—d1794

3-2- وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده20
3-3- مواد شیمیایی20
3-4- آماده‌سازی گیاه گزنه20
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-7- استخراج عصاره متانولی24
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل24
3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی25
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC26
3-8-1- آماده سازی نمونه26
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک27
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی27
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC29
3-9-1- آماده سازی نمونه29
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین29
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی30
3-10- مشخصات طرح31
3-11- تجزیه و تحلیل آماری31
فصل چهارم- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک34
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ34
4-1-2- تعداد برگ در بوته36
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها36
4-1-4- قطر ساقه37
4-1-5- قطر و طول ریشه37
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته.37
4-1-7-ارتفاع گیاه38
4-1-8- میزان کلروفیل38
4-2- صفات بیوشیمیایی39
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل39
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل42
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل44
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل46
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل48
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید50
4-4- نتیجه گیری کلی56
4-5- پیشنهادات56
منابع58
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- طبقه بندی ترکیبات فنلی12
جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک35
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن35
جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه36
جدول4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر40
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمایی مورد بررسی با دستگاه HPLC40
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه7
شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ، ب- فیروزجاه، پ- خشک کردن گزنه21
شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید25
شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین26
شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک28
شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک28
شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین30
شکل 3-7- کروماتوگرام استاندارد روتین31
شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ41
شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل41
شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه42
شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ43
شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل43
شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه44
شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ45
شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل45
شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه46
شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ47
شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل47
شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه48
شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ49
شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل49
شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ51
شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل51
شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه52
شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی52

1-1- مقدمه
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور است که امکان صادرات آن نیز وجود دارد. ایران از نظر آب و هوا در زمینه رشد گیاهان دارویی یکی از بهترین مناطق جهان محسوب می‌‌شود، به همین دلیل صادرات آن می‌‌تواند منبع بزرگی از درآمد برای کشور باشد (صمصام شریعت، 1382). بنابراین ضروریست تا با توجه به توان بالقوه بسیار خوب کشور در زمینه تنوع گیاهان دارویی، با شناخت گونه‌‌های گیاهی و دستیابی به اطلاعات لازم در مورد محل‌‌های رویش و خصوصیات بوم‌‌شناختی آن‌ها، گام‌‌های اساسی برای استفاده از اسانس‌‌های گیاهی و ترویج شیوه‌‌های اصولی بهره‌‌برداری از این گیاهان برداشته شود (حسنی، 1383).
گیاه دارویی به گیاهان و مشتقات آن‌ها گفته می‌‌شود که دارای مواد موثر مشخص است، در درمان بیماری یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می‌‌گیرد و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه‌‌های معتبر بین‌‌المللی ذکر شده باشد (دوازده امامی و مجنون‌‌حسینی، 1387).
فارماکوپه یک کتاب رسمی است که توسط دولت هر کشور و یا انجمن‌‌های پزشکی و داروسازی زیر نظر دولت به چاپ می‌‌رسد و حاوی حقایق علمی و اصول استاندارد‌‌سازی مواد دارویی از قبیل روش‌‌های جمع‌‌آوری مواد دارویی از منابع مختلف، آماده سازی، نگهداری، ترکیب و اختلاط داروهای مختلف و روش‌‌های اثبات آن‌ها می‌‌باشد. به علاوه این کتاب شامل دارو‌‌هایی با استعمال خارجی، نحوه نسخه‌‌نویسی، نحوه و مقدار تجویز دارو‌‌ها و اطلاعات کامل تهیه، ساخت و کاربرد داروهاست (دوازده امامی، 1382).
استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده‌‌های حاصل از آن‌ها نقش این گیاهان را در چرخه اقتصادی پر اهمیت کرده است. به طوری که مصرف رو به ازدیاد آن‌ها تنها به کشور‌‌های در حال توسعه محدود نشده است، بلکه اخیراً در کشور‌‌های توسعه یافته نیز جایگاه ویژه‌‌ای به خود اختصاص داده است. در اواخر قرن بیستم حجم مبادلات جهانی گیاهان دارویی به 200 میلیارد دلار بالغ گردیده است. بر اساس گزارش سازمان خوار و بار جهانی (FAO) ارزش صادرات گیاهان دارویی در سال 1995 بالغ بر 880 میلیون دلار بوده است. بر اساس گزارش بانک جهانی، حجم تجارت گیاهان دارویی تا سال 2050 بالغ بر 5 تریلیون دلار خواهد بود (امیدبیگی، 1384). در حالی که طی گزارشی میزان ارزش فروش گیاهان دارویی در ایران در سال 2000 میلادی تنها در حدود 37 میلیارد ریال برآورد شده است و این در حالی است که ایران جزء 8 کشور مهم دارای فلور متنوع گیاهان دارویی در دنیاست (قاسمی، 1389).
گزنه از مهمترین گیاهان دارویی است که از دوران ماقبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم آن زمان از آن برای تغذیه استفاده می‌کردند و از خواص درمانی آن اطلاع داشته‌اند. از کاربرد‌‌های دارویی آن می‌توان به کاهش قند خون، کاهش التهاب آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، درمان پروستات و اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق
تاثیر ارتفاع بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی (ریخت‌‌شناسی) گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اندام‌‌های گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گیاه گزنه چگونه است؟
1-3- فرضیهها
عوامل محیطی روی میزان ترکیبات ثانویه گیاه گزنه موثر است.
شرایط محیطی متنوع در زیستگاه‌های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیکی گیاه تاثیر می‌گذارند.
میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی تحت تاثیر ارتفاع قرار دارد.
1-4- اهداف
ارزیابی تاثیر اقلیم‌‌های مختلف بر صفات ریختی و عملکرد برخی مواد موثره گزنه.
معرفی بهترین ارتفاع و اندام دارویی گزنه از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی.
مقایسه برخی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی موجود درگزنه در ارتفاعات مختلف.
-76508-504458

2- بررسی منابع
2-1- گیاه‌شناسی گزنه
گزنه با نام علمی Urtica dioica از خانواده Urticaceae می‌باشد. گزنه، گیاهی است علفی، چند‌‌ساله، پایا، دوپایه و بندرت تکپایه، ریزوم‌‌دار، به ارتفاع 150-50 سانتیمتر، دارای کرک‌‌های گزنده، ساقه آن علفی، کمی زاویه‌‌دار و چهار پهلو، تقریباً ضخیم، ساده و یا خیلی کمانشعاب و پوشیده از کرک‌‌های گزنده، برگ‌‌ها نیزه‌‌ای، نیزه‌‌ای باریک، تخممرغی، تخممرغی پهن تا تقریبا دایره‌‌ای، نوک تیز یا نوک باریک، قاعده قلبی، باریک یا گوه‌‌ای، اندازه برگ 5/2-12×5/4-15 سانتیمتر، رنگ برگ‌‌ها سبز روشن است. برگ‌‌ها عموما گوشواره‌‌دار و گاه بدون گوشواره، متقابل و پوشیده از کرک‌‌های گزنده است. گل‌‌های آن، تک جنسی، بسیار ریز، سبز فام، مجتمع در توده‌‌های کوچک کروی، و واقع در طول محورهای خوشه‌‌ای شکل، گل‌‌های نر دارای 4 کاسبرگ هم اندازه و 4 پرچم با بساک‌‌های پهن دراز و قلوه‌‌ای شکل، ماده‌‌ها دارای 4 کاسبرگ متقابل صلیبی، دو کاسبرگ خارجی بسیار کوچک و گاهی گل فاقد آن و رنگ آن‌ها سبز مایل به زرد می‌‌باشد. گلآذین سنبله یا خوشهای مرکب، کرکی متراکم، گل‌آذین نر 4-11 سانتیمتر و ماده 5/1-9 سانتیمتر میباشد میوه آن فندقه تخم‌مرغی تا بیضوی و محتوی آلبومین روغن‌‌دار است. فندقه به طول 5/1 میلی‌‌متر و محصور در کاسه پایای گل می‌‌باشد (شکل 2-1)، (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ قهرمان، 1372).
تکثیر آن از طریق کاشت بذر در بهار یا تابستان و کاشت قطعات ریشه‌‌دار در پاییز صورت می‌‌گیرد (زرگری، 1383).

شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه (ویلر، 1981)
2-2- دامنه انتشار
این گیاه غالبا در اماکن مخروبه، باغ‌‌ها، و نقاط مرطوب خارج شهر و نواحی سایه‌‌دار و جاهایی که چهار‌‌پایان در آنجا به سر می‌‌برند، به حالت خودرو می‌‌روید. از ریشه‌‌‌‌های خزنده آن پاجوش‌‌هایی در کلیه جهات خارج می‌‌گردد که خود باعث می‌‌شود گیاه بصورت پایه‌‌های متعدد در آمده، تا محل رویش خود را به کلی فرا گیرد. انتشار عمومی گیاه گزنه در نقاط مرطوب ایران خصوصاً نواحی شمالی، غربی و مرکزی مانند اصفهان، شاهرود، بسطام و کاشان است (زرگری، 1376).
2-3- اندام‌های دارویی
برگ‌‌ها، ریشه، دانه و شیرابۀ گیاه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌‌دهند (زرگری، 1376). گلدهی آن از اواسط اردیبهشت تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد و بهترین زمان برداشت و جمع‌‌آوری برگ‌‌‌‌های این گیاه از اردیبهشت‌‌ تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی
گزنه دارای تانن، موسیلاژ، اسید فورمیک، ماده مومی، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کنندگی پوست، نیتراتپتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن‌‌دار، گوگرد و نوعی ماده رنگی به نام اورتی‌‌سین در سر شاخه هوایی می‌‌باشد (زرگری، 1376). در برگ گیاه گزنه، کلروفیل، گزانتوفیل، لوکوآنتوسیانیدین، فلاوون و فلاونول موجود است که فلاوون و فلاونول به میزان کمتری از لوکوآنتوسیانیدین در این گیاه است. تری‌‌ترپن‌‌ها و استرول‌‌ها شامل بتاسیتوسترول در گیاه موجود است. اسید فرمیک نیز در برگ وجود دارد. برگ‌‌های تازه گزنه حاوی سکرتین می‌‌باشد. همین‌‌طور دارای 5/1 درصد کلروفیل خالص است. برگ خشک گزنه 5/7 درصد کلروفیل دارد. اسیدهای فنلی نیز در این گیاه وجود دارد که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، اسکولتین و کافئوئیل مالیک اسید و کلروژنیک اسید می‌‌باشد. تری گلیسیرید، دی گلیسیرید و فسفولیپید‌‌های مختلفی هم از این گیاه جدا شده است. سیتوکنین‌‌های عمده گزنه شامل زآتین، زآتین نوکلئوتید، ایزو پنتیل آدنین، ایزو پنتیل آدنوزین، ایزو پنتیل آدنین نوکلئوتید و دی هیدرو زآتین می‌‌باشد. همچنین ترکیبات ایندولی همراه با هیستامین و 5- هیدروکسی تریپتامین و اسید‌‌هایی از جمله اسید آسکوربیک، سالیسیلیک اسید و عناصری مانند ازت، گوگرد، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و عناصر نادر مانند آهن، روی، مولیبدن و مس موجود است (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
ترکیبات فنلی موجود در گزنه که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، فیستین و میریستین می‌‌باشند. بر باکتری‌‌هایی مثل اشریشیاکلی، پروتئوس ‌‌ولگاریکوس، کلبسیلا و پسودوموناس اثر دارد و عصاره این گیاه بر سالمونلا و پروتئوس که در مقابل آنتی‌‌بیوتیک‌‌ها مقاوم است، خاصیت آنتی‌‌بیوتیکی دارد. همچنیین باعث وقفه در رشد چندین مخمر، کپک، قارچ و باکتری شده است. اثرات ضد قارچی بعضی ترکیبات موجود در گزنه نیز تائید شده است. گزنه دارای اثرات مدری است. اثرات دیورتیک این گیاه با افزایش دفع کلر و اوره همراه است و ثابت شده که مصرف 14 روزه این گیاه موجب کاهش وزن بدن و نیز کاهش فشار سیستولیک می‌‌گردد (محمودی و همکاران، 2007). گزنه بصورت خوراکی به عنوان مدر، پایین آورنده قند خون و اسید اوریک و به صورت موضعی در درمان برخی از بیماری‌‌های پوستی و مو از جمله اگزما، بیماری‌‌های التهابی و حتی در درمان ریزش مو مورد استفاده قرار می‌‌گیرد (محمودی و همکاران، 2007). اعتقاد بر این است که جوشانده گیاه و خیسانده ریشه آن در الکل بصورت لوسیون در رشد موی سر موثر است. همچنین عصاره ریشه گزنه در بعضی حالات هیپرتروف غده پروستات را بهبود می‌بخشد (آزاد بخت، 1378). از دیگر کاربردهای دارویی گزنه می‌‌توان به درمان آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، بزرگ شدگی ‌‌پروستات، حساسیت فصلی و درمان اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی
پراکنش و استقرار گیاهان اصولاً تحت تاثیر شرایط محیط و عوامل داخلی گیاه صورت می‌‌گیرد. مهم‌‌ترین عوامل موثر بر ترکیبات شیمیایی ثانویه گیاهان عوامل ژنتیکی، محیطی و اثرات متقابل آن‌ها ست. عوامل ژنتیکی مربوط به ژنوم گیاه است. از عوامل محیطی و اکولوژیکی مؤثر می‌‌توان عوامل آب و هوایی، جغرافیایی و ادافیکی (خاکی) را نام برد. عوامل آب و هوایی مانند دما، بارندگی، طول روز، نور خورشید، تبخیر و تعرق و باد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌‌های ثانویه این گیاهان دارند. ارتفاع از سطح دریا، درصد شیب و جهت آن، عرض جغرافیایی، پوشش اراضی، نزدیکی به منابع آبی به طور مستقیم یا غیر مستقیم به واسطه تأثیر بر سایر عوامل بوم شناسی بر سنتز ترکیبات ثانویه به خصوص اسانس در گیاهان موثر هستند. خصوصیات خاک مثل بافت خاک، مواد آلی، آهک، شوری و اسیدیته از فاکتورهای محیطی می‌‌باشند که باید مورد مطالعه قرار گیرند. در صورتیکه گیاه اهلی شده باشد عوامل مدیریتی نیز تاحدودی بر درصد ترکیبات ثانویه گیاهان دارویی موثر است (قاسمی، 1389). از مهمترین عوامل محیط رویش گیاهان که تاثیر بسیار عمده‌‌ای بر کمیت و کیفیت مواد موثره آن‌ها می‌‌گذارند، نور، درجه‌‌حرارت، آبیاری و ارتفاع محل می‌‌باشد (امید بیگی، 1384). بر پایه تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محـور زیـر بر آن‌ها تاثیـر می‌‌گـذارد: 1- تاثیر بر مقدار کلی ماده موثره گیاهان دارویی؛ 2- تاثیر بر عناصر تشکیل دهنده مواد موثره؛ 3- تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه (امیدبیگی، 1384).
به‍طور‌‌ کلی مواد مؤثره گیاهان دارویی که حاصل سوخت‌‌و‌‌ساز (متابولیسم) ثانویه است به ‍عنوان ترکیبــات ثانویه معروف می‌‌باشند. این ترکیبات عموماً وزن مولکولی کمتر از 1000 داشته و به ‍مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول‌های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولیـد می‌شوند. گیـاهان دارای این نوع مکانیـسم‌ها، نسبت به سایر گیاهان از سازگاری و بقای طولانی‌‌تری برخوردارند (تایز و زایگر، 1379). مهـم‍ترین آن‌ها آلــکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن‌‌های فرار (اسانس‌ها)، فنلها، تانن‌ها، فلاونوئیدها و غیره هستند. تولید این ترکیبات برای گیاه گران و هزینه‍بر می‌باشند، ولی گیاه این ترکیبات را بیهوده تولید نمی‌کند و اهـداف خاصی جهت تولید، ترشح و ذخیره آن‌ها دارد که مهم‍ترین این وظایف به شرح زیر است:
- دفع عوامل بیماریزا
- دفع آفات و حیـوانات گیاه‍خوار
- افزایش توان رقابتی گیاه بر سر منابع مانند نور، آب و مواد غذایی
- جلب حشرات و پرندگان گردهافشان
- رفع تنشهای غـیرزنده و حفاظت در برابر اشعۀ ماوراء بنفش (قاسمی، 1389).
2-6- فنل و فلاونوئید
ترکیبات فنلی به یک گروه وسیع و متنوعای از ترکیبات شیمیایی اطلاق میشود که این ترکیبات می‌‌توانند به روش‌‌های مختلفی طبقه‌‌بندی شوند. هاربورن و سیموندس این ترکیبات را به گروه‌‌هایی بر اساس تعداد کربن‌‌های موجود در مولکول طبقه‌بندی کردند (جدول 2-1) (ورمریس و نیکولسون، 2006).
ترکیبات فنولی در طی رشد و نمو با هدایت عوامل ژنتیکی و در پاسخ به محرکهای محیطی از جمله آلودگی، زخم و تابش فرابنفش ساخته میشوند که از میان آنها میتوان به لیگنینها، لیگنانها، فنلهای ساده و اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها اشاره کرد. این ترکیبات بخش جدایی ناپذیری در رژیم غذایی بشر بوده و به دلیل ویژگیهای آنتیاکسیدانی قوی و ضدسرطانی، بسیار مورد توجه است (قربانی و همکاران، 1390؛ محمد و همکاران، 2001؛ دینکا و همکاران، 2004؛ اسکین و رابینسون، 2000).
ترکیبات فنولی دارای خواص متعددی از جمله خواص آنتی باکتریال، ضدقارچ، ضدویروس، ضددیابت، ضدالرژی و ضدالتهاب هستند. اما بیشتر به منظور فعالیت‌های ضدویروسی و آنتی‌اکسیدانیشان شهرت دارند به خصوص در بعضی از اسیدهای فنولیکی مانند اسیدکلرژنیک، اسیدگالیک و اسیدکافئیک (دیمیتری جویک و همکاران، 2010).
فلاونوئیدها دسته‌‌ای از ترکیبات طبیعی هستند که در سلسله گیاهان گسترش وسیعی دارند. آن‌ها به عنوان یکی از بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی شناخته می‌‌شوند. تا به امروز متجاوز از 4000 فلاونوئید شناخته شده است که به طور وسیعی در برگ‌‌ها، دانه‌‌ها، پوسته و گل‌‌های گیاهی وجود دارند. به‌‌طور کلی فلاونوئیدها بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی فنلی در گیاهان هستند و به دلیل حضور آن‌ها در تقریبا همه گروه‌‌های گیاهی، در بیشتر مطالعات مربوط به عصاره‌‌های گیاهی مورد بررسی قرار می‌‌گیرند (مدیکا و همکاران، 2004).

جدول 2-1- طبقهبندی ترکیبات فنلی (ورمریس و نیکولسون، 2006).

فلاونوئیدها به عنوان یکی از گستردهترین متابولیتهای ثانویه در گیاهان هستند که فعالیتهای مختلفی را بر عهده دارند. آنها دارای اثرات و عملکرد بسیار مفیدی بر سلامتی انسان هستند که دارای شش زیر گروه میباشند: فلاوونها، ایزو فلاوونها، فلاونولها، فلاونون، آنتوسیانین‌‌ها و آنتوسیانیدین. فلاونوئیدها معمولاً در واکوئل گیاهان به صورت گلیکوزید تجمع مییابند. فلاونها مخصوصا کامپفرول و کوئرستین در بسیاری از گونههای گیاهی وجود دارد که برای جوانهزنی گرده و رشد لوله گرده ضروری است (جاکولا و هوتولا، 2010؛ کاسیمیر و مین، 2008).
فلاونوئیدها ترکیبات دیفنیل پروپانوئیدهایی هستند که تقریبا در همه گیاهان یافت می‌‌شوند و نقش‌‌های فراوانی برای این ترکیبات شناخته شده است، در گیاهان عالی، فلاونوئیدها دفاع در برابر نور ماورابنفش، پاتوژن‌‌ها و علف‌‌خوران را سبب می‌‌شوند. نقش‌‌های ویژه‌‌ آن‌ها در گیاهان، در ایجاد رنگ و تثبیت نیتروژن در گیاهانی است که دارای زندگی همزیستی‌‌اند. اثرات سلامت فلاونوئیدها بیشتر در نتیجه خاصیت آنتی‌‌اکسیدانی و توانایی کلات‌‌کنندگی آن‌ها ست. مطالعات زیادی انجام شده است تا موثر بودن فلاونوئیدها به عنوان، عوامل ضدقارچی، ضدباکتری، ضدویروسی، ضداشتعال، آنتی‌‌اکسیدانت، متعادل کننده ایمنی، بازدارنده آنزیمی و عوامل موتاژنی سمی به اثبات رساند (مدیکا و همکاران، 2004).
روتین نوعی فلاونوئید است، روتین در پیشگیری و درمان افزایش فشار خون و سایر نارسائیهای قلبی و عروقی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی مطرح است (افشار و همکاران، 1376).
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد
عملکرد، میزان و کیفیت مواد ثانویه یک گیاه در رویشگاه‌‌ها و مناطق مختلف تغییر می‌‌یابد، دلیل این امر نوسان فعالیت‌‌های متابولیکی گیاه تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی است، نتیجه تاثیر طولانی عوامل محیطی، تشکیل جمعیت‌‌های تازه زیرگونه‌‌ای یا اکوتیپ‌‌های مشتق از یک گونه گیاهی خاص است (امیدبیگی، 1388). تفاوت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بین اکوتیپ‌‌های گیاهی به اثبات رسیده است و این اختلافات می‌‌تواند به منظور انتخاب بهترین کمیت و کیفیت مورد استفاده قرار گیرد (آواتو و همکاران، 1998؛ برادلی و همکاران، 1996). در دهه اخیر در کشورهای مطرح دنیا در زمینه تولید گیاهان دارویی مانند مجارستان، ایتالیا و اسلواکی بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و ترکیبات ثانویه به منظور به کارگیری در برنامه‌‌های به‌‌نژادی صورت گرفته است و اکوتیپ‌‌های برتر نسبت به ارقام اصلاح شده شناسایی گردیده‌‌اند (من و استابا، 1986). در ارزیابی خصوصیات گیاهشناسی، درصد و اجزای اسانس اکوتیپ‌‌های آویشن کرمانی توسط مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران (1389)، نتایج نشان داد که بیشترین ارتفاع بوته، قطر بوته، تعداد شاخساره، طول و عرض برگ، وزن تر و وزن خشک بوته مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین مربوط به اکوتیپ شاهرود بود، ولی تعداد شاخساره در بوته، طول برگ و عرض برگ در هیچ یک از اکوتیپ‌‌ها با اکوتیپ دیگری اختلاف معنی‌‌داری نداشت. عسکرزاده و همکاران (1387) در مقایسه 8 اکوتیپ زیرهکوهی از نقاط مختلف ایران در شرایط مزرعه به منظور بررسی عملکرد کمی و کیفی گزارش کردند که بیشترین عملکرد تکبوته مربوط به اکوتیپ منطقه خواجه خراسان و کمترین عملکرد مربوط به اکوتیپ کوه باقران بیرجند بود. نتایج مطالعه‌‌ای روی بررسی مورفولوژی، فنولوژی و برخی مشخصات کیفی چند اکوتیپ علف باغ از مناطق مختلف ایران و یک اکوتیپ خارجی در شرایط آزمایشگاه نشان داد که بالاترین ارتفاع بوته مربوط به اکوتیپ همدان و کمترین مربوط به اکوتیپ کرج، بیشترین میزان وزنتر متعلق به اکوتیپ خارجی و کمترین متعلق به اکوتیپ همدان بود در حالیکه بیشترین وزن خشک در اکوتیپ اردبیل و کمترین در اکوتیپ خارجی مشاهده شد (علیزاده و جعفری، 2011). به منظور بررسی اجزای عملکرد، مورفولوژی اکوتیپ‌‌های بومی یونجه کشور ترکیه آزمایشی توسط سینگ در سال 2002 انجام شد و نتایج این آزمایش بدین صورت بود که بالاترین ارتفاع بوته متعلق به اکوتیپ محمودی و کوتاهترین متعلق به اکوتیپ ارسیس3 بود، اکوتیپ قاسم‌‌اوغلو بیشترین تعداد ساقه و اکوتیپ‌‌های الاکوی و کایرباسی کمترین تعداد ساقه را داشتند، بیشترین تعداد غلاف در اکوتیپ محمودی و کمترین در اکوتیپ گلگورن مشاهده شد.
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیتهای ثانویه
اصولاً مواد ثانویه به اقتضای ساختار طبیعی (وراثت) و هم تحت تاثیر تهییج‌‌های غیرطبیعی(تنشی) در گیاه ساخته می‌‌شوند به‌طوری‌که حضور برخی از این مواد در تعدادی از افراد یک گونه، به‌طور مستثنی از افراد دیگر ممکن است به منزله نشانه فعالیت ژن‌‌های خاص سازگاری آن افراد نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی به شمار آید و افراد مذکور را به عنوان یک جمعیت زیرگونه‌‌ای متفاوت از بقیه که نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی پاسخ شیمیایی ویژه‌‌ای دارند معرفی کند (فیتر و هی، 1987). طی مطالعه‌‌ای با هدف بررسی توده‌‌های محلی مرزه تابستانه نتایج نشان داد که تنوع قابل توجهی از نظر صفات بیوشیمیایی بین توده‌‌ها وجود دارد، میانگین بازده اسانس توده‌های مختلف بین 57/0 و 9/2 درصد متنوع بود که کمترین مقدار آن در توده ارومیه و بیشترین آن متعلق به توده اهواز بود، توده‌‌های اراک، نیشابور، مریوان و اهواز به ترتیب با میزان کارواکرول 3/83، 3/83، 9/76 و 67 درصد در گروه توده‌های غنی از کارواکرول قرار گرفتند (هادیان، 1387).
نتایج تحقیقی با موضوع ارزیابی درصد و اجزای اسانس چندین اکوتیپ‌‌ آویشن کرمانی از مناطق مختلف کشور با ارتفاع مختلف نشان داد که بازده اسانس بر حسب حجم اسانس در 100 گرم سرشاخه خشک در اکوتیپ کرمان- راین، 5/2 درصد، در اکوتیپ کرمان- سیرچ، 9/1 درصد، در اکوتیپ یزد، 2 درصد، در اکوتیپ شاهرود، 8/1 درصد و در اکوتیپ اصفهان، 5/1 درصد بود. همچنین در بررسی میزان ترکیبات غالب اسانس، بیشترین میزان کارواکرول در اکوتیپ کرمان- راین و بیشترین میزان تیمول در اکوتیپ شاهرود مشاهده شد (مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران، 1389). زینلی و همکاران (1386) در بررسی ژنوتیپ‌‌های مختلف دو گونه نعناع لانگیفولیا و اسپیکاتا پس از استخراج اسانس، شناسایی و تعیین مقدار اجزای اسانس با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی، گزارش کردند که توده‌‌های مختلف از لحاظ میزان اسانس و ترکیبات اسانس با هم اختلاف قابل‌‌ توجهی داشتند، این محققین اختلاف در میزان اسانس را مربوط به بالا بودن تعداد برگ و ارتفاع زیاد در تیمارهای با اسانس بالا اعلام کرد و پیشنهاد کردند که از این فاکتورها می‌‌توان به عنوان معیار انتخاب در بین ژنوتیپ‌ها در جهت افزایش عملکرد اسانس استفاده نمود. نری و همکاران (2009) در آزمایشی به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی اکوتیپ‌‌های مختلف شاه‌‌بلوط شیرین مناطق مختلف ایتالیا به این نتیجه رسیدند که بالاترین میزان ساکارز در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا و کمترین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو بود درحالیکه بیشترین میزان پروتئین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو و کمترین میزان در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا مشاهده شد، همچنین درصد اسید مالیک، پلی‌‌فنل‌‌ها و خواص آنتی‌‌اکسیدانتی در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو به طور معنی‌‌داری بالاتر از اکوتیپ وال‌‌کاستلانا بود. طی مطالعه‌‌ای مقایسه‌‌ای اکوتیپ‌‌های مختلف سیر از مناطق مختلف کشور از لحاظ میزان ماده آلیسین مورد مقایسه قرار داده شدند و نشان داده شد که اختلاف در میزان آلیسین در بین اکوتیپ‌‌ها نسبتاً زیاد بود بهطوری که بالاترین میزان (13 درصد) در اکوتیپ گرگان و کمترین میزان (61/1 درصد) در اکوتیپ تالش یک بود، و اکوتیپ‌‌های تارم 1، تربت‌‌جام، بهشهر و تالش 2 از لحاظ میزان آلیسین با هم اختلاف معنی‌‌داری نداشتند.
همتی و همکاران (1386) با بررسی تاثیر اقلیم و اندامهای مختلف روی برخی فلاونویید‌‌های درختچه سرخ ولیک، نشان دادند که اثرات متقابلی بین مکان و صفات وجود دارد و آن‌ها به این نتیجه رسیدند که میزان کوئرستین در اندام کل گیاه سرخ ولیک در کلاردشت مازندران بیشتر از گرگان بود. در بررسی دیگری که جایمند و همکاران (1388) با استفاده از استخراج و اندازهگیری ترکیب‌‌های فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی در مناطق غربی ایران انجام دادند دریافتند که بهترین اکشن‌‌ها از نظر میزان ترکیب‌‌های کامفرول و کوئرستین به ترتیب شامل آذربایجان غربی، ایلام و اردبیل بودند.
یکی از محققان در سال 1973 نسبت به کاشت گونه‌‌ای گل انگشتانه‌‌ در چهار نقطه که از نظر ارتفاع متفاوت بودند (بین 660 تا 1840 متر ارتفاع از سطح دریا) اقدام نموده و پس از مطالعات لازم به این نتیجه رسید که کاشت این گیاه در ارتفاعات بالا بویژه سبب کاهش برخی کلیکوزیدها می‌‌گردد (امیدبیگی، 1384). در تحقیقاتی که در سال 1975 در اتیوپی روی گونه‌‌ای از ریحان انجام گرفت معلوم گردید که در ارتفاعات پایین مقدار لینالول موجود در اسانس گیاه مذکور افزایش می‌‌یابد، در حالی که کاشت این گیاه در ارتفاعات باعث افزایش تولید اوژنول موجود در اسانس می‌‌گردد (امید بیگی، 1384).
تجلی و همکاران (2002) با بررسی تأثیر ارتفاع و اندامها بر روی فنول و فلاونوئید گیاه Carateagus Microphylla بیان داشتند که این گیاه در ارتفاع 1000 متری، دارای بیشترین سطح فنول و فلاونوئید نسبت به گیاهان رشد یافته در ارتفاعات پست بوده است. قاسمی و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتی اکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد.
گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تأثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتی‌کسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیای غربی نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
سپهری‌‌فر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی در عصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره‌‌قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌‌باشد.
نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (2006) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمعآوری شده در سالهای متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

-104361-473572

3- مواد و روش‌ها
3-1- مواد گیاهی
در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
3-2- وسایل و دستگاههای مورد استفاده
کلروفیلسنج: جهت اندازهگیری میزان کلروفیل برگ
خطکش
ترازوی دیجیتال
آسیاب برقی
دستگاه موقعیت سنج (GPS)
سانتریفوژ آزمایشگاهی
دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
3-3- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرفها از شرکت مرک و حلالها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
3-4- آمادهسازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمعآوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال 1390 در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال 91) جهت جمعآوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمعآوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل 3-1). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با استفاده از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش 18 عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمعآوری شد با استفاده از دستگاه موقیعتسنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول 3-1). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول 3-2). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 13 صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گلآذین، تعداد گلآذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.

جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

3-7- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره 18 گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن100 میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با 10 سی‌‌سی متانول 80 درصد (نسبت 1 به 10) مخلوط شد. سپس نمونهها به مدت 24 ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک میباشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکیوالانت اسید گالیک بیان میگردد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با 16/1 میلی‌‌لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از 8-1 دقیقه استراحت، 300 میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (6/10 گرم در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در حمام بخار oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیکاسید (50، 100، 200، 250، 350 میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (50:50) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل 3-2).

شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) استفاده شد؛ به این صورت که 5/0 میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلی‌‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید 10درصد در اتانول (10 گرم آلومینیوم کلرید در 100 میلی‌‌لیتر اتانول و آبمقطر)، 1/0 میلی‌‌لیتر استاتپتاسیم یکمولار (41/2 گرم در 10 میلی‌‌لیتر آب مقطر) و 8/2 میلی‌‌لیتر آبمقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (10، 50، 100 و 200 میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل 3-3).

شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC
3-8-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- 7100

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- 2450
آون ستون: هیتاچی ال-2300
نوع ستون: آر پی- 18 با ابعاد 6/4 250 میلی‌متر و اندازه ذرات 5 میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 1 میلیلیتر اسیداستیک، 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و 10 میلیلیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استاندارد‌‌های اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های 10، 20، 50، 100، 150 و 200 و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های 20، 25، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-4 و 3-5).
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد اسید کلروژنیک و اسید کافئیک به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد نمونهها در طول موج 330 نانومتر قرائت شد.
میزان اسید کلروژنیک و اسید کافئیک بر حسب درصد بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم. واحد مجهول (x) برحسب پی‌‌پی‌‌ام می‌‌باشد.

شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک

شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC
3-9-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فلاونوئیدی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 50 میلیلیتر متانول خالص مرک، 49 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه شده و 1 میلیلیتر اسید استیک با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر (مدت زمانی که طول می‌‌کشد تا ترکیب مورد نظر از ستون خارج شود) و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان روتین تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک نمونه بیان گردید (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد برای روتین غلظت‌‌های 20، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-6).

شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد روتین به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به روتین در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد (شکل 3-7). برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد. نمونهها در طول موج 285 نانومتر قرائت شد. میزان روتین بر حسب درصد یا میلیگرم بر گرم وزن خشک بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم.

شکل 3-7- کروماتوگرام نمونه استاندارد روتین در دقیقه 4:50
3-10- مشخصات طرح
برای انجام این تحقیق از طرح کاملاً تصادفی به صورت آشیانه‌ای استفاده شد. در این طرح اثر چهار ارتفاع در هر یک از دو استان مازندران و گلستان بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مورد بررسی قرار گرفت. برای ویژگی‌های مورفولوژیکی از پنج تکرار و برای ویژگی‌های بیوشیمیایی از سه تکرار استفاده شد. طرح آشیانه‌ای یا نستد در واقع یک طرح کاملاً تصادفی چند مشاهده‌ای می‌باشد، در این تحقیق استان به عنوان تیمار می‌باشد و ارتفاع نقش تکرار را دارد، و از آنجایی که چند نمونه در هر ارتفاع برداشت می‌شود به این طرح‌ها چند مشاهده‌ای گفته می‌شود.
3-11- تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس داده‌های به دست آمده با نرم‌افزار SAS انجام شد و به علت معنی‌دار شدن اثر متقابل ارتفاع در استان، مقایسه میانگین این اثر به کمک نرم‌افزار MSTAT و با روش آزمون دانکن صورت پذیرفت، رسم نمودارها نیز با نرم‌افزار Excel انجام شد.

-225529-624053

4- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک
نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گزنه نشان داد که بین دو استان مازندران و گلستان در تمامی صفات به جزء تعداد گل آذین در بوته اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان، در همه صفات معنی‌دار بود (جدول 4-1). جدول 4-2 مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان را برای صفات مورفولوژیک نشان میدهد.
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که مقدار هر سه صفت طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ با افزایش ارتفاع کاهش یافت به طوریکه بیشترین مقدار طول برگ (3/14 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری استان گلستان و کمترین مقـدار آن (9/6 سانتیمتر) در ارتفاع 2250 متری استان مازندران بدست آمد.
بیشترین مقدار عرض برگ (16/9 سانتیمتر) در ارتفاع 10 متری مازندران و کمترین مقدار آن (5/5 سانتی‌متر) در ارتفاع 2250 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین نسبت طول به عرض برگ (85/1) در ارتفاع 1450 متری گلستان و کمترین مقدار آن (18/1) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد.
تجزیه همبستگی نشان داد که دو صفت طول و عرض برگ همبستگی مثبت بالا (71/0=r) دارند (جدول 4-3).

جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک

*، ** و ns به ترتیب نشان معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دارمی‌باشد.
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن

در هر ستون حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است.

جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه

*، ** و ns به ترتیب نشاندهنده معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
4-1-2- تعداد برگ در بوته
با افزایش ارتفاع، تعداد برگ در بوته کاهش محسوسی نشان داد به طوریکه در ارتفاعات پایین مازندران و گلستان تعداد برگ در بوته، به ترتیب 8/84 و 2/80 عدد بود اما در ارتفاع 2250 متری این تعداد به 2/19 و 4/36 عدد کاهش یافت.
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها
با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان، تعداد گره در گزنه کاهش اما فاصله گره‌ها افزایش نشان داد. در پایین‌ترین ارتفاع مازندران و گلستان تعداد گره به ترتیب 23 و 2/26 عدد بود اما در بالاترین ارتفاع دو استان این تعداد به 6/9 و 11 عدد کاهش یافت.
بیشترین فاصله گره (48/8 سانتی‌متر) مربوط به استان مازندران و ارتفاع 1450 متری بود که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری اختلاف معنی‌دار نداشت. کمترین فاصله گره (4/3 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد. با توجه به همستگی منفی و بالا (71/0= r) بین دو صفت تعداد و فاصله گره، می‌توان نتایج حاصله را مورد انتظار دانست، یعنی در ارتفاعات افزایش فاصله گره‌ها در نتیجه کاهش تعداد گره قابل توجیه هست.
4-1-4- قطر ساقه
بیشترین میزان قطر ساقه که به ترتیب 05/7 و 98/6 میلی‌متر بود در ارتفاعات 1450 و 2250 متری گلستان و کمترین مقدار آن (44/4 میلی‌متر) در ارتفاع 10 متری مازندران مشاهده شد.
4-1-5- قطر و طول ریشه
با افزایش ارتفاع روند مشخصی برای دو صفت قطر و طول ریشه مشاهده نشد، بهطوری که بیشترین مقدار قطر ریشه (01/5 میلی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری این استان و همچنین ارتفاع 10 متری مازندران اختلاف معنی‌داری نشان نداد (05/0 ≤ P) کمترین مقدار قطر ریشه (02/3 میلی‌متر) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین مقدار طول ریشه (01/31 سانتی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد.
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته
بین دو استان از نظر تعداد گل آذین اختلاف معنی‌دار (05/0 ≤ P) مشاهده شد. میانگین تعداد گل آذین در بوته، در گلستان 8/46 عدد بود، در حالی‌که در مازندران 35/41 عدد بود. در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، مشخص شد که استان گلستان با ارتفاع 1450 متر بیشترین تعداد گل آذین (2/59 عدد) را داشت در حالیکه در ارتفاع 750 متری مازندران کمترین تعداد گل آذین (8/35 عدد) مشاهده شد.
تعداد گل آذین در بوته با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره، قطر ساقه و طول ریشه همبستگی مثبت و معنیداری نشان داد.
اندازه گل آذین در مناطق نمونه برداری کم و بیش مشابه بود، تنها در ارتفاع 1450 متری مازندران گزنه‌هایی با اندازه گل آذین بالاتر (52/5 سانتی‌متر) نسبت به سایر مناطق مشاهده شد.
4-1-7- ارتفاع گیاه
افزایش ارتفاع نقش موثری در کاهش ارتفاع گیاه گزنه داشت، بهطوری‌که نتایج نشان داد در ارتفاعات پایین (تا 750 متر) ارتفاع بوته‌ها بالا بود اما در ارتفاعات بالاتر کاهش چشمگیری در ارتفاع گیاه مشاهده شد. بیشترین ارتفاع گیاه (3/120 سانتی‌متر) در استان مازندران با ارتفاع 750 متر بدست آمد و کمترین مقدار این صفت (2/77 سانتی متر) در ارتفاع 2250 متری مازندران مشاهده شد که البته با ارتفاع 2250 متری گلستان اختلاف معنی‌دار نداشت.
ارتفاع گیاه گزنه با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره و طول ریشه همبستگی مثبت و معنی داری داشت (جدول 4-3).
4-1-8- میزان کلروفیل
با افزایش ارتفاع میزان کلروفیل روند افزایشی داشت بهطوری که بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد در حالیکه مقدار این صفت در ارتفاع 750 متری 3/27 درصد بود. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که میزان کلروفیل با طول برگ و تعداد گره، همبستگی منفی و معنی‌دار و با فاصله گره (40/0= r) همبستگی مثبت و معنی‌داری داشت (جدول 4-3).
طبق نتایج بدست آمده، صفات مورفولوژیکی و بیوشمیایی گیاه گزنه تحت تاثیر شرایط محیطی مختلف ناشی از تغییر ارتفاع محل رویش قرار گرفتند، یهطوری‌‌که ارتفاعات بالا در دو استان مازندران و گلستان به خصوص منطقه له کوه بابل با ارتفاع 2250 متر از سطح دریا، دارای بیشترین تاثیرپذیری از افزایش ارتفاع بودند. با توجه به داده‌های هواشناسی (جدول 3-1) با افزایش ارتفاع، دما به طور محسوسی کاهش یافت به‌طوری‌که میانگین دمای سالیانه از 17 درجه سانتی‌گراد در پایینترین ارتفاع به 8 درجه سانتیگراد در بالاترین ارتفاع رسید و از آنجایی که رشدونمو اندام‌های گیاهی در شرایط دمای پایین کاهش می‌یابد بسیاری از صفات مورفولوژیکی مورد بررسی در این مطالعه نظیر طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه کاهش یافت. در بسیاری از گیاهان تاثیر دمای پایین در کاهش خصوصیات رویشی به اثبات رسیده است (امیدبیگی، 1379). همزمان با کاهش دما در ارتفاعات بالا میزان کلروفیل افزایش نشان داد، افزایش درصد کلروفیل در شرایط سرد نوعی مقاومت در برابر سرما محسوب می‌شود تا گیاه بتواند تا حدودی خسارات ناشی از کاهش فتوسنتز را جبران کند (اسپیرینگ و کارلاندر، 1979).
4-2- صفات بیوشیمیایی
نتایج تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر و دستگاه HPLC نشان داد که اثر متقابل ارتفاع در استان برای تمامی صفات معنی‌دار بود (جدول 4-4 و جدول 4-5). مقایسه میانگین نیز برای این صفات انجام شد.
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج بررسی‌ها نشان داد که با افزایش ارتفاع، میزان فنل در اندام‌های مختلف گزنه افزایش می‌یابد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل برگ (57/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر، فنل کل برگ کاهش محسوسی نشان داد، ارتفاعات بالای استان گلستان نیز از فنل بالاتری نسبت به ارتفاعات پایین ر برخوردار بودند (شکل 4-1).
میزان فنل کل ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری که بیشترین میزان آن (38/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (48/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-2).
در ریشه نسبت به اندام‌های دیگر میزان فنل کل کاهش محسوسی نشان داد و حتی اختلاف کمتری در ارتفاعات مختلف مشاهده شد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل ریشه (21/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (09/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-3).

جدول 4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه HPLC

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.

شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان میزان فلاونوئید کل در اندام‌های مختلف افزایش یافت، به‌طوری‌که بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ (64/5 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، در ارتفاع 1450 متری مازندران مقدار آن به 94/4 میلی‌گرم بر گرم رسید و پس از آن ارتفاعات بالای گلستان بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ را داشته‌اند. کمترین میزان فلاونوئید برگ (3 میلی‌گرم بر گرم) مربوط به ارتفاع 50 متری گلستان بود (شکل 4-4).
مقدار فلاونوئید کل ساقه وگل نسبت به برگ کاهش نشان داد اما همچنان در ارتفاعات بالاتر مقدار بیشتری از این ماده در اندام‌های ساقه و گل وجود داشت. بیشترین میزان فلاونوئید ساقه و گل (98/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران حاصل شد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر میزان آن کاسته شد اما در سایر مناطق نمونه برداری میزان این ماده تقریباً یکسان بود و با هم اختلاف معنی‌داری نداشتند (شکل 4-5).
فلاونوئید کل ریشه کاهش چشمگیری نسبت به برگ و ساقه و گل داشت به‌طوری‌که بیشترین میزان آن (53/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و سایر مناطق مرتفع دو استان میزان تقریباً مشابهی از فلاونوئید کل را در اندام ریشه داشتند، کمترین میزان این ماده (1/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران بدست آمد (شکل 4-6).

شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل
مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ گیاه گزنه نشان داد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع میزان کلروژنیک برگ افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (29/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن ارتفاع 2250 متری گلستان مقدار کلروژنیک بالایی داشت، کمترین مقدار این ماده (1/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-7).
در اندام‌های ساقه و گل نیز بیشترین میزان اسید کلروژنیک در ارتفاعات بالا مشاهده شد، به‌طوری‌که بیشترین مقدار این ماده (3/0 میلی‌گرم بر گرم) در رویشگاه‌های 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن سایر مناطق مرتفع دو استان قرار داشتند، کمترین مقدار کلروژنیک اسید ساقه و گل (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران دیده شد (شکل 4-8).
در ریشه گزنه نسبت به اندام‌های هوایی مقدار اسید کلروژنیک کمتری دیده شد، بهطوری‌که بیشترین مقدار این ماده (13/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع مقدار این ماده در ریشه بصورت چشمگیری کاهش یافت بهطوری که در ارتفاع 50 متری گلستان به 02/0 میلی‌گرم بر گرم رسید (شکل 4-9).

شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ گیاه گزنه نشان داد که بیشترین مقدار این ماده (054/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن ارتفاع 1450 متری این استان قرار داشت، بین سایر مناطق نمونه‌برداری اختلاف معنی‌دار مشاهد نشد (شکل 4-10).
مقدار اسید کافئیک در اندام‌های ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (065/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، سایر مناطق مرتفع دو استان در جایگاه دوم قرار گرفتند و کمترین مقدار اسید کافئیک (046/0 میلی‌گرم بر گرم) در پایین‌ترین ارتفاع گلستان مشاهده شد (شکل 4-11).
نتایج بررسی‌ها نشان داد که در ریشه گزنه اسید کافئیک کمتری نسبت به سایر اندام‌ها وجود داشت و مقدار آن در ارتفاعات پایین بسیار ناچیز بود، بیشترین مقدار این اسید (021/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بود و ارتفاع1450 متری مازندران و مناطق مرتفع گلستان در رده‌های بعدی قرار گرفتند (شکل 4-12).

شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل
در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، بر میزان روتین برگ مشاهده شد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع مقدار روتین افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (34/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن، سایر مناطق مرتفع دو استان قرار گرفتند، کمترین مقدار روتین برگ (16/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-13).
نتایج مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل نیز، روندی مشابه با روتین برگ داشت، بهطوری که بیشترین مقدار آن (37/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان دیده شد (شکل 4-14).
طبق نتایج HPLC در ریشه گیاه گزنه روتین مشاهده نشد.

شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید
در همه اندام‌های گیاه گزنه، مقدار فلاونوئید کل بیشتر از فنل کل بوده است. با افزایش ارتفاع از سطح دریا میزان فنل و فلاونوئید کل به صورت چشمگیری افزایش نشان داد. در ارتفاعات کمتر از 1000 متر مقدار شیب رگرسیون بسیار کمتر از ارتفاعات بالاتر بوده است. در برگ گزنه مقدار فلاونوئید کل ارتباط بیشتری با ارتفاع نسبت به فنل کل نشان داد (96/0= r2)، به‌طوری‌که در ارتفاعات بالا شیب خط رگرسیون افزایش بیشتری نشان داد (شکل 4-15).
برخلاف برگ در اندام‌های ساقه و گل مقدار فنل کل ارتباط مثبت و معنی‌دار بیشتری با ارتفاع از سطح دریا نشان داد (95/0=r2)، بطوریکه در ارتفاعات بالاتر از 1000 متر، میزان فنل کل با شیب رگرسیونی بیشتری نسبت به فلاونوئید کل افزایش یافت (شکل 4-16).
در ریشه گیاه گزنه علاوه بر کمتر بودن مقدار فنل کل نسبت به فلاونوئید کل، پاسخ کمتری (87/0=r2) هم نسبت به افزایش ارتفاع از سطح دریا مشاهده شد (شکل 4-17).
میزان اسید کلروژنیک و روتین گیاه به طور محسوسی بیشتر از اسید کافئیک بود، همچنین بیشترین ارتباط (99/0=r2) با ارتفاع از سطح دریا، مربوط به میزان اسید کلروژنیک کل گیاه بود که بهشدت تحت تاثیر ارتفاع از سطح دریا قرار گرفت (شکل 4-18).

شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ گیاه گزنه

شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل گیاه گزنه

شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه گیاه گزنه

شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی در گیاه گزنه
میزان فنل و فلاونوئید کل و همچنین ترکیبات آن‌ها با ارتفاع از سطح دریا ارتباط مثبت و معنی‌دار داشتند، بهطوری که بیشترین میزان این ترکیبات در منطقه له کوه بابل مشاهده شد. با افزایش ارتفاع علاوه بر دما میزان رطوبت نسبی نیز کاهش یافت (جدول 3-1) و به نظر می‌رسد کاهش دما و رطوبت از مهمترین عوامل تاثیرگذار در افزایش تولید ترکیبات فنل و فلاونوئیدی باشند، هر چند در منطقه له کوه مقدار مواد آلی نیز نسبت به سایر مناطق بیشتر بود (جدول 3-2). در مطالعات مختلف تاثیر رویشگاه بر میزان متابولیت‌های ثانویه در گیاهان مختلف بررسی شده است که در اکثر موارد بر نقش رویشگاه به عنوان عامل تاثیر گذار در تجمع متابولیت‌های ثانویه تاکید شده است. مکان رشد گیاه می‌تواند از طریق تغییرات دمایی و رطوبتی بر فرآیند تشکیل مواد موثره تاثیرگذار باشد، مکانیسم تاثیرات محیط بر تجمع متابولیت‌های ثانویه به درستی روشن نیست، با این وجود این نکته روشن است که محیط از طریق تاثیری که در فرایند تولید متابولیت و عوامل مرتبط در تولید آنزیم‌ها دارد، در نوع و شدت واکنش‌های شیمیایی موثر است (همتی و همکاران، 2003؛ سیوستاوا و شیم، 2002). درجه حرارت از جمله عوامل محیطی تاثیرگذار در تشکیل و تجمع متابولیت‌های ثانویه است. بررسی‌های اولیه نشان داد که در مناطقی با درجه حرارت پایینتر تجمع فلاونوئید بیشتر است (داویس و آلبریگو، 1994). میزان مواد موثره در اندام‌های گیاهان هیچگاه ثابت نیست و متناسب با مراحل رشد گیاه و بعضی شرایط محیطی قابل تغییر است. کمیت و کیفیت ترکیبات شیمیایی وابسته به تنوع ژنتیکی، شرایط محیط و فنولوژی گیاه متغیر است (پلاتی و همکاران، 2005). در ضمن اختلاف زیادی در میزان مواد موثره یک گونه در شرایط مختلف رویشی وجود دارد (هانلیدو و همکاران، 1992). کسکیتالو و همکاران (2001) اعلام داشتند که نمی‌توان رابطه روشنی بین محصول و مقدار مواد موثره در گیاهان دارویی یافت. مهمترین عوامل در تغییرات کمی و کیفی به ترتیب به نوع گونه، زمان و مکان برداشت، تغییرات فصلی و روش‌های عصارهگیری بستگی دارد. اوماه و مازا (1996) نشان دادند که با افزایش ارتفاع بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی در اندام‌های گیاهی افزوده می‌شود. ترکیبات فلاونوئیدی جاذب نور مانند فلاونها و آنتوسیانینها، در پاسخ به اشعه یو-وی و برای محافظت بافتهای درونی ساقه و برگ از آسیبهای ناشی از این اشعه، در سلولهای اپی درمال تجمع پیدا میکنند. کامپفرول و کوئرستین از جمله این فلاونوئیدها هستند که در پاسخ به این اشعه در گیاه تولید میشوند. ارتفاع جغرافیایی در میزان متابولیتهای ثانویه مؤثر بوده است که یکی از دلایل این به کیفیت تشعشعات مخصوصا Uv-B در ارتفاعات ارتباط میدهند. اشعه Uv-B در ارتفاعات بالاتر بیشتر است و در نتیجه سبب تولید بیشتر بعضی از فلاونوئیدها میشود. (جاکولا و همکاران، 2010).
همتی و همکاران (1391) نشان دادند که میزان کورسترین اندام‌های مختلف گیاه نمدار در منطقه کلاردشت مازندران در مقایسه با منطقه گرگان بیشتر بوده است، بر طبق داده‌های هواشناسی منطقه کلاردشت نسبت به گرگان از ارتفاع بیشتر و هوای خنکتر برخوردار بوده است. علاوه بر این با توجه به اینکه منطقه کلاردشت نسبت به جنگل شصت‌کلا گرگان در ارتفاع بالاتری قرار دارد و با توجه به نقش فلاونوئیدها در حفاظت گیاه در برابر نور فرابنفش، تراکم بیشتر ترکیبات فلاونوئیدی در منطقه کلاردشت توجیح‌پذیر است. تاثیر هوای خنک بر تجمع مواد موثره اندازه‌گیری شده، می‌تواند به طولانی بودن بیشتر دوره تقسیم سلولی و فعالیت بافت گیاهی در مناطق خنک مرتبط باشد. در همین رابطه تحقیقات انجام شده روی برخی فلاونوئیدهای مرکبات نشان داد که تولید آن‌ها در مناطقی با آب و هوای خنک بیشتر ازمناطق گرم می‌باشد، زیرا طول دوره تقسیم سلولی بیشتر می‌شود و در این مرحله عوامل تولید برخی فلاونوئیدها بیشتر می‌شود (داویس و آلبریگو، 1994). میزان آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی در گیاه دارویی مامیران در دو منطقه گرگان و زیارت مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد میزان این ترکیبات در منطقه زیارت نسبت به گرگان بیشتر بود، با توجه به اینکه آب و هوای دو منطقه متفاوت است و منطقه زیارت دارای ارتفاع بالاتر و هوای سردتر است این شرایط برای گیاه تنش ایجاد کرده و تولید متابولیت‌های ثانویه افزایش یافت (قربانلی و همکاران، 1388). تحقیقات مشابه نیز نشان داد که در شرایط تنش برخی از ترکیبات ثانویه به میزان قابل توجهی در گیاه افزایش می‌یابد (آتال، 1998). قاسمی و همکاران (2011) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتیاکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد. گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتیاکسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیا نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی مورد مطالعه در این تحقیق در برگ گیاه گزنه بیشتر از اندام‌های دیگر بود، در بررسی میزان فلاونوئیدهای سرخ ولیک، میزان روتین این گیاه در برگ نسبت به گل و میوه بیشتر بود (همتی و همکاران، 2006). تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در اندام‌های مختلف گیاه ممکن است در نتیجه تغییر در برخی فعالیت‌های آنزیمی و نقش پیش ماده آن باشد (پیتر و ریچارد، 1993). در حمایت از این فرضیه محققین دیگر اشاره کردند که تنظیم کننده‌های رشد و نمو مانند هورمون‌های سیتوکنین و اسید جیبرلیک ممکن است بعضی آنزیم‌های تولید کننده فلاونوئیدها را فعال کنند (سیمور و همکاران، 1993).
سپهریفر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی درعصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌باشد.
آذریوند و همکاران (1388) در تحقیقی روی اسانس برگ و گل گیاه بومادران در ارتفاعات مختلف منطقه سیاه بیشه استان مازندران به این نتیجه رسیدند که ارتفاع بر میزان اسانس این گیاه تاثیر بسزایی داشته بطوریکه میزان ترکیبات اسانسی در ارتفاعات بالاتر بیشتر بود و این میزان در گل بیشتر از برگ بوده است.
حبیبی و همکاران (1384) با بررسی اثر ارتفاع روی اسانس گیاه دارویی آویشن وحشی منطقه طالقان به این نتیجه رسیدند که با افزایش ارتفاع مقدار ترکیبات اسانسی لینانول و آلفا ترپنین که بیشترین ترکیبات اسانسی در آویشن وحشی را تشکیل می‌دهند افزایش می‌یابد بهطوری‌که در ارتفاع 1800 متری کمترین و در ارتفاع 2800 متری بیشترین مقدار بوده است.
4-4- نتیجه‌گیری کلی
در بررسی اثر ارتفاع از سطح دریا، بر ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مشخص گردید که بین دو استان مازندران و گلستان اختلاف معنیداری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان بر صفات مورد مطالعه معنی‌دار بود، بسیاری از صفات مورفولوژیکی مثل طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه با افزایش ارتفاع کاهش و مقدار کلروفیل افزایش نشان داد. کمترین مقدار طول برگ (9/6 سانتی‌متر)، کمترین مقدار عرض برگ (8/5 سانتی‌متر) کمترین ارتفاع گیاه (2/77 سانتی‌متر) و بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در منطقه له کوه مازندران با ارتفاع 2250 متر بدست آمد. از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، در ارتفاعات بالا میزان ترکیباتی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین افزایش چشمگیری نشان داد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل (16/8 میلیگرم بر گرم)، فلاونوئید کل (15/12 میلیگرم بر گرم)، اسید کلروژنیک (72/0 میلیگرم بر گرم)، اسید کافئیک (140/0 میلیگرم بر گرم) و روتین (71/0 میلیگرم بر گرم) در کل گیاه در ارتفاع 2250 متری منطقه له کوه مازندران مشاهده شد.
4-5- پیشنهادات
با توجه به خودرو بودن گیاه گزنه توصیه می‌شود با کاشت این گیاه در شرایط کنترل شده زراعی و گلخانه‌ای زمینه جهت مطالعات بیشتر در این گیاه فراهم شود.
با توجه به کمبود تحقیقات پژوهشی در گیاه گزنه پیشنهاد می‌شود تاثیر عوامل مختلف محیطی و همچنین تنش‌ها در افزایش متابولیت‌های ثانویه این گیاه مورد بررسی قرار گیرد.
ناشناس بودن گیاه دارویی گزنه باعث می‌شود انجام یکسری مطالعات پایه سیتوژنتیکی و بررسی تنوع ژنتیکی در این گیاه ضروری به نظر آید.
تحقیقات بیشتر در زمینه دیگر ترکیبات فنل و فلاونوئیدی که در این پایاننامه مورد مطالعه قرار نگرفت.
منابع
فهرست منابع
آذرنیوند، ح.، قوام عربانی، م.، سفیدکن، ف. و طویلی، ع. 1388. بررسی تاثیر ویژگی‌های اکولوژیک (خاک و ارتفاع) بر کمیت و کیفیت اسانس گل و برگ Achillea millefolium. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 25(4):571-556.
آزاد بخت، م. 1378. رده بندی گیاهان دارویی. چاپ اول. انتشارات تیمورزاده. ص 401.
افشار، ج.، و دل اذر، ع. 1373. روتین از Ruta graveolens. مجله دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، 1، ص 12-1.
امیدبیگی، ر. 1379. رهیافت‌های تولید و فرآوری گیاهان دارویی. انتشارات طراحان نشر. مشهد. جلد 1. چاپ دوم. ص 283.
امیدبیگی، ر. 1384. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد اول، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 347.
امیدبیگی، ر. 1388. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد دوم، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 430.
تایز، ل. و زایگر، ل. 1379. فیزیولوژی گـیاهی. جلد دوم. ترجمه: کافی،م. لاهوتی، م. زند، ا. شریفی، ح. گلدانی، م. و کامکار، ح. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. ص 379.
دوازده امامی، س. 1382. کاربرد گیاهان دارویی. انتشارات نصوح. ص 113.
دوازده امامی، س. و مجنون حسینی، ن. 1387. زراعت و تولید برخی گیاهان دارویی و ادویهای. چاپ دوم. انتشارات دانشگاه تهران. ص 300.
حبیبی، ح.، مظاهری، د.، مجنون حسینی، ن.، چایچی، م.ر. و فخرطباطبایی، م. 1385. اثر ارتفاع بر روغن، اسانس و ترکیبات گیاه دارویی آویشن وحشی Thymus kotschynus منطه طالقان. مجله پژوهش و سازندگی در زراعت و باغبانی. شماره 73: 10-1.
جایمند، ک.، رضایی، م.، عصاره، م. و مشکی‌زاده، س. 1388. استخراج واندازه‌گیری ترکیبهای فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی (Rosa damascene Mill) از مناطق غربی ایران، فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 555:4-47.
حسنی، ج. 1383. شناسایی و بررسی اکولوژیکی دو جنس از گیاهان معطر Thymus و Ziziphora در استان کردستان. فصلنامه تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20(1): 17-1.
زرگری، ع. 1376. گیاهان دارویی. جلد چهارم، چاپ پنجم. انتشارات دانشگاه تهران، ص970.
زرگری، ع. 1383. گیاهان دارویی. جلد پنجم. چاپ ششم، انتشارات دانشگاه تهران، ص1010.
زینلی، ح.، رزمجو، خ. ارزانی، ا. و رضایی، م. 1386. ارزیابی دو گونه نعناع پونه سنبله‌ای و پودنه از لحاظ صفات زراعی، فیتوشیمیایی و سیتوژنتیکی. سومین همایش گیاهان دارویی. تهران، دانشگاه شاهد.
سپهری‌فر، ر. و حسنلو، ط. 1388. بررسی ترکیبات پلی‌فنلی، آنتوسیانینها و فلاونوئیدهای تام و خواص آنتی‌اکسیدانی گیاه دارویی قره قاط، جمع‌آوری شده از جهار منطقه مختلف ایران. فصلنامه گیاهان دارویی، 74:33 -66.
صمصام شریعت، ه. 1382. پرورش و تکثیر گیاهان دارویی. انتشارات مانی، ص420.

—c2392

3-7- استخراج عصاره متانولی24
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل24
3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی25
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC26
3-8-1- آماده سازی نمونه26
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک27
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی27
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC29
3-9-1- آماده سازی نمونه29
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین29
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی30
3-10- مشخصات طرح31
3-11- تجزیه و تحلیل آماری31
فصل چهارم- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک34
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ34
4-1-2- تعداد برگ در بوته36
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها36
4-1-4- قطر ساقه37
4-1-5- قطر و طول ریشه37
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته.37
4-1-7-ارتفاع گیاه38
4-1-8- میزان کلروفیل38
4-2- صفات بیوشیمیایی39
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل39
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل42
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل44
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل46
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل48
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید50
4-4- نتیجه گیری کلی56
4-5- پیشنهادات56
منابع58
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- طبقه بندی ترکیبات فنلی12
جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک35
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن35
جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه36
جدول4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر40
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمایی مورد بررسی با دستگاه HPLC40
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه7
شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ، ب- فیروزجاه، پ- خشک کردن گزنه21
شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید25
شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین26
شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک28
شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک28
شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین30
شکل 3-7- کروماتوگرام استاندارد روتین31
شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ41
شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل41
شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه42
شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ43
شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل43
شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه44
شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ45
شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل45
شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه46
شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ47
شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل47
شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه48
شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ49
شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل49
شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ51
شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل51
شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه52
شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی52

1-1- مقدمه
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور است که امکان صادرات آن نیز وجود دارد. ایران از نظر آب و هوا در زمینه رشد گیاهان دارویی یکی از بهترین مناطق جهان محسوب می‌‌شود، به همین دلیل صادرات آن می‌‌تواند منبع بزرگی از درآمد برای کشور باشد (صمصام شریعت، 1382). بنابراین ضروریست تا با توجه به توان بالقوه بسیار خوب کشور در زمینه تنوع گیاهان دارویی، با شناخت گونه‌‌های گیاهی و دستیابی به اطلاعات لازم در مورد محل‌‌های رویش و خصوصیات بوم‌‌شناختی آن‌ها، گام‌‌های اساسی برای استفاده از اسانس‌‌های گیاهی و ترویج شیوه‌‌های اصولی بهره‌‌برداری از این گیاهان برداشته شود (حسنی، 1383).
گیاه دارویی به گیاهان و مشتقات آن‌ها گفته می‌‌شود که دارای مواد موثر مشخص است، در درمان بیماری یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می‌‌گیرد و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه‌‌های معتبر بین‌‌المللی ذکر شده باشد (دوازده امامی و مجنون‌‌حسینی، 1387).
فارماکوپه یک کتاب رسمی است که توسط دولت هر کشور و یا انجمن‌‌های پزشکی و داروسازی زیر نظر دولت به چاپ می‌‌رسد و حاوی حقایق علمی و اصول استاندارد‌‌سازی مواد دارویی از قبیل روش‌‌های جمع‌‌آوری مواد دارویی از منابع مختلف، آماده سازی، نگهداری، ترکیب و اختلاط داروهای مختلف و روش‌‌های اثبات آن‌ها می‌‌باشد. به علاوه این کتاب شامل دارو‌‌هایی با استعمال خارجی، نحوه نسخه‌‌نویسی، نحوه و مقدار تجویز دارو‌‌ها و اطلاعات کامل تهیه، ساخت و کاربرد داروهاست (دوازده امامی، 1382).
استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده‌‌های حاصل از آن‌ها نقش این گیاهان را در چرخه اقتصادی پر اهمیت کرده است. به طوری که مصرف رو به ازدیاد آن‌ها تنها به کشور‌‌های در حال توسعه محدود نشده است، بلکه اخیراً در کشور‌‌های توسعه یافته نیز جایگاه ویژه‌‌ای به خود اختصاص داده است. در اواخر قرن بیستم حجم مبادلات جهانی گیاهان دارویی به 200 میلیارد دلار بالغ گردیده است. بر اساس گزارش سازمان خوار و بار جهانی (FAO) ارزش صادرات گیاهان دارویی در سال 1995 بالغ بر 880 میلیون دلار بوده است. بر اساس گزارش بانک جهانی، حجم تجارت گیاهان دارویی تا سال 2050 بالغ بر 5 تریلیون دلار خواهد بود (امیدبیگی، 1384). در حالی که طی گزارشی میزان ارزش فروش گیاهان دارویی در ایران در سال 2000 میلادی تنها در حدود 37 میلیارد ریال برآورد شده است و این در حالی است که ایران جزء 8 کشور مهم دارای فلور متنوع گیاهان دارویی در دنیاست (قاسمی، 1389).
گزنه از مهمترین گیاهان دارویی است که از دوران ماقبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم آن زمان از آن برای تغذیه استفاده می‌کردند و از خواص درمانی آن اطلاع داشته‌اند. از کاربرد‌‌های دارویی آن می‌توان به کاهش قند خون، کاهش التهاب آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، درمان پروستات و اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق
تاثیر ارتفاع بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی (ریخت‌‌شناسی) گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اندام‌‌های گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گیاه گزنه چگونه است؟
1-3- فرضیهها
عوامل محیطی روی میزان ترکیبات ثانویه گیاه گزنه موثر است.
شرایط محیطی متنوع در زیستگاه‌های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیکی گیاه تاثیر می‌گذارند.
میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی تحت تاثیر ارتفاع قرار دارد.
1-4- اهداف
ارزیابی تاثیر اقلیم‌‌های مختلف بر صفات ریختی و عملکرد برخی مواد موثره گزنه.
معرفی بهترین ارتفاع و اندام دارویی گزنه از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی.
مقایسه برخی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی موجود درگزنه در ارتفاعات مختلف.
-76508-504458

2- بررسی منابع
2-1- گیاه‌شناسی گزنه
گزنه با نام علمی Urtica dioica از خانواده Urticaceae می‌باشد. گزنه، گیاهی است علفی، چند‌‌ساله، پایا، دوپایه و بندرت تکپایه، ریزوم‌‌دار، به ارتفاع 150-50 سانتیمتر، دارای کرک‌‌های گزنده، ساقه آن علفی، کمی زاویه‌‌دار و چهار پهلو، تقریباً ضخیم، ساده و یا خیلی کمانشعاب و پوشیده از کرک‌‌های گزنده، برگ‌‌ها نیزه‌‌ای، نیزه‌‌ای باریک، تخممرغی، تخممرغی پهن تا تقریبا دایره‌‌ای، نوک تیز یا نوک باریک، قاعده قلبی، باریک یا گوه‌‌ای، اندازه برگ 5/2-12×5/4-15 سانتیمتر، رنگ برگ‌‌ها سبز روشن است. برگ‌‌ها عموما گوشواره‌‌دار و گاه بدون گوشواره، متقابل و پوشیده از کرک‌‌های گزنده است. گل‌‌های آن، تک جنسی، بسیار ریز، سبز فام، مجتمع در توده‌‌های کوچک کروی، و واقع در طول محورهای خوشه‌‌ای شکل، گل‌‌های نر دارای 4 کاسبرگ هم اندازه و 4 پرچم با بساک‌‌های پهن دراز و قلوه‌‌ای شکل، ماده‌‌ها دارای 4 کاسبرگ متقابل صلیبی، دو کاسبرگ خارجی بسیار کوچک و گاهی گل فاقد آن و رنگ آن‌ها سبز مایل به زرد می‌‌باشد. گلآذین سنبله یا خوشهای مرکب، کرکی متراکم، گل‌آذین نر 4-11 سانتیمتر و ماده 5/1-9 سانتیمتر میباشد میوه آن فندقه تخم‌مرغی تا بیضوی و محتوی آلبومین روغن‌‌دار است. فندقه به طول 5/1 میلی‌‌متر و محصور در کاسه پایای گل می‌‌باشد (شکل 2-1)، (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ قهرمان، 1372).
تکثیر آن از طریق کاشت بذر در بهار یا تابستان و کاشت قطعات ریشه‌‌دار در پاییز صورت می‌‌گیرد (زرگری، 1383).

شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه (ویلر، 1981)
2-2- دامنه انتشار
این گیاه غالبا در اماکن مخروبه، باغ‌‌ها، و نقاط مرطوب خارج شهر و نواحی سایه‌‌دار و جاهایی که چهار‌‌پایان در آنجا به سر می‌‌برند، به حالت خودرو می‌‌روید. از ریشه‌‌‌‌های خزنده آن پاجوش‌‌هایی در کلیه جهات خارج می‌‌گردد که خود باعث می‌‌شود گیاه بصورت پایه‌‌های متعدد در آمده، تا محل رویش خود را به کلی فرا گیرد. انتشار عمومی گیاه گزنه در نقاط مرطوب ایران خصوصاً نواحی شمالی، غربی و مرکزی مانند اصفهان، شاهرود، بسطام و کاشان است (زرگری، 1376).
2-3- اندام‌های دارویی
برگ‌‌ها، ریشه، دانه و شیرابۀ گیاه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌‌دهند (زرگری، 1376). گلدهی آن از اواسط اردیبهشت تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد و بهترین زمان برداشت و جمع‌‌آوری برگ‌‌‌‌های این گیاه از اردیبهشت‌‌ تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی
گزنه دارای تانن، موسیلاژ، اسید فورمیک، ماده مومی، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کنندگی پوست، نیتراتپتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن‌‌دار، گوگرد و نوعی ماده رنگی به نام اورتی‌‌سین در سر شاخه هوایی می‌‌باشد (زرگری، 1376). در برگ گیاه گزنه، کلروفیل، گزانتوفیل، لوکوآنتوسیانیدین، فلاوون و فلاونول موجود است که فلاوون و فلاونول به میزان کمتری از لوکوآنتوسیانیدین در این گیاه است. تری‌‌ترپن‌‌ها و استرول‌‌ها شامل بتاسیتوسترول در گیاه موجود است. اسید فرمیک نیز در برگ وجود دارد. برگ‌‌های تازه گزنه حاوی سکرتین می‌‌باشد. همین‌‌طور دارای 5/1 درصد کلروفیل خالص است. برگ خشک گزنه 5/7 درصد کلروفیل دارد. اسیدهای فنلی نیز در این گیاه وجود دارد که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، اسکولتین و کافئوئیل مالیک اسید و کلروژنیک اسید می‌‌باشد. تری گلیسیرید، دی گلیسیرید و فسفولیپید‌‌های مختلفی هم از این گیاه جدا شده است. سیتوکنین‌‌های عمده گزنه شامل زآتین، زآتین نوکلئوتید، ایزو پنتیل آدنین، ایزو پنتیل آدنوزین، ایزو پنتیل آدنین نوکلئوتید و دی هیدرو زآتین می‌‌باشد. همچنین ترکیبات ایندولی همراه با هیستامین و 5- هیدروکسی تریپتامین و اسید‌‌هایی از جمله اسید آسکوربیک، سالیسیلیک اسید و عناصری مانند ازت، گوگرد، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و عناصر نادر مانند آهن، روی، مولیبدن و مس موجود است (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
ترکیبات فنلی موجود در گزنه که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، فیستین و میریستین می‌‌باشند. بر باکتری‌‌هایی مثل اشریشیاکلی، پروتئوس ‌‌ولگاریکوس، کلبسیلا و پسودوموناس اثر دارد و عصاره این گیاه بر سالمونلا و پروتئوس که در مقابل آنتی‌‌بیوتیک‌‌ها مقاوم است، خاصیت آنتی‌‌بیوتیکی دارد. همچنیین باعث وقفه در رشد چندین مخمر، کپک، قارچ و باکتری شده است. اثرات ضد قارچی بعضی ترکیبات موجود در گزنه نیز تائید شده است. گزنه دارای اثرات مدری است. اثرات دیورتیک این گیاه با افزایش دفع کلر و اوره همراه است و ثابت شده که مصرف 14 روزه این گیاه موجب کاهش وزن بدن و نیز کاهش فشار سیستولیک می‌‌گردد (محمودی و همکاران، 2007). گزنه بصورت خوراکی به عنوان مدر، پایین آورنده قند خون و اسید اوریک و به صورت موضعی در درمان برخی از بیماری‌‌های پوستی و مو از جمله اگزما، بیماری‌‌های التهابی و حتی در درمان ریزش مو مورد استفاده قرار می‌‌گیرد (محمودی و همکاران، 2007). اعتقاد بر این است که جوشانده گیاه و خیسانده ریشه آن در الکل بصورت لوسیون در رشد موی سر موثر است. همچنین عصاره ریشه گزنه در بعضی حالات هیپرتروف غده پروستات را بهبود می‌بخشد (آزاد بخت، 1378). از دیگر کاربردهای دارویی گزنه می‌‌توان به درمان آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، بزرگ شدگی ‌‌پروستات، حساسیت فصلی و درمان اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی
پراکنش و استقرار گیاهان اصولاً تحت تاثیر شرایط محیط و عوامل داخلی گیاه صورت می‌‌گیرد. مهم‌‌ترین عوامل موثر بر ترکیبات شیمیایی ثانویه گیاهان عوامل ژنتیکی، محیطی و اثرات متقابل آن‌ها ست. عوامل ژنتیکی مربوط به ژنوم گیاه است. از عوامل محیطی و اکولوژیکی مؤثر می‌‌توان عوامل آب و هوایی، جغرافیایی و ادافیکی (خاکی) را نام برد. عوامل آب و هوایی مانند دما، بارندگی، طول روز، نور خورشید، تبخیر و تعرق و باد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌‌های ثانویه این گیاهان دارند. ارتفاع از سطح دریا، درصد شیب و جهت آن، عرض جغرافیایی، پوشش اراضی، نزدیکی به منابع آبی به طور مستقیم یا غیر مستقیم به واسطه تأثیر بر سایر عوامل بوم شناسی بر سنتز ترکیبات ثانویه به خصوص اسانس در گیاهان موثر هستند. خصوصیات خاک مثل بافت خاک، مواد آلی، آهک، شوری و اسیدیته از فاکتورهای محیطی می‌‌باشند که باید مورد مطالعه قرار گیرند. در صورتیکه گیاه اهلی شده باشد عوامل مدیریتی نیز تاحدودی بر درصد ترکیبات ثانویه گیاهان دارویی موثر است (قاسمی، 1389). از مهمترین عوامل محیط رویش گیاهان که تاثیر بسیار عمده‌‌ای بر کمیت و کیفیت مواد موثره آن‌ها می‌‌گذارند، نور، درجه‌‌حرارت، آبیاری و ارتفاع محل می‌‌باشد (امید بیگی، 1384). بر پایه تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محـور زیـر بر آن‌ها تاثیـر می‌‌گـذارد: 1- تاثیر بر مقدار کلی ماده موثره گیاهان دارویی؛ 2- تاثیر بر عناصر تشکیل دهنده مواد موثره؛ 3- تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه (امیدبیگی، 1384).
به‍طور‌‌ کلی مواد مؤثره گیاهان دارویی که حاصل سوخت‌‌و‌‌ساز (متابولیسم) ثانویه است به ‍عنوان ترکیبــات ثانویه معروف می‌‌باشند. این ترکیبات عموماً وزن مولکولی کمتر از 1000 داشته و به ‍مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول‌های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولیـد می‌شوند. گیـاهان دارای این نوع مکانیـسم‌ها، نسبت به سایر گیاهان از سازگاری و بقای طولانی‌‌تری برخوردارند (تایز و زایگر، 1379). مهـم‍ترین آن‌ها آلــکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن‌‌های فرار (اسانس‌ها)، فنلها، تانن‌ها، فلاونوئیدها و غیره هستند. تولید این ترکیبات برای گیاه گران و هزینه‍بر می‌باشند، ولی گیاه این ترکیبات را بیهوده تولید نمی‌کند و اهـداف خاصی جهت تولید، ترشح و ذخیره آن‌ها دارد که مهم‍ترین این وظایف به شرح زیر است:
- دفع عوامل بیماریزا
- دفع آفات و حیـوانات گیاه‍خوار
- افزایش توان رقابتی گیاه بر سر منابع مانند نور، آب و مواد غذایی
- جلب حشرات و پرندگان گردهافشان
- رفع تنشهای غـیرزنده و حفاظت در برابر اشعۀ ماوراء بنفش (قاسمی، 1389).
2-6- فنل و فلاونوئید
ترکیبات فنلی به یک گروه وسیع و متنوعای از ترکیبات شیمیایی اطلاق میشود که این ترکیبات می‌‌توانند به روش‌‌های مختلفی طبقه‌‌بندی شوند. هاربورن و سیموندس این ترکیبات را به گروه‌‌هایی بر اساس تعداد کربن‌‌های موجود در مولکول طبقه‌بندی کردند (جدول 2-1) (ورمریس و نیکولسون، 2006).
ترکیبات فنولی در طی رشد و نمو با هدایت عوامل ژنتیکی و در پاسخ به محرکهای محیطی از جمله آلودگی، زخم و تابش فرابنفش ساخته میشوند که از میان آنها میتوان به لیگنینها، لیگنانها، فنلهای ساده و اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها اشاره کرد. این ترکیبات بخش جدایی ناپذیری در رژیم غذایی بشر بوده و به دلیل ویژگیهای آنتیاکسیدانی قوی و ضدسرطانی، بسیار مورد توجه است (قربانی و همکاران، 1390؛ محمد و همکاران، 2001؛ دینکا و همکاران، 2004؛ اسکین و رابینسون، 2000).
ترکیبات فنولی دارای خواص متعددی از جمله خواص آنتی باکتریال، ضدقارچ، ضدویروس، ضددیابت، ضدالرژی و ضدالتهاب هستند. اما بیشتر به منظور فعالیت‌های ضدویروسی و آنتی‌اکسیدانیشان شهرت دارند به خصوص در بعضی از اسیدهای فنولیکی مانند اسیدکلرژنیک، اسیدگالیک و اسیدکافئیک (دیمیتری جویک و همکاران، 2010).
فلاونوئیدها دسته‌‌ای از ترکیبات طبیعی هستند که در سلسله گیاهان گسترش وسیعی دارند. آن‌ها به عنوان یکی از بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی شناخته می‌‌شوند. تا به امروز متجاوز از 4000 فلاونوئید شناخته شده است که به طور وسیعی در برگ‌‌ها، دانه‌‌ها، پوسته و گل‌‌های گیاهی وجود دارند. به‌‌طور کلی فلاونوئیدها بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی فنلی در گیاهان هستند و به دلیل حضور آن‌ها در تقریبا همه گروه‌‌های گیاهی، در بیشتر مطالعات مربوط به عصاره‌‌های گیاهی مورد بررسی قرار می‌‌گیرند (مدیکا و همکاران، 2004).

جدول 2-1- طبقهبندی ترکیبات فنلی (ورمریس و نیکولسون، 2006).

فلاونوئیدها به عنوان یکی از گستردهترین متابولیتهای ثانویه در گیاهان هستند که فعالیتهای مختلفی را بر عهده دارند. آنها دارای اثرات و عملکرد بسیار مفیدی بر سلامتی انسان هستند که دارای شش زیر گروه میباشند: فلاوونها، ایزو فلاوونها، فلاونولها، فلاونون، آنتوسیانین‌‌ها و آنتوسیانیدین. فلاونوئیدها معمولاً در واکوئل گیاهان به صورت گلیکوزید تجمع مییابند. فلاونها مخصوصا کامپفرول و کوئرستین در بسیاری از گونههای گیاهی وجود دارد که برای جوانهزنی گرده و رشد لوله گرده ضروری است (جاکولا و هوتولا، 2010؛ کاسیمیر و مین، 2008).
فلاونوئیدها ترکیبات دیفنیل پروپانوئیدهایی هستند که تقریبا در همه گیاهان یافت می‌‌شوند و نقش‌‌های فراوانی برای این ترکیبات شناخته شده است، در گیاهان عالی، فلاونوئیدها دفاع در برابر نور ماورابنفش، پاتوژن‌‌ها و علف‌‌خوران را سبب می‌‌شوند. نقش‌‌های ویژه‌‌ آن‌ها در گیاهان، در ایجاد رنگ و تثبیت نیتروژن در گیاهانی است که دارای زندگی همزیستی‌‌اند. اثرات سلامت فلاونوئیدها بیشتر در نتیجه خاصیت آنتی‌‌اکسیدانی و توانایی کلات‌‌کنندگی آن‌ها ست. مطالعات زیادی انجام شده است تا موثر بودن فلاونوئیدها به عنوان، عوامل ضدقارچی، ضدباکتری، ضدویروسی، ضداشتعال، آنتی‌‌اکسیدانت، متعادل کننده ایمنی، بازدارنده آنزیمی و عوامل موتاژنی سمی به اثبات رساند (مدیکا و همکاران، 2004).
روتین نوعی فلاونوئید است، روتین در پیشگیری و درمان افزایش فشار خون و سایر نارسائیهای قلبی و عروقی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی مطرح است (افشار و همکاران، 1376).
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد
عملکرد، میزان و کیفیت مواد ثانویه یک گیاه در رویشگاه‌‌ها و مناطق مختلف تغییر می‌‌یابد، دلیل این امر نوسان فعالیت‌‌های متابولیکی گیاه تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی است، نتیجه تاثیر طولانی عوامل محیطی، تشکیل جمعیت‌‌های تازه زیرگونه‌‌ای یا اکوتیپ‌‌های مشتق از یک گونه گیاهی خاص است (امیدبیگی، 1388). تفاوت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بین اکوتیپ‌‌های گیاهی به اثبات رسیده است و این اختلافات می‌‌تواند به منظور انتخاب بهترین کمیت و کیفیت مورد استفاده قرار گیرد (آواتو و همکاران، 1998؛ برادلی و همکاران، 1996). در دهه اخیر در کشورهای مطرح دنیا در زمینه تولید گیاهان دارویی مانند مجارستان، ایتالیا و اسلواکی بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و ترکیبات ثانویه به منظور به کارگیری در برنامه‌‌های به‌‌نژادی صورت گرفته است و اکوتیپ‌‌های برتر نسبت به ارقام اصلاح شده شناسایی گردیده‌‌اند (من و استابا، 1986). در ارزیابی خصوصیات گیاهشناسی، درصد و اجزای اسانس اکوتیپ‌‌های آویشن کرمانی توسط مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران (1389)، نتایج نشان داد که بیشترین ارتفاع بوته، قطر بوته، تعداد شاخساره، طول و عرض برگ، وزن تر و وزن خشک بوته مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین مربوط به اکوتیپ شاهرود بود، ولی تعداد شاخساره در بوته، طول برگ و عرض برگ در هیچ یک از اکوتیپ‌‌ها با اکوتیپ دیگری اختلاف معنی‌‌داری نداشت. عسکرزاده و همکاران (1387) در مقایسه 8 اکوتیپ زیرهکوهی از نقاط مختلف ایران در شرایط مزرعه به منظور بررسی عملکرد کمی و کیفی گزارش کردند که بیشترین عملکرد تکبوته مربوط به اکوتیپ منطقه خواجه خراسان و کمترین عملکرد مربوط به اکوتیپ کوه باقران بیرجند بود. نتایج مطالعه‌‌ای روی بررسی مورفولوژی، فنولوژی و برخی مشخصات کیفی چند اکوتیپ علف باغ از مناطق مختلف ایران و یک اکوتیپ خارجی در شرایط آزمایشگاه نشان داد که بالاترین ارتفاع بوته مربوط به اکوتیپ همدان و کمترین مربوط به اکوتیپ کرج، بیشترین میزان وزنتر متعلق به اکوتیپ خارجی و کمترین متعلق به اکوتیپ همدان بود در حالیکه بیشترین وزن خشک در اکوتیپ اردبیل و کمترین در اکوتیپ خارجی مشاهده شد (علیزاده و جعفری، 2011). به منظور بررسی اجزای عملکرد، مورفولوژی اکوتیپ‌‌های بومی یونجه کشور ترکیه آزمایشی توسط سینگ در سال 2002 انجام شد و نتایج این آزمایش بدین صورت بود که بالاترین ارتفاع بوته متعلق به اکوتیپ محمودی و کوتاهترین متعلق به اکوتیپ ارسیس3 بود، اکوتیپ قاسم‌‌اوغلو بیشترین تعداد ساقه و اکوتیپ‌‌های الاکوی و کایرباسی کمترین تعداد ساقه را داشتند، بیشترین تعداد غلاف در اکوتیپ محمودی و کمترین در اکوتیپ گلگورن مشاهده شد.
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیتهای ثانویه
اصولاً مواد ثانویه به اقتضای ساختار طبیعی (وراثت) و هم تحت تاثیر تهییج‌‌های غیرطبیعی(تنشی) در گیاه ساخته می‌‌شوند به‌طوری‌که حضور برخی از این مواد در تعدادی از افراد یک گونه، به‌طور مستثنی از افراد دیگر ممکن است به منزله نشانه فعالیت ژن‌‌های خاص سازگاری آن افراد نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی به شمار آید و افراد مذکور را به عنوان یک جمعیت زیرگونه‌‌ای متفاوت از بقیه که نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی پاسخ شیمیایی ویژه‌‌ای دارند معرفی کند (فیتر و هی، 1987). طی مطالعه‌‌ای با هدف بررسی توده‌‌های محلی مرزه تابستانه نتایج نشان داد که تنوع قابل توجهی از نظر صفات بیوشیمیایی بین توده‌‌ها وجود دارد، میانگین بازده اسانس توده‌های مختلف بین 57/0 و 9/2 درصد متنوع بود که کمترین مقدار آن در توده ارومیه و بیشترین آن متعلق به توده اهواز بود، توده‌‌های اراک، نیشابور، مریوان و اهواز به ترتیب با میزان کارواکرول 3/83، 3/83، 9/76 و 67 درصد در گروه توده‌های غنی از کارواکرول قرار گرفتند (هادیان، 1387).
نتایج تحقیقی با موضوع ارزیابی درصد و اجزای اسانس چندین اکوتیپ‌‌ آویشن کرمانی از مناطق مختلف کشور با ارتفاع مختلف نشان داد که بازده اسانس بر حسب حجم اسانس در 100 گرم سرشاخه خشک در اکوتیپ کرمان- راین، 5/2 درصد، در اکوتیپ کرمان- سیرچ، 9/1 درصد، در اکوتیپ یزد، 2 درصد، در اکوتیپ شاهرود، 8/1 درصد و در اکوتیپ اصفهان، 5/1 درصد بود. همچنین در بررسی میزان ترکیبات غالب اسانس، بیشترین میزان کارواکرول در اکوتیپ کرمان- راین و بیشترین میزان تیمول در اکوتیپ شاهرود مشاهده شد (مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران، 1389). زینلی و همکاران (1386) در بررسی ژنوتیپ‌‌های مختلف دو گونه نعناع لانگیفولیا و اسپیکاتا پس از استخراج اسانس، شناسایی و تعیین مقدار اجزای اسانس با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی، گزارش کردند که توده‌‌های مختلف از لحاظ میزان اسانس و ترکیبات اسانس با هم اختلاف قابل‌‌ توجهی داشتند، این محققین اختلاف در میزان اسانس را مربوط به بالا بودن تعداد برگ و ارتفاع زیاد در تیمارهای با اسانس بالا اعلام کرد و پیشنهاد کردند که از این فاکتورها می‌‌توان به عنوان معیار انتخاب در بین ژنوتیپ‌ها در جهت افزایش عملکرد اسانس استفاده نمود. نری و همکاران (2009) در آزمایشی به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی اکوتیپ‌‌های مختلف شاه‌‌بلوط شیرین مناطق مختلف ایتالیا به این نتیجه رسیدند که بالاترین میزان ساکارز در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا و کمترین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو بود درحالیکه بیشترین میزان پروتئین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو و کمترین میزان در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا مشاهده شد، همچنین درصد اسید مالیک، پلی‌‌فنل‌‌ها و خواص آنتی‌‌اکسیدانتی در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو به طور معنی‌‌داری بالاتر از اکوتیپ وال‌‌کاستلانا بود. طی مطالعه‌‌ای مقایسه‌‌ای اکوتیپ‌‌های مختلف سیر از مناطق مختلف کشور از لحاظ میزان ماده آلیسین مورد مقایسه قرار داده شدند و نشان داده شد که اختلاف در میزان آلیسین در بین اکوتیپ‌‌ها نسبتاً زیاد بود بهطوری که بالاترین میزان (13 درصد) در اکوتیپ گرگان و کمترین میزان (61/1 درصد) در اکوتیپ تالش یک بود، و اکوتیپ‌‌های تارم 1، تربت‌‌جام، بهشهر و تالش 2 از لحاظ میزان آلیسین با هم اختلاف معنی‌‌داری نداشتند.
همتی و همکاران (1386) با بررسی تاثیر اقلیم و اندامهای مختلف روی برخی فلاونویید‌‌های درختچه سرخ ولیک، نشان دادند که اثرات متقابلی بین مکان و صفات وجود دارد و آن‌ها به این نتیجه رسیدند که میزان کوئرستین در اندام کل گیاه سرخ ولیک در کلاردشت مازندران بیشتر از گرگان بود. در بررسی دیگری که جایمند و همکاران (1388) با استفاده از استخراج و اندازهگیری ترکیب‌‌های فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی در مناطق غربی ایران انجام دادند دریافتند که بهترین اکشن‌‌ها از نظر میزان ترکیب‌‌های کامفرول و کوئرستین به ترتیب شامل آذربایجان غربی، ایلام و اردبیل بودند.
یکی از محققان در سال 1973 نسبت به کاشت گونه‌‌ای گل انگشتانه‌‌ در چهار نقطه که از نظر ارتفاع متفاوت بودند (بین 660 تا 1840 متر ارتفاع از سطح دریا) اقدام نموده و پس از مطالعات لازم به این نتیجه رسید که کاشت این گیاه در ارتفاعات بالا بویژه سبب کاهش برخی کلیکوزیدها می‌‌گردد (امیدبیگی، 1384). در تحقیقاتی که در سال 1975 در اتیوپی روی گونه‌‌ای از ریحان انجام گرفت معلوم گردید که در ارتفاعات پایین مقدار لینالول موجود در اسانس گیاه مذکور افزایش می‌‌یابد، در حالی که کاشت این گیاه در ارتفاعات باعث افزایش تولید اوژنول موجود در اسانس می‌‌گردد (امید بیگی، 1384).
تجلی و همکاران (2002) با بررسی تأثیر ارتفاع و اندامها بر روی فنول و فلاونوئید گیاه Carateagus Microphylla بیان داشتند که این گیاه در ارتفاع 1000 متری، دارای بیشترین سطح فنول و فلاونوئید نسبت به گیاهان رشد یافته در ارتفاعات پست بوده است. قاسمی و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتی اکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد.
گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تأثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتی‌کسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیای غربی نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
سپهری‌‌فر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی در عصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره‌‌قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌‌باشد.
نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (2006) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمعآوری شده در سالهای متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

-104361-473572

3- مواد و روش‌ها
3-1- مواد گیاهی
در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
3-2- وسایل و دستگاههای مورد استفاده
کلروفیلسنج: جهت اندازهگیری میزان کلروفیل برگ
خطکش
ترازوی دیجیتال
آسیاب برقی
دستگاه موقعیت سنج (GPS)
سانتریفوژ آزمایشگاهی
دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
3-3- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرفها از شرکت مرک و حلالها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
3-4- آمادهسازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمعآوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال 1390 در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال 91) جهت جمعآوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمعآوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل 3-1). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با استفاده از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش 18 عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمعآوری شد با استفاده از دستگاه موقیعتسنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول 3-1). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول 3-2). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 13 صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گلآذین، تعداد گلآذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.

جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

3-7- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره 18 گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن100 میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با 10 سی‌‌سی متانول 80 درصد (نسبت 1 به 10) مخلوط شد. سپس نمونهها به مدت 24 ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک میباشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکیوالانت اسید گالیک بیان میگردد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با 16/1 میلی‌‌لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از 8-1 دقیقه استراحت، 300 میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (6/10 گرم در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در حمام بخار oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیکاسید (50، 100، 200، 250، 350 میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (50:50) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل 3-2).

شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) استفاده شد؛ به این صورت که 5/0 میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلی‌‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید 10درصد در اتانول (10 گرم آلومینیوم کلرید در 100 میلی‌‌لیتر اتانول و آبمقطر)، 1/0 میلی‌‌لیتر استاتپتاسیم یکمولار (41/2 گرم در 10 میلی‌‌لیتر آب مقطر) و 8/2 میلی‌‌لیتر آبمقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (10، 50، 100 و 200 میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل 3-3).

شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC
3-8-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- 7100
دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- 2450
آون ستون: هیتاچی ال-2300
نوع ستون: آر پی- 18 با ابعاد 6/4 250 میلی‌متر و اندازه ذرات 5 میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 1 میلیلیتر اسیداستیک، 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و 10 میلیلیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استاندارد‌‌های اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های 10، 20، 50، 100، 150 و 200 و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های 20، 25، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-4 و 3-5).
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد اسید کلروژنیک و اسید کافئیک به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد نمونهها در طول موج 330 نانومتر قرائت شد.
میزان اسید کلروژنیک و اسید کافئیک بر حسب درصد بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم. واحد مجهول (x) برحسب پی‌‌پی‌‌ام می‌‌باشد.

شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک

شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC
3-9-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فلاونوئیدی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 50 میلیلیتر متانول خالص مرک، 49 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه شده و 1 میلیلیتر اسید استیک با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر (مدت زمانی که طول می‌‌کشد تا ترکیب مورد نظر از ستون خارج شود) و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان روتین تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک نمونه بیان گردید (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد برای روتین غلظت‌‌های 20، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-6).

شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد روتین به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به روتین در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد (شکل 3-7). برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد. نمونهها در طول موج 285 نانومتر قرائت شد. میزان روتین بر حسب درصد یا میلیگرم بر گرم وزن خشک بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم.

شکل 3-7- کروماتوگرام نمونه استاندارد روتین در دقیقه 4:50
3-10- مشخصات طرح
برای انجام این تحقیق از طرح کاملاً تصادفی به صورت آشیانه‌ای استفاده شد. در این طرح اثر چهار ارتفاع در هر یک از دو استان مازندران و گلستان بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مورد بررسی قرار گرفت. برای ویژگی‌های مورفولوژیکی از پنج تکرار و برای ویژگی‌های بیوشیمیایی از سه تکرار استفاده شد. طرح آشیانه‌ای یا نستد در واقع یک طرح کاملاً تصادفی چند مشاهده‌ای می‌باشد، در این تحقیق استان به عنوان تیمار می‌باشد و ارتفاع نقش تکرار را دارد، و از آنجایی که چند نمونه در هر ارتفاع برداشت می‌شود به این طرح‌ها چند مشاهده‌ای گفته می‌شود.
3-11- تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس داده‌های به دست آمده با نرم‌افزار SAS انجام شد و به علت معنی‌دار شدن اثر متقابل ارتفاع در استان، مقایسه میانگین این اثر به کمک نرم‌افزار MSTAT و با روش آزمون دانکن صورت پذیرفت، رسم نمودارها نیز با نرم‌افزار Excel انجام شد.

-225529-624053

4- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک
نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گزنه نشان داد که بین دو استان مازندران و گلستان در تمامی صفات به جزء تعداد گل آذین در بوته اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان، در همه صفات معنی‌دار بود (جدول 4-1). جدول 4-2 مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان را برای صفات مورفولوژیک نشان میدهد.
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که مقدار هر سه صفت طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ با افزایش ارتفاع کاهش یافت به طوریکه بیشترین مقدار طول برگ (3/14 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری استان گلستان و کمترین مقـدار آن (9/6 سانتیمتر) در ارتفاع 2250 متری استان مازندران بدست آمد.
بیشترین مقدار عرض برگ (16/9 سانتیمتر) در ارتفاع 10 متری مازندران و کمترین مقدار آن (5/5 سانتی‌متر) در ارتفاع 2250 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین نسبت طول به عرض برگ (85/1) در ارتفاع 1450 متری گلستان و کمترین مقدار آن (18/1) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد.
تجزیه همبستگی نشان داد که دو صفت طول و عرض برگ همبستگی مثبت بالا (71/0=r) دارند (جدول 4-3).

جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک

*، ** و ns به ترتیب نشان معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دارمی‌باشد.
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن

در هر ستون حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است.

جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه

*، ** و ns به ترتیب نشاندهنده معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
4-1-2- تعداد برگ در بوته
با افزایش ارتفاع، تعداد برگ در بوته کاهش محسوسی نشان داد به طوریکه در ارتفاعات پایین مازندران و گلستان تعداد برگ در بوته، به ترتیب 8/84 و 2/80 عدد بود اما در ارتفاع 2250 متری این تعداد به 2/19 و 4/36 عدد کاهش یافت.
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها
با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان، تعداد گره در گزنه کاهش اما فاصله گره‌ها افزایش نشان داد. در پایین‌ترین ارتفاع مازندران و گلستان تعداد گره به ترتیب 23 و 2/26 عدد بود اما در بالاترین ارتفاع دو استان این تعداد به 6/9 و 11 عدد کاهش یافت.
بیشترین فاصله گره (48/8 سانتی‌متر) مربوط به استان مازندران و ارتفاع 1450 متری بود که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری اختلاف معنی‌دار نداشت. کمترین فاصله گره (4/3 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد. با توجه به همستگی منفی و بالا (71/0= r) بین دو صفت تعداد و فاصله گره، می‌توان نتایج حاصله را مورد انتظار دانست، یعنی در ارتفاعات افزایش فاصله گره‌ها در نتیجه کاهش تعداد گره قابل توجیه هست.
4-1-4- قطر ساقه
بیشترین میزان قطر ساقه که به ترتیب 05/7 و 98/6 میلی‌متر بود در ارتفاعات 1450 و 2250 متری گلستان و کمترین مقدار آن (44/4 میلی‌متر) در ارتفاع 10 متری مازندران مشاهده شد.
4-1-5- قطر و طول ریشه
با افزایش ارتفاع روند مشخصی برای دو صفت قطر و طول ریشه مشاهده نشد، بهطوری که بیشترین مقدار قطر ریشه (01/5 میلی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری این استان و همچنین ارتفاع 10 متری مازندران اختلاف معنی‌داری نشان نداد (05/0 ≤ P) کمترین مقدار قطر ریشه (02/3 میلی‌متر) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین مقدار طول ریشه (01/31 سانتی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد.
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته
بین دو استان از نظر تعداد گل آذین اختلاف معنی‌دار (05/0 ≤ P) مشاهده شد. میانگین تعداد گل آذین در بوته، در گلستان 8/46 عدد بود، در حالی‌که در مازندران 35/41 عدد بود. در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، مشخص شد که استان گلستان با ارتفاع 1450 متر بیشترین تعداد گل آذین (2/59 عدد) را داشت در حالیکه در ارتفاع 750 متری مازندران کمترین تعداد گل آذین (8/35 عدد) مشاهده شد.
تعداد گل آذین در بوته با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره، قطر ساقه و طول ریشه همبستگی مثبت و معنیداری نشان داد.
اندازه گل آذین در مناطق نمونه برداری کم و بیش مشابه بود، تنها در ارتفاع 1450 متری مازندران گزنه‌هایی با اندازه گل آذین بالاتر (52/5 سانتی‌متر) نسبت به سایر مناطق مشاهده شد.
4-1-7- ارتفاع گیاه
افزایش ارتفاع نقش موثری در کاهش ارتفاع گیاه گزنه داشت، بهطوری‌که نتایج نشان داد در ارتفاعات پایین (تا 750 متر) ارتفاع بوته‌ها بالا بود اما در ارتفاعات بالاتر کاهش چشمگیری در ارتفاع گیاه مشاهده شد. بیشترین ارتفاع گیاه (3/120 سانتی‌متر) در استان مازندران با ارتفاع 750 متر بدست آمد و کمترین مقدار این صفت (2/77 سانتی متر) در ارتفاع 2250 متری مازندران مشاهده شد که البته با ارتفاع 2250 متری گلستان اختلاف معنی‌دار نداشت.
ارتفاع گیاه گزنه با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره و طول ریشه همبستگی مثبت و معنی داری داشت (جدول 4-3).
4-1-8- میزان کلروفیل
با افزایش ارتفاع میزان کلروفیل روند افزایشی داشت بهطوری که بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد در حالیکه مقدار این صفت در ارتفاع 750 متری 3/27 درصد بود. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که میزان کلروفیل با طول برگ و تعداد گره، همبستگی منفی و معنی‌دار و با فاصله گره (40/0= r) همبستگی مثبت و معنی‌داری داشت (جدول 4-3).
طبق نتایج بدست آمده، صفات مورفولوژیکی و بیوشمیایی گیاه گزنه تحت تاثیر شرایط محیطی مختلف ناشی از تغییر ارتفاع محل رویش قرار گرفتند، یهطوری‌‌که ارتفاعات بالا در دو استان مازندران و گلستان به خصوص منطقه له کوه بابل با ارتفاع 2250 متر از سطح دریا، دارای بیشترین تاثیرپذیری از افزایش ارتفاع بودند. با توجه به داده‌های هواشناسی (جدول 3-1) با افزایش ارتفاع، دما به طور محسوسی کاهش یافت به‌طوری‌که میانگین دمای سالیانه از 17 درجه سانتی‌گراد در پایینترین ارتفاع به 8 درجه سانتیگراد در بالاترین ارتفاع رسید و از آنجایی که رشدونمو اندام‌های گیاهی در شرایط دمای پایین کاهش می‌یابد بسیاری از صفات مورفولوژیکی مورد بررسی در این مطالعه نظیر طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه کاهش یافت. در بسیاری از گیاهان تاثیر دمای پایین در کاهش خصوصیات رویشی به اثبات رسیده است (امیدبیگی، 1379). همزمان با کاهش دما در ارتفاعات بالا میزان کلروفیل افزایش نشان داد، افزایش درصد کلروفیل در شرایط سرد نوعی مقاومت در برابر سرما محسوب می‌شود تا گیاه بتواند تا حدودی خسارات ناشی از کاهش فتوسنتز را جبران کند (اسپیرینگ و کارلاندر، 1979).
4-2- صفات بیوشیمیایی
نتایج تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر و دستگاه HPLC نشان داد که اثر متقابل ارتفاع در استان برای تمامی صفات معنی‌دار بود (جدول 4-4 و جدول 4-5). مقایسه میانگین نیز برای این صفات انجام شد.
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج بررسی‌ها نشان داد که با افزایش ارتفاع، میزان فنل در اندام‌های مختلف گزنه افزایش می‌یابد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل برگ (57/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر، فنل کل برگ کاهش محسوسی نشان داد، ارتفاعات بالای استان گلستان نیز از فنل بالاتری نسبت به ارتفاعات پایین ر برخوردار بودند (شکل 4-1).
میزان فنل کل ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری که بیشترین میزان آن (38/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (48/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-2).
در ریشه نسبت به اندام‌های دیگر میزان فنل کل کاهش محسوسی نشان داد و حتی اختلاف کمتری در ارتفاعات مختلف مشاهده شد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل ریشه (21/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (09/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-3).

جدول 4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه HPLC

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.

شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان میزان فلاونوئید کل در اندام‌های مختلف افزایش یافت، به‌طوری‌که بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ (64/5 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، در ارتفاع 1450 متری مازندران مقدار آن به 94/4 میلی‌گرم بر گرم رسید و پس از آن ارتفاعات بالای گلستان بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ را داشته‌اند. کمترین میزان فلاونوئید برگ (3 میلی‌گرم بر گرم) مربوط به ارتفاع 50 متری گلستان بود (شکل 4-4).
مقدار فلاونوئید کل ساقه وگل نسبت به برگ کاهش نشان داد اما همچنان در ارتفاعات بالاتر مقدار بیشتری از این ماده در اندام‌های ساقه و گل وجود داشت. بیشترین میزان فلاونوئید ساقه و گل (98/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران حاصل شد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر میزان آن کاسته شد اما در سایر مناطق نمونه برداری میزان این ماده تقریباً یکسان بود و با هم اختلاف معنی‌داری نداشتند (شکل 4-5).
فلاونوئید کل ریشه کاهش چشمگیری نسبت به برگ و ساقه و گل داشت به‌طوری‌که بیشترین میزان آن (53/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و سایر مناطق مرتفع دو استان میزان تقریباً مشابهی از فلاونوئید کل را در اندام ریشه داشتند، کمترین میزان این ماده (1/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران بدست آمد (شکل 4-6).

شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل
مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ گیاه گزنه نشان داد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع میزان کلروژنیک برگ افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (29/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن ارتفاع 2250 متری گلستان مقدار کلروژنیک بالایی داشت، کمترین مقدار این ماده (1/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-7).
در اندام‌های ساقه و گل نیز بیشترین میزان اسید کلروژنیک در ارتفاعات بالا مشاهده شد، به‌طوری‌که بیشترین مقدار این ماده (3/0 میلی‌گرم بر گرم) در رویشگاه‌های 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن سایر مناطق مرتفع دو استان قرار داشتند، کمترین مقدار کلروژنیک اسید ساقه و گل (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران دیده شد (شکل 4-8).
در ریشه گزنه نسبت به اندام‌های هوایی مقدار اسید کلروژنیک کمتری دیده شد، بهطوری‌که بیشترین مقدار این ماده (13/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع مقدار این ماده در ریشه بصورت چشمگیری کاهش یافت بهطوری که در ارتفاع 50 متری گلستان به 02/0 میلی‌گرم بر گرم رسید (شکل 4-9).

شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ گیاه گزنه نشان داد که بیشترین مقدار این ماده (054/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن ارتفاع 1450 متری این استان قرار داشت، بین سایر مناطق نمونه‌برداری اختلاف معنی‌دار مشاهد نشد (شکل 4-10).
مقدار اسید کافئیک در اندام‌های ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (065/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، سایر مناطق مرتفع دو استان در جایگاه دوم قرار گرفتند و کمترین مقدار اسید کافئیک (046/0 میلی‌گرم بر گرم) در پایین‌ترین ارتفاع گلستان مشاهده شد (شکل 4-11).
نتایج بررسی‌ها نشان داد که در ریشه گزنه اسید کافئیک کمتری نسبت به سایر اندام‌ها وجود داشت و مقدار آن در ارتفاعات پایین بسیار ناچیز بود، بیشترین مقدار این اسید (021/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بود و ارتفاع1450 متری مازندران و مناطق مرتفع گلستان در رده‌های بعدی قرار گرفتند (شکل 4-12).

شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل
در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، بر میزان روتین برگ مشاهده شد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع مقدار روتین افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (34/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن، سایر مناطق مرتفع دو استان قرار گرفتند، کمترین مقدار روتین برگ (16/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-13).
نتایج مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل نیز، روندی مشابه با روتین برگ داشت، بهطوری که بیشترین مقدار آن (37/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان دیده شد (شکل 4-14).
طبق نتایج HPLC در ریشه گیاه گزنه روتین مشاهده نشد.

شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید
در همه اندام‌های گیاه گزنه، مقدار فلاونوئید کل بیشتر از فنل کل بوده است. با افزایش ارتفاع از سطح دریا میزان فنل و فلاونوئید کل به صورت چشمگیری افزایش نشان داد. در ارتفاعات کمتر از 1000 متر مقدار شیب رگرسیون بسیار کمتر از ارتفاعات بالاتر بوده است. در برگ گزنه مقدار فلاونوئید کل ارتباط بیشتری با ارتفاع نسبت به فنل کل نشان داد (96/0= r2)، به‌طوری‌که در ارتفاعات بالا شیب خط رگرسیون افزایش بیشتری نشان داد (شکل 4-15).
برخلاف برگ در اندام‌های ساقه و گل مقدار فنل کل ارتباط مثبت و معنی‌دار بیشتری با ارتفاع از سطح دریا نشان داد (95/0=r2)، بطوریکه در ارتفاعات بالاتر از 1000 متر، میزان فنل کل با شیب رگرسیونی بیشتری نسبت به فلاونوئید کل افزایش یافت (شکل 4-16).
در ریشه گیاه گزنه علاوه بر کمتر بودن مقدار فنل کل نسبت به فلاونوئید کل، پاسخ کمتری (87/0=r2) هم نسبت به افزایش ارتفاع از سطح دریا مشاهده شد (شکل 4-17).
میزان اسید کلروژنیک و روتین گیاه به طور محسوسی بیشتر از اسید کافئیک بود، همچنین بیشترین ارتباط (99/0=r2) با ارتفاع از سطح دریا، مربوط به میزان اسید کلروژنیک کل گیاه بود که بهشدت تحت تاثیر ارتفاع از سطح دریا قرار گرفت (شکل 4-18).

شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ گیاه گزنه

شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل گیاه گزنه

شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه گیاه گزنه

شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی در گیاه گزنه
میزان فنل و فلاونوئید کل و همچنین ترکیبات آن‌ها با ارتفاع از سطح دریا ارتباط مثبت و معنی‌دار داشتند، بهطوری که بیشترین میزان این ترکیبات در منطقه له کوه بابل مشاهده شد. با افزایش ارتفاع علاوه بر دما میزان رطوبت نسبی نیز کاهش یافت (جدول 3-1) و به نظر می‌رسد کاهش دما و رطوبت از مهمترین عوامل تاثیرگذار در افزایش تولید ترکیبات فنل و فلاونوئیدی باشند، هر چند در منطقه له کوه مقدار مواد آلی نیز نسبت به سایر مناطق بیشتر بود (جدول 3-2). در مطالعات مختلف تاثیر رویشگاه بر میزان متابولیت‌های ثانویه در گیاهان مختلف بررسی شده است که در اکثر موارد بر نقش رویشگاه به عنوان عامل تاثیر گذار در تجمع متابولیت‌های ثانویه تاکید شده است. مکان رشد گیاه می‌تواند از طریق تغییرات دمایی و رطوبتی بر فرآیند تشکیل مواد موثره تاثیرگذار باشد، مکانیسم تاثیرات محیط بر تجمع متابولیت‌های ثانویه به درستی روشن نیست، با این وجود این نکته روشن است که محیط از طریق تاثیری که در فرایند تولید متابولیت و عوامل مرتبط در تولید آنزیم‌ها دارد، در نوع و شدت واکنش‌های شیمیایی موثر است (همتی و همکاران، 2003؛ سیوستاوا و شیم، 2002). درجه حرارت از جمله عوامل محیطی تاثیرگذار در تشکیل و تجمع متابولیت‌های ثانویه است. بررسی‌های اولیه نشان داد که در مناطقی با درجه حرارت پایینتر تجمع فلاونوئید بیشتر است (داویس و آلبریگو، 1994). میزان مواد موثره در اندام‌های گیاهان هیچگاه ثابت نیست و متناسب با مراحل رشد گیاه و بعضی شرایط محیطی قابل تغییر است. کمیت و کیفیت ترکیبات شیمیایی وابسته به تنوع ژنتیکی، شرایط محیط و فنولوژی گیاه متغیر است (پلاتی و همکاران، 2005). در ضمن اختلاف زیادی در میزان مواد موثره یک گونه در شرایط مختلف رویشی وجود دارد (هانلیدو و همکاران، 1992). کسکیتالو و همکاران (2001) اعلام داشتند که نمی‌توان رابطه روشنی بین محصول و مقدار مواد موثره در گیاهان دارویی یافت. مهمترین عوامل در تغییرات کمی و کیفی به ترتیب به نوع گونه، زمان و مکان برداشت، تغییرات فصلی و روش‌های عصارهگیری بستگی دارد. اوماه و مازا (1996) نشان دادند که با افزایش ارتفاع بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی در اندام‌های گیاهی افزوده می‌شود. ترکیبات فلاونوئیدی جاذب نور مانند فلاونها و آنتوسیانینها، در پاسخ به اشعه یو-وی و برای محافظت بافتهای درونی ساقه و برگ از آسیبهای ناشی از این اشعه، در سلولهای اپی درمال تجمع پیدا میکنند. کامپفرول و کوئرستین از جمله این فلاونوئیدها هستند که در پاسخ به این اشعه در گیاه تولید میشوند. ارتفاع جغرافیایی در میزان متابولیتهای ثانویه مؤثر بوده است که یکی از دلایل این به کیفیت تشعشعات مخصوصا Uv-B در ارتفاعات ارتباط میدهند. اشعه Uv-B در ارتفاعات بالاتر بیشتر است و در نتیجه سبب تولید بیشتر بعضی از فلاونوئیدها میشود. (جاکولا و همکاران، 2010).
همتی و همکاران (1391) نشان دادند که میزان کورسترین اندام‌های مختلف گیاه نمدار در منطقه کلاردشت مازندران در مقایسه با منطقه گرگان بیشتر بوده است، بر طبق داده‌های هواشناسی منطقه کلاردشت نسبت به گرگان از ارتفاع بیشتر و هوای خنکتر برخوردار بوده است. علاوه بر این با توجه به اینکه منطقه کلاردشت نسبت به جنگل شصت‌کلا گرگان در ارتفاع بالاتری قرار دارد و با توجه به نقش فلاونوئیدها در حفاظت گیاه در برابر نور فرابنفش، تراکم بیشتر ترکیبات فلاونوئیدی در منطقه کلاردشت توجیح‌پذیر است. تاثیر هوای خنک بر تجمع مواد موثره اندازه‌گیری شده، می‌تواند به طولانی بودن بیشتر دوره تقسیم سلولی و فعالیت بافت گیاهی در مناطق خنک مرتبط باشد. در همین رابطه تحقیقات انجام شده روی برخی فلاونوئیدهای مرکبات نشان داد که تولید آن‌ها در مناطقی با آب و هوای خنک بیشتر ازمناطق گرم می‌باشد، زیرا طول دوره تقسیم سلولی بیشتر می‌شود و در این مرحله عوامل تولید برخی فلاونوئیدها بیشتر می‌شود (داویس و آلبریگو، 1994). میزان آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی در گیاه دارویی مامیران در دو منطقه گرگان و زیارت مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد میزان این ترکیبات در منطقه زیارت نسبت به گرگان بیشتر بود، با توجه به اینکه آب و هوای دو منطقه متفاوت است و منطقه زیارت دارای ارتفاع بالاتر و هوای سردتر است این شرایط برای گیاه تنش ایجاد کرده و تولید متابولیت‌های ثانویه افزایش یافت (قربانلی و همکاران، 1388). تحقیقات مشابه نیز نشان داد که در شرایط تنش برخی از ترکیبات ثانویه به میزان قابل توجهی در گیاه افزایش می‌یابد (آتال، 1998). قاسمی و همکاران (2011) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتیاکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد. گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتیاکسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیا نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی مورد مطالعه در این تحقیق در برگ گیاه گزنه بیشتر از اندام‌های دیگر بود، در بررسی میزان فلاونوئیدهای سرخ ولیک، میزان روتین این گیاه در برگ نسبت به گل و میوه بیشتر بود (همتی و همکاران، 2006). تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در اندام‌های مختلف گیاه ممکن است در نتیجه تغییر در برخی فعالیت‌های آنزیمی و نقش پیش ماده آن باشد (پیتر و ریچارد، 1993). در حمایت از این فرضیه محققین دیگر اشاره کردند که تنظیم کننده‌های رشد و نمو مانند هورمون‌های سیتوکنین و اسید جیبرلیک ممکن است بعضی آنزیم‌های تولید کننده فلاونوئیدها را فعال کنند (سیمور و همکاران، 1993).
سپهریفر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی درعصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌باشد.
آذریوند و همکاران (1388) در تحقیقی روی اسانس برگ و گل گیاه بومادران در ارتفاعات مختلف منطقه سیاه بیشه استان مازندران به این نتیجه رسیدند که ارتفاع بر میزان اسانس این گیاه تاثیر بسزایی داشته بطوریکه میزان ترکیبات اسانسی در ارتفاعات بالاتر بیشتر بود و این میزان در گل بیشتر از برگ بوده است.
حبیبی و همکاران (1384) با بررسی اثر ارتفاع روی اسانس گیاه دارویی آویشن وحشی منطقه طالقان به این نتیجه رسیدند که با افزایش ارتفاع مقدار ترکیبات اسانسی لینانول و آلفا ترپنین که بیشترین ترکیبات اسانسی در آویشن وحشی را تشکیل می‌دهند افزایش می‌یابد بهطوری‌که در ارتفاع 1800 متری کمترین و در ارتفاع 2800 متری بیشترین مقدار بوده است.
4-4- نتیجه‌گیری کلی
در بررسی اثر ارتفاع از سطح دریا، بر ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مشخص گردید که بین دو استان مازندران و گلستان اختلاف معنیداری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان بر صفات مورد مطالعه معنی‌دار بود، بسیاری از صفات مورفولوژیکی مثل طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه با افزایش ارتفاع کاهش و مقدار کلروفیل افزایش نشان داد. کمترین مقدار طول برگ (9/6 سانتی‌متر)، کمترین مقدار عرض برگ (8/5 سانتی‌متر) کمترین ارتفاع گیاه (2/77 سانتی‌متر) و بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در منطقه له کوه مازندران با ارتفاع 2250 متر بدست آمد. از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، در ارتفاعات بالا میزان ترکیباتی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین افزایش چشمگیری نشان داد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل (16/8 میلیگرم بر گرم)، فلاونوئید کل (15/12 میلیگرم بر گرم)، اسید کلروژنیک (72/0 میلیگرم بر گرم)، اسید کافئیک (140/0 میلیگرم بر گرم) و روتین (71/0 میلیگرم بر گرم) در کل گیاه در ارتفاع 2250 متری منطقه له کوه مازندران مشاهده شد.
4-5- پیشنهادات
با توجه به خودرو بودن گیاه گزنه توصیه می‌شود با کاشت این گیاه در شرایط کنترل شده زراعی و گلخانه‌ای زمینه جهت مطالعات بیشتر در این گیاه فراهم شود.
با توجه به کمبود تحقیقات پژوهشی در گیاه گزنه پیشنهاد می‌شود تاثیر عوامل مختلف محیطی و همچنین تنش‌ها در افزایش متابولیت‌های ثانویه این گیاه مورد بررسی قرار گیرد.
ناشناس بودن گیاه دارویی گزنه باعث می‌شود انجام یکسری مطالعات پایه سیتوژنتیکی و بررسی تنوع ژنتیکی در این گیاه ضروری به نظر آید.
تحقیقات بیشتر در زمینه دیگر ترکیبات فنل و فلاونوئیدی که در این پایاننامه مورد مطالعه قرار نگرفت.
منابع
فهرست منابع
آذرنیوند، ح.، قوام عربانی، م.، سفیدکن، ف. و طویلی، ع. 1388. بررسی تاثیر ویژگی‌های اکولوژیک (خاک و ارتفاع) بر کمیت و کیفیت اسانس گل و برگ Achillea millefolium. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 25(4):571-556.
آزاد بخت، م. 1378. رده بندی گیاهان دارویی. چاپ اول. انتشارات تیمورزاده. ص 401.
افشار، ج.، و دل اذر، ع. 1373. روتین از Ruta graveolens. مجله دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، 1، ص 12-1.
امیدبیگی، ر. 1379. رهیافت‌های تولید و فرآوری گیاهان دارویی. انتشارات طراحان نشر. مشهد. جلد 1. چاپ دوم. ص 283.
امیدبیگی، ر. 1384. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد اول، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 347.
امیدبیگی، ر. 1388. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد دوم، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 430.
تایز، ل. و زایگر، ل. 1379. فیزیولوژی گـیاهی. جلد دوم. ترجمه: کافی،م. لاهوتی، م. زند، ا. شریفی، ح. گلدانی، م. و کامکار، ح. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. ص 379.
دوازده امامی، س. 1382. کاربرد گیاهان دارویی. انتشارات نصوح. ص 113.
دوازده امامی، س. و مجنون حسینی، ن. 1387. زراعت و تولید برخی گیاهان دارویی و ادویهای. چاپ دوم. انتشارات دانشگاه تهران. ص 300.
حبیبی، ح.، مظاهری، د.، مجنون حسینی، ن.، چایچی، م.ر. و فخرطباطبایی، م. 1385. اثر ارتفاع بر روغن، اسانس و ترکیبات گیاه دارویی آویشن وحشی Thymus kotschynus منطه طالقان. مجله پژوهش و سازندگی در زراعت و باغبانی. شماره 73: 10-1.
جایمند، ک.، رضایی، م.، عصاره، م. و مشکی‌زاده، س. 1388. استخراج واندازه‌گیری ترکیبهای فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی (Rosa damascene Mill) از مناطق غربی ایران، فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 555:4-47.
حسنی، ج. 1383. شناسایی و بررسی اکولوژیکی دو جنس از گیاهان معطر Thymus و Ziziphora در استان کردستان. فصلنامه تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20(1): 17-1.
زرگری، ع. 1376. گیاهان دارویی. جلد چهارم، چاپ پنجم. انتشارات دانشگاه تهران، ص970.
زرگری، ع. 1383. گیاهان دارویی. جلد پنجم. چاپ ششم، انتشارات دانشگاه تهران، ص1010.
زینلی، ح.، رزمجو، خ. ارزانی، ا. و رضایی، م. 1386. ارزیابی دو گونه نعناع پونه سنبله‌ای و پودنه از لحاظ صفات زراعی، فیتوشیمیایی و سیتوژنتیکی. سومین همایش گیاهان دارویی. تهران، دانشگاه شاهد.
سپهری‌فر، ر. و حسنلو، ط. 1388. بررسی ترکیبات پلی‌فنلی، آنتوسیانینها و فلاونوئیدهای تام و خواص آنتی‌اکسیدانی گیاه دارویی قره قاط، جمع‌آوری شده از جهار منطقه مختلف ایران. فصلنامه گیاهان دارویی، 74:33 -66.
صمصام شریعت، ه. 1382. پرورش و تکثیر گیاهان دارویی. انتشارات مانی، ص420.
عسکرزاده، م. ع.، غلامی، ب. و نگاری، ع. 1387. بررسی عملکرد کمی و کیفی اکوتیپهای زیره کوهی کشور در شرایط آب و هوایی مشهد، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی خراسان.
فارماکوپه گیاهی ایران. 1381. کمیته تدوین فارماکوپه گیاهی ایران. تهران: وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی. معاونت غذا دارو. چاپ اول.

user8328

چکیده
اثر عصاره آبی- الکلی برگ و گل گیاه بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.) بر سیستم قلب و عروق و بررسی تداخل اثر آن با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتریک اکساید در موش صحرایی نر
به کوشش:
سهراب انوری حاجی محمدلو
گیاه بومادران شیرازی، گونه بومی جنس بومادران در ایران است. به منظور بررسی اثرات عصاره هیدروالکلی آن بر روی سیستم قلب و عروق و مکانیسم احتمالی آن، تحقیق حاضر به صورت زیر انجام شده است: 55 سر موش صحرایی نر بالغ از نژاد ویستار با محدوده وزنی 250-220 گرم به مدت یک هفته در شرایط نرمال 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی در حیوان خانه نگهداری شدند. تعداد 15 سر موش برای بررسی اثرات دوز های مختلف عصاره بومادران( دوز های 40، 50، 60، 80 و 100 میلی گرم بر کیلوگرم، 3=n) بر روی فشارخون سرخرگی مورد استفاده قرار گرفتند و تعداد 40 سر موش به منظور بررسی اثرات عصاره(دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) و حلال عصاره) اتانول 70 درصد) با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتررژیک به صورت تصادفی به هشت گروه پنج تایی تقسیم شدند. هر رت به وسیله تزریق داخل صفاقی یورتان بی هوش شد، سپس یک سیاهرگ و یک سرخرگ رانی به ترتیب برای انجام تزریقات و اندازه گیری فشارخون سرخرگی کانوله شدند. فشارخون سرخرگی و ضربان قلب، به وسیله ترانسدیوسر فشار متصل به دستگاه پاورلب ثبت گردید. فشارخون سرخرگی و ضربان قلب، قبل و بعد از تزریق عصاره بومادران(دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم، در گروه یک) و حلال عصاره(در گروه دو) ثبت شد. در گروه سوم (گروه کنترل سیستم کولینرژیک)، پارامترهای بالا قبل و بعد از تزریق آب مقطر(حلال دارو)، استیل کولین و حلال عصاره به همراه استیل کولین ثبت گردید. در گروه چهارم، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، استیل کولین و عصاره به همراه استیل کولین ثبت گردید. در گروه پنجم(گروه کنترل سیستم آدرنرژیک)، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، اپی نفرین و اپی نفرین به همراه حلال عصاره ثبت گردید. در گروه ششم، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، اپی نفرین و اپی نفرین به همراه عصاره بومادران ثبت شد. پارامترها در گروه هفتم(گروه کنترل سیستم نیتررژیک) قبل و پس از تزریق آب مقطر، L-NAME و حلال عصاره و در نهایت در گروه هشتم، پارامترها قبل و پس از تزریق آب مقطر، L-NAME و عصاره ثبت گردید. داده ها به کمک نرم افزار SPSS و با استفاده از آزمون Independent T-test برای بررسی تفاوت های بین گروه ها و آزمون Paired sample T-test برای بررسی تفاوت های بین مراحل مختلف یک گروه با در نظر گرفتنp<0.05 به عنوان سطح معنی دار، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج نشان داد که تزریق داخل سیاهرگی دوزهای مختلف عصاره بومادران باعث کاهش فشار میانگین سرخرگی در یک روش وابسته به دوز شد. عصاره(دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) به طور قابل ملاحظه ای فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی و دیاستولی را کاهش داد، در حالی که حلال هم حجم آن اثر قابل ملاحظه ای بر روی فشارخون سرخرگی نداشت. ضربان قلب در حضور عصاره و حلال آن در مقایسه با حالت پایه خود، تغییر قابل ملاحظه ای نداشت. نتایج کاهش قابل ملاحظه فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی و فشاردیاستولی و افزایش ضربان قلب را در حضور عصاره به همراه استیل کولین در مقایسه با مرحله تزریق استیل کولین نشان داد. عصاره فشار دیاستولی را در رت هایی که اپی نفرین دریافت کرده بودند کاهش داد، در حالی که ضربان قلب تغییر چشمگیری نداشت. در آخر تزریق داخل وریدی عصاره به طور چشمگیری باعث کاهش فشار میانگین سرخرگی و فشاردیاستولی در رت هایی شد که به آن ها L-NAME تزریق شده بود. می توان نتیجه گرفت که عصاره هیدروالکلی بومادران شیرازی اثر کاهش دهندگی فشار خون دارد و این اثر هم سو با سیستم کولینرژیک و احتمالاً مستقل از سیستم آدرنرژیک است. اثر کاهش فشارخون این گیاه، عمدتاً به خاطر اثرگذاری آن بر عروق و مستقل از سیستم نیتررژیک می باشد.
کلمات کلیدی: عصاره بومادران شیرازی، سیستم کولینرژیک، سیستم آدرنرژیک، سیستم نیتررژیک، فشارخون، موش صحرایی
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه TOC f h z t "عنوان;1"
1-1بومادران21-2-بومادران شیرازی PAGEREF _Toc398906150 h 21-3ترکیبات موجود در گیاهان جنس Achillea PAGEREF _Toc398906151 h 31-4خواص درمانی بومادران PAGEREF _Toc398906152 h 41-5- نقش سیستم نیتررژیک در دستگاه قلب و عروق: PAGEREF _Toc398906158 h 51-6- عوامل تعیین کننده فشار شریانی PAGEREF _Toc398906159 h 71-7- مشخصات عملکرد دستگاه عصبی اتونوم(سیستم سمپاتیک و پاراسمپاتیک) PAGEREF _Toc398906160 h 71-8- نقش سیستم عصبی اتونوم در تنظیم عملکرد گردش خون: PAGEREF _Toc398906162 h 81-9- سیستم عصبی سمپاتیک: PAGEREF _Toc398906163 h 81-10- عصب دهی سمپاتیکی عروق خونی: PAGEREF _Toc398906164 h 81-11- رشته های سمپاتیک قلب: PAGEREF _Toc398906165 h 9فصل دوم:مروری بر تحقیقات پیشین
2-1- مطالعات انجام شده در رابطه با اثرات بومادران PAGEREF _Toc398906167 h 112-2- هدف PAGEREF _Toc398906168 h 15عنوان صفحه
2-3- فرضیات PAGEREF _Toc398906169 h 15فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- مواد مورد استفاده PAGEREF _Toc398906170 h 173-2- وسایل مورد استفاده PAGEREF _Toc398906171 h 183-3- روش کار PAGEREF _Toc398906172 h 193-3-1-روش عصاره گیری PAGEREF _Toc398906173 h 213-3-2- چگونگی تهیه و نگهداری موش های صحرایی PAGEREF _Toc398906174 h 213-3-3-گروه بندی موش ها213-3-4- اجزای سیستم ثبت فشار خون PAGEREF _Toc398906176 h 233-4- مراحل انجام آزمایش PAGEREF _Toc398906177 h 243-4-1- چگونگی تجویز دارو PAGEREF _Toc398906178 h 263-5- واکاوی آماری PAGEREF _Toc398906179 h 27فصل چهارم: نتایج
4-1-گراف های ثبت شده با دستگاه PAGEREF _Toc398906180 h 294-2- فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به دوز های مختلف عصاره شیرین بیان PAGEREF _Toc398906181 h 314-3- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره PAGEREF _Toc398906182 h 32عنوان صفحه
4-3-1 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) به عنوان گروه آزمایش با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) به عنوان گروه کنترل بر روی فشار خون PAGEREF _Toc398906183 h 324-3-2 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) به عنوان گروه آزمایش با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) به عنوان گروه کنترل بر روی ضربان قلب PAGEREF _Toc398906184 h 334-4- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره و داروی استیل کولین(دوز 01/0 میلی گرم بر کیلوگرم) PAGEREF _Toc398906185 h 364-4-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906186 h 374-4-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906187 h 384 -4-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906188 h 394-4-5- فشار دیاستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906189 h 404-4-6- فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906190 h 414-4-7- فشار میانگین سرخرگی در حضور عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906191 h 424-4-8- ضربان قلب در حضورحلال عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906192 h 444-4-9- ضربان قلب در حضور عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906193 h 454-5- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره و داروی اپی نفرین(دوز 04/0 میلی گرم بر کیلوگرم) PAGEREF _Toc398906194 h 464-5-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906195 h 474-5-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906196 h 494-5-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906197 h 504-5-6- فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906198 h 52عنوان صفحه
4-5-7- فشار میانگین سرخرگی در حضور عصاره بومادران و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906199 h 534-5-8- ضربان قلب در حضور حلال عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906200 h 544-5-9- ضربان قلب در حضور عصاره بومادران و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906201 h 554-6- فشار میانگین و فشار سیستولی و دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره بومادران، حلال عصاره و داروی L-NAME (دوز 5 میلی گرم بر کیلوگرم) PAGEREF _Toc398906202 h 564-6-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906203 h 574-6-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و L-NAME PAGEREF _Toc398906204 h 584-6-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و داروی L-NAME PAGEREF _Toc398906205 h 594-6-5- فشار دیاستولی در حضور عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906206 h 604-6-6-فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906207 h 614-6-7- فشار میانگین سرخرگی در حضور عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906208 h 624-6-8- ضربان قلب در حضور حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906209 h 644-6-9-ضربان قلب در حضور عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906210 h 65 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- بررسی اثر عصاره آبی الکلی برگ و گل بومادران شیرازی بر فشار خون(فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستولی و دیاستولی) و ضربان قلب PAGEREF _Toc398906212 h 675-2- تداخل اثر عصاره آبی –الکلی برگ و گل بومادران شیرازی با سیتم کولینرژیک در سیستم قلب و عروق موش صحرایی نر PAGEREF _Toc398906213 h 69عنوان صفحه
5-3- تداخل اثر عصاره آبی –الکلی برگ وگل بومادران شیرازی با سیستم آدرنرژیک در سیستم قلب و عروق موش صحرایی نر PAGEREF _Toc398906214 h 705-4- تداخل اثر عصاره آبی –الکلی برگ وگل بومادران شیرازی با سیستم نیتررژیک PAGEREF _Toc398906215 h 725-5- نتیجه گیری PAGEREF _Toc398906216 h 745-6- پیشنهادات PAGEREF _Toc398906217 h 74فهرست منابع PAGEREF _Toc398906218 h 75منابع فارسی PAGEREF _Toc398906219 h 75منابع انگلیسی PAGEREF _Toc398906220 h 76

عنوان صفحه
فهرست جدول ها
TOC h z t "جدول ها;1" جدول 4-1-مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه در گروه کنترل PAGEREF _Toc398906551 h 32جدول 4-2- مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درحالت تزریق عصاره بومادران نسبت به حالت پایه در گروه آزمایش PAGEREF _Toc398906552 h 33جدول 4-3-مقایسه تغییرات ضربان قلب درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه(گروه کنترل) و تزریق عصاره نسبت به حالت پایه(گروه آزمایش) PAGEREF _Toc398906553 h 33جدول4-4 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906554 h 37جدول 4-5- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906555 h 38جدول4-6- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906556 h 39جدول4-7- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906557 h 40جدول4-8-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906558 h 41جدول4-9-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906559 h 43عنوان صفحه
جدول4-10-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906560 h 44جدول4-11- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین PAGEREF _Toc398906561 h 45جدول4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906562 h 48جدول 4-13 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906563 h 49جدول4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906564 h 50جدول 4-15- تغییرات فشاردیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906565 h 51جدول4-16- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906566 h 52جدول4-17- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906567 h 53جدول4-18-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906568 h 54جدول4-19-تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره (erio)و اپی نفرین(Epi) PAGEREF _Toc398906569 h 55جدول4-20- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906570 h 57جدول4-21- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906571 h 58عنوان صفحه
جدول4-22- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906572 h 59جدول4-23- تغییرات فشاردیاستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906573 h 61جدول4-24- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و PAGEREF _Toc398906574 h 62L-NAME PAGEREF _Toc398906575 h 62جدول4-25- تغییرات فشارمیانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906576 h 63جدول4-26- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و L-NAME PAGEREF _Toc398906577 h 64جدول4-27- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906578 h 65

فهرست شکل ها
عنوان صفحه
TOC h z t "شکلا;1" شکل 1-1- بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.) PAGEREF _Toc398906078 h 3شکل(1-2) ساختار برخی از فلاوونوئید های موجود در گونه های مختلف جنسAchillea PAGEREF _Toc398906079 h 4شکل 1- 3-سنتز نیتریک اکساید در اندوتلیوم عروق PAGEREF _Toc398906080 h 6شکل 3-1قیف پرکولاتور PAGEREF _Toc398906081 h 20شکل 3-2-روتاری PAGEREF _Toc398906083 h 20شکل 3-3- Freez-dryer PAGEREF _Toc398906084 h 21 شکل 3-4- دستگاه Power lab PAGEREF _Toc398906085 h 24شکل 3-5-تراکئوستومی PAGEREF _Toc398906086 h 25شکل 3-7-اتصال کانول سرخرگی به ترانسدیوسر فشار و نحوه قرار گیری کانول سیاهرگی PAGEREF _Toc398906087 h 26شکل 3-6-کانول گذاری سرخرگ و سیاهرگ رانی PAGEREF _Toc398906088 h 25شکل 4-1-گراف ثبت شده از ABP , Ps , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه PAGEREF _Toc398906089 h 29شکل 4-2-گراف ثبت شده از ABP , PS , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق عصاره PAGEREF _Toc398906090 h 29شکل 4-3-گراف ثبت شده از ABP ,PS, Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق حلال عصاره(اتانول 70 درصد) PAGEREF _Toc398906091 h 30عنوان صفحه
شکل 4-4- مقایسه میزان افت فشارمیانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره بومادران شیرازی نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906101 h 31شکل 4-5- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906102 h 34شکل 4-6- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه PAGEREF _Toc398906103 h 34شکل 4-7-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق حلال نسبت به سطح پایه PAGEREF _Toc398906104 h 35شکل 4-8-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق عصاره نسبت به سطح پایه PAGEREF _Toc398906105 h 35شکل 4-9-مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906106 h 36شکل 4-10-مقایسه میزان تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906107 h 37شکل 4-11- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906108 h 38شکل 4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906109 h 39شکل4-13- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906110 h 40عنوان صفحه
شکل 4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906111 h 41شکل 4-15- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906112 h 42شکل 4-16- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین PAGEREF _Toc398906113 h 43شکل 4-17- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین PAGEREF _Toc398906114 h 454-18- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره بومادران و استیل کولین PAGEREF _Toc398906115 h 46شکل 4-19- مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی اپی نفرین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906116 h 47شکل 4-20-مقایسه تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی اپی نفرین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906117 h 47شکل 4-21- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906118 h 48شکل 4-22- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906119 h 49شکل 4-23- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906120 h 50شکل 4-24- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906121 h 51شکل 4-25- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906122 h 52شکل 4-26- تغییرات فشار میانگین در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین PAGEREF _Toc398906123 h 53عنوان صفحه
شکل 4-27- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و اپی نفرین(S+Epi) PAGEREF _Toc398906124 h 54شکل 4-28- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و اپی نفرین(erio+Epi) PAGEREF _Toc398906125 h 55شکل 4-29- مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی L-NAME(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906126 h 56شکل 4-30- مقایسه تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی L-NAME(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش PAGEREF _Toc398906127 h 57شکل 4-31- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906128 h 58شکل 4-32- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906129 h 59شکل 4-33- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906130 h 60شکل 4-34- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906131 h 61شکل 4-35- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906132 h 62شکل 4-36- تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906133 h 63شکل 4-37- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم حلال عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906134 h 64شکل 4-38- تغییرات ضربان قلب در حضور تواًم عصاره و L-NAME PAGEREF _Toc398906135 h 65

فصل اولمقدمه

1-1بومادرانگیاه بومادران متعلق به جنس Achillea L. و تیره Asteraceae می باشد. جنس Achillea در ایران 19 گونه گیاه علفی چندساله و غالبا معطّر دارد. گونه های بومی آن عبارتند از:
A. Aucheri Boiss. A. eriophora DC.A.callichroa Boiss. Boiss. A. talagonica
A. kellalensis Boiss. Rech.f.A. pachycephala
Oxyodonata Bioss.
دیگر گونه های این جنس علاوه بر ایران در عراق، آناتولی، سوریه، قفقاز، لبنان، فلسطین، روسیه مرکزی، ماورای قفقاز، ترکمنستان، افغانستان، آسیای جنوب غربی و آسیای مرکزی نیز می رویند)1(.
بومادران ساقه ای به ارتفاع 20 تا 90 سانتیمتر و حتّی بیشتر دارد. در دشت ها و دامنه های بعضی از نواحی کوهستانی اروپا و آسیا، منجمله ایران به حالت خودرو می روید. برگ های آن عاری از دمبرگ، پوشیده از کرک و منقسم به بریدگی های بسیار باریک است. کاپیتول های کوچک و متعدد آن، وضع مجتمع به صورت گل آذین دیهیم دارد(2).
از کلیه قسمت های این گیاه، بوی قوی استشمام می شود به طوریکه به مجرد دست زدن به اعضاء گیاه، این بو احساس می گردد. قسمت های مورد استفاده این گیاه، سرشاخه های گلدار و برگ آن است که طعم تلخ و بوی قوی دارند(3).
1-2-بومادران شیرازیAchillea eriophora DC. (شکل1 -1)یکی از گیاهان بومی جنس Achillea در ایران می باشد و در زبان فارسی به آن بومادران جنوبی، سرزردو، بومادران شیرازی گفته می شود. پراکندگی این گیاه در استان های جنوبی و در ارتفاع 700 تا 3000 متر می باشد.( Peter et al ,1997)

شکل 1-1- بومادران شیرازی(Achillea eriophora DC.)1-3ترکیبات موجود در گیاهان جنس Achillea با تحقیقات فیتوشیمیایی بر روی گونه های مختلف جنس Achillea مشخص شده که ترکیبات موجود در گیاهان این جنس، از نظر زیستی ترکیبات بسیار فعالی هستند. از ترکیبات مهم موجود در در این گیاهان فلاوونوئیدها(شکل 1-2)، ترپنوییدها، لیگنان ها، مشتقات آمینواسیدی، اسیدهای چرب،آلکامیدها می باشند(Saeidnia et al, 2011).

شکل(1-2) ساختار برخی از فلاوونوئید های موجود در گونه های مختلف جنسAchilleaSaeidnia et al (2011)
1-4خواص درمانی بومادرانبومادران، گیاهی است دارویی و ارزنده که مصرف آن از قرن اول میلادی بین مردم معمول بوده است به طوری که در آن زمان برای برای بند آوردن خون و علاج زخم هایی که با خونروی همراه بوده استفاده می شده و به آن اعتقاد زیاد داشته اند. ضمناً از این گیاه در مراسم سحر و جادو استفاده می کرده اند. در قرون وسطی، بومادران را برای بند آوردن خونروی های بینی، اختلالات قاعدگی، بی خوابی، اختلالات بینایی، وجود خون در ادرار، اخلاط خونی، صرع و غیره به کار می برده اند. استفاده از آن برای مصارف درمانی از این زمان به بعد رو به افزایش یافت به طوری که تدریجاً علاوه بر موارد مذکور، از آن در رفع بیماری هایی نظیر بیماری های کبدی و کلیوی، بواسیر و غیره استفاده می شده است و با آن که در قرن حاضر، تدریجاً استفاده از آن کاهش یافت، با این حال، بررسی های جدید، ضمن تأیید برخی از اثرات درمانی بومادران، جای آن را در ردیف گیاهان دارویی مفید، محفوظ نگهداشت. دم کرده سرشاخه های گلدار بومادران، در رفع گاستریت های حاد و مزمن، رفع نفخ اثر نافع دارد. ضمناً سوء هاضمه های ناشی از نفخ را از بین می برد.
بومادران ، در رفع ترشحات زنانگی، بند آورندن خون، بواسیرهای خونی و اسهال های ساده اثر معالج دارد و چون در این گونه موارد به طور قاطع عمل می کند، اعتقاد مردم به آن در طی قرون متمادی همواره زیاد بوده است. بررسی ها نشان داد که با مصرف بومادران، از ترشحات مخاط رکتوم نیز که موجب پرخونی و تورم ناحیه دردناک بواسیر می شود، جلوگیری می شود. اثر قاعده آور بومادران باعث آن شد که در طی قرون متمادی، مردم از آن پیوسته استفاده کنند و چون با تکرار مصرف آن، اثر سویی در بیمار به وجود نمی آید، از آن برای تنظیم قاعدگی در مواقعی که به صورت ناکافی به وقوع می پیوندد و هم چنین برای جلوگیری از درد و ناراحتی در مواقع اشکال وقوع قاعدگی استفاده می شود. بومادران به علت اثر مدر خود در ازدیاد حجم ادرار و دفع سنگ کلیه نیز موثر است، به علاوه باد شکن و تب بر می باشد(2و3).
1-5- نقش سیستم نیتررژیک در دستگاه قلب و عروق:در سال 1980 ، Furchgott و Zawadski در تحقیقات خود بر روی عروق متوجه شدند که استیل کولین در آئورتی که دارای اندوتلیوم سالم می باشد اثر شل کنندگی دارد. این محققین به این نتیجه رسیدند که استیل کولین سبب تحریک آزاد شدن ماده ای از اندوتلیوم می گردد که باعث اتساع عروقی می شود و آن ها این ماده را ، فاکتور متسع کننده ی مشتق شده از اندوتلیوم (EDRF) نامیدند. چند سال بعد محققینی دیگر متوجه شدند که این ماده که باعث اتساع عروقی می شود همان گاز NO (نیتریک اکساید) است که این مولکول ، یکی از مهمترین مولکول ها در فیزیولوژی پستانداران است. در سلول های پستانداران، NO از آمینواسید L-arginine تولید می شود که از اکسید شدن این آمینواسید، L-Citruline و گاز NO تولید می شود(شکل 1-3). این واکنش به وسیله آنزیم های خانواده NOS کاتالیز می شود که تا به حال سه ایزوفرم از آن شناسایی شده است. نیتریک اکساید به عنوان یک مولکول سیگنالینگ در سیستم های قلب و عروق ودستگاه عصبی عمل می کند و در سیستم ایمنی و بهبود زخم هم نقش دارد. در سیستم قلب و عروق، NO عمدتا از سلول های اندوتلیال عروق و به میزان کمتری توسط پلاکت ها تولید می شود و مهمترین عملکرد آن خاصیت Vasodilation آن است. این مولکول همچنین از تجمع پلاکت ها و تکثیر بیش از حد سلول های اندوتلیال عروق جلوگیری می کند. از ایزوفرم های مختلف آنزیم NOS ، ایزوفرم eNOS در سلول های اندوتلیالی وجود دارد که با افزایش غلظت کمپلکس کلسیم-کالمودولین و فعال سازی آنزیم eNOS باعث تولید نیتریک اکساید می شود. نیتریک اکساید بسیاری از اثرات خود را بر روی مولکول هدف از طریق گوانیلیل سیکلاز(sGC) اعمال می کند که این آنزیم باعث تبدیل GTP به cGMP می شود که مهمترین پیام بر ثانویه داخل سلولی برای NO است که cGMP باعث فعال ساز ی پروتئین کیناز G) (PK می شود که این پروتئین کیناز باعث کاهش غلظت کلسیم داخل سلولی می شود که این باعث کاهش فسفریلاسیون وابسته به کلسیم زنجیره سبک میوزین می شود و در نهایت موجب ریلکس شدن عروق و افزایش جریان خون در این عروق می شود
(Queen and Ferro, 2006)و(Chunying LI et al, 2005) و(Robert W et al, 2001) .

