درصد کاهش داد و [C2MIM][L-GluO] باعث کاهش 80 درصدی سرعت شد (Zhao, 2006). مایع یونی [C4MIM][Cl] در غلظتهای کمتر از 20 درصد اثر کمی بر آنزیم پراکسیداز ترب سیاه (HRP) گذاشت در حالیکه در غلظتهای 25 و 30 درصد کاهش شدید فعالیت و پایداری دمایی آنزیم را نشان داد (Machado and Saraiva, 2005).
آنیون نیترات یک آنیون بی ضرر و بی اثر است با این وجود مایعات یونی حاوی این آنیون زیاد مورد مطالعه قرار نگرفتهاند. از معدود مطالعات انجام شده در این زمینه میتوان پژوهشی روی آنزیم پاپائین را نام برد که در حضور 15 درصد [C4MIM][NO3] 50 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. در گزارشی توسط کفتزیک و همکاران دو آنزیم CbFDH و β-گالاکتوزیداز مربوط به باسیلوس سیرکولانس در حضور 25 درصد [PrNH3][NO3] کاملا غیرفعال شدند (Kaftzik et al., 2002). دلیل این غیرفعال شدن را اسیدی شدن pH احتمال دادند.
مایعات یونی حاوی یون [BF4] بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. این آنیون به شدت کائوتروپ است و نسبت به آنیونهایی که قبل از این گفته شد قدرت کمتری در تشکیل پیوند هیدروژنی دارد. اثر [C4MIM][BF4] بر فعالیت HRP توسط ماکادو و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. در غلظتهای کمتر از 20 درصد [C4MIM][BF4] کمترین کاهش فعالیت دیده شد و در غلظت 25 درصد آن 30 درصد کاهش فعالیت دیده شد. ماکادو و همکاران همچنین تغییرات پایداری دمایی HRP را در [C4MIM][BF4] بررسی کردند. در غلظت 10 درصدی مایع یونی، آنزیم HRP با تأخیر بیشتری نسبت به محیط آبی در اثر دمادهی غیرفعال شد. در حالی که در غلظت 25 درصد مایع یونی، پایداری آنزیم به شدت کاهش یافت (Machado and Saraiva, 2005).
اولین بیوترانسفورماسیون موفق در یک محیط مایع یونی حاوی 5 درصد آب مربوط به یک مایع یون آبگریز بود. ترمولایزین، یک آنزیم بسیار پایدار، واکنش سنتز Z- آسپارتام را در محیط [C4MIM][BF4] اشباع از بافر کاتالیز کرد؛ سرعت واکنش در این حالت نسبت به سرعت واکنش در محیط اتیل استات 40 درصد بود (Erbeldinger et al., 2000).
لیپازها به عنوان آنزیمهای مقاوم به حلالهای آلی مسلما اولین گزینه انتخابی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی بودند. در حقیقت لیپازهای میکروبی پایدار مانند CALB (Madeira Lau et al., 2000 , Schofer et al., 2001) و لیپاز سودوموناس کاپاسیا (PCL) (Park and Kazlauskas. 2001, Nara et al., 2002) در مایعات یونی از خانواده 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم، در ترکیب با آنیونهای BF4- ، PF6-، TfO- و NTf2- دارای فعالیت کاتالیتیک هستند. نتایج اولیه در این قبیل کارها معمولا تکرارپذیر نبود و این به دلیل حضور ناخالصی باقی مانده طی فرآیند تهیه مایعات یونی بود. لیپازها واکنشهای ترانساستریفیکاسیون را در این مایعات یونی با بازده قابل مقایسه با واکنشهای انجام شده در ترت- بوتیل الکل (Madeira Lau et al., 2000)، دیاکسان (Nara et al., 2002)، یا تولوئن (Park and Kazlauskas 2001) را کاتالیز کردند.
لیپاز A کاندیدا آنتراکتیکا (CALA) به عنوان یک استثناء در محیط مایعات یونی [C4MPy][BF4] و [C4MIM][NTf2] 10 برابر فعالتر از محیط دیایزوپروپیلاتر (DIPE) (Schofer et al., 2001) بود. مایعات یونی خارج از خانوادههای 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم به ندرت در فرآیند بیوکاتالیز مورد استفاده قرار گرفتهاند.
لیپازهای مختلفی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی مورد بررسی قرار گرفته اند که از این میان میتوان آنزیمهای لیپاز CALB (Lozano et al., 2003)،PCL (Itoh et al., 2003)، ASL (Schofer et al., 2001)، CALA، RML و TLL (Schofer et al., 2001) را نام برد. برای مثال دو آنزیم RML و TLL فعالیت خود را در مایع یونی [C4MIM][NTf2] حفظ کردند در حالی که در دو مایع یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] غیرفعال شدند (Schofer et al., 2001).
لیپاز CRL به طور معمول در محیطهای بدون آب فعالیت کمی دارد. بر اساس مطالعات انجام شده در رابطه با کاتالیز واکنشهای مختلف، این آنزیم در مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] فعالیت خود را حفظ میکند (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003). CRL در [C4MIM][PF6] بهترین فعالیت خود را در حضور حداکثر 4/0 مولار آب (یا 5/0=aw براساس سایر گزارشات (Ulbert et al., 2004) نشان میدهد. همچنین گزارش شده است که CRL واکنش استریفیکاسیون را در محیط بدون آب [C4MIM][PF6] بهتر از محیط ایزواکتان کاتالیز میکند (Yu et al., 2005).
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003)و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای [MeSO4] (Schofer et al., 2001)، [NO3] (Kaar et al., 2003)، [AcO] یا [lactate] (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است. آب نیز چنین عملکردی دارد اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند، و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کوئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی
در گزارشی از لیو و همکاران فعالیت و ساختار آنزیم لیپاز CRL انکوبه شده در 17 نوع مایع یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که انتخاب نوع آنیون اثر مهمتری بر فعالیت آنزیم در واکنش استریفیکاسیون داشته است و مایعات یونی محلول در آب اثر منفی بر فعالیت آنزیمی داشتهاند. مطالعات ساختاری این گروه با روش FTIR تا حدودی تغییرات ساختاری مرتبط با تغییرات فعالیت آنزیم را نشان داد. هرچند افزایش فعالیت دیده شده در برخی موارد را نمیتوان با دادههای تجربی حاصل از بررسی ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسی ساختاری آنزیم لاکاز در مخلوط آبی مایعات یونی [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهای CD و فلورسانس اثر مثبت مایع یونی [C4MA][TfO] بر پایداری ساختاری آنزیم نسبت به دو نوع دیگر نشان داده شد. در این مطالعه نتایج مطالعات ساختاری با نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاری دیگری به کمک فلورسانس و FTIR اثر مایعات یونی ایمیدازولیومی محلول در آب بر ساختار دو آنزیم α- آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس و آمیلولیکوئی فاسینس مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی نشان داد که آنزیم α- آمیلاز در محیط بافری و محلول آبی مایع یونی [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره میشود. در حالیکه محلول آبی مایع یونی [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهای مانع از دناتوره شدن آنزیم میشود (Dabirmanesh et al., 2011).
اهداف
بررسی اثر مایعات یونی مختلف روی پایداری و فعالیت آنزیمهای لیپاز تا حدودی انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهای مختلف زنجیره کاتیونی مایعات یونی روی آنزیم و بررسی چگونگی تغییر ساختار آنزیم و اثر آن بر فعالیت آنزیمی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنین با توجه به اثرات متفاوت مایعات یونی بر روی آنزیمهای مختلف، در این پژوهش اثر مایعات یونی روی آنزیم لیپاز TTL، یک آنزیم گرمادوست با پتانسیل کاربردهای صنعتی، مورد بررسی قرار میگیرد. بنابراین اهداف این پژوهش عبارتند از:
بررسی اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
بررسی اثر مایعات یونی با کاتیون و آنیونهای مختلف بر پایداری دمایی آنزیم TTL
مطالعه پایداری دمایی بر اساس تغییر در ساختار سوم آنزیم TTL در حضور و عدم حضور مایعات یونی
فرضیه
با استفاده از مایع یونی مناسب به عنوان محیط واکنش میتوان به پایداری بیشتر و فعالیت بهتری از آنزیم دست یافت.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- ابزار
انواع ظروف و لوازم آزمایشگاهی (ارلن، بشر، پلیت، بورت، کندانسور و غیره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کیسه دیالیز
استیرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پدیده نوژن پارس)
بن ماری (ریحان طب)
آون خلاء
سیستم تغلیظ پروتئین و فیلتر مربوطه (Amicon)
هود لامینار (ژال تجهیز)
انکوباتور (ریحان طب)
شیکر انکوباتور (Vision)
سانتریفوژ (Sigma 16-P)
سانیکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ریحان طب)
پمپ پریستالتیک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)
3-2- مواد
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی
آلکیل هالید ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متیل ایمیدازولیوم (Merck)
آمونیوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دی اتیل اتر (Panreac)
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL
3-2-2-1- سوش باکتری
باکتریxL1blue E.coli (جهت تکثیر پلازمید حاوی ژن لیپاز)
باکتری E.coli BL21 (جهت بیان پروتئین)
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون
پلازمید حاوی ژن لیپاز درون سلولی TTL (pQE-TTL)
KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استریل
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی
تریپتون، عصاره مخمر، نمک سدیم کلرید (Merck) (جهت تهیه محیط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتی بیوتیک آمپی سیلین
ایزوپروپیل β-D- تیوگالاکتوزید (IPTG) (سیناژن)
آنزیم لیزوزیم (CinnaGen)
بافر تریس (Merck)
سدیم فسفات (Merck)
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز
رزین Q- Sepharose
رزین Gel filtration
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE
رنگ کوماسی بلو G-250 و R-250
فسفریک اسید و استیک اسید گلاسیال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکریل آمید و بیس آکریل آمید (Merck)
TEMED(N,N,N,N'-tetramethylenediamine)
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) (Merck)
آمونیوم پرسولفات (APS)
2- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومین سرم گاو (BSA)
بافر تریس و گلایسین (Merck)
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز
سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (Sigma)
استونیتریل (Merck)
بافر تریس (Merck)
3-2-4- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طیف های فلورسانس)
3-3- روشها
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید
در این پژوهش جهت تهیه مایعات یونی از میزان مول برابر از آلکیل هالید و متیل ایمیدازولیوم استفاده شد. در این روش متیل ایمیدازولیوم قطره قطره در فواصل زمانی مساوی به آلکیل هالید که در حال بهم خوردن شدید بود اضافه شد و محلول نهایی در حال بهم خوردن شدید به مدت 24 ساعت در دمای °C 50 رفلاکس شد (شکل3-1). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دی اتیل اتر شستشو داده شد تا مواد آلی واکنشگر باقیمانده حذف شود. مرحله شستشو 10 تا 15 بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دی اتیل اتر به مایع یونی و بهم زدن شدید آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مایع یونی و دی اتیل اتر از هم جدا شوند. سپس مایع یونی شسته شده به مدت 24 ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دی اتیل اتر آن کاملا تبخیر شود.

شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات
در این مرحله میزان مول مساوی از نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات در مقداری آب حل شد و سپس محلول نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبی مایع یونی دارای آنیون برومید در حال بهم خوردن شدید اضافه گردید. سپس به مدت 24 ساعت در دمای اتاق محلول روی استیرر بهم خورد تا واکنش جایگزینی آنیون به خوبی انجام شود. در مرحله بعد شستشوی مایع یونی جدید با آب جهت جداسازی آنیون برومید انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نیترات نقره نبود یون برمید را در مایع یونی PF6- دار تایید کرد. سپس مایع یونی PF6- دار بدست آمده به مدت 24 ساعت برای حذف آب موجود در محیط در آون خلاء در دمای °C 70 قرار داده شد. مایع یونی ساخته شده در ظرف درب دار نگهداری شد.
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli
در این پژوهش از محیط کشت Luria Bertani (LB) برای رشد سویههای اشرشیاکلی به صورت مایع و جامد (حاوی آگار) استفاده گردید. همچنین در محیط کشت سوشهای حامل ساختار پلاسمید از آنتیبیوتیک آمپیسیلین با غلظت نهایی µg/ml 100 استفاده شد. جدول 3-1 نشان دهنده ترکیبات محیط کشت Luria Bertani است. شایان ذکر است که آنتی بیوتیک پس از استریل شدن محیط کشت توسط اتوکلاو و رسیدن دمای محیط کشت به حدود C° 50 اضافه میگردد.
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani
ترکیب غلظت
عصاره مخمر 5/0 درصد
تریپتون 1 درصد
NaCl 1 درصد
آگار (محیط کشت جامد) 2 درصد
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی:به منظور تهیه سلولهای مستعد برای عمل ترانسفورماسیون (انتقال پلاسمید به داخل سلول)، ابتدا یک کشت خطی از سلولهای ذخیره شده مورد نظر در ازت مایع بر روی پلیت LB تهیه و یک شب در گرمخانه Cº 37 قرار داده میشود. سپس یک کلنی از روی پلیت برداشته و در شرایط استریل به 25 میلی لیتر محیط کشت مایع LB افزوده و به مدت 4 الی 6 ساعت در دمای cº37 با حرکت دورانی rpm180رشد داده میشود تا تراکم سلولها در محیط کشت به جذبی ما بین 4/0 تا 6/0 در طول موج 600 نانومتر برسد. سلولها را در دمای ºC 4 به مدت 10 دقیقه در g4000 سانتریفوژ کرده و آنها را در5/2 میلیلیتر محیط خاص مناسب برای تهیه ی این نوع سلولها به نام محیط TSB که طبق جدول3-2 تهیه گردید، به صورت معلق در میآوریم. لازم به ذکر است که در این حالت غلظت سلولی به میزان 10 برابر افزایش داده میشود. سپس سلولهای معلق شده را به مدت 10 الی 60 دقیقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروی یخ قرار میدهیم. محصول سلولی حاصل را در مقادیر 200-100 میکرولیتری در لولههای اپندروف استریل تقسیم کرده و بلافاصله در ازت مایع قرار میدهیم. این سلولها را میتوان در فریزر cº80- نگهداری کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الی دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها یک بار میتوان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد :بین 1 تا 10 میکرولیتر بسته به غلظت محلولDNA موجود (معادل 1-1/0 میکروگرم) پلاسمید، در شرایط استریل در یک لوله اپندروف ریخته وبه آن پنج میکرولیتر از بافر KCM 5X که طبق جدول3-3 تهیه گردید، افزوده و با آب مقطر استریل به حجم lµ25 میرسانیم. مخلوط در یخ نگهداری میشود. حال سلول مستعد را از فریزر ºC80- خارج و اجازه میدهیم تا ذوب شود . 25 میکرولیتر از سلول مستعد را به محلول حاوی پلاسمید افزوده و به مدت 15 الی 20 دقیقه در دمای ºC4 قرار میدهیم. سپس در دمای ºC 42 به مدت 105 ثانیه گرمادهی شده که در این مرحله، ملکولهای DNA بر روی سطح سلول ها رونشینی شده و به درون سلول منتقل خواهند شد . بلافاصله سلولها را به درون یخ منتقل کرده و به آنها 100 میکرولیتر محیط LB سرد استریل و بدون آنتیبیوتیک،اضافه و به مدت یک ساعت در دمای Cº37 و حرکت دورانی مناسب قرار میدهیم. در نهایت 150 میکرولیتر محیط حاصل را بر روی پلیت حاوی محیط کشت انتخابی برده و با استفاده از لوپ شیشهای استریل به آرامی بر روی تمامی سطح پلیت بطور کامل و یکنواخت پخش میگردد . پس از جذب سلولها بر روی سطح پلیت، پلیتها به صورت وارونه در گرمخانه cº37 به مدت 16 ساعت قرار داده میشوند.
لازم به ذکر است که این پلیتها، حاوی آنتیبیوتیک خاصی است که ژن مقاومت مربوطه بر روی پلاسمید مورد نظر وجود دارد و در نتیجه تنها سلولهایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند قادر به رشد بر روی محیط انتخابی هستند.
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSBترکیبات مورد نیاز مقدار
Luria Bertani 75 (ml) 2X
DMSO 5/7 (ml)
PEG 400 3/13 (ml)
MgSo4 5/1 (ml)
MgCl2 5/1 (ml)
ddH2O 3/51 (ml)
Total valume 150 (ml)
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCMغلظت مناسب برای تهیه محلول 5X ترکیبات مورد استفاده
(M) 5/0 KCl
(M) 15/0 CaCl2
(M) 25/0 MgCl2
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری
برای تهیه استوک از باکتریهای حاوی ساختار پلاسمید، ابتدا از باکتری مورد نظر کشت یک شبه گذاشته شد. سلولها به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند و سوپ رویی دور ریخته شد. سپس به نسبت 1:1 گلیسرول استریل 50% به محیط کشت LB اضافه شد. آنگاه رسوب سلولها در 15 حجم اولیه محیط کشت، از این محلول حل شدند. در آخر آمپیسیلین با غلظت نهایی μg/ml 100 به سلولها اضافه شد و در C°20- ذخیره گردید.
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب
کلنی مورد نظر از بین باکتریهای ترانسفورم شده انتخاب شد و به محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک آمپیسیلین (μg/ml100) انتقال یافت. پس از رشد باکتری به مدت 16 ساعت در دمای °C 37، کشت 1 درصد تلقیح از نمونه باکتری رشد کرده، در حجم ml 20 محیط LB با آمپی سیلین ایجاد شد. پس از گذشت 4 ساعت از کشت اولیه باکتری ها در دمای °C 37، زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، با افزودن IPTG (با غلظت نهایی mM 1) به محیط های کشت بیان پروتئین نوترکیب القا شد و با کاهش دمای انکوباتور به °C 30 شرایط برای تولید آنزیم نوترکیب توسط باکتریها فراهم شد. پس از گذشت 5 ساعت از زمان القا، سلول های باکتری به کمک سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در 110 حجم اولیه، در بافر تریس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت 16 ساعت در °C 20- فریز شدند.
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
در این بخش بهینهسازی بیان پروتئین نوترکیب ابتدا با انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان TTL بر اساس میزان فعالیت آنزیمی عصاره سلولی و سپس بهینه سازی زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
ساختار پلاسمید حاوی ژن آنزیم TTL به روش گفته شده در بخش 3-3-2-2 به درون باکتری منتقل شد. سپس با لیز باکتریها پروتئینهای درون سلول جدا شدند (بخش 3-3-2-5) و سنجش فعالیت آنزیمی در مورد هرکدام از نمونهها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش 3-3-6). از بین 6 کلنی ترانسفورم شده بر اساس میزان توانایی تولید آنزیم 1 کلنی انتخاب شد و به صورت غلیظ شده در دمای°C 20- ذخیره گردید و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمانهای مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئینهای محلول درون سلول و میزان پروتئینهای موجود دراجسام نامحلول و پروتئینهای در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمانهای مختلف پس از القا، میتوان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپیسیلین، 1% تلقیح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتریها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، ابتدا ml1 از باکتریها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونهبرداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداری شد.
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتریها با استفاده از دستگاه سانیکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی 1 دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت 4 دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین


در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفوردمواد مورد نیاز مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250 1/0 گرم
اتانول 95% 50 میلیلیتر
فسفریک اسید 85% 100 میلیلیتر
در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیلآلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد میشود که شدت این رنگ در غلظتهای کم پروتئین نزدیک به قهوهای و در غلظتهای بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در 595 نانومتر خوانده میشود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازهگیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههای حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی 100 میکرولیتر، رقتهایی تهیه کرده و یک میلیلیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گردید. طی مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS(SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئینها و پپتیدها بکار میرود. قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلیاکریل آمید در غربال پروتئینهای مختلف است. در این روش پروتئینها بر اساس اندازه از هم جدا میشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرایط احیا، این ملکولها خطی شده و SDS به آنها بار منفی میدهد، که میزان بار منفی بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئینها به این صورت بر اساس اندازهشان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعتهای متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا میشوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفورزمحلول استوک اکریل آمید (8/30 %): 30 گرم اکریل آمید و 8/0 گرم بیس اکریل آمید در حدود 50 میلیلیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به 100 میلیلیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده): این بافر دارای غلظت 5/1 مولار تریس با 8/8~pH است. برای تهیه آن 2/18 گرم تریس- باز در حدود 70 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/8 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده): این بافر دارای غلظت 5/0 مولار تریس با 8/6~pH است. برای تهیه آن 1/6 گرم تریس باز در حدود 50 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/6 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تریس- باز، 2/7 گرم گلیسین و 5/0 گرم SDS در 500 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهیه گردید.
محلول رنگآمیزی: 05/0 گرم کوماسی آبی 250-R در 40 میلیلیتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 50 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول 05/0% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری میشود.
محلول رنگبر: 15 میلیلیتر متانول، 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 75 میلیلیتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگبری را تسریع میکند. با این حال باید توجه داشت که اگر ژل مدت طولانی در محلولهایی با درصد بالای متانول قرار گیرد، باندهای پروتئینی نیز بیرنگ میشوند).
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورزیک قالب شیشهای به کمک صفحات شیشهای کاملاً تمیز و فاصلهاندازها که با توجه به ضخامت مورد نیاز ژل انتخاب شده اند، ایجاد شد و با چند گیره محکم گردید. به انتهای صفحات شیشهای به اندازه 2/0 سانتیمتر آگار مذاب 5/0% اضافه شد.
محلول ژل پایین (ژل جدا کننده): مقادیر مورد نیاز برای تهیه ژل با درصد مشخص در جدول 3-6 آورده شده است. پس از افزودن مواد، محلول را به سرعت بهم زده و با دقت در قالب شیشهای تا ارتفاع مناسبی ریخته شد، به طوریکه حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل بالا باقی ماند. سپس به آرامی از کناره شیشه روی سطح ژل اتانول اضافه گردید (این کار به منظور صاف شدن ژل و جلوگیری از چین خوردن در اثر خشک شدن به دلیل تماس هوا با آن است). انعقاد ژل پایین معمولاً 45-15 دقیقه طول میکشد.
محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده) طبق جدول 3-6 تهیه شد ، بعد از انعقاد ژل پایین، اتانول روی ژل پایین کاملاً خالی شد و پس از تهیه محلول ژل بالا و هم زدن آن، سریعاً تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین ریخته شد. سپس شانه در ژل بالا قرار گرفت، به صورتی که حدود 5/1 سانتیمتر از سطح ژل پایین فاصله داشت. انعقاد ژل بالا حدود 45-60 دقیقه طول میکشد.
پس از خارج ساختن فاصلهانداز پایین از حد فاصل شیشهها، قالب شیشهای با چند گیره به تانک الکتروفورز متصل گردید و مخازن بالا و پایین تانک با بافر الکتروفورز پر شد (به وسیلهی یک سرنگ حبابهای هوا در حد فاصل شیشهها خارج شد)، سپس شانه به آرامی خارج و درون چاهکها با تزریق بافر الکتروفورز تمیز گردید.
برای آماده سازی نمونههای پروتئینی، یک حجم بافر نمونه به 3 حجم نمونهی پروتئین حاوی 6 تا 20 میکروگرم پروتئین اضافه شد (بافر نمونه 4x) و به مدت 5 دقیقه در دمای ˚C 100 قرار داده شد. سپس حجم مناسبی از آن (حداکثر 40 میکرولیتر) به کمک سمپلر وارد چاهک شد.
کابلها به الکترودهای مربوطه وصل گردید. برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان 30-20 میلیآمپر برای یک مینی ژل مناسب است. در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، ولتاژ 150-100 ولت مناسب میباشد. جریان برق قبل از رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع شد (حدود 5/2-5/1 ساعت).
بعد از قطع جریان، قالب شیشهای از تانک جدا گردید و با فرو بردن یک فاصلهانداز به حد فاصل شیشهها و حرکت آرام آن، شیشهی بالا برداشته شد و سپس ژل درون یک ظرف مناسب قرار گرفت.
حجم کافی از محلول رنگ (100 میلیلیتر) به ژل اضافه شد.
محلول رنگ تخلیه و سپس ژل را شسته و حجم مناسبی از محلول رنگبر (100 میلیلیتر) به آن اضافه گردید. اگر زمینهی ژل تیره بود تا شفاف شدن آن از محلول رنگبر تازه استفاده میشد تا باندهای پروتئینی به وضوح دیده شوند.

user8304

عنوان صفحه
فهرست مطالبهشت
فهرست اشکالده
فهرست جداولیازده
چکیده1
فصل اول: مقدمه
مقدمه.............................................................................................................................................................................................................................2
1-1مقدمه.......................................................................................................................................................................................................................2
1- 2هدف از مطالعه.......................................................................................................................................................................................................4
فصل دوم:کلیات و مرور منابع
2-1کلیات....................................................................................................................................................................................................................5
2-2 فلزات سنگین........................................................................................................................................................................................................6
2- 2- 1منشأ فلزات سنگین...........................................................................................................................................................................................8
2- 2-2 اثرات فلزات سنگین بر سلامت آبزیان..............................................................................................................................................................9
2- 3 کادمیوم، منشأ و منایع آن در محیط زیست.........................................................................................................................................................10
2- 4 مسیر های جذب...............................................................................................................................................................................................11
2- 5 آبشش...............................................................................................................................................................................................................11
2- 6 کبد، روده،کلیه.................................................................................................................................................................................................12
2-7 سایر مسیرهای جذب..........................................................................................................................................................................................13
2- 8 تاثیر متقابل فلزات سنگین بر یکدیگر.................................................................................................................................................................13
2- 9 عوامل موثر در قابلیت دسترسی ماهیان به فلزات سنگین......................................................................................................................................13
2- 10مسمویت.............................................................................................................................................................................................................14
2-11مسمومیت و بیماریهای ناشی از کادمیوم در ماهیان..............................................................................................................................................14
2- 12مرور منابع...........................................................................................................................................................................................................16
فصل سوم: مواد و روشها
3- 1 منطقه نمونه برداری...........................................................................................................................................................................................19
3- 2معرفی ماهی نازک.............................................................................................................................................................................................20
3-3 انتقال ماهیان به سالن آکواریوم جهت سازگاری....................................................................................................................................................20
3-4 اندازه گیری فاکتورهای فیزیکوشیمیایی..............................................................................................................................................................21
3- 5 ساخت محلول ذخیره کادمیوم......................................................................................................................................................................... 21
-198783-5883973-6 آنالیزهای خونشناسی...........................................................................................................................................................................................22
3-6-1 اندازهگیری هموگلوبین...................................................................................................................................................................................22
2724785640080هشت
00هشت
3-6-2 اندازهگیری هماتوکریت..............................................................................................................................................................................22
-261257-4868883-6-3 شمارش گلبول قرمز.......................................................................................................................................................................................22
3- 7 شاخصهای ثانویه خونشناسی..............................................................................................................................................................................23
3- 7-1 حجم متوسط گویچه قرمز (MCV).................................................................................................................................................................23
3-7-2 میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای (MCHC).....................................................................................................................................................23
3-7-3 آنالیز شیمیایی میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH).............................................................................................................................................23
3-8 شمارش گلبول سفید................................................................................................................................................................................................23
3- 9 نمونه برداری برای مطالعه بافتشناسی..................................................................................................................................................................24
3-10 تهیه مقطع بافتی.....................................................................................................................................................................................................24
3-10-1 مرحله آبگیری و شفاف سازی..........................................................................................................................................................................24
3-10-2 مرحله قالب گیری..........................................................................................................................................................................................25
3- 10-3 برش وتهیه لام.................................................................................................................................................................................................25
3-10-4 رنگ آمیزی.....................................................................................................................................................................................................25
3-10-5 کمی سازی آسیب بافتی...................................................................................................................................................................................25
3-11 آنالیز تجمع زیستی آماده سازی نمونه های آبشش و جهت .................................................................................................................................30
3-12 جذب اتمی.........................................................................................................................................................................................................30
3-13 تحلیل آماری.......................................................................................................................................................................................................31
فصل چهارم: نتایج و بحث
۴- ۱ شاخصهای زیستی ماهیان و پارامترهای فیزیکوشیمیایی آب...............................................................................................................................32
۴-2 پارامترهای خونشناسی........................................................................................................................................................................................33
۴- 3 شاخصهای ثانویه..............................................................................................................................................................................................36
۴-4 تعداد گلبولهای سفید خون................................................................................................................................................................................38
۴-5 نتایج تجمع زیستی..............................................................................................................................................................................................40
۴-6 تغییرات هیستوپاتولوژیک آبشش.........................................................................................................................................................................42
4-7 تغییرات هیستوپاتولوژیک کبد..............................................................................................................................................................................48
فصل پنجم: نتیجهگیری و پیشنهادها
5- 1 نتیجهگیری......................................................................................................................................................................................................52
5-2 پیشنهادها..............................................................................................................................................................................................................53
منابع............................................................................................................................................................................................................................54
27825702593340نه
00نه
2877185228536500
5653377-659958-292293-597342
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل2-1 چرخه زیستی فلزات سنگین در موجودات زنده.............................................................................................................................................8
شکل3- 1 تصویری از موقعیت چشمه دیمه19
شکل 3-2 ماهی نازک20
شکل۴-1 تغییرات پارامترهای اولیه خونشناسی34
شکل ۴-2 تغییرات پارامترهای ثانویه خونشناسی37
شکل۴-3 تعداد گلبولهای سفید در تیمارهای آزمایشی38
شکل۴- 4 میزان تجمع کادمیوم بافت آبشش ماهی نازک...........................................................................................................................................40
شکل۴-5 تغییرات بافتی مشاهده شده در آبشش ماهی نازک........................................................................................................................................43
شکل۴-6 میانگین میزان تغییرات شاخص Iorg بافت آبشش ماهی نازک....................................................................................................................45
شکل۴-7 تغییرات بافتی مشاهده شده در کبد ماهی نازک............................................................................................................................................48
شکل۴-8 میانگین میزان تغییرات شاخص Iorg بافت کبد ماهی نازک........................................................................................................................50
2853055546100ده
00ده

-294198-556591-85090-91376500فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 2-1 انواع فلزات سنگین و شدت سمیت آنها8
جدول 3-1 روش ارزیابی آسیبشناسی بافتها............................................................................................................................................................29
جدول4-1 پارامترهای فیزیکوشیمیایی آب....................................................................................................................................................................32
جدول 4-2 درجه بندی نیمهکمی آسیب آبشش ماهی نازک.......................................................................................................................................44
جدول4-3 درجه بندی نیمهکمی آسیب کبد ماهی نازک.............................................................................................................................................49
28545186093239یازده
00یازده

-294198-5009325716988-500932
-295275-533400-460982-598584چکیده
بوم سازگان آبی هر روزه، دریافت کننده حجم وسیعی از آلایندههایی همچون فلزات سنگین، هیدروکربنها، آفتکشها و مواد آلی هستند. هدف از انجام این تحقیق بررسی اثرات کلرید کادمیوم بر برخی شاخصهای خونشناسی و بافتشناسی ماهی نازک Chondrostoma regium است. به این منظورتعداد 100 قطعه ماهی نازک از یکی از سرشاخههای زایندهرود صید و به آزمایشگاه منتقل شد. ماهیان در گروههای صفر(گروه شاهد)، 5/0، 5/2، 5/7 میکروگرم بر لیتر کلرید کادمیوم قرار گرفتند. در طی آزمایش فاکتورهای فیزیکوشیمیایی آب شامل اکسیژن محلول، درجه حرارت، pH، قلیائیت و سختی سنجش شد. در پایان دوره آزمایش، خونگیری از ساقه دمی ماهیان صورت گرفت و شاخصهای مرسوم خونشناسی بررسی شد. بافت کبد و آبشش نیز در پایان روز 14 به منظور مطالعات آسیب شناسی بافتی در فرمالین 10% تثبیت شد. به منظور ارزیابی میزان تجمع کادمیوم، پس از آمادهسازی و هضم نمونههای بافت آبشش مقدار فلز سنگین کادمیوم با استفاده از دستگاه جذب اتمی شعلهای تعیین گردید. نتایج نشان داد که تعداد گلبولهای قرمز در غلظت 5/0 میکروگرم در لیتر کادمیوم نسبت به گروه شاهد افزایش یافت. میزان هموگلوبین و هماتوکریت در غلظت 5/7 میکروگرم بر لیتر کادمیوم نسبت به گروه شاهد کاهش نشان داد. همچنین آنالیزهای مربوط به پارامترهای ثانویه خونشناسی شامل حجم متوسط گلبول قرمز (MCV) و میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH) نشاندهنده کاهش این دو پارامتر در غلظت 5/0 میکروگرم بر لیتر کادمیوم نسبت به گروه شاهد بود. بیشترین تجمع فلز سنگین در غلظت 5/7 میکروگرم در لیتر کادمیوم مشاهده شد که معادل 136/0± 8/2 بر حسب میکروگرم برگرم وزن خشک ماهی بود. مهمترین تغییرات ایجاد شده در بافت آبشش شامل هایپرپلازی، چماقی شدن و همجوشی بود. در بافت کبد پرخونی، پیکنوزیس هستهای و نکروز کانونی مشاهده شد. به طور کلی نتایج نشان داد که به جز میانگین غلظت هموگلوبین (MCHC)، در سایر فاکتورهای ثانویه خونشناسی تفاوت معنیداری(p<0/05) با گروه شاهد مشاهده شد. همانگونه که در فاکتورهای اولیه خونشناسی نیز تفاوت معنی دار با گروه شاهد نشان داده شد(p<0/05). شدت تغییرات وارده به بافت آبشش و کبد متناسب با افزایش غلظت کلرید کادمیوم، افزایش یافت به طوریکه بیشترین تغییرات آسیب شناسی در ماهیان تیمار شده با غلظت 5/7 میکروگرم بر لیتر کلریدکادمیوم در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد. این نتایج بیانگر اثر کادمیوم در ایجاد تغییرات فاکتورهای خونشناسی و آسیب شناسی بافت آبشش و کبد است.
کلمات کلیدی: ماهی نازک Chondrostoma regium،کادمیوم، پارامترهای خونشناسی، تجمع، آبشش، کبد.
-262393-17468025701085-1977390فصل اول
مقدمه
1-1 مقدمه
اکوسیستمهای آبی هر روزه، دریافت کننده حجم وسیعی از آلایندههایی همچون فلزات سنگین، هیدروکربنها، آفتکشها و مواد آلی ناشی از فاضلابهای خانگی، صنعتی، معدنی، کشاورزی هستند. این مواد پس از ورود به اکوسیستم آبی موجب آلودگی و تجمع در بدن موجودات آبزی میشوند. در چنین شرایطی برآورد اثرات این آلایندهها بر بوم سازگان آبی، امری کاملاً ضروری است چرا که تغییرات شیمیایی، تعادل بوم سازگان را بر هم زده و از عملکرد درست آن، ممانعت مینماید ]44[. فلزات سنگین از منابع طبیعی و غیرطبیعی به طور پیوسته وارد اکوسیستمهای آبی میشوند و به دلیل مسمویت، حضور طولانی،آلودگی موجودات زنده و حضور در زنجیره غذایی موجودات زنده، تهدیدی جدی برای اکوسیستم به شمار میروند. گزارشهای متعددی در مورد مرگ و میر آبزیان در منابع آبی داخلی و یا دریایی به دلیل ورود آلایندههای فلزات سنگین وجود دارد. به طور معمول بعضی از فلزات سنگین گرچه به میزان بسیار کم، برای انجام فعالیتهای طبیعی فیزیولوژیک بدن انسان و پستانداران و نیز آبزیان ضروری هستند اما زمانی که غلظت فلزات سنگین در محیط از حد مجاز فراتر رود و یا به طور مستمر وارد محیط زیست ماهیان و سایر آبزیان شوند، ماهیان با جذب آنها به طریق مستقیم و یا غیرمستقیم و ذخیره سازیشان در اندامهایی مانند آبشش، کبد و کلیه دچار نوعی مسمومیت مزمن میشوند و در صورت استمرار، علایم ویژه این نوع مسمومیتها را نشان میدهند.

چنین رخدادی در انسان به دلیل برداشت یکباره و زیاد فلزات سنگین تجمع یافته در ماهیچههای ماهی، ممکن است علائم حاد مسمومیتها را نشان دهد و افراد مسموم علائم کلینیکی و اختلالات فیزیولوژیک مربوط به عنصر مربوط را به طور خاص نشان میدهند]9[. فلزات سنگین به عنوان یکی از گروههای اصلی آلاینده محیطهای آبی در اثر فعالیتهای طبیعی و نیز به طور عمده در اثر فعالیتهای انسانی به محیط های آبی راه می یابند]66[. این فلزات با تجمع در بافتهای ماهیان، تغییراتی را در سطوح مختلف عملکردی آنها ایجاد مینمایند و امروزه از ماهیان به عنوان شاخصهای زیستی حساس در بحث ارزیابی کیفیت محیطهای آبی استفاده میشود که میتوانند اطلاعات ما را در خصوص نوع و میزان آلاینده و نیز مکانیزمهای سمیت آن ها در بومسازگان آبی افزایش دهد]107[. در بررسیهای انجام شده، فلزات سنگین در ماهیان میتوانند موجب تغییرات رفتاری،تغییر در استراتژی تغذیه، الگوی شنا، فرار شکار و شکارچی، تولیدمثل، یادگیری، استرسهای تنفسی]45[، تغییر رشد]69[، تغییر شاخصهای خونی]32، 108، 109[، اختلال در تنظیم اسمزی]55[، تغییر در بیان ژن متالوتیونین]34[، مقدار هورمون کورتیزول]89[ و آسیبهای بافتی ]97[ گردد.
همانطور که گفته شد فاضلابهای صنعتی و شهری و پسابهای کشاورزی هرکدام حاوی مقادیر متنابهی فلزات سنگین هستند که این مواد پس از ورود به اکوسیستم آبی موجب آلودگی و تجمع در بدن موجودات آبزی میشوند]44[. سنجش فلزات سنگین موجود در آبزیان ممکن است تصویر بهتری از خطرهای متوجه انسان را نسبت به اندازهگیری آنها در محیط زیست فیزیکی یا گیاهان نشان دهد. برای ارزیابی میزان سمیت آلایندههای محیطی شاخصهای فیزیولوژیکی متفاوتی در ماهیها وجود دارد که از جمله آنها شاخصهای خونشناسی است. به دلیل اینکه سیستم گردش خون و محیط خارجی با یکدیگر در ارتباط هستند، متغیرهای خون شناسی برای تشخیص اثرات مواد سمی استفاده میشود. پارامترهای خونی غیرنرمال میتواند بیانگر نغییرات شرایط فیزیکی و شیمیایی آب باشد، لذا ماهی به عنوان یک شاخص هشدار دهنده در تشخیص حضور نامطلوب آلاینده در آب استفاده میشود]76[.
بافتشناسی نیز ارزیابی کاملی از سلامتی موجود زنده فراهم میکند و به طور موثری اثرات مواجهه با آلایندههای محیطی را انعکاس میدهد. لذا میتوان با بررسی بافتها، اثرات سمی فلزات سنگین را مورد مطالعه قرار داد. بافت آبشش، کبد، روده و کلیه ماهیان اندامهای مناسب برای مطالعات بافتشناسی در محیطهای آلوده به فلزات سنگین هستند]62[. از آنجا که آبششها اولین مکان بعد از پوست است که در معرض مستقیم سموم یا آلایندهها قرار دارند، بنابراین بررسی تغییرات ساختار آبشش شاخص مناسبی برای سموم یا آلایندهها است. آبشش ماهیها به عنوان اندام مبادله گاز، تنظیم اسمزی، تنظیم اسید-باز، دفع مواد زائد نیتروزنی و تنظیمات درونریز است و به دلیل داشتن سطح وسیع و لایه اپیتلیالی نازک، یکی از راههای جذب مواد سمی محیطی مانند کادمیوم است]37[.کبد نیز به عنوان بافت خونساز یکی از مهمترین بافتهای جانوری است که تحت تاثیر فلزات سنگین دچار عوارض نامطلوبی میگردد.با توجه به نقش کبد در سم زدایی و نگهداری هموستاز متابولیک بدن، میتوان از این بافت نیز به عنوان شاخص مناسبی در مطالعات بافت شناسی نام برد]31[.
از دیدگاه بومشناسی ماهیانی که دچار مسمومیت با فلزات سنگین هستند در حالتهای شدید احتمال خطر حذف جمعیت آنها وجود دارد. جذب کادمیوم از طریق آب در جانوران آبزی به عواملی همچون دمای آب، محتوای اکسیژن، pH آب و غلظت یونهای کلسیم و منیزیم موجود در آب بستگی دارد. از سوی دیگر، کادمیوم موجود در طعمهها میتواند نقش مهمی در تجمع این عنصر در بافتهای ماهی داشته باشد]9[.کادمیوم تقریباً درتمام بافتها واندامها مثل کبد، کلیه،آبشش و روده به نسبت بالاتر و در بافت ماهیچه به مقدار کمتر تجمع مییابد]75[. از سوی دیگر میتوان بیان نمودکه تغییرات بافت شناسی در مقایسه با تغییرات تولید مثلی و رشد و نمو حساستر است و زودتر هم رخ میدهد و به دنبال آن این عنصر باعث تغییرات هیستوپاتولوژیک در بافتهایی نظیر آبشش، کبد، کلیه و روده میگردد و نهایتاً فعالیت فیزیولوژیک آنها را مختل مینماید، در نتیجه ارزیابی بهتر از سلامت ماهی و اثرات آلودگی نسبت به پارامترهای بیوشیمیایی فراهم میکند. در صورت وجود یون کادمیوم در آب، ماهیان آبهای شیرین در مقایسه با ماهیان دریایی،کادمیوم بیشتری را طریق آبشش به درون بدن انتقال میدهند]90[. مطالعات نشان داده است،گرچه فاکتورهای محیطی نظیر دما، اکسیژن، شوری،pH و سختی نقش مهمی در تجمع فلزات ایفا میکند، اما تجمع فلزات سنگین در بافت عمدتاً به غلظت فلز موجود در آب و دوره قرارگیری در برابر آن بستگی دارد. نیازهای اکولوژیک، جنس، اندازه وپوست اندازی موجودات آبزی هم چنین درتجمع فلز در بافت اثردارند ]44[.
1-2 اهداف
در این پژوهش تلاش گردید تا اهداف زیر پوشش داده شود:
بررسی تاثیرات فلز سنگین کادمیوم بر برخی ویژگیهای خونشناسی ماهی نازک.
اندازهگیری مقادیر فلز سنگین کادمیوم در بافت آبشش.
ارزیابی تغییرات هیستوپاتولوژیک بافت آبشش و کبد در مواجهه با غلظتهای تحت کشنده کادمیوم در ماهی نازک.