شکل 1- 3-سنتز نیتریک اکساید در اندوتلیوم عروقDavid C. Gaze(2012)

1-6- عوامل تعیین کننده فشار شریانیفشار شریانی را می توان به صورت فشار متوسط شریانی تعریف کرد که میانگین فشار در طول زمان است و یا می توان به صورت فشار سیستولی(فشار حداکثر) و فشار دیاستولی(فشار حداقل) در سیکل قلبی تعریف کرد. اختلاف بین فشار سیستولی و دیاستولی را فشار نبض((Pulse pressure گویند. عوامل تعیین کننده ی فشار خون شریانی به دو دسته عوامل فیزیکی و فیزیولوژیکی تقسیم می شوند. دو عامل فیزیکی عبارتند از: حجم مایع(یعنی حجم خون) در سیستم شریانی و ویژگی های ارتجاعی سیستم(کمپلیانس). عوامل فیزیولوژیکی شامل برون ده قلب( که برابر است با ضربان قلب ضربدر حجم ضربه ای) و مقامت محیطی می شود(برن ولوی،2011) و(Khan and Gilani, 2011)
1-7- مشخصات عملکرد دستگاه عصبی اتونوم(سیستم سمپاتیک و پاراسمپاتیک)فیبرهای عصبی سمپاتیک وپاراسمپاتیک یکی از دوماده ی میانجی سیناپسی استیل کولین یا نوراپی نفرین را ترشح می کنند. فیبرهای ترشح کننده استیل کولین را کولینرژیک می نامند و فیبرهای ترشح کننده نوراپی نفرین را آدرنرژیک می گویند که مشتق از آدرنالین یعنی معادل اپی نفرین است(گایتون هال،2011).
نورون هایی که کولینرژیک هستند عبارتند از:1-کلیه نورون های پیش عقده ای، 2-نورون های پس عقده ای پاراسمپاتیک، 3-نورون پس عقده ای سمپاتیک که به غدد عرق عصب می دهند و 4- نورون های سمپاتیک که روی عروق خونی عضلات مخطط ختم شده و هنگام تحریک موجب اتساع عروقی می شوند. باقیمانده نورون های پس عقده ای سمپاتیک نورآدرنرژیک هستند. قسمت مرکزی غده فوق کلیوی در اصل یک عقده سمپاتیک است که در آن سلول های پس عقده ای آکسون های خود را از دست داده و مستقیما نوراپی نفرین، اپی نفرین و مقداری دوپامین را به داخل جریان خون ترشح می کنند. نتیجتا نورون های پیش عقده ای کولینرژیکی که به این سلول ها می روند به صورت اعصاب حرکتی ترشحی این غده درآمده اند.
معمولا هیچ گونه استیل کولینی در گردش خون وجود ندارد و اثرات تخلیه کولینرژیک موضعی به علت غلظت زیاد استیل کولین استراز در انتهاهای عصبی کولینرژیک عموماً محدود، مجزا و کوتاه مدت است. نوراپی نفرین تا مسافت های دورتری انتشار می یابدو عمل طولانی تری از استیل کولین دارد(گانونگ 2010).
1-8- نقش سیستم عصبی اتونوم در تنظیم عملکرد گردش خون:مهمترین قسمت سیستم عصبی خودکار در تنظیم عملکرد گردش خون، سیستم عصبی سمپاتیک است. سیستم عصبی پاراسمپاتیک نیز به خصوص در تنظیم عملکرد قلب نقش دارد.
1-9- سیستم عصبی سمپاتیک:رشته های عصبی وازوموتور سمپاتیک از طریق کلیه ی اعصاب نخاعی توراسیک و اولین یا دومین اعصاب نخاعی کمری از نخاع خارج می شوند. سپس این رشته ها وارد زنجیره سمپاتیک می شوند که در دو طرف ستون مهره ها واقع شده اند. پس از این، رشته های سمپاتیک از دو طریق روی گردش خون اثر می گذارند: 1) از طریق اعصاب سمپاتیک که عمدتا عروق احشای داخلی و قلب را تغذیه می کنند 2) با ورود به بخش محیطی اعصاب نخاعی که به عروق محیطی می روند(گایتون هال، 2011) و (Lin et al, 2003)
1-10- عصب دهی سمپاتیکی عروق خونی:در اکثر بافت ها تمام عروق به جز مویرگ ها، توسط این رشته ها عصب دهی می شوند. اسفنگترهای پیش مویرگی و متارتریول ها در برخی از بافت ها از جمله عروق خونی مزانتر عصب دهی می شوند. با این وجود، عصب دهی سمپاتیکی آن ها بسیار کمتر از شریان ها، شریانچه ها و وریدها می باشد. عصب دهی شریان های کوچک و شریانچه ها این امکان را فراهم می آورد که با تحریک سیستم سمپاتیک مقاومت عروقی در مقابل جریان خون افزایش یافته و در نتیجه سرعت جریان خون بافتی کاهش یابد. عصب دهی عروق بزرگ، به خصوص وریدها، باعث می شود که در موارد تحریک سمپاتیکی، حجم این عروق کاهش یابد. این رخداد موجب می شود که خون به سمت قلب فرستاده شود و بنابراین نقش مهمی در تنظیم عملکرد پمپی قلب داردگایتون هال، 2011) و (Paul and Levy, 1980).
1-11- رشته های سمپاتیک قلب:علاوه بر رشته های سمپاتیکی که عروق خونی را تغذیه می کنند، رشته های عصبی سمپاتیک به طور مستقیم نیز به قلب می روند. تحریک سمپاتیک به طور مشخص فعالیت قلب را افزایش می دهد و این اثر هم از طریق افزایش سرعت ضربان قلب و هم با افزایش قدرت قلب و حجم خون پمپ شده اعمال می شود (L.R.Queen, and A. Ferro, ).
TOC h z t "عنوان;1"

فصل دوم
مروری بر مطالعات پیشین
2-1- مطالعات انجام شده در رابطه با اثرات بومادراندر تحقیقی مکانیسم کاهش فشار خون توسط عصاره های هیدرواتانولی و دی کلرومتانی و اتیل استاتی و بوتانولی و دی کلرومتان-2 و همچنین فلاوونوئید Ar--etin استخراجی از گیاه Achillea millefolium بررسی شده است. در این تحقیق مصرف خوراکی عصاره های هیدرواتانولی و دی کلرومتانی و دی کلرومتان-2 به طور قابل ملاحظه ای فشار میانگین سرخرگی را در موش های با فشار نرمال کاهش داد. آنالیز فیتوشیمیایی این عصاره ها، وجود مقدار زیادی Ar--etin را در این عصاره ها نشان داد که بعد از جداسازی این فلاوونوئید ، هم به صورت خوراکی و هم تزریق داخل وریدی بر روی موش اثر داده شد و در یک روش وابسته به دوز فشار میانگین سرخرگی را کاهش داد. نتایج این آزمایش نشان داد که اثر کاهش فشار خون توسط Achillea millefolium ممکن است بخشی از آن به خاطر وجود میزان بالای فلاوونوئید Ar--etin و توانایی آن در کاهش تولید آنژیوتنسین ΙΙدر شرایط in vivo از طریق ممانعت از عملکرد آنزیم ACE باشد(Desoza et al,2011).
در تحقیقی اثر کاهش فشار خون گیاه Achillea millefolium و هم چنین عملکردهای ممانعتی آن بر روی قلب و عروق و اثر گشادکنندگی آن بر روی نای مشخص شده است. نتایج این پژوهش استفاده دارویی از این گیاه برای درمان بیماری های قلب و عروق و دستگاه تنفسی مثل فشار خون بالا و آسم را نشان داد (Khan et al, 2o11).
محققی به نام Dallacqueو همکاران (2011)، اثرات عصاره ی A. millefolium بر فعالیت Vasoprotective را در شرایط in vitro بررسی کردند. در این تحقیق عصاره این گیاه باعث افزایش رشد سلول های اولیه ی ماهیچه ی صاف عروق در رت گردید. همچنین در این تحقیق اثر عصاره این گیاه بر روی مسیر NF-KB در سلول های اندوتلیال ورید نافی انسان بررسی شد. نتایج نشان داد که عصاره با اثر ممانعتی بر روی NF-KB می تواند از التهاب عروقی جلوگیری کند. یافته های این محققین، استفاده سنتی از این گیاه بر روی بیماری های قلب و عروق را تاییدکرد.
نیازمند وهمکاران (2011)، در تحقیقی اثر عصاره آبی-اتانولی A. wilhelmsiiرا بر روی فشارخون در خرگوش بررسی کردند. نتایج این تحقیق نشان داد که عصاره این گونه به طور قابل ملاحظه ای باعث کاهش فشارخون شد. به گفته این محققین اثرکاهش دهندگی فشارخون عصاره این گیاه ممکن است بخاطر cardiac depressant و یا اثرات گشادکنندگی عروق باشد.
عسگری و همکاران در سال ( 2000 ) اثرات گیاه Achillea wilhelmsii را بر روی فشار خون و ضد چربی خون بررسی کردند. در این مطالعه به صورت تصادفی 120 نفر زن و مرد در سنین بین 60-40 سال انتخاب شدند و به آن ها روزی دو بار و هر مرتبه 20-15 قطره از عصاره ی هیدروالکلی گیاه Achillea wilhelmsii داده شد و این درمان به مدت بیش از شش ماه ادامه داشت. فشار خون و لیپیدهای سرمی (کلسترول ،تری گلیسرید ، LDL، HDL) در طی دو ماه در سه مرحله اندازه گیری شد. نتایج، کاهش قابل ملاحظه ای در میزان تری گلیسریدها، بعد از دو ماه نشان داد، در حالی که کاهش قابل ملاحظه در میزان تری گلیسرید ها، کلسترول(Totalcholesterol) و LDL cholesterol بعد از چهار ماه دیده شد. میزان HDL-cholesterol به طور قابل ملاحظه ای بعد از شش ماه درمان افزایش یافت. کاهش قابل ملاحظه ای در فشار دیاستولی و فشار سیستولی به ترتیب بعد از دو و شش ماه دیده شد.
بومادران (Achillea millefolium) به طور مؤثر می تواند لایه موکوسی معده را محافظت کند و از ترشح اسید معده جلوگیری کند. در تحقیقی عصاره آبی برگ های این گونه از جنس Achillea باعث محافظت از لایه موکوسی معده در مقابل عمل نکروزی مستقیم اتانول شده که این اتانول می تواند باعث آسیب به لایه موکوسی معده از طریق تخریب لایه ژلاتینی متشکله از موکوس و بی کربنات سطح داخلی معده شود که این لایه ژلاتینی از زخم شدن معده جلوگیری می کند. تحریک رسپتورهای موسکارینی M3 سلول های جداری، افزایش سطوح پپتیدهای تنظیمی معده ای، تحریک هیستامین و کاهش میزان جریان خون لایه موکوسی معده، باعث افزایش میزان ترشح معده و کاهش فاکتورهای حفاظتی معده می شود. عصاره این گونه از بومادران، باعث کاهش حجم و اسیدیته شیره معده شد که احتمالاً عصاره با بلاک کردن رسپتورهای موجود در سلول های جداری(M3، رسپتور هیستامینی H2 و رسپتور گاسترینی cckb) باعث این نقش حفاظتی مهم شده است(Baggio et al,2002)
بومادران (Achillea wilhelmsii) باعث تحریک سیستم ایمنی می شود. در مطالعه ای که بر روی موش انجام شد، عصاره آبی این گونه از جنس Achillea باعث تحریک ایمنی سلولی و ایمنی هومورال شدکه این فعالیت می تواند به خاطر حضور فلاوونوئید ها یا ساپونین ها باشد که این ها از طریق تحریک ماکروفاژها و لنفوسیت های B باعث افزایش تولید آنتی بادی و در نتیجه تقویت سیستم ایمنی می شوند(Sharififar et al, 2009).
در طب سنتی از گونه های جنس Achillea برای فرآیند بهبود زخم استفاده می شود. در تحقیقی برای تایید این موضوع از عصاره های یکی از گونه های بومی این جنس در ترکیه به نام Achillea biebersteinii بر روی دو مدل زخم سطحی و عمقی در رت استفاده شد و عصاره های مختلف این گیاه، باعث تسریع فرآیند بهبود زخم شدند و عصاره –n هگزانی این گیاه دارای اثراتی مشابه داروی Madecassol بود که این دارو برای بهبود زخم استفاده می شود. موقعی که یک زخم ایجاد می شود و در معرض محیط خارجی قرار می گیرد احتمال آن وجود دارد که به وسیله میکروب ها مورد تهاجم قرار گیرد که باعث تاخیر در فرآیند بهبود زخم می شوند. علاوه بر این حضور میکروب ها در محل زخم باعث تجمع ماکروفاژها و نوتروفیل ها در آن ناحیه می شوند که این ها باعث تولید ROS می شوند که اگر میزان ROS تولیدی زیاد باشد می تواند باعث القاء آسیب بافتی شدید شود که این هم مانعی برای فرآیند بهبود زخم است. عصاره این گیاه دارای پتانسیل آنتی اکسیدانی و فعالیت ضد میکروبی می باشد که از این طریق می تواند به عنوان یک دارویی مفید برای تسریع در فرآیند بهبود زخم باشد(Akkol et al, 2009).
بومادران دارای فعالیت ضد میکروبی نیز می باشد. در پژّوهشی در شرایط In vitro عصاره اتانولی و روغن فرار Achillea eriophora مانع رشد میکروارگانیسم های بیماریزا شد.در این تحقیق مشخص شد کهStaphylococcus aureus نسبت به روغن فرار Achillea eriophora بسیار حساس است. روغن فرار این گیاه در غلظت های مختلف از رشد میکروب های دیگری مثل Aspergillus niger، Bacillus subtilis، Candida albicans، Pseudomonas aeruginosa، Escherchia coli جلوگیری کرد. بنابراین از این گیاه می توان بر ضد میکروب های فرصت طلبی که باعث بیماریهای دستگاه تنفسی مثل سرماخوردگی می شوند استفاده کرد. همچنین از روغن فرار Achillea eriophoraمی توان به عنوان ضدمیکروب طبیعی و نگهدارنده و محافظت کننده غذایی با خطر کم استفاده کرد (Ghasemi et al, 2008).
گونه های جنس Achillea از التهاب ایجاد شده در اثر عفونت و آسیب نیز جلوگیری می کنند. در تحقیقی از لیپوپلی ساکارید) (LPSجدا شده از دیواره سلولی باکتری های گرم منفی برای فعال کردن ماکروفاژهای RAW264.7 موش در محیط کشت استفاده شد و با فعالیت ماکروفاژها تعداد زیادی واسطه های التهابی مثل NO، COX-2، TNF-α و IL-6تولید شد که روغن فرار گونه Achilleamillefolium L. با کاهش این عوامل التهابی، از پیشرفت پاسخ التهابی در این ماکروفاژها جلوگیری کرد(Chou et al, 2013).
گیاهان جنس Achillea باعث کاهش التهاب عصبی می شوند که این التهاب عصبی، نقش مهمی در پیشرفت بیماری هایی مثل پارکینسون و آلزایمر دارد و در این فرآیند تحریک زیاد سلول های میکروگلیال نقش دارد و با تولید واسطه های التهابی اولیه مثل سایتوکاین ها، MMP(matrixmetallo proteinases) و ROS و NO باعث مرگ سلول های عصبی می شوند. در تحقیقی عصاره Achillea fragrantissima از تولید بیش از حد واسطه های التهابی توسط سلول های میکروگلیال موش در محیط کشت جلوگیری کرد. بنابراین می تواند برای کنترل بیماری های تخریب نورونی در نظر گرفته شود . (Elmann et al, 2011)
بومادران (Achillea millefolium) اثر حفاظتی روی کبد دارد. در تحقیقی از (D-GalN) D-galactosamine و لیپوپلی ساکارید(LPS) برای القاء آسیب کبدی در موش استفاده شد و این آسیب با اندازه گیری میزان آلانین آمینوترانسفراز(ALT) و آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) پلاسما تایید شد. عصاره آبی-متانولی این گونه از بومادران به طور قابل ملاحظه ای میزان ALT و AST را در موش هایی که با این گیاه تحت درمان قرار گرفته بودند کاهش داد واین اثر محافظتی بومادران روی کبد با مشاهدات بافت شناسی نیز تایید شد. (Sheikh Yaeesh et al, 2006)
2-2- هدفاز آن جایی که یکی از گونه های جنس Achillea به نام A. eriophora بومی استان فارس و استان های هم جوار می باشد و با توجه به گزارشاتی که در خصوص اثرات متعدد و متنوع این گیاه موجود است، در تحقیق حاضر بررسی اثر آن بر بعضی از پارامترهای قلب و عروق مد نظر است.
2-3- فرضیاتعصاره آبی الکلی این گونه از بومادران موجب تغییراتی در فشار خون و پاسخ دهی آن به سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و سیستم نیتریک اکساید می شود.
فصل سوممواد و روش ها
3-1- مواد مورد استفادهعصاره آبی الکلی برگ و گل بومادران شیرازی
موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار
غذای موش(خریداری شده از شرکت جوانه خراسان)
ماده بیهوشی (Urethane) ساخت شرکت SIGMA
دی اتیل اتر
اتانول 70 درصد
آب مقطر
کاغذ صافی
سرنگ انسولینی، 5 و 10 سی سی با نیدل G23
سرم فیزیولوژیک
نرمال سالین
هپارین
استیل کولین(Acetylcholine hydrochloride) (تهیه شده از از شرکت Merk آلمان)
اپی نفرین( ساخت شرکت دارو پخش ایران)
داروی ممانعت کننده آنزیم نیتریک اکساید سنتتاز(L-NAME) (ساخت شرکت SIGMA-ALDRCH آلمان)
3-2- وسایل مورد استفادهوسایل تشریح( قیچی جراحی چشم، قیچی معمولی، تشتک تشریح، پنس، کلمپ، Moser)
میکروسکوپ
کانول پلی اتیلن PE 50
سمپلر
وسایل شیشه ای شامل بشر، پیپت، استوانه مدرج،لوله آزمایش
لوله آزمایش
قفس نگهداری حیوان
میز جراحی
یخچال فریزر 20-
ترازو
فشار سنج جیوه ای
ترمومتر مقعدی
کامپیوتر و نرم افزلر chart
دستگاه Power lab مجهز به Pressure transducer، Bridge amplifier
3-3- روش کار
3-3-1- روش عصاره گیریدر ابتدا گیاه بومادران شیرازی از ارتفاعات اطراف باغ ارم شیراز از ارتفاع حدود 1500 متر در ماه خرداد جمع آوری گردید و فوراً علف های هرز و قسمت های غیرقابل استفاده گیاه جدا شد و با انتقال به دانشکده علوم توسط استاد گیاه شناسی دانشکده علوم دانشگاه شیراز، مورد شناسایی علمی قرار گرفت. سپس گیاه جمع آوری شده سالم در محیط سایه و بدون رطوبت خشک گردید. پس از خشک شدن به دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی شیراز منتقل شد و زیر نظر متخصص فارماکوگنوزی به روش پرکولاتور عصاره گیری انجام شد.
ابتدا گل ها و برگ ها از قسمت ساقه جدا شدند و توسط دستگاه آسیاب به پودر تبدیل شدند و وزن پودر یادداشت شد. در سوراخ انتهای قیف پرکولاتور(شکل 3-1) مقداری پنبه طوری قرار داده شد که سوراخ آن کاملا مسدود شود. بعد روی آن پودر گیاه ریخته شد و روی پودر هم یک تکه کاغذ صافی قرار داده شد و روی کاغذ صافی هم وزنه ای قرار داده شد. سپس به میزان کافی اتانول 70 در صد ( 73 میلی لیتر اتانول 96درصد و 27 میلی لیتر آب مقطر) به پودر اضافه شد تا فضای بین پودر بومادران را پرکند و به طور کامل حلال روی پودر قرار گیرد. به محض نفوذ حلال به داخل پودر، دوباره مقداری از اتانول 70 درصد استفاده می شد. دور قیف پرکولاتور و هم چنین روی آن با فویل آلومینیومی پوشانده شد و در زیر قیف هم ظرفی تیره قرار می گرفت که رنگ تیره این ظرف مانع از تاثیر مضر نور بر روی عصاره می شد. روی ظرف هم قیفی قرار داده شد که عصاره خارج شده از قیف به داخل ظرف هدایت شود. حدود 67 ساعت طول کشید تا بومادران به روش پرکولاتور عصاره گیری شود. در طول این مدت با پایین آمدن سطح حلال، به میزان کافی اتانول 70 اضافه می شد و میزان آن هم یادداشت می شد. بعد از آن عصاره رقیق توسط دستگاه روتاری(شکل3-2) تا حد ممکن تغلیظ گردید. به خاطر عدم تبخیر کامل حلال، با نظر استاد فارماکوگنوزی فرآیند تغلیظ عصاره توسط روتاری متوقف شد و ادامه کار توسط دستگاه Freez dryer(شکل 3-3) انجام شد. عصاره در یک بالن کوچک مخصوص ریخته شد و در دستگاه قرار داده شد و دور بالن هم توسط فویل آلومینیومی پوشانده شد. حدود 48 ساعت طول کشید تا عصاره توسط دستگاه Freez dryer در دمای 49- درجه سانتیگراد به حالت پودری تبدیل شود. میزان پودر گل و برگ بومادران 146.66 گرم بود و در نهایت 24 گرم عصاره به دست آمد و راندمان این فرآیند عصاره گیری %16.36بود.
130238581915
شکل 3-1 قیف پرکولاتور
شکل 3-2-روتاری
شکل 3-3- Freez-dryer3-3-2-چگونگی تهیه و نگهداری موش های صحرایی
تعداد 55 سر موش صحرایی نر بالغ از نژاد ویستار با محدوده وزنی 250-220 گرم از موسسه رازی شیراز خریداری و به اتاق حیوانات بخش زیست شناسی دانشکده علوم منتقل گردید. رت ها به مدت یک هفته در شرایط کنترل شده نور (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و درجه حرارت حدود 22 درجه سانتی گراد نگهداری می شدند. در طول مدت نگهداری، غذا و آب به اندازه کافی در اختیار آن ها قرار می گرفت تا به این وسیله از سلامت کامل آن ها مطمئن شویم.
3-3-3-گروه بندی موشهاابتدا بر روی 15 موش اثرات دوز های مختلف محلول عصاره بررسی شد و دوز موثر انتخاب شد. سپس برای بررسی اثرات عصاره و حلال هم حجم آن از 10 سر موش استفاده شد که به صورت تصادفی در دو گروه کنترل(بررسی اثرات حلال)و گروه آزمایش(بررسی اثرات عصاره) قرار می گرفتند.
برای بررسی تداخل اثر عصاره و حلال با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتررژیک 30 رت به صورت تصادفی به شش گروه پنج تایی تقسیم شدند:
1- گروهی که به آن ها حلال هم حجم عصاره(اتانول 70%) و داروی استیل کولین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال استیل کولین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان استیل کولین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر استیل کولین به همراه اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
2- گروهی که به آن ها عصاره (mg/kg60) و داروی استیل کولین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال استیل کولین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان استیل کولین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر استیل کولین به همراه عصاره بومادران تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
3- گروهی که به آن ها حلال هم حجم عصاره(اتانول 70%) و داروی اپی نفرین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال اپی نفرین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان اپی نفرین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر اپی نفرین به همراه اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
4- گروهی که به آن ها عصاره (mg/kg60) و داروی اپی نفرین تزریق شد. در این گروه، حالت پایه، حالتی بود که موش ها فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال اپی نفرین تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان اپی نفرین تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد و در مرحله آخر اپی نفرین به همراه عصاره بومادران تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
5- گروهی که اتانول 70درصد و L-NAME دریافت می کردند که در این گروه، حالت پایه فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال L-NAME تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان محلول L-NAME تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد. با توجه به اینکه حدود 20 دقیقه لازم بود که اثرات این دارو کاملا ظاهر شود و پارامترهای قلبی عروقی در یک سطح حدودا ثابتی قرار گیرند، در بررسی نتایج اعداد مربوط به 20 دقیقه اول در نظر گرفته نشد. در مرحله آخر اتانول 70 درصد تزریق شد و باز هم به مدت چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد.
6- گروهی که عصاره و L-NAME دریافت می کردند که در این گرو، حالت پایه فقط سرم فیزیولوژیک دریافت می کردند. بعد از سی دقیقه ثبت نرمال به حیوان آب مقطر به عنوان حلال L-NAME تزریق شد و ده دقیقه پارامترها ثبت گردید. بعد از این مرحله به حیوان محلول L-NAME تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرفته شد. بعد از آن عصاره تزریق شد و چهل و پنج دقیقه ثبت گرقته شد. در این گروه نیز اعداد مربوط به 20 دقیقه اول در مرحله تزریق L-NAME در نظر گرفته نشد.
3-3-4- اجزای سیستم ثبت فشار خون
در این تحقیق، فشار خون و پارامترهای مربوط به آن توسط Pressure transducer ثبت می گردید. این ترانسدیوسر به یک Bridge amplifier که عملکرد آن تقویت سیگنال و فیلتر نمودن نویزهاست متصل می شد. بریج امپلی فایر به Recorder متصل می شد و نتایج ثبت شده بر روی مانیتور مشخص می شد(شکل 3-4).
Bridge amplifier
Recorder

شکل 3-4- دستگاه Power lab
3-4- مراحل انجام آزمایشدوازده ساعت قبل از بیهوش کردن موش ها، غذای آن ها قطع می شد ولی به آب دسترسی داشتند. بعد از دوازده ساعت، ابتدا به وسیله تزریق داخل صفاقی Urethane( دوزg/kg2/1(، حیوان بی هوش شده و سپس برای جلوگیری از آسپیره شدن و خفگی در زمان بی هوشی، تراکئوستومی(شکل 3-5) انجام شده و نای حیوان کانوله می گردید. برای دسترسی به عروق فمورال، برش کوچکی در سطح داخلی ران ایجاد کرده و با پنس مجرای این برش باز و گشاد می شد. سپس با استفاده از قیچی چشم پزشکی سرخرگ و سیاهرگ رانی را شکاف داده و کانول گذاری می شد(شکل 3-6). از کانول سیاهرگی برای انجام تزریقات در حین آزمایش استفاده می شد و کانول سرخرگی به دستگاه پاورلب وصل شده که از این طریق فشار میانگین سرخرگی، فشار سیستول، فشار دیاستول و ضربان قلب ثبت می گردید(شکل 3-7). در کل زمان آزمایش، سرم فیزیولوژیک به مقدار 1/ . سی سی در هر ده دقیقه از طزیق کانول سیاهرگی به حیوان تزریق می شد و دمای بدن حیوان در محدوده 37 درجه سانتیگراد کنترل می گردید.

شکل 3-5-تراکئوستومی
113792016510

شکل 3-6-کانول گذاری سرخرگ و سیاهرگ رانی

شکل 3-7-اتصال کانول سرخرگی به ترانسدیوسر فشار و نحوه قرار گیری کانول سیاهرگی3-4-1- چگونگی تجویز داروپس از این که سرخرگ و ورید رانی موش کانول گذاری شد، مدت یک ساعت به موش برای به تعادل رسیدن پس از جراحی استراحت داده می شد و بعد از آن به مدت سی دقیقه پارامترهای قلبی عروقی ثبت گردید. بعد از ثبت نرمال در گروه های مختلف، با استفاده از داروهای مقلد کولینرژیک، آدرنرژیک و مهارگر آنزیم نیتریک اکساید سنتاز، چگونگی اثر گذاری آن ها و تداخل اثرشان با عصاره بومادران مورد مطالعه قرار گرفت. تمامی تزریقات به صورت داخل وریدی و از طریق کانول سیاهرگی انجام شد. برای تعیین دوز موثر عصاره، پس از تهیه محلول mg/ml 200 (200 میلی گرم عصاره در یک میلی لیتر اتانول 70)، دوزهای 40،50، 60، 80 و100میلی گرم بر کیلوگرم مورد بررسی قرار گرفتند که بهترین و بیشترین پاسخ با دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم مشاهده گردید. بعد از تعیین دوز mg/kg 60 به عنوان دوز موثر، تداخل اثر این دوز از عصاره بومادران شیرازی و حلال هم حجم آن (اتانول 70 درصد) با سیستم های کولینرژیک، آدرنرژیک و نیتریک اکساید مورد بررسی قرار گرفت. برای تهیه محلول تمامی داروها از آب مقطر استفاده شد.
3-5- واکاوی آماری
گراف های ثبت شده با استفاده از نرم افزار Lab chart متعلق به سیستم Power lab به اعداد تبدیل شدند و این اعداد به وسیله نرم افزار SPSS و با استفاده از Paired- samples T-test برای تحلیل آماری درون گروهی و برای تحلیل آماری بین گروهی از آزمون آماری Independent T-test با در نظر گرفتن P<0.05 به عنوان سطح معنی دار، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

فصل چهارم
نتایج
4-1-گراف های ثبت شده با دستگاه
شکل 4-1-گراف ثبت شده از ABP , Ps , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت پایه
شکل 4-2-گراف ثبت شده از ABP , PS , Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق عصاره

شکل 4-3-گراف ثبت شده از ABP ,PS, Pd , MAP , HR (به ترتیب از بالا به پایین) در حالت تزریق حلال عصاره(اتانول 70 درصد)نتایجی که در قالب جدول و یا شکل در این فصل آمده است بر حسب میانگین±خطای میانگینSEM)± (Mean بیان شده است.
4-2- فشار میانگین سرخرگی در پاسخ به دوز های مختلف عصاره شیرین بیان
با بررسی دوزهای مختلف عصاره بومادران، بهترین و طولانی ترین افت فشار میانگین سرخرگی در دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم اتفاق افتاد.
n=3

شکل 4-4- نمودار تغییرات فشارمیانگین سرخرگی در پاسخ به دوزهای مختلف عصاره بومادران شیرازی نسبت به حالت پایه4-3- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره4-3-1 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) بر روی فشار خونبا توجه به جدول 4-1 و شکل 4-5 فشار خون( میانگین سرخرگی، سیستولی و دیاستولی) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه تغییرات قابل ملاحظه ای نشان نداده است.
با توجه به جدول 4-2 و شکل 4-6 فشارخون ( میانگین سرخرگی، سیستولی و دیاستولی) در حالت تزریق عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) نسبت به حالت پایه تغییرات معنی داری داشته است.
جدول 4-1- تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درمرحله تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه Mean pressure
(mm Hg) n=5 Diastolic pressure
(mm Hg) n=5 Systolic pressure
(mm Hg) n=5 Stage
Time(min)
Solvent Base Solvent Base Solvent Base 92.7±4.7
93.2±4.3
93.2±4.5
85.7±7.2
95.4±8.1 91.8±4.8
89.2±5.7
96.3±4.5
91.6±6.6
96.1±3.8 74.9±4.4
75.6±3.9
75.4±4.2
68.7±6.5
78.7±8 74±4.7
71.7±5.4
78.3±4.3
74.2±6.4
78.3±3.6
128.4±5.5
128.5±5.4
128.7±5.2
119.9±8.7
128.9±8.6
127.6±5.2
124.4±6.3
132.3±4.9
126.6±7.1
131.7±4.3 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25
جدول 4-2- مقایسه تغییرات فشار (سیستولی، دیاستولی و میانگین) درمرحله تزریق عصاره بومادران نسبت به حالت پایه Mean pressure
(mm Hg) n=5 Diastolic pressure
(mm Hg) n=5 Systolic pressure
mm Hg)n=5) Stage
Time(min)
erio Base erio Base erio Base 91.8±3.4 b
96.1±1.9
93.1±3.2
89.8±.6 b
87.4±1.7 b 99.7±1.7
103±.6
102.1±1
100.1±1
100.1±3.5 76.7±5
81±3.3
77.8±4.1
74.9±1.6 b
72.4±.4 b 86.3±1.5
89.4±.6
87.8±.6
86.2±.7
86.2±2.7 122.2±.2
126.3±.8 b
123.8±1.2
119.6±1.2 b
117.3±4.2 b 126.6±2.1
130.3±.6
130.7±1.7
127.9±1.6
127.9±5 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25
b : اختلاف معنی دار حالت تزریق عصاره(erio) نسبت به حالت پایه(Base)
4-3-2 مقایسه اثرات عصاره بومادران (دوز 60 میلی گرم بر کیلوگرم) با اثرات حلال هم حجم عصاره (اتانول 70 درصد) بر روی ضربان قلببا توجه به جدول 4-3 و شکل 4-7 و شکل 4-8، ضربان قلب درحالت تزریق حلال نسبت به حالت پایه در گروه کنترل و در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه در گروه آزمایش تغییرات قابل ملاحظه ای نداشته است.
جدول 4-3-مقایسه تغییرات ضربان قلب درحالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه و تزریق عصاره نسبت به حالت پایهHeart rate (Beats/min)
n=5 Heart rate (Beats/min)
n=5 Stage
Time(min)
erio Base Solvent Base 410.8±8.8
404.6±7.9
414.4±3.3
414±5.7
400.2±2.6 406.1±12.1
407.1±10.9
403.3±12.5
406.8±9.1
397.7±12 372±22.2
369±22.9
369.6±17.8
352.2±26.2
351.1±27.1 372.5±22.7
366.4±22.4
376.1±23.7
367.6±27.1
372.9±23.5 1-5
5-10
10-15
15-20
20-25

شکل 4-5- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق حلال عصاره نسبت به حالت پایه
شکل 4-6- تغییرات فشار(سیستولی، دیاستولی ومیانگین) در حالت تزریق عصاره نسبت به حالت پایه
b : اختلاف معنی دار حالت تزریق عصاره(erio) نسبت به حالت پایه(Base) p<.05

شکل 4-7-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق حلال نسبت به سطح پایه
شکل 4-8-میزان تغییرات ضربان قلب در حالت تزریق عصاره نسبت به سطح پایه4-4- فشار میانگین، فشار سیستولی ، دیاستولی و ضربان قلب در حضور عصاره و حلال عصاره و داروی استیل کولین(دوز 01/0 میلی گرم بر کیلوگرم)4-4-1- با توجه به شکل 4-9 و 4-10، فشار میانگین و ضربان قلب در حالت کنترل دارو و حالت پایه در هر دو گروه، در مقایسه با یکدیگر تغییرات قابل ملاحظه ای نداشته است.
در حالت پایه، حیوان سرم فیزیولوژیک دریافت می کرد.
در حالت کنترل دارو به حیوان، آب مقطر به عنوان حلال داروی استیل کولین تزریق می شد.

شکل 4-9-مقایسه میزان فشار میانگین در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش
شکل 4-10-مقایسه میزان تغییرات ضربان قلب در حالت پایه (B) و حالت کنترل داروی استیل کولین(تزریق آب مقطرW) در دو گروه کنترل و آزمایش4-4-2- فشار سیستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول های 4-4 و شکل 4-11، فشار سیستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. در حالت تزریق حلال عصاره تواًم با استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین، اختلاف معنی داری دیده نشد.
جدول4-4 - تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولینStage
Time Systolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 119.7+8.4
117.3+8.1
118.4+8.9 118.7+8.4
124.2+8.4
127.5+11.6
b110.3+9.6
b90.5+4.3
99.3+7.1
93.1+14.4
97.8+15.9 108.4+5.5
94.7+4
89+3.9
94.1+7.1
99.6+9.5
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05

شکل 4-11- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
4-4-3- فشار سیستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین
با توجه به جدول های 4-5 و شکل 4-12، فشار سیستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار سیستولی در حالت تزریق تواًم عصازه و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین نیز کاهش نشان داد که در بعضی از این دقایق، این کاهش معنی دار بود.
جدول 4-5- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین Stage
Time Systolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) erio +Ach
(n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 119.8+6
117.3+7
123.6+3.6 123+5.3
125.1+5.3
126.8+6.7 b114.1+5
b94.2+10.4
107+5.8
104+7.4
112.8+5.9 c
94.2+9
c81.9+3.9
83.9+4.1
86.5+6.9
94.4+12.3
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05

شکل 4-12- تغییرات فشار سیستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
4 -4-4- فشار دیاستولی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول 4-6 و شکل 4-13، فشار دیاستولی در حالت تزریق محلول استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار دیاستولی در حالت تزریق تواًم حلال عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین تغییرات قابل ملاحظه ای نشان نداد.
جدول4-6- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین Stage

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

Time Diastolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 70.4+7.1
68.3+5.6
69.5+5.5 70.5+8.8
73.4+7.5
75.4+8.1 64.9+5.7
b52.9+3.1
59.9+4.1
55.3+10.8
57.5+10.7 61.7+3.5
55.6+3.9
52.7+3.7
54.3+4.7
58.9+5.5
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05

شکل4-13- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) با کنترل دارو(تزریق آب مقطر W) P<.05
4-4-5- فشار دیاستولی در حضور عصاره بومادران و استیل کولین
با توجه به جدول 4-7 و شکل 4-14، فشار دیاستولی در حالت تزریق استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار دیاستولی در حالت تزریق تواًم عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین کاهش بیشتری داشته است که در بعضی از دقایق این کاهش معنی دار است.
جدول4-7- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره بومادران شیرازی و استیل کولین Stage
Time Diastolic Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) erio +Ach
(n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 72.4+2.9
71.6+5.4
74+5.6 75.1+3.6
76.3+4.5
76.4+2.9 b63.8+4
b54.4+7.5
66.5+5
64.4+5.6
70.4+3.3 57.4+4.2
c45.7+4.7
50.2+1.7
51.8+3.4
55.9+5.1
:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
b
شکل 4-14- تغییرات فشار دیاستولی در حضور تواًم عصاره و استیل کولین:b اختلاف معنی دار استیل کولین(Ach) باحالت کنترل دارو(تزریق آب مقطرW) P<.05
:c اختلاف معنی دار تزریق تواًم عصاره بومادران شیرازی(erio) و(Ach) نسبت به تزریق استیل کولین (Ach) P<.05
4-4-6- فشار میانگین سرخرگی در حضور حلال عصاره و استیل کولین
با توجه به جدول 4-8 و شکل 4-15، فشار میانگین سرخرگی در حالت تزریق استیل کولین نسبت به حالت کنترل دارو(تزریق آب مقطر) کاهش نشان داده است که در بعضی از دقایق این کاهش، معنی دار است. فشار میانگین سرخرگی در حالت تزریق تواًم حلال عصاره و استیل کولین نسبت به حالت تزریق استیل کولین تغییرات معنی داری نداشته است.
جدول4-8-تغییرات فشار میانگین سرخرگی در حضور تواًم حلال عصاره(اتانول 70 درصد) و استیل کولینStage
Time Mean arterial Pressure (mmHg)
Base
(n=5) Solvent of Ach (W) (n=5) Ach
(n=5) Solvent(ethanol 70%)+Ach (n=5)
Min 1-3
Min 3-6
Min 6-9
Min 9-12
Min 12-15 86.8+7.4
84.6+6.2
85.8+6.4 86.6+9.8
90.3+8.3
92.8+9.1 b80+6.8

user8300

1-4- مایعات یونی 8
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی 9
1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی - آب 10
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی 11
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب 13
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت 13
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها 14
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس 15
فصل دوم: مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز 18
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم 19
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی 22
اهداف 23
فرضیه 23
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- ابزار 25
عنوان صفحه
3-2- مواد 26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی 26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL 26
3-2-2-1- سوش باکتری 26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون 26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی 26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز 26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE 27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز 27
3-2-4- نرم افزارها 27
3-3- روشها 28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی 28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید 28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات 28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب 29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli 29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli 29
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی 29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد 30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری 31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا 32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL 32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL 33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی 33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین 34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد 34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 34
عنوان صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) 35
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفور 35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز 36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات 38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی 39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا 39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف 39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 40
فصل چهارم: نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا 43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL 44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی 44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز 45
4-3- سنتز مایعات یونی 47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی 48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف 49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی 51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم 51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی 54
فصل پنجم: بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 57
عنوان صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی 61
فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات
6-1- نتیجهگیری 63
6-2- پیشنهادات 63
فهرست منابع 65
چکیده انگلیسی 75
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) 6
شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز 9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب 12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز 18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید 28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL 42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی 45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL 46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL 47
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی 48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون 52
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85 54
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] 55
فصل اول
مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که میتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده زمین لیپیدها هستند و آنزیمهای لیپولیتیک نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیمهای لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلولهای یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیمها مزایای زیادی در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها میتوان اختصاصیت بالای آنها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینهها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیمها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم درBOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).
آنزیمهای میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیمهای میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دستورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن میباشد)، پایداری بیشتر و تولید آسانتر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتریها و بنابراین آسانتر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آنها، باعث تسهیل فرآیندهایی همچون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دستیابی به بیشترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلولها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی میشوند. تنها حدود دو درصد از گونههای میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شدهاند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).
1-2- لیپازها
لیپازها اولین بار در سال 1901 در باکتریهای Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهای امروزی Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسایی شدند (Eijkman et al., 1901). باکتریهای گفته شده هماکنون بیشترین مطالعات لیپازی را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روی آنزیمهای هیدرولیز کننده تریگلیسریدها میگذرد و حدود 70 سال است که توانایی لیپازها در کاتالیز واکنشهای هیدرولیز و سنتز استرها تشخیص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولین آنزیم لیپاز را (آنزیم تجزیه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شیره پانکراس کشف کرد. انسانها در قدیم لیپاز را از پانکراس حیوانات به صورت خالص یا به صورت مخلوط با سایر آنزیمهای پانکراس میگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مینمودند. به دلیل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوری آنزیم از آن، دانشمندان به سراغ لیپازهای میکروبی رفتند. لیپازها از نظر نوع منشأ ( باکتری، قارچ یا پستاندار و غیره) و از نظر خصوصیات متفاوت هستند. این آنزیمها دارای توانایی کاتالیز واکنشهای مختلفی از جمله واکنشهای هیدرولیزی، یا سنتز کربوکسیلیکاسترهای مختلف و تبدیل آنها به اسیدهای آلی و گلیسرول هستند. همه لیپازها اختصاصیت بسیار بالایی برای سوبستراهای گلیسریدی دارند.
آنزیمهای لیپولایتیک به دلیل کاربرد فراوانی که در بیوتکنولوژی دارند ( به عنوان مهمترین گروه بیوکاتالیزورها در بیوتکنولوژی)، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). تولید انبوه لیپازهای میکروبی نیازمند بیان شدید و کارآ از ژنهای مربوطه و فهم دقیق مکانیسم ملکولی نحوه پیچش پروتئین و ترشح آن میباشد. از جمله کاربردهای جدید لیپازها در بیوتکنولوژی میتوان استفاده از این آنزیم در سنتز بیوپلیمر، بیودیزل، داروهای خالص انانتیومری، مواد شیمیایی مورد استفاده در کشاورزی ( مانند انواع آفت کش)، ترکیبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسیاری از مواد شیمیایی مهم صنعتی، به دست آمده از روغنها و چربیها طی فرآیندهای شیمیایی را میتوان به کمک لیپازها با سرعت بیشتر، اختصاصیت بهتر و در شرایط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزینی بالای لیپازها و اختصاصیت بالای شیمیایی و انانتیومری آنها توجه بسیاری از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
لیپازهای گرفته شده از منابع مختلف باکتری، قارچ، گیاه و حیوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصیت به موقعیت پیوند، اختصاصیت به اسیدچرب، پایداری دمایی و pH بهینه و غیره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههای متعددی از باکتریها، مخمرها و قارچهای رشتهای توانایی تولید لیپاز دارند (جدول1) سویه های نزدیک به هم (از نظر تاکسونومی) ممکن است انواع مختلفی از لیپاز ها را تولید کنند (Sharma et al., 2001).
جدول 1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز
منشأ جنس گونه
باکتری Bacillus B. megaterium
B. subtilis
B. thermoleovorans
B. thermocatenulatus
B. cereus
Pseudomonas P. putida 3SK
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. fragi
Staphylococcus S. canosus
S. hyicus
S. haemolyticus
S. aureus
S. warneri
S. xylosus
قارچ Penicillium P. cyclopium
P. simplicissimum
Aspergillus A. niger
A. oryzae
Rhizopus Rhizop. delemar
Rhizop. oryzae
Rhizop. arrhizus
Rhizop. nigricans
Rhizop. nodosus
مخمر Candida C. rugosa
C. tropicalis
C. antarctica
لیپازها را میتوان براساس اختصاصیت به سه گروه تقسیم کرد (Mukherjee et al., 1994). لیپازهای غیر اختصاصی ملکولهای آسیل گلیسرول را در موقعیتهای تصادفی میشکنند و اسیدچرب آزاد و گلیسرول و منوآسیل گلیسرول و دیآسیلگلیسرول را به عنوان حدواسطهای واکنش ایجاد میکنند. محصولات این واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتالیزورهای شیمیایی است. در واکنش آنزیمی محصول در اثر دما کمتر تجزیه میشود و این به دلیل پایینتر بودن دمای واکنش در کاتالیز زیستی است. لیپازهای اختصاصی به موقعیتهای 1و3، آزادسازی اسیدچرب از موقعیتهای 1و3 اسکلت گلیسرولی را کاتالیز میکنند. لیپازهای دارای اسیدچرب اختصاصی، تنها یک اسیدچرب خاص از ملکول آسیل گلیسرول آزاد میکنند (Macrae et al., 1983). لیپازها همچنین تفکیک انانتیومری ترکیبات کایرال و واکنشهای استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون، و اینتراستریفیکاسیون را کاتالیز میکنند. این تواناییهای متنوع کاتالیز، در شکست چربیها، اصلاح چربیها و روغنها، سنتز ترکیبات آلی، تأمین شویندهها و روشهای تجزیهای، کاربرد بسیاری پیدا کرده است (Macrae et al., 1985).
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن
این خصوصیت لیپازها که در سطح بین فضای آبدوست و آبگریز عمل میکنند، وجه تمایز لیپازها از استرازها میباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولی آنزیمهای لیپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون میباشد. این آنزیمها نیز شبیه سرینپروتئازها دارای مجموعه سه تایی کاتالیتیک باقیمانده نوکلئوفیل- باقیمانده هیستیدین- باقیمانده اسیدی هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرین- هیستیدین- آسپارتات یا به صورت مجموعه سه تایی سرین- هیستیدین- گلوتامات میباشد (Noble et al., 1993).
جایگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقیماندههای آبگریز احاطه میشود. یک ساختار مارپیچ پلیپپتیدی همانند یک درپوش مانع از قرارگیری جایگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال میشود. همچنین محافظت از آنزیم در برابر فعالیت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تایی کاتالیتیک پروتئاز ایجاد شود (B--y et al., 1990). سمتی از درپوش که روبروی جایگاه فعال است بیشتر از زنجیرههای جانبی آبگریز آلیفاتیک تشکیل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بیرون قرار گرفته است.
تغییر جهتگیری ساختار α- هلیکس درپوش همراه با افزایش آبگریزی سطوح نزدیک جایگاه فعال و روبروی آن، باعث پدیده "فعال شدن در فضای بینابینی" میشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزیم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهای آبگریز، اتصال زنجیرههای آلیفاتیک سوبسترا به سطح آبدوست آنزیم، به ویژه در حضور یک لایه آبپوشی، بسیار نامطلوب است. فضای بینابینی ایجاد شده در دهانه شیار فعال ممکن است به فراهم سازی یک لایه ناکامل آبپوشی در اطراف ملکول لیپاز و در نتیجه تسهیل پیچش زنجیرههای آلیفاتیک ملکول سوبسترا در سطح آنزیم کمک کند (Petersen et al., 1996). پایدارسازی بیشتر میتواند به کمک محدودههای الکتروستاتیک موضعی در سطح آنزیم و با ایجاد جاذبه دوقطبی به سمت پیوند C-H (با قطبیت ضعیف) زنجیرههای جانبی آلیفاتیک فراهم شود.

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL).
آمینواسیدهای اصلی جایگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.
1-3- آنزیمها در محیط آلی
کلیبانو با انجام تعدادی آزمایش ابتدایی و ساده نشان داد که میتوان از آنزیمها در حلالهای آلی آبگریز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنین محیطهایی سرعت واکنش به شدت پایین میآید (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسیاری از لیپازها و همچنین برخی از پروتئازها و آسیلازها بسیار پایدار هستند، به طوری که حتی در حلالهای آلی بدونآب نیز فعالیت خود را حفظ میکنند. این خصوصیت اساس استفاده موفقیتآمیز از این آنزیمهای هیدرولاز در واکنشهای غیرهیدرولازی است. از جمله این واکنشهای غیرهیدرولازی میتوان آسیلاسیون الکلها و آمینها با اختصاصیت انانتیومری را نام برد که در صنعت کاربرد زیادی دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محیط آلی، که شامل مایعات یونی نیز میشود، با فعالیت آنزیم غالبا از جنبه حذف آب ضروری آنزیم مورد بررسی قرار میگیرد. بسیاری از آنزیمها برای فعال بودن به یک پوشش آبی کامل نیاز دارند، اما تعداد زیادی استثناء نیز وجود دارد مانند لیپاز B کاندیدا آنتراکتیکا (CALB) که فعالیت خود را حتی پس از خشک شدن با پنتوکسید فسفر حفظ میکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتیسیلین که برای فعال ماندن تنها نیاز به تعداد اندکی ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزیم دارد (Dolman et al., 1997). بررسی منابع علمی نشان میدهد که بیان نیاز آنزیم به آب در قالب فعالیت آبی (aW ) مرسومتر از بیان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهای غیرهیدرولازی با آنزیمهای لیپاز یا پروتئاز ممکن است باعث حفظ یا افزایش فعالیت آنزیمی شود. هرچند چنین محیطهایی همیشه باعث افزایش واکنشهای جانبی هیدرولازی میشوند. همچنین اسید حاصل از این واکنشها ممکن است باعث کاهش pH و از دست رفتن فعالیت آنزیمی شود.
حلالهایی که به خوبی توسط این آنزیمها تحمل میشوند – هیدروکربنهای آروماتیک و آلیفاتیک، اترها، و الکلها (بجز متانول)- فقط به صورت ضعیفی با آنزیم برهمکنش میدهند و میتوان حدس زد که این حلالها کم و بیش فقط برای آنزیم یک فضای خالی ایجاد میکنند. تنها الکلها که تشکیل دهنده پیوند هیدروژنی هستند میتوانند لیپازها را غیرفعال کنند. حلالهایی که برهمکنش بسیار قوی با پروتئینها میدهند، مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) و دی متیل فرمآمید (DMF) نیز باعث غیرفعال شدن برگشتناپذیر آنزیمها میشوند. بنابراین آنزیمها برهمکنشهای قوی با هیچ مادهای به جز آب را نمیتوانند تحمل کنند (Van Rantwijk, 2007).
نامشخص بودن pH در محیط بدون آب یک عامل پیچیده در آنزیمشناسی است. آنزیم توزیع بار الکتریکی (pH ظاهری) را مطابق با آخرین محلول آبی، مثلا بافر لیوفیلیز، حفظ میکند (Zaks and Klibanov 1985). البته pH بهینه ظاهری تحت تأثیر نوع حلال و aW تغییر میکند (Yang et al., 1993). چنین اثرات مشابهی در محیط مایعات یونی نیز قابل انتظار است.
در حقیقت بیشترین اطلاعات درباره رفتار آنزیم در محیط غیرآبی، حاصل از مطالعات آنزیمها در حلالهای آلی است. اما حلال های آلی برای طبیعت زیان آور هستند بنابراین در سالهای اخیر تلاش زیادی در جهت یافتن جایگزین پاکتری برای محیطهای واکنش انجام شده است.از جمله محلولهای دوستدار محیط زیست مایعات یونی را میتوان نام برد که میتوانند جایگزین حلالهای آلی شوند.
علاقه عمومی برای افزایش سرعت واکنشهای آنزیمی در حلالهای آلی نیز عامل پیشبرنده دیگر به سمت مایعات یونی بوده است. یکی از دلایل کاهش فعالیت آنزیمی در حلالآلی (در مقایسه با محیط آبی) پایدارسازی مواد واکنش دهنده در حلال است (Klibanov et al., 1997). این اثر که در واقع همان افزایش حلالیت (افزایش Km) است، با به کارگیری غلظتهای بالاتری از ماده واکنشدهنده قابل جبران است (Halling et al., 2004). بقیه کاهش فعالیت، در حد 1 تا 2 برابر، مربوط به اثر مجموعهای از عوامل شامل ناپایدار شدن حالت گذار واکنش (Clark et al., 2004)، تغییرات کنفورماسیون و از دست دادن انعطافپذیری میباشد (Halling et al., 2004, Clark et al., 2004 ). ثابت دیالکتریک پایین محیطهای آلی معمولی باعث افزایش انرژی حالت گذار شدیدا قطبیده در مقایسه با آب میشود و بنابراین ناپایدار شدن حالت گذار را در پی خواهد داشت (Clark et al., 2004).
1-4- مایعات یونی
از میان مایعات مختلفی که میتوان بهعنوان حلال به کار برد تنها تعداد اندکی به طور عمومی مورد استفاده قرار میگیرند. با معرفی تکنولوژیهای سبز یک نگرانی اصلی، ایجاد جایگزینهای مناسب برای حلالهای مخرب است که در صدر جدول مواد شیمیایی زیانآور هستند. زیرا این حلالها در مقادیر بالا استفاده میشوند و به طور معمول مایعات فراری هستند. نمکهای مرکب مایعاتی هستند که فقط یون دارند (مایعات یونی). در صورت انتخاب مواد اولیه مناسب میتوان مایعات یونی ساخت که در دمای اتاق و در دمای پایینتر از دمای اتاق مایع هستند. مایعات یونی مواد جدیدی نیستند. بسیاری از آنها سالهای زیادی است که شناخته شدهاند. برای مثال میتوان [EtNH3][NO3] را نام برد که دمای ذوب 12 درجه سانتیگراد دارد و در سال 1914 معرفی شد. از همان زمان پیشنهاد شد که از مایعات یونی در سنتز شیمیایی به جای حلال استفاده شود. البته تنها در سالهای اخیر تعداد زیادی مقالات در این زمینه به چاپ رسیده است. برخی خصوصیات فیزیکی ساده مایعات یونی که آنها را به عنوان حلالهای بالقوه برای سنتز جالب توجه کرده است توسط ولتون بیان گردیده است (Welton et al., 1999):حلالهای خوبی برای طیف وسیعی از مواد آلی و غیر آلی هستند.
معمولا شامل یونهای نامتناسبی هستند که امکان قطبیت بالا در آنها را ایجاد میکند.
طبق مقیاس قطبیت نرمال شده که در آن تترامتیل سیلان صفر و آب 0/1 در نظر گرفته شده، قطبیت مایعات یونی مرسوم، به طور معمول در محدوده 6/0-7/0 قرار میگیرد ( مانند فرمامید و الکلهای محلول در آب )
(van Rantwijk et al., 2003). همچنین کاهش طول زنجیره آلکیلی متصل به حلقه ایمیدازولیوم و اندازه آنیون در مایعات یونی دارای کاتیون ایمیدازولیومی، با افزایش قطبیت مایع یونی در ارتباط است (Carmichael and Seddon, 2000). مقدار قطبیت مایع یونی گاهی به دما و حضور آب حساس است (Baker et al., 2002). مایعات یونی به دلیل قطبیت بالایی که دارند محیط خوبی برای واکنشهای شیمیایی و بیوشیمیایی ایجاد میکنند. زیرا میتوانند سوبستراهای مختلفی شامل ترکیبات آلی قطبی و غیرقطبی و ترکیبات آلی و غیر آلی و پلیمری را در خود حل کنند.
با تعدادی از حلالهای آلی غیر قابل امتزاج هستند و بنابراین یک جایگزین قطبی غیرآبی برای سیستمهای دو فازی میباشند. همچنین مایعات یونی آبگریز را میتوان به عنوان فاز قطبی غیر قابل امتزاج همراه با آب استفاده کرد (Welton et al., 1999).
مایعات یونی فرار نیستند و این به دلیل یونی بودن ماهیت آنها است که فشار بخار ناچیزی دارند. بنابراین میتوان از آنها بدون ایجاد آلودگی در سیستمهایی با مکش قوی استفاده کرد (Welton et al., 1999).
بنابراین مایعات یونی دارای پایداری دمایی بوده و فاقد فشار بخار میباشند (Gordon et al., 2001, Brennecke et al., 2001). به علاوه داری خصوصیات استثنائی به عنوان حلال هستند و میتوانند هر ماده شیمیایی را در خود حل کنند. با جایگزین کردن کاتیون، آنیون و اجزای متصل به آنها، میتوان خصوصیات این حلالها را تغییر داد و به این صورت مایع یونی مناسب برای واکنش خاصی را ایجاد نمود (Brennecke and Maginn, 2001) (شکل 1-3). گرچه هنوز مشخص نیست که مایع یونی چگونه خصوصیات کاتالایتیک آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهد، آنزیمها در مایعات یونی مانند [C4MIM][PF6] فعال و به شدت پایدار هستند (Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000, Laszlo et al., 2001).

شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز.
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی
دلیل تمایل به انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی در واقع میل به جایگزین کردن مایعات یونی غیرفرار به جای حلالهای آلی فرار بوده است. هرچند این واکنشها در محیط طبیعی آنزیم یعنی محیط آبی قابل انجام است اما حلالهای آلی به طور وسیعی همراه با آنزیمها مورد استفاده قرار گرفتهاند تا از این طریق میزان حلالیت واکنشگرهای آبگریز را بیشتر کرده و تعادل واکنش را از سمت هیدرولیز به سمت سنتز تغییر جهت دهند. همچنین خصوصیات غیرمرسوم مایعات یونی به عنوان حلال، باعث گسترش روشهای متعدد جدید و بسیار کارآ شده است (Van Rantwijk et al., 2007).1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی- آب
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. سری هافمیستر نوعی دستهبندی یونها است که به ترتیب توانایی آنها در حل کردن و رسوبدهی پروتئینها ایجاد شده است.
اخیرا در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. مایعات یونی را به خوبی میتوان براساس موقعیت قرارگیری یونها، در سری هافمیستر به گونهای مرتب نمود که ترتیبی از پایدارکنندهترین تا ناپایدارکنندهترین (کاسموتروپ تا کائوتروپ) ایجاد شود.
نمک های سری هافمیستر با ویژگی های کاسموتروپیک و کائوتروپیک یونها مرتبط هستند. یونهایی که به شدت آب پوشی میشوند به کاسموتروپ ها معروفند و آن دسته از یون هایی که به صورت ضعیف هیدراته می شوند، کائوتروپ خوانده می شوند (Lo Nostro et al., 2005). یونهای حاصل از نمکهای سری هافمیستر به دو گروه تقسیم می شوند: Salting- out و Salting- in (Kunz et al., 2004). یون های out-Salting (آنیون های کاسموتروپ مثل فسفات، سولفات وکاتیون های کائوتروپیک مثل کاتیون های آمونیوم) پروتئین ها را پایدارکرده و نیز باعث رسوب آنها می شوند. در مقابل یون های Salting- in (آنیونهای کائوتروپ مثل آنیون های پرکلرات، برماید و کاتیونهای کاسموتروپ مثل کاتیون لیتیم) پروتئین ها را ناپایدار میکنند (Kunz et al., 2004). درغلظت های پایین نمک (تا سقف 01/0 مولار) یون ها غالبا از طریق برهمکنش های الکترواستاتیک روی آنزیم ها تاثیر می گذارند. هنگامی که در غلظت های زیاد نمک نیروهای انتشار یا پراکندگی یونی بر پتانسیل الکترواستاتیک پیروز میشوند، اثر یونهای هافمیستری اهمیت پیدا میکنند (Lo Nostro et al., 2005).
بسیاری از آنزیمها به خوبی در طیف وسیعی از مایعات یونی در محیط آبی عمل میکنند. به سختی میتوان مایع یونی پیدا کرد که به هیچ عنوان با هیچ آنزیمی سازگاری نداشته باشد. در رابطه با پیشبینی سازگاری آنزیم و مایعات یونی آبی به نظر میرسد که کائوتروپی و کاسموتروپی نمیتوانند به عنوان تنها عوامل پیشبینی کننده استفاده شوند. همچنین بعید به نظر میرسد که بتوان سازگاری آنزیم با مایعات یونی را با در نظر گرفتن تعداد محدودی پارامتر همچون قطبیت یا logP تفسیر نمود. این موضوع در مورد حلالهای ملکولی محلول در آب نیز صدق میکند (Van Rantwijk et al., 2007).
اساس پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی آبی را میتوان این گونه بیان کرد که پروتئین زمانی پایداری خود را از دست میدهد که یونها یا ملکول های حلال اطراف آن با فرم بازشده آنزیم برهمکنش قویتری نسبت به فرم طبیعی آنزیم داشته باشند (Baldwin et al.,1996). چنین برهمکنشهای ناپایدارکنندهای میتوانند حاصل از "Salting in" یونهای دوگانه دوست روی گروههای آبگریز فرو رفته درون ساختار پروتئین یا حاصل از برهمکنشهای قوی آنها با پیوندهای پپتیدی باشد (Kaar et al., 2003, Lou et al., 2006). از جمله مباحث مهمتری که باید به خصوص در مورد آنزیمهای حساس مد نظر قرار داد میتوان تغییرات pH ایجاد شده توسط یونهای اسیدی یا قلیایی برونشتد و فعالیت آبی ترمودینامیکی را نام برد.
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001) و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای MeSO4- (Schofer et al., 2001)، NO3- (Kaar et al., 2003)، AcO-یا lactate- (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است (شکل 1-4). آب نیز چنین عملکردی دارد؛ اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
به نظر میرسد که مایعات یونی بدون آب با روشی مشابه حلالهای آلی مرسوم، آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهند؛ زیرا بسیاری از آنها به خوبی تحمل میشوند اما برخی از آنها نیز سازگاری بسیار کمی دارند که البته این موضوع به نوع آنزیم نیز بسیار وابسته است. برای مثال مایعات یونی حاوی یونهای AcO- و NO3- که به صورت مخلوطهای آبی سازگاری بسیار خوبی دارند، در حالت بدون آب آنزیم بسیار مقاوم CALB را غیر فعال میکنند. بر اساس اطلاعات فعلی، مایعات یونی با آنیونهای BF4- و PF6-، و آنیون مقاوم به هیدرولیز NTf2- و آنیونهای زنجیر متوسط آلکیل سولفات به همراه کاتیونهای دیآلکیلایمیدازولیوم و آلکیلپیریدینیوم گزینههای ایمنتری به نظر میرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون یک اساس نظری برای پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی بیآب ایجاد نشده است. هرچند تعدادی از عوامل سهیم احتمالی مانند قابلیت کاتیون برای ایجاد پیوند هیدروژنی (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکیل نانوساختارهای متصل به هیدروژن، و گرانروی حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر میرسد که میزان هسته دوستی آنیون (Kaar et al., 2003) یا قابلیت پذیرش پیوند هیدروژنی توسط آن (Sheldon et al., 2002) نیز، حداقل در حالتی که میل کاتیون برای تشکیل پیوند هیدروژنی کم است، میتواند یکی از عوامل کنترل کننده باشد. در این مورد یک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنیون H2PO4- است که بدون دناتوره کردن میتواند Cyt C را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء دیگر [HOPMIM][glycolate] است که با داشتن کاتیون و آنیونی با قابلیت بالا در ایجاد پیوند هیدروژنی، آنزیمهای احیاکننده را در فرم فعال در خود حل میکند (Walker and Bruce, 2004).

شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب. الف) شکل شماتیک از نحوه برهمکنش مایع یونی با بخشهای باردار و غیرقطبی آنزیم، ب) ساختار شبیه سازی شده آنزیم CALB در محیط مایع یونی DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقی از سطح آنزیم را نشان میدهد که زنجیرههای آلیفاتیک حضور دارند و رنگ نارنجی نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزیم هستند (Klahn et al., 2011).
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب
پایداری (دمایی) آنزیمها (فعالیت در طی زمان) معمولا در محیطهای آلی به خصوص با فعالیت آبی کم، نسبت به محیطهای آبی، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مایعات یونی نیز میتوانند چنین اثری داشته باشند. پایداری آنزیمی تعریف واضحی ندارد و روشهای متنوعی برای سنجش آن وجود دارد. برای بررسی پایداری در ذخیره سازی، آنزیم در مایع یونی در یک دمای خاص انکوبه شده و میزان فعالیت باقیمانده در نمونهها که با آب رقیق شدهاند بررسی میشود. بازیابی فعالیت بالایی از آنزیم در چنین روشی نشان دهنده این است که تغییرات ایجاد شده در ساختار آنزیم در این چنین محیط ذخیرهسازی برگشت پذیر است. پایداری آنزیم را میتوان با انکوبه کردن آنزیم در مایع یونی در بازههای زمانی مختلف و سنجش فعالیت در همان محیط بررسی نمود. همچنین میتوان ساختار آنزیم را با روشهای اسپکتروسکوپی در محیط مورد نظر بررسی نمود. برای مثال دمای بازشدن ساختار پروتئین شیرین مونولین از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزایش یافت (Baker et al., 2004). نوع دیگر پایداری که میتوان مورد بررسی قرار داد پایداری در شرایط واکنش است.
بهطور کلی آنزیمها در مایعات یونی فعالیت و ساختار خود را در مدت زمان طولانیتر و در دماهای بالاتری نسبت به حلالهای آلی ملکولی حفظ میکنند. دلیل احتمالی این امر گرانروی بالای مایعات یونی است که باعث کند شدن حرکت دمینهای پروتئین از موقعیت خود در فرم فعال پروتئین به موقعیتهای جدید ایجاد کننده فرم غیرفعال میشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت
پیوندهای هیدروژنی عامل پیوستگی ساختار آنزیمهای آبپوشی شده و بدون آب هستند. هر تغییر ساختاری مستلزم فروپاشی تعداد قابل توجهی از پیوندهای هیدروژنی به طور همزمان میباشد؛ این امر سهم قابل توجهی در پایداری آنزیم دارد و گویای اثرات حافظه آبپوشی و اثرات پسماند است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند این است که تعداد ملکولهای آب متصل به آنزیم تنها وابسته به میزان فعالیت آبی نیست، بلکه به حافظه آبپوشی نیز مربوط میباشد.
پژوهشهای مختلفی نشان داده اند حلالهایی که در شرایط آبی یا غیرآبی با آنزیم سازگارند، مانند استونیتریل یا ترت- بوتیل الکل، در غلظتهای پایین باعث غیرفعال شدن آنزیم میشوند (Griebenow et al., 1996). چنین نتایجی را میتوان در پژوهشهای انجام شده در مایعات یونی نیز مشاهده کرد. دلیل این امر کاهش اثر آبگریزی در حضور حلال است. در نتیجه پایداری آنزیم کاهش مییابد تا اینکه در یک غلظت مشخص آنزیم غیرفعال میشود.
پیوندهای هیدروژنی میتوانند توضیح مناسبی برای پایداری آنزیم در مایعات یونی بدون آب باشند. مایعات یونی، بهخصوص آنیون آنها که پیوندهای هیدروژنی قوی ایجاد میکنند، ممکن است باعث از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی شوند که عامل یکپارچگی ساختار α- هلیکسها و صفحات β بودهاند و بنابراین باعث باز شدن کل پروتئین یا بخشی از آن شوند. برای مثال یون لاکتات به راحتی میتواند با اسکلت پلیپپتیدی پیوند هیدروژنی برقرار کند. اندازه یون نیز میتواند مهم باشد زیرا یونهای با اندازه بزرگ برای ایجاد تعداد اندکی پیوند هیدروژنی بین خود و آنزیم، نیاز دارند که تعداد زیادی پیوند هیدروژنی را بشکنند، بنابراین نمیتوانند به سادگی پایداری آنزیم را مختل کنند. در آنزیمهایی که به صورت برگشتپذیر غیرفعال شدهاند احتمالا پیوندهای هیدروژنی توانستهاند کانفورماسیون را حفظ کنند و در ادامه برای بازیابی ساختار آنزیم لازم است این پیوندها فروپاشند و پیوندهای طبیعی دوباره ایجاد شوند. رقیق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مایع یونی دناتوره کننده، میتواند باعث تشکیل دوباره پیوندها شود احتمالا چنین ترکیباتی که پیوند هیدروژنی قوی تشکیل میدهند با تشکیل پیوندهای هیدروژنی ناپایدار، تشکیل دوباره پیوندها را تسهیل میکنند.
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها
کاربرد لیپازها در بیوترانسفورماسیون شامل طیف وسیعی از واکنشهای سالوولایتیک( نوعی از واکنشهای جانشینی هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفیل عمل کرده و جانشین یک اتم یا گروه در ملکول سوبسترا میشود) مربوط به گروه کربوکسیل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله این واکنشها میتوان استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون (الکلولیز)، پرهیدرولیز، و آمینولیز (سنتز آمید) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهای ترانساستریفیکاسیون و سنتز آمید ترجیحا در محیط بیآب و در حضور زئولیت فعال، جهت متوقف ساختن واکنشهای هیدرولازی ناخواسته، انجام میشود. در این واکنشها اغلب از آنزیمهایی همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده میشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتی چنین شرایطی را تحمل میکنند.
جهت دستیابی به بهینهترین حالت تشخیص انانتیومرها لازم است که محیط واکنش، مایع یونی یا محیطهای سنتی، با توجه به نوع ماده واکنش دهنده و نوع آنزیم بهینهسازی شود. در واقع نمیتوان یک مایع یونی را به عنوان بهترین گزینه برای انجام واکنشهای تفکیک مخلوطهای راسمیک نام برد، همانطور که یک حلال آلی را نمیتوان به طور کلی بهترین دانست. با ظهور مایعات یونی، گزینههای حلال انتخابی و بنابراین شانس یافتن محیط مناسب به میزان زیادی افزایش یافته است.
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس
ملکول پروتئین طی فرآیندهای غیرفعال شدن چند فاز مختلف را طی میکند. این پدیده نشاندهنده یک سری وقایع درون ملکولی در کنفورماسیونهای گذرای پروتئین است (De Diego et al., 2004). از روشهای مختلفی جهت بررسی ساختار پروتئین استفاده میشود که از آن جمله میتوان روشهای DSC ، NMR، CD، FTIR، اسپکتروفتومتری UV، کریستالوگرافی اشعه X و اسپکتروسکوپی فلورسانس را نام برد. فلورسانس یک روش در دسترس است که میتوان از آن جهت بررسی ساختار سوم پروتئین استفاده کرد.
در پروتئینهایی که دارای آمینواسیدهای فلوروفور هستند (مثل تریپتوفان، تیروزین یا فنیلآلانین) تغییر در IMax فلورسانس و شیفت قرمز در λMax فرآیند دناتوره شدن پروتئین را نشان میدهند و هر دوی این تغییرات به دلیل افزایش قطبیت باقیماندههای تریپتوفان پروتئین با قرارگیری آن در معرض حلال است. مکانیسم ملکولی پایدار شدن آنزیم در مایعات یونی (در بیوکاتالیز کاربردی) همچنان نامعلوم است و نیاز به بررسیهای بیشتر وجود دارد (De Diego et al., 2004).
پروتئینها پس از برانگیختگی در طول موج nm 280 (مربوط به همگی فلوروفورهای پروتئین) یا nm 295 (بیشتر مربوط به باقیماندههای تریپتوفان)، به طور معمول نور را بین طول موج nm 300 و nm 350 منتشر میکنند. شدت فلورسانس در واقع جمع نور منتشر شده توسط هر کدام از باقیماندههای فلوروفور پروتئین میباشد. باز شدن نسبی ساختار پروتئین باعث افزایش برهمکنش باقیماندههای آمینواسیدی پروتئین با حلال (به طور معمول آب) میشود. همچنین ممکن است حلقه اندولی تریپتوفان با دیگر آمینواسیدهای موجود در ساختار پروتئین وارد برهمکنش شود. هر دوی این پدیدهها سبب کاهش شدت فلورسانس و گاهی سبب ایجاد یک شیفت قرمز در پیک نشر فلورسانس (کاهش λMax) میشود که این پدیده را نشانهای از باز شدن پروتئین در محیط آبی میدانند (Bekhouche et al., 2011).
با ورود مایعات یونی به محیط پروتئینها به عنوان حلالهای جدید، مشکلاتی در بررسی ساختار توسط روشهای مختلف ایجاد میشود. از جمله این مشکلات تداخلهای ایجاد شده در طیفهای CD و فلورسانس را میتوان نام برد که در گزارشات مختلفی به آنها اشاره شده است (Shu et al., 2011, Bekhouche et al., 2011, Attri and Venkatesu, 2013). با این وجود شاید بتوان ساختار پروتئین را بیشتر بر اساس شیفتهای λMax و مقایسه شدت فلورسانس در حالتهای دمادهی مختلف در یک مایع یونی با غلظت مشخص، مورد بررسی قرار داد.
به طور کلی میتوان گفت که طیف وسیعی از آنزیمها میتوانند مخلوطهای آبی مایعات یونی را به عنوان محیط واکنش تحمل کنند. به سختی میتوان مایع یونی را یافت که هیچ آنزیمی نتواند با آن سازگار باشد. عقیده بر این است که مایعات یونی در غلظتهای بالاتری، نسبت به حلالهای ملکولی قابل امتزاج با آب، میتوانند توسط آنزیمها تحمل شوند.
بسیاری از هیدرولازها به خصوص آنهایی که توانایی تحمل حلالهای ملکولی را دارند به میزان قابل توجهی میتوانند واکنشهای غیرهیدرولازی را در مایعات یونی کاتالیز کنند. میزان فعالیت آنزیمها در مایعات یونی در حد فعالیت آنها در حلالهای آلی و یا حتی بالاتر نیز میباشد. به علاوه در بسیاری از موارد افزایش پایداری دمایی و عملکردی و افزایش اختصاصیت انانتیو و ریجیو نیز دیده شده است.
مایعات یونی سازگار با آنزیمها به طور معمول برهمکنش قوی با آنزیم نمیدهند و باعث حل شدن آنزیم نمیشوند. تاکنون اساس نظری برای پیشبینی سازگار بودن یا نبودن مایع یونی با آنزیم ایجاد نشده است هرچند با توجه به علاقه زیادی که در این موضوع وجود دارد انتظار میرود که به زودی یک اساس نظری در این زمینه مطرح گردد.
مایعات یونی قابلیت بالایی در کاربرد به عنوان حلال در واکنشهای بیوترانسفورماسیون مربوط به واکنشدهندههای بسیار قطبی مانند پلیساکاریدها دارند؛ زیرا چنین واکنشهایی به دلیل محدودیتهای تعادل واکنش در آب قابل انجام نیستند. چنین جایگزینی یک محیط فرار با محیط غیرفرار مایعات یونی بدون شک ادامه خواهد یافت و به تدریج توسط صنایع شیمیایی پذیرفته خواهد شد و سهم بزرگی در ایجاد کارآیی بالای واکنشهای مختلف خواهد داشت. توسعه مایعات یونی ارزانتر نیز باعث افزایش استفاده از آنها در بیوترانسفورماسیونهای صنعتی خواهد شد. به علاوه باید این موضوع را در نظر داشت که سیستمهای حلالی که بر پایه مایعات یونی هستند قابلیت بالایی در انجام ترانسفورماسیونهای چند کاتالیزوری دارند. برای دستیابی به این اهداف تلاشهای جدیدی انجام گرفته است.
بدون شک انتظار میرود که مایعات یونی سبز و زیست سازگار به زودی در دسترس باشند؛ زیرا به کارگیری مایعات یونی در ایجاد صنایع شیمیایی سبزتر، امری کاملا ضروری است. اینگونه به نظر میرسد که انجام بیوترانسفورماسیون در مایعات یونی بسیار امید بخش است.
فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز
اولین گزارش از بیوکاتالیز در محیط مایعات یونی مربوط به سال 2000 است (Cull et al., 2000). اولین کارهای انجام شده در این زمینه شامل مایعات یونی متشکل از کاتیونهای 1و3- دی آلکیل ایمیدازولیوم یا N- آلکیل پیریدینیوم و یک آنیون ضعیف کئوردینه کننده بود (شکل2-1و جدول 2-1). این نوع مایعات یونی هنوز نقش اصلی را در واکنشهای آنزیمی ایفا میکنند. هرچند که تحقیقات در حال حاضر بیشتر به سمت مایعات یونی با ساختارهای جدید گرایش یافته است. تاکنون مقالات مروری خوبی در زمینه بیوکاتالیز در مایعات یونی منتشر شده است که از آن جمله پروژه - ریسرچمروری ون رنتویجک و شلدون و مقالات مروری منیرالزمان را میتوان نام برد (Van Rantwijk and Sheldon, 2007, Moniruzzaman, 2010 a& b).

شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی که به طور مرسوم در بیوکاتالیز استفاده میشوند
(Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونیفرمول ساختاری علامت اختصاری نام آنیون
BF4- BF4- Tetrafluoroborate
PF6- PF6- Hexafluorophosphate
(CF3SO2)2N- Tf2N Bis(trifluoromethylsulfonyl)amide
CF3SO3- TfO Trifluoromethanesulfonate
CF3COO- TFA Trifluoroacetate
CH3SO3- MeSO3 Methylsulfite
n-C7H15SO3- HpSO3 Hydrogenthiophosphate
TsO- TsO Toluenesulfonate
CH3OSO3- MeSO4 Methylsulfate
C2H5OSO3- EtSO4 Ethylsulfate
n-C8H17OSO3- OctSO4 Octylsulfate
(HO)2PO2- H2PO4 Dihydrogenphosphate
(CH3O)2PO2- Me2PO4 Dimethyl phosphate
C2H5O(CH2)2OSO13- EtOEtSO4 Ethoxyethylsulfate
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. یک مطالعه اولیه روی آنزیم آلکالین فسفاتاز مربوط به باکتری اشرشیا کلای در مخلوط آبی [EtNH3][NO3] (قدیمیترین مایع یونی (Walden, 1914 )) نشان داد که این مایع یونی در غلظتهای پایین روی آنزیم اثر فعال کننده داشته است و بیشترین اثر گذاری آن (10 درصد افزایش فعالیت) در غلظت 1/1 مولار دیده شده است. با افزایش غلظت مایع یونی تا قبل از غلظت 80 درصد فعالیت آنزیم به طور برگشت پذیر کاهش یافت و پس از آن آنزیم به طور برگشت ناپذیری غیر فعال گردید (Magnuson et al., 1984).
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم
در سالهای اخیر در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. به تازگی آنیونهای α-آمینواسیدها در مایعات یونی مورد استفاده قرار گرفتهاند. این آنیونها کاسموتروپ هستند (Zhao, 2006). مایعات یونی تشکیل شده از α-آمینواسیدهای D و L و ω- آمینوکربوکسیلاتها و کاتیون [C2MIM] در غلظت 5/0 مولار اثر بسیار کمی بر فعالیت آنزیم سوبتیلیسین داشتند. در حالی که [C2MIM][D-GluO] در غلظت 1 مولار سرعت واکنش را بیش از 60 درصد کاهش داد و [C2MIM][L-GluO] باعث کاهش 80 درصدی سرعت شد (Zhao, 2006). مایع یونی [C4MIM][Cl] در غلظتهای کمتر از 20 درصد اثر کمی بر آنزیم پراکسیداز ترب سیاه (HRP) گذاشت در حالیکه در غلظتهای 25 و 30 درصد کاهش شدید فعالیت و پایداری دمایی آنزیم را نشان داد (Machado and Saraiva, 2005).
آنیون نیترات یک آنیون بی ضرر و بی اثر است با این وجود مایعات یونی حاوی این آنیون زیاد مورد مطالعه قرار نگرفتهاند. از معدود مطالعات انجام شده در این زمینه میتوان پژوهشی روی آنزیم پاپائین را نام برد که در حضور 15 درصد [C4MIM][NO3] 50 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. در گزارشی توسط کفتزیک و همکاران دو آنزیم CbFDH و β-گالاکتوزیداز مربوط به باسیلوس سیرکولانس در حضور 25 درصد [PrNH3][NO3] کاملا غیرفعال شدند (Kaftzik et al., 2002). دلیل این غیرفعال شدن را اسیدی شدن pH احتمال دادند.
مایعات یونی حاوی یون [BF4] بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. این آنیون به شدت کائوتروپ است و نسبت به آنیونهایی که قبل از این گفته شد قدرت کمتری در تشکیل پیوند هیدروژنی دارد. اثر [C4MIM][BF4] بر فعالیت HRP توسط ماکادو و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. در غلظتهای کمتر از 20 درصد [C4MIM][BF4] کمترین کاهش فعالیت دیده شد و در غلظت 25 درصد آن 30 درصد کاهش فعالیت دیده شد. ماکادو و همکاران همچنین تغییرات پایداری دمایی HRP را در [C4MIM][BF4] بررسی کردند. در غلظت 10 درصدی مایع یونی، آنزیم HRP با تأخیر بیشتری نسبت به محیط آبی در اثر دمادهی غیرفعال شد. در حالی که در غلظت 25 درصد مایع یونی، پایداری آنزیم به شدت کاهش یافت (Machado and Saraiva, 2005).
اولین بیوترانسفورماسیون موفق در یک محیط مایع یونی حاوی 5 درصد آب مربوط به یک مایع یون آبگریز بود. ترمولایزین، یک آنزیم بسیار پایدار، واکنش سنتز Z- آسپارتام را در محیط [C4MIM][BF4] اشباع از بافر کاتالیز کرد؛ سرعت واکنش در این حالت نسبت به سرعت واکنش در محیط اتیل استات 40 درصد بود (Erbeldinger et al., 2000).
لیپازها به عنوان آنزیمهای مقاوم به حلالهای آلی مسلما اولین گزینه انتخابی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی بودند. در حقیقت لیپازهای میکروبی پایدار مانند CALB (Madeira Lau et al., 2000 , Schofer et al., 2001) و لیپاز سودوموناس کاپاسیا (PCL) (Park and Kazlauskas. 2001, Nara et al., 2002) در مایعات یونی از خانواده 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم، در ترکیب با آنیونهای BF4- ، PF6-، TfO- و NTf2- دارای فعالیت کاتالیتیک هستند. نتایج اولیه در این قبیل کارها معمولا تکرارپذیر نبود و این به دلیل حضور ناخالصی باقی مانده طی فرآیند تهیه مایعات یونی بود. لیپازها واکنشهای ترانساستریفیکاسیون را در این مایعات یونی با بازده قابل مقایسه با واکنشهای انجام شده در ترت- بوتیل الکل (Madeira Lau et al., 2000)، دیاکسان (Nara et al., 2002)، یا تولوئن (Park and Kazlauskas 2001) را کاتالیز کردند.
لیپاز A کاندیدا آنتراکتیکا (CALA) به عنوان یک استثناء در محیط مایعات یونی [C4MPy][BF4] و [C4MIM][NTf2] 10 برابر فعالتر از محیط دیایزوپروپیلاتر (DIPE) (Schofer et al., 2001) بود. مایعات یونی خارج از خانوادههای 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم به ندرت در فرآیند بیوکاتالیز مورد استفاده قرار گرفتهاند.
لیپازهای مختلفی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی مورد بررسی قرار گرفته اند که از این میان میتوان آنزیمهای لیپاز CALB (Lozano et al., 2003)،PCL (Itoh et al., 2003)، ASL (Schofer et al., 2001)، CALA، RML و TLL (Schofer et al., 2001) را نام برد. برای مثال دو آنزیم RML و TLL فعالیت خود را در مایع یونی [C4MIM][NTf2] حفظ کردند در حالی که در دو مایع یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] غیرفعال شدند (Schofer et al., 2001).
لیپاز CRL به طور معمول در محیطهای بدون آب فعالیت کمی دارد. بر اساس مطالعات انجام شده در رابطه با کاتالیز واکنشهای مختلف، این آنزیم در مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] فعالیت خود را حفظ میکند (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003). CRL در [C4MIM][PF6] بهترین فعالیت خود را در حضور حداکثر 4/0 مولار آب (یا 5/0=aw براساس سایر گزارشات (Ulbert et al., 2004) نشان میدهد. همچنین گزارش شده است که CRL واکنش استریفیکاسیون را در محیط بدون آب [C4MIM][PF6] بهتر از محیط ایزواکتان کاتالیز میکند (Yu et al., 2005).
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003)و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای [MeSO4] (Schofer et al., 2001)، [NO3] (Kaar et al., 2003)، [AcO] یا [lactate] (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است. آب نیز چنین عملکردی دارد اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند، و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کوئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی
در گزارشی از لیو و همکاران فعالیت و ساختار آنزیم لیپاز CRL انکوبه شده در 17 نوع مایع یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که انتخاب نوع آنیون اثر مهمتری بر فعالیت آنزیم در واکنش استریفیکاسیون داشته است و مایعات یونی محلول در آب اثر منفی بر فعالیت آنزیمی داشتهاند. مطالعات ساختاری این گروه با روش FTIR تا حدودی تغییرات ساختاری مرتبط با تغییرات فعالیت آنزیم را نشان داد. هرچند افزایش فعالیت دیده شده در برخی موارد را نمیتوان با دادههای تجربی حاصل از بررسی ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسی ساختاری آنزیم لاکاز در مخلوط آبی مایعات یونی [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهای CD و فلورسانس اثر مثبت مایع یونی [C4MA][TfO] بر پایداری ساختاری آنزیم نسبت به دو نوع دیگر نشان داده شد. در این مطالعه نتایج مطالعات ساختاری با نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاری دیگری به کمک فلورسانس و FTIR اثر مایعات یونی ایمیدازولیومی محلول در آب بر ساختار دو آنزیم α- آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس و آمیلولیکوئی فاسینس مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی نشان داد که آنزیم α- آمیلاز در محیط بافری و محلول آبی مایع یونی [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره میشود. در حالیکه محلول آبی مایع یونی [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهای مانع از دناتوره شدن آنزیم میشود (Dabirmanesh et al., 2011).
اهداف
بررسی اثر مایعات یونی مختلف روی پایداری و فعالیت آنزیمهای لیپاز تا حدودی انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهای مختلف زنجیره کاتیونی مایعات یونی روی آنزیم و بررسی چگونگی تغییر ساختار آنزیم و اثر آن بر فعالیت آنزیمی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنین با توجه به اثرات متفاوت مایعات یونی بر روی آنزیمهای مختلف، در این پژوهش اثر مایعات یونی روی آنزیم لیپاز TTL، یک آنزیم گرمادوست با پتانسیل کاربردهای صنعتی، مورد بررسی قرار میگیرد. بنابراین اهداف این پژوهش عبارتند از:
بررسی اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
بررسی اثر مایعات یونی با کاتیون و آنیونهای مختلف بر پایداری دمایی آنزیم TTL
مطالعه پایداری دمایی بر اساس تغییر در ساختار سوم آنزیم TTL در حضور و عدم حضور مایعات یونی
فرضیه
با استفاده از مایع یونی مناسب به عنوان محیط واکنش میتوان به پایداری بیشتر و فعالیت بهتری از آنزیم دست یافت.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- ابزار

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

انواع ظروف و لوازم آزمایشگاهی (ارلن، بشر، پلیت، بورت، کندانسور و غیره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کیسه دیالیز
استیرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پدیده نوژن پارس)
بن ماری (ریحان طب)
آون خلاء
سیستم تغلیظ پروتئین و فیلتر مربوطه (Amicon)
هود لامینار (ژال تجهیز)
انکوباتور (ریحان طب)
شیکر انکوباتور (Vision)
سانتریفوژ (Sigma 16-P)
سانیکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ریحان طب)
پمپ پریستالتیک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)
3-2- مواد
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی
آلکیل هالید ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متیل ایمیدازولیوم (Merck)
آمونیوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دی اتیل اتر (Panreac)
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL
3-2-2-1- سوش باکتری
باکتریxL1blue E.coli (جهت تکثیر پلازمید حاوی ژن لیپاز)
باکتری E.coli BL21 (جهت بیان پروتئین)
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون
پلازمید حاوی ژن لیپاز درون سلولی TTL (pQE-TTL)
KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استریل
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی
تریپتون، عصاره مخمر، نمک سدیم کلرید (Merck) (جهت تهیه محیط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتی بیوتیک آمپی سیلین
ایزوپروپیل β-D- تیوگالاکتوزید (IPTG) (سیناژن)
آنزیم لیزوزیم (CinnaGen)
بافر تریس (Merck)
سدیم فسفات (Merck)
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز
رزین Q- Sepharose
رزین Gel filtration
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE
رنگ کوماسی بلو G-250 و R-250
فسفریک اسید و استیک اسید گلاسیال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکریل آمید و بیس آکریل آمید (Merck)
TEMED(N,N,N,N'-tetramethylenediamine)
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) (Merck)
آمونیوم پرسولفات (APS)
2- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومین سرم گاو (BSA)
بافر تریس و گلایسین (Merck)
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز
سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (Sigma)
استونیتریل (Merck)
بافر تریس (Merck)
3-2-4- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طیف های فلورسانس)
3-3- روشها
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید
در این پژوهش جهت تهیه مایعات یونی از میزان مول برابر از آلکیل هالید و متیل ایمیدازولیوم استفاده شد. در این روش متیل ایمیدازولیوم قطره قطره در فواصل زمانی مساوی به آلکیل هالید که در حال بهم خوردن شدید بود اضافه شد و محلول نهایی در حال بهم خوردن شدید به مدت 24 ساعت در دمای °C 50 رفلاکس شد (شکل3-1). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دی اتیل اتر شستشو داده شد تا مواد آلی واکنشگر باقیمانده حذف شود. مرحله شستشو 10 تا 15 بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دی اتیل اتر به مایع یونی و بهم زدن شدید آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مایع یونی و دی اتیل اتر از هم جدا شوند. سپس مایع یونی شسته شده به مدت 24 ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دی اتیل اتر آن کاملا تبخیر شود.

شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات
در این مرحله میزان مول مساوی از نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات در مقداری آب حل شد و سپس محلول نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبی مایع یونی دارای آنیون برومید در حال بهم خوردن شدید اضافه گردید. سپس به مدت 24 ساعت در دمای اتاق محلول روی استیرر بهم خورد تا واکنش جایگزینی آنیون به خوبی انجام شود. در مرحله بعد شستشوی مایع یونی جدید با آب جهت جداسازی آنیون برومید انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نیترات نقره نبود یون برمید را در مایع یونی PF6- دار تایید کرد. سپس مایع یونی PF6- دار بدست آمده به مدت 24 ساعت برای حذف آب موجود در محیط در آون خلاء در دمای °C 70 قرار داده شد. مایع یونی ساخته شده در ظرف درب دار نگهداری شد.
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli
در این پژوهش از محیط کشت Luria Bertani (LB) برای رشد سویههای اشرشیاکلی به صورت مایع و جامد (حاوی آگار) استفاده گردید. همچنین در محیط کشت سوشهای حامل ساختار پلاسمید از آنتیبیوتیک آمپیسیلین با غلظت نهایی µg/ml 100 استفاده شد. جدول 3-1 نشان دهنده ترکیبات محیط کشت Luria Bertani است. شایان ذکر است که آنتی بیوتیک پس از استریل شدن محیط کشت توسط اتوکلاو و رسیدن دمای محیط کشت به حدود C° 50 اضافه میگردد.
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani
ترکیب غلظت
عصاره مخمر 5/0 درصد
تریپتون 1 درصد
NaCl 1 درصد
آگار (محیط کشت جامد) 2 درصد
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی:به منظور تهیه سلولهای مستعد برای عمل ترانسفورماسیون (انتقال پلاسمید به داخل سلول)، ابتدا یک کشت خطی از سلولهای ذخیره شده مورد نظر در ازت مایع بر روی پلیت LB تهیه و یک شب در گرمخانه Cº 37 قرار داده میشود. سپس یک کلنی از روی پلیت برداشته و در شرایط استریل به 25 میلی لیتر محیط کشت مایع LB افزوده و به مدت 4 الی 6 ساعت در دمای cº37 با حرکت دورانی rpm180رشد داده میشود تا تراکم سلولها در محیط کشت به جذبی ما بین 4/0 تا 6/0 در طول موج 600 نانومتر برسد. سلولها را در دمای ºC 4 به مدت 10 دقیقه در g4000 سانتریفوژ کرده و آنها را در5/2 میلیلیتر محیط خاص مناسب برای تهیه ی این نوع سلولها به نام محیط TSB که طبق جدول3-2 تهیه گردید، به صورت معلق در میآوریم. لازم به ذکر است که در این حالت غلظت سلولی به میزان 10 برابر افزایش داده میشود. سپس سلولهای معلق شده را به مدت 10 الی 60 دقیقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروی یخ قرار میدهیم. محصول سلولی حاصل را در مقادیر 200-100 میکرولیتری در لولههای اپندروف استریل تقسیم کرده و بلافاصله در ازت مایع قرار میدهیم. این سلولها را میتوان در فریزر cº80- نگهداری کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الی دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها یک بار میتوان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد :بین 1 تا 10 میکرولیتر بسته به غلظت محلولDNA موجود (معادل 1-1/0 میکروگرم) پلاسمید، در شرایط استریل در یک لوله اپندروف ریخته وبه آن پنج میکرولیتر از بافر KCM 5X که طبق جدول3-3 تهیه گردید، افزوده و با آب مقطر استریل به حجم lµ25 میرسانیم. مخلوط در یخ نگهداری میشود. حال سلول مستعد را از فریزر ºC80- خارج و اجازه میدهیم تا ذوب شود . 25 میکرولیتر از سلول مستعد را به محلول حاوی پلاسمید افزوده و به مدت 15 الی 20 دقیقه در دمای ºC4 قرار میدهیم. سپس در دمای ºC 42 به مدت 105 ثانیه گرمادهی شده که در این مرحله، ملکولهای DNA بر روی سطح سلول ها رونشینی شده و به درون سلول منتقل خواهند شد . بلافاصله سلولها را به درون یخ منتقل کرده و به آنها 100 میکرولیتر محیط LB سرد استریل و بدون آنتیبیوتیک،اضافه و به مدت یک ساعت در دمای Cº37 و حرکت دورانی مناسب قرار میدهیم. در نهایت 150 میکرولیتر محیط حاصل را بر روی پلیت حاوی محیط کشت انتخابی برده و با استفاده از لوپ شیشهای استریل به آرامی بر روی تمامی سطح پلیت بطور کامل و یکنواخت پخش میگردد . پس از جذب سلولها بر روی سطح پلیت، پلیتها به صورت وارونه در گرمخانه cº37 به مدت 16 ساعت قرار داده میشوند.
لازم به ذکر است که این پلیتها، حاوی آنتیبیوتیک خاصی است که ژن مقاومت مربوطه بر روی پلاسمید مورد نظر وجود دارد و در نتیجه تنها سلولهایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند قادر به رشد بر روی محیط انتخابی هستند.
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSBترکیبات مورد نیاز مقدار
Luria Bertani 75 (ml) 2X
DMSO 5/7 (ml)
PEG 400 3/13 (ml)
MgSo4 5/1 (ml)
MgCl2 5/1 (ml)
ddH2O 3/51 (ml)
Total valume 150 (ml)
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCMغلظت مناسب برای تهیه محلول 5X ترکیبات مورد استفاده
(M) 5/0 KCl
(M) 15/0 CaCl2
(M) 25/0 MgCl2
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری
برای تهیه استوک از باکتریهای حاوی ساختار پلاسمید، ابتدا از باکتری مورد نظر کشت یک شبه گذاشته شد. سلولها به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند و سوپ رویی دور ریخته شد. سپس به نسبت 1:1 گلیسرول استریل 50% به محیط کشت LB اضافه شد. آنگاه رسوب سلولها در 15 حجم اولیه محیط کشت، از این محلول حل شدند. در آخر آمپیسیلین با غلظت نهایی μg/ml 100 به سلولها اضافه شد و در C°20- ذخیره گردید.
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب
کلنی مورد نظر از بین باکتریهای ترانسفورم شده انتخاب شد و به محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک آمپیسیلین (μg/ml100) انتقال یافت. پس از رشد باکتری به مدت 16 ساعت در دمای °C 37، کشت 1 درصد تلقیح از نمونه باکتری رشد کرده، در حجم ml 20 محیط LB با آمپی سیلین ایجاد شد. پس از گذشت 4 ساعت از کشت اولیه باکتری ها در دمای °C 37، زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، با افزودن IPTG (با غلظت نهایی mM 1) به محیط های کشت بیان پروتئین نوترکیب القا شد و با کاهش دمای انکوباتور به °C 30 شرایط برای تولید آنزیم نوترکیب توسط باکتریها فراهم شد. پس از گذشت 5 ساعت از زمان القا، سلول های باکتری به کمک سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در 110 حجم اولیه، در بافر تریس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت 16 ساعت در °C 20- فریز شدند.
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
در این بخش بهینهسازی بیان پروتئین نوترکیب ابتدا با انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان TTL بر اساس میزان فعالیت آنزیمی عصاره سلولی و سپس بهینه سازی زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
ساختار پلاسمید حاوی ژن آنزیم TTL به روش گفته شده در بخش 3-3-2-2 به درون باکتری منتقل شد. سپس با لیز باکتریها پروتئینهای درون سلول جدا شدند (بخش 3-3-2-5) و سنجش فعالیت آنزیمی در مورد هرکدام از نمونهها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش 3-3-6). از بین 6 کلنی ترانسفورم شده بر اساس میزان توانایی تولید آنزیم 1 کلنی انتخاب شد و به صورت غلیظ شده در دمای°C 20- ذخیره گردید و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمانهای مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئینهای محلول درون سلول و میزان پروتئینهای موجود دراجسام نامحلول و پروتئینهای در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمانهای مختلف پس از القا، میتوان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپیسیلین، 1% تلقیح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتریها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، ابتدا ml1 از باکتریها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونهبرداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداری شد.
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتریها با استفاده از دستگاه سانیکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی 1 دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت 4 دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفوردمواد مورد نیاز مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250 1/0 گرم
اتانول 95% 50 میلیلیتر
فسفریک اسید 85% 100 میلیلیتر
در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیلآلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد میشود که شدت این رنگ در غلظتهای کم پروتئین نزدیک به قهوهای و در غلظتهای بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در 595 نانومتر خوانده میشود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازهگیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههای حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی 100 میکرولیتر، رقتهایی تهیه کرده و یک میلیلیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گردید. طی مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS(SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئینها و پپتیدها بکار میرود. قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلیاکریل آمید در غربال پروتئینهای مختلف است. در این روش پروتئینها بر اساس اندازه از هم جدا میشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرایط احیا، این ملکولها خطی شده و SDS به آنها بار منفی میدهد، که میزان بار منفی بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئینها به این صورت بر اساس اندازهشان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعتهای متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا میشوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفورزمحلول استوک اکریل آمید (8/30 %): 30 گرم اکریل آمید و 8/0 گرم بیس اکریل آمید در حدود 50 میلیلیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به 100 میلیلیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده): این بافر دارای غلظت 5/1 مولار تریس با 8/8~pH است. برای تهیه آن 2/18 گرم تریس- باز در حدود 70 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/8 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده): این بافر دارای غلظت 5/0 مولار تریس با 8/6~pH است. برای تهیه آن 1/6 گرم تریس باز در حدود 50 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/6 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تریس- باز، 2/7 گرم گلیسین و 5/0 گرم SDS در 500 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهیه گردید.
محلول رنگآمیزی: 05/0 گرم کوماسی آبی 250-R در 40 میلیلیتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 50 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول 05/0% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری میشود.
محلول رنگبر: 15 میلیلیتر متانول، 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 75 میلیلیتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگبری را تسریع میکند. با این حال باید توجه داشت که اگر ژل مدت طولانی در محلولهایی با درصد بالای متانول قرار گیرد، باندهای پروتئینی نیز بیرنگ میشوند).
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورزیک قالب شیشهای به کمک صفحات شیشهای کاملاً تمیز و فاصلهاندازها که با توجه به ضخامت مورد نیاز ژل انتخاب شده اند، ایجاد شد و با چند گیره محکم گردید. به انتهای صفحات شیشهای به اندازه 2/0 سانتیمتر آگار مذاب 5/0% اضافه شد.
محلول ژل پایین (ژل جدا کننده): مقادیر مورد نیاز برای تهیه ژل با درصد مشخص در جدول 3-6 آورده شده است. پس از افزودن مواد، محلول را به سرعت بهم زده و با دقت در قالب شیشهای تا ارتفاع مناسبی ریخته شد، به طوریکه حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل بالا باقی ماند. سپس به آرامی از کناره شیشه روی سطح ژل اتانول اضافه گردید (این کار به منظور صاف شدن ژل و جلوگیری از چین خوردن در اثر خشک شدن به دلیل تماس هوا با آن است). انعقاد ژل پایین معمولاً 45-15 دقیقه طول میکشد.
محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده) طبق جدول 3-6 تهیه شد ، بعد از انعقاد ژل پایین، اتانول روی ژل پایین کاملاً خالی شد و پس از تهیه محلول ژل بالا و هم زدن آن، سریعاً تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین ریخته شد. سپس شانه در ژل بالا قرار گرفت، به صورتی که حدود 5/1 سانتیمتر از سطح ژل پایین فاصله داشت. انعقاد ژل بالا حدود 45-60 دقیقه طول میکشد.
پس از خارج ساختن فاصلهانداز پایین از حد فاصل شیشهها، قالب شیشهای با چند گیره به تانک الکتروفورز متصل گردید و مخازن بالا و پایین تانک با بافر الکتروفورز پر شد (به وسیلهی یک سرنگ حبابهای هوا در حد فاصل شیشهها خارج شد)، سپس شانه به آرامی خارج و درون چاهکها با تزریق بافر الکتروفورز تمیز گردید.
برای آماده سازی نمونههای پروتئینی، یک حجم بافر نمونه به 3 حجم نمونهی پروتئین حاوی 6 تا 20 میکروگرم پروتئین اضافه شد (بافر نمونه 4x) و به مدت 5 دقیقه در دمای ˚C 100 قرار داده شد. سپس حجم مناسبی از آن (حداکثر 40 میکرولیتر) به کمک سمپلر وارد چاهک شد.
کابلها به الکترودهای مربوطه وصل گردید. برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان 30-20 میلیآمپر برای یک مینی ژل مناسب است. در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، ولتاژ 150-100 ولت مناسب میباشد. جریان برق قبل از رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع شد (حدود 5/2-5/1 ساعت).
بعد از قطع جریان، قالب شیشهای از تانک جدا گردید و با فرو بردن یک فاصلهانداز به حد فاصل شیشهها و حرکت آرام آن، شیشهی بالا برداشته شد و سپس ژل درون یک ظرف مناسب قرار گرفت.
حجم کافی از محلول رنگ (100 میلیلیتر) به ژل اضافه شد.
محلول رنگ تخلیه و سپس ژل را شسته و حجم مناسبی از محلول رنگبر (100 میلیلیتر) به آن اضافه گردید. اگر زمینهی ژل تیره بود تا شفاف شدن آن از محلول رنگبر تازه استفاده میشد تا باندهای پروتئینی به وضوح دیده شوند.
ژل در محلول آبی 7% اسید استیک قرار داده شد که ژل در این حالت برای مدتهای طولانی قابل نگهداری است.
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4Xماده مقدار
SDS (mg) 750
تریس- HCl (mg) 380
گلیسرول (ml) 5/2

user8252

72 جدول پ-3: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 2......................................................................................................
72 جدول پ-4: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 3......................................................................................................
72 جدول پ-5: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 4......................................................................................................
73 جدول پ-6: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 5......................................................................................................
73 جدول پ-7: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 6......................................................................................................
73 جدول پ-8: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 7......................................................................................................
73 جدول پ-9: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 8......................................................................................................
73 جدول پ-10: توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 9...................................................................................................
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
فصل اول
5 شکل 1-1: نمونههایی از سنگهای کلسیمی در اندازههای مختلف....................................................................
5 شکل 1-2: نمونههایی از سنگهای کلیه در داخل کلیه و مجاری ادراری.........................................................
7 شکل 1-3: ساختار مولکولی اگزالات کلسیم.............................................................................................................
فصل سوم
25 شکل3-1: مشخصه‌های محوری یک جسم...............................................................................................................
26 شکل 3-2: ترتیب گرد شدن یک ذره.........................................................................................................................
27 شکل3-3: محیط و مساحت برای محاسبه ضریب کرویت.....................................................................................
فصل چهارم
32 شکل 4-1: شماتیک رآکتور ترسیب............................................................................................................................
33 شکل 4-2: پوستهی قرار گرفته در محفظه جهت انتقال حرارت..........................................................................
33 شکل 4-3: تفلون بهکار رفته در کف محفظه برای حذف فضای مرده در اختلاط............................................
34 شکل4-4: پرهی مورد استفاده جهت ایجاد تلاطم...................................................................................................
34 شکل4-5: نمای کلی تجهیزات مورد استفاده فرآیند..............................................................................................
36 شکل4-6: نمای کلی دستگاه........................................................................................................................................
فصل پنجم
45 شکل5-1: مقادیر میانگین در صد کرویت برای فاکتورها و سطوح آنها..............................................................
45 شکل5-2: میانگین نسبت SNR برای فاکتورها و سطوح آنها در حالت بررسی Sphericity......................
46 شکل5-3: مقادیر میانگین اندازه‌ی ذرات برای فاکتورها و سطوح آنها................................................................
46 شکل5-4: میانگین نسبت SNR برای فاکتورها و سطوح آنها در حالت بررسی میانگین اندازه‌ی ذرات....
51 شکل5-5 (A) و (B): تصویر میکروسکوپ نوری از بلورهای اگزالات کلسیم قبل از افزودن تری‌پتاسیم سیترات..............................................................................................................................................................................
52 شکل5-6 (A) و (B): تصویر میکروسکوپ نوری از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری‌پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 2.....................................................................................................................
53 شکل5-7 (A) و (B): تصویر میکروسکوپ نوری از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری‌پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 3.......................................................................................................................
54 شکل5-8 (A) و (B) و (C) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم قبل از افزودن تری‌پتاسیم سیترات..............................................................................................................................................................................
55 شکل5-9 (A) و (B) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری‌پتاسیم‌سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 2...........................................................................................................................................
56 شکل5-10(A) و (B) و (C): تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری‌پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 3.......................................................................................................................
59 شکل5-11: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش قبل از افزودن تری‌پتاسیم‌سیترات..........................................
59 شکل5-12: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 1.........................................................................................
60 شکل5-13: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 2.........................................................................................
60 شکل5-14: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 3.........................................................................................
61 شکل5-15: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 4.........................................................................................
61 شکل5-16: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 5.........................................................................................
62 شکل5-17: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 6.........................................................................................
62 شکل5-18: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 7.........................................................................................
63 شکل5-19: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 8.........................................................................................
63 شکل5-20: نمودار توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 9........................................................................................
فصل اول
مقدمه

1-1- پیشگفتار
کریستالیزاسیون از محلول، از مهمترین عملیاتی است که قادر به تولید محصولاتی با بالاترین خلوص می‌باشد. شکل و اندازه‌ کریستال روی سرعت انحلال آن مؤثر است. در صنعت داروسازی سرعت انحلال، اهمیت زیادی دارد. کنترل ضعیف بر شکل و اندازه بلورهای تولیدی، نتایج غیر‌‌ قابل قبولی در مراحل بعدی مثل زمان فیلتراسیون و خشک کردن را به دنبال دارد.
انواع مختلف فرآیند تبلور صنعتی وجود دارد که در آنها محصول مطلوب نهایی، به خواسته بازار بستگی دارد. در صنعت کود شیمیایی، مورفولوژی رشد و توزیع اندازه ذرات اهمیت دارد چرا که خواص محصولات مثل جداسازی، روان شدن، فشرده سازی، انحلال و بسته‌بندی را تعیین می‌کند. محصولات باید در مدت زمان ذخیره‌سازی، متعادل باشند و قابلیت انحلال مناسب برای جذب شدن توسط زمین و گیاه را داشته باشند. در صنعت داروسازی، این مسئله حساس‌تر می‌شود (Sangwal, 2007). در یک کریستالیزاسیون مطلوب، محصول دارای سطحی صاف و خلوص بالاست و اندازه‌ی ذرات نیز با توجه به کاربرد آن تعیین می‌شود.
مورفولوژی و خصوصیات مربوط به شکل بلور همچنین در بررسی بیماری سنگ کلیه نیز دارای اهمیت است. هدف از این تحقیق مطالعه اثر مواد افزودنی بر شکل بلورهای اگزالات کلسیم به عنوان رایج‌ترین نوع سنگ کلیه می‌باشد. نوع تک‌آبه‌ی این کریستال به دلیل پایداری ترمودینامیکی بالا، فراوان‌ترین شکل سنگ‌های کلیوی اگزالات کلسیم را به خود اختصاص می‌دهد. این گونه به شکل شش گوشه و لبه تیز بوده که قابل دفع نیست و توانایی رشد کردن نیز دارد. تلاش می‌شود با تغییر شکل آن به فرم دو آبه‌ که گرد و بدون لبه است، گامی مؤثر در جهت کاهش تشکیل این سنگ و دفع هر چه راحت‌تر آن برداشته شود.
1-2- کلیه
کلیه آب زائد موجود در خون را جدا کرده و همچنین یک تعادل پایدار برای نمک‌ها و دیگر مواد موجود در خون ایجاد می‌کند. در تعریف سنگ کلیه می‌توان این چنین بیان کرد که سنگ کلیه یک جسم سخت است که از کریستال‌هایی که درون ادرار رشد می‌کنند تشکیل می‌شود. کلیه یکی از اندامهای درونی بدن انسان و برخی دیگر از جانداران است. کلیه مانند فیلتری برای تصفیه خون عمل کرده و ادرار تولید میکند. داخل هر کلیه متجاوز از یک میلیون واحد ریز عملکردی بنام نفرون وجود دارد. هر نفرون از یک صافی بسیار کوچک بنام کلافه که به یک لوله کوچک متصل است تشکیل میشود. آب و مواد زائد توسط این صافی از خون جدا می‌شوند و به داخل لوله‌های کوچک جریان پیدا می‌کنند. قسمت عمده این آب توسط لوله‌های کوچک، باز جذب می‌شود و مواد زائد بصورت غلیظ وارد ادرار می‌شوند تا دفع گردند. ادرارهای جمع شده از لوله‌های کوچک وارد قسمت قیفی شکل بنام لگنچه کلیه شده و سپس از طریق لوله‌ای بنام میزنای وارد مثانه می‌شود (Wikipedia).

1-3- بیماری سنگ کلیه
اگر چه کلیه‌ها عضوهای کوچکی هستند، ولی از وظایف حیاتی زیادی از جمله تصفیه نمودن مواد زائد و مایعات اضافی از خون را به عهده دارند که در حفظ سلامتی عمومی بدن مؤثر است. بیماری شدید کلیه، ممکن است منجر به نارسایی کامل آن شود، که نیازمند درمان با دیالیز یا پیوند کلیه برای جلوگیری از مرگ است .
بیماری سنگ‌های کلیوی به یکی از شایعترین بیماری‌ها در قرن اخیر تبدیل شده است. سنگ‌های کلیوی انواع مختلفی دارند و از مواد آلی و غیر آلی تشکیل شده‌اند. ترکیبات غیر آلی مهمترین قسمت تشکیل‌دهنده آن‌ها هستند که تقریبا 98 درصد از وزن سنگ‌ها را تشکیل می‌دهند. سنگهای کلسیمی نظیر اگزالات کلسیم و فسفات کلسیم از معمولترین سنگ‌هایی هستند که در کلیه رسوب می‌کنند و بیش از 70 تا 80 درصد از آن‌ها از اگزالات کلسیم تشکیل شدهاند (1993 Khan,).
در شکل 1-1 نمونههایی از سنگهای کلسیمی نشان داده شده است. همچنین شکل 1-2 نمونه‌هایی از سنگ را در کلیه نمایش می‌دهد. در صورتی که سیستم خود کنترلی بدن قادر به جلوگیری از تشکیل سنگ و یا دفع سنگ‌های تولیدی نباشد بایستی با استفاده از روشهای دیگر به درمان این بیماری پرداخت. بیماران مبتلا به سنگ کلیه توسط راههای گوناگونی نظیر جراحی، استفاده از مکمل‌های خوراکی و مصرف داروهای گیاهی تحت درمان قرار می‌گیرند. در سالهای اخیر با توجه به افزایش آگاهی عمومی نسبت به عوارض جراحی‌های کلیه، درمان دارویی افزایش قابل توجهی یافته است. در جدول 1-1 انواع سنگ‌های کلیوی و درصد احتمال تشکیل آنها نشان داده شده است.

جدول 1-1 : انواع سنگهای کلیوی و درصد احتمال تشکیل آنها (Frackowiak et al., 2010)

% of all stones Stones Type

71
26
7
38
5
3
0.5
21 1. Calcium salts
Calcium oxalate
Calcium phosphate
Calcium oxalate and phosphate
2. Uric acid
3. Cystine
4. Oxalate
5. Struvite

شکل 1-1 : نمونههایی از سنگهای کلسیمی در اندازههای مختلف
(http://www.urocit-k.com/Kidney_Stone_Photos/Photo01-Calcium-Oxalate.aspx)

شکل 1-2 : نمونههایی از سنگهای کلیه در داخل کلیه و مجاری ادراری
(http://forum.hammihan.com/thread69200.html)
1-4- بررسی تولید سنگهای کلیوی
مقدار یونها یا مولکولهای حل‌شده در یک محلول توسط پارامتری با نام حاصلضرب غلظت (CP) تعیین می‌گردد که برابر با حاصلضرب غلظت اجزای شیمیایی خالص نمک است. به عنوان مثال CP نمک کلرید سدیم برابر CP = [Na+][Cl-] می‌باشد. اگر محلول آبی یک نمک به نقطهای برسد که هیچ بلور نمکی در آن حل نشود آن را محلول اشباع می‌نامند. در این حالت به CP، حاصلضرب حلالیت ترمودینامیکی (Ksp) گفته می‌شود. در ادرار با وجود اینکه CP اگزالات کلسیم از حاصلضرب ترمودینامیکی تجاوز میکند به علت حضور مواد بازدارنده طبیعی تبلور اتفاق نمی‌افتد.
هنگامی که نمکهای سنگ‌ساز موجود در ادرار به حالت فوق‌اشباع رسیدند، نمک‌ها توانایی باقی ماندن در ادرار به صورت محلول را ندارند، بنابراین مولکولها یا یون‌های حل شده در ادرار رسوب کرده و اولین هستههای سنگ کلیه تولید می‌شوند. در این نقطه CP را حاصل ضرب تشکیل (Kf) بلورها مینامند. حاصلضرب حلالیت ترمودینامیکی و حاصلضرب تشکیل سه ناحیه عمده اشباعیت را از یکدیگر متمایز می‌کنند: ناحیه زیر اشباع، ناحیه شبه‌پایدار و ناحیه ناپایدار. در ناحیه زیر‌اشباع بلورها تحت هیچ شرایطی تشکیل نمی‌شوند و در صورتی که بلوری در محلول وجود داشته باشد حل می‌شود. در ناحیه شبه پایدار معمولاً بلورها به صورت خود به خود تشکیل نمی‌شوند. در این ناحیه امکان هسته‌سازی و تولید بلورهای جدید در بازه‌ی زمانی که ادرار در کلیه فیلتر می‌شود، وجود ندارد ولی تحت شرایطی خاص ممکن است در این ناحیه نیز هسته‌سازی رخ دهد. به عنوان مثال ممکن است به علت وجود انسداد در برخی نقاط کلیه زمان عبور ادرار به اندازهای طولانی گردد که برای ایجاد هسته‌سازی مناسب باشد، بنابراین در این نقاط امکان هسته‌سازی بلورها وجود دارد.
وجود ناخالصی‌های میکروسکوپی در ادرار نیز عامل دیگری است که از طریق جذب سطحی بلور در یک شکل هندسی که شباهت زیادی به بلور اصلی دارد فرآیند هسته‌سازی را تسهیل می‌بخشد. در ناحیه ناپایدار که درجه فوق‌اشباعیت محلول زیاد می‌باشد هسته سازی بلورها صورت می‌گیرد و هستهها در محلول از فاز مایع رسوب های جامد را تشکیل می‌دهند. بلورهای سنگهای کلیوی یا از طریق ادرار دفع می‌شوند و یا درون کلیه در نقاطی که امکان لنگر انداختن برای آن‌ها وجود دارد باقی می‌مانند و به دلیل وجود فوق اشباعیت در ادرار رشد می‌کنند (Wein et al., 2004).
1-5- اگزالات کلسیم
اگزالات کلسیم جامدی سفید رنگ است با فرمول شیمیایی CaC2O4 که در شکل 1-3 ساختار مولکولی آن نشان داده شده است. بسته به شرایط تبلور کریستالهای اگزالات کلسیم به سه گونه اگزالات کلسیم مونوهیدرات (COM)، اگزالات کلسیم دیهیدرات (COD) و اگزالات کلسیم تریهیدرات (COT) تشکیل بلور می‌دهد.

شکل 1-3 : ساختار مولکولی اگزالات کلسیم (Wikipedia)
اگزالات کلسیم مونوهیدرات از لحاظ ترمودینامیکی پایدارترین گونه می‌باشد. اگزالات کلسیم دی‌هیدرات نیز که نیمه پایدار است به میزان کم در بلورهای اگزالات کلسیم یافت می‌شوند، ولی اگزالات کلسیم تری هیدرات به ندرت در بلورهای اگزالات کلسیم ظاهر می‌شوند.
در ادرار مواد بازدارندهای وجود دارند که مانع هستهزایی اگزالات کلسیم می‌شوند، بنابراین تشکیل بلورهای اگزالات کلسیم حتی در فوق اشباعی ادرار، کمتر اتفاق میافتد. مواد گوناگونی به عنوان بازدارنده تبلور اگزالات کلسیم شناخته شده‌اند، برخی از آن‌ها وزن مولکولی کمی دارند مانند سیترات منیزیم و اسیدهای آمینه و برخی دیگر وزن مولکولی زیادی دارند مانند گلوکزامینوگلیکن ها، استئوپنتین و نفرو‌کلسین (Sayan et al., 2009).
1-6- پتاسیم سیترات
پتاسیم سیترات، نمک پتاسیم از سیتریک اسید با فرمول مولکولیC6H5K3O7 می‌باشد که به عنوان افزودنی غذایی جهت تنظیم اسیدیته کاربرد دارد. سیترات مانع ایجاد ترکیب‌های کلسیم و اتصال کریستال‌های فسفات و اگزالات کلسیم می‌شود که می‌توانند هسته‌ای برای ایجاد سنگ‌های ادراری باشند. از طرفی سیترات به کلسیم در ادرار چسبیده و با افزایشpH و قلیایی شدن ادرار مانع تشکیل سنگ‌های اسید‌اوریکی و کلسیمی می‌شود (Dalirani, 2010).
مواد سیترات‌دار بعنوان قلیایی‌کننده ادرار و ضد سنگهای ادراری اوراتی و سیستینی، و ضد سنگهای ادراری کلسیمی شناخته می‌شوند که مکانیزم اثر آن‌ها در زیر آورده شده است.
قلیایی‌کننده ادرار و ضد سنگهای ادراری اوراتی و سیستینی: سیترات در بدن به بیکربنات متابولیزه می‌شود و از طریق افزایش دفع یونهای آزاد بی‌کربنات، pH ادرار را افزایش می‌دهد. افزایش pH ادرار موجب افزایش حلالیت سیستین در ادرار و یونیزه‌شدن اسیداوریک به اوراتهای محلولتر می‌شود. با قلیایی نگهداشتن pH ادرار، سنگ‌های اوراتی ادرار ممکن است حل شوند.
ضد سنگ‌های ادراری کلسیمی: سیترات پتاسیم بعد از جذب و متابولیسم سبب ایجاد بار قلیایی، افزایش pH و سیترات ادرار، از طریق افزایش کلیرانس ادرار می‌شود. از این روی به نظر می‌رسد مصرف سیترات‌پتاسیم بیش از آنکه بر میزان سیترات قابل فیلتراسیون اثر بگذارد، عمدتاً با تغییر دفع سیترات توسط کلیه موجب افزایش مقدار سیترات ادرار می‌شود. افزایش pH و سیترات ادرار، از طریق افزایش تشکیل مجموعه کلسیم با آنیون‌های مربوطه، فعالیت یون کلسیم را کاهش می‌دهد و در نتیجه میزان اشباع‌شدگی اگزالات کلسیم کاهش می‌یابد. مواد سیترات دار، تبلور و تشکیل خود به خود هسته‌ی اگزالات و فسفات کلسیم در ادرار بیماران مبتلا به سنگ‌های کلسیمی را نیز مهار می‌کند (www.darunama.com ).
1-7- ضرورت تحقیق
همانطوری که ذکر شد بیماری سنگ‌کلیه یکی از شایع‌ترین بیماری‌هایی است که افراد زیادی از آن رنج می‌برند. با توجه به اینکه اگزالات کلسیم مهمترین ماده تشکیل دهنده سنگ‌های کلیوی می‌باشد تبلور این ماده مورد توجه محققان زیادی قرار گرفته است.
برخی از مواد به روشهای مختلفی بر شکل بلورهای اگزالات کلسیم تأثیر می‌گذارند و بلورهای اگزالات کلسیم را از گونه‌ای به گونه‌ی دیگر تغییر می‌دهند. این تغییر گونه معمولاً از گونهی COM به گونه‌ی COD صورت می‌گیرد. به عنوان مثال پروتئین‌ها نقش مهمی در تغییر گونه اگزالات کلسیم از مونوهیدرات به دیهیدرات ایفا می‌کنند (Taesung et al., 2004). به واسطه‌ی این که غلظت یون کلسیم به ازای هر سلول واحد در بلورهای COD بیشتر می‌باشد، در‌نتیجه نیروی دافعه بین بلورها افزایش یافته و منجر به کاهش چسبندگی بلورها به‌هم می‌شود (Cerini et al., 1999). از آن‌جا که چسبندگی بلورها به یکدیگر یکی از مهمترین مراحل تشکیل سنگ‌کلیه می‌باشد، تبلور اگزالات کلسیم دیهیدرات (COD) منجر به کاهش تشکیل سنگ می‌شود. از این رو تغییر گونه اگزالات کلسیم از مونوهیدرات به دی‌هیدرات گامی مؤثر در راه جلوگیری از تشکیل سنگهای کلیوی به شمار میآید (Ouyang et al., 2006).خواص فیزیکی رسوب و پاره‌ای از خواص ترکیبات شیمیایی آن وابسته به فرآیند هسته‌سازی بلورها می‌باشد. بنابراین کنترل فرآیند هسته‌سازی دارای اهمیت بسیار است. در بدن انسان سنگهای کلیوی رسوب می‌کنند، پس شناخت کلیه و مشخص کردن ویژگی‌های آن می‌تواند در کنترل هر چه بیشتر فرآیند هسته‌سازی سنگ‌ها مؤثر واقع شود.
1-8- عوامل مؤثر در تغییر شکل بلور
شکل کریستالها تابعی از ساختمان مولکولی آنها و سرعت رشد سطوح مختلف آنها می‌باشد. شرایط خاصی از کریستالیزاسیون ممکن است موجب رشد سریعتر بعضی از سطوح نسبت به سطوح دیگر شود. بنابراین با تغییر شرایط میتوان کریستالهایی با شکلهای متفاوت از یک جسم واحد ساخت. مثلاً بعضی شرایط موجب کریستالهای سوزنی میشوند، درحالیکه در شرایط دیگر میتوان از همان جسم کریستالهای ورقهای ساخت (Kittel, 1996). شرایطی که بر شکل کریستال تأثیر میگذارند عبارتند از نوع حلال، pH محلول، غلظت، وجود ناخالصی، میزان فوقاشباعیت، دامنه دمای کریستالیزاسیون و غیره، که بطور خلاصه به بعضی از آنها اشاره می شود.
1-8-1- اثر حلالتغییر حلال میتواند منجر به تغییر شکل کریستالها شود. بطور مثال نفتالین در محیط سیکلوهگزان به صورت سوزنی کریستاله میشود، ولی اگر حلال متانول باشد کریستالهای نفتالین بهصورت ورقهای درمیآیند. یدوفرم نیز در محیط سیکلوهگزان بهصورت منشورهای ششوجهی و در محیط آنیلین بهصورت هرمهای ششوجهی کریستاله میشود. بنابراین هنگام انتخاب حلال برای کریستالیزاسیون باید به تأثیر آن بر شکل کریستال توجه نمود (خدایی، 1387).
1-8-2- اثر pHگاهی pH محیط بر شکل کریستالهای حاصل تأثیر میگذارد، بطور مثال فسفاتهای هیدروژنه پتاسیم و آمونیوم در pH=4 بهصورت سوزنی و در pH=5 بهصورت منشور کریستاله میشود. سولفات مس نیز که معمولاً بهصورت دانههای درشت کریستاله میشود، در محیط اسیدی بهصورت ورقهای درمیآید. معمولاً کنترل pH یک راه مؤثر برای کنترل شکل کریستال محسوب نمیشود (خدایی، 1387).
1-8-3- اثر فوقاشباعیمیزان فوقاشباع میتواند بر شکل کریستال حاصله اثر بگذارد. دلیل این پدیده گوناگونی وابستگی شدت رشد سطوح مختلف کریستال به میزان فوقاشباع میباشد. این فاکتور روی همگنی بلور تأثیر میگذارد. وقتی محلول به شدت فوقاشباع است، همگنی بلورها کمتر و زمانی که فوقاشباعی محلول کم است، بلورها از همگنی بیشتری برخوردار هستند. عامل فوقاشباعی، تأثیر قابلتوجهی روی شکل بلور و تعداد سطوح آن دارد (خدایی، 1387).
1-8-4- اثر دمادمای کریستالیزاسیون مستقیماً اثر مهمی بر شکل کریستالها ندارد ولی از آنجا که ممکن است فعالیت ناخالصیهای موجود در محیط به تغییرات دما بستگی داشته باشد، میتواند بهطور غیر مستقیم بر شکل کریستالها تأثیر بگذارد (خدایی، 1387).
1-8-5- اثر ناخالصی
وجود ناخالصیها میتواند تأثیر شدیدی بر روی شکل کریستالهای حاصله داشته باشد. وجود ناخالصی رشد وهستهزایی را تحت تأثیر قرار میدهد و منجر به تغییر پهنای منطقه نیمه‌پایداری میگردد. میتوان گفت که مواد افزودنی، یونها و مولکولهای ناخالصی، بر روی سطح کریستالهای موجود در محلول جذب میگردند و منجر به تغییر در رشد آن سطوح می‌شوند. بطور مثال وجود یون PO+2 در کریستالیزاسیون هالیدهای قلیایی از محیط آبی موجب به دستآمدن کریستالهای درشت و محکم میشود. نمونه دیگری از تأثیر ناخالصی وجود کربامید، در محلول کلریدسدیم است. بدون حضور این ناخالصی، کلرید سدیم به شکل مکعبی متبلور میشود، درحالیکه در حضور این ناخالصی شکل آن هشتوجهی میشود (خدایی، 1387).
1-9- رشد بلور
هسته‌‌های بحرانی بلافاصله بعد از شکل‌گیری در درون محلول فوق اشباع شروع به رشد می‌کنند. رشد نیازمند این است که ماده‌ی حل شده از محلول به سطح کریستال نفوذ کرده و وارد شبکه‌ی کریستالی شود. رشد بلور، فرآیندی نفوذی است که تحت تأثیر سطوح جامدی است که بلورها روی آن رشد میکنند. مولکولها یا یونهای ماده حلشده با نفوذ در مایع، به سطح در حال رشد بلور میرسند. مولکولها یا یونهایی که به سطح میرسند باید توسط بلور پذیرفته شوند و بهصورت شبکه فضایی نظم بگیرند. یک رشد موفق شامل یک مرحله نفوذ و یک مرحله واکنش سطحی است. بنابراین فرآیند کلی رشد، از دو مرحله سری تشکیل میشود. لازم به ذکر است که تا وقتی محلول فوقاشباع نشده، نه مرحله نفوذ و نه مرحله جذب سطحی هیچ کدام اتفاق نمیافتد (Mccabe, 1988). مکانیسم و نظریه‌های مختلفی برای رشد بلور ارائه شده است که در اینجا به چند نمونه از آن‌ها اشاره خواهد شد.
1-9-1- نظریه انرژی سطحینظریه انرژی سطحی بر این مبنا استوار است که شکل بلور رشد کرده بهگونهای باشد که دارای مینیمم انرژی سطحی کل باشد. یک قطره از سیال در حالتی در پایدارترین حالت قرار دارد که انرژی سطحی در واحد سطح آن مینیمم باشد. در سال 1878 گیبس پیشنهاد کرد که رشد بلور را میتوان یک حالت خاص از این اصل در نظر گرفت با این بیان که انرژی آزاد کل یک بلور در تعادل با محیط خود در دما و فشار ثابت برای یک حجم مشخص باید مینیمم باشد. اگر به یک بلور در محیط فوقاشباع اجازه رشد داده شود به طرف شکل تعادلی پیش خواهدرفت. توسعه وجوه مختلف بلور باید بهگونهای باشد که انرژی آزاد سطحی کل برای یک حجم مشخص مینیمم باشد (Gibbs, 1878).
1-9-2- نظریه لایهای جذب سطحی مکانیسم رشد بلورها در نظریه لایهای جذب سطحی بر اساس وجود یک لایه جذبشده از اتمها یا مولکول های جسم حلشده بر روی یک وجه بلور است که اولین بار این نظریه در سال 1939 توسط والمر ارائه شدهاست. محققین زیادی بر روی توسعه و اصلاح نظریه‌ی والمر کار کردند. این نظریه را که به آن نظریه‌ی گیبس والمر نیز میگویند بر مبنای ترمودینامیکی استوار است (Volmer, 1939).
وقتی که یک واحد از مواد بلوری به سطح بلور میرسد به سرعت به سطح بلور نمیچسبد، بلکه فقط یک درجه آزادی را از دست میدهد و آزادانه تا سطح بلور میتواند حرکت کند. بنابراین یک لایه جذبشده آزاد از واحدهای مجتمع در سطح مشترک به وجود میآید که در تعادل ترمودینامیکی با توده محلول است. این لایه جذبشده که گاهی اوقات فاز سوم نامیده میشود، نقش مهمی را در رشد بلور و هستهزایی اولیه بازی میکند. ضخامت این لایه عمدتاً از ده نانومتر تجاوز نمیکند و گاهی ممکن است در حدود یک نانومتر باشد (ده نمکی، 1380).
اتمها، یونها یا مولکولهای این لایه بهطرف سطح بلور حرکت میکنند و در جاییکه نیروی جاذبه بیشتر باشد مینشینند، این عمل ادامه پیدا میکند تا یک لایه کامل روی سطح بنشیند. قبل از آنکه سطح بتواند به رشد خود ادامه دهد یعنی قبل از آنکه لایه دیگری بتواند شروع شود، باید مرکز مرحله اول یا دوم و یا هر دو مرحله فرآیند کلی تعیین شود. معمول بر این است که رشد کریستالها به صورت نرخ تغییرات طول مشخصه بلور نسبت به زمان بیان میشود. رشد بلورها وابستگی شدیدی به میزان فوقاشباعیت دارد. با این وجود عوامل متعدد دیگری همچون هیدرودینامیک سیستم، اندازه بلور، شکل و میزان ناهمواری، دما، حلالها و حضور ناخالصیها بر این فرآیند تأثیر میگذارند.
فصل دوممروری بر تحقیقات گذشته
مروری بر تحقیقات گذشته
در این فصل به بررسی تحقیقاتی که روی تغییر مورفولوژی بلورها به روشهای مختلف صورت گرفته و پژوهشهایی که اختصاصاً در مورد اگزالات کلسیم انجام شده، پرداخته میشود.
با توجه به اینکه اگزالات کلسیم مهمترین ماده تشکیل دهنده سنگ‌های کلیوی می‌باشد، تبلور این ماده مورد توجه محققان قرار گرفته است. لیانگ و همکارانش در سال 2009 اثر نانوذرات سلنیوم را بر تبلور اگزالات کلسیم بررسی کردند. نتایج این مطالعه نشان داد که نانو ذرات سلنیوم می‌تواند با اگزالات تشکیل پیوند دهد و منجر به کاهش تشکیل اگزالات کلسیم شود. همچنین این نانوذرات می‌تواند از رشد و به هم چسبندگی بلورها جلوگیری کنند و گونهی آنها را از COM به COD تغییر دهد (Liang et al., 2009).
در سال 2006، تونگ‌بوکنرد و همکارانش تأثیر متغیرهای مختلفی نظیر دما، pH و اختلاط را بر تبلور و شکل بلورهای اگزالات کلسیم مطالعه کردند. نتایج به دست آمده از تحقیقات آن‌ها نشان داد که در دماهای کمتر تشکیل و رشد بلورهای اگزالات کلسیم افزایش می‌یابد. نتایج مطالعات همچنین مشخص ساخت که هر چه pH کمتر شود و محلول خاصیت اسیدی بیشتری داشته باشد، امکان تشکیل بلورهای COM که پایدارترین گونهی اگزالات کلسیم است و بخش عمدهی سنگ‌های کلیوی را تشکیل می‌دهد، بیشتر خواهد شد. بنابراین مطالعه مذکور این گفته را که هرچه محیط ادرار اسیدیتر باشد امکان تشکیل سنگ بیشتر می‌شود را تأیید کرد. در این بررسی تأثیر اختلاط نیز بر تبلور اگزالات کلسیم مطالعه شد و نتایج نشان داد که اختلاط بر اندازه و گونهی بلورها تأثیر مهمی دارد و موجب کاهش تشکیل و رشد آنها می‌شود (Thongboonkerd et al., 2006).
پاک‌مهر و علمداری در سال 2011 هسته سازی اگزالات کلسیم را در حضور عصاره‌ی خارشتر مورد بررسی قرار دادند. آزمایش‌های آن‌ها نشان داد که حضور عصارهی خارشتر موجب افزایش زمان تأخیر بلورهای اگزالات کلسیم می‌شود. همچنین در نسبتهای فوق اشباعیت کمتر وجود این عصاره تأثیر بیشتری را در کاهش سرعت هسته‌سازی و در نتیجه کاهش تشکیل بلورها نشان داد. با توجه به آنکه در آزمایشهای SEM مشاهده شد که حضور عصارهی خارشتر در مدت زمانی طولانی در مجاورت بلور اگزالات کلسیم ممکن است باعث کاهش اندازهی آنها شود، میتوان گفت که مصرف عصارهی خارشتر می‌تواند موجب تسریع شدن فرآیند دفع سنگهای کلیوی با اندازهی کوچک از مجاری ادراری بیمار شود (پاک‌مهر و علمداری، 2011).
اویانگ و همکاران اثر تارتارات پتاسیم را بر تبلور و رشد بلورهای اگزالات کلسیم در محیط ژلاتینی در دماهای مختلف بررسی کردند. در این تحقیق اگزالات کلسیم مونوهیدرات با استفاده از روش نفوذ دوطرفه در محیط ژلاتینی تولید شد. مطالعات آنها نشان داد که در غلظت‌های مختلف تارتارات پتاسیم هر سه گونه‌ی اگزالات کلسیم تشکیل می‌شود، به این ترتیب که در غلظت کمی از تارتارات پتاسیم (0.01 mol/l) گونهی غالب COM می‌باشد. در این غلظت گونه COD در حدود 5 درصد تشکیل می‌شود و گونهی COT تشکیل نمی‌شود. با افزایش غلظت تارتارات پتاسیم تا غلظتهای 0.1 mol/l و 0.5 mol/l مشاهده شد که به ترتیب 56 و 82 درصد از بلورهای اگزالات کلسیم تشکیل شده از گونهی COT می‌باشند. همچنین مشاهده شد که تغییر دمای تبلور نیز بر روی شکل بلورها تأثیرگذار است. و همکارانش در سال 2006 تشکیل گونه‌های مختلف اگزالات کلسیم را تحت تأثیر تارتارات پتاسیم در محیط ژلاتینی بررسی کردند و میزان تشکیل هر یک از این گونه‌ها را در غلظت‌های مختلف تارتارات پتاسیم با روش‌های XRD و FT-IR به دست آوردند‌ (2006 Ouyang et al.,).
تائسونگ و همکارانش در سال 2005 اثر بیوپلیمرها را روی شکل بلورهای اگزالات کلسیم بررسی کردند. آن‌ها دریافتند که با افزایش غلظت بیوپلیمر، اگزالات کلسیم مونو هیدرات (COM) تغییر ساختار داده و به اگزالات کلسیم دی‌هیدرات (COD) تبدیل می‌شود (Taesung et al., 2005).
لی‌جون‌وانگ و همکارانش تأثیر ترکیب دو مادهی سیترات و پروتئین استئوپنتین را به عنوان بازدارنده تبلور اگزالات کلسیم بررسی کردند. در این تحقیق نشان داده شد که هر دو ماده به تنهایی از رشد بلورها جلوگیری میکنند. عکسبرداری SEM انجام شده روی هر دو ماده نشان داد که حضور سیترات به تنهایی باعث تغییر شکل بلورها می‌شود ولی حضور استئوپنتین به تنهایی تأثیر قابل‌توجهی را روی شکل بلورها نشان نمی‌دهد. نتایج به دست آمده از این پژوهش تأثیر ترکیب این دو ماده را به عنوان ماده بازدارنده تبلور اگزالات کلسیم اثبات کرد (Lijun Wang et al., 2006).

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

دنگ و همکارانش در سال 2006 تبلور اگزالات کلسیم را در دو نمونه ادرار سالم و سنگ‌ساز بررسی کردند. در ادرار سالم در ابتدای تبلور رشد بلورها کنترل کنندهی فرآیند بود و در اواسط و اواخر فرآیند مشاهده شد که هستهسازی بلورها کنترل کننده تبلور می‌باشد. همچنین نتایج نشان داد که در ادرار سنگ ساز در کلیه مراحل فرآیند تبلور، رشد بلورها کنترلکننده می‌باشد. آنها با مقایسه بلورهای رشد کرده در ادرار سالم با بلورهای رشد کرده در ادرار سنگساز سه اختلاف اساسی مشاهده کردند. 1- اندازه متوسط ذرات تبلور یافته در ادرار سنگساز بزرگتر از اندازه متوسط ذرات در ادرار سالم می‌باشد. 2- شکل بلورهای اگزالات کلسیم در ادرار سنگ ساز به صورت شش گوشه با لبههای تیز و در ادرار سالم به صورت بلورهای گرد بدون لبه است و 3- در ادرار سالم گونه اگزالات کلسیم دیهیدرات مشاهده شد (Siu-Ping Deng et al., 2006).
اونر و همکارانش اثر پلیمر وینیل سولفونیک اسید را که قابل حل در آب است را روی تبلور اگزالات کلسیم مطالعه کردند و دریافتند که حضور پلیمر از رشد بلورها جلوگیری میکند. بدین ترتیب که پلیمر بر روی مکانهای فعال رشد بلورها جذب می‌شود و مانع از قرار گرفتن مولکولهای دیگر اگزالات کلسیم بر روی مکانهای فعال می‌شود. همچنین نتایج آنها مشخص کرد که با افزودن پلیمر وینیل سولفونیک اسید گونه بلور اگزالات کلسیم از مونوهیدرات به دیهیدرات تغییر می‌کند (Oner et al., 2010).
در سال 2004 ال شال و همکاران اثر مواد موجود در ادرار شامل اگزالات، کلسیم، سیترات و پروتئین میوسین بر روی هسته‌سازی و رشد بلورهای اگزالات کلسیم را با اندازه‌گیری وزن بلورهای تولید شده و بازهی اندازه بلورها در شرایط مختلف بررسی کردند. نتایج حاصله نشان داد که وجود یونهای کلسیم و اگزالات هسته سازی و تبلور اگزالات کلسیم را افزایش می‌دهد و وجود پروتئین میوسین اثر مهمی را در هسته‌سازی و رشد بلورهای اگزالات کلسیم ندارد (El-Shall et al., 2004).
ال شال و همکارانش در سال 2004 نیز رابطه زمان تأخیر بلورها بر حسب نسبت فوق‌اشباعیت را برای شناسایی اثر سیترات بر روی هستهسازی اگزالات کلسیم مونو هیدرات به کار بردند. آنها دریافتند که سیترات تغییر اساسی را روی انرژی سطحی هسته‌های اگزالات کلسیم مونو‌هیدرات اعمال نمی‌کند، ولی زمان تشکیل بلورها را به واسطه کمپلکس‌هایی که با یون‌های آزاد کلسیم در محلول تشکیل می‌دهد، به تأخیر می‌اندازد. آن‌ها همچنین تأثیر فوق‌اشباعیت را روی هسته‌‌سازی اولیه اگزالات کلسیم بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که با افزایش نسبت فوق اشباعیت سرعت هسته سازی افزایش می‌یابد (El-Shall et al., 2004).
تائسونگ و همکاران در سال 2004 با استفاده از روش Biomineralization در محلول بافر که شرایطی شبیه ادرار دارد، شکل و رشد بلورهای اگزالات کلسیم را در نسبتهای فوق‌اشباعیت مختلف و شرایط استوکیومتری متفاوت بررسی کردند. آن‌ها دریافتند که در نسبت‌های فوق اشباعیت کوچک‌تر از 20، گونه‌ی غالب COD می‌باشد و در نسبت‌های فوق اشباعیت بزرگتر از 20، به دلیل تغییر در سینتیک هسته‌سازی بلورها گونه‌ی غالب COM تشکیل می‌شود. همچنین تغییرات ساختاری بلورها در حضور یونهای اضافی از Ca2+ و C2O42- مورد آزمایش قرار گرفت و مشخص شد که در حضور مقادیر اضافی از یون Ca2+ ، گونهی COD و در حضور مقادیر اضافی از یون C2O42- ، گونهی COM تشکیل می‌شود (Taesung et al., 2004).
در سال 2009 مطالعاتی در زمینه تأثیر آمینو اسیدها، پروتئین‌ها و اسیدهای کربوکسیلیک بر تبلور اگزالات کلسیم در دما و pH های مختلف توسط سایان و همکارانش انجام شد. آنها آنالیزهای SEM, XRD, FT-IR را برای مشاهده تغییرات حاصله در تبلور اگزالات کلسیم پس‌ از افزودن این مواد به کار گرفتند. نتایج تحقیقات نشان داد که اندازه متوسط بلورها در حضور این مواد به صورت قابل توجهی تغییر نمود. همچنین مشاهده شد که در حضور کلیه افزودنیها به غیر از اسید تارتاریک گونه غالب بلور از نوع COM می‌باشد (Sayan et al., 2009).
در سالهای اخیر مطالعه و تحقیق روی عصارههای گیاهی و مواد طبیعی به عنوان مواد بازدارنده تبلور اگزالات کلسیم به دلیل فراوانی و عدم بروز عوارض جانبی به نسبت مواد و بازدارندههای شیمیایی رواج بیشتری یافته است. به عنوان مثال در سال 2000 در دانشگاه فلوریدا اتمنی و خان تحقیقاتی را در زمینه تأثیر عصاره گیاه Herniaria hirsuta بر تبلور اگزالات کلسیم در محیط مصنوعی انجام دادند. آنها دریافتند که این عصاره هسته‌سازی بلور اگزالات کلسیم را افزایش و اندازه ذرات را کاهش می‌دهد. افزودن عصاره همچنین باعث تغییر گونه بلورها به اگزالات کلسیم دیهیدرات شد (Atmani and Khan, 2000).
عبدل-آل و همکاران در سال 2009 اثر نسبت فوق اشباعیت و همچنین عصاره گیاه خلا را روی هسته‌سازی و شکل بلورهای اگزالات کلسیم بررسی کردند. آنها دریافتند که با افزایش نسبت فوق اشباعیت، زمان تأخیر کاهش می‌یابد. همچنین آنها دریافتند که در اثر افزودن عصاره خلا، انرژی سطحی بلورها کاهش یافته و بنابراین زمان تأخیر افزایش مییابد (Abdel-Aal et al., 2009).
عیدی و همکارانش در سال 2008 اثر کاکل ذرت را روی تبلور اگزالات کلسیم در محیط مصنوعی بررسی کردند. آنها مشاهده کردند که افزودن کاکل ذرت باعث افزایش تعداد بلورهای اگزالات کلسیم در مقایسه با نمونه قبل از افزودن کاکل ذرت می‌شود. همچنین آنها دریافتند که کاکل ذرت باعث افزایش بلورهای کوچک و کاهش بلورهای بزرگ می‌شود و موجب افزایش تعداد بلورهای اگزالات کلسیم از گونه مونوهیدرات نسبت به گونه دیهیدرات می‌گردد (Eydi et al., 2008).
در سال 2010 ، دکتر علی سیروس و همکاران در دانشگاه علوم پزشکی اراک اثر عرق خارشتر بر دفع سنگهای حالب را بررسی کردند. در این مطالعه که روی 100 بیمار مبتلا به سنگ‌کلیه انجام گرفت مشخص شد که مصرف عرق خارشتر دفع سنگهای ادراری را به میزان 26 درصد افزایش می‌دهد (Cyrus et al., 2010).
فصل سوم
تئوری

3-1- تئوری روش تاگوچی
3-1-1- طراحی آزمایشها
طراحی آزمایشات شامل یک آزمایش یا یک سری از آزمایش‌هایی می‌شود که به‌طور آگاهانه در متغیر‌های ورودی فرآیند تغییراتی ایجاد می‌گردد تا از این طریق میزان تغییرات حاصل در پاسخ خروجی فرآیند مشاهده و شناسایی شود. طراحی آزمایش‌ها یکی ازابزار‌های مهندسی مهم در راستای بهبود فرآیند‌های تولید محسوب می‌شود. کاربرد این فنون در مراحل اولیه توسعه فرآیند می‌تواند نتایج زیر را به همراه داشته باشد:
بهبود بازده
کاهش تغییرات
کاهش زمان توسعه
کاهش هزینه‌ها
محققان برای شناخت پدیده‌ها، آزمایش‌هایی را انجام می‌دهنـد تا حقیقتی را در مورد سامانه یا فرآینـدی کشف کنند. انجام آزمایش همواره متضمن هزینـه و زمان است. بنابراین به روشی نیاز است که در آن بتوان با صرف حداقل هزینه و زمان، به بیشترین اطلاعات در مورد فرآیند دست پیدا کرد و نتیجه‌گیری‌های منطقی ارائه کرد و مدارک مستند در خصوص فرآیند بهدست آورد. روشی که به بهترین شکل اهداف ذکر شده را برآورده می‌سازد، طراحی آزمایش‌های صنعتی نام دارد. در تمام فرآیندها و سامانه‌ها می‌توان از طراحی آزمایشات بهره گرفت و کیفیت خروجـی را افزایش داد. این تحلیل‌هـا اغلب بهوسیلهی نرم افزارهـای تحلیل آماری انجام می‌شود که معروفتـرین آنها Minitab و Design Expert می‌باشد.
3-1-2- هدف از طراحی آزمایش
در واقع هدف طراحی آزمایشات حل مسأله زیر است:
1- کسب حداکثر اطلاعات و شناخت از فرآیندها
2- صرف حداقل هزینه‌ها
3- کسب حداقل زمان برای اجرای فرآیندها
پارامترهای مستقل مورد مطالعه در فرآیند آزمایش با نام فاکتور یا عامل شناخته میشوند. هر کدام از این عوامل میتواند دارای چندین مقدار مختلف باشد که به این مقادیر سطح گفته میشود و به نتیجه حاصله از هر آزمایش، پاسخ گفته میشود.
3-1-3- مراحل طراحی آزمایش
به طور کلی جهت طراحی آزمایش و بررسی عوامل مؤثر بر پدیدهی مورد نظر باید مراحل زیر را به ترتیب انجام داد (Lazic, 2004):
1- تشخیص مسئله.
2- انتخاب ابتدایی عوامل، سطوح و دامنه آن‌ها.
3- انتخاب پاسخ.
4- انتخاب طراحی آزمایش.
5- انجام آزمایشها.
6- تجزیه و تحلیل نتایج.
7- جمعبندی، نتیجهگیری و بهینهسازی.
با توجه به تعداد پارامتر‌های مؤثر و تعداد سطوح هر کدام از آن‌ها (مقادیر مختلفی که در طول آزمایش برای هر کدام در نظر گرفته می‌شود) تعداد آزمایش‌ها مشخص می‌شود. به این ترتیب که طبق جدول 3-1 تعداد پارامترها را از ردیف افقی بالای جدول مشخص کرده و سطوح را نیز از ردیف عمودی سمت چپ مشخص میکنیم، محل برخورد این دو تعداد آزمایش‌های مورد نظر را معین می‌کند.
جدول 3-1 : جدول بدست آوردن تعداد آزمایش به روش تاگوچی

پس از معین کردن تعداد آزمایش‌ها یک ماتریس تشکیل می‌دهیم که سطر‌های این ماتریس مشخص‌کننده شرایط آزمایش می‌باشد. برای ایجاد این ماتریس‌ها راه‌های پیچیده‌ای وجود دارد ولی می‌توان از تحقیق‌ها و یا سایر منابع نیز آن‌ها را به صورت آماده پیدا کرده و از آن‌ها استفاده کرد. برای تحلیل آزمایش‌ها نیز روش‌های مختلفی وجود دارد که در این پژوهش از روش نسبت سیگنال به اغتشاش استفاده کردیم.
در این روش ما انتظار داریم که از تحلیل جواب‌ها نتایج زیر را بدست آوریم:
شرایط بهینه‌ای که در آن کیفیت مطلوب بدست می‌آید.
میزانی که هر فاکتور روی عملکرد و کیفیت تأثیر‌گذار است و تعیین فاکتوری که بیشترین تأثیر را دارد.
در این تحقیق طراحی آزمایش‌ها در محیط نرم افزار MINITAB16 انجام گرفته است. تاگوچی برای چهار فاکتور ورودی و سه سطح، روش آرایه متعامد L9 را پیشنهاد می‌کند. هدف از بکارگیری روش تاگوچی در طراحی، تعیین سطوحی از عوامل قابل کنترل جهت دست‌یابی به بالاترین راندمان است. لازم به ذکر است چنانچه یافتن شرایط بهینه بدون استفاده از روش طراحی آزمایش انجام می‌گرفت نیاز به 34=81 آزمایش بود، که با این روش تعداد آزمایش‌ها به 9 کاهش یافت. یکی از اهداف اصلی روش تاگوچی، تعیین میزان تأثیر هر یک از پارامترها بر روی خروجی فرآیند و تعیین سطوح بهینه‌ی این پارامترها می‌باشد.
در این پژوهش هدف اصلی بررسی مورفولوژی می‌باشد که پارامتری کیفی است. از آنجائیکه برای استفاده از تحلیل تاگوچی، پاسخ باید متغیری کمی باشد، بدین منظور در این پژوهش از پارامترهای ضریب کرویت و اندازه‌ی متوسط وزنی ذرات، بعنوان پاسخ فرآیند استفاده شده است.
ضریب کرویت :
ضریب کرویت میزان نزدیکی و شباهت یک جسم به کره را نشان می‌دهد. فرآیند‌های مختلفی در علوم صنایع غذایی، کشاورزی، نظامی و غیره وجود دارد که تصمیم‌گیری در خصوص آن‌ها بر اساس شکل محصولات است. درجه‌بندی و بسته‌بندی محصولات یکی از این موارد است و در این میان خصوصیات فیزیکی نظیر کرویت می‌تواند یکی از فاکتور‌های لازم برای این کار باشد. در واقع این ضریب یکی از شاخص‌های تعیین شکل جسم است و نشان دهنده میزان شباهت یک جسم به کره می‌باشد. شکل محصولات نقش مهمی در فرآیندهای جداسازی و درجه‌بندی توسط ماشین‌های غربال دارد. ضریب‌کرویت همواره عددی بین صفر و یک می‌باشد که هر چه شکل جسم از کره دورتر باشد، مقدار آن کمتر است.
محققان روش‌های گوناگونی را برای این ضریب ارائه کرده‌اند که به برخی از آن‌ها اشاره می‌شود. در سال 1970 محسنین رابطه‌ی زیر را برای محاسبه‌ی ضریب کرویت ارائه داد (Mohsenin, 1970).
φ= (LWT)13T (3-1)
مطابق شکل 3-1 در این رابطه L طول، W عرض، و T ضخامت جسم است.

شکل 3-1 : مشخصه‌های محوری یک جسم
جین و بال در سال 1997 رابطه‌ی زیر را برای ضریب کرویت ارائه دادند (Jain, Bal, 1997).
φ=B(2L-B)L13 (3-2)
(3-3) B= (WT)12در این روابط L, W و T با توجه به شکل 3-1 مشخص می شوند.
وادل رابطه‌ی زیر را برای تعیین ضریب کرویت اجسام متمایل به کره پیشنهاد کرد:
φ= π13 (6Vp)23Ap (3-4)
در این رابطه Vpو Apبه ترتیب بیانگر حجم ومساحت سطحی ذره می‌باشد (Wadell, 1935).
برای درک بهتر میزان کرویت جداولی طراحی شده‌اند که در شکل 3-2 نمونه‌ای از آن آورده شده است. ذرات به ترتیب از راست به چپ: خیلی گوشه‌دار، گوشه‌دار، تقریباً گوشه‌دار، تقریباً گرد‌شده، گردشده و خیلی گرد‌شده تقسیم‌بندی شده‌اند.

شکل 3-2 : ترتیب گرد شدن یک ذره (Wikipedia)
از آنجائیکه کرویت پارامتری سه‌بُعدی بوده و اندازه‌گیری آن با روش‌های معمولی کاری دشوار، پیچیده و پر‌هزینه است (limei,wang, 2007 )، در این مطالعه برای محاسبه‌ی آن از نرم‌افزار پردازش تصاویر میکروسکوپی MIP و فرمول 3-5 استفاده شد (Sympatec GmbH, 2012):
(3-5) 2πAPREAL Sphericity=φ=
که PREAL و A به ترتیب بیانگر محیط و مساحت ذرات است.
با استفاده از پردازش تصاویر میکروسکوپ نوری، نرم افزار MIP مقادیر عددی محیط و مساحت هر ذره را در اختیار قرار می‌دهد.

شکل 3-3 : محیط و مساحت برای محاسبه ضریب کرویت ( Zellnitz and kappl, 2013)
میانگین اندازه‌ی وزنی :
برای انجام مقایسه بین نتایج آزمایش‌ها، اندازه‌ی متوسط وزنی بر اساس رابطه‌ی زیر در هر حالت محاسبه شد (Shonel and Garside, 1992 ).
d= WidiWi (3-6)
در رابطه‌ی 3-6 Wi و di به ترتیب کسر جرمی دانه‌های روی هر الک نسبت به کل دانه‌ها و متوسط حسابی اندازه‌ی سوراخ‌های دو الک متوالی است ( Abbasi and Alamdari, 2007).
مقادیر کوچکتر اندازه‌ی متوسط وزنی بیانگر شکسته شدن دانه‌ها در اثر برخورد با همزن و دیواره‌ها در طول انجام عملیات و تولید ذرات با اندازه‌ای ریزتر است. از آنجائیکه هدف ما تولید ذرات ریزتر اگزالات کلسیم برای دفع راحت‌تر می‌باشد، مقادیر کوچکتر d برای ما مطلوب‌تر است.
3-1-4- تحلیل نسبت عملکردی SN پس از انجام آزمایش‌ها و اندازه‌گیری نتایج، سطوح بهینه‌ی پارامترها به کمک تکنیک‌های آماری و روش سیگنال به اغتشاش تعیین گردید. نسبتSNR ، نشان دهنده‌ی حساسیت مشخصه‌ی مورد بررسی به فاکتورهای ورودی در یک فرآیند کنترل شده می‌باشد. شرایط بهینه با تعیین تأثیر هر یک از فاکتورهای ورودی بر روی مشخصه‌ی خروجی، شناسایی می‌شود. مقدار S/N میزان پراکندگی را حول یک مقدار مشخص بیان میکند یا به بیان دیگر اینکه جواب‌ها در بین چند آزمایش انجام شده چگونه تغییر کرده‌اند.
از نقطه نظر مشخصه‌ی خروجی فرآیند، آن را می‌توان به سه دسته‌ی هر چه کمتر بهتر، هر چه به مقدار اسمی نزدیکتر بهتر، و هر چه بزرگتر بهتر، تقسیم‌بندی نمود (Radmehr and Shams, 2013). تاگوچی برای محاسبه‌ی نسبت سیگنال به اغتشاش، بر حسب اینکه مشخصه‌ی مورد نظر جزء کدام یک از سه گروه فوق باشد، روابط مختلفی را ارائه کرده است. اما به طور کلی، در هر آزمایش همواره بالاترین نسبت SNR مطلوب مسأله است ( Liang Chia Chen, 2008 ).
یکی از خروجی‌های اندازه‌گیری شده در این تحقیق، در صد‌کرویت است که در گروه هر چه بیشتر بهتر، قرار می‌گیرد. بنابراین از رابطه‌ی زیر برای محاسبه‌ی نسبت سیگنال به اغتشاش استفاده می‌شود (Bendell and Disney, 1989):
SN=-10.log10 [ 1ni=1n( 1yi )2] (3-7)
خروجی اندازه‌گیری شده‌ی دیگر، اندازه‌ی متوسط وزنی است که در گروه هر چه کمتر بهتر، قرار می‌گیرد و از رابطه‌ی زیر برای محاسبه‌ی نسبت سیگنال به اغتشاش استفاده می‌شود:
SN=-10.log10 [ 1ni=1n(yi)2] (3-8)
که n تعداد تکرار هر آزمایش و yi مقدار i امین خروجی اندازه گیری شده است. برای مشاهده‌ی میزان تأثیر سطوح عوامل مختلف بر روی متوسط نسبت SN ، از نمودار اثرات عوامل استفاده می‌شود. از روی هرکدام ازاین نمودارها می‌توان تعیین نمود، که چه عواملی برهرکدام ازمشخصه‌های کیفی تأثیرمعنی‌دار دارد، چه عواملی تأثیرشان بینابین است، وچه عواملی روی مشخصه‌ی کیفی تأثیری ندارند. این سطح بهینه از روی نمودار اثرات عوامل بدست می‌آید. بدین‌ترتیب که برای عوامل کنترل سطحی که مقدار عملکرد نسبت برای آن بیشترین مقدار را داشته باشد، به عنوان سطح بهینه‌ی آن عامل انتخاب می‌شود.
فصل چهارم
عملیات آزمایشگاهی

4-1- شرح دستگاه
آزمایش‌ها در یک رآکتور استوانهای انجام گرفت(شکل 4-1). جنس این دستگاه، فولاد ضد‌زنگ است و دارای لوله مکش می‌باشد. این لوله دارای پوستهی حرارتی، دو لوله متصل و چهار تیغه است که آب گردشی از طریق این لوله به پوسته منتقل میشود. این پوسته دارای یک ورودی و یک خروجی است که به یک مخزن آب متصل است و توسط پمپ آب را از درون مخزن به پوسته منتقل میکند. پایین مخزن شامل یک المنت حرارتی است که برای گرمکردن آب بهکار میرود که در نتیجه‌ی آن مادهی درون محفظه گرم میشود (شکل 4-5). دریچهی بالایی رآکتور دارای دو روزنهی شیشهای برای مشاهده محتویات درون دستگاه میباشد.
این دستگاه دارای یک پرهی همزن جهت اختلاط مواد است که توسط یک الکتروموتور به چرخش درمیآید. سرعت چرخش پره تا 200 دور بر دقیقه (rpm) قابل تنظیم است. منافذی روی درپوش ظرف برای نمونه‌برداری و ورود و خروج مواد در نظر گرفته شده است. قطر داخلی و خارجی لوله مکش و استوانهی بیرونی به همراه تفلون بهکاررفته در دستگاه به گونهای است که عمل اختلاط و الگوی جریان بهصورت کنترل شده باشد، بهطوری که فضای مرده و تغییرات سرعت در فضای رآکتور به حداقل برسد. پره همزن راکتور از نوع 6-pitched blade45° است و زاویه پرهها به گونهای است که محلول در قسمت داخلی لوله مکش به سمت بالا و در قسمت بیرونی لوله به سمت پایین حرکت میکند.
برای کنترل دقیق دمای آب حمام از یک المنت حرارتی و یک کنترلردیجیتالی با دقت دهم درجه استفاده شده است، که درصورت لزوم المنت حرارتی بهوسیله کنترلر روشن یا خاموش میشد. بهاین‌صورت که کنترلر به سنسوری جهت خواندن دمای آب مخزن متصل است، و با دادن دمای مورد نظر، کنترلر این دما را با دمایی که از سنسور میگیرد مقایسهکرده و باعث خاموش و روشنشدن المنت حرارتی میشود. ضمن آنکه از اختلاف دمایی آب درون مخزن و مادهی درون محفظه به دلیل ناچیز بودن صرف نظر میگردد.
در شکلهای 4-1 تا 4-5 تصاویر اجزای مختلف راکتور نشان داده شده است.

شکل 4-1 : شماتیک رآکتور ترسیب (اندازه‌ها بر حسب میلی‌متر است)
شکل 4-2 :پوستهی قرار گرفته در محفظه جهت انتقال حرارت
شکل 4-3 : تفلون بهکار رفته در کف محفظه برای حذف فضای مرده در اختلاط
شکل 4-4 : پرهی مورد استفاده جهت ایجاد تلاطم
شکل 4-5 : نمای کلی تجهیزات مورد استفاده فرآیند( 1- محفظه آزمایش، 2- پوستهی انتقال دهندهی حرارت، 3- کنترلر دما، 4- المنت حرارتی، 5- پمپ آب، 6- شیر کنترل دبی آب، 7- حمام آب )
با توجه به شکل 4-5، شماره‌ی 1 محفظهی مورد آزمایش و پرهی همزن را نشان میدهد. محلول پس از آمادهسازی به درون محفظه ریخته خواهد شد و درب محفظه بسته میگردد. شماره‌ی 2، نقش انتقال حرارت و تنظیم دمای درون محفظه را به عهده دارد. شماره‌ی 3، یک کنترلر دما بوده و پس از مقایسه دمای درون مخزن و دمای مطلوب، دستور خاموش یا روشن بودن را به المنت حرارتی شمارهی 4 خواهد داد. شماره‌ی 5، پمپ آب را نشان میدهد که نقش به گردش درآوردن آب جهت انتقال حرارت به محفظه را دارد و توسط شیر شماره‌ی 6، میزان دبی آن تنظیم میگردد. چون مخزن از محفظه پایینتر بوده، به دلیل اختلاف ارتفاع در صورت باز بودن شیر شماره‌ی 6، تقریباً تمامی آب به درون مخزن برگشت داده میشود و در صورت بسته بودن آن، تمامی آب به درون محفظه رفته و انتقال حرارت به سرعت صورت می‌گیرد. شماره‌ی 7 نیز مخزن آب را نشان میدهد که با توجه به اینکه حجم مخزن از حجم محفظه بیشتر بوده، تأثیرات دمایی محفظه بر مخزن اثری نداشته و دمای مخزن و محفظه یکسان فرض میشود. ضمن آنکه پس از تغییر دما در مخزن، به دلیل شدت جریان بالای پمپ، دمای محفظه در مدت زمان کمی با دمای مخزن یکسان میشود که این زمان قابل صرف‌نظر کردن است.

شکل 4-6 : نمای کلی دستگاه4-2- تجهیزات مورد استفاده
دستگاه رآکتور ترسیب، بشر، دماسنج، ارلن، قیف بوخنر، کاغذ صافی، پمپ خلأ، الک با اندازههای مختلف، ترازو و حمام آب.
4-3- مواد مورد استفاده
آب مقطر، کلسیم کلرید، سدیم اگزالات، تری پتاسیم سیترات، اسید‌کلریدریک و سدیم هیدروکسید.
4-4- آزمایشات
برای شروع آزمایش‌ها در این بخش در ابتدا آزمایش کریستالیزاسیون اگزالات کلسیم به طور معمول انجام شد. این بلورهای حاصل برای مقایسه نمونه‌های حاصل شده از سایر آزمایش‌ها مورد استفاده قرار گرفت. با این مقایسه تأثیر اعمال هر کدام از روش‌ها در میزان تغییر شکل بلور‌ها قابل مشاهده است.
4-4- 1- استفاده از افزودنی در فرآیند تبلور
همان‌طور که در فصل اول بیان شد، افزودنی‌ها می‌توانند بر رشد کریستال تأثیرگذار باشند. آن‌ها بر صفحات خاصی از بلور چسبیده و غالباً رشد آن‌ها را کم می‌کنند. از آنجا که تغییر مورفولوژی ناشی از تفاوت نسبی سرعت رشد صفحات مختلف است، بنابراین اگر افزودنی بتواند سرعت رشد صفحات را تغییر دهد بر مورفولوژی بلور مؤثر است. پس برای انتخاب افزودنی مناسب در گام نخست باید معلوم شود که آیا افزودنی با مولکول‌های بلور واکنشی می‌دهد و قابل جذب بر سطح بلور هست یا خیر؟ در گام بعد باید مشخص شود که آیا جذب یک افزودنی بر سطوح مختلف بلور و تغییر در سرعت رشد آن، ساختار نهایی بلور را به مورفولوژی مورد نظر ما نزدیک می‌کند یا خیر؟
با توجه به مطالب ذکر شده، انتخاب یک افزودنی مناسب گام اصلی است. اگرچه هیچ الگوی خاصی برای این انتخاب در مراجع ذکر نشده است. در واقع برای انتخاب افزودنی، بهترین روش آزمایش کردن آن است. ماده‌ی افزودنی مورد استفاده در این تحقیق تری پتاسیم سیترات می‌باشد.
4-4-2- روش آزمایش
همانگونه که پیش از این ذکر شد، هدف از تحقیق حاضر بررسی تأثیر تری پتاسیم سیترات بر مورفولوژی کریستال‌های اگزالات کلسیم می‌باشد. بدین منظور ابتدا اگزالات کلسیم در غیاب تری پتاسیم سیترات تهیه می‌گردد، و سپس با نمونه‌های دیگر بعد از افزودن ماده مقایسه می‌شود. از میان روش‌های مختلف تولیدی کلسیم اگزالات مونوهیدرات، در این آزمایش از واکنش بین کلسیم کلرید) (CaCl2 و سدیم اگزالات (Na2Ox) با استوکیومتری زیر استفاده شد:
CaCl2 + Na2C2O4 CaC2O4 + 2NaCl (4-1)
آزمایش‌ها به اینصورت انجام گرفت که ابتدا 400 میلی‌لیتر محلول کلرید کلسیم 2/0 مولار به همراه 150 میلی‌لیتر آب مقطر درون راکتور ریخته شد. سپس در‌حالی‌که محلول توسط همزن با سرعت 100 دور در دقیقه و در دمای ثابت 37 درجه سانتیگراد به هم زده می‌شد، 400 میلی‌لیتر محلول اگزالات سدیم 2/0 مولار با شدت جریان 4/0 لیتر بر ساعت به محفظه‌ی انجام واکنش افزوده شد. پس از آن محلول به مدت یک ساعت به منظور کامل شدن واکنش و تخلیه فوق اشباعی از محلول به کریستال‌های محصول در دمای 37 درجه سانتیگراد توسط همزن به هم زده شد. بعد از اتمام واکنش به مدت 30 دقیقه فرصت داده شد تا بلورها ته‌نشین شوند. سپس بلورهای اگزالات کلسیم تولید شده توسط کاغذ صافی فیلتر شد و پس از خشک شدن درون آون، برای عکسبرداری میکروسکوپی و آزمایش میکروسکوپ الکترونی (SEM) آماده گردید.
این آزمایش‌ها در حضور تری پتاسیم سیترات، به عنوان ماده‌ی افزودنی و در شرایط معین انجام گرفت. از محلول اسیدکلریدریک و سدیم هیدروکسید برای تنظیم pH استفاده شد.
4-4-3- آزمایشات طراحی شده
اثر 4 عامل اساسی روی پدیده‌ی کریستالیزاسیون اگزالات کلسیم تحت تأثیر تری پتاسیم سیترات بررسی می‌شود. این پارامترها عبارتند از: دما، غلظت، شدت اختلاط، و pH که به روش طراحی آزمایش تاگوچی مورد استفاده قرار گرفتند. بررسی 4 عامل در قالب 3 سطح از روش آرایه متعامد استاندارد L9 تاگوچی استفاده شد. به همین منظور برای هر عامل تعداد 3 سطح در نظر گرفته‌ شد که با قرار دادن این دادهها در نرم افزار Minitab طراحی زیر حاصل شده است:
جدول 4-1 : اطلاعات مربوط به تست های تاگوچی
شماره آزمایش pHسطح
سطح سرعت همزن سطح غلظت ماده‌ی افزودنی
سطح دما
1 1 1 1 1
2 2 2 2 1
3 3 3 3 1
4 3 2 1 2
5 1 3 2 2
6 2 1 3 2
7 2 3 1 3
8 3 1 2 3
9 1 2 3 3
جدول 4-2 : پارامترها و سطوح درنظر گرفته شده برای آزمایش‌ها
pH سرعت همزن
(rpm ) غلظت ( gl) دما ( °C )
سطح 1 5/5 50 10 25
سطح 2 7 100 30 37
سطح 3 8 150 60 45
4-4- 4- فیلتراسیون
پس از انجام هر آزمایش اجازه داده شد تا کریستال‌های تولید شده ته‌نشین شود. سپس فاز مایع زلال روی دانه‌ها با خم‌کردن کریستالیزور تا جایی تخلیه شد که هیچ دانه‌ای به همراه مایع خارج نگردد. در مرحله‌ی بعد سوسپانسیون به یک قیف بوخنر و صافی متصل به پمپ خلأ منتقل شده و آب آن گرفته شد. فیلتراسیون برای کل نمونه ها یکسان بود و تا جایی ادامه پیدا کرد که فاصله‌ی زمانی دو قطره‌ی آب خروجی متوالی از انتهای قیف دو دقیقه باشد. پس از آن جامد هنوز مرطوب بوده و برای خشک کردن به مدت 10 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
4-4-4 -1- توزیع اندازه ذرات
برای انجام یک فرآیند تبلور مطلوب، شکل و توزیع اندازه ذرات از ارکان اصلی بهشمار می‌رود. در این آزمایش توزیع اندازه ذرات اگزالات کلسیم بهوسیله الک اندازهگیری شد. هر کدام از نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه الک شد، سپس جامد باقی‌مانده روی هر الک با‌‌دقت 001/0 گرم وزن شد و داده‌های حاصل برای بدست آوردن توزیع اندازه‌ی جرمی استفاده شد.
بعد از آماده‌سازی محصول، گونه‌ها مهیای عکسبرداری میکروسکوپی شده و بهترین نمونه‌ها برای آنالیز دقیق‌تر با عکسبرداری میکروسکوپی الکترونی SEM مورد بررسی قرار گرفتند.
4-4-4-2- عکسبرداری میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)
در میکروسکوپ نوری شاید بتوان با تغییر انحنای (تقعر و تحدب) سطح عدسی‌ها و تعداد آنها بزرگنمائی تصاویر را به هر مقدار زیاد کرد اما به علت بلندبودن طول موج نور عملاً تصاویر در بزرگنمائی‌های بالای 2000 وضوح خود را از دست می‌دهند(احمدیان، 1392). منظور از وضوح، کمترین فاصله بین دو نقطه‌ای است که بتوان آنها را با دیدن از هم تفکیک کرد. در میکروسکوپ الکترونی بهجای نور از شعاع الکترونی استفاده می‌شود. چون طولموج الکترون کوتاه است می‌توان در میکروسکوپهای الکترونی بزرگنمائی تصاویر را بالا برد (تا حد یک میلیون برابر در بعضی از میکروسکوپهای الکترونی و یا بیشتر). اما استفاده از اشعه الکترونی محدودیت‌های خاصی نیز ایجاد می‌کند، از جمله اینکه شعاع الکترون تک طولموج میباشد و تصاویر حاصله سیاه و سفید هستند. دومین محدودیت این است که الکترون بر خلاف نور نمی‌تواند به آسانی در هوا حرکت کند، در نتیجه باید در مسیر حرکت الکترون و محفظه نمونه خلأ قوی ایجاد کرد. با استفاده از یک پمپ چرخشی و یک پمپ نفوذی خلأ مورد نیاز ایجاد میشود. پمپ چرخشی خلأ را به 3- 10 تور میرساند و سپس پمپ نفوذی فعال میگردد و خلأ را در داخل میکروسکوپ به 6- 10×2 می‌رساند تا سیستم شروع بهکارکند.
طرز کار میکروسکوپ الکترونی به این صورت است که الکترون به سطح نمونه تابیده می‌شود و منعکس میگردد و توسط دیتکتورها جمعآوری میشود و تبدیل به فوتون نوری می‌گردد تا تصویر مرئی ایجاد شود. به عبارت دیگر این نوع میکروسکوپ فقط از ساختار سطحی تصویر میدهد. حداکثر ولتاژی که توسط این نوع میکروسکوپ‌ها مورد استفاده قرار میگیرد حدود 30 کیلو ولت است. این ولتاژ برای شتابدادن الکترون استفاده میشود. برای بهدست آوردن بزرگنمایی‌های بالاتر و وضوح بیشتر از ولتاژ بیشتری استفاده میشود تا الکترون شتاب و انرژی بیشتری داشته باشد. میکروسکوپ الکترونی دانشگاه شیراز ساخت شرکت فیلیپس از کشور هلند و مدل XL30 می‌باشد (احمدیان، 1392).
فصل پنجم
بحث و نتایج

نمونه‌های بهدستآمده از انجام آزمایشها پس از خشکشدن ابتدا توسط میکروسکوپ ساخت شرکت E200 Nikon Eclipse با لنز DS-Fi1 و سپس توسط میکروسکوپ الکترونی اسکن و عکسبرداری شدند.
برای بررسی آزمایشها و درک تأثیر تغییر هر عامل، در جدول 5-1 شرایط تمامی آزمایش‌های صورت گرفته، آورده شده است تا دید کلی از نحوهی تغییر عوامل آزمایشها را نشان دهد.
جدول 5-1 : داده‌های عددی انجام آزمایششماره آزمایش pH سرعت همزن
(rpm ) غلظت ماده‌ی افزودنی
( g100 ml) )0C ( دما
1 5/5 50 1 25
2 7 100 3 25
3 8 150 6 25
4 8 100 1 37
5 5/5 150 3 37
6 7 50 6 37
7 7 150 1 40
8 8 50 3 40
9 5/5 100 6 40
5-1- نتایج حاصل از نرم‌افزار MINITAB
همانطور که اشاره شد طراحی آزمایش‌ها در محیط نرم افزار MINITAB16 انجام گرفت. طبق روابط 3-7 و 3-8 فصل سوم، مقادیر سیگنال به اغتشاش برای نتایج تمامی آزمایش‌ها محاسبه شد. سپس برای هر یک از سطوح مورد آزمایش هر پارامتر، میانگین مقدار سیگنال به اغتشاش به دست آمد. برای مشاهده‌ی میزان تأثیر سطوح عوامل مختلف بر روی متوسط نسبت SN ، نمودار اثرات عوامل نیز آورده شده است.
شکل‌های 5-1 و 5-2 مقادیر میانگین در‌صد کرویت و میانگین نسبت سیگنال به اغتشاش برای هر یک از چهار پارامتر تنظیمی را در حالت بررسی در‌صد کرویت بعنوان پاسخ فرآیند نشان می‌دهند.
همچنین شکل‌های 5-3 و 5-4 مقادیر میانگین اندازه‌ی ذرات و میانگین نسبت سیگنال به اغتشاش برای حالتی که میانگین اندازه‌ی ذرات بعنوان پاسخ فرآیند است را نشان می‌دهند.
در جداول 5-2 و 5-4 مقادیر عددی درصد کرویت و میانگین اندازه‌ی ذرات و همچنین نسبت سیگنال به اغتشاش برای هر دو پاسخ آورده شده است.
شکل 5-1 : مقادیر میانگین در‌صد کرویت برای فاکتورها و سطوح آنها

شکل 5-2 : میانگین نسبت SNR برای فاکتورها و سطوح آن‌ها در حالت بررسی Sphericity

شکل 5-3 : مقادیر میانگین اندازه‌ی ذرات برای فاکتورها و سطوح آن‌ها

شکل 5-4 : میانگین نسبت SNR برای فاکتورها و سطوح آنها در حالت بررسی میانگین اندازه‌ی ذرات
جدول 5-2 : مقادیر عددی درصد کرویت وSNR
شماره آزمایش Sphericity
( % ) SNRA
1 80 276/38
2 93 554/39
3 95 735/39
4 83 588/38
5 86 890/38
6 89 181/39
7 70 147/37
8 73 501/37
9 76 842/37
جدول 5-3 : مقادیر عددی پیش‌بینی و پیشنهاد شده‌ی درصد کرویت وSNR توسط تاگوچی برای حالت بهینه‌ی بررسی درصد کرویت
PSNRA PMEAN
825/39 667/95
جدول 5-4 : مقادیر عددی میانگین اندازه‌ی ذرات وSNR
شماره آزمایش Mass Mean
Size SNRA
1 6/228 181/47-
2 7/101 146/40-
3 84 485/38-
4 201 063/46-
5 1/176 915/44-
6 4/147 369/43-
7 6/323 2/50-
8 3/274 764/48-
9 5/251 01/48-
جدول 5-5 : مقادیر عددی پیش‌بینی و پیشنهاد شده‌ی درصد کرویت وSNR توسط تاگوچی برای حالت بهینه‌ی بررسی Mass Mean Size
PSNRA PMEAN
692/38- 166/74
نسبت سیگنال به اغتشاش، نشان دهنده‌ی حساسیت مشخصه‌ی مورد بررسی به فاکتورهای ورودی در یک فرآیند کنترل شده می‌باشد. همانگونه که ذکر شد، همواره مقادیر بالایSNR ، مطلوب می‌باشد. بنابراین بر اساس میانگین نسبت سیگنال به اغتشاش هر پارامتر تنظیمی، می‌توان سطوح بهینه‌ی آن‌ها را تعیین نمود.
با توجه به شکل‌های 5-1 و 5-2 بهترین سطوح پارامترهای دما، غلظت، pH و شدت اختلاط، به ترتیب سطوح 1، 3، 2 و 2 می‌باشد. مشاهده می‌شود که با تغییرات pH و دور همزن مقادیر درصد کرویت و SNR تغییر چندانی نکرده‌اند، درحالیکه تغییرات دما و غلظت ماده‌ی افزودنی اثر قابل توجه و بیشتری داشته‌اند. همچنین طبق جدول 5-2 ملاحظه می‌شود که بیشترین مقادیر درصد کرویت و SNR مربوط به آزمایش شماره‌ی 3 می‌باشد. PSNRA و PMEAN، مقادیر پیش‌بینی و پیشنهاد شده توسط نرم افزار برای حالت بهینه‌ی انجام آزمایش است، مشاهده می‌شود که این مقادیر، نزدیکترین حالت به آزمایش شماره‌ی 3 می‌باشند.همچنین شکل‌های 5-3 و 5-4 حاکی از آنند که سطوح بهینه‌ی پارامترهای دما، غلظت، pH و شدت اختلاط، به ترتیب سطوح 1، 3، 3 و 2 می‌باشد. از چهار پارامتر بررسی شده، دما و غلظت بیشترین اثرگذاری را داشتند، در‌حالیکه شدت اختلاط و pH نقش و تأثیر کمتری از خود نشان دادند. از جدول 5-4 ملاحظه می‌شود که کمترین مقدار اندازه‌ی متوسط وزنی و بیشترین مقدار SNR در شرایط انجام آزمایش شماره‌ی 3 است، که مقادیر پیش‌بینی و پیشنهاد شده‌ی تاگوچی نیز این را تأیید می‌کند.
به نظر می‌رسد استفاده از تری پتاسیم سیترات بتواند با افزایش سیترات ادرار، مانع واکنش بین کلسیم و اگزالات شود. در واقع سیترات رقابت شدیدی با اگزالات برای واکنش با کلسیم از خود نشان می‌دهد و از تجمع کلسیم و اگزالات بعنوان اصلی‌ترین پیش برنده‌های تولید سنگ جلوگیری می‌کند. توصیه‌ی پزشکان به بیماران کلیوی برای استفاده از آبمیوه‌های طبیعی پرتقال و لیمو به دلیل سیترات موجود در این میوه‌ها است. همچنین سیترات باعث تنظیم و افزایش pH ادرار می‌شود. pH طبیعی ادرار بین 4/4 تا 8 است و تحقیقات انجام شده حاکی از آنند که قدرت انحلال کلسیم اگزالات مونو‌هیدرات در pH پایین، کاهش و درpH بالاتر، افزایش می‌یابد. البته باید توجه داشت که تأثیر pH بر انحلال ترکیبات در سنگ‌های خارج شده از بدن انسان‌ها که مجموعه‌ای از نسبت‌های مختلف ترکیبات با آنیون‌ها وکاتیون‌های متفاوت است، متغیر می‌باشد. باید در نظر داشت که در واقع سنگ‌های کلیوی به طور خالص از یک نوع ترکیب مثل کلسیم اگزالات تشکیل نشده‌اند و به‌همین ترتیب تأثیر pH نیز بر سنگ‌های کلیه که در بدن انسان تشکیل می‌شوند، متفاوت است.
همانطور که ذکر شد، تغلیظ ادرار و رسوب املاح سبب تشکیل سنگ‌های کلیوی می‌شوند. زمانی که بدن کم‌آب می‌شود، نمک‌ها، مواد معدنی و سایر مواد موجود در ادرار ممکن است با هم تجمع یابند و بنای اولیه یک سنگ را پایه‌ریزی کنند. بنابراین نوشیدن مقدار کافی مایعات در طول روز می‌تواند، در رقیق کردن ادرار مفید واقع شود.
کم‌تحرکی و عدم فعالیت فیزیکی نیز از عوامل زمینه‌ساز بروز سنگ‌های کلیه است. کم‌تحرکی که مثلاً در هنگام بیماری یا ناتوانی رخ می‌دهد، می‌تواند سبب برداشت کلسیم بیشتری از استخوان شده ، لذا غلظت کلسیم در ادرار افزایش می‌یابد و تعادل بین کلسیم و اگزالات به‌هم خورده و احتمال رسوب ذرات افزایش می‌یابد. هر چند که در این پژوهش سرعت همزن اثر قابل توجهی از خود نشان نداد، اما به نظر می‌رسد که شدت اختلاط در حین انجام آزمایش‌ها و همچنین فعالیت‌های بدنی بیشتر بعد از استفاده از داروهای مصرفی، نقش مثبتی در اثرگذاری دارو داشته باشد.
5-2- نتایج عکسبرداری میکروسکوپی و میکروسوپ الکترونی روبشی (SEM)
آزمایشها جهت بررسی شکل و گونهی بلورهای اگزالات کلسیم درون راکتور ترسیب در حضور و عدم حضور تری پتاسیم سیترات انجام شد. بلورهای تولید شده پس از فیلتراسیون و عمل خشک شدن توسط میکروسکوپ نوری مشاهده شدند. در شکل‌های 5-5 تا 10-5، عکس‌های گرفته شده از نمونه‌های حاصل از آزمایشات کریستالیزاسیون اگزلات کلسیم آورده شده است:
A
100µm

B
100µm

شکل 5-5 (A) و (B) : تصویر میکروسکوپ نوری از بلورهای اگزالات کلسیم قبل از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط عملیاتی : دما = 37 درجه سانتیگراد، سرعت همزن 100 دور در دقیقه و pH = 7
100µm
A

100µm
B

شکل 5-6 (A) و (B) : تصویر میکروسکوپ نوری از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 2 شامل: دما = 25 درجه سانتیگراد، غلظت = 30 گرم بر لیتر، سرعت همزن 50 دور در دقیقه و pH = 5/5
100µm
A

B
100µm

شکل 5-7 (A) و (B) : تصویر میکروسکوپ نوری از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 3 شامل: دما = 25 درجه سانتیگراد، غلظت = 60 گرم بر لیتر، سرعت همزن 150 دور در دقیقه و pH = 8
A

شکل 5-8 (A) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم قبل از افزودن تری پتاسیم سیترات
BA

شکل5-8 (B) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم قبل از افزودن تری پتاسیم سیترات
C

شکل 5-8 (C) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم قبل از افزودن تری پتاسیم سیترات
A

شکل 5-9 (A) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 2
B

شکل5-9 (B) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 2
A

شکل 5-10 (A) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 3
B

شکل5-10 (B) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 3
C

شکل5-10 (C) : تصاویر SEM از بلورهای اگزالات کلسیم بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 3
شکل 5-5 کریستال‌های اگزالات کلسیم بدون افزودن تری پتاسیم سیترات را نشان می‌دهد که ساختار COM، به صورت شش‌وجهی کشیده دارد. شکل 5-6 و 5-7 کریستال اگزالات کلسیم را در حالت افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط آزمایش شماره‌ی 2 و 3 نشان می‌دهد که گونه‌ی COD، به صورت گرد و بدون لبه تشکیل شده است.
تصاویر 5-8 الی 5-10 عکسهای میکروسکوپ الکترونی (SEM) از نمونهی آزمایشهای 2، 3 و قبل از افزودن تری پتاسیم سیترات است. در این تصاویر شکل سهبعدی ذرات قابل مشاهده است.
همانگونه که در شکلها مشاهده می‌شود بلورهای اگزالات کلسیم تولید شده در غیاب تری پتاسیم سیترات از گونهی مونوهیدرات (COM) بوده و به شکلهای به هم چسبیده و لبه‌دار، با اندازه‌ی بزرگتر تشکیل بلور می‌دهند، اما بعد از افزودن تری پتاسیم سیترات ذرات ریزتر و گردتر شده‌اند.
5-3- توزیع اندازه ذراتبرای تعیین توزیع اندازه ذرات در هر آزمایش، محصول اگزالات کلسیم بهدستآمده توسط غربالهایی با اندازه‌های مختلف دستهبندی شد که نتایج آن در شکل‌های شماره‌ی 5-11 تا 5-20 آورده شده است.

شکل 5-11 : توزیع اندازه ذرات آزمایش قبل از افزودن تری پتاسیم سیترات در شرایط عملیاتی : دما = 37 درجه سانتیگراد، سرعت همزن 100 دور در دقیقه و pH = 7

شکل 5-12 : توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 1 در شرایط عملیاتی : دما = 25 درجه سانتیگراد، غلظت = 10 گرم بر لیتر، سرعت همزن 50 دور در دقیقه و pH = 5/5

شکل 5-13 : توزیع اندازه ذرات آزمایش شماره 2 در شرایط عملیاتی : دما = 25 درجه سانتیگراد، غلظت = 30 گرم بر لیتر، سرعت همزن 50 دور در دقیقه و pH = 5/5

user6-712

2-5-3 کنترل ترشح هورمون رشدترشح هورمون رشد در موجودات مختلف تحت تاثیر فاکتورهای زیادی از جمله استرس، تغذیه، خواب، خود هورمون رشد و همچنین مرحله رشد، سن، تغذیه، تحریکات عصبی هیپوکلسیمی، فاکتورهای آزاد کننده هورمون رشد، فاکتورهای بازدارنده هورمون رشد، فاکتورهای رشد از قبیل فاکتور رشد شبه انسولین نوع 1، هورمون تیروئید آدرنال، پانکراس و تعدادی از متابولیت ها واقع می‌شود (ماهنامه جهان دامپروری، 1385). کنترل‌های اولیه رشد توسط دو هورمون هیپوتالاموس (هورمون آزاد کننده هورمون رشد و سوماتواستاتین) و یک هورمون از معده (گرلین) صورت می‌گیرد. هورمون آزادکننده هورمون رشد یک پپتید هیپوتالامیک است که هم سنتز و هم ترشح هورمون رشد را تحریک می‌کند. اما سوماتواستاتین پپتیدی است که آزاد شدن هورمون رشد رادر پاسخ به هورمون آزادکننده هورمون رشد از طریق دیگر فاکتورهای محرک مانند غلظت پایین گلوکز خون ممانعت می‌کند. گرلین با اتصال به گیرنده‌های روی سوماتوتروف ها، همانند هورمون آزاد کننده هورمون رشد ترشح هورمون رشد را تحریک می‌کند. ترشح هورمون رشد همچنین متاثر از فیدبک منفی فاکتور رشد شبه انسولین نوع 1 می‌باشد. سطوح بالای آن در خون منجر به کاهش ترشح هورمون رشد نه فقط از طریق ممانعت مستقیم سوماتوتروف، بلکه از طریق تحرک آزادسازی سوماتواستاتین از هیپوتالاموس می‌شود. جهت ممانعت از ترشح هورمون، اثر فیدبک و احتمالا اثر ممانعت مستقیم (اتوکراین) نسبت به ترشح از سوماتوتروف دارد. ترشح هورمون رشد مانند بیشتر هورمون‌های هیپوفیزی حالت یک جریان دائمی و یکنواخت ندارد بلکه به صورت جریاناتی ضربانی انجام می‌پذیرد (شهبازی، 1378).
2-5-4 اثرات متابولیکی هورمون رشد هورمون رشد اثرات مهمی روی متابولیسم پروتئین، لیپید و کربوهیدرات دارد. در بعضی موارد، اثرات مستقیم هورمون رشد ثابت شده است، از طرفی دیگر که فاکتورهای رشد شبه انسولین نوع 1 در این بین نقش واسطه‌ای داشته و در بعضی موارد هردوی آن‌ها اثرات مستقیم و غیر مستقیم ایفا می‌کنند.
2-5-4-1 افزایش سرعت پروتئین سازی در بیشتر سلول‌های بدنگرچه مکانیسم‌های دقیق افزایش ذخیره پروتئین به وسیله هورمون رشد معلوم نیست، ولی یک رشته اثرات متعدد شناخته شده‌اند که همه آن‌ها می‌تواند منجر به ذخیره پروتئین شوند.
هورمون رشد مستقیما انتقال اسیدهای آمینه یا شاید بیشتر اسیدهای آمینه را از غشاء سلول به درون سلول تقویت می‌کند. غلظت اسیدهای آمینه درون سلول را زیاد می‌کند و تصور بر این است که حداقل تا حدی مسئول افزایش پروتئین سازی است. این تنظیم اسیدهای آمینه شبیه اثر انسولین بر انتقال گلوکز از غشاء است (سپهری، 1385).
2-5-4-2 افزایش رونویسی هسته‌ای DNA برای ساخت RNAهورمون رشد طی دوره‌های طولانی‌تر (24 تا 48 ساعت) رونویسی DNA درون هسته را هم تحریک می‌کند و موجب ساخت مقادیر بیشتری RNA می‌شود. به این ترتیب، اگر انرژی، اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و سایر عوامل رشد کافی در دسترس باشند، پروتئین سازی افزایش می‌یابد و رشد به میزان بیشتری صورت می‌گیرد، این کار احتمالا مهم‌ترین عمل هورمون در بلند مدت است. خلاصه اینکه هورمون رشد تقریبا تمام جنبه‌های دریافت اسیدآمینه و ساخت پروتئین در سلول را تقویت می‌کند و در عین حال تجزیه پروتئین‌ها را کاهش می‌دهد (سپهری، 1385).
2-5-4-3 افزایش میزان چربی‌ها برای تولید انرژیهورمون رشد اثر ویژه‌ای در آزاد سازی اسیدهای چرب دارد و به این ترتیب غلظت اسیدهای چرب را در مایعات بدن افزایش می‌دهد. به علاوه هورمون رشد تبدیل اسیدهای چرب استیل 36 COA و مصرف بعدی آن برای تولید انرژِی را در بافت‌های سراسر بدن تقویت می‌کند. بنابراین، تحت تاثیر هورمون رشد، چربی مقدم بر کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها انرژی مصرف می‌شود (سپهری، 1385).

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

2-5-4-4 کاهش مصرف کربوهیدرات‌هاهورمون رشد اعمال متعددی دارد که بر متابولیسم کربوهیدرات‌ها اثر می‌گذارند، از جمله:
کاهش برداشت گلوکز در بافت‌ها مثل عضله اسکلتی و بافت چربی.
افزایش تولید گلوکز در کبد.
افزایش ترشح انسولین.
همه این تغییرات، «نتیجه مقاومت به انسولین» ناشی از هورمون رشد است که اثرات انسولین در تحریک برداشت و مصرف گلوکز در عضله اسکلتی و بافت چربی و مهار گلوکونئوژنز در کبد را تضعیف می‌کند. مکانیسم مقاومت به انسولین و کاهش مصرف گلوکز توسط سلول‌ها، بر اثر هورمون رشد هنوز معلوم نیست. به هر حال، هورمون رشد با افزایش غلظت اسیدهای چرب در خون ممکن است سبب اختلال در اثر انسولین بر مصرف گلوکز در بافت‌ها شود (سپهری، 1385).
2-6 ژن هورمون رشداین ژن به طور مستقیم و غیر مستقیم نقش مهمی در فرایندهای رشد سلول‌های بدنی، رشد اسکلت و تقسیم سلولی و سنتز پروتئین بعد از تولد را دارا می‌باشد، علاوه بر آن هورمون رشد میزان اکسیداسیون چربی و نقل و انتقال گلوکز به بافت پیرامونی و تنظیم فعالیت ترجمه ریبوزومی که در سنتز پروتئین مرتبط است دخالت دارد (دی سانتیس و جری، 2007). مطالعاتی که روی حیوانات انجام شد دلالت بر این دارد که ژن هورمون رشد می‌تواند یک ژن کاندید باشد که برای صفات تولیدی همانند رشد (تامباسو و همکاران،2003) مقاومت در برابر بیماری و تولید تخم (دان کانمینگ، 1997) میزان چربی (کنور و همکاران،2003) اثر به سزایی داشته باشد. پروتئین اصلی این هورمون از تحول تدریجی در طی زمان و تکامل محفوظ مانده است و اطلاعات بسیار ارزشمندی را در زمینه تغییرات پروتئینی و عملکرد هورمون رشد به ما می‌دهد (دین و همکاران، 2008).
بر اساس مطالعاتی که روی ژن هورمون رشد در ماهیان صورت گرفته مشخص شد که ژن هورمون رشد در ماهیان به صورت محافظت شده نمی‌باشد. به عنوان مثال ژن هورمون رشد کپور ماهیان همانند پستانداران دارای 4 اینترون و 5 اگزون می‌باشد (هو،1991) ولی در اکثر ماهیان دیگر دارای یک اگزون اضافی (6 اگزون و 5 اینترون) می‌باشد (آگلون و همکاران، 1988 و بر و دانیال، 1993) اندازه اگزون‌ها در همه ماهیان تقریبا برابر است به جزء اگزون 5 که در طول تکامل به دو قسمت تبدیل شده است (آلمولی و همکاران،2000). فرض بر این است که اضافه شدن اینترون 5 به اگزون 5 و تبدیل اگزون 5 به دو قسمت منجر به واگرایی بین کپور ماهی شکلان و دیگر ماهیان استخوانی شده باشد.
با بررسی تکامل اینترون 5، ماهیان را به سه گروه متفاوت تقسیم بندی کرده‌اند. گروه اول ماهیانی که فاقد اینترون 5 می‌باشند و ساختار این ژن مانند پستانداران و پرندگان می‌باشد مانند کپورماهیان و گربه ماهیان. گروه دوم ماهیانی که اینترون 5 آن‌ها به طول 100-70 جفت باز است مانند تیلاپیا، کفشک ماهی و جراح ماهی دم زرد و گروه سوم که طول اینترون 5 در ژن هورمون رشد 200 تا 600 جفت باز می‌باشد که در برگیرنده خانواده آزادماهیان می‌باشد (یانگ و همکاران، 1997). محققین بر این باورند که دو نسخه‌ای شدن کل ژنوم ماهیان در طول دوره تکامل ماهیان استخوانی اتفاق افتاده است (کریستوفل و همکاران، 2004). اما فقط در آزاد ماهیان و کپور معمولی و تیلاپیا ژن هورمون رشد به صورت دو نسخه‌ای تا به حال گزارش شده است (آگلون و همکاران، 1988). که ماهی سفید و کپور معمولی دارای دو ژن هورمون رشد GH-1 و GH-2 می‌باشد.
2-7 نشانگرهای ژنتیکیهر آنچه که در میان افراد، لاین‌ها، جمعیت‌ها، گونه‌ها، نژادها و یا سویه‌های مختلف به لحاظ ژنتیکی تفاوت داشته و سبب تمایز آن‌ها از یکدیگر گردد به عنوان نشانگر ژنتیکی شناخته می‌شود (بنابازی، 1381). چند شکلی بودن و توارث پذیری از جمله شرایط لازم برای یک نشانگر ژنتیکی می‌باشند.
از مهم‌ترین ویژگی‌های یک نشانگر برتر می‌توان به این موارد اشاره نمود (نقوی، 1388) :
تشخیص آسان همه فنوتیپ‌های ممکن (افراد هتروزیگوت و افراد هموزیگوت).
نداشتن تاثیر روی آلل های موجود در سایر جایگاه‌های ژنی نشانگر (نداشتن اپیستازی).
تظاهر در مراحل اولیه نمو.
حداقل بودن یا عدم اثر متقابل با نشانگرهای دیگری که می‌توانند به طور هم زمان در یک جمعیت در حال تفرق مورد استفاده قرار گیرند.
پیوستگی بسیار نزدیک با ژن‌های مورد نظر.
توارث پذیری کامل.
آسان بودن اندازه گیری.
2-7-1 نشانگرهای ریخت شناسیبه علائمی گفته می‌شوند که به طور مستقیم در فنوتیپ فرد قابل تشخیص بوده و توارث پذیرند، مانند تعداد فلس‌ها روی خط جانبی، اتولیت ها و شکل زوائد پیلوریک و از این دست پارامترها که به راحتی قابل ردیابی هستند. این نشانگرها غالبا تحت تاثیر محیط قرار داشته و متاثر از سن هستند. اگرچه نشانگرهای ریخت شناسی در علوم زیستی مورد استفاده قرار گرفته‌اند، ولی دارای محدودیت‌های اساسی هستند و به همین دلیل توجه محققین به انواع دیگری از نشانگرها جلب شده است (مردانی، 1372).
2-7-2 نشانگرهای فیزیولوژیکیمطالعات مربوط به تولید شیر نشان می‌دهند که افزایش تولید شیر با افزایش سطح برخی از هورمون‌ها در پلاسما همراه است. پس میزان این هورمون‌ها می‌تواند به عنوان یک نشانگر فیزیولوژیک محسوب شود. اشکال نشانگرهای فیزیولوژیک این است که این نشانگرها (از جمله سطح هورمون‌ها در پلاسمای خون) علاوه بر ژن‌ها به شدت تحت تاثیر محیط داخلی، سن و جنس حیوان هستند (مردانی، 1372).
2-7-3 نشانگرهای سیتوژنتیکیدر بسیاری از موجودات زنده تفاوت‌های گسترده کروموزمی مشاهده می‌شوند که می‌توانند به عنوان نشانگر به کار روند. تلوسنتریک ها، ایزوکروموزوم ها، جابجائی ها و الگوهای نواربندی از جمله این نشانگرها می‌باشند (مردانی، 1372).
2-7-4 نشانگرهای پروتئینی برآورد شده است که 20 تا 50 درصد ژن‌های یک موجود حاوی اطلاعات کدکننده پروتئین‌ها می‌باشند. تنوع و گوناگونی یک پروتئین معین حاصل جابجایی و یا جایگزینی اسیدهای آمینه زنجیره پلی پپتیدی است. این تفاوت‌ها بار الکتریکی و در نتیجه حرکت پروتئین بر حسب نوع و تعداد اسیدهای آمینه جابه جا شده را تغییر می‌دهند. وجود پروتئین‌های چند شکل یا تغییر در اسید آمینه یک پروتئین نشان دهنده جابجایی و یا جایگزینی نوکلئوتیدها در زنجیره DNA بر اثر جهش می‌باشد. این تغییر در اسیدهای آمینه پروتئین و نوکلئوتیدهای یک ژن، نقش اساسی فرآورده ژن را تغییر نمی‌دهد بلکه محصولی را به وجود می‌آورد که با محصول ژن جهش نیافته متفاوت نبوده و این تغییر نشان دهنده جهش در زنجیره DNA است. از معایب نشانگرهای پروتئینی این است که تعداد نشانگرهای پروتئینی محدود است. چند شکلی در این نشانگرها چندان زیاد نیست. فنوتیپ‌های الکتروفورزی در آن‌ها پیچیده است (بنابازی، 1381). تحت تاثیر تغییرات پس از ترجمه هستند و تظاهر کمی، برخی از آنزیم‌ها و پروتئین‌ها تحت تاثیر مرحله رشد قرار می‌گیرد (نقوی، 1388).
2-7-5 نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولیبا مقایسه ردیف بازهای مولکول DNA در کروموزوم‌های دو فرد هم گونه در می‌یابیم که اکثر جفت بازها یکسان می‌باشند. مناطق معینی که تفاوت‌های ردیفی در آنها به وقوع می‌پیوندند را تحت عنوان نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولی می‌شناسیم. به عبارت دیگر این نوع تغییرات انعکاس دهنده مستقیم تنوع در ساختار ژنتیکی (ساختمان DNA) هستند. وقتی تغییرات DNA در درون ژن‌ها رخ می‌دهند، توانایی تاثیر روی عمل ژن‌ها و در نتیجه فنوتیپ فرد را دارا می‌باشند ولی اکثر نشانگرهای مولکولی با یک فنوتیپ قابل مشاهده همراه نیستند و بایستی این تغییرات را از طریق آنالیز مستقیم DNA مطالعه نمود (امتیازی و کریمی، 1384).
نشانگرهای مولکولی به دو دسته تقسیم می‌شوند:نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR.نشانگرهای مولکولی غیرمبتنی بر PCR.
2-8 نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمرازواکنش زنجیره‌ای پلیمراز که معمولا به طور اختصار PCR خوانده می‌شود روشی بسیار قوی است که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در کمتر از نیم روز امکان پذیر می‌کند. اما این فرایند هنگامی امکان پذیر است که دست کم ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه دی. ان. ای مورد نظر معلوم باشد (نقوی، 1388). در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانند سازی دی. ان. ای در طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه مورد نظر DNA هستند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‌گیرند تا واکنش آنزیمی همانند سازی دی. ان. ای در درون لوله آزمایش امکان پذیر شود. این همانندسازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‌های پلیمراز صورت می‌گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم‌ها به صورت تجاری در دسترساند (نقوی، 1388).
این واکنش از آن روی ارزشمند است که عمل آن بسیار اختصاصی است و به سادگی ماشینی شده و قادر است عمل تکثیر را از مقادیر فوق العاده کم DNA الگو آغاز کند. به کمک این روش می‌توان نزدیک به 5 کیلو باز از ژنوم را بدون هیچ مشکلی تکثیر نمود. از روش PCR بیشتر در نقشه یابی DNA، انتخاب به کمک شناساگرها و همچنین در فیلوژنیک مولکولی استفاده می‌شود. همچنین از PCR می‌توان برای تکثیر DNA‌های به وجود آمده از RNA ها نیز استفاده نمود. نشانگرهای DNA تفاوت قابل ملاحظه‌ای با نشانگرهای پروتئینی و مورفولوژیک داشته و دارای مزایای به شرح زیر می‌باشد:
دقت و سهولت تعقیب آن‌ها.
امکان به کارگیری آن‌ها در مراحل اولیه زندگی.
فراوانی فوق العاده این نشانگرها.
امکان استفاده برنامه‌های کامپیوتری برای تجزیه و تحلیل نتایج.
عدم تاثیرپذیری از شرایط داخلی و خارجی موجود (نقوی، 1388).
2-9 واکنش رنجیره ای پلیمراز (PCR)بی تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. این تکنیک در سال 1985 به وسیله کری مولیس و همکارانش ابداع شد و اکنون کاربردهای نامحدودی در تمامی حوزه‌ها یافته است (امتیازی و کریمی، 1384). این تکنیک ساده امکان ایجاد رونوشت‌هایی نامحدود از قطعات خاصی از DNA را فراهم می‌نماید. DNA ی الگو که PCR روی آن انجام می‌گیرد، می‌تواند DNA ی ژنومی (که از گلبول‌های سفید خون یا نمونه‌ای از طحال یا هر بافت دیگری استخراج گردیده است) و یا قطعه‌ای از DNA (از هر منبعی) باشد. PCR تقریبا یک میلیون رونوشت از قطعه‌ای کوچک از DNA ی الگو ایجاد می‌نماید که این مقدار برای استفاده در هر نوع مطالعه ژنتیکی (ردیف یابی، انتقال ژن، هضم آنزیمی و غیره) کافی است. قبل از انجام PCR لازم است ردیف قطعه‌ای که باید تکثیر شود و یا حداقل ردیف هر دو انتهای آن شناسایی گردد. با استفاده از این ردیف‌ها دو قطعه چند نوکلئوتیدی که هر یک حدود 20 باز طول دارند، طراحی و ساخته می‌شود که یکی از آن‌ها مکمل پایانه '3 یکی از رشته‌های قطعه‌ای است که تکثیر خواهد شد و دیگری نیز مکمل پایانه '3 رشته دیگر می‌باشد. وجود این دو قطعه چند نوکلئوتیدی برای شروع سنتز رشته‌های جدید DNA لازم است و آن‌ها را آغازگر می‌نامند. DNA الگو، آغازگرها، مقداری دئوکسی نوکلئوتیدها شامل گوانین (G)، سیتوزین (C)، تیمین (T) و آدنین (A) در داخل تیوپ کوچکی ریخته می‌شود برای اینکه DNA الگو واسرشته شود، مخلوط واکنش را در دمای 95  درجه سانتی گراد قرار می‌دهند. آنزیم DNA پلیمراز می‌تواند دمای بالا را تحمل کند. شکل رایج این آنزیم، Taq پلیمراز است که از باکتری گرمادوست به دست می‌آید. پس از مرحله واسرشته سازی، دما به حدود 60-50 درجه سانتی گراد کاهش پیدا می‌کند تا آغازگرها به ردیف‌های مکمل مربوطه متصل شوند. این مرحله را جفت شدن می‌گویند. به محض اتصال آغازگرها، دما به حدود 70 درجه سانتی گراد افزایش می‌یابد. این دما برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز مناسب است. این مرحله بسط نامیده می‌شود. آنزیم از انتهای '3 هر آغازگر ساخت و بسط رشته جدید را آغاز می‌نماید. پس از طی زمان کافی برای ساخت رشته‌های جدید، مجددا دما به 95 درجه سانتی گراد افزایش می‌یابد و به‌این‌ترتیب چرخه‌ای جدید از واکنش آغاز می‌گردد و سه مرحله قبلی این بار روی DNA دو رشته‌ای جدید صورت می‌گیرد و این رشته‌ها خود به عنوان الگو برای چرخه‌های بعدی عمل خواهند کرد (امتیازی و کریمی، 1384). طول هر چرخه تکثیر حدود 5 دقیقه است (15 ثانیه برای واسرشته سازی، 30 ثانیه برای جفت شدن و 90 ثانیه برای بسط به علاوه حداقل زمان مورد نیاز برای تغییر دماها در بین مراحل که حدود 30 تا 60 ثانیه برای هر تغییر لازم است) (امتیازی و کریمی، 1384).
چرخه‌های تکثیر معمولا در ماشین‌های PCR که از نظر طول و دمای هر مرحله در هر چرخه دقیقا قابل برنامه ریزی و کنترل هستند، انجام می‌گردد. تعداد چرخه‌ها 30 تا 35 بار می‌باشد. نتیجه این تعداد چرخه بین 230 تا 235 رونوشت از قطعه مورد نظر است که معادل حدود یک میلیون قطعه مشابه می‌باشد (این مقدار فراورده PCR نامیده می‌شود). در عمل، این تکثیر نمایی کامل نیست ولی احتمال رسیدن به حداقل یک میلیون بار تکثیر و در نتیجه به دست آوردن یک میکروگرم فراورده PCR بسیار زیاد است (امتیازی و کریمی، 1384).
2-9-1 بافر RCRاین بافر معمولا شامل Tris با 8/8-3/8 pH = و یک نمک مثل کلرید پتاسیم (KCl) یا سولفات آمونیوم می‌باشد. این بافر می‌تواند حاوی افزودنی‌هایی مانند Tween 20، Triton X-100، DMSO (دی متیل سولفوکساید) و ژلاتین باشد که کارایی RCP را افزایش می‌دهند (فرسون و همکاران، 2000 ). این بافر معمولا به صورت 10x تهیه و همراه با آنزیم نک پلیمراز ارائه می‌گردد. غلظت مناسب آن در واکنش معمولا 1X می‌باشد. KCl به اتصال آغازگر به DNA الگو کمک می‌کند اگرچه در غلظت‌های بالا این عمل ممکن است بیش از حد مطلوب گردد و باعث پایداری اتصال غیر اختصاصی آغازگر به DNA الگو و ایجاد محصولات ناخواسته شود (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-2 کلرید منیزیم (Mgcl2)از اجزا به سیر مهم PCR است و غلظت بهینه آن در کارایی واکنش نقش مهمی دارد. با افزایش غلظت یون منیزیم (Mg+2) قدرت اتصال آغازگرها افزایش می‌یابد و به دمای اتصال بالاتری نیاز است و احتمال تشکیل پرایمر-دایمر اقزایش می‌یابد و این امر موجب اتصال آغازگرها به صورت دوتایی با یکدیگر یا به صورت حلقوی با خودشان شده و در اثر تکثیر غیر اختصاصی آن‌ها، تجمعی از قطعات کوچک به وجود می‌آید. مقداری از آغازگرها نیز بدین ترتیب از واکنش خارج می‌شوند. افزایش غلظت یون منیزیم موجب افزایش دمای مرحله واسرشته سازی و افزایش فعالیت پلیمرازی آنزیم تک پلیمراز (این آنزیم برای فعالیت پلیمرازی خود به یون آزاد Mg+ نیاز دارد) می‌شود. همچنین یون منیزیم با نوکلئوتیدها ترکیب می‌شود و کمپلکس محلولی را به وجود می‌آورد که برای ورود و جایگزین شدن آن‌ها در زنجیره DNA بسیار لازم است. در صورتی که در غلظت‌های بسیار پایین بازده واکنش کم خواهد شد. غلظت منیزیوم آزاد تحت تاثیر غلظت dNTP ها، پیروفسفات آزاد (PPi) و EDTA می‌باشد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-3 دی اکسی نوکلئوتیدها (dNTPs)نوکلئوتیدها واحدهای سازنده DNA هستند و از مواد مهم مورد نیاز واکنش PCR می‌باشند. آنزیم‌های DNA پلیمراز ساخت زنجیره پلی نوکلئوتیدی را از این مونومرها یا واحدها کاتالیز می‌کنند. در واکنش PCR نیز همانند سنتز طبیعی DNA از چهار نوع نوکلئوتید به فرم دی اکسی (dTTP، dGTP، dCTP، dATP) استفاده می‌شود. این نوکلئوتیدها معمولا به طور جداگانه یا مخلوط به صورت تجاری در دسترس هستند. باید از غلظت برابر نوکلئوتیدها استفاده شود در غیر این صورت اشتباه جایگزینی رخ می‌دهد و ممکن است باعث تفاوت توالی فرآورده PCR با توالی الگو شود. کیفیت و مقدار dNTP مورد استفاده در کارایی و اختصاصی بودن PCR موثر است. چنانچه مقدار dNTP بیشتر از نیاز واکنش باشد امکان تشکیل نقاط آغازین اشتباه و تشکیل قطعات غیر اختصاصی وجود دارد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-4 آنزیم تک پلیمرازاین آنزیم به شکل طبیعی یا نوترکیب تولید می‌شود و از سایر انواع DNA پلیمرازها معروف‌تر است و بیشتر از آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آنزیم با شناسایی انتهای آزاد هیدروکسیل '3 آغازگر، نوکلئوتیدها را به ترتیب ارائه شده از روی زنجیره مکمل به آن متصل می‌کنند و یک رشته DNA مکمل رشته الگو می‌سازد. سرعت اتصال نوکلئوتیدها و حرکت آنزیم پلیمراز در انواع مختلف این آنزیم متفاوت بوده و بین 5 الی 80 نوکلئوتید در ثانیه می‌باشد. اگر غلظت آنزیم زیاد باشد قطعات غیراختصاصی در فراورده PCR دیده خواهد شد که گاهی به صورت کشیدگی مشاهده می‌شود و در صورتی که مقدار آنزیم کمتر از حد مورد نیاز واکنش باشد، فرآورده مورد نظر به اندازه کافی تولید نمی‌شود و به ویژه در موارد تشخیصی نتایج منفی کاذب را به وجود می‌آورد (فرسون و همکاران، 2000 ).
2-9-5 آغازگرهادر طی واکنش PCR، آغازگرها به دو طرف توالی هدف اتصال یافته و امکان آغاز فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می‌آورند. مهم‌ترین ویژگی آغازگر، توالی صحیح آن برای مکان مورد تکثیر می‌باشد. با در اختیار داشتن توالی هدف امکان تعیین توالی آغازگرها به وجود می‌آید. طول آغازگر نیز مهم است و طول مناسب از اتصال آغازگر به مناطق غیر هدف می‌کاهد. طویل بودن پرایمر (پرایمرهای با بیش از 30 جفت باز) امکان اتصال آن‌ها به خود و به یکدیگر را تشدید می‌کند و زمان اتصال را نیز افزایش می‌دهد. در طراحی آغازگرها نکات متعددی مانند طول آغازگر، ترکیب نوکلئوتیدی (محتوای GC)، دمای ذوب (Tm) و غیره را باید در نظر داشت (فرسون و همکاران، 2000 ). برای طراحی آغازگرها نرم افزارهای متعددی وجود دارد که می‌توان به DNA MAN، DNASIS و Oligo tech اشاره نمود.
2-10 چند شکلی فضایی رشته‌های منفردSSCP) )این روش در سال 1989 ابداع شد. در الکتروفورز SSCP، ابتدا از یک ماده واسرشته ساز مانند اوره استفاده می‌شود تا DNA ی دو رشته به DNA ی تک رشته‌ای تبدیل شود. به هنگام راندن DNA ی تک رشته‌ای روی ژل اثرات متقابل درون مولکولی روی می‌دهد. به عبارت دیگر بین بخش‌هایی از این DNA پیوند ایجاد می‌شود و ساختمان ثانویه‌ای تشکیل می‌دهد. بنابراین حرکت مولکول‌های DNA در این حالت به جای اینکه تابع اندازه مولکول باشد به ساختمان ثانویه DNA ی تک رشته‌ای بستگی دارد. در طی الکتروفورز، این ساختمان‌ها که به توالی رشته مورد نظر بستگی دارد به وسیله برودت حفظ می‌شود. اگر در این توالی جهشی رخ داده باشد، نوع پیوندهایی که تشکیل می‌شوند متفاوت بوده و باند مربوطه روی ژل نیز متفاوت خواهد بود. در صورتی که چند شکلی در قسمت ابتدائی محصول PCR باشد، تشخیص آن از طریق SSCP آسان‌تر است. عواملی مثل دمای ژل (نباید بالا باشد)، درصد ژل اکریل آمید (5 تا 6 درصد مناسب است) و اندازه قطعه DNA مورد بررسی (معمولا بین 100 تا 250 جفت باز و ایده آل 155 جفت باز) در موفقیت SSCP نقش دارد (رضوانی، 1997).
2-11 مروری بر برخی پژوهش‌های انجام شده:طبق مطالعات انجام شده مشخص شد که ساختار ژن هورمون رشد در بین ماهیان استخوانی یکسان نیست. به طور مثال، در کپور ماهیان همانند پستانداران، این ژن دارای پنج اگزون و چهار اینترون است اما در دیگر ماهیان متفاوت بوده و دارای یک اگزون اضافی است (اهکوبو و همکاران، 1996). جهش‌های موجود در نواحی مختلف ژن‌ها همواره مورد توجه بسیاری از متخصصان علم اصلاح نژاد بوده است. ارتباط چند شکلی این ژن‌ها با خصوصات فنوتیپی برای مثال رشد به طور وسیعی در دیگر حیوانات مورد بررسی قرار گرفته و مطالعاتی محدود نیز در مورد ماهی انجام شده است (گروس و نیلسون، 1999).
طبق پژوهش‌های گروس و نیلسون (1999) تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان مورد بررسی قرار گرفت. تعداد نمونه‌های مورد بررسی در این پژوهش 579 ماهی از 22 جمعیت مختلف بود که از شمال اروپا تهیه و به روش PCR-RFLP و با استفاده از 10 نوع آنزیم تنوع این ژن مورد مطالعه قرار گرفت که سه نوع هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد.
اندازه‌های چهار اگزون در طول دوره تکامل بدون تغییر باقی مانده‌اند به جز اگزون 5 که به دو قسمت تبدیل شده است به طوری که دو نوع ساختار ژن هورمون رشد را در ماهیان استخوانی به وجود آورده است. برای مثال، خانواده کپور ماهیان دارای پنج اگزون و گونه‌های دیگر همانند آزاد ماهیان و سوف ماهیان دارای شش اگزون می‌باشند (آلمولی و همکاران، 2000). در ضمن، در ماهیان دو نوع متفاوت از ژن هورمون رشد شامل GH-1 و GH-2 برای مثال در ماهیانی نظیر آزاد اطلس نیز گزارش شده است (تائو و بولدینگ، 2003).
این ژن به صورت موفقیت آمیزی در گونه سیم دریایی (کالدوچ گینر و همکاران، 2003) و ماهی تیلاپیا (کاجیمورا و همکاران، 2004) و چندین گونه دیگر کلون شده است. ولی در خصوص چندشکلی این ژن و ارتباط آن با میزان رشد در ماهیان گزارشی مشاهده نشده است. در حیوانات دیگر پژوهش‌های زیادی به عمل آمده است که ارتباط بسیار زیاد این ژن با میزان رشد فنوتیپی را نشان می‌دهد.
پریمر و رینانن (2004) در پژوهشی تنوع ژن GH-1 در ماهی قزل آلای رنگین کمان را به روش PCR-RFLP بررسی و SNP را شناسایی کردند. از تعداد 9 جمعیت مختلف شامل 2 جمعیت از شمال آمریکا و 7 جمعیت در اروپا نمونه برداری شده بود. چند شکلی مشاهده شده در مناطق بالا دست و پایین دست ژن هورمون رشد، اینترون 3 و اینترون 4 نشان دهنده اختلاف بین جمعیت‌های آمریکای شمالی و اروپا بود.
مو و همکاران (2004) در هفت جمعیت کپور وحشی، هفت نوع الگو (A، B، C، D، E، F و G) در ناحیه اینترون 2 ژن GH-1 به روش PCR-SSCP شناسایی کردند که طول آن‌ها به ترتیب 189، 196، 204، 205، 206، 207 و bp 209 بود.
کوخر و کهلمن (2011) چندشکلی‌های ژن هورمون رشد در لای ماهی از خانواده کپور ماهیان را بررسی کردند. پژوهش‌های آن‌ها نشان داد این ماهی مانند همه کپور ماهیان دارای چهار اینترون و پنج اگزون می‌باشد و با دو روش PCR-RFLP و تعیین توالی، اختلاف موجود در ساختار ژنتیکی ژن هورمون رشد در تعداد 17 نمونه از دو جمعیت مختلف مورد بررسی قرار دادند. از 14 چندشکلی مشاهده شده از 12 جایگاه در منطقه اینترون و 2 جایگاه در منطقه اگزون، در مجموع 13 هاپلوتیپ مختلف در جمعیت‌های مورد مطالعه مشاهده شد که کل جمعیت را به دو کلاس اروپای شرقی و اروپای غربی تقسیم نمود.
نی و همکاران (2012) در یک جمعیت از ماهی کراکر زرد، نتایج PCR-SSCP دو هاپلوتیپ از اینترون 1 را به نام ژنوتیپ های AA و AB نشان دادند. در AB، یک چند شکلی تک نوکلئوتیدی (SNP) در موقعیت 196 (G→A) مشاهده شد که با وزن بدن همبستگی منفی و با طول/ ارتفاع استاندارد بدن همبستگی مثبت داشت. در جمعیت دیگر، دو ژنوتیپ مختلف CC و CD در اینترون 2 شناسایی شدند که در CD یک SNP در موقعیت 692 (T→C) مشخص شد. ژنوتیپ CD همبستگی مثبت قابل توجهی با وزن کل و طول بدن داشت.
تیان و همکاران (2014) چندشکلی ژن GH و ارتباط آن با صفات رشد را در 282 نمونه ماهی سوف چینی مورد بررسی قرار دادند. با استفاده از توالی‌یابی، چهار SNP در ژن GH شناسایی شد که دو جهش در اینترون 4، یک جهش در اگزون 5 و یک جهش در اینترون 5 رخ داده بود که سه جهش از آن‌ها ارتباط مثبت معنی داری را با رشد نشان دادند.