-322525-1770656فصل دوم
کلیات و مرور منابع
2-1کلیات
نوسانات عوامل زیستی و غیر زیستی در تعادل و پایداری هر اکوسیستم نقش عمده ای دارند. وجود این عوامل در حد مطلوب، مفید بوده ولی کاهش یا افزایش زیاد آنها سبب بر هم زدن تعادل یا روابط موجود در محیط میگردد که این امر، تغییرات شدید در جمعیت موجودات زنده را به دنبال خواهد داشت. فلزات سنگین از جمله این عوامل میباشند که به طور طبیعی کمتر از ١ درصد از وزن بدن موجودات زنده را تشکیل میدهند و نوسانات غلظتی آنها سبب ناپایداری محیط و ایجاد اختلال در موجود میشود ]29[. با صنعتی شدن جوامع، حجم وسیعی از انواع مواد شیمیایی به محیط زیست وارد میشوند که این مواد از طریق فاضلاب ها، سیلابها،آبهای زیرزمینی و ورود مواد اتمسفری به اکوسیستمهای آبی راه یافته و در ستون آب و همچنین رسوبات بستر توزیع میشوند. بومسازگان آبی به دلیل تجمع غلظتهای بالای مواد شیمیایی، بهشدت حساس و آسیبپذیر شدهاند و در حقیقت این ورودی عظیم، آنها را به مخزن و انباری برای انواع مواد شیمیایی تنشزا و آلاینده تبدیل نموده است ]48[. علیرغم پیشرفتهای زیادی که در زمینه مدیریت تصفیه و پالایش مواد زائد در محیط زیست صورت گرفته، فلزات سنگین هنوز بهعنوان یک خطر جدی برای انسانها و سایر موجودات زنده محسوب میشود. زیرا این مواد بر خلاف سایر آلایندهها که میتوانند بهطورکامل بهواسطه باکتریها و میکروارگانیسمها تجزیه شده و از بین برود، قابلیت تجزیه زیستی ندارند و به نوعی غیر قابل تجزیه هستند]52[.
اندازهگیریهای شیمیایی فلزات سنگین در آب اگر چه بسیار حساس و دقیق است ولی اطلاعات جامع و کامل در مورد میزان قابلیت دسترسی زیستی فلزات سنگین ارائه نمیکند. از سوی دیگر کاربرد روشهای زیستی در پایش و ارزیابی آلودگی فلزات سنگین و بررسی اثرات آن بر آبزیان هدف سودمند است. در این راستا فاکتورهای زیستی در سطوح مختلف سلولی، تحت سلولی، بافت، فرد، جامعه و اکوسیستم قابل بررسی هستند. استفاده از ماهی به عنوان یک شاخص زیستی در برنامههای پایش آلودگی در اکوسیستمهای آبی در سطح گسترده سفارش میشود. سم شناسی (توکسیکولوژی) که علم مطالعه اثرات نامطلوب مواد شیمیایی تعریف میشود، از قدمت زیادی برخوردار است و در گذشته بیشتر پیرامون درک اثرات سموم بر انسان متمرکز بوده ولی امروز از دو جنبه پزشکی و زیست محیطی مد نظر است و بخش زیستمحیطی با فون و فلور موجود در محیط، جمعیتها، جوامع و نیز بومسازگان حمایت کننده آنها سروکار دارد و اغلب برای بیان اثرات مواد شیمیایی بر بومسازگان و به عبارت دقیقتر، اثرات آلایندههای شیمیایی بر فون و فلور طبیعی تعریف میشود. برای فهم اثرات ایجاد شده بر سطوح مختلف سازمان زیستی و در حجم وسیعی از موجودات زنده، باید یافتهها و نتایج حاصل از انواع مطالعات صورت گرفته بین گونههای مختلف، مورد تفسیر قرار گیرد.ماهیان در مباحث سمشناسی هر دو جنبه انسانی و محیطی از اهمیت بهسزایی برخوردار هستند. ماهیان متنوعترین و پرتعدادترین مهرهداران انواع بومسازگان آبی هستند که سطوح مختلف زنجیره غذایی را اشغال نمودهاند. با توجه به طویل بودن زنجیره غذایی آبی و نیز وجود اغلب ماهیان بهعنوان مصرفکنندگان ثانویه یا نهایی در این زنجیره، غلظت بالاتری از آلایندههای پایدار در بدن آنها مورد انتظار است که این موضوع از جنبه سلامت انسانی نیز حائز اهمیت است]9[.
2-2 فلزات سنگین
عناصر سنگین در مقابل اکثر آلایندهها در محیط زیست از بین نرفته و یک چرخه اکولوژیک را طی میکنند که از این طریق منابع آبی را تهدید میکنند. معمولاً بالاترین غلظت فلزات سنگین در محیطهای آبی و در رسوبات بستر محیط آبی یافت میشوند. بنابراین آگاهی از غلظت فلزات سنگین و پراکندگی آنها در رسوبات و بدن موجودات آبزی میتواند نقش اساسی در منابع آلودگی در سیستمهای آبی ایفا کنند. علاوه برکربوهیدراتها، لیپیدها، اسیدهای آمینه و ویتامینها برخی از فلزات سنگین برای فعالیت بیولوژیکی سلولها ضروری است. برخی از فلزات مانند آهن برای زندگی جنبه حیاتی داشته و گروهی دیگر مانند مس و روی به مقدار جزئی برای فعالیت آنزیمها ضروری هستند]22[. براساس میزان و شدت سمیت، فلزات سنگین به سه گروه سمیت ملایم، متوسط و شدید تقسیم میشوند. مهمترین فلزات با سمیت ملایم آلومینیوم، آهن، آرسنیک، کروم و منگنز، فلزات با سمیت متوسط شامل کادمیوم، روی، سرب و نیکل و فلزات دارای سمیت شدید نظیر مس، جیوه و نقره دارای کشندگی زیاد در ماهیان هستند جدول (2-1، 19). به طور کلی فلزات سنگین موجود در محیط زیست یک خطر بالقوه برای موجودات زنده به شمار میآیند. انسان و موجودات همیشه در معرض آلودگی با فلزات سنگین هستند، اینگونه فلزات با ترکیبات ضروری بدن از قبیل اکسیژن، گوگرد و ازت به صورت گروههایی از قبیل S-S، SH، OH، COO و COOH پیوند برقرار میکنند. بیشتر ترکیبات ضروری بدن از جمله آنزیمها و پروتئینها دارای چنین گروههایی است در نتیجه فلزات سنگین موجب وقفه فعالیت آنزیمها و اختلال در سنتز ترکیبات ضروری بدن میشوند ]61[.
جدول2-1 انواع فلزات سنگین و شدت سمیت آنها ]19[.
عناصر ماکرونوترینت (پرمصرف) کبالت(Co)، مس(Cu)، روی (Zn) و آهن(Fe)
عناصر میکرونوترینت (ریز مغذی) نیکل(Ni)، کروم(Cr)
عناصر با سمیت بالا کادمیوم(Cd)، سرب(Pb) و جیوه (Hg)
عناصر با سمیت حاد نقره(Ag)، طلا(Au) و پلاتین(Pt)
فلزات سنگین تغییراتی بنیادی در اکوسیستم های طبیعی ایجاد مینمایند. ورود فلزات سنگین به دریا در غلظتهای غیر معمول عمدتاً با کاهش تنوع گونهای، تولیدمثل و جمعیت موجودات آبزی همراه است. در بدن انسان نیز باعث بروز اختلالاتی در فعالیتهای حیاتی میگردد. مکانیسم سمیت فلزات سنگین، بر بدن ماهیان بسته به نوع فلز متفاوت است. فلزات سنگینی همچون کادمیوم، سرب، مس و به خصوص جیوه قادرند به اکثر ارگانیسمها حتی در غلظتهای خیلی پایین آسیب وارد کنند. بیشتر فلزات تمایل شدیدی به آمینواسیدها و گروههای سولفیدریل و پروتئینها دارند و به این دلیل به عنوان سموم آنزیمی عمل میکنند ]9[.
یکی از عمدهترین منابع تولیدکننده این عوامل سنگهای معادن و غبارهای آتشفشانی است ولی در کنار اینها انسان خود به اشکال مختلف مانند صنایع رنگرزی، آبکاری فلزات و باطریسازی در انتشار فلزات سنگین نقش دارد. حضور این عوامل در محیط زیست در دراز مدت منجر به کاهش توان تولید مثلی آبزیان، مشکلات تنفسی و عصبی شده و در ضمن با توجه به تجمع آن در بدن (تجمع زیستی) و انتقال آنها به مصرفکنندگان بعدی از جمله انسان میتواند عوارض غیر قابل جبرانی را ایجاد نماید (شکل2-1) ]47[.
1323395-94173 چرخه تجمع زیستی
00 چرخه تجمع زیستی

شکل 2-1 چرخه زیستی فلزات سنگین در موجودات زنده]47[.
2-2-1منشأ فلزات سنگین
این فلزات جزء عوامل متشکله طبیعی آب دریاها میباشند و مقادیر فراوانی از آنها به صورت طبیعی از طرق متنوعی مانند فرسایش سنگهای معادن، باد، ذرات غبار، فعالیتهای آتشفشانی، رودخانهها و آبهای زیرزمینی وارد دریا میشوند. ولی آنچه مسئلهساز است افزایش منطقهای این فلزات به واسطه فعالیتهای صنعتی انسانی مانند افزایش پسابها و ضایعات صنعتی کارخانجات،آلودگیهای نفتی، سموم، دفع آفات است، این آلایندهها از یک طرف باعث کاهش اکسیژن محلول در آب شده و ازطرف دیگر دارا بودن سموم اثر مستقیمی بر روی ماهیها داشته و باعث تلفات آنها میشود. آبی که از مناطق آبخیز یا بستر رودخانهها عبور میکند، سنگهای معدنی یا مواد محلول را با خود انتقال داده و باعث مسمومیت ماهیان قسمتهای پائین رودخانه میشوند. این روند سبب شده است که قسمتهای مشخصی از نهرها، دریاچهها یا سایر آبها از ماهی تخلیه شوند. از موارد دیگری که سبب آلودگی آبها میشوند میتوان از صنایع استخراج سنگ فلزات نام برد که طی بهره برداری از معادن، آب زهکشی آنها دارای مقادیر زیادی فلزات سمی است. pH بعضی از این آبها به مقدار کمی اسیدی است و سبب افزایش حلالیت فلزات میشود به عنوان مثال آب زهکشی معدن زغال سنگ به دلیل اسیدیته زیاد فلزات موجود در بستر معدن را در خود حل میکند. بررسی برخی راههای ورود فلزات به محیط زیست، به دلیل ورودیهای طبیعی بسیار بزرگ ناشی از فرسایش صخرههای حاوی مواد معدنی، گرد و غبار همراه باد، فعالیت آتشفشانی و آتش سوزی جنگلها، بسیار دشوار است به دلیل تنوع بسیار زیاد در استفاده از این عناصر، آلودگی محیط زیست و اکوسیستمهای آبی توسط آنها ممکن است از راههای بسیار متنوعی صورت گیرد. یک مسیر بسیار مهم برای ورود فلزات سنگین به دریا از طریق اتمسفر است ]9[.
2-2-2 اثر فلزات سنگین بر سلامت آبزیان
امروزه با صنعتی شدن اکثر شهرها و ایجاد کارخانهها در مناطق شهری و عدم استفاده صحیح از سیستم فاضلاب در اکثر کارخانهها این آلایندهها بخش اعظم محیط زیست موجودات زنده را تهدید می کنند به طوری که حتی باعث نابودی برخی از گونههای جانوری و گیاهی در چنین مناطقی شدهاند و این موضوع در سالهای اخیر اکثر محققین را بر آن داشته تا از موجوداتی از خود اکوسیستم استفاده کرده و با کمک آنها میزان این آلاینده ها را محاسبه نمایند. این موجودات معمولاً نسبت به میزان این آلودگیها حساس بوده و برای از بین بردن اثر سمی این مواد، آنها را در بدن خود انباشته می سازند که این خود می تواند کمک ارزنده ای برای محاسبه دقیق این مواد باشد.
اثرات این نوع آلایندهها را می توان به سه دسته حاد (تغییرات مورفولوژیکی) ، تحتحاد (تغییرات هیستوپاتولوژیک) و مزمن (تغییرات ژنتیکی) دسته بندی کرد]19[. موجودت آبزی به لحاظ تنوع و گستردگی بیشمار و قرارگیری مداوم در معرض آلایندههای فلزات سنگین و نیز مشابهت ساختار فیزیولوژیکی با سایر مهرهداران از جمله بهترین شاخصهای زیستی برای ارزیابی اثرات آلودگی به فلزات سنگین هستند. اثرات حاد به اثراتی اطلاق می شود که در زمانی حدود 24، 48، 72 یا 96 ساعت ظاهر شوند. اثرات تحت حاد به اثراتی اطلاق می شود که به مدت زمان بیشتری مثلاً چند هفته یا چند ماه برای آشکارشدن نیاز دارند. اثرات مزمن، هر اثری از ماده آلاینده را گویند که بر روی یک موجود زنده یا نسلهای بعد از آن تاثیرات خود را حفظ می کند. توانایی موجودات برای جذب، تجمع، برداشت یا سمزدایی فلزات سنگین بهطور اساسی متفاوت است.گونههایی که دارای مقادیر مشخصی از متالوتیونئینها و لیزوزومها باشند میتوانند سمیت این فلزات را از بین ببرند. اگر محتوای فلزات سنگین زیاد باشد، سمیت آنها افزایش مییابد زیرا توانایی متالوتیونئینها و لیزوزومها برای از بین بردن اثر سمی آنها محدود است]34[. ماهی به عنوان یکی از مهمترین مواد غذایی در جهان به ویژه برای مردمی که در حاشیه دریاها زندگی میکنند محسوب میشود. متخصصان تغذیه برای بهرهمندی از مزایای سلامتی توصیه میکنند که مردم ماهی را در زنجیره غذای خود بگنجانند اما با توجه به قابلیت تجمع فلزات در بافتهای بدن ماهیان ملاحظات ویژهای در مصرف آنها باید لحاظ شود. به طور کلی اطلاعات در زمینه آلایندهها در مورد ماهیهای تجاری در دسترس عموم مردم نیست. بنابراین ضرورت دارد که اطلاعات در مورد سطوح آلاینده در ماهی از مناطق خاص ارائه شود. اطلاعات در زمینه شناسایی دقیق گونهها، محل جمعآوری، سطوح مجاز آلایندهها در ماهیهای مناطق خاصی از جهان میتواند به مردم اجازه دهد که تصمیمات آگاهانه بگیرند که با مصرف ماهیان مناسب کمترین مقدار فلزات را به بدن برسانند]47[.
بررسی اثرات فلزات سنگین در اکوسیستم های آبی به علت جابجائی اکثر گونه های آبزی و از طرف دیگر رابطه نزدیک بین رسوبات آلوده با آبهای آلوده و عدم تمایز اثرات این دو بسیار مشکل است. موجودات آبزی را میتوان به گروه گیاهان، بیمهرگان و ماهیها تقسیم کرد. به دلیل حساسیت گونههای مذکور به تغییر شرایط زیستی، ورود فلزات سنگین (در غلظت های غیرمعمول) عموماً با کاهش تنوع گونهای، تولیدمثل و نیز کاهش جمعیت موجودات آبزی همراه است. اعضای پایینتر زنجیره غذایی مانند پلانکتونها میتوانند فلزات سنگین را در خود ذخیره نمایند و زمانیکه پلانکتونها توسط گیاهخواران یا گوشتخوارهای بالاتر زنجیره غذایی خورده میشوند، این فلزات به آنها منتقل میشود]9[.
2-3 کادمیوم، منشاء و منابع آن در محیطزیست
کادمیوم عنصری با عدد اتمی 48 و جرم اتمی 4/112 متعلق به گروه دوم عناصر واسطه است که به آسانی توسط چاقو بریده میشود. این ماده در سال 1817 توسط استرومایر در آلمان کشف شد. کادمیوم از جمله عناصر فلز سنگین (با وزن مخصوص بیش از 5 گرم بر سانتیمتر مکعب)، نادر وکمیاب محسوب میشود. به عنوان نمونه مقادیر کادمیوم در آب رودخانهها 1/1 الی 5/13 نانو گرم بر لیتر]91[ و در آب دریا کمتر از 1/0 میکروگرم در لیتر گزارش شده است]70[. کادمیوم دارای نمکهای مختلفی است، که برخی از آنها همانند سولفید و اکسید دارای حلالیت کمی در آب هستند، این در حالی است که نمکهای کلراید، بروماید، یدات، سولفات و نیترات دارای حلالیت خوبی در آب است. این عنصر به آسانی در اسید نیتریک محلول ولی در اسید کلریدریک و اسید سولفوریک به کندی حل میشود]63[. حلالیت کادمیوم در آب تحت تأثیر عواملی نظیر نوع ترکیبات و pH آب است. کادمیوم بطور یکنواخت در پوسته زمین یافت میشودکه در آبهای سطحی طبیعی عمدتاً به فرم دو ظرفیتی دیده میشود که شامل ترکیبات آلی و غیر آلی است]9[. حداکثر غلظت مجاز کادمیوم در پسابهای صنعتی تصفیه شده قابل تخلیه به آب پذیرنده 25/0 میلیگرم بر لیتر و حداکثر غلظت مجاز کادمیوم در آب شرب 005/0میلیگرم بر لیتر است]9[. این مقادیر میتواند تحت تاثیر عوامل درونی مانند گونه ماهی و یا سن ]108،106[ چرخه رسیدگی جنسی، بیماری]106[ یا سایر شرایط بیرونی باشد.
کادمیوم برای ماهیان به شدت سمی است و تجهیزات فلزی که با کادمیوم پوشیده شدهاند نباید برای حوضچههای نگهداری ماهی استفاده شوند. به علاوه رنگهایی را که حاوی کادمیوم هستند نباید به منظور رنگآمیزی حوضچهها مصرف کرد]9[. این فلز از طریق فعالیتهایی همچون حفاری معادن، صنایع فلزی، صنایع خودرو، صنایع شیمیایی، آبکاری فلزات، کودهای سوپر فسفات، آفتکشهای حاوی کادمیوم و نیز تولید برخی از آلیاژهای فلزی، باطری سازی به محیط زیست وارد میشود]42[. ترکیبات آلی کادمیوم در ساخت PVC استفاده وسیعی پیدا کرده است که به دلیل افزایش مقاومت پلیمر به حرارت، نور و زایل شدن رنگ است. از دیگر موارد عمده کاربرد این فلز در صنایع میتوان به استفاده از آن به عنوان کاتالیزور در واکنشهای پلیمری اشاره کرد. کادمیوم همچنین به عنوان ثابت کننده و رنگدانه در پلاستیکها، آبکاری و لحیم کاری و سایر آلیاژها و نیز در باتریهای نیکل-کادمیوم مورد استفاده قرار میگیرد]47[. در حضور کادمیوم در غلظتهای بیشتر از 3 میلیگرم در لیتر، انتقال اکسیژن در آبشش دچار نقصان میکند. اثر کادمیوم میتواند سرعت جذب کلسیم را از روده، حتی در آبهای شور که حاوی کلسیم زیاد هستند، کاهش دهد]9[. از لحاظ پاتولوژیک کمخونی مهمترین علامت مسمومیت ماهیان با اغلب فلزات سنگین مانند کادمیوم است ]23[. کاهش کلسیم و افزایش قند و منیزیم خون نیز از دیگر اثرات مسمومیت ماهیان با کادمیوم است. سمیت کادمیوم و ذخیره آن با کمبود روی افزایش مییابد. میزان مناسبی از روی میتواند از آسیب بافتها جلوگیری کند.کادمیوم نیز بر روی مؤثر بوده و میتواند در مقدار روی مورد نیاز تداخل نموده و از واکنشهای آنزیمی و جذب مواد غذایی جلوگیری کند. کادمیوم ممکن است به عنوان کاتالیزور در واکنشهای اکسیداسیون شرکت کند و باعث ایجاد آسیب به بافتهای اصلی شود. غلظت مجاز کادمیوم برای آبزیان حداکثر 5/1 میکروگرم در لیتر است]9[.
2-4 مسیرهای جذب
فلزات در شرایط متفاوت محیطی به طرق مختلف جذب بدن ماهی میشوند. سطوح مختلف بدن ماهی که در تماس با محیط قرار دارند ممکن است محلی برای انتقال، رسوب و تجمع فلزات سنگین باشند. این سطوح شامل پوست، آبشش، روده و بویایی است. مسیر جذب فلزات سنگین و مکانیسم انتقال آنها به بدن ماهی به عوامل مختلفی وابسته است که شکل شیمیایی فلز(یونی یا نمکهای آنها) در تعیین این مسیر بسیار مهم است. در اغلب مطالعات بیشترین مکانیسم شناخته شده در مهرهداران پست مانند ماهی، انتقال فلزات سنگین به وسیله سلولهای کلراید از گذرگاه آبشش است. کادمیوم میتواند از طریق کانال کلسیمی وارد سلول شود. این امر به دلیل شباهت شیمیایی این عنصر با کلسیم است. به هر حال هنگامی که فلزات وارد بدن ماهی میشوند با ترکیبات آلی و مواد آنزیمی واکنش داده و پس از اتصال به پروتئینها به کمک گردش خون جابجا میشوند. عمدهترین پروتئینی که در سلول به فلزات سنگین اتصال مییابد متالوتیونین (اتصال پروتئینی به نام آپوتیونین به فلزات سنگین که در تمامی بدن حضور دارد و سرشار از اسید آمینه سیستئین است) است. فلزات سنگین توانایی وادار کردن سلولها به رونویسی ژنهای متالوتیونین دارند. به نظر میرسد که مسوولیت اصلی سمیتزدایی ماهیان از فلزات سنگین به عهده این پروتئین است]9[.
2-5 آبشش
آبشش ماهیان به عنوان یکی از حیاتیترین اندامها محسوب میشود که علاوه بر تبادلات گازی نقش مهمی در تنظیم اسمزی به عهده دارد. لذا مطالعه تاثیر فاکتورهای محیطی بر ساختار و عملکرد آن از اهمیت بالایی برخوردار است. فاکتورهای محیطی نظیر شوری، pH و آلایندههای صنعتی با تاثیر با بافت آبشش، عملکرد آن را تحت تاثیر قرار میدهند ]63[. آبشش مهمترین مسیر در جذب این فلزات محسوب میشود. آبششها بعد از پوست اندام بعدی است که به طور مستقیم تحت تاثیر آلایندهها آسیب میبیند که این مسئله در ماهیها به خوبی نشان داده شده است. آبششهای ماهیان دارای عملکرد مختلفی همچون تبادل گازهای تنفسی، تنظیم اسمزی، دفع نیتروژن و تعادل اسید باز میباشند و به جهت این عملکردها، دارای ویژگیهای خاصی بوده که در تبادل مواد شیمیایی سمی بین ماهی و محیط، اثرگذار هستند. گفته شده است در ماهیان جذب کادمیوم در وهله اول از طریق آبششها و روده انجامپذیر است. اثبات شده است که اکثر کادمیوم موجود در آب به صورت کلراید به وسیله ماهی جذب میشود، در حالی که کادمیوم جذب اندکی از طریق غذا دارد. اولین دو کمان آبششی، 5/1 تا 3 برابر بیشتر از دو کمان آبششی انتهایی، کادمیوم را جذب میکنند. همچنین سرعت جذب فلزات به داخل بافت آبششی نسبت به میزان متابولیسم و وزن ماهی متفاوت است. بنابراین ماهیان کوچکتر فلزات سنگین را با سرعت بیشتری نسبت به ماهیان بزرگتر جذب میکنند، چرا که در ماهیان کوچکتر، آب با سرعت بیشتری از میان آبشش جریان دارد. همچنین در شرایط کم اکسیژنی، ورود کادمیوم به آبششها افزایش مییابد ]9[.
2-6کبد، روده و کلیه
با توجه به اهمیت کبد (بهعنوان غده اصلی در دستگاه گوارش ماهیان) در سم زدایی و نگهداری هموستاز متابولیک بدن و نیز نقش کلیدی آن در سنتز پروتئینهای پلاسما و همچنین اندام هدف اولیه گزنوبیوتیکها و انباشت آنهاا، بهعنوان یکی از اندامهای مورد مطالعه در این تحقیق استفاده شده است. ﻣﺮاﻛﺰ ﺧﻮنﺳﺎز ﻳﻜﻲ از ﻣﻬﻤﺘﺮﻳﻦ ﺑﺎﻓﺖ ﻫﺎی ﺟﺎﻧﻮری اﺳﺖ ﻛﻪ ﺗﺤﺖ ﺗﺎﺛﻴﺮ ﺳﻤﻮم دﭼﺎر ﭘﻴﺎﻣﺪﻫﺎ و ﻋﻮارض ﻧﺎﻣﻄﻠﻮﺑﻲ میگردد. ﻳﻜﻲ از مهمترین بخشﻫﺎی ﻣﺮاﻛﺰ ﺧﻮن ﺳﺎز در ﻣﺎﻫﻴﺎن، ﻣﺮاﻛﺰ ﻣﻼﻧﻮﻣﺎﻛﺮوﻓﺎژی اﺳﺖ ﻛﻪ ﻣﻌﻤﻮﻻ در اﻧﺪامهای ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﺎﻫﻴﺎن اﻋﻢ از ﻛﻠﻴﻪ، ﻛﺒﺪ و ﻃﺤﺎل ﻳﺎﻓﺖ میﺷﻮد. اﻓﺰاﻳﺶ اﻧﺪازه و ﺗﻌﺪاد ﻣﺮاﻛﺰ ﻣﻼﻧﻮﻣﺎﻛﺮوﻓﺎژ بهخصوص در کبد و کلیه ﻳﻜﻲ از ﻣﻬﻤﺘﺮﻳﻦ ﺷﺎﺧﺺهای زﻳﺴﺘﻲ ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده در ﺗﺸﺨﻴﺺ ﺷﺮاﻳﻂ اﺳﺘﺮس زا و ﺑﻴﻤﺎریهای ﻋﻔﻮﻧﻲ اﺳﺖ ]36[. روده ماهیان دارای سلولهای مخطط (ریزپرز) و سلولهای جامی شکل است که در عمل جذب و ترشح دخالت دارند. از سوی دیگر رودهها با داشتن سلولهای گرانولا دئوزینوفیلیک ویژگی پاک کنندگی دارد و ارتباط تنگاتنگی با ایمنی ذاتی و التهابی دارد ]37[. جذب کادمیوم در دستگاه گوارش در تمام بخشهای روده (قدامی، میانی و خلفی) و همچنین معده رخ میدهد. ترکیبات فلزی که با مواد آلی اتصال یافته و ماهی آن را بلعیده، با مکانیسم اندوسیتوز در روده جذب میشوند. روده یکی از راههای اصلی عبور مواد سمی و یکی از مهم ترین بافت هایی است که در تماس مستقیم با مواد سمی است. هر نوع آسیب به بافت پوششی روده میتواند به عنوان شاخصی از سمیت گزنوبیوتیکها و آلاینده های محیطی باشد. کلیه ماهیان اندامی ترکیبی از عناصر خونساز، بیگانهخوارها، درون ریز و دفع است. در ماهیان بخش قدامی (کراینال) واجد انواع بافتهایی است که نقش انحصاری خونسازی دارند، که مراکز ماکروفا‍ژ نیز در آن وجود دارند. اما بخش تحتانی کلیه دارای لولههای کلیوی بیشتری است و بعنوان اندام تنظیم اسمزی و تا حدی دفعی عمل میکند. لذا بررسی بافت شناسی کلیه ماهیان تحت تاثیر آلایندهها بسیار مهم است ]94[.
2-7 سایر مسیرهای جذب
مسیرهای جذب دیگر در هنگام تماس ماهی با Cd 2+ محلول در آب، پوست و اپیتلیوم بویایی است. در صورت افزایش غلظت بیش از حد طبیعی فلزات سنگین در آب، اولین اندام ماهی که دچار آسیب میشود، لایه موکوس پوست است که با نابودی آن فعالیت حیاتی ماهیان به مخاطره میافتد. جذب Cd 2+ از طریق پوست در مقایسه با آبشش و روده نسبتا به مقدار کمی رخ میدهد. این فلز یونی به آسانی از اپیتلیوم بویایی از طریق مسیرهای جذب کلسیم عبور میکند و در پیاز بویایی تجمع مییابد. یون کادمیوم در مناطق مغزی تجمع نمییابد و به نرونهای مرکزی وارد نمیشود ]63[.
2-8 تاثیر متقابل فلزات سنگین بر یکدیگر
از میان فلزات سنگین فلزاتی مانند سرب و کادمیوم زنوبیوتیک هستند به این مفهوم که این عناصر برای متابولیسم بدن مورد نیاز نیستند و حتی مقادیر کم آنها نیز برای بدن مضر است. مهم ترین اثر سوء مصرف کادمیوم در انسان بیماری ایتایی ایتایی است که اولین بار به علت مصرف برنج آلوده به این فلز در ژاپن گزارش شد .از دیگر اثرات سمی این فلز میتوان به تخریب بافت کلیه اشاره کرد. از اثرات مخرب فلز سرب نیز میتوان به آسیب جدی به سیستم عصبی مرکزی و محیطی اشاره نمود. اما دسته دیگر فلزات سنگین عناصری هستند که به مقدار کم برا ی بدن مورد نیاز است و در واقع مقادیر بالاتر از حد استاندارد آنها میتواند منجر به اثرات سوء گردد که مس و روی از این دسته میباشند. در اغلب شرایط، فاضلاب صنایعی که به داخل یک اکوسیستم آبی تخلیه میشوند، دارای فلزات سنگین متنوعی است. وجود یونهایی مثل کلسیم، منیزیم، سدیم، منگنز و سولفور نیز بر میزان سمیت فلزات سنگین مانند کادمیوم، مس، روی، جیوه به راههای گوناگون تاثیر میگذارند. فلزات سنگین بسته به غلظت، اثر تقویت کنندگی یا تضعیف کنندگی بر میزان سمیت یکدیگر دارند. نشان داده شده است که وجود کلسیم باعث کاهش و به حداقل رساندن سمیت کادمیوم و روی میشود ]9[. دانشمندان در تحقیقات خود به این نتیجه رسیدهاند که سمیت مخلوط مس و روی در ماهیان جوان تاثیر کشندهتری نسبت به هریک از فلزات فوق به طور انفرادی دارد. به علاوه حضور این دو عنصر منجر به افزایش تولید متالوتیونین در کلیه،کبد وآبشش ماهی میشود، در حالی که هریک از فلزات فوق به تنهایی قادر به تحریک تولید متالوتیونین به همان میزان نیستند]72[.
2-9 عوامل موثر در قابلیت دسترسی ماهیان به فلزات سنگین
عوامل موثر در قابلیت دسترسی بسته به شکل شیمیایی آن(یون آزاد، ترکیب با مواد معدنی یا ترکیب با مواد آلی)، حضور یا عدم حضور سایر فلزات، ویژگیهای فیزیکوشیمیایی آب نظیرpH، ترکیبات آلی، سختی، شوری، دما و اکسیژن محلول و مرحله زیستی ماهی(تخم، لارو، بچه ماهی، مولد) جنس و ویژگیهای زیستی آن تغییر میکند ]9[.
2-10مسمومیت
مسومیت عبارت است از بهم خوردن تعادل فیزیولوژیکی، فیزیکی و یا روانی موجودات زنده که در اثر ورود و تماس ماده خارجی سمی به بدن رخ میدهد. بروز مسمومیت با ظاهر شدن علایم خارجی همراه است و شدت آن بستگی به نوع ماده سمی و مقدار آن و همچنین طول مدت تماس با آن دارد. مسمومیت بر اساس زمان بروز انواع مختلف دارد. مسمومیت حاد، مسمویتی چند ساعت تا چند روز پس از تماس با ماده سمی است. در این نوع مسمومیت معمولاً ماده سمی یکباره به مقدار زیاد با موجود تماس پیدا میکند. مسمومیت مزمن، مسمومیتی چندین ماه تا چند سال پس از تماس با ماده سمی ایجاد میشود. در این نوع مسمومیت معمولاً ماده سمی به مقدار کم یا جزئی در دفعات متعدد و در مدت زمان طولانی به موجود میرسد و آثار و علایم آن نیز به کندی و پس از گذشت زمان نسبتاً طولانی ظاهر میگردد. به علت جزئی بودن ماده سمی و عدم بروز یکباره عوارض، مسمومیت مزمن ممکن است مدتی طولانی مخفی بماند. مسومیت تحت حاد مسمومیتی چندین هفته تا چند ماه پس از تماس با ماده سمی ایجاد میشود]48[.
2-11مسمومیت و بیماریهای ناشی از کادمیوم در ماهیان
بیشتر اندامهای ماهی در برابر مسمومیت با فلزات سنگین حساساند و در این میان آبشش به دلیل نقش آن در تنفس و تعادل اسمزی، کبد به دلیل اینکه عضو اصلی در سوخت و ساز بدن است و کلیه به دلیل اینکه عضو اصلی در دفع مواد مضر است، صدمات اصلی را تحمل میکنند] 7[.گرچه مقادیر جزئی از فلزات موجود در آبها دارای منشاء طبیعی هستند، اما مقادیر بیشتر آنها که ناشی از آلودگیهای طبیعی و صنعتی هستند، باعث ایجاد مسمومیت در ماهیان میگردند. مسمومیت ماهیان ناشی از فلزات سنگین، موجب تحمیل استرس مزمن به ماهیان شده و تحمیل استرسهای اضافی، مانند عفونتها، موجب مرگ سریع آنها میگرد این عنصر فلزی سنگین و غیرضروری برای ماهی است که در صورت ورود به بدن ماهی، به طور عمده در آبشش و کلیه و به میزان کمتری در کبد تجمع مییابد. تجمع کادمیوم در آبشش باعث افزایش تعداد سلول های کلراید در اپیتلیوم آبششی میشود. همچنین تولید موکوس در سطح بدن آن گروه از ماهیانی که در معرض کادمیوم هستند افزایش مییابد و به تعداد سلولهای تولید کننده موکوس در روده و آبشش افزوده میگردد]9[. تجمع کادمیوم در آبشش باعث جدا شدن لایههای مخاطی از آبشش میشود، که پس از آن هایپرتروفی و هایپرپلازیا لایه درونی اپیتلیوم اتفاق میافتد. آسیبهای پاتولوژیکی در کلیه، روده و دستگاه تنفسی در مسمومیت با کادمیوم نیز رخ میدهد و در نهایت ماهی در نتیجه آسیبهای سیستم تنفسی و عصبی میمیرد]80[. زمانی که کادمیوم وارد بدن ماهی میشود، باعث جلوگیری از فعالیت آلکالین فسفاتتاز و آدنوزین تری فسفاتاز کلسیم میشود، در صورتی که فعالیت آلکالین فسفاتاز زا افزایش میدهد. کاهش کلسیم و افزایش قند و منیزیم خون از دیگر اثرات مسمومیت ماهیان با کادمیوم است. آسیب به لولههای پروکسیمال کلیه و تحریک میتوکندری و افزایش فعالیت شبکه آندوپلاسمی نیز جز اثرات آسیب شناسی مسمومیت با این عنصر هستند. بسیاری از این اثرات منجر به اختلال در سوخت و ساز طبیعی کلسیم میگردند. کادمیوم سطوح کلسیم و کلر و پتاسیم سرم را پایین میآورد که شاید به خاطر کاهش جریان کلسیم از آبششها به خون باشد. علت آن رقابت کادمیوم با کلسیم برای یافتن مکانهایی روی پمپهای کلسیم در آبششها است ]98[.
اثبات شده است که کادمیوم سوخت و ساز کلسیم را در ماهیان آب شیرین حتی نسبت به ماهیان آب شور به میزان بیشتری تحت تاثیر قرار میدهد. کلسیم پلاسما طی یک هفته در معرض قرارگیری قزلآلای رنگینکمان Oncorhynchus mykiss با کادمیوم با غلظت 3/0 میلیگرم در لیتر، تقریباً تا 50% کاهش مییابد و پژوهشگران به این نتیجه رسیدهاند که ماهی در مراحل اولیه زندگی به کادمیوم حساسیت بیشتری دارد ]9[. به نظر میرسد که کادمیوم تنها سبب تغییرات آرام در تنظیم اسمزی میشود. اما مشخص شده است که تنظیم برداشت و دفع برخی یونها مانند کاتیونهای دو ظرفیتی در جریان تعادل اسمزی از کادمیوم متاثر میگردد. مسومیت ماهی با کادمیوم منجر به کاهش سدیم خون میشود. اما حجم سدیم و پتاسیم و آب در ماهیچههای آن افزایش مییابد. پژوهشگران معتقدند که این تغییرات به افزایش جذب آب از محیط و آب تجمع یافته در مایع خارج سلولی مرتبط است]9[.
از لحاظ پاتولوژیک کمخونی مهمترین علامت مسمومیت ماهیان با اغلب فلزات سنگین مانند کادمیوم است.کادمیوم اثرات محسوسی بر ویژگیها و شاخصهای خون شناسی نظیر شمارش گلبولهای قرمز ، شمارش گلبولهای سفید ، میزان هموگلوبین و هماتوکریت میگذارد که بهطور مثال مسمومیت این فلز منجر به کاهش تعداد گلبولهای سفید در گربه ماهی آب شیرینClarias gariepinus شد. همچنین افزایش تعداد و اندازه گلبول قرمز و افزایش مقادیر هماتوکریت در ماهی استرلیاد Acipencer ruthenus گزارش شده است]22[. مسمومیت با فلز سنگین روی در گربه ماهی آب شیرینHeteroclarias sp. منجر به افزایش لنفوسیتها و کاهش بازوفیلها و نوتروفیلها شد]92[. تکامل جنینی در برخی ماهیان نیز تحت تأثیر کادمیوم دچار نقص میشود و مجاورت طولانی ماهی با کادمیوم منجر به بروز اثرات اختصاصی خواهد شد که عمدهترین آن تأثیر بر اندامهای تناسلی است]48[.

2-12 مرور منابع
در سالهای اخیر توجه زیادی به اثر فلزات در محیط زیست شده است. به طوریکه امروزه فلزات سنگین جزء مهمترین آلایندههای منابع آبی کره زمین به شمار میآیند.
در مطالعه ریاحی بختیاری (1380) میزان و نحوه تغییرات فلزات ) Cd، (Pbدر بافتهای آبشش، عضله و امعأ و احشای برخی از گونههای ماهی رودخانه هراز، سیاه ماهیCapoeta capoeta ، ماهی سفید رودخانهای Leuciscus cephalus، ماهی کاراس Carassius auratus، ماهی خیاطه Alburnoides bipunctaus و قزلآلای رنگینکمان Oncorhynchus mykiss مورد بررسی قرار گرفت. میزان جذب و تجمع سرب و کادمیوم در بافتهای مختلف هریک از گونهها به طور مجزا متفاوت و معنیدار بوده و همچنین میانگینهای غلظت سرب و کادمیوم در شش گونه مورد مطالعه نیز تفاوت معنی داری نشان دادند]16[.
شجیعی (1381) با بررسی اثر کادمیوم بر پارامترهای خون شناسی در ماهی کپور معمولی نشان دادند که در غلظت 0 تا 55 میکروگرم در لیتر کادمیوم، اختلاف معنیداری در میزان شمارش گلبول قرمز و سفید و همچنین در میانگین مقادیر مختلف یونهای Mg+2، K+، Cl-، Na+، Ca+2 در خون مشاهده شد. او بیان داشت که در ماهی کپور معمولی، تغییراتی در تعادل یونی خون بر حسب غلظت و زمان در معرض قرارگیری یون کادمیوم در آب ایجاد میگردد]21[.
در مطالعهای که توسط ابطحی و همکاران (1384) در سواحل جنوبی دریای خزر انجام شد، غلظت پنج فلز شامل سرب(Pb)، نیکل(Ni)، کادمیوم(Cd)، مس(Cu) و وانادیوم (V) در بافتهای ماهی ازون برون Acipenser stellatus بررسی شد. نتایج حاصله نشان داد که تجمع فلزات در بافتهای کبد و آبشش به ترتیب به صورت مس>سرب>کادمیوم>نیکل>وانادیوم است. در این تحقیق رابطه غلظت فلزات و شاخصهای زیست سنجی مورد توجه قرار گرفت که در آن همبستگی مثبت و معنی داری بین طول و وزن ماهی و غلظت کادمیوم مشاهده شد. همبستگی غلظت فلز با سن ماهی فقط در مورد سرب و تنها در بافت کبد یافت شد]1[.
محمدنژاد شموشکی (1383) به بررسی میزان h) 96 ,50LC (فلزات سنگین از جمله کادمیوم بر روی بچه ماهی شیپ Acipenser nudiventris 1-3 گرمی پرداختند و بیان داشت میزان h) 96 ,50LC ( به دست آمده از کادمیوم در ماهی شیپ83 0/0 میلی گرم بر لیتر و حداکثر غلظت مجاز (MAC) کادمیوم 8 میلی گرم بر لیتر است ]28[.
خیرور و دادالهی (1388) غلظت فلزات سنگین مس، سرب، کادمیوم و نیکل را در بافت عضله و آبشش 64 قطعه ماهی شیربت Barbus grypus در اروند رود در 4 ایستگاه بررسی کردند، به ترتیب برای فلزات نیکل، سرب، کادمیوم و مس میانگین غلظت فلزات در آبشش 52/1، 03/9، 79/2 و 97/6 میکروگرم بر گرم وزن خشک بدست آمد. در این مطالعه میزان سرب و کادمیوم در بافت عضله بیشتر از آبشش و میزان مس و نیکل در بافت آبشش بیشتر از بافت عضله بود. اختلاف معنی داری بین ایستگاهها وجود نداشت اما در مورد فصول، برای دو عنصر کادمیوم و مس بین دو فصل زمستان و بهار اختلاف معنی داری وجود داشت، که این اختلاف برای کادمیوم در سطح 05/0 و برای مس 01/0 معنی دار بود]11[.
بهشتی و همکاران (1389) بررسی غلظت فلزات سنگین در ماهی بیاح در رودخانه دز را انجام دادند. نتایج این تحقیق نشان داد که میانگین غلظت فلزات سنگین در بافت عضله حداقل و در بافت آبشش حداکثر است. در اندامهای مختلف ماهی بیاه غلظت آهن به ترتیب بیشتر از روی، سرب، منگنز، کادمیوم، مس و جیوه بود]3[.
غیاثی و همکاران (1389) پارامترهای خونی و بیوشیمیایی در ماهی کپور معمولی در مواجهه با غلظت کم کادمیوم30 میکروگرم بر لیتر به مدت یک ماه بررسی کردند. آنها بیان داشتند که تعداد گلبولهای سفید به طور معناداری در پایان دوره کاهش یافت. با این وجود در سایر پارامترهای خونشناسی و مقادیر آنزیمهای سرمی ماهیان گروه تیمار اختلاف معناداری در مقایسه با گروه شاهد مشاهده نشد]25[.
نتایج مطالعه عروجعلی (1391) بر روی ماهی استرلیاد Acipenser ruthenus نشان داد که کادمیوم تعداد گلبولهای سفید خون را کاهش و تعداد لنفوسیتها را افزایش میدهد که این منجر به کاهش توانایی فاگوسیتوز سلولهای مرده داخلی میشود. همچنین کادمیوم سبب افزایش هماتوکریت و هموگلوبین در گروههای تیمار شده با 32 و 64 میکروگرم در لیتر کادمیوم در مقایسه با گروه شاهد شد]22[.
حمیدیان و همکاران (1393) تغییرات هیستوپاتولوژیک کبد ماهی گورخری Aphanius sophiae در مواجهه با آرسنیک و کادمیوم، مورد مطالعه قرار دادند. نتایج نشان داد که در تمامی غلظتهای کادمیوم و آرسنیک افزایش غلظت فلز سبب افزایش نکروزه شدن هپاتوسیتی و آتروفی میشود. همچنین نتایج نشان دهنده افزایش تورم ابری و آتروفی با افزایش غلظت بود. در تمامی غلظتهای کادمیوم و آرسنیک با افزایش غلظت بطور کلی تخریب بافتی در غلظتهای آرسنیک بیشتر از کادمیوم بود]8[.
هانسن و همکاران (1978) با بررسی اثرات کادمیوم بر ماهی قزلآلای Salmo gairdneris تحت غلظت های 05/0، 09/0، 19/0، 39/0 و 79/0 میکروگرم بر لیتر در طی 55 روز بیان کردند که در همه غلظتها تجمع کادمیوم در کل بدن ایجاد میشود و رشد و بقا ماهی در طولانی مدت در غلظت 78/0 کاهش یافت]59[.
ال-اتار و همکاران (2005) با قرار دادن تیلاپیای نیل در برابر غلظت تحت کشنده کادمیوم 5/5 میلیگرم بر لیتر به مدت 1، 3، 5 هفته تغییرات هماتولوژیک از قبیل آنمی(کاهش گلبولهای قرمز)، هموگلوبین، هماتوکریت و میانگین حجم گلبولها را نشان داد]32.[
نونتیا و همکاران (2008) به بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک گربهماهی راهرونده هیبرید Claria macrocephalus× Claria garipinus تحت تاثیر دوز 6/1و 6/ 13 میلی گرم بر لیتر کادمیوم در دو مدت زمان 1 تا 4 روزه و 10 تا 30 روزه پرداختند و تغییرات بافتی در آبشش و کبد و کلیه را بررسی کردند. در بافت آبشش تغییراتی از قبیل ادم در سلولهای اپیتلیال، افزایش در سلولهای کلراید و شکستگی تیغههای آبششی نشان داده شد. در کبد، جمع شدن رگ های خونی و متورم شدن سلول و در کلیه واکوئله شدن و نکروز سلول مشاهده شد] 78[. نیکولا و دومیترسکو (2009) به بررسی ضایعات بافتی ناشی از مسمومیت کادمیوم بر روی کبد،آبشش،کلیه، روده و ماهیچه در ماهی کاراس نقرهای Carassius auratus gibelio پرداختند. دوز مورد استفاده 53/1 میلیگرم بر لیتر در مدت زمان 21 روزه بود. در کلیه وجود فضاهای بین سلولی بزرگ، هیپرتروفی در اپیتلیوم در لولههای ادرار بر و در کبد نیز لخته شدن و تجمع خون در رگ های کبدی و پارانشیم کبد وجود قطره های زیاد چربی مشاهده شد]77[. سورش (2009) اثر کادمیوم را بر روی کبد، طحال،کلیه و مراکز ماکروفاژ در ماهی تیلاپیا موزامبیک بررسی کردند. این آزمایش در دوره زمانی 120 ساعته و دوز 93/20 میلی گرم در لیتر صورت گرفت و تغییرات قابل توجهی در مراکز ماکرفاژ و ماکروفاژهای آزاد کبد و طحال و کلیه تیلاپیا مشاهده شد]94[.
بررسی میزان تجمع فلزات سنگین در کبد، آبشش، روده و عضله در ماهی استرلیاد رودخانه دانوب با طول کل 38 سانتی متر و طول استاندارد 32 سانتی متر توسط جاریک و همکاران (2011) انجام شد. آنها اظهار کردند که کبد مهمترین بافت ذخیره فلزات سنگین است در حالی که کمترین سطح فلزات در بافت عضله یافت شد. غلظت فلزات سنگین در بافت ماهیچه به جزء تا حدودی برای کادمیوم در سطح قابل قبول برای مصرف انسانی بود ]62[. بیلال و همکاران (2011) به بررسی اثر کلرید کادمیوم بر روی کبد و کلیه گربه ماهی آب شیرین Clarias batrachus پرداختند. دوز مورد استفاده 4 و 8 میلیگرم بر لیتر در مدت زمان 60 روز بوده است. تغییرات بافتی را در این اندامها بررسی کردند. آسیبهاب بافتی نظیر سست شدن بافت کبدی، تغییر شکل هسته، واکوئله شدن سیتوپلاسم سلول کبدی و آسیب گلومرول های کلیه و تنگی لوله لومن و تغییر شکل لوله های ادرار بر را مشاهده شد ]40[. آمین و همکاران (2013) نشان دادند که در گربه ماهی آب شیرین Channa punctatus در معرض کلرید کادمیوم با دوز 3 و 5 میلی گرم بر لیتر در مدت زمان 15 و 45 روزه، بافت کلیه نشانههایی نظیر سست شدن بافت کلیه،تغییر شکل لوله های ادرار بر وآسیب گلومرول ها را نشان میدهد. در بافت کبد نکروز هسته، سست شدن بافت ، هیپرتروفی سلولها، خون ریزی در بافت و واکوئله شدن سلول در بافت کبد مشاهده شد]36[. اثرات فلز سرب نیز بر فاکتورهای خونی ماهیهای مختلف از جمله کپور معمولی Cyprinus carpio مورد ارزیابی قرار گرفته است. در این مطالعات تعداد نوتروفیلها و فعالیت فاگوسیتها، لوکوسیتها و فراوانی بازوفیلها در کپور معمولی کاهش پیدا کرد ونشان داد سیستم ایمنی غیراختصاصی آن دچار اختلال شده است. همچنین این فلز سبب کاهش تعداد گلبول قرمز، میزان هموگلوبین و افزایش حجم گویچه قرمز ، میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای و میانگین هموگلوبین ذرهای شد]110[.
-219158-1826315فصل سوم
-322994-113753300-322580-100203000مواد و روشها
3-1معرفی منطقه نمونهبرداری
برای انجام این تحقیق ابتدا 100 قطعه ماهی نازک از چشمه دیمه (شکل3-1) واقع در استان چهارمحال و بختیاری با استفاده از تور صید گردید سپس ماهیان با استفاده از کیسه پلاستیکی پر شده با اکسیژن خالص به سالن آکواریوم واقع در دانشکده منابع طبیعی منتقل شدند. ماهی ها به مدت روز 10 جهت سازش با شرایط نگه داری شدند و سپس به آکواریوم با حجم 50 لیتر و هوادهی شده با سنگ هوای 10 سانتی متری و پر شده با آب شیر بدون کلر مستقر شدند. هر آکواریوم شامل 15 قطعه ماهی بوده که در مجموع 60 قطعه ماهی درون 4 آکواریوم قرار گرفت و آزمایش در 4 تیمار شامل غلظتهای 5/0 و 5/2 و 5/7 میکروگرم در لیتر کلرید کادمیوم و گروه شاهد اجرا شد.
18992851167130ایران
00ایران
32642021162050استان چهارمحال و بختیاری
00استان چهارمحال و بختیاری

1355725767143500 51
00 52
00 50
-
00 33
00 32
-
25 کیلومتر
کوهرنگ
چشمه دیمه
زاینده‌رود
مرغملک
0000 51
00 52
00 50
-
00 33
00 32
-
25 کیلومتر
کوهرنگ
چشمه دیمه
زاینده‌رود
مرغملک
1355725767143500 51
00 52
00 50
-
00 33
00 32
-
25 کیلومتر
کوهرنگ
چشمه دیمه
زاینده‌رود
مرغملک
0000 51
00 52
00 50
-
00 33
00 32
-
25 کیلومتر
کوهرنگ
چشمه دیمه


زاینده‌رود
مرغملک
1355725767143500 51
00 52
00 50
-
00 33
00 32
-
25 کیلومتر
کوهرنگ
چشمه دیمه
زاینده‌رود
مرغملک
0000 51
00 52
00 50
-
00 33
00 32
-
25 کیلومتر
کوهرنگ
چشمه دیمه
زاینده‌رود
مرغملک
شکل3-1 محل انجام نمونه برداری از ماهیان (1 سانتیمتر بر روی نقشه معادل 5/7 کیلومتر بر روی زمین است).
3-2 معرفی گونه ماهی نازک
ماهی نازک Chondrostoma regium، یک گونه بنتوپلاژیک است و در هر دو محیط آبهای راکد و آبهای جاری زیست میکند (شکل3-2). در واقع بیشتر در دریاچهها و حتی مخازن سدها و رودخانهها وجود دارند. در قسمت میانی و فوقانی رودخانه که دارای آب شفاف و بستر ماسهای- قلوه سنگی میباشد، زندگی میکنند. به طور معمول مهاجرت تخم ریزی بین فاصله 30-300 کیلومتر دارند و در نهایت در بسترهای سنگریزهای در آبهای کمعمق با جریان قوی تخمریزی میکنند. دامنه دمایی آنها 3-21 درجه سانتیگراد است ]21[. از نظر اهمیت اقتصادی اگرچه این گونه دارای ارزش اقتصادی به عنوان ماهی تجاری نیست ولی به عنوان صید ورزشی ارزشمند است. همچنین افراد محلی آن را به عنوان غذا مصرف میکنند.
522795521000831 cm
001 cm
53860702425148
شکل 3-2 ماهی نازک (Chondrostoma regium) صید شده از چشمه دیمه در پاییز 1393
3-3 انتقال ماهیان نازک به سالن آکواریوم و درمعرض قرار دادن با غلظتهای متفاوت کادمیوم محلول در آب
تعداد 100 قطعه ماهی نازک با وزن متوسط 88/0±32/19 گرم و طول 45/0±2/14 سانتیمتر ازسرشاخه زاینده رود در منطقه چشمه دیمه با تورکشی به روش پره صید شد و پس از قرار دادن در کیسههای پلاستیکی پرشده با اکسیژن و آب به صورت زنده به سالن آکواریوم دانشکده منابع طبیعی دانشگاه صنعتی اصفهان منتقل شد. ماهیان برای سازگاری به مدت 5 روز قبل از شروع آزمایش در مخازن پر شده با آب شهری نگهداری شدند. جهت ایجاد مسمومیت از کلرید کادمیوم (CdCl2.H2O) ساخت شرکت مرک، کشور آلمان استفاده شد. محلول استوک با انحلال کلرید کادمیوم محاسبه شده در 100 میلیلیتر آب مقطر و جهت رسیدن به غلظت مورد نظر حجم مشخصی از استوک برداشته میشد. آزمایش سمیت در شرایط آزمایشگاهی ساکن انجام شد . دوز تحت کشنده کادمیوم در این مطالعه بر اساس یافته های دیگر محققین در خصوص تعیین(h 96، 50LC) کادمیوم برای گونههای نزدیک به ماهی نازک تعیین شد. برای این مطالعه 4 تیمار در نظر گرفته شد. در مجموع برای هر تیمار 15 قطعه ماهی استفاده شد. مقدار مصرفی کادمیوم در تیمار ها عبارتند از گروه شاهد، 5/0، 5/2، 5/7 میکروگرم بر لیتر که بهترتیب با کدهای Cd،Cd 5/0،Cd 5/2، Cd5/7 مشخص گردید.
3-4 اندازهگیری فاکتورهای فیزیکوشیمیایی آب
فاکتورهای کیفی نظیر اکسیژن محلول ، درجه حرارت، pHو EC به صورت روزانه سنجش شد، که به ترتیب به وسیله اکسیژن متر مدل WTW DO meter ساخت کشور آمریکا، دماسنج، pH متر مدل Research Jenway 330 و EC متر مدل UK Research4310 اندازهگیری شد. اکسیژن محلول اندازه گیری شده در طی مطالعه در محدوه 3/6-5 میلیگرم برلیتر قرار گرفت. دامنه دمایی در طول دوره در محدوده 5/22-4/21 درجه سانتی گراد بود. pH محاسبه شده در دامنه 25/8-19/7 قرارگرفت. دامنه تغییرات EC دراین مطالعه در محدوده 48/3-06/3 دسیزیمنس بر متر قرارگرفت. کادمیوم محلول در طول دوره 4 بار اندازهگیری شد. سختی آب از روش تیتراسیون ml100 آب با HCl 1/0 نرمال اندازه گیری شد که در دامنه 148-112 میلیگرم بر لیترکربنات کلسیم قرار گرفت ]85[.کادمیوم آب به روش اسپکتروفتومتری در دستگاه جذب اتمی مدل Jascov-530 اندازهگیری شد ]35[.
3- 5 ساخت محلول ذخیره کادمیوم
به منظور تامین کادمیوم مورد نظر هر تیمار، محلول استوک با انحلال 5/7 میلیگرم کلرید کادمیوم (CdCl2.H2O) در 100 میلی لیتر آب مقطر به حجم رسانده شد و برای تیمارهای 5/0، 5/2، 5/7 میکروگرم بر لیتر به ترتیب 600، 3000 و 9000 میکروگرم بر لیتر از این محلول به آکواریومها اضافه گردید ]97[. به منظور حفظ غلظت کادمیوم و کیفیت آب هر دو روز یکبار به صورت متوالی درطی 14 روز، 40 لیتر از 50 لیتر آب داخل تانک تعویض شد ومقادیر 480، 2400 و 7200 میکروگرم بر لیتر کادمیم حل شده محاسبه شده ازذخیره کلریدکادمیوم به آن اضافه شد.

3-6 آنالیزهای خونشناسی
در پایان روز چهاردهم (6 قطعه از هر تیمار) ماهیها با استفاده از گل میخک با غلظت 100میلی گرم در لیتر بیهوش شدند. سپس خونگیری از ماهیان پس از خشک کردن ساقه دمی، با استفاده از سرنگ 5/2 میلیلیتری هپارینه انجام شد و ویژگیهای مرسوم خونشناسی مطابق روشهای استاندارد خونشناسی برگرفته از هوستون(1990) به شرح زیر اندازهگیری شد.]60[
3-6-1 اندازهگیری هموگلوبین
همچنین میزان هموگلوبین (Hb گرم در دسی لیتر)، با استفاده از روش سیان متهموگلوبین با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Perkinelmer lambda Z 800; USA) در طول موج 540 نانومتر در آزمایشگاه تشخیص طبی جم، اصفهان اجرا شد.
3-6-2 اندازهگیری هماتوکریت
هماتوکریت (HCT) روشی برای اندازهگیری حجم تودهای یا ذرهای یاختههای قرمز نسبت به حجم کل خون است که بر حسب حجم گلبول قرمز در 100 میلیلیتر خون بیان میشود. برای اندازهگیری هماتوکریت، لولههای موئینه میکروهماتوکریت را به ماده ضد انعقاد آغشته و با نمونه خون تماس داده شد تا تیوب از خون پر شود. سپس سر تیوبها مسدود شد و به مدت 5 دقیقه با سرعت 7000 دور بر ثانیه سانتریفیوژ گردید و درصد هماتوکریت با استفاده از خطکش مخصوص قرائت شد]26[.
3-6-3 شمارش گلبولهای قرمز
برای رقیق سازی یاختههای قرمز خون از پیپت ملانژور قرمز استفاده میشود. برای استفاده از این نوع پیپت، تا درجه 5/0 آن از خون و بقیه حجم تیوب تا درجه 101 از محلول رقیق کننده پر میشود (رقت 200/1). در این مطالعه از محلول رقیق کننده دایس استفاده شد. محلول دایس از ترکیب 1/0 گرم ترکیب بریلیانت کریزل بلو، 8/3 گرم سدیم سیترات و 2/0 میلیلیتر فرمالدهید 37% در 100 میلیلیتر آب مقطر تهیه میشود. پس از قرار دادن لامل روی لام هموسایتومتر، سه تا چهار قطره از مایع درون پیپت را تخلیه شد تا در فاصله بین آن دو جریان یافته و حجره لام را پرکند. لام در زیر میکروسکوپ قرار گرفت و یاختههای قرمز موجود در 5 مربع کوچک از 25 مربع مرکزی با لنز 40 شمارش شد. برای محاسبه تعداد گلبولهای قرمز در هر میلیمتر مکعب خون با رقت یک دویستم از رابطه ذیل استفاده شد:
N=n×S×h×d
N=n×5×10×200=n×1000 در این رابطه N مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در 5 مربع کوچک، S مساحت 5 مربع (یک پنچم مترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (رقت 200/1) را نشان میدهد]26[.
3-7 شاخصهای ثانویه خونشناسی
شاخصهای ثانویه خونشناسی برای توصیف اندازه سلولها و میزان هموگلوبین آنها بهکار میرود]26[.
3-7-1 حجم متوسط گویچه قرمز (MCV)
این شاخص حجم متوسط هر یاخته قرمز خون را نشان میدهد. این شاخص بر حسب فمتولیتر محاسبه میشود. هر فمتولیتر برابر یک میکرومتر مکعب است.
MCV=HCTRBC×10
در این رابطه، HCT میزان هماتوکریت و RBC تعداد یاختههای قرمز خون (بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد.
3-7-2 میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای (MCHC)
این شاخص غلظت هموگلوبین در توده یاختههای قرمز را بر حسب درصد نشان میدهد.
MCHC=HbHCT×100 در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و HCT میزان هماتوکریت را نشان میدهد.
3-7-3 میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH)این شاخص متوسط هموگلوبین در یک یاخته قرمزخون را بر حسب پیکوگرم نشان میدهد.
MCH=HbRBC×100 در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و RBC(بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد]26[.
3-8 شمارش گلبولهای سفید
به دلیل تراکم کمتر سلولهای سفید خون (WBC) نسبت به یاختههای قرمز، رقیق سازی با رقت کمتری صورت میگیرد. به این منظور از پیپت ملانژور سفید استفاده میشود. برای استفاده از این نوع پیپت، تا درجه 5/0 آن از خون و بقیه حجم تیوب تا درجه 11 از محلول رقیق کننده دایس پر میشود (رقت یک بیستم). سپس همانند روش توضیح داده برای گلبول قرمز شمارش شدند. برای محاسبه تعداد گلبولهایسفید در هر میلیمتر مکعب خون با رقت یک دویستم از رابطه ذیل استفاده شد:

N=n×S×h×dN=n×50 در این رابطه N مجموع یاختههای سفید شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای سفید شمارش شده در چهار مربع، S مساحت چهار مربع (چهار میلیمترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (یک بیستم) را نشان میدهد]26 [.
3-9 نمونهبرداری برای مطالعه بافتشناسی
نمونه برداری از ماهیان در پایان 14 روز پس از در معرض قرار گیری با کادمیوم با برداشت همه ماهیان در طی یک روز انجام گرفت. پس از بیهوش کردن ماهیان توسط گل میخک، بافتهای کبد، آبشش به منظور انجام بافت شناسی جدا سازی شد سپس در محلول 10 درصد فرمالین برای انجام عمل بافت شناسی قرارگرفت.
3-10 تهیه مقطع بافتی
آماده سازی نمونهها و تهیه اسلایدهای میکروسکوپی مطابق روش زیر اجرا گردید ]58 .[
3-10-1مرحله آبگیری و شفاف سازی
بافتها با دستگاه عملآور بافت به ترتیب با نگهداری در اتانول 70، 80، 95، 95، 100، 100درجه به شرح زیر اجرا شد.
الکل 70% یک ساعت
الکل 80% یک ساعت
الکل 95% دو ساعت
الکل 95% دو ساعت
الکل 100% دو ساعت
الکل 100% یک ساعت
به منظورآبگیری و سپس در گزیلل برای شفاف سازی قرارگرفتند.
گزیلل 45 دقیقه
گزیلل 45 دقیقه
گزیلل به عنوان حلال حد واسط بین الکل و پارافین عمل کرده و در هر دو آنها حل میشود.
3-10-2 مرحله قالبگیری
پارافین جامد با دمای ذوب 60-58 درجه سانتی گراد برای پارافینه کردن بافت استفاده شد. مراحل کار شامل قرار دادن نمونهها در پارافین مذاب با سه مرتبه تعویض و در نهایت قرار دادن آنها در پارافین مذاب به مدت 12 ساعت بود. در پایان قالب گیری با پارافین مذاب انجام شد]58[.
3-10-3 برش وتهیه لام
در این مرحله تهیه برش (6-5 میکرومتر) از قالبهای پارافینی با میکروتوم JUNG RM 2055 صورت گرفت. نوارهای پارافینی حاوی بافت بر روی سطح حمام بافت آب و الکل(20% الکل و 80% آب با دمای 40-35 درجه سانتیگراد) تا زمانی که چین و چروک آن برطرف شود، قرار داده شدند.
3-10-4 رنگآمیزی
هماتوکسیلین- ائوزین روش انتخابی برای رنگآمیزی بود. در این روش، قسمتهای بازوفیل، هسته با رنگ هماتوکسیلین و بخشهای اسیدوفیل، سیتوپلاسم با رنگ ائوزین رنگ آمیزی شدند. لامها داخل انکوباتور 62-56 درجه سانتیگراد قرار داده تا پارافین آنها ذوب و جدا شود. سپس لام نمونه بافت از مراحل زیر تیمار شدند.
3-10-5کمیسازی آسیب بافتی
در اغلب موارد، تغییرات بافتی تنها به صورت توصیفی و کیفی صورت میگیرد، اما لازم است که برای مقایسه آماری و شدت تاثیر از روش کمی استفاده شود. در این تحقیق برای شرح تغییرات بافتشناسی و سنجش شدت آسیب، روش پیشنهادی برنت و همکاران (1999) استفاده شد. طبق این روش تغییرات آسیبشناسی (اندام) در پنج الگوی واکنش طبقهبندی شدند. تغییرات در هر الگوی واکنش، قسمتهای درم (اپیدرم) اندام و یا کل اندام را در بر میگیرد. پنج واکنش به شرح زیر است:
الگوی واکنش یک (rp1): اختلالات گردش خون:
الف- خونریزی، پرخونی و آنوریسم (اتساع رگهای خونی).
ب- ادم داخل سلولی: مایع داخل مویرگها به درون بافت تراوش میکند.
الگوی واکنش دو(rp2): تغییرات برگشتپذیر: ضایعاتی هستند که سبب کاهش فعالیت و عملکرد سلولها و بافتها میشوند.
الف- تغییرات ساختاری: تغییرات در ساختار بافت و همچنین تغییر در شکل و ترتیب سلولها.
ب- تغییرات پلاسما: تغییرات در پلاسمای سلول ناشی از قطرات شفاف (دژنره شدن دانهای)، قطرات کلوئیدی (فساد کلوئیدی)، دژنره شدن گلیکوژن، آهکی شدن و ضخیم شدن الیاف ریز بافت همبند.
ج- رسوب: تجمع مواد در داخل سلول.
د- تغییرات هستهای: تغییر در شکل هسته و ساختار کروماتین.
و- آتروفی: کاهش در تعداد و حجم سلول و یا کاهش اندامکهای داخل سلولی.
ه- نکروز: وضعیت ریختشناسی سلول یا بافت که به نظر میرسد سبب از دست دادن قطعی عملکرد سلول شود.
الگوی واکنش سه (rp3): تغییرات پیشرونده: فرآیندهایی که منتهی به افزایش فعالیت سلول یا بافتها میشود.
الف- هیپرتروفی: بزرگ شدن حجم سلول یا بافت بدون افزایش در تعداد سلولها.
ب- هیپرپلاژی: بزرگ شدن بافت یا اندام به خاطر افزایش در تعداد سلولها بدون تغییر در حجم سلولها.
الگوی واکنش چهار (rp4): آماس :
تورم یا آماس واکنش دفاعی و حفاظتی در حیوان زنده است، که به هنگام تحریک توسط عوامل فیزیکی و یا شیمیایی و همچنین زمانی که انگلها بافتها را به طور موضعی شدیداً آلوده کنند، رخ میدهد. تغییرات التهابی اغلب با فرآیندهای واکنشهای دیگر مثل ادم در ارتباط است.
الف- ترشح التهابی: مواد مترشحه حاوی غلظت بالایی از پروتئینها و مقدار زیادی بقایای سلولی است که از خون و عروق لنفاوی خارج میشود.
ب- فعالشدن سیستم ماکروفاژ یا سیستم رتیکولواندوتلیال :بخشی از سیستم ایمنی بدن شامل سلولهای فاگوسیتوز است که در بافت همبند مشبک قرار دارد.
ج- نفوذ: نفوذ لوکوسیتها به دیواره عروق خونی و بافتهای اطراف.
الگوی واکنش پنج:rp5 تومور (نئوپلاسم)
الف- تومورهای خوشخیم: سلولهای تمایز یافتهای که جایگزین سلولهای بافت اصلی میشوند. این سلولهای توموری شبیه سلولهای بافت اصلی هستند.
ب- تومورهای بدخیم: این سلولها به مقدار ناچیزی تمایز یافتهاند و به سرعت تکثیر میکنند و بافت اصلی را از بین میبرند. دگردیسی ممکن است دیده شود.
ج- برای نشان دادن گسترش تغییر آسیبشناسی از روش برنت همکاران (2005) استفاده شد [39]. در این روش هر برش از هر اسلاید به شرح زیر مورد بررسی قرار گرفت.
هیپرپلاژی سلولهای اپیتلیال رشتهها و تیغههای ثانویه آبششی با گرزی شدن: کمتر از 10 رشته (-)، 10-20 رشته (+)، 20-30 رشته (++)، 30-40 رشته (+++)، و بالای 40 رشته (++++).
حلقه شدن تیغههای ثانویه آبششی: کمتر از 5 رشته (-)، 5-20 رشته (+)، 20-40 رشته (++)، 40-60 رشته (+++) و بالای 60 رشته (++++).
کوتاه شدن تیغههای ثانویه: کمتر از 5 رشته (-)، 5-10 رشته (+)، 10-20 رشته (++)، 20-30 رشته (+++)، و بالای 30 رشته (++++).
برای ارزیابی تغییرات بافتشناسی در اندامهای مختلف یک روش استاندارد پیشنهاد شده که این روش بر اساس دو عامل است:
الف- گسترش تغییر آسیبشناسی که با ارزش نمره (a) ارزیابی میشود. هر تغییر در محدوده 0-6 ارزیابی شد. با توجه به درجه و میزان تغییر عدد صفر (بدون تغییر)، 2 (تغییر ضعیف)، 4 (تغییر متوسط)، و 6 (وقوع تغییر شدید)، البته مقادیر بینابین هم در نظر گرفته شد (هر مثبت معادل یک عدد در نظر گرفته شد).
ب- اهمیت آسیب شناسی که به عنوان یک فاکتور اهمیت (W) تعریف شده است. آسیب وارده با اهمیت عملکرد بافت ارتباط دارد یعنی آسیب بر عملکرد اندام یا بافت و توانایی بقای ماهیان چگونه اثر میگذارد این تغییرات در سه فاکتور طبقهبندی شدهاند:
:A حداقل اهمیت آسیبشناسی، آسیب ایجاد شده به راحتی بعد از در معرض قرارگیری با مواد محرک قابل برگشت است.
:B متوسط اهمیت آسیبشناسی، آسیب در اکثر مواقع در مواقعی که عامل استرسزا خنثی میشود، برگشتپذیر است.
:C اهمیت پاتولوژیک مشخص و واضح، آسیب معمولاً برگشتناپذیر است. منجر به از دست رفتن عملکرد بافت یا اندام میشود.
با استفاده از فاکتور اهمیت (جدول 3-1) و ارزش نمره شاخص اندام برای بافت آبشش محاسبه شد:
Iorg=rpaltaorg rp alt×worg rp alt
:org اندام یا بافت، :alt تغییرات، :rpالگوی واکنش، :a ارزش نمره، :w فاکتور اهمیت
این شاخص درجه آسیب یک بافت را نشان میدهد که حاصلضرب اهمیت فاکتور و ارزش نمره همه تغییرات یافت شده در بافت مورد آزمایش است. این شاخص امکان مقایسه بین درجه آسیب همان اندام را در ماهیان مختلف میدهد.

جدول 3-1 روش ارزیابی آسیبشناسی بافتها [39]
a ارزش نمره فاکتور اهمیت w تغییرات واحد عملکردی بافت الگوی واکنش
aGC1 WGC1=1 خونریزی، پرخونی، آنوریسم اختلالات خونی
aGC2 WGC2=1 ادم داخل سلولی aGR1 WGR1=1 ساختاری بافت پوششی تغییرات برگشتپذیر
aGR2 WGR2=1 تغییرات پلاسما aGR3 WGr3=1 رسوب aGR4 WGR4=2 تغییرات هستهای aGR5 WGR5=2 آتروفی aGR6 WGR6=3 نکروز aGR7 WGR7=1 ساختاری بافت حمایت کننده
aGR8 WGR8=1 تغییرات پلاسما aGR9 WGR9=1 رسوب aGR10 WGR10=2 تغییرات هستهای aGR11 WGR11=2 آتروفی aGR12 WGR12=3 نکروز aGP1 WGP1=1 هایپرتروفی بافت پوششی تغییرات پیشرونده
aGP2 WGP2=2 هیپرپلازی aGP3 WGP3=1 هیپرتروفی بافت حمایت کننده aGI1 WGI1=1 ترشحات التهابی التهاب
aGI2 WGI2=1 فعال شدن ماکروفاژ aGI3 WGI3=2 نفوذ لکوسیت ها aGT1 WGT1=2 خوشخیم تومور