فصل سوممواد و روش‌ها3-1 نمونه بردارینمونه برداری از 150 قطعه ماهی سفید از کارگاه شهید رجایی و 150 قطعه ماهی کپور معمولی از کارگاه پرورش ماهی نصر ساری انجام شد. ماهی سفید از دوره هچری به سالن تکثیر منتقل و تا 3 ماهگی نگهداری شدند. سپس از آن‌ها نمونه گیری شد و تمامی آن‌ها در سن 3 ماهگی بودند ولی در ماهی کپور 84 قطعه از آن‌ها در سن 4 ماهگی، 54 قطعه در سن 12 ماهگی، 5 قطعه ماهی در سن 24 ماهگی و 7 قطعه ماهی در سن 6 ماهگی بودند. نمونه گیری به میزان 3-2 گرم از بافت باله دمی ماهی سفید و کپور معمولی انجام شد. نمونه‌های باله دمی در الکل 96 درصد فیکس شده و سپس تا زمان استخراج DNA در دمای 20- درجه سانتیگراد قرار داده شدند. نمونه‌های جمع آوری شده به آزمایشگاه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی دام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل شده و DNA ژنومی استخراج گردید.
3-2 بررسی فاکتور وضعیتیکی از شاخص‌های رشد فاکتور وضعیت است که ضریب چاقی نیز نامیده می‌شود. برای به دست آوردن آن طول کل که فاصله پوزه تا انتهای باله دمی است؛ بر حسب سانتی متر اندازه گیری شد. وزن ماهی نیز به وسیله ترازو دیجیتالی بر حسب گرم اندازه گیری شد. فاکتور وضعیت یا ضریب چاقی برابر است با:
CF= W/L3 *100
W: وزن و L: طول بدن می‌باشد.
3-3 استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافتهاستخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته (میلر و همکاران، 1988) انجام شد. قبل از شروع استخراج تمام بافرها تهیه و مواد و وسایل مورد نیاز برای استخراج آماده و جهت ضدعفونی اتوکلاو شد.
3-3-1 طرز تهیه بافرهای استخراج DNA برای تهیه بافر STE 7/0 گرم تریس، 2/0 گرم نمک 07/0 مولار را با cc50 آب مقطر حل کرده، سپس 100 میکرولیتر محلول EDTA 5/0 مولار به آن اضافه می‌شود. برای تهیه EDTA 5/0 مولار، 3/9 گرم پودر EDTA را با cc50 آب مقطر حل کرده و pH آن به 8 می‌رسد، برای تنظیم pH از دستگاه pH متر، برای کاهش pH از HCl و برای افزایش pH از NaoH استفاده می‌شود. برای تهیه SDS و استات آمونیوم 10% بایستی به نسبت 1 به 10 پودر آن با آب مقطر حل شود. برای تهیه استات سدیم 3 مولار، بایستی 3/12 گرم پودر آن با cc 50 آب حل شود.
سی میلی گرم از باله را جدا کرده و در محیط بیرون قرار داده تا الکل آن تبخیر شود، سپس آن را خرد نموده و در تیوپ‌های 5/1 میلی لیتری ریخته و به آن 500 میکرولیتر بافر STE برای انفجار سلولی، 50 میکرولیتر بافر SDS 10% برای هضم چربی‌های موجود در بافت و 6-5 میکرولیتر پروتئیناز K برای هضم پروتئین‌ها اضافه شد. سپس نمونه‌ها را به خوبی ورتکس کرده و به مدت یک ساعت روی دستگاه شیکر با سرعت 90 قرار داده تا این مواد به طور کامل با هم مخلوط گردد و در نهایت به مدت 16 ساعت در بن ماری با دمای 58 درجه سانتی گراد گذاشته تا بافرها بهتر عمل کرده و عمل لیز شدن و هضم آنزیمی به خوبی انجام شود. پس از بیرون آوردن آن‌ها از بن ماری 160 میکرولیتر استات آمونیوم 10% به نمونه‌ها اضافه نموده و به مدت یک ساعت روی شیکر با سرعت 90 قرار داده شد تا خوب مخلوط شود و بعد به مدت 10 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. پس از پایان سانتریفیوژ دو فاز درون تیوپ تشکیل می‌شود، فاز زیرین حاوی بافت خرد شده باله و چربی و پروتئین بافت است و فاز بالایی حاوی DNA می‌باشد. به آرامی فاز بالایی را جدا کرده و درون تیوپ‌های جدید ریخته شد. به مایع درون تیوپ‌های جدید 600 میکرولیتر الکل ایزوپروپانول یا الکل مطلق سرد و 30 میکرولیتر استات سدیم اضافه شده (در این حالت کلاف شفافی در تیوپ قابل مشاهده است که همان DNA می‌باشد). سپس نمونه‌ها به مدت 40-30 دقیقه در یخچال C°20- نگهداری شده، بعد به مدت چند دقیقه از یخچال بیرون آورده تا یخ آن آب شود. نمونه‌ها را به مدت 15 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ کرده، سپس محلول را دور ریخته و تیوپ حاوی DNA را با 100 میکرولیتر الکل 70% شستشو داده و به مدت 2 دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ شد. مجددا محلول رویی را دور ریخته و تیوپ‌ها در دمای آزمایشگاه کاملا خشک شده و سپس 50 میکرولیتر آب مقطر یا بافر TE به تیوپ حاوی DNA اضافه نموده و در یخچال C°20- تا زمان ازمایش نگهداری شدند.
3-4 تعیین ویژگی‌های کمی و کیفی DNA استخراج شده:به منظور تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده دو روش استفاده می‌شود:
الف) ژل آگارز.
ب) دستگاه اسپکتروفتومتر.
در این پژوهش به منظور بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از ژل آگارز استفاده شد.
3-4-1 ژل آگارز آگارز یک پلیمر خطی است و از زیر واحدهای L ,D گالاکتوز که با پیوندهای گلیکوزیدی 3→1α و 4→1β به یکدیگر پیوسته‌اند، درست شده است. برخی از آگارزها دارای اندکی ناخالصی آنیونی همچون سولفات و پیروات هستند. هر چه ناخالصی ژل کمتر باشد توان آن برای جداسازی DNA بیشتر می‌شود. اندازه روزنه‌ها در زمینه ژل به غلظت آگارز وابسته است. به گونه‌ای که در غلظت زیاد آگارز، روزنه‌ها کوچک می‌شوند. با توجه به غلظت‌های آگارز می‌توان تکه‌هایی از 5/0 تا 50 کیلو باز جدا سازی کرد. اندازه مولکول‌های DNA، غلظت آگارز، ساختار فضایی DNA، ولتاژ بکار رفته شده، نوع آگارز و توان یونی بافر الکتروفورزی که به کار گرفته می‌شود، از سازه‌های کارآمد برای جدا سازی DNA در ژل آگارز هستند (لی و همکاران، 2012).
شکل 3-1 دستگاه الکتروفورز افقی3-4-2 رنگ آمیزی ژل آگارز در این پژوهش رنگ آمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید انجام پذیرفت. اتیدیوم بروماید یک رنگ فلورسانت است که دارای یک گروه سه حلقه‌ای بوده که می‌تواند در بین بازهای DNA جای گیرد. روش کار به‌این گونه است که پرتو فرابنفش به وسیله اسید نوکلئیک گرفته شده و به اتیدیوم بروماید می‌رسد. این پرتو در طول موج 302 تا 366 نانومتر به وسیله اتیدیوم بروماید پیوسته به اسیدنوکلئیک دریافت شده و دوباره به وسیله اتیدیوم بروماید در طول موج 590 نانومتر بازتاب می‌یابد. این طول موج در گستره روشنایی سرخ نارنجی پرتویی آشکار می‌باشد که می‌توان آن را دید. برای انجام این کار مقدار 3 میکرو لیتر دیانای و 2 میکرولیتر بافر بارگذاری را روی کاغذ پارافیلم با هم مخلوط کرده و داخل چاهک ژل آگارز قرار داده شد. بعد از بار گذاری تانک الکتروفورز را به یک منبع الکتریکی وصل کرده و ولتاژ دستگاه را روی 85 ولت تنظیم شد. نمونه‌ها به مدت 60 تا 90 دقیقه درون ژل آگارز موجود در تانک در حرکت بودند. سپس ژل را از داخل تانک الکتروفورز برداشته و به مدت 5 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و جهت مشاهده باندها و تعیین کیفیت دیانای، از دستگاه ژل داک استفاده شد. اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری در جدول 3-1 نشان داده شد (لی و همکاران، 2012).
جدول 3-1 اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاریمواد استفاده شده مقدار مواد (میکرولیتر)
گلیسرول
برموفنول آبی (10 درصد)
فرمامید
EDTA(5/0 مولار) 190
10
800
2
3-5 تعیین غلظت DNA استخراج شده با استفاده از اسپکتوفتومتربرای بررسی غلظت DNA استخراج شده از دستگاه اسپکتوفتومتر استفاده شد. برای این منظور ابتدا میزان رقت DNA مشخص شد (مثلاً 100 برابر یا بیشتر). دستگاه برای دو طول موج 260 و 280 نانومتر تنظیم و به تعداد نمونه لوله استریل در آماده شد. با توجه به حجم کووت دستگاه و میزان رقت در لوله‌ها از بافر TE یا آب مقطر استفاده و DNA مورد نیاز به لوله‌ها اضافه شد (با توجه به ضریب رقت). ابتدا دستگاه با بافر TE یا آب مقطر کالیبره شد. لوله حاوی DNA رقیق شده چند بار وارونه شد. کووت دستگاه که برای بررسی غلظت DNA از آن استفاده می‌شود با بافر TE یا آب مقطر شسته می‌شود. DNA رقیق شده موجود در لوله را در کووت دستگاه قرار داده و OD های 260 و 280 نانومتر به اضافه نسبت دو طول موج یاداشت شد (OD260 مربوط به جذب DNA و OD280 مربوط به جذب پروتئین می‌باشد). اگر این نسبت کمتر از 8/1 باشد نشان دهنده آلودگی با پروتئین و یا دیگر ناخالصی‌ها می‌باشد و اگر این نسبت بیشتر از 2 باشد نشان دهنده آلودگی DNA با RNA است. برای به‌دست آوردن غلظت DNA مورد نظر از فرمول زیر استفاده شد.
ضریب رقت
*عدد بدست آمده غلظت DNA استخراج شده بر حسب نانو گرم بر میکرو لیتر می‌باشد که بسته به مقدار نیاز در واکنش PCR از آن استفاده می‌شود.
3-6 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)3-6-1 پروتکل و مواد استفاده شده در PCR
مواد مورد نیاز برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلی مراز برای نشانگر استفاده شده در این تحقیق در جدول 3-2 نشان داده شد:
جدول 3-2 مواد استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمرازمواد غلظت مواد مقدار در حجم 20 میکرولیتر
دیانای الگو
آغازگر (*F)
آغازگر (**R)
مستر میکس***
آب مقطر 120 نانوگرم
20 پیکومول
20 پیکومول
-
- 5/1
1
1
10
5/6
*Forward **Backward ***Master Mix
3-6-2 مراحل PCRقبل از انجام پی سی آر، آغازگرها با توجه به دستور العمل شرکت سازنده آن‌ها با میزان آب مقطر مشخص شده بر حسب میکرولیتر رقیق شدند تا غلظت آن‌ها به 100 پیکومول برسد. سپس به مدت 24 ساعت در شرایط یخچال نگهداری شدند تا کاملا حل شوند. سپس تیوب‌های مورد استفاده بعد از استریل کردن، شماره خورده و به منظور جلوگیری از پاک شدن شماره‌ها برچسب نصب شدند. تمام اجزای واکنش (به غیر از DNA که در تیوپ‌های جداگانه ریخته شدند) با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده برای پی سی آر به صورت مخلوط در تیوب جدا گانه ریخته شدند. لازم به ذکر است که در تهیه مخلوط اصلی واکنش، با توجه به تعداد نمونه‌های استفاده شده در پی سی آر یک ضریب خطا در نظر گرفته شد. بعد از تهیه مخلوط اصلی، مقدار 5/18 میکرولیتر از آن، به هر یک از تیوپ‌های حاوی 5/1 میکرو لیتر DNA افزوده شده تا حجم کل مخلوط واکنش در هر تیوب به 20 میکرو لیتر برسد. به منظور مخلوط شدن اجزای تشکیل دهنده واکنش، تیوب‌ها به مدت 15 ثانیه و با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. بعد از سانتریفوژ تیوپ‌ها برای انجام پی سی آر در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شدند.

شکل 3-2 دستگاه ترموسایکلر3-6-3 تنظیم سیکل‌های حرارتی PCR
همانند سازی و تکثیر توالی مورد نظر در پی سی آر در طی سه مرحله انجام می‌پذیرد:3-6-3-1 واسرشته سازی قطعه الگو
پیوندهای هیدروژنی که در واقع اتصال دهنده دو رشته DNA هستند در دمای 95-93 درجه سانتی‌گراد تخریب می‌شوند بنابراین در این حرارت دو رشته DNA الگو از هم جدا می‌شوند. پس از تک رشته‌ای شدن DNA الگو، آغازگر و سایر مواد شرکت کننده در واکنش، فعالیت خود را آغاز می‌کنند.
3-6-3-2 اتصال آغازگرها: در این مرحله آغازگرها به رشته DNA الگو می‌چسبند. دمای اتصال با توجه به دمای ذوب آغازگرها تنظیم می‌شود که معمولا بین 50 تا 65 درجه سانتی گراد می‌باشد. آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش برای ژن هورمون رشد در بر گیرنده قسمتی از اگزون 4 و اینترون 4 و اگزون 5 به طور کامل هستند (گروس و همکاران،1996).
جدول 3-3 توالی آغازگر اختصاصی برای جایگاه GHمنبع نام جایگاه توالی نوع پرایمر
گروس و همکاران
،1996 GH 5'-GGAAGCTTAACCCCAACCAGCTCACTGAGAA-3' رفت

–298

فصل اول: مقدمه1ـ1 مقدمهرزینهای اپوکسی مانند هر پلیمر دیگری تحت شرایط تولید، افزودنیها و دما قرار میگیرند و این عوامل روی خواص فیزیکی و شیمیایی آنها اثرگذار است. باتوجه به گسترش استفاده از این نوع رزینها تلاش میشود که خواص آنها بسته به نوع کاربردشان حفظ شده و یا بهبود یابد.

1ـ2 بیان مسألهرزینهای اپوکسی پلیمرهایی گرماسخت هستند که کاربرد وسیعی در رنگ، چسب، پوششها، ایمپلنتهای پزشکی، صنایع الکتریکی و ابزارآلات پلیمری دارند (اودگارد، 2013). این رزینها از دو پایه مختلف; رزین اپوکسی و عامل پخت تشکیل شدهاند. عامل پخت از نوع آمینها، انیدریدها و یا تیولها میتواند باشد. هنگامی که رزین اپوکسی سخت میشود ساختار شبکهای سه بعدی پیدا میکند که پلیمرهای حاصل دارای پایداری گرمایی خوب و مدول نسبتاً بالا و چسبندگی عالی هستند )کینلوچ و همکاران، 2014؛ چن و همکاران، 2013؛ بن صالح و همکاران، 2014؛ ممانی و همکاران، 1391).
ساختار شبکهای بالا باعث میشود که رزین سخت و شکننده و دارای مقاومت ضربهپذیری پایینی باشد (چن و همکاران، 2013). هدف از انجام این طرح انتخاب مواد مناسب برای تقویت نرمی رزین با حفظ حداقل خواص و دستیابی به شرایط پخت مناسب میباشد.
1ـ3 ضرورت انجام تحقیقدامنه کاربرد رزین اپوکسی وسیع میباشد که بنا به نوع کاربرد و شرایط پخت آن، اصلاح میگردد، این طرح به دلیل اینکه شرایط پخت همراه با نرمکننده را بررسی میکند، میتواند مورد توجه قرار گیرد.
1ـ4 اهداف تحقیقمسأله مورد بحث، سختی و شکنندگی رزین اپوکسی پخت شده میباشد که هدف از این تحقیق اصلاح رفتار و دستیابی به حالت تقریباً بهینه و مناسب از رزین همراه نرمکننده و سیستم پخت برای رسیدن به رزین اصلاح شده است.
1ـ5 فرضیه های تحقیقبرای انجام این پروژه روشهای مورد نظر به صورت زیر مطرح میگردد:
الفـ تدارک رزین اپوکسی مناسب،
بـ فرمولاسیون سیستم پخت،
جـ انتخاب عوامل پخت متفاوت و بررسی خواص ناشی از استفاده از آن،
دـ دستیابی به سیستم پخت مناسب در حضور نرمکننده.

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده2ـ1 مقدمهاصطلاح «رزین» از موادی که به طور طبیعی و در بیشتر موارد، از گیاهان به دست میآیند، گرفته شده است. در صورتی که محلولهای این مواد در حلالهای آلی، در هوا خشک شوند، به پوششهای محافظ و سختی تبدیل میگردند. کاربردیترین رزین طبیعی، روزین (یا کلوفان) است. بعدها، هر مادهی سنتزی که مکمل یا جایگزین این فراوردههای طبیعی شد، «رزین» نام گرفت (ظهوریانمهر، 1376).
امروزه رزین به تعدادی از انواع پلیمرها، شامل محصولات تراکمی فنولـفرمالدئید و رزینهای اپوکسی، پلیمرهای وینیلی مانند پلیاستیرن و پلیمتیلمتاکریلات، و پلیمرهای تراکمی طبقهی پلیآمید یا پلیاستر و ... گفته میشود. بیشترین اصطلاح رزین به پلیمرهای خطی یا شبکهای (یا قابل شبکهای شدن) که برای عملیات قالبگیری، ریختهگری یا روزنرانی و در پوششهای سطوح استفاده میشوند ارتباط دارد.
رزینها پلیمرهایی و به عبارتی کوپلیمرهایی با وزن مولکولی بالا هستند که در درون زنجیره خود گروههای فعالی دارند. بیشتر این پلیمرها در دمای محیط، مایع با گرانروی بالا و ظاهر عسل مانند، شفاف با رنگ زرد روشن تا مایل به قهوهای هستند و یا به صورت پولک و دانههای جامدی هستند که برحسب نیاز در حلال مناسب حل میشوند (ظهوریانمهر و همکاران، مترجم، 1376).
2ـ2 رزین اپوکسیاصطلاح اپوکسی به گروه شیمیایی اطلاق میشود که در آن یک اتم اکسیژن با دو اتم کربن دیگر که به نوعی به هم پیوند خوردهاند، متصل میباشند. سادهترین اپوکسی دارای یک ساختمان حلقوی سه عضوی بوده که اصطلاحاً به آن "1و2 اپوکسی" یا "آلفا اپوکسی" گفته میشود (دادییوک و گودمن، 2013؛ راتنا، 2010).
2ـ3 تاریخچهترکیبات دارای رزین اپوکسی از اواخر قرن نوزده (در سال 1891) توسعه پیدا کردند (لی، 1967).در اواخر دهه 1930 دو محقق به طور جداگانه از ترکیب اپیکلروهیدرین و بیسفنول A رزین اپوکسی را ساختند که اولین رزین اپوکسی در دسترس شد. در 1936 دکتر پییر کاستان که در یک شرکت در زوریخ آلمان مشغول کار بود رزین اپوکسی را توسعه داد، این رزین گرماسخت از واکنش با یک انیدرید بدست آمد. در 1955 شرکت شل آمریکایی یک اداکت آمینـاپوکسی به عنوان عامل پخت تولید نمود. در 1958 اولین پوششهای صنعتی برای صنعت نقاشی به صورت رزینهای جامد تهیه شدند (می، 1987).
دردهه 1980 افزایش ملزومات در صنایع کامپوزیت برای کاربردهای هوا فضا و دفاعی، رزینهای اپوکسی چند عاملی با کارآیی بالا بر پایه ساختار های فنولی و آمینی کمپلکس گسترش یافت. در همین دهه رزینهای اپوکسی با کارآیی بالاتر برای استفاده در صنایع الکترونیک و رایانه تولید شد، در دههی 1990 رزینهای اپوکسیـآکریلات پخت شونده با تابش، رشد یافتند، رزینهای مقاوم به نور و چاپ در صنایع الکترونیک از این دسته میباشند (خلینا، 1392). تولید رزین اپوکسی به علت کاربردهای فراوانی که پیدا کرده همچنان رو به گسترش است (دادییوک و گودمن، 2013).
2ـ4 ساخت رزین اپوکسیمتداولترین راه تهیهی رزینهای اپوکسی تراکم یک ترکیب پلیهیدروکسی در حضور یک باز است. معمولاً یک بیسفنول (مانند بیسفنول A) است که در بیشتر موارد با اپیکلروهیدرین، محصول واسطهای با وزن مولکولی پایین میدهد که در شکل (2ـ1) آورده شده است. این واسطه یک پلیمر خطی، دارای گروههای اپوکسید انتهایی و هیدروکسیلهای میانی است. در این واکنش، اپیکلروهیدرین اضافی باعث میشود که انتهای زنجیرها به گروههای اپوکسی ختم شوند (ظهوریانمهر و همکاران، مترجم، 1376).

شکل (2ـ1) واکنش تهیه رزین اپوکسی از بیسفنول A و اپیکلروهیدرین (گریمسلی و همکاران، 2002؛ یانگ، 1998).رزین واسطه (1) مایع یا جامدی با نقطه ذوب بالا (تقریباً °C150) میباشد.
2ـ5 سخت شدن
عملیات پخت یا سخت شدن، یک واکنش شیمیایی است که پیوندهای عرضی ایجاد میگردد (رضایی، 1390). رزینهای اپوکسی در اثر پخت شدن با عوامل شبکهای کننده به شبکههای گرماسخت سه بعدی جامد، غیرقابلذوب و انحلالناپذیر تبدیل میشوند (ساختمانیان و بهزادی، 1385). باز شدن حلقهی اپوکسید انتهایی و یا استری شدن هیدروکسیلهای زنجیر باعث شبکهای شدن میشود. حلقهی اکسیران گروههای اپوکسی باز شده و اتصالات C-O خطی و بلند ایجاد میشود، به همین دلیل اپوکسیهای پخت شده جمعشدگی کم و پایداری ابعادی مناسبتری دارند (ظهوریان مهر و همکاران، مترجم، 1376).
عوامل پخت یا کاتالیست و یا کمک واکنش هستند. عامل پخت کاتالیستی به عنوان یک شروع کننده هموپلیمرشدن رزین اپوکسی و یا به عنوان شتابدهندهی عوامل پخت دیگر عمل میکند، در حالی که عوامل پخت کمک واکنشی مانند یک کومونومر در فرآیند پلیمرشدن شرکت میکنند. در اکثر موارد پخت اپوکسیها از طریق ساز و کارهای هستهدوستی انجام میشود. مهمترین گروه از عوامل پخت کمک واکنشی عوامل دارای اتمهای هیدروژن فعال مانند آمینهای نوع اول و دوم، فنولها، تیولها و دیکربوکسیلیکاسیدها یا انیدریدها هستند. اسیدهای لوییس و آمینهای نوع سوم نیز عوامل پخت کاتالیستی هستند (خلینا، 1392).
2ـ5ـ1 فرایند پخت با آمین
رزینهای اپوکسی با عامل پخت آمینی با مکانیسم پلزدن و یا کاتالیستی شبکهای می شوند (زردان و همکاران، 1388). در مورد آمینهای نوع اول یک نوع افزایش صورت میگیرد که سرعت واکنشدهی آنها بیشتر از آمینهای نوع دوم است. گروه آمین نوع اول که دارای دو اتم هیدروژن متصل به خود است با دو گروه اپوکسی واکنش داده (شکل (2ـ2))، در حالی که آمین نوع دوم تنها با یک گروه اپوکسی واکنش میدهد. آمینهای نوع سوم به جای انجام یک واکنش افزایشی ساده، بیشتر به وسیله یک مکانیسم پلیمرشدن حلقه گشای کاتالیزوری بر روی گروههای اپوکسی عمل میکنند، زیرا واکنش افزایشی ساده با ترکیبات R3N انجام پذیر نیست (ظهوری، مترجم1381).

شکل (2ـ2) واکنش پخت رزین اپوکسی با آمین (یانگ، 1998).2ـ5ـ2 فرایند پخت با انیدریدانیدریدها یکی دیگر از عوامل پخت اپوکسی به شمار میروند. گرانروی کم و عمر مصرف طولانی از مزایای ترکیبات اپوکسیدیـانیدریدی به شمار میرود، همچنین در حین پخت گرمای کمتری آزاد میشود (خلینا، 1392).
سخت شدن با سختکنندههای انیدرید همراه با پلیمرشدن تراکمی است و نیاز به دمای بالا دارد (ظهوری، مترجم، 1381). شکل (2ـ3) مکانیسم پخت اپوکسی و انیدرید را نشان میدهد.

شکل (2ـ3) پخت اپوکسی و انیدرید (خلینا، 1392؛ گریمسلی و همکاران، 2002).2ـ5ـ3 عوامل پخت فنولیفنول ها گروه دیگر ی از عوامل پخت اپوکسیها هستند که دارای گروههای هیدروکسیل فنولی هستند و میتوانند با گروههای اپوکسی وارد واکنش شوند. ازجمله ترکیبات دارای گروههای فنولی میتوان به نووالاکها اشاره نمود که فرایند پخت آن با اپوکسی در شکل (2ـ4) نشان داده شده است.

شکل (2ـ4) واکنش اپوکسی با فنولها (خلینا، 1392).2ـ5ـ4 عوامل پخت گوگردداراین عوامل پخت شامل ترکیبات سولفیدی و مرکاپتانی دارای گروه های انتهایی تیولی ((-SH هستند. گروه تیول یا مرکاپتان به تنهایی و در دمای محیط به طور آهسته با رزین اپوکسی واکنش میدهند. در صورت استفاده از آمین نوع سوم به یون مرکاپتید با واکنشپذیری بالا تبدیل میشوند.

شکل (2ـ5) واکنش عامل گوگرددار و اپوکسی (خلینا، 1392).سختکنندههای پلیتیول شامل گروههای CH(OH)CH2SH هستند که گروههای هیدروکسیل گروههای تیول را به وسیلهی اتصالات هیدروژنی فعال میکنند (ظهوری، مترجم، 1381).2ـ6 شتابدهندههابه منظور بالا بردن عملیات پخت برای اینکه زمان پخت کاهش یابد به شتابدهنده نیاز است. شتابدهندهها زمان سخت شدن را کاهش میدهند و با فعالیت کاتالیستی بهرهوری را بهبود میبخشند. شتابدهندههای مورد استفاده شامل؛ پلیآمینهای آلیفاتیک یا آمینهای نوع سوم، فنولها و نانیل فنول، رزورسینول یا شتابدهندههای مشتقشده معدنی مانند تری فنیل فسفیت هستند (اردبیلی وپتچ، 2009).
2ـ7 نرمکنندههابرای بهبود خواص پلیمرها و انعطافپذیری آنها از نرمکننده استفاده میشود. نرمکنندهها در میان زنجیرهای پلیمری قرار میگیرند و آنها را از هم دور کرده و پلیمر را نرم میکنند و باعث دوام آن میشوند. از نرمکنندهها میتوان به استرفتالیکهایی مانند دی بوتیل فتالات و دی اکتیل فتالات اشاره نمود (براوون، 2011).
2ـ8 خواص رزینهای اپوکسی ساختار شیمیایی رزینهای اپوکسی طوری است که آنها را در مقابل مواد شیمیایی مقاوم میکند. رزینهای اپوکسی چسبندگی بسیار خوبی به طیف وسیعی از مواد دارند (بن صالح و همکاران، 2014). همچنین ابعاد قالب خود را به خوبی حفظ میکنند (زردان و همکاران، 1388). پس از پخت دارای استحکام هستند و در مقابل سایش و حرارتهای بالا مقاومت خوبی نشان میدهند (هور و همکاران، 1392). علاوه بر این، اپوکسیها دارای ویژگیهای زیر هستند:
مقاومت در برابر حلالها، رطوبت و مواد شیمیایی (شکرالهی و همکاران، 1392)،
چسبندگی خوب به بستر های مختلف (هور و همکاران، 1392؛ بالاسوبرامانیا و ناتاراجان، 2014)،
خواص برجسته مکانیکی مانند استحکام کششی، فشاری و خمشی بسیار بالا (ران و همکاران، 2014)،
پایین بودن جمعشدگی پخت (خسروی و موسی، 2010؛ ران و همکاران، 2014؛ سوزان و ریس، 2013؛ لو و همکاران، 2010)،
مقاومت به خوردگی (سوزان و ریس، 2013؛ لو و همکاران، 2010)،
مقاومت به خزش (کینلوچ و همکاران، 2014)،
عایق عالی الکتریسیته (سیگلا و چاولا، 2013)،
دوام بالا در پیری و شرایط سخت محیطی (شکوه فر و عرب، 1392؛ هور و همکاران، 1392)،
قابلیت پخت در دماهای مختلف (چوبدار، 1393)،
مقاومت خستگی ممتاز (چوبدار، 1393)،
بی بو و بیمزه (چوبدار، 1393)،
پایداری ابعادی (چن و همکاران، 2013).
2ـ9 کاربرد رزین اپوکسی رزینهای اپوکسی در کاربردهای مختلفی از قبیل پوشش سطح، روکشدهی، ابزارسازی و کامپوزیتها استفاده میشوند (ران و همکاران، 2014؛ لو و همکاران، 2010). در صنایع نظامی(غلاف و پوشش موشکها) و صنایع خودروسازی رزینها کاربرد دارند (حسامی و همکاران، 1392). ساخت قالب با ابعاد بزرگ، ساخت قطعات ریختهگری ماشینی، ساخت قالبهای مقاوم در برابر حرارت، صنایع چسب، مصارف خانگی و دریایی از کاربردهای متعدد این رزین هستند. چند لایههای رزین اپوکسی از اهمیت فوقالعادهای در صنایع هواپیماسازی برخوردارند (چوبدار، 1393).
صنایع هوافضا نیز از دیگر زمینههای استفاده رزین اپوکسی است (ساختمانیان و بهزادی، 1385). همچنین به کاربرد در صنایع بستهبندی و ورزشی میتوان اشاره نمود (شکوه فر و عرب، 1392). بسیاری از قطعات ساختاری از جنس الیاف کربن و رزین اپوکسی جایگزین آلیاژهای فلزی مرسوم شده و نتایج مطلوبی داشتهاند. همچنین از این رزین به همراه الیاف آرامید در ساخت موتور راکت و کپسولهای تحت فشار به روش رشتهپیچی استفاده میشود. علاوه بر این رزینهای اپوکسی به طور وسیعی به همراه الیاف و ساختارهای لانه زنبوری برای ساخت ملخ بالگرد استفاده میگردد. رزینهای اپوکسی تقویت شده با الیاف کربن و آرامید در ساخت قایقهایی که ضمن حفظ وزن، برای استفاده بیشتر از فضا و در استحکام مورد نظر، به جای پلیاسترـشیشه کاربرد دارد. همچنین کامپوزیتهای آرامیدـ اپوکسی برای جایگزین فولاد در کلاهخودهایجنگی استفاده میشوند (چوبدار، 1393).

فصل سوم :مواد و روشها3ـ1 مقدمه در مرحله آزمایشگاهی برای تولید نمونه، سعی شده که آزمایشات با چند نوع متفاوت از مواد تهیه شده انجام گیرد.
3ـ 2 مواداپوکسی 828 (گرانروی P150-110 در دمای محیط و خصوصیت فیزیکی مایع روان و شفاف) تولید شرکت Shell تهیه شده از بازار تهران، اپوکسی EPOLAM 2040 RESIN (چگالی g/cm3 16/1 در دمای محیط و به شکل مایع سیال و شفاف به رنگ کهربایی) ساخت شرکت Axson سفارش شده از آمریکا و عامل پخت آمینی EPOLAM 2047 HARDNER (چگالی g/cm3 94/ 0 در دمای محیط و به صورت مایع روان وکهربایی رنگ) ساخت شرکت Axson سفارش شده از آمریکا، عامل پخت انیدریدی با نام فتالیکانیدرید با وزن مولکولی g/mol 1/148، جامد و سفید رنگ تهیه شده از شرکت کیان شیمی مشهد، شتابدهنده آمینی دیمتیلآمینوبنزیل BDMA (به صورت محلول و مولاریته mol/L 21/135) تهیه شده از بازار تهران، نرمکننده دیاکتیلفتالات DOP (وزن مولکولی g/mol 57/390 و فرمول شیمیایی C24H38O4) تهیه شده از بازارتهران، در این طرح استفاده شدند.
3ـ3 روش کار
برای تهیه نمونهها یا از یک نوع اپوکسی و یا مخلوطی از دو نوع اپوکسی به نسبت مساوی استفاده گردیده است. نسبت وزن رزین به وزن عامل سخت کننده 3 به 1 و نسبت وزن رزین به وزن شتابدهنده 100 به 1 در نظر گرفته شد، میزان نرمکننده در جدول (3ـ1) مشخص گردیده است. پس از افزودن مواد به یکدیگر،
ظرف محتوی مواد درون حمام آب گرم قرار داده و محلول همزده شد که نمونهها و مشخصات آنها در جدول (3-1) آورده شده است. همچنین نمونههای دارای هر دو نوع عامل پخت به نسبت مساوی از هر کدام استفاده شده است. مقدار نرمکننده بر اساس قسمت در 100 قسمت رزین اپوکسی(phr) میباشد.
جدول (3ـ1) مشخصات نمونههای تهیه شده.شماره نمونه رزین اپوکسی عامل پخت شتابدهنده نرمکننده phr دما ((˚C زمان سخت
شدن
نمونه 1 EPOLAM 2040 EPOLAM 2047 BDMA (دیمتیلآمینوبنزیل) — 65 45 دقیقه
نمونه 2 EPOLAM 2040 EPOLAM 2047 BDMA 2 45 50 دقیقه
نمونه 3 EPOLAM 2040 EPOLAM 2047 BDMA 6 40 120 دقیقه
نمونه 4 EPOLAM 2040 EPOLAM 2047 BDMA 15 45 140 دقیقه
نمونه 5 EPOLAM 2040 EPOLAM 2047+ انیدرید فتالیک BDMA — دمای محیط (°C 25) بیش از 24 ساعت
نمونه 6 EPOLAM 2040+ 828 EPOLAM 2047+ انیدرید فتالیک BDMA — 65 بیش از 24 ساعت
نمونه 7 828 EPOLAM 2047+ انیدرید فتالیک BDMA — دمای محیط بیش از 24 ساعت
نمونه 8 828 EPOLAM 2047 BDMA — 40 135 دقیقه
نمونه 9 EPOLAM 2040+ 828 EPOLAM 2047 BDMA 6 40 160 دقیقه
نمونه 10 828+ EPOLAM 2040 EPOLAM 2047 BDMA 15 35 165 دقیقه
نمونه 11* 828 EPOLAM 2047 BDMA — 50 30 دقیقه
*مقدار شتابدهنده آمینی نمونه شماره 11 دو برابر میزان نمونههای دیگر بوده است.
3-3-1 مشاهدات
نمونه شماره 5 با اضافه کردن انیدرید فتالیک مخلوط حاصل تولید حبابهای زیادی کرده و سفید رنگ شد و به سرعت به صورت ژل درآمد و مدت زمان سخت شدن نهایی بیش از 24 ساعت به طول انجامید و مقداری از انیدرید داخل رزین سخت شده نامحلول باقی مانده بود.
نمونه شماره 6 نیز که با استفاده از حمام گرم انجام گرفت همان نتایج مربوط به نمونه شماره 2 مشاهده گردید با این تفاوت که رزین نهایی بدست آمده دارای ظاهری شفاف با حبابهایی داخل آن بود.
نمونه 7 که از یک اپوکسی تهیه شد نتایجی همانند نمونه 2 داشت. بنابراین استفاده از انیدرید از دستور کار آزمایشات خارج شد.
نمونههای دیگر (1، 2، 3، 4، 8، 9، 10 و 11) با اضافه کردن عامل پخت آمینی در شرایط دمایی متفاوت، شروع به ژل شدن کرده و پس از مدت زمان لازم عملیات پخت کامل شد و رزین سخت شد. در مرحله پخت گرما ایجاد شد و رزین بدست آمده سخت و با ظاهری شفاف بود.
3ـ4 دستگاههای مورد استفادهبرای انجام آزمایشها از دستگاههای موجود در پژوهشگاه نفت واقع در تهران استفاده گردیده است.
3ـ4ـ1 گرماسنجی روبشی تفاضلی(DSC)برای بررسی رفتار گرمایی مواد، مانند دمای ذوب و دمای انتقال شیشهای از دستگاه DSC استفاده میشود که میزان گرمای جذب یا آزاد شده با نمونه مرجع مقایسه شده و منحنی مربوطه رسم میشود. نمونه در معرض یک برنامه دمایی کنترل شده قرار میگیرد و تغییرات دمایی اندازهگیری میشود. از منحنیهای DSC برای تعیین دمای انتقال شیشهای (Tg) استفاده میشود (لوبو و بونیلا، 2003؛ سالامون و فیلدر، 2003). نوع دستگاه مورد استفاده 8000 Perkin Elmer آمریکا بود.
3ـ4ـ2 آنالیزگر حرارتی(TGA)به منظور اندازهگیری دمای تخریب، دستگاه TGA مورد استفاده قرار میگیرد. نمونه را داخل دستگاه میگذارند و از دمای محیط تا برنامه دمایی معین که با سرعت مشخص تغییر میکند (10 درجه سانتیگراد بر دقیقه) گرم میشود که دستگاه کاهش وزن نمونه را ثبت میکند. منحنی TGA تغییرات وزن ماده نسبت به دما را مشخص میکند (کینزی و فالکن، 2003؛ لوبو و بونیلا، 2003). دستگاه به کاربرده شده SDTA 851 Mettler Tolede ساخت سوئیس بود.
3ـ4ـ3 دستگاه اندازه گیری مدول فشاریدستگاه تنسایل برای تعیین استحکام فشاری و مدول فشاری کاربرد دارد. نمونه داخل دستگاه قرار داده میشود و تحت نیرویی قرار میگیرد تا رفتار نمونه نسبت به تنش اعمال شده اندازه گیری شود. میزان تنش تا زمانی ادامه مییابد که نمونه نسبت به تنش اعمال شده واکنش نشان دهد یعنی ارتفاع آن کم شود. این دستگاه با نام Zwick/Roell Z030 ساخت کشور آلمان بود.
فصل چهارم: نتایج و بحث
4ـ1 مقدمهبرای بررسی و بحث در مورد نمونهها، آزمایشهایی متناسب با رزینها روی تعدادی از نمونهها انجام گرفت. این آزمایشات شامل دمای تخریب، مدول فشاری، دمای تبدیل شیشهای، درصد ماده فرار و تورم در حلال و نفوذپذیری به آب بود. در این بخش به آزمایشهای انجام گرفته بر روی تعدادی از نمونههای تهیه شده، پرداخته شده است.

4ـ1ـ1 اثر نرمکننده بر دمای تبدیل شیشهایبه منظور بررسی تعیین دمای تبدیل شیشهای رزین در برابر نرمکننده، نمونهها طبق استاندارد ASTM D3895-07, 2007 به روش DSC در شرایط دمایی از °C 250-0 و با سرعت °C 10 بر دقیقه و در محیط نیتروژن مورد آزمایش قرار گرفته است. مقدار Tg نمونهها در جدول (4ـ2) و نمودار DSC نمونه (الف) در نمودار (4ـ1) نشان داده شده است و نمودارهای (4-2) تا (4-6) مربوط به DSC نمونههای دیگر در پیوست الف آمده است. نتایج بدست آمده نشان داد که نمونه های دارای نرمکننده دیاکتیل فتالات دمای تبدیل شیشهای پایینتری نسبت به نمونههای بدون نرمکننده دارند و هر چه میزان نرمکننده بیشتر باشد، Tg کمتر میشود به این دلیل که نرم کننده موجب تضعیف نیروهای بینمولکولی پلیمر شده و حجم آزاد پلیمر را افزایش میدهد.
جدول (4-2) نتایج دمای تبدیل شیشهای نمونههای مورد آزمایش.شماره نمونه مشخصه نمونه نتایج (ºC) شرایط آزمایش
الف EPOLAM 2040 RESIN 7/78 min/°C 10 ،°C 250- 0
ب EPOLAM 2040 RESIN + نرمکننده (phr 15) 5/55 ج EPOLAM 2040 RESIN + اپوکسی 828 + نرمکننده (phr 15) 5/55 د اپوکسی 828 0/89 ه EPOLAM 2040 RESIN+ اپوکسی 828 + نرمکننده (phr 6) 3/77 و EPOLAM 2040 RESIN + نرمکننده (phr 6) 4/74
نمودار (4ـ1) نمودارTg نمونه (الف)، شرایط آزمایش: دما °C250-0 و min/ °C 10.
میزان Tg نمونههای مورد آزمایش از نظر نوع اپوکسی و میزان نرمکننده بر روی نمودار (4-2) مقایسه شده است.

نمودار (4-2) مقایسه Tg نمونههای مورد آزمایش.4ـ1ـ2 اثر نرمکننده بردمای تخریب برای تأثیر نرمکننده بر دمای تخریب، آزمایش بر اساس استاندارد ASTM D3850-94, 2006 و شرایط دمایی از °C 50 تا °C 700 و سرعت °C 10 بر دقیقه با استفاده از دستگاه TGA انجام گردیده است. نتایج بدست آمده در جدول (4ـ3) و نمودارهای (4ـ4) تا (4ـ7) نشان داده شده است. که تخریب اپوکسی EPOLAM 2040 در دمای °C 350 و اپوکسی 828 در دمای °C 373 و نمونههای با نرمکننده به ترتیب °C 345 و °C 365 بود. نرمکننده میزان اتصالات عرضی را کاهش داده است به همین علت نمونههای دارای نرم کننده در دمای کمتری تخریب شدند. همچنین نوع اپوکسی بر روی نتایج تأثیر داشته است که در نمودار (4-3) آورده شده است.

جدول (4-3) دمای تخریب نمونههای مورد آزمایش.شماره نمونه مشخصه نمونه نتایج (ºC) شرایط آزمایش
الف EPOLAM 2040 RESIN 350 دمای °C 50 تا °C 700 و سرعت °C 10 بر دقیقه
ب EPOLAM 2040 RESIN + نرمکننده (phr 15) 345 ج EPOLAM 2040 RESIN + اپوکسی 828 + نرمکننده (phr 15) 365 د اپوکسی 828 373
نمودار (4-3) مقایسه دمای تخریب نمونههای مورد آزمایش.
نمودار (4ـ4) نمودار دمای تخریب نمونه (الف).تفسیر نمودار (4-4): سه مرحله برای تخریب رزین اپوکسی EPOLAM 2040 پخت شده قابل مشاهده است، مرحله اول که از حدود دمای °C 300 تا °C 345 ادامه دارد که مربوط به تخریب گروههای هیدروکسیل رزین (شکل 2-1 و 2-2) میباشد، مرحله دوم از حدود °C 345 تا °C 540 مربوط به خروج آمین و بخش آروماتیک رزین است که تقریباً 70% وزن آن کاهش یافته، مرحله سوم از °C 540 تا °C 700 ادامه دارد که نمونه به طور کامل تخریب شده است. از نمونه زیر دمای °C 300 میتوان استفاده نمود. منحنی دوم مشتق منحنی اول است که در °C 300 اولین افت وزن را نشان میدهد و در دمای °C 345 بیشترین میزان تخریب صورت گرفته است و در مرحله سوم منحنی دمای °C 545 را نشان میدهد (ممانی و همکاران، 1392؛ رای و سونیی، 2012).

نمودار (4ـ5) نمودار دمای تخریب نمونه (ب).تفسیر نمودار (4-5): نمونه (ب) دارای اپوکسی EPOLAM 2040 با نرمکننده دیاکتیلفتالات، در مرحله اول تخریب از حدود °C 200 تا °C 343 با خروج نرمکننده و گروههای هیدروکسیل اپوکسی همراه است مرحله دوم تخریب از °C 343 تا °C 545 اتفاق میافتد که با تخریب بیشتر آمین و گروههای آروماتیک و بقیه نرمکننده از بین میروند. مرجله سوم از °C 545 تا °C 700 تخریب کامل نمونه است. تفاوت نمودارهای نمونه الف و ب را میتوان وجود نرمکننده دانست. منحنی دوم چند نقطه مشخص شده است که به ترتیب شدت تخریب °C 343، °C 545، °C 300 و °C 200 میباشند، از نمونه تا دمای °C200 میتوان استفاده نمود (ممانی و همکاران، 1392؛ رای و سونیی، 2012).

نمودار (4ـ6) نمودار دمای تخریب نمونه (ج).تفسیر نمودار (4-6): این نمودار مربوط به نمونه (ج) (دارای نرمکننده و مخلوطی از دو نوع اپوکسی 828 و EPOLAM 2040) است که دارای سه مرحله تخریب گرمایی میباشد. مرحله اول از حدود °C 200 تا °C 365 مربوط به خروج نرمکننده و تخریب بخش هیدروکسیل اپوکسیها است افزایش این محدوده دمایی نسبت به نمونه الف را میتوان ناشی از وجود نرمکننده دیاکتیلفتالات و اپوکسی 828 دانست. مرحله دوم از °C 365 تا °C 545 مربوط به تخریب آمین و گروههای آروماتیک و احتمالاً بخشی از نرم کننده است. مرحله سوم هم که به خروج قسمتهای مقاوم نمونه ارتباط دارد از °C 545 تا °C 700 است. کارایی نمونه تا دمای °C 200 است. منحنی دوم که مشتق منحنی اول است بیشترین سرعت تخریب در دمای °C 365 و یک مرحله آهستهتر در دمای °C 545 را نشان میدهد از °C 200 تا °C 300 هم با یک شیب بسیار آهسته کاهش وزن روی میدهد (ممانی و همکاران، 1392؛ رای و سونیی، 2012).

نمودار (4ـ7) نمودار دمای تخریب نمونه (د).تفسیر نمودار (4-7): نمونه (د) دارای اپوکسی 828 و بدون نرم کننده؛ تخریب دمایی از حدود دمای °C 300 تا °C 370 شروع شده که افت وزن به دلیل شکست در گروههای هیدروکسیل اپوکسی روی داده و بعد از دمای °C 370 تا °C 545 نمونه با کاهش وزنی در حدود 70% روبرو میشود، مرحله سوم از °C545 تا °C 700 بخشهای مقاومتر اپوکسی تجزیه میشوند. منحنی مشتق دارای سه نقطه °C 300، °C 373 و °C 545 میباشد که بیشترین میزان تخریب در °C 373 است. این ماده تا °C 300 دارای کارایی است (ممانی و همکاران، 1392؛ رای و سونیی، 2012).
4ـ1ـ3 درصد مواد فرار
نمونههای وزن شده، داخل آون در دمای °C 105 و به مدت سه ساعت گذاشته میشوند. نمونهها پس از خروج از آون دوباره وزن میشوند و درصد مادهی فرار طبق رابطهی (4ـ1) بدست میآید. این آزمایش با استاندارد ASTM D2832-92, 2011 انجام شده است. نتایج هر نمونه در جدول (4ـ4) دیده میشود. نتایج نشان داد که نرمکننده روی فرار بودن اپوکسی تأثیر منفی نداشته است. ممکن است نمونه رطوبت احتمالی جذب شده از محیط و یا درصدکمی از اپوکسی خود را از دست داده باشد. نمودار (4-8) درصد ماده فرار نمونههای آزمایش شده را نشان داده است.
100× وزن ابتدایی/ (وزن ابتدایی-وزن نهایی) = درصد ماده فراررابطه (4ـ1)جدول (4-4) درصد ماده فرار نمونههای مورد آزمایش.شماره نمونه مشخصه نمونه نتایج ( %) شرایط آزمایش
الف EPOLAM 2040 RESIN 10/0- h3، ºC105
ب EPOLAM 2040 RESIN + نرمکننده (phr 15) 11/0- ج EPOLAM 2040 RESIN + اپوکسی 828 + نرمکننده (phr 15) 10/0- د اپوکسی 828 18/0-
نمودار(4-8) مقایسه درصد ماده فرار نمونههای مورد آزمایش.
4ـ1ـ4 آزمون فرورفتگی سوزنهنگامی که رزین اپوکسی به شکل ژل شد و نرم است، سوزن در آن وارد میشود اما بعد از سخت شدن، سوزن وارد نمیشود که نشاندهنده پیشرفت میزان پخت میباشد.
4ـ1ـ5 اثر نرمکننده بر مدول فشاری مدول الاستیسیته (E) یا همان مدول یانگ برابر است با نسبت تنش بر کرنش ایجاد شده به واسطهی تنش وارده بر جسم در حالتی که جسم در ناحیه الاستیک قرار گرفته باشد. واحد مدول الاستیسیته در SI پاسکال (هم واحد با تنش) میباشد. مدول الاستیسیته در رابطه (4ـ2) مشخص شده است (ابیول، 1996). این آزمایش با توجه به استاندارد ASTM D695-08, 2010 و در دمای محیط انجام گرفته است. مدول فشاری نمونهها در جدول (4ـ5) نمایان شده است.
اختلاف طول بر طول اولیه/ نیروی وارد بر سطح مقطع =کرنش/ تنش = مدول الاستیسیته
E=tensil stresstensil strain=δε=FAₒ∆LLₒ=FLₒ∆LAₒرابطه (4ـ2)جدول (4-5) میزان مدول فشاری نمونههای مورد آزمایش.شماره نمونه مشخصه نمونه نتایج ( MPa) شرایط آزمایش
الف EPOLAM 2040 RESIN 7/73 ℃2±32
ب EPOLAM 2040 RESIN + نرمکننده (phr 15) 9/18 ج EPOLAM 2040 RESIN + اپوکسی 828 + نرمکننده (phr 15) 3/21 د اپوکسی 828 2/84 اعداد بدست آمده نشان از کاهش شدید مدول نمونههای دارای نرمکننده بود، زیرا نرمکننده باعث کاهش میزان اتصالات عرضی شده و از سختی پلیمر کاسته شده است. نمودار (4-9) اثر نرمکننده و نوع اپوکسی بر مدول فشاری را نمایش داده است.

نمودار (4-9) مقایسه نمونههای مورد آزمایش از نظر مدول فشاری.4ـ1ـ6 مقاومت شیمیایی در حلالمطابق با استاندارد ASTM D543-06, 2006 نمونهها توزین میشوند و بعد در استن یا حلال شیمیایی دیگری به مدت 7 روز غوطهور میماند. پس از گذشت مدت زمان تعیین شده نمونهها وزن میگردند. درصد اختلاف وزن نمونه نسبت به وزن ابتدایی بیانگر میزان تورم در حلال است که در رابطه (4ـ3) بیان شده است. جدول (4ـ5) درصد تورم در حلال استن نمونهها را نشان میدهد. افزایش وزنی که در نمونههای دارای نرمکننده ایجاد شده به دلیل کم شدن اتصالات عرضی بوده است.
100× وزن ابندایی/ (وزن ابتدایی- وزن نهایی)= درصد تورم در حلالرابطه (4ـ3)
جدول (4-6) میزان تورم در حلال استن نمونههای مورد آزمایش.شماره نمونه مشخصه نمونه نتایج (%) شرایط آزمایش
الف EPOLAM 2040 RESIN 3/24 °C 2±32، 7 روز، استن
ب EPOLAM 2040 RESIN + نرمکننده (phr 15) 1/38 ج EPOLAM 2040 RESIN + اپوکسی 828 + نرمکننده (phr 15) 5/37 د اپوکسی 828 8/17 از مقایسه نمونهها که در نمودار (10-4) آورده شده، مشخص شد که نمونههای دارای نرمکننده نسبت به حلال استن مقاومت شیمیایی خوبی نشان ندادهاند، بنابراین نرمکننده میزان اتصالات عرضی رزین را پایین میآورد و باعث نفوذ حلالی مانند استن در پلیمر میشود (ابیول، 1996).

نمودار (10-4) مقایسه اثر نرمکننده و نوع اپوکسی بر میزان تورم در استن نمونههای مورد آزمایش.4ـ2ـ7 نفوذپذیری آبنمونههای با وزن مشخص در دمای محیط به مدت 24 ساعت در ظرف حاوی آب طبق استاندارد ASTM D570-98, 2010 غوطهور گردید. افزایش وزن نمونهها پس از 24 ساعت اندازهگیری و درصد نفوذپذیری آب براساس رابطه (4-4) محاسبه گردید که نتایج در جدول (4-6) ارائه گردیده است.
100× وزن ابندایی/ (وزن ابتدایی- وزن نهایی)= درصد نفوذپذیری آبرابطه(4ـ4)جدول (4-7) میزان نفوذپذیری آب نمونههای مورد آزمایش.شماره نمونه مشخصه نمونه نتایج ( %) شرایط آزمایش
الف EPOLAM 2040 RESIN 22/0 h24، °C 2±32
ب EPOLAM 2040 RESIN + نرمکننده (phr 15) 13/0 ج EPOLAM 2040 RESIN + اپوکسی 828 + نرمکننده (phr 15) 17/0 د اپوکسی 828 16/0 نتایج بدست آمده که در نمودار (11-4) مشخص شده است نشان داد که نفوذپذیری آب در نمونهها بسیار پایین بوده است. اپوکسی 828 نسبت به اپوکسی 2040 نفوذپذیری کمتری به آب نشان داده است. در نمونههای دارای اپوکسی 2040 همراه نرمکننده کاهش نفوذ آب نسبت به نمونه بدون نرمکننده مشاهده شده در حالی که نمونه دارای اپوکسی 828 و نرمکننده افزایش نفوذپذیری به آب (در مقایسه با نمونه 828 بدون نرمکننده) دیده شده است.

نمودار (11-4) مقایسه نمونههای آزمایش شده نسبت به نفوذ آب.
فصل پنجم: نتیجه گیری5ـ1 مقدمه
پخت اپوکسی به عواملی چون رزین، عامل پخت، گرانروی، دما و ... وابسته است. به منظور رفتار دو نوع اپوکسی و عامل پخت آمینی در حضور نرمکننده، موارد زیر مورد بررسی قرار گرفت:
تأثیر نرمکننده و اپوکسیها بر مدول فشاری
تأثیر نرمکننده بر Tg و اثر اپوکسیها بر آن
درصد مواد فرار
دمای تخریب
درصد جذب آب
مقاومت شیمیایی ـ تورم در حلال
5ـ1ـ1 اثر دما
زمان سخت شدن به دما وابسته است که با بالا بردن دما زمان سخت شدن رزین کاهش یافت. دما میزان پیوندهای کووالانسی را افزایش میدهد در نتیجه باعث تسریع در عملیات پخت و ایجاد پیوندهای عرضی میشود (ساختمانیان و بهزادی، 1385؛ رضایی، 1390).
5ـ1ـ2 تأثیر نرمکننده و اپوکسیها بر Tgحضور نرمکننده در ترکیب رزین باعث کاهش دمای تبدیل شیشهای شد. وجود نرمکننده موجب تضعیف جاذبههای بین مولکولی رزین میشود وحجم آزاد پلیمر را افزایش میدهد (ظهوری، مترجم، 1381؛ ابیول 1996). همچنین اپوکسی 828 دمای تبدیل شیشهای بیشتری داشت.
5ـ1ـ3 دمای تخریبوجود نرم کننده دمای تخریب را پایین میآورد. هرچه میزان اتصالات عرضی بیشتر باشد دمای لازم برای تخریب و تجزیه پلیمر افزایش مییابد ولی نرمکننده فاصله بین اتصالات عرضی را افزایش میدهد و در نتیجه پلیمر در دمای پایینتر تخریب میگردد (ظهوری، مترجم، 1381).
5ـ1ـ4 درصد ماده فرارمیتوان نرمکننده را تقریباً عامل بیتأثیری در فراریت اپوکسی دانست، که درصد ماده فرار بدست آمده را میتوان به از دست دادن رطوبت که احتمال دارد از محیط جذب رزین شده و یا حذف مقدار کم اپوکسی محتمل دانست.
5ـ1ـ5 تأثیر نرمکننده بر مدول فشاری نرمکننده مدول الاستیسیته را کاهش میدهد زیرا میزان اتصالات عرضی را پایین میآورد (خلینا، 1392؛ ابیول، 1996).
5ـ1ـ6 نفوذپذیری نسبت به آبافزایش شبکهای شدن باعث کاهش قدرت جذب آب میگردد چون فضاهای خالی میان زنجیرهها کاهش مییابد (باغی و سپهریان، 1391).
5ـ1ـ7 مقاومت شیمیاییمقاومت شیمیایی رزین اپوکسی در حلال استن مناسب است که حضور نرمکننده دیاکتیلفتالات باعث کاهش مقاومت رزین در استن شده است.
5ـ1ـ8 میزان شتابدهندهبا افزایش مقدار شتابدهنده در آزمایش مشخص شد که زمان سخت شدن کاهش یافت، ازاین رو مدت زمان وابسته به میزان شتابدهنده میباشد. شتابدهنده با واکنش با حلقه اپوکسی (شکل 2-1) موجب باز شدن حلقه اپوکسی شده و پخت را تسهیل و تسریع میکند (خلینا، 1392).
5ـ1ـ9 نوع رزین
بررسی نتایج بدست آمده معلوم میکند نمونههای دارای اپوکسی 828 نسبت به اپوکسی EPOLAM 2040 تقریباً رفتار متفاوتی در آزمایشات از خود نشان دادهاند. به عنوان مثال کاهش گرانروی موجب کاهش استحکام کششی، Tg ، مقاومت شیمیایی و خواص الکتریکی میشود و سرعت پخت را افزایش میدهد (رضایی، 1390).
5ـ2 توجیه رفتار انیدریدبه نظر میرسد عوامل پخت انیدریدی از نوع جامد باید در یک حلال مناسب حل شده و سپس به رزین اضافه شوند تا پخت به طور کامل انجام شود (گریمسلی و همکاران، 2002). بنابراین در آزمایشاتی که انیدرید به کار رفته بود بخشی از آن به صورت نامحلول باقی مانده بود و در سیستم تعریف شده غلظت کم مورد نظر نبود تا از حلال استفاده گردد.

فهرست منابعمنابع فارسی1- باغی ش، سپهریان آذر ا. 1391. تهیه و شناسایی هیدروژل آمفیفیلیت آکریل آمید و سدیم آلژینات (I.P.N) و شناسایی
خواص فیزیکی آن. فصلنامه کاربرد شیمی محیط زیست، سال سوم، 10: 23-32.
2- حسامی م، باقری ر، معصومی م. 1391. مروری بر بازدارندگی شعله در رزین اپوکسی-قسمت اول: ریز پرکننده
های بازدارنده شعله. فصلنامه علمیـترویجی بسپارش، سال دوم، 4: 49-60
3- زردان ر، گنجی م.ت، تحویلدار ک. 1389. تهیه و به کارگیری هاردنرهای دارای گروه های ایمیدی در پخت
رزین اپوکسی. نیترو پی دی اف، سال چهارم، 13: 281- 288
4- شکرالهی ف، مهدویان ع، شکرالهی پ. 1392. سنتیک پخت رزین اپوکسی-نووالاک دارای بازدارنده شعله. مجله
علوم و تکنولوژی، 26، 6: 537-547
5- شکوه فر ع، عرب ب. 1392. مطالعه ساختار و رفتار تبدیل شیشهای پلیمرهای اپوکسی به روش دینامیک
مولکولی. ماهنامه علمی پژوهشی مهندسی مکانیک مدرس، 99، 9 : 1-6
6- ممانی آ، ابراهیمی م، عطایی فرد م. 1392. بهبود ویژگی های حرارتی، مقاومت به آتش و مکانیکی رزین
اپوکسی به کمک گرافیت قابل انبساط. نشریه علمی پژوهشی مواد پیشرفته و پوشش های نوین، 6: 410-
419.
7- ساختمانیان م.ر، بهزادی م. 1385. تأثیر دما و زمان پخت برخواص مکانیکی کامپوزیتهای زمینه اپوکسی
تقویت شده با الیاف شیشه. ششمین کنفرانس سراسری انجمن هوا فضای ایران. تهران(دانشگاه صنعتی
خواجه نصیرالدین طوسی)، اسفند ماه.
8- هور م، رضانژاد س، جودت ح، پیلهور س. 1392. طراحی فرمولاسیون رزین مورد استفاده در ساخت پیش
آغشته کامپوزیت پرهی توربین بادی. بیست و هشتمین کنفرانس بینالمللی برق. تهران، 13ـ14 آبان.
9- کومین ج. دانش چسب و چسبندگی. ظهوری غ. 1381. چاپ اول. مشهد. سخن گستر، 200ص.
10- سورنسون دبلیو.آر.، کمپبل تی.دبلیو.. شیمی پلیمر عملی. ظهوریانمهر م، نادعلی م، ترپوگوسیان گ. 1376.
چاپ اول. موسسه انتشارات علمی دانشگاه صنعتی شریف، 652ص.
11- خلینا م. رزین های اپوکسی- بررسی مورفولوژی و خواص ریز ساختارهای آمیزه های اپوکسی. 1392. دوره
دکتری. پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران.
12- چوبدار ح. 1393. رزینها. خانه مهندسی شیمی ایران. www.ICHEH.com. 16دی.

فهرست منابع انگلیسی1- ASTM D695. Standard Test Method for Compressive Properties of Rigid Plastics. 2010.
2- ASTM D543. Standard Practices for Evaluating the Resistance of Plastics to Chemical
Reagents. 2006.
3- ASTM D2832. Standard Guide for Determining Volatile and Nonvolatile Content of
Paint and Related Coatings. 2011.
4- ASTM D3895. Standard Test Method for Oxidative-Induction Time Polyolefins by
Differential Scanning Calorimetry. 2007.
5- ASTM D3850. Standard Test Method for Rapid Thermal Deg--ation of Solid Electrical
Insulating Materials by Thermogravimetric Method (TGA). 2006.
6- ASTM D570. Standard Test Method for Water Absorption of Plastics. 2010.

7- Balasubramanya P, Natarajan K. 2014. Mechanical and Morphological Studies of
Modified Epoxy Resin Matrix for Composite Applications. Emerging Technology and
Advanced Engineering Journal, 4(1): 281-288.
8- Ben Saleh A, Mohd Ishak Z, Hashim A, Kamil W, Ishiaku U. 2014. Synthesis
and Characterization of Liquid Natural Rubber as Impact Modifier for Epoxy Resin.
Physics Procedia Journal, 55: 129-137
9- Chen J, Kinloch A, Sprenger S, Taylor A. 2013. The Mechanical Properties and
Toughening Mechanisms of an Epoxy Polymer Modified with Polysiloxan-based Core-
Shell Particles. Polymer Journal, 54: 4276-4289.
10- Grimsley B, Hubert P, Song X, Cano R, Loos A, Pipes R. 2002. Effects of Amine
and Anhydride Curing Agents on the Vartm Matrix Processing Properties. SAMPE
Journal, 38(4): 8-15.
11- Hardis, R., Jessop J, Peters F.E. Kessler M.R. 2013. Cure Kinetics Characterization and
Monitoring of an Epoxy Resin Using DSC, Raman Spectroscopy, and DEA.
Composites. Part A: Applied Science and Manufacturing Journal, 49: 100-108.

12- Khosravi E, Musa O. 2011. Thermally Deg--able Thermosetting Materials. European
Polymer Journal, 47: 465-473.
13- Kinloch A.J, Lee S.H, Taylor A.C. 2014. Improving the Fracture Toughness and the
Cyclic-Fatigue Resistance of Epoxy-Polymer Blend, Polymr Journal, 55: 6325-6334.
14- Lu Sh , Ban J, Yu Ch, Deng W. 2010. Properties of Epoxy Resins Modified with Liquid
Crystalline Polyurethane. Iranian Polymer Journal 19 (9): 669-678.

15- Odegard G.M., Jensen B.D, Gowtham S., Wu J, He J, Zhang Z. 2014. Predicting
Mechanical Response of Cross linked Epoxy Using ReaxFF. Chemical Physics Letters,
591: 175-178.
16- Rane U. G, Sabnis A, Shertukde V. 2014. Synthesis and Characterization of Imide
Ontaining Hybrid Epoxy Resin with Improved Mechanical and Thermal Properties. International Journal of Polymer Science, 2014: 10 p.17- Singla M, Chawla V. 2010. Mechanical Properties of Epoxy Resin – Fly Ash Composite.
Journal of Minerals & Materials Characterization & Engineering, 9(3): 199-210.
18- Sprenger, S. 2013. Epoxy resin Composites with Surface‐Modified Silicon Dioxide
Nanoparticles: A review. Journal of Applied Polymer Science, 130(3): 1421-1428.
19- Souza J, Reis J. 2013.Thermal behavior of DGEBA (Diglycidyl Ether of Bisphenol
A) Adhesives and its Influence on the Strength of Joints. Applied Adhesion.Science, 1(6): 1-10.
20- Me--, L., Benyoucef B., Abadie M.J.M., Charles J.P. 2014. Characterization and
Mechanical Properties of Epoxy Resin Reinforced with TiO2 Nanoparticles.
Experimental Techniques, 38(1): 59-66.
21- Ardebili H, Petch M. 2009. Encapsulation Technologies for Electronic Application. 1st
edn. Andrew W, 504 p.
22- Braun D, Cherdon H, Ritter H. 2001. Polymer Synthesis: Theory and Practice:
Fundamentals, Methods, Experiments; with 31 Tables. Springer Science & Business Media, 333 p.
23- Dodiuk H, Goodman S. 2013. Handbook of Thermoset Plastics. Andrew W, 800 p.
24- Ebewel H O.. 1996. Polymer Science and Thecnology. New York: CRC Press, 530 p.
25- Kutz M. 2012. Handbook of Environmental Deg--ation of Materials. Ray S, Cooney R.
Thermal Deg--ation of Polymer and Polymer Composites. Andrew W. 936 p.
26- Lee H., Neville K. 1967. Handbook of epoxy resins. New York. McGraw-Hill. 922p.
27- Lobo H, Bonilla J. 2003. Handbook of Plastic Analysis. New York. Marcel Dekker, Inc.
620 p.28- Lobo H, Bonilla J. 2003. Handbook of Plastic Analysis. Salamon A W., Fielder K J..
Practical Uses of Differential Scanning Calorimetry for Plastics. New York. Marcel
Dekker, Inc. 620 p.29- Lobo H, Bonilla J. 2003. Handbook of Plastic Analysis. Kinzy S, Falcon R.
Thermogravimetric Analysis of Polymers. New York. Marcel Dekker, Inc. 620 p.30- May C. 1987. Epoxy Resins: Chemistry and Technology. 2nd edn. New York: CRC Press,
1288 p.31- Ratna D. 2007. Epoxy Composites: Impact Resistance and Retardancy. iSmithers Rapra
Publishing, 118 p.
32- Yang J. Modification of Epoxy Resins with Functional Hyper branched Poly(Arylen
Ester) s. chapter 8, Literature Review of Epoxy Toughening. 154-169. 1998. PhD thesis.
Virginia.
33- Perkins S. A Study of the Mechanical Behavior of Epoxy Sys-- under Different Testing
Temperatures. 2011. PhD thesis. University of Florida.

پیوست الف
نمونه دارای اپوکسی 2040، نرمکننده phr15.
نمودار (الف-1) نمودار Tg نمونه (ب)، شرایط آزمایش: دما °C250-0 و min/ °C 10.
نمونه دارای اپوکسی 2040، اپوکسی 828، نرمکننده phr15.
نمودار (الف-2) نمودار Tg نمونه (ج)، شرایط آزمایش: دما °C250-0 و min/ °C 10.
نمونه دارای اپوکسی 828، نرمکننده phr15.
نمودار (الف-3) نمودار Tg نمونه (د)، شرایط آزمایش: دما °C250-0 و min/ °C 10.
نمونه دارای اپوکسی 2040، اپوکسی 828، نرمکننده phr 6.
نمودار (الف-4) نمودار Tg نمونه (ه)، شرایط آزمایش: دما °C250-0 و min/ °C 10.
نمونه دارای اپوکسی 2040، نرمکننده phr6.
نمودار (الف-5) نمودار Tg نمونه (و)، شرایط آزمایش: دما °C 250-0 و min/ °C 10.
AbstractEpoxy resins are a class of thermosetting polymers which have properties such as high thermal and chemical stability, excellent adhesion properties, moisture resistance and simply processible. This resins wildly used for adhesive, coating, painting and tools of polymeric. Common of epoxy resins are prepare by reaction of bis phenol A with epiclorohydrin in presence of a base as catalyst. Epoxy resins can be cured with amines, thiols, anhydrides and phenols. In this project some modification of epoxy resin and behavior was achieved with using a plasticizer and accelerator. Samples were prepared using two types of resins, two curing agents, amine accelerator and plasticizer. The resins behavior were studied. Samples of testing are:
Sample (a): epoxy EPOLAM 2040 RESIN with amine curing agent EPOLAM 2047 HARDNER and accelerator,
Sample (b): mixing of two type of epoxy (828 and EPOLAM 2040) and amine curing agent EPOLAM 2047 and plasticizer (DOP) with accelerator,
Sample (c): epoxy EPOLAM 2040 and amine curing agent EPOLAM 2047 with plasticizer (DOP) and accelerator,
Sample (d): epoxy 828and amine curing agent EPOLAM 2047 with accelerator
The DSC studies were reviled that Tg of the resin samples were decreased from (a) 78.7˚C and (b) 89.0˚C to 55.5˚C with using DOP as plasticizer. The volatile content of the same carried out at 105˚C during 3 hour were (a) -0.10%, (b) -0.18%, while the value for the plasticizer same were (c) -0.10% and (d) -0.11%. Thermal decomposition of the samples were (a) 350˚C, (b) 373˚C and (c) 345˚C (d), 365˚C. Inflation present in acetone solvent showed for samples (a) 24.3%, (b) 17.5% and 37.5%, 38.1% respectively for (c) and (d). Water absorption percent were for samples within plasticizer (a) 0.22% and (d) 0.16% and samples without plasticizer (b) 0.13%, (c) 0.17%.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

Key words: epoxy resin, curing agent, thermal decomposition, plasticizer.

4863465-546735
Islamic Azad University
Damghan Branch
Faculty of Science-Department of Chemistry
A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of M.sc in Applied Chemistry
Title:
Modification of Epoxy Resin with Plasticizer and Accelerator

–278

انتقال پلاسمید به سلول های مستعد..................................................................................................21
بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع..........................................................................................21
PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری......................................................................................22
استخراج پلاسمید در مقیاس کم.......................................................................................................22
استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد.....................................................................................................23
الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)........................................................24
سنتز ژن gcsf...................................................................................................................................29
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf....................................................................................................30
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.................................................................................31
هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf.......................................................................................................32
هضم آنزیمی وکتوربیانی pHan......................................................................................................33
کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan.................................................................................33
بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf...........................................................................................34
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf......................................................................................................35
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.....................................................35
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین..............................................................................35
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy..........................................................37
بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo.........................................................................................38
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf......................................................39
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo..............................................................................39
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf.........40
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................41
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin.................................................................................41
الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا...................................................................................42
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین.............................43
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا......................................................................................44
کشت سلولهای مخمری....................................................................................................................44
بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE........................................................................44
تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش.....................................................................................................45
ایمونوبلاتینگ...................................................................................................................................46
فصل سوم نتایج
سنتز ژن gcsf...................................................................................................................................49
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf...................................................................................................49
طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf...........................................................................................49
بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf...........................................................................................50
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.................................................................................51
هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan.......................................................51
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf.............................................................................................52
بررسی کلونها به روش سریع...........................................................................................................52
انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf............................................................52
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf......................................................................................53
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.....................................................54
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble).............................................................54
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy..........................................................55
تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin.......................................................................................55
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................55
هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII.....................................................................56
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf......................................................57
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin..............................................................................57
بررسی سریع کلونهای نوترکیب........................................................................................................57
بررسی کلونها به روش Colony-PCR.............................................................................................58
برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo.................................................................................58
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.......................................59
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا........................................59
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین..............................................59
بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا.....................................................................................60
تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting.......................................................61
فصل چهارم :بحث و پیشنهادات
رویکرد کلی پژوهش........................................................................................................................63
فصل پنجم : منابع و پیوست
فهرست منابع و مواخذ......................................................................................................................66
پیوست‌ها..........................................................................................................................................75
مقدمه
تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.
هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.
مواد و روش ها
cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده مربوط به هانسونلا پلی مورفا که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.
نتایج
ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با استفاده از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً 20 کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.
بحث
پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.
کلید واژه ها
هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک
فصل اول : مقدمه
در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:
رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،
تحمل دماهای بالا (توانایی رشد در دمای °C49)،
تبادل آسان محتوای ژنتیکی بین سلولهای هاپلوئید و دیپلوئید ( (Teunisson, 1960.
1-1میکروبیولوژی هانسونلا
این مخمر برای اولین بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوی 50% قند در فلوریدای آمریکا جداسازی شد.
سلولهای هانسونلا به هر دو صورت سلولهای دیپلوئیدی و هاپلوئیدی رشد می کنند. کلنی ها بر روی محیط کشت جامد دارای طیف رنگی صورتی هستند که به علت آسکوسپورها می باشد. کلنی سلولهای هاپلوئیدی و دیپلوئیدی از نظر رنگ، اندازه، چیدمان سلولی و سایر ویژگیها با یکدیگر متفاوت می باشند.
تاکنون اطلاعاتی در مورد توانایی هانسونلا پلی مورفا در تشکیل میسلیوم کاذب پیدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).

شکل 1-1 مخمر H. polymorpha
هانسونلا پلی مورفا میتواند در دمای بالا و در °C42 رشد کند. به نظر می رسد در این مخمر سنتز تره هالوز قسمتی از پاسخ به قحطی منبع کربن و شوک حرارتی است و پیشنهاد شده که این ترکیب، فاکتور مهمی در مقاومت دمایی است (Reinders, 1999).
مطالعات انجام شده بر روی هانسونلا پلی مورفا به طور عمده به بررسی پروتئین های سلولی، ساختار سلولهای مخمر در حال رشد و یا بررسی متابولیسم مخمر پرداخته اند.
در سویه هایی از این مخمر که از متانول به عنوان منبع انرژی استفاده می کنند، آنزیمهای متانول اکسیداز و کاتالاز، به فرم کریستالی درون اندامکی به نام پراکسی زوم قرار گرفته اند (Van Dijken, 1975).
هانسونلا پلی مورفا بعنوان یک ارگانیسم متیلوتروف، یک مدل مطلوب برای تحقیق در مورد عملکرد پراکسی زم ها و تکامل حیات می باشد. همچنین به منظور بررسی ژنتیکی جنبه های مختلف متابولیسم سلولی از جمله متابولیسم متانول، جذب نیترات و مقاومت به فلزات سنگین مورد مطالعه قرار می گیرد ( (Mannazzu, 2000.
با وجود این ویژگیها، هنوز قابلیت های ژنتیکی و طبیعی سویه های مورد استفاده از این مخمر کاملاً مشخص نیست و کنترل ژنتیکی فرایندهای سلولی پایه از جمله کنترل تقسیم سلولی، تولید مثل و اسپورزایی هنوز با سؤالات زیادی مواجه می باشد.
با اینحال هانسونلا پلی مورفا به عنوان یک میزبان برای تولید پروتئین های خارجی(ترشحی به خارج از سلول) توجه زیادی را به خود جلب کرده است ( (Gellissen, 2000.
1-2مطالعات ژنتیکی
تحقیقات ژنتیکی تاکنون تنها بر روی سه سویه از این مخمر انجام شده است که شامل سویه های DL-1، CBS 4732 و NCYC 495 می باشند.
پیدایش سویه های هانسونلا پلی مورفا از سویه های جهش یافته اکسوتروف شروع شده است.این موتانت ها از سویه هایی که در بالا نام برده شد با استفاده از ترکیب شیمیایی N-متیل-N-نیترونیتروزو گوانیدین یا اتیل متان سولفونات به دنبال یک مرحله غنی سازی با نیستاتین به دست آمده اند.
از طرف دیگر اشعه ماوراء بنفش نیز یک موتاژن بسیار قوی است که طیف موتانت های ایجاد شده بوسیله آن در مقایسه با موتانت های حاصل از مواد شیمیایی متفاوت و گسترده تر می باشد (Roggenkamp, 1986).
بطور کلی فرایندهای جهش زایی متعددی در این مخمر انجام شده است که یکی از این فرایندها، جهش های ژنتیکی است که منجر به سنتز اسیدآمینه های آروماتیک می شود که به مخمر اجازه رشد در محیط غنی YPD را نمی دهند (Krappmann, 2000).
از جمله انواع جهش یافته های اکسوتروف میتوان به موارد زیر اشاره نمود:
سویه هانسونلا پلی مورفای جهش یافته ای که برای رشد بر روی محیط های معدنی الزاماً به ریبوفلاوین نیاز دارد و محدود نمودن منبع ریبوفلاوین تأثیر شدیدی بر روی سنتز مجموعه الکل اکسیداز و تکثیر پروکسی زومهای سلولی دارد (Evers, 1994).
نوع دوم جهشهای ایجاد شده در ژن FAD1 است که اسید چرب دلتا را کد می کند. کاربرد این سلولهای جهش یافته در بررسی ژنتیکی سنتز اسیدهای چرب غیراشباع می باشد ( (Anamnart, 1998.
تحقیقات اخیر نشان داده است که هانسونلا پلی مورفا میتواند برای بررسی مقاومت به فلزات سنگین مورد استفاده قرار گیرد چراکه توانایی رشد در حضور تجمع فلزات سنگین متفاوت را که برای سایر موجودات سمی است دارا می باشد (Mannazzu, 1997).
در طی رشد در محیط حاوی vanadate، سلول ها افزایش قابل توجهی از پلی فسفات های واکوئلی پیدا میکنند. احتمالاً نقش این واکوئل ها در فعال کردن مکانیسم های اتوفاژی است که شاید برای جبران کمبود مواد مغذی و یا حذف ساختارهای سلولی ناهنجار القاء شده توسط این یون فلزی لازم باشند (Mannazzu, 1998).
سلول های هانسونلا پلی مورفا در مقایسه با S. cerevisiae به یون های کادمیوم(cd2+) بسیار مقاومند )این مقاومت به شدت به ماهیت منبع کربن استفاده شده بستگی دارد. سلول ها اغلب زمانیکه بر روی محیط حاوی گلوکز رشد میکنند به کادمیم مقاومتراند اما در طی رشد بر روی محیط حاوی متانول، به عنوان منبع کربن و انرژی، به این یون بسیار حساس می باشند. سویه های جهش یافته مقاوم به کادمیوم به سه گروه cds1، cds2 و cds3 تقسیم میشوند ( (Lahtchev, unpublished data.
جهش در ژنهای کدکننده آنزیم های پراکسی زومی یا سیتوپلاسمی درگیر در متابولیسم متانول
ژن AOX1 (MOX)، کدکننده آنزیم الکل اکسیداز (AO) موجود در ماتریکس پروکسی زوم است و یکی از بهترین ژن های هانسونلا پلی مورفا در تحقیقات می باشد (Ledeboer, 1985). الکل اکسیداز یک آنزیم فلاووهومواکتامری است که اولین مرحله در متابولیسم متانول را کاتالیز میکند. مونومر این آنزیم در سیتوپلاسم سنتز شده و به صورت هومواکتامر فعال، تجمع یافته و در داخل پراکسی زوم قرار میگیرد. حدود 210 نوع جهش یافته از ژن AO وجود دارد ( (Titorenko, 1995. بیان این ژن در مرحله رونویسی تنظیم میشود.

شکل 1-2 مورفولوژی سلولهای H. polymorpha جهش یافته
در هانسونلا پلی مورفا وقایع مربوط به مهار و القاء ژنهای کد کننده آنزیم های اختصاصی متانول و یا آنزیمهای پراکسی زومی به شدت کنترل می شوند. تنظیم در سطح رونویسی با مکانیسم های کنترلی قابل ملاحظه ای انجام میشود. عناصر تنظیمی به فرم سیس در بالادست ژنهای DAS، CAT و FMD با نقش مهاری برای گلوکز شناسایی شده اند.
1-3 نقشه ژنتیکی
آنالیز تتراد در هانسونلا پلی مورفا امکان پذیر است اما اندازه کوچک اسپورها روند این آنالیز را کند می نماید. در کشت سلول های دیپلوئیدی تفکیک مندلی نرمال در مورد بیشتر مارکرهای ژنتیکی مشاهده شده است.
الکتروفورز DNA کروموزومی هانسونلا پلی مورفا به روش pulse field، 3 تا 7 باند را نشان داده است که به نوع سویه وابسته است (Mari, 1993)اما بطور کلی مشخص شده است که هانسونلا پلی مورفا حداقل 7 کروموزوم دارد که بعضی از آنها مضاعف (دو تایی) هستند (Naumov, 1992).
1-4 تولیدمثل و اسپورزایی
فاکتورهایی در تولیدمثل و اسپورزایی هانسونلا پلی مورفا درگیرند که هنوز بطور کامل شناسایی نشده اند. از القاء کننده های قوی تولیدمثل جنسی میتوان به مالتوز، گلیسرول و سوربیتول اشاره کرد (Lahtchev, unpublished data).
سلول های هاپلوئید بر اساس نوع فنوتیپشان به چهار گروه تقسیم میشوند:
سویه های گروه 1 و 2 میتوانند هیبریداسیون متقاطع داشته باشند. این سویه ها سریع الرشد و تهاجمی بوده و پس از گذشت یک روز در محیط انتخابی، دیپلوئیدی می شوند. سویه های گروه 3 توانایی جفتگیری با اعضای گروه 1 و 2 را دارند و سویه های مثبت (+) نامگذاری می شوند. سویه های گروه 4 تنها میتوانند با گروه مثبت جفتگیری کنند و گروه منفی (-) را تشکیل دهند.
1-4-1 اسپورزایی
در هانسونلا پلی مورفا سلولهای هاپلوئیدی توانایی اسپورزایی دارند. اسپورزایی هاپلوئیدها بعد از گذشت 8 روز در محیط حاوی 3% مالتوز در دماهای پائین قابل تشخیص است. اسپورزایی با ظاهر شدن کلنی های دیپلوئیدی به رنگ صورتی روشن همراه می باشد.
در اواخر دهه 1960 کشف شد که مخمرها توانایی رشد بر روی محیط حاوی متانول به عنوان منبع کربن و انرژی را دارند (Ogata, 1969). اخیراً در تحقیقات پایه، متیلوتروف ها به عنوان منبع پروتئین های تک سلولی (SCP) ((Cooney and Levine, 1976) و آنزیم های غیرمعمول و متابولیت ها توجه بسیاری را به خود جلب کرده اند. با استفاده از روشهای جدید کلونینگ، ژن های کد کننده آنزیم های کلیدی در متابولیسم متانول شناسایی شده اند (Wegner, 1990).
پروموترهای MOX و FMD بعد از القاء، بسیار قوی عمل می نمایند. این مطلب با مشاهده میزان بالای بیان محصولات تحت تأثیر این پروموترها قابل انتظار است.
این یافته ها استفاده از هانسونلا پلی مورفا، به عنوان یک میزبان مناسب برای بیان به میزان زیاد ژنهای هترولوگ با استفاده از این پروموترها، به عنوان اجزاء کنترل کننده بیان، را قابل قبول نماید (Roggenkamp, 1984; Hollenberg and Janowicz, 1988).
سیستم بیانی شامل هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 و پلاسمیدهای حاوی توالی های URA3و HARS1 است که به دنبال هم قرار گرفته اند. استفاده از پروموترهای FMD یا MOX و ترمیناتور MOX همراه با جایگاههای برش آنزیمی کوتاه مربوط به کلونینگ (MSC) بین این دو واحد، کلونینگ و بیان ORFهای هترولوگ را ممکن ساخته است.
آنالیز سویه های بیانی، پایداری میتوزی قابل توجه پلاسمید های الحاق شده به درون ژنوم را نشان می دهد که در بعضی موارد بیانگر سرعت بیان بالای ORF هترولوگ می باشد.
از طرف دیگر، سویه RB11، اغلب دستکاری های ژنتیکی به صورت نوترکیبی را به راحتی نمی پذیرد که شاید ناشی از پایداری میتوزی فوق باشد. به نظر می رسد سویه DL-1 نسبت به سویه RB11 توانایی پذیرش بیشتری را دارد (Gellissen, 1992).
1-6 پروموترهای مورد استفاده در سیستم های بیانی هانسونلا پلی مورفا RB11
یکی از پروموترهای مورد استفاده برای تولید پروتئینهای هترولوگ در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11، پروموتر ژن MOX می باشد که طول آن بیش از 5/1 کیلوباز بوده و در حضور منبع کربن تنظیم می شود. به این صورت که در حضور گلوکز، پروموتر MOX مهار می شود ولی در حضور متانول، القاء می گردد.
پروموتر سایر ژن های کدکننده آنزیم های کلیدی در کاتابولیسم متانول از جمله FMD، DAS و CAT نیز مشابه با پروموتر ژن MOX کنترل می شوند اما سطح تنظیمی بعضی از آنها همچون CAT مشخص نیست (Veenhuis, 1983).
اگرچه پروموترهای FMD و MOX به طور واضحی مقایسه نشده اند اما بعضی مقایسه ها نشان داده است که مزایای پروموتر FMD از پروموتر MOX بیشتر است. بعنوان مثال، هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 بیان کننده ژن فیتاز تحت کنترل پروموتر FMD، بازده زیادی در تخمیر در شرایط قحطی گلوکز دارد.
1-6-1 HARS1
پلاسمیدهای بیانی مورد استفاده در هانسونلا پلی مورفا سویه RB11 دارای عنصر HARS1 به طول تقریبی 5/0 کیلوباز می باشند. این قطعه ژنی در سالهای اخیر در طراحی وکتورهای مناسب برای انتقال به هانسونلا پلی مورفا مورد توجه قرار گرفته است Roggenkamp, 1986)). پلاسمیدهای حامل توالی HARS1 در 30-20 نسل ابتدایی رشد سلولها به صورت اپی زومال باقی می مانند اما پس از آن در ژنوم سلول مزبان به صورت تکرارهای متوالی به تعداد زیاد الحاق می شوند. این در حالی است که ناحیه ای که این پلاسمیدها دقیقاً در ژنوم ادغام می شوند هنوز مشخص نیست Gellissen, 1990)). چهار عنصر دیگر از خانواده قطعه ژنی HARS در سویه های DL-1 به دست آمده است اما تعداد کپی آنها از تعداد عناصر HARS1 در سویه RB11 کمتر است.
جزئیات مکانیسم ادغام شدن پلاسمیدهای حاوی توالی HARS1 در ژنوم این مخمر هنوز مشخص نیست. تنها ویژگی شناخته شده، توانایی ادغام شدن به صورت توالیی تکراری و غیرتصادفی است که قسمت خاصی از ژنوم را انتخاب می کند (Sohn, 1996).

شکل 1-3 تصویر پلاسمید بیانی مخمر H. polymorpha
1-7 بیان همزمان:
با چنین سیستم هایی، مجموعه های پروتئینی هترومری تولید می شود. یک مثال قابل توجه از این نوع بیان، بیان همزمان آنتی ژن های S و Lویروس هپاتیت B است.
از دیگر موارد بیان همزمان میتوان به بیان ژن های کد کننده گلیکولات اکسیداز (GO) اسفناج و کاتالاز (CTT1) T ساکارومیسس سرویزیه در هانسونلا پلی مورفا اشاره نمود.
بیان، پردازش، تغییر و تبدیل و یا ترشح مؤثر پروتئینهای نوترکیب خاص در هانسونلا پلی مورفا ممکن است دچار تغییر شود. این محدودیت می تواند با بیان همزمان ژن مورد نظر با یک ژن دوم (یا بیش از یک ژن دیگر) برطرف شود به همراه می آورد. به عنوان مثال فرآیند پردازش نادرست اینترفرون آلفا 2a، می تواند با بیان همزمان ژن KEX2 ساکارومیسس سرویزیه بهبود یابد.
1-8 ترشح پروتئین های هترولوگ الیگومری و فعال
هانسونلا پلی مورفا مقدار کمی پروتئین درونی (خودی) ترشح می کند و در نتیجه این ویژگی، پروتئین های هترولوگ ترشح شده به محیط کشت، عموماً خالص هستند. بنابراین استفاده از این میزبان بیانی، روش مناسبی جهت تولید پروتئین های نوترکیب خارجی به فرم محلول می باشد. ترشح پروتئین ها توسط توالیهای نشانه (سیگنال) قابل جداسازی انجام می شود. اگرچه گاهاً مستقل از سیگنال ترشحی، در مواردی ترشح خودبخودی پروتئین هترولوگ نیز مشاهده شده است (Gellissen, 2000).
برای درک توانایی هانسونلا پلی مورفا در تولید و ترشح پروتئین های هترولوگ، سویه هایی از این مخمر به منظور ترشح الکل اکسیداز (AOX) مهندسی گردیدند. الکل اکسیداز، یک پروتئین هومواکتامر کوفاکتوری است که هر زیرواحد آن دارای یک مولکول FAD می باشد (van der Klei et al, 1991). زمانیکه هانسونلا پلی مورفا بر روی محیط حاوی متانول رشد می کند فعالیت پروتئین AOX در ماتریکس پراکسی زومی، جائیکه اکثر پروتئین های اصلی وجود دارند، محدود می شود.
از طرف دیگر، برای فهم چگونگی ترشح الکل اکسیداز، سویه هایی از هانسونلا پلی مورفا مهندسی گردید که ژن اندوژن AOX با ژن AOX به دنبال سیگنال ترشحی در انتهای N، جایگزین شد. به دنبال کشت این سویه در محیط کشت حاوی متانول، حضور AOX فعال شناسایی گردید که این بیان نشان می دهد هانسونلا پلی مورفا قادر به تولید و ترشح کمپلکسهای پروتئینی دارای کوفاکتور و ساختارهای الیگومری می باشد (van der Heide and Veenhuis, Unpublished results).
1-9 تولید واکسن نوترکیب
در بسیاری از کشورها واکسن های علیه هپاتیت در اوایل دهه 1980 در دسترس عموم قرار گرفت. این واکسن ها با جداسازی آنتی ژن HBs از سرم افراد ناقل تولید شده بود که اگرچه مؤثر بودند اما به دلیل مشتق شدن از سرم، گران بوده و مدت زمان کوتاهی به سیستم ایمنی عرضه می شوند. به همین دلیل، تولید آنتی ژن HBS هترولوگ در سیستم های بیانی مختلف از جمله مخمر، باکتری، سلولهای گیاهی یا جانوری و نیز حیوانات تراریخته توسعه پیدا نمود. (Billman-Jacobe, 1996, Makrides, 1996).
1-10 مخمرها به عنوان میکروارگانیسم های تولیدی
سیستم های مخمری دارای مزایایی از جمله توانایی دستکاری ژنتیکی آسان، فرآیند های پس از ترجمه یوکاریوتی با میزان بالای تولید محصول و فرآیندهای تخمیری ارزان قیمت هستند. بنابراین تعجب آور نیست که ساکارومیسس سرویزیه به عنوان یکی از میزبانهای مطلوب در تولید پروتئین های هترولوگ شناخته شده است (Hinnen et al, 1995; Barr et al, 2000).
تاکنون دو روش در سیستم بیانی هانسونلا پلی مورفا به منظور تولید زیرواحدهای adw2 و adr از آنتی ژن HBs ابداع شده است که یکی از آنها توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) تأیید شده است (Gregg et al, 1985; Gregg and Madden, 1987).
1-10 ساخت سویه هانسونلا پلی مورفا بیان کننده آنتی ژن HBs
به طور کلی تولید سویه های هانسونلا پلی مورفا نوترکیب نیازمند دنبال کردن پروتکل استاندارد زیر است:
تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
انتقال وکتور طراحی شده به سلول هانسونلا پلی مورفا
جداسازی سویه های نوترکیب
1-10-1 تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی
تولید سویه H415 بیان کننده آنتی ژن HBs بوسیله گروهی از محققین یک مثال از این فرآیند است. توالی کدکننده آنتی ژن به طول 683 نوکلئوتید از پلاسمید pRIT10616 جدا گردید (Harford et al, 1987) و قطعه پروموتریMOX به عنوان سیگنال برای رونویسی از ژن MOX هانسونلا پلی مورفا مشتق شد (Ledeboer et al, 1985; Eckart 1988). این سه عنصر ترکیب شده و قطعه MOX promoter-HBsAg gene-MOX terminator را تشکیل می دهند که اساس کاست بیانی می باشند (Stinchcomb et al, 1980). سپس این کاست دارای عملکرد بیانی درون وکتور پلاسمیدی حاوی عناصر زیر قرار داده شد. ژن مقاومت به کلرامفنیکل به منظور تکثیر در باکتری E. coli، توالی همانند سازی هانسونلا پلی مورفا (HARS1) و ژن URA3 از ساکارومیسس سرویزیه به عنوان مارکر انتخابی در بررسی انتقال پلاسمید به هانسونلا پلی مورفا می باشند.
پلاسمیدهای دارای توالی HARS1 توانایی بالایی برای ادغام در ژنوم میزبان دارند. امروزه سویه هایی شناسایی شده که دارای بیش از 60 کپی از کاست بیانی خارجی اند که این مطلب به دلیل وجود این توالی می باشد.
1-11 انتقال (ترانسفرم) وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا
1-11-1 روش پلی اتیلن گلیکول
پلاسمیدpRBS-269 با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول به سویه RB10 انتقال یافت و برای مشخص شدن ادغام پلاسمید به درون ژنوم، غربالگری صورت گرفت (Gregg et al, 1985).
تاکنون چندین سویه ترانسفرم شده با کاست های بیانی الحاقی بطور پایدار تولید شده است و سویه H415 یکی از این سویه هاست که برای بیان آنتی ژن HBs تحت شرایط خاص مورد آزمایش قرار گرفته است (Janowicz et al, 1991).
1-12 جداسازی سویه های نوترکیب
تشخیص بیان پروتئین با رشد سویه های ترنسفورم شده بر روی محیط های تقریباً مغذی حاوی گلوکز، گلیسرول و یا متانول بررسی می شود. در این راستا، مقدار آنتی ژنHBs تولید شده در این سیستم بیانی در مقایسه با مقدار استاندارد آنتی ژن خالص با روش ایمونوبلاتینگ کمی اندازه گیری شد. میزان تولید د ر سویه H415 در محیط کشت حاوی متانول mg100 بود. زمانیکه سلول ها در محیط حاوی گلیسرول قرار گرفتند سنتز آنتی ژن HBs 70% کاهش پیدا کرد و زمانیکه سلول ها به محیط حاوی گلوکز منتقل شدند آنتی ژنی تولید نگردید که این مطلب نشان دهنده تولید این آنتی ژن به طور طبیعی تحت کنترل ژن MOX میباشد (Rutgers et al, 1988).
1-13 تنظیم متابولیسم متانول
تنظیم آنزیم های احیاکننده به روش مهاری و نه القاء صورت می پذیرد. در طی فرایند رشد، در شرایط کمبود گلوکز این آنزیم ها افزایش پیدا می کنند (Egli, 1980). تجزیه و تحلیل منطقه پروموتر ژن کد کننده AOD نشان داده است که در H. polymorpha بیان ژن MOX نیز توسط یک مکانیسم مهاری تنظیم می شود (Roggenkamp, 1984; Sakai and Tani, 1992).
1-14 فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (G-CSF)
در دهه 60 میلادی، دو گروه به طور همزمان روش هایی را برای توسعه و بهبود رشد کلنی های گرانولوسیتی و مونوسیتی مغز استخوان موش و یا سلول های طحال بر روی آگار نیمه جامد مورد بررسی قرار دادند. رشد کلنی این سلولها به حضور فاکتورهایی بستگی دارد که اصطلاحاً آنها را فاکتورهای محرک رشد کلنی(CSF) می نامند. تلاش برای شناخت بیولوژیکی و بیوشیمیایی این محرکها آزمایشگاههای زیادی را تا اواسط دهه 80 میلادی درگیر کرده بود (Metcalf, 2010). این تحقیقات نشان دادند که CSF ها عملکردی اختصاصی و مجزا ندارند بلکه چهار CSF که از نظر بیوشیمیایی کاملاً متفاوت هستند با هم همکاری می کنند. این چهار CSF با توجه به نوع فعالیت شان بر روی کلنی های متفاوت، نامگذاری شدند. به طور مثال GM-CSF که محرک رشد کلنی ماکروفاژها و گرانولوسیت ها می باشد.M-CSF محرک تولید کلنی ماکروفاژها و G-CSF محرک رشد کلنی گرانولوسیتی می باشد.
1-15 ژن gcsf
این ژن بر روی کروموزوم 17 قرار گرفته و دارای 4 اینترون است. دو نوع پلی پپتید متفاوت در نتیجه پردازش های مختلف از این ژن ایجاد می شود. تفاوت این دو پلی پپتید در وجود و یا عدم وجود 3 اسید آمینه می باشد. مطالعات انجام گرفته بر روی بیان این دو نشان می دهد که هر دوی آنها دارای فعالیت های مربوط به GCSF می باشند.
1-16 پروتئین GCSF
فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF)که فاکتور محرک کلنی3 هم نامیده می شود، یک سیتوکین وهورمون محرک رشد و دارای 175 اسید آمینه می باشد. گلیکوپروتئین های طبیعی انسانی در دو فرم وجود دارند. 174 آمینو اسیدی و 180 آمینو اسیدی که پروتئینی طویل با وزن مولکولی 19600 دالتون می باشد. فرم 174 آمینو اسیدی بیشترین فعالیت را دارد که در محصولات دارویی به کمک تکنولوژی DNA نوترکیب ساخته می شود. این فاکتور در بافت های مختلف اثربخشی خود را از طریق تحریک مغز استخوان برای ساخت گرانولوسیت و سلولهای بنیادی انجام می دهد.GCSF همچنین توسط اندوتلیوم، ماکروفاژها و تعدادی از سلولهای ایمنی تولید می شود.

شکل 1-4 ساختار کریستالی از 3 مولکول G-CSF انسانی
1-17 عملکرد پروتئین GCSF
G-CSF مغز استخوان را برای انتشار گرانولوسیت و سلولهای بنیادی در خون تحریک می کند. این پروتئین همچنین باعث تحریک بقاء، تکثیر، تمایز و عملکرد پیش سازه های نوتروفیلی و نوتروفیل های بالغ می شود که تنظیم این واکنش ها از طریق Janus kinase (JAK)، مبدل سیگنال و فعال کننده رونویسی STAT، پروتئین کیناز میتوژنی فعال (MAPK) و فسفاتیدیل اینوزیتول-3-کیناز انجام میشود.
شکل 1-5 مکانیسم عملکرد GCSF
گیرنده های GCSF بر روی سلول های پیش ساز مغز استخوان قرار دارند و در پاسخ به GCSF تحریک می شوند و این باعث رشد و تمایز این سلول ها به گرانولوسیت بالغ می شود. این پروتئین همچنین یک القاء کننده قوی برای انتقال سلول های بنیادی خون ساز هماتوپویتیک از مغز استخوان به درون خون می باشد (Wonganu, 2008).
GCSF همچنین محرک تولید گلبولهای سفید خون نیز می باشد و در انکولوژی و هماتولوژی، در بعضی سرطان های خاص برای افزایش سرعت بهبودی افراد نوتروپنی بعد از شیمی درمانی از شکل نوترکیب آن استفاده می شود. شیمی درمانی سبب تولید سطح غیر قابل قبول (کم) سلولهای سفید خون می شود که این مورد بیماران را در مقابل حملات میکروبی و عفونت ها حساس می نماید.
به نظر میرسدGCSF برای یک بارداری امن در طی مرحله لانه گزینی مؤثر باشد که این امر در بارداری های دوم و سوم بیشتر می شود (Strife, 2013).
در کنار تاثیر بر روی سیستم خون سازی، GCSF همچنین می تواند بر روی سلول های عصبی به عنوان مثال فاکتور نوتروفیک تأثیر بگذارد. در واقع گیرنده های این گلیکوپروتئین بر روی نورون های مغز و نخاع ظاهر می شوند (Cooper, 2011).
همچنین از GCSF برای درمان تخریب بافت قلب از طریق تزریق در خون محیطی به همراهSDF stromal) (cell-derived factor استفاده می شود (Anderlini, 2005) .
امروزهGCSF نوترکیب انسانی در سیستم بیانی باکتری E. coli تولید می شود که با نام فیلگراستیم شناخته شده است. فیلگراستیم از لحاظ ساختاری تفاوت کمی با گلیکوپروتئین طبیعی GCSF دارد. فیلگراستیم (Neupogen) و فیلگراستیم پگیله شده (Neulasta) (PEG-filgrastim) دو نوع تجاری متداول فرم نوترکیب GCSF انسانی rhG-CSF هستند. فرم پگیله، نیمه عمر طولانی تری دارد و این موضوع سبب کاهش ضرورت تزریق روزانه این دارو می شود.
شکل دیگر GCSF نوترکیب انسانی در سلولهای تخمدان هامستر چینی (CHO cells) ساخته می شود که با نام لنوگراستیم شناخته می شود. از آنجا که این سیستم بیانی در سلول پستانداران می باشد، لنوگراستیم تولیدی تفاوت بسیار کمی (غیر قابل تشخیص) در 174 آمینو اسید با GCSF طبیعی انسان دارد.
برای اولین بار در سال 1999 در آکادمی بیوتکنیک چین، ژنوم انسان به عنوان رشته الگو برای کلونینگ و بیان GCSF در غدد پستانی موش استفاده شد و قطعه ای به طول 5/1 کیلوباز با PCR بدست آمد(Lu, 1999).
در سال 2009 محققین به بیان پروتئین نوترکیب GCSF در مخمرPichia Pastoris پرداختند که نتیجه این تلاش بیان این پروتئین تحت پروموتور AOX1 بوده که در نتیجه القاء با متانول میزان پروتئین شده به 2 میلی گرم در لیتر رسید (Apte-Deshpande, 2009).
در سال 1387 محققین ایرانی به جهش زایی هدفمند در فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیت انسانی و کلونینگ و بیان آن در باکتری E. coli پرداختند و نتایج آنها نشان داد که پروتئین نوترکیب مورد نظر با موفقیت در سیستم پروکاریوتی کلون و بیان شده است (حامد ناقوسی، 1387).
به دلیل اهمیت بالینی بالا و نیز نیاز گسترده به GCSF در مراقبت های بهداشتی، تلاش های زیادی به منظور تولید مولکولهای مشابه با فرم طبیعی انسانی آن که دارای عملکرد باشند در حال انجام است.
در سالهای گذشته محققین ایرانی سعی در بیان آن در کاهوی تراریخته داشتنه اند چراکه در این سالها گیاهان تراریخته برای تولید انواع داروی نوترکیب و واکسن ها مورد استفاده قرار گرفته اند (مهدی شریفی تبار،1392).
فصل دوم مواد و روش ها
2-1 میکروارگانیسم های مورد استفاده
از باکتری E. coli سویه ' TOP10F به منظور کلونینگ و تکثیر پلاسمیدها و از مخمر Hansenula polymorpha سویه RB11 به عنوان میزبان بیانی مخمری استفاده شد.
2-2 محیط های کشت مورد نیاز
جهت رشد باکتری‌ E. coli از محیط کشت LB جامد یا مایع و جهت رشد مخمر از محیطهای کشت YPD جامد یا مایع، BMMY و BMGY استفاده شد (پیوست 1).
پس از آماده نمودن محیط¬های کشت میکروبی مورد نیاز، این محیط ها در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه در فشار یک اتمسفر اتوکلاو گردیدند. محلول‌های قندی یا محلولهای حساس به اتوکلاو با استفاده از فیلترهای 22/0 میکرون استریل شدند.
2-3 پلاسمیدهای مورد استفاده
وکتور کلونینگ pGH برای کلون نمودن ژن سنتز شده gcsf توسط شرکت مربوطه مورد استفاده قرار گرفت (شکل 3-1). وکتور بیانی مورد نیاز برای سلولهای مخمری به صورت سنتتیک و با درج عناصر ضروری جهت بیان پروتئین های هترولوگ در این سلولها با استفاده از وکتور کلونینگ pGH به عنوان وکتور اولیه ساخته شده است.

شکل 3-1. وکتور کلونینگ pGH
2-4 آنزیم ها و کیت‌ها
آنزیم Taq DNA polymerase، آنزیم های محدودالأثر، RNaseA و آنزیم T4 DNA ligase از شرکت Fermentas تهیه شدند.
کیت استخراج محصول PCR یا DNA از ژل آگارز از شرکت Roche تهیه گردید.
2-5 آنتی بیوتیکها
آنتی بیوتیک ها (آمپی سیلین، تتراسایکلین و زئوسین) با غلظت مناسب (پیوست 2) تهیه و در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2-6 روش های عمومی
2-6-1 الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز
به منظور بررسی نتایج PCR و یا کیفیت هرنوع مولکول DNA، از ژل آگارز استفاده می شود. به همین جهت ابتدا ژل آگارز با غلظت متناسب با سایز مولکول مورد بررسی تهیه می شود. با توجه به ظرفیت کاست ژل، ابتدا پودر آگارز وزن شده و سپس در حجم مشخصی از بافر TAE (پیوست 3) با رقت X1 حل می گردد. این مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق باقی مانده و سپس مخلوط به مدت 1 دقیقه جوشانده می شود تا به خوبی حل شده و محلول یکنواختی حاصل شود. پس از کاهش دمای محلول تا حدود °C40، به میزان لازم از محلول رنگی DNA Safety Stain به آن اضافه کرده و به آرامی به درون کاست ژل ریخته شده و شانه روی آن قرار داده می شود. پس از چند دقیقه و پس از بستن کامل ژل، شانه به آرامی و به صورت عمودی از داخل آن خارج ‌شده و ژل به همراه کاست در داخل تانک الکتروفورز افقی حاوی بافر TAE (X1) قرار داده می شود. در ادامه نمونه های DNA همراه با حجم مشخصی از بافر بارگذاری ، با ترتیب مشخص به آرامی به درون چاهک ها ریخته می شود. سپس الکترودهای تانک به منبع تغذیه متصل می شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص با توجه به اندازه قطعه، جریان برق قطع گشته و ژل از درون کاست خارج می گردد. ژل را در معرض نور فرابنفش قرار داده و باندها را مشاهده می نماییم.
نکته: در صورتی که قرار است DNA از ژل تخلیص شود، به هیچ‌وجه نمی‌بایست به مدت طولانی در معرض اشعه فرابنفش قرار گیرد زیرا این اشعه طول موج پایینی داشته و قادر است در توالی DNA جهش ایجاد کند.
2-6-2 تخلیص محصول هضم آنزیمی با استفاده از کیت تخلیص از ژل آگارز
جهت انجام کلونینگ، تخلیص محصول هضمهای آنزیمی فوق با استفاده از کیت تخلیص از ژل (Roche) و بر اساس پروتوکل موجود در کیت به شرح زیر انجام ‌شد:
1.به ازای هر mg100 ژل آگارز بریده شده ، µl300 بافر 1 (Binding buffer) به هر تیوب اضافه گردید.
2.تیوب ها به مدت 30-15 ثانیه ورتکس شده و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای C°56 گرماگذاری شدند.
3.در این مرحله به ازای هر mg100 ژل اولیه، µl150 ایزوپروپانول به تیوب ها اضافه شده وسپس ورتکس گردیدند.
4.محتویات هر تیوب به یکی از ستون های کیت افزوده شده و این مجموعه را با بالاترین سرعت (rpm13000) به مدت 30-60 ثانیه سانتریفوژ نمودیم.
5.مایع زیرین دور ریخته شده و سپس µl500 بافر شستشو به هر ستون اضافه گردید.
6.پس از سانتریفوژ در بالاترین سرعت به مدت 1 دقیقه، مایع زیرین دور ریخته شده و در این مرحله µl250 بافر شستشو مجدداً اضافه گردید.
7.پس از سانتریفوژ به مدت 1 دقیقه (در بالاترین سرعت)، هریک از ستون ها را به تیوب های 5/1 میلی لیتری انتقال داده و µl35 آب دیونیزه به فیلتر ستون ها اضافه کرده و پس از انکوباسیون 5 دقیقه ای در دمای اتاق، هریک از تیوبها را مشابه با مراحل قبلی سانتریفیوژ نمودیم.
2-6-3 واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده
واکنش لیگاسیون پس از تعیین غلظت وکتور و قطعه الحاقی تخلیص شده از ژل آگارز، بر طبق واکنش مندرج در جداول مربوطه انجام گرفت. در نمونه کنترل منفی، وکتور خطی شده به تنهایی در یک واکنش لیگاسیون وارد گردید. به عبارت دیگر، در این واکنش به جای قطعه DNA، آب دیونیزه به مخلوط واکنش اضافه گردید. تمامی تیوب ها به مدت 16 ساعت (ON) در دمای °C4 گرماگذاری شدند. این دما کمک می‌کند تا تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین انتهاهای چسبنده آسان‌تر و با پایداری بیشتری انجام شود و آنزیم لیگاز نیز زمان کافی برای تشکیل پیوند فسفودی‌استری را خواهد داشت.
2-6-4 تهیه سلول‌ های مستعد 'E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم
باکتری مستعد، سلولی است که توانایی لازم برای وارد نمودن پلاسمید به درون خود را پیدا کرده است.
1.یک کلنی از باکتری مورد نظر به مدت 3-2 ساعت در حضور تتراسایکلین در محیط LB مایع و در دمای °C37 بر روی شیکر با سرعت rpm 150 کشت داده شد تا جذب نوری محیط کشت در طول موج nm600 (OD600nm) به 6/0-4/0 رسید.
2.محیط کشت در شرایط استریل (در کنار شعله) به میکروتیوپ استریل منتقل شده و با سرعت rpm9000 به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شد.
3.محیط کشت دور ریخته شده و رسوب سلولی در µl720 کلرید سدیم mM100 سرد استریل، حل شده و به مدت 20 دقیقه در یخ گذاشته شد.
4.پس از گذشت این مدت، سوسپانسیون باکتریایی با دور rpm9000 و به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شده و مراحل 3 و 4 تکرار شدند.
5.رسوب باکتریایی حاصل در µl300 محلول کلرید کلسیم حل گردید.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

2-6-5 انتقال پلاسمید به سلول های مستعد (ترانسفورماسیون)
1.µl100 از سوسپانسیون سلول های مستعد به تیوپ استریل انتقال داده شد.
2.حجم مشخصی از پلاسمید و یا محصول لیگاسیون به سوسپانسیون باکتریایی اضافه شده و تیوب ها به مدت 30 دقیقه درون یخ قرار داده می شوند.
3.بلافاصله تیوب ها به حمام آبی دمای °C42 منتقل شده و به مدت 90 ثانیه گرماگذاری شدند. پس از اتمام این زمان سریعاً تیوب ها را به ظرف یخ منتقل نمودیم.
4.ml 1 محیط کشت مایع LB به محتویات هر یک از تیوبها اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در °C37 گرماگذاری گردیدند.
5.100 تا 150 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی بر روی محیط کشت LB جامد حاوی آنتی بیوتیک های مناسب (آمپی سیلین، تتراسایکلین یا زئوسین) کشت داده شد و پلیت ها به مدت 16 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری شدند.
6.پس از گذشت این مدت، از کلنی های تشکیل شده بر روی محیط کشت جامد، ماتریکس سلولی تهیه گردید.
2-6-6 بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع
1.مقدار µl50 از محلول EDTA(10 میلی مولار) به تیوبها اضافه کرده و حدود 70% از ماتریکس باکتریایی را در آن حل نموده و سوسپانسیون را ورتکس نمودیم.
2.مقدارµl 50 از محلول NSS (پیوست 4) را به هر تیوب افزوده و به مدت 30 ثانیه ورتکس نمودیم.
3.تیوب ها را به مدت 5 دقیقه در حمام آبی°C 70 گرماگذاری نمودیم.
4.مقدار µl 5/1 از محلول KCl (4 مولار) به تیوب ها اضافه کرده و هر تیوب به مدت 30 ثانیه ورتکس گردیده و سپس به مدت 5 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد.
5.محتویات هر سلول در دمای 4 درجه به مدت 3 دقیقه در g3000 سانتریفوژ گردید.
6.مایع رویی هر تیوب به تیوب جدید منتقل شد و میزان µl25 از آن بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
2-6-7 PCR بر روی کلنی های باکتریایی/ مخمری
با رعایت شرایط استریل، از کلنی های رشد یافته بر روی پلیت ماتریکس، مقداری باکتری برداشته و در مقداری آب دیونیزه استریل حل نموده و به مدت 5 دقیقه در بن ماری در حال جوش (100 درجه سانتی گراد) جوشانده و سپس از این محلول بعنوان الگوی DNA برای انجام PCR بر اساس پروتوکل مندرج در قسمت مربوطه استفاده می شود.

2-6-8 استخراج پلاسمید در مقیاس کم
1.باکتری E. coli حاوی پلاسمید مورد نظر را به لوله ml5 محیط کشت LB مایع حاوی آنتی بیوتیک مناسب تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) درون شیکر انکوباتور در دمای C°37 با دور 140 rpm قرار می دهیم.
2.سلولهای باکتریایی را با سرعت rpm10000 به مدت 3 دقیقه جمع آوری می نماییم.
3.در این مرحله رسوب باکتریایی را می توان در دمای °C20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصله از مرحله 3 را در µl100 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5. µl200 از محلول شماره 2 (پیوست 5) را به محلول حاصل از مرحله قبل اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.µl150 استات سدیم به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه درون ظرف یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول فوق را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
8.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
9.هم حجم مایع بدست آمده از مرحله قبل به آن مخلوط فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل به نسبت 25، 24، 1 اضافه می کنیم.
10.محلول را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
11.با دقت مایع رویی را به تیوپ دیگری منتقل می کنیم.
12.به میزان ml1 اتانول 96% سرد به مایع رویی اضافه کرده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C20- نگهداری می نماییم.
13.نمونه را در rpm12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می نماییم.
14.به میزان µl750 اتانول 70% سرد به رسوب مرحله قبل اضافه کرده و مشابه با مرحله قبل سانتریفوژ می نماییم.
15.رسوب بدست آمده را در µl30-20 آب دیونیزه استریل حل می نماییم.
2-6-9 استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد
برای این کار از روش لیز قلیایی استفاده شد. مراحل انجام این روش به شرح زیر می باشد:
1.میزان µl450 از محلول آنتی بیوتیکی تتراسایکلین (غلظت نهاییml / µg15) را به ml300 محیط کشت مایع LB اضافه نموده و سپس سلول E. coli TOP10F' حاوی پلاسمید مورد نظر را به این محیط تلقیح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) بر روی شیکر انکوباتور C°37 قرار می دهیم.
2.محیط کشت به لوله های 50 میلی لیتری منتقل شده و با سرعت rpm10000 به مدت 4 دقیقه سانتریفوژ می گردد.
3.پس از انجام سانتریفوژ، محیط کشت رویی تخلیه شده و رسوب سلولی جمع آوری می گردد. در این مرحله می توان رسوب سلولی را در دمای °C 20- نگهداری نمود.
4.رسوب حاصل از مرحله 3 را در ml6 از محلول شماره 1 (پیوست 5) حل می کنیم.
5.به مقدار ml12 از محلول شماره 2 (پیوست 5) به تیوب فوق اضافه نموده و 10 دقیقه درون یخ قرار می دهیم.
6.سی میلی لیتر از محلول استات سدیم M3 (2/5pH) به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه درون یخ نگهداری می نماییم.
7.محلول را به مدت 15 دقیقه در rpm12000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ می نماییم.
8.مایع رویی را از گاز استریل عبور داده و به محلول فیلتر شده، ml16 ایزوپروپانول اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری می کنیم. سپس این محلول را در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ نموده، مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک می کنیم.
9.رسوب خشک شده را در ml1 آب دیونیزه استریل حل کرده و به آن µl40 از محلول RNaseA (mg/ml10) اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در دمای °C37 گرماگذاری می نماییم.
10. به محلول فوق به نسبت 1:1 از فنل و کلروفرم اضافه نموده و به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژ می نماییم.
11.فاز رویی (فاز آبی) را به تیوپ جدید منتقل کرده و دو برابر حجم این فاز، به آن اتانول 96% سرد اضافه نموده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C 20- قرار داده و سپس به مدت 10 دقیقه در rpm12000 سانتریفوژمی نماییم.
12.مایع رویی را دور ریخته و به رسوب حاصل ml1 اتانول 70% سرد اضافه نموده و مجدداً سانتریفوژ می نماییم.
13.مایع رویی را دور ریخته و رسوب حاصله را در دمای اتاق خشک نموده و سپس در µl150-100 آب دیونیزه حل می کنیم.
2-6-10 الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید (SDS-PAGE)
مقدمه
الکتروفورز در واقع همان حرکت ذرات باردار تحت تأثیر میدان الکتریکی، می باشد. خصوصیات مولکول ها (اندازه، شکل، میزان بار الکتریکی)، شرایط محیطی (قدرت یونی، pH، درجه حرارت و نوع ژل) و فاکتورهای الکتریکی (اختلاف پتانسیل، شدت جریان و ولتاژ) میتوانند در این فرایند مؤثر باشند. از متداول ترین محیط های نیمه جامد برای الکتروفورز پروتئین ها پلی اکریل آمید می باشد که پروتئین ها را در محدوده وزنی 500 تا 250000 دالتون از هم جدا می کند. این ماتریکس، پلیمری از مولکول های خطی اکریل آمید و N و N- متیلن بیس اکریل آمید می باشد. مولکول های بیس اکریل آمید پل های عرضی را بین مولکول های خطی اکریل آمید ایجاد می کنند و تشکیل یک شبکه رشته ای را می دهند که قادرند پروتئین ها را از هم جدا کنند. پلیمریزاسیون این ترکیبات در حضور آمونیوم پرسولفات آغاز می شود و به دلیل سرعت کم این واکنش، از ماده TEMED بعنوان کاتالیزور واکنش پلیمریزاسیون استفاده می شود. عامل اصلی حرکت مولکول های باردار در الکتروفورز، اختلاف پتانسیل (V) بین قطب های مثبت و منفی می باشد. در روش SDS-PAGE پروتئین ها در حضور شوینده یونی SDS، الکتروفورز می شوند. این ماده به اسید های آمینه هیدروفوب پروتئین ها متصل شده و ساختمان طبیعی پروتئین ها را واسرشته کرده و به ازای طول زنجیره پپتیدی بار منفی ثابتی به آن ها اضافه می کند. بنابر این در این نوع الکتروفورز، به دلیل خنثی شدن اثر بار پروتئین ها توسط SDS، پروتئین ها تنها بر اساس اندازه و شکل از هم جدا می شوند(Sambrook, 2001).
مواد لازم
-اکریل آمید
-N,N متیلن بیس اکریل آمید
-سدیم دو دسیل سولفات (SDS)
-تریس بازی
-TEMED
-آمونیوم پرسولفات (APS)
-آب مقطر
-رنگ کوماس بلو (شامل کوماسی بریلینت بلو G250، متانول، اسید استیک گلاسیال می باشد)
-بافر نمونه x6 ( شامل تریس بازی، گلیسرول، SDS، برومو فنل بلو و 2-مرکاپتو اتانول (2-ME) می باشد)
-بافر تانک X1 (شامل تریس، گلایسین،SDS و آب مقطر می باشد، پیوست 6).
-الکل 96%
وسایل لازم
•سیستم الکتروفورز (منبع تغذیه، تانک، شیشه ها، فضا سازها و شانه )
•سرنگ هامیلتون
روش انجام کار
روش تهیه ژل تحتانی یا جدا کننده (پیوست 6)
•ژل تحتانی بر اساس جدول (3-1) تهیه می شود. درصد ژل بستگی به وزن مولکولی پروتئین دارد. هر چه وزن مولکولی نمونه، بیشتر باشد از درصد پائین تر ژل استفاده می شود تا پروتئین بهتر بتواند در ژل حرکت کند.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه نموده و خوب مخلوط نمایید.
2-6-10-1روش تهیه ژل فوقانی (پیوست 6)
•از این ژل به منظور متراکم کردن نمونه پروتئینی استفاده می شود و عموماً از ژل 4% استفاده می شود. این ژل بر اساس مقادیر جدول(3-1) تهیه می گردد.
•محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه و به خوبی مخلوط نمایید.
•صفحات شیشه ای را با آب و الکل 70% کاملاً تمیز کرده و دو فضا ساز بین صفحات شیشه ای قرار دهید و با گیره محکم کنید. در ظرفی جداگانه به 1 تا 2 میلی لیتر از محلول ژل تحتانی کل TEMED لازم برای ژل تحتانی را اضافه کرده وتوسط آن سریعاً اطراف قالب شیشه ای و به ویژه انتهای ژل را پوشانده تا از نشت احتمالی جلوگیری شود. قالب شیشه ای بطور عمودی روی سطح صاف قرار داده شود.
•پس از تهیه ژل تحتانی، TEMED را به آن اضافه کرده و پس از اینکه کاملاً مخلوط شد، داخل قالب شیشه ای تا ارتفاعی که حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل فوقانی باقی بماند، بریزید.
• سپس مقداری اتانول 96% را به گونه ای که سطح ژل بهم نخورد، به آرامی در بالای ژل ریخته و صبر کنید تا ژل ببندد.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل تحتانی، الکل روی ژل را خالی و سطح ژل را چند بار با آب مقطر شستشو دهید.
•شانه را بین دو شیشه در بالای ژل قرار دهید و سپس به ژل فوقانی تهیه شده، TEMED را اضافه نموده و پس از خوب مخلوط کردن بر روی ژل تحتانی بریزید.
•پس از اطمینان از بسته شدن ژل فوقانی، شانه را به آرامی خارج و داخل چاهک ها را چندین بار با آب مقطر شستشو دهید. قالب شیشه ای را با گیره به سیستم الکتروفورز وصل کرده و محفظه بالا و پائین سیستم را با بافر تانک پرکنید.

جدول 2-1 نحوه تهیه درصدهای مختلف ژل های فوقانی و تحتانی در SDS-PAGE

2-6-10-2 آماده سازی نمونه
•بر اساس نوع و غلظت نمونه، از بافر نمونه به آن اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار دهید.
•نمونه ها را با استفاده از سرنگ هامیلتون در داخل چاهک ها بریزید. مقدار نمونه قرار داده شده در هر چاهک بستگی به اندازه چاهک، میزان خلوص نمونه، روش رنگ آمیزی و نوع بافر نمونه (X2و X6) دارد.
•سیستم الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل نمایید و در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، هنگامیکه نمونه داخل ژل فوقانی است از ولتاژ V60 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل تحتانی ولتاژ به V130 رسانده شود.
•پس از اتمام الکتروفورز (رسیدن رنگ نشانه به انتهای ژل)، منبع تغذیه را خاموش کنید. قالب شیشه ای را خارج کرده و فضا سازها بیرون آورده شود. با قرار دادن یکی از فضا سازها بین دو صفحه شیشه ای، شیشه بالایی را جدا نمایید.
• سپس ژل رنگ آمیزی گردد.
2-6-10-3 رنگ آمیزی ژل SDS-PAGE
به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، لازم است ژل را رنگ آمیزی نمود. روشهای مختلفی برای رنگ آمیزی ژل های SDS-PAGE وجود دارد که متداولترین آنها روش رنگ آمیزی با کوماسی بلو و یا نیترات نقره می باشد. عموماً از روش کوماسی بلو استفاده می شود زیرا که یک روش سریع و ارزان بوده و ثبات رنگ طولانی است.
استفاده از کوماسی بلو
مواد لازم
-رنگ کوماسی بلو
-الکل 96% (برای رنگ بری)
-آب مقطر
روش انجام رنگ آمیزی
•ژل را در داخل ظرف رنگ آمیزی قرار می دهیم و مقداری رنگ به آن اضافه و به مدت10 دقیقه بر روی شیکر می گذاریم.
•رنگ را خالی کرده و ژل را داخل محلول رنگ بر (آب مقطر حاوی اتانول) بر روی شیکر قرار می دهیم تا زمینه ژل شفاف شده و باندهای پروتئینی آبی رنگ نمایان شوند.
2-6-10-4 رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (پیوست 7)
•قرار دادن ژل در بافر فیکساسیون به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر.
•دور ریختن بافر فیکساسیون و اضافه نمودن بافر شستشو سه بار و هر بار به مدت 20 دقیقه.
•اضافه کردن بافر sensitizing به مدت 2 دقیقه.
•دور ریختن بافر sensitizing و شستشو با آب مقطر سه بار و هر بار 5 دقیقه.
•اضافه کردن بافر رنگزا به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر.
•شستشوی ژل در آب مقطر و اضافه کردن بافرdeveloping تا ظهور باندهای پروتئینی.
•اضافه کردن بافر متوقف کننده به مدت 15 دقیقه.
•شستشوی ژل در آب مقطر.

2-7 روشهای اختصاصی
2-7-1 سنتز ژن gcsf
توالی cDNA کد کننده پروتئین GCSF به طول bp 615 از بانک ژنومی (شماره 172219.1) استخراج و به منظور سنتز به یکی از شرکتهای فعال در این زمینه سفارش داده شد. این توالی به منظور بیان در سلولهای مخمری از نظر کدونهای مورد استفاده در سنتز پروتئین، بهینه سازی شده و پس از بررسی های نهایی از نظر جایگاه های برش آنزیم های محدودالأثر، ساخته شده و در وکتور کلونینگ pGH کلون گردید. در دو انتهای این ژن، دو جایگاه برش آنزیمی برای آنزیمهای محدودالأثر HpaI و BamHI در نظر گرفته شد تا برای جدا نمودن این قطعه و کلون کردن آن در وکتور بیانی مخمر استفاده شوند. لازم به ذکر است که جایگاه برش این آنزیم ها بر روی قطعه ژنی سنتز شده، وکتور pGH و وکتور بیانی هانسونلا وجود ندارد.
2-7-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
2-7-1-1-1 طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
به منظور انجام PCR بر روی ژن gcsf در وکتورهای بدست آمده در مراحل مختلف، پرایمرهای اختصاصی این ژن با استفاده از برنامه genrunnr سنتز گردید (جدول 2-2).

پرایمر F 'gtagatcttgcggatccccc-3-'5
پرایمر R 'gtagatcttggtctccagcttgc-3-'5
جدول 2-2: توالی پرایمرهای ژن gcsf
2-7-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
با انجام گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها به منظور بهینه سازی شرایط این واکنش مشخص گردید. این واکنش بر اساس مواد ذکر شده در جدول2-3 و بر طبق برنامه مندرج در جدول 2-4 انجام شد.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-3 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش gcsf PCR
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-4 برنامه PCR گرادیان مربوط به ژن gcsf

2-7-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
به منظور کلون نمودن قطعه ژنی gcsf، این قطعه با برش آنزیمی از وکتور کلونینگ حامل قطعه (pGH-gcsf) جدا شده و در وکتور بیانی برش خورده با همان آنزیمها وارد گردید.
2-7-2-1 هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
با توجه به جایگاههای برشی که در دو انتهای این قطعه (ژن gcsf) در نظر گرفته شد (جایگاه برش BamHI در انتهای ´5 و جایگاه‌ برش HpaI در انتهای ´۳)، این قطعه از وکتور مورد نظر (pGH-gcsf) بر اساس واکنش مندرج در جدول 2-5 در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 5 ساعت مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-5 واکنش هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
2-7-2-2 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan
وکتور pHan نیز با آنزیمهای BamHI و HpaI بر طبق جدول 2-6 مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-6 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan
2-7-2-3 کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan
واکنش لیگاسیون قطعات هضم و تخلیص شده پس از تعیین غلظت، بر طبق واکنش مندرج در جدول 2-7 انجام گرفت. تیوب ها به مدت 16 ساعت در یخچال قرار گرفته و پس از آماده سازی سلولهای مستعد از E. coli TOP10F'، به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های حاوی آمپی سیلین و تتراسایکلین کشت داده شدند.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan خطی شده (ng/µl100) 1 1
قطعه gcsf (ng/µl15) 16 -
بافر T4 DNA ligase (10X) 2 2
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 17
جدول 2-7 واکنش لیگاسیون ژن gcsf در وکتور بیانی pHan

کلنی های ظاهر شده بر روی پلیت ها، به صورت ماتریکس کشت داده شده و به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند.
2-7-2-4 بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf
•بررسی کلون ها به روش سریع
مقداری از هر کلنی بر اساس پروتوکل موجود (2-6-6) آماده سازی شده و بر روی ژل آگارز برده شد. وکتورهای سنگین تر از وکتور بیانی pHan (بدون ژن الحاقی)، به عنوان وکتورهای مشکوک گزارش گردید.
•استخراج پلاسمید در مقیاس کم
از کلنی هایی که gcsf PCR آنها مثبت گردید، بر اساس پروتوکل2-6-8 به لوله های ml5 حاوی محیط LB مایع کشت داده و پس از گرماگذاری در °C37 به مدت 16 ساعت، استخراج پلاسمید در مقیاس کم انجام گردید.
•gcsf PCR بر روی پلاسمیدهای استخراج شده pHan-gcsf
پلاسمیدهای استخراج شده در واکنش PCR ژن gcsf بر اساس پروتوکل 2-7-1-1 وارد شده و محصول PCR بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
•هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf
پلاسمید تأیید شده در مراحل قبل، مورد هضم آنزیمی با آنزیم های محدودالأثر BamHI، EcoRI و HpaI بر طبق جدول2-8 قرار گرفته و پس از گرماگذاری در C °37 به مدت 3 ساعت، محصول واکنشها بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 2
بافر آنزیمی (10X) 2
آنزیم محدودالأثر (units/µl10) 75/0
آب دیونیزه 25/15
جدول 2-8 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf
•استخراج پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf در مقیاس زیاد
پلاسمید تأیید شده با تست های فوق، بر اساس پروتوکل های2-6-9 منظور استفاده در مراحل بعدی، به مقیاس انبوه استخراج گردید.
2-7-3 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-3-1 PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)
در این تحقیق، به منظور غربالگری کلونهای هانسونلا بر آن شدیم تا ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble) را در وکتور بیانی pHan که حاوی ژن gcsf می باشد کلون نماییم. برای این منظور، توالی این ژن در وکتور pPICZα (Invitrogen, USA) موجود در بخش بیوتکنولوژی بررسی گردید و پرایمرهای لازم جهت تکثیر این ژن طراحی گردید (جدول 2-9) و جهت سنتز سفارش داده شد. پس از دریافت پرایمرها، دمای بهینه برای تکثیر این ژن، به روش PCR گرادیان، در محدوده 65-50 درجه سانتی گراد (جدول2-10) بر طبق جدول 2-11 انجام شد.
پرایمر F 5'-gtagatcttgcggatccccc-3'
پرایمر R 5'-gtagatcttggtctccagcttgc-3'
جدول 2-9 پرایمرهای طراحی شده جهت تکثیر ژن zeocin
تعداد چرخه مدت زمان (دقیقه) دما (°C)
واسرشتی اولیه 1 '5 ˚94
واسرشتی
اتصال پرایمرها
طویل شدن 35 '1
"30
"30 ˚94
60-50
˚72
طویل شدن نهایی 1 '5 ˚72
جدول 2-10 برنامه PCR گرادیان ژن zeocin
مواد مقدار (µl)
DNA الگو (پلاسمید pPICZα) (1:10) 2
بافر PCR (X10) 2
کلرید منیزیم (mM25) 6/0
dNTPs (mM10) 4/0
پرایمر F (mM25) 3
پرایمر R (mM25) 3
Taq DNA polymerase (units/µl5) 1/0
آب مقطر به حجم 20 میکرولیتر
جدول 2-11 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش zeocin PCR
2-7-3-2 کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy
قطعه تکثیر شده zeocin با استفاده از کیت از ژل آگارز بر اساس پروتوکل 2-6-2 استخراج شده و پس از تعیین غلظت،واکنش لیگاسیون آن در وکتور کلونینگ pGEM بر طبق جدول 2-12 صورت گرفت.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pGEM-T Easy خطی (ng/µl50) 1 1
ژن zeocin (ng/µl50) 2 -
بافر T4 DNA ligase (X4) 5 5
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه 11 13
جدول 2-12 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور pGEM-T Easy

واکنشهای فوق به صورت ON در دمایC ˚4 قرار داده شدند و پس از تهیه سلولهای مستعد از سلولهای ' E. coli TOP10F ، به این سلول ها منتقل شده و بر روی محیط LB آگار با غلظت پایین NaCl (پیوست 1) و حاوی زئوسین، تتراسایکلین، IPTG و X-gal (پیوست 5) کشت داده شد. پس از گرماگذاری در 37 درجه به مدت 16 ساعت، کلنی های سفید تشکیل شده، بر روی پلیت ماتریکس حاوی ترکیبات فوق کشت داده شدند.
2-7-3-3 بررسی کلونهای نوترکیب pGEM-Zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
70% هر یک از کلنی های سفید به روش quick check (پروتوکل 2-6-6) مورد بررسی قرار گرفت.
•استخراج پلاسمید pGEM-Zeo در مقیاس کم
از کلون نوترکیب تأیید شده با دو روش قبل، استخراج پلاسمید در مقیاس کم (2-6-8) انجام گردید.
•هضم آنزیمی وکتور pGEM-Zeo
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده از مراحل قبل با آنزیم BglII به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد بر اساس جدول 2-13 صورت گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pGEM-Zeo 2
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/15
جدول 2-13 واکنش هضم آنزیمی pGEM-Zeo با BglII
2-7-4 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-4-1 هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo
برای کلون نمودن قطعه ژنی مقاومت به زئوسین در وکتور pHan-gcsf، این دو وکتور با آنزیم BglII که جایگاه برش آن در دو انتهای قطعه ژنی زئوسین و نیز بر روی وکتور pHan-gcsf در نظر گرفته شده بود، مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند (جدول 2-14).
مواد مقدار (µl)
پلاسمید 20
بافر آنزیمی (X10) 20
BglII (units/µl10) 5
آب دیونیزه 155
جدول 2-14 واکنش هضم آنزیمی pGEM-zeo و pHan-gcsf با BglII
وکتور pHan-gcsf هضم و تخلیص شده، بر اساس جدول 2-15 به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی گراد تحت تیمار با آلکالین فسفاتاز قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf 60
بافر آنزیمی (X10) 8
آنزیم آلکالین فسفاتاز (units/µl10) 2
آب دیونیزه -
جدول 2-15 تیمار وکتور هضم شده pHan-gcsf با آلکالین فسفاتاز
2-7-4-2 کلون نمودن قطعه ژنی zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
پس از هضم آنزیمی، قطعه مورد نظر (ژن مقاومت به زئوسین، حدوداً bp1100( از روی ژل جدا شده و پس از تخلیص با کیت، بر طبق واکنشهای لیگاسیون جدول 2-16 در درون وکتور بیانی pHan-gcsf تیمار شده با آلکالین فسفاتاز کلون گردید.
مقدار (µl)
مواد واکنش اصلی واکنش کنترل
وکتور pHan-gcsf خطی شده (ng/µl100) 5/1 5/1
قطعه zeocin (ng/µl15) 25 -
بافر T4 DNA ligase (X2) 3 3
T4 DNA ligase (units/µl5) 1 1
آب دیونیزه - 5/24
جدول 2-16 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
واکنش‌های فوق به صورتON در دمای C˚4 قرار داده شدند و روز بعد پس از تهیه سلولهای مستعد از E. coli TOP10F' به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های LB آگار با غلظت پایین NaCl و حاوی زئوسین با غلظت µg/ml25 کشت داده شدند. پس از گذشت 16 ساعت در دمای C˚37، از کلنی های رشد یافته، پلیت ماتریکس تهیه گردید.
2-7-4-3 بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
•بررسی سریع کلونهای نوترکیب
کلونهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی زئوسین به منظور بررسی الحاق قطعه ژنی مقاومت به زئوسین بر روی ژل آگارز برده شدند.
•بررسی کلونها به روش Colony-PCR
کلونهایی که با روش سریع سنگینتر تشخیص داده شدند، برای انجام PCR اختصاصی ژن زئوسین مورد استفاده قرار گرفتند.
•برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
به منظور تأیید نهایی وکتور نوترکیب فوق، با توجه به سایت‌های برشی موجود، وکتور بر اساس جدول 2-17 با آنزیم BglII برش داده شد. مخلوط این واکنش به مدت 3 ساعت در دمای C˚37 گرماگذاری شد و سپس بر روی ژل 1% برده شد.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 3
بافر آنزیمی (X10) 2
BglII (units/µl10) 5/0
آب دیونیزه 5/14
جدول 2-17 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با BglII
2-7-5 انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا
2-7-5-1 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin
پس از اطمینان از قرار گرفتن ژنهای مورد نظر در پلاسمید هانسونلا، انتقال این پلاسمید به درون میزبان مخمری (هانسونلا پلی مورفا) با روش الکتروپوریشن صورت گرفت. برای این منظور، به مولکول DNA خطی شده با غلظت بالا نیاز می باشد. برای تهیه DNA خطی، وکتور نوترکیب تأیید شده در مراحل قبل با آنزیم EcoRI بر طبق جدول 2-18 مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و پس از استخراج از ژل، در پروسه الکتروپوریشن مورد استفاده قرار گرفت.
مواد مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin 15
بافر آنزیمی (X1) 20
EcoRI (units/µl10) 5
آب دیونیزه 160
جدول 2-18 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با EcoRI
2-7-5-2 الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا
1.ابتدا میزان مناسبی از کلنی تازه رشد یافته مخمر را به درون ml200 محیط کشت مایع YPD تلقیح نموده و محیط را بر روی شیکر در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری میکنیم تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر (OD600nm) به 2/1-8/0 برسد.
2.محیط کشت فوق را در rpm5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نموده و به میزان 2/0 برابر، بافر فسفات پتاسیم mM50 ولرم (C°37( با 5/7pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهایی mM25 به آن اضافه نمایید.
3.سلولها را به مدت 15 دقیقه در دمای C°37 قرار می دهیم.
4.سلول ها را با سانتریفوژ در rpm5000 به مدت 5 دقیقه جمع آوری نموده و دو بار با بافر STM (پیوست 7) درحالیکه سلولها بر روی یخ قرار دارند شستشو می دهیم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اولیه).
5.رسوب سلولی نهایی را در 005/0 حجم اولیه از بافر STM حل کرده و این سوسپانسیون سلولی مستعد را در حجم های کم در دمای C°70- نگهداری میکنیم.
6.به منظور ترانسفورم نمودن سلولهای مستعد، سوسپانسیون های سلولی (حجم µl60) را بر روی یخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطی شده را به آن اضافه میکنیم.
7.سپس سلولها به کووت الکتروپوریشن 2 میلی متری سرد منتقل می شوند.
8.بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوریشن قرار داده و به آن پالسی با مشخصات 2 کیلوولت، 25 میکروفاراد و 200 اهم وارد مینماییم.
9.بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محیط کشت YPD به تیوب حاوی سلولها اضافه کرده و به مدت 1ساعت در دمای °C 37 در شیکر انکوباتور قرار می دهیم.
10.محیط را سانتریفوژ نموده (rpm5000, 5دقیقه( و سلولها را بر روی محیط کشت YPD جامد حاوی زئوسین با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت 5-3 روز در دمای °C37 قرار میدهیم.
11.سلولهای رشد یافته در غلظت بالای زئوسین (µg/ml400)، به صورت ماتریکس بر روی پلیت حاوی 800 و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.
12.پس از گذشت مدت زمان لازم (3 روز) از کلونهای رشد یافته برای انجام PCR اختصاصی ژنهای کلون شده در وکتور بیانی استفاده گردید.
2-7-5-3 تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین
PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلونهای نوترکیب رشد یافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل 2-7-3-1 و جدول 2-13 انجام گردید.
2-7-6 بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
2-7-6-1 کشت سلولهای مخمری
1.سلول مخمری تأیید شده با PCR ژن زئوسین و نیز سلول مخمری فاقد پلاسمید در ml5 محیط کشت BMGY (پیوست 1) کشت داده شده و بر روی شیکر در دمای С °30 با دور rpm200 قرار داده شد تا OD600 محیط به 6-2 برسد (حدود 18-16 ساعت).
2.محیط کشت فوق را در g3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نمودیم.
3.رسوب سلولی را در 30 میلی لیتر محیط BMMY (پیوست 1)، اختصاصی جهت بیان پروتئین های نوترکیب با اتانول حل نموده و مجدداً برای ادامه رشد در انکوباتور قرار دادیم.
4.پس از گذشت 24 ساعت، از متانول 100% به غلظت نهایی 5/0% به محیط اضافه نمودیم تا بیان پروتئین القاء گردد.
5.پس از گذشت مدت زمان 96 ساعت از شروع کشت، محیط بیانی را در دور rpm6000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوز مینماییم.
6.محلول رویی را به تیوب جدید منتقل نموده و پس از اندازه گیری غلظت پروتئینی در 280 نانومتر، اقدام به تغلیظ این محلول به منظور بررسی با SDS-PAGE می نماییم.
7.محلول فوق را با عبور از فیلترهای Centriprep YM50 بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده تغلیظ می نماییم.
2-7-6-2 بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE
•ژل SDS-PAGE 15% بر اساس روش ذکر شده در بخش2-6-10 تهیه گردید.
•پس از انجام الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل، میزان بیان پروتئین نوترکیب با روش کوماسی بلو بر اساس شدت باند حاصله مورد بررسی قرار گرفت.
2-7-7 تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش
تولید آنتی بادی پلی کلونال به روشهایی برای معرفی یک ایمونوژن به حیوان و خونگیری برای سنجش میزان آنتی بادی نیاز دارد. انتخاب حیوان بستگی به امکانات موجود در نگهداری حیوان، میزان آنتی سرم مورد نیاز و میزان ایمونوژن موجود، دارد. پاسخ ایمنی بهتر، عموماً زمانی بدست می آید که از یک ادجوان مناسب در اولین ایمنی زایی استفاده گردد. برای این منظور، ایمونوژن بصورت یک امولسیون آب و روغن آماده می شود که حاوی میکوباکتریوم کشته شده با حرارت می باشد که تحت عنوان آدجوان کامل فروند معرفی می گردد. استفاده از این امولسیون فرد را مطمئن می کند که آنتی ژن به آرامی در جریان خون حیوان آزاد می شود و از طرفی باکتریهای کشته شده میکوباکتریوم، سیستم ایمنی حیوان را تحریک می کنند. ایمن سازی های بعدی، برای افزایش سطح آنتی بادی لازم اند و در بافر فسفات سالین (PBS) یا در امولسیون روغنی (ادجوان ناقص فروند ) مصرف می شوند (Johnstone, 1996).
روشهای مختلفی برای تزریق ایمونوژن وجود دارد (Johnstone, 1996) که عبارتند از :
1)درون ماهیچه ای (i.m=Intra muscular)
2)درون رگی (i.v = Intra venous)
3)درون پوستی (i.d = Intra dermal)
4)درون صفاقی (i.p = Intra peritoneal)
5)زیر پوستی (s.c = Sub cutaneous)
ایمن سازی درون پوستی یک روش مؤثر در ایجاد پاسخ اولیه است. روشهای i.m و i.d و یا s.c بهتر است در چندین محل مختلف صورت گیرند.
در مورد خرگوشها، در اولین ایمن سازی به μg200-50 پروتئین در FCA نیاز است که باید به صورت درون پوستی به 8-6 جای مختلف از پشت حیوان تزریق گردد. تزریقهای بعدی با فاصله 28 روز یا بیشتر، با 200-50 میکروگرم پروتئین آماده شده در PBS یا FIA به فرم i.m یا i.v یا s.c صورت می گیرد (Johnstone, 1996).
1) اولین تزریق:
•براساس غلظت نمونه پروتئینی مورد نظر (پروتئین GCSF نوترکیب موجود در بازار دارویی (ساخت شرکت پویش دارو)، l85 از ویال (200 میکروگرم) را برداشته و با l415 از PBS استریل مخلوط کرده و آن را با μl500 ادجوان کامل فروند مخلوط کرده و با emulsifier آنقدر این دو ماده را مخلوط کردیم تا شیری رنگ و سفت شد.
•قبل از اولین تزریق،ml 1 خون از حیوان گرفته شد تا به عنوان کنترل منفی (قبل از تزریق) از آن استفاده شود.
•این نمونه در rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید و سرم از گلبول های قرمز جدا گردید. سرم را در تیوب جدید ریخته و در 20- درجه سانتیگراد نگهداشتیم.
•محلول آماده شده از آنتی ژن در FCA به 8 جای مختلف از پشت خرگوش به صورت درون پوستی تزریق گردید.
2) دومین تزریق:
•سی روز پس از اولین تزریق، دومین تزریق به خرگوش باμl 85 از نمونه پروتئینی (200 میکروگرم) در μl415 PBS استریل با μl 500 ادجوان ناقص فروند مجدداً به صورت درون پوستی صورت گرفت.
•30 روز بعد، ml1 خون از حیوان گرفته شد تا از نظر ایمنی زایی تزریقهای فوق با روش ایمونوبلاتینگ، مورد بررسی قرار بگیرد.
2-7-8 ایمونوبلاتینگ
برای شناسایی پروتئین های اختصاصی از طریق آنتی بادی های پلی کلونال یا مونو کلونال، از لکه گذاری ایمنی استفاده می شود. در روش لکه گذاری ایمنی نمونه های پروتئینی در حضور ماده SDS و عوامل احیاء کننده (مانند 2- مرکاپتواتانول) الکتروفورز شده و سپس از روی ژل به غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی منتقل می گردند و با استفاده از آنتی بادی های نشاندار شده شناسایی می شوند. برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء از روش هایی مانند روش تانک و یا روش نیمه خشک استفاده می شود. در روش انتقال با تانک، از بافر حاوی تریس -گلایسین و متانول استفاده می شود که متانول علاوه بر اینکه از تورم ژل جلوگیری می کند، باعث جدا شدن SDS از پروتئین ها شده و بازده اتصال پروتئین به غشاء را افزایش می دهد. در روش انتقال نیمه خشک، ساندویچ انتقال پس از خیس شدن در بافر انتقال، بین دو الکترود بزرگ گرانیتی قرار گرفته و عمل انتقال انجام می گیرد (Sambrook, 2001).
در اینجا روش انتقال با روش نیمه خشک توضیح داده می شود.
مواد لازم
-غشاء نیتروسلولز با منافذ 45/0 میکرومتری
-کاغذ واتمن
-بافر انتقال (شامل تریس بازی، گلایسین، متانول و آب مقطر می باشد، پیوست 8).
-دستگاه Semidry
-رنگ پانسوS
روش انجام کار
•نمونه پروتئینی در مجاورت مارکر پروتئینی با روش SDS-PAGE، الکتروفورز شد.
•به مدت 30 دقیقه ژل در بافر انتقال قرار داده شد تا از تغییر حجم ژل در هنگام انتقال جلوگیری شود.
•غشای نیترو سلولزی را به اندازه ژل برش زده و در بافر انتقال قرار می دهیم.
•چندین لایه کاغذ واتمن (هم اندازه با ژل) را در ظرف حاوی بافر انتقال، مرطوب کرده و سپس کاغذ ها روی صفحه گرانیتی دستگاه بلاتینگ با سیستم نیمه خشک گذاشته شد ( با غلتاندن یک میله شیشه ای حباب های احتمالی بین کاغذها خارج گردید).
•غشای نیترو سلولز خیس شده به آرامی به گونه ای که حبابی تشکیل نگردد بر روی کاغذ های واتمن قرار داده شد. سپس ژل مورد نظر را را به گونه ای که حباب تشکیل نگردد به آرامی روی کاغذ قرار دادیم.
•مجدداً چند لایه کاغذ واتمن خیس شده در بافر انتقال، روی ژل قرار داده شد و با غلتاندن میله شیشه ای، حباب های احتمالی را خارج نمودیم.
•درب دستگاه را بسته و دستگاه را به جریان برق متصل نمودیم و با توجه به اندازه پروتئین، ولتاژ ثابت و زمان انتقال دستگاه تنظیم شد.
•پس از اتمام زمان انتقال، کاغذ نیتروسلولز با رنگ پانسوS رنگ آمیزی شد تا باندهای پروتئینی ظاهر گردند. از طرفی باندهای مارکر پروتئینی نیز علامت گذاری گردیدند. سپس غشاء با آب مقطر شسته شد تا رنگ پانسوS آن از بین برود.
•غشاء نیتروسلولز به مدت 1 ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر در بافر بلوکه کننده قرار گرفت. سپس به مدت 16 ساعت در 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
نکته: به منظور بلوکه کردن غشاء در نواحی که فاقد پروتئین است می توان از شیر خشک بدون چربی و یا آلبومین سرم گاوی (BSA) محلول در بافر PBS دارای توئین20 استفاده کرد.
•آنتی بادی اولیه، سرم خرگوشی رقیق شده به نسبت 1 به 500 در PBS بود. این آنتی بادی به مدت 2 ساعت در دمای اتاق بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•غشاء 5 بار 10 دقیقه ای در TTBS بر روی شیکر شسته شد.
•آنتی بادی دوم، Goat anti Rabbit IgG کونژوگه با HRP بود که به نسبت 1 به 1000 در PBS رقیق شده بود. این آنتی بادی به مدت 1 ساعت بر روی غشاء بر روی شیکر انکوبه شد.
•بعد از اتمام زمان انکوباسیون در آنتی بادی ثانویه، کاغذ پنج بار 10 دقیقه ای با PBS حاوی 05/0% توئین 20 شستشو داده شد.
•کاغذ به مدت 10 دقیقه با بافر PBS بدون توئین شستشو داده شد.
•کاغذ نیتروسلولز در محلول سوبسترای آنزیم نشاندار (DAB) گذاشته شد تا باندهای مورد نظر نمایان گردند.
•پس از نمایان شدن باندها، کاغذ با آب مقطر چند بار شستشو داده شد و سپس کاغذ را خشک کرده و در جای تاریک نگهداری گردید.
فصل سوم نتایج
3-1 سنتز ژن gcsf
cDNA کد کننده پروتئین GCSF پس از بهینه سازی کدونها برای بیان در سلول مخمری به یکی از شرکت های مرتبط سفارش داده شد و توالی سنتز شده در وکتور کلونینگ pGH به گروه تحویل داده شد (شکل 3-1).

شکل 3-1 طرح شماتیک وکتور کلونینگ حاوی ژن gcsf
3-1-1 PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
3-1-1-1طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
با توجه به این که جایگاه برش آنزیم‌های BamHΙ و HpaI در توالی ژن هدف، gcsf، و نیز وکتور بیانی طراحی شده وجود ندارد، این دو جایگاه بر روی توالی پرایمرهای F و R تعبیه شدند. طراحی پرایمرها با بررسی نکات کلیدی در زمینه عدم تشکیل فرم سنجاق سری ، دایمرهای پرایمری و سایر ساختارهای ثانویه با استفاده از نرم‌افزار genrunnr انجام شد. نتایج حاصل از بررسی پرایمرها در این نرم‌افزار در شکل‌های 3-2 الف و ب آورده شده است.

(الف) (ب)
شکل3-2 بررسی توالی پرایمرهای F (الف) و R (ب) ژن gcsf.
3-1-1-2 بهینه ‌سازی واکنش PCR
گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها و تکثیر ژن gcsf را 60 درجه سانتی گراد نشان داد (شکل 3-3).
17856203187708 7 6 5 4 3 2 1
008 7 6 5 4 3 2 1

شکل 3-3 PCR گرادیان ژن مقاومت به gcsf
چاهک 7-1: محصول PCR در دماهای 50 تا 60 درجه سانتی گراد
چاهک 5: مارکر DNA (kb1)
چاهک 8: کنترل منفی PCR
3-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
3-2-1 هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan
به دنبال هضم آنزیمی این وکتورها با آنزیمهای BamHI و HpaI، در مورد وکتور کلونینگ، بر روی ژل آگارز قطعه ژنی gcsf به طول تقریبی bp615 و وکتور کلونینگ pGH به طول تقریبی bp2900 مشاهده شد در حالیکه در مورد وکتور بیانی، وکتور خطی شده ای به طول حدوداً 6500 نوکلئوتید بر روی ژل ظاهر گردید (شکل 3-4).
191262065405 5 4 3 2 1
00 5 4 3 2 1

–142

3-1-7 ژل الکتروفورز...............................................................................................................................................................25
3-1-8 مواد شیمیایی. ................................................................................................................................................................25
3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی ...................................................................................................................................25
3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئین ALCAM. .......................................................................................................29
3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM ............................................................................................................29
3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization ........................................................................................................................29
3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAM .............................................................................................................29
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب ...............................................................................................................................................29
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده ....................................................................................................................30
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه...........................................................................................................................................30
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM ......................................................30
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته............................................................................................................................................30
3-4-1-1 مواد و محلول ها.......................................................................................................................................................30
3-4-1-2 روش کار..................................................................................................................................................................30
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli.. ..........................................................................31
3-4-2-1 روش کار.................................................................................................................................................................31
3-4-3 ارزیابی کلونی ها...........................................................................................................................................................32
3-4-4 استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه C2................................................................................33
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده.............................................................................................................................35
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion........................................................................................................35
3-4-5-2 الکتروفورز................................................................................................................................................................35
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM.............................................................................................................37
3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2 از ژل..................................................................................................................................37
3-5-2 لایگیشن.........................................................................................................................................................................38
3-5-3 ترانسفورماسیون.............................................................................................................................................................39
3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته.................................................................................................................................39
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن................................................40
3-5-4 ارزیابی کلونی ها...........................................................................................................................................................40
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM..............................................................41
3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده.............................................................................................................................42
3-6 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM................................................................................................................................43
3-6-1 القاء بیان پروتئین...........................................................................................................................................................43
3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page...................................................................................................................43
3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها.............................................................................................................................44
3-6-2-2 Run کردن نمونه ها...............................................................................................................................................45
3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی................................................................................................................45
فصل چهارم:نتایج
4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی ...........................................................................................................................................47
................................................................................................................50..........................C2ناحیهDNA4-2 سنتز شیمیایی
4-3کلونینگ پلاسمید AMP+ -pBSK حاویDNA ناحیهC2.................................................................................................52
4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2.................................................................................................................................................54
4-5بیان پروتئینC2 و تایید آن به کمک تکنیک SDS_page........................................................................................................57
فصل پنجم:
بحث...................................................................................................................................................................................................59
نتیجه گیری.........................................................................................................................................................................................69
منابع....................................................................................................................................................................................................71
چکیده انگلیسی...........................................................................................................................................................................................74
فهرست شکل ها:
شکل 1-1 تصویر بخش های مختلف روده بزرگ.....................................................................................................................5
شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده.............................................................................................................6
شکل1-3 درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال .....................................................................................................7
شکل1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال.................................................................................................................12
شکل1-5 نقشه ژنتیکی پروتئین ALCAM............................................................................................................................15
شکل1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری...............................................................................17
شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a.....................................................................................................................................24
شکل3-2 دستگاه انکوباتور......................................................................................................................................................25
شکل3-3 دستگاه اتوکلاو.........................................................................................................................................................26
شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژو تانک الکتروفورز.......................................................................................................................26
شکل3-5 شیکر انکی باتور.......................................................................................................................................................27
شکل3-6 سانتریفیوژ.................................................................................................................................................................27
شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل.............................................................................................................................................27
شکل3-8 ترموسایکلر...............................................................................................................................................................28
شکل3-9 بن ماری ..................................................................................................................................................................28
شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید..........................................................................................................................................33
شکل3-11 کیت استخراج DNA از ژل فرمانتاز.....................................................................................................................37
شکل4-1 شاخص سازی کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی.........................................48
شکل4-2 میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی سمت راست:بعد از بهینه سازی ..........................48
شکل4-3 شاخص سازی محتوای G-C سمت راست:قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی.............................49
شکل4-4ترادف ناحیهC2 مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli...........................49
شکل4-5 مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.......................................................50
شکل4-6 تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی......................................................................................................51
شکل4-7 نقشه ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2 پروتئینALCAM...........................................................................53
شکل4-8 تائید حضور پلاسمید حاوی ژن ناحیه C2 در محصول استخراج پلاسمید.............................................................53
شکل4-9 هضم دوگانه آنزیمی پلاسمید تکثیر یافتهPBSK....................................................................................................54
شکل4-10 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a..................................................................................................................................55
شکل4-11 باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با Pet28a حاوی ژن ناحیه C2....................................................55
شکل4-12 تائید حضور پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) ......................56
شکل4-13 نتیجه حاصلهاز هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید Pet28a حاوی ژن ناحیه C2......................................................57
شکل4-14 بررسی بیان پروتئین ناحیه C2 به کمک تکنیک SDS-Page...................................................................58
چکیده:
همه سرطان ها از سلول ها شروع می شوند به طور طبیعی‌، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می کنند و تقسیم می شوند. سلول های جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.
سرطان کولورکتال یکی از شایع ترین سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد که میزان ابتلا به آن حدود 6/0 می باشد که منجر به مرگ600 هزار نفر در سال می گردد. .CD166 به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی و معرفی شده است.که با توجه به بیان آن بر سطح سلول های سرطان کولورکتال در مراحل مختلف بیماری می توان از آن جهت کارهای درمانی و تشخیصی استفاده نمود.
ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند.ALCAM معمولا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد که بر اهمیت ان در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.در این مطالعه ما ابتدا سعی بر آن داشتیم توالی مورد نظر را از بانک های اطلاعاتی ژنی استخراج نماییم و سپس از طریق آنالیز بیوانفورماتیکی توالی مورد نظر را از نظر بهترین بیان در میزبان باکتریایی آماده نماییم.ژن مورد نظر از طریق شیمیایی سنتز شده و سپس با استفاده از فرایند کلونینگ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال داده و تکثیرنموده. در انتها نیز بیان ناحی C2در باکتری های نوترکیب با القاگر مناسب القا می نماییم و وجود پروتئین مورد نظر را به کمک تکنیک SDS-page مورد بررسی قرار می دهیم.
ناحیه C2 می تواند به مانند پروتئین اصلی خاصیت ایمنی زائی داشته باشد. این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین مورد نظر را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت نمود.
واژه های کلیدی:
سرطان کولورکتال، ALCAM، ناحیه C2 پروتئینALCAM ،کلونینگ
فصل اول
مقدمه
1-1سرطان چیست
اصطلاح سرطان به تومورهای اطلاق می شود که می توانند به بافت های مجاور خود که از سلولهای سالم تشکیل میشوند حمله کنند توانایی مجاورت و هجوم سلول های توموری عامل طبقه بندی تومورها به دو دسته خوش خیم و بدخیم است اگر یک تومور بدخیم به یک رگ خونی یا لنفی برسد می تواند متاستاز دهد ودر بافت های دیگری رشد کند. نئوپلاسم(که معنی آن رشد جدید است) شکل غیر طبیعی رشد سلولها است و تومور، نئپلاسمی است که با وضعیت بیمار گونه همراه است، تومور ها بیماری هایی هستند که در آنها جمعیتی از سلول های، که به لحاظ ژنتیکی هم خانواده هستند توانایی رشد نا به هنجار را کسب می کنند(نخعی سیستانی وهمکاران 1389). همه سرطان ها از سلول ها شروع می شوند که واحد سازنده بدن و اساس زندگی محسوب می شوند. سلول ها بافت را می سازند و بافت های بدن، اندام ها را تشکیل می دهند. به طور طبیعی‌، سلول ها به گونه ای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد می کنند و تقسیم می شوند. سلول های پیر می میرند وسلول های جدید جای آنها را می گیرند. گاهی نظم مراحل رشد به هم می خورد. سلول های جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود می آیند و یا سلول های پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه می دهند. این سلول های اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل می دهند.
تومورها خوش خیم یا بد خیم می باشند.
تومورهای خوش خیم سرطانی نیستند.
این نوع تومورها به ندرت زندگی فرد را تهدید می کنند.
بیشتر تومورهای خوش خیم قابل جراحی بوده و معمولا عود نمی کنند.
تومورهای خوش خیم، به بافت های اطراف و سایر قسمت های بدن گسترش نمی یابند.
تومورهای بدخیم سرطانی هستند.
عموما این تومورها بسیار خطرناک تر از تومورهای خوش خیم بوده و زندگی فرد را تهدید می کنند.
تومورهای بدخیم قابل جراحی بوده ولی در مواردی بعد از عمل جراحی مجددا عود می کنند.
تومورهای بدخیم انتشار یافته و به بافت ها و اعضای مجاور، آسیب می رسانند.
سلول های سرطانی از بافت توموری جدا شده و با وارد شدن در جریان خون یا سیستم لنفاوی، تومورهای جدیدی درسایراعضاء بدن تشکیل می دهند. گسترش و انتشار سلول های سرطانی به سایر بافت های بدن را متاستاز می نامند.
زمانی که سرطان از بافت اصلی به سایر قسمت های بدن گسترش پیدا می کند، تومور جدید شبیه همان نوع سلول های غیر طبیعی تومور اولیه بوده و به همان اسم تومور اولیه خوانده می شود. برای مثال اگر سرطان کولورکتال به کبد متاستاز دهد سلول های سرطانی کبد همان سلول های سرطانی کولورکتال بوده و بیماری سرطان متاستاتیک کولورکتال نامیده شده و همانند سرطان کولورکتال، درمان می شود (کاظمی اسکندانی 1388).
دانش کنونی از مکانیسم های سرطان پیشنهاد کننده این مطلب است که علت ایجاد همهی سرطان ها ناشی از هر دو عامل محیطی و ژنتیکی است(clapp et at 2005).
عوامل ژنتیکی، هورمونی و ویروسی روی سرطان تاثیر می گذارند باقی ماندن تغییراتی مانند آسیب بافتی، تغییرات ژنتیکی و اپیژنتیک(مثل جهش،از دست دادن هتروزیگوسیتی و متیلاسیون پروموتور)و تغییرات ترانسکریپتوم(مثل التهاب و مسیر های آپاپتوز) در دراز مدت منجر به فعال شدن مسیر ها و عملکرد های سلولی نابجا گشته و در نهایت منجر به تغییرات پیش سرطانی می گردد(Roy et el 2008).
انکوژن ها کد کننده پروتئین های هستند که کنترل کنندهی تقسیم سلولی، آپاپتوز و یا هر دوی آنها هستند. آنها می توانند به وسیله تغییرات ساختمانی، که حاصل جهش یا اتصال ژن ها توسط کنار هم نشینی عناصر تحریک کننده و یا به وسیله تحریک فعال شوند. جا به جای و جهش می تواند به عنوان وقایع اولیه یا در طی پیشرفت تومور اتفاق بیفتد در حالی که تکثیر معمولا در طی پیشرفت اتفاق می افتد هنگامی که یک
انکوژن توسط جهش فعال می شود ساختار پروتئین کد شده توسط آن در مسیر افزایش فعالیت تغییر می کند(croce2008).
جهش های که پروتوانکوژن ها را به انکوژن ها تبدیل می کند شامل:تغییرات تک نوکلئوتیدی،تکثیر یا ازدیاد ژنی، ترکیب ژنی و سایر بازآرایی های کروموزومی است که فعالیت پروتئین های ساخته شده توسط پروتوانکوژن ها را افزایش می دهند. جهش های تغییر دهنده قالب، جهش های بی معنی و جهش هایی که در جایگاه پردازش روی می دهند عموما موجب فعال شدن انکوژن ها نمی شوند(Thomas et al 2007).
سرطان بوسیلهی تغییر در انکوژن ها، ژن های سرکوب گر تومور و ژن های microRNA ایجاد می شود
یک تغییر ژنتیکی به ندرت برای توسعه یک تومور بدخیم کافی است. بیشتر شواهد به یک فرآیند چند مرحله ای از تغییرات پی در پی در انکوژن های مختلف، ژن های سرکوب گر تومور یا ژن های microRNA در سلول های سرطانی اشاره دارند(croce 2008).
انکوژن ها شکل جهش یافتهی یک ژن طبیعی سلولی به نام پروتوانکوژن ها است که در گسترش سرطان شرکت می کند انکوژن های که اغلب در رشد و گسترش سرطان های انسانی شرکت دارند به وسیلهی ویروس ها منتقل نمی شوند بلکه در نتیجه جهش های سوماتیک در پروتوانکوژن ها ایجاد می گردند (نخعی سیستانی و همکاران1389). پروتئین های حاصل از پروتوانکوژن ها در شرایط عادی عملکرد حیاتی در پیام رسانی سلول، رشد و تمایز بر عهده دارند اما بیان غیر طبیعی آنها قادر به القای تومور زایی است(pappou 2010).
یک ژن سرکوب کننده تومور نوعی ژن است که بوسیلهی جهش های حذف عملکرد ایجاد می شود، ژن های سرکوب کننده تومور فرآیند های اصلی مسئول حفظ بخش های پایدار بافتی را کنترل می کنند این فرآیند ها شامل تمامیت ژنتیکی، پیشرفت چرخه سلولی،تمایز، برهمکنش های سلولی و مرگ می باشند. غیر فعال شدن این ژن ها موجب حذف هموستازی بافتی می شود که مشخصه یک تومور در حال گسترش است(نخی سیستانی و همکاران1389).
1-2 آناتومی روده بزرگ:
روده بزرگ از دریچه ایلئوسکال روده کوچک تا آنوس گسترش یافته است و شامل آپاندیس، کولون، رکتوم و کانال آنال می باشد بنا به موقعیت کولون به قسمت های مختلف تقسیم شده است: سکوم، کولون
صعودی، زاویهی کبدی، کولون عرضی، زاویه طحالی، کولون نوزولی و کولون سیگموئید (میبدی و همکاران 1382، ACS 2010).

شکل 1-1 تصویر و بخشهای مختلف روده بزرگ (کاظمی اسکندانی 1388)
کولون از انتهای ایلئوم شروع می شود و در پرومونتوری ساکروم جایی که تیناکولی ها حالت باند های مشخص و مجزای خود را از دست می دهند پایان می یابد.تیناکولی ها سه نوار عضله طولی هستند که در فواصل 120 درجه از هم در محیط کولون قرار گرفته اند رکنوم در سطح پرومونتوری ساکروم جایی که سه تنیا ها پخش می شوند و یک لایه عضلانی طولی صاف تشکیل می دهند شروع می شود. رکتوم به پایین تا
سطح عضلات بالابرنده مقعد ادامه پیدا می کند و طول آن از 12 تا 15 سانتی متر ادامه پیدا می کند.کانال جراحی آنال که حدودا 4 سانتی متر می باشد، قسمت انتهای روده بزرگ است که از بین عضلات بالا رونده مقعد عبور می کند و به لبه مقعد باز می شود(میبدی و همکاران 1382).
دیواره روده بزرگ شامل شش لایه است: مخاط، موسکولاریس موکوزا، زیر مخاط، موسکولاریس پروپریا، چربی زیر سروزی و سروز، رکتوم نیز بافت مشابهی دارد ولی سروز ندارد(میبدی و همکاران 1382).
1-3جنین شناسی روده بزرگ:
در طول هفته چهارم حاملگی، روده اولیه که شامل پیش روده، میان روده و پس روده می باشد تشکیل می شود. میان روده به روده کوچک(که از نقطهی ورودی مجرای صفراوی شروع می شود) و بخشی از روده بزرگ که پیش از نقطه میانی کولون عرضی قرار گرفته تبدیل می شود. خون این بخش از روده توسط شریان مزانتریک فوقانی تامین می گردد. پس روده به بخشی از روده بزرگ که پس از نقطه میانی کولون عرضی قرار گرفته نیز قسمت پرگزیمال مقعد و مجرای ادراری تناسلی تحتانی تبدیل می شود.
در طول هفته ششم حاملگی میان روده به خارج از حفره شکمی منتقل می گردد بیش از آنکه میان روده موقعیت نهایی خود را در حفره شکمی به دست آورد. در طول چهار هفتهی بعدی در خلاف جهت عقربه های ساعت حول شریان مزانتریک فوقانی 270 درجه می چرخد.
انتهای پس روده به کلواک ختم می شود که در هفته ششم توسط دیواره اتورکتال به دو بخش شکمی و پشتی یعنی سینوس ادراری تناسلی و رکتوم تقسیم می شود. تکمیل مجرای آنال در انتهای هفته هشتم است یعنی هنگامی که غشاء نازک آنال پاره می شود خط دندانه ای در قسمت تحتانی مجرای آنال مشخص کننده مرز بین پس روده اندودرمی و بافت اکتودرمی می باشد(میبدی و همکاران1382).
1-4سرطان کولورکتال:

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

سرطان کولون و رکتوم را سرطان کولورکتال گویند(kang et at 2011). سرطان کولورکتال سومین عامل مرگ از سرطان ها در جهان محسوب می شود(پارکین 2001 ) این بیماری در ایران به عنوان چهــارمین سرطان شایع در هر دو جنس به شمار می رود(بویل و لانگمان 2000). سرطان کولورکتال سومین سرطان شایع در بین مردان و چهارمین سرطان شایع در بین زنان در ایران می باشد(کلاهدوزان 2009).تخمین زده می شود سالانه در ایران 3641 نفر به این بیماری مبتلا می شوند(ملک زاده 2009).
سرطان کولورکتال به دو شکل عمده وجود دارد سرطان کولورکتال موردی(spo--ic) و سرطان کولورکتال ارثی(kang et at2011).

شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده (کاضمی اسکندانی 1388)
سرطان کولورکتال دارای سه زیر گروه بر اساس عمده ژنتیکی یا تغییرات اپی ژنتیک است:
1.تومور با بی ثباتی کروموزومی
2.کسانی با ناپایداری میکروستلایت
3.تومورهای با جزایر CpG متیلاتور
آسیب شناسی مولکولی سرطان کولورکتال یکی از برجسته ترین موارد مطالعه در سال های اخیر بوده است(kang et al-2001) .و به دلیل اثرات جانبی شدید شیمی درمانی استراتژی های جدید بر مبنای مکانیسم های مولکولی به شدت احساس می گردد(hisayuki and Gazdar 2005).
هم چنین یکی از معظلات اساسی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز آن به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.

1-3درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال (دکتر سید مهدی جلالی و همکاران با تحقیق بر روی بیماران از سال 1360تا 1380 )1-4-1چه کسانی در معرض خطر قرار دارند (ریسک فاکتورها یا عوامل خطر ):
علت دقیق بروز سرطان کولورکتال شناخته شده نیست. پزشکان به ندرت می توانند علت ابتلا و یا عدم ابتلای افراد به سرطان کولورکتال را بیان کنند. به هر حال آنچه مشخص است این است که این بیماری مسری نبوده و هیچ فردی این بیماری را از فرد دیگری نمی گیرد.تحقیقات نشان داده اند که افراد با عوامل خطر معین، نسبت به سایر افراد در معرض خطر بالای ابتلا به سرطان کولورکتال قرار دارند. وجود عامل خطر یا ریسک فاکتور، شانس ابتلا و پیشرفت بیماری را در یک فرد افزایش می دهد(کاظمی اسکندانی1388).
فاکتور های مختلفی در تبدیل موکوس رودهی بزرگ به سرطان دخالت دارند عوامل محیطی و ژنتیکی هر دو از عوامل مهم در ایجاد این بیماری هستند(caseito and lowitz 2001).
1-4-2عوامل محیطی:
سن بالای 50 سالگی: احتمال بروز سرطان کولورکتال در افراد مسن بیشتر است. بیش از 90% مبتلایان، بالای50 سال سن دارند و متوسط سن مبتلایان در زمان تشخیص، بالای 72 سال می باشد.
رژیم غذایی: مطالعات نشان داده است که رژیم های پر چرب (بخصوص چربی های حیوانی)، کم فیبر، کم کلسیم و کم فولات خطر ابتلا را افزایش می دهند. هم چنین خطر ابتلا به سرطان کولورکتال در افرادی که از میوه جات و سبزیجات کمتراستفاده می کنند، بیشتر است.
مصرف سیگار : خطر بروز پولیپ و سرطان کولورکتال در افراد سیگاری بیشتراست(کاظمی اسکندانی 1388).
1-4-3عوامل ژنتیکی:
کشف انکوژن ها در سال 1910 زمانی که پیتون رویس(Peyton Rous) نشان داد یک عصاره عبور داده شده از فیلتر که فاقد سلول و باکتری است می تواند باعث ایجاد فیبروسارکوما در جوجه ها شود آغاز شد(pappou 2010). بعد از آن او دریافت که سارکومای جوجه می تواند به دفعات به وسیله عصاره توموری فاقد سلول، از حیوانی به حیوان دیگر منتقل شود.عامل این بیماری در عصاره سلولی ویروسRouse sarcoma Virus بود. کشف انکوژن های ویروسی برای اولین بار باعث شد که یک عامل ایجاد کننده سرطان از منظر ژنتیک مورد مطالعه قرار گیرد(نخعی سیستانی 1389).
از دست دادن ثبات ژنومی از طریق تسهیل دستیابی به جهش های مرتبط با تومور در توسعه سرطان روده بزرگ دخالت دارد. در این بیماری بی ثباتی ژنومی اشکال مختلفی دارد که هر کدام علل متفاوتی دارند.متداول ترین بی ثباتی ژنومی در سرطان کولورکتال بی ثباتی کروموزومی است که منجر به تغییرات زیاد در تعداد رونوشت و ساختار کروموزوم می شود. بی ثباتی کروموزومی مکانیسم موثری در فقدان فیزیکی رونوشت های نوع وحشی ژن های سرکوب کننده تومور مانند APC و P53 است (Sanford and bertagnolli 2009).
1-4-4عوامل دیگر در بروز سرطان کولورکتال:
پولیپ های کولورکتال: پولیپ ها در دیواره داخلی روده بزرگ یا رکتوم رشد می کنند.
سابقه خانوادگی ابتلا به سرطان کولورکتال: سابقه ابتلا به سرطان درفامیل نزدیک ( والدین،برادران و خواهران و یا فرزندان ) به ویژه در سنین پایین، احتمال بروز سرطان را افزایش می دهد.
داشتن سابقه ابتلا به سرطان : سرطان کولورکتال ممکن است مجددا در فرد دارای سابقه ابتلای قبلی به این بیماری، بروز نماید
بیماری های التهابی روده یا بیماری کرون: خطر بروز سرطان کولون ، در فردی که سابقه بیماری های التهابی زخم شونده روده و بیماری کرون را برای چندین سال دارند، بیشتر می باشد(کاظمی اسکندانی 1388).
1-4-5علائم و نشانه ها
علائم و نشانه های شایع عبارتند از :
اسهال، یبوست
احساس عدم تخلیه کامل روده
مشاهده خون (قرمز روشن یا خیلی تیره) در مدفوع
باریک شدن بیش از حد معمول مدفوع
کاهش وزن بدون علت مشخص
احساس خستگی مداوم
تهوع و استفراغ
ناراحتی های عمومی شکم (احساس پری شکم، درد، پیچش شکم و شکم نفاخ)
در اغلب موارد، این علائم ناشی از سرطان نمی باشند. سایر بیماری ها نیز این نشانه ها را ایجاد می کنند. بایستی در صورت وجود این علائم ، جهت تشخیص و درمان هر چه سریع تر به پزشک مراجعه نمود(کاظمی اسکندانی 1388).
1-5غربالگری
بررسی های انجام شده حاکی از این است که در صورت شناسایی سرطان کولورکتال در مراحل ابتدایی شانس بهبودی کامل مبتلایان به این بدخیمی در حدود 90% می باشد ولی در صورتی که در تشخیص و درمان این سرطان تعویق ایجاد شود بدخیمی وارد مرحله پیشرفته و غیر قابل درمان می شود (ma et at 2009). غربالگری سرطان قبل از بروز علائم و نشانه های بیماری، به پزشک در شناسایی پولیپ ها یا سرطان اولیه کمک می کند. شناسایی وخارج نمودن پولیپ ها، از بروز سرطان کولورکتال پیشگیری می کند.
برای شناسایی سرطان و پولیپ در مراحل اولیه بایستی:
افراد 50 سال و به بالا، غربالگری شوند.
افرادی که احتمال بروز بیماری در آنها بیشتر است ، با پزشک خود در مورد انجام آزمایشات غربالگری قبل از 50 سالگی ، نوع آزمایشات و فواید و مضرات هرکدام از آزمایشات صحبت نمایند.
از آزمایشات غربالگری زیر برای تشخیص سرطان، پولیپ ها و سایر موارد غیر طبیعی کولون و رکتوم استفاده می شود:
وجود خون مخفی در مدفوع: اغلب اوقات سرطان ها یا پولیپ ها دچار خونریزی می شوند و این آزمایش قادر به شناسایی کمترین مقادیر خون در مدفوع می باشد. در صورت شناسایی وجود خون در مدفوع سایر آزمایشات برای شناسایی منبع خون مورد نیاز می باشد. البته لازم به ذکر است که موارد خوش خیم همانند بواسیر( هموروئید ) نیز موجب بروز خون در مدفوع می شوند.
سیگموئیدوسکپی: پزشک با سیگموئیدوسکپ ( لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد) داخل رکتوم و قسمت تحتانی کولون (سیگموئید) را بررسی می کند و در صورت وجود پولیپ، آنها را خارج می کند. به خارج کردن پولیپ، پولیپکتومی گفته می شود.
کولونوسکپی: پزشک با استفاده از کولونوسکپ (لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد) داخل کولون و رکتوم را بررسی نموده و در صورت وجود پولیپ، آنها را خارج می کند.
تنقیه با محلول باریم : پس از تنقیه بیمار با محلول باریم، هوا داخل رکتوم پمپ شده و توسط اشعه ایکس از کولون و رکتوم ، عکس برداری های متعدد انجام می شود. توسط باریم و هوا، پولیپ ها در عکس برداری مشخص می شوند.
معاینه انگشتی رکتوم : معاینه رکتوم یکی از روش های معمول معاینه بدنی است. پزشک پس از پوشیدن دستکش و مالیدن ژل، با داخل کردن انگشت داخل رکتوم نواحی غیر طبیعی موجود در قسمت های تحتانی رکتوم را بررسی می کنند (کاظمی اسکندانی1388).
1-6تعیین مرحله بیماری
زمانی که نمونه برداری نشانگر وجود سرطان کولورکتال باشد، لازم است پزشک وسعت بیماری( درجه بیماری) را بداند تا بهترین روش درمانی را طرح ریزی کند.
مرحله بیماری به تهاجم تومور به بافت های مجاور و انتشار سرطان بستگی دارد و اینکه در صورت انتشار، به کدام قسمت از بدن منتشر شده است. برای تعیین مرحله بیماری آزمایشات و اقدامات زیر انجام می شود:
آزمایشات خون: پزشک میزان CEA (آنتی ژن کارسینومای امبریونیک) و سایر مواد موجود در خون را کنترل می کند. در اغلب مبتلایان به سرطان کولورکتال، میزان CEA بالا می باشد.
کولونوسکپی: پزشک با کولونوسکپی داخل کولون و رکتوم را از نظر وجود نواحی غیرطبیعی بررسی می کند.
سونوگرافی داخل مقعدی: پروب سونوگرافی داخل رکتوم قرار داده می شود. پروب، امواج صوتی را که افراد قادر به شنیدن آن نیستند به داخل رکتوم و بافت های اطراف می فرستد. کامپیوتر با استفاده از انعکاس صوت(اکو) تصویر ایجاد می کند. تصویر ایجاد شده، نشان میدهد که تا چه عمقی تومور رکتوم رشد کرده است و همچنین انتشارسرطان به گره های لنفاوی یا سایر بافت های مجاور را نشان می دهد.
عکس برداری توسط اشعه ایکس از قفسه سینه: عکس برداری از قفسه سینه، نشان دهنده انتشار سرطان به ریه است.
سی تی اسکن: دستگاه عکسبرداری توسط اشعه ایکس که به کامپیوتر متصل می باشد، یک سری تصاویر با جزئیات بیشتر را از نواحی داخل بدن در دسترس قرار می دهد. ممکن است ماده حاجب تزریق گردد. این روش انتشار تومور به کبد، ریه ها و یا سایر نواحی بدن را نشان می دهد(کاظمی اسکندانی 1388).
مراحل سرطان کولورکتال به شرح زیر می باشد:
مرحله I : سرطان درون دیواره داخلی رکتوم و کولون رشد کرده است ولی هنوز به دیواره خارجی کولون نرسیده و یا به بیرون از کولون گسترش نیافته است .
مرحلهII : تومور به قسمت های عمقی و یا سرتاسرعمق دیواره کولون و رکتوم انتشار یافته و ممکن است بافت های مجاور را نیز درگیر کند اما سلول های سرطانی هنوز به گره های لنفاوی انتشار نیافته اند.
مرحله III : سرطان به گره های لنفاوی مجاور انتشار پیدا کرده اما به سایر قسمت های بدن منتشر نشده است.
مرحلهIV : سرطان در سایر قسمت های بدن همانند کبد و ریه ها منتشر شده است(کاظم اسکندانی 1388).
در مراحل 1و2 سرطان کولورکتال امکان درمان این سرطان با عمل جراحی وجود دارد ولی احتمال بهبودی در مرحله 4 بسیار ضعیف است(ma et at 2009).
سرطان عود کرده : سرطانی است که درمان شده است ولی پس از یک دوره زمانی مجددا عود نموده است. این بیماری ممکن است در کولون، رکتوم و یا سایر قسمت های بدن عود کند (کاظمی اسکندانی1388).

1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال(دکتر سید مهدی جلالی و همکاران با تحقیق بر روی بیماران از سال 1360تا 1380 )
1-7روش های درمانی:
اساسا انتخاب نوع درمان به محل تومور در رکتوم و کولون و مرحله بیماری بستگی دارد. برای درمان سرطان کولورکتال از جراحی، رادیوتراپی (پرتودرمانی)، شیمی درمانی و یا ترکیبی از این درمان ها استفاده می شود درمان سرطان به صورت درمان موضعی یا درمان سیستمیک است(کاضمی اسکندانی 1388)..
کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. )محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از 90% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ میدهند.تومورهای اولیه میتوانند توسط جراحی یا درمانهای مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطانهایی که به مرحله متاستاز رسیده اندبه درمان مقاوماند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ را در میان افراد دارای
متاستاز نشان میدهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایندهای ایجادکننده متاستاز و فراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن میباشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).
1-7-1درمان موضعی:
جراحی و پرتودرمانی جزء درمان های موضعی هستند. در جراحی، تومور خارج شده و پرتودرمانی، سلول های سرطانی را نابود می کند. در صورت انتشار سرطان کولورکتال به سایر قسمت های بدن ، از درمان موضعی برای کنترل بیماری در آن مناطق خاص، استفاده می شود. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-2درمان سیستمیک:
شیمی درمانی و درمان بیولوژیکی از سایر روش های درمانی سیستمیک هستند و برای کنترل سرطان، دارو وارد جریان خون می شود.
بروز عوارض جانبی به علت تاثیر درمان روی سلول ها و بافت های سالم، شایع است. عوارض جانبی به نوع و وسعت درمان بستگی داشته و در تمام افراد یکسان نمی باشد. ممکن است عوارض جانبی، در هر جلسه از درمان متفاوت باشد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-3کولونوسکپی:
یک پولیپ سرطانی کوچک موجود در کولون یا قسمت فوقانی رکتوم ممکن است توسط کولونوسکوپ خارج گردد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-4لاپاراسکپی:
ممکن است سرطان کولون در مراحل اولیه با استفاده از لاپاراسکوپ ( لوله ای که در انتهای آن منبع نوری قرار دارد ) برداشته شود. سه الی چهار برش کوچک در شکم داده می شود. جراح با لاپاراسکوپ داخل شکم را مشاهده کرده و تومور و قسمتی از نواحی سالم کولون را خارج می کند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-6جراحی باز:
رایج ترین درمان سرطان کولورکتال، جراحی است. جراح برای خارج نمودن تومور و قسمتی از نواحی سالم رکتوم و کولون، روی شکم برش بزرگی ایجاد می کند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-7شیمی درمانی
شیمی درمانی استفاده از داروهای ضد سرطان برای از بین بردن سلول های سرطانی است. داروهای شیمی درمانی وارد گردش خون شده و بر سلول های سرطانی تمام بدن اثر می کنند.
عوارض شیمی درمانی:
سلول های خونی: این سلول ها با عفونت مقابله نموده و به لخته شدن خون کمک می کنند، هم چنین اکسیژن را به تمام بافت های بدن حمل می کنند. ممکن است به علت تاثیر دارو روی سلول های خونی، عفونت و خونریزی های خودبخودی و کبودی، احساس ضعف و خستگی ایجاد شود.
سلول های ریشه مو: شیمی درمانی موجب ریزش مو می شود. باید دانست که موها مجدد رشد می کنند ولی ممکن است از نظر بافت و رنگ متفاوت باشد.
سلول های دستگاه گوارشی: شیمی درمانی موجب کاهش اشتها، تهوع و استفراغ، اسهال یا زخم های دهان و لب ها می شود. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-8درمان بیولوژیکی:
.برخی از مبتلایان به سرطان کولورکتال انتشار یافته، نوعی درمان بیولوژیکی به نام آنتی بادی مونوکلونال دریافت می کنند. آنتی بادی های مونوکلونال به سلول های سرطانی کولورکتال می پیوندند و رشد و انتشار آن ها را مهار می کنند. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-9پرتودرمانی ( درمان با اشعه )
دراین روش از اشعه های پرانرژی جهت از بین بردن سلول های سرطانی استفاده می شود. پرتودرمانی تنها در ناحیه تحت درمان، بر سلول های سرطانی تاثیر می گذارد. (کاضمی اسکندانی 1388).
1-7-9-1 انواع درمان با اشعه:
پرتو درمانی خارجی : دستگاهی بزرگ، اشعه هایی را به سمت موضع هدایت می کند.
پرتودرمانی داخلی: اشعه، توسط ماده رادیواکتیو قرار داده شده در لوله باریکی که مستقیما در داخل و یا نزدیک تومور کار گذاشته است، تابانده می شود.
پرتودرمانی حین جراحی: در برخی موارد، پرتو درمانی خارجی در طول جراحی داده می شود (کاضمی اسکندانی 1388).
CD166 یا ALCAM 8-1
ALCAM یا CD166 به عنوان مارکر های سلول های بنیادی سرطان کولورکتال عمل کرده و همچنین در تومور زایی سرطان کولورکتال نقش دارند و از آن می توان به عنوان یک مارکر جهت تشخیص زود هنگام و هم درمان سرطان کولورکتال استفاده کرد.دومین C2 پروتئین ALCAM یک دومین ایمونوگلوبولین می باشد که در بخش خارج سلولی قرار دارد.
همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،2013)
1- 9 ویژگی های عمومی ALCAM
ALCAM یک عضو از خانواده ایمونوگلوبولین است و بر اساس توانایی آن در باند شدن با cd6 شناسایی میشود و از سلولهای cos به همراه DNA آزمایشی استفاده میشود Bowen et al1995, Pate et al 1995)). ALCAM قادر است که واکنش متقابل هموفیلیک را همانند هتروفیلیک به کار اندازد. ژن انسانی برای ALCAM روی کروموزم 3 قرار گرفته است(3q33، 1q132) و از 16 اگزون تشکیل شده است که دارای اندازه ای بیش از kb 200 است. ALCAM یک نوع مولکول غشایی تیپ 1 است و دارای 500 اسید آمینه در ناحیه خارج سلول و 22 اسید آمینه در ناحیه گذرنده از غشا ، 34 اسید آمینه در ناحیه سیتوپلاسمیک و یک ناحیه مولکولی KDa 105 است.

شکل 1-5 نمای کلی پروتئین ALCAM (اولریج و همکاران ،2010)
1- 10 شناسایی ALCAM به عنوان یک هدف مرتبط با آنکولوژی
روشهای مختلف ژنومیک و پروتئومیک مختلف اشاره کرده اند که ALCAM به عنوان یک هدف مرتبط با آنکولوژی است. همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،2013) کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. روش های متداول شیمی درمانی سلول ها تمایز یافته یا درحال تمایز را که قسمت عمده ی توده تومور را شکل می دهند هدف قرار می دهند اما باید توجه داشت که این سلول ها تنها حجم تومور را می سازند و  قادر به تولید سلول های جدید نیستند و در پیشرفت بیماری و رشد تومور نقشی ندارند در حالیکه جمعیت سلول های سرطانی که سرطان و رشد تومور را سبب می شوند، دست نخورده و دور از چشم باقی مانده و باعث عود کردن بیماری می شوند.برخی محققان بر این باورند که در مرکز هر توموری تعداد کمی سلول های بنیادی نابهنجار قرار گرفته اند که رشد بافت های بدخیم و ناهنجار را تداوم می بخشند.اگر این نظر درست باشد، می تواند توضیح دهد که چرا تومورها اغلب حتی پس از اینکه به وسیله داروهای ضدسرطان تقریباً تخریب شده اند دوباره بازسازی می شوند. این حالت همچنین یک راهکار متفاوت برای ایجاد داروهای ضدسرطان را نشان می دهد و دال بر آن است که این داروها می بایستی برای از بین بردن سلول های بنیادی سرطانی و نه برای توانایی شان در از بین بردن هر سلولی و کوچک کردن تومورها، انتخاب شوند.چندین روش مبتنی بر روش های ژنومیکو پروتئومیکس این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.
این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان آنتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010 ) آنتی ژن ها مارکر های سطح سلولی اند و می توانند برای شناسایی گروه های سلولی که تشکیل دهنده یک ارگان هستند مورد استفاده قرار گیرند.این مارکرها را می توان جهت پیش بینی پاسخ به درمان ،مرتب سازی سلول های بنیادی سرطان، درمان سرطان و مرتب سازی رده های سلولی مورد استفاده قرار داد.(الوین لیو و همکاران، 2004).
این پروتئین نقش مهمی در تهاجم و پیشرفت تومور در سرطان کولورکتال دارد(جیایی وانگ و همکاران،2011).

1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری(مرته تونه وایجر و همکاران،2010)
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از 90% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ میدهند.تومورهای اولیه میتوانند توسط جراحی یا درمانهای مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطانهایی که به مرحله متاستاز رسیدهاند به درمان مقاوماند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ را در میان افراد دارای متاستاز نشان میدهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایندهای ایجاد کننده متاستاز و فراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن میباشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،1391).هم چنین یکی از
معظلات اساسی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز آن به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.
در طول شکل گیری ضایعات توده ، سلول های سرطانی باید به یکدیگر متصل شوند بنابراین از مولکولهای چسبنده برای اینکه با هم بمانند استفاده می کنند.تومور می تواند از طریق افزایش حجم خود به ساختارهای مجاور به طور مستقیم هجوم برده و یا اینکه می توانند به سایت های دور متاستاز شوند.متاستاز هنگامی رخ می دهد سلول ها از تومور اولیه جدا شده و محیط خودشان را ترک کرده ، به رگ های خونی یا لمفاتیک حمله کرده و به مکان های دور مهاجرت کنند.با توجه به اهمیت این پروتئین در چسبندگی
سلول ها می توان نقش مهمی را برای این پروتئین در ایجاد متاستاز در سرطان کولورکتال قائل بود(سالمون اوفوری و جودی کینگ،2008).
مساله تحقیق:
در این مطالعه سعی بر آن داریم که با آنالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان یک دومین اختصاصی (دومینC2) پروتئین غشایی ALCAM که در سطح سلول های سرطانی کولورکتال است و پتانسیل موجود برای بهبود روشهای تشخیصی(تولید کیت های تشخیصی) قبل از وارد شدن به فاز بدخیمی، و گشایشی در تولید واکسن برای تقویت سیستم ایمنی فرد جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان کولورکتال، را بررسی می کنیم.
با استفاده از فرآیند کلونینگ قطعه ژن اپتیمایز شده پروتئین ALCAM را به کمک وکتور وارد باکتری کامپتنت کرده و سپس باکتری حاوی ژن مورد نظر خود را از دیگر سلول ها جدا می کنیم و از آن ها استخراج پلاسمید انجام داده و سپس از طریق ساب کلونینگ ژن مورد نظر خود را وارد یک وکتور بیانی کرده و از سلول های ترنسفکت شده استخراج پروتئین انجام داده و سپس بیان پروتئین مورد نظر خود را بررسی می کنیم.
در این مطالعه فرضیه ای مطرح شد که مولکول دومین سنتز شده می تواند در میزبان پروکاریوتی کلون و بیان شود.
فصل 2:مروری بر تحقیقات انجام شده
کلونینگ و بیان این پروتئین در سال 1995 توسط مایک بوون و همکارانش شرح داده شد.آنها نشان دادند که آنتی بادی های CD166 به عنوان یک پروتئین ایمنوگلوبولین به CD6متصل می گردد.(مایکل بوون و همکاران ،1995؛ مایکل بوون و اروفو،1999).
CD166 نقش بسیار مهمی در تهاجم توموری دارد.(جیاجی وانگ و همکاران،2011)
چندین روش مبتنی بر روش های ژنومیک و پروتئومیکس این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان آنتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010)
در آزمایشات صورت گرفته مرته تونه و همکارانش در شرایط آزمایشگاهی و هم چنین محیط زنده، آنتی بادی های ضد این مارکر اثر مهارکننده ایی بر سرطان کولورکتال از خود نشان دادند.در آزمایش آنها رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی برای این مارکر در تومور مثبت بود در صورتی که در اکثر تست هایی که بروی بافت های طبیعی انسان صورت گرفته بودALCAMمشاهده نشد. با توجه به منفی بودن رنگ آمیزی بافت نرمال انسان و مشاهده فعالیت ضد توموری این مارکر بر سرطان کولورکتال در داخل بدن آنتی بادی scFvیک کاندیدای بالقوه جهت درمان سرطان کولورکتال معرفی گردید(مرته تونه و همکاران، 2010).
هم چنین الگوی بیان این مارکر در بافت نرمال و توموری ، روده انسان و موش با استفاده از روش های ایمنوهیستوشیمی،فلوسیتومتری و واکنش زنجیره ایی پلی مراز ترانس کریپتاز معکوس مورد بررسی قرار
گرفت.در نهایت پس از بررسی صورت گرفته ALCAM را به عنوان یک مارکر بالقوه جهت اهداف درمانی برای سرطان کولورکتال معرفی کردند.(لوین و همکاران ،2010)
بیان ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می باشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند .افزایش بیان در تومورهای با تمایز بالا ممکن است مشخص کننده نقش بالقوه این مارکر در مراحل اولیه تومورزایی باشد،از دست دادن این پروتئین نیز ممکن است با کاهش چسبندگی سلولی همراه شود ، نتیجه پتانسل بالقوه بالای
تومور در متاستاز خواهد بود.این نتایج از طریق آنالیز ایمونوهیستوشیمیایی ALCAM که بروی نمونه بافتی بیماران تحت درمان صورت گرفته بود بدست آمد.(مایکل تاچزی و همکاران، 2010؛سالمون اوفوری و جودی کینگ،2008)
همچنین مشخص شده است که ریزش ALCAM در مراحل اولیه بیماری می تواند به عنوان یک مارکر تشخیصی دقیق برای شناسایی سریع بیمارانی که در معرض خطر پیشرفت بیماری هستند مورد استفاده قرار گیرد.(اماندا هنسن و همکاران ، 2013)
این نکته مشخص گردیده است ALCAM در دو نوع تعامل سلول –سلول هموفیلیک و هتروفیلیک به عنوان میانجی عمل می کند. مشخص شده گلیکوزیلاسیون پس از ترجمه هیچ اثری بروی خاصیت اتصالی هموفیلیک ندارد.(گیادو اسوارت،2002)
در مطالعاتی که جهت تهیه نقشه خانواده مولکلوهای ایمونوگلوبولین چسبنده سلولی ((Igfs صورت گرفته مشخص شده است که دومین های ناحیه C2 نقش بسیار مهمی در اتصال به لیگاند ایفا می کنند.) گیادو اسوارت و همکاران ،2002 ؛ کوین زن وهمکاران،1999)
تجزیه و تحلیل سلول هایی با مجموعه مولکول های سطحی EpCAMhigh/CD44+ منجر شناسایی CD166 به عنوان مارکر بیانی اضافی متفاوت، که جهت جداسازی سلول های بنیادی به شناسایی سرطان در سرطان کولورکتال مفید می باشد شد.(پیه رو دالربا و همکاران ،2006)
هم چنین پیشنهاد شده است که CD166 به همراه CD44 نیز می تواند نقش بالقوه ایی در سرطان کولورکتال انسانی ایفا کند زیرا سلول های موشی که برای هر دوی این ماکر ها مثبت بودند تومورزایی بسیار بیشتری در مقایسه با سلول هایی که تنها برای CD44 مثبت بودند داشتند.(کاترینا فانالی و همکاران ،2014)
در بیشتر مطالعاتی که اخیرا بروی بافت های سرطان کولورکتال صورت گرفته گزارش شده است که از دست دادن غشایی CD166 و CD44 استاندارد(CD44s) با تهاجم و بدتر شدن وضعیت بقا در ارتباط می باشد.(توماس برونر و همکاران ،2012)
هم چنین ترکیب مارکرهایCD166،CD44 و CD133 می تواند به طور موفق آمیزی جهت شناسایی بیمارانی که خطر متاستاز و عود بیماری در انها کم،متوسط و یا زیاد است در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال استفاده گردد.(یوسوکه شینوزووا و همکاران،2013)
همچنین در طی آزمایشی دیگری مشخص شد که ALCAM غالبا در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی می باشد ، که بر اهمیت آن در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.( ویچرت و همکاران،2004)
بر اساس تحقیقی دیگری که بروی بیان CD166 صورت گرفت مشخص شد که موقعیت های مختلف سلولی این پروتئین ارزش تشخیصی متفاوتی دارند و بیان سیتوپلاسمی آن با نتایج تشخیصی بدتری همراه می باشد.هم چنین اینها متوجه شدند که بیان CD166 به صورت خاصی در انواع رده های توموری افزایش پیدا می کند.(چائو نی و همکاران،2013)
بیان بالای CD166 به همراه P21 در نمونه برداری های قبل درمان با عود تومور و پیش بینی ضعیف در بیماران درمان شده با 5-FU بر پایه شیمورادیوتراپی قبل عمل ارتباط داشت.البته برای تعیین نقش CD166 وP21 به عنوان نشانگرهای پیش بینی به پاسخ شیمورادیوتراپی قبل از عمل جراحی به مطالعات بزرگتر و کابردی تری در آینده نیاز می باشد.(سانگ هون سیم و همکاران،2014)
در تحقیقی بروی نمونه های کولکتومی به دست آمده از سرطان کولون به منظور بررسی ماکر CD166 صورت گرفت مشخص شد که بیش از دو سوم نمونه ها CD166 را بیان می کنند.هم چنین بیان غشایی CD166 مرتبط با سرطان کولورکتال در قسمت کولون این سرطان بیشتر می باشد. (شهریار صفایی و همکاران،2013)
فصل 3 : مواد و روش ها:
3-1 مواد مورد استفاده:
3-1-1 باکتری مورد استفاده
برای این مطالعه در مرحله کلونینگ ژن دومینC پروتئین ALCAM از باکتری E.coli سویه TOP10 و در مرحله ی ساب کلونینگ از باکتری E.coli سویه BL21(DE3)استفاده شد . این باکتری ها ابتدا بصورت لیوفیلزه بوده و سپس برای استفاده از آن، پودر باکتری را به 5 میلی لیتر محیط کشت مایع LB اضافه کرده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شبانه روز کشت می دهیم.
3-1-2 آنزیم ها
از آنزیم های NcoI و XhoI که از شرکت فرمنتازخریداری و تهیه شدند و همچنین از آنزیم اتصال دهنده T4 DNA Ligase هم در مرحله ی Ligation استفاده شد. این آنزیم ها در دمایی 20- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
3-1-3 پلاسمید
برای مرحله ی ساب کلونینگ از پلاسمید بیانی (pet-28a ) استفاده شد . این پلاسمید دارای جایگاه های مختلف برای انواع آنزیم های محدود کننده می باشد که می توان ژن مورد نظر را به کمک آنها وارد پلاسمید کرد. این پلاسمید دارای پارامترهای بیان کننده و همچنین جایگاه های برش آنزیمی دلخواه است و همچنین ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین را دارا بوده که به باکتری ترانسفورم شده امکان زنده بودن و بقاء در محیط کشت حاوی کانامایسین را می دهد. جهت بیان قطعه ژن کلون شده در آن هم دارای پارامتر های بیانی مانند پروموتر lac می باشد که در حضور القاگرIPTG شروع به بیان ژن مورد نظر می کند. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a در شکل 3-1 نشان داده شده است.

شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید pet28
3-1-4 آنتی بیوتیک ها
از آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و کانامایسین استفاده شد. که ابتدا این آنتی بیوتیک ها به غلظت مناسب رسانده شد و در تیوب های 5/1 میلی لیتری تقسیم گردید و سپس در شرایط دمایی20- درجه سانتیگراد و در فریز نگهداری شدند.
3-1-5 کیت های آزمایشگاهی
از کیت های استخراج DNA از ژل و استخراج پلاسمید که از شرکت فرمنتاز تهیه و خریداری شدند استفاده شد. که این کیت ها در شرایط دمایی 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
3-1-6 ژل الکتروفورز
برای ساختن ژل الکتروفورز از پودر آگارز Low که از شرکت هیسپانلب تهیه شد استفاده گردید و همچنین در ساختن ژل از رنگ اتیدیوم برماید و بافر TAE50X که آن را به یک ایکس رقیق نموده استفاده شد.
3-1-7 مواد شیمیایی
کلیه مواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان با درجه ی خلوص بیولوژی مولکولی تهیه گردید و در مراحل مختلف مطالعه از جمله تولید ژل الکتروفورز (SDS-page ) مورد استفاده قرار گرفت.
3-1-8 محیط کشت باکتری
در این مطالعه از محیط کشت های آگار و محیط کشت LBآگار جهت تکثیر و رشد باکتری استفاده شد.
3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی استفاده شده در این مطالعه
1- میکروتیوب های 2/0 ، 5/0 و 5/1
2- لوله ی آزمایش 160 × 16 سیماکس
3- پلیت یکبار مصرف 10 سانتیمتری
4- سمپلر در سایزهای مختلف
5- نوک سمپلر آبی، زرد، کریستالی
6- انکوباتور ساخت شرکت ممرت ایالات متحده امریکا (شکل 3-2 )

شکل3-2 دستگاه انکوباتور
7- اتوکلاو جهت ضد عفونی کردن وسایل پلاستیکی و محیط کشت ها(شکل 3-3)

شکل3-3 دستگاه اتوکلاو
8- دستگاه فور جهت ضد عفونی کردن وسایل شیشه ای
9- تانک الکتروفورز (SDS-Page )
10- تانک الکتروفوز افقی
11- دستگاه مولد ولتاژ (شکل 3-4 )

شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژ و تانک الکتروفورز
12- شیکرانکوباتور ساخت (شکل 3-5 )

شکل 3-5 شیکر انکو باتور
14- سانتریفیوژ ساخت شرکت اپندور آلمان (شکل 3-6 )

شکل 3-6 سانتریفیوژ
14- گرماساز
16- دستگاه تصویر ساز ژل ( شکل3-7)

شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل
17- انکی باتور شانزده درجه ( شکل 3-8 )

شکل3-8 انکی باتور شانزده درجه
18- بن ماری (شکل 3-9 )

شکل3-9 بن ماری
19.سانتریفیوژ یخچال دار
3-2 آنالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
توالی مورد نظر از طریق سایت های Swiss-port / Uniprot KB و مرکز ملی اطلاعات ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite Hidden="1"><Author>Online</Author><RecNum>84</RecNum><record><rec-number>84</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="vpp0ad9pgwdrfoefffjxvv9er2zwf0z0ep5z">84</key></foreign-keys><ref-type name="Online Database">45</ref-type><contributors><authors><author>Server Online</author></authors></contributors><titles><title>National Center for Biotechnology Information</title></titles><dates></dates><pub-location>www.ncbi.nlm.nih.gov</pub-location><urls><related-urls><url>www.ncbi.nlm.nih.gov</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote> بیوتکنولوژی (NCBI) بدست آورده شد. سپس در انتهای 3' توالی مورد نظر ، 6 اسید آمینه ی هیستیدین (His-Tag ) قرار داده شد و کدون پایان (TAA ) هم بعد از آن قرار گرفت. در انتها نیز جایگاه های برش آنزیمی برای آنزیم های محدود کننده NcoI در سر '5 توالی و جایگاه برش آنزیمی برای آنزیم محدود کننده XhoI در سر '3 توالی قرار داده شد.
3-2-2 بهینه سازی یا Optimization توالی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
از آنجای که ثابت شده فرآیند گلیکوزیلاسیون به نحوه اتصال این پروتئین در واکنش های هموفیلیک تاثیری ندارد میزبان پروکاریوتی E.coli برای فرآیند کلونینگ انتخاب شد. برای دستیابی به بیشترین میزان بیان صحیح در E.coli توالی 792 نوکلئوتیدی ناحیه C2 پروتئیینALCAM طراحی شده توسط شرکت Genscript ایالات متحده آمریکا بهینه سازی شد.
پارامترهایی که توسط این شرکت برای فرآیند بهینه سازی در نظر گرفته شد، شامل موارد زیر می شود :
codon usage میزبان
محتوای CG
ساختار دوم mRNA پیش بینی شده .
از بین بردن نواحی برش ناخواسته .
جایگاه های آنزیمی آنزیم های محدودالاثر که ممکن است در فرآیند کلونینگ اختلال ایجاد کنند.
6.به حداقل رساندن نواحی تکرار شونده مستقیم یا غیر مستقیم.
3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده ناحیه C2 پروتئین ALCAM توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد.
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده
DNA لیوفیلیزه شده را می توان توسط بافر TE استریل یا آب بدون نوکلئاز در PH طبیعی و با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول در آورد. و سپس می توان آن را در دمای بین20- تا 80- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد. DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TE می تواند به مدت 6 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود در صورتی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در 4 درجه سانتیگراد وجود ندارد.
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا بهتر است به مدت چند ثانیه تیوب را سانتریفیوژ کنیم تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند. در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیرهی DNA در هنگام برداشتن آن به دیواره های سر سمپلر بچسبد و از دسترس خارج شود.
1.استوک اصلی: µg 10 از DNA لیوفیلیزه در µl 100 از بافر TE حل شد.
2. استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگرµl 1 از استوک اصلی در µl10 از بافر TE حل شد. ( غلظت نهایی به ng/ µl10 رسید.)
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهC2پروتئین ALCAM
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته
جهت آماده سازی باکتری Top 10 برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید آن را کامپتنت یا شایسته سازی کرد.
3-4-1-1 مواد و محلول ها
- محلول کلرید کلسیم 0.1 مولار
- LB براث بدون آنتی بیوتیک
- LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن آن بعد از اتوکلاو کردن، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد. غلظت آمپی سیلین باید حدود 100 میکروگرم در هر میلی لیتر باشد )
- LB آگار حاوی آمپی سیلین ( روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است ).
3-4-1-2 روش کار
باکتری را در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده.
2- برای مدت24 ساعت (over night) محیط کشت را در انکوباتور قرار داده، یک تک کلون از آن را انتخاب کرده و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
3- 400 میکرو لیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB براث تازه تلقیح نموده و مجددا آن را به مدت 2تا 3 ساعت در شیکرانکوباتور قرار می دهیم. تا محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را به ما می دهد در این حالت باکتری در فاز رشد لگاریتمی خود قرار دارد.
4- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم.
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
9- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
10- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
12- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا 72 ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli
بدین منظور از سویه E.coli Top10 که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم. این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است و نمی تواند در محیط حاوی آمپی سیلین رشد نماید ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین رشد می کند .3-4-2-1 روش کار:
1- 50 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته را ابتدا روی یخ ذوب می کنیم.
2- 2 میکرولیتر از پلاسمید AMP+-pBSK حاوی DNA ناحیه C2پروتئینALCAM را به آن اضافه می کنیم .
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار می دهیم .
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و 5 دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB فاقد آمپی سیلین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 700 میکرولیتر از مایع رویی را دور ریخته و رسوب را در 250 میکرولیتر باقی مانده خوب حل می کنیم.
8- 100 میکرولیتر را روی یک پلیت LB آگار و150 میکرولیتر را روی یک پلیت دیگر دارای LB آگار آمپی سیلین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
9. 100 میکرولیتر از باکتری شایسته شده که عمل ترانسفوماسیون را روی آن انجام نداده ایم برای کنترل منفی روی پلییتLB آگار کشت می دهیم به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم.
3-4-3 ارزیابی کلونی ها
پس از 18 تا 20 ساعت پلیت ها را ارزیابی می کنیم، پلیت داری باکتری ترانسفورم شده تشکیل کلونی داد و پلیت حاوی باکتری ترانسفورم نشده نباید تشکیل کلونی دهد چون ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را دریافت نکرده است. پس از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود 1 تا 2 میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر LB براث آمپی سیلین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم . با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری، پلاسمید حاوی ژن ما را دریافت کرده است.

3-4-4 استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK حاوی DNA ، C2 پروتئین ALCAM
اساس استخراج پلاسمید مبتنی بر لیز قلیایی و متعاقب آن جذب DNA توسط سیلیکا است و سپس جداسازی پلاسمید از ستون می باشد. برای استخراج پلاسمید از کیت تهیه شده از شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد . ( شکل 3-10 )

شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید
روش کار :
1- از محیط کشتLB مایع حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تا اتمام محیط کشت5 میلی لیتری تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را 4 تا 6 بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول رویی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله12و13 را یک بار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.ستون را به مدت 15 دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم تا الکل آن به طور کامل تبخیر شود.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور ستون را در درون میکروتیوب5/1 سانتریفیوژ می کنیم .
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید - AMP+ pBSK که حاوی ژن C2 پروتئین ALCAM سنتز شده توسط کمپانی می باشد، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن سنتز شده می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion
با توجه به سازه ی طراحی شده از دو آنزیم محدود کننده ی Nco1 و XhoI جهت تایید آنزیمی استفاده شد. مراحل انجام کار به شکل زیر است:
1- ابتدا باید بافر مناسب برای هضم دوگانه آنزیم های NcoI و XhoI را انتخاب کنیم که این کار را با کمک سایت شرکت تولید کننده آنزیم ها یعنی فرمنتاز لیتوانی انتخاب می کنیم . بهترین شرایط بافری برای این واکنش بافرx2 تانگو می باشد .
2- یک میکروتیوب 2/0 برمی داریم و محتویات واکنش که توسط سایت فرمانتاز انتخاب کردیم را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید : 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
3- میکروتیوب را به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیموم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
3-4-5-2 الکتروفورز
جهت جداسازی قطعات حاصل از هضم دو گانه آنزیمی از الکتروفورز استفاده می شود.
3-4-5-2-1 تهیه بافر 50x TAE
برای تهیه بافر TAE 50x از موارد زیر استفاده می بریم:
Tris : 5/60 گرم
EDTA 5/0 مولار ( در 8 PH = ) : 25 میلی لیتر
اسید استیک: 28/14 میلی لیتر
آب استریل: به مقداری که حجم نهایی به 250 میلی لیتر برسد.
حجم نهایی:250 میلی لیتر
نکته: برای اینکه بافر 50x TAE را به بافر TAE 1x مورد استفاده دربیاوریم آن را در حجم مناسب رقیق می کنیم .
3-4-5-2-2 تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از ژل آگارز Low استفاده می کنیم . برای تهیه ی ژل 1.5 درصد آگارز، 0.45 گرم آگارز را در 30 میلی لیتر از بافر TAE 1x حل می کنیم و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی آن را مخلوط می کنیم . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت می دهیم تا کاملا ذوب شود. این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد ولی نباید به مرحله جوشیدن برسد. باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده و محلول کاملا شفاف شود.
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای 50 تا 60 درجه سرد شد(زمانی که دست را نسوزاند) ، رنگ گرین ویوئریا اتیدیوم برماید را به میزان 2 میکرولیتر به آن اضافه می کنیم و به ظرف مناسب شانه دار منتقل می کنیم و در دمای محیط قرار می دهیم تا ژل سفت شود و ببندد(تقریبا 15 دقیقه) . این ژل در حضور بافر TAE 1x تا یک هفته در دمای 4 درجه قابل نگه داری است.
3-4-5-2-3 Run کردن نمونه
پس از بسته شدن کامل ژل، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند . تانک الکتروفورز را با بافر TAE 1x پر می کنیم تا حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را با 2میکرولیتر (loading dye) مخلوط کرده و در درون چاهک ریخته ومقدار 2میکرولیتر از یک مارکر با وزن مولکولی kb 1 هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهک ها استفاده می کنیم .
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ 120 ولت و 55 آمپر الکتروفورز را انجام می دهیم .
وقتی رنگ تا حدود 3/2 ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه Gel) (documentation مورد بررسی قرار می دهیم .
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM
جهت بیان ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM از باکتری E.coli BL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از روی ژل اگارز مرحله الکتروفورز با استفاده از کیت خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد.
3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAMاز ژل
برای تخلیص از کیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل 3-11 )

شکل 3-11. کیت استخراج DNA از ژل فرمنتاز
روش انجام آن بصورت زیر می باشد:
1- به کمک یک اسکالپل استریل، ناحیه ای از ژل که DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM در آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم می کنیم برای راحت ذوب شدن ژل .
2- به ژل حاوی DNA نوترکیب ، 400 میکرولیتر Binding Buffer در داخل یک میکروتیوب اضافه می کنیم.
3- مخلوط را به داخل بن ماری 55 درجه انتقال داده و به مدت 5 دقیقه انکوبه می کنیم برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر 2 دقیقه هم می زنیم .
4- 5 میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه می کنیم .
5- 5 دقیقه در بن ماری 55 درجه قرار می دهیم تا سیلیکا به خوبی حل شود.
6- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند . محلول رویی را دور می ریزیم.
7- 500 میکرولیتر washing buffer به میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط می کنیم.
8- به مدت 10 ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را دور می ریزیم.
9- مرحله ی 7 و 8 را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود ( الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
10- 30 میکرولیتر بافر TE به رسوب اضافه کرده و ورتکس می کنیم تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود .
11- میکروتیوب را به مدت 5 دقیقه در 55 درجه قرار می دهیم.
12- به مدت 1 دقیقه میکروتیوب را در 000/15 دور سانتریفیوژ کرده تا تمامی ترکیبات جامد ته نشین شود . اینک محلول رویی حاوی DNA تخلیص شده است.
3-5-2 لایگیشن
برای اتصال DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM استخراج شده از ژل، با پلاسمید بیانی pet-28a در آزمایشگاه از آنزیم لیگاز استفاده می شود که می تواند اتصالات فسفودی استری شکسته شده را ترمیم کند. این آنزیم از فاژ T4 استخراج شده است و انرژی لازم برای فعالیت خود را از ATP تامین می کند و می تواند هم انتهاهای صاف و هم چسبنده را به هم متصل کند.
روش انجام این عمل به شکل زیر است:
1- محتویات واکنش را بصورت زیر مخلوط می کنیم.
بافر لایگیشن x 10 : 3 میکرولیتر
آب استریل: 9 میکرولیتر
DNA لیگاز T4 : 1 میکرولیتر
پلاسمید Pet-28a : 2 میکرولیتر
Insert (DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM) : 15 میکرولیتر
حجم نهایی: 30 میکرولیتر
نکته : در آخرین مرحله آنزیم T4، DNA لیگاز اضافه شود. چون اگر بعد از اضافه کردن آنزیم T4 ، محلول برای مدت طولانی در محیط بماند با توجه به قدرت بالای اتصال T4 اتصال های که مورد نظر ما نیست اتفاق خواهد افتاد.
2- به کمک دستگاه ترموسایکلر میکروتیوب حاوی مخلوط واکنش را به مدت 4 ساعت در 16 درجه سانتیگراد سپس به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار می دهیم .
3-5-3 ترانسفورماسیون
برای این مرحله از سویه E.coli BL21(DE3) که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم . این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب می کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین رشد، و تشکیل کلونی می دهد .
3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته
1- باکتری در محیط کشت فاقد کانامایسین کشت داده شد.
2- پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را برداشته و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون کانامایسین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح(over night) در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
3- 400 میکرولیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB مایع تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار می دهیم . 2 تا 3 ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را به ما می دهد.در این حالت باکتری ها در مرحله فاز رشد لگاریتمی قرار دارد.
4- باکتری هایی که تازه شده و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل تقسیم کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم .
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8.سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
9- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
10- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
11- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
12- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
13- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها را می توان برای مدت 72 ساعت روی یخ در یخچال نگهداری کرد و همچنین می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
1- ابتدا 100 میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) را روی یخ ذوب می کنیم.
2- 30 میکرولیتر از محصول لایگیشن را به 100 میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه می کنیم به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه بر روی یخ انکوبه می کنیم.
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار می دهیم، بدون حرکت و کاملا ثابت.
5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB مایع فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 800 میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در 230 میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل می کنیم .
8- 230 میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
3-5-4 ارزیابی کلونی ها
پس از مدت18 تا 20 ساعت در انکوباتور باکتری BL21 بر روی محیط کشت تشکیل کلونی می دهد. یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر محیط LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت
یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب در شیکر انکوباتور قرار می دهیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3) ، پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه آلودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت.
1- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را چند بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله 12 و 13 را یکبار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- ستون را در داخل میکروتیوپ 5/1 قرار داده و به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید بیانی pet-28a که حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM است که به کمک تکنیک لایگیشن به آن انتقال داده شده است، و برای تایید حضور ژن از جایگاه برش آنزیمی که در دو طرف، ابتدا و انتهای ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM در نظر گرفته شده است استفاده می کنیم، برای این منظور از هضم آنزیمی دو گانه استفاده می کنیم سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-5-6-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion و الکتروفورز
1- یک میکروتیوب 2/0 برمی داریم و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر