NFR6

پنومونی زمانی رخ می دهد که مکانیسم پاکسازی مخاطی مژکی برونش یا سلول‌های فاگوسیت کننده‌ی ذرات استنشاقی یا آسپیره شده از بین برود. ارتشاح ارگانیسم‌ها در پارانشیم ریه نمایانگر یک پاسخ التهابی با رسوبات سلول های فاگوسیت کننده به داخل آلوئول‌ها و راه‌های هوایی و تولید اگزودایِ غنی از پروتئین است. این پاسخ التهابی باعث اختلال تهویه وکاهش ظرفیت ریه، افزایش کار تنفس و هیپوکسمی می‌گردد. پاسخ التهابی منجر به تب و لُکوسیتوز نیز می‌گردد]1[.
اگرچه مجموعه‌ای از ارگانیسم‌های مشابه باعث ایجاد پنومونی وابسته به ونتیلاتور می‌شوند ولی باکتری‌های زیر، به ترتیب از بیشتر به کمتر، عوامل ابتلا به پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور هستند: استافیلوکوک اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا، سوش‌های انتروکوک، آسینتو باکتر بامائی، کلبسیلاپنومونیه، اشرشیاکولی و استافیلو کواگولاز منفی. ولی ویروس ها، قارچ ها، وپاتوژن های بی‌هوازی، نقش زیادی ندارند ]1[.
2-4. عوامل خطر ابتلاء به VAPسن بالا، کاهش سطح هوشیاری، دریافت خون و فرآورده‌های خونی، بیماری ریوی زمینه ای، بیماری های تهدید کننده‌ی حیات (دیسترس تنفسی، تروما ،سوختگی ،شوک )،کلونیزاسیون اوروفارنجیال، افزایش طول مدت تهویه‌ی مکانیکی، وضعیت طاق‌باز، تماس با سایر بیماران و یا سایر پرستاران، آنتی بیوتیک ها، مصرف بیش از اندازه آرام بخش‌ها، فشار کم کاف اندوتراکئال (کمتراز cm/H2o 20)، انتقال موقت به خارج از ICU وتضعیف سیستم ایمنی، عوامل خطر ابتلاء به VAP هستند ]15و1[.
2-5. علائم پنومونی وابسته به ونتیلاتور
ارتشاح پیش‌رونده‌ی ریوی، تب، لُکوسیتوز وترشحات تراکئوبرونشیالِ چرکی
Lung filtration
Fever > 38.5 or < 35 C
WBC> 10000/mm3 or < 3000/ mm3
Purulent sputum ]8[.
2-6. راهنمای بالینی پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور کشور ایرلند در سال 2011 2-6-1.اهمیتراهنمای بالینی پیشگیری از بیماری ها دستور العملی است که بر اساس اخرین دست اورد های علمی جهانی توسط صاحب نظران تدوین می گردد تا جامعه پزشکی را در رسیدن به اهداف پیشگیری وکنترل بیماری ها یاری نماید.کمیته کنترل مقاومت میکروبی کشور ایرلند با کمک راهنماهای بالینی قبلی پیشگیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور وبر اساس آخرین دست آورد های علمی استخراج شده از مقالات متعدد پیشنهاداتی را در جهت کنترل این عارضه ارائه نموده است که به ان اشاره می گردد ]16[.2-6-2.آموزشهمه بیمارستان‌ها باید برنامه‌ای برای آموزش، پیش‌گیری وکنترل VAP برای پرسنل درمانی داشته باشند که شامل اطلاعات در مورد اپیدمیولوژیِ بومی، بعلاوه‌ استراتژیِ مبتنی بر شواهد پیش‌گیری از VAP باشد.
گام اول در آموزش پیش‌گیری وکنترل، باید شامل ضد عفونی دست‌ها و استفاده از وسایل محافظتی شخصی باشد.
گاید لاین‌های بالینی و پروتوکل‌های مراقبت از VAP در بخش های ویژه، باید اجرا شوند و توسعه یابند.
علاوه بر آن، راهنماهای بالینی و پروتوکل‌ها باید به‌طور منظم پایش شوند تا از پذیرش آن توسط پرسنل مطمئن شویم و هرگونه نقص در این زمینه شناسایی وگزارش شوند ]16[.
2-6-3.کنترل مراقبت‌های بالینی و پیش‌گیری از عفونت
به‌کارگیری پیش‌گیری‌های استاندارد، باید اولین اقدام در پیش‌گیری از انتقال عوامل عفونی در بیماران وپرسنل باشد.
ضد عفونی کردن دست‌ها بر اساس راهنماهای بین‌المللی، باید جزئی از مراقبت‌های بالینیِ پیش‌گیری از VAP باشد.
قبل و بعد از هر تماسِ مستقیم با بیمار و بعد از هر عملی که بالقوه باعث آلودگی دست می‌شود و بعد از در آوردن دست‌کش‌ها، دست‌ها باید به‌طور مناسب با آب و صابون شستشو داده شوند و در صورت عدم وجود آلودگی واضح در دست، با محلول های الکلی، ضد عفونی شوند.
علاوه بر آن، ضد عفونی دست‌ها باید مرتب پایش شوند تا از پذیرش آن توسط پرسنل مطمئن شویم و بازخورد مناسبی از آن‌ها دریافت نماییم.
وسایل محافظتی پرسنل مثل دست‌کش، پیش‌بند، ماسک، عینک و... باید به‌طور مناسب استفاده شوند و به‌طور مناسب جمع‌آوری و معدوم گردند ]16[.
2-6-4. لوله گذاری نایتاحد ممکن لوله گذاری از طریق دهان باشد تا از طریق بینی.
حتی المقدور از خارج سازی غیر ضروری لوله‌ی نای و لوله گذاری مجدد خودداری شود ]16[.
2-6-5. تهویه با فشار مثبت
تاحد ممکن از تهویه غیر تهاجمی استفاده شود.
تهویه‌ی مکانیکی در مواردی که ضرورت ندارد نباید ادامه پیدا کند.
پروتوکل جدا سازی بیمار از دستگاه بر اساس شواهد موجود باشد.
ارزیابی روزانه بیمار برای امکان جا سازی از دستگاه انجام شود.
کم کردن یا قطع آرامبخش‌ها روزانه به‌طور مناسب اجرا شود ]16[.
2-6-6.استراتژی داروییخط مشی محدودیت استفاده از فرآورده‌های خونی در بیماران با تهویه‌ی مکانیکی باید اجرا شود.
2-6-7. پیش‌گیری از آسپیراسیون یک فشار کاف مناسب باید در بیمارانی که تراکئوستومی یا دارای لوله‌ی تراشه بوده و در معرض اسپیراسیون قرار دارند اجرا شود.
فشار کاف باید دقیقا اندازه‌ای باشد که هیچ صدای قابل شنیدنی از لیک هوا در اطراف لوله وجود نداشته (در مواقعی که فشار طبیعی راه هوایی وجود دارد ) و باید حد اقل 20 سانتی متر آب باشد .
بیماران تحت تهویه‌ی مکانیکی، باید وضعیت نیمه نشسته (30 تا 45 درجه بالا بودن سر تخت ) داشته، مگر آن‌که ممنوعیتی داشته باشند.
در بیمارانی که وضعیت نیمه نشسته را نمی توانند تحمل کنند، باید از تخت چرخان استفاده شود.
بایداز نفخ معده در بیماران تحت تهویه‌ی مکانیکی که تغذیه‌ی معدی دارند اجتناب شود ]16[.
2-6-8.پیش‌گیری ازآلودگی وسایلوسایل یک‌بار مصرف نباید هیچ‌گاه دو بار استفاده شوند.
همه وسایلی که در ارتباط با بیمار هستند باید بر طبق خط و مشی بیمارستان وکارخانه سازنده، تمیز، ضد عفونی ونگهداری شوند.
بعد از گندزدایی، برای شستشوی وسایل تنفسیِ غیر تهاجمی و چند بار مصرف باید از آب مقطر استریل استفاده کرد.
پرسنل، هنگامی که مدار تنفسی را قطع می‌کنند باید از ماسک صورت استفاده کنند.
برای شستشوی وسایل تنفسی غیر تهاجمی وچند بار مصرف باید از اب مقطر استریل استفاده کرد.
سیستم وسایل مرطوب‌کننده (مرطوب‌کننده‌های گرمائی و یا فیلترهای نگه‌داری گرما و رطوبت ) باید بر اساس توصیه‌ی کارخانه‌ی سازنده یا هر زمان که از نظر بالینی لازم شد، تعویض شوند.
و برای هر بیمار جدید، یک سیستم جدید آماده شود.
هنگامی که مرطوب‌کننده‌ها پر می شوند نکات استریل رعایت شود ، آب استفاده برای مرطوب‌کننده‌ها باید استریل یا تقطیر شده باشد.
توصیه خاصی برای استفاده ازنوع خاصی از مرطوب‌کننده وجود ندارد.
نوع سیستم ساکشن ( بسته یا باز) بر شیوع VAP تاثیری ندارد.
ولی در بیمارانی که ترشحات فراوان دارند یا عفونت مشکوک یا شناخته شده ای دارند که می‌تواند از طریق هوا منتقل شود، ساکشن بسته توصیه می‌شود.
وسایل ساکشن باید زمانی تعویض شوند که خراب یا کثیف شده باشند، برنامه‌ی منظم تعویض توصیه نمی‌شود.
یک سیستم ساکشن جدید برای بیمار جدید باید آماده شود ]16[.
2-6-9. پیش‌گیری از کلونیزاسیونِ مجاری گوارشیآنتاگونیست های H2 نظیر رانیتیدین و یا مهارکننده‌های پمپ پروتون نظیر پنتوپرازول باید در بیماران تحت تهویه‌ی مکانیکی که ریسک بالایی برای خونریزی دستگاه گوارش دارند استفاده وسوکرالفات ممکن است در بیمارانی که ریسک پایین تری دارند استفاده شود.
ضد عفونی دهان باید به‌طور منظم در بیماران تهویه‌ی مکانیکی استفاده شود.
یک مسواک نرم هر 12 ساعت یک‌بار برای تمیزی پلاک های دهانی استفاده شود مگر در مواردی که ممنوعیت دارد مانند: کمبود پلاکت وخطر افزایش خونریزی.
کلرو هگزیدین (2%-12/0%) باید طبق برنامه منظم برای ضد عفونی دهان استفاده شود.
بتادین 10% ممکن است در بیماران با صدمات شدید سر به‌جای کلروهگزیدین استفاده شود ]16[.
2-7. بررسی وکنترل فشار کاف لوله‌ی نای و تراکئوستومیهدف از پر کردن کاف امکان برقراری تنفس با فشار مثبت بدون اتلاف حجم جاری و جلوگیری از آسپیراسیون ترشحات دهان ومعده و عوارض متعاقب آن است ]17[.
2-7-1.صدمات نای به‌علت فشار بالای کاف لوله‌ی نای
فشار کاف بیشتر از فشار پرفیوژن آرتریول ها موجب بروز صدمات ایسکمیک، آسیب، له شدگی ونکروز بافت نای می گردد. در بیماران ICU این مسئله جدی‌تر است چراکه بعضی از بیماران ممکن است دچار حملات افت فشار نیز شوند و پرفیوژن نای کمتر از حد عادی شود.
التهاب ساده، ایجاد زخم، خونریزی، تشکیل بافت نکروزه ، فیستول نای مری، تشکیل بافت اضافی، تنگی تراشه و انسداد، از صدمات تراشه به‌ علت فشار بالای کاف لوله نای است]17[.
2-7-2. نرم شدگی غضروف نای
پرشدگی بیش از حد کاف و فشار طولانی مدت، باعث ضعف عضلات نای، نرم شدن غضروف‌ها وگشاد شدگی تراشه در محل تماس کاف با تراشه می گردد، که برای جلوگیری از نشت، احتیاج به اضافه کردن حجم بیشتری از هوا به کاف است. که این موضوع باعث وضعیت خطرناک تبعیت نای از کاف و احتمال نرم شدگی غضروف نای می گردد. مطالعات نشان داده اند که بین فشارهای بالای 25 تا 30 میلیمتر جیوه و افزایش صدمات نای ارتباط مستقیم وجود دارد. فشار بیش از 25 میلیمتر جیوه (حدود 34 سانتی متر آب ) موجب آسیب به سیستم گردش خون نای می گردد. فشار بیش از 50 میلیمتر جیوه قادر است در عرض 15 دقیقه ایسکمی غیر قابل برگشت و تخریب لایه پوششی نای را در محل کاف ایجاد کند و پس از 48 ساعت منجر به نکروز کامل ‌گردد]17[.
فشار کاف باید بین 20 تا 30 سانتی متر آب نگه‌داری شود؛ بعضی منابع بین 25 تا 30 و بعضی دیگر20 تا 25 ذکر کرده اند ولی حد اقل آن، 20 سانتی متر آب است. باید به بیماران جدید بخصوص بیمارانی که از اتاق عمل یا اورژانس منتقل شده اند توجه خاصی داشته باشیم. درصورتیکه با فشار 20 تا 30 سانتی متر آب، هنوز نشتی داشته باشیم باید به پزشک اطلاع داده شود. فشار کمتر از 20 سانتی متر آب باعث آسپیراسیون و ایجاد پنومونی وابسته به ونتیلاتور می‌گردد]17و16[.
2-8 .شست‌وشو و ضد عفونی دست‌هاروزانه هزاران نفر در دنیا به‌علت عفونت های ناشی از مراقبت‌های درمانی می‌میرند ودست‌ها عامل اصلی انتقال میکروب‌ها است وشستن یا ضدعفونی دست‌ها مهمترین عامل در پیش‌گیری از انتقال میکروب‌هاست. ]18[.
2-9. مراقبت‌های پرستاری در پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور1-جلوگیری از انتقال آلودگی توسط دست‌ها (دست شستن- ضدعفونی دست - پوشیدن دست‌کش ).
2-تکنیک استریل در انجام پروسیجرها به‌خصوص در ساکشن لوله‌ی تراشه یا تراکئوستومی.
3-استفاده از لوله‌ی‌ تراشه با لومن ساکشن دار جهت ساکشن ترشحات ساب گلوت (باقی نماندن ترشحات در دهان وته حلق).
4-تخلیه‌ی ترشحات ته حلق ( به هنگام لوله گذاری یا خارج سازی آن، جابه‌جایی لوله و یا اندازه‌گیری فشار کاف ).
5-لوله گذاری از طریق دهان (تاحد ممکن).
6-لوله گذاری در شرایط استریل (استریل باقی ماندن لوله- پایین نرفتن ترشحات ).
7-انجام تراکئوستومی در شرایط استریل.
8-عدم تعویض مکرر لوله‌های خرطومی (تعویض موقع خرابی یا آلودگی و یا هر بیمار جدید ).
9-استفاده از فیلتر مناسب و جلوگیری از حرکت آب به سمت بیمار و تخلیه به‌موقع آب جمع شده در مدار.
10- ماسک زدن در موقع قطع مدار ونتیلاتور.
11- پیش‌ گیری از زخم‌های گوارشی.
12- پیش ‌گیری از ترومبوز وریدهای عمقی.
13- سر تخت 30 تا 45 درجه، مگر در موارد ممنوعیت .
14- چک کردن محل صحیح لوله معدی به‌طور روتین .
15- چک کردن حجم باقی‌مانده معدی به‌طور روتین .
16-دهان‌شویه منظم و موثر با کلروهگزیدین و مسواک مناسب .
17-کم کردن روزانه آرامبخش ها و ارزیابی روزانه برای خارج سازی لوله‌ی نای ]17و8و2و1[.
2-10. آموزش چهره به چهره وکارگاهی در پرستاری آموزش فردی به صورت آموزش چهره به چهره از روش‌های مستقیم و حضوری آموزش بوده و با انواع روش‌های توضیحی یا عملی در محل‌های مختلف و در فرصت‌های متنوع قابل اجرا است. مزیت آموزش انفرادی آن است که می‌توان با افراد بحث و گفتگو کرد و آن‌ها را ترغیب نمود تا رفتار خود را دگرگون کنند. و کارگاه آموزشی روشی برای حل مسائل و مشکلات است؛ که در آن تعداد معدودی از افراد ( بین 25 تا 40 نفر) که به یک رشته یا موضوع خاص علمی، فنی و... وابستگی دارند در کنار یکدیگر قرار می‌گیرند و با حضور کارشناسان، موضوعات، مباحث و یا مسایل مشخصی را به‌منظور ارائه‌ی توصیه‌ها یا پیشنهادهایی برای اقدامات و برنامه‌های بعدی مورد بحث و تجزیه و تحلیل قرار می‌دهند. همکاری کامل تک تک شرکت کننده‌گان ازطریق فراگیری به‌صورت عمل و تجربه از خصوصیات کارگاه است ]11[.
2- 11. جمع بندیدر این بخش تعریف پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور، عوارض، شیوع، مرگ‌و‌میر، راه‌های اصلی انتقال، اتیولوژی، پاتوفیزیولوژی، علائم و عوامل خطر آن، به اختصار توضیح داده شد. همچنین آخرین دست آوردهای مبتنی بر شواهد علمی در پیش‌گیری از VAP و تنظیم فشار کاف لوله‌ی نای وضد عفونی دست‌ها مطرح و در آخر، آخرین روش‌های مراقبت‌های پرستاری در پیش ‌گیری از این بیماری بحث گردید و اما میزان رعایت جزئیات پیش‌ گیری توسط پرستار چه قبل وچه بعد از آموزش سوالی است که ما در این پژوهش آن‌را دنبال می کنیم.
2-12.مروری بر متوندر این بخش ابتدا متون مرتبط با گاید لاین‌های پیش‌گیری از VAP و تایید آن‌ها و سپس مطالعات مرتبط با آموزش پرستاران و نقش آن ها در پیش‌گیری از VAP بررسی می شود. اغلب مطالعات به‌صورت یک مجموعه‌ی نسبتا کامل VAP را بررسی نکرده بودند، بعضی فقط دانش پرستار را بررسی و بعضی از خودگزارش‌دهی و مشاهده‌ی عملکرد و یا یک یا چند عاملِ معدود در پیش‌ گیری از VAP بهره جسته اند،که بطور خلاصه به آنها اشاره می شود:
مدنی و همکاران اثر بالا بودن سر تخت را درپیش‌گیری ازVAP در یک مطالعه‌ی آینده نگر، در360 بیمار ترومایی درسال2006 آزمودند و نتیجه گرفتند که بالا بردن سر تخت به اندازه 30درجه به میزان معنی داری خطر آسپیراسیون ریوی و پنومونی را کم می‌کند]19[.
نتیجه یک متا آنالیز از 11 پژوهش، شامل 3242 بیمار که تهویه‌ی مکانیکی دریافت می‌کردند،در سال 2007 نشان داد که ضد عفونی کننده های دهانی، مثل کلروهگزیدین، به‌طور معنی داری شیوع VAP راکاهش می‌دهند]20[.
تریک وهمکاران،در سال 2007 اثر سه ضد عفونی کننده دست را به‌طور اتفاقی آزمودند و مشاهده کردند، میکروب های بیماری زا در گروهی که دست‌شان ضد عفونی نشده بود نسبت به گروهی که ضد عفونی شده بود 10 برابر بیشتر می باشد]21[.
مرکز مراقبت و حمایت های پزشکی اخیرا VAP را در لیست بیماری‌هایی قرار داده است که پیش‌گیری از آن‌ها ضروری است(سال 2012). از نظر این مرکز، VAP باید پیش‌گیری شود چرا که خسارت‌های آن قابل جبران نیست به‌عنوان مثالی از عواقب آن، استافیلوکوک ارئوسِ مقاوم به متی سیلین را می‌توان نام برد و اگر VAP پیش‌گیری نشود بیمارستان‌ها باید یک ضایعه‌ی بزرگ اقتصادی را تجربه کنند]8[.
راهنمای بالینی پیش‌گیری از VAP به‌صورت یک مجموعه در سال 2003 منتشر شد و با استفاده از شواهد علمی، بارها آزمایش و تایید گردید. اجزاء مجموعه‌ی 2010 پیش ‌گیری شامل: بالا بردن سر، به میزان 30تا45 درجه، پیش‌گیری از ترمبوز وریدهای عمقی، پیش‌گیری از زخم های گوارشی، قطع و کم کردن روزانه‌ی آرامبخش‌ها، ارزیابی روزانه برای خارج سازی سریع‌تر لوله‌ی تراشه وبهداشت روزانه‌ی دهان با کلروهگزیدین می باشد. چندین محقق این مجموعه را آزمودند و دریافتند که شیوع VAP را کاهش می دهد]23و22و8[.
واما در بحث آموزش پرستاران، در مطالعه‌ی که حسن‌پور و همکاران در سال 1385 با عنوان تاثیر آموزش به روش یادگیری بر اساس حل مشکل وسخنرانی بر یادگیری، نگرش وعملکرد دانشجویان پرستاری انجام دادند، از40 دانشجوی پرستاری که به دو گروه 20 نفره تقسیم می‌شدند استفاده کردند و از سه پرسش‌نامه‌ی، بررسی نگرش، بررسی یادگیری و چک لیست بررسیِ عملکرد استفاده نمودند و نتیجه گرفتند که یادگیری بر اساس حل مشکل تاثیر بیشتری دارد]24[.
در پژوهشی که مهرعلی و همکاران در سال 2011 درباره‌ی میزان دانش مبتنی بر شواهد پرستاران در پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور قبل و بعد از آموزش در شهر کراچی پاکستان داشتند از گاید لاین 2003 مرکز پیش‌گیری وکنترل بیماری های امریکا(CDC) جهت آموزش استفاده کردند ودانش پرستار را با ابزار پرسش‌ نامه ، یک‌ بار قبل از آموزش، بار دوم دقیقا بعد از آموزش وبار سوم یک ماه بعد از آموزش سنجیدند. در این پژوهش 40 پرستار سنجیده،حداقل سابقه کار پرستار در ICU یکسال بعنوان معیار ورود،آموزش انجام شده5ساعت و متوسط دانش پرستاران در قبل از آموزش نمره 7، دقیقا بعد از آموزش 9/10 ویک ماه بعد از آموزش 8/9 گزارش شده است ]9[.
در مطالعه برزیل که توسط مارتین و همکارانش در سال های 2007 و2008 ، تحت عنوان تاثیر آموزش بر فشار کاف‌ها دربخش مراقبت های ویژه انجام شده است، فشار کاف‌ها یک ‌بار قبل از آموزش پرستاران به‌صورت گذشته نگر ویک ‌بار بعد از آموزش در شیفت های صبح، عصر وشب به‌طور جداگانه جمع‌آوری گردیده است. از آزمون مجذور کای استفاده شد و محدوده‌ی 5% (P <0.05) به‌عنوان تغییرات معنی دار وفشار بالاتر از 30 سانتی متر آب به‌عنوان فشار کاف نامناسب در نظر گرفته شده است.همچنین آموزش تئوری وعملی انجام شده در این پژوهش 30 دقیقه گزارش شده است و نتایج به‌دست آمده در این مطا لعه به‌شرح زیر می باشد: میزان فشارهای نامناسب کاف‌ در شیفت صبح، قبل از آموزش 9.2% در حالی که بعد از آموزش به 7.6% و در شیفت عصر و شب نیز به همین ترتیب از 11.9% به 4.1% و از 13.7% به 5.2% کاهش پیدا کرده بود. که تغییرات در شیفت عصر وشب معنی دار ولی در شیفت صبح معنی دار نبود]10[.
در مطالعه ی قندیل وطنطاوی درسال 2011 که در کشور مصر تحت و عنوان تمرینات عملی که در حال حاضر پرستاران در پیشگیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور دارند، انجام شده است .بر روی 150 پرستار از شش ICU مختلف با استفاده از دو ابزار پرسش ‌نامه‌ی خودگزارش ‌دهی و چک ‌لیستِ مشاهده،اطلاعات مربوط به پیش ‌گیری از پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور توسط پرستار با دو ابزار فوق در یک مقطع زمانی جمع‌آوری وشش ICU جراحی،عمومی،مغزواعصاب،داخلی،ریه وکبد با هم مقایسه شده اند.در این مطالعه از راهنمای بالینی CDC استفاده شده است ومواردی مانند:شستن دست ،پوشیدن دستکش،ساکشن ته حلق،درجه سرتخت و مسواک زدن بررسی شده است. در این مطالعه، دانش پرستار لحاظ نشده بود و آموزش نیز وجود نداشت. همچنین در این مطالعه 3/53 % از پرسنل گفته‌اند که همیشه در انجام امور بیماران دست ‌شان را می‌شویند،47%گفته اند که ساکشن ته حلق را قبل از خارج سازی لوله نای انجام می دهند،39%سرتخت را بالا قرار می دهندو33% هر 8تا12 ساعت یکبار بیمارشان را مسواک می کنند.]25[.
در مرور متون ، مطالعه‌ی خارجی یا داخلی که آموزش پرسنل در پیش‌گیری از VAP را دقیقا در دو گروهِ چهره به چهره یا کارگاهی مقایسه نماید ،یافت نشدوهمانطور که اشاره شد اغلب مطالعات انجام شده در این زمینه، به‌صورت یک مجموعه‌ی نسبتا کامل VAP را بررسی نکرده بودند، واما در مطالعه حاضر سعی شد از یک مجموعه‌ی نسبتا کامل، یعنی دانش، خودگزارش‌دهی و مشاهده‌ی عملکرد استفاده گردد،تا عوامل موثر بر VAPکه مرتبط با پرستاران می باشد مانند انجام ساکشن ،بالا بودن سر تخت، دست شستن ، فشار کاف و... در دو گروه ، قبل وبعد از آموزش مقایسه شود.این در حالی است ‌که هنوز بسیاری از عوامل مرتبط با VAP در کنترل قرار نگرفت.

2057400-1097280فصل سوم
00فصل سوم
فصل سوم
مواد و روش‌ها
3-1. اهداف 3-1-1.هدف کلی
مقایسه‌ی تاثیر آموزش راهنمای بالینیِ پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور به دو روش چهره به چهره وکارگاهی بر دانش و عملکرد پرستاران.
3-1-2.اهداف جزئی شاملالف: اهداف مشاهده:
1- تعیین و مقایسه‌ی میزان فشار کاف لوله‌ی تراشه یا تراکئوستومیِ بیماران گروه آموزش چهره به چهره با گروه آموزش کارگاهی، قبل و بعد از آموزش.
2-تعیین و مقایسه‌ی میزان آماده بودن مایع ضدعفونی دست در مجاورت تخت بیماران ، قبل و بعد از آموزش.
3-تعیین و مقایسه‌ی میزان صحیح بودن وضعیت سر تخت بیماران ، قبل و بعد از آموزش.
4-تعیین و مقایسه‌ی میزان تعویض فیلتر ضد باکتری دستگاه ونتیلاتور بیماران ،قبل و بعد از آموزش.
5-تعیین و مقایسه‌ی میزان شستن، ضد عفونی کردن دست و یا پوشیدن دست‌کش معاینه قبل از تماس با بیمار، قبل و بعد از آموزش.
6- تعیین و مقایسه‌ی میزان ترشحات دهان (ساکشن انجام نشده پرستار) بیماران ، قبل و بعد از آموزش.
ب: هدف خودگزارش‌دهی:
تعیین و مقایسه‌ی میزان رعایت اصول پیش‌گیری از VAP در خودگزارش‌دهی پرستار گروه آموزش چهره به چهره با گروه آموزش کارگاهی، بعد از آموزش
ج: هدف دانش پرستاری:
تعیین و مقایسه میزان دانش پرستار در پیش‌گیری از VAP ، در گروه آموزش چهره به چهره با گروه آموزش کارگاهی، قبل و بعد از آموزش
3-2.فرضیات
1-آموزش چهره به چهره‌ی راهنمای بالینی پیش ‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور نسبت به آموزش کارگاهی آن، بر عملکرد پرستاران موثرتر است.
2-آموزش چهره به چهره‌ی راهنمای بالینی پیش‌گیری از پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور نسبت به آموزش کارگاهی آن، بر دانش پرستاران موثرتر است.
3-آموزش چهره به چهره وکارگاهیِ راهنمای بالینیِ پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور، بر دانش وعملکرد پرستاران در پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور موثر است.
3-3. معیارهای پذیرش و خروج نمونه3-3-1. معیارهای وروددارا بودن لیسانس پرستاری و سابقه حداقل 3 ماه کار در ICU
3-3-2. معیار های خروج:
آگاه شدن پرستار از بخش مشاهده طرح، مرخصی ویا انتقال پرستار به بخش دیگر

3-4. مواد و روش انجام تحقیق3-4-1. جامعه مورد مطالعه و روش نمونه گیری
در این پژوهش نیمه‌تجربی در سال 1392، کلیه 75 نفر پرستار شاغل در چهار ICU مشابه (همگی بیماران جراحی) در یکی از بیمارستان‌های وابسته به دانشگاه علوم پزشکی شیراز در دو گروه 35 نفره و40 نفره که از نظر تحصیلات، همگی دارای مدرک لیسانسِ پرستاری و از نظر جنس، سن و سابقه‌ی کار در ICU، کاملا مشابه بودند، تحت آموزش و بررسی قرار گرفتند. داده ها به روش تمام شماری جمع آوری شدند.
3-4-2.روش اجراجهت انجام این پژوهش از سه ابزار: چک لیست مشاهده(ضمیمه الف )، پرسش ‌نامه‌ی خودگزارش ‌دهی (ضمیمه ب) و پرسش‌ نامه‌ی سنجش‌ دانش(ضمیمه ج) استفاده شد.
جهت روایی پرسش ‌نامه‌ی سنجش‌دانش و عملکرد پرستار در پیش ‌گیری ازپنومونی وابسته به ونتیلاتور که توسط قندیل و همکاران [25] و کارولاین و همکاران ]26[ استفاده شده بود، به فارسی ترجمه و سپس توسط پزشک عمومیِ مسلط به زبان انگلیسی مجددا به انگلیسی بازگردانده شد و آن‌گاه توسط متخصص ICU، اصل پرسش ‌نامه و ترجمه‌ی فارسی و ترجمه‌ی انگلیسی آن مقایسه وپس ازحذف چند سوال وجایگزینی آنها، روایی آن تایید گردید. برای تایید پایایی آن نیز 2 بار به فاصله‌ی 10 روز به 7 نفر پرستارICU تحویل شد و با ضریب همبستگی 87% برای پرسش‌ نامه‌ی خودگزارش ‌دهی و84% برای پرسش‌ نامه‌ی سنجش‌دانش پرستار، تایید گردید.. چک لیست مشاهده نیز بر اساس آخرین راهنمای بالینی پیش‌ گیری از پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور توسط پژوهشگر تهیه و پس از تائید اعضای هیئت علمیِ بیهوشی، جهت استفاده در پژوهش آماده گردید.
چهارICU مورد مطالعه از نظر نوع بیماران بستری به‌طور کامل همگن بودند ولی از نظر اداره‌ی آن توسط متخصص دو به دو متفاوت بوده که با قید قرعه، همگن گردیدند و پرستاران دو ICU درگروه آموزشِ چهره به چهره و دو ICU دیگر در گروه کارگاهی قرار گرفتند. پس از کسب اجازه از مسئولین، جهت مشاهده‌ی قبل از آموزش، دوکمک پژوهشگر که دانشجوی کارشناسی رشته‌ی بیهوشی بودند، در حالی‌که بر روی یک طرح پژوهشی دیگری نیز در همان ICU ها کار می‌کردند (بدینوسیله پرستاران از قسمت مشاهده‌ی طرح مطلع نشدند) وارد بخش‌های ویژه شده، و پرستارِ هر بیماری را که احتیاج به مراقبت‌های پیش‌گیری از VAP داشت، تحت نظر گرفتند. کمک پژوهشگر طبق فرم مشاهده‌ی عملکرد، (ضمیمه الف) عملکردِ پرستار را که شامل موارد زیر است، کنترل و ثبت می نمود:
1- اندازه فشار کاف لوله‌ی تراشه بوسیله‌ی مانومتر مخصوص و قابل اعتماد کنترل و ثبت می‌شد.
2- در دسترس بودنِ ضد عفونی کننده های دست در مجاورت تخت بیمار کنترل و ثبت می‌شد.
3- کمک پژوهشگر، دستور پزشک مبنی بر وضعیت سر تخت بیمار را از پرونده چک و اجرا شدن یا نشدن این دستور راکنترل و ثبت می‌کرد.
4- میزان تعویض فیلتر ضد باکتریِ دستگاه ونتیلاتور را طبق تاریخی که پرستار بر آن درج کرده بود، در چک لیست ثبت می نمود.
5-سه تماس پرستار با بیمار که شامل یکی از موارد دست شستن، ضدعفونی کردن دست، پوشیدن دست‌کش معاینه و یا انجام ندادن هیچ‌کدام است ، را یاداشت می‌کرد. (چنان‌چه پرستاری برای یک پروسیجر استریل، دست‌کش استریل می پوشید این مشاهده، از 3 مشاهده‌ی پرستار حذف و بعدا مشاهده جدیدی ثبت می‌شد.همچنین فقط عکس العمل پرستار قبل از تماس با بدن بیمار ،ملحفه،تخت وسایر تجهیزات بیمار یا قبل از انجام پروسیجر برای بیمار ثبت می شد و عکس العمل بعد از تماس یاداشت نمی شد ).
6- کمک پژوهشگر دهان بیمار را مشاهده می‌کرد وچنان‌چه دهان پر از ترشحات بوده یا از گوشه های لب و ایروی لبریز بود، به‌عنوان ساکشن انجام نشده پرستار ثبت می‌کرد.
پس از آنکه چک‌ لیستِ مشاهده‌ی قبل از آموزش پر شد. آموزش پرستاران توسط دانشجوی مسئول پایان نامه، به شکل کارگاه و با پرسش و پاسخ پرستاران و آموزش عملیِ چگونگی تنظیم فشار کافِ لوله‌ی نای وتراکئوستومی و در دو روز متوالی و هر روز حدود20 پرستار، برای گروه گارگاهی و طبق آخرین اصول پیش‌گیری ازVAP ارائه گردید که این آموزش شامل: شناسائی، عوامل خطر، علل ایجاد، اهمیت، میزان مرگ‌ومیر و اصول پرستاری در پیش‌گیری از VAP بود و جزییات پیرامون: شست‌شوی دست، ساکشن استریل، بالا بردن سر به میزان 30تا45 درجه ، پیش‌گیری از ترمبوز وریدهای عمقی ، پیش‌گیری از زخم‌های گوارشی، قطع وکم کردن روزانه آرامبخش ها، ارزیابی روزانه برای خارج سازی سریع‌تر لوله‌ی تراشه و بهداشت روزانه‌ی دهان با کلروهگزیدین می‌شد که بیشتر از گاید لاین پیش‌گیری ازVAP کشور ایر لند استفاده شده بود(ضمیمه د). قبل از شروع آموزش، پرسش‌نامه‌ی سنجش دانش به پرستاران ارائه و جواب ها اخذ گردید. و در همان هفته نیز آموزش گروه بعدی به روش چهره به چهره ودر گروه‌های 2الی 5 نفره و با همان محتوا انجام پذیرفت. یک هفته بعد از ارائه آموزش کارگاهی و چهره به چهره، پرسش ‌نامه‌ی سنجش دانش پرستاری مجددا و به همراه پرسش ‌نامه‌ی خودگزارش‌ دهی توسط پرستاران و در ICU ها تکمیل گردید، و یک ماه بعد از آموزش، چک لیستِ مشاهده بعد از آموزش، توسط کمک پژوهشگر مجددا برای همان پرستاران و دقیقا به‌مانند قبل از آموزش ، بعد از مشاهده آنان تکمیل گردید.ودر آخر داده‌های گردآوری شده وارد نرم افزار spss و به کارشناس آمار ارائه گردید.
3-4-3.روش تجزیه و تحلیل اطلاعاتداده ها با کمک آزمون های آماری توصیفی (میانگین و فراوانی) و تحلیلی( آزمون تیِ‌ زوجی،تیِ مستقل، مک نمار، فیشر دقیق، ساین و آزمون مجذور کای)تحلیل گردید، P value کمتر از05/ به‌عنوان اختلاف معنی داری در نظر گرفته و جهت انجام تمام تجزیه و تحلیل ها، از نرم افزار spss/19 استفاده شد.

3-4-4. حجم نمونه حجم نمونه شامل 75 پرستار بود که نمونه ها به روش سرشماریِ کل پرستارانِ شاغل در چهارICU یکی از بیمارستان های تابعه‌ی دانشگاه علوم پزشکی شیراز ،وارد مطالعه شدند وICU ها با قرعه کشی در دو گروه 35 نفره و40نفره همگن قرار گرفتند.
3-5.محدودیت‌ها
فشار کاف لوله‌های نای وتراکئوستومی که در حین اندازه گیری نامناسب و برای بیمار خطرناک بود همان موقع تصحیح می‌شد ودر شیفت های بعدی این بیمار از لیست مشاهده حذف می شد.
محدودیت بعدی حضور مشاهده گر بود که در هر حال می توانست بر عملکرد پرستار موثر باشد اگرچه سعی شد با انتخاب دو کمک پژوهش گری که بر یک طرح تحقیقاتی دیگری نیزدر همین ICU ها کار می کردند، این تاثیر به حد اقل برسد.
ومحدودیت اخر اینکه ارتباط بین گروه ها در زمان مطالعه و دریافت آموزش درطول طرح از منابع دیگر می توانست بر یافته ها موثر باشد که پژوهش گر قادر به کنترل آن نبود.
3-6.ملاحضات اخلاقی
مشاهده پرستار بدون اطلاع و اجازه او از مشکلات اخلاقی طرح بود که با در نظر گرفتن این امر، که حفظ حیات بیماران و پیش‌ گیری از ابتلای آنها به یک بیماریِ با مرگ‌ومیر بالا مهمتر است و با محرمانه بودن اطلاعات و ارائه آن‌ها با شماره‌ی پرستار و مطرح نشدن نام پرستار، نام بخش وحتی نام بیمارستان سعی شد تا اثرات این مشکل تقلیل یابد.

2272665-360680فصل چهارم
00فصل چهارم

فصل چهارمنتایج و یافته‌ها
در این فصل ابتدا به مقایسه گروه ها از نظر جنس ،سن ،مدرک تحصیلی ومیزان سابقه کار در ICU پرداخته وسپس یافته های مشاهده وخودگزارش دهی بررسی می گردد.4-1. مقایسه جنس ،سن ،مدرک تحصیلی ومیزان سابقه کار در ICU ،گروه چهره به چهره و کارگاهیدو گروه از نظر جنس، سن، مدرک تحصیلی و میزان سابقه کار در ICU تفاوت معنی داری نداشتند.قابل ذکر است، با توجه به این‌که یکی از گروه‌ها دارای دو پرسنل با مدرک کارشناسی ارشد بود برای یکسان سازیِ دو گروه، این دو نفر از مطالعه حذف گردیدند( جدول شماره4- 1،جدول شماره4- 2 و جدول شماره4- 3)
جدول شماره4- 1. مقایسه جنس گروه چهره به چهره وکارگاهیگروه جنس تعداد درصد P*
چهره به چهره مرد 4 12 P=1
زن 31 88 کارگاهی مرد 5 12 زن 35 88 * آزمون مجذورکایجدول شماره4- 2.مقایسه میانگین سن گروه چهره به چهره وکارگاهی
گروه میانگین سن انحراف معیار P*
چهره به چهره 001/4 44. 2877/0P=
کارگاهی
14/ 4 49. 28*آزمون تی تست
جدول شماره 4-3. مقایسه میانگین سابقه کار گروه چهره به چهره وکارگاهیگروه میانگین (سال)± انحراف معیار آزمون P
چهره به چهره 74/1 6/2تی
تست
(t=0/429)
(df=67) 57/0P=
کارگاهی
94/1 4/24-2. یافته ها و نتایج مشاهده4-2-1. میزان فشار کاف لوله‌های تراشه و یا تراکئوستومی بیماراندر اندازه گیری فشار کاف لوله‌های تراشه و یا تراکئوستومی از 35 بیمار در هر گروه که هر کدام متعلق به یک پرستار بود یک‌بار قبل از آموزش ویک‌بار بعد از آموزش فشار ثبت گردید. فشار 20 تا 30 سانتی متر آب طبیعی و بیشتر یا کمتر از آن غیر طبیعی محسوب گردید. فشار کاف بالاتر از 42 سانتی متر آب بعلت قطع کامل پرفیوژن آرتریول های تراشه، به‌عنوان فشار خطرناک محسوب شد ونتایج زیر حاصل شد.در مقایسه دو گروه قبل از آموزش و همچنین بعد از آموزش از آزمون فیشر دقیق استفاده شد ونتایج معنی دار نبود(P=0/69 قبل از آموزش وp=1 بعد از آموزش) واما مقایسه قبل وبعدازآموزش گروهها معنی دار بودو نتایج در(جدول شماره4-4)و(نمودار شماره 4-1 ، نمودار شماره 4-2 و نمودار شماره 4-3)آمده است.

جدول شماره 4-4.مقایسه وضعیت فشار کاف قبل بابعد از آموزش
گروه زمان وضعیت فشار کاف ها تعداد درصد P*
چهره به چهره قبل از آموزش مناسب 8 20 P=0/001
نامناسب 32 80 بعد ازآموزش مناسب 27 67.5 نامناسب 13 32.5 کارگاهی قبل از آموزش مناسب 16 40 P<0/001
نامناسب 24 60 بعد ازآموزش مناسب 34 85 نامناسب 6 15 * آزمون مک نمار

نمودار شماره4-1.مقایسه فشارکاف لوله های تراکئوستومی ونای گروه چهره به چهره
نمودار شماره 4-2. مقایسه فشارکاف لوله های تراکئوستومی ونای گروه کارگاهی
نمودار شماره 4-3. مقایسه فشارکاف های خطرناک4-2-2 نتایج آماده بودن مایع ضد عفونی کنار تخت بیمار.درمقایسه دو گروه قبل از آموزش وهمچنین بعد از آموزش از آزمون فیشر دقیق استفاده شد و تفاوت ها معنی دار نبود(P=1)، ادامه مقایسه ها در( جدول شماره 4-5)آمده است.جدول شماره 4-5. مقایسه قبل با بعد از آموزش اماده بودن مایع ضد عفونی کنار تخت بیمار.گروه زمان مشاهده آماده بودن مایع ضد عفونی در مجاورت تخت بیمار تعداد درصد P *
چهره به چهره قبل از آموزش آماده 31 88 P=0/12
غیر آماده 4 12 بعد از آموزش آماده 35 100 غیر آماده 0 0 کارگاهی قبل از آموزش آماده 31 88 P=0/37
غیر آماده 4 12 بعد از آموزش آماده 34 97 غیر آماده 1 3 * آزمون مک نمار
4-2-3. مناسب بودن وضعیت سر تخت بیمار (30 تا 45 درجه در صورت نداشتن ممنوعیت )از مشاهده‌ی تخت بیماران در دو گروه قبل از آموزش، فقط در هر گروه یک مورد تخت نامناسب بود و بعد از آموزش، در دو گروه وضعیت مناسب تخت، صد درصد رعایت شده بود. ( جدول شماره 4-6).
جدول شماره 4-6. مقایسه قبل از آموزش وهمچنین بعد از آموزش مناسب بودن وضعیت سر تخت بیمار گروه ها با یکدیگرگروه زمان مشاهده مناسب بودن سرتخت تعداد درصد P *
چهره به چهره قبل از آموزش مناسب 34 97 P=1
نامناسب 1 3 بعد از آموزش مناسب 35 100 نامناسب 0 . کارگاهی قبل از آموزش مناسب 34 97 نامناسب 1 3 بعداز آموزش مناسب 35 100 نامناسب 0 0 * آزمون فیشر دقیق4-2-4. مشاهده‌ی تعویض فیلتر ضد باکتریفیلتر ضد باکتری در بخش، طبق توصیه‌ی کارخانه وکمیته‌ی کنترل عفونت 48 ساعته تعویض می‌شد. در مشاهده‌ی فیلتر، چنان‌چه تاریخ درج شده توسط پرستار بیشتر از 48 ساعت یا تاریخ درج نشده بود، به‌عنوان نامناسب و در غیر این صورت به‌عنوان مناسب یادداشت می‌شد. درمقایسه دو گروه قبل از آموزش وهمچنین بعد از آموزش از آزمون مجذور کای استفاده شد و تفاوت ها معنی دار نبود(P=0/19 در گروه چهره به چهره وP=0/13 در گروه کارگاهی)،ادامه مقایسه ها در( جدول شماره 4-7)آمده است.
جدول شماره 4-7. مقایسه قبل با بعد از آموزش تعویض فیلتر ضد باکتریگروه زمان مشاهده وضعیت فیلتر ضد باکتری تعداد درصد P*
چهره به چهره قبل از آموزش مناسب 23 65.7 P=0/1
نامناسب 12 34.3 بعد از آموزش مناسب 29 82.9 نامناسب 6 17.1 کارگاهی قبل از آموزش مناسب 18 51.4 P=0/039
نامناسب 17 48.6 بعداز آموزش مناسب 26 74.3 نامناسب 9 25.7 * آزمون مک نمار
4-2-5. مشاهده‌ی پوشیدن دست‌کش معاینه، شستن دست و یا ضدعفونی دست‌ها.تماس پرستار با بیمار وانجام پروسیجر بیمار به‌جز مواردی که احتیاج به دست‌کش استریل داشت در این قسمت مشاهده گردید و به‌صورت، پوشیدن دست‌کش معاینه، شستن دست، ضدعفونی کردن دست و یا هیچکاری نکردن ثبت گردید. درمقایسه دو گروه قبل از آموزش وهمچنین بعد از آموزش از آزمون مجذور کای استفاده شد و تفاوت ها معنی دار نبود(P=0/78 در گروه چهره به چهره وP=0/88 در گروه کارگاهی)،ادامه مقایسه ها در( جدول شماره 4-8)آمده است.

جدول شماره 4-8. مقایسه قبل با بعد از آموزش درصد پوشیدن دستکش معاینه ،شستن دست ویا ضدعفونی دستها.گروه زمان مشاهده عکس‌العمل در تماس با بیمار تعداد درصد P*
چهره به چهره قبل از آموزش پوشیدن دست‌کش معاینه 3 5/8 P=0/68
ضدعفونی یا شستن دست 1 8/2 هیچکاری نکردن 31 7/88 بعد از آموزش پوشیدن دست‌کش معاینه 4 5/11 ضدعفونی یا شستن دست 2 7/5 هیچکاری نکردن 29 8/82 کارگاهی قبل از آموزش پوشیدن دست‌کش معاینه 4 5/11 P=0/75
ضدعفونی یا شستن دست 1 8/2 هیچکاری نکردن 30 7/85 بعد از آموزش پوشیدن دست‌کش معاینه 5 2/14 ضدعفونی یا شستن دست 2 7/5 هیچکاری نکردن 28 1/80 * آزمون ساین4-2-6. مشاهده‌ی ساکشن انجام نشده پرستار.درمقایسه دو گروه قبل از آموزش وهمچنین بعد از آموزش از آزمون فیشر دقیق استفاده شد و تفاوت ها معنی دار نبود(P=1 در گروه چهره به چهره وP=0/11 در گروه کارگاهی)، در حالی که مقایسه قبل با بعد از آموزش گروه ها معنی دار بود.ادامه مقایسه ها در( جدول شماره 4-9) و(نمودار شماره 4-4و4-5)آمده است.
جدول شماره 4-9. مقایسه قبل با بعد از آموزش ساکشن انجام نشده پرستارگروه زمان مشاهده ساکشن تعداد درصد P*
چهره به چهره قبل از آموزش انجام نشده 10 5/28 P=0/008
انجام شده 25 5/71 بعد از آموزش انجام نشده 2 7/5 انجام شده 33 3/94 کارگاهی قبل از آموزش انجام نشده 12 2/34 P=0/002
انجام شده 23 8/65 بعداز آموزش انجام نشده 2 7/5 انجام شده 33 3/94 * آزمون مک نمار

نمودار شماره 4-4. مقایسه میزان ساکشن انجام نشده پرستار گروه چهره به چهره
نمودار شماره 4-5. مقایسه میزان ساکشن انجام نشده پرستار گروه کارگاهی4-3. یافته ها و نتایج خودگزارش‌دهیدر این قسمت میزان پاسخ پرستاران به گزینه های سوالات خودگزارش دهی در جدول بعد از هر سوال آمده است.
4-3-1. سوالات عمومی در ارتباط با روتین بخش‌ها1-آیا یک پروتوکل نوشته شده(مدون) دربخش ICU شما در مورد پیش‌گیری از VAP وجود دارد؟
جدول شماره4-10.پاسخ سوال1خودگزارش دهیگروه گزینه تعداد
پاسخ درصد
پاسخ
گروه چهره به چهره(34 پرستار) بلی 15 44%
خیر 19 56%
گروه کارگاهی(38 پرستار) بلی 23 60%
خیر 15 40%
2-آیا یک پروتوکل نوشته شده(مدون) دربخش ICU شما در مورد مراقبت های بهداشتی دهان وجود دارد؟
جدول شماره4-11. پاسخ سوال 2 خودگزارش دهیگروه تعداد کل گزینه تعداد درصد
چهره به چهره 35 بلی 20 57%
خیر 15 43%
کارگاهی 40 بلی 31 77%
خیر 9 23%
3-دفعات مسواک کردن دهان بیمار در بخش شما در 24 ساعت چند بار است ؟
جدول شماره4-12. پاسخ سوال 3 خودگزارش دهیگروه تعدادکل گزینه تعداد درصد
چهره به چهره 34 4 بار 1 3%
3 بار 22 65%
2 بار 8 23%
1بار 3 9%
کارگاهی 38 4 بار 2 5%
3 بار 33 87%
2 بار 2 5%
1بار 1 3%
4-دفعات دهان‌شویه بیمار با کلرو هگزیدین در بخش شما در 24 ساعت چند بار است ؟
جدول شماره4-13. پاسخ سوال 4 خودگزارش دهیگروه کل جواب تعداد درصد
چهره به چهره 35 4بار 3 8%
3بار 28 80%
2بار 0 0%
1بار 4 12%
کارگاهی 37 4بار 4 11%
3بار 30 81%
2بار 3 8%
1بار 0 0%
5- نوع مرطوب‌کننده‌ی راه‌های هوایی که در بخش شما استفاده می‌شود کدام است ؟
جدول شماره4-14. پاسخ سوال 5 خودگزارش دهیگروه گزینه تعداد درصد
چهره به چهره
33نفر سیستم مرطوب‌کننده‌های گرمایی 3 10%
فیلتر مخصوص حفظ گرما ورطوبت 10 30%
هردو نوع 20 60%
کارگاهی
35نفر سیستم مرطوب‌کننده‌های گرمایی 3 9%
فیلتر مخصوص حفظ گرما ورطوبت 11 31%
هردو نوع 21 60%
4-3-2. نتایج عملکرد شخصی پرستارانچنان‌چه بیمار شما در ICU احتیاج به مراقبت پیش‌گیری ازپنومونی وابسته به ونتیلاتور داشته باشد (دارای لوله‌ی تراشه یا تراکئوستومی )، در این زمینه عملکرد خود را گزارش فر مایید.
6-شستن دست قبل از تماس با بیمار یا ضدعفونی انرا.. ....
جدول شماره 4-15. پاسخ سوال 6 خودگزارش‌دهیگروه گزینه تعداد درصد
چهره به چهره(31 پرستار) همیشه انجام می دهم 23 74%
اکثر اوقات انجام می دهم 8 26%
بندرت انجام می دهم 0 0%
هیچ وقت انجام نمی دهم 0 0%
کارگاهی(38پرستار) همیشه انجام می دهم 31 81%
اکثر اوقات انجام می دهم 7 19%
بندرت انجام می دهم 0 0%
هیچ وقت انجام نمی دهم 0 0%

7-برای انجام امور بهداشتی دهان بیمار.. ........
جدول شماره 4-16. پاسخ سوال 7 خودگزارش دهیگروه گزینه تعداد درصد
چهره به چهره
(34 پرستار) همیشه دست‌کش می پوشم 32 94%
اکثراوقات دست‌کش می پوشم 2 6%
بندرت دست‌کش می پوشم 0 0%
هیچ وقت دست‌کش نمی پوشم 0 0%
کارگاهی(37پرستار) همیشه دست‌کش می پوشم 34 91%
اکثراوقات دست‌کش می پوشم 3 9%
بندرت دست‌کش می پوشم 0 0%
هیچ وقت دست‌کش نمی پوشم 0 0%
8-قبل از خارج ساختن لوله‌ی نای، جابه‌جایی یا خالی کردن کاف آن، ساکشن ته حلق واطراف لوله‌ی نای را.. ......
جدول شماره 4-17. پاسخ سوال 8 خودگزارش دهیگروه و
تعدادکل پرستاران پاسخ داده گزینه ها تعداد ودرصد پاسخ داده به این گزینه
تعداد درصد
چهره به چهره(34 پرستار) همیشه انجام می دهم 32 94%
اکثر اوقات انجام می دهم 2 6%
بندرت انجام می دهم 0 0%
هیچ وقت انجام نمی دهم 0 0%
کارگاهی(37پرستار) همیشه انجام می دهم 34 91%
اکثر اوقات انجام می دهم 3 9%
بندرت انجام می دهم 0 0%
هیچ وقت انجام نمی دهم 0 0%

4-چنان‌چه بیمارم منعی برای بالا بودن سر تخت نداشته باشد، قراردادن سر تخت بیمار دروضعیت 30 تا45 درجه بالاتر را.. ..
جدول شماره 4-18. پاسخ سوال 9 خودگزارش دهیگروه و
تعدادکل پرستاران پاسخ داده گزینه ها تعداد ودرصد پاسخ داده به این گزینه
تعداد درصد
چهره به چهره(33 پرستار) همیشه انجام می دهم 29 88%
اکثر اوقات انجام می دهم 4 12%
بندرت انجام می دهم 0 0%
هیچ وقت انجام نمی دهم 0 0%
کارگاهی(39پرستار) همیشه انجام می دهم 32 82%
اکثر اوقات انجام می دهم 7 18%
بندرت انجام می دهم 0 0%
هیچ وقت انجام نمی دهم 0 0
10-تعویض کاتتر ساکشن لوله‌ی نای راچگونه انجام می دهید؟
جدول شماره 4-19. پاسخ سوال 10 خودگزارش دهیگروه و

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

تعدادکل پرستاران پاسخ داده گزینه ها تعداد ودرصد پاسخ داده به این گزینه
تعداد درصد
چهره به چهره(35 پرستار) هربار ساکشن یک کاتتر جدید 35 100%
هرشش ساعت یک کاتتر 0 0%
هردوازده ساعت یک کاتتر 0 0%
هر24ساعت یک کاتتر باشد 0 0%
کارگاهی(39پرستار) هربار ساکشن یک کاتتر جدید 39 100%
هرشش ساعت یک کاتتر 0 0%
هردوازده ساعت یک کاتتر 0 0%
هر24ساعت یک کاتتر باشد 0 0%
11- روشی که عموما شما در بخش برای ساکشن کردن استفاده می‌کنید کدام است ؟
جدول شماره 4-20. پاسخ سوال 11 خودگزارش دهیگروه و
تعدادکل پرستاران پاسخ داده گزینه ها تعداد ودرصد پاسخ داده به این گزینه
تعداد درصد
چهره به چهره(35 پرستار) روش باز 24 68%
روش بسته 9 26%
هر دو روش استفاده می‌شود 2 6%
کارگاهی(35پرستار) روش باز 22 63%
روش بسته 8 23%
هر دو روش استفاده می‌شود 5 14%
12- لوله‌های خرطومی ونتیلاتور را چگونه تعویض می‌کنید ؟
جدول شماره 4-21. پاسخ سوال 12 خودگزارش دهیگروه و
تعدادکل پرستاران پاسخ داده گزینه ها تعداد ودرصد پاسخ داده به این گزینه
تعداد درصد
چهره به چهره(35 پرستار) هر48ساعت یک‌بار 2 6%
هرهفته یک‌بار 0 0%
هربیمارجدید و
هرموقع از نظر بالینی لازم باشد 33 94%
کارگاهی(37پرستار) هر48ساعت یک‌بار 2 6%
هرهفته یک‌بار 0 0%
هربیمارجدید و
هرموقع از نظر بالینی لازم باشد 35 94%

13-به چه میزان از مرطوب‌کننده راه‌های هوایی استفاده می‌کنید ؟
جدول شماره 4-22. پاسخ سوال 13 خودگزارش دهیگروه و
تعدادکل پرستاران پاسخ داده گزینه ها تعداد ودرصد پاسخ داده به این گزینه
تعداد درصد
چهره به چهره(31 پرستار) همیشه 18 58%
اکثر اوقات 13 42%
بند رت 0 0%
هیچ وقت استفاده نمی کنم 0 0%
کارگاهی(38پرستار) همیشه 15 40%
اکثر اوقات 21 55%
بند رت 2 5%
هیچ وقت استفاده نمی کنم 0 0%
4-4.نتایج دانش پرستاردر مقایسه دو گروه قبل از آموزش وهمچنین بعد از آموزش ازآزمون تی مستقل استفاده شد ونتایج معنی دار نبود(P=0/97 در گروه چهره به چهره و P=0/92 درگروه کارگاهی )،در حالیکه مقایسه قبل با بعد از آموزش گروه ها معنی دار بود(جدول شماره4-23 ) و (نمودار شماره 4-6)

جدول شماره4-23. مقایسه قبل با بعد از آموزش میانگین وانحراف معیاردانش پرستاران
گروه زمان میانگین ± انحراف معیار P*
چهره به چهره قبل از آموزش 7/14 ± 17/36 P < 0/001
بعد از آموزش 79/7 ± 82/93 کارگاهی قبل از آموزش 56/14 ± 28/36 P < 0/001
بعد از آموزش 35/ 7 ± 94 * آزمون تی جفتی
نمودار شماره4-6.مقایسه قبل با بعد ازآموزش دانش پرستاران2298700-1049655فصل پنجم
00فصل پنجم
فصل پنجمبحث ونتیجه گیری
در این پژوهش، ابتدا بعضی از مهمترین عواملی را که در پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور نقش داشته و به‌طور مستقیم با عملکرد پرستاران مرتبط بود، در ICU های مورد مطالعه و با استفاده از روش‌های خودگزارش‌دهی، سنجش دانش و مشاهده‌ی عملکرد پرستاران جمع‌آوری شد و بعد از آموزش به دو روشِ چهره به چهره وکارگاهی، مجددا با روش‌های ذکر شده پرستاران ارزیابی شدند، در حالی‌که در مطالعه قندیل و طنطاوی در مصر که بر روی 150 پرستار از 6 ICU مختلف با استفاده از دو ابزار پرسش‌نامه‌ی خودگزارش‌دهی وچک لیست مشاهده، انجام گردیده بود، اطلاعات مربوط به پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور توسط پرستار با دو ابزار فوق در یک مقطع زمانی جمع‌آوری و6 ICU با هم مقایسه شده بودند. در این مطالعه دانش پرستار لحاظ نشده بود و آموزشی نیز وجود نداشت. ولی اطلاعات گردآوری شده می توانست در برنامه‌ریزی در پیش‌گیری از VAP موثر باشد.
در این قسمت به بحث در مورد جزئیاتِ نتایجِ به‌دست امده در پژوهشِ حاضر می پردازیم:
5-1. مشاهده 5-1-1. فشار کاف‌های لوله‌ی نای یا تراکئوستومیمشاهدات نشان داد که، فشار کاف‌ها که باید هر 8 ساعت یک‌بار کنترل شود، فقط یک ‌بار در 24 ساعت کنترل می‌شد و علاوه بر آن، فشار کاف‌ها بسیار بالاتر از میزان طبیعی آن بود. در این میان بیماران بخش های دیگر مثل اتاق‌عمل یا اورژانس که به ICU منتقل می‌شدند، اکثرا فشار کاف‌هایشان بالاتر از میزان استاندارد بود. در مورد کنترل فشار کاف‌ها، آموزش پرسنل موفقیت‌آمیز بود و با همکاری مسئولین، تنظیم کاف‌ها به‌صورت 8 ساعته انجام شد. اگرچه در ابتدای تنظیم فشارها توسط پرسنل، با کاهش بیش از اندازه (کمتر از 20 سانتی متر اب ) در بعضی موارد مواجه بودیم ولی این مشکل با آموزش و تمرین مجدد پرسنل حل گردید . در مطالعه‌ی مارتین و همکاران که در برزیل با عنوان تاثیر آموزش بر فشار کاف‌ها در بخش مراقبت های ویژه انجام شده بود، 6/11 درصد از بیمارانِ دارای لوله‌ی نای قبل از آموزش، فشارکاف نامناسب داشتند، درحالی‌که بعد از آموزش به 6/5 درصد کاهش یافته بود. ولی در مطالعه‌ی ما متوسط کاف‌هائی که فشارشان نامناسب بود در دو گروه قبل از آموزش 70 درصد بود درحالی‌که بعد از آموزش به7/23 درصد کاهش پیدا کرد. و این به این معنی است که در ICU های مورد مطالعه ما حدود7 برابر بیشتر از ICU های مورد مطالعه برزیل فشار کاف‌ها نامناسب و خطر ناک است.
5-1-2. ضد عفونی وشستن دست
انجام این مهم یعنی همان شستن دست و ضدعفونی، که یکی از مهمترین عوامل کنترل عفونت و پیش‌گیری از پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور است، درپرسنلِ مورد مطالعه‌ی ما قبل از آموزش بسیار ناچیز بود (حدود8/2% ). وبعد از آموزش نیزاگرچه افزایش پیدا نمود ولی تغییرات آن معنی دار نبود(حدود7/5%).با توجه به اظهار نظر مسئولین کنترل عفونت بیمارستان مبنی بر اینکه آموزش روش دست شستن وضد عفونی دست واهمیت بالینی آن در کنترل عفونت بارها ارائه گردیده است وپرستاران در این رابطه اطلاعات کافی دارند، شاید بتوان دلیل عدم نتیجه گیری مطلوب این مورد را به علل زیر نسبت داد:باور ونگرش منفی پرستاران در این مورد، حجم زیاد کار پرستار وداشتن بیش از یک بیمار در ICU (ICU های مورد مطالعه‌ی این پژوهش به این شکل اداره می‌شد)، بی انگیزگی پرستار در مراقبت از بیمار به‌علل حقوق و مزایای پایین، عدم کنترل کافی مسئولینِ پرستاری وکنترل عفونت،کمبود وسایل و لوازم مورد نیاز ، کمبود روشوئی وفاصله زیاد انها تا تخت بیماران و...
5-1-3. آماده بودن مایع ضدعفونی ومناسب بودن سرتخت بیمار
بالا بودن سر تخت درصورت نداشتن ممنوعیت به میزان 30 تا 45 درجه و آماده بودن مایع ضدعفونی در مجاورت تخت بیمار در این پژوهش، هم قبل از آموزش و هم بعد از آن، توسط دو گروه به‌خوبی رعایت می‌شد و در این زمینه مشکلی مشاهده نشد.
5-1-4. تعویض فیلتر ضد باکتریدرمورد تعویض به‌موقع فیلتر ضد باکتری که طبق دستورالعمل کارخانه‌ی سازنده، هر48 ساعت یک‌بار تعویض می گردید، بعد از آموزشِ ما در دو گروه، شاهدِ بهبودی نسبی تعویض به‌موقع بودیم ولی فقط در گروه کارگاهی معنی دار بود.
5-1-5. ساکشن انجام نشده‌ی پرستاراز آن‌جایی که علت اصلی ایجاد پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور، آسپیراسیون و میکروآسپیراسیونِ ترشحات حلق ، دهان و معده است، در ارزیابی و مقایسه‌ی میزان ساکشن انجام نشده‌ی پرستار قبل و بعد از آموزش، ساکشن های انجام نشده بعداز آموزش کاهش چشمگیر داشت؛ که دلیل آنرا می توان در اطلاعات ناکافی پرستاران ، قبل از آموزش در این مورد و تاکید زیاد پژوهش ‌گر حین آموزش‌ها به تاثیر انجام ساکشن ها در پیش‌گیری از آسپیراسیون ونهایتا پیشگیری از VAP ، جستجو کرد .
5-2. خودگزارش دهی
فرم خودگزارش دهی که توسط پرستاران یک هفته بعد از آموزش تکمیل گردید، حاوی نکات زیر بود:
اکثر پرستاران در دوگروه اعلام داشتند که در یک دوره‌ی 24 ساعته، بیماران 3 بار دهان شویه با کلروهگزیدین گرفته و3 بار مسواک می شوندو همچنین اکثر آن‌ها اعلام کرده اند که برای امور بهداشتیِ دهان بیمار، همیشه دست‌کش می پوشند و قبل از خارج سازی لوله‌ی نای، ته حلق را ساکشن می‌کنند و بالا گذاشتن سرتخت به میزان 30 تا 45 درجه را درصورت نداشتن ممنوعیت انجام می دهند در حالیکه در پژوهش مشابه آن که در مصر توسط قندیل وهمکاران انجام گردیده بود کمتر از 50% پرستاران به سه سوال آخر جواب مثبت داده بودند.
5-3. دانش پرستاران در پیش‌گیری از VAP
در پژوهش مهر علی و همکاران که در باره‌ی میزان دانش مبتنی بر شواهد پرستاران در پیش‌گیری از پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور قبل و بعد از آموزش انجام شده بود، دانش پرستار با ابزار پرسش‌نامه ، یک‌بار قبل از آموزش، بار دوم دقیقا بعد از آن سنجیده شده بود. ولی در پژوهش حاضر، برای ارزیابی هرچه بهترِ آموزشِ داده شده در حافظه‌ی دراز مدت پرستاران، این پرسش‌نامه‌ها یک هفته بعد از آموزش تحویل داده شد و دانش پرستاران در پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتورارزیابی گردید و دانش پرستاران در دو گروه در قبل از آموزش با بعد از آن تغییر چشمگیری داشت. (نمودار شماره 4- 6)
5-4. مقایسه‌ی قبل با بعد آموزشِ هر گروهدر مقایسه‌ی قبل با بعد هر گروه به‌طور جداگانه، همان‌طور که ذکر گردید در بعد از آموزش موفقیت چشمگیری در موارد زیر مشاهده شد: کاهش درصد فشارهای‌ نامناسب وخطر ناک کاف ، کاهش ساکشن‌های انجام نشده، افزایش تعویض فیلتر ضد باکتری و افزایش دانش پرستار.
برخی موارد مورد مطالعه، هم قبل و هم بعد از آموزش مناسب بود مانند: آماده بودن مایع ضد عفونی در مجاورت تخت بیمار و مناسب بودن سر تخت.
ولی در بعضی موارد دیگر، هم قبل از آموزش ضعف مشاهده شد و هم بعد ازآموزش نیز تغییری معنی داری نداشت؛ مانند: دست شستن و ضدعفونی کردن دست.

5-5. مقایسه‌ی گروه چهره به چهره با کارگاهی
اگرچه آموزش به روش چهره به چهره وکارگاهی بر اکثر متغییرهای مورد مطالعه در پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور موثر بود ولی در مقایسه‌ی دو گروه با یک‌دیگر در قبل از آموزش و همچنین بعد از آن، تفاوت معنی داری مشاهده نشد که این می‌تواند به‌علت ماهیت آموزش در این دو روش باشد که با هم تفاوت آن‌چنانی نداشت. چرا که محتوای آموزش در آموزش کارگاهی و چهره به چهره یکی و فقط تعداد افراد در گروه کارگاهی بیشتر بودند؛ در نتیجه زمان بیشتری نیز برای بحث در گروه کارگاهی صرف ، ولی در گروه چهره به چهره به‌علت تعداد کمتر، زمان کم‌تری نیز گرفته می‌شد.
5-6.نتیجه گیری
پایش و ارزیابی بخش مراقبت های ویژه از نظر میزان رعایت اصول پیش‌گیری از پنومونیِ وابسته به ونتیلاتور، امری ضروری و آموزش پرستاران در جهت پیش‌گیری از این بیماری بسیار موثر است و در این میان، بررسی فشار کاف‌ها، دست شستن و ضدعفونی کردن دست‌ها و ساکشن های انجام نشده، توجهی ویژه را می طلبد.
5-7. کاربرد پ‍‍‍ژوهش در حرفه‌ی پرستاریاولین دست‌آورد این پژوهش آن است که ICU ها احتیاج به پایشِ منظم عملکردِ پرسنل، به‌خصوص پرسنل پرستاری به‌خاطر ارتباط تنگاتنگ و موثرشان با بیماران را دارد، تا به این وسیله از میزان اجرای استانداردهای مراقبت‌های پرستاری توسط پرسنل اطمینان حاصل کرده وکاستی ها و مشکلات را با آموزشِ موثر بهبود بخشیم.
فشار کاف‌های لوله‌ی نای و تراکئوستومی در بیماران ICU باید بیش از پیش پایش شوند، پر کردن کاف‌ها بدون مانومترِ مخصوص، معمولا به فشار غیر مجاز کاف منجر می شود و این مشکل، علاوه بر درگیری اغلب ICU ها شامل اتاق‌های عمل و اورژانس‌ها و سایر بخش‌ها نیز می گردد که لازم است مسئولین علاوه بر فراهم نمودن مانومتر مخصوص برای تمام بخش ها، آموزش لازم را نیز به پرستاران ارائه نمایند.
این پژوهش نشان داد که به شستن دست و ضدعفونی آن که مهمترین عامل در پیشگیری از انتقال میکروارگانیسم ها است،کم توجهی می‌شود .پس لازم و حیاتی است که مسئولینِ مربوط، به گونه ای برنامه‌ریزی نمایند تا پذیرش این امر توسط پرسنل افزایش یابد.
5-8.پیشنهادات جهت پژوهش‌های آیندهبررسی تاثیر آموزش پرستاران بر بروز VAP در ICU
مقایسه تاثیر آموزش به روش فعال و غیر فعال بر عملکرد پرستاران در پیشگیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور
مقایسه‌ی تاثیر آموزش حضوری و غیرحضوری بر عملکرد پرستاران در پیشگیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور
مقایسه‌ی تاثیر آموزش به روش الکترونیکی و حضوری بر عملکرد پرستاران در پیشگیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور
بررسی میزان نامناسب بودن فشار کاف لوله‌های نای وتراکئوستومی در ICU، اتاق‌های عمل و بخش‌های اورژانس
بررسی علل کاهش پذیرش دست شستن وضدعفونی دست توسط پرسنل پرستاری.
بررسی میزان اجرای ساکشن استریل در بخش مراقبت های ویژه.
بررسی موانع بکارگیری راهنمای بالینی پیشگیری از بیماری ها از دیدگاه پرستاران.

23215601112520فهرست منابع
00فهرست منابع
فهرست منابع منابع1- مارینو پ. کتاب کامل ICU.مترجم: پوران سامی.چاپ چهارم، تهران،انتشارات بشری، 1390،ص 429-421.
2-چولای م. ‌برنز س. ضروریات پرستاری مراقبت های ویژه. مترجم: شوریده آتش زاده، چاپ اول، تهران،انتشارات جامعه‌نگر ،1390.ص 269-267.
3- Pobo A, García-Esquirol O, Mariscal D, Real J, Vallés J, Fernández R. Excess ICU mortality attributable to ventilator-associated pneumonia: the role of early vs late onset. Intensive Care Med 2008;33(8):1363–1368.
4- Mcnabb B, Isakow W. probiotics for the prevention of nosocomial pneumonia:current evidence and opinions. Curr Opin Pulm Med 2008; 14:168-175.
5- سلیمی ص.ارزیابی اثر استاندارد سازی مراقبتهای پرستاری بر میزان عفونت‌های بیمارستانی در بخش MICU. مجله پزشکی ارومیه 1387; 4 (19):ص 310
6- Jacobi C, Schulz C, Mal Fertheiner P, Treating critically ill patients with probiotics Beneficial or dangerous?. Gut pathogens 2011,3:2 oi:10.1186/1757-4749-3-2
7-Restrepo M, Anzueto A, Arrogliga A. Economic burden of
ventilator-associated pneumonia based on total resource utilization. Infect Control Hosp Epidemiol 2010;31: 509–515.
8-Sedwick M , Smith M, Sara J, Nardi J. Using Evidence-Based Practice to Prevent Ventilator-Associated Pneumonia. Crit Care Nurse 2012;32:441-51
9- Meherali S, Parpio Y, Tazeen S. nurses, knowledge evidence based Guidelines for the prevention of ventilator associated pneumonia in critical care areas:a pre and post design. J Ayub Med Coll Abbottabad 2011;23(1): 146-149
10- Renata DE, Martin P .Cuff pressure control in intensive care unit: training effects. Rev. bras. ter 2010;22(2):192-195
11- خراسانی پ ، سعیدالذاکرین م. روش تدریس فعال و اثربخش با نقشه مفهومی .نشریه سبز 1388;شماره 10
12-Buczk. Ventilator-associated pneumonia among elderly Medicare beneficiaries in long-term care hospitals. Health Care Financ Rev 2009;31(1):1–10.
13-افخم زاده ع،لاهور پور ف،دل پیشه ع. بررسی میزان بروز پنومونی وابسته به ونتیلاتور و الگوی مقاومت باکتریایی آن در بخش مراقبت های ویژه بزرگسالان بیمارستان بعثت سنندج. مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی کردستان1390 ;دوره شانزدهم:ص 26-20
14- نادی ا،نکویی ب، مبین ا. بررسی علل پنومونی های بیمارستانی در بخش های مراقبت ویژه بیمارستانهای آموزشی دانشگاه علوم پزشکی همدان. مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی همدان 1390; دوره هجدهم، شماره 59 :ص 16-11.
15-Torpy JM , Lynm C , Glass RM Ventilator-associated pneumonia . JAMA 2008;300 (7):864.
16- SARI working group. Guidelines for the prevention of ventilator associated pneumonia in adults in Ireland [internet]. 2011 February [cited 2013 ,6,13]. Availabel from: http: //www.hpsc.ie
17-نیک روان مفرد م،شیری ح.اصول مراقبت های ویژه در ICU ، CCU ودیالیز،چاپ سوم،تهران ،انتشارات نور دانش،1387،ص 280-259
18-WHO Guidelines on Hand Hygiene in Health Care:First Global Patient Safety,Challenge Clean Care is Safer Care.World Health Organization &World Alliance for Patient Safety[internet]. 2009 February [cited 2014 .1.2]. Availabel from:www.cdc.gov/handhygiene .
19-Metheny N, Clouse R, Chang U, Stewart B, Tracheobronchial aspiration of gastric contents in critically ill tube-fed patients: frequency, outcomes, and risks. Crit Care Med 2006;34(4):1007–101
20-Chan E, Ruest A, Meade MO, Cook DJ. Oral decontamination for prevention of pneumonia in mechanically ventilated adults: sys--atic review and meta-analysis. BMJ 2007;334:889.
21-Trick WE, Vernon MO, Welbel SF, Demarais P, Hayden MK, Weinstein RA. Multicenter intervention program to increase adherence to hand hygiene recommendations and glove use and to reduce the incidence of antimicrobial resistance. Infect Control Hosp Epidemiol 2007;28(1):42–49.
22-Resar R, Pronovost P, Ha--en C, Simmonds T, Rainey T, Nolan T. Using a bundle approach to improve ventilator care process and reduce ventilator-associated pneumonia. Jt Comm J Qual Patient Saf 2005;31(5):243–248.
23-Cason C, Tyner T, Sunder S, Broome L. Nurses’ implementation of guidelines for ventilator-associated pneumonia from the Centers for Disease Control and Prevention. Am J Crit Care 2007;16(1):28–36
24-حسن پور دهکردی ع، خیری س، شهرانی م. بررسی تأثیر آموزش به روش یادگیری بر اساس حل مشکل و سخنرانی بر یادگیری، نگرش و عملکرد دانشجویان کارشناسی پرستاری. مجله دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد1385; 8 (3): 82-76
25- Kandeel N , Tantawy N. Current Nursing Practice for Prevention of Ventilator Associated Pneumonia in ICUs. Life science journal 2012 ;9(3):966-75
26- Carolyn L, Tyner T, Saunders S, Broom L. Nurses' Implementation of Guidelines for Ventilator-Associated Pneumonia From the Centers for Disease Control and Prevention. American Journal of Critical Care 2007 ;16: 28-37

2264410-360680ضمائم
00ضمائم

ضمائمضمیمه الف
فرم مشاهده عملکرد
شماره
مشاهده شونده دست‌ها(ضدعفونی-شستن دستها پوشیدن دست‌کش معاینه–هیچکاری نکردن –) ساکشن انجام نشده (بلی –خیر) میزان فشار کاف (سانتی متر اب) وضعیت مناسب سر تخت (بلی –خیر) فیلتر ضد باکتری(تاریخ نگذشته-تاریخ گذشته-بدون تاریخ) آماده بودن مایع ضدعفونی (بلی-خیر)
1-
2-
3- 1-
2-
3- 1-
2-
3- 1-
2-
3- ضمیمه ب.
فرم خودگزارش‌دهی
بسم ا.. الرحمن الرحیم
پرسش‌نامه‌ی خودگزارش‌دهی پرستار در پیش‌گیری از پنومونی وابسته به ونتیلاتور(VAP)
همکار گرامی این پرسش‌نامه بدون نام پرستار بوده واز چندین ICU مختلف جهت انجام یک پژوهش گردآوری می گردد، وپاسخ شما به‌عنوان شخص خاص یا حتی ICU خاصی مطرح نمی گردد، لذا خواهشمندیم عملکرد خود را بدقت وبدون هیچ نگرانی گزارش فرمایید. باتشکر
سابقه کار شما در ICU : سال ماه
تحصیلات:
الف: کارشناسی ارشد ب: کارشناسی د: کمتر از کارشناسی
سوالات عمومی در ارتباط با روتین بخش:
1 - ایا یک پروتوکل نوشته شده(مدون) دربخش ICU شما در مورد پیش‌گیری از VAP وجود دارد؟
الف: بلی ب: خیر
2- ایا یک پروتوکل نوشته شده(مدون) دربخش ICU شما در مورد مراقبت های بهداشتی دهان وجود دارد؟
الف: بلی ب: خیر
3- دفعات مسواک کردن دهان بیمار در بخش شما در 24 ساعت چند بار است ؟
الف: 4 بار ب: 3 بار ج: 2 بار د: 1 بار
4- دفعات دهان شویه بیمار با کلرو هگزیدین در بخش شما در 24 ساعت چند بار است ؟
الف: 4 بار ب: 3 بار ج: 2 بار د: 1 بار
5- نوع مرطوب‌کننده راه‌های هوایی که در بخش شما استفاده می‌شود کدام است ؟

—d1738

فهرست اشکال
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست اشکال,1" شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان PAGEREF _Toc142952501 h 4شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای PAGEREF _Toc142952502 h 8شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis L PAGEREF _Toc142952503 h 15شکل 1-4- گیاه گلپر PAGEREF _Toc142952504 h 19شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifolia PAGEREF _Toc142952505 h 22شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium polium PAGEREF _Toc142952506 h 24شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare L PAGEREF _Toc142952507 h 25

فهرست جداول
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست جداول;1" جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalis PAGEREF _Toc369168412 h 17جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A) PAGEREF _Toc369168413 h 34جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C) PAGEREF _Toc369168414 h 35جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B) PAGEREF _Toc369168415 h 35جدول 2-4- محلول ریزازورین PAGEREF _Toc369168416 h 35جدول 2-5- محلول احیاء کننده PAGEREF _Toc369168417 h 35جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc369168418 h 36جدول 2-7 PAGEREF _Toc369168419 h 45جدول 2-8 PAGEREF _Toc369168420 h 45جدول 2-9 PAGEREF _Toc369168421 h 45جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه PAGEREF _Toc369168422 h 46جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S) PAGEREF _Toc369168423 h 47جدول 3-1 گاز حاصل از تخمیر جیره و عصاره‌های گیاهان دارویی پس از 96 ساعت انکوباسیون PAGEREF _Toc369168424 h 51جدول 3-2- اثر سطوح مختلف پنج عصاره بر فراسنجه‌های تولید گاز PAGEREF _Toc369168425 h 52جدول 3-3- تعداد کل باکتری‌ها در هر میلی لیتر مایع شکمبه بعد از تاثیر عصاره‌ها PAGEREF _Toc369168426 h 56
فصل اولمقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1- مقدمهدر بین حیوانات اهلی گیاهخوار، نشخوارکنندگان سهم بزرگی را در تامین خوراک و سلامت بشر دارند. از طرفی تغذیه نقش اصلی را در بازده اقتصادی و عملکردی این دام‌ها داشته به طوری که تقریبا دوسوم از کل هزینه تولیدات دامی در واحدهای مختلف پرورش دام به هزینه‌های خوراک اختصاص داشته و از طرفی با توجه به مسئله کمبود پروتئین حیوانی و افزایش تولید با منابع علوفه‌ای موجود، لازم است تا از ارزش تغذیه‌ای منابع خوراکی قابل دسترس و مکمل‌های قابل استفاده به منظور افزایش راندمان تولید اطلاع کافی وجود داشته باشد (امیرخانی، 1386). از این رو اهمیت تغذیه مناسب نشخوارکنندگان ایجاب می‌نماید که ارزش غذایی هر یک از مواد خوراکی و اجزای تشکیل دهنده آنها طبق روش‌های صحیح و استاندارد تعیین گردد (قورچی، 1374).
معده حیوانات نشخوارکننده از چهار بخش شکمبه، نگاری، هزارلا و شیردان تشکیل گردیده است (آلاوونگ و همکاران، 2010). سه بخش اول فاقد هر گونه غده بوده و پیش معده نامیده شده و دو بخش آخر جایی است که هضم میکروبی یا تخمیر در آن صورت می‌پذیرد (منصوری و همکاران، 1381). شکمبه دارای انواع باکتری، پروتوزوآ و قارچ است اما باکتری در تمام جنبه‌های تخمیر شکمبه‌ای نقش غالب را بازی می‌کند (راسل و همکاران، 2002).
حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)
0/1
0/1 Glucose (W/V)
0/1 Cellobiose(W/V)
0/1 Maltose (w/V)
0/1 Xylose (W/V)
0/75 (V/V) %3 Cellolose Suspension
0/1 (W/V) % 1/0 Hemin Solution
0/2 Trypticase (W/V)
0/05 Yeast Extract (W/V)
0/45 VFA Mixture (V/V)
1/67 (V/V) %3 Cystein-HCL-Water
3/33 (V/V) %12 Sodium Carbonate Solution

user8300

3-2- مواد 26
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی 26
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL 26
3-2-2-1- سوش باکتری 26
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون 26
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی 26
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز 26
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE 27
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز 27
3-2-4- نرم افزارها 27
3-3- روشها 28
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی 28
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید 28
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات 28
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب 29
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli 29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli 29
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی 29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد 30
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری 31
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا 32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL 32
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL 33
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی 33
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی 33
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین 34
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد 34
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 34
عنوان صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) 35
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفور 35
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز 36
3-3-6- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات 38
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی 39
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا 39
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف 39
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 40
فصل چهارم: نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب 42
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL 43
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا 43
4-2- تخلیص آنزیم لیپاز TTL 44
4-2-1- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی 44
4-2-2- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز 45
4-3- سنتز مایعات یونی 47
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 47
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 48
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی 48
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی 49
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف 49
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی 51
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم 51
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی 54
فصل پنجم: بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL 57
عنوان صفحه
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL 59
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی 61
فصل ششم: نتیجهگیری و پیشنهادات
6-1- نتیجهگیری 63
6-2- پیشنهادات 63
فهرست منابع 65
چکیده انگلیسی 75
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز 4
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونی 19
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani 29
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSB 30
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCM 31
جدول 3-4- نحوه تهیه محلول برادفورد 34
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X 37
جدول 3-6- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید 37
جدول 3-7- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم 38
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون 44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخلیص TTL. 46
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه 58
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) 6
شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز 9
شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب 12
شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز 18
شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید 28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL 42
شکل 4-2- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی 45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL 46
شکل 4-4- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL 47
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی 48
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 49
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 50
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون 52
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL 53
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85 54
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 55
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] 55
فصل اول
مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که میتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده زمین لیپیدها هستند و آنزیمهای لیپولیتیک نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیمهای لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلولهای یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیمها مزایای زیادی در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها میتوان اختصاصیت بالای آنها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینهها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیمها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم درBOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).
آنزیمهای میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیمهای میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دستورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن میباشد)، پایداری بیشتر و تولید آسانتر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتریها و بنابراین آسانتر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آنها، باعث تسهیل فرآیندهایی همچون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دستیابی به بیشترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلولها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی میشوند. تنها حدود دو درصد از گونههای میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شدهاند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).
1-2- لیپازها
لیپازها اولین بار در سال 1901 در باکتریهای Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهای امروزی Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسایی شدند (Eijkman et al., 1901). باکتریهای گفته شده هماکنون بیشترین مطالعات لیپازی را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روی آنزیمهای هیدرولیز کننده تریگلیسریدها میگذرد و حدود 70 سال است که توانایی لیپازها در کاتالیز واکنشهای هیدرولیز و سنتز استرها تشخیص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولین آنزیم لیپاز را (آنزیم تجزیه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شیره پانکراس کشف کرد. انسانها در قدیم لیپاز را از پانکراس حیوانات به صورت خالص یا به صورت مخلوط با سایر آنزیمهای پانکراس میگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مینمودند. به دلیل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوری آنزیم از آن، دانشمندان به سراغ لیپازهای میکروبی رفتند. لیپازها از نظر نوع منشأ ( باکتری، قارچ یا پستاندار و غیره) و از نظر خصوصیات متفاوت هستند. این آنزیمها دارای توانایی کاتالیز واکنشهای مختلفی از جمله واکنشهای هیدرولیزی، یا سنتز کربوکسیلیکاسترهای مختلف و تبدیل آنها به اسیدهای آلی و گلیسرول هستند. همه لیپازها اختصاصیت بسیار بالایی برای سوبستراهای گلیسریدی دارند.
آنزیمهای لیپولایتیک به دلیل کاربرد فراوانی که در بیوتکنولوژی دارند ( به عنوان مهمترین گروه بیوکاتالیزورها در بیوتکنولوژی)، بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). تولید انبوه لیپازهای میکروبی نیازمند بیان شدید و کارآ از ژنهای مربوطه و فهم دقیق مکانیسم ملکولی نحوه پیچش پروتئین و ترشح آن میباشد. از جمله کاربردهای جدید لیپازها در بیوتکنولوژی میتوان استفاده از این آنزیم در سنتز بیوپلیمر، بیودیزل، داروهای خالص انانتیومری، مواد شیمیایی مورد استفاده در کشاورزی ( مانند انواع آفت کش)، ترکیبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسیاری از مواد شیمیایی مهم صنعتی، به دست آمده از روغنها و چربیها طی فرآیندهای شیمیایی را میتوان به کمک لیپازها با سرعت بیشتر، اختصاصیت بهتر و در شرایط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزینی بالای لیپازها و اختصاصیت بالای شیمیایی و انانتیومری آنها توجه بسیاری از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
لیپازهای گرفته شده از منابع مختلف باکتری، قارچ، گیاه و حیوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصیت به موقعیت پیوند، اختصاصیت به اسیدچرب، پایداری دمایی و pH بهینه و غیره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههای متعددی از باکتریها، مخمرها و قارچهای رشتهای توانایی تولید لیپاز دارند (جدول1) سویه های نزدیک به هم (از نظر تاکسونومی) ممکن است انواع مختلفی از لیپاز ها را تولید کنند (Sharma et al., 2001).
جدول 1-1- میکروارگانیسمهای تولید کننده لیپاز
منشأ جنس گونه
باکتری Bacillus B. megaterium
B. subtilis
B. thermoleovorans
B. thermocatenulatus
B. cereus
Pseudomonas P. putida 3SK
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. fragi
Staphylococcus S. canosus
S. hyicus
S. haemolyticus
S. aureus
S. warneri
S. xylosus
قارچ Penicillium P. cyclopium
P. simplicissimum
Aspergillus A. niger
A. oryzae
Rhizopus Rhizop. delemar
Rhizop. oryzae
Rhizop. arrhizus
Rhizop. nigricans
Rhizop. nodosus
مخمر Candida C. rugosa
C. tropicalis
C. antarctica
لیپازها را میتوان براساس اختصاصیت به سه گروه تقسیم کرد (Mukherjee et al., 1994). لیپازهای غیر اختصاصی ملکولهای آسیل گلیسرول را در موقعیتهای تصادفی میشکنند و اسیدچرب آزاد و گلیسرول و منوآسیل گلیسرول و دیآسیلگلیسرول را به عنوان حدواسطهای واکنش ایجاد میکنند. محصولات این واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتالیزورهای شیمیایی است. در واکنش آنزیمی محصول در اثر دما کمتر تجزیه میشود و این به دلیل پایینتر بودن دمای واکنش در کاتالیز زیستی است. لیپازهای اختصاصی به موقعیتهای 1و3، آزادسازی اسیدچرب از موقعیتهای 1و3 اسکلت گلیسرولی را کاتالیز میکنند. لیپازهای دارای اسیدچرب اختصاصی، تنها یک اسیدچرب خاص از ملکول آسیل گلیسرول آزاد میکنند (Macrae et al., 1983). لیپازها همچنین تفکیک انانتیومری ترکیبات کایرال و واکنشهای استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون، و اینتراستریفیکاسیون را کاتالیز میکنند. این تواناییهای متنوع کاتالیز، در شکست چربیها، اصلاح چربیها و روغنها، سنتز ترکیبات آلی، تأمین شویندهها و روشهای تجزیهای، کاربرد بسیاری پیدا کرده است (Macrae et al., 1985).
1-2-1- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن
این خصوصیت لیپازها که در سطح بین فضای آبدوست و آبگریز عمل میکنند، وجه تمایز لیپازها از استرازها میباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولی آنزیمهای لیپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون میباشد. این آنزیمها نیز شبیه سرینپروتئازها دارای مجموعه سه تایی کاتالیتیک باقیمانده نوکلئوفیل- باقیمانده هیستیدین- باقیمانده اسیدی هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرین- هیستیدین- آسپارتات یا به صورت مجموعه سه تایی سرین- هیستیدین- گلوتامات میباشد (Noble et al., 1993).
جایگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقیماندههای آبگریز احاطه میشود. یک ساختار مارپیچ پلیپپتیدی همانند یک درپوش مانع از قرارگیری جایگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال میشود. همچنین محافظت از آنزیم در برابر فعالیت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تایی کاتالیتیک پروتئاز ایجاد شود (B--y et al., 1990). سمتی از درپوش که روبروی جایگاه فعال است بیشتر از زنجیرههای جانبی آبگریز آلیفاتیک تشکیل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بیرون قرار گرفته است.
تغییر جهتگیری ساختار α- هلیکس درپوش همراه با افزایش آبگریزی سطوح نزدیک جایگاه فعال و روبروی آن، باعث پدیده "فعال شدن در فضای بینابینی" میشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزیم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهای آبگریز، اتصال زنجیرههای آلیفاتیک سوبسترا به سطح آبدوست آنزیم، به ویژه در حضور یک لایه آبپوشی، بسیار نامطلوب است. فضای بینابینی ایجاد شده در دهانه شیار فعال ممکن است به فراهم سازی یک لایه ناکامل آبپوشی در اطراف ملکول لیپاز و در نتیجه تسهیل پیچش زنجیرههای آلیفاتیک ملکول سوبسترا در سطح آنزیم کمک کند (Petersen et al., 1996). پایدارسازی بیشتر میتواند به کمک محدودههای الکتروستاتیک موضعی در سطح آنزیم و با ایجاد جاذبه دوقطبی به سمت پیوند C-H (با قطبیت ضعیف) زنجیرههای جانبی آلیفاتیک فراهم شود.

شکل 1-1- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL).
آمینواسیدهای اصلی جایگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.
1-3- آنزیمها در محیط آلی
کلیبانو با انجام تعدادی آزمایش ابتدایی و ساده نشان داد که میتوان از آنزیمها در حلالهای آلی آبگریز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنین محیطهایی سرعت واکنش به شدت پایین میآید (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسیاری از لیپازها و همچنین برخی از پروتئازها و آسیلازها بسیار پایدار هستند، به طوری که حتی در حلالهای آلی بدونآب نیز فعالیت خود را حفظ میکنند. این خصوصیت اساس استفاده موفقیتآمیز از این آنزیمهای هیدرولاز در واکنشهای غیرهیدرولازی است. از جمله این واکنشهای غیرهیدرولازی میتوان آسیلاسیون الکلها و آمینها با اختصاصیت انانتیومری را نام برد که در صنعت کاربرد زیادی دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محیط آلی، که شامل مایعات یونی نیز میشود، با فعالیت آنزیم غالبا از جنبه حذف آب ضروری آنزیم مورد بررسی قرار میگیرد. بسیاری از آنزیمها برای فعال بودن به یک پوشش آبی کامل نیاز دارند، اما تعداد زیادی استثناء نیز وجود دارد مانند لیپاز B کاندیدا آنتراکتیکا (CALB) که فعالیت خود را حتی پس از خشک شدن با پنتوکسید فسفر حفظ میکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتیسیلین که برای فعال ماندن تنها نیاز به تعداد اندکی ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزیم دارد (Dolman et al., 1997). بررسی منابع علمی نشان میدهد که بیان نیاز آنزیم به آب در قالب فعالیت آبی (aW ) مرسومتر از بیان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهای غیرهیدرولازی با آنزیمهای لیپاز یا پروتئاز ممکن است باعث حفظ یا افزایش فعالیت آنزیمی شود. هرچند چنین محیطهایی همیشه باعث افزایش واکنشهای جانبی هیدرولازی میشوند. همچنین اسید حاصل از این واکنشها ممکن است باعث کاهش pH و از دست رفتن فعالیت آنزیمی شود.
حلالهایی که به خوبی توسط این آنزیمها تحمل میشوند – هیدروکربنهای آروماتیک و آلیفاتیک، اترها، و الکلها (بجز متانول)- فقط به صورت ضعیفی با آنزیم برهمکنش میدهند و میتوان حدس زد که این حلالها کم و بیش فقط برای آنزیم یک فضای خالی ایجاد میکنند. تنها الکلها که تشکیل دهنده پیوند هیدروژنی هستند میتوانند لیپازها را غیرفعال کنند. حلالهایی که برهمکنش بسیار قوی با پروتئینها میدهند، مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) و دی متیل فرمآمید (DMF) نیز باعث غیرفعال شدن برگشتناپذیر آنزیمها میشوند. بنابراین آنزیمها برهمکنشهای قوی با هیچ مادهای به جز آب را نمیتوانند تحمل کنند (Van Rantwijk, 2007).
نامشخص بودن pH در محیط بدون آب یک عامل پیچیده در آنزیمشناسی است. آنزیم توزیع بار الکتریکی (pH ظاهری) را مطابق با آخرین محلول آبی، مثلا بافر لیوفیلیز، حفظ میکند (Zaks and Klibanov 1985). البته pH بهینه ظاهری تحت تأثیر نوع حلال و aW تغییر میکند (Yang et al., 1993). چنین اثرات مشابهی در محیط مایعات یونی نیز قابل انتظار است.
در حقیقت بیشترین اطلاعات درباره رفتار آنزیم در محیط غیرآبی، حاصل از مطالعات آنزیمها در حلالهای آلی است. اما حلال های آلی برای طبیعت زیان آور هستند بنابراین در سالهای اخیر تلاش زیادی در جهت یافتن جایگزین پاکتری برای محیطهای واکنش انجام شده است.از جمله محلولهای دوستدار محیط زیست مایعات یونی را میتوان نام برد که میتوانند جایگزین حلالهای آلی شوند.
علاقه عمومی برای افزایش سرعت واکنشهای آنزیمی در حلالهای آلی نیز عامل پیشبرنده دیگر به سمت مایعات یونی بوده است. یکی از دلایل کاهش فعالیت آنزیمی در حلالآلی (در مقایسه با محیط آبی) پایدارسازی مواد واکنش دهنده در حلال است (Klibanov et al., 1997). این اثر که در واقع همان افزایش حلالیت (افزایش Km) است، با به کارگیری غلظتهای بالاتری از ماده واکنشدهنده قابل جبران است (Halling et al., 2004). بقیه کاهش فعالیت، در حد 1 تا 2 برابر، مربوط به اثر مجموعهای از عوامل شامل ناپایدار شدن حالت گذار واکنش (Clark et al., 2004)، تغییرات کنفورماسیون و از دست دادن انعطافپذیری میباشد (Halling et al., 2004, Clark et al., 2004 ). ثابت دیالکتریک پایین محیطهای آلی معمولی باعث افزایش انرژی حالت گذار شدیدا قطبیده در مقایسه با آب میشود و بنابراین ناپایدار شدن حالت گذار را در پی خواهد داشت (Clark et al., 2004).
1-4- مایعات یونی
از میان مایعات مختلفی که میتوان بهعنوان حلال به کار برد تنها تعداد اندکی به طور عمومی مورد استفاده قرار میگیرند. با معرفی تکنولوژیهای سبز یک نگرانی اصلی، ایجاد جایگزینهای مناسب برای حلالهای مخرب است که در صدر جدول مواد شیمیایی زیانآور هستند. زیرا این حلالها در مقادیر بالا استفاده میشوند و به طور معمول مایعات فراری هستند. نمکهای مرکب مایعاتی هستند که فقط یون دارند (مایعات یونی). در صورت انتخاب مواد اولیه مناسب میتوان مایعات یونی ساخت که در دمای اتاق و در دمای پایینتر از دمای اتاق مایع هستند. مایعات یونی مواد جدیدی نیستند. بسیاری از آنها سالهای زیادی است که شناخته شدهاند. برای مثال میتوان [EtNH3][NO3] را نام برد که دمای ذوب 12 درجه سانتیگراد دارد و در سال 1914 معرفی شد. از همان زمان پیشنهاد شد که از مایعات یونی در سنتز شیمیایی به جای حلال استفاده شود. البته تنها در سالهای اخیر تعداد زیادی مقالات در این زمینه به چاپ رسیده است. برخی خصوصیات فیزیکی ساده مایعات یونی که آنها را به عنوان حلالهای بالقوه برای سنتز جالب توجه کرده است توسط ولتون بیان گردیده است (Welton et al., 1999):حلالهای خوبی برای طیف وسیعی از مواد آلی و غیر آلی هستند.
معمولا شامل یونهای نامتناسبی هستند که امکان قطبیت بالا در آنها را ایجاد میکند.
طبق مقیاس قطبیت نرمال شده که در آن تترامتیل سیلان صفر و آب 0/1 در نظر گرفته شده، قطبیت مایعات یونی مرسوم، به طور معمول در محدوده 6/0-7/0 قرار میگیرد ( مانند فرمامید و الکلهای محلول در آب )
(van Rantwijk et al., 2003). همچنین کاهش طول زنجیره آلکیلی متصل به حلقه ایمیدازولیوم و اندازه آنیون در مایعات یونی دارای کاتیون ایمیدازولیومی، با افزایش قطبیت مایع یونی در ارتباط است (Carmichael and Seddon, 2000). مقدار قطبیت مایع یونی گاهی به دما و حضور آب حساس است (Baker et al., 2002). مایعات یونی به دلیل قطبیت بالایی که دارند محیط خوبی برای واکنشهای شیمیایی و بیوشیمیایی ایجاد میکنند. زیرا میتوانند سوبستراهای مختلفی شامل ترکیبات آلی قطبی و غیرقطبی و ترکیبات آلی و غیر آلی و پلیمری را در خود حل کنند.
با تعدادی از حلالهای آلی غیر قابل امتزاج هستند و بنابراین یک جایگزین قطبی غیرآبی برای سیستمهای دو فازی میباشند. همچنین مایعات یونی آبگریز را میتوان به عنوان فاز قطبی غیر قابل امتزاج همراه با آب استفاده کرد (Welton et al., 1999).
مایعات یونی فرار نیستند و این به دلیل یونی بودن ماهیت آنها است که فشار بخار ناچیزی دارند. بنابراین میتوان از آنها بدون ایجاد آلودگی در سیستمهایی با مکش قوی استفاده کرد (Welton et al., 1999).
بنابراین مایعات یونی دارای پایداری دمایی بوده و فاقد فشار بخار میباشند (Gordon et al., 2001, Brennecke et al., 2001). به علاوه داری خصوصیات استثنائی به عنوان حلال هستند و میتوانند هر ماده شیمیایی را در خود حل کنند. با جایگزین کردن کاتیون، آنیون و اجزای متصل به آنها، میتوان خصوصیات این حلالها را تغییر داد و به این صورت مایع یونی مناسب برای واکنش خاصی را ایجاد نمود (Brennecke and Maginn, 2001) (شکل 1-3). گرچه هنوز مشخص نیست که مایع یونی چگونه خصوصیات کاتالایتیک آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهد، آنزیمها در مایعات یونی مانند [C4MIM][PF6] فعال و به شدت پایدار هستند (Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000, Laszlo et al., 2001).

شکل 1-2- آنیونها و کاتیونهای مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز.
1-5- بیوکاتالیز در مایعات یونی
دلیل تمایل به انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی در واقع میل به جایگزین کردن مایعات یونی غیرفرار به جای حلالهای آلی فرار بوده است. هرچند این واکنشها در محیط طبیعی آنزیم یعنی محیط آبی قابل انجام است اما حلالهای آلی به طور وسیعی همراه با آنزیمها مورد استفاده قرار گرفتهاند تا از این طریق میزان حلالیت واکنشگرهای آبگریز را بیشتر کرده و تعادل واکنش را از سمت هیدرولیز به سمت سنتز تغییر جهت دهند. همچنین خصوصیات غیرمرسوم مایعات یونی به عنوان حلال، باعث گسترش روشهای متعدد جدید و بسیار کارآ شده است (Van Rantwijk et al., 2007).1-5-1- آنزیمها در مخلوطهای مایع یونی- آب
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. سری هافمیستر نوعی دستهبندی یونها است که به ترتیب توانایی آنها در حل کردن و رسوبدهی پروتئینها ایجاد شده است.
اخیرا در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. مایعات یونی را به خوبی میتوان براساس موقعیت قرارگیری یونها، در سری هافمیستر به گونهای مرتب نمود که ترتیبی از پایدارکنندهترین تا ناپایدارکنندهترین (کاسموتروپ تا کائوتروپ) ایجاد شود.
نمک های سری هافمیستر با ویژگی های کاسموتروپیک و کائوتروپیک یونها مرتبط هستند. یونهایی که به شدت آب پوشی میشوند به کاسموتروپ ها معروفند و آن دسته از یون هایی که به صورت ضعیف هیدراته می شوند، کائوتروپ خوانده می شوند (Lo Nostro et al., 2005). یونهای حاصل از نمکهای سری هافمیستر به دو گروه تقسیم می شوند: Salting- out و Salting- in (Kunz et al., 2004). یون های out-Salting (آنیون های کاسموتروپ مثل فسفات، سولفات وکاتیون های کائوتروپیک مثل کاتیون های آمونیوم) پروتئین ها را پایدارکرده و نیز باعث رسوب آنها می شوند. در مقابل یون های Salting- in (آنیونهای کائوتروپ مثل آنیون های پرکلرات، برماید و کاتیونهای کاسموتروپ مثل کاتیون لیتیم) پروتئین ها را ناپایدار میکنند (Kunz et al., 2004). درغلظت های پایین نمک (تا سقف 01/0 مولار) یون ها غالبا از طریق برهمکنش های الکترواستاتیک روی آنزیم ها تاثیر می گذارند. هنگامی که در غلظت های زیاد نمک نیروهای انتشار یا پراکندگی یونی بر پتانسیل الکترواستاتیک پیروز میشوند، اثر یونهای هافمیستری اهمیت پیدا میکنند (Lo Nostro et al., 2005).
بسیاری از آنزیمها به خوبی در طیف وسیعی از مایعات یونی در محیط آبی عمل میکنند. به سختی میتوان مایع یونی پیدا کرد که به هیچ عنوان با هیچ آنزیمی سازگاری نداشته باشد. در رابطه با پیشبینی سازگاری آنزیم و مایعات یونی آبی به نظر میرسد که کائوتروپی و کاسموتروپی نمیتوانند به عنوان تنها عوامل پیشبینی کننده استفاده شوند. همچنین بعید به نظر میرسد که بتوان سازگاری آنزیم با مایعات یونی را با در نظر گرفتن تعداد محدودی پارامتر همچون قطبیت یا logP تفسیر نمود. این موضوع در مورد حلالهای ملکولی محلول در آب نیز صدق میکند (Van Rantwijk et al., 2007).
اساس پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی آبی را میتوان این گونه بیان کرد که پروتئین زمانی پایداری خود را از دست میدهد که یونها یا ملکول های حلال اطراف آن با فرم بازشده آنزیم برهمکنش قویتری نسبت به فرم طبیعی آنزیم داشته باشند (Baldwin et al.,1996). چنین برهمکنشهای ناپایدارکنندهای میتوانند حاصل از "Salting in" یونهای دوگانه دوست روی گروههای آبگریز فرو رفته درون ساختار پروتئین یا حاصل از برهمکنشهای قوی آنها با پیوندهای پپتیدی باشد (Kaar et al., 2003, Lou et al., 2006). از جمله مباحث مهمتری که باید به خصوص در مورد آنزیمهای حساس مد نظر قرار داد میتوان تغییرات pH ایجاد شده توسط یونهای اسیدی یا قلیایی برونشتد و فعالیت آبی ترمودینامیکی را نام برد.
1-5-2- فعالیت آنزیمها در شرایط نسبتا بیآب در مایعات یونی
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001) و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای MeSO4- (Schofer et al., 2001)، NO3- (Kaar et al., 2003)، AcO-یا lactate- (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است (شکل 1-4). آب نیز چنین عملکردی دارد؛ اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
به نظر میرسد که مایعات یونی بدون آب با روشی مشابه حلالهای آلی مرسوم، آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهند؛ زیرا بسیاری از آنها به خوبی تحمل میشوند اما برخی از آنها نیز سازگاری بسیار کمی دارند که البته این موضوع به نوع آنزیم نیز بسیار وابسته است. برای مثال مایعات یونی حاوی یونهای AcO- و NO3- که به صورت مخلوطهای آبی سازگاری بسیار خوبی دارند، در حالت بدون آب آنزیم بسیار مقاوم CALB را غیر فعال میکنند. بر اساس اطلاعات فعلی، مایعات یونی با آنیونهای BF4- و PF6-، و آنیون مقاوم به هیدرولیز NTf2- و آنیونهای زنجیر متوسط آلکیل سولفات به همراه کاتیونهای دیآلکیلایمیدازولیوم و آلکیلپیریدینیوم گزینههای ایمنتری به نظر میرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون یک اساس نظری برای پیشبینی سازگاری آنزیمها و مایعات یونی بیآب ایجاد نشده است. هرچند تعدادی از عوامل سهیم احتمالی مانند قابلیت کاتیون برای ایجاد پیوند هیدروژنی (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکیل نانوساختارهای متصل به هیدروژن، و گرانروی حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر میرسد که میزان هسته دوستی آنیون (Kaar et al., 2003) یا قابلیت پذیرش پیوند هیدروژنی توسط آن (Sheldon et al., 2002) نیز، حداقل در حالتی که میل کاتیون برای تشکیل پیوند هیدروژنی کم است، میتواند یکی از عوامل کنترل کننده باشد. در این مورد یک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنیون H2PO4- است که بدون دناتوره کردن میتواند Cyt C را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء دیگر [HOPMIM][glycolate] است که با داشتن کاتیون و آنیونی با قابلیت بالا در ایجاد پیوند هیدروژنی، آنزیمهای احیاکننده را در فرم فعال در خود حل میکند (Walker and Bruce, 2004).

شکل 1-3- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب. الف) شکل شماتیک از نحوه برهمکنش مایع یونی با بخشهای باردار و غیرقطبی آنزیم، ب) ساختار شبیه سازی شده آنزیم CALB در محیط مایع یونی DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقی از سطح آنزیم را نشان میدهد که زنجیرههای آلیفاتیک حضور دارند و رنگ نارنجی نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزیم هستند (Klahn et al., 2011).
1-5-3- پایداری آنزیمها در مایعات یونی تقریبا بیآب
پایداری (دمایی) آنزیمها (فعالیت در طی زمان) معمولا در محیطهای آلی به خصوص با فعالیت آبی کم، نسبت به محیطهای آبی، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مایعات یونی نیز میتوانند چنین اثری داشته باشند. پایداری آنزیمی تعریف واضحی ندارد و روشهای متنوعی برای سنجش آن وجود دارد. برای بررسی پایداری در ذخیره سازی، آنزیم در مایع یونی در یک دمای خاص انکوبه شده و میزان فعالیت باقیمانده در نمونهها که با آب رقیق شدهاند بررسی میشود. بازیابی فعالیت بالایی از آنزیم در چنین روشی نشان دهنده این است که تغییرات ایجاد شده در ساختار آنزیم در این چنین محیط ذخیرهسازی برگشت پذیر است. پایداری آنزیم را میتوان با انکوبه کردن آنزیم در مایع یونی در بازههای زمانی مختلف و سنجش فعالیت در همان محیط بررسی نمود. همچنین میتوان ساختار آنزیم را با روشهای اسپکتروسکوپی در محیط مورد نظر بررسی نمود. برای مثال دمای بازشدن ساختار پروتئین شیرین مونولین از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزایش یافت (Baker et al., 2004). نوع دیگر پایداری که میتوان مورد بررسی قرار داد پایداری در شرایط واکنش است.
بهطور کلی آنزیمها در مایعات یونی فعالیت و ساختار خود را در مدت زمان طولانیتر و در دماهای بالاتری نسبت به حلالهای آلی ملکولی حفظ میکنند. دلیل احتمالی این امر گرانروی بالای مایعات یونی است که باعث کند شدن حرکت دمینهای پروتئین از موقعیت خود در فرم فعال پروتئین به موقعیتهای جدید ایجاد کننده فرم غیرفعال میشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
1-5-4- آنزیمها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت
پیوندهای هیدروژنی عامل پیوستگی ساختار آنزیمهای آبپوشی شده و بدون آب هستند. هر تغییر ساختاری مستلزم فروپاشی تعداد قابل توجهی از پیوندهای هیدروژنی به طور همزمان میباشد؛ این امر سهم قابل توجهی در پایداری آنزیم دارد و گویای اثرات حافظه آبپوشی و اثرات پسماند است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند این است که تعداد ملکولهای آب متصل به آنزیم تنها وابسته به میزان فعالیت آبی نیست، بلکه به حافظه آبپوشی نیز مربوط میباشد.
پژوهشهای مختلفی نشان داده اند حلالهایی که در شرایط آبی یا غیرآبی با آنزیم سازگارند، مانند استونیتریل یا ترت- بوتیل الکل، در غلظتهای پایین باعث غیرفعال شدن آنزیم میشوند (Griebenow et al., 1996). چنین نتایجی را میتوان در پژوهشهای انجام شده در مایعات یونی نیز مشاهده کرد. دلیل این امر کاهش اثر آبگریزی در حضور حلال است. در نتیجه پایداری آنزیم کاهش مییابد تا اینکه در یک غلظت مشخص آنزیم غیرفعال میشود.
پیوندهای هیدروژنی میتوانند توضیح مناسبی برای پایداری آنزیم در مایعات یونی بدون آب باشند. مایعات یونی، بهخصوص آنیون آنها که پیوندهای هیدروژنی قوی ایجاد میکنند، ممکن است باعث از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی شوند که عامل یکپارچگی ساختار α- هلیکسها و صفحات β بودهاند و بنابراین باعث باز شدن کل پروتئین یا بخشی از آن شوند. برای مثال یون لاکتات به راحتی میتواند با اسکلت پلیپپتیدی پیوند هیدروژنی برقرار کند. اندازه یون نیز میتواند مهم باشد زیرا یونهای با اندازه بزرگ برای ایجاد تعداد اندکی پیوند هیدروژنی بین خود و آنزیم، نیاز دارند که تعداد زیادی پیوند هیدروژنی را بشکنند، بنابراین نمیتوانند به سادگی پایداری آنزیم را مختل کنند. در آنزیمهایی که به صورت برگشتپذیر غیرفعال شدهاند احتمالا پیوندهای هیدروژنی توانستهاند کانفورماسیون را حفظ کنند و در ادامه برای بازیابی ساختار آنزیم لازم است این پیوندها فروپاشند و پیوندهای طبیعی دوباره ایجاد شوند. رقیق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مایع یونی دناتوره کننده، میتواند باعث تشکیل دوباره پیوندها شود احتمالا چنین ترکیباتی که پیوند هیدروژنی قوی تشکیل میدهند با تشکیل پیوندهای هیدروژنی ناپایدار، تشکیل دوباره پیوندها را تسهیل میکنند.
1-5-5- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپازها و استرازها
کاربرد لیپازها در بیوترانسفورماسیون شامل طیف وسیعی از واکنشهای سالوولایتیک( نوعی از واکنشهای جانشینی هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفیل عمل کرده و جانشین یک اتم یا گروه در ملکول سوبسترا میشود) مربوط به گروه کربوکسیل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله این واکنشها میتوان استریفیکاسیون، ترانساستریفیکاسیون (الکلولیز)، پرهیدرولیز، و آمینولیز (سنتز آمید) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهای ترانساستریفیکاسیون و سنتز آمید ترجیحا در محیط بیآب و در حضور زئولیت فعال، جهت متوقف ساختن واکنشهای هیدرولازی ناخواسته، انجام میشود. در این واکنشها اغلب از آنزیمهایی همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده میشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتی چنین شرایطی را تحمل میکنند.
جهت دستیابی به بهینهترین حالت تشخیص انانتیومرها لازم است که محیط واکنش، مایع یونی یا محیطهای سنتی، با توجه به نوع ماده واکنش دهنده و نوع آنزیم بهینهسازی شود. در واقع نمیتوان یک مایع یونی را به عنوان بهترین گزینه برای انجام واکنشهای تفکیک مخلوطهای راسمیک نام برد، همانطور که یک حلال آلی را نمیتوان به طور کلی بهترین دانست. با ظهور مایعات یونی، گزینههای حلال انتخابی و بنابراین شانس یافتن محیط مناسب به میزان زیادی افزایش یافته است.
1-6- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس
ملکول پروتئین طی فرآیندهای غیرفعال شدن چند فاز مختلف را طی میکند. این پدیده نشاندهنده یک سری وقایع درون ملکولی در کنفورماسیونهای گذرای پروتئین است (De Diego et al., 2004). از روشهای مختلفی جهت بررسی ساختار پروتئین استفاده میشود که از آن جمله میتوان روشهای DSC ، NMR، CD، FTIR، اسپکتروفتومتری UV، کریستالوگرافی اشعه X و اسپکتروسکوپی فلورسانس را نام برد. فلورسانس یک روش در دسترس است که میتوان از آن جهت بررسی ساختار سوم پروتئین استفاده کرد.
در پروتئینهایی که دارای آمینواسیدهای فلوروفور هستند (مثل تریپتوفان، تیروزین یا فنیلآلانین) تغییر در IMax فلورسانس و شیفت قرمز در λMax فرآیند دناتوره شدن پروتئین را نشان میدهند و هر دوی این تغییرات به دلیل افزایش قطبیت باقیماندههای تریپتوفان پروتئین با قرارگیری آن در معرض حلال است. مکانیسم ملکولی پایدار شدن آنزیم در مایعات یونی (در بیوکاتالیز کاربردی) همچنان نامعلوم است و نیاز به بررسیهای بیشتر وجود دارد (De Diego et al., 2004).
پروتئینها پس از برانگیختگی در طول موج nm 280 (مربوط به همگی فلوروفورهای پروتئین) یا nm 295 (بیشتر مربوط به باقیماندههای تریپتوفان)، به طور معمول نور را بین طول موج nm 300 و nm 350 منتشر میکنند. شدت فلورسانس در واقع جمع نور منتشر شده توسط هر کدام از باقیماندههای فلوروفور پروتئین میباشد. باز شدن نسبی ساختار پروتئین باعث افزایش برهمکنش باقیماندههای آمینواسیدی پروتئین با حلال (به طور معمول آب) میشود. همچنین ممکن است حلقه اندولی تریپتوفان با دیگر آمینواسیدهای موجود در ساختار پروتئین وارد برهمکنش شود. هر دوی این پدیدهها سبب کاهش شدت فلورسانس و گاهی سبب ایجاد یک شیفت قرمز در پیک نشر فلورسانس (کاهش λMax) میشود که این پدیده را نشانهای از باز شدن پروتئین در محیط آبی میدانند (Bekhouche et al., 2011).
با ورود مایعات یونی به محیط پروتئینها به عنوان حلالهای جدید، مشکلاتی در بررسی ساختار توسط روشهای مختلف ایجاد میشود. از جمله این مشکلات تداخلهای ایجاد شده در طیفهای CD و فلورسانس را میتوان نام برد که در گزارشات مختلفی به آنها اشاره شده است (Shu et al., 2011, Bekhouche et al., 2011, Attri and Venkatesu, 2013). با این وجود شاید بتوان ساختار پروتئین را بیشتر بر اساس شیفتهای λMax و مقایسه شدت فلورسانس در حالتهای دمادهی مختلف در یک مایع یونی با غلظت مشخص، مورد بررسی قرار داد.
به طور کلی میتوان گفت که طیف وسیعی از آنزیمها میتوانند مخلوطهای آبی مایعات یونی را به عنوان محیط واکنش تحمل کنند. به سختی میتوان مایع یونی را یافت که هیچ آنزیمی نتواند با آن سازگار باشد. عقیده بر این است که مایعات یونی در غلظتهای بالاتری، نسبت به حلالهای ملکولی قابل امتزاج با آب، میتوانند توسط آنزیمها تحمل شوند.
بسیاری از هیدرولازها به خصوص آنهایی که توانایی تحمل حلالهای ملکولی را دارند به میزان قابل توجهی میتوانند واکنشهای غیرهیدرولازی را در مایعات یونی کاتالیز کنند. میزان فعالیت آنزیمها در مایعات یونی در حد فعالیت آنها در حلالهای آلی و یا حتی بالاتر نیز میباشد. به علاوه در بسیاری از موارد افزایش پایداری دمایی و عملکردی و افزایش اختصاصیت انانتیو و ریجیو نیز دیده شده است.
مایعات یونی سازگار با آنزیمها به طور معمول برهمکنش قوی با آنزیم نمیدهند و باعث حل شدن آنزیم نمیشوند. تاکنون اساس نظری برای پیشبینی سازگار بودن یا نبودن مایع یونی با آنزیم ایجاد نشده است هرچند با توجه به علاقه زیادی که در این موضوع وجود دارد انتظار میرود که به زودی یک اساس نظری در این زمینه مطرح گردد.
مایعات یونی قابلیت بالایی در کاربرد به عنوان حلال در واکنشهای بیوترانسفورماسیون مربوط به واکنشدهندههای بسیار قطبی مانند پلیساکاریدها دارند؛ زیرا چنین واکنشهایی به دلیل محدودیتهای تعادل واکنش در آب قابل انجام نیستند. چنین جایگزینی یک محیط فرار با محیط غیرفرار مایعات یونی بدون شک ادامه خواهد یافت و به تدریج توسط صنایع شیمیایی پذیرفته خواهد شد و سهم بزرگی در ایجاد کارآیی بالای واکنشهای مختلف خواهد داشت. توسعه مایعات یونی ارزانتر نیز باعث افزایش استفاده از آنها در بیوترانسفورماسیونهای صنعتی خواهد شد. به علاوه باید این موضوع را در نظر داشت که سیستمهای حلالی که بر پایه مایعات یونی هستند قابلیت بالایی در انجام ترانسفورماسیونهای چند کاتالیزوری دارند. برای دستیابی به این اهداف تلاشهای جدیدی انجام گرفته است.
بدون شک انتظار میرود که مایعات یونی سبز و زیست سازگار به زودی در دسترس باشند؛ زیرا به کارگیری مایعات یونی در ایجاد صنایع شیمیایی سبزتر، امری کاملا ضروری است. اینگونه به نظر میرسد که انجام بیوترانسفورماسیون در مایعات یونی بسیار امید بخش است.
فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین
2-1- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز
اولین گزارش از بیوکاتالیز در محیط مایعات یونی مربوط به سال 2000 است (Cull et al., 2000). اولین کارهای انجام شده در این زمینه شامل مایعات یونی متشکل از کاتیونهای 1و3- دی آلکیل ایمیدازولیوم یا N- آلکیل پیریدینیوم و یک آنیون ضعیف کئوردینه کننده بود (شکل2-1و جدول 2-1). این نوع مایعات یونی هنوز نقش اصلی را در واکنشهای آنزیمی ایفا میکنند. هرچند که تحقیقات در حال حاضر بیشتر به سمت مایعات یونی با ساختارهای جدید گرایش یافته است. تاکنون مقالات مروری خوبی در زمینه بیوکاتالیز در مایعات یونی منتشر شده است که از آن جمله پروژه - ریسرچمروری ون رنتویجک و شلدون و مقالات مروری منیرالزمان را میتوان نام برد (Van Rantwijk and Sheldon, 2007, Moniruzzaman, 2010 a& b).

شکل2-1- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی که به طور مرسوم در بیوکاتالیز استفاده میشوند
(Van Rantwijk and Sheldon, 2007).
جدول2-1- آنیونهای متداول در مایعات یونیفرمول ساختاری علامت اختصاری نام آنیون
BF4- BF4- Tetrafluoroborate
PF6- PF6- Hexafluorophosphate
(CF3SO2)2N- Tf2N Bis(trifluoromethylsulfonyl)amide
CF3SO3- TfO Trifluoromethanesulfonate
CF3COO- TFA Trifluoroacetate
CH3SO3- MeSO3 Methylsulfite
n-C7H15SO3- HpSO3 Hydrogenthiophosphate
TsO- TsO Toluenesulfonate
CH3OSO3- MeSO4 Methylsulfate
C2H5OSO3- EtSO4 Ethylsulfate
n-C8H17OSO3- OctSO4 Octylsulfate
(HO)2PO2- H2PO4 Dihydrogenphosphate
(CH3O)2PO2- Me2PO4 Dimethyl phosphate
C2H5O(CH2)2OSO13- EtOEtSO4 Ethoxyethylsulfate
در بیوترانسفورماسیون غالبا از مخلوط محیط آلی- آبی برای افزایش حلالیت واکنشدهندهها و محصولات آبگریز استفاده میشود. پایداری و فعالیت آنزیمها در مخلوطهای آبی مایعات یونی غالبا براساس اثرات هافمیستر مورد بررسی قرار میگیرد. یک مطالعه اولیه روی آنزیم آلکالین فسفاتاز مربوط به باکتری اشرشیا کلای در مخلوط آبی [EtNH3][NO3] (قدیمیترین مایع یونی (Walden, 1914 )) نشان داد که این مایع یونی در غلظتهای پایین روی آنزیم اثر فعال کننده داشته است و بیشترین اثر گذاری آن (10 درصد افزایش فعالیت) در غلظت 1/1 مولار دیده شده است. با افزایش غلظت مایع یونی تا قبل از غلظت 80 درصد فعالیت آنزیم به طور برگشت پذیر کاهش یافت و پس از آن آنزیم به طور برگشت ناپذیری غیر فعال گردید (Magnuson et al., 1984).
2-2- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم
در سالهای اخیر در حوزه بیوکاتالیز در مخلوطهای مایع یونی- آب کارهای زیادی در رابطه با طیف وسیعی از آنزیمها و مایعات یونی انجام شده است. به تازگی آنیونهای α-آمینواسیدها در مایعات یونی مورد استفاده قرار گرفتهاند. این آنیونها کاسموتروپ هستند (Zhao, 2006). مایعات یونی تشکیل شده از α-آمینواسیدهای D و L و ω- آمینوکربوکسیلاتها و کاتیون [C2MIM] در غلظت 5/0 مولار اثر بسیار کمی بر فعالیت آنزیم سوبتیلیسین داشتند. در حالی که [C2MIM][D-GluO] در غلظت 1 مولار سرعت واکنش را بیش از 60 درصد کاهش داد و [C2MIM][L-GluO] باعث کاهش 80 درصدی سرعت شد (Zhao, 2006). مایع یونی [C4MIM][Cl] در غلظتهای کمتر از 20 درصد اثر کمی بر آنزیم پراکسیداز ترب سیاه (HRP) گذاشت در حالیکه در غلظتهای 25 و 30 درصد کاهش شدید فعالیت و پایداری دمایی آنزیم را نشان داد (Machado and Saraiva, 2005).
آنیون نیترات یک آنیون بی ضرر و بی اثر است با این وجود مایعات یونی حاوی این آنیون زیاد مورد مطالعه قرار نگرفتهاند. از معدود مطالعات انجام شده در این زمینه میتوان پژوهشی روی آنزیم پاپائین را نام برد که در حضور 15 درصد [C4MIM][NO3] 50 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. در گزارشی توسط کفتزیک و همکاران دو آنزیم CbFDH و β-گالاکتوزیداز مربوط به باسیلوس سیرکولانس در حضور 25 درصد [PrNH3][NO3] کاملا غیرفعال شدند (Kaftzik et al., 2002). دلیل این غیرفعال شدن را اسیدی شدن pH احتمال دادند.
مایعات یونی حاوی یون [BF4] بسیار مورد استفاده قرار گرفته است. این آنیون به شدت کائوتروپ است و نسبت به آنیونهایی که قبل از این گفته شد قدرت کمتری در تشکیل پیوند هیدروژنی دارد. اثر [C4MIM][BF4] بر فعالیت HRP توسط ماکادو و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. در غلظتهای کمتر از 20 درصد [C4MIM][BF4] کمترین کاهش فعالیت دیده شد و در غلظت 25 درصد آن 30 درصد کاهش فعالیت دیده شد. ماکادو و همکاران همچنین تغییرات پایداری دمایی HRP را در [C4MIM][BF4] بررسی کردند. در غلظت 10 درصدی مایع یونی، آنزیم HRP با تأخیر بیشتری نسبت به محیط آبی در اثر دمادهی غیرفعال شد. در حالی که در غلظت 25 درصد مایع یونی، پایداری آنزیم به شدت کاهش یافت (Machado and Saraiva, 2005).
اولین بیوترانسفورماسیون موفق در یک محیط مایع یونی حاوی 5 درصد آب مربوط به یک مایع یون آبگریز بود. ترمولایزین، یک آنزیم بسیار پایدار، واکنش سنتز Z- آسپارتام را در محیط [C4MIM][BF4] اشباع از بافر کاتالیز کرد؛ سرعت واکنش در این حالت نسبت به سرعت واکنش در محیط اتیل استات 40 درصد بود (Erbeldinger et al., 2000).
لیپازها به عنوان آنزیمهای مقاوم به حلالهای آلی مسلما اولین گزینه انتخابی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی بودند. در حقیقت لیپازهای میکروبی پایدار مانند CALB (Madeira Lau et al., 2000 , Schofer et al., 2001) و لیپاز سودوموناس کاپاسیا (PCL) (Park and Kazlauskas. 2001, Nara et al., 2002) در مایعات یونی از خانواده 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم، در ترکیب با آنیونهای BF4- ، PF6-، TfO- و NTf2- دارای فعالیت کاتالیتیک هستند. نتایج اولیه در این قبیل کارها معمولا تکرارپذیر نبود و این به دلیل حضور ناخالصی باقی مانده طی فرآیند تهیه مایعات یونی بود. لیپازها واکنشهای ترانساستریفیکاسیون را در این مایعات یونی با بازده قابل مقایسه با واکنشهای انجام شده در ترت- بوتیل الکل (Madeira Lau et al., 2000)، دیاکسان (Nara et al., 2002)، یا تولوئن (Park and Kazlauskas 2001) را کاتالیز کردند.
لیپاز A کاندیدا آنتراکتیکا (CALA) به عنوان یک استثناء در محیط مایعات یونی [C4MPy][BF4] و [C4MIM][NTf2] 10 برابر فعالتر از محیط دیایزوپروپیلاتر (DIPE) (Schofer et al., 2001) بود. مایعات یونی خارج از خانوادههای 1- آلکیل 3- متیل ایمیدازولیوم و 1- آلکیل پیریدینیوم به ندرت در فرآیند بیوکاتالیز مورد استفاده قرار گرفتهاند.
لیپازهای مختلفی برای انجام بیوکاتالیز در مایعات یونی مورد بررسی قرار گرفته اند که از این میان میتوان آنزیمهای لیپاز CALB (Lozano et al., 2003)،PCL (Itoh et al., 2003)، ASL (Schofer et al., 2001)، CALA، RML و TLL (Schofer et al., 2001) را نام برد. برای مثال دو آنزیم RML و TLL فعالیت خود را در مایع یونی [C4MIM][NTf2] حفظ کردند در حالی که در دو مایع یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] غیرفعال شدند (Schofer et al., 2001).
لیپاز CRL به طور معمول در محیطهای بدون آب فعالیت کمی دارد. بر اساس مطالعات انجام شده در رابطه با کاتالیز واکنشهای مختلف، این آنزیم در مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] فعالیت خود را حفظ میکند (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003). CRL در [C4MIM][PF6] بهترین فعالیت خود را در حضور حداکثر 4/0 مولار آب (یا 5/0=aw براساس سایر گزارشات (Ulbert et al., 2004) نشان میدهد. همچنین گزارش شده است که CRL واکنش استریفیکاسیون را در محیط بدون آب [C4MIM][PF6] بهتر از محیط ایزواکتان کاتالیز میکند (Yu et al., 2005).
توانایی لیپاز در تحمل مایعات یونی به صورت بیآب یک توانایی عمومی نیست. آنزیم CALB (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003)و CRL (Kaar et al., 2003) در طیف وسیعی از مایعات یونی امتزاجپذیر با آب، حاوی آنیونهای [MeSO4] (Schofer et al., 2001)، [NO3] (Kaar et al., 2003)، [AcO] یا [lactate] (Sheldon et al., 2002) غیرفعال است. نکته قابل توجه این است که لیپاز در چنین محیطهایی حل میشود زیرا حل شدن پروتئین مستلزم شکسته شدن برهمکنشهای پروتئین- پروتئین و تشکیل اینترکشنهای قویتر با محیط است. آب نیز چنین عملکردی دارد اما حلالهای آلی مانند N،N- دیمتیل فرمامید و دیمتیل سولفوکسید که آنزیمها را در خود حل میکنند، و در ضمن، گروههای سطح پروتئین را کوئوردینه میکنند، عوامل دناتوره کننده قوی محسوب میشوند.
2-3- بررسی ساختار آنزیمها در مایعات یونی
در گزارشی از لیو و همکاران فعالیت و ساختار آنزیم لیپاز CRL انکوبه شده در 17 نوع مایع یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که انتخاب نوع آنیون اثر مهمتری بر فعالیت آنزیم در واکنش استریفیکاسیون داشته است و مایعات یونی محلول در آب اثر منفی بر فعالیت آنزیمی داشتهاند. مطالعات ساختاری این گروه با روش FTIR تا حدودی تغییرات ساختاری مرتبط با تغییرات فعالیت آنزیم را نشان داد. هرچند افزایش فعالیت دیده شده در برخی موارد را نمیتوان با دادههای تجربی حاصل از بررسی ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسی ساختاری آنزیم لاکاز در مخلوط آبی مایعات یونی [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهای CD و فلورسانس اثر مثبت مایع یونی [C4MA][TfO] بر پایداری ساختاری آنزیم نسبت به دو نوع دیگر نشان داده شد. در این مطالعه نتایج مطالعات ساختاری با نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاری دیگری به کمک فلورسانس و FTIR اثر مایعات یونی ایمیدازولیومی محلول در آب بر ساختار دو آنزیم α- آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس و آمیلولیکوئی فاسینس مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی نشان داد که آنزیم α- آمیلاز در محیط بافری و محلول آبی مایع یونی [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره میشود. در حالیکه محلول آبی مایع یونی [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهای مانع از دناتوره شدن آنزیم میشود (Dabirmanesh et al., 2011).
اهداف
بررسی اثر مایعات یونی مختلف روی پایداری و فعالیت آنزیمهای لیپاز تا حدودی انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهای مختلف زنجیره کاتیونی مایعات یونی روی آنزیم و بررسی چگونگی تغییر ساختار آنزیم و اثر آن بر فعالیت آنزیمی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنین با توجه به اثرات متفاوت مایعات یونی بر روی آنزیمهای مختلف، در این پژوهش اثر مایعات یونی روی آنزیم لیپاز TTL، یک آنزیم گرمادوست با پتانسیل کاربردهای صنعتی، مورد بررسی قرار میگیرد. بنابراین اهداف این پژوهش عبارتند از:
بررسی اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
بررسی اثر مایعات یونی با کاتیون و آنیونهای مختلف بر پایداری دمایی آنزیم TTL
مطالعه پایداری دمایی بر اساس تغییر در ساختار سوم آنزیم TTL در حضور و عدم حضور مایعات یونی
فرضیه
با استفاده از مایع یونی مناسب به عنوان محیط واکنش میتوان به پایداری بیشتر و فعالیت بهتری از آنزیم دست یافت.
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- ابزار
انواع ظروف و لوازم آزمایشگاهی (ارلن، بشر، پلیت، بورت، کندانسور و غیره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کیسه دیالیز
استیرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پدیده نوژن پارس)
بن ماری (ریحان طب)
آون خلاء
سیستم تغلیظ پروتئین و فیلتر مربوطه (Amicon)
هود لامینار (ژال تجهیز)
انکوباتور (ریحان طب)
شیکر انکوباتور (Vision)
سانتریفوژ (Sigma 16-P)
سانیکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ریحان طب)
پمپ پریستالتیک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)
3-2- مواد
3-2-1- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی
آلکیل هالید ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متیل ایمیدازولیوم (Merck)
آمونیوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دی اتیل اتر (Panreac)
3-2-2- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL
3-2-2-1- سوش باکتری
باکتریxL1blue E.coli (جهت تکثیر پلازمید حاوی ژن لیپاز)
باکتری E.coli BL21 (جهت بیان پروتئین)
3-2-2-2- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون
پلازمید حاوی ژن لیپاز درون سلولی TTL (pQE-TTL)

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استریل
3-2-2-3- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی
تریپتون، عصاره مخمر، نمک سدیم کلرید (Merck) (جهت تهیه محیط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتی بیوتیک آمپی سیلین
ایزوپروپیل β-D- تیوگالاکتوزید (IPTG) (سیناژن)
آنزیم لیزوزیم (CinnaGen)
بافر تریس (Merck)
سدیم فسفات (Merck)
3-2-2-4- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز
رزین Q- Sepharose
رزین Gel filtration
3-2-2-5- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE
رنگ کوماسی بلو G-250 و R-250
فسفریک اسید و استیک اسید گلاسیال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکریل آمید و بیس آکریل آمید (Merck)
TEMED(N,N,N,N'-tetramethylenediamine)
سدیم دو دسیل سولفات (SDS) (Merck)
آمونیوم پرسولفات (APS)
2- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومین سرم گاو (BSA)
بافر تریس و گلایسین (Merck)
3-2-3- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز
سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (Sigma)
استونیتریل (Merck)
بافر تریس (Merck)
3-2-4- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طیف های فلورسانس)
3-3- روشها
3-3-1- روش تهیه مایعات یونی
3-3-1-1- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید
در این پژوهش جهت تهیه مایعات یونی از میزان مول برابر از آلکیل هالید و متیل ایمیدازولیوم استفاده شد. در این روش متیل ایمیدازولیوم قطره قطره در فواصل زمانی مساوی به آلکیل هالید که در حال بهم خوردن شدید بود اضافه شد و محلول نهایی در حال بهم خوردن شدید به مدت 24 ساعت در دمای °C 50 رفلاکس شد (شکل3-1). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دی اتیل اتر شستشو داده شد تا مواد آلی واکنشگر باقیمانده حذف شود. مرحله شستشو 10 تا 15 بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دی اتیل اتر به مایع یونی و بهم زدن شدید آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مایع یونی و دی اتیل اتر از هم جدا شوند. سپس مایع یونی شسته شده به مدت 24 ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دی اتیل اتر آن کاملا تبخیر شود.

شکل 3-1- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید
3-3-1-2- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات
در این مرحله میزان مول مساوی از نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات در مقداری آب حل شد و سپس محلول نمک آمونیوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبی مایع یونی دارای آنیون برومید در حال بهم خوردن شدید اضافه گردید. سپس به مدت 24 ساعت در دمای اتاق محلول روی استیرر بهم خورد تا واکنش جایگزینی آنیون به خوبی انجام شود. در مرحله بعد شستشوی مایع یونی جدید با آب جهت جداسازی آنیون برومید انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نیترات نقره نبود یون برمید را در مایع یونی PF6- دار تایید کرد. سپس مایع یونی PF6- دار بدست آمده به مدت 24 ساعت برای حذف آب موجود در محیط در آون خلاء در دمای °C 70 قرار داده شد. مایع یونی ساخته شده در ظرف درب دار نگهداری شد.
3-3-2- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب
3-3-2-1- محیط کشت باکتری E. coli
در این پژوهش از محیط کشت Luria Bertani (LB) برای رشد سویههای اشرشیاکلی به صورت مایع و جامد (حاوی آگار) استفاده گردید. همچنین در محیط کشت سوشهای حامل ساختار پلاسمید از آنتیبیوتیک آمپیسیلین با غلظت نهایی µg/ml 100 استفاده شد. جدول 3-1 نشان دهنده ترکیبات محیط کشت Luria Bertani است. شایان ذکر است که آنتی بیوتیک پس از استریل شدن محیط کشت توسط اتوکلاو و رسیدن دمای محیط کشت به حدود C° 50 اضافه میگردد.
جدول 3-1- محیط کشت Luria Bertani
ترکیب غلظت
عصاره مخمر 5/0 درصد
تریپتون 1 درصد
NaCl 1 درصد
آگار (محیط کشت جامد) 2 درصد
3-3-2-2- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli
3-3-2-2-1- تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی:به منظور تهیه سلولهای مستعد برای عمل ترانسفورماسیون (انتقال پلاسمید به داخل سلول)، ابتدا یک کشت خطی از سلولهای ذخیره شده مورد نظر در ازت مایع بر روی پلیت LB تهیه و یک شب در گرمخانه Cº 37 قرار داده میشود. سپس یک کلنی از روی پلیت برداشته و در شرایط استریل به 25 میلی لیتر محیط کشت مایع LB افزوده و به مدت 4 الی 6 ساعت در دمای cº37 با حرکت دورانی rpm180رشد داده میشود تا تراکم سلولها در محیط کشت به جذبی ما بین 4/0 تا 6/0 در طول موج 600 نانومتر برسد. سلولها را در دمای ºC 4 به مدت 10 دقیقه در g4000 سانتریفوژ کرده و آنها را در5/2 میلیلیتر محیط خاص مناسب برای تهیه ی این نوع سلولها به نام محیط TSB که طبق جدول3-2 تهیه گردید، به صورت معلق در میآوریم. لازم به ذکر است که در این حالت غلظت سلولی به میزان 10 برابر افزایش داده میشود. سپس سلولهای معلق شده را به مدت 10 الی 60 دقیقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروی یخ قرار میدهیم. محصول سلولی حاصل را در مقادیر 200-100 میکرولیتری در لولههای اپندروف استریل تقسیم کرده و بلافاصله در ازت مایع قرار میدهیم. این سلولها را میتوان در فریزر cº80- نگهداری کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الی دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها یک بار میتوان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.
3-3-2-2-2- انتقال پلاسمید به سلول مستعد :بین 1 تا 10 میکرولیتر بسته به غلظت محلولDNA موجود (معادل 1-1/0 میکروگرم) پلاسمید، در شرایط استریل در یک لوله اپندروف ریخته وبه آن پنج میکرولیتر از بافر KCM 5X که طبق جدول3-3 تهیه گردید، افزوده و با آب مقطر استریل به حجم lµ25 میرسانیم. مخلوط در یخ نگهداری میشود. حال سلول مستعد را از فریزر ºC80- خارج و اجازه میدهیم تا ذوب شود . 25 میکرولیتر از سلول مستعد را به محلول حاوی پلاسمید افزوده و به مدت 15 الی 20 دقیقه در دمای ºC4 قرار میدهیم. سپس در دمای ºC 42 به مدت 105 ثانیه گرمادهی شده که در این مرحله، ملکولهای DNA بر روی سطح سلول ها رونشینی شده و به درون سلول منتقل خواهند شد . بلافاصله سلولها را به درون یخ منتقل کرده و به آنها 100 میکرولیتر محیط LB سرد استریل و بدون آنتیبیوتیک،اضافه و به مدت یک ساعت در دمای Cº37 و حرکت دورانی مناسب قرار میدهیم. در نهایت 150 میکرولیتر محیط حاصل را بر روی پلیت حاوی محیط کشت انتخابی برده و با استفاده از لوپ شیشهای استریل به آرامی بر روی تمامی سطح پلیت بطور کامل و یکنواخت پخش میگردد . پس از جذب سلولها بر روی سطح پلیت، پلیتها به صورت وارونه در گرمخانه cº37 به مدت 16 ساعت قرار داده میشوند.
لازم به ذکر است که این پلیتها، حاوی آنتیبیوتیک خاصی است که ژن مقاومت مربوطه بر روی پلاسمید مورد نظر وجود دارد و در نتیجه تنها سلولهایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند قادر به رشد بر روی محیط انتخابی هستند.
جدول 3-2- نحوه تهیه محلول TSBترکیبات مورد نیاز مقدار
Luria Bertani 75 (ml) 2X
DMSO 5/7 (ml)
PEG 400 3/13 (ml)
MgSo4 5/1 (ml)
MgCl2 5/1 (ml)
ddH2O 3/51 (ml)
Total valume 150 (ml)
جدول 3-3- نحوه تهیه محلول KCMغلظت مناسب برای تهیه محلول 5X ترکیبات مورد استفاده
(M) 5/0 KCl
(M) 15/0 CaCl2
(M) 25/0 MgCl2
3-3-2-3- روش تهیه استوک باکتری
برای تهیه استوک از باکتریهای حاوی ساختار پلاسمید، ابتدا از باکتری مورد نظر کشت یک شبه گذاشته شد. سلولها به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند و سوپ رویی دور ریخته شد. سپس به نسبت 1:1 گلیسرول استریل 50% به محیط کشت LB اضافه شد. آنگاه رسوب سلولها در 15 حجم اولیه محیط کشت، از این محلول حل شدند. در آخر آمپیسیلین با غلظت نهایی μg/ml 100 به سلولها اضافه شد و در C°20- ذخیره گردید.
3-3-2-4- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب
کلنی مورد نظر از بین باکتریهای ترانسفورم شده انتخاب شد و به محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک آمپیسیلین (μg/ml100) انتقال یافت. پس از رشد باکتری به مدت 16 ساعت در دمای °C 37، کشت 1 درصد تلقیح از نمونه باکتری رشد کرده، در حجم ml 20 محیط LB با آمپی سیلین ایجاد شد. پس از گذشت 4 ساعت از کشت اولیه باکتری ها در دمای °C 37، زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، با افزودن IPTG (با غلظت نهایی mM 1) به محیط های کشت بیان پروتئین نوترکیب القا شد و با کاهش دمای انکوباتور به °C 30 شرایط برای تولید آنزیم نوترکیب توسط باکتریها فراهم شد. پس از گذشت 5 ساعت از زمان القا، سلول های باکتری به کمک سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در 110 حجم اولیه، در بافر تریس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت 16 ساعت در °C 20- فریز شدند.
3-3-2-5- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
در این بخش بهینهسازی بیان پروتئین نوترکیب ابتدا با انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان TTL بر اساس میزان فعالیت آنزیمی عصاره سلولی و سپس بهینه سازی زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
ساختار پلاسمید حاوی ژن آنزیم TTL به روش گفته شده در بخش 3-3-2-2 به درون باکتری منتقل شد. سپس با لیز باکتریها پروتئینهای درون سلول جدا شدند (بخش 3-3-2-5) و سنجش فعالیت آنزیمی در مورد هرکدام از نمونهها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش 3-3-6). از بین 6 کلنی ترانسفورم شده بر اساس میزان توانایی تولید آنزیم 1 کلنی انتخاب شد و به صورت غلیظ شده در دمای°C 20- ذخیره گردید و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمانهای مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئینهای محلول درون سلول و میزان پروتئینهای موجود دراجسام نامحلول و پروتئینهای در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمانهای مختلف پس از القا، میتوان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپیسیلین، 1% تلقیح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتریها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، ابتدا ml1 از باکتریها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونهبرداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداری شد.
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتریها با استفاده از دستگاه سانیکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی 1 دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت 4 دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفوردمواد مورد نیاز مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250 1/0 گرم
اتانول 95% 50 میلیلیتر
فسفریک اسید 85% 100 میلیلیتر
در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیلآلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد میشود که شدت این رنگ در غلظتهای کم پروتئین نزدیک به قهوهای و در غلظتهای بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در 595 نانومتر خوانده میشود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازهگیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههای حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی 100 میکرولیتر، رقتهایی تهیه کرده و یک میلیلیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گردید. طی مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS(SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئینها و پپتیدها بکار میرود. قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلیاکریل آمید در غربال پروتئینهای مختلف است. در این روش پروتئینها بر اساس اندازه از هم جدا میشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرایط احیا، این ملکولها خطی شده و SDS به آنها بار منفی میدهد، که میزان بار منفی بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئینها به این صورت بر اساس اندازهشان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعتهای متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا میشوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفورزمحلول استوک اکریل آمید (8/30 %): 30 گرم اکریل آمید و 8/0 گرم بیس اکریل آمید در حدود 50 میلیلیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به 100 میلیلیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده): این بافر دارای غلظت 5/1 مولار تریس با 8/8~pH است. برای تهیه آن 2/18 گرم تریس- باز در حدود 70 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/8 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده): این بافر دارای غلظت 5/0 مولار تریس با 8/6~pH است. برای تهیه آن 1/6 گرم تریس باز در حدود 50 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/6 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تریس- باز، 2/7 گرم گلیسین و 5/0 گرم SDS در 500 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهیه گردید.
محلول رنگآمیزی: 05/0 گرم کوماسی آبی 250-R در 40 میلیلیتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 50 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول 05/0% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری میشود.

user8249

جدول STYLEREF 1 s ‏14 پارامترهای تحلیل واریانس برای حذف متیل مرکاپتان...................................................112

فهرست شکلها
عنوان صفحه
TOC h z c "شکل" شکل ‏11 فرمول ساختاری آمینهای استفاده شده در تصفیهی گاز. (الف) منواتانول آمین، (ب) دی اتانول آمین، (پ) تری اتانول آمین، (ت) متیل دی اتانول آمین، (ث) دی ایزوپروپانول آمین، (ج) 2-(2-آمینواتوکسی) اتانول. PAGEREF _Toc412254356 h 20شکل ‏12 شماتیکی از یک زیست فیلتر. PAGEREF _Toc412254357 h 36شکل ‏13 شماتیکی از یک زیست فیلتر چکه‌ای. PAGEREF _Toc412254358 h 37شکل ‏14 شماتیکی از یک زیست شوینده. PAGEREF _Toc412254359 h 38شکل ‏15 چرخهی گوگرد در طبیعت. PAGEREF _Toc412254360 h 45شکل ‏16 نمایی از چرخه گوگرد در یک برکه. PAGEREF _Toc412254361 h 46شکل ‏31 محلول ویتامین(20 برابر غلیظ)، شناساگر بروموکروزول بنفش و محلول فلزات ناچیز (از راست به چپ) PAGEREF _Toc412254362 h 73شکل ‏32 کشت جامد به جامد. (الف و ب) نمایی از رو و پشت محیط کشت جامد در روز دوم از رشد. تمام کشت‌های میانی نمونه شاهد (بدون باکتری) می‌باشند. PAGEREF _Toc412254363 h 78شکل ‏33 کشت جامد به جامد. (الف و ب) نمایی از رو و پشت محیط کشت جامد در روز سوم از کشت. تمام کشت‌های میانی نمونه شاهد (بدون باکتری) می‌باشند. PAGEREF _Toc412254364 h 78شکل ‏34 نمایی از کشت‌های مورداستفاده در CFU. PAGEREF _Toc412254365 h 79عنوان صفحه
شکل ‏35 نمایی از محیط کشت مایع. (الف) محیط مایع بدون بافر و محلول بافر (از راست به چپ). (ب) محیط کشت مایع پس از 5 روز اینکوباسیون. PAGEREF _Toc412254366 h 80شکل ‏36 شماتیکی از زیست رآکتور مورد استفاده در انجام آزمایش. PAGEREF _Toc412254367 h 81شکل ‏37 نمودار کالیبراسیون مربوط به میزان جذب یون‌های مرکاپتید بر اساس غلظت در طول‌موج 500 نانومتر. PAGEREF _Toc412254368 h 85شکل ‏38 نمودار کالیبراسیون میزان جذب یون‌های سولفات بر اساس غلظت در طول‌موج 420 نانومتر. PAGEREF _Toc412254369 h 86شکل ‏39 نمودار کالیبراسیون میزان جذب یون‌های تیوسولفات بر اساس غلظت در طول‌موج 760 نانومتر. PAGEREF _Toc412254370 h 87شکل ‏310 نمودار اسکن طیفی برای گوگرد در تولوئن با نقطه‌ی بیشینه در طول‌موج 290 نانومتر. ................ PAGEREF _Toc412254371 h 89شکل ‏311 نمودار کالیبراسیون میزان جذب ذرات گوگرد در تولوئن بر اساس غلظت در طول‌موج 290 نانومتر. PAGEREF _Toc412254372 h 90شکل ‏312 نمودار کالیبراسیون میزان جذب ذرات گوگرد درون آب بر اساس غلظت در طول‌موج 600 نانومتر. PAGEREF _Toc412254373 h 91شکل ‏313 نمودار کالیبراسیون میزان CFU بر اساس میزان جذب. PAGEREF _Toc412254374 h 92شکل ‏41 تغییرات میزان جذب در طول‌موج 600 نانومتر برحسب زمان. PAGEREF _Toc412254375 h 97شکل ‏42 تغییرات میزان جذب باکتری در طول‌موج 600 نانومتر و تغییرات غلظت تیوسولفات برحسب زمان. PAGEREF _Toc412254376 h 98شکل ‏43 تغییرات میزان جذب در طول‌موج 600 نانومتر و تغییرات غلظت سولفات و گوگرد برحسب زمان. PAGEREF _Toc412254377 h 99شکل ‏44 تغییرات pH و ORP برحسب زمان. PAGEREF _Toc412254378 h 100عنوان صفحه
شکل ‏45 تغییرات ORP برحسب pH. PAGEREF _Toc412254379 h 101شکل ‏46 تغییرات غلظت سولفید با زمان در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254380 h 102شکل ‏47 تغییرات غلظت پلی سولفید با زمان در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254381 h 103شکل ‏48 تغییرات غلظت تیوسولفات با زمان در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254382 h 104شکل ‏49 تغییرات غلظت سولفات با زمان در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254383 h 104شکل ‏410 تغییرات غلظت گوگرد و جذب آن در طول‌موج 600 نانومتر با زمان در فرآیند ناپیوسته...... PAGEREF _Toc412254384 h 105شکل ‏411 تغییرات pH با زمان در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254385 h 106شکل ‏412 تغییرات ORP با زمان در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254386 h 107شکل ‏413 تغییرات ORP با میزان غلظت سولفید در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254387 h 107شکل ‏414 تغییرات ORP با pH در فرآیند ناپیوسته. PAGEREF _Toc412254388 h 108شکل ‏415 نمودار مقادیر پیش بینی شده بر حسب مقادیر واقعی برای حذف سولفید................. PAGEREF _Toc412254388 h 108
شکل ‏416 نمودار مقادیر پیش بینی شده بر حسب مقادیر واقعی برای حذف متیل مرکاپتان... PAGEREF _Toc412254388 h 108
شکل‏4-17 نمودار مقادیر باقیمانده بر حسب مقادیر پیش بینی شده برای حذف سولفید هیدروژن............................................................................................................................................................114
شکل‏4-18: نمودار مقادیر باقیمانده بر حسب مقادیر پیش بینی شده برای حذف متیل مرکاپتان..115
شکل ‏419 درصد حذف سولفید بر حسب میزان بار سولفید (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254389 h 116شکل ‏420 درصد حذف سولفید بر حسب بار مرکاپتید (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254390 h 117شکل ‏421 درصد حذف سولفید بر حسب OD باکتری (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254391 h 118شکل ‏422 درصد حذف سولفید بر حسب دما (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254392 h 119شکل ‏423 درصد حذف سولفید بر حسب pH (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254393 h 120شکل ‏424 درصد حذف سولفید بر حسب غلظت باکتری و pH (دیگر عامل ها در مقدار میانی)................................................................................................................................................................ PAGEREF _Toc412254394 h 121شکل ‏425 نمودار کانتور اثر متقابل غلظت باکتری و pH بر روی حذف سولفید. PAGEREF _Toc412254395 h 121شکل ‏426 درصد حذف مرکاپتید بر حسب بار سولفید (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254396 h 122شکل ‏427 درصد حذف مرکاپتید بر حسب بار مرکاپتید (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254397 h 123شکل ‏428 درصد حذف مرکاپتید بر حسب غلظت باکتری (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254398 h 124شکل ‏429 درصد حذف مرکاپتید بر حسب دما (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254399 h 124شکل ‏430 درصد حذف مرکاپتید بر حسب pH (دیگر عامل ها در مقدار میانی) PAGEREF _Toc412254400 h 125
فصل اول

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

فصل اول: مقدمهزیست‌گازو گاز طبیعی به عنوان مهمترین جریانهای گازی که به عنوان سوخت استفاده میشوند و همچنین گازهای خروجی از صنایع شیمیایی و پالایشگاهای نفتی اغلب دارای ترکیبات گوگردی می‌باشند که در آنها سولفید هیدروژن نسبت به دیگر ترکیبات به مقدار بیشتر وجود دارد. علاوه بر سولفید هیدروژن، این جریان‌های گازی همچنین می‌توانند شامل ترکیبات آلی فرار مانند متان تیول، اتان تیول، پروپان تیول، سولفید کربن، دی متیل سولفید و دی متیل دی سولفید باشند[1]. زیست‌گاز یک گاز غنی از انرژی می‌باشد، که نیازمند به حذف ترکیبات گوگردی به‌منظور جلوگیری از مشکلات خوردگی در موتورهای احتراق، حفظ محیط‌زیست و سلامت انسانی می‌باشد. معمول‌ترین ترکیبات گوگردی دیده‌شده در زیست‌گاز و گازهای خروجی از صنایع پتروشیمی، سولفید هیدروژن و متیل مرکاپتان می‌باشد. همچنین اتیل مرکاپتان، دی متیل سولفید و دی متیل دی سولفید دیده می‌شوند[2]. مقدار معمول برای سولفید هیدروژن در زیست‌گاز گستره‌ای از 1/0 درصد تا 2 درصد( ppmv20000 تا ppmv 1000) و برای متیل مرکاپتان در سطوح ناچیز، حوالی ppmv 1 تا ppmv 20 را شامل می‌شود[1و3و4]. اهمیت حذف متیل مرکاپتان مربوط به اثر آن بر روی فرآیند گوگردزدایی بیولوژیکی از زیست‌گاز و همچنین به مقدار کمتر، به علت تشکیل اکسیدهای گوگرد در طول احتراق زیست‌گاز در موتورهای احتراق می‌باشد. علاوه بر این موارد آستانه‌ی بوی پایین، سمیت بالا و اثر سرطان‌زایی دلایل مهمی برای حذف متیل مرکاپتان از زیست‌گاز می‌باشد.
خالص سازی گازخالص‌سازی گاز، شامل حذف ناخالصی‌ها از جریان گاز می‌باشد. فرآیندهایی که برای خالص‌سازی گاز توسعه‌یافته‌اند از عملیات شستشوی تک‌مرحله‌ای گرفته تا سیستم‌های بازگشتی چندمرحله‌ای را شامل میشوند. در موارد متعدد، پیچیدگی‌های فرآیند از نیاز به بازیاب ناخالصی تا استفاده‌ی مجدد مواد بکار رفته برای حذف نتیجه می‌شود. عملیات اصلی فرآیند خالص‌سازی گاز دریکی از چند دسته‌ی زیر قرار می‌گیرد[5]:
جذب درون مایع
جذب بر روی جامد
نفوذ درون یک غشا
تبدیل شیمیایی به ترکیبات دیگر
مایع سازی
تبدیل زیستی به ترکیبات دیگر
جذبانتقال یک ترکیب از فاز گاز به فاز مایع که در آن محلول است می‌باشد را جذب گویند. انتقال یک ترکیب از فاز مایع به فاز گاز که در آن محلول است دفع است. بدون شک جذب مهم‌ترین عملیات در فرآیندهای خالص‌سازی جریان‌های گازی می‌باشد.
جذب سطحیتغلیظ انتخابی یک یا چند ترکیب از یک گاز بر روی سطح جامد ریز متخلخل جذب سطحی می‌باشد. مخلوط ترکیبات جذب‌شده را ماده‌ی جذب شونده و جامد ریز متخلخل را جاذب می‌نامند. نیروهای جاذب بین ماده‌ی جذب شونده و ماده‌ی جاذب شامل پیوندهای شیمیایی ضعیف‌ می‌باشند. ماده‌ی جذب‌شده می‌تواند با افزایش دما یا کاهش فشار جزئی ترکیبات درون فاز گاز آزاد شود. زمانی که ترکیبات جذب‌شده به‌صورت شیمیایی با جامد واکنش می‌دهند، عملیات شیمیاجذب نامیده می‌شود و عملیات دفع به‌صورت کلی غیرممکن می‌شود.
نفوذ غشایینفوذ غشایی یک فن‌آوری تقریباً جدید درزمینه‌ی خالص‌سازی گاز می‌باشد. در این فرآیند، غشاهای پلیمری، گازها را به‌وسیله‌ی نفوذ انتخابی یک یا چند ترکیب از یک سمت غشا به سمت دیگر جدا می‌کنند. ترکیبات در یک‌طرف سطح پلیمر حل می‌شوند و از میان پلیمر عبور می‌کنند و باعث ایجاد گرادیان غلظت می‌شوند. گرادیان غلظت به‌وسیله‌ی فشار جزئی بالای ترکیبات کلیدی درون گاز روی یک‌طرف مانع غشایی و فشار پایین در طرف دیگر حفظ می‌شود.
تبدیل شیمیایییک عملیات بنیادین در گستره‌ی وسیعی از فرآیندها، شامل واکنش‌های فاز گازی کاتالیستی و نانوکاتالیستی و واکنش ترکیبات فاز گاز با جامدها می‌باشد. واکنش گونه‌های گازی با مایعات و ذرات معلق درون مایع، حالت ویژه‌ای از جذب در نظر گرفته می‌شود.
مایع سازیبه‌عنوان ابزار خالص‌سازی گاز عمدتاً برای حذف ترکیبات آلی فرار از گازهای خروجی موردنظر می‌باشد. فرآیند شامل دو مرحله میباشد، ابتدا سردسازی ساده جریان گاز به دمایی که در آن ترکیبات آلی دارای فشار بخار پایین مناسب هستند و سپس جمع‌آوری میعانات.
تبدیل زیستیفن‌آوری زیستی، اقتصادی‌ترین روش می‌باشد و روش‌های خوش‌خیم زیستی را برای کنترل آلودگی گاز زمانی که با حذف آلاینده‌های سمی و بدبو از جریان‌های گازی صنایع و شهری سرکار باشد پیشنهاد می‌دهد. روش‌های زیستی برای حذف ترکیبات زیست تخریب پذیر بودار و آلاینده‌های کربن آلی فرار ، مؤثر و اقتصادی است. در این روش چندین گروه از میکروارگانیزم‌ها، به‌صورت عمده گونه‌های باکتریایی، مسئول تجزیه‌ی زیستی آلاینده‌های گاز در زیست رآکتورها می‌باشند[6]. ناخالصی‌های بنیادین گاز در جدول 1-1 آورده شده است.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 1: ناخالصی‌های بنیادین فاز بخارسولفید هیدروژن
دی‌اکسید کربن
بخارآب
اکسیدهای گوگرد
اکسیدهای نیتروژن
ترکیبات آلی فرار
ترکیبات کلردار فرار ترکیبات فلوئور دار فرار
ترکیبات نیتروژنی مبنا
منواکسید کربن
سولفید کربونیل
دی سولفید کربن
ترکیبات گوگردی آلی
سیانید هیدروژن
فنآوریهای حذف سولفید هیدروژنانتخاب فرآیند بهینه برای حذف هر یک یا ترکیبی از ناخالصی‌های ذکرشده آسان نیست. در بیشتر موارد، خالص‌سازی مطلوب گاز می‌تواند با چندین فرآیند متفاوت کامل شود. تعیین اینکه کدام‌یک برای دسته‌ی خاصی از شرایط بهترین است نیازمند تحلیل با جزئیات از عملکرد و هزینه می‌باشد. اگرچه یک گزینش اولیه می‌تواند برای بیشتر ناخالصی‌های معمول به‌وسیله‌ی راهنمای عمومی ذکرشده‌ی زیر صورت گیرد.
سولفید هیدروژنگاز ترش گاز طبیعی شامل سولفید هیدروژن می‌باشد. ترکیبی که شامل یک اتم گوگرد و دو اتم هیدروژن است. سولفید هیدروژن قابل اشتعال می‌باشد. دارای بوی تخم‌مرغ گندیده است که در غلظت‌های بالا برای انسان‌ها و حیوانات سمی است.
در دمای اتاق و فشار جوی، سولفید هیدروژن به صورت گاز می‌باشد. سولفید هیدروژن اسید ضعیفی است که به بیسولفید (HS-) و سولفید(S2-) تفکیک می‌شود. مقدار ثابت تفکیک برای آن‌ها به ترتیب در دمای اتاق (oC 25) 9/6 و 92/12 می‌باشد[7]. اصطلاح سولفید برای هر دو گونه بکار می‌رود. گاز سولفید حتی در غلظت‌های کم سمی می‌باشد. سمیت سولفید هیدروژن برای انسان در جدول 2-1 به‌صورت کامل ذکر ‌شده است.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 2: اثرات سلامتی مربوط به رهاسازی گاز سولفید هیدروژنسولفیدهیدروژن (ppm) اثرات سلامتی
1 بوی تخم‌مرغ گندیده، مظالم‌های بویی.
10 حد در معرض تماس شغلی برای 8 ساعت (USA).
20 نیازمند دستگاه ذخیره‌ی کامل اکسیژن.
100 ممکن است باعث سردرد/ حالت تهوع، از دست دادن حس بویایی در مدت‌زمان 2 الی 15 دقیقه شود.
200 از دست دادن سریع حس بویایی، سوزش چشم و گلو درد.
500 از دست دادن هوشیاری و تعادل، ایست تنفسی در مدت‌زمان 200 دقیقه.
700 بیهوشی سریع، حملات ناگهانی (غش کردن).
مقدار بیشینه غلظت مجاز در شرایط کار برای سولفید هیدروژن ppm 6/1 در هلند و ppm 10 (متوسط گیری شده بر اساس زمان) برای ایالات‌متحده می‌باشد[8]. سولفید هیدروژن در سطح‌های بالاتر از ppm 70 به‌شدت خطرناک‌تر است و در ppm 600 کشنده می‌باشد. سولفید هیدروژن همچنین گازی خورنده است. با ترکیبی از خوردگی و تنش، استیل‌های خط لوله در پی تماس با سولفید ممکن است بشکنند[9]. بنابراین معیارهای خط لوله برای انتقال گاز طبیعی، غلظت‌های سولفید هیدروژن را به سطوح پایین، معمولاً ppmv 4 محدود می‌کنند. به دلیل اثرات خوردگی و تشکیل دی‌اکسید سولفید، استفاده از زیست‌گاز در موتورهای توانی به غلظت‌های سولفید هیدروژن حوالی 100 تا ppmv 200 محدودشده است. فرآیندهای حذف سولفید هیدروژن را می‌تواند در هفت نوع در جدول 1-3 نشان داد[5و6].
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 3: راهبردهای انتخاب فرآیند برای حذف سولفید هیدروژن[6].نوع فرآیند اندازه‌ی تأسیسات ظرفیت گوگرد
جذب درون محلول قلیایی زیاد زیاد
جذب فیزیکی زیاد زیاد
جذب/ اکسایش زیاد کم
نفوذ غشایی کم کم
جذب سطحی کم کم
حذف زیستی کم کم
آمینهای قلیایی برای حذف سولفید هیدروژنآمین‌هایی که ازنظر تجاری برای حذف گازترش از گاز طبیعی مدنظر می‌باشند، منو اتانول آمین، دی اتانول آمین و متیل دی اتانول آمین می‌باشند. تری اتانول آمین به علت ظرفیت پایینش (ناشی از وزن اکی والانی بالا)، واکنش‌پذیری پایینش (به‌عنوان آمین نوع سوم) و پایداری پایین آن، جایگذین شده است.
فرمول ساختاری برای آمین‌های قلیایی در شکل 1-1 نشان داده‌شده است. هرکدام حداقل دارای یک گروه هیدروکسیل و یک گروه آمینی می‌باشد. به‌صورت کلی، این نکته که گروه هیدروکسیل به‌عنوان کاهنده‌ی فشار بخار و افزاینده‌ی حلالیت در آب عمل می‌کند می‌تواند در نظر گرفته شود. درحالی‌که گروه آمینی قلیاییت لازم در محلول‌های آبی را ایجاد می‌کند تا گازهای اسیدی جذب شوند. آمین‌هایی که داری دو اتم هیدروژن می‌باشند که مستقیماً به اتم نیتروژن متصل شده‌اند، مانند منو اتانول آمین و 2- (2-آمینو اتوکسی) اتانول، آمین‌های نوع اول نامیده می‌شوند و عموماً قلیایی‌ترین می‌باشند. دی اتانول آمین و دی ایزوپروپانول آمین دارای یک اتم هیدروژن می‌باشند که مستقیماً به اتم نیتروژن متصل می‌باشند و آمین نوع دوم نامیده می‌شوند.
تری اتانول آمین و متیل دی اتانول آمین نشان می‌دهند که مولکول آمونیاک به‌صورت کامل بدون اتم‌های هیدروژن متصل به نیتروژن جایگزین شده و آمین نوع سوم نامیده می‌شوند. واکنش‌های بنیادینی که هنگام استفاده‌ی آمین‌های نوع اول، مانند منو اتانول آمین، برای جذب سولفید هیدروژن صورت می‌گیرد در زیر نشان داده‌شده است:
واکنش تجزیه‌ی یونی آب:
(1-1) 2H2O ↔ OH- + H3O+
واکنش تجزیه‌ی یونی سولفید هیدروژن:
(1-2) H2S + H2O ↔ HS- + H3O+
(پ)
(ب)
(ت)
(ج)
(ث)
(الف)

شکل STYLEREF 1 s ‏1 SEQ شکل * ARABIC s 1 1 فرمول ساختاری آمینهای استفاده شده در تصفیهی گاز. (الف) منواتانول آمین، (ب) دی اتانول آمین، (پ) تری اتانول آمین، (ت) متیل دی اتانول آمین، (ث) دی ایزوپروپانول آمین، (ج) 2-(2-آمینواتوکسی) اتانول.واکنش آبکافت و تجزیه‌یونی دی‌اکسید کربن محلول:
(1-3) CO2 + 2H2O ↔ HCO3- + H3O+
واکنش پروتون دهی به آمین قلیایی:
(1-4) RNH2 + H3O+ ↔ RNH3+ + H2O
واکنش تشکیل کاربامات:
(1-5) CO2 + RNH2 + H2O ↔ RNHCOO- + H3O+
واکنش‌های 1-1 تا 1-5 برای گونه‌های بنیادین موجود در محلول قلیایی آبی تصفیه آمین در نظر گرفته میشوند. این‌گونه‌ها مولکول‌های تفکیک یونی نشده آب، سولفید هیدروژن، دی‌اکسید کربن و آمین نوع اول و همچنین یون‌های هیدرونیوم، هیدروکسید، سولفید، بیکربنات، یون آمین نوع اول و استات آمین نوع اول می‌باشد.
غلظت‌های تعادلی سولفید هیدروژن و دی‌اکسید کربن در محلول متناسب با فشارهای بخار جزئی آن‌ها در فاز گاز می‌باشد. بنابراین واکنش‌های 1-2 ، 1-3 و 1-5 با افزایش فشار جزئی گاز اسیدی به راست رانده می‌شوند. تعادل واکنش همچنین به دما حساس می‌باشد. با افزایش دما فشار بخار گازهای اسیدی جذب‌شده به‌سرعت افزایش میابد. بنابراین با به‌کارگیری حرارت می‌تواند گازهای جذب‌شده را از محلول‌های آمین به‌سرعت دفع کرد.
مهم‌ترین فرآیند گوگردزدایی گاز، فرایند کلوس می‌باشد، که گوگرد عنصری از سولفید هیدروژن جذب‌شده باز فرآوری می‌شود.
فنآوری کلوسفن‌آوری کلوس به دو مرحله فرآیندی، حرارتی و کاتالیستی تقسیم می‌شود.
مرحلهی حرارتی
در مرحله‌ی حرارتی، گاز غنی از سولفید هیدروژن در یک احتراق کمتر از موازنهی استوکیومتری، در دمایی بالاتر از oC 850 آن‌چنان‌که ذرات گوگرد عنصری در سردکننده گاز فرآیند جریان پایین‌دستی ته‌نشین می‌شوند واکنش می‌دهد.
غلظت‌های سولفید هیدروژن و ترکیبات قابل‌احتراق دیگر (هیدروکربن‌ها و آمونیاک)، اینکه گاز خوراک در کدامین نقطه سوزانده شوند را تعیین می‌کند. گاز کلوس (گازترش) بدون محتویات قابل اشتعال صرف‌نظر از سولفید هیدروژن در لنسهای اطراف صدا خفه کن‌های مرکزی به‌وسیله‌ی واکنش زیر سوزانده می‌شود:
(1-6) 2H2S + 3O2 → 2SO2 + 2H2O
این واکنش به‌شدت گرمازا، بدون شعله و اکسایش کامل سولفید هیدروژن، تولیدکننده‌ی دی‌اکسید گوگرد که در واکنش‌های بعدی خارج می‌شود است. مهم‌ترین این واکنش‌ها واکنش کلوس می‌باشد:
(1-7) 2H2S + SO2 → 3S + 2H2O
واکنش کلی به‌صورت زیر می‌باشد:
(1-8) 10H2S + 5O2 → 2H2S + SO2 + 7/2 S2 + 8H2O
واکنش فوق نشان می‌دهد در مرحله‌ی حرارتی تنها دوسوم سولفید هیدروژن به گوگرد تبدیل می‌شود.
جداسازی فرآیندهای احتراق مقدار معینی از حجم هوای موردنیاز به‌عنوان تابعی از ترکیب گاز خوراک را تأیید می‌کند. به‌منظور کاهش حجم گاز فرآیند یا مشاهده‌ی دماهای احتراق بالاتر، هوای موردنیاز می‌تواند همچنین با تزریق اکسیژن خالص تأمین گردد. چندین فرآیند تغلیظ سازی اکسیژن با سطوح کم و سطوح بالا در صنعت در دسترس می‌باشد، که نیازمند استفاده‌ی سوزاننده‌های مخصوص در کوره‌ی واکنش برای گزینش این فرآیند می‌باشد.
معمولاً 60 تا 70 درصد مقدار کل گوگرد عنصری تولیدشده در این فرآیند در مرحله‌ی حرارتی فرآیند دیده می‌شود.
قسمت اصلی گاز داغ از اتاقک احتراق از میان لوله سردکننده‌ی گاز فرآیند جریان میابد و طوری سرد می‌شود که گوگرد تشکیل‌شده در مرحله‌ی فرآیند متراکم (مایع) می‌شود. حرارتی که به‌وسیله‌ی گاز فرآیند خارج می‌شود و حرارت میعان سازی آزادشده برای تولید محیط یا جریان کم‌فشار بکار گرفته می‌شود. گوگرد مایع‌شده در بخش خروجی گاز سردکننده‌ی گاز فرآیند خارج می‌شود.
بخش کوچکی از گاز فرآیند می‌تواند از میان یک مسیر فرعی درون سردکننده‌ی گاز فرآیند خارج شود. این جریان فرعی داغ به گاز فرآیند سرد از طریق یک شیر سه‌طرفه برای تنظیم دمای ورودی موردنیاز برای رآکتور اول اضافه می‌شود.
گوگرد تشکیل‌شده در مرحلهی حرارتی به‌عنوان دیرادیکال فعال S2 به‌صورت گسترده ترکیب می‌شود و دگرشکل S8 را می‌دهد:
(1-9) 4S2 → S8
مرحلهی کاتالیستی
واکنش کلوس در مرحله‌ی کاتالیستی با اکسید آلومینیوم (III) یا تیتانیوم (IV) فعال‌شده، ادامه میابد و به‌منظور افزایش بازده گوگرد صورت می‌گیرد. سولفید هیدروژن بیشتر با دی‌اکسید گوگرد تشکیل‌شده در طول احتراق درون کوره‌ی احتراق از طریق واکنش کلوس واکنش می‌دهد و منجر به گوگرد عنصری در حالت گازی می‌شود.
(1-10) 2H2S + SO2 → 3S + 2H2O
این گوگرد می‌تواند S6، S7، S8 یا S9 باشد.
مرحله‌ی باز فرآوری کاتالیستی گوگرد شامل سه زیر مرحله می‌باشد: حرارتی، واکنش کاتالیستی و سردسازی به همراه مایع سازی می‌باشد. این سه مرحله حداکثر سه دفعه تکرار می‌شوند. جایی که یک واحد سوزاننده یا تصفیه گاز باقیمانده در انتهای واحد کلوس اضافه‌شده است، تنها دو مرحله‌ی کاتالیستی معمولاً نصب می‌شوند. اولین مرحله‌ی فرآیند در مرحله‌ی کاتالیستی فرآیند حرارتی گاز می‌باشد. جلوگیری از مایع سازی گوگرد در بستر کاتالیست ضرورت دارد، که منجر به گرفتگی کاتالیست می‌شود. دمای عملیاتی موردنیاز بستر در مراحل کاتالیستی منفرد به‌وسیله‌ی گرمایش گاز فرآیند در یک باز گرمایی تا رسیدن به دمای بستر دلخواه صورت می‌گیرد.
دمای عملیاتی معمول پیشنهادشده اولین مرحله‌ی کاتالیستی oC 315 تا oC 330 (دمای بستر پایینی) می‌باشد. دمای بالا در مرحله‌ی اول همچنین به هیدرولیز COS و دی سولفید کربن، که در کوره تشکیل می‌شوند و غیرازاین در فرآیند کلوس بهینه‌شده تبدیل نمی‌شوند کمک می‌کند.
تبدیل کاتالیستی در دماهای پایین‌تر بیشینه شده، اما برای اطمینان از اینکه هر بستر بالای نقطه‌ی شبنم گوگرد کار کند مراقبت باید به عمل آید. دماهای عملیاتی مراحل کاتالیستی بعدی معمولاً oC 240 برای مرحله‌ی دوم و oC 200 برای مرحله‌ی سوم (دماهای بستر پایین) می‌باشد.
در میعان کننده‌ی گوگرد، گاز فرآیند آمده از رآکتور کاتالیستی بین دمای oC 150 تا oC 130 سرد می‌شود. حرارت میعان سازی برای تولید بخار در طرف پوسته‌ی چگالنده استفاده می‌شود.
قبل از ذخیره‌سازی، جریان گوگرد مایع از سردکننده‌ی گاز فرآیند، چگالنده‌های گوگرد و از جداکننده‌ی گوگرد نهایی به واحد گاز زدایی رانده می‌شوند، جایی که گاز (عمدتاً سولفید هیدروژن) حل‌شده در گوگرد حذف می‌شود.
گاز باقیمانده از فرآیند کلوس هنوز شامل ترکیبات قابل اشتعال و ترکیبات گوگردی (سولفید هیدروژن، هیدروژن و منواکسید کربن) می‌باشد که در یک واحد سوزاننده یا در یک واحد تصفیه گاز باقیمانده پایین‌دستی برای گوگردزدایی بیشتر سوزانده می‌شود.
جذب فیزیکیروند گرایش به حلال‌های فیزیکی در سال 1960 با معرفی فرآیند حلال فلور شدت یافت، که با چندین فرآیند حلال فیزیکی دیگر دنبال شد. اخیراً بیشتر، رده جدیدی از فرآیند بر مبنای استفاده از جاذب‌های ترکیبی، شامل هر دو حلال فیزیکی و شیمیایی، تجاری شده است. لیستی از حلال فیزیکی عمده فرآیندهای خالص‌سازی گاز که پیشنهادشده یا اخیراً می‌شود برای استفاده‌ی تجاری و حلال‌های استفاده‌شده به‌وسیله‌ی هرکدام در جدول 1-4 نشان داده‌شده است. یک مطالعه‌ی گزینشی به‌منظور بهینه‌سازی فرآیندهای حلال فیزیکی برای خالص‌سازی گازها در فشارهای بالا به‌وسیله‌ی زاواکی ارائه‌شده است[10]. در این کار شمار زیادی از حلال‌های فیزیکی گزینش شد و بعداز انتخاب دو حلال (دی متیل اتر تترا اتیلن گلیکل و ان-فرملی مرفولین)، شماتیک فرآیند برای کاربردهای متنوع ارائه شد. یک پارامتر کلیدی در گزینش حلال‌های ممکن، حلالیت ناخالصی‌های گازی که جذب‌شده‌ می‌باشد. روشهای ارزیابی حلالیت‌ گازها در حلال‌های قطبی استفاده‌شده به‌عنوان حلال‌های فیزیکی به‌وسیله‌ی اگلون [11] و سوینی [12] توصیف شد. مؤلف‌های بعدی فنی ارائه دادند که به‌صورت ویژه برای ارزیابی یک سری از حلال‌هایی که به‌صورت عملکردی مرتبط می‌باشند ارائه دادند. نیاز به آزمایش حذف نشده است، اما به‌شدت کاهش یافت.
به ساده‌ترین شکل، فرآیندهای حلال فیزیکی نیازمند کمی بیشتر از یک جاذب، مخزن تبخیرآنی در فشار جوی و یک پمپ برگشتی می‌باشند. بخار یا منبع حرارتی دیگری موردنیاز نیست. بعدازاینکه گازهای جذب‌شده از محلول به‌وسیله‌ی تبخیرآنی در فشار جوی دفع شدند، محلول فقیر شامل مقداری گاز اسیدی در تعادل در فشار یک اتمسفر فشار جزئی گاز می‌باشد. این، کمترین فشار جزئی تئوری گاز اسیدی در جریان گاز تصفیه‌شده را نشان می‌دهد. برای مشاهده‌ی درجه‌ی بیشتری از خالص‌سازی، خلأ، دفع گاز بی‌اثر یا حرارت دادن به حلال باید بکار گرفته شود. این امر منجر به دمای نسبتاً پایین از عملیات و علاوه براین بهبود اقتصادی فرآیند می‌شود.
جذب-اکسایشفرآیندهای جذب و اکسایش سولفید هیدروژن و تبدیل آن به گوگرد عنصری در یک سیستم مایع نسبت به چرخه‌های جذب-دفع گزینشپذیری بیشتری برای سولفید هیدروژن در حظور دی‌اکسید کربن دارند.
نسبت بالای دی‌اکسید کربن به سولفید هیدروژن در گاز خوراک به نوع فرآیند جذب-دفع معمول (برای مثال اتانول آمین) می‌تواند منجر به گاز اسیدی شود که در تأسیسات کلوس فرآیندش مشکل می‌باشد. گروه‌های عمده و فرآیندهای خاص در هر گروه در جدول 1-5 ارائه‌شده است. اولین نوع از این فرآیندها بر مبنای بازگردش محلول آمونیوم پلی تیونات که ازنظر تجاری موفق نبود، بوده است.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 4: فرآیندهای حلال فیزیکینام فرآیند حلال اعطاکننده‌ی پروانه
Fluor Solvent Propylene carbonate (PC) Fluor Daniel
SELEXOL Propylene carbonate (PC)
Dimethyl ether of polyethylene glycol (DMPEG) Union Carbide
Sepasolv MPE Methyl isopropyl ether of polyethylene glycol (MPE) Badische (BASF)
Purisol N-Methyl-2-p yrrolidone (WP) Lurgi
Rectisol Methanol Lurgi and Linde AG
Ifpexol Methanol Institut Franqais du Pitrole (IFP)
Estasolvan Tributyl phosphate IFP/Uhde
Methylcyanoacetate Methylcyanoacetate Unocal

گام منطقی دیگر در توسعه‌ی فرآیندهای حذف سولفید هیدروژن به‌کارگیری اکسید آهن به شکل مایع می‌باشد. شیمی این نوع از فرآیندها بر اساس واکنش سولفید هیدروژن با یک ترکیب قلیایی، سدیم کربنات یا آمونیوم، به دنبال واکنش هیدروسولفید با اکسید آهن برای تشکل سولفید آهن می‌باشد.
بازیابی به‌وسیله‌ی تبدیل سولفید آهن به گوگرد عنصری و اکسید آهن به‌وسیله‌ی هوادهی صورت می‌گیرد. این بخش از چرخه شامل واکنش‌های مشابه همچون آن‌هایی که در خالص کننده‌های جعبه-خشک رخ می‌دهد می‌باشد. واکنش‌های زیر مکانیزم واکنش را نشان می‌دهند:
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 5: دسته‌بندی و حالت فرآیندهای جذب/ اکسایشنوع فرآیند نام فرآیند توسعه‌دهنده
Polythionate Koppers C.A.S. Koppers
Iron Oxide Ferrox
Gluud
Burkheiser
Manchester Sperr – Koppers
Gluud
Burkheiser
Manchester Gas
Iron-cyanide Fischer FischerMueller
Thioarsenate Thylox
Giammarco- Vetrocoke Gollmar- Koppers
Giammarco- Vetrocoke
Naphtho-quinones and/or vanadium Perox
Takaha
stretford
Hiperion
Sulfolin
Unisulf h P P Koppers
Tokyo Gas Co., LTD
NicklidBritish Gas
HasebeRJltrasy s--s
WeberRhde AG
Unocal
Iron-chelate Cataban
LO-CAT
Sulfmt
SulFerox Rhodia Inc.
U.S. Filter Engineered Sys--s
Integral Eng.
Shell/Dow Chemical
Sulfur dioxide Townsend
IFP Clauspol1500
Wiewiorowski
UCBSRP Steams-Roge
IFP
Freeport Sulfur
UCB
(1-11) H2S + Na2CO3 ↔ NaHS + NaHCO3
(1-12) Fe2O3.3H2O + 3NaHS + 3NaHCO3 ↔ Fe2S3.3H2O + 3 Na2CO3 + 3H2O
(1-13) Fe2O3.3H2O + 3O2 ↔ 2Fe2S3.3H2O + 6S
نفوذ غشاییفن‌آوری غشا، نظر به اینکه برای گاز بکار گرفته می‌شود، شامل جداسازی ترکیبات منفرد بر مبنای تفاوت در نرخ‌های نفوذ آن‌ها از میان مانع غشایی نازک می‌باشد. نرخ نفوذ برای هر جز به‌وسیله‌ی خصوصیات جز، خصوصیات غشا و تفاوت فشار جزئی ترکیبات گازی در میان غشا می‌باشد. چون جداسازی بر مبنای تفاوت در نرخ‌های نفوذ بجای مانعی مطلق برای یک جز می‌باشد، ترکیب بازیاب شده که از میان غشا نفوذ می‌کند 100 درصد خالص نمی‌باشد. همچنین، یک تفاوت فشار جزئی به‌عنوان نیروی محرک موردنیاز می‌باشد. بخشی از جز نفوذی در گاز باقی می‌ماند، و بازیابی 100 درصد صورت نمیگیرد.
این فرآیند به‌صورت خاص برای عملیات حذف توده‌ای بجای حذف ناخالصی‌ها به‌صورت ناچیز از جریان‌های گازی می‌باشد. این نکته باید تذکر داده شود که، بازیابی بالا با سیستم‌های غشایی (همراه با افزایش هزینه) به‌وسیله‌ی استفاده از سیستم‌های چندمرحله‌ای و بازگشتی یا زمانی که به‌صورت ترکیبی با دیگر فن‌آوری‌ها استفاده می‌شود، همراه می‌باشد.
به‌صورت کلی توافق شده که مکانیزم محلول – نفوذ حاکم بر انتقال گازها از میان غشاهای منفذدار مهم تجاری می‌باشد. مکانیزم شامل موارد زیر می‌باشد:
(الف) جذب گاز در یک‌طرف غشا (ب) انحلال گاز درون غشا (ت) نفوذ گاز از میان غشا (ث) آزادسازی گاز از محلول در طرف مخالف (ج) و دفع گاز از سطح می‌باشد. چون این مراحل ضرورتاً مستقل نمی‌باشند، اصطلاح نفوذ برای انتقال کلی گازها از میان یک غشا استفاده می‌شود.
یکی از بهترین غشاها برای حذف سولفید از گاز طبیعی استات سلولز می‌باشد. ضریب جداسازی برای سولفید هیدروژن و متان (نسبت نفوذپذیری سولفید هیدروژن به متان) بین 40 تا 60 می‌باشد.
جذب سطحیترکیبات قطبی، مانند آب، دی‌اکسید کربن، سولفید هیدروژن، دی‌اکسید گوگرد، آمونیاک، سولفید کربونیل و مرکاپتان‌ها به‌شدت جذب سطحی می‌شوند و می‌توانند به‌سرعت از سیستم‌های غیر قطبی همچون گاز یا هیدروژن جدا شوند.
حذف سولفید هیدروژن از گازها به‌وسیله‌ی ترکیبات اکسید آهن در ایالات‌متحده به‌صورت کامل در صنایع گاز تولیدی شناخته‌شده می‌باشد. در این فرآیند سولفید هیدروژن با اکسید آهن برای تشکیل سولفید آهن و آب واکنش می‌دهد.
حذف زیستیدر تصفیه زیستی چندین گونه‌ی باکتری برای تبدیل ترکیبات گوگردی به شکل غیر سمی آن مانند سولفات و یا ذرات گوگرد استفاده می‌شود.
مهندسی فرآیند خالص‌سازی زیستی گاز در انتخاب و عملیات با هدف نهایی اطمینان یابی از انتقال جرم و زیست‌تخریب‌پذیری یک یا چند آلاینده در جریان گاز می‌باشد. در بعضی موارد خاص، میکروارگانیزم‌ها یک ماده خوراکی خاص مانند گلوکز، اتانول و... را مورداستفاده قرار می‌دهند، همچنین می‌توانند دیگر آلاینده‌ها را اکسید کنند. مقدار خالص‌سازی زیستی گاز که می‌تواند صورت گیرد عمدتاً با شاخصه‌های فیزیک شیمیایی آلاینده‌ها، توانایی فیزیولوژی و بوم‌شناسی ذاتی میکروارگانیزم‌ها و شرایط عملیاتی و محیط‌زیستی تعیین می‌شود[13].
زمانی که فن‌آوری رآکتور زیستی انتخاب می‌شود، تمرکز بر روی عملیات و تجهیزات موردنیاز برای کنترل کردن، به‌منظور حصول اطمینان از محیط فیزیکی و شیمیایی بهینه برای انتقال جرم و تجزیه زیستی، برای رسیدن به بیشینه بازده‌ی حذف آلاینده‌ها است.
فنآوری های خالصسازی زیستی گاز
فن‌آوری خالص‌سازی زیستی گاز شامل رآکتورهای زیستی شناخته‌شده همچون زیست فیلترها، زیست فیلترهای چکه‌ای، زیست شوینده‌ها و زیست رآکتورهای غشایی است. حالت تمام این رآکتورها یکسان است. هوای شامل ترکیبات آلاینده از میان زیست رآکتور عبور داده می‌شود، به‌طوری‌که ترکیب آلاینده از فاز گاز به فاز مایع انتقال میابد. میکروارگانیزم‌ها ازجمله باکتری‌ها و قارچ‌ها که در فاز مایع رشد می‌کنند در حذف ترکیبات آلایندهی گاز شرکت می‌کنند.
میکروارگانیزم‌های مربوط به حذف زیستی معمولاً به‌صورت مخلوطی از ارگانیزم‌ها رشد می‌کنند. این مخلوط شامل باکتری، قارچ و تکیاختهها است و اغلب جامعه‌ی میکروبی نامیده می‌شود. میکروارگانیزم‌هایی که در لایه‌ای نازک سازماندهی‌شده‌اند زیست لایه نامیده می‌شوند. آلاینده‌ی آلی معمولاً به‌عنوان منبع کربنی برای میکروارگانیزم عمل می‌کنند. میکروارگانیزم‌ها همچنین به مواد مغذی ضروری و عامل‌های رشد برای عملکرد و تولید سلول‌های جدید نیاز دارند. این مواد شامل نیتروژن، فسفر، گوگرد، ویتامین‌ها و فلزات با مقدار ناچیز می‌باشند. اغلب این مواد مغذی و عامل‌های رشد در گاز وجود ندارند و به‌صورت خارجی باید تأمین گردد.
چندین میکروارگانیزم قادر به اکسید سولفید هیدروژن در دماها و فشارهای محیط می‌باشند، و هردوی ارگانیزم‌های شیمی دوست و نور دوست برای کاربرد در سیستم زیست فن‌آوری حذف سولفید هیدروژن موردمطالعه قرارگرفته است[14]. باکتری‌های نور دوست عیب نیاز به نور و نیاز به سطح شفاف رآکتور، محلول‌های رآکتور شفاف و زمان ماند بالا را دارند. بنابراین باکتری‌های شیمی دوست (به‌صورت ویژه تیوباسیلوسهای شیمی مستقیم دوست) نوعی از باکتری‌هایی هستند که مورد مطالعه قرارگرفته‌اند و به‌صورت گسترده در فرآیندهای حذف سولفید هیدروژن استفاده می‌شوند.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 6: ویژگیهای باکتری‌های اکسیدکننده‌ی گوگرد.Organism Energy Carbon
Sulfur
globules Optimum pH of growth
Chlorobiaceae phototrophic autotrophic extracellular -
Thiobacillus thioparus chemotrophic autotrophic extracellular 6−8
Thiobacillus denitrificans chemotrophic autotrophic extracellular 6−8
Thiobacillus denitrificans chemotrophic autotrophic extracellular 6−8
Thiobacillus sp. W5 chemotrophic autotrophic extracellular 7−9
Allochromatium vinosum phototrophic mixotrophic intracellular 7.5
Halorhodospira abdelmalekii phototrophic mixotrophic extracellular 8.4
Beggiatoa alba chemotrophic mixotrophic intracellular Acidithiobacillus thiooxidans chemotrophic autotrophic extracellular 2−4
Acidithiobacillus ferrooxidans chemotrophic mixotrophic extracellular 2−4
Thioalkalivibrio denitrificans chemotrophic autotrophic extracellular 7.5−10.5
Xanthomonas chemotrophic heterotrophic 7
Oscillatoria limnetica phototrophic autotrophic extracellular 6.8
در جدول 1-6 شماری از باکتری‌های اکسیدکننده‌ی ترکیبات گوگردی با بعضی از ویژگی‌های متمایزشان گردآوری‌شده‌اند. باکتری‌های متفاوت از خانواده‌ی باکتری یکسان می‌توانند ویژگی‌های متفاوتی داشته باشند. هر خانواده شامل گستره وسیعی از اجداد و سویه‌ها می‌باشد که می‌توانند اساساً در ظرفیت‌های اکسید – گوگرد یا دیگر ویژگی‌ها متفاوت باشند. مهم‌ترین ویژگی در تقسیم سازی باکتری‌های گوگردی تفاوت بین نور دوست بودن و شیمی دوست بودن باکتری‌های گوگردی می‌باشد[15].
باکتریهای نور دوست
باکتری‌های نور دوست (بنفش یا سبز)، نور را به‌عنوان منبع انرژی برای کاهش دی‌اکسید کربن به کربوهیدرات‌ها استفاده می‌کنند. ترکیبات گوگردی کاهش‌یافته به‌عنوان یک الکترون دهنده برای این کاهش، که تحت شرایط بی‌هوازی صورت میگیرد استفاده می‌شنود. واکنش‌های اکسایش سولفید به گوگرد و سولفات به‌وسیله‌ی باکتری‌های نور دوست واکنش‌های ون نیل نامیده می‌شوند[16].
(1-14) 2H2S + CO2 نور CH2O + H2O + 2S0
(1-15) H2S + 2CO2 + 2H2O نور 2CH2O + 2H2SO4
اولین واکنش ون نیل، یک واکنش موازی با فتوسنتز در گیاهان میباشد به‌طوری‌که در واکنش 1-16 نشان داده‌شده است[16].
(1-16) H2O + CO2 نور CH2O + O2
در حقیقت، سیانوباکترها قادر به پیش بردن هر دو مسیر فتوسنتز می‌باشند، که قرار دادن آن‌ها در گروه گیاهان یا باکتری‌ها را مشکل می‌سازد[17].
باکتری های گوگردی شیمی دوست
باکتری‌های گوگردی شیمی دوست (بی‌رنگ) انرژی موردنیاز را از اکسایش هوازی شیمیایی ترکیبات گوگردی کاهش‌یافته میابند. در خصوص اکسایش سولفید، واکنش‌های کلی صورت گرفته واکنش‌های تشکیل گوگرد (در غلظت‌های کم گوگرد) و واکنش‌های تشکیل سولفات (در غلظت‌های اضافی اکسیژن) بر اساس واکنش‌های زیر می‌باشند:
(1-17) H2S + O2 → 2S0 + 2H2O
(1-18) H2S + 2O2 → H2SO4
باکتری‌های شیمی مستقیم دوست نوعی از باکتری‌های اکسیدکننده‌ی گوگرد می‌باشند که موردمطالعه قرارگرفته و بیشتر در فرآیندهای حذف سولفید هیدروژن استفاده‌شده‌اند. استفاده از گونه‌های تیوباسیلوس به‌صورت فزآینده‌ای موردمطالعه قرار گرفت زیرا تولید گوگرد از سولفید مزایایی متفاوت بر تولید سولفات دارد. اولاً، دیده‌شده که گوگرد عنصری ضرر کمتری نسبت به سولفات دارد. دوماً، جداسازی گوگرد نامحلول از جریان‌های آبی از جداسازی سولفات راحت‌تر می‌باشد و سوم اکسیژن کمتری برای اکسایش موردنیاز می‌باشد، که در هزینه‌ی انرژی برای هوادهی صرفه‌جویی می‌شود. علاوه بر این موارد، یون‌های هیدروکسید که در طول جذب سولفید هیدروژن مصرف‌شده‌اند زمانی که گوگرد تولید می‌شود بازیابی می‌شوند. این ویژگی هزینه‌ی افزودن یون هیدروکسید به سیستم را کاهش می‌دهد. تشکیل سولفات انرژی بیشتری نسبت به تشکیل گوگرد تولید می‌کند. برای افزایش تشکیل گوگرد، غلظت اکسیژن باید محدود شود[18].
انواع زیست رآکتورهای حذف سولفید هیدروژن از گاز
حذف سولفید هیدروژن از جریان‌های گازی به‌وسیله‌ی میکروارگانیزم‌ها در رآکتورهای گوناگونی صورت می‌گیرد که در جدول 1-7 ذکرشده‌اند.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 7: دسته‌بندی رآکتورهای زیستیBiomass Liquid Phase Bioreactor
Fixed on a support Stationary Biofilter
Fixed on a support Flowing Biotrickling filter
Suspended Flowing Bioscrubber
تفاوت‌های بنیادینی میان چهار نوع رآکتور بیان‌شده وجود دارد. رآکتورها از جهت آن که میکروارگانیزم‌ها میان فاز مایع رآکتور (ثابت یا متحرک) ثابت یا پخش‌شده باشند تغییر می‌کنند. فاز مایع به‌صورت قابل‌توجه بر روی ویژگی‌های انتقال جرم سیستم تأثیر می‌گذارد. توصیف کوتاهی از چهار نوع زیست رآکتوری که برای خالص‌سازی زیستی گاز در حال حاضر استفاده می‌شوند در ادامه آمده است.
زیست فیلترها
در یک زیست فیلتر، گاز حاوی آلاینده از میان بستری از پرکن‌ها شامل مواد آلی عبور می‌کند. ترکیبات درون گاز به درون لایه‌ی زیستی که بر روی مواد فیلتری رشد می‌کند انتقال میابد. مواد مغذی ضروری برای رشد میکروارگانیزم‌ها به‌وسیله ترکیبات آلی تأمین می‌شود. بر روی زیست لایه، لایه‌ی نازکی از مایع قرار دارد. یک پارامتر کنترلی مهم، محتوای رطوبت کل جریان گاز می‌باشد که باید بین 40 تا 60 درصد باشد. برای جلوگیری از آب‌زدایی، گاز به‌صورت کلی قبل از ورود به زیست فیلتر رطوبت دهی می‌شود. اگر گاز شامل محتویات زیادی از ذرات جامد باشد (گاز یک هواویز باشد) یک فیلتر حذف هواویز می‌تواند قبل از مرحله رطوبت دهی نصب شود. این مرحله از مسدود شدن زیست فیلترها به‌وسیله‌ی ذرات جلوگیری می‌کند. در یک زیست فیلتر فعالیت میکروبی زیست لایه به‌وسیله‌ی غلظت میکروبی و شرایط محیط، مانند دما، در دسترس بودن مواد مغذی، pH و رطوبت تعیین می‌شود. رطوبت زیستغشا مادامی‌که فعالیت زیستی به‌شدت وابسته به فعالیت آبی است یکی از گام‌های بحرانی در حفظ عملکرد مناسب رآکتور می‌باشد. گرمای تولیدشده به‌وسیله‌ی واکنش زیستی و رطوبت گاز ورودی تعیین‌کننده‌ی آب مصرفی و نیاز به تجدید آب می‌باشد. برای حفظ عملکرد، گاز به‌صورت کلی پیش مرطوب‌سازی می‌شود و برای این کار زیست فیلتر یک پخش‌کننده‌ی آب متناوب دارد[6]. شکل 1-2 نمایی از این نوع زیست رآکتور را نشان میدهد.

شکل STYLEREF 1 s ‏1 SEQ شکل * ARABIC s 1 2: شمایی از یک زیست فیلتر و تجهیزات مربوط به آن[19].زیست فیلتر چکهای
یک زیست فیلتر چکه‌ای مشابه یک زیست فیلتر می‌باشد. در اینجا نیز آلاینده‌ها از فاز گاز به یک زیست لایه که بر روی مواد پرکن رشد کرده‌اند انتقال میابند. اگرچه، مواد پرکن ممکن است از مواد شیمیایی بی‌اثر مانند حلقه‌های پلاستیکی ساخته شوند. چون مواد مغذی در این مواد حضور ندارند، مواد مغذی باید به‌وسیله‌ی بازچرخش کردن فاز مایع از میان رآکتور در یک جریان موازی یا ناموازی اعمال شوند(شکل 1-3).
زیست شویندهها
یک زیست شوینده شامل دو رآکتور می‌باشد. قسمت اول یک برج جذب، جایی که آلاینده‌ها به‌وسیله‌ی فاز مایع جذب می‌شوند است. این فاز مایع به رآکتور دوم می‌رود، که یک واحد لجن فعال می‌باشد، جایی که میکروارگانیزم‌ها در لخته‌های معلق درون آب رشد می‌کنند و آلاینده‌ها را تجزیه می‌کنند. خروجی این واحد بر روی برج جذب به‌صورت جریان موازی و یا غیر موازی با جریان گاز بازچرخش می‌شود.
در یک زیست شوینده، حذف آلاینده‌ها از جریان گاز، به‌صورت ویژه ترکیبات آلی فرار و غیر فرار، به دو راه مجزا یا همراه، ممکن می‌شود:
الف) انتقال و یا تغلیظ آلاینده‌ها از فاز گاز به درون فاز مایع (مرحله‌ی جذب)؛ این عملیات با فن‌آوری‌های متفاوت صورت می‌گیرد؛ یک برج خالی افشانه‌ای، یک ستون پرکن، و یا یک شوینده‌ی ونچوری. یک محلول آبی با pH اسیدی یا بازی عموماً برای مولکول‌های آب‌دوست استفاده می‌شود. از روغن سیلیکون در رآکتورهای چند فازی برای گرفتن مواد آب‌گریز استفاده می‌شود.
ب) تجزیه مولکول‌ها به‌وسیله میکروارگانیزم‌ها در یک رآکتور لجن فعال (مرحله‌ی زیست دگرسازی)؛ آلاینده‌هایی که از قبل به درون فاز مایع انتقال‌یافته‌اند، درون یک رآکتور زیستی تجزیه می‌شوند. هوا به درون سوسپانسیون لجن فعال برای ثابت نگه‌داشتن میزان مناسب غلظت اکسیژن تزریق می‌شود. سوسپانسیون باکتریایی معمولاً در یک حوضچه‌ی ته‌نشینی، ته‌نشین می‌شوند. آب در بالای برج گاز – مایع بازیاب می‌شود.

شکل STYLEREF 1 s ‏1 SEQ شکل * ARABIC s 1 3: شماتیکی از یک زیست فیلتر چکه‌ای و تجهیزات مربوط به آن[19].

شکل STYLEREF 1 s ‏1 SEQ شکل * ARABIC s 1 4 شماتیکی از یک زیست شوینده[19].درون یک زیست شوینده مطابق شکل 1-4 گاز آلاینده از میان یک جذب‌کننده جایی که سولفید هیدروژن از جریان گاز به‌وسیله‌ی یک محلول قلیایی مانند سود شسته می‌شود عبور می‌کند (واکنش‌های 1-19 و 1-20). سپس محلول قلیایی غنی از سولفید به درون یک زیست رآکتور جایی که سولفید محلول به گوگرد عنصری یا سولفات اکسید می‌شود فرستاده می‌شود (واکنش‌های 1-21 و 1-22). بخشی از گوگرد عنصری تشکیل‌شده از مایع به‌وسیله‌ی ته‌نشینی درون یک ته‌نشین کننده جداشده، درحالی‌که بخش دیگر به درون برج جذب همراه با مایع برگشتی برمی‌گردد[20]. برای جلوگیری از اکسایش سولفید به سولفات (واکنش 1-22)، که انرژی بیشتری برای باکتری‌ها نسبت به تشکیل گوگرد تولید می‌کند، شرایط اکسیژن محدود درون زیست راکتور بکار گرفته می‌شود.
(1-19) H2S(g) → H2S(aq)
(1-20) H2S(aq) + OH- → HS- + H2O
(1-21) HS- + 1/2O2 → S0 + OH-
(1-22) HS- + 2O2 → SO42- + H+
رآکتورهای زیست چکه‌ای و زیست فیلترها برای سولفید با ظرفیت پایین مناسب می‌باشند. در این فرآیندها، سولفات و نه گوگرد تولید می‌شود. در مورد حذف سولفید هیدروژن از گاز طبیعی، مقدار بیشتری از سولفید هیدروژن باید حذف شود. بنابراین، فرآیند زیست شوینده از دو فرآیند دیگر مناسب‌تر می‌باشد.
رآکتورهای خوراک-ناپیوسته
یک سلول زنده میکروبی، گیاهی و یا حیوانی، ضرورتاً یک رآکتور زیست‌شیمیایی در حال گسترش و در حال تقسیم است. به‌طوری‌که در آن شمار زیادی از واکنش‌های زیست‌شیمیایی آنزیم-کتالیستی اتفاق می‌افتد. کشت‌های میکروبی شامل سلول‌های زنده‌ی میکروبی است درحالی‌که کشت‌های بافتی شامل گیاهان زنده و یا سلول‌های حیوانی است. این کشت‌ها می‌توانند همچون رآکتورهای شیمیایی و زیست‌شیمیایی، در سه حالت عملیاتی سنتی؛ ناپیوسته، پیوسته و یا شبه – ناپیوسته (شبه-پیوسته) عمل کنند. در طول دهه‌های گذشته، رشد عظیمی در استفاده از رآکتورهای شبه – ناپیوسته در صنایع تخمیر، زیست فن‌آوری، شیمیایی و تصفیه – پسماند به دلیل رشد تقاضا برای تولیدات و مواد شیمیایی خاص و برخی از مزایای رآکتورهای نیمه‌پیوسته صورت گرفته است. فرآیندهای ناپیوسته و شبه – ناپیوسته معمولاً به‌منظور به‌کارگیری در حجم پایین؛ مقدار بالای محصول مانند محصولات تخمیر، شامل اسیدهای آمینه و آنتی‌بیوتیک‌ها؛ بازترکیبی DNA محصولات و مواد شیمیایی خاص استفاده می‌شوند. به دلیل ارزش بالای این محصولات، سودآوری می‌تواند حتی با اصلاحات حداکثری در بازده و بهره‌وری شدیداً افزایش یابد. بنابراین انگیزه‌هایی برای بهینه کردن عملیات رآکتورهای ناپیوسته و شبه – ناپیوسته وجود دارد. در فرآیند یک رآکتور ناپیوسته یا شبه – ناپیوسته، هدف بیشینه کردن کمیتی می‌باشد که می‌توان در انتهای فرآیند به آن دست‌یافت، زمانی که مانند فرایند جداسازی و خالص‌سازی محتویات رآکتور برای فرآیند بیشتر برداشت می‌شوند. بنابراین، مسئله بهینه‌سازی نقطه‌ی پایانی تنها در انتها نه میانه نامیده می‌شود. در زیر انواع کشت به اختصار توضیح داده شده است.
کشت‌های ناپیوسته
در عملیات ناپیوسته تمام اجزای ضروری محیط و تلقیح در شروع و نه در طول دوره‌ی تخمیر افزوده می‌شوند. بنابراین، غلظت‌های آن‌ها کنترل نمی‌شوند اما اجازه داده می‌شود تا غلظتشان همزمان با جذبشان توسط سلول‌های زنده تغییر کنند.
کنترل‌های مبنایی برای pH، دما، اکسیژن محلول و کف در طول مسیر کشت ناپیوسته بکار گرفته می‌شود.
pH، میزان اکسیژن محلول و دما معمولاً در طول عملیات رآکتور ناپیوسته ثابت نگه‌داشته می‌شود. تنها پارامترهای بهینه‌سازی، ترکیبات محیط کشت می‌باشند. اگرچه، نمودارهای بهینه‌سازی دما و pH ممکن است منجر بهبود عملکرد کل عملیات صورت گرفته در دما و pH ثابت شوند.
کشت‌های پیوسته
در عملیات پیوسته، یک جریان یا بیشتر شامل مواد مغذی ضروری به‌صورت پیوسته خوراک داده می‌شوند، درحالی‌که جریان خروجی شامل سلول‌ها، محصولات و مواد باقی‌مانده به‌صورت پیوسته خارج می‌شود. یک حالت‌پایا با حفظ نرخ جریان حجمی یکسان برای خوراک و جریان‌های خروجی حاصل می‌شود. همچنین، حجم کشت ثابت نگه‌داشته می‌شود و تمام غلظت‌های مواد مغذی در سطحی از مقادیر حالت‌پایا ثابت می‌ماند. عملیات رآکتورهای پیوسته در صنایع شیمیایی متداول می‌باشند. به‌جز تولید پروتئین منفرد-سلول، تولید آبجو خاص و فرآیندهای تصفیه پسماندهای شهری، کشت‌های پیوسته به‌صورت گسترده در صنعت سازگار نشده است. کشت پیوسته حالت غالب در عملیات صنعتی به علت مشکل در حفظ استریل ماندن (آلودگی به‌وسیله ارگانیزم‌های دیگر) و محافظت کردن از حملات باکتری‌خوارها یا تغییر ژنتیکی نمی‌باشد. چون اغلب دیده‌شده عملیات حالت‌پایا نتایجی با بازده معدودتری از عملیات پویا به علت‌هایی که هنوز به‌طور کامل شناخته نشده‌اند دارند.
کشت‌های خوراک – ناپیوسته
یک کشت خوراک – ناپیوسته یک عملیات شبه – ناپیوسته می‌باشد که در آن مواد مغذی ضروری برای رشد سلول و تشکیل محصول به‌صورت متناوب یا پیوسته در مقابل یک یا بیشتر از جریان خوراک در طول عملیات ناپیوسته دیگر خوراک داده می‌شود. مایع کشت معمولاً تنها در پایان دوره عملیات، یا به‌صورت کامل و یا به‌صورت پاره‌ای (باقیمانده به‌عنوان مایع تلقیح عملیات بعدی) برداشت می‌شود.
این فرآیند اگر سلول‌ها کاملاً ارزشمند و مولد باشند ممکن است چندین بار تکرار شود. بنابراین، ممکن است یک یا چند جریان خوراک اما بدون جریان خروجی در طول عملیات وجود داشته باشد. منابع کربن، نیتروژن، فسفات، مواد مغذی، پیش مادها و یا محرک‌ها به‌صورت متناوب یا پیوسته به درون کشت به‌وسیله‌ی تنظیم نرخ‌های خوراک در طول اجرا داده می‌شوند. محصولات تنها در پایان فرآیند برداشت می‌شوند بنابراین، حجم کشت در طول عملیات افزایش میابد تا اینکه حجم کامل شود. از این رو حالت ناپیوسته عملیات برای رسیدن به نتایج نهایی استفاده می‌شود. بنابراین کشت خوراک – شبه ناپیوسته یک عملیات پویا می‌باشد. با تنظیم نرخ‌های جریان، غلظت‌های مواد مغذی محدودکننده در کشت می‌تواند برای حفظ در سطح ثابت و یا به دنباله‌ی یک پروفیل بهینه از پیش تعیین‌شود تا اینکه حجم کشت به یک بیشینه برسد، و سپس یک حالت ناپیوسته برای مهیاکردن تماس نهایی استفاده می‌شود. علاوه بر این کار، غلظت محصول دلخواه یا بازده تولید در پایان فرآیند بیشینه میشود. این نوع از عملیات برای اولین بار کشت خوراک – ناپیوسته یا تخمیر خوراک – ناپیوسته نامیده شد. همچنین به‌عنوان زولافورفارن در آلمان یا ریوکاو (حالت افزودن جریان) در ژاپن نامیده می‌شود. در مهندسی محیط‌زیست مربوط به پسماندهای سمی، این نوع از عملیات به‌عنوان عملیات پر و خالی یا رآکتورهای ناپیوسته متوالی شناخته‌شده است. در مهندسی زیست پزشکی، فرآیند تنفس درون و خارج شش به‌عنوان سوراخ و بالون نامیده می‌شود، زمانی که حجم شش افزایش میابد با نفس کشیدن و کاهش میابد هنگامی‌که عمل بازدم انجام می‌دهیم، یک‌شکل فرآیند خوراک – ناپیوسته می‌باشد.
دلایلی بر کشت‌های خوراک – ناپیوسته
از طریق تنظیم یک یا چند نرخ خوراک، عملیات خوراک – ناپیوسته می‌تواند ابزاری یکتا از تنظیم غلظت ترکیبات که نرخ واکنش‌های کلیدی را کنترل می‌کنند باشد، بنابراین، می‌توان یک مزیت مشخص عملیات ناپیوسته یا پیوسته را مهیا کرد.
عملیات خوراک – ناپیوسته که پیش‌ازاین توصیف شد می‌تواند همچنین نشان‌دهنده‌ی بازده‌ای از عملیات ممتاز (بازده بالاتر یا ضریب تولید بالاتر) برای واکنش‌های شیمیایی یا زیست‌شیمیایی که یک بیشینه در نرخ واکنش کلی را ارائه می‌دهند یا بیشینه کردن گزینشپذیری یک محصول خاص در سیستم‌های چند واکنشی مانند واکنش‌های زیستی و واکنش‌های پلیمر سازی ‌باشد. مثال‌ها شامل واکنش‌های آنزیمی ممانعتی و واکنش‌های مستقیم کاتالیستی، واکنش‌هایی که یکی از محصولات به‌عنوان یک کاتالیست عمل می‌کند، برخی از واکنش‌های بیدرو و واکنش‌های موازی سری است[21].
گوگردگوگرد یکی از مهم‌ترین عناصر برای زندگی می‌باشد. در سلول به‌ویژه برای تثبیت ساختار پروتئین و در انتقال هیدروژن به‌وسیله‌ی آنزیم‌ها در سوخت‌وساز اکسایش و کاهش اهمیت دارد. برای بعضی پروکریوتها، حالت کاهیده‌ی گوگرد می‌تواند به‌عنوان منبع انرژی و کاهنده‌ی توان بکار رود. برای دیگر پروکاریوتها، حالت‌های اکسیده، مخصوصاً سولفات همچنین گوگرد عنصری، می‌تواند به‌عنوان پایانه‌ی پذیرش الکترون در تنفس بی‌هوازی بکار می‌رود. ازنظر زمین میکروب‌شناسی، واکنش‌های اکسایش و کاهش شامل گوگرد و ترکیبات گوگردی به‌صورت ویژه اهمیت دارند. در طبیعت عنصر گوگرد به دو نوع تقسیم می‌شود، گوگرد یا گوگرد معدنی و زیست گوگرد یا گوگرد آلی. این دو نوع ویژگی‌های متفاوتی دارند که در زیر به‌صورت خلاصه به آن پرداخته‌شده است[22].
گوگرد یا گوگرد معدنیگوگرد معدنی در حالت‌های اکسایش 2- ، 0 ، 2 ، 4 ، 6 ، به‌صورت عمده واقع می‌شود. جدول 1-8 شکل‌های مهم از نظر زمین‌شیمیایی و حالت‌های اکسایش آن‌ها را نشان می‌دهد. در طبیعت حالت‌های اکسایش، 2- ، 0 و 6 معمول‌ترین می‌باشند، که با سولفید، گوگرد عنصری، و سولفات به ترتیب نشان داده می‌شوند. اگرچه، در بعضی محیط‌ها (برای مثال، لایه‌ی شیمیایی محیط‌های آبی، و در بعضی خاک‌ها و ته‌نشینی‌ها)، دیگر حالت‌های اکسایش ترکیبی (مانند، تیوسولفات، و تتراتیونیت) ممکن است به مقادیر کمتر، یافت شوند.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 8: شکل های مهم زمین میکروبی گوگرد و حالت های اکسایش آن.Compound Formula Oxidation State (s) of Sulfur
Sulfide S2- -2
Polysulfide Sn2- -2, 0
Sulfur a S8 0
Hyposulfite (dithionite) S2O42- +3
Sulfite SO32- +4
Thiosulfate b S2O32- -1, +5
Dithionate S2O62- +4
Trithionate S3O62- -2, +6
Tetrathionate S4O62- -2, +6
Pentathionate S5O62- -2, +6
Sulfate SO42- +6
a Occurs in an octagonal ring in crystalline form.
b Outer sulfur has an oxidation state of −1; the inner sulfur has an oxidation state of +5.
زیست گوگردنوعی از گوگرد که به‌وسیله‌ی میکروارگانیزم تولید می‌شود را زیست گوگرد یا گوگرد آلی می‌نامند و با S0 نشان می‌دهند. حالت اکسایش آن صفر می‌باشد. گوگرد زیستی تولیدشده به‌وسیله‌ی میکروارگانیزم‌ها یک ماده‌ی واسط از اکسایش سولفید یا تیوسولفات به سولفات می‌باشد و این باکتری‌ها باکتری‌های اکسیدکننده‌ی گوگرد (SOB) یا به‌صورت مختصر باکتری‌های گوگردی نامیده می‌شوند.
چرخهی زیستگوگردچرخه‌ی زیستگوگرد شامل اکسایش و کاهش پیوسته ترکیبات گوگردی به‌وسیله‌ی میکروارگانیزم‌ها یا گیاهان می‌باشد. در سمت چپ این چرخه در شکل 1-5 [15] معمول‌ترین شکل کاهیده و در سمت راست معمول‌ترین شکل اکسیده از ترکیبات نشان داده‌شده است.
کاهش سولفات به سولفید به دو روش صورت می‌پذیرد. در روش اول، باکتری‌های کاهنده‌ی گوگرد، سولفات را از طریق واکنش ناهمگون کردن (واکنش ترکیبات معدنی به دیگر ترکیبات آلی) می‌کاهند. مرحله‌ی دوم، شرکت کردن ترکیبات گوگردی معدنی به ماده‌ی مغذی آلی، مانند پروتئین، به‌وسیله‌ی گیاهان و میکرو ارگانیزم (واکنشهمگون کننده) می‌باشد.
چرخه‌ی گوگرد، در بوم‌سازگان زیستی، باید در تعادل باشد. بدان معنی که مقدار سولفیدی که اکسید می‌شود باید مربوط به مقدار سولفاتی که کاهش میابد باشد. این موقعیت اغلب در طبیعت رخ می‌دهد و گوگرد پاییز نامیده می‌شود. یک مثال معمول برکهای در پاییز می‌باشد، جایی که برگ‌های ریزان منبع ماده‌ی آلی می‌باشد[23]. شکل 1-6 [24] واکنش‌هایی را که در یک گوگرد پاییزی در لایه‌های متفاوت رخ می‌دهد نشان می‌دهد. باکتری‌های شیمی دوست نزدیک سطح آب غالب می‌باشند، جایی که می‌توانند انرژی را از اکسایش هوازی سولفید و گوگرد به سولفات به دست آورند.

شکل STYLEREF 1 s ‏1 SEQ شکل * ARABIC s 1 5 چرخهی گوگرد در طبیعت.در عمق ناحیه‌ی بی‌هوازی جایی که غلظت اکسیژن کم است، با تجزیه‌ی بی‌هوازی ماده آلی هیدروژن سولفید تولید می‌شود. در بالای ناحیه‌ی بی‌هوازی جایی که نور خورشید هنوز می‌تواند نفوذ کند و هیدروژن سولفید حضور دارد، رشد باکتری‌های نور دوست صورت می‌گیرد. این باکتری‌ها شرایط مناسب برای رشد را تنها در ناحیه‌ای کم‌عمق از همپوشانی میابند چون سولفید و نور خورشید در جهت مخالف واقع می‌شوند. در این لایه‌های کم‌عمق، آن‌ها الکترون‌های کاهنده را از سولفید یا گوگرد به دست میآورند[25].

شکل STYLEREF 1 s ‏1 SEQ شکل * ARABIC s 1 6 نمایی از چرخه گوگرد در یک برکه.نقش میکروبی در چرخهی گوگردمیکروب‌ها نقش مهمی در دگرسازی معدنی و آلی گوگرد ایفا می‌کنند. این دگرسازی زیستی گوگرد در خاک، رسوب و محیط‌زیست‌های آبی صورت می‌گیرد. برخی از دگرسازی‌ها ممکن است با شکلهای متفاوت پیش رود، برای مثال اکسایش هوازی هیدروژن سولفید یا گوگرد ممکن است بخشی به‌وسیله‌ی یک مسیر بی‌هوازی، پیش برود اگرچه اغلب به‌صورت ویژه خیلی آرام‌تر از مسیر هوازی ، صورت می‌گیرد. دو دگرسازی اکسایش بی‌هوازی هیدروژن سولفید و گوگرد به سولفوریک اسید و کاهش سولفات به هیدروژن سولفید، در فشار اتمسفری در محدوده‌ی دمای غالب سطح زمین نمی‌تواند به‌صورت بی‌هوازی پیش رود. کاهش سولفات در حال حاظر شناخته‌شده است و یک مکانیزم مهم معدنی سازی بی‌هوازی کربن آلی در دهان گاه بی‌هوازی و دیگر محیط‌های ساحلی جایی که سولفات زیاد از آب دریا در دسترس می‌باشد. ازنظر زمین‌شیمی شناسی، باکتری‌های اکسیدکننده‌ی گوگرد و کاهنده‌ی گوگرد کاتالیزورهای مهم در چرخه‌ی گوگرد در زیست فضا می‌باشند[22].
باکتریهای کاهندهی گوگرد
سولفات به‌صورت زیستی می‌تواند از دو مسیر تولید شود. در مسیر اول، تولید سولفات به‌عنوان نتیجه‌ی شکست پروتئینی آمینواسید و تجزیه‌ی بیشتر آمینواسید به سولفید صورت میگیرد. در مسیر دوم سولفات می‌تواند به‌وسیله‌ی SRB به‌صورت مستقیم تولید شود. کاهش سولفات ممکن است هم از طریق همگونسازی و یا هم از طریق ناهمگونسازی رخ دهد. مسیر همگونسازی ترکیبات گوگردی کاهیده شده برای سنتز زیستی، اسیدهای آمینه و پروتئین‌ها را تولید می‌کند و منجر به دفع مستقیم سولفید نمی‌شود. در کاهش ناهمگونسازی، سولفات (یا گوگرد) به سولفید غیر آلی به‌وسیله‌ی باکتری‌های شدیداً بی‌هوازی کاهنده‌ی گوگرد یا سولفات کاهیده می‌شود. کاهش همگونسازی یا غیر همگونسازی سولفات، هردو با فعالیت سولفات به‌وسیله‌ی ATP آغاز می‌شود. ضمیمه شدن سولفات به ATP، منجر به تشکیل APS می‌شود که سرانجام به‌وسیله‌ی آنزیم ATP سولفوریلاز کاتالیست می‌شود. در واکنش ناهمگونسازی، نصفه‌ی سولفاتی APS به‌صورت مستقیم به سولفیت به‌وسیله‌ی آنزیم کاهنده‌ی APS کاهش میابد. در واکنش همگونسازی، اتم دیگر فسفر به APS افزوده می‌شود تا فسفوادنوسین فسفوسولفات تشکیل شود.
PAPS سپس به سولفیت کاهیده می‌شود. یک‌بار که سولفیت تشکیل شد، به‌وسیله‌ی آنزیم کاهنده‌ی سولفیت به سولفید تبدیل می‌شود. در واکنش ناهمگون سازی، سولفید دفع می‌شود، درحالی‌که در واکنش همگون سازی، سولفید در ترکیبات گوگردی معدنی شرکت می‌کند. بعضی از باکتری‌های کاهنده‌ی گوگرد در جدول 1-9 [22] خلاصه‌شده‌اند.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 9: برخی از باکتری‌های کاهنده‌ی سولفات در گستره‌ی باکتریaHeterotrophs Autotrophsb
Desulfovibrio desulfuricans c,d Desulfovibrio baarsii
Desulfovibrio vulgaris Desulfobacter hydrogenophilus
Desulfovibrio gigas Desulfosarcina variabilis
Desulfovibrio fructosovorans Desulfonema limicola
Desulfovibrio sulfodismutans Desulfomonas pigra Desulfotomaculum nigrificans Desulfotomaculum acetoxidans Desulfotomaculum orientisd Desulfobacter postgatei Desulfolobus propionicus Desulfobacterium phenolicume Desulfobacterium indolicumf Desulfobacterium catecholicumg a For a more detailed description of sulfate-reducers, see Pfennig et al. (1981) Postgate (1984), and Dworkin (2001).
b Autotrophic growth on H2 and CO2.
c Some strains can grow mixotrophically on H2 and CO2 and acetate.
d At least one strain can grow autotrophically on H2 and CO2.
e Bak and Widdel (1986b).
f Bak and Widdel (1986a).
g Szewzyk and Pfennig (1987).
باکتریهای اکسندهی گوگرد
باکتری‌های اکسنده‌ی گوگرد اغلب باکتری‌های گوگرد نامیده می‌شوند، که SOB برای نشان دادن باکتریهای مستقیم معدنی دوست استفاده می‌شود. این نوع از باکتری‌ها شامل نور دوست‌ها (بنفش و سبز) و شیمی دوست‌ها (بی‌رنگ‌ها) می‌باشند. چون شماری از باکتری‌های گوگرد می‌توانند به‌صورت آلی دگر دوستی و دیگر باکتری‌ها غیر از باکتری‌های گوگرد می‌توانند به‌صورت مستقیم دوستی رشد کنند، نام مناسب برای باکتری‌های گوگرد، باکتری‌های اکسنده‌ی گوگرد است.

جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 10 برخی از باکتریهای هوازی اکسندهی گوگردa,bHeterotrophic Mixotrophic Autotrophic
Beggiatoa spp. Pseudomonas spp. Acidithiobacillus
albertensisc
Thiobacillus
perometabolis Thiobacillus intermedius Acidithiobacillus caldusc
Thiobacillus organoparus Acidithiobacillus ferrooxidansc
Thiobacillus versutusd Acidithiobacillus thiooxidansc
Acidianus brierleyie
Alicyclobacillus
disulfidooxidansf,g
Alicyclobacillus toleransf,g
Beggiatoa alba MS-81-6
Sulfolobus acidocaldariuse
Thermothrix thioparaf
Thiobacillus denitrificansh
Thiobacillus neapolitanus
Thiobacillus novellusf
Thiobacillus tepidarius
Thiobacillus thioparus
a A more complete survey of aerobic sulfur-oxidizing bacteria can be found in Balows et al. (1992) and Dworkin (2001).
b All members of the domain Bacteria in this table are gram-negative except for Alicyclobacillus disulfidooxidans and A. tolerans.
c Formerly assigned to the genus Thiobacillus (see Kelly and Wood, 2000).
d Can also grow autotrophically and heterotrophically.
e Archeon.
f Alicyclobacillus disulfi dooxidans formerly known as Sulfobacillus disulfi dooxidans and Alicyclobacillus
tolerans formerly known as Sulfobacillus thermosulfi dooxidans subsp. Thermotolerans (see Karavaiko et al., 2005).
g Facultative autotroph.
h Facultative anaerobe.
گستره‌ی وسیعی از باکتری‌های اکسنده‌ی گوگرد که ویژگی‌های مخصوص خود در منبع انرژی، منبع کربنی، مسیرهای اکسایش ترکیبات گوگردی، اندازه و شکل وجود دارد. جدول 1-10 و جدول 1-11 شماری از باکتری‌های هوازی اکسنده‌ی گوگرد و بیهوازی اکسنده گوگرد را به ترتیب نشان می‌دهند.
جدول STYLEREF 1 s ‏1 SEQ جدول * ARABIC s 1 11 برخی از باکتریهای بیهوازی اکسندهی گوگردaChemolithotrophs Photolithotrophs
Thermothrix thioparab,c Chromatinum spp.
Thiobacillus denitrificansc Chlorobium spp.
Ectothiorhodospira spp.
Rhodopseudomonas spp.b
Chlorofl exus aurantiacusb
Oscillatoria sp.c
Lyngbya spp.c
Aphanothece spp.c
Microcoleus spp.c
Phormidium spp.c
a For a more complete description of anaerobic sulfur-oxidizing bacteria, see Starr et al. (1981), Holt (1984), and Dworkin (2001).
b Facultatively autotrophic.
c Facultatively anaerobic.
تیوباسیلوس تیوپاروساعضای نژاد تیوباسیلوس ارگانیزم‌های کوچک و میله‌ای شکل می‌باشند که قادر به استخراج کردن انرژی از اکسایش سولفیدها، تیوسولفیدها یا گوگرد آزاد، در تشکیل گوگرد، پرسولفات و سولفات تحت شرایط اسیدی یا بازی می‌باشند. آن‌ها کربن خود را از دی‌اکسید کربن یا از کربنات و بی‌کربنات محلول مشاهده می‌کنند. به‌جز یکی، تمام گونه‌ها هوازی می‌باشند. بعضی از گونه‌های شدیداً هوازی و بعضی مستقیم دوست اختیاری می‌باشند. هشت گونه شناخته‌شده‌اند. دو عضو مهم، تیوباسیلوس تیوپاروس و تی. تیوآکسیدانس می‌باشند.
در یک محیط معدنی شامل سدیم تیوسولفات ارگانیزم‌ها قادر به اکسایش این ترکیب با تشکیل سولفات و گوگرد آزاد می‌باشند. گوگرد آزاد در ادامه به سولفوریک اسید اکسید می‌شود.
(1-23) 5S2O32- + 4O2 + H2O → 4S0 + 6SO42- + 2H+
(1-24) 2S0 + 3O2 + 2H2O → 2SO42- + 4H+
یک غشای نازک، شامل مخلوطی از باکتری‌ها و دانه‌های گوگرد، بر روی سطح محیط کشت در ظرف 24 تا 48 ساعت تشکیل می‌شود.
در حضور هوای شامل دی‌اکسید کربن، اما بدون کربنات و بی‌کربنات محلول، سرعت رشد خیلی کاهش میابد. در غیاب دی‌اکسید کربن و بی‌کربنات حتی در حضور ترکیبات آلی گوناگون هیچ رشدی رخ نمی‌دهد. این ارگانیزم‌ها قادر به تجمع گوگرد درون سلول خود نیستند، اگرچه تولید وسیعی در خارج سلول رخ می‌دهد. تولید گوگرد و سولفات از تیوسولفات یک واکنش گرمازا می‌باشد که منجر به آزاد شدن مقدار قابل‌توجهی از انرژی می‌شود. از این انرژی برای کاهش سدیم بی‌کربنات و برای سنتز ترکیبات ساختاری استفاده می‌شود. سدیم تیوسولفات ممکن است با سولفید فلزی، تتراتیونید و هیدروژن سولفید جایگزین شود. دی‌اکسید کربن نمی‌تواند با کربن ترکیبات آلی به‌عنوان منبع کربنی جایگزین شود. کلونی‌های آگار از میکروارگانیزم خیلی به شرایط ساختگی کشت وابسته می‌باشند و بعد از یک دوره هفتگی می‌میرند[26].
پتانسیل اکسایش-کاهش
پتانسیل اکسایش-کاهش (ORP) سنجشی در واحد میلی ولت از میزان سطح اکسایش آب می‌باشد. این مقدار فعالیت آب را بجای غلظت در مقیاس ppm نشان می‌دهد. مواد شیمیایی مانند کلر، برم، پرکسید هیدروژن، پروکسی استیک اسید و ازون همه اکسیدکنندههایی با پتانسیل اکسایش متفاوت می‌باشند. زمانی که سنجش ORP در سیستمهای تصفیه پساب استفاده می‌شود، در حقیقت توانایی یا پتانسیل اجازه دادن پساب به انجام گرفتن واکنش‌های (اکسایش – کاهش) زیستی خاص سنجش میشود.
واکنش‌های اکسایش – کاهش مهم در سیستمهای تصفیه پساب شامل نیتروژندهی، نیتروژنگیری، حذف فسفر زیستی، حذف بوی بد زیستی و حذف cBOD (ترکیبات شامل کربن و هیدروژن) می‌باشد. این واکنش‌ها شامل کربن، فسفر، گوگرد و نیتروژن و تغییر در حالت‌های اکسایش آن‌ها (شامل اکسیژن) مانند نیترات و سولفات و حالت‌های کاهیده ی آن‌ها (شامل هیدروژن) مانند آمونیاک و سولفید می‌باشد. همچنین از تعریف ORP برمی‌آید که حظور عامل‌های اکسنده مانند اکسیژن باعث افزایش میزان ORP میشود. درحالی‌که حضور عامل‌های کاهنده مانند ماده‌ی مغذی یا cBOD مقدار ORP را کاهش می‌دهد.
در زیر برای هر یک از فرآیندهای فوق توضیحی بین سطح ORP و فعالیت میکروبی به‌صورت خلاصه آورده ‌شده است[27].
نیتروژنگیری
نیتروژندهی برای جبران حدهای تخلیه‌ی نیتروژن کل یا تخریب رشد ارگانیزم‌های رشته‌ای غیر دلخواه صورت می‌گیرد. نیتروژندهی کاهش نیترات به مولکول نیتروژن می‌باشد و به‌وسیله‌ی باکتری‌های نیتروژنده با ORP پساب در محدودهی mV 50- تا mV 50 صورت می‌گیرد[27].
حذف فسفر زیستیتأسیسات تصفیه پساب، حذف فسفر زیستی را به منظور رساندن مقدار فسفر خروجی کل به حد استاندارد انجام می‌دهند. فرآیند شامل دو مرحله‌ی تصفیه؛ اول، فسفر زیستی آزاد می‌شود و دوم، حذف فسفر زیستی، می‌باشد. در رهاسازی فسفر زیستی، باکتری‌های تخمیری، اسیدهای چرب در یک تانک بی‌هوازی دارای محدوده‌ی ORP، mV 225- تا mV 100- تولید می‌کنند. زمانی که اسیدها به‌وسیله‌ی باکتری‌های تجمع‌کننده‌ی – فسفر جذب سطحی می‌شوند، باکتری‌ها فسفر به درون محلول تانک رها می‌کنند. در مرحله‌ی دوم حذف فسفر زیستی، باکتری‌های تجمع‌کننده‌ی فسفر اسیدهای جذب‌شده در تانک هوازی را تجزیه و انرژی مشاهده‌شده از اسیدهای تجزیه‌شده را در دانه‌های فسفر ذخیره می‌کنند. این ذخیره‌سازی انرژی نیازمند حذف مقدار زیادی از فسفر از محلول تانک می‌باشد. ذخیره‌سازی دانه‌های فسفری یا حذف فسفر زیستی زمانی که ORP تانک هوازی mV 25 تا mV 250 است صورت می‌گیرد[27].
تشکیل و تخمیر سولفید (تولید بوی بد زیستی)تولید بوی بد زیستی از طریق دو واکنش زیست‌شیمیایی عمده صورت می‌گیرد، تشکیل سولفید و تشکیل اسید (تخمیر). زمانی که باکتری‌های کاهنده‌ی سولفات، سولفات را مصرف میکنند، سولفید هیدروژن به مقدار زیادی تولید می‌شود. سولفات در آب‌های زیرزمینی و اوره یافت می‌شود و زمانی که به‌وسیله‌ی فعالیت میکروبی کاهش میابد، سولفید هیدروژن تشکیل می‌شود. زمانی که ORP بین mV 250- تا mV 50- است، وقتی که سولفید به‌عنوان ماده‌ی مغذی برای باکتری‌های بی‌هوازی و بی‌هوازی اختیاری شامل باکتری‌های تولیدکننده‌ی متان میباشد، تشکیل سولفید یک رخداد بحرانی در هضم‌کننده‌های بی‌هوازی خواهد بود[27].
متان تیولمتان تیول (یا متیل مرکاپتان) یک ترکیب شیمیایی آلی با فرمول ساختاری CH3SH می‌باشد. متیل مرکاپتان گازی بی‌رنگ با بوی کلم فاسد شده می‌باشد، همچنین یک ماده‌ی طبیعی می‌باشد که در خون و مغز انسان‌ها و دیگر حیوانات و نیز در بافت‌های گیاهان دیده می‌شود. متیل مرکاپتان به‌صورت طبیعی در برخی از مواد غذایی، مانند برخی از پنیرها و آجیل‌ها وجود. متیل مرکاپتان یکی از ترکیبات شیمیایی می‌باشد که منجر به اختلال در تنفس کشیدن و بوی بد گاز شکم میشود. متیل مرکاپتان در دسته‌ی تیولها طبقه‌بندی می‌شود و گاهیاوقات به‌صورت MeSH نوشته می‌شود. گاز متیل مرکاپتان به‌شدت اشتعال‌پذیر است. آستانه‌ی استشمام برای این ترکیب ppm 024/0 گزارش‌شده است[28].
ساختار و خواص شیمیاییمولکول متیل مرکاپتان دارای ساختاری چهاروجهی با کربن در مرکز آن می‌باشد. متیل مرکاپتان اسیدی ضعیف با pKa تقریباً برابر با 4/10 است[29]. این ترکیب به‌سرعت به دی متیل دی سولفید اکسید می‌شود و اکسایش بیشتر دی سولفید را به متان سولفونیک اسید با فرمول مولکولی CH3SO3H تبدیل می‌کند که ترکیبی بدون بو است.
وقوعگاز متیل مرکاپتان به‌عنوان محصول جانبی خمیرکاغذ کرفت در آسیاب‌های خمیرسازی آزاد می‌شود. در خمیرکاغذ کرفت، لیگنین با حمله‌ی هسته‌دوستی با یون هسته‌دوست بسیار قوی سولفید هیدروژن در محیط قلیایی بالا به دو مونومر شکسته می‌شود. در واکنش جانبی، سولفید هیدروژن به گروه متوکسیل (ArOMe) در لیگنین حمله می‌کند، آن‌ها را متیل زا می‌کند تا گروه فنولیت (ArO-) و گاز متیل مرکاپتان آزاد شود. به علت قلیاییت، متیل مرکاپتان پروتون خود را ازدست‌داده (MeSH) و یون متیل مرکاپتید (MeS-)، یک هسته‌دوست قوی تشکیل می‌شود. این ترکیبات در مایع مادر سیاه‌رنگ می‌مانند و در جوشانندهی بازیاب، سوزانده می‌شود، جایی که سولفید به سدیم سولفید باز فرآوری می‌شود[30].
متیل مرکاپتان از تجزیه‌ی ترکیبات آلی در قارچ‌ها نیز آزاد می‌شود و در گاز طبیعی برخی نواحی، در قطران ذغال سنگ و در برخی از نفت‌های خام حظور دارد. این ترکیب در برخی از گیاهان و سبزی‌ها مانند تربچه نیز وجود دارد.
در آب‌های سطحی، متان تیول اولین محصول تجزیه از سوخت‌وساز جلبکی دی متیل سالفونیوپروپینات می‌باشد(DMSP). باکتری‌های دریایی بیشتر پروتئین گوگردی خود را به‌وسیله‌ی تجزیه‌ی ترکیب DMSP و مشارکت متان تیول، علی‌رغم حضور متان تیول در آب دریا که کمتر از غلظت‌ سولفید (nM 3/0 مقابل mM 28) به دست می‌آورند. باکتری‌ها در محیط‌های هوازی و غیر هوازی همچنین می‌توانند متان تیول را به دی متیل سولفید تبدیل کنند، همچنین بیشتر DMS در آب‌های سطحی به‌وسیله‌ی یک مسیر جدا تولید می‌شود. هر دو ترکیب متیل مرکاپتان و دی متیل سولفید می‌توانند به‌عنوان منبع غذایی برای فرآیند تولید متان در بعضی از خاک‌های بی‌هوازی مورداستفاده قرار گیرند.
متان تیول محصول جانبی از متابولیزم گیاه آسپاراجوس می‌باشد[31]. توانایی تولید متان تیول در ادرار بعد از خوردن این گیاه قبلاً به‌عنوان یک ویژگی ژنتیکی گمان می‌شد. بیشتر تحقیقات اخیر نشان میدهد که در حقیقت این بوی عجیب به‌وسیله‌ی تمام انسان‌ها بعد از مصرف این گیاه تولید می‌شود درحالی‌که تنها توانایی تشخیص آن ژنتیکی می‌باشد[32].
روش تهیهمتان تیول به‌صورت تجاری به‌وسیله‌ی واکنش متانول با گاز هیدروژن سولفید بر روی یک کاتالیست جامد اسیدی، مانند آلومینا تهیه می‌شود[33].
(1-25) CH3OH + H2S → CH3SH + H2O
همچنین این ترکیب می‌تواند به‌وسیله‌ی واکنش متیل یودید با تیواوره تهیه شود[34].
کاربردهامتان تیول به‌صورت عمده به‌منظور تولید متیونین، که به‌عنوان ترکیب غذایی در خوراک حیوانات و مرغ و خروس استفاده می‌شود به کار می‌رود[33]. متان تیول همچنین در صنایع پلاستیک و به‌عنوان پیش ماده در تولید حشره‌کش‌ها استفاده می‌شود.
متان تیول همچنین به‌عنوان رابط در عملیات معدن بکار می‌رود. آزادسازی این ماده درون سیستم تهویه به‌منظور هشدار دادن به کارگرهای اورژانس صورت می‌گیرد. چون گاز طبیعی و پروپان گازهای بدون رنگ و بدون بو می‌باشند، اضافه کردن مقدار کمی از متیل مرکاپتان یا اتیل مرکاپتان به‌منظور شناسایی نشتی گاز صورت می‌گیرد.
روش حذف شیمیاییفن‌آوری‌های حذف متیل مرکاپتان از جریان‌های گازی شامل اکسایش(کاتالیستی و شیمیایی)، جذب سطحی به‌وسیله‌ی جاذب‌هایی همچون کربن فعال و زئولیت و جذب درون مایع می‌باشد. یکی از فرآیندهای معروف برای حذف متیل مرکاپتان از گاز فرآیند مرآکس می‌باشد. مرآکس مخففی برای اکسایش مرکاپتان می‌باشد. مرآکس فرآیند شیمیایی کاتالیستی اختصاصی به‌وسیله‌ی UOP در صنایع واحدهای فرآیند گاز طبیعی و پالایشگاه‌های نفتی برای حذف مرکاپتان از LPG ، پروپان، بوتان‌ها، نفتاهای سبک، کروزن و سوخت جت به‌وسیله‌ی تبدیل آن‌ها به دیسولفیدهای کربنی مایع است.

user8251

فهرست جداول
عنوانصفحه
TOC h z t "فهرست جداول;1" جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalis PAGEREF _Toc369168412 h 17جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A) PAGEREF _Toc369168413 h 34جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C) PAGEREF _Toc369168414 h 35جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B) PAGEREF _Toc369168415 h 35جدول 2-4- محلول ریزازورین PAGEREF _Toc369168416 h 35جدول 2-5- محلول احیاء کننده PAGEREF _Toc369168417 h 35جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعی PAGEREF _Toc369168418 h 36جدول 2-7 PAGEREF _Toc369168419 h 45جدول 2-8 PAGEREF _Toc369168420 h 45جدول 2-9 PAGEREF _Toc369168421 h 45جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه PAGEREF _Toc369168422 h 46جدول 2-11- ترکیب رقیق کننده بی‌هوازی (A.D.S) PAGEREF _Toc369168423 h 47جدول 3-1 گاز حاصل از تخمیر جیره و عصاره‌های گیاهان دارویی پس از 96 ساعت انکوباسیون PAGEREF _Toc369168424 h 51جدول 3-2- اثر سطوح مختلف پنج عصاره بر فراسنجه‌های تولید گاز PAGEREF _Toc369168425 h 52جدول 3-3- تعداد کل باکتری‌ها در هر میلی لیتر مایع شکمبه بعد از تاثیر عصاره‌ها PAGEREF _Toc369168426 h 56
فصل اولمقدمه و مروری بر تحقیقات گذشته
1-1- مقدمهدر بین حیوانات اهلی گیاهخوار، نشخوارکنندگان سهم بزرگی را در تامین خوراک و سلامت بشر دارند. از طرفی تغذیه نقش اصلی را در بازده اقتصادی و عملکردی این دام‌ها داشته به طوری که تقریبا دوسوم از کل هزینه تولیدات دامی در واحدهای مختلف پرورش دام به هزینه‌های خوراک اختصاص داشته و از طرفی با توجه به مسئله کمبود پروتئین حیوانی و افزایش تولید با منابع علوفه‌ای موجود، لازم است تا از ارزش تغذیه‌ای منابع خوراکی قابل دسترس و مکمل‌های قابل استفاده به منظور افزایش راندمان تولید اطلاع کافی وجود داشته باشد (امیرخانی، 1386). از این رو اهمیت تغذیه مناسب نشخوارکنندگان ایجاب می‌نماید که ارزش غذایی هر یک از مواد خوراکی و اجزای تشکیل دهنده آنها طبق روش‌های صحیح و استاندارد تعیین گردد (قورچی، 1374).
معده حیوانات نشخوارکننده از چهار بخش شکمبه، نگاری، هزارلا و شیردان تشکیل گردیده است (آلاوونگ و همکاران، 2010). سه بخش اول فاقد هر گونه غده بوده و پیش معده نامیده شده و دو بخش آخر جایی است که هضم میکروبی یا تخمیر در آن صورت می‌پذیرد (منصوری و همکاران، 1381). شکمبه دارای انواع باکتری، پروتوزوآ و قارچ است اما باکتری در تمام جنبه‌های تخمیر شکمبه‌ای نقش غالب را بازی می‌کند (راسل و همکاران، 2002).
حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)

–413

1-4-1-4-هماتوکریت27
1-4-1-5-هموگلوبین27
1-5-شاخص های بیوشیمیایی27
1-5-1-پروتئین کل پلاسما و آلبومین27
1-5-2-گلوکز28
1-5-3-گلوتامیک پیرویک ترانس آمیناز28
1-6-رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش28
1-7-باکتری های اسید لاکتیک (LAB)29
1-7-1-رده بندی علمی30
فصل دوم: سابقه ی تحقیق
2- سابقه ی تحقیق32
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-مکان و زمان انجام تحقیق41
3-2-مکان پرورش42
3-3-ذخیره سازی ، سازگاری و تقسیم بچه ماهیان43
3-4-پروبیوتیک مورد آزمایشLactobacillus plantarum44
3-5-نحوه ی آماده سازی جیره غذایی44
3-6-زیست سنجی45
3-7-نحوه ی غذادهی45
3-8-بررسی عوامل فیزیکی و شیمیایی آب46
3-9-بررسی پارامترهای خون شناسی46
3-9-1-خون گیری و تهیه سرم46
3-9-2-شاخص های خونی47
3-9-2-1-شمارش گلبول های قرمز و سفید47
3-9-2-2-اندازه گیری هماتوکریت48
3-9-2-3-اندازه گیری هموگلوبین49
3-9-2-4-شاخص های گلبول قرمز49
3-9-2-5-تشخیص افتراقی گلبول های سفید50
3-10-فاکتورهای ایمنی51
3-10-1-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی اختصاصی51
3-10-1-1-اندازه گیری ایمنو گلوبولینM (IgM)51
3-10-2-شاخص های بیوشیمیایی ایمنی غیر اختصاصی51
3-10-2-1-اندازه گیری فعلیت لیزوزیم51
3-10-2-2-پروتئین کل سرم52
3-11-روش انجام آزمایشات فلور باکتریایی روده در آزمایشگاه52
3-11-1-روش آماده سازی محیط های کشت52
3-11-2-روش آماده سازی رقت های محلول روده و کشت اولیه53
3-11-3-روش شمارش کلنی ها و تقسیم بندی آنها54
3-12-روش محاسبه شاخص های رشد54
3-12-1-اندازه گیری طول و وزن54
3-12-2-شاخص وضعیت55
3-12-3-درصد افزایش وزن55
3-12-4-ضریب تبدیل غذایی55
3-12-5-ضریب رشد ویژه55
3-12-6-میانگین رشد روزانه55
3-12-7-شاخص کبدی56
3-13-آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی 56
3-14-تجزیه و تحلیل آماری56
فصل چهارم: نتایج
4-نتایج58
4-1-نتایج حاصل از اندازه گیری عوامل محیطی58
4-1-1-دمای آب58
4-1-2-اکسیژن محلول آب58
4-1-3-pH آب محیط پرورش58
4-2-نتایج حاصل از عملکرد رشد بچه ماهیان قزل آلا تحت تاثیر سطوح مختلف پروبیوتیک59
4-2-1-اثر بر وزن نهایی59
4-2-2-اثر بر طول نهایی59
4-2-3-اثر بر ضریب تبدیل غذایی60
4-2-4-ضریب رشد ویژه60
4-2-5-درصد افزایش وزن61
4-2-6-میانگین رشد روزانه61
4-2-7-میزان ضریب چاقی62
4-3-فلور باکتریایی روده ماهیان تیمار و شاهد62
4-3-1-میزان باکتریL.p در فلور روده قزل آلا در محیط کشت MRS62
4-3-2-توتال کانت باکتریایی روده ماهی قزل آلای رنگین کمان در محیط کشتTSA 62
4-4-نتایج حاصل از فاکتورهای خونی63
4-4-1-تعداد گلبول های سفید خون63
4-4-2-تعداد گلبول های قرمز خون64
4-4-3-غلظت هموگلوبین خون64
4-4-4-درصد هماتوکریت خون65
4-4-5-متوسط حجم گلبول قرمز65
4-4-6-متوسط غلظت هموگلوبین سلولی66
4-4-7-متوسط هموگلوبین گلبول قرمز66
4-4-8-درصد لنفوسیت67
4-4-9-مقادیر نوتروفیل67
4-4-10-درصد منوسیت68
4-4-11-درصد ائوزینوفیل68
4-5-نتایج فاکتورهای سرم68
4-5-1-میزان توتال ایمنوگلوبولین سرم خون69
4-5-2-میزان IgM69
4-5-3-میزان لیزوزیم سرم خون70
4-6-نتایج آنالیز لاشه70
4-6-1-درصد رطوبت لاشه70
4-6-2-درصد پروتئین لاشه71
4-6-3-درصد چربی لاشه71
4-6-4-درصد خاکستر لاشه72
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-بحث74
5-1-عملکرد رشد74
5-2-فلور باکتریایی روده77
5-3-شاخص های خونی78
5-4-شاخص های ایمنی خون81
5-4-1-لیزوزیم81
5-4-2-ایمنوگلوبین IgM83
5-5-آنالیز لاشه84
5-6-جمع بندی86
پیشنهادات 87
منابع88
پیوست107
چکیده انگلیسی121
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1: آنالیز تقریبی خوراک استفاده شده در تغذیه بچه ماهیان مورد آزمون44
جدول4-1: میانگین دما، اکسیژن محلول و pH آب در مقاطع زمانی مشخص در طول دوره بررسی58
جدول 4-2- میانگین وزن نهایی (گرم) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-3- میانگین طول نهایی (سانتیمتر) در بچه ماهیان قزل آلا در تیمارهای مختلف59
جدول 4-4- میانگین ضریب تبدیل غذایی بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-5- میانگین ضریب رشد ویژه بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف60
جدول4-6- میانگین درصد افزایش وزن بچه ماهیان قزلآلا در تیمارهای مختلف61
جدول 4-7- میانگین رشد روزانه بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف61
جدول 4-8- میانگین میزان ضریب چاقی بچه ماهیان قزلآلا درتیمارهای مختلف62
جدول 4-9-میزان پروبیوتیک (لاکتوباسیلوس) در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت MRS62
جدول4-10-شمارش کلی فلور باکتریایی در روده ماهیان قزل آلا در محیط کشت TSA63
جدول 4-11-تعدادگلبول های سفید خونی قزل آلا در تیمارهای شاهد وآزمایشی در پایان60روز63
جدول 4-12-تعدادگلبول های قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60روز64
جدول 4-13- غلظت هموگلوبین g/dl)) خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان60
روز64
جدول 4-14- درصد هماتوکریت % خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز65
جدول 4-15- متوسط حجم گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز65
جدول 4-16- متوسط غلظت هموگلوبین سلولی خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول 4-17- متوسط هموگلوبین گلبول قرمز خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان
60 روز66
جدول4-18- درصد لنفوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-19-درصد نوتروفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز67
جدول4-20-درصد منوسیت خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-21-درصد ائوزینوفیل خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز68
جدول4-22-توتال ایمنوگلوبولین سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60
روز69
جدول4-23-میزان IgM سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز69
جدول4-24-میزان لیزوزیم سرم خون قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-25-درصد رطوبت لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز70
جدول4-26-درصد پروتئین لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71
جدول4-27-درصد چربی لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز71
جدول4-28-درصد خاکستر لاشه قزل آلا در تیمارهای شاهد و آزمایشی در پایان 60 روز72
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل( 1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"13
شکل (1-2) رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش29
شکل (3-1) موقعیت جغرافیایی گارگاه پرورش ماهی سردابی(قزل آلا) اشکرآب سیاهکل41
شکل (3-2) نمایی از کارگاه پرورش ماهی سردابی اشکراب سیاهکل42
شکل (3-3) نمایی از کانال های بتونی پرورش و تیمار و تکرارها43
شکل(3-4) پودر اولیه حاوی1011-101244
شکل(3-5) رقت های مختلف از106-101044
شکل(3-6) غذای آماده و غنی شده با پروبیوتیک45
شکل (3-7) غذادهی روزانه بر اساس محاسبات روزانه46
شکل (3-8) خونگیری از سیاهرگ در محل ساقه دمی46
شکل (3-9) دستگاه سانتریفوژ و نحوه ی جداسازی سرم خون47
شکل (3-10) دستگاه سانتریفیوژ هماتوکریت48
شکل (3-11) دستگاه اسپکتروفتو متر نور مرئی و UV49
شکل(3-12): دستگاه اسپکتروفتومتر مدل 2100-VIS شرکت Unico آمریکا51
شکل(3-13)دستگاه Auto Analyzer مدلBT- 150052
شکل (3-14) نحوه ی آماده سازی محیط کشت TSA و MRS آگار53
شکل (3-15) برداشت روده و تهیه رقت های مختلف و کشت در پلت های TSAو MRS54
شکل (3-16) نگهداری پلت ها در انکوباتور و شمارش باکتری ها54
شکل (3-17) آماده سازی لاشه جهت تجزیه شیمیایی56
چکیده
تحقیق حاضر به منظور ارزیابی تاثیر باکتری اسید لاکتیک Lactobacillu plantarum (KC426951) جداسازی شده از روده قزل آلای رنگین کمان بر فاکتورهای رشد ، فلور باکتریایی روده ،فاکتورهای خونی و ایمنی بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) در بهار و تابستان سال 1392انجام شد. بچه ماهیان قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزن 24/2±56/3 به مدت 2 هفته با شرایط پرورشی محیطی در یک مرکز پرورش خصوصی ماهیان سردآبی (اشکرآب سیاهکل) در استان گیلان قبل از شروع آزمایش سازگار شدند . ماهیان در قالب یک طرح کاملا تصادفی به شش گروه شامل 540 قطعه بچه ماهی تقسیم شدند . پارامترهای کیفی آب شامل درجه حرارت ، مقدار اکسیژن محلول و pH به ترتیب 3/0±3/17 درجه سانتی گراد ،43/0±5/8 میلی گرم و 26/0±4/7 اندازه گیری شد .پنج گروه از ماهیان ( هر گروه شامل 90 ماهی) با جیره حاوی 106 (تیمار1) ، 107 (تیمار2) ، 108 (تیمار3) ، 109 (تیمار4) و1010 (تیمار5) cfu g-1 لاکتو باسیلوس پلانتاروم و گروه کنترل (شاهد) بدون جیره حاوی پروبیوتیک به مدت 60 روز تغذیه شدند . تغذیه ماهیان بر اساس 3 درصد بیوماس وزن بدن بصورت روزانه و برابر صورت پذیرفت. نتایج نشان داد که میزان وزن نهایی ، طول نهایی، ضریب رشد ، درصد افزایش وزن و میانگین رشد روزانه در تیمار 2 بیشترین و در تیمار 5 کمترین مقدار و میزان ضریب تبدیل غذایی در تیمار 2 کمترین و در تیمار 5 بیشترین را به خود اختصاص داده بودند(05/0> P). همچنین بالاترین میزان توتال لاکتیک اسید روده ماهیان قزل آلا در تیمار4 و در حالیکه کمترین مقدار مربوط به تیمار شاهد و بالاترین توتال کانت مربوط به تیمار 2 و کمترین تیمار 5 بدست آمد(05/0> P). فاکتورهای خونی: بالاترین سطوح گلبول های قرمز در تیمار 5 (3/10408±3/898333) ، گلبولهای سفید در تیمار4 (4/702±3/10833) ، حجم گلبول های قرمز در تیمار 1(8/3±7/508) ، غلظت هموگلوبین در تیمار 5 (15/0±2/11) ، هماتوکریت در تیمار 5 (2±42) ،فراوانی لنفوسیت ها در گروه شاهد (53/1±67/69) ، فراوانی نوتروفیل ها در تیمار 5 (1±39) ، بدست آمد (05/0> P).
فاکتورهای ایمنی: بالاترین سطوح توتال ایمنوگلوبولین در تیمار 4 (15/1±33/20) ، IgM در تیمار4 (65/2±39) و لیزوزیم در تیمار4(08/2±67/40) حاصل گردید(05/0> P) .حداکثر رطوبت لاشه مربوط به تیمار 3 ، درصد پروتئین مربوط به تیمار 4 ، و کمترین درصد چربی مربوط به تیمار شاهد می باشد (05/0> P). با توجه به نتایج بدست آمده در خصوص بکارگیری Lactobacillus plantarum می توان از آن به عنوان یک فاکتور مثبت جهت بهبود فلور باکتریایی روده ، عملکرد رشد ، شاخص های خونی ، ایمنی و ترکیب لاشه استفاده نمود.
کلمات کلیدی: قزل آلای رنگین کمان،باکتری اسید لاکتیک ، Lactobacillus plantarum ، رشد ، فلور باکتریایی، شاخص خونی، ایمنی ، لاشه
فصل اول
کلیات

مقدمه
رشد فزاینده و روز افزون جمعیت جهان، تامین غذا و دستیابی به منابع جدید غذایی را به یکی از مهمترین دغدغه های دولت ها مبدل ساخته و موجب شده است تا تاًمین مواد پروتئینی به سمت سایر منابع از جمله آبزیان سوق یابد. در این میان ارزش بالای پروتئین آبزیان باعث گردید که صنعت ماهیگیری و آبزی پروری به صنعتی مهم و شایان توجه تبدیل شود. پرورش آبزیان یک فعالیت با گستره جهانی است که در بهبود تغذیه و کمک به توسعه اقتصادی کشورها موثر است.
صنعت آبزی پروری علیرغم این رشد قابل توجه، همواره با مشکلاتی روبرو بوده است که از عمده مشکلات را می توان ابتلا به بیماری های مختلف ذکر نمود . بیماریها در آبزیان به سه سه عامل مهم بستگی دارد وضعیت ماهی (میزبان) از نظر سلامت و تناسب اندام ظاهری و دارا بودن صفات مقاومتی و ایمنی در مقابل اجرام بیماریزا ، عوامل محیطی اهم از شرایط فیزیکی و شیمیایی نظیر اوضاع جوی ، تغییرات حرارتی ، تابش خورشید ، بارندگی و ... و عوامل پاتوژن یا بیماریزا را می توان نام برد ( آذری تاکامی، 1376). اغلب آبزیان پرورشی تحت تأثیر عفونت های باکتریایی قرار می گیرند که سیستم ایمنی شان توسط شرایط استرس زا به خطر می افتد. یکی از معمول ترین روش های درمان این عفونت ها، استفاده از آنتی بیوتیک ها می باشد این در حالی است که استفاده بیش از حد از این داروها باعث بروز مقاومت باکتریایی در این حیوانات می شود (Teuber, 2001). لذا بکارگیری آنتی بیوتیک ها جهت درمان بیماری های آبزیان پرورشی به طور گسترده مورد انتقاد قرار گرفته است، که دلائل آن علاوه بر افزودن هزینه ها عبارتند از: افزایش توانایی مقاومت باکتری ها در برابر آنتی بیوتیک ها، از بین بردن فلور میکروبی محیط زیست، هزینه بالای این داروها و عوارض جانبی این داروها بر ماهی و میگومی باشد . ثابت شده که برخی از آنتی بیوتیک ها سیستم ایمنی را سرکوب می کنند و موجودات آبزی را بیشتر مستعد پذیرش بیماری های باکتریایی ، ویروسی و انگلی می نمایند.افزایش نگرانی های ناشی از بکارگیری آنتی بیوتیک ها منجر به کاهش استفاده از آنها در صنعت آبزی پروری آمریکا و اروپا گردیده است.
آنتی بیوتیکها به تعادل باکتریهای موجود در روده آسیب وارد می کنند و اکثر باکتریهای مفید را از بین برده و منجر به پیدایش باکتریهای مقاوم به دارو می گردند و همچنین فقط 20 تا 30 درصد آنتی بیوتیک ها بوسیله ماهی هضم می شوند و بقیه وارد محیط زیست می شوند.
مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی علاوه بر ایجاد مقاومت در میکرو ارگانیسمها سبب نفوذ این مواد به خاک و آب گردیده و محیط زیست مجاور مزارع پرورش آبزیان را به شدت آلوده نموده است تثبیت داروها و مواد شیمیایی در بافتهای ماهی و آبزیان بهداشت انسانی را نیز به خاطر ایجاد حساسیتهای مختلف، مقاومت باکتریایی و عوارض کلیوی و کبدی به مخاطره می اندازد(آذری تاکامی، 1376).
در حال حاضر، استفاده از پروبیوتیک ها و سین بیوتیک ها به عنوان جایگزین استفاده از آنتی بیوتیکها در پرورش آبزیان مطرح هستند. آبزیان در مراحل اولیه تکثیر و پرورش از سطح ایمنی کافی برخوردار نبوده و نیازمند تدابیر لازم در خصوص پیشگیری و درمان می باشند و بهره گیری از پروبیوتیک ها نیز می تواند به عنوان یکی از ابزارهای موثر در پیشگیری از بیماریها و همچنین محرک رشد مد نظر قرار گیرد.
استفاده از پروبیوتیک ها بعنوان جایگزینی برای روشهای سابق به نظر می رسد می تواند بسیاری از مشکلات را مرتفع سازد. استفاده از پروبیوتیک ها در واقع تکنولوژی جدید آبزی پروری همگام با محیط زیست به شمار می رود. با استفاده از این مواد هم می توان تولید را افزایش داد، هم کیفیت آب را اصلاح کرد و هم اینکه آنها را به عنوان مبارزه بیولوژیک مد نظر قرار داد (حسینی فر، 1386).
تأثیر پروبیوتیک ها در تغذیه، مقاومت در برابر بیماریها و دیگر فعالیت های مفید به اثبات رسیده که از
جمله اثرات مفیدی که بر سلامتی دارند تأثیر بر روی سیستم ایمنی و تحریک سیستم ایمنی است(کامکار، 1390).
استفاده از زیست یارهای حیاتی (پروبیوتیک ها) به عنوان یک مکمل غذایی که قادر به بهبود دفاع و ایجاد
مقاومت در برابر عوامل بیماری زا در زمان بروز استرس های متفاوت طی دوره پرورش ماهی باشند، مورد
توجه هستند.پروبیوتیک ها بطور سودمندی با بهبود تعادل فلور میکروبی روده به میزبان سود می رسانند Fuller,1989)).پروبیوتیک ها نه تنها اثرات منفی آنتی بیوتیک ها را ندارند بلکه نقش مهمی در افزایش بهره وری ، تولید و کاهش درصد تلفات ماهی و میگو دارا می باشند.
تا کنون سویه های زیادی جهت استفاده در تغذیّه دام، طیور و آبزیان به عنوان پروبیوتیک معرفی شده است و با بهره گیری از مهندسی ژنتیک و دانش بیوتکنولوژی، سویه های مؤثرتر و بهتری نیز تولید خواهد شد. ولی به طور کلی پروبیوتیک ها از لحاظ نوع سویه میکروبی مؤثرشان به سه گروه تقسیم می شوند، پروبیوتیکهای 1- باکتریایی2- قارچی 3- مخمری.
پروبیوتیکهای باکتریایی عمده ترین پروبیوتیک هایی هستند که تاکنون در آبزی پروری استفاده شده اند. استفاده از پروبیوتیکهای حاوی باکتریهای اسید لاکتیک به افزایش میزان زنده مانی میزبان در مواجه با عوامل بیماریزا منجر میشوند که این عملکرد از طرق زیر صورت میگیرد ( Gatesoupe, 1999)
آثار آنتاگونیستی بر ضد عوامل بیماریزا از طریق ترشح مواد باکتری ُکش همانند باکتریوسینها
محدود کردن عوامل بیماریزا از طریق افزایش محل اتصال یا استفاده از ماده و انرژی در دسترس
افزایش سد دفاعی بدن از طریق افزایش سطوح ایمنی
همچنین مشاهده شده است برخی پروبیوتیکها اشتها را افزایش می دهند، سلامتی را بهبود می بخشند و افزایشی کلی را در وزن به وجود می آورند که احتما ً لا به دلیل افزایش قابلیت هضم مواد غذایی است (Gatesoupe and Ringo,1998)
توانایی باکتریهای اسید لاکتیک در تقویت ایمنی غیر اختصاصی ماهی قزل آلای رنگین کمان توسط مطالعات برخی از محققین ثابت شده است. به خصوص تجویز خوراکی بعضی از سویه های باکتری اسید
لاکتیک موجب افزایش پاسخ ایمنی سلولی مثل فعالیت فاگوسیتوز، انفجار تنفسی فاگوسیت ها، تکثیر لنفوسیتها و سنتز سیتوکنین ها می شود. (Austin &Irianto, 2002; Nikoskelainen et al., 2001; Balcazar et al., 2006; Panigrahi et al., 2010)
دفتر مواد غذایی و مطالعه دارویی آمریکا و انجمن رسمی کنترل مواد غذایی، برای متمایز نمودن میکرو ارگانیسم های مفید و مضر، لیست گونه هایی از میکرو ارگانیسم را ارائه نموده است که می توان آنها را با مواد غذایی مصرف نمود. از جمله این مواد می توان به لاکتوباسیلوس پلانتاروم Lactobacillus plantarum اشاره نمود.
در این تحقیق باکتری توسط دکترشناور ماسوله در سال 1391 از فلور باکتریایی روده برداشت و با روش مولکول 16S rRNA مورد شناسایی و در NCBI مورد ثبت قرار گرفت (KC426951) و برای اولین بار در ایران جهت تغذیه بچه ماهی قزل آلا بصورت in vivo مورد مصرف قرار گرفت.
تحقیقات و استفاده های گسترده ای از باکتری های اسید لاکتیک شده است که از آنها می توان به لاکتو باسیلوس اشاره کرد (Kesarcodi-Watson . et al .,2008)
در خصوص تاثیر انواع پروبیوتیکها بر رشد و بازماندگی ماهیان تحقیقات فراوانی بعمل آمده است ولی در زمینه اثرات ایمنی زایی آن در ماهیان اطلاعات بسیار محدودی در دسترس می باشد. لذا در این مطالعه بررسی ایمنی زایی این ترکیب در ماهی قزل آلای رنگین کمان مدنظر می باشد
قزل آلای رنگین کمان نخستین گونه از خانواده آزادماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش یافت. این ماهی از اواخر قرن نوزدهم میلادی به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار پرورش داده شده است. در حال حاضر، ماهی قزل آلا اساس صنعتی را تشکیل می دهد که در حال توسعه است و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند در حال افزایش است.
لذا با توجه به مطالب ذکر شده در نوشتار بالا که بیانگر نقش و اهمیت بسیار زیاد پرورش گونه قزل آلا
در تامین پروتئین جامعه می باشد و مشکلات پیش رو حاصل از تغییر شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط پرورش این گونه با ارزش که منجر به انواع بیماریها و تلفات قابل توجه و در نهایت از دست رفتن سرمایه پرورش دهندگان می گردد و با هدف کاهش مصرف بی رویه داروها و مواد شیمیایی در مبارزه با بیماریها ی این آبزی که در نهایت به نحوی وارد چرخه مواد بدن انسان و اثرات سو می شود مطالعه جایگزینی مناسب نظیر پروبیوتیک ها از جمله باکتری لاکتو باسیلوس پلانتاروم بعنوان اولین زیست یار حیاتی ضروری به نظر میرسد لذا مطالعه ای در خصوص تاثیر مقادیر مختلف زیست یار حیاتیباکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم در جیره غذایی قزل آلای رنگین کمان بر رشد ، فلورباکتریایی روده، شاخصهای خونی و ایمنی این گونه مورد مطالعه قرار گرفت که به ضرورت انجام این تحقیق ، فرضیات و اهداف آن در ذیل اشاره شده است.
تاکنون در زمینه افزودن باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم به جیره غذایی قزل آلا، بویژه در سن رشد (بچه ماهی) جهت پرورش آنها در مزارع پرورش، مطالعه علمی و عملی و نیز بررسی اثر غذای حاوی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم روی فلور باکتریایی روده، عوامل خونی و ایمنی خون قزل آلای رنگین کمان به انجام نرسیده است. هرگونه تغییر در شرایط زیستی، تغذیه ای و ... می تواند روی فلور باکتریایی، شاخص های خونی و ایمنی اثر گذار باشد. برآورد این تغییرات جهت دست یابی به وضعیت ایمنی ماهیان تغذیه شده با پروبیوتیک مذکور از روی شاخص های خونی و بیوشیمیایی، از بررسی های علمی نوین در ایران می باشد.
تحقیق حاضر جهت بررسی سطوح مختلف باکتری Lactobacillus plantarum در جیره غذایی روی برخی فاکتورهای خونی ، ایمنی ماهی و فلور باکتریایی و رشد قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) طی60 روز مورد بررسی قرار گرفت. از آنجا که پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان در جهان بسیار رونق دارد، نتایج این تحقیق می تواند در سطوح بین المللی نیز حایز اهمیت بوده و مورد بهره برداری کارگاهها و مراکز دولتی و خصوصی پرورش ماهیان سرد آبی قرار گیرد.
سوالات تحقیق
1-یا مقادیرمختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتور رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
2- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
3- آیا مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان تاثیر مثبت دارد؟
فرضیه تحقیق
1-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت ندارد.
2-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum برفاکتورهای رشد و فلور باکتریایی روده بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان (Oncorhynchus mykiss) تاثیر مثبت دارد.
3-مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum ، شاخص خون و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان(Oncorhynchus mykiss) را بهبود می بخشد.
اهداف تحقیق
1-تعیین مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum یر فاکتورهای رشد بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
2-تعیین تاثیر مقادیر مختلف باکتریLactobacillus plantarum بر فلور باکتریایی روده ی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
3-تعیین مقادیر مختلف باکتری Lactobacillus plantarum بر شاخص های خونی و ایمنی بچه ماهی قزل آلای رنگین کمان.
در مقایسه با تیمار شاهد.
1-1- مشخصات آزاد ماهیان (Salmonidae)
اکثر آزاد ماهیان گونه هایی با ارزش تجاری بالا هستند. هیچ یک از گونه های این خانواده کاملاً دریایی نیستند. یعنی به صورت آنادرموس ((Andromouse در دریا زندگی کرده و جهت تخم ریزی به آب شیرین مهاجرت می کنند. از مشخصات عمده این خانواده وجود باله چربی ( Fine Adipose) می باشد. این باله فاقد شعاع است و حد فاصل باله پشتی و دمی است. وجود دندان از مشخصات آزاد ماهیان است و در برخی گونه ها دندان ها در تمام محفظه دهان گسترش یافته است و وجه تمایز جنس های نر و ماده در زمان تخم ریزی می باشد. آزاد ماهیان گونه هایی گوشتخوار هستند (Maitland,2000).
به طور کلی آزادماهیان از نژادها و جمعیت های مختلفی برخوردار بوده و در نقاط مختلف جهان پراکنش گسترده ای دارند. این ماهیان در زمره ماهیان سردآبی قرار دارند و اغلب متعلق به مناطق سردسیری و معتدله جهان می باشند. در بین خانواده آزاد ماهیان، گونه های قزل آلای رنگین کمان، قزل آلای خال قرمز، آزاد ماهی دریای خزر و میزان محدودی ماهی آزاد زیبا و ماهی آزاد کتا در آب های ایران یافت میشود. این گونه ها از ارزش اقتصادی و زیستی بسیار بالایی برخوردارند و بایستی مورد توجه جدی تری قرار گیرند (فرزانفر، 1384)
1-1-1- رده بندی ماهی قزلآلا
این ماهیان از راسته آزادماهی شکلان(Salmoniforms) و مشتمل بر شش خانواده که عبارتند از: آزاد ماهیان (Salmonidae)، سفید ماهیان(Coregonidae)، بلند باله ماهیان(Thymalidae) ، نازک فلس ماهیان(Osmeridae) ، اردک ماهیان(Esocidae) و سگ ماهیان(Umberidae) که در این مجموعه تنها خانواده نخست، بطورمختصرتشریح می‌گردد.
از جنس‌های معروف این خانواده می‌توان به جنس Salmo، Hucho، Oncorhynchus ، Salmothymus ، Salvelinus و Stenodus اشاره نمود (فرزانفر، 1384).
در بین خانواده های راسته آزادماهی شکلان بجز خانواده های اردک ماهیان و سگ ماهیان مابقی دارای یک باله چربی کوچک هستند که در حدواسط بین باله پشتی و دمی آنها قرار دارد و فاقد شعاع های استخوانی سخت و نرم می باشند (وثوقی و مستجیر، 1379). در گذشته ماهی قزل آلای رنگین کمان را متعلق به جنس Salmo و Salvelinus قلمداد می کردند، در حالی که ماهی آزاد را مربوط به جنس Oncorhynchus می دانستند. اما در سال 1989 ماهی قزل آلای رنگین کمان را که قبلاً تحت عنوان علمی Salmo gairdneri معروف بود، جزو جنس Oncorhynchus طبقه بندی نمودند. امروزه قزل آلای رنگین کمان با نام علمی O. mykiss معروف است و از لحاظ علمی این ماهی جزو گونه های آزاد ماهیان محسوب می گردد (Stickney, 1991)
1-1-2- برخی ویژگی های مورفولوژیک و بیولوژیک ماهی قزل آلا ی رنگین کمان
این ماهی دارای یک نوار پهن بصورت رنگین کمان در هر طرف بدن بوده، بر روی سر، بدن، پشت، باله چربی و باله دمی آن لکه های تیره رنگی مشاهده می شود (شکل1-1). حداکثر طول این ماهی 70 سانتی متر و وزن آن به 7 کیلوگرم نیز بالغ می گردد. این ماهی را متعلق به گروه ماهیان رودرو((Anadromous Fishes ، میدانند. یعنی کلیه مهاجرت های تولید مثلی خود را درآب شیرین انجام می دهد (وثوقی و مستجیر،1379)این ماهی بطور طبیعی در ایران، در دریاچه های با آب سرد، نهرها و رودخانه های با بستر قلوه سنگی و سنگلاخی به سر می برد. زیستگاه این ماهی تا حدی مشابه قزل آلای خال قرمز (گونه بومی ایران) می باشد. در اغلب رودخانه های حوزه جنوبی دریای خزر بوسیله انسان معرفی شده است (نادری و عبدلی، 1383) این ماهی قابلیت بسیار خوبی برای پذیرش غذای دستی و پرورش مصنوعی را داشته، از سرعت رشد قابل قبولی برخوردار است.
1-1-2-1- دستگاه گوارش و اندام های مرتبط
آزاد ماهیان ، جانورانی گوشتخوار بوده ، دارای سیستم گوارشی کوتاهی می باشند ، دندان های این جانوران به شکلی بوده که قابلیت شکار را بخوبی برای آنها میسر می سازد. دهان در این ماهیان از قسمت های مختلفی مانند فک میانی ، فک فوقانی ، فک تحتانی ، استخوان تیغه ایی Vomer و زبان تشکیل شده است.
در این ماهیان علاوه بر فکین ، دندان ها بر روی سقف دهان و قاعده زبان نیز یافت می شوند (فرزانفر ، 1384). در محوطه معده واکنش های وابسته بع ترشح اسیدمعده ، آنزیم ها و همچنین حرکات معده می تواند موجب له شدن مواد غذایی شده، مراحلی از هضم صورت پذیرد.در بخش انتهایی معده و در محل اتصال به روده حدود 30 الی 80 زوائد انگشتی بنام زوائد باب المعده ای Pyloric caeca قرار گرفته اند که در هضم می توانندنقش موثری داشته باشند. مواد غذایی از سوی معده از طریق یک دریچه یک طرفه به نام پیلور وارد روده شده تا به کمک آنزیم های آن هضم بیشتری بر روی مواد غذایی انجام پذیرد. بعلاوه آب ، املاح و ویتامین ها نیز از طریق جداره روده جذب می گردند. بقیه مواد باقیمانده سپس بصورت مدفوع از مخرج ماهی دفع می شود(Ali,2000) .
غدد گوارشی مانند ، کبد ، کیسه صفرا و پانکراس نقش بسزایی در هضم مواد غذایی دارند. کبد بعلت داشتن اندازه بزرگ و همچنین بافتی نرم براحتی قابل شناسایی می باشد. رنگ این غده از قرمز تیره تا قهوه ایی روشن متفاوت است. در کنار کبد، کیسه صفرا قرار گرفته است که مایع سبز رنگی به نام صفرا را تولید می نماید. عمل اصلی این مایع ، تاثیر بر روی مواد چربی و شکستن مولکول های چربی می باشد. پانکراس در آزاد ماهیان بصورت غدد پراکنده در میان زوائد باب المعده ای ظاهر می گردد . پانکراس با تولید آنزیم های گوناگون به هضم مواد غذایی کمک کرده ، بعلاوه با ترشح هورمون انسولین در کنترل قند خون نقش موثری دارد (Pannell and barton , 1996) .
1-1-3- برخی ویژگی های ماهی قزلآلایرنگینکمان "Oncorhynchus mykiss"
قزل آلای رنگین کمان جز ماهیان پرورشی است که از اواخر قرن نوزدهم میلادی اهلی شد و به صورت قابل مصرف و قابل عرضه به بازار، پرورش داده شده است. اکنون ماهی قزل آلا اساس یک صنعت در حال توسعه را تشکیل می دهد و اهمیت آن بویژه در کشورهایی که قادر به تدارک شرایط و مهیا کردن محیط آب شیرین یا شور برای پرورش آن هستند، در حال افزایش است. این ماهی نخستین ماهی (گونه) از خانواده آزاد ماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان اهلی و پرورش داده شد. در حال حاضر، این ماهی سهم با ارزشی در تامین غذای انسان دارد. علت این امر فقط به دلیل ارزش غذایی بالای این ماهی و کمیاب و گران شدن ماهیان وحشی که از طبیعت صید می شوند، نیست. بلکه بخاطر وجود چربی های اشباع نشده ای هستند که در این ماهی یافت می شوند (فرزانفر، 1384).
جنسهای این خانواده در آب های سرد با اکسیژن فراوان زندگی می کنند که توسط انسان به اقصی نقاط
دنیا برده شد. به خاطر خاصیت سازگاری زیاد آن، هماکنون در بیشتر آب های شیرین که دارای دمای مناسب جهت رشد این گونه هستند، حضور دارد و گونه پرورشی بیشتر مزارع پرورش ماهیان سردآبی دنیا و تقریباً صددرصد مزارع پرورش ماهیان سردآبی ایران را به خود اختصاص میدهد (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-4- پراکنش ماهی قزل آلا در جهان و ایران
محدوده زیستگاه اصلی ماهی قزل آلای رنگین کمان شمال غرب آمریکاست و از رودخانه Kuskokwim در آلاسکا آغاز شده و به سمت جنوب ادامه می یابد و با عبور از بخش British Clombia به منطقه Baja در کالیفرنیا می رسد. در سواحل شرقی انشعاب اصلی در رودخانه Peace در ایالت British Clombia و Athabasca (در آلبرتا) نیز وجود دارد. جمعیتی از این ماهی نیز به صورت بومی در استان Chihuahua در کشور مکزیک وجود دارند. سرعت رشد نژاد مهاجر پولادسر (که به دریا مهاجرت میکند) بیشتر است. ماهیان نژاد مهاجر عموماً از نژاد غیر مهاجر که تمام دوره زندگی خود را در رودخانه سپری می کنند بزرگترند؛ اما بزرگترین ماهیان قزل آلای رنگین کمان را می توان در دریاچه های آب شیرین یافت (مشائی، 1386)این ماهی
در حوضه خزر، دجله ،کارون، نمک، کویر، زاینده رود، تجن (خراسان) و کرمان پراکنش دارد (هدایتی فرد،1382). همچنین در رودخانه پارک ملی گلستان در مناطقی با دمای کمتر از 20 درجه سانتی گراد مشاهده می گردد (عبدلی،1389).قدمت پرورش آن در ایران نیز به چند دهه قبل، یعنی سال 1338 هجری شمسی مربوط می شود (نفیسی بهابادی، 1385).
1-1-5- بررسی آماری تولیدات پرورشی ماهی قزل آلا
براساس سالنامه آماری سازمان خواربار جهانی ملل متحد (FAO) که در سال 2012 منتشر نمود، میزان کل تولید آبزیان پرورشی در سال 2010، بالغ بر 6/63 میلیون تن بوده است.
نرخ رشد صنعت پرورش آبزیان طی سالهای 1960 الی 2009 برابر 2/3 درصد بود در حالیکه طی مدت مشابه نرخ رشد افزایش جمعیت معادل 7/1 درصد بوده است . میزان تولید ماهیان خانواده آزاد ماهیان در سال 2001 برابر 1785121 تن گزارش شده است که این گونه ها در سال 2010 به مقدار 2411136 تن افزایش یافت. بر اساس گزارش در همین منبع میزان پرورش آبزیان در ایران در سال 2010 برابر 220034 تن می باشد که رتبه 14پرورش آبزیان را بین کشورهای جهان دارا می باشد .
آمار ارائه شده در آمارنامه سازمان شیلات ایران میزان تولیدحاصل از آبزی پروری را در سال 1389 معادل 251374 تن و در سال 1379 معادل 66000 تن گزارش نموده است .طی ده سال اخیر، روند صعودی میزان تولید ماهی قزل‌آلای رنگین کمان در ایران پیشرفت بسیار قابل توجهی داشته است. بطوریکه میزان تولید سالانه این ماهی در سال 1379، از مقـدار 9000 تـن، به مـرز 91519 تـن در سـال 1389 رسـیده است. که معادل 8/3 درصد تولیدات ماهیان سردآبی جهان است (FAO,2012).

شکل(1-1) ماهی قزل آلای رنگین کمان " Oncorhynchus mykiss"
1-2- پروبیوتیک چیست؟
واژه پروبیوتیک، واژه ای یونانی و به معنای "برای زندگی" می باشد (Chukeatirote, 2003). پروبیوتیک نخستین بار توسط Lilly & Stillwell (1965) برای برخی مواد مترشحه بوسیله میکروارگانیسم ها بکار گرفته شد که موجب تحریک رشد سایر میکروارگانیسم ها می شوند. بنابر این، ترکیبات اخیر از لحاظ تاثیر می توانند کاملاً در برابر آنتی بیوتیک ها یا مواد پاد زیست، قرار گیرند. با این وجود، بکارگیری این واژه بدین شکل تداوم نیافت و Sperti (1971) از این واژه تحت عنوان عصاره ی بافتی که موجب تحریک رشد میکروبی می شوند، یاد نمود.
تحقیق Metchinkoff (1907) در آغاز قرن بیستم را می توان نخستین تحقیق انجام شده در زمینه پروبیوتیک ها دانست. وی تاثیر مصرف ماست را مورد بررسی قرار داد و متوجه تأثیر این ماده غذایی روی طول عمر کشاورزان بلغاری شد. در واقع او اصول دستکاری میکروفلور روده را درک نموده بود و این موضوع را این گونه شرح داد: "میکروب هایی که با هدف بهبود سلامتی خورده می شوند". همین تعریف، بعدها توسط Parker (1974) اینگونه اصلاح شد: "موجودات و موادی که در تعادل میکروبی روده تأثیرگذارند".
Fuller (1989) نیز تعریف Parker را اینگونه اصلاح نمود: "مکمل های غذایی حاوی میکروب های زنده که از طریق تعادل میکروفلور روده اثرات مفیدی بر سلامت میزبان می گذارد"، این تعریف امروزه بیشتر متعارف است. اجزای اصلی این تعریف منعکس کننده لزوم زنده بودن میکروارگانیسم و استفاده آن به صورت مکمل غذایی برای میزبان است و ابهامی را که با بکاربردن اصطلاح "مواد" ایجاد می شد را از بین می برد. "اثر بر روی تعادل میکروبی روده" که در تعریف اخیر اشاره شد، در تحقیقات انجام شده کمتر مورد توجه قرار گرفته است. Tannock(1997) به این نکته توجه نمود و این تعریف را به این صورت پیشنهاد کرد: "سلول های میکروبی زنده که با هدف بهبود سلامتی، به صورت مکمل های غذایی بکار می روند".
بسیاری از محققین تعریف Fuller را مورد تجزیه و تحلیل بیشتری قرار داده و تعاریف کامل تری را ارئه نمودند. بعنوان نمونه، Gatesoupe (1999) پروبیوتیک ها را اینگونه تعریف نمود: "سلول های میکروبی که به طریقی وارد دستگاه گوارش می شوند و زنده می مانند تا سلامتی را در میزبان ایجاد نمایند". Gram و همکاران (1999) نیز پیشنهاد کردند که "پروبیوتیک هر نوع مکمل میکروبی زنده است که از طریق بهبود تعادل میکروبی بر میزبان تأثیر مثبت می گذارد". همچنین، Salminen و همکاران (1999) تعریف پروبیوتیک را این گونه ارائه کردند: "پروبیوتیک ها فرآورده هایی از سلول های میکروبی یا اجزایی از سلول های میکروبی هستند که اثرات مفیدی روی سلامت میزبان دارند". در این تعریف لزوم زنده بودن سلول های مرتبط با تغذیه نادیده گرفته شد.
روشن است که اختلافات زیادی در درک واقعی اصطلاح "پروبیوتیک" وجود دارد. از آنجا که پروبیوتیک ها در آبزی پروری هم استفاده می شوند، تعاریف بایستی اصلاح شوند. در جانوران آبزی نه تنها دستگاه گوارش مهم است، بلکه آب محیط پرورش هم دارای اهمیت می باشد (Gomez-Gil et al., 2000).
به طور خلاصه می توان پروبیوتیک را اینگونه تعریف نمود: "پروبیوتیک ها باکتری های بی ضرری هستند که به سلامت جانور میزبان کمک می کنند و بطور مستقیم یا غیر مستقیم، میزبان را در بر ابر عوامل بیماریزای باکتریایی محافظت می نمایند" ( Irianto et al.,2000).
1-2-1- ضرورت استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری
در سیستم های متراکم تولید تخم و لارو، آب با روش های گوناگونی مانند فیلتر کردن تصفیه می شود و با این کار عده ای از باکتری ها از سیستم خارج می شوند که این عمل ممکن است تعادل بین جمعیت میکروب ها را از بین ببرد یا سبب تکثیر باکتری های فرصت طلب گردد و یا باعث توسعه جمعیت باکتری های پیش بینی نشده شود. بنابراین برای کنترل میکروبی سیستم، روش های بهتری مورد نیاز است (Olafsen, 1998).
در طی دوره انکوباسیون یا پرورش لارو، میان کنش های متفاوتی بین باکتری ها و سطوح روده جاندار ممکن است رخ دهد که احتمالاً منجر به تشکیل میکروفلور بومی در موجود می گردد و یا زمینه ساز بروز عفونت می گردد. از این رو برای موفقیت در تولید متراکم و انبوه استفاده از روش هایی برای تقویت سیستم های دفاع طبیعی جاندار ضروری بنظر می رسد ( Olafsen, 1998). از دیگر کاربردهای پروبیوتیک بهبود تعادل میکروبی روده و در نتیجه بهبود جذب غذا می باشد (Parker, 1974 ; Fuller, 1989).
در سیستم های آبزی پروری، میکروب ها از اهمیت ویژه ای برخوردار بوده و بر عملکرد رشد اثرات ویژه ای نشان می دهند. علت این امر تا حدی مربوط به ارتباط مستقیم بیماری ها و کیفیت آب، با عوامل میکروبی است. اخیراً در آبزی پروری بمنظور حفظ شرایط اکولوژیک، از پروبیوتیک به جای آنتی بیوتیک استفاده می شود و تکنیک انتقال باکتری به لارو ضروری است (Skjermo & Vadstein, 1999). احتمالاً در فرایند . بمنظور استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، در نظر گرفتن الزاماتی نظیر وجود باکتری با کیفیت مناسب بعنوان پروبیوتیک هاضمه دوکفه ای ها، باکتری ها آنزیم های خارج سلولی همانند پروتئاز و لیپاز تولید کرده و فاکتورهای لازم را برای رشد فراهم می آورند. همچنین احتمالاً باکتری ها در تغذیه بی مهرگان دریایی و ماهی ها نیز نقش دارند (Olafsen, 1998). این گونه باکتری ها با تولید مواد سلولی یا میکرونوترینت هایی شبیه اسیدهای چرب ضروری (Ringo et al.,1995)، ویتامین ها ( Sugita et al.,1998)، مواد معدنی یا حتی آنزیم ها به تغذیه کمک می نمایند.
حضور باکتری های اسید لاکتیک در دستگاه گوارش دلیلی بر وجود تخمیر در روده می باشد، این باکتری ها روی هیدرات های کربن پیچیده همچون نشاسته و سلولز تاثیر گذاشته و آنها را به ترکیبات ساده تر تبدیل می کنند تا جذب و سنتز ویتامین های خانواده B و ویتامین K در لوله گوارش صورت گیرد (Hansen & Olafsen, 1999). در اکوسیستم های آبی ارتباط بین میکروارگانیسم ها و دیگر واحدهای زنده و همچنین جریان مداوم آب، میان دستگاه گوارش ماهیان و بی مهرگان، همه بر روی میکروفلور بومی تاثیر می گذارد(Olafsen, 1998). ایجاد کلنی های پروبیوتیک در امعا و احشا احتمالاً در اثر مصرف آن از محیط آبی اطراف می باشد که سبب تعدیل فلور امعا و احشا میشود و باعث بهبود رشد و بقای لاروها میگردد.
این امکان وجود دارد که پروبیوتیک ها همانند یک ماده فعال کننده مکانیسم های دفاعی عمل نمایند ( Raa, 1996). باکتری های پروبیوتیک هوازی با مصرف اکسیژن، شرایط لوله گوارش را برای عوامل بیماریزا هوازی سخت می نمایند و برای آنها محدودیت ایجاد می نمایند و از رشد آنها جلوگیری می کنند. همچنین از لحاظ فضا و غذا نیز با آنها رقابت می کنند. در این میان تعدادی از پروبیوتیک ها اجباراً از بین میروند.
در واقع استفاده از پروبیوتیک ها در آبزی پروری، باعث کاهش سطح ترکیبات آنتی میکروبیال (بویژه آنتی بیوتیک ها) بکار رفته، افزایش میزان اشتها و یا مقدار رشد گونه های پرورش یافته می شود)
Irianto & Austin, 2002)). شاید بتوان مهمترین ویژگی پروبیوتیک ها را در این دانست که ضمن کاهش بیماری و بهبود ضریب تبدیل غذایی در دام و طیور، هیچ باقیمانده ای در بافت ها نداشته و بر خلاف پادزیست ها مقاومت میکروبی ایجاد نمی نمایند. مطمئناً، پروبیوتیک ها نبایستی برای میزبان ضرر داشته باشند (Salminen et al., 1999) و آنها غیر بیماریزا و غیر سمی بوده و می توانند موجب پیشگیری از بروز اثرات جانبی نامناسب باشند. آنها بایستی در یک محدوده دمائی و دامنه شوری مشخصی مؤثر باشند ((Fuller, 1989 .
1-2-2- خطرات مصرف آنتی بیوتیک ها
امروزه درمان با مداخله میکروارگانیسم ها به چند دلیل مورد توجه می باشد (رنجبرو میرنژاد، 1380; Rengpipat et al., 1998):
درمان با آنتی بیوتیک بطور موفقیت آمیزی برای کل عوامل عفونی مثمر ثمر واقع نشده است، اگرچه بدون شک بعضی از مسائل را حل نموده ولی بعضاً خود مساله ساز بوده است.
درمان با آنتی بیوتیک وضعیت فلور معمولی محافظت کننده بدن را بر هم می زند و موجود را نسبت به سایر عفونت های فرصت طلب مستعد می نماید و موجب افزایش نگرانی و ترس از ایجاد سویه های میکروبی مقاوم به آنتی بیوتیک در اثر استعمال گسترده آن شده است. با استفاده از آنتی بیوتیک های مشابه، سویه های میکروبی نسبت به آنها مقاومت پیدا می کنند و به سرعت رشد یافته و تکامل می یابند.
1-2-3- نحوه عمل پروبیوتیک ها
1-2-3-1- تولید ترکیبات ممانعت کننده (Inhibitory Component)
باکتری های پروبیوتیکی ترکیبات شیمیایی مختلفی تولید می کنند، که موجب از بین رفتن سایر باکتری ها و یا توقف فعالیت آنها می گردد (Verschuere et al., 1999). به نظر می رسد تولید مواد ممانعت کننده می تواند در داخل و یا سطح روده و حتی در محیط پرورشی، به عنوان سدی موجب جلوگیری از رشد و نمو عوامل بیماری های فرصت طلب گردد. معمولاً اثر ضد باکتریایی باکتری ها می تواند بعلت تولید برخی از عوامل زیر به تنهایی و یا بصورت ترکیبی باشد: تولید آنتی بیوتیک ها ) Williams & Vickers, 1986)، باکتریوسین ها (Bruno & Montville, 1993 و Boyd et al., 1984)، سیدروفورها ( Pybus et al., 1994،
Yoshida et al., 2002 و Braun, & Braun, 2002)، لیزوزیم ها، پروتئازها، هیدروژن پراکساید ها و یا تغییر میزان pH از طریق تولید اسیدهای آلی (Sugita et al., 1997 و Ringo & Gatesoupe, 1998)، دی اکسید کربن (Gill, 2003). تعدادی ازمحققین ترکیباتی کشف و مشاهده نموده اند. بعنوان نمونه، Nair و همکاران (1985) نشان دادند که تعداد قابل توجهی از باکتری های دریایی، آنزیم های باکتریولیتیک علیه باکتری Vibrio parahaemolyticus تولید می کنند. همچنین،Imad و همکاران (1985)، Alteromonas SB-10-31 را از نواحی نزدیک ساحل دریای ژاپن جداسازی نمودند. آنها نشان دادند که این باکتری قادر است یک پروتئاز آلکالینی ممانعت کننده که موناستاتین نامیده می شود، تولید کند. در آزمایش فعالیت ممانعت کنندگی موناستاتین علیه پروتئاز بدست آمده از Aeromonas hydrophila و پروتئاز تیول بدست آمده از Vibrio anguillarum، به اثبات رسید (هر دو باکتری مذکور عوامل بیماریزای ماهی هستند) (Verschuere et al., 1999).
1-2-3-2- رقابت بر سر مکان های اتصال
موجودات پروبیوتیکی برای مکان های اتصال و غذا در سطح مخاطی روده رقابت می کنند و در نتیجه از تشکیل کلونی باکتری های بیماریزا پیشگیری می کنند ( Vanbelle et al., 1990). قدرت اتصال باکتری های پروبیوتیکی ظاهراً طی مرحله سکون رشد بیشتر از مرحله رشد لگاریتمی است (Vine et al., 2004). اتصال ممکن است غیراختصاصی، بر پایه فاکتورهای فیزیکوشیمیایی و یا اختصاصی باشد. محل اتصال می تواند در بر گیرنده مولکول های چسبیده به سطح باکتری های متصل به روده و یا مولکول های گیرنده روی سطح سلول های مخاطی روده باشد (Salminen 1996). توانایی پروبیوتیک ها برای چسبیدن به موکوس روده احتمالاً می تواند ایجاد عفونت روده را توسط برخی از عوامل بیماریزا متوقف می کند. البته اتصال پروبیوتیک ها به دیواره روده یا سایر بافت ها لزوماً نشان دهنده رقابت بر سر مکان های اتصال به عنوان تنها روش عملی اثر پروبیوتیک ها نیست. این نکته که باکتری ها قادر به تشکیل کلونی، مثلاً در دیواره روده ماهی، هستند و نقش حفاظتی شان از طریق ترشح ترکیبات ممانعت کننده اعمال می نمایند، کاملاً پذیرفته شده است (Verschuere et al., 2000). توانایی اتصال و رشد در سطح روده یا درون موکوس خارجی در شرایط آزمایشگاهی در مورد برخی عوامل بیماریزا در ماهی از قبیلV. anguillarum وA. hydrophila ( Krovacek et al., 1987 ; Garcýa de la Banda et al., 1992) و همچنین برای پروبیوتیک های مانند Carnobacterium SK1 و بسیاری از پروبیوتیک های تخلیص شده نشان داده شده است. همچنین نقش ممانعت کنندگی برایV. anguillarum ( Olsson et al., 1992) نیز به اثبات رسیده است. در یکی از این مطالعات، هدف ارزیابی توانایی سویه های پروبیوتیکی در اتصال یا رشد در موکوس روده ای در شرایط آزمایشگاهی بوده تا پتانسیل آنها در تشکیل کلونی در توربوت پرورشی، به عنوان روشی برای پیشگیری از عفونت میزبان باV. anguillarum بررسی گردد (Olsson et al., 1992).
1-2-3-3- رقابت جهت جذب و مصرف مواد مغذی
پروبیوتیک ها از مواد مغذی که توسط میکروب های بیماریزا مصرف می شوند، استفاده می کنند و در نتیجه محیط را از مواد غذایی مورد نیاز برای سایر میکروارگانیسم ها تهیه می نمایند و موجب بروز مشکلاتی برای رشد آنها می شوند .در تئوری، رقابت بر سر مواد مغذی می تواند نقش مهمی در ترکیب توده زنده میکروبی روده یا محیط زیست موجودات آبزی پرورشی، ایفا نماید.(Ringo & Gatesoupe, 1998). اما تاکنون مطالعات جامعی در این زمینه انجام نگرفته است. از اینرو بکارگیری صحیح و بجای اصل رقابت بر سر مواد مغذی در شرایط طبیعی کاری آسان نبوده و وظیفه اصلی اکولوژیست های میکروبی است (Verschuere et al., 1999).
Verschuere و همکاران (1999) سویه های مختلف باکتریایی را که اثر مثبتی بر روی بقاء و رشد آرتمیای جوان داشتند، انتخاب نمودند. آزمایش های آنتاگونیستی در شرایط in vitro و آزمایشات فیلتری نشان داد که هیچ ترکیب ممانعت کننده خارج سلولی در عمل حفاظتی این سویه ها علیهVibrio  proteolytics CW8T2 شرکت نداشته اند. اما سلول های زنده این سویه در حفاظت آرتمیا در برابر عامل بیماریزا ضروری بنظر می رسند یافته های اخیر بر این نکته اشاره دارند که باکتری های انتخاب شده عمل حفاظتی شان را از طریق رقابت با عامل بیماریزا بر سر دسترسی به مواد مغذی و انرژی اعمال می کنند.
1-2-4- معیارها و روشهای انتخاب پروبیوتیک
نخستین و مهمترین هدف ازکاربرد پروبیوتیک ها، حفظ یا ایجاد مجدد رابطه مطلوب بین میکروارگانیسم های بیماریزا و مفید است که فلور موکوس پوست و روده ماهی را تشکیل می دهند. بنابراین یک پروبیوتیک مناسب بایستی برخی خصوصیات خاصی که اثر مثبت آن را تأیید نماید، داشته باشد( Ali, 2000).
اکثر مطالعات انجام گرفته در زمینه اثر پروبیوتیک ها بر جانوران آبزی پرورشی بر کاهش مرگ و میر و بالعکس، افزایش بقاء (Moriarty, 1998 ; Skjermo & Vadstein, 1999 Chang & Liu, 2002 ; ; Irianto & Austin, 2002)، افزایش مقاومت در برابر بیماری (Gatesoupe, 1994)، توانایی چسبندگی و تشکیل کلونی در روده ( Joborn et al., 1997)، توانایی کاهش تعداد سلول های باکتریایی در کلیه، تولید پلی آمین ها و فعالیت آنزیم های گوارشی (Tovar et al., 2002) و تکامل سیستم ایمنی غیر اختصاصی توسط سیستم های داخل سلولی، مثلاً افزایش فاگوسیتوز و فعالیت های لیزوزیمی ( ;Irianto, & Austin, Panigrahi et al., 2004 ; Gullian et al., 2004) بوده است. اثر مثبت پروبیوتیک ها برمیزبان نظیر، سم زدایی از ترکیبات مضر موجود در غذا و بهبود مواد مغذی آن، تجزیه کردن اجزای غیر قابل هضم موجود در جیره غذایی توسط آنزیم های هیدرولیتیک من جمله آمیلاز و پروتئاز، تولید ویتامین ها مثل بیوتین و B12، تولید ترکیباتی که آنتاگونیست عوامل بیماریزا هستند و در نهایت تحریک سیستم ایمنی میزبان تاکنون گزارش شده اند. روشن است که یک پروبیوتیک مفروض می تواند بیش از یک پاسخ حفاظتی را در میزبان القا نماید. همچنین پروبیوتیک های مختلف می توانند اثرات جداگانه و مشخصی را بر میزبان بگذارندIrianto, 2002) Austin &). دوام پروبیوتیک ها در دستگاه گوارش می تواند منعکس کننده شرایط سن و بهداشت و سلامتی ماهی باشد. مثلاً تجویز پروبیوتیک ها درماهیان جوان، در هنگام انجام اولین مراحل تغذیه و در ماهیان بزرگتر پس از مصرف آنتی بیوتیک ممکن است منجر به تشکیل کلونی بلندمدت از باکتری های پروبیوتیکی در دستگاه گوارش گردد. روش های انتخاب باکتری پروبیوتیکی برای استفاده در پرورش موجودات آبزی شامل مراحل زیر می باشد (Gomez-Gil et al., 2000):
1-2-4-1- جمع آوری اطلاعات زمینه ای
پیش از انجام فعالیت های تحقیقاتی در زمینه توسعه پروبیوتیک ها، در مورد فعالیت های پرورشی و توسعه اقتصادی مزارع پرورشی هم باید بررسی شود. مروری بر مقالات علمی در دسترس و اطلاعات گسترده مربوط به نحوه پرورش در مزارع پرورشی هم باید انجام شود تا تعیین گردد که آیا استفاده از پروبیوتیک میسر است یا خیر؟ وضعیت محیط زنده و غیر زنده اشغال شده توسط موجودات پرورشی با تأکید بر میکروب های موجود و ارتباط بین میکروب های محیط و ظرفیت نگهداری میکروب نیز از جمله مواردی است که بایستی مورد بررسی واقع گردد (Verschuere et al. 2000).
1-2-4-2- تهیه پروبیوتیک

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

تهیه یک پروبیوتیک مناسب از اهمیت ویژه ای بر خوردار است. ضروریست برای سویه های به کار گرفته شده در فرآورده های پروبیوتیک با مصرف خوراکی ، مقاومت در برابر آنزیم های دستگاه گوارش و دهان از مهمترین معیارهای انتخاب و گزینش می باشد ( مطلبی و همکاران ، 1389).
1-2-4-3- ارزیابی توان پروبیوتیک در جهت خارج سازی سویه های بیماریزا
با استفاده از آزمایش های in vitro توانایی سویه های جداسازی شده را می توان ارزیابی نمود(Gram et al.,2001).
1-2-4-4- ارزیابی امکان بیماریزایی پروبیوتیک
پیش از استفاده از یک باکتری به عنوان پروبیوتیک، لازم است که عدم بیماریزایی آن در میزبان تأیید شود. بنابراین موجودات پرورشی بایستی به همراه پروبیوتیک انتخاب شده، تحت شرایط نرمال و استرس مورد آزمایش قرار گیرند. این کار را می توان با تزریق یا غوطه وری میزبان در سوسپانسیون پروبیوتیک انتخاب شده، یا افزودن پروبیوتیک به محیط پرورشی، انجام داد (Gomez-Gil et al., 2000).
1-2-4-5- ارزیابی اثر پروبیوتیک بر میزبان
اثر پروبیوتیک انتخاب شده بایستی به صورت in vivo هم آزمایش شود. وقتی اثر پروبیوتیک به صورت مصرف در غذا در نظر گرفته شود، پروبیوتیک های انتخاب شده را می توان به محیط پرورش گونه آبزی مورد نظر افزوده و اثرشان را بر رشد و باز ماندگی ارزیابی نمود. اگرچه هنگامیکه کنترل زیستی توده میکروبی مورد نظر است، به نظر می رسد آزمایش های in vivo ابزاری مناسب جهت ارزیابی اثر بالقوه پروبیوتیک انتخاب شده بر میزبان باشد(Kesarcodi-Watson et al., 2008).
پروبیوتیک را می توان به روش های مختلف به میزبان یا محیط اطرافش اضافه نمود:
-اضافه کردن به جیره غذایی (Irianto & Austin, 2002)
-افزودن به آب پرورش (Verschuere et al., 2000)
-غوطه وری ( Austin et al. 1995)
-اضافه کردن از طریق غذای زنده (Gomez-Gil et al. 1998 ;Dhert et al. 1990 ; Robles et al. 1998)
1-2-4-6- تولید انبوه، ارزیابی سود اقتصادی
این مرحله، آخرین مرحله انتخاب پروبیوتیک است. آزمایشات اولیه بایستی در محیط یک سالن تفریخ در مزارع پرورشی انجام شود تا اثرات اقتصادی کاربرد پروبیوتیک مورد ارزیابی واقع گردد. فاکتور مهم در ارزیابی اقتصادی، امکان تولید انبوه یک پروبیوتیک است. همچنین، ممکن است قوانین محدودکننده ای در مورد کاربرد آنها در یک کشور وضع شده باشد. از اینرو بایستی پیش از آنکه کاربردهای تجاری در این خصوص آغاز شود، به آنها توجه بیشتری معطوف گردد. در پایان بایستی تعیین شود که آیا پروبیوتیک ها را می توان در عمل بکار برد یا خیر؟ بر اساس تعریف Fuller (1987)، یک پروبیوتیک بایستی برای میزبان سودمند باشد، قادر باشد در دستگاه گوارش باقی بماند، قابلیت تولید به صورت تجاری را داشته باشد، یعنی در سطح وسیع رشد کند و تولید آن اقتصادی بوده و در شرایط طولانی مدت در انبار و مزرعه، پایدار و مؤثر بماند.
به طور خلاصه، انتخاب باکتری های پروبیوتیکی یک فرایند تجربی مبتنی بر شواهد علمی محدود بوده است. بسیاری از تجارب ناموفق در زﻣﻴﻨﺔ تحقیقات در خصوص پروبیوتیک ها را می توان به انتخاب میکروارگانیسم های نامناسب نسبت داد. توسعه پروبیوتیک های قابل استفاده در کاربردهای تجاری در آبزی پروری یک فرایند چند جانبه و چند مرحله ای است، که نیازمند تحقیقات بنیادی و تجربی بوده و نیز مستلزم انجام آزمایشات در مقیاس وسیع و ارزیابی اقتصادی کاربرد آن است. لازم است که مراحل انتخاب برای میزبان های مختلف و محیط های متفاوت تغییر و اصلاح گردند((Verschuere, et al., 2000
1-3- سیستم ایمنی در ماهیان
اختلاف عمده موجود در سیستم ایمنی از نظر تشریحی بین ماهی و پستانداران، فقدان مغز استخوان و گره های لنفاوی در ماهیان است. تیموس، کلیه و طحال بافت های اصلی لنفوییدی در ماهیان استخوانی حقیقی اند. در حالی که تیموس در ماهی یک اندام لنفوییدی اولیه به حساب می آید ، اندام های لنفوییدی ثانویه تنوع قابل توجهی را نشان می دهند. بافت های لنفوییدی اغلب در اندام هایی تشکیل می شوند که جریان سینوزوییدی داشته و سلول های لنفوییدی در آنها جمع شده و به حضور آنتی ژن ها پاسخ دهند. این اندام ها در ماهیان عبارت اند از : کلیه و طحال. کبد پوست و روده نیز از اجزا مهم سیستم های دفاعی ماهیان هستند. کلیه ، طحال و کبد اندام های اصلی و پاکسازی کننده محسوب می شوند ، بطوریکه سلول های اندوتلیال و ماکروفاژها آنها به شدت نسبت به مواد خودی و غیر خودی که باید از گردش خون حذف شوند ، خاصیت آندوسیتوز دارند (سلطانی، 1387).
مهم ترین اندام ها و بافت های سیستم ایمنی ماهیان شامل تیموس، آبشش ها، پوست، کلیه اندام اپی گونال، خون، طحال، بافت مننژی، فلس ها، کبد، اجسام غاری شکل، قلب گره های لنفاوی یا اندام لیدیگ دیواره مری، مجرای گوارشی و ترشحات موکوسی و صفراوی می باشد. ایمنی در ماهیان به دو صورت اختصاصی و غیر اختصاصی تظاهر می یابد (سلطانی، 1387).
1-3-1- ایمنی غیر اختصاصی
سیستم ایمنی غیر اختصاصی، ماهی را به طیف وسیعی از عوامل بیماریزا مصون می سازد و علت مقاومت
یک فرد به یک عامل خاص بیماریزا نیز همین سیستم دفاعی می باشد (جلالی جعفری، 1377). امروزه تحقیقات در زمینه نحوه عملکرد سیستم ایمنی غیر اختصاصی ماهیان و تولید جمعیت های مقاوم به انواع عوامل بیماریزا متمرکز شده است (Galindo-Villegas & Hosokawa, 2004). دفاع غیر اختصاصی بر پایه گیرنده هایی است که الگوهای مولکولی خاصی را شناسایی می کنند. این مولکول ها در سلول های میکروبی (باکتری ها، قارچ ها و ویروس ها) وجود دارند. اما در خود میزبان دیده می شوند و هر مولکول نا آشنایی که باعث بیان ژن گیرنده خود شود محکوم به مرگ خواهد بود. سیستم ایمنی غیر اختصاصی پاسخ های سازشی را سبب شده و در حفظ هموستازی بدن شرکت می کند (Magnadottir, 2006). علاوه بر این، در القا سیستم ایمنی اکتسابی نیز شرکت دارد که از طریق تولید واسطه های خاصی در سلول ها مواجه شده با عامل خارجی صورت می گیرد (Jones, et al., 1993).
مهم ترین اجزا و سیستم ایمنی غیر اختصاصی شامل موارد زیر می باشند (جلالی جعفری،1377 و Magnadottir, 2006):
عوامل فیزیکی: شامل فلس ها، موکوس و پوست است. موکوس علاوه بر به دام اندازی و ریزش و تجدید شدن، واجد لستین، پنتراکسین، لیزوزیم، پروتئین های خنثی کننده و ایمونوگلبولین ها نیز می باشد.
عوامل سلولی: نظیر سلول های فاگوسیتوزی (گرانولوسیت ها، مونوسیت ها و ماکروفاژها) هستند. که به دو دسته ثابت (مثل سلول های موجود در بافت لنفوئیدی دستگاه گوارش) و متحرک (ماکروفاژها، نوتروفیل ها،...) تقسیم می شوند.
عوامل خونی: این تقسیم بندی به دلیل ویژگی های شناسایی عوامل نا آشنا یا نحوه عملکرد آنها می باشد. ترانسفرین از طریق رقابت برای آهن (جذب سطحی) مانع رشد باکتری ها می گردد. انترفرون نیز پروتئین ضد ویروسی است. آنزیم های پروتئازی ممانعت کننده نیز در مایعات بدنی ماهیان شناسایی شده اند.
1-3-1-1- ایمنی غیر اختصاصی ( ترکیبات مایع)
ساز و کارهای ایمنی مایعات بدن در ماهیان نقش مهمی در همه مراحل رفع یک عفونت دارند. دفاع غیر اختصاصی مایعات بدن ماهی شامل پروتئازها ، لیزین ها و آگلوتینین های موجود در ترشحات موکوسی ، به عنوان اولین خط دفاعی عمل می کنند. در حالی که سلول های پوشش مخاطی دومین سد دفاعی در برابر تهاجم میکروارگانیسم ها محسوب می شوند.
مواد گوناگون ضد میکروبی مانند تریپسین، لیزوزیم، آگلوتینین ها، عامل مکمل، پروتئین فاز حاد و دیگر عوامل لیز کننده در سرم و در موکوس پوست، آبشش ها و روده از جمله عواملی بوده که به عنوان اولین خط دفاعی در ماهی عمل کرده و مانع از چسبیدن و تثبیت میکروارگانیسم ها بر سطوح پوششی خارجی (پوست و آبشش ها) و داخلی (مجرای گوارشی) می شوند. این مواد به طور غیر اختصاصی از رشد و تکثیر عوامل عفونی بیماریزا مثل باکتری ها، قارچ ها، انگل ها و ویروس ها جلوگیری می کنند. این ترکیبات اغلب از نوع پروتئینی یا گلیکوپروتئین بوده و ترکیبات مشابه آنها و یا پیش ساز آنها نیز در همولنف بی مهرگان وجود دارد (سلطانی ، 1387).
1-3-1-1-1- لیزوزیم
لیزوزیم نقش مهمی برای مواجهه با عوامل بیماریزای عفونی در ماهیان ایفا می کند.در ماهیان لیزوزیم اغلب در بافت های غنی از گلبول های سفید مانند قسمت قدامی کلیه و بافت های پوست ، آبشش و دستگاه گوارش یافت می شود (سلطانی، 1387).لیزوزیم یک نوع واکنش ایمنی غیر اختصاصی است که توسط گلبول های سفید منتشر و در بافت های مختلف و خون ترشح می شود. (سلطانی، 1387؛ Sakai, 1999).
1-3-1-1-2- سیستم عامل مکمل (کمپلمان) در ماهیان
کمپلمان به صورت یک سیستم پروتئینی سرمی است، که عمل همولیز با واسطه ایمنی را انجام میدهد، و فعالیتهای بیولوژیکی متنوعی را نیز انجام میدهد( سلطانی، 1387).
سیستم کمپلمان نقش کلیدی در ایمنی ذاتی و اکتسابی و هشدار دادن به سیستم ایمنی میزبان در رابطه با حضور عوامل بیماریزا و برداشتن ان مانع (عامل بیماریزا) بازی می کند (Boshra and Sunyer, 2006 ; Sunyer and Lambris, 1999; Gasque, 2004 ).
1-3-1-2- ایمنی غیر اختصاصی (سلولی)
واکنش های التهابی و واکنش های ناشی از فعالیت گرانولوسیت ها ، مونوسیت ها و لنفوسیت ها ساز و کارهای دفاع غیر اختصاصی سلولی را در ماهیان تشکیل می دهند که در پاسخ به شرایط مختلفی مانند عفونت های باکتریایی ، ویروسی ، قارچی ، تک یاخته ای و انگلی به وقوع می پیوندند. (سلطانی، 1387).
سلول های فاگوسیت کننده ماهیان شامل نوتروفیل ها ، ماکروفاژها ، لنفوسیت ها ، منوسیت ها، ترومبوسیت ها ، بازوفیل ها و ائوزینوفیل ها می باشند که بیشترین نقش را ماکروفاژها و بعد نوتروفیل ها بر عهده دارند(سلطانی، 1387).
1-3-1-2-1- لنفوسیت ها
این سلول ها از سلول های مهم ایمنی می باشند و عبارت اند از : سلول های B که در اندام های مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید در کبد و سلول های T در تیموس تمایز می یابند (سلطانی ، 1387).معمولاً تعداد لنفوسیت ها در خون ماهی ، به استثنای گلبول های قرمز از سایر سلول ها بیشتر و در حالات مختلف ماهی و به خصوص در هنگام بیماری ها تفاوت دارد (ستاری، 1381).
1-3-1-2-2- نوتروفیل ها
اکثر ماهیان دارای این نوع سلول می باشند. این نوع سلول ها در ماهیان بیشترین گلبول های سفید چند هسته ای را تشکیل می دهند. (Stoskopf, 1993).
وظیفه نوتروفیل ها دفاع علیه عفونت های باکتریایی است. در اثر تحریکات تورمی به جریان خون مهاجرت
و در مرحله حاد تورمی به نواحی صدمه دیده تورمی نفوذ می کنند. این سلول ها به باکتری به صورت بیگانه خوار حمله نموده توسط فاگوزوم های داخلی آنها کشته و هضم می گردند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-1-2-3- ائوزینوفیل ها
ائوزینوفیل ها از نظر اندازه مشابه نوتروفیل ها یا به مقدار جزئی کوچکتر از آنها هستند. (Stoskopf, 1993). گرانول ها به صورت پراکنده در سلول وجود دارند و اندازه و شکل آنها در گونه های مختلف و گاهی در بین سویه های مختلف یک گونه نیز متغیر است. قدرت بیگانه خواری آنها در مقایسه با نوتروفیل ها محدود تر است (Stoskopf, 1993).
1-3-1-2-4- مونوسیت ها
کمترین تعداد گلبول های سفید متعلق به مونوسیت ها می باشد و تعداد آنها حداکثر 2 درصد در ماهیان گزارش شده است (Kumar and Tembhre, 1998). در ماهیان مونوسیت های خونی عمل ماکروفاژی دارند. (تاکاشیما و هایبیا، 1994). مواد خارجی که توسط این سلولها گرفته می شوند، با آنزیم های هیدرولیتیک لیزوزیم های آنها کشته شده و سپس هضم می شوند. این سلول ها به عنوان سلول های خنثی کننده آنتی ژن نیز عمل می کنند (تاکاشیما و هایبیا، 1994).
1-3-2- ایمنی اختصاصی
بطور کلی اساس سیستم ایمنی اختصاصی بر این است که ماهیان را بطور انفرادی قادر به بقاء و حفظ تعادل داخلی خودشان در محیط می نماید. اندام هایی که در ایجاد واکنش دفاع اختصاصی نقش دارند شامل بخش قدامی کلیه، طحال و تیموس است (جلالی جعفری، 1377). سیستم ایمنی اختصاصی از نظر سرعت عمل کند بوده و در مراحل ابتدایی زندگی موجود فعال نمی باشد ولی باعث ایجاد ایمنی برای دفعات بعدی مجاورت با عامل بیماریزا می گردد (Magnadottir, 2006). پاسخ های ایمنی اختصاصی بر اساس اجزاء شرکت کننده در پاسخ به دو گروه زیر تقسیم بندی می شوند (عسگری و همکاران، 1386 و Rotllant et al., 1997):
الف - پاسخ های ایمنی همورال: با واسطه ملکول هایی در خون شکل می گیرند که مسئول شناسایی اختصاصی آنتی ژن ها و انهدام آنها می باشند و همانگونه که قبلاً نیز اشاره شد آنتی بادی نام دارند؛ بروز این پاسخ ها با واسطه لنفوسیت های B انجام می گردد.
ب- پاسخ های ایمنی سلولار: با واسطه سلولی که با واسطه لنفوسیت های T ایجاد می گردد.
ایمنی ذاتی که به عنوان ایمنی طبیعی نیز در ماهیان شناخته می شود دارای دو جزئ اصلی ن شامل عوامل طبیعی و سلول های فاگوسیت کننده (ماکروفاژها) می باشند. از این میان عوامل بازدارنده فیزیکی و شیمیایی لیزوزیم ها، از اهمیت و جایگاه ویژه ای برخوردار بوده و به عنوان یکی از شاخص های استرس محسوب می گردند (Fast, et al., 2002).
1-3-2-1- ایمنی هومورال
1-3-2-1-1- ایمونوگلوبولین M(IgM)
ایمونوگلوبولین ها در ماهیان همگی جزو ماکروگلوبولین ها هستند. ماهیان ایمونوگلوبولین مشابه IgG جانوران عالی را نداشته یا کمی از آن را دارند. در ماهیان فاقد فک ایمونوگلوبولین تنها به میزان کمی وجود دارد و به خوبی شناسایی نشده اند. در ماهیان فکدار ایمونوگلوبولین از نوع IgM و دارای یک زنجیره سنگین مشابه μ پستانداران است. هر مولکول ایمونوگلوبولین در ماهیان استخوانی از نظر ساختمانی تترامر بوده و شامل دو ناحیه اتصال به آنتی ژن یعنی انتهای آمینی و ناحیه تاثیر گذار انتهایی کربوکسی است که در مجموع 4 زیر واحد مونومری را تشکیل می دهد (سلطانی، 1387).
ایمونوگلوبولین ها دارای وظایف و عملکرد های مهمی هستند که از آن جمله می توان به موارد ذیل اشاره نمود:
1.خنثی سازی2. رسوب و آگلوتیناسیون و 3.خاصیت اپسونیزاسیون (فعالیت عامل مکمل در طی فاگوسیتوز توسط نوتروفیل ها و ماکروفاژها)فعال کردن عامل مکمل (سلطانی، 1387).
1-3-2-2- ایمنی با واسطه سلولی
لنفوسیت ها به طور واضح مسئول هر دو نوع پاسخ ایمنی اختصاصی هومورال و با واسطه سلولی اند. دو نوع از لنفوسیت ها عبارت اند از : سلول های T که در تیموس تمایز می یابند و مسئول ایمنی با واسطه سلولی اند و سلول های B که در اندام های غیر از تیموس مانند بخش قدامی کلیه ، طحال و قسمت قدامی قلب و شاید کبد تولید و تمایز می یابند (سلطانی، 1387).
1-4- اهمیت مطالعات خون شناسی در ماهیان
شناخت فاکتورهای خونی علاوه بر شناخت فیزیولوژی آبزی شاخص مهم و منحصر به فرد هر گونه است که آن را از سایر ماهیان متمایز میکند. اهمیت این شناخت نه تنها در تشخیص گونه مهم است بلکه از نظر اقتصادی نیز می تواند در شناسایی بیماری ها و تعیین شرایط بهداشتی و سلامت ماهی مفید باشد (Bahmani et al., 2001; Abdel-Tawwab et al., 2005).
بافت خون شاخص مهمی برای وضعیت فیزیولوژیک اندام های بدن در تشخیص سلامت یا بیماری و کنترل روند زیستی موجودات زنده بوده و تجزیه وتحلیل شاخص های خونی راهنمای ارزشمندی در سنجش وضعیت زیستی آبزیان می باشد (بهمنی، 1377).
1-4-1- شاخص های خونی
1-4-1-1- گلبول های سفید(White Blood Cells = WBC) (لکوسیت)
تعداد این سلول ها بسیار کمتر از گلبول های قرمز است (مشایی،1386). گلبول های سفید در خون ماهیان به دو دسته تقسیم می شوند:
-گرانولوسیت (دانه دار بوده و هسته چند قسمتی دارند) شامل نوتروفیل یا هتروفیل، ائوزینوفیل و بازوفیل
-آگرانولوسیت (فاقد دانه بوده و هسته تک قسمتی دارند) شامل لنفوسیت و مونوسیت (ستاری، 1381).
هر یک اعمال حیاتی متنوعی را بر عهده دارند. گلبول های سفید در برابر عوامل گوناگون بیماریزا در بدن ماهی مقاومت ایجاد می‌کنند و پاسخ های ایمنی مختلفی بوجود می‌آورند. وظیفه اصلی این سلول ها تولید پادتن می‌باشد. مونوسیت‌ها، ماکروفاژها و گرانوسیت‌ها، وظیفه بیگانه خواری دارند، بعلاوه گرانولوسیت ها موادی برای از بین بردن باکتری ها ترشح می‌نمایند.
1-4-1-2- گلبول های قرمز (Red Blood Cells = RBC) (اریتروسیت، هموسیت)
سلولهای گلبول قرمز بیضی شکل بوده و در ماهیان مانند دوزیستان، خزندگان و پرندگان هسته دار هستند. جمعیت گلبول های قرمز در خون محیطی ماهیان را عمدتاً گلبول های قرمز بالغ تشکیل می دهد(تاکاشیما و هایبیا، 1994). تعداد آنها با افزایش سن کمتر و در فصل جفتگیری دوباره افزایش می یابد (وثوقی و مستجیر، 1388). گلبول های قرمز یا اریتروسیت ها بیشترین فراوانی را در بین سلول های خونی دارند (ستاری، 1381).
1-4-1-3- شاخص های گلبول قرمز یا اندیس های خونی
مهم ترین این شاخص ها عبارت اند از: متوسط حجم گلبول قرمز (MCV)، متوسط هموگلوبین گلبول قرمز (MCH) و متوسط غلظت هموگلوبین سلولی (MCHC) که از طریق روابط ریاضی ذیل محاسبه می شوند (Houston, 1990).
1-4-1-4- هماتوکریت
هنگامی که خون کامل دارای ماده ضد انعقاد، سانتریفوژ می شود، فضایی که توسط گلبول های قرمز فشرده شده اشغال می شود را هماتوکریت می گویند که به صورت درصد گلبول های قرمز خون نسبت به خون کامل بیان می شود. (عامری مهابادی، 1378).در صورت وجود عوامل بیماریزا در بدن یا بهم خوردن تعادل تراکم مواد معدنی در خون یا هر دو، میزان هماتوکریت متغیر خواهد بود. بعلاوه، حجم بسیار زیاد هماتوکریت نیز خود می‌تواند بیانگر احتمال وجود شرایط محیطی نامساعد همراه با استرس باشد (Parker, 1974).
1-4-1-5- هموگلوبین
هموگلوبین کروموپروتئینی است که جز اصلی گلبول قرمز را تشکیل می دهد. هر گرم هموگلوبین هنگامی که کاملاً اشباع شده باشد، 34/1 میلی لیتر اکسیژن حمل می کند (عامری مهابادی، 1378).
چندین نوع هموگلوبین مختلف ممکن است در یک ماهی وجود داشته باشد که احتمالاً برای سازگاری سیستم حمل گاز با شرایط متغیر است (کیوانی،1384).
1-5- شاخصهای بیوشیمیایی
1-5-1- پروتئین کل پلاسما و آلبومین
تقریبا بین 5 الی 10 درصد پلاسمای خون را پروتئین های خون تشکیل می دهند. اغلب پروتئین ها توسط کبد و برخی نیز مانند آنتی بادیها توسط سیستم ایمنی ساخته می شوند. اگر چه تغییر در میزان پروتئین کل پلاسمای خون به عنوان یک شاخص اختصاصی مطرح نمی باشد ولی می تواند بیانگر یک تغییر متابولیک و یا آسیب شناسی باشد( کاظمی و همکاران، 1389). آلبومین سرم فراوان ترین پروتئین پلاسما می باشد. آلبومین ها اساساً در کبد ساخته شده و از خارج شدن خون از رگهای خونی جلوگیری می کنند. (دانیال زاده و همکاران، 1385).توتال پروتئین شامل آلبومین و گلوبولین های سرمی است. این ترکیب مانند آلبومین در بیماریهای حاد و مزمن کبدی و کلیوی کاهش می یابد (Densmore, 2001). در ماهیان واجد عفونت این فاکتور نیز بصورت معنی داری نسبت به ماهیان فاقد عفونت کاهش داشته است (Austin, 1993)
1-5-2- گلوکز
گلوکز می تواند به عنوان یکی از شاخصهای مهم در تعیین وضعیت فیزیولوژیک ماهی بکار رود.با افزایش مصرف گلوکز ومتابولیت های دیگر در بعضی گونه ها ذخایر گلیکوژن چربی ها کاهش می یابد و احتمالا پروتئین ها برای تامین انرژی شکسته می شوند ( کاظمی و همکاران، 1389).
1-5-3- گلوتامیک پیرویک ترانس آمیناز (SGPT)=ALT
گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز (SGOT)AST=
دو آنزیم گلوتامیک پیرویت ترانس آمیناز) آلاتین آمینو ترانسقراز یا ALT) و گلوتامیک اکسالواستیک ترانس آمیناز(آسپارات آمینو ترانسفراز یا AST)، نقش بسیار مهمی در خنثی سازی عوامل سمی و نیز فعالیتهای متابولیکی کبد داشته و دو آنزیم کلیدی برای تعیین عملکرد کبد می باشند در عفونتهایی که آسیب کبدی را با خود به همراه دارند مقدار این آنزیم کاهش می یابد(Shariffi et a.l, 2001).
1-6- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارشی
در اکثر موارد، زمانی که صحبت از میکروارگانیسمها میشود، آنها موجوداتی مضر و زیانبار تصور میشوند. چنین تصوری نمیتواند صحیح باشد، چرا که تعداد باکتریهای غیربیماریزا بمراتب بیش از باکتریهای بیماریزا است و بسیاری از گونههای غیربیماریزای باکتریها نه تنها مفیدند، بلکه برای ادامه حیات ضروری هستند. یک دسته از این باکتریها سودمند، آنهایی هستند که در دستگاه گوارش حیوانات زندگی میکنند. این میکروارگانیسمها تحتتأثیر عوامل مختلفی قرار میگیرند (شکل 1-2).
تنشهای محیطی، نوع جیره غذایی، داروها، سموم شیمیایی و همچنین شرایط آب و هوایی از جمله عواملی هستند که بر رشد میکروفلور روده تأثیرگذارند (فولر، 1380).

شکل 1-2- رابطه عوامل محیطی و میکروفلور دستگاه گوارش (فولر، 1380)
طی سالهای اخیر با استفاده از مواد افزودنی در خوراک دام و طیور بشدت مورد توجه متخصصین تغذیه و دام واقع شده است، یکی از مهمترین افزودنیها محصولاتی است که به طور زنده مستقیم در جیره به مصرف میرسند و در تجارت به نام پروبیوتیک شناخته شدهاند.
1-7- با کتری های اسید لاکتیک (LAB)
باکتریهای اسید لاکتیک به باکتریهایی اطلاق می شود که قادرند از تخمیر قند تولید اسید لاکتیک کنند . پرو بیو تیکها یا باکتریهای سلامت بخش جزو همین نوع باکتری هستند. استفاده از باکتریهای اسید لاکتیک در تولید فرآورده های غذایی تخمیری به حدود 4000 سال پیش بر می گردد . به طوریکه عملا آنها در تولید فرآورده هایی چون ماست و پنیر بکار می رفته اند. تحقیقات نشان می دهد علاوه بر نقش مهار کننده بر باکتریهای غیر مفید روده ، در متابولیسم لاکتوز، کاهش مصرف آنتی بیوتیک، افزایش جذب عناصر و ویتامینها و افزایش رشد و ایمنی نقش دارند(کاظمی و قدس، 1389)
این باکتری گرم مثبت بوده و برای تغذیه نیاز به کربوهیدرات، اسیدهای آمینه، پپتید، مشتقات اسید نوکلئیک و ویتامینها دارند.درک بهتر از بسیاری از عوامل موثر بر سطح جمعیت اسید لاکتیک باکتری های موجود در دستگاه گوارش برای تجارت آبزی پروری ممکن است جالب باشد. استخراج این باکتری ها از جدار روده نسبت به اندامهای دیگر بهتر است چون در آنجا در اکثر ماهی ها، بیشتر از اندام های دیگر ماهی این باکتری ها (LAB) یافت می شوند. عواملی که بر (LAB) تاثیر گذار است شامل دما، شوری، استرس، نوع تغذیه و استفاده از انواع پروبیوتیک می باشد (Ringo and Gatesoupe, 1998).
1-7-1- رده بندی علمی lactobacillus plantarum
سلسله: Bacteria
تقسیمات Firmicutes :
کلاس: Bacilli
راسته : Lactobacillales lactobacillus plantarum
خانواده : Lactobacillaceae (Orla-yensen 1919)
جنس : lactobacillus 1923 Bergey,.et al ,
گونه: l.plantarum
Lactobacillus plantarumیک گونه از باکتری میله ایی هوازی اختیاری و گرم مثبت است که اغلب به صورت تکی وجود دارد. این باکتری در pH 3.5 دارای بیشترین رشد می باشد (Balcazar et al, 2008)
اسپور تولید نمی کنند، کاتالاز منفی و اکسیداز منفی می باشند، این باکتری از کربو هیدرات به عنوان منبع انرژی استفاده کرده و (به عنوان محصول منحصر به فرد متابولیسم تخمیر همولاکتیک و یا به عنوان محصول نهایی عمده تخمیر هترو لاکتیک) اسید لاکتیک تولید می کنند.

–313

1-6- پرسشهای تحقیقآیا دی اکسید تیتانیوم به صورت نانو ذرات میتواند خواص مکانیکی را در فیلمهای نشاسته تاپیوکا را افزایش دهد؟
آیا نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم بر خواص ممانعتی فیلمهای نشاسته تاپیوکا تاثیر دارند؟
آیا نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم بر خواص فیزیکوشیمیایی فیلمهای نشاسته تاپیوکا تاثیر دارند؟
آیا استفاده از نانو دی اکسید تیتانیوم بر پارامترهای رشد میکروبی اشرشیا کلی فیلمهای خوراکی نشاسته تاپیوکا را تاثیر دارند؟
1-7- محدودیتهای تحقیقدر این پژوهش حداکثر غلظت ترکیب نانو به عنوان یک محدود کننده مطرح میگردد. بیشتر از 5% ترکیب نانو باعث هتروژن نمودن فیلم میشد.
1-8- نمودار تحقیقشکل 1-1 نمودار تحقیق را برای این پژوهش نشان می دهد.

شکل 1- SEQ شکل_1- * ARABIC 1: نمودار فرآیند تحقیقفصل دوممروری بر پژوهشهای پیشین2-1- معرفی نشاسته و نشاسته تاپیوکا2-1-1- ترکیب و ساختار نشاستهنشاسته یک جزء غذایی عمده است و یک کربوهیدرات تجزیه پذیر که از هزاران واحد گلوکز ساخته شده است. نشاسته دربرگیرنده زنجیرههای خطی و شاخهدار مولکولهای گلوکز است که آمیلوز و آمیلو پکتین نامیده میشوند. آمیلوز که یک حالت خطی نشاسته است مسئول شکل گیری فیلمهای قوی است. پیوندهای فیزیکی در شبکه ماکرو مولکولی نشاسته بیشتر براساس آمیلوز هستند و بر خصوصیات مکانیکی فیلمها تاثیر میگذارند از سوی دیگر، ساختار شاخهدار آمیلو پکتین عموماً باعث ایجاد فیلمهایی میشود که شکننده هستند ] 36[.
نشاسته ترکیبی از دو پلیمر است آمیلوز، یک اتصال خطی (4→ 1 ) از glucan – D – α و آمیلوپکتین، یک مولکول پرشاخه که از شاخه های کوچک (4 → 1 ) glucan – D – α و پیوند α (6 → 1) در اتصالات تشکیل شده است. طول زنجیره آمیلوز حدود 6000 واحد D - گلوکو پیرانوز، با وزن مولکولی بین 600000 – 150000 دالتون است. آمیلو پکتین، بر عکس بسیار پر شاخه است به طور میانگین 26- 17 شاخه، با واحدهای D- گلوکوزیل جداشده از پیوندهای (6 → 1 ) α است. اندازهی مولکولی آمیلو پکتین بزرگتر از آن است که به طور دقیق مشخص شود ولی مطالعات پراکنش نور حدود 106 D – گلوکوزیل در هر مولکول را نشان داد که آمیلو پکتین را یکی از بزرگترین ماکرو مولکولهای موجود در طبیعت میکنند. همهی نشاستهها از این دو ترکیب ساخته شدهاند. نسبت آنها در نمونههای نشاسته معمولا 20 به 80 آمیلوز به آمیلو پکتین است ]6 و 8[.

شکل 2- SEQ شکل_2- * ARABIC 1: ساختمان شیمیایی نشاسته نشاسته که به وفور در طبیعت یافت میشود، به دلیل قیمت پائین، قابلیت تجدید شوندگی و بازیافت زیستی، یکی از مواد خام جذاب و مورد علاقه برای استفاده در بسته بندیهای خوراکی محسوب میگردد. علاوه بر این حساسیت زا نبوده و به دلیل دارا بودن ویژگیهای مکانیکی و مقاومت در برابر نفوذ گازها، امکان به کارگیری و استفاده از آن در صنایع غذایی وجود دارد ]1 و 3[.
نشاسته به دلیل ماهیت پلیمری قابلیت فیلم سازی دارد به علاوه، به دلیل قیمت مناسب و در دسترس بودن توجه زیادی به آن میشود یکی از معایب فیلمهای نشاسته، مقاومت پایین آنها به رطوبت است برای حل این مشکل میتوان از چربیها یا پلیمرهای زیست تخریب پذیر مقاوم به رطوبت استفاده کرد، برای بهبود ویژگیهای فیلمهای نشاسته به ویژه خصوصیات کششی آنها میتوان از هیدروکلوئیدها در ترکیب آنها استفاده کرد ]4[.
2-1-2- نشاسته تاپیوکاکاساوا مانیهوت اسکولنتا Manihot esculenta، یوکا یا مانیوت هم نامیده میشود گیاهی است چوبی از تیره فرفیون (خانواده فرفیون) بومی آمریکای جنوبی است که به طور گسترده به عنوان یک محصول هر ساله در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری برای  ریشه غده ای نشاسته ای آن کشت شده است که عمده ترین منبع کربوهیدرات هستند. آرد تولید شده از ریشه تاپیوکا نامیده میشود. کاساوا سومین منبع بزرگ کربوهیدرتها برای غذای انسان در جهان است. و محصولی کم هزینه برای جمعیت ساکن در مناطق مرطوب استوایی میباشد. شواهد مستقیم نشان می دهد که 1400 سال پیش کشت  کاساوا در السالوادور صورت گرفته است. نشاسته تاپیوکا نشات گرفته از منبع متفاوتی نسبت به نشاستههای رایج مانند غلات (برنج، ذرت)، غده ای (سیب زمینی )، ریشهای (تاپیوکا ) و (نخود و لوبیا) است نام مگذاری این گیاه تا حدی زیادی بستگی به منطقه ای که در آن رشد میکند دارد مانند ( آمریکای مرکزی (yucca anioca M یاMadioca در برزیل و Tapioca در هند و مالزی و در آفریقا و آسیای جنوبی Cassada یا Cassava) ]68 و 71[.
1120140204470
شکل 2- SEQ شکل_2- * ARABIC 2: ریشه کاساواجدول 2- SEQ جدول_2- * ARABIC 1: گیاه شناسی گیاه کاساواطبقه بندی علمی
رده دولپه ایها
راسته مالپیگیالس
خانواده تیره فرفیون
زیرخانواده کروتنوییده
نژاد مانیهوته
گونه اسکولنتا
نام علمی مانیهوت اسکولنتاکرانتز
2-1-2-1- مرفولوژی گیاه کاساوابوته کاساوا چوبی و چند ساله است که تا ارتفاع 2 تا 4 متر رشد می کند برگ ها به صورت توده ای در تاج درخت شبیه به برگ نخل گسترده و روی دمبرگ بلند و باریکی شامل 5 تا 9 پهنه به وجود می آیند آن ها فقط به سوی انتهای شاخه رشد می کنند. وقتی گیاه درحال رشد است.ساقه اصلی به سه شاخه تقسیم شده وبعد به همین ترتیب شاخه ها ی دیگری بر روی آن ها تشکیل می شود ریشه یا غده ها نیز در زیرسطح زمین توسعه می یابند. گل نر و ماده به صورت مجزا مرتب شده و به روی همان بوته تشکیل می شوند. شکل میوه سه گوش و حاوی سه دانه است که قابل دوام بوده و برای انتشار گیاه مورد استفاده قرار می گیرد. تعداد ریشه ها ی غده ای و ابعاد آن ها و تا حد زیاد ی در میان گونه های مختلف متفاوت است. ریشه ی کاساوا مخروطی وطویل است و با گوشت سفت همگن در پوسته ای قابل تفکیک که حدود یک میلی متر ضخامت دارد و با رنگ قهوه ای و درقسمت خارجی زبر می باشد گوشت غده می تواند سفید گچی یا زرد باشد. ممکن است اندازه ی طول ریشه از 30 تا 120 سانتی متر و قطر آن 4 تا 15 سانتی متر و وزن 1 تا 8 کیلوگرم یا بیشتر برسد. ترکیب شیمیایی ریشه های کاساوا متفاوت است مطالعهی 30گونه در مکزیک نتایجی به شرح ذیل در بر داشته است ریشه های آن بسیار غنی از نشاسته است و حاوی مقادیر قابل توجهی از کلسیم،فسفر و ویتامین ‏c‏ می باشد.ولی فقیر از پروتئین است. دربرگ این نوع گیاهان،منبع خوبی از پروتئین لیزین،اما کمبود اسید امینه احتمالا متیونین و تریپتوفان است ]22[.
جدول 2- SEQ جدول_2- * ARABIC 2: آنالیز ریشه کاساوا و سیب زمینی ] 68[.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

درصد کاساوا سیب زمینی
رطوبت 7/25 75/80
مواد نشاستهای 21/45 19/90
قندها 5/13 0/40
پروتئین 1/12 2/80
چربیها 0/41 0/20
فیبر 1/11 1/10
خاکستر 0/54 0/92
2-1-2-2- فرآوری و تبدیل کاساواعمر مفید کاساوا چند روز است و خواص ویژه خود را از دست می دهد اگر برگ های کاساوا دو هفته قبل از برداشت حذف شوند عمر مفید آن دو هفته طولانی تر می شود.قرار دادن ریشه در پارافین یا موم یا ذخیره کردن آن در کیسه پلاستیکی خطرات آن را کاهش داده و عمر مفید آن را به 3 تا 4 هفته افزایش می دهد ریشه پوست گیری شده را می توان منجمد کرد.روش سنتی عبارتست از بسته بتدی ریشه در مالچ مرطوب برای تمدید عمر مفید آن می باشد .ریشه های خشک را می توان کوبید و به آرد تبدیل کرد در خلال فرآیند کوبیدن ریشه،ذرت را می توان اضافه کرد تا پروتئین آرد افزوده شود. آرد کاساوا دارای ظرفیت نگهداری آب زیادی میباشد و از آن در تهیه پخت نان،کیک،کراکر و پودینگ استفاده میشود. بعضا آرد کاساوا با مشتقات جزیی ممکن است به عنوان جانشین آرد گندم در تهیه نان استفاده شود. نانی که بطور کامل از آرد کاساوا تهیه شده در امریکا به بازار عرضه شده و نیاز افراد دارای آلرژی به آرد گندم را برآورده کرده است. ریشه های تازه را میتوان به صورت قطعه های نازک کاملا سرخ کرده و محصولی مشابه چیپس سیب زمینی تهیه کرد.ریشه ها را میتوان پوست گیری رنده کرده و با آب شستشو داده و نشاسته را استخراج نمود و همچنین پروتئین برگ را میتوان به خوراک دام اضافه کرد. در افریقا فرآوری ریشه به چند روش مختلف صورت میگیرد. آن ها ممکن است برای اولین بار در آب تخمیر شده سپس آن ها را بوسیله آفتاب خشک کرده برای ذخیره سازی یا رنده نمودن آن سپس خمیر تهیه می نمایند و می پزند. نوشیدنی های الکلی را نیز میتوان از ریشه کاساوا تهیه نمود. برگهای جوان حساس می تواند به عنوان سبزیهای معطر خوراکی مورد استفاده قرار گیرد که حاوی سطوح بالایی از پروتئین می باشد. استفاده های صنعتی از کاساوا و فرآیند تبدیل آن در کارخانجات و تولید محصولاتی شامل کاغذسازی، پارچه،چسب، شربت فروکتوز، سوخت زیستی، خوراک دام وکیسه های زیست تخریب پذیر میباشد ]22 و 68[.

2-2- نانو تکنولوژی
علم نانو و علوم مرتبط با آن جدید نیستند چرا که صدها سال است شیمیدانان از تکنیک‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های علم نانو در کار خود استفاده می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌کنند. از پنجره های رنگارنگ کلیساهای قرون وسطی گرفته تا شمشیرهای یافت شده در حفاری های سرزمین های مسلمان همگی گویای این مطلب هستند که بشر مدت هاست که از برخی شگردهای این فناوری در بهینه کردن فرایندها و ساخت باکیفیت تر اشیاء بهره می برده است اما تنها به دلیل پیشرفت کم فناوری و نبود امکانات امروزی نتوانسته حوزه مشخصی برای این فناوری تعیین کند. اولین بار ریچارد فیمن در سال 1959 طی سخنرانی خود با بیان امکان به راه اندازی فرآیندی برای دستکاری اتمها و مولکولها با استفاده از ابزارهای دقیق سبب شده تا افکار به سمت توسعه چنین امکانی متمایل شوند. در سال 1974، پروفسور نوریو تانیگوشی، مدرس دانشگاه علوم توکیو، نخستین بار واژه "فناوری نانو" را بکار گرفت. او در پروژه - ریسرچای با نام "مفهوم اساسی فناوری نانو" اشاره می کند که فناوری نانو اساسا مجموعه ای از فرایندهای تفکیک، ادغام و تشکیل مواد در حد یک اتم یا یک مولکول است. در دهه 1980 این تعریف به طور وسیع تر توسط دکتر درکسلر (نویسنده کتاب های موتور خلقت) مورد بررسی قرار گرفت. فناوری نانو و نانوعلوم در اوایل دهه 1980 با تولد علم کلاستر آغاز به کار کرد. این توسعه سبب کشف فلورین در سال 1986 و نانولوله های کربنی در مدت چند سال بعد شد. مقیاس نانو، ابعادی کمتر ازnm 100 (معمولا nm 1/0 تا nm 100) را شامل می شود، که شامل موادی یا سطوح خارجی بسیار زیاد و ناهمگونی کم که پدیدههای کوانتومی بروز میدهند میباشد. علم نانو، مطالعه پدیدهها و خواص نوین مواد، در این مقیاس (در حد اتم ها و مولکولها ) میباشد. فناوری نانو، کاربرد دانش ، مهندسی و فناوری در مقیاس نانو در جهت تولید مواد و سیستمهایی است که وظایف خاص الکتریکی، مکانیکی، بیولوژیکی، شیمیایی یا محاسباتی را انجام میدهند. نانو تکنولوژی بر اساس ارائه خواص و عملکردهای نوینی از نانو ساختارها، دستگاه ها و سیستم ها به علت ساختار بسیار کوچک آنهاست. این دستگاه ها عموما کاربردهای بیولوژیکی و پزشکی دارند به طور کلی نانوتکنولوژی، فن آوری تغییر در خواص مولکولهای تشکیل دهنده مواد است. و به همین دلیل مقیاس نانو بهترین تعریف برای تکنولوژی میباشد ]88[.
2-3- بایو نانو تکنولوژی
نانو بایو تکنولوژی حوزه نوظهور علمی و فنی است که گرایش چند رشته ای از علوم (شیمی ، زیست شناسی، فیزیک، علم مواد) است. این حوزه از یک سو، به فعالیتهای همگام علم مواد و بیولوژی اشاره دارد و از سوی دیگر حد فاصل علم فیزیک و بیولوژی است. نانو بایوتکنولوژی با سیستمهایی در مقیاس نانو که با راهکار بالا به پائین ساخته شدهاند(خرد کردن واحدهای بزرگتر به اجزای کوچکتر ) یا از روش پائین به بالا برای سامان دادن اجزا بهره میبرند، سر کار دارند. نانو بایو تکنولوژی بیش از آنکه شاخه ای از بایوتکنولوژی باشد شاخه ای از نانو تکنولوژی است. بایوتکنولوژی از سازوارههای زنده در کاربردهای صنعتی مختلف است، ولی نانو بایوتکنولوژی استفاده از قابلیتهای نانوتکنولوژی در کاربردهای زیستی است. بنابراین واژه نانو بایوتکنولوژی نیز مانند واژههایی چون بیومکانیک و بیومتریال به استفاده از تکنولوژیهای مختلف، در کاربردهای زیستی اشاره دارد و نه به استفاده از قابلیتهای ارگانیزمهای حیاتی در کاربردهای مختلف صنعتی. نانو کامپوزیتها جایگزین خوبی برای بطریهای پلاستیکی نوشیدنیها هستند استفاده از پلاستیک برای ساخت بطری باعث فساد و تغییر طعم نوشیدنی میشوند، نانوکامپوزیتها میتوانند به عنوان مواد بسته بندی جدید استفاده شوند، یک مثال نانوکامپوزیتهای تشکیل شده از نشاسته سیب زمینی و کلسیم کربنات است، این فوم مقاومت خوبی به حرارت دارد، سبک و زیست تخریب پذیر است و میتواند برای بسته بندی مواد غذایی به کار رود. افزودن 5-3% از نانو خاک رس به ماده پلاستیک آن را سبک تر، قویتر و مقاومتر به حرارت می کند و خواص ممانعت کنندگی بهتر در برابر اکسیژن، دی اکسید کربن، رطوبت و مواد فرار دارد ]81[.
2-4- کامپوزیترشد فزاینده تکنولوژی در سال‌های اخیر باعث شد تا موادی که در دسترس بشر بود برای جامه حقیقت پوشاندن بر رویاهای مدرن کافی نباشد و از این رو تلاش برای رسیدن به مواد جدید آغاز شد. امروزه در بیشتر کاربردهای مهندسی، اغلب به تلفیق خواص مواد نیاز داریم. موادی که ضمن داشتن استحکام بالا، سبک باشند، مقاومت سایشی وجذب UV1خوبی داشته باشند که از جمله آن انواع کامپوزیت ها را می توان نام برد.
کامپوزیتها، ترکیبات ساخته شده از پلیمر و پر کننده آلی یا غیر آلی هستند. استفاده از پر کنندهای غیرآلی در ماتریکس پلیمر، استحکام و سفتی پلیمر را افزایش میدهد و تولید آنها به صورت بالقوه میتواند باعث بهبود ویژگیهای مکانیکی مواد بسته بندی و ظروف نشاستهای گردد.
کامپوزیت‌ها از دیدگاه زیستی به دو دسته کامپوزیت‌های طبیعی. مانند استخوان، ماهیچه، چوب و ...و کامپوزیت‌های مصنوعی(مهندسی) تقسیم میشود.کامپوزیت‌های سبز(کامپوزیت‌های زیست‌تجزیه‌پذیر)در اینگونه کامپوزیت‌ها، فاز زمینه و تقویت کننده، از موادی که در طبیعت تجزیه می‌شوند، ساخته می‌شوند. در کامپوزیت‌های سبز، معمولاً فاز زمینه از پلیمرهای سنتزی قابل جذب بیولوژیکی و تقویت کننده‌ها از فیبرهای گیاهی ساخته می‌شوند ] 88[.
2-5- تعریف نانو کامپوزیتفناوری نانو به دلیل تعامل نزدیکی که با سایر رشتههای علوم دارد به سرعت در حال گسترش است و در این علم پلیمر را نیز از مزایای خود بی بهره نگذاشته است. استفاده از فناوری نانو در زمینهی علم پلیمر به تولید پلیمرهای نانوکامپوزیت منجر شده است. نانوکامپوزیتها پلیمرهایی هستند که در آنها از ترکیبات آلی یا غیرآلی مختلفی که دارای اشکال مختلف صفحه ای، کروی و یا به صورت ذرات ریز بوده و اندازه ای در حد ابعاد نانو دارند به عنوان فیلر یا پرکننده استفاده میشود. فیلمهای حاصل از ترکیب نانو مواد و بیوپلیمرها و یا به اصطلاح نانو کامپوزیتهای بیوپلیمری خواص کاربردی مطلوبتری از خود نشان میدهند که مهمترین آنها افزایش مقاومت مکانیکی و کاهش نفوذپذیری نسبت به بخار آب میباشد. افزایش بازدارندگی در برابر نفوذ گازها، افزایش کارایی فیلم در استفاده به عنوان بسته بندی فعال، افزایش مقاومت حرارتی ماده بسته بندی و ایجاد شفافیت و بهبود خواص ظاهری فیلم از دیگر مزایای نانوکامپوزیتهای بیوپلیمری است ]6[.
2-6- تعریف بایو نانو کامپوزیتدر طول چند سال اخیر "بایونانوکامپوزیت" تبدیل به یک اصطلاح رایج برای تعیین نانوکامپوزیت ها که شامل پلیمرهای طبیعی در ترکیب با مواد معدنی هستند و نشان دهنده حداقل یک بعد در مقیاس نانومتر است ] 31 و 61[. که ویژگی های آنها در مقایسه با نانوکامپوزیت های مشتق شده از پلیمرهای سنتزی بسیار مطلوب تر است. علاوه بر این بایونانوکامپوزیت ها مزیت قابل توجه ای از زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری و بهبود ویژگی های عملکردی به وسیله ارائه بایولوژی یا بخش معدنی نشان دادند. موجودات زنده تولید کننده نانوکامپوزیت های طبیعی هستند که آرایش ترکیبی از ترکیبات آلی و معدنی در مقیاس نانو نشان میدهد ]32[.
در واقع بایونانوکامپوزیت ها نسل جدیدی از نانوکامپوزیتها هستند که شامل ترکیبی از بیوپلیمرها و مواد معدنی هستند که حداقل یکی از ابعاد آنها در مقیاس نانومتری باشد ] 63[. علاوه بر این، مواد بیوپلیمر به عنوان یک فن آوری سبز شناخته شده ]73[. و در صنایع دارویی، بسته بندی مواد غذایی و تکنولوژی های کشاورزی قابلیت تجزیه بیولوژیک و زیست سازگاری از خود نشان داده اند ]84[.
2-7- فلز تیتانیومبسیاری از مهندسین و طراحان هنوز تیتانیوم را فلزی گران و ناشناخته قلمداد می کنند اما پیشرفت های اخیری که در زمینه تولید این فلز صورت گرفته است نشان می دهد که تیتانیوم ماده ای بسیار فوق العاده برای استفاده های مهندسی است. تیتانیوم با عدد اتمی 22 و نماد Ti از عناصر گروه فلزات واسطه می باشد. نقطه ذوب 1668درجه سانتیگراد، نقطه جوش 3287 درجه سانتیگراد و وزن اتمی 88/47 دارد. یکی از ویژگی های مهم تیتانیوم چگالی پایین آن 506/4 گرم بر سانتیمتر مکعب می باشد. این ویژگی همراه با استحکام و مقاومت بالا در برابر خراشیدگی تیتانیوم را به فلزی ایده آل تبدیل کرده است. تیتانیوم عمدتاً در صنایع هوا فضا و همینطور در کارخانه ها و تجهیزات صنایع شیمیایی مورد استفاده قرار می گیرد. این فلز همچنین در ساخت عینک ها، مهندسی کنترل و فناوری پزشکی خصوصاً مواردی که حد تحمل بیولوژیک از اهمیت زیادی برخوردار است مورد استفاده قرار می گیرد. تیانیوم ماده ای غیر سمی حتی در مقادیر بالا می باشد. همچنین این ماده هیچ نقشی در سیستم طبیعی بدن انسان ایفا نمی کند. بطور تخمینی روزانه 8 میلی گرم تیتانیوم وارد بدن انسان می شود. اگر چه تقریباً بدون جذب شدن از بدن دفع میگردد ]2[.
2-7-1- نانو دی اکسید تیتانیومدی اکسید تیتانیوم در اندازه نانومتری یک فوتو کاتالیست ایده آل است که مهم ترین دلیل وجود این خاصیت در این ماده قابلیت جذب اشعه فرابنفش است. فوتون های فرابنفش بسیار پرانرژی هستند و در بیشتر موارد می توانند به سادگی باعث تخریب اجسام گردند. دی اکسید تیتانیوم با جذب اشعه فرابنفش و به واسطه خاصیت فوتوکاتالیستی خود می تواند پوششی ضد باکتری روی سطوح ایجاد کند و هم چنین مانع از عبور اشعه گردد. وجود همین خواص ویژه، نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم را تبدیل به گزینه ای مناسب برای استفاده در کرم های ضدآفتاب نموده است. حذف بوی نامطبوع و تجزیه سموم آلی و معدنی و میکروارگانیسم های مضر و بیماری زای موجود در آب و فاضلاب کاربرد عمده دیگر این ماده است. نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم خاصیت آب دوستی بالایی دارند ]2[.
2-8- فیلم های خوراکیتولید فیلمهای خوراکی از پلیمرهای طبیعی مورد توجه زیادی قرار گرفته است که به علت قابلیت خوراکی بودن و سازگاری زیستی این فیلمها است. آماده سازی این فیلمها شامل استفاده از دست کم یک عامل شکل دهنده فیلم، یک محلول و یک واسط میشود. ماکرو مولکولهای مورد استفاده عبارتند از پلی ساکاریدها، پروتئینها و لیپیدها هستند. بسیاری از منابع پلی ساکارید برای آماده سازی فیلمهای خوراکی همچون ریشه و نشاسته غلات و پکین وجود دارند. با این حال، نشاستهها بیشتر در مواد خام بهکار برده میشوند زیرا منابعی تجدیدپذیر هستند و ارزان هم هستند. نشاسته یک جزء غذایی عمده است و یک کربوهیدرات تجزیهپذیر که از هزاران واحد گلوکز ساخته شده است. نشاسته دربرگیرنده زنجیرههای خطی و شاخهدار مولکولهای گلوکز است که آمیلوز و آمیلوپکین نامیده میشوند. آمیلوز که یک حالت خطی نشاسته است مسئول شکلگیری فیلمهای قوی است. پیوندهای فیزیکی در شبکه ماکرومولکولی نشاسته بیشتر براساس آمیلوز هستند و بر خصوصیات مکانیکی فیلمها تاثیر میگذارند از سوی دیگر، ساختار شاخهدار آمیلو پکتین عموماً باعث ایجاد فیلمهایی میشود که شکننده هستند .فیلمهای بر پایه نشاسته خصوصیات فیزیکی شبیه پلیمرهای سنتزی دارند از جمله شفاف بودن، بدون بو، بدون مزه و نیمه نفوذپذیر به علاوه، آنها خصوصیات مانعی خوبی دارند ]51[.
2-9- پوشش ها و فیلم های خوراکیپوششهای خوراکی لایه نازکی از یک ماده خوراکی هستند که بر روی سطح ماده غذایی به عنوان پوشش و یا در لابلای اجزای تشکیلدهنده ماده غذایی از طریق پیچیدن، فروبری، برسزدن یا اسپری کردن قرار داده می‌شود تا مانعی در برابر عوامل مخرب از قبیل حضور گازهایی مانند اکسیژن و دی اکسید کربن، رطوبت و مواد معطر باشد تا به این ترتیب زمان ماندگاری ماده غذایی افزایش یابد. این مواد می‌توانند به صورت پوشش کامل محصول باشند و یا به عنوان یک جزء غذایی همراه غذا مصرف گردند. فیلمهای خوراکی از نظر نحوه تولید متفاوت از پوششهای خوراکی هستند. آنها قبل از کاربرد در بستهبندی مواد غذایی به صورت لایهای نازک تولید میشوند و سپس مانند پلیمرهای سنتزی برای بندی بکار میروند. کاربرد فیلمها و پوششهای خوراکی بدینمعنی نمیباشد که میتوانند برای افزایش زمان انبارمانی مواد غذایی جایگزین مواد بستهبندی غیرخوراکی و ساختگی گردند. پوششهای خوراکی در واقع ظرفیت افزایش کیفیت و ماندگاری غذا و بهبود بازده اقتصادی مواد را به عنوان یک ماده کمکی بستهبندی دارا میباشند ]47[.
فیلمهای حاصل از نانو مواد و بیوپلیمر ها یا به اصطلاح نانو کامپوزیت های بیوپلیمری خواص کاربردی مطلوب تری نشان می دهند که مهم ترین آنها افزایش مقاومت مکانیکی و کاهش نفوذ پذیری به بخار آب، افزایش بازدارندگی در برابر نفوذ گازها، افزایش کارائی فیلم به عنوان بسته بندی فعال، افزایش مقاومت گرمایی ماده بسته بندی و بهبود خواص ظاهری فیلم از دیگر مزایای نانوکامپوزیت های بیوپلیمری می باشد ]51[.
پوشش محصولات غذایی با فیلمهای خوراکی و پوششهای خوراکی، آنها را از مزایای گونا گون از نقطه نظر جنبههای سلامت بخش، حسی و اقتصادی برخوردار می سازد .برخی از مهمترین این مزایا به شرح زیر هستند: به سبب زیست کافت بودن، بر خلاف فیلم های سنتزی باعث آلودگی محیط زیست نمی شوند] 35[ ؛ خود، از ارزش تغذیه ای نیز برخوردار هستند ]21و 41[. ؛ مانع فساد و آلو دگی میکروبی می شوند ]77[. فساد و پلاسیدگی 2میوه ها و سبزی ها را طی انبارداری به تعویق می اندازند]62 و 26[. ظاهر یا جلوه غذا را به نحو مطلوب حفظ می کنند ]23و 96[ و مانع جذب رطوبت یا آبگیری مواد غذایی با رطوبت کم و تبعات منفی ناشی از آن همچون بدبافتی حاصل از تبلور قندها در فرآورده، بدرنگی وجلوگیری از کلوخه شدن پودرها می شوند ]61[ مانع ازدست رفتن رایحه غذا می شوند ]86[. مانع قهوه ای شدن آنزیمی و غیرآنزیمی مواد غذایی می شوند]26 و 39[. براستحکام و یکپارچگی بافت مواد غذایی می افزایند و از افت ترکیبات مغذی در اثر واکنش های ناخواسته همچون اکسایش و واکنش های قهوه ای شدن جلوگیری می کنند ] 39[. بدطعمی و بدرنگی و آثار سوء ناشی از آن ها را کاهش می دهند ]19، 26 و 95 [. مانع چکیدن یا تراو ش، درگوشت می شوند ] 39[. به عنوان حامل مواد افزودنی نظیر ترکیبات پادمیکروبی، پاداکسنده ها، مواد طعم دهنده ورنگ ها عمل می کنند]86[. مانع سبز شدن سطحی سیب زمینی در برابر نور می شوند ] 39[.و جذب بیش از حد روغن به بافت محصول و خروج بیش از حد آب از آن را طی سرخ کردن به طور چشمگیر کاهش می دهند ] 21 و 98[. زیست -کافت بودن (تجزیه پذیر بودن زیستی)، خوراکی بودن و کارآمد بودن فیلم های خوراکی سبب شده است که این فیلم ها به عنوان جایگزین های فیلم های سنتزی به طور وسیع مورد مطالعه، پژوهش و کاربرد قرار گیرند. کارآیی فیلم های خوراکی به شاخص های کیفی آن ها مربوط می شود. این شاخص ها نیز به نوبه خود از جنس فیلم و روش تولید آن اثر میپذیرند.
کاربرد فیلم های خوراکی در محصولات غذایی به سال های بسیار دور برمی گردد. چینی ها در قرن دوازدهم و سیزدهم میلادی مرکبات را با موم پوشش می دادند تا از افت وزن و کاهش رطوبت آنها جلوگیری شود. در قرن شانزدهم میلادی گوشت را با چربی پوشش می دادند تا از چروکیدگی آن جلوگیری شود. در همان زمان برای نگهداری گوشت گوشت و سایر مواد غذایی آنها را با فیلم های ژلاتین پوشش می دادند. یوبانوعی فیلم ترکیبی از چربی و پروتئین خوراکی است که از قرن پانزدهم در شرق آسیا به طور سنتی از شیر سویا تهیه می شده است. در قرن نوزدهم فندق و بادام را با ساکاروز پوشش می دادند تا از اکسید شدن و تندی آنها جلوگیری شود. از دهه 1930 تا کنون سطح میوه ها را با موم ها و امولسیون روغن در آب پوشش می دهند. طی 40 سال گذشته تحقیقات متعدی در زمینه تهیه، کاربرد و ویژگی های فیلم ها و پوشش های خوراکی انجام شده است. یکی از روش های تولید فیلم های تجزیه پذیر استفاده از بایو پلیمرهایی بر پایه نشاسته، پروتئین و سلولز است. ]53[.
2-10- بسته بندی فعال
تکنولوژی جدید در بسته بندی مواد غذایی در پاسخ به نیازهای مشتریان یا در راستای تولید صنعتی محصولات غذایی محافظت شده با روش های ملایم تر، تازه، لذیذ و راحت با عمر انباری زیاد و کیفیت کنترل شده توسعه می یابند. علاوه بر این تغییرات در نحوه توزیع(مثل جهانی سازی بازاردر نتیجه توزیع غذا در مسافت های طولانی) یا روش زندگی مصرف کنندگان ( بدلیل صرف زمان کمتر برای خرید غذای تازه از بازارو پخت و پز) مهمترین چالش ها در زمینه صنعت بسته بندی می باشد و به عنوان نیروی پیش برنده در جهت توسعه مفاهیم جدید بسته بندی و بهبود یافته می باشند که میزان مدت زمان نگهداری را افزایش داده در حالیکه موجب حفظ ایمنی و کیفیت مواد غذایی شده و آن را تحت نظارت دارد. در بسته بندی فعال به بسته بندی اجازه داده می شود تا با غذا و محیط اطرافش واکنش متقابل داشته باشد و نقش دینامیکی در نگهداری ماده غذایی بازی نماید.
بسته بندی فعال به صورت زیر تعریف می شود:
"در بسته بندی فعال شرایط حاکم بر غذای بسته بندی شده را به نحوی تغییر می دهد تا مدت زمان نگهداری آن را افزایش داده و ایمنی و خصوصیات حسی غذا را بهبود بخشیده در حالیکه کیفیت غذای بسته بندی شده را حفظ می نماید"یا" بسته بندی فعال به عنوان زیر مجموعه ای از بسته بندی هوشمند طبقه بندی می شود و به شرکت افزودنی های خاص در فیلم های بسته بندی یا در داخل بسته با فرض نگهداری و افزایش عمر انبار مانی اطلاق میشود".
بسته بندی فعال می تواند نقش های متعددی را داشته باشد که در بسته بندی های رایج وجود ندارد. این نقش ها عبارتنداز: فالیت ضدمیکروبی، گرفتن اکسیژن، رطوبت و اتیلن (ویژگی اسکاونجری)، رهاکردن مواد طعمی و یا اتانول ] 2[.
2-11- بسته بندی نانو
یکی از کاربردهای تجاری نانوتکنولوژی در بخش غذایی بسته بندی است. پیشگوئی شده است که در 25% بسته بندی های غذایی در دهه آینده از نانوتکنولوژی استفاده میشود. هدف اصلی در بسته بندی نانو افزایش عمر ماندگاری به وسیله بهبود عملکرد مانع در کاهش گاز، تبادل رطوبت و پرتو نور UV است. بالغ بر 90 درصد بسته بندی نانو بر اساس نانو کامپوزیت است که بهبود دهنده عوامل حامل در لفاف های پلاستیکی برای مواد غذایی و بطری های پلاستیکی برای نوشیدنی های غیر الکلی و آبمیوه است.
بسته بندی نانو می تواند خصوصیات ضدمیکروبی، آنتی اکسیدانی و گسترش مدت ماندگاری و غیره داشته باشد.
به طور کلی کاربردهای فناوری نانو در بسته بندی و حفاظت از محصولات را می توان به صورت زیر خلاصه کرد:
-نانوکامپوزیت های مغناطیسی مورد استفاده در حسگرهای برچسبی.
-نانوکامپوزیت های پلیمری کلی(خاک رس) برای بهبود ویژگی های عایقی.
-پلاستیک های جدید برای استفاده در بطری ها با خواص عایق در برابراشعه UVو نفوذ گازها.
-برچسب های RFID .
-نفوذ ذرات پرکننده پلیمرها.
-نانو بارکدها و برچسب ها جهت بسته بندی و محافظت مقادیر کم.
-ارتقای دوام و قابلیت استفاده و بسته بندی پلاستیک ها.
-روکش های با نانو کامپوزیت های پلیمری و نانو الیافی.
-نانومواد افزودنی برای بهبود عملکرد (استحکام، مقاوم به آب، جذب، رسانایی و ...).
-کاغذ و یا پلاستیک های با قابلیت حسگرها.
-نانوکدهای ساخته شده از مواد کاغذی و یا پلاستیکها برای شناسایی و تأیید اهداف بسته بندی هوشمند ]88[.
2-12- بسته بندی ضد میکروبیسیستم بستهبندی است که قادر به بازداری از فساد و جلوگیری از رشد میکرو ارگانیسمهای بیماریزایی که آلودهکننده مواد غذایی هستند، میباشد. میتوان از طریق افزودن مواد ضدمیکروبی در سیستم بستهبندی و یا به کارگیری پلیمرهای ضدمیکروبی که نیازمندیهای بستهبندی مورد رضایت مصرف کننده را تامین کند، به عملکرد ضدمیکروبی جدیدی دست یافت. هنگامیکه سیستم بستهبندی فعالیت ضدمیکروبی را القا میکند، سیستم بستهبندی یا مواد بسته بندی بوسیله افزایش دوره تاخیری و کاهش سرعت رشد و یا کاهش تعداد میکرو ارگانیسمهای زنده، رشد میکروبی را محدود میکند و یا از رشد میکروبی جلوگیری میکند ]7[.
2-12-1- انواع بسته بندی های ضد میکروبی
بسته بندیهای ضد میکروبی را میتوان به انواع زیر طبقهبندی کرد :
قرار دادن کیسههای کوچک (ساچت) حاوی مواد ضدمیکروبی فرار در داخل بستهبندی
وارد کردن مستقیم مواد ضد میکروبی و غیر فرّار در داخل پلیمر بستهبندی
پوششدادن یا جذب سطحی ماده ضدمیکروبی بر روی سطح پلیمر بستهبندی
بی تحرککردن مواد ضد میکروبی بر روی پلیمر توسط پیوندهای کووالانسی
استفاده از پلیمرهایی که به صورت ذاتی ویژگی ضدمیکروبی دارند ]5[.
2-12-2- مزایای استفاده از بسته بندی های ضد میکروبیدر بستهبندیهای ضد میکروبی انتشار مواد ضد میکروبی از ماتریکس پلیمر به سطح ماده غذایی به صورت آهسته و در زمان طولانی انجام میگیرد و در نتیجه برای مدت طولانی غلظت زیادی از ماده ضدمیکروب در سطح فرآورده وجود خواهد داشت. مواد ضدمیکروبی از طریق کاهش سرعت رشد و طولانی کردن فاز تاخیری میکروارگانیسمها و یا غیر فعال کردن و نابودی میکروبها باعث افزایش ماندگاری فرآورده غذایی میشود ]5[.
2-12-3- معایب استفاده از بسته بندی های ضد میکروبیماده ضد میکروبی به سرعت از سطح ماده غذایی به داخل آن نفوذ میکند (منتشر میشود ) و در نتیجه خاصیت ضد میکروبی در سطح کاهش مییابد. مواد ضد میکروبی باقی مانده در تماس با مواد فعال موجود در سطح خنثی میشوند و میکروبهای آسیب دیده ممکن است دوباره فعال گردند. برای مثال ثابت شده است که امولیسفایرها و اسیدهای چرب با نایسین واکنش داده و خواص آن را کاهش میدهند ]5[.
2-13- پلاستی سایزرهافیلم ها و پوشش های خوراکی نیاز به کشش خوب و انعطاف پذیری، شکنندگی پایین، چقرمگی بالا برای جلوگیری از ترک خوردن در طول حمل و نقل و ذخیره سازی دارند بنابراین پلاستیسایزرها با وزن مولکولی پایین برای تغییر انعطاف پذیری فیلم های خوراکی به آنها افزوده میشود. سایز کوچک، قطبیت بالا گروههای قطبی در مولکول و فاصله بیشتر گروههای قطبی در مولکولهای پلایستسایزر سبب افزایش اثرات آن بر روی پلیمرها میگردد. در واقع عملکرد آنها اینگونه است که با افزایش حجم آزاد یا کاهش جاذبه ذرات بین زنجیره های پلیمری مجاور سبب کاهش پیوند هیدروژنی بین زنجیره های پلیمر میگردد ]89[. بیشترین پلاستیسایزرهای استفاده شده پروپیلن گلایکول ]97[، گلیسرول ]89[، سوربیتول ]44[، الیگوساکارید ]20[، و آب هستند. در نهایت به این نتیجه میرسیم که افزودن پلاستیسایزرها سبب تغییرات قابل توجه ای در خواص مانعی از فیلم ها به عنوان مثال افزایش نفوذپذی فیلم به گازها، کاهش توانایی فیلم در جذب آب و کاهش استحکام کش ] 34و 38[. به عنوان یک قانون کلی می توان بیان نمود:با افزایش پلاس سایزرها به فیلم های غذایی، قابلیت نفوذ پذیری تا حد قابل توجهی افزایش یافته و باعث پیوند هیدروژنی بین زنجیرههای پلیمری کاهش یافته و در عین حال حجم مولکولی افزایش می یابد که منجر به افزایش قابلیت انعطاف پذیری فیلم میشود ]87[.
تالجا و همکاران (2007)، اعلام کرده اند که گلیسرول به منظور نرم کنندگی به فرمولاسیون فیلم افزوده می شود. پلاستیسایزرها تحرک زنجیره های پلیمر را با پرکردن فضاهای خالی بین شبکه پلیمر، افزایش می دهند و نیروهای پیوندی درون مولکولی کاهش یافته، شکنندگی کم، آبدوستیو قابلیت انتقال گاز و بخار آب زیاد می شود ]92[.
بنابه گزارش ( گیلبرت و همکاران، 1996)، افزودن پلاستیسایزر با کاهش پیوندهای درون مولکولی بین زنجیره های پلیمر، خواص فیلم را اصلاح کره و WVP را افزایش می دهد. علیرغم این یافته فیلم های دارای فروکتوز و سوربیتولWVP کمتری را نسبت به فیلم های بدون پلاستیسایزر نشان دادند. از آنجائیکه فیلم های بدون پلاستیسایزر بسیار شکننده اند، این امکان وجود دارد که منافذ بسیار ریزی داشته باشند که سرعت انتقال بخار آب را افزایش دهند ]37[.
2-14- روشهای تولید فیلمبه طورکلی فیلمهای خوراکی از محلول ها یا دیسپرسیون های ترکیبات فیلمساز پدید می آیند ]50[. اجزای اصلی فیلم سازی را میتوان به سه بخش شامل حلال، پلیمر و نرم کننده (پلاستیسایزر) تقسیم کرد. پلاستیسایزرها همچون پلیمرها باید محلول در حلال و نیز با آنها قابل امتزاج باشند ]70[. تولید فیلم مستلزم وجود دست کم یک ترکیب پلیمری است که قادر به ایجاد ساختار شبکهای با استحکام و پیوستگی کافی باشد ]69[. در ارتباط با تولید فیلم های خوراکی نکات و ظرایف فراوانی وجود دارند که هر یک بر خواص نهایی فیلم های تولید شده اثر قابل ملاحظه دارند. از جمله آنها می توان به اثر عواملی نظیر جنس و غلظت پلیمر فیلم ساز، PHمحلول لفاف ساز، دما، زمان، قدرت یونی محلول فیلم ساز، نوع و مقدار افزودنی های مورد استفاده، فشار، نوع ترکیب بندی فیلم از نظر ساده و یا مرکب بودن و مخلوط یا لایه ای بودن (قرار گیری دو یا چند لایه مجزا روی یکدیگریا مخلوط شدن اجزاء)، جزئیات مربوط به خواص شیمیایی هر یک از اجزای فیلم ساز، حضور الکترولیت ها و روش تولید فیلم اشاره داشت ]54[. تولید این فیلم ها را می توان در دو قسمت شامل تشکیل فیلم به صورت مجزا و تشکیل فیلم به طور مستقیم بر سطح غذا مورد بررسی قرار داد. در حالت نخست، ابتدا فیلم ساخته شده و سپس بر سطح ماده غذایی پوشش داده میشود، حال آن که در حالت دوم تشکیل فیلم و پوشش دهی آن بر سطح غذا در یک مرحله صورت میگیرد. هر یک از روش های بالا که مورد استفاده قرار گیرند، نخستین مرحله در تولید فیلم، تهیه محلول فیلم ساز است. این محلول، حلال، پلیمر فیلم ساز و افزودنی ها را شامل می شود. در شیوه تشکیل مجزای فیلم، محلول فیلم ساز پس از تهیه شدن با یکی از روش های لایه سازی گسترانده و خشکمی شود. فیلم حاصل با روش های روکش دادن بر سطح ماده غذایی پوشش داده می شود. معادل این شیوه ها در روش پوشش دهی مستقیم فیلم بر غذا، شیوه های افشانی، لایه سازی، برس زنی، غرقابی یا غوطه وری و پوشش دهی با بستر سیال را شامل میشود ]48[.
2-15- ارزیابی خواص فیلم های خوراکی2-15-1- خواص ممانعتی خواص ممانعتی فیلمهای خوراکی به گازها/ بخارات در صنعت غذا، در شرایطی که جلوگیری از پدیدههای نامطلوبی نظیر از دست رفتن رایحه، جذب بوهای نامطلوب از محیط، از دست رفتن رطوبت غذا و جذب رطوبت از اتمسفر به غذاهای خشک مطرح باشد، از اهمیت فراوان برخوردار است ]30[. به طور کلی فیلم های خوراکی به دلیل آبدوست بودن، از خواص ممانعتی مطلوب به O2 و CO2 به ویژه در رطوبت نسبی پائین برخوردارند. عوامل محیطی دما و رطوبت نسبی در میزان تراوایی این فیلمها مؤثرند ] 12[. زیاد بودن رطوبت در مواد غذایی باعث واکنش های شیمیایی و آنزیمی مخرب و زایل شدن بافت آنها میشود. به طور کلی خواص ممانعتی فیلمهای زیست پلیمری به رطوبت به دلیل خاصیت آبدوستی آنها، برخلاف خواص ممانعتی به اکسیژن و سایرگازها، ضعیف است ]13[. ممانعت به عبور بخار آب با شاخص "تراوائی بخار آب =WVP، سرعت گذر بخار آب = WVTR
و ممانعت به عبور اکسیژن با شاخص" تراوائی اکسیژن =OP " یا " سرعت گذر اکسیژن = OTR " سنجیده میشود ] 14[ .
OTR= oxygen transmission rate
OP= oxygenpermeability
WVP=water vapor permeability
WVTR=water vapor transmission rate
استفاده از پوشش های خوراکی به ویژگی های ممانعت در برابر گاز، بخار آب، آروما و روغن وابسته است که به ترکیبات شیمیایی و ساختار پلیمر تشکیل دهنده و ویژگی های محصول و شرایط نگهداری بستگی دارد.
کاهشOTR موجب کاهش اکسیداسیون چربی (رنسیدیتی)، اکسیداسیون میوگلوبین (قهوه ای شدن رنگ)، کاهش تصعید مواد فرار از محصول و جلوگیری از نفوذ مواد فرار از محیط می شود.
در مورد نفوذ پذیری به بخار آب از میان ماتریکس پلیمر فیلم میزانWVP برای فیلمهای خوراکی بستگی به پلاستیسایزر، دما، رطوبت نسبی و ... دارد. میل ترکیب شدن با آب در فیلم ها به ترکیبات هیدروفیلیک موجود در پلیمر نسبت داده شود ]91[.
جییوآگو و همکاران در سال 2009بیان داشتند، در فیلم بر پایه نشاسته نخود با پلاستیسایزر گلیسرول (GPS) با پر کننده اکسید روی به همراه40% کربوکسی متیل سلولز ZnO-CMC))، WVPدر فیلم های کامپوزیت Zno-CMC/GPS با افزایش محتوی Zno-CMCکاهش معنی داری پیدا می کند که نشان دهنده اینموضوع استکهمقاومت دربرابرآب درکامپوزیت بهتراز ماتریکسخالصاست] 45[.
لی و همکاران در سال 2010 نشان دادند کهWVPدر فیلم هایPVC با فزایش مقدار نانو ذرات اکسید روی کاهش قابل توجه ای دارد (05/0 > P)، بنابراین فیلمهای پوشیده شده با نانو ذرات اکسید روی میتوانند مولکول آب بیشتری در سیستم بسته بندی نگه دارند و در نتیجه عمر مفید برخی مواد غذایی مانند میوه ها و سیبزیجات را به تاخیر می اندازد. این محققین بیان کردند که ضعف اصلی فیلم های خوراکیWVTR بالای آنهاست که در این تحقیق مشخص شد که نرخ انتقال رطوبت نسبی و اکسیژن در بسته بندی های نانو کاهش یافت در مقایسه با بسته بندی های طبیعی در نتیجه فیلم های پوشش داده شده با نانو اکسید روی پتانسیل خوبی برای بسته بندی مواد غذایی است ]57[.
طی تحقیقات برودی در سال 2006 نشان داده شد که نانو کامپزیت هایCNTs با PLA تا 200 درصد سرعت انتقال بخار آب را بهتر از PLA خالص افزایش میدهد ]24[.
2-15-2- خواص مکانیکیبه طور معمول، مقاومت مکانیکی فیلم های هیدروکلوئیدی بر اساس سه پارامتر مورد بررسی قرار میگیرد: استحکام کششی (TS) مدول یانگ (Y)و درصد افزایش طول در نقطه شکست (E).قدرت کشش، خواص ازیاد طول،مدول یانگ توسط منحنی استرس–استرین (تنش-کرنش) توسط انجمن مواد و آزمایش آمریکا (ASTM ) تعریف شده است.
خواص مکانیکی فیلمها به نیروهای بین مولکولی زنجیرههای پلیمری سازنده آنها، نسبت ترکیبات سازنده افزودنیهای اضافه شده در شرایط محیطی بستگی دارد ]53[.
مهمترین شاخصهای سنجش خواص مکانیکی عبارتند از:
استحکام کششی(TS)، بیشترین نیرویی که سبب کسیختگی جسم میشود تقسیم بر سطح مقطع جسم را گویند. نشان دهنده قدرت کششی یا فشاری آن جسم است و یا نشان دهنده مقاومت جسم است.
کشیدگی در نقطه شکست (E%)، بیشترین تغییر طول نسیت به طول اولیه را گویند.به عنوان یک خاصیت جسم معرفی می شود که انعطاف پذیری جسم را بررسی میکند. نشان دهنده قدرت کشش پذیری است. (چند درصد طول می تواند کش بیاید ولی پاره نشود)
مدول یانگ (Young’s moduls) نسبت stress به strain در ناحیه خطی است که میزان سختی جسم را بررسی می کند و نشان می دهد که هرچه سختی جسم بیشتر باشد سختی جسم بیشتر است.
ویلهلم و همکاران در سال 2003 نشان دادند که افزودن پر کننده غیر آلی به ماتریکسPS-PVOH سفتی فیلم را افزایش میدهد ] 102[.
لین و همکاران در سال 2009 نانو ذرات اکسید روی را در سه شکل(P-N-W)به پلیمر پلی پروپیلن(PP)اضافه کردند. که نتایج نشان داد ساختار شش ضلعی یا چند وجهیrod اجازه می دهد، استرس به طور موثرتری نسبت به دیگر نانو ذرات ZnO به ماتریکس پلیمری منتقل شود که سبب افزایش قدرت و سفتی کامپوزیت میشود. پر کننده ZnO _ N کمترین میزان کشیدگی(E%)را دارد که بدین علت است که بطور متوسط سایز کریستال کوچکتر است و تمایل دارد به آگلومیریزه شدن (بهم پیوستن) در هنگام مخلوط شدن با پلی پروپیلن دارد، در نتیجه ماتریکس حاصل خواص کششی پایین تری دارد ]60[.
لی و همکارانش (2009) اثرات نانو ذرات ZnO بر خواص مکانیکی پوشش های پلی اورتان را بررسی کرده اند. پوشش های پلی اورتان غنی شده با نانو ذرات ZnOتا 2 درصد وزنی بهبود قابل توجهی در Young’s moduls و استحکام کششی (TS) نشان داده اند. پلی اورتان به دلیل خواص فیزیکی خوب مانند انعطاف پذیری در دمای پایین، استحکام کششی، قابلیت کنترل سختی و شفافیت به طور گسترده ای استفاده می شود اما از معایب آن مقاومت دمایی پایین و دوام مکانیکی پایین آن می باشد. اندازه نانومتر و بویژه سطح تماس زیاد نانو فیلرها واکنش سطح داخلی فیلر و پلیمر را افزایش داده و در نتیجه موجب بهبود خواص پلیمر می شود. آزمایش های متناوب نشان می دهد که نانوفیلر ذرات ZnO استحکام را افزایش می دهد اما تأثیری بر انعطاف پذیری فیلم های کامپوزیتی ندارد. بالا رفتنYoung’s moduls و استحکام کششی ممکن است به دلیل محدودیت نسبی حرکت اجزاء ساختاری زنجیرهPU با افزودن ZnO باشد. صاف کردن نیز می تواند سبب تراکم نانو ذرات ZnO در فیلم خشک شده و منجر به تنزل خاصیت مکانیکی فیلم شود ]56[.
2-16- خواص ضد میکروبیبسته بندیهای فعال ضد میکروبی ساخته شده از نانوکامپوزیت های فلزی نسل جدیدی از بسته بندی با ساختار نانو هستند که از ترکیب مستقیم نانو ذرات فلزی با پلیمر پایه تولید میشوند. در بسته بندیهای فعال، انتشار مواد ضد میکروبی از ماتریکس پلیمری به سطح ماده غذایی به صورت آهسته و در زمان طولانی انجام میشود و در نتیجه برای مدت طولانی غلظت بالایی از ماده ضد میکروبی در سطح فرآورده وجود خواهد داشت. مواد ضد میکروبی از طریق کاهش سرعت رشد و طولانی کردن فاز تأخیری میکروارگانیسم ها و یا غیر فعال کردن و نابودی میکروب ها باعث افزایش ماندگاری فرآورده های غذایی میشوند. در مورد فیلم ها و پوشش های خوراکی انتخاب نوع ماده ضد میکروبی تنها به ترکیبات خوراکی محدود میشود. زیرا از آن جا که این مواد همراه ماده بسته بندی و ماده غذایی مصرف می شوند، خوراکی بودن و ایمنی آنها امری ضروری است. ویژگی هایی که یک ترکیب ضد میکروبی مورد استفاده در بسته بندی های فعال باید داشته باشد عبارتند از:
-مورد تأیید سازمان های نظارت کننده بوده و برای تماس با ماده غذای مجاز باشد.
-قیمت پایینی داشته باشد تا مقرون به صرفه باشد.
-بر طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها مؤثر باشد.
-در غلظت های کم بر میکروارگانیسم ها مؤثر باشد.
-بر خواص حسی مواد غذایی تأثیر منفی نداشته باشد.
استفاده از فیلم ها و پوششهای خوراکی ضد میکروبی و فیلم های سنتزی حاوی ترکیبات ضد میکروبی به زمان های خیلی دور بر می گردد. زمانیکه از مواد حاوی نگهدارنده های شیمیایی و اسیدهای آلی به عنوان پوشش سوسیس استفاده می شد این لفاف های طبیعی عمدتاً لوله هایی از جنس پروتئین خوراکی بودند که خمیر سوسیس در داخل آنها پر می شد. علاوه بر پوشش دادن سوسیس ها، قطعات و لاشه های گوشت نیز با ژل های حامل ترکیبات ضد میکروبی پوشش داده می شدند تا از رشد باکتریهای فسادزا و پاتوژن در آنها جلوگیری شود. تحقیقات اندکی در رابطه با استفاده از پوشش های پروتئینی(از جمله ژلاتین) حامل ترکیبات ضد میکروبی در مورد محصولات گوشتی گزارش شده است.
مطالعات بر روی استفاده از فیلم ها و پوشش های پروتئینی به عنوان حامل ترکیبات ضد میکروبی از سال 1980 شروع شد. گیلبرت اثر اسیدسوربیک اضافه شده به فیلم های کازئینی یا ژلاتینی را مورد بررسی قرار داد و مشاهده کرد پایداری میکروبی بهبود مییابد. از اواخر دهه 1990استفاده از ترکیبات ضدمیکروبی طبیعی نیز در فیلمهای خوراکی پروتئینی آغاز شد. فعالیت ضدمیکروبی فیلم های زئینی حاوی نایسین و فیلم زئینی یا پروتئین سویای حاوی لیزوزیمیا نایسین در مقابل لاکتوباسیلوس پلانتاروم کورد آزمایش قرار گرفت ]37[.
در مطالعات صورت گرفته نشان داده شده است که نانو ذراتی چون Zn,Ti,Ag,Cr و اکسید آن ها خاصیت باکتری کشی بالایی دارند ]55[. باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (S.aureus) یکی از باکتری های بیماری زای مهم است. که مقاومت آنتی بیوتیکی یکی از مشکلاتی است که برای از بین بردن این باکتری بسیار مطرح است. لذا نانو مواد به عنوان مواد مناسب برای مهار و ازبین بردن این باکتری میتوانند مورد استفاده قرار گیرند ]33[. خاصیت ضد میکروبی ترکیبات اکسید روی از گذشته بسیار دور شناخته شده و کاربردهای فراوانی در ضدعفونی کردن وسایل پزشکی، تصفیه آب ، لوسیون ها و پمادهای ضد میکروبی دارد. نانو ذرات اکسید فلزی، بر اساس نسبت سطح به حجم، خاصیت ضد باکتریایی متفاوتی از خود نشان می دهند. باکتری های گرم مثبت در مقایسه با باکتری های گرم منفی در مقابل نانو ذرات فلزی، مقاومت بیشتری از خود نشان می دهند که میتواند به ساختار دیواره سلولی ارتباط داشته باشد. مکانیسم ضد میکروبی نانوذرات فلزی حاصل از این فلز هنوز دقیقاً مشخص نیست. بر اساس مطالعات محققان این مکانیسم ممکن است به صورت القای تنش اکسیداتیو به غشای سلول میکروب به دلیل آزادسازی گونه های اکسیژن فعال (ROS) یا آزادسازییون از سطح ذره و اتصال به غشای سلول و انهدام آن باشد.احتمال داده میشود. یون های آزادشده از نانو مواد با گروه های تیول (-SH) پروتئین های سطحی سلول های باکتریایی واکنش دهند. تعدادی از این پروتئین های غشای سلول های باکتریایی عمل انتقال مواد معدنی از سطح دیواره را به عهده دارند، که نانو مواد با اثر بر روی این پروتئین ها باعث نفوذپذیری غشاء میشوند ]59[. غیر فعال شدن تراوایی غشا در نهایت باعث مرگ سلول می شود. همچنین نانو مواد چسبیدن سلول باکتری و تشکیل بیوفیل را به تأخیر میاندازد که این عمل باعث می شود گروهی از باکتری ها نتوانند تثبیت شوند و تکثیر یابند ]65[.
لی و همکارانش (2009) گزارش کردهاند که فیلم پلی اورتان غنی شده با نانو ذرات ZnO فعالیت ضد باکتریایی خیلی خوبی خصوصاً در برابر E.coliنشان دادند ]56[.
لی و همکارانش در سال 2010خواص ضد باکتریایی و عبوردهی بخار آب فیلم پلی وینیل کلرایدPVC پوشیده با نانوذرات ZnO را بررسی کردند و دریافتند فعالیت ضد باکتریایی فیلم پوشیده با ZnO برای غیرفعالسازی اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس به وسیله اشعه UV بهبود یافته است و این محققین نیز اعلام کردند که فعایت ضد میکروبی مشخصهای از نانو ذرات اکسید روی است. همچنین محققان فوق بیان داشتند که در مقایسه با بی ثباتی مواد ضدباکتریایی آلی، عوامل ضدباکتریایی معدنی پایداری و ثبات بهتری را در شرایط سخت فرآیند مانند فشار یا دمای بالا دارند. بنابراین عوامل ضدباکتریایی معدنی مانند اکسیدروی توجه زیادی را دردهه گذشته به خود جلب کرده است. فعالیت آنتی باکتریال نانوذرات ZnO بیشتر از میکروذراتZnO می باشد و همچنین به غلظت آن نیز بستگی دارد ]57[.

–246

1-1-بیان مسئله....................................................................................................................................................................................................................................2
1-2-اهمیت و ضرورت تحقیق...................................................................................................................................................................................................3
1-3-اهداف تحقیق............................................................................................................................................................................................................................4
1-4-فرضیه های تحقیق.................................................................................................................................................................................................................4
1-5-تاریخچه اشرشیا......................................................................................................................................................................................................................5
1-5-1-خانواده انتروباکتریاسه....................................................................................................................................................................................................5
1-5-2-اشرشیا کلی.........................................................................................................................................................................................................................6
1-5-3-طبقه بندی...........................................................................................................................................................................................................................6
1-5-3-1-ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی..............................................................................................................................................................................7
1-5-3-2-ساختار آنتی ژن سوماتیک یا آنتی ژن O.......................................................................................................................................................7
1-5-3-3-ساختار آن کپسولی یا آنتی ژن K......................................................................................................................................................................8
1-5-3-4-ساختار آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن H.........................................................................................................................9
1-5-3-5-ساختار آنتی ژن فیمبریه ای یا آنتی ژن F......................................................................................................................................................9
1-6-خصوصیات مورفولوژی..................................................................................................................................................................................................10
1-6-1-خصوصیات کشت و بیوشیمیایی...........................................................................................................................................................................11
1-6-2-مقاومت..............................................................................................................................................................................................................................12
1-6-3-ژنتیک..................................................................................................................................................................................................................................13
1-7-بیماری زایی اشرشیا کلی.................................................................................................................................................................................................13
1-7-1-فاکتورهای حدت..........................................................................................................................................................................................................14
1-7-1-1-کپسول..........................................................................................................................................................................................................................14
1-7-1-2-آندوتوکسین...............................................................................................................................................................................................................14
1-7-1-3-پروتئین های اتصالی فیمبریه ای......................................................................................................................................................................14
1-7-1-4-اگزوتوکسین ها........................................................................................................................................................................................................15
1-7-2-1-انتروتوکسین ها........................................................................................................................................................................................................16
1-7-2-2-سیتوتوکسین ها........................................................................................................................................................................................................16
1-7-2-3-وروتوکسین ها.........................................................................................................................................................................................................17
1-7-2-4-آلفاهمولیزین ها.......................................................................................................................................................................................................17
1-7-2-5-سیدروفورها..............................................................................................................................................................................................................17
عنوان صفحه
1-7-3-تغییر فاز آنتی ژنی............................................................................................................................................................................................................18
1-7-3-1-سیستم ترشحی نوع III .........................................................................................................................................................................................18
1-7-3-2-بیماری در انسان.........................................................................................................................................................................................................18
1-7-4-1-پاتوتیپ اشرشیا کلی های پاتوژن روده ای...................................................................................................................................................19
1-7-4-2-پاتوتیپ اشرشیا کلی توکسین زای روده ای(ETEC)..............................................................................................................................19
1-7-4-3-پاتوتیپ اشرشیا کلی بیماری زای روده ای (EPEC)..............................................................................................................................20
1-7-4-4-پاتوتیپ اشرشیاکلی انترواگرگتیو(EAggEC).............................................................................................................................................21
1-7-4-5-پاتوتیپ اشرشیا کلی انتروهموراژیک (EHEC)........................................................................................................................................21
1-7-4-6-پاتوتیپاشرشیا کلی انترواینواسیو(EIEC)........................................................................................................................................................22
1-8-عفونت های اشرشیا کلی های خارج روده ای.......................................................................................................................................................22
1-8-1-1-باکتریولوژی و مننژیت اشرشیا کلی (MAEC)...........................................................................................................................................23
1-8-1-2-سپسیس..........................................................................................................................................................................................................................23
1-8-1-3-التهاب مثانه...................................................................................................................................................................................................................23
1-8-1-4-سپتی سمی....................................................................................................................................................................................................................24
1-8-2-عفونت مجاریادراری(UTI)........................................................................................................................................................................................24
1-8-2-1-مقاومت های آنتی بیوتیکی...................................................................................................................................................................................25
1-8-2-2-مقاومت در اشرشیا کلی..........................................................................................................................................................................................26
1-8-2-3-فیلوژنتیک اشرشیا کلی............................................................................................................................................................................................26
1-9-عوامل بیماری زایی(ویرولانس در اشرشیا)...............................................................................................................................................................27
1-9-1-ژن aer (آئروباکتین)........................................................................................................................................................................................................28
1-9-1-2-اتصال دهنده ها (Adhesions)............................................................................................................................................................................29
1-9-1-3-مکانیسم بیماری زاییUPEC در ارتباط با افمبریال ادهسین................................................................................................................30
1-9-1-5-مکانیسم بیماری زایی UPEC در ارتباط با همولیزین (HlyA)...........................................................................................................33
1-10-تعاریف واژه ها....................................................................................................................................................................................................................34
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1- بررسی تحقیقات انجام شده..........................................................................................................................................................................................35
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-نوع مطالعه................................................................................................................................................................................................................................38
3-2-جامعه مورد مطالعه...............................................................................................................................................................................................................38
3-3-روش انجام طرح...................................................................................................................................................................................................................38
3-3-1-مواد وتجهیزات................................................................................................................................................................................................................38
عنوان صفحه
3-3-1-1-دستگاه ها و وسایل مورد نیاز................................................................................................................................................................................38
3-3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز...............................................................................................................................................................................................41
3-3-1-3-محیط های کشت مورد استفاده.............................................................................................................................................................................41
3-4-ترکیبات و محلول های مورد استفاده در تحقیق و فرمول ساخت آنها...........................................................................................................41
3-5-روش اجرا....................................................................................................................................................................................................................................43
3-5-1-جمع آوری اطلاعات........................................................................................................................................................................................................43
3-5-2-انجام امور باکتریولوژیک.........................................................................................................................................................................................................................43
3-5-3-نمونه برداری، کشت، جداسازی و تعیین هویت باکتری ها...........................................................................................................................43
3-5-3-1-نمونه برداری...................................................................................................................................................................................................................43
3-5-3-2-طرز تهییه محیط های کشت....................................................................................................................................................................................43
3-5-3-3-نگه داری نمونه های عفونت ادراری..................................................................................................................................................................45
3-5-3-4-نگه داری سویه باکتری...............................................................................................................................................................................................45
3-5-4-استخراج، تعیین کمیت و کیفیت DNA...................................................................................................................................................................46
3-5-4-1-استخراج DNA..............................................................................................................................................................................................................46
3-5-4-2-کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA استخراج شده...................................................................................................................................46
3-5-5-انجام آزمایشات مولکولی................................................................................................................................................................................................47
3-5-5-1-پرایمرها..............................................................................................................................................................................................................................47
3-5-5-2-رقیق سازی پرایمرها....................................................................................................................................................................................................49
3-5-6-انجام PCR.............................................................................................................................................................................................................................49
3-5-6-1-بهینه سازی اجزاء واکنش PCR.............................................................................................................................................................................50
3-5-6-2-بهینه سازی تهیه Master Mix ...............................................................................................................................................................................50
3-5-7-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن aer ............................................................................................................50
3-5-7-1-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن HlyA...............................................................................................51
3-5-7-2- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Pap ..................................................................................................51
3-5-7-3- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Cnf ............................................................................................. 52
3-5-7-4- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Afa ............................................................................................... 53
3-5-7-5-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژنFim ............................................................................................. 53
3-6-مراحل انجام PCR ..................................................................................................................................................................................................................54
3-6-1-بهینه سازی PCR ...............................................................................................................................................................................................................54
3-6-2-بررسی محصول PCR.......................................................................................................................................................................................................55
3-7-مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز.............................................................................................................................................................................56
3-7-1-ژل آگارز.................................................................................................................................................................................................................................56
عنوان صفحه
3-7-1-1-طرز تهییه ژل آگارز....................................................................................................................................................................................................56
3-7-1-3-بافر سنگین کننده.........................................................................................................................................................................................................56
3-7-1-4-رنگ آمیزی ژل.............................................................................................................................................................................................................57
3-8-توالی یابی....................................................................................................................................................................................................................................57
3-9-1-روش گردآوری اطلاعات..............................................................................................................................................................................................57
3-9-2-روش تجزیه و تحلیل اطلاعات..................................................................................................................................................................................58
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1-فراوانی بیماران بر اساس جنس.........................................................................................................................................................................................59
4-2-نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی...................................................................................................................................60
4-3-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن آئروباکتین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن........................................................61
4-3-1-بهینه سازی دمای اتصال.................................................................................................................................................................................................61
4-3-1-1-انجام آزمون روی سایر ایزوله ها.........................................................................................................................................................................62
4-3-2-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن سایتوتوکسیک نکروز دهنده در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن...........64
4-3-2-1- بهینه سازی دمای اتصال.........................................................................................................................................................................................64
4-3-2-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها.......................................................................................................................................................................64
4-3-3- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن همولیزین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن..................................................65
4-3-3-1- بهینه سازی دمای اتصال.........................................................................................................................................................................................65
4-4-4- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنP - فیمبریه در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن................................................66
4-4-4-1- بهینه سازی دمای اتصال .........................................................................................................................................................................................66
4-4-4-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها .......................................................................................................................................................................67
4-5-5- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن Afaدر سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن..............................................................68
4-5-5-1- بهینه سازی دمای اتصال.........................................................................................................................................................................................68
4-5-5-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها .......................................................................................................................................................................69
4-6-6- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنFim در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن............................................................70
4-6-6-1- بهینه سازی دمای اتصال........................................................................................................................................................................................70
4-7-ژن های ویرولانس..................................................................................................................................................................................................................72
4-8-نتایج ویرولوتایپینگ سویه ها.............................................................................................................................................................................................77
4-9-نتایج تایید محصولات PCR .............................................................................................................................................................................................79
فصل پنجم: نتیجه گیری
5-1-بحث..............................................................................................................................................................................................................................................91
5-2-مقایسه نتایج بدست آمده با یافته های دیگر محققین............................................................................................................................................91
عنوان صفحه
5-3-نتیجه گیری..................................................................................................................................................................................................................................95
5-4- پیشنهادات...................................................................................................................................................................................................................................95
فهرست منابع
منابع فارسی..............................................................................................................................................................................................................................................96
منابع انگلیسی..........................................................................................................................................................................................................................................97
چکیده انگلیسی...................................................................................................................................................................................................................................102زمون آ
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه
جدول 1-1: ژن های ویرولانس در اشرشیا کلی و عملکرد ژن ها..................................................................................................................................30
جدول3-1: مشخصات پرایمرهای مورد استفاده.......................................................................................................................................................................48
جدول 3-2: اجزاء و ترکیبات مورد استفاده برای واکنش PCR ......................................................................................................................................49
جدول 3-3: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن aer .............................................................................................................................................................50
جدول 3-4: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن HlyA.........................................................................................................................................................51
جدول 3-5: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Pap ................................................................................................................................................. 52
جدول 3-6: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Cnf ........................................................................................................................................................52 جدول 3-7: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Afa ............................................................................................................................................................53
جدول 3-8: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Fim...........................................................................................................................................................54
جدول 4-1: مشخصات ایزوله های اشرشیا کلی جدا شده از بیماران...........................................................................................................................73
جدول 4-2: نتایج ویرولوتایپینگ درکل سویه ها.....................................................................................................................................................................77
جدول4-3: نتایج ویرولوتایپینگ در سویه های اشرشیا کلی، سویه های مشابه در هر ژن..................................................................................78
فهرست علامت ها و اختصارها
معادل فارسی معادل انگلیسی علامت
اشرشیا کلی Escherichia coli E.coli
واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR Polymerase chain reaction
عفونت مجاری ادراری Infectios UTI Urinary Tract
اشرشیا کلی یوروپاتوژن UPEC Uropathogenic Escherichia coli
فهرست شکل ها و تصویر ها
عنوان شکل صفحه
شکل1-1: شکل شماتیک از ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی..................................................................................................................................................10
شکل1-2: شکل شماتیک از نحوه اتصال باکتریE.coli به سطح سلول های اپیتلیال سطحی بدن.................................................................31
شکل1-3: شکل شماتیک از فاکتورهای ویرولانس در اشرشیا کلی................................................................................................................................33
شکل1-4: شکل شماتیک از مکانیسم بیماری زاییUPEC .................................................................................................................................................34
شکل 3-1: کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA ...................................................................................................................................................................47
شکل 4-1: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن aer...........................................................................................................................62
شکل4-1-1: نتایج PCR به منظور تکثیر ژن aer در سایر ایزوله ها...............................................................................................................................63
شکل4-1-2: نتایج PCR ژن aer در سایر ایزوله ها...............................................................................................................................................................63
شکل4-2: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Cnf .........................................................................................................................64
شکل4-2-1: نتایج PCR ژن Cnf در سایر ایزوله ها.............................................................................................................................................................65
شکل4-3: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن HlyA ....................................................................................................................66
شکل4-4: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژنPap...........................................................................................................................67
شکل4-4-1: نتایج PCR ژن Pap در سایر ایزوله ها............................................................................................................................................................68
شکل 4-5: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Afa ....................................................................................................................69
شکل 4-5-1: نتایج PCR ژن Afa در سایر ایزوله ها........................................................................................................................................................70
شکل4-6: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Fim.......................................................................................................................71
شکل4-7: ژن های ویرولانس در کنار هم. ..............................................................................................................................................................................72
شکل4-8-1: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس aer......................................................................................79
شکل4-8-2: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس HlyA................................................................................81
عنوان شکل صفحه
شکل4-8-3: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Cnf....................................................................................83
شکل4-8-4: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Afa ....................................................................................86
شکل4-8-5: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Fim......................................................................................88
شکل4-8-6: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانسPap........................................................................................89
فهرست نمودار ها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1: فراوانی بیماران بر اساس جنس.......................................................................................................................................................................59
نمودار4-2: فراوانی بیماران براساس سن (سال)..............................................................................................................................................................60
نمودار4-3: نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی................................................................................................................61

چکیده
زمینه و هدف: اشرشیا کلی یوروپاتوژن یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده عفونت مجاری ادراری است. این سویه ها انواع مختلفی از فاکتورهای ویرولانس از جمله چسبنده ها، توکسین ها، سیستم های اکتساب آهن را دارا می باشند. ژن های ویرولانس روی عناصر ژنتیکی متحرک و یا در نواحی خاصی از کروموزوم که جزایر پاتوژنیستی نامیده می شوند قرار دارند. هدف از این مطالعه بررسی وجود و تعیین هویت فاکتور های پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله(عج) تهران می باشد. مواد و روش ها: از 150 نمونه ی ادرار جمع آوری شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران مجموعه ای از 100 ایزوله ی اشرشیا کلی بین تیرماه تا دی ماه 1393 جدا گردید. باکتری اشرشیا کلی با استفاده از تکنیک های بیوشیمیایی و میکروب شناسی استاندارد شناسایی شد. استخراج ژنوم باکتری ها با استفاده از روش جوشاندن انجام گرفت و بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای ویرولانس با استفاده از روش PCR انجام گرفت. نتایج: PCR به طور موفقیت آمیزی برای تمامی 6 ژن مورد نظر بهینه سازی شد و توانست باندهای مورد نظررا نشان دهند. عفونت مجاری ادراری ایجاد شده با اشرشیا کلی 83 % برآورد گردید شیوع ژن های ویرولانس به ترتیب شامل:(98%)( bp 328) Pap(95%)(bp 602) aer ،(94%)( bp 559) Fim،(86%)( bp 693)cnf ،(63%)( bp 750)Afa ، (62%)( bp 1177)hlyA به طور موفقیت آمیزی تکثیر یافتند. بحث: مطالعه حاضر نشان داد که شیوع ژن های ویرولانس pap ،aer ، Fimدر میان سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران بالا می باشد و کمترین شیوع مربوط به ژن hlyA (همولیزین)می باشد.
کلمات کلیدی: اشرشیا کلی یوروپاتوژن، عفونت مجاری ادراری، ژن های ویرولانس، واکنش زنجیره ای پلیمراز
فصل اول
مقدمه
1-1-بیان مسئله
اشریشیا کلی(E.coli)1 یک باسیل گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه است که به طور شایع در روده جانوران خونگرم و برخی پرندگان وجود دارد. انتقال این باکتری از طریق مسیر مدفوعی- دهانی از یک فرد به فرد دیگر و یا از طریق آب و غذای آلوده می باشد. اشریشیا کلی به خوبی روی محیط های معمولی رشد کرده و یک باکتری کم نیاز است و در روی محیط های جدا کننده روده ای بیشتر سویه ها کلنی های تخمیر کننده لاکتوز را ایجاد می کنند (هاملین و همکاران،2007)2. اشرشیا کلی یکی از مهمترین دلایل ایجاد کننده عفونت های کلیه، مثانه، ریه و مننژ می باشند که به نوبه خود ممکن است منجر به سپسیس گردند و یکی از مهمترین عوامل تهدید کننده حیات انسان محسوب می شوند (چانج و همکاران، 2006 )3. عفونت مجاری ادراری(UTI)4 یکی از شایع ترین عفونت های باکتریایی در انسان است که به طور عمده توسط اشرشیا کلی ایجاد می شود(گریبلینگ و توماس، 2005)5. عفونت های ادراری از لحاظ شیوع، رتبه دوم را پس از عفونت های تنفسی داشته و در بزرگسالان رتبه اول بیماری های عفونی بزرگسالان را از نظر مراجعه به پزشک تشکیل می دهند. به این ترتیب اهمیت عفونت های ادراری از نظر عوارض بسیار جدی که در نتیجه عدم تشخیص درمان مناسب بر جای می گذارد بر کسی پوشیده نیست در ارزیابی تکامل ژنتیکی اشرشیا کلی، بررسی های فیلوژنتیکی از اهمیت خاصی برخوردار است. اشرشیا کلی عامل 90-80 درصد از عفونت مجاری ادراری اکتسابی از جامعه و 50-30 درصد از عفونت مجاری ادراری بیمارستانی است(نعمتی و همکاران، 2014).

عفونت مجاری ادراری از علل عمده بستری شدن در بیمارستان با عوارض قابل توجه و هزینه های مراقبت بهداشتی است(نعمتی و همکاران، 2014 ). تشخیص و درمان موثر عفونت مجاری ادراری یک نگرانی بزرگ در زمینه ی مراقبت های بهداشتی است(سنتیلو و فرانکلین، 2007)1. در سراسر جهان حدود 150 میلیون نفر با عفونت مجاری ادراری تشخیص داده شده اند که هر ساله هزینه اقتصادی در این زمینه بیش از 6 میلیارد دلار در جهان می باشد (کومار و همکاران، 2006)2. شدت عفونت مجاری ادراری به دو عامل ویرولانس باکتری و حساسیت میزبان بستگی دارد(گریبلینگ و توماس، 2005). اشرشیا کلی ایجاد کننده ی عفونت مجاری ادراری UPEC))3 فاکتورهای ویرولانس مختلفی از جمله آلفا همولیزین، فاکتور نکروز دهنده سایتوتوکسیک، چسبنده ها و سیستم های اکتساب آهن دارد; این فاکتورها در نهایت منجر به آسیب بافتی می شوند(پیت آئوت، 2012)4. اتصال باکتری به سلول های اورو اپی تلیال یک مرحله ضروری برای شروع و گسترش است. این فرایند به باکتری اجازه می دهند تا در مقابل عملکرد شستشوی ادرار و تخلیه مثانه و فعال شدن مسیرهای انتقال پیام در میزبان مقاومت کند. سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن قادر هستند تا انواع متفاوتی از چسبنده های لازم برای تشخیص و اتصال به رسپتورهای مجاری ادراری را تولید کنند: از جمله فیمبریه تیپ 1 که توسط ژن fim کد می شود، P فیمبریه که توسط ژن های pap (phylonephritis-associated pili) کد می شود، S فیمبریه که توسط ژن های sfa کد می شود و چسبنده ی Afa که توسط ژن های afa کد می شود(آنتااو و همکاران، 2009)5. تولید توکسین ها مانند همولیزین و سایتوتوکسیک نکروز دهنده فاکتور 1(CNF1 ( باعث آسیب بافتی می شود که انتشار باکتری و ترشح مواد غذایی میزبان را تسهیل می کنند و ممکن است همچنین باعث تغییر مسیرهای انتقال پیام در میزبان شود(توماس و همکاران، 2011)6. از دیگر خصوصیات UPEC برای ایجاد عفونت مجاری ادراری سیستم اکتساب آهن است که باکتری با کمک سیدروفورها آهن را از محیط جذب می کند. ژن aer سیدروفور آئروباکتین را کد می کند (نعمتی و همکاران، 2014).
1-2- اهمیت و ضرورت تحقیق
تحقیق فوق از آن جهت حائز اهمیت نو آوری است که تاکنون در خصوص شناسایی ژن های پاتوژنیسته و ویرولوتیینگ ایزوله های جداشده از منابع یوروپاتوژن عفونت های ادراری اشرشیا کلی تحقیقی جامع در برخی بیمارستان ها از جمله بیمارستان بقیه الله (عج) تهران انجام نشده است و ما قصد داریم این تحقیق را برای اولین بار در این بیمارستان به انجام برسانیم.
1-3-اهداف تحقیق:
اهداف علمی:
تعیین فراوانی ژن های مرتبط با بیماری زایی سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله(عج) تهران.
تعیین ویرولوتیپ های سویه های اشرشیا کلی جدا شده از بیماران بیمارستان بقیه الله (عج) تهران.
تعیین رابطه ی بین ژن های پاتوژنیسته خاص با سویه های جدا شده از اشرشیا کلی یوروپاتوژن از بیماران بیمارستان بقیه الله (عج) تهران.
اهداف کاربردی:
راه اندازی روش های سریع شناسایی ژن های پاتوژنیسته و تعیین ویرولوتیپ های سویه ها
1-4- فرضیه های تحقیق:
سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از عفونت های ادراری دارای ژن های ویرولانس خاصی می باشند.
انتظار می رود فراوانی ژن های ویرولانس باکتری اشرشیا کلی در ایران همانند کشورهای دیگر باشد.
بین حضور ژن های خاص ویرولانس و منبع جداسازی باکتری ها رابطه وجود دارد.
1-5- تاریخچه
اشرشیا کلی اولین بار به وسیله پزشکی آلمانی به نام تئودر اشریش1شناسایی شد. او در سال 1885، این ارگانیسم را باکتریوم کلی 2 نامید و آن را به عنوان عامل بیماری زای اصلی عفونت های روده ای و برخی از عفونت های خارج روده ای معرفی کرد. نام باکتریوم کلی به طور وسیع تا سال 1919 استفاده می شد تا وقتی که کاستلائی 3 و کالمرز4جنس اشرشیا را تعریف کردند و نام اشرشیا کلی را پایه نهادند.
اشرشیا کلیارگانیسمی است که به شدت از جنبه های مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. در باکتریولوژی عمومی به عنوان ارگانیسم مدل برای مطالعه ی ساختار سلولی، رشد ومتابولیسم استفاده می شود، همچنین ابزاری بسیار مهم برای کلونینگ ژن ها در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی و بیان محصولات ژن ها شده است. اشرشیا کلی به عنوان ارگانیسم کنترلی جهت انجام آزمایشهای کنترلی موثر بودن عوامل ضد میکروبی و مواد ضد عفونی کننده استفاده می شود و به عنوان ارگانیسم اندیکاتور جهت تعیین آلودگی مدفوعی، مواد غذایی، آب و محیط مطرح می باشد و نقش مهمی را به عنوان فلور میکروبی روده ی انسان و حیوانات خونگرم تشکیل می دهد. کم و بیش برخی از سویه های پاتوژن های مهمی برای میزبان هایشان هستند.
1-5-1- خانواده انتروباکتریاسه
خانواده انتروباکتریاسه بزرگترین و ناهمگون ترین مجموعه ی باسیل های گرم منفی هستند که از لحاظ بالینی اهمیت دارند. حداقل 28 جنس و 7 گروه روده ای5 با بیش از 80 سویه شناخته شده است. جنس های این خانواده بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی، ساختار آنتی ژنی و ترادف یابی اسیدهای نوکلئیک طبقه بندی شده اند. باکتری های متعلق به انتروباکتریاسه گسترش جهانی داشته و ساکن روده ی حیوانات و انسان ها هستند و گیاهان، خاک و آب را آلوده می سازند. آن ها بسیاری از بیماری های بالینی از قبیل آبسه، پنومونی6، مننزیت، سپتی سمی و عفونت های اداری را باعث می شوند(عموئیان و میبدی، 1383). باکتری های خانواده انتروباکتریاسه را به دو دسته باکتری های فرصت طلب و بیماری زای روده ای تقسیم می کنند که برخی از جنس های این خانواده مثل سالمونلا، شیگلا و یرسینا همیشه مرتبط با بیماری هستند و جز پاتوژن های روده ای می باشند ولی برخی دیگر مانند اشرشیا کلی، کلبسیلا و پروتئوس به عنوان فلور طبیعی روده بوده و با ایجاد شدن شرایطی مانند کسب ژن های بیماری زایی از طریق پلاسمید و باکتریوفاژ، به هم خوردگی فلور میکروبی، جابجایی فلور میکروبی و غیره، قدرت بیماری زایی را به دست آورده و سبب ایجاد عفونت های فرصت طلب می شوند.
1-5-2- اشرشیا کلی
اشرشیا کلی شایع ترین و مهمترین جنس در خانواده انتروباکتریاسه می باشد که در پزشکی اهمیت دارد. اشرشیا کلی باکتری بی هوازی اختیاری و بخشی از فلور فیزیولوژی روده ای در انسان و حیوانات خونگرم است اما برخی از سویه ها سبب بیماری هایی مثل پنومونی، گاستروانتریت1، بیماری های ادراری –تناسلی و سپتی سمی می شوند. چندین واریانت پاتوژن اجباری و اختیاری از اشرشیا کلی وجود دارد که باعث انواع مختلفی از عفونت های روده ای و خارج روده ای در انسان و حیوانات می شود. در سال های اخیر سویه O157:H7 اشرشیا کلی به عنوان پاتوژن مهم مشترک بین انسان و دام مطرح گردیده، که از طریق غذا منتقل می شود. این سویه عامل سندرم اورمی همولیتیک –کولیت خونریزی دهنده 2 در انسان است (عادلی، 1386).
1-5-3- طبقه بندی
برای اولین بار دسته بندی اشرشیا کلی بر اساس تیپ های متنوعی از آنتی ژن سوماتیک O توسط کائوفمن3 انجام گرفت. برخی محققین چندین گونه برای آن قائل اند : اشرشیا هرمانی4، اشرشیا دکربوکسیلاتا5، اشرشیا ولنزی6، اشرشیا فرگوسنی7، اشرشیا کلی و اشرشیا بلاته8، که بین این ها گونه اخیر از موارد انسانی جدا نشده است. در کتاب Bergeys Manual که در سال 1984 چاپ شد، بر اساس یافته های DNA در خانواده انتروباکتریاسه 20 جنس قرار گرفت (رحیمی، 1387 ).
طبقه بندی اشرشیا کلی بر دو اساس صورت می گیرد:
بر اساس ساختار آنتی ژنی
بر اساس Colicin typing (شناسایی کلی سین ها)
1-5-3-1- ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی
آنتی ژن های سطحی در اشرشیا کلی را می توان به وسیله آزمایش هماگلوتیناسیون نشان داد: سه نوع آنتی ژن سطحی بطور گسترده برای تعیین سروتیپ ارگانیسم های انتریک استفاده می شوند که شامل آنتی ژن های سوماتیک 1 (آنتی ژن (O، آنتی ژن کپسولی ( آنتی ژن K ) و آنتی ژن تاژکی ( آنتی ژن H ) می باشند(تصویر شماره1-1). آنتی ژنF یا فیمبریه ای، نیز جزء آنتی ژن های سطحی است که در برخی از سروتیپ ها یافت می شود.
1-5-3-2- ساختار آنتی ژن سوماتیک یا آنتی ژن O
آنتی ژن سطحی O، بخشی از لیپو پلی ساکارید 2 یا LPS جدار باکتری است. LPS، مجتمع گلیکولیپیدی جدار باکتری های گرم منفی است و از سه ساختار مشخص تشکیل شده است :
الف- هسته مرکزی پلی ساکاریدی، که یک قند 8 کربنی به نام کتودزاکسی اوکتونات است و به آنتی ژن اختصاصیO متصل می شود.
ب- لیپید A که به هسته مرکزی متصل می شود و بروز تاثیرات بیولوژیکLPS باکتری های گرم منفی ناشی از این بخش از باکتری است و درواقع اندوتوکسین باکتری محسوب می شود. لیپید A می تواند باعث تب، لوکوپنی و حتی نهایتاً مرگ شود.
ج – آنتی ژن اختصاصی O، که پلیمری از واحد های تکراری الیگوساکاریدی است و به خاطر تفاوت آن در سویه های مختلف، در تعیین سروتیپ حائز اهمیت است.
به نظر می رسد طول زنجیره جانبی اختصاصی Oو انتشار آن در سطح باکتری در مقاومت نسبت به کمپلمان نقش داشته باشد، یعنی سویه هایی که بیش از 20 درصد از زنجیره های مولکولی LPS آن ها طویل هستند نسبت به تاثیر سرم مقاومند، در حالی که سویه هایی که کمتر از 20 درصد زنجیره های مولکولی LPS آن ها طویل باشد، نسبت به سرم حساس هستند. بر همین اساس، اخیراً آنتی بیوتیک هایی طراحی شده است که با بیوسنتز پلی ساکارید مرکزی LPS تداخل می کنند.
همچنین بیان شده که در بین باکتری های روده ای، اجرامی که آنتی ژن های سوماتیک آن ها دارای گروه های فوق العاده هیدروفوبیک 3 ( قندهای دی دزاکسی ) باشند، بیماری زا تر هستند. آنتی ژن های O مقاوم به حرارت هستند و در دمای 100 درجه سانتی گراد برای 5/2 ساعت هم غیر فعال نمی شوند (کویین و همکاران، 1386)4.
آنتی ژن O در تنوع آنتی ژنی شرکت دارد و باعث القاء پاسخ های سیستم ایمنی میزبان می شود. غربالگری سروگروه های سوماتیک اشرشیا کلی یک روش متداول در شناسایی اشرشیا کلی است. به طوری که براساس آنتی ژن O اشرشیا کلی 14 سروتیپ را ایجاد می کند که شامل O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16,O18, O21, O22, O25, O75, O85 می باشند. آنتی ژن سوماتیک به عنوان آنتی ژن اختصاصی در هر جنس مطرح می باشد، اما واکنش متقاطع بین جنس های بسیار نزدیک (سالمونلا با سیتروباکتر1 و اشرشیاکلی با شیگلا) شایع می باشد (موری، 1389; بران و همکاران، 2002)2.
1-5-3-3- ساختار آنتی ژن کپسولی یا آنتی ژن k
این آنتی ژن در اکثر جنس های خانواده انتروباکتریاسه به صورت یک لایه چسبنده همگن اطراف باکتری را فرا گرفته و روی آنتی ژن O قرار دارد و نسبت به حرارت حساس است و به طور معمول برای تیپ بندی سویه ها استفاده نمی شود، اما از این جهت اهمیت دارد که ممکن است در تشخیص آنتی ژن O اختلال ایجاد کند پادگن کپسولی k که گاهی به آن پادگن پوششی هم می گویند، روی پادگن های O قرار گرفته و مانع آگلوتیناسیون 3 آن با آنتی سرمO 4 می شوند. با جوشاندن سوسپانسیون ارگانیسم به منظور از بین بردن آنتی ژن K (که حساس به حرارت است ) و باقی ماندن آنتی ژن O (مقاوم به حرارت ) در حرارت زیاد می توان بر این مشکل فایق آمد(کویا، 1998). ماهیت این گروه پادگنی پلی ساکاریدی بوده که با حرارت دادن، تغییر یافته و در نتیجه آگلوتیناسیون بین آنها رخ می دهد. در طی تحقیقات اخیر مشخص شده است که پادگن های K در سویه های خاصی از اشرشیا کلی ماهیت پروتئینی دارد. فیمبریه های K99 و K88 جدا شده از حیوانات و پادگن های عوامل سیطره ای جدا شده از انسان، مثال هایی از پادگن های K غیر پلی ساکاریدی هستند. در مجموع تعداد کمی از سویه های اشرشیا کلی دارای کپسول می باشند. پادگن های A, B, L در بیرون از جدار یاخته و پادگن O وجود دارند. در این میان باکتری های واجد پادگن نوع A کپسول دار هستند.
و باکتری های واجد پادگن های نوع Lو B تنها در محیط قنددار و در دمای 20-15 درجه سانتی گراد می توانند کپسول تولید کنند. هم اکنون حدود 180 آنتی ژن متفاوت K برای اشرشیا کلی شناسایی شده است (کوبین و همکاران، 1386; کبیر، 2010).
1-5-3-4- ساختار آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن H
آنتی ژن های تاژکی، پروتئین های حساس به حرارت هستند و به وسیله ی آگلوتیناسیون اسلایدی یا لوله ای با استفاده از محیط مایع یا رشد روی محیط نیمه جامد برای فعالیت سویه های بسیار متحرک مشخص می شوند. بیشتر آنتی ژن های H مختص گونه هستند و تنها در تعداد کمی ذره های مهم آنتی ژنی وجود دارند و ممکن است در باکتری وجود نداشته باشند یا دچار تغییرات آنتی ژنتیکی شوند. بیشتر این آنتی ژن ها مونوفاژیک هستند اما ندرتاً سویه های دی فازیک نیز گزارش شده است. گاهی تحرک در دمای 30 درجه سانتی گراد بهتر از 37 درجه رخ می دهد(موری، 1389; نوروزی، 1389).
1-5-3-5- ساختار آنتی ژن فیمبریه ای یا آنتی ژن F
برای مرحله ی اتصال و چسبندگی باکتری لازم هستند و جزء فاکتورهای مهم ویرولانس باکتری محسوب می شوند. معمولاً در دمای 37 درجه بیان می شوند و در دمای 18 درجه بیان نخواهند شد. آنتی ژن F پروتئین های حساس به حرارت هستند. توانایی آگلوتیناسیون گلبول های قرمز مختلف، برای توصیف ویژگی های سویه های فیمبریه دار استفاده می شود. توانایی هماگلوتیناسیون بیشتر سویه های اشرشیا کلی در حضور مانوز (هماگلوتیناسیون حساس به مانوز )کاهش می یابد مانند فیمبریه تیپ 1 علاوه براین سویه هایی که منجر به اسهال یا بیماری های خارج روده ای می شوند ممکن است فیمبریه هایی را تولید کنند که قادر به هماگلوتیناسیون در حضور قند مانوز ( هماگلوتیناسیون مقاوم به مانوز ) هستند این آنتی ژن ها به وسیله ژن های پلاسمیدی کد می شوند. از آن جایی که آنتی ژن F در سروتایپینگ باعث ایجاد واکنش متقاطع می شود بایستی از عدم حضور آن مطمئن شد. به همین دلیل یا از کشت هایی استفاده می شود که باکتری در فاز غیر فیمبریه ای 1 باشد و یا باکتری به مدت یک ساعت در دمای 100 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود تا فیمبریه ای از بین برود(تچسنوکوا و همکاران، 2013)2.
484441515951200052787551363345آنتی ژن K
00آنتی ژن K
4976495-101600آنتی ژن H
00آنتی ژن H
3014980-98425آنتی ژن O
00آنتی ژن O

تصویر شماره(1-1): شکل شماتیک از ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی
1-5-3-6- رده بندی بر اساس نوع کلی سین :
کلی سین ها ترکیباتی پروتئینی می باشند که همانند آنتی بیوتیک ها عمل کرده و تنها روی سویه ها ی همان گونه موثر می باشد و تولید آنها به وسیله پلاسمید کنترل می گردد. کلی سین نوعی باکتریوسین است سویه های مولد باکتریوسین ها نسبت به باکتریوسین های خود مقاوم اند بنابراین از کلی سین ها نیز می توان برای طبقه بندی اشرشیا کلی استفاده کرد.
1-6- خصوصیات مورفولوژی
اشرشیا کلی سلول های میله ای شکل با 4-2 میکرومتر طول و 5/1- 1/1 میکرومتر عرض هستند که انتهای گرد دارند و به صورت منفرد، زنجیره دوتایی و یا چند تایی قرار می گیرد. جدار سلولی این باکتری ها شامل مورئین لیپوپروتئین 1، فسفولیپید 2 و لیپوپلی ساکارید است که در واقع ساختمان جدار باکتری های گرم منفی است. لیپوپلی ساکارید دارای زنجیر اختصاصی پلی ساکاریدی است که عهده دار بروز خصوصیات پادتنی در گونه های مختلف است(کیسر و همکاران، 2005)3..
اسپور تشکیل نمی دهند، بعضی نیز زمانی که در محیط واجد قند و در دمای 20-15 درجه سانتی گراد کشت داده شوند لایه لعابی 1در اطراف خود ایجاد می کنند. حدود 80 درصد سویه های باکتری متحرکند که این امر بواسطه وجود تاژک های اطرافی 2 امکان پذیر می گردد، کپسول یا میکروکپسول های ساخته شده از پلی ساکارید های اسیدی تولید می کنند اشرشیا کلی انواع متفاوتی از پیلی را تولید می کند که از نظر ساختمانی و خصوصیات آنتی ژنی متفاوت هستند و رشته های پروتئینی مو شکلی هستند که دورتادور باکتری را احاطه کرده اند. تقریباً 80 درصد سویه های دارای فیمبریه، که اغلب از نوع فیمبریه تیپ یک است، می باشند که توان هماگلوتیناسیون و اتصال به سلول های اپیتلیال را داشته و حساس به مانوز هستند (موری، 1389).
1-6-1- خصوصیات کشت و بیوشیمیایی
اشرشیا کلی به خوبی روی محیط های معمولی آزمایشگاهی حاوی یک درصد پپتون به عنوان منبع کربن و نیتروژن رشد می کند. آن ها کموارگانوتروف 3 هستند و دو نوع متابولیسم تخمیری و تنفسی دارند و در طیف وسیعی از دما رشد کرده اما دمای مناسب برای رشد آن ها C ◦37 می باشد. با توجه به کیفیت لیپوپلی ساکارید موجود در غشای خارجی، رشد بر روی محیط جامد به ترتیب به وسیله کلنی های صاف و براق یا (S)4 و خشک و چین وچروک دار یا خشن (R)5 مشخص می شود. پرگنه های آن در محیط آگار مغذی6 صاف بوده، تحدب کمی داشته و خاکستری رنگ و شفاف است. پرگنه های نوع R این باکتری، خشک بوده و به راحتی در سرم فیزیولوژی پخش نمی شود البته حالت های بینابینی(S,R) نیز وجود دارد البته سویه های شدیداً کپسول دار، پرگنه های موکوئیدی ایجاد می کنند(کوبین، 1386; یانگ، 2011).
اشرشیا کلی کلنی های مدور، درشت، محدب و بدون پیگمان در سطح نوترینت آگار و بلاد آگار تولید می کند و بعضی از سویه ها، به ویژه سویه های مرتبط با بیماری های مجاری ادراری، در محیط ژلوز خون همولیز نوع( β ) ایجاد می کنند. سویه های اشرشیا کلی در غلظت های پایین نمک های صفراوی (5 درصد سدیم دی اکسی کلات) باقی می مانند و در محیط مک کانکی، به علت تولید لاکتوز به صورت پرگنه های صاف، شفاف، براق و صورتی رنگ رشد می کنند. اکثر موارد جدا شده متحرکند و پیگمان تولید نمی کنند.

پرگنه های این باکتری در محیط دزاکسی کلات سیترات آگار1، کوچک، صورتی و کدر است. این باکتری در محیط براث کدورت ایجاد می کند. از نظر بیوشیمیایی طیف وسیعی از قند ها را تخمیر کرده و فاقد آنزیم سیتوکروم اکسیداز بوده و اکسیداز آن منفی است. آن ها باکتری های کاتالاز مثبت، احیا کننده نیترات ( به جز اروینیا) 2 بی هوازی اختیاری و غیر هاگدارند. در جداسازی اولیه از نمونه های درمانگاهی تخمیر یا عدم تخمیر گلوکز توسط این باکتری ها اهمیت دارد و به همین علت به دو گروه لاکتوز مثبت و لاکتوز منفی تقسیم می شوند. اشرشیا کلی قادر است از استات 3 به عنوان منبع کربن استفاده کند، اما قادر به استفاده از سیترات 4 نیست، لذا از محیط سیمون سیترات برای شناسایی آن استفاده می شود. این باکتری گلوکز و سایر کربوهیدرات را تخمیر کرده و پیرووات تولید می کند سپس آن را به اسیدهای لاکتیک، استیک و فرمیک تبدیل می کند قسمتی از اسیدفرمیک تولید شده، طی سیستم پیچیده هیدروژن لیاز5 به مقادیر مساوی از H2,CO2 تبدیل می شود. اشرشیا کلی ژلاتین را ذوب کرده و معمولاً آنزیم تریپتوفاناز داشته و به همین دلیل اندول تولید می کند آزمایش VP6 آن منفی و MR7 آن مثبت است که این آزمایش در تمایز این باکتری از آنتروباکتر آئروژناز اهمیت فراوان دارد. همچنین این باکتری قادر به تجزیه اوره نمی باشد. به طور کلی برای تمایز باکتری های روده ای از فرمول IMViC استفاده می شود که بدین ترتیب می توان این باکتری را از کلبسیلا، آنتروباکترها و سایر کلی فرمهای خاک و گیاهان متمایز نمود (تسلی و هکی، 2005).
1-6-2- مقاومت
به علت عدم تولید هاگ در جنس های مختلف این خانواده مقاومت آنها کم بوده و به راحتی به وسیله حرارت و مواد ضد عفونی کننده و باکتری کش نظیر مواد فنلی، فرمالدهید و ترکیبات هالوژنی از بین می روند. کنترل این اجرام در مواد غذایی به وسیله پاستوریزاسیون، حرارت پخت و نگه داری غذا در یخچال های خاص امکان پذیر است. البته اشرشیا کلی نسبت به بسیاری از سویه های دیگر خانواده انتروباکتریاسه، نسبت به حرارت مقاومت بیشتری دارد و در C°60 به مدت 15 دقیقه و درC °55 به مدت 60 دقیقه زنده باقی می ماند.
این باکتری ممکن است در آب به مدت هفته ها یا ماه ها زنده بماند اما در مایعات طبیعی خارج از بدن رشد نمی کند، همچنین باکتری برای چند روز در غبار یا بر روی پارچه ممکن است زنده باشد و سروتیپ های بیماری زا ممکن است در هوا یا روی وسایل بیمارستانی بقا یابند(گیراردیو و همکاران، 2005)1.
1-6-3- ژنتیک
برای چندین دهه اشرشیا کلی به عنوان ارگانیسم مدل برای مطالعه ژنتیک باکتری ها به چندین دلیل استفاده می شود :
نداشتن احتیاجات غذایی و رشد اختصاصی
در دسترس بودن، آسانی استفاده و غیر بیماری زا بودن
تکثیر سریع و زمان دو برابر شدن کوتاه که حدود 20 دقیقه می باشد.
ژنوم E.coli یک تک کروموزوم حلقوی DNA، به طول5/5 -5/4 mb می باشد. بنابراین این ارگانیسم هاپلوئید است، هر چند یک کپی از بخشی از کروموزوم آن می تواند بر روی پلاسمید های آن حمل شود، اشرشیا کلی معمولاً دارای تعدادی DNA ی حلقوی خارج کروموزومی به نام پلاسمید می باشد. بسیاری از سویه های اشرشیا کلی پلاسمیدهای خارج کروموزومی را حمل می کنند که می توانند کونزوگاتیو و انتقال پذیر یا غیر قابل انتقال باشند. تیپ دیگری از پلاسمید ها که در حدود 30 درصد از تیپ های وحشی اشرشیا کلی یافت می شوند، فاکتور کلی سین 2 است. کلی سین ها توکسین های هستند که توسط یک باکتری تولید شده و باکتری های دیگر را می کشند .حداقل 20 تیپ مجزای از پلاسمیدهای کلی سین که برخی از آنها انتقال پذیر هستند، در سویه های اشرشیا کلی یافت شده است.
1-7- بیماری زایی اشریشیاکلی
اکثر سویه های اشریشیاکلی به صورت همسفره یا کامنسال در دستگاه گوارشی انسان و دام ها حضور دارند. اما برخی از آن ها بیماری زا بوده و قادرند بیماریهای گوارشی و غیر گوارشی ایجاد نمایند. سویه های بیماری زا قابلیت تولید و نمود طیف وسیعی از عوامل حدت را دارند که بر این اساس به پاتوتیپ های مختلفی تقسیم می شوند..
1-7-1- فاکتور های حدت
اهمیت هر کدام از عوامل حدت به وضعیت میزبان، محل عفونت و توان ژنتیکی سویه خاص بستگی دارد که بسته به سویه توسط پلاسمید 1و یا کرومزوم کد می شود(بیلاوسکا و همکاران، 2004)2.
1-7-1-1- کپسول
اشرشیا کلی ممکن است باعث ایجاد عفونت های گوارشی و خارج گوارشی گردد، بطور کلی سویه هایی که عفونت غیرگوارشی ایجاد می کنند کپسول دار هستند. کپسول یکی از مهمترین سویه هایی که عفونت غیرگوارشی ایجاد می کنند کپسول دار هستند. کپسول یکی از مهمترین عوامل حدت است که جرم پاتوژن را قادر می سازد تا در مراحل اولیه عفونت (که هنوز ایمنی ایجاد نشده است) بتواند از فعالیت سیستم ایمنی غیراختصاصی فرار کند که این عمل از طریق تعارض با فاگوسیت ها و فعالیت عامل کمپلمان امکان پذیر می گردد. البته این اثرات موقت بود و در مرحله ایمنی3، سیستم دفاعی با تولید پادتن اختصاصی ضدکپسول، قادر به حذف جرم می گردد. کپسول این باکتری را به دو دسته تقسیم می کنند که براساس تفاوتهای بیوشیمیایی است(جانسون و آدم، 2000)4.
1-7-1-2- آندوتوکسین 5
دیواره سلولی باکتری های گرم منفی است، که در اثر مرگ (LPS) ترکیب لیپوپلی ساکاریدی از لیپوپلی ساکارید است. نقش A سلول آزاد می شود. فعالیت این توکسین وابسته به لیپید آندوتوکسین در بیماری، تب زایی، آسیب آندوتلیالی و به دنبال آن انعقاد داخل عروقی منتشر (DIC)6 و شوک آندوتوکسیک است. این اثرات اهمیت زیادی در بروز بیماری های سپتی سمی دارند.
1-7-1-3- پروتئین های اتصالی فیمبریه ای 7
سویه های اشرشیا کلی مقدار زیادی ادهسین 8های اختصاصی دارد.
این ادهسین ها عبارت اند از: آنتی ژن های فاکتور کلونیزاسیونCFA/I, CFA/II,CFAIII))، فیمبریه های چسبنده (AFA/III و AFAI) و پیلی های تولید کننده کلاف (BFP)، اینتیمین 1، پیلی P، پروتئین IPA و فیمبریه های Dr (موری، 1389).
عوامل چسبنده سطحی، فیمبریه ها و سایر عوامل سطحی ادهسین نامیده می شود. در یک تقسیم بندی، فیمبریه ها را به دو قسمت تقسیم می کنند: فیمبریه های مقاوم به مانوز 2 و فیمبریه های حساس به مانوز 3، فیمبریه های حساس به مانوز قادرند به رسپتور هایی از سلول میزبان متصل گردند، که واجد مانوز باشند. این فیمبریه ها را، فیمبریه تیپ I یا پیلی مشترک 4 نیز می نامند زیرا بر روی اکثر سویه های اشرشیا کلی یافت می شوند. فیمبریه تیپ I در سیطره یافتن باکتری در غیاب سایر فیمبریه ها اهمیت دارد و برای آنها هیچ عملکرد پاتوژنی تعیین نشده است. عوامل سطحی که با ادهسین های مقاوم به مانوز مرتبط هستند، همگی در جایگزینی سویه های بیماری زا در بافت های مختلف میزبان نقش مهمی را ایفا می کنند و در سویه های بیماری زا دیده می شوند. فیمبریه تیپ I بیشترین اهمیت را در کلونیزاسیون باکتری در مثانه و کلیه دارد.
1-7-1-4- اگزوتوکسین ها
اثرات پاتولوژیک عفونت های حاصل از اشرشیا کلی های بیماری زا، به غیر از مواردی که مربوط به آندوتوکسین هاست، عمدتاً مربوط به تولید آنتروتوکسین ها، وروتوکسین ها 5و یا عوامل نکروز کننده سمیت یاخته ای 6 می باشد. بر خلاف آنتروتوکسین ها که تنها روی فعالیت عملکردی آنتروسیت ها موثرند، وروتوکسین ها و عوامل نکروز کننده ی سمیت یاخته ای آسیب های سلولی قابل مشاهده در محل عمل خویش ایجاد می کنند.

1-7-2-1- انتروتوکسین ها
انتروتوکسین ها سموم پروتئینی هستند که عملکرد مجاری گوارشی را تحت تاثیر قرار می دهند و شامل توکسین های مقاوم به حرارت (STa,STb)1و توکسین حساس به حرارت (LT1-LT2 )2 می باشند.
1-ST : خانواده ای از توکسین های کوچک مقاوم به حرارت و غیر آنتی ژنی هستند که به دو گروه محلول در متانول (STa یاST1 ) و غیر محلول در متانول (STb یا ST2) تقسیم می شوند. STa آنزیم گوانیلات سیکلاز 3را در سلول های اپیتلیال پرزهای روده فعال کرده و سبب افزایش GMP حلقوی در سلول های پرزهای ایلئوم و ژوزنوم می شود که این عمل باعث افزایش ترشح مایعات و در نتیجه عدم جذب سدیم و کلر توسط پرزهای روده شده و به همین دلیل با افزایش مایعات در روده اسهال رخ می دهد. مکانیسم عمل STb شناخته نشده است و تاثیری روی GMP حلقوی ندارد و فقط افزایش ترشح کربنات ها را بیش از کلرایدها باعث می شود(فروست . همکاران، 2014).
2-LT: آنتروتوکسین حساس به حرارت است که توسط پلاسمید رمز می شود. از نظر ساختاری مشابه توکسین کلرا هستند و به دو نوع LT1 و LT2 تقسیم می شوند. این توکسین ها به وسیله انکوباسیون در 100 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه غیر فعال می شوند و از نظر ساختاری بسیار شبیه سم کلرا می باشند به گانگلیوزید GM1 در سلول های مخاطی روده اتصال می یابد. بعد از ورود، باعث فعال کردن آدنیلات سیکلاز4 می شود که در نتیجه آن میزان AMP حلقوی داخل سلول افزایش می یابد و منجر به ترشح زیاد سدیم، کلر و آب از سلول به داخل روده باریک می گردد. LT2 رسپتورهای مختلفی دارد و عمدتاً در سویه هایی با منشا حیوانی یافت می شود.
1-7-2-2- سیتوتوکسین ها
گروه دوم از توکسین های تولید شده توسط اشرشیا کلی سیتوتوکسین ها می باشند که توسط پاتوتیپ NTEC تولید می شوند و به سه دسته ی اصلی تقسیم شده اند :
توکسین CNF1 : فاکتور سیتوتوکسینی نکروز دهنده 1
توکسین CNF2 : فاکتور سیتوتوکسینی نکروز دهنده 2
توکسین CDT: توکسین تورم دهنده کشنده سلول (ادیب فر، 1383)
1-7-2-3- وروتوکسین ها
این سم از نظر ساختاری و عملکردی و آنتی ژنی شبیه به سم شیگا (STx1,STx2)1، در شیگلا دیسانتری است و به همین علت توکسین شبیه شیگلا یاSLT 2 نامیده می شود. این نوع توکسین ها حساس به حرارت بوده و برای سلول های کشت سلولی ورو 3خاصیت کشندگی دارند. توکسین های SLT بر دو نوع است:
1) توکسین SLT1 : فقط دارای یک نوع پادتن است که فعالیت آن توسط آنتی بادی اختصاصی توکسین شیگلا خنثی می شود.
2) توکسین SLT2 : گروهی از توکسین ها هستند که از نظر پادتنی ارتباط نزدیک با هم دارند و با توکسین شیگلا و آنتی بادی اختصاصی SLT خنثی نمی شوند. سویه های تولید کننده توکسین در انسان سبب اسهال، کولیت هموراژیک و سندرم همولیتیک- اورمیک می شود، که با اسهال همراه است علت این علائم به درستی مشخص نیست، اما محققین بر این باورند که وروتوکسین به سلول های اندوتلیال آسیب می زند که منجر به کاهش تولید پروستاگلاندین I2 می شود(ادیب فر، 1383).
1-7-2-4- آلفا همولیزین ها
آلفا همولیزین ها، اگرچه اغلب شاخص مفیدی برای بیماری زایی در سویه های خاص اشرشیا کلی است، اما ظاهراً به طور مستقیم با بروز بیماری زایی مشارکت ندارند.عمل آلفا همولیزین میزان دسترسی اجرام مهاجم به آهن را بالا می برد. این آنزیم توسط سویه های یوروپاتوژن اشرشیا کلی ترشح می شود و توکسینی است که باعث آسیب بافتی میزبان و تسهیل انتشار باکتری می گردد و در پاتوژنز باکتری نقش دارد.
1-7-2-5- سیدروفورها4
مولکول های متصل به آهن مانند آئروباکتین 5 و آنتروباکتین 6 به وسیله ی برخی از سویه های بیماری زایی اشرشیا کلی، سنتز می گردند. زمانی که میزان آهن در دسترس بافتی پایین باشد، این مولکول ها با اتصال به آهن موجبات ادامه ی حیات باکتری را فراهم می نمایند. باکتری ها به واسطه تولید ترکیبات ترشح کننده آهن مانند آئروباکتین با پروتئین های ترشح کننده آهن موجود در بدن رقابت کرده و آهن را از آنها می گیرد.
1-7-3- تغیر فاز آنتی ژنی
بیان آنتی ژن ها کپسولی و تاژکی تحت کنترل ژنتیکی ارگانیسم می باشد. هر یک از این آنتی ژن ها می توانند بیان شده یا بیان نشوند (تغییر فاز) و این ویژگی باکتری را در برابر مرگ به واسطه آنتی بادی ها حفاظت می کند.
1-7-3-1- سیستم ترشحی نوع III
این سیستم، سیستم موثری برای ارسال فاکتور های حدت به داخل سلول یوکاریوتی هدف می باشد و متشکل از 20 پروتئین می باشد که هنگام تماس باکتری با سلول، ترشح فاکتور های حدت باکتری را به داخل سلول هدف تسهیل می کند. در فقدان این سیستم باکتری بیماری زایی خود را از دست می دهد.
1-7-4- بیماری در انسان
سویه های اشرشیا کلی می توانند سبب انواع مختلفی از بیماری ها مانند سپتی سمی1، پنومونی2، مننژیت 3، عفونت های کلیه و مثانه4، سندرم اورمی همولیتیک یا HUS و اسهال در انسان گردند. بر اساس ظهور علائم کلینیکی اشرشیا کلی های پاتوژن به گروه های مختلفی تقسیم می شوند.
اشرشیا کلی های پاتوژن روده ای
اشرشیا کلی های پاتوژن خارج روده ای
1-7-4-1-پاتوتیپ های اشرشیا کلی های پاتوژن روده ای
تاکنون چندین پاتوتیپ اشرشیا کلی اسهال زا در انسان و دام ها شناخته شده است (موری، 1389)
اشرشیا کلی انتروتوکسیژن (ETEC)1
اشرشیا کلی انتروپاتوژن (EPEC)2
اشرشیا کلی انترواگرگتیو (EAEC)3
اشرشیا کلی انتروهموراژن (EHEC)4
5 - اشرشیا کلی انتروانیواسیو (EIEC)5
1-7-4-2- پاتوتیپ اشرشیا کلی توکسین زای روده ای (ETEC)
اشرشیا کلی انتروتوکسیژن ETEC)) به سویه هایی از اشرشیا کلی اطلاق می گردد که قابلیت تولید حداقل یکی از دو نوع انتروتوکسین حساس به حرارت یا LT و مقاوم به حرارت یا ST را دارا می باشد. سویه های ETEC توسط پیلی های خاص به دیواره روده می چسبند و سپس از طریق توکسین باعث ایجاد اسهال می شوند. سویه های ETEC اولین بار در اسهال حیوانات و سپس در انسان نیز مشاهده شدند. این ارگانیسم تولید دو نوع انتروتوکسین می نماید که توسط ژن های موجود بر روی پلاسمید کد می شود و می تواند با تولید این انتروتوکسین باعث ترشح مایعات به داخل روده شده و اسهال آبکی ایجاد نماید. این سویه ها یکی از اصلی ترین عوامل اسهال در مسافران می باشند. سویه های ETEC هم در بزرگسالان و هم در کودکان به ویژه شیرخواران اسهال وبایی شکل به صورت اسپورادیک و اپیدمیک به وجود می آورد ولی شدت بیماری از وبا کمتر است گاستروانتریت ایجاد شده توسط گروه ETEC به واسطه تولید انتروتوکسین های حساس به حرارت LT-II,LT –I و مقاوم به حرارت ST می باشد LT-I از نظر ساختاری و عملکرد بسیار شبیه به کلراتوکسین بوده و عامل بیماری در انسان می باشد در حالی که LT-II عامل بیماری در انسان نیست. آب و مواد غذایی آلوده از مهمترین عوامل انتقال بیماری می باشد.اسهال ایجاد شده توسطETEC خود محدود کننده می باشد و پس از دو یا سه روز بهبودی حاصل می گردد و موارد مرگ و میر صرفاً در کودکان شیر خوار در کشور های در حال توسعه مشاهده می شود.
1-7-4-3- پاتوتیپ اشرشیا کلی بیماری زا ی روده ای EPEC
اشرشیا کلی انتروپاتوژن (EPEC) عامل بیماری اسهال نوزادان در کشورهای در حال توسعه بوده و از قدیمی ترین پاتوتیپ های شناسایی شده اشرشیا کلی می باشند که در روده کوچک تکثیر یافته و اساساً باعث اسهال حاد و غیر خونی می گردند. اغلب عفونت های EPEC در طول سه سال اول زندگی رخ می دهد و سویه های EPEC به ندرت باعث اسهال بعد از یک سالگی می شود و تقریباً همه بیماران 6 ماهه و یا کوچکتر می باشد. سویه های EPEC قبلاً با شیوع اسهال در شیرخواران کشورهای توسعه یافته در ارتباط بوده است. این ارگانیسم از طریق اتصال به دیواره روده باعث بهم ریختگی ساختار در سلول گردیده و منجر به ایجاد ضایعات هیستوپاتولوژیک A&E 1 در سطح روده می شود و با این عمل پدیده جذب و دفع روده مختل می گردد.
شایع ترین سروگروه های EPEC که عامل اصلی اسهال در انسان شناخته شده اند شامل O142, O85, O86, O111ab, O119, O125ac,O55, O127, O126, O128ab, O114 می شود. انسان مخزن اصلی این پاتوتیپ ها بوده است و در سال 1995 این سویه ها به دو دسته ی مجزا تقسیم شده اند:
سویه های انتروپاتوژن تیپیک2 : به سویه هایی از سروگروپ های بالا اطلاق می شود که دارای دو ژن به نام های eae (ژن کدکننده پروتئین غشای خارجی) و bfp3 ( ژن کد کننده پیلی) می باشند.
سویه های انتروپاتوژن آتیپیک4 : به سویه هایی از سروگروپ های بالا اطلاق می شود که دارای ژن eae بوده و فاقد ژن bfp می باشند.
مطالعات اپیدمیولوژی بیانگر این امر می باشند که سویه های آتیپیک در کشورهای پیشرفته و صنعتی شایع هستند در حالیکه سویه های تیپیک در کشورهای در حال توسعه شیوع دارند. در کشور ما ایران مطالعات موجود نشان می دهد که سویه های تیپیک و هم آتیپیک از موارد اسهال جدا می شوند.
1-7-4-4- پاتوتیپ اشرشیا کلی انترواگرگتیو(EAggEC)
پاتوتیپ اشرشیا کلی انترواگرگتیو عامل ایجاد اسهال آبکی پایدار نوزادان در کشورهای در حال توسعه و اسهال مسافرین در این کشورها است. این سویه ها به وسیله الگوی چسبندگی آجری شکل بی نظیری که طی 6 ساعت بعد از کشت در سلول های کشت سلولHEP-2 1 ایجاد می کنند، شناسایی می شوند. این فرایند توسط شماره یک چسبنده ایجاد کننده تجمع صورت می گیرد که باعث حفاظت از باکتری در برابر آنتی بیوتیک ها و فاگوسیتوز می شود(جودیت و مازنر، 1373; کوبین و همکاران، 1386). بنابراین می توان تست HEP-2 را به عنوان روش استاندارد طلایی برای شناسایی سویه هایی (EAggEC) دانست. این باکتری با CFA2 مقاوم به قند مانوز مشخص می شود. این ارگانیسم ژن های eae را ندارد و ضایعات A&E را ایجاد نمی کنند.
سویه های (EAggEC) به عنوان یک پاتوژن نوظهور با شیوع روزافزون شناخته شده و همچنین به عنوان دومین عامل اتیولوژی از راه مدفوعی-دهانی انتقال می یابد و مکانیسم بیماری زایی پیچیده ای دارد. پاتوژنز این سویه ها شامل سه مرحله است:
اتصال به لایه موکوس روده توسط پیلی خاص (AAFs)3
تولید موکوس توسط باکتری و سلول های میزبان که باعث ایجاد بیوفیلم بر روی سطح، آنتروسیت های روده می شود.
تولید و آزادسازی توکسین های مختلف و بروز پاسخ های التهابی که در نهایت توکسیسیتی موکوس و ترشح روده را سبب می شود. این باکتری توکسین شبیه ST4 یا EAST5 و همولیزین تولید می کند.
1-7-4-5- پاتوتیپ اشرشیا کلی انتروهموراژیک (EHEC)
سویه های اشرشیا کلی انتروهموراژیک (EHEC) از جمله زیر گروه های اشرشیا کلی تولید کننده ی شیگا توکسین می باشند که باعث ایجاد کولیت هموراژیک6 و سندرم همولیتیک اورمیک در انسان می شوند. مهمترین سروتیپ شایع، O157:H7 می باشد که باعث اپیدمی و مرگ و میر می شود، از طرف دیگر سویه های تولید کننده شیگا توکسین دیگری هستند که به سروتایپ های دیگر متعلق می باشند.
و اصطلاحاً به آنانNon O157:H7 می گویند. دام ها از مهمترین منابع عامل بیماری می باشند. یکی از فاکتورهای حدت سویه های (EHEC)، تولید توکسینی مشابه با شیگا توکسین است که دارای اثرات سیتوتوکسیک روی سلول های ورو می باشد به همین خاطر این ارگانیسم ها اشرشیا کلی تولید کننده وروتوکسین یا VTEC 1یا اشرشیا کلی تولید کننده ی شیگاتوکسین STEC2هم نامیده می شوند(واکر، 1386; ارن، 2006). مخزن اصلی سویه های VTEC مجاری معدی-روده ای گاو و دیگر حیوانات مزرعه و انسان است لذا آلودگی انسان با این سویه ها معمولاً مربوط به مصرف گوشت گاو آلوده یا نیم پز، شیر غیر پاستوریزه، آب و سبزیجات آلوده به مدفوع است. در سال های اخیر، تماس مستقیم یا غیر مستقیم با حیوانات یا مدفوع آنها به خصوص گاوها به عنوان مهمترین راه انتقال بیماری به انسان شناسایی شده است(بیسر و همکاران، 1993)3.
1-7-4-6- پاتوتیپ اشرشیا کلی انترواینواسیو(EIEC):
سویه های اشرشیا کلی انترواینواسیو، می توانند هم اسهال آبکی و هم اسهال خونی که شبیه دیسانتری می باشد ایجاد نمایند. سویه های (EIEC) از نظر خواص بیوشیمیایی، ژنتیکی و پاتوفیزیولوژی شبیه به سویه های شیگلا می باشند. این سویه ها، لیزین را دکربوکسیله نمی کنندو معمولاً لاکتوز را تخمیر نکرده یا دیر تخمیر می کنند. اکثر آن ها غیر متحرک هستند و آنتی ژن O مشابه با آنتی ژن های خاص شیگلا دارند. سویه های (EIEC) به واسطه ی خصوصیات تهاجمی داشتن شناسایی می گردند. سویه های اشرشیا کلی انترواینواسیو جزء سروتیپ های O124, O143, O164 می باشند. این باکتری قادر است به اپی تلیوم روده بزرگ تهاجم نموده و آن ها را تخریب کند و موجب بیماری شود. در ابتدا اسهال آبکی است اما به زودی مشابه اسهال دیسانتری باسیلی شد و خون و موکوس در مدفوع دیده می شود(جودیت و مازنر، 1373; کوبین و همکاران، 1386).
1-8- عفونت های اشرشیا کلی های خارج روده ای
برخلاف اشرشیا کلی های مسئول بیماری های اسهالی، باکتری های خارج روده ای یا ExPEC4باکتری های کومنسال روده ی انسان و حیوانات هستند و تنها وقتی که وارد خون، مایع مغزی و نخاعی یا CSF یا مجاری ادراری شوند، به پاتوژن های حاد تبدیل می شوند. سویه های ExPEC منجر به سندرم های کلاسیک مثل UTI، باکتریمی یا مننژیت نوزادی می گردند. عفونت های ناشی از ExPEC به وسیله سه پاتوتیپ مجزا از اشرشیا کلی ایجاد می شوند :
1. اشرشیا کلی یوروپاتوژن UPEC))
2. سویه های اشرشیا کلی مسئول در مننژیت نوزادی MAEC))
3. سویه های اشرشیا کلی که سپتی سمی در انسان و حیوان ایجاد می کنند (تاج بخش، 1380; ژئوف و همکاران، 1383; دیویدسون، 1383)
1-8-1-1- باکتریوری و مننژیت اشرشیا کلی MAEC))1

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

اشرشیا کلی یکی از بیشترین موارد باکتری های گرم منفی مسئول باکتریوری در انسان است. مننژیت های MAEC در هر گروه سنی رخ می دهند، عفونت های اولیه مننژیت نوزادی معمولاً از راه انتقال عمودی از مادر و در حین زایمان یا در موارد نادری از عفونت های بیمارستانی ناشی می شوند. مادامی که باکتریوری در خلال UTI رخ می دهد. خصوص هنگامی که انسداد مجاری ادراری وجود داشته باشد، باکتریوری گسترش یافته و منجر به مننژیت می گردد. سویه های MAEC معمولترین باکتری های گرم منفی هستند که می توانند سبب مننژیت در انسان گردند. در مننژیت های اشرشیا کلی فاکتور اتصالی اصلی برای اتصال باکتری به سلول های آندوتلیال مغز، فیمبریه S می باشد.
1-8-1-2- سپسیس2
سپسیس ناشی از اشرشیا کلی معمولاً به دنبال عفونت های UTI رخ می دهند و در زنان بیش از مردان دیده می شوند. در بیش از 85 تا 95 درصد بیماران مبتلا به سپسیس، بیماری های کبدی، بدخیمی های خونی، تومور و دیگر سرطان ها نیز رایج است. سپسیس و مننژیت اغلب ناشی از سویه های اشرشیا کلی دارای آنتی ژن کپسولی K1 می باشند.
1-8-1-3- التهاب مثانه3
التهاب مثانه ناشی از اشرشیا کلی، معمولاً با سوزش حاد حین دفع ادرار و درد کمر مشخص می شود. در حالی که پیلونفریت، قسمت های بالاتر مجاری ادراری (کلیه ها و لگنچه )را درگیر می کند و ممکن است آرام یا با تهوع و استفراغ همراه با سپسیس رخ دهد.

–264

٣-٢: مراحل جداسازی باکتری.............................................................................................۲٩
٣-٣: شناسایی باکتری...........................................................................................................٣٠
٣-۴:سنجش میزان تجزیه فنل توسط باکتری جداسازی شده...............................................٣٠

٣-۵.: Cell concentration........................................................................................................٣١
٣-۶: روش بهینه سازی و طراحی آزمایش............................................................٣۲
٣-۶-.١: طراحی آزمایش ( نرم افزارPlackettBurman).................................................٣۲
٣-۶-۲:. طراحی آزمایش(RSM)......................................................................................٣۵
٣-۷: تعیین صحت مدل سطح پاسخ.....................................................................................٣۶
٣-٨:.آنالیز آماری.....................................................................................................................................٣۶
فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها و یافته های تحقیق
۴-١: نتایج جداسازی و شناسایی باکتری..............................................................................۴١
۴-٢: نتایج طراحی آزمایش( PlackettBurman )..........................................................۴٣
۴-٣: نتایج بهینه سازی و طراحی آزمایش( RSM).............................................................۴٨
۴-۴: صحت مدل سطح پاسخ...............................................................................................۶٨
فصل پنجم: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات
بحث......................................................................................................................................۷٠
نتیجه گیری کلی....................................................................................................................۷۷
پیشنهادات..............................................................................................................................۷٨
"منابع"...................................................................................................۷٩
چکیده انگلیسی......................................................................................................................٨٣

فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول ۱-۱: غلظت ترکیبات فنلیک در برخی صنایع.............................................................۷
جدول ۱-٢: ترکیبات فنلی موجود در فاضلاب برخی صنایع.................................................٨
جدول٣-۱: تجهیزات آزمایشگاهی........................................................................................٢۷
جدول ٣-٢: وسایل مورد استفاده.........................................................................................۲٨
جدول ٣-٣: مواد مورد استفاده در محیط کشت...................................................................۲٩
جدول ٣-۴: طراحی آزمایش ( PlackettBurman ) بر اساس مقادیر کد شده...............٣٣
جدول ٣-۵: طراحی آزمایش ( PlackettBurman ) بر اساس مقادیر واقعی..................٣۴
جدول ٣-۶-مقادیر کد شده و حقیقی در روش طراحی آزمایش RSM............................٣۶
جدول ٣-۷: آزمایشات بهینه ٣٠ گانه روش طراحی آزمایش (RSM)...............................٣۷
جدول ٣-٨: سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش (RSM).......................................٣٨
جدول ۴-۱: نتایج کشت باکتری جدا شده...........................................................................۴۲
جدول ۴-٢: نتایج طراحی آزمایشPlackettBurman براساس مقادیر کد شده...............۴۴
جدول ۴-٣: نتایج طرح آزمایش بر اساس مقادیر واقعی.....................................................۴۵
جدول۴-۴:آنالیز واریانس (ANOVA) برای آزمایشات انجام شده با روشPlackettBurman برای رشد باکتری.......................................................................۴۶
جدول۴-۵: آنالیز واریانس (ANOVA) برای آزمایشات انجام شده با روشPlackettBurman برای درصد تجزیه فنل...............................................................۴۷
جدول۴-۶ : نتایج آزمایشات بهینه ٣٠ گانه طراحی آزمایشRSM.....................................۵٠
جدول ۴-۷:نتایج سطوح کد شده بر اساس طراحی آزمایش RSM....................................۵١

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

جدول۴-٨: آنالیز واریانس (ANOVA) برای آزمایشات انجام شده با روش RSM برای نتایج رشد باکتری..................................................................................................................۵۲
جدول۴-٩: آنالیز واریانس (AVONA) برای آزمایشات انجام شده با روش RSM برای نتایج درصد تجزیه فنل..........................................................................................................۶٠
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل ۴-١-باکتری جدا شده در محیط Medium Salt  Mineral و در زیر میکروسکوپ نوری......................................................................................................................................۴١
شکل ۴-۲-انطباق مقدار تجربی ومقدار پیش بینی شده در رشد باکتری در nlackettBurmP....................................................................................۴۶
شکل۴-٣- انطباق مقدار تجربی و مقدار پیش بینی شده درصد تجزیه فنل در nlackettBurmP...............................................................................................................۴۷
شکل ۴-۴-انطباق مقدار تجربی و مقدار پیش بینی شده در رشد باکتری در RSM...................................................................................................................................۵٣
شکل ۴-۵- تاثیر متقابل پارامترهای آمونیوم سولفات و غلظت فنل بر میزان رشد سلولی باکتری...................................................................................................................................۵۴
شکل ۴-۶- تاثیر متقابل پارامترهای آمونیوم سولفات وPH بر میزان رشد سلولی باکتری....۵۵
شکل ۴-۷- تاثیرمتقابل پارامترهای مقدار آمونیوم سولفات و دما بر میزان رشد سلولی باکتری...................................................................................................................................۵۶
شکل ۴-٨- تاثیر متقابل پارامترهای غلظت فنل وPH بر میزان رشد سلولی باکتری............۵۷
شکل ۴-٩- تاثیر متقابل پارامترهای غلظت فنل و دما بر میزان رشد سلولی باکتری............۵٨
شکل ۴-١٠- تاثیر متقابل پارامترهایPH و دما بر میزان رشد سلولی باکتری....................۵٩ شکل ۴-١١- انطباق مقدار تجربی و مقدار پیش بینی شده در تجزیه فنل در RSM..........۶١
شکل ۴-١۲- تاثیر متقابل پارامترهای آمونیوم سولفات و غلظت فنل بر میزان تجزیه فنل...۶۲
شکل ۴-١٣- تاثیر متقابل پارامترهای آمونیوم سولفات وPH بر میزان تجزیه......................۶٣
شکل ۴-۱۴- تاثیر متقابل پارامترهای مقدار آمونیوم سولفات و دما بر میزان تجزیه فنل..۶۴
شکل ۴-۱۵- تاثیر متقابل پارامترهای غلظت فنل وPH بر میزان تجزیه فنل......................۶۵
شکل ۴-۱۶- تاثیر متقابل پارامترهای غلظت فنل و دما بر میزان تجزیه فنل........................۶۶
شکل ۴-۱۷- تاثیر متقابل پارامترهای PH و دما بر میزان تجزیه فنل..................................۶۷
چکیده:
ترکیبات فنلی ، فنل و مشتقات فنل ، آلوده کننده های محیطی هستند که در پساب های صنعتی مختلف مانند تبدیلات زغال سنگ ، پالایشگاه نفت ، کارخانه های شیمیایی و پتروشیمی وجود دارند.حضور این ترکیبات خطر جدی برای محیط زیست در پی دارد زیرا این پساب ها وارد رودخانه ها و دریا می شوند و موجب آلودگی آبها می گردند.بهترین و کم هزینه ترین روش تصفیه پساب های آلوده به فنل و ترکیبات فنلی استفاده از روش های تصفیه زیستی است. در این تحقیق، نمونه ها از مناطقی از دریای خزر که آلودگی نفتی دارند جمع آوری شد.هدف از این تحقیق جداسازی و بهینه سازی باکتری های تجزیه کننده فنل بود که مورد بررسی قرار گرفت.بعد از جمع آوری نمونه و انتقال آن به آزمایشگاه، از محیط medium salt mineral برای جداسازی باکتری استفاده شد.از نرم افزار Burman-Plackett و methodology surface Response ) RSM( برای بررسی تاثیر فاکتورهای مختلف بر رشد باکتری و درصد تجزیه فنل استفاده شد. فاکتورهای مورد بررسی در Burman-Plackett ، فنل به عنوان منبع کربن و آمونیوم سولفات، سدیم کلرید، پپتون و عصاره مخمر به عنوان منبع ازت بود.فنل به عنوان بهترین منبع کربن و آمونیوم سولفات به عنوان بهترین منبع ازت در مرحله بهینه سازی با نرم افزار RSM مورد بررسی قرار گرفته است. فاکتورهای مورد بررسی در RSM، آمونیوم سولفات ، غلظت فنل، pH و دمای انکوباسیون بود. نتایج پیش بینی شده توسط نرم افزار با نتایج بدست آمده برای رشد باکتری و درصد تجزیه فنل نزدیک بوده است که نشان می دهد سویه ی جدا شده از دریای خزر توانایی زیادی در تجزیه فنل داراست.
کلمات کلیدی: فنل،جداسازی باکتری،دریای خزر، Plackett-Burman، RSM

۱-۱-مقدمه: مبارزه با آلودگی های نفتی از زمان پیدایش این ماده سیاهرنگ اما گرانبها، بخشی از پژوهش های علمی را به خود اختصاص داده که در گذشته به مراتب کمتر و امروزه به طور روز افزون، توجه متخصصان و کارشناسان را به خود جلب کرده است. در میان راهکارهای ارایه شده با نتایج هر چه بهتر و سریعتر، استفاده از میکروارگانیسم ها روشی است که با عنوان پاکسازی زیستی یا تجزیه زیستی Bioremediation در اکثر کشورهای پیشرفته مورد استفاده قرار می گیرد.
نفت خام، کمپلکس پیچیده ای از مخلوط صدها نوع ترکیب مختلف شامل هیدروکربنها، نیتروژن، گوگرد و وانادیوم است که قسمت هیدروکربنی شامل ترکیبات آروماتیک، آلیفاتیک و آسفالتن است. آلودگی های نفتی تقریباً یک پیامد اجتناب ناپذیر از افزایش سریع جمعیت و مصرف انرژی است که بر پایه تکنولوژی نفت قرار دارد. طی سالهای گذشته تمام توجه کارشناسان به آلودگی های نفتی اقیانوس ها ناشی از تصادف نفت کش ها معطوف شده بود که بزرگترین آن در سال١٩۶۷در آبهای انگلستان رخ داد.  در سالهای اخیر دریای خزر به دلیل تردد کشتی های نفت کش، حفر چاه های متعدد بویژه در سواحل استان گیلان، همچنین تاسیس پالایشگاه نفتی و استخراج نفت در این استان، سالانه حدود١۶٠ هزار تن نفت و مواد نفتی را در خود جای می دهد و به عنوان یکی از آلوده ترین دریاهای جهان شناخته می شود. به طور کلی وقایعی که به برخی از آنها اشاره شد، سبب شد تا توجه بیشتری به ساخت و ابداع روشهای مختلف معطوف شود تا بتوان با آلودگی های دریاها و نواحی ساحلی مقابله کرد. روشهای متعددی برای حذف آلودگی های نفتی در محیط زیست ارایه شده که مهمترین آنها عبارتند از:
۱-جمع آوری دستی آلودگی های نفتی از سطح آب
۲-محصور کردن آلودگی های نفتی به وسیله وسایل فیزیکی
۳-استفاده از موادی مانند پر و کاه که ذرات نفت را جذب می کند
۴-آتش زدن
۵-استفاده از حلال های دو قطبی
۶-پاکسازی زیستی یا تجزیه زیستی و یا Bioremediation
۲۵ درصد از نفت رها شده در آب از طریق تبخیر از بین می رود و بقیه به وسیله عمل اکسایش نوری و اکسایش میکروارگانیزم ها شکسته می شود. حضور میکروارگانیزم های تجزیه کننده هیدراتهای کربن در آب دریا و خاکها سبب شده که تجزیه به عنوان یکی از موثرترین روشهای حذف آلودگی های نفتی معرفی شود. این عمل در حضور اکسیژن و مواد غذایی به خصوص نیتروژن و فسفر تسریع می شود. فراورده های حاصل از تجزیه زیستی معمولاً CO2 و مواد آلی کوچک مولکول با سمیت بسیار کم است. روش های متعددی برای تجزیه توسط میکروارگانیزم ها وجود دارند که از جمله مهمترین آنها می توان به bioleaching- bio augmentation -Biostimulation-Bioreactor اشاره کرد. انواع روش های فوق در کشورهای صنعتی نظیر آمریکا، ژاپن، آلمان، انگلستان، کره جنوبی و روسیه به طور معمول استفاده می شود و در سایر کشورهای در حال پیشرفت در مرحله تحقیقاتی است. میکروارگانیزم های متعددی برای تجزیه هیدروکربنهای نفتی بکار می روند که مهمترین آنها عبارتند از: باکتری ها- آنزیمها- اکتینومسیت ها – قارچها اصولاً تجزیه پذیری ترکیبات نفتی به صورت زیر است: آلکان<آلکن= آلیکن< هیدروکربونهای آروماتیک< هیدروکربنهای پلی آروماتیک در میان میکروارگانیزم های فوق آنزیمها از اهمیت بیشتر برخوردارند. آنزیم ها قادرند هم ترکیبات آلیفاتیک و هم ترکیبات آروماتیک موجود در نفت را تجزیه کنند. آنزیمهای مونواکسیژناز و دی اکسیژناز مهمترین آنزیمهای موثر در تجزیه هیدروکربنهای نفتی بوده و فراورده های حاصل از فعالیت این آنزیمها، الکلها هستند، بنابراین با سنجش میزان الکل ها می توان پی به مقدار تجزیه هیدروکربن های نفتی برد. فنل از جمله آروماتیک های تک حلقه ای مهم است.این ماده و مشتقات آن در صنایع متعددی چون پالایشگاه های نفت،پتروشیمی،معادن و سموم دفع آفات کاربرد دارد که از طریق دفع غیر بهداشتی پساب این صنایع منجر به آلودگی محیط زیست و به خصوص منابع آبی می شود.

۱-۲-فنل و خصوصیات فیزیکی آن:

فنل با فرمول ArOH (C6H5OH) یک ترکیب حلقوی است که با نام های هیدروکسی بنزن یا اسید کاربولیک (Carbolic Acid)شناخته می شودو به فرم مختلف و در ترکیب با عناصر مختلف وجود دارد (١). فنل ها بلور های سفید سوزنی شکل نیمه شفاف به صورت توده متبلور و جاذب الرطوبه می باشد.فنل به صورت مایع یا جامد دارای نقطه ذوب پایین اما نقطه جوش بالا است زیرا در ساختمان خود پیوندهای هیدروژنی دارد وحتی در مقادیر کم می تواند با آب پیوند هیدروژنی برقرار کند(٩ گرم در هر ١٠٠میلی لیتر آب). فنل دارای وزن مولکولی ١١/٩۴،وزن مخصوص ٠۷۲/١،نقطه ذوب ۴١درجه سانتی گراد،نقطه جوش ١٨۲ درجه سانتی گراد،چگالی بخار ۲۴/٣وضریب شکست در ۴۵درجه سانتی گراد معادل ۵۴/١و فشار بخار معادل ٣۵١٣/٠ میلی متر جیوه در ۲۵درجه سانتی گراد است(۲). ترکیبات فنل آلودگی جدی برای رودخانه ها به شمار می رود.
۱-۳-منابع تولید فنل:
منبع اصلی فنل در محیط طبیعی به دو صورت آنتروپوژنیک وزنوبیوتیک می باشد: منبع آنتروپوژنیک :آتش سوزی جنگل ها ، خروج طبیعی از محیط شهری حاصل از آسفالت ها که به عنوان مواد چسبنده به کار می روند و فساد طبیعی مواد لیگنوسلولزی در این دسته قرار می گیرند. منبع زنوبیوتیک:شامل پسماند های صنعتی حاصل از استخراج سوخت های فسیلی و فرآیندهای سودمند شیمیایی از قبیل صنایع تولید فنل و رزین های فنلی ،صنایع دارویی ، صنایع چوب و کاغذ ، صنایع تولید حشره کش ها و سموم کشاورزی ، صنایع چرم و دباغی ، صنایع رنگ ، صنایع تولید انواع مواد پاک کننده می باشد. فنل را می توان از فاضلاب های صنعتی مختلف مثل پالایشگاه نفت و صنایع پتروشیمی و معدن زغال سنگ و صنایع شیمیایی جدا کرد. مقدار فنل در خروجی های صنعتی نباید بیش از ۵/٠ میلی گرم در لیتر باشد. روش های فیزیکوشیمیایی برای حذف فنل وترکیبات آن استفاده می شود(٣). اما امروزه ترجیحا از تجزیه فنل استفاده می کنند که ابزار جدید حذف آلودگی محیطی است.شماری از میکروارگانیسم های تجزیه کننده فنل از منابع مختلف جدا شده است که شامل مخمر و قارچ وجلبک و باکتری می باشد.
امروزه نگرانی بسیاری در مورد موضوع وجود سموم شیمیایی همچون فنل در آب وجود دارد که می تواند از این طریق وارد بدن انسان شود ویا به مصرف جانوران آبزی برسد. آب معمولا با فاضلاب کارخانه ها آلوده می شود واین امر موجب کدر شدن آب رودخانه ها می شود.در حدود ٨٠ درصد از بیماری ها در ارتباط با آب است ودر حدود ۵٠ درصد از جمعیت های شهری جهان این مشکل وجود دارد(۴).مطالعات بر روی انسان و جانوران نشان می دهد فنل به طور موثر از طریق استنشاق و گوارش جذب می شود. بخار فنل می تواند به آسانی از طریق پوست جذب شود. فنل در فرم محلول به آسانی از پوست عبور می کند و روی کبد و کلیه و ریه اثر می گذارد. فنل سمی است و می تواند موجب کاهش فعالیت آنزیماتیک شود, اختلال در سیستم عصبی ایجاد کند و منجر به غش و اغما شود. این سم در ماهی ها بین ۲۵-۵ میلی گرم در لیتر مرگ آور است. اثر مستقیم فنل یک مانع برای واکنش های بیولوژیک است. ترکیبات فنل آلودگی جدی برای رودخانه ها است و اثر مضر آن مهار کنندگی رشد , کاهش مقاومت در برابر بیماری ها , مرگ آبزیان و افزایش رشد علف های هرز است. اگر آلودگی های فنلی در آب های زیرزمینی وارد شود سبب مشکلات اکولوژیکی جدی می شود. از اینرو حذف فنل از محیط مخصوصا از آب و منابع آب اهمیت حیاتی دارد. از روش های فیزیکو شیمیایی روتین در تخریب فنل استفاده می شود اما این روش ها هزینه بالایی دارد و تولید مواد و حدواسط مضر می کند. به همین دلیل امروزه از تجزیه میکروبی برای حذف آلودگی های فنل استفاده می شود(۵).
۱-۴- حلالیت در آب و سایر حلال ها :
فنل افزوده شده به آب ۲۵ درجه سانتی گراد در غلظت تا ٨ درصد و همچنین از ۷١ تا ٩٨درصد وزن حجمی تولید محلول های حقیقی می کند.فنل در الکل اتیلیک ،کلروفرم،تولوثن ، گلیسرین، روغن زیتون حتی بیش از ۵٠درصد حل می شود. در روغن های معدنی حلالیت آن در ۲۵ درجه سانتی گراد تقریبا ۲/٠ درصد و در اتر دوپترون ۵/۵درصد (در ٣٠ درجه سانتی گراد) و در روغن های حیوانی تا حدود ۴٠ درصداست. مطابق قانون عمومی با افزوده شدن تعداد گروه هیدروکسیل در یک ترکیب میزان حلالیت آن در آب افزایش می یابد.ولی در مورد فنل چند ظرفیتی صدق نمی کند(۶).
۱-۵- قدرت اسیدی فنل:
یک خاصیت اسیدی بعلت وجود اوربیتال ان ، مربوط به حلقه بنزن است.قدرت اسیدی فنل ها بوسیله جانشین های جاذب یا دافع الکترون تغییر می کند.از طرف دیگر وارد شدن گروه های جاذب الکترون ، مانند گروه های نیترو بسته به تعداد آن ها موجب افزایش قدرت اسیدی فنل می شود.
۱-۶-رنگ فنل:
بسیاری از فنل ها بصورت محلول های خیلی رقیق در آب یا الکل بوسیله میکرورفریک ایجاد رنگ های مشخصی می نمایند، گاهی برای ایجاد رنگ ، محلول غلیظ الکلی فنل لازم است.این رنگ ها بر حسب نوع فنل در تعداد گروه های هیدروکسی و محل قرار گرفتن آن ها متفاوت است.برای مثال فنل بنفش ، گایاکول آبی یا سبز و...
۱-۷-پایداری فنل:
فنل ها در مقابل حمله اکسیژن هوا و عوامل اکسید آن ، مانند میکرورفریک و اسید کرومیک حساس هستند.گروه های جاذب الکترون پایداری فنل ها را افزایش می دهد، در حالیکه گروه های الکترون دهنده موجب کاهش پایداری آن ها در مقابل اکسید شدن بوسیله هوا می شود(۷).
۱-۸-منابع و مصارف صنعتی:
جدول ۱-۱ : غلظت ترکیبات فنلیک در برخی صنایع
غلظت ترکیبات فنلیکmg/l صنعت

۵/۵-۴/۴ چرم سازی
۲۲
١۲٩-٨/۲ تولید خمیر کاغذ از چوب
سموم آفت کش

۷/۴
٨٠-۴٠ تولید چسب
پالایش نفت
۲۵٠٠-١۴٠٠
۶۶٠٠-١۴٠٠ تولید کک
تولید سوخت گازی ومایع از زغال سنگ
۶٠٠-۵٠٠ پتروشیمی
۴٠٠-۲٠٠
١/٩-۶/۵ نگهداری و تعمیر هواپیما
ذوب فلزات
١٠-٣
١۶٠٠ احیای لاستیک
تولید رزین های فنلیک
منابع ترکیبات فنلی
پالایشگاه نفت بی فنیل ها ،تولوئن ها، بنزن ها ، (هیدروکربن های پلی آروماتیک،سیکلوآلکان ها و آلکان ها) هیدروکربن ها ، الکل ها ، نرمال دکان ها ، نرمال اکتان ها، بوتادین ، نفتالین ها ، فنل ها
پتروشیمی و صنایع شیمیایی آنیلین ، کلرو بنزن ها ، تولوئن ، دی نیترو فنل، نیترو فنل ، اسید های سولفوریک بنزن
زغال سنگ بنزوئیک اسید ، زایلن ها ، پیرو گالل، کتکول وفنل
صنایع دارویی کلروفرم ، اتر ، اتیل الکل ، فنیل استیک اسید، بنزن الکل ها ، تولوئن ها
دباغی کتکین ، فنل ، نیترو فنل ها ، کلرو فنل
صنایع چوب و کاغذ فنیل روپیونیک اسید ، فنل ها،کلرو فنل ها، وانیلیک اسید ،بنزوئیک اسید،وانیلین،لیگنین
جدول ۱-۲: ترکیبات فنلی موجود در فاضلاب برخی صنایع
فنل از مونو هیدروکسی بنزن در قطران زغال سنگ در محیط قلیایی با راندمان ۷/٠ درصد استخراج می شود(٨).آن را از سایر مواد به وسیله عمل تقطیر جز به جز در ۷٠ الی ۲٣ درجه سانتی گراد و یا روش های دیگر تصفیه جدا می کنند و تا موقعی که اسید فنیک خاکستری و یافنل خالص تولید شود روش های سنتتیک نیز جهت تولید فنل وجود دارد. از آن جمله ذوب بنزن سولفونات سدیم است یا هیدروکسید سدیم و هیدرولیز کلروبنزین فنل در ساخت و تولید تعداد زیادی از ترکیبات عطری و مختلف شامل مواد منفجره، کودهای شیمیایی کک و گازهای درخشان ، رنگ ها ،لاستیک، اجناس تهیه شده از تینر نسوز، مواد پاک کننده ،رنگ زدا، رزین های مصنوعی ، مواد محافظت کننده و چوب، منسوجات دارو و اسپاسیالیته های دارویی عطر ها ، لوازم کاثوچویی، باکلیت و سایر مواد پلاستیکی چون رزین های فنل فرمالدهید وارد می شود.فنل در صنایع نفت، چرم ، کاغذ ، صابون ، اسباب بازی ، دباغی ، رنگرزی ، کشاورزی مصرف دارد. تماس انسان با فنل در صنعت ، جز در مواردی بسیار معدود محدود بوده است. تماس های استثنایی چندی به طریقی اتفاقی از راه پوست یا استنشاق بخارات فنل اتفاق افتاده است.اثرات سمی فنل بستگی مستقیم به مقدار فنل آزاد در خون دارد. مرگ و میر در اثر مسمومیت با افتاده است.هر چند که هنوز مسمومیت های ناشی از آن خصوصا در خانه و خانواده اتفاق می افتد(٩).مقدار یک گرم فنل از طریق خوراکی می تواند برای انسان بسیار کشنده باشد. به طور کلی باید گفت که در ۵٠ درصد از موارد مسمومیت گزارش شده مرگ اتفاق افتاده است. خوردن فنل ایجاد سوزش ، سوختگی شدید در دهان و گلو نموده و متعاقبا درد شدید معده حاصل می شود.تنفس دارای بوی فنل بوده و رنگ صورت پریده و عرق سرد آن را پوشانده است.مردمک چشم ممکن است انقباض یافته و یا گشاد شده باشد و معمولا حالت سیانوز (سیاه شدن) در مسموم دیده می شود. صرف نظر از طرز مصرف ، علایم و اثرات زیان آور فنل در حیوانات آزمایشگاهی مشابه انسان است. در انسان معمولا فنل روی مرکز فوقانی عصبی (سلسله اعصاب مرکزی) به طور مستقیم و یا غیر مستقیم اثرات عمده ای داشته و باعث اغما ناگهانی می شود. اگرچه فنل شباهت زیادی به الکل ها دارد، خواص منحصر به فرد آن موجب شده تا نتوان آن را در گروه الکل های آلیفاتیک قرار داد. این خواص بیشتر به دلیل اتصال گروه هیدروکسیل به کربن غیر اشباع می باشد . فنل ها عموما به خاطر داشتن حلقه بنزنی (آروماتیک ) از اسیدیته نسبی بالاتری نسبت ٠به الکل ها برخوردار می باشند. اسیدیته باند هیدروکسیل در فنل چیزی بین اسیدیته الکل های آلیفاتیک و اسیدهای کربوکسیلیک می باشد(١۲,١١,١٠).
١-٩-اهمیت و ضرورت انجام تحقیق:
امروزه نگرانی بسیاری در مورد موضوع وجود سموم شیمیایی همچون فنل در آب وجود دارد که می تواند از این طریق وارد بدن انسان شود ویا به آب معمولا با فاضلاب امروزه نگرانی بسیاری در مورد موضوع وجود سموم شیمیایی همچون فنل در آب وجود دارد که می تواند از این طریق وارد بدن انسان شود و یا به مصرف جانوران آبزی برسد.آب معمولا با فاضلاب کارخانه ها آلوده می شود واین امر موجب کدر شدن آب رودخانه ها می شود..در حدود ٨٠ درصد از بیماری ها در ارتباط با آب است ودر حدود۵٠ درصد از جمعیت های شهری جهان این مشکل وجود دارد. مطالعات بر روی انسان و جانوران نشان می دهد فنل به طور موثر از طریق استنشاق و گوارش جذب می شود. بخار فنل می تواند به آسانی از طریق پوست جذب شود. فنل در فرم محلول به آسانی از پوست عبور می کند و روی کبد و کلیه و ریه اثر می گذارد. فنل سمی است و می تواند موجب کاهش فعالیت آنزیماتیک شود, اختلال در سیستم عصبی ایجاد کند و منجر به غش و اغما شود. این سم در ماهی ها بین ۲۵-۵ میلی گرم در لیتر مرگ آور است. اثر مستقیم فنل یک مانع برای واکنش های بیولوژیک است. ترکیبات فنل آلودگی جدی برای رودخانه ها است و اثر مضر آن مهار کنندگی رشد , کاهش مقاومت در برابر بیماری ها , مرگ آبزیان و افزایش رشد علف های هرز است. اگر آلودگی های فنلی در آب های زیرزمینی وارد شود سبب مشکلات اکولوژیکی جدی می شود. از اینرو حذف فنل از محیط مخصوصا از آب و منابع آب اهمیت حیاتی دارد. از روش های فیزیکو شیمیایی روتین در تخریب فنل استفاده می شود اما این روش ها هزینه بالایی دارد و تولید مواد حدواسط مضر می کند. به همین دلیل امروزه از تجزیه میکروبی برای حذف آلودگی های فنل استفاده میشود. با توجه به قوانین و استانداردهای زیست محیطی ، پساب صنایع نفتی اعم از پالایشگاه ها و شرکت های پتروشیمی که واجد مقادیر زیادی هیدروکربن های آروماتیک و آلیفاتیک می باشند، می بایستی قبل از ورود به شبکه جمع آوری تصفیه شده و مقادیر مواد مضر آن ها به زیر حد مجاز کاهش داده شوند. استفاده از میکروارگانیسم ها یکی از راهکارهای اصلی برای تجزیه زیستی این ترکیبات آلاینده می باشد. از آنجاییکه ترکیبات فنلی از اجزای تشکیل دهنده نفت خام بوده وباعث از بین رفتن جمعیت میکروبی محیط و یا سیستم های تصفیه زیستی ( لجن فعال ) می گردد، سویه هایی که قادر به تحمل فنل و مصرف این هیدروکربن سمی باشند ازاهمیت ویژه ای برخوردارند (١۶،١۵،١۴،١٣).
١-١٠- اهداف تحقیق
١-جداسازی باکتری های تجزیه کننده فنل
۲-تاثیر فاکتورهای موثر محیطی بر روی تجزیه فنل
۳-تاثیر منابع مختلف نیتروژن بر روی تجزیه فنل
۴-بدست آوردن شرایط بهینه باکتری ایزوله شده برای افزایش سرعت تجزیه فنل

۲-۱-مروری بر ادبیات و سوابق تحقیق:
گیتی امتیازی و همکاران در یک تحقیق، ١۵ سویه باکتریایی تجزیه کننده فنل از مکان های مختلف کارخانه ذوب آهن اصفهان جداسازی کردند.از بین ١۵ سویه باکتریایی ، ۵ سویه به عنوان سویه های غالب شناخته شدند ، که قابلیت بالایی برای حذف فنل نشان می دادند.سپس اثر غلظت های مختلف فنل بر میزان رشد ، تنفس و تشکیل بیوفیلم این 5 سویه بررسی شد.نتایج حاکی از آن بود که کلیه سویه ها تا غلظت ۵٠٠ میلی گرم بر لیتر فنل ، رشد و حذف فنل مناسبی نشان می دادند. اما در این بین رشد یکی از سویه ها در غلظت ٣٠٠ میلی گرم بر لیتربالاتر از چهار سویه دیگر بود و همین سویه بالاترین بیوفیلم را در این غلظت تشکیل می داد.با به کارگیری این سویه ها در حوضچه های تصفیه فنل کارخانه ذوب آهن می توان میزان آلودگی فنلی این کارخانه را بطور قابل توجهی کاهش داد(١۷).
رضا شکوهی و همکاران در مورد شناسایی باکتری های تجزیه کننده فنل در سیستم ترکیبی بیوفیلتر و لجن فعال تحقیق نموده اند.برای انجام این پژوهش ابتدا مقداری لجن بیولوژیکی تصفیه خانه فاضلاب شهری به عنوان منبع اولیه میکروبی ، به داخل سیستم تلقیح شدو با تزریق مداوم محلول شیرخشک و هوا تعداد آن ها افزایش داده شد. سپس با تزریق تدریجی فنل در مدت ٣ ماه به تدریج فنل جایگزین شیر خشک گردید.نمونه برداری پس از سازگاری میکروب ها با فنل و استفاده از آن به عنوان تنها منبع مواد غذایی صورت گرفت.به منظور تفکیک میکروارگانیسم ها ابتدا نمونه ها در محیط های کشت اختصاصی و افتراقی کشت داده شد و پس از تشکیل و تکثیر کلنی ، با انجام آزمایشات متعدد باکتری های هوازی مورد شناسایی قرار گرفتند.تمامی باکتری های هوازی موجود در این سیستم غیر تخمیری بوده و نتیجه تست گلوکز منفی بوده است . نتیجه اینکه باکتری های موجود در این سیستم از فنل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی استفاده کردند و تمام باکتری های جدا شده هوازی هستند و باکتری برواندیوموناس ویسیکالریس برای اولین بار به عنوان باکتری تجزیه کننده فنل گزارش شده است(١٨).
Yaacob Nor Suhaila و همکارانش در یک تحقیق از متد واکنش سطحی برای بهینه سازی ترکیب محیط کشت و شرایط محیطی برای افزایش رشد رودوکوکوس و تجزیه فنل استفاده کردند.مقدار فنل و غلظت سولفات آمونیوم و دما فاکتور های موثر در رشد باکتری وتجزیه فنل است.کشت با ۵/٠ گرم در لیتر فنل و ٣/٠ گرم در لیتر آمونیوم سولفات در ٣۶ درجه سانتی گراد انکوبه شد و باکتری رودوکوکوس رشد کرد و غلظت سلول های باکتری از ١١۷/٠ گرم در لیتر به ٣۷۶/٠ گرم در لیتر افزایش یافت.در یک محیط دیگر ۷/٠ گرم در لیتر فنل و ۴/٠ گرم در لیتر آمونیوم سولفات بوده و انکوباسیون در دمای ٣۷ درجه سانتی گراد انجام گرفت که در این کشت مدت زمان تجزیه ١ گرم در لیتر فنل از ۴٨ ساعت به ۲۷ ساعت کاهش یافت.نتیجه اینکه افزایش تجزیه فنل در کشت رودوکوکوس با افزایش فعالیت فنل هیدروکسیلاز در رابطه است.نرم افزار RSM برای بهینه سازی اجزای محیط کشت استفاده شد و افزایش دمای رشد رودوکوکوس موجب کاهش زمان تجزیه فنل توسط این باکتری می شود( ١٩).
موحدیان و همکارانش در یک تحقیق ١٠ کلنی از باکتری های تجزیه کننده فنل را از لجن فعال شهری جدا کردند ومیزان تجزیه فنل و میزان رشد این باکتری ها را در غلظت های مختلف فنل (٩٠٠-۲٠٠میلی گرم در لیتر) ارزیابی کردند و زیرواحد های ژن فنل هیدروکسیلاز و کدینگ ژن را در سودوموناس پوتیدا بررسی کردند.نتیجه در این مطالعه اینکه بهترین باکتری های تجزیه کننده فنل غلظت ۶٠٠-۵٠٠میلی گرم در لیتر فنل را در طی ۴٨ ساعت انکوبه شدن به طور کامل تجزیه کردند.این باکتری وابسته به سویه های سودوموناس پوتیدا بوده است.استفاده از این باکتری جداسازی شده می تواند نقش قابل توجهی در کاهش زمان تجزیه فنل گردد (۲٠ ).
Munazza Ajaz و همکارانش دریک مطالعه روی جداسازی وبررسی ژنتیکی باکتری های
تجزیه کننده فنل که از خاک جدا شده کار کردند.باکتری های جدا شده از نظر مقاومت به فنل شناسایی و غربال شدند.۴ تا از این سویه ها ( استافیلوکوک ها ، کورینه باکتریوم ، باسیلوس و پروتئوس) پیدا شده که به ١۵ میلی گرم در لیتر از فنل مقاوم هستند.الگوی رشد و زمان تولید سویه های مقاوم فنل تعیین شد.شرایط پر دغدغه مثل کاهش گلوکز با غلظت های مختلف فنل در افزایش زمان تولید مؤثر است (۲١).
محمد رضا سودی و نرجس کلاهچی تحقیقی انجام دادند که در آن برای اولین بار باکتری رودوکوکوس اریتروپلیس از خاک آلوده در پالایشگاه نفت تهران جداسازی شد.تشخیص با روش مولکولی و تعیین حالت مورفولوژیکی وشاخص های بیوشیمی انجام گرفت. فنل به عنوان منبع کربن مورد استفاده قرار گرفت.
تجزیه فنل تقریبا۶۴/٩٩درصد از غلظت اولیه فنل که ١٠٠٠میلی گرم در لیتر در مدت ۵۶ ساعت رسید.نتیجه اینکه سویه جدا شده می تواند برای تجزیه فنل موجود در پساب ها استفاده شود (۲۲ ).
Reda و همکارانش روی بهینه سازی باکتری های تجزیه کننده فنل و تولوئن تحت شرایط مختلف محیطی و تغذیه ای کار کردند. به این دلیل که این مواد سمی و کارسینوژنیک هستند.٨ باکتری جداسازی شد که تولوئن و فنل را به عنوان منبع انرژی مصرف می کنند. باکتری های جدا شده از ۲ سویه قوی هستند که اساس جداسازی آن ها بر مبنای مشخصات مورفولوژیکی و بیوشیمی بوده است.٨ باکتری جداسازی شده شناسایی شدند ، میکروکوکوس واریانس ، باسیلوس سوبتیلیس ، سودوموناس آلکالیژنز ، باسیلوس لیکنی فورمیس ، باسیلوس لاتروسپوروس ، سودوموناس پوتیدا ، باسیلوس فرموس و اسینتوباکتر.
برای شناسایی این ٨ باکتری از روش های مولکولی استفاده شد. اثرات مختلف تغدیه ای و
محیطی در میزان تجزیه میکروبی تولوئن و فنل توسط باسیلوس سوبتیلیس ، باسیلوس لاتروسپوروس از طریق اندازه گیری میزان رشد از طریق بررسی جذب نوری و مقدار پروتئین در سلول باکتری بررسی شد.آمونیوم کلرید و دی آمونیوم هیدروژن فسفات به عنوان منابع خوبی برای نیتروژن و فسفر این ۲ سویه باکتری به شمار می رود.غلظت نمک ۲درصد بود که غلظت اپتیمم برای باکتری های جدا شده است.مقدار پروتئین برای رشد (۴۴/٠و۴۵/٠میکروگرم درمیلی لیتر) بوده و در شرایط خنثی، رنج رشد (٩٨/٠-۶۵/٠میکروگرم درمیلی لیتر) بوده است و در دمای ٣٠ درجه سانتی گراد و مقدار پروتئین (٨٩/٠-۵۴/٠میکروگرم در میلی لیتر) رنج رشد (٩٩/٠-۴۵/٠میکروگرم درمیلی لیتر) بوده است.نتیجه اینکه باسیلوس سرئوس می تواند به شکل کاربردی تولوئن و فنل را در شرایط غذایی و شرایط محیطی مختلف در آلودگی های خاک و آب تجزیه کند ( ۲٣).

D. Hank و همکارانش روی باکتری سودوموناس آئروجینوسا کار کردند که توانایی رشد و مصرف فنل به عنوان منبع انرژی را در محیط کشت هوازی دارد.از پارامتر های تأثیر گذار روی تجزیه زیستی فنل، دما است.نتایج نشان می دهد برای یک رنج دمایی ٣٠ تا ۴٠ درجه سانتی گراد ، بیشترین تجزیه میکروبی فنل برای غلظت ١٠٠ میلی گرم در لیتر در دمای ٣٠ درجه سانتی گراد مشاهده شده است.در باکتری هایی که فعالیت آنزیماتیک دارند دیده شده برای تجزیه میکروبی ١٠٠ میلی گرم در لیتر سوبسترا در ٣٠ درجه سانتی گراد زمانی در حدود ۵٠ ساعت در صورت انرژی گرفتن نیاز است در غیر این صورت ۷۲ ساعت زمان نیاز است.در صورت آداپته شدن با افزایش غلظت، باکتری ها غلظتی از سوبسترا در حدود ۴٠٠ میلی گرم در لیتر را در زمان کمتر از ٣۵ ساعت تجزیه می کنند. نتایج آنالیزهای آماری پیدا شدن روابط بسیاری بین فاکتور های مختلف و مدت زمان تجزیه میکروبی فنل بوده است (۲۴).
KRYSTYNA PRZYBULEWSKA و همکارانش در یک تحقیق روی جداسازی باکتری هایی که توانایی تجزیه فنل را دارند کار کردند. یک مطالعه برای معین کردن ترکیب میکروفلورا از یک بستر بیوفیلتراستفاده شد، برای خروج گازها از یک کابل مارپیچ در کارخانه استفاده شد.توانایی جداسازی سویه های باکتریایی که فنل را تجزیه می کنند نیازمند ارزیابی محیط های کشت دارای ترکیبات مختلف است.غلظت های فنل در محیط کشت : ۲۵/٠و۵/٠و۷۵/٠و١ گرم در دسی متر مکعب بوده است.هوا در دسیکاتور در جایی که میکروارگانیسم ها رشد می کنند با فنل اشباع بوده است.جداسازی میکروارگانیسم ها با درجات مختلف از تجزیه فنل در کروماتوگرافی مورد استفاده بوده است.به کار بردن بسترهایی از بیوفیلتر در صنعت موجب می شود میکروارگانیسم هایی که توانایی تجزیه فنل را دارند پدیدار شوند.میکروارگانیسم هایی که فعال تر بودند شامل : رودوکوکوس رودوکروس، گوردونیا اسپوتی ، سودوموناس پوتیدا بودند (۲۵).
سمیه اسکندری و همکارانش در یک تحقیق با جداسازی باکتری های بومی موجود در پساب فنل دار کارخانه ذوب آهن اصفهان ، اقدام به سازش پذیر کردن یک جدایه و در نهایت حذف فنل توسط این جدایه گردید. همچنین رفتار این جدایه در محیط کشت سنتزی حاوی ۲٠٠٠و ۴٠٠٠ میلی گرم در لیتر فنل بررسی شد و مشخص شد که این جدایه پس از یک فاز تأخیری ۲۴ و ۴٨ ساعته رشد کرده و مقدار فنل را به ترتیب پس از ۲۶۴و ۲٨٨ ساعت به صفر میلی گرم در لیتر می رساند.این جدایه قادر است مقدار فنل را در یک پساب طبیعی از ۲۲٣٣ میلی گرم در لیتر در طی مدت ١۲٠ ساعت به صفر برساند.شناسایی این جدایه مشخص کرد یک کوکوباسیل گرم منفی است که احتمالا از گونه سودوموناس است . با بکارگیری این جدایه به تنهایی و یا حتی ترکیبی از چند جدایه سازگار شده ، می توان میزان فنل در این پساب ها را در طی مدت زمان کوتاه تری به صفر رساند (۲۶).
B. Marrot , A. Barrios- Martines , P. Moulin, N. Roche در یک تحقیق اثر سازش پذیری با محیط کشت ترکیبی را در تجزیه میکروبی فنل مورد مطالعه قرار دادند.آزمایش تجزیه میکروبی با غلظت های مختلف فنل (٣-۵/٠ گرم بر لیتر) انجام شد.این فعالیت زیستی جنبه اقتصادی و کاربردی دارد و این ها موجب کامل شدن تجزیه میکروبی فنل می شوند.غلظت های بالای فنل اثر بازدارنده بر رشد باکتری ها دارد.به هر حال غلظت فنل دارای اهمیت است.نتایج نشان می دهد مطابق با گزارش مطبوعات برای توانایی تجزیه فنل در سیستم های مختلف و مدل هالدان پذیرفته شده است (۲۷).
گیتی امتیازی و همکارانش دریک مطالعه روی خاک های که آلودگی فنلی دارند کار کردند،
۴۵ باکتری تجزیه کننده فنل از خاک و نمونه فاضلاب در محیط کشت فنل آگار و همچنین محیط فنل براث جداسازی شدند.همه محیط ها دارای ۲/٠ گرم بر لیتر فنل بودند و باکتری جدا شده سودوموناس بوده است. نتیجه اینکه تعداد باکتری های تجزیه کننده فنل در خاک آلوده به فنل از خاک های غیر آلوده بیشتر است..از روش مولکولی هم در این تحقیق برای شناسایی باکتری ها استفاده شده است (۲٨).
فرشید کفیل زاده و همکارانش در یک تحقیق بر روی جداسازی و شناسایی باکتری های تجزیه کننده فنل در دریاچه پریشان و بررسی رشد باکتری ها کار کردند.۶ نمونه از آب و رسوب از مناطق مختلف دریاچه پریشان جمع آوری شد.باکتری های تجزیه کننده فنل که جداسازی شدند را در محیط سالت بیس فنل براث مدیا کشت دادند.برای جدا کردن باکتری های تجزیه کننده ، بروموتیمول بلو را به مدیا اضافه کردند که تولید رنگ سبز کرد. توانایی باکتری ها در تجزیه غلظت های مختلف فنل از ۲/٠ تا ٩/٠ گرم بر لیتر بررسی شد.کشت باکتری ها در محیط سالت بیس فنل براث موجب تغییر رنگ مدیا از رنگ سبز به زرد در اثر مصرف فنل محیط شد.این باکتری ها مخصوصا گرم منفی ها و آن ها که به خانواده سودوموناسه و اسینتوباکتریاسه تعلق دارند.سودوموناس ها مهم ترین باکتری های تجزیه کننده فنل در دریاچه پریشان هستند که نشان دهنده تنوع زیاد در قسمت های مختلف دریاچه است.گونه هایی از اسینتوباکتر و دیگر گونه ها مثل کلبسیلا، سیترو باکتر و شیگلا نیز پیدا شده است.ببشتر باکتری های جدا شده توانایی خوبی در تجزیه فنل نشان دادند.سودوموناس و اسینتوباکتر ٩/٠-٨/٠ گرم بر لیتر و کلبسیلا و سیتروباکتر و شیگلا ۷/٠-۶/٠ گرم بر لیتر و بقیه ٣/٠-۲/٠ گرم بر لیتر فنل را تجزیه کردند.نتایج نشان می دهد دریاچه پریشان تعداد زیادی باکتری تجزیه کننده فنل با توانایی بالا دارد که مهم ترین گونه آن ها سودوموناس و اسینتوباکتر است(۲٩).
Catia Tavares dos Passos و همکارانش در سال 2010 سویه هایی از باکتری ها را از خاک آلوده به نفت خام در برزیل جدا کردند.در محیط کشت افزایش میزان تجزیه بین سویه های فاقد کپسول و دارای کپسول مختلف است.اما مدت زمان تجزیه فنل توسط باکتری های دارای کپسول کمتر است.در حقیقت یک میکروارگانیسم محیطی مطلوب برای تجزیه میکروبی، سلول های دارای کپسول هستند چون فشار کم تری تحمل می کند.قارچ فیلامنتوس آسپرژیلوس دارای کپسول نمونه ای از اینهاست که غلظت ۵٠٠ میلی گرم در لیتر فنل را تجزیه می کند(٣٠).
DARYL F. DWYERو همکارانش تحقیقاتی انجام دادند که در آن روی متانوژن های تجزیه کننده فنل در بستر جامد تحقیق کردند.با غنی سازی یک متانوژن تجزیه کننده فنل و کشت در بستر جامد، فنل را به متان و دی اکسید کربن تبدیل کردند.از یک متانوتریکس شبیه باکتریوم و یک متانوژن مصرف کننده هیدروژن استفاده شد و در این تکنیک بستر جامد سلول ها به شکل جاسازی شده در یک مدت طولانی می ماند.تقریبا شباهت هایی بین میزان نتایج آزمایش برای هر دو گروه تحریک کننده و بازدارنده غلظت فنل وجود داشت (٣١).
علی محمد اشراقی تحقیقی در مورد تصفیه پساب های حاوی فنل با استفاده از لجن فعال انجام داد.در این پروژه سعی شده تا کارایی یکی از فرآیندهای لجن فعال ( فرآیند کاملا مخلوط ) برای تصفیه فنل که در بسیاری از فاضلاب های صنعتی یافت می شود و ترکیبی بسیار سمی است مورد بررسی قرار گیرد.ابتدا با افزایش تدریجی غلظت فنل در مدت ٩٠ روز در یک سیستم ناپیوسته میکروارگانیسم ها به فنل سازش یافتند.سپس در یک سیستم پیوسته اثر زمان ماند و حضور یک سوبسترای رقابتی ( ملاس ) در حذف فنل بررسی گردید و مشخص شد که در زمان های ماند بالا و در غیاب سوبسترای رقابت کننده کارایی حذف فنل بهتر است و در بیشترین بار اعمال شده به سیستم در این پروژه (٣۲/٠گرم بر روز بر لیتر ) درصد حذف فنل ۵٨۶/٩١ درصد است در حالیکه با حضور ملاس در سیستم این کارایی به شدت کاهش می یابد و در بیشترین غلظت مورد آزمایش (۲٠٠٠ میلی گرم بر لیتر ملاس ) در همان بار قبلی درصد حذف فنل به ٣۵/۴۶ درصد کاهش می یابد. هم چنین در این پروژه سعی شد تا درصد حذف فنل از طریق جذب روی بیومس و تبخیر نیز مشخص می شود که مجموع این دو اثر وقتی غلظت بیومس سیستم به بیشترین مقدار می رسد تنها ۴۲/٠ درصد می باشد(٣۲).
سیامک نجاتی در تحقیقی به بررسی تصفیه پساب های فنلی با استفاده از
HRB تثبیت شده پرداخت . به منظور بررسی حذف فنل از پساب ، آنزیم پراکسیداز با موفقیت تثبیت شد و شرایط عملیاتی برای حذف فنل توسط بیوکاتالیست، بررسی شد. تثبیت پراکسیداز گیاهی بر روی دانه های شیشه ای آمین دار و در درون ژل آلژینات موجب گردید تا دامنه pH عملیاتی برای حذف فنل به اندازه ١ واحد وسیعتر گردد. بیشینه میزان حذف فنل برای آلژینات ۵۷ درصد و برای دانه های شیشه ای ۷۵ درصد حاصل گشت.نسبت های مولار بهینه پراکسید هیدروژن به فنل در مورد دانه های آلژینات ٩۵ درصد و در مورد دانه های شیشه ای ١/١ بدست آمد که این نسبت ها برای غلظت ۲ میلی مولار محلول فنلی گزارش شده اند.بر اثر تثبیت آنزیم در ژل آلژینات زمان رسیدن به ٩٠ درصد بیشینه تبدیل به ١٠٠ دقیقه رسید حال آنکه این تبدیل بر روی دانه های شیشه ای در حدود ۲٠ دقیقه به اتمام می رسد. پایداری این بیوکاتالیست بر دانه های شیشه ای نشان داد که این کاتالیست تا ۶٠ روز فعالیت اولیه خود را حفظ می کند.امکان استفاده مجدد از دانه های آلژینات نشان داد که تا 5 دوره بدون مشاهده افت چشمگیر ، فعالیت دانه ها در مقدار قابل قبولی قرار دارند. به جهت کاهش ریزش و افزایش محبوس شدن در ژل شرایط بهینه برای عمل محبوس کردن در ژل به دست آمد.میزان فعالیت باقیمانده آنزیم در درون دانه های آلژینات در بیشینه خود به ١٠درصد می رسید حال آن که این مقدار در مورد دانه های شیشه ای در حدود ٣۵ درصد بود (٣٣).
فرناز امیری در مورد تصفیه بیولوژیکی پساب های حاوی مواد آروماتیکی در واحدهای پتروشیمی تحقیق کرد.در این تحقیق با استفاده از فناوری نوین افزایش زیستی ، بهبود عملکرد این سیستم جهت افزایش راندمان (استاندارد کردن پساب خروجی) ، مقاومت سیستم و به خصوص قابلیت ته نشینی لجن ، در حذف فنل به عنوان یک مدل از ترکیبات سمی مونوآروماتیک ، که هم اکنون مشکل تصفیه پساب بسیاری از صنایع به خصوص نفت و پتروشیمی در ایران می باشد ، مورد بررسی قرار می گیرد.بدین ترتیب با بررسی های تجربی ، ابتدا با سازگار کردن سیستم با این ترکیب سمی و بررسی عملکرد آن در سه زمان ماند ٨،١٠،١۲ ساعت با افزایش تدریجی فنل ، سپس جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده فنل سازگار شده و در انتها افزایش زیستی بهترین میکروارگانیسم ها به سیستم که نوعی مخمر های ٨٠٠،١٠٠٠،١۵٠٠،۲٠٠٠ میلی گرم بر لیتر ،CODمی باشد،عملکرد سیستم با اعمال در زمان های ٨،١٠،١۲و۲۴ ساعت مورد بررسی قرار می گیرد.نتایج مطالعات فوق نشان می دهدکه با بکارگیری لجن سازگار شده و در نهایت افزایش زیستی راندمان حذف تا حدود ٩/٩٩-۴/٩٩درصد در زمان های اقامت مختلف افزایش یافته و پساب های خروجی در COD های ٨٠٠ و ١٠٠٠ و١۵٠٠ میلی گرم بر لیتر در زمان ماند ١۲ساعت ودر COD

–269

بیان مسئله3
1-2- کلیات5
1-2-1، تاریخچه5
1-2-2، باکتریولوژی سالمونلا6
1-2-3، تست ها و خواص بیوشیمیایی6
1-2-4، طبقه بندی سالمونلا7
1-2-5، آنتی ژن های سالمونلا9
1-2-6، عوامل دخیل در بیماریزایی در سالمونلا12
1-2-7. بیماری های ناشی از سالمونلا13
1-2-8. اپیدمیولوژی سالمونلا16
1-2-9، تشخیص آزمایشگاهی سالمونلا16
1-2-10. پیشگیری و کنترل19
1-2-11، ایمنی 19
1-2-12، درمان19
1-3 – مروری بر روش های تایپینگ باکتری ها20
1-3-1- اصول و مبانی روش MLVA 22
1-2-3- کلمات و اصطلاحات کاربردی در MLVA24
1-3-3- مزایای MLVA نسبت به سایر روش های ژنوتایپنگ26
1-4- اهداف پایان نامه 31
1-4-1- هدف علمی پایان نامه31
1-4-2- اهداف جزئی31
1-4-3- اهداف کاربردی31
1-5- فرضیه ها31
1-6- سئوالات 31
1-7- ضرورت انجام تحقیق32
1-8- جنبه جدید بودن و نوآوری تحقیق32
1-9- واژه نامه ها و اصطلاحات فنی32
فصل دوم مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه تحقیق34
بررسی متون:35
فصل سوم :مواد وروشها39
3-1-مواد و تجهیزات40
3-1-1-دستگاه ها ووسایل مورد نیاز:40
3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز: 41
3-1-3- محیطهای کشت مورد استفاده: 41
3-2-ترکیبات و محلولهای مورد نیاز و فرمول ساخت آنها42
3-2-1-تهیه محلول(%25) SDS:42
3-2-2- محلول EDTA(5/0 مولار):42
3-2-3-تامپون لیز کننده سلول42
3-2-4- تامپون TE حاوی RNase42
3-2-5- بافر(5X)TBE:42
3-2-7- محلول فنل-کلروفروم-ایزو آمیلیک الکل(PCI):43
3-3- روش انجام طرح:44
3-3-1- نوع مطالعه:44
3-3-2-جامعه مورد مطالعه:44
3-3-3- جمع آوری اطلاعات:44
3-3-4- انجام امور باکتریولوژیک:44
3-4- ژنوتایپینگ ایزوله های سالمونلا با استفاده از روش MLVA46
3-4-1- انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR46
3-4-2- الکتروفورز محصولات VNTR50
3-4-3- محاسبه ی اندازه و تعداد تکرار های VNTR52
3-4-4-تجزیه و تحلیل داده های VNTR 52
فصل چهارم یافته ها54
4-1- نمتایج حاصل از جمع آوری نمونه ها 55
4-2- نتایچ حاصل از استخراج ژنوم باکتریایی57
4-3- نتایج حاصل از واکنش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR58
4-4- میزان تنوع الل های VNTR74
4-5- آنالیز داده ها با استفاده از الگوریتم Minimum Spanning Tree 74
4-6- آنالیز داده های VNTR با استفاده از روش NJ75
فصل پنجم :بحث ونتیجه گیری 77
5-1- بحث78
5-2- نتیجه گیری و جمع بندی91
منابع:92
چکیده انگلسی 96

فهرست جداول و نمودارها
عنوان صفحه
جدول1-1، ویژگی های بیو شیمیایی سالمونلا8
جدول 1-2، طبقه بندی نوین سالمونلا و میزان سروتایپ ها در زیر گونه ها9
جدول 3-1، نام لوکوس ها و پرایمر های اختصاصی47
جدول 3-2،مقادیرموردنیازجهت انجام واکنش هایPCRبرای تکثیرلوکوسهایVNTR48
جدول 3-3، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس های SENTR2،
SENTR3 و SE-749
جدول3-4،برنامه ریزی دستگاهترموسایکلرجهت تکثیرلوکوسهایENTR6وSE-849
جدول 3-5، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر لوکوس SE-4 49
جدول 3-6، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-1050
جدول 3-7، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-650
جدول 4-1، در فایل EXCEL73
جدول 4-2، ضریب تنوع هانتر- گاتسون برای هر لوکوس محاسبه شده 74
نمودار 4-1، میزان فراوانی هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر56
نمودار 4-2، میزان شیوع هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر56
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-1 تصویر دکتر سالمون دامپزشک آمریکایی.5
شکل1-2 باکتری سالمونلا 6
شکل 1-4مای شماتیک از VNTR ها 23
شکل 1-5 پروفایل اللی 24
شکل 1-6 آنالیز MLVA بوسیله MST 25
شکل 1-7، مزایای MLVA 26
شکل 1-8، مراحل انجام MLVA 27
شکل 4-1، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 5357
شکل 4-2، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 2457
شکل 4-3، لوکوس ENTR6 58
شکل 4-4، لوکوس SE4 59
شکل 4-5، لوکوس SE4 60
شکل 4-6، لوکوسSE6 61
شکل 4-7، لوکوس SE6 62
شکل 4-8، لوکوسSE7 63
شکل 4-9، لوکوسSE7 64
شکل 4-10، لوکوسSE8 65
شکل 4-11، لوکوسSE8 66
شکل 4-12، لوکوسSE10 67
شکل 4-13، لوکوسSE10 68
شکل 4-14، لوکوسSENTR2 69
شکل 4-15، لوکوسSENTR2 70
شکل 4-16، لوکوسSENTR3 71
شکل 4-17، لوکوسSENTR3 72
شکل 4-18، آنالیز داده های VNTR با استفاده از الگوریتم MST. 75
شکل 4-22، درختچه ی NJ 76
چکیده فارسی :
ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی در تهران بر پایه روش آنالیز چند لوکوسی متغیر تکراری( MLVA)
مقدمه:سالمونلاانتریکا سبب ایجاد سالمونلوزیس در انسان می شود. سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس، دومین سروتایپی می باشد که در سطح دنیا سبب ایجاد سالمونلوزیس می شود. تکنیک MLVA، یکی از روش های نوین ژنوتایپینگ جهت تمایز ایزوله های باکتریایی در همه گیری ها و یا تعیین قرابت فیلوژنتیکی این ایزوله ها می باشد. هدف از این پژوهش، ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی در تهران بر پایه ی روش MLVA.
مواد و روش ها: در این پژوهش، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از نمونه های بالینی در طی سال های 1387 تا 1389 در تهران جدا شدند. ایزوله های سالمونلا انتریتیدیس با استفاده از تکنیک های بیوشیمیایی و سرولوژیکی تایید شدند. جهت انجام تکنیک MLVA، از هشت لوکوس VNTR استفاده شد.
نتایج: 10 ژنوتایپ متفاوت MLVA، در این پزوهش شناسایی شد. با استفاده از روش MST، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریتیدیس در 2 کلونال کمپلکس قرار گرفتند. همچنین با استفاده از تکنیک NJ، این ایزوله ها در دو کلاستر جای گرفتند.
بحث و نتیجه گیری: نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که تکنیک MLVA، یک روش قدرتمند و آسان می باشد و می توان از این تکنیک در اپیدمی ها ی ناشی از سالمونلا انتریتیدیس استفاده نمود.
کلمات کلیدی: سالمونلا، MLVA، VNTR
68580077470

کلیات تحقیق
بیان مسئله
سالمونلا باسیل گرم منفی،واجدتاژک پری تریش وجزءخانوادهیانتروباکتریاسهمیباشد.گروه سالمونلا شامل یک جنس منفرد به نام سالمونلا است. این جنس شامل ارگانیسم هایی است که قبلا تحت عنوان سالمونلا و آریزونا شناخته می شدند. وقتی سالمونلا ها از طریق مسیر خوراکی به انسان و حیوانات منتقل شوند، بیماریزا هستند. این باکتری از طریق حیوان و فروارده های حیوانی به انسان سرایت می کنند و موجب تب روده ای، مسمومیت های غذایی و گاستروانتریت در انسان می شوند ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(7).
طبقه بندی سالمونلا در طی سالیان متمادی دچار تغییرات زیادی شده است. سالمونلا گروه بزرگی از باکتری های روده ای شامل تقریبا 2200 سروتایپ می باشد. بر مبنای مدل اخیر طبقه بندی CDC تنها یک گروه منفرد از سالمونلا وجود دارد که به هفت زیر گروه(1،2،،a3،b3،4،5،6) طبقه بندی می شوند. طبقه بندی اخیر بر مبنای شباهت ژنتیکی ایزوله های سالمونلا) 16S r RNA) است. سیستم های طبقه بندی قدیمی تر شامل 1) طبقه بندی کافمن_وایت: که هر سروتایپ را به صورت یک گونه منفرد سالمونلا شناسایی می کند. 2) سیستم ادواردز_اوینگ: که سالمونلاها را به سه گونه( سالمونلا کلراسوئیس، سالمونلا تایفی، سالمونلا انتریتیدیس) و صدها سروتایپ تقسیم بندی می کند. 3) مدل هیبریداسیون DNA: که سالمونلا ها را به یک گونه به نام سالمونلا انتریتیدیس و زیر گونه های اریزونه، بونگوری، دی اریزونه، انتریکا، سالاما،هاتنا، تقسیم می نمایند که طبقه بندی CDC با کمی تغییر از همین طبقه بندی استفاده می کند ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Murray</Author><Year>2013</Year><RecNum>2</RecNum><record><rec-number>2</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">2</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Murray, P.R.</author><author>Rosenthal, K.S.</author><author>Pfaller, M.A.</author></authors></contributors><titles><title>Medical Microbiology</title></titles><dates><year>2013</year></dates><publisher>Mosby/Elsevier</publisher><isbn>9780323054706</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=O92zd8fV-RcC</url></related-urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Walker</Author><Year>1998</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">3</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Walker, T.S.</author></authors></contributors><titles><title>Microbiology</title></titles><dates><year>1998</year></dates><publisher>W.B. Saunders Company</publisher><isbn>9780721646411</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=DtlpAAAAMAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4-6).
روش های مختلفی برای جداسازی باکتری سالمونلا از نمونه های محیطی وجود دارند که شامل: روش های کشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژی و مولکولی می باشد. در کشت سنتی از محیط های پیش انتخابی و اختصاصی نظیر S.S Agarو XLD Agar استفاده می شود. روش های سرولوژی براساس واکنش انتی بادی با انتی ژن تولیدی توسط باکتری می باشد.
استفاده از روش های سرولوژیک بدلیل تنوع گسترده خصوصیات آنتی ژنتیکی باکتریایی و نیاز به طیف گسترده و وسیعی از آنتی بادی ها و همچنین هزینه گزاف تولید و مصرف آن، به مرور جایگاه خود را از دست داده اند. تا کنون از روش های مولکولی متنوعی جهت ژنوتایپینگ گونه های مختلف سالمونلا استفاده شده است. به کارگیری این روش ها، اهمیت ویژه ای در پژوهش های اپیدمیولوژیکی دارد . با شروع عصر مولکولی دانشمندان رویکرد خود را از فنوتیپ به ژنوتیپ تغییر داده اند.
روش های مختلفی مثل Rep- PCR، RAPD- PCR، Ribotyping، PFGE، MLST و MLVA جهت ژنتوتایپینگ سویه های سالمونلا تا به حال مورد استفاده قرار گرفته است بطوریکه هریک ازاینروش ها معایب و مزایایی دارند، که در این میان روش MLVA از روش هایی مولکولی جدید و نوینی جهت ژنوتایپینگ باکتریایی مطرح شده است و بر این اساس توسعه یافتهُ است ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Nadon</Author><Year>2013</Year><RecNum>1605</RecNum><record><rec-number>1605</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="w0dfex0040rvzzewepypdsruzp9vstsx02tt">1605</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Nadon, C. A.</author><author>Trees, E.</author><author>Ng, L. K.</author><author>Moller Nielsen, E.</author><author>Reimer, A.</author><author>Maxwell, N.</author><author>Kubota, K. A.</author><author>Gerner-Smidt, P.</author></authors></contributors><auth-address>National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada.</auth-address><titles><title>Development and application of MLVA methods as a tool for inter-laboratory surveillance</title><secondary-title>Euro Surveill</secondary-title></titles><periodical><full-title>Euro Surveill</full-title></periodical><pages>20565</pages><volume>18</volume><number>35</number><edition>2013/09/07</edition><keywords><keyword>Clinical Laboratory Techniques/instrumentation/*methods/standards</keyword><keyword>Consensus</keyword><keyword>Consensus Development Conferences as Topic</keyword><keyword>Disease Outbreaks/*prevention &amp; control</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>International Cooperation</keyword><keyword>Multilocus Sequence Typing/instrumentation/*methods/standards</keyword><keyword>Population Surveillance/*methods</keyword><keyword>*Quality Control</keyword><keyword>Tandem Repeat Sequences/*genetics</keyword></keywords><dates><year>2013</year></dates><isbn>1560-7917 (Electronic)&#xD;1025-496X (Linking)</isbn><accession-num>24008231</accession-num><urls><related-urls><url>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&amp;db=PubMed&amp;dopt=Citation&amp;list_uids=24008231</url></related-urls></urls><language>eng</language></record></Cite></EndNote>(7).
این روش با مزایایی که نسبت به تکنیک PFGE دارد روز به روز به اهمیت و محبوبیت آن افزوده می شود. بطوریکه در آینده جایگاه ویژه ای در بین اپیدمیولوژیست ها خواهد داشت. در تکنیک MLVA بطور خاص، توالی های تکراری پشت سر هم مورد بررسی و ارزیابی قرار می گیرند و از نظر تعداد تکرار های VNTR با یکدیگر مقایسه می شوند. مجموعه ای از این تکرار ها بصورت دسته ای از اعداد که در اصطلاح پروفایل اللی گفته می شود. برای هر سویه باکتری نمایش داده می شود و به عنوان یک کد اطلاعاتی برای آن سویه در نظر گرفته می شود. ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Nadon</Author><Year>2013</Year><RecNum>1605</RecNum><record><rec-number>1605</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="w0dfex0040rvzzewepypdsruzp9vstsx02tt">1605</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Nadon, C. A.</author><author>Trees, E.</author><author>Ng, L. K.</author><author>Moller Nielsen, E.</author><author>Reimer, A.</author><author>Maxwell, N.</author><author>Kubota, K. A.</author><author>Gerner-Smidt, P.</author></authors></contributors><auth-address>National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada.</auth-address><titles><title>Development and application of MLVA methods as a tool for inter-laboratory surveillance</title><secondary-title>Euro Surveill</secondary-title></titles><periodical><full-title>Euro Surveill</full-title></periodical><pages>20565</pages><volume>18</volume><number>35</number><edition>2013/09/07</edition><keywords><keyword>Clinical Laboratory Techniques/instrumentation/*methods/standards</keyword><keyword>Consensus</keyword><keyword>Consensus Development Conferences as Topic</keyword><keyword>Disease Outbreaks/*prevention &amp; control</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>International Cooperation</keyword><keyword>Multilocus Sequence Typing/instrumentation/*methods/standards</keyword><keyword>Population Surveillance/*methods</keyword><keyword>*Quality Control</keyword><keyword>Tandem Repeat Sequences/*genetics</keyword></keywords><dates><year>2013</year></dates><isbn>1560-7917 (Electronic)&#xD;1025-496X (Linking)</isbn><accession-num>24008231</accession-num><urls><related-urls><url>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&amp;db=PubMed&amp;dopt=Citation&amp;list_uids=24008231</url></related-urls></urls><language>eng</language></record></Cite></EndNote>(7)
MLVA دارای مزایای زیادی نسبت به PFGE می باشد. در MLVA تنها نیاز به دستگاه PCR است و این روش یک تکنیک PCR-bassed میباشد در حالیکه در PFGE نیاز به امکانات و تجهیزات مخصوص و پر هزینه است. در MLVA تنها داشتن DNA باکتری کافیست در حالیکه در PFGE نیاز به باکتری زنده است.هزینه MLVA به مراتب از PFGE کمتر است و بسیار سریع تر از آن انجام پذیر می باشد. و نکته بسیار مهم اینست که، داده های حاصل از MLVA از آنجایی که بصورت مجموعه ای از ارقام ذخیره می شود را می توان به راحتی در بانک های اطلاعاتی ذخیره نمود و با نتایج سایر پژوهشگران مقایسه نمود هر چند چنین چیزی در PFGE دیده نمی شود گرچه تلاش های مانند شبکه Plus Net در جهت حل این موضوع ایجاد شده است.به این ترتیب MLVA بعنوان یک تکنیک جایگزین PFGE برای کشور های در حال توسعه مطرح می باشد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Nadon</Author><Year>2013</Year><RecNum>1605</RecNum><record><rec-number>1605</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="w0dfex0040rvzzewepypdsruzp9vstsx02tt">1605</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Nadon, C. A.</author><author>Trees, E.</author><author>Ng, L. K.</author><author>Moller Nielsen, E.</author><author>Reimer, A.</author><author>Maxwell, N.</author><author>Kubota, K. A.</author><author>Gerner-Smidt, P.</author></authors></contributors><auth-address>National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, Winnipeg, Manitoba, Canada.</auth-address><titles><title>Development and application of MLVA methods as a tool for inter-laboratory surveillance</title><secondary-title>Euro Surveill</secondary-title></titles><periodical><full-title>Euro Surveill</full-title></periodical><pages>20565</pages><volume>18</volume><number>35</number><edition>2013/09/07</edition><keywords><keyword>Clinical Laboratory Techniques/instrumentation/*methods/standards</keyword><keyword>Consensus</keyword><keyword>Consensus Development Conferences as Topic</keyword><keyword>Disease Outbreaks/*prevention &amp; control</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>International Cooperation</keyword><keyword>Multilocus Sequence Typing/instrumentation/*methods/standards</keyword><keyword>Population Surveillance/*methods</keyword><keyword>*Quality Control</keyword><keyword>Tandem Repeat Sequences/*genetics</keyword></keywords><dates><year>2013</year></dates><isbn>1560-7917 (Electronic)&#xD;1025-496X (Linking)</isbn><accession-num>24008231</accession-num><urls><related-urls><url>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&amp;db=PubMed&amp;dopt=Citation&amp;list_uids=24008231</url></related-urls></urls><language>eng</language></record></Cite></EndNote>(7).
هر گونه باکتریایی، توالی های VNTR مخصوص به خود را دارد که می توان با طراحی پرایمر برای آنها، الل مورد نظر را تکثیر داد و از نظر تعداد تکرار مورد بررسی قرار داد. در طرح حاضر سعی شده است با انتخاب توالی هایVNTR مناسب، یک روش جدید، کم هزینه، سریع برای ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس بکار گرفته شود تا در آینده بتواند جایگزین روش های گرانقیمتی مانند PFGE شود و بتوان از آن در آزمایشگاه های تحقیقاتی که تنها تجهیز به دستگاه PCR باشند، استفاده نمود و بتواند به سرعت هر نوع اپیدمی را شناسایی کند و پژوهشگران بتوانند نتایج خود را با یکدیگر مقایسه نمایند(7).
1-2- کلیات
1-2-1، تاریخچه
دو دانشمند فرانسوی با نام های کومل و لوئی در اوایل قرن نوزدهم میلادی علائم کلینیکی تب تیفوئید را بررسی کردند. در سال 1823 میلادی برتونئو به علت تورم غدد لنفاوی روده آن بیماری را به نام روده جوشان نام گذاری نمود. کرهارد در اپیدمی تیفوئید در فیلادلفیا ایالات متحده آمریکا در سال 1837 میلادی، تیفوس و حصبه را از متمایز کرد.در سال 1839 میلادی شونلین تیفوس را به نام تیفوس اگژنتماتیکوس و حصبه را تیفوس احشایی نام گذاری نمود. در میان سال های 1849-1851 در انگلستان، جنر با استفاده از علائم بیماری های تب دانه دار، حصبه را تشخیص داد و عامل آن را سالمونلا تایفی نامید. اسم سالمونلا بر گرفته شده از دامپزشک آمریکایی به نام دکتر دانیال المر سالمون می باشد که به پاس تحقیقات و زحمات گسترده این دانشمند نام گذاری شده است.هوپ در سال 1886 از ادرار، فیفیر در سال 1885 از مدفوع، در سال 1888 ویلچور از خون سالمونلا را جدا نمودند.در سال 1896 سیکارد و ویدال آنتی بادی علیه سالمونلا را از خون جداسازی کردند (2و3) .

شکل 1-1: تصویر دکتر سالمون دامپزشک آمریکایی.
1-2-2، باکتریولوژی سالمونلا
سالمونلا از اجزای خانواده انتروباکتریاسه می باشد که واجد تاژک پری تریش می باشد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4) این باکتری از طریق حیوانات و محصولات حیوانی آلوده به این باکتری به انسان منتقل شده و سبب بیماری در انسان می شود ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4). سالیانه تخمین زده می شود 1.4 میلیون نفر در ایلات متحده آمریکا توسط سالمونلا بیمار می شوندPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5NZWFkPC9BdXRob3I+PFllYXI+MTk5OTwvWWVhcj48UmVj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ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5NZWFkPC9BdXRob3I+PFllYXI+MTk5OTwvWWVhcj48UmVj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ADDIN EN.CITE.DATA (8).
بیشتر سروتایپ های این باکتری برای انسان و اکثر حیوانات بیماریزا هستند. سالمونلا در دستگاه گوارش مهره داران یافت شده و بیماری های متعدد با علائم متفاوت را ایجاد می نماید ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Baumler</Author><Year>1998</Year><RecNum>1613</RecNum><record><rec-number>1613</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="w0dfex0040rvzzewepypdsruzp9vstsx02tt">1613</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Baumler, A. J.</author><author>Tsolis, R. M.</author><author>Ficht, T. A.</author><author>Adams, L. G.</author></authors></contributors><auth-address>Department of Medical Microbiology and Immunology, College of Medicine, Texas A&amp;M University, College Station, Texas 77843-4467, USA.abaumler@tamu.edu</auth-address><titles><title>Evolution of host adaptation in Salmonella enterica</title><secondary-title>Infect Immun</secondary-title></titles><periodical><full-title>Infect Immun</full-title></periodical><pages>4579-87</pages><volume>66</volume><number>10</number><edition>1998/09/24</edition><keywords><keyword>*Adaptation, Biological</keyword><keyword>Animals</keyword><keyword>*Biological Evolution</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Mammals/*microbiology</keyword><keyword>Models, Biological</keyword><keyword>Plasmids/genetics</keyword><keyword>Salmonella Infections/microbiology</keyword><keyword>Salmonella enterica/*pathogenicity</keyword><keyword>Virulence/genetics</keyword></keywords><dates><year>1998</year><pub-dates><date>Oct</date></pub-dates></dates><isbn>0019-9567 (Print)&#xD;0019-9567 (Linking)</isbn><accession-num>9746553</accession-num><urls><related-urls><url>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&amp;db=PubMed&amp;dopt=Citation&amp;list_uids=9746553</url></related-urls></urls><custom2>108564</custom2><language>eng</language></record></Cite></EndNote>(9). یکی از علل مهم مسمومیت های غذایی در اروپا و ایالات متحده آمریکا، سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس می باشد. براورد شده است که 93.8 میلیون نفر سالانه در کل جهان به سالمونلا مبتلا می شوند که نتیجه آن 155000 مورد مرگ در سال می باشد.

شکل1-2: در شکل سمت چپ باکتری سالمونلا با تاژک پری تریش دیده می شود و در شکل سمت راست میزان شیوع باکتری سالمونلا در سطح جهان را نشان می دهد.
1-2-3، تست ها و خواص بیوشیمیایی
این باکتری تست اندول و ONPG آن منفی بوده و لاکتوز را تخمیر نمی کند اما این باکتری متحرک بوده و تست سیترات و SH2 آن مثبت می باشد. واکنش آنتی بادی علیه آنتی ژن های Vi و H و O این باکتری مبنای سروتایپینگ سالنونلا است.
در حالیکه مبنای اصلی طبقه بندی سالمونلا سروتایپینگ آنتی ژن های سطحی می باشد اما اساس تفریق سروتایپ تایفی تست های بیوشیمیایی می باشد . سروتایپ تایفی از نظر تست های بیوشیمیایی به صورت خنثی می باشد. سروتایپ تایفی در همه تست های تولید گاز از گلوکز، موسینات،آرابینوز، سیمون سیترات، اورنی تین دکربوکسیلاز و مصرف استات منفی را بروز می دهد. سروتایپ تایفی مسئول تیفوئید بوده و سایر سروتایپ ها باعث انتریت و انتروکولیت می شودPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5Ccm9va3M8L0F1dGhvcj48WWVhcj4yMDEyPC9ZZWFyPjxS
ZWNOdW0+MTwvUmVjTnVtPjxyZWNvcmQ+PHJlYy1udW1iZXI+MTwvcmVjLW51bWJlcj48Zm9yZWln
bi1rZXlzPjxrZXkgYXBwPSJFTiIgZGItaWQ9InhhOWZ3cDl6dmU1eGFlZXhkdmlwOTkyY3QydHd6
ZXZ3Mjl6dyI+MTwva2V5PjwvZm9yZWlnbi1rZXlzPjxyZWYtdHlwZSBuYW1lPSJCb29rIj42PC9y
ZWYtdHlwZT48Y29udHJpYnV0b3JzPjxhdXRob3JzPjxhdXRob3I+QnJvb2tzLCBHLjwvYXV0aG9y
PjxhdXRob3I+Q2Fycm9sbCwgSy5DLjwvYXV0aG9yPjxhdXRob3I+QnV0ZWwsIEouPC9hdXRob3I+
PGF1dGhvcj5Nb3JzZSwgUy48L2F1dGhvcj48L2F1dGhvcnM+PC9jb250cmlidXRvcnM+PHRpdGxl
cz48dGl0bGU+SmF3ZXR6IE1lbG5pY2smYW1wO0FkZWxiZXJncyBNZWRpY2FsIE1pY3JvYmlvbG9n
eSAyNi9FPC90aXRsZT48L3RpdGxlcz48ZGF0ZXM+PHllYXI+MjAxMjwveWVhcj48L2RhdGVzPjxw
dWJsaXNoZXI+TWNncmF3LWhpbGw8L3B1Ymxpc2hlcj48aXNibj45NzgwMDcxNzkwMzE0PC9pc2Ju
Pjx1cmxzPjxyZWxhdGVkLXVybHM+PHVybD5odHRwczovL2Jvb2tzLmdvb2dsZS5jb20vYm9va3M/
aWQ9VVVTWFY4QjlpOXNDPC91cmw+PC9yZWxhdGVkLXVybHM+PC91cmxzPjwvcmVjb3JkPjwvQ2l0
ZT48Q2l0ZT48QXV0aG9yPkJhdW1sZXI8L0F1dGhvcj48WWVhcj4xOTk4PC9ZZWFyPjxSZWNOdW0+
MzwvUmVjTnVtPjxyZWNvcmQ+PHJlYy1udW1iZXI+MzwvcmVjLW51bWJlcj48Zm9yZWlnbi1rZXlz
PjxrZXkgYXBwPSdFTicgZGItaWQ9J3BhMGZ6MnAwOGF4OXd0ZXh3ZTg1NTJ0ZTBkdjBhd3dhOTlm
cyc+Mzwva2V5PjwvZm9yZWlnbi1rZXlzPjxyZWYtdHlwZSBuYW1lPSdKb3VybmFsIEFydGljbGUn
PjE3PC9yZWYtdHlwZT48Y29udHJpYnV0b3JzPjxhdXRob3JzPjxhdXRob3I+QmF1bWxlciwgQS4g
Si48L2F1dGhvcj48YXV0aG9yPlRzb2xpcywgUi4gTS48L2F1dGhvcj48YXV0aG9yPkZpY2h0LCBU
LiBBLjwvYXV0aG9yPjxhdXRob3I+QWRhbXMsIEwuIEcuPC9hdXRob3I+PC9hdXRob3JzPjwvY29u
dHJpYnV0b3JzPjxhdXRoLWFkZHJlc3M+RGVwYXJ0bWVudCBvZiBNZWRpY2FsIE1pY3JvYmlvbG9n
eSBhbmQgSW1tdW5vbG9neSwgQ29sbGVnZSBvZiBNZWRpY2luZSwgVGV4YXMgQSZhbXA7TSBVbml2
ZXJzaXR5LCBDb2xsZWdlIFN0YXRpb24sIFRleGFzIDc3ODQzLTQ0NjcsIFVTQS5hYmF1bWxlckB0
YW11LmVkdTwvYXV0aC1hZGRyZXNzPjx0aXRsZXM+PHRpdGxlPkV2b2x1dGlvbiBvZiBob3N0IGFk
YXB0YXRpb24gaW4gU2FsbW9uZWxsYSBlbnRlcmljYTwvdGl0bGU+PHNlY29uZGFyeS10aXRsZT5J
bmZlY3QgSW1tdW48L3NlY29uZGFyeS10aXRsZT48L3RpdGxlcz48cGFnZXM+NDU3OS04NzwvcGFn
ZXM+PHZvbHVtZT42Njwvdm9sdW1lPjxudW1iZXI+MTA8L251bWJlcj48ZWRpdGlvbj4xOTk4LzA5
LzI0PC9lZGl0aW9uPjxrZXl3b3Jkcz48a2V5d29yZD4qQWRhcHRhdGlvbiwgQmlvbG9naWNhbDwv
a2V5d29yZD48a2V5d29yZD5BbmltYWxzPC9rZXl3b3JkPjxrZXl3b3JkPipCaW9sb2dpY2FsIEV2
b2x1dGlvbjwva2V5d29yZD48a2V5d29yZD5IdW1hbnM8L2tleXdvcmQ+PGtleXdvcmQ+TWFtbWFs
cy8qbWljcm9iaW9sb2d5PC9rZXl3b3JkPjxrZXl3b3JkPk1vZGVscywgQmlvbG9naWNhbDwva2V5
d29yZD48a2V5d29yZD5QbGFzbWlkcy9nZW5ldGljczwva2V5d29yZD48a2V5d29yZD5TYWxtb25l
bGxhIEluZmVjdGlvbnMvbWljcm9iaW9sb2d5PC9rZXl3b3JkPjxrZXl3b3JkPlNhbG1vbmVsbGEg
ZW50ZXJpY2EvKnBhdGhvZ2VuaWNpdHk8L2tleXdvcmQ+PGtleXdvcmQ+VmlydWxlbmNlL2dlbmV0
aWNzPC9rZXl3b3JkPjwva2V5d29yZHM+PGRhdGVzPjx5ZWFyPjE5OTg8L3llYXI+PHB1Yi1kYXRl
cz48ZGF0ZT5PY3Q8L2RhdGU+PC9wdWItZGF0ZXM+PC9kYXRlcz48aXNibj4wMDE5LTk1NjcgKFBy
aW50KSYjeEQ7MDAxOS05NTY3IChMaW5raW5nKTwvaXNibj48YWNjZXNzaW9uLW51bT45NzQ2NTUz
PC9hY2Nlc3Npb24tbnVtPjx1cmxzPjxyZWxhdGVkLXVybHM+PHVybD5odHRwOi8vd3d3Lm5jYmku
bmxtLm5paC5nb3YvZW50cmV6L3F1ZXJ5LmZjZ2k/Y21kPVJldHJpZXZlJmFtcDtkYj1QdWJNZWQm
YW1wO2RvcHQ9Q2l0YXRpb24mYW1wO2xpc3RfdWlkcz05NzQ2NTUzPC91cmw+PC9yZWxhdGVkLXVy
bHM+PC91cmxzPjxjdXN0b20yPjEwODU2NDwvY3VzdG9tMj48bGFuZ3VhZ2U+ZW5nPC9sYW5ndWFn
ZT48L3JlY29yZD48L0NpdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5aaW5zc2VyPC9BdXRob3I+PFllYXI+MTk5
NzwvWWVhcj48UmVjTnVtPjExPC9SZWNOdW0+PHJlY29yZD48cmVjLW51bWJlcj4xMTwvcmVjLW51
bWJlcj48Zm9yZWlnbi1rZXlzPjxrZXkgYXBwPSJFTiIgZGItaWQ9InhhOWZ3cDl6dmU1eGFlZXhk
dmlwOTkyY3QydHd6ZXZ3Mjl6dyI+MTE8L2tleT48L2ZvcmVpZ24ta2V5cz48cmVmLXR5cGUgbmFt
ZT0iQm9vayI+NjwvcmVmLXR5cGU+PGNvbnRyaWJ1dG9ycz48YXV0aG9ycz48YXV0aG9yPlppbnNz
ZXIsIEguPC9hdXRob3I+PGF1dGhvcj5Kb2tsaWssIFcuSy48L2F1dGhvcj48L2F1dGhvcnM+PC9j
b250cmlidXRvcnM+PHRpdGxlcz48dGl0bGU+Wmluc3NlciBNaWNyb2Jpb2xvZ3k8L3RpdGxlPjwv
dGl0bGVzPjxkYXRlcz48eWVhcj4xOTk3PC95ZWFyPjwvZGF0ZXM+PHB1Ymxpc2hlcj5QcmVudGlj
ZSBIYWxsPC9wdWJsaXNoZXI+PGlzYm4+OTc4OTgxNDAwOTE5NTwvaXNibj48dXJscz48cmVsYXRl
ZC11cmxzPjx1cmw+aHR0cHM6Ly9ib29rcy5nb29nbGUuY29tL2Jvb2tzP2lkPWs1cHpQZ0FBQ0FB
SjwvdXJsPjwvcmVsYXRlZC11cmxzPjwvdXJscz48L3JlY29yZD48L0NpdGU+PC9FbmROb3RlPgB=
ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5Ccm9va3M8L0F1dGhvcj48WWVhcj4yMDEyPC9ZZWFyPjxS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=
ADDIN EN.CITE.DATA (4, 9, 10).
ویژگی های بیوشیمیایی سالمونلا همان ویژگی های عمومی خانواده انتروباکتریاسه می باشد. تخمیر کربوهیدرات توسط سالمونلا همراه با تولید گاز و اسید می باشد. سالمونلا مانیتول، آرابینوز، گلوکز، دولسیتول، سوربیتول و مالتوز را تخمیر می کند اما سالیسین، آدنیتول، لاکتوز و ساکارز را تخمیر نمی کند ولی سالمونلا کلراسوئیس و تعدادی از سویه های سالمونلا تایفی، قادر به تخمیر آرابینوز نیستند. سالمونلا کلراسوئیس، سالمونلا پولروم، برخی از سویه های سالمونلا پاراتایفی و تقریبا تمام سویه های سالمونلا تایفی قادر به تخمیر دولسیتول نمی باشند. سالمونلا گالیناروم، برخی از سروتایپ های سالمونلا تایفی موریوم، سالمونلا تایفی و سالمونلا دابلین هنگام تخمیر کربوهیدرات، گاز ایجاد نمی کند. برخی از سویه ها قادر به تخمیر ساکارز، رافینوز و لاکتوز هستند، این ویژگی های غیر عادی بدلیل وجود پلاسمید است. اکثرا سالمونلا آریزونه واجد فعالیت بتاگالاکتوزیداز می باشد و لاکتوز را یا به سرعت و یا به آهستگی تخمیر می کند. بیشتر سویه هایی که قند های خاص را تخمیر میکنند، این عمل را با شدت بالا انجام می دهند و در آب پپتون دار در دمای 37 درجه سانتی گراد و در مدت زمان 6 تا 10 ساعت، اسید تولید می کنند. ممکن است سویه های غیر تخمیر کننده در اثر چهش به تخمیر کننده تبدیل شوند و بعد از گذشت چند روز اسید ایجاد کنند و امکان دارد با سایر سالمونلا ها که تخمیر کننده هستند، اشتباه گرفته شوند. برخی از سویه ها دارای نقص در فرایند جذب قند هستند و اسید را در طول مدت 10 الی 20 ساعت ایجاد می کنند ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4).
1-2-4، طبقه بندی سالمونلا
طبقه بندی سالمونلا بسیار دشوار است، به علت اینکه از گونه های متععدی تشکیل شده است. معمولا گونه های سالمونلا را بر اساس ویژگی های بیوشیمیایی، اپیدمیولوژی، میزبان و آنتی ژن های O، H و Vi طبقه بندی می شوند. برای اولین بار در سال 1929 میلادی طبقه بندی سالمونلا توسط کافمن صورت گرفت که توسط وایت این طبقه بندی تکمیل گردید. بر اساس این طبقه بندی، سروتایپ های سالمونلا در یک گونه منفرد قرار گرفت. طبقه بندی دیگری که وجود دارد،ادواردز-اوینگ می باشد که سالمونلا را در سه گونه ی سالمونلا تایفی، سالمونلا کلراسوئیس و انتریتیدیس و صد ها سروتایپ طبقه بندی می کند(4و10).
طبقه بندی سومی که برای سالمونلا وجود دارد، بر اساس هیبریداسیون DNA می باشد. که بر اساس آن جنس سالمونلا شامل دو گونه ی سالمونلا بونگوری و سالمونلا انتریکا می باشد. در این طبقه بندی اکثر پاتوژن های انسان در گونه ی انتریکا جای گرفته اند.
سالمونلا انتریکا به شش زیر گونه تقسیم می شودکه شامل: سالمونلا انتریکا، سالمونلا سالاما، سالمونلا آریزونه، سالمونلا دی آریزونه، سالمونلا هونته و سالمونلا انتریتیدیس می باشد(5).
جدول1-1، ویژگی های بیو شیمیایی سالمونلا
زیرگووه گونه
ویژگی
1 2 3a 3b 4 5 6
انتریکا سالامه آریزونه دی آریزونه هونته بونگوری اندیکا
ONPG - - + + - + متغییر
هضم ژلاتین - + + + + - +
مصرفD تارتارات + - - - - - -
مصرف مالونات - + + + - - -
تخمیر دولسیتول + + - - - + متغییر
تخمیر لاکتوز - - - + - -
تخمیر سالیسین - - - - + - -
تخمیر سوربیتول + + + + + + -
تخمیر Dگالاکتورونات - - + + + +
گاماگلوتامیل ترانسفراز + + - + + + +
تاژک دو فازی دو فازی تک فازی دو فازی تک فازی تک فازی دو فازی
رشد در حضورKCN - - - - + + +
جدول 1-2، طبقه بندی نوین سالمونلا و میزان سروتایپ ها در زیر گونه هاPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5Ccm9va3M8L0F1dGhvcj48WWVhcj4yMDEyPC9ZZWFyPjxS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=
ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5Ccm9va3M8L0F1dGhvcj48WWVhcj4yMDEyPC9ZZWFyPjxS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=
ADDIN EN.CITE.DATA (1, 8, 9)
اسم گونه میزان سرو تایپ در سال 2000 میلادی میزان سرو تایپ در سال 2001 میلادی میزان سرو تایپ در سال 2002 میلادی
الف- گونه سالمونلا انتریکا
1-سالمونلا انتریکا زیر گونه انتریکا
2-سالمونلا انتریکا زیر گونه سالامه
3-سالمونلا انتریکا زیر گونه آریزونه
4-سالمونلا انتریکا زیر گونه دی آریزونه
5-سالمونلا انتریکا زیر گونه هونته
6- سالمونلا انتریکا زیر گونه اندیکا
ب- گونه بونگوری
جمع کل 2469
1610
497
94
325
69
12
21
2628 2491
1624
499
95
329
69
13
21
2650 2509
1636
501
95
331
70
13
30
2668
1-2-5، آنتی ژن های سالمونلا
الف) آنتی ژن O
آنتی ژن O در برابر الکل و حرارت مقاوم است و در سالمونلا 67 انتی ژن O وجود دارد که با عدد نشان داده می شود. آنتی ژن O می تواند حرارت جوش را به مدت دو ساعت و نیم تحمل کند اما آنتی ژن فلاژل و آنتی ژن فیمبریه در این درجه حرارت نابود می شوند و قادر به تحمل آن نیستند. خاصیت آنتی ژن O بوسیله لیپوپلی ساکارید که در دیواره باکتری های گرم منفی وجود دارد ایجاد می شود.
بدلیل هیدروفیل بودن آنتی ژن O در محلول نمکی0.85% NaCl، یک سوسپانسیون یکنواخت ایجاد می کند.آنتی ژن O می تواند در درجه حرارت 37 درجه سانتی گراد اتانول 96 درصد به مدت زمان چهار ساعت تحمل کند اما فرمالین 0.2% باعث غیر فعاسازی آنتی ژن O میشود. (2و3).
ب)آنتی ژن فلاژلی یا آنتی ژن H
آنتی ژن H در برابر الکل و حرارت حساس می باشد و در درجه حرارت 100 درجه سانتی گراد به مدت زمان سی دقیقه همه ی فلازل ها از باکتری جدا می شود. این فرایند جدا شدن فلاژل ها از باکتری در دمای 60 درجه سانتی گراد آغاز می شود اما این فلاژل هایی که از باکتری جدا می شوند، سیستم ایمنی را تحریک می کنند. آنتی ژن H یکی دیگر از آنتی ژن های سالمونلا می باشد که این آنتی ژن مربوط به فلاژل باکتری می باشد. هنگامیکه که ما سوسپانسیون باکتری را به مدت دو نیم ساعت بجوشانیم این خاصیت ایمنی زایی باکتری از بین می رود اما اگر در دمای پایین تر از دمای جوش قرار گیرد خاصیت اگلوتیناسیون آنتی ژن از بین رفته اما قدرت آنتی ژن از بین نمی رود (2و3).
آنتی ژن فلاژلی دو نوع است که عبارت است از : 1) آنتی ژن فلاژلی فاز یک(H₁) 2) آنتی ژن فلاژلی فاز دو(H₂).
آنتی ژن H₁ با حروف لاتین نشان داده می شود و از حرف a تا حرف z میباشد. به علت اینکه تعداد آنتی ژن H₁ بسیاز بیشتر از 25 می باشد، سایر آنتی ژن های H با اضافه کردن عدد به حرف Z مشخص می شود. آنتی ژن H₂ به صورت عدد از 1 تا 12 نشان داده می شود.تعداد آنتی ژن H₁، 93 عدد می باشد (3).
ج) آنتی ژن K یا آنتی کپسولی
سه نوع آنتی ژن کپسولی در سالمونلا وجود دارد که شامل: آنتی ژن M، آنتی ژن Vi و آنتی ژن 5
آنتی ژن M:
آنتی ژن M شامل کولانیک اسید است. آنتی ژن M باعث ایجاد کلونی های مخاطی می گردد. آنتی ژن M پلی ساکارید های خارج سلولی می باشد. مکانیسم جلوگیری از آگلوتیناسیون به وسیله آنتی سرم علیه O، شبیه مکانیسم عمل آنتی ژن Vi می باشد. خصوصیت آنتی ژن M با آنتی ژن Vi تفاوت دارد.برخی از آنتی ژن های کپسولی اشرشیاکلی (مثل: K₃₀ و K₃₉) و K₈ و K₃ کلبسیلا با آنتی ژن M سالمونلا واکنش متقاطع دارند. برای تعیین آنتی ژن M، کلونی ها حالت لعابی پیدا می کند و به کشت باکتری سرم ضد آنتی ژن M اضافه می کنیم که می توان از آزمایش تورم کپسولی استفاده نمود(3).
آنتی ژن Vi:
آنتی ژن Vi یک پلی ساکارید کپسولی می باشد و از واحد های هموپلیمرN- استیل گالاکتوز آمینورونیک اسید تشکیل شده است که با پیوند 1 به 4 بهم متصل شده اند و کربن شماره ی 3 آن استیله می باشد. هنگامیکه از خون بیماران مبتلا به تب روده ای، سالمونلا انتریکا سرووار تایفی جدا شود، این سالمونلا ها در برابر آنتی سرم O₉ آگلوتینه نمی شوند. بدلیل آنکه این آنتی ژن برای موش دارای قدرت بیماریزایی بیشتر می باشد به آن آنتی ژن حدت گفته می شود.
سویه هایی که دارای آنتی ژن Vi می باشند در برابر آب اکسیژنه حساس اند و به همین علت دانشمندان معتقند که آنتی ژن Vi در مکانیسم فاگوسیتوز نوتروفیل ها اختلال ایجاد نمی کند بلکه در برابر عمل انفجار اکسیداتیوی که در داخل نوتروفیل ها رخ می دهد، مقاوم است. آنتی ژن Vi میزان تثبیت C₃ در سطح سالمونلا تایفی کاهش می دهد(زهرایی سال1378 Murray, Rosenthal et al. 2013). به علت آنکه آنتی ژن Vi مانع از عمل آگلوتیناسیون به وسیله آنتی سرم ضد آنتی ژن O می شود، برای حذف آنتی ژن Vi، باید باکتری را در دمای صد درجه سانتی گراد( دمای جوش) به مدت یک ساعت جوشاند(1 و 3).
آنتی ژن 5:
در ابتدا این آنتی ژن به عنوان آنتی ژن O شناسایی شد و این آنتی ژن دارای تفاوت هایی با سایر آنتی ژن های پیکری است.
کافمن نشان داد که این آنتی ژن در برابر کلریدریک اسید حساس بوده و در مجاورت آن تخریب می شود و ویژگی آگلوتیناسیون آنتی ژن 5 در درجه حرارت 120 درجه سانتی گراد از بین می رود که این ویژگی بر خلاف آنتی ژن O₄ می باشد.این آنتی ژن در برابر الکل مقاوم است که این ویژگی مشابه آنتی ژن O₄ می باشد.آنتی ژن 5 در ارتباط با بیماریزایی سروتایپ ها بی تاثیر است، به عنوان مثال سالمونلا انتریکا سرووار تایفی موریوم که فاقد آنتی ژن 5 می باشد برای موش به شدت بیماریزا است. می توان آنتی سرم ضد آنتی ژن 5 را بوسیله کشت فرمالین اشکال بدون فلاژل با کشت حرارت دیده سالمونلا پارا تایفیB بدست اوردPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5Ib2xtZXM8L0F1dGhvcj48WWVhcj4xOTY4PC9ZZWFyPjxS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دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 
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ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5Ib2xtZXM8L0F1dGhvcj48WWVhcj4xOTY4PC9ZZWFyPjxS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ADDIN EN.CITE.DATA (11, 12).
د) آنتی ژن های فیمبریه ای
اکثر سروتایپ های سالمونلا دارای جایگاهی برای آنتی ژن فیمبریه هستند و فیمبریه تولید می کنند. با توجه به بررسی هایی که بر روی سالمونلا انتریتیدیس و سالمونلا تایفی موریوم صورت پذیرفت، اطلاعاتی در مورد فیمبریه ی سالمونلاها بدست آمد. آنتی ژن فیمبریه ای در برابر فرمالدئید0.1-0.2 ثابت می شود که این ویژگی مشابه آنتی ژن فلاژل می باشد. برخی از آنتی ژن های فیمبریه ای دارای خاصیت پوشانندگی آگلوتیناسیون O وH می باشند، این ویژگی باعث می شود که هنگامیکه از سالمونلایی که در مرحله اول فیمبریه قرار دارد، آنتی بادی ضد فیمبریه جدا شود و از این آنتی بادی استفاده شود، باعث ایجاد واکنش متقاطع و گیج کننده ای می شود. برای آنکه این واکنش صورت نگیرد باید از کشت هایی برای تهیه سوسپانسیون استفاده شود که در مرحله غیر فیمبریه ای باشند. فیمبریه اگر به مدت 30 دقیقه در حرارت 100 درجه سانتی گراد قرار گیرد از باکتری جدا می شود ولی در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت سی دقیقه قرار گیرد، غیر فعال می شود ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Murray</Author><Year>2013</Year><RecNum>2</RecNum><record><rec-number>2</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">2</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Murray, P.R.</author><author>Rosenthal, K.S.</author><author>Pfaller, M.A.</author></authors></contributors><titles><title>Medical Microbiology</title></titles><dates><year>2013</year></dates><publisher>Mosby/Elsevier</publisher><isbn>9780323054706</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=O92zd8fV-RcC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(5).
1-2-6، عوامل دخیل در بیماریزایی در سالمونلا
سالمونلا دارای عوامل بیماریزایی متعددی می باشد که شامل: انتروتوکسین، سیتوتوکسین، اندوتوکسین، سیدروفور، آنتی ژن های سطحی و غیره می باشد و این عوامل در سروتایپ های مختلف سالمونلا نقش مختلفی در بیماریزایی سالمونلا در میزبان های مختلف بر عهده دارند مثلا سالمونلا تایفی موریوم در میزبان طبیعی خود، موش، بیماری هایی شبیه حصبه ایجاد می کند ولی در انسان ، گاستروانتریت خود محدودشونده ایجاد می کند در حالیکه سالمونلا تایفی حتی به صورت خوراکی در حیوانات ایجاد بیماری نمی کند و تنها در انسان بیماری ایجاد می کند. این باکتری انگل اختیاری داخل سلولی می باشد. بقاء سالمونلا داخل سلول های میزبان به دلیل پاسخ های متفاوت سیستم اینمنی میزبان های مختلف سالمونلا در برابر این باکتری می باشد(3).
الف) سیتوتوکسین
فعالیت سیتوتوکسین تنها در عصاره باکتری دیده می شود، این ویژگی بدلیل وابستگی توکسین به غشای خارجی باکتری می باشد. میزان تولید سیتوتوکسین توسط سروتایپ های مختلف سالمونلا، متفاوت می باشد. سروتایپ تایفی کمترین میزان و سروتایپ های انتریتیدیس و کلراسوئیس بیشترین میزان توکسین را تولید می نمایند. سیتوتوکسین در سلول های یوکاریوتی باعث مهار سنتز پروتئین می گردد. درانتریت سالمونلایی تخریب سلول های پوشش روده دیده می شود که احتمال داده می شود این تخریب توسط سیتوتوکسین سالمونلا ایجاد شود. عملکرد سیتوتوکسین در بیماریزایی سالمونلا هنوز بطور کامل معلوم نمی باشد اما احتمال داده می شود این سم باعث ایجاد تغییراتی در غشای سلولی که می شود که موجب مختل شدن عبور و مرور انتخابی مولکول ها از غشای سلولی می گردد که این عملکرد در نهایت باعث نکروز شدن انتروسیت ها می شود. اسیب بافتی ناشی از سیتوتوکسین باعث سهولت در تهاجم سالمونلا می شود(3،10 ).
ب) اندوتوکسین
علامت هایی که در حیوانات آزمایشکاهی نظیر موش در اثر تزریق اندوتوکسین ایجاد می شود مشابه علایمی است که در اثر سپتمی سمی ناشی از سالمونلا ایجاد می گردد. علامت هایی که در اثر اندوتوکسین سالمونلا ایجاد می شود نظیر کاهش فشار خون، لکوپنی و در نهایت لکوسیتوز، شوک، اسیدوز و تب می باشد. عامل اصلی سمیت اندوتوکسین، لیپید A موجود در غشای خارجی باکتری های گرم منفی می باشد. حساسیت انسان در برابر اندوتوکسین از سایر موجودات زنده بسیاربالاتر می باشد و این بدلیل آن می باشد که بروز حالت تحمل در برابر اندوتوکسین بدلیل افزایش آهسته درجه حرارت از بین می رود. سلول های مختلفی از بدن مثل پلاکت ها، مونوسیت ها، سلول ها، ماکروفاژها و نوتروفیل ها تحت تاثیر اندوتوکسین قرار گرفته و موادی از این سلول ها آزاد می شود مثل اینترلوکین هشت، آنافیلاتوکسین، اینترلوکین یک، اینترلوکین شش و فاکتور نکروز دهنده تومور می باشد که هریک از این مواد برروی اندام های بدن تاثیر می گذارد(3).
ج) انتروتوکسین
توکسین حساس به حرارت که نوسط اشرشیا کلی و ویبریو کلرا تولید می شود توسط برخی از سویه های سالمونلا تایفی موریوم نیز تولید می گردد که از نظر مکانیسم مشابه سم تولیدی توسط ویبریو کلرا می باشد و با فعال کردن ادنیلات سیکلاز و در نهایت باعث افزایش cAMP می گردد. انتروتوکسینی که توسط برخی از سویه های سالمونلا تایفی موریوم تولید می شود از لحاظ نیاز به نفوذ نوتروفیل ها با کلراتوکسین متفاوت می باشد در نتیجه ارتباطی بین میزان بیماریزایی سالمونلا تایفی موریوم و توانایی تحریک نفوذ نوتروفیل ها وجود دارد. این باکتری باعث غالب شدن نوتروفیل ها در بین سایر لکوسیت ها در طی تهاجم در غشای روده می شود و با تهاجم نوتروفیل ها به باکتری، انتروتوکسین از باکتری آزاد می گردد.انترو توکسین همراه با دیواره باکتری می باشد و ماهیت پروتئینی دارد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Isenberg</Author><Year>1992</Year><RecNum>225</RecNum><record><rec-number>225</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">225</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Isenberg, H.D.</author><author>American Society for Microbiology</author></authors></contributors><titles><title>Clinical microbiology procedures handbook</title></titles><dates><year>1992</year></dates><publisher>American Society of Microbiology</publisher><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=0JpKAQAAIAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(13).
1-2-7. بیماری های ناشی از سالمونلا
بیماری های ناشی از سالمونلا که در انسان ایجاد می شوند شامل: گاستروانتریت، سپتی سمی، تیفوئید و انترو کولیت حاد می باشد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4).
الف) حصبه
سالمونلابه انتهای دیواره اپیتلیال روده حمله می کند و سپس به گره های لنفاوی روده منتقل می شود، در این گره های لنفاوی، سالمونلا توسط ماکروفاژها- مونوسیت ها و پلی مورفونوکلئوز بلعیده می شود و سالمونلاهایی که توسط PMN ها بلعیده می شود، از بین می روند اما سالمونلاهایی که توسط ماکروفاژها بلعیده می شوند در درون واکوئل آن ها تکثیر یافته و ماکروفاژها به عنوان یک ناقل برای سالمونلا عمل می کند و باعث انتقال سالمونلا به بافت های مختلف رتیکلواندوتلیال می شود. در نهایت این ماکروفاژهای آلوده به سالمونلا تخریب شده و سالمونلا آزاد می شود و باعث ایجاد سپتی سمی می شود. حصبه توسط دو سروتایپ تایفی و پاراتایفی ایجاد می گردد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Walker</Author><Year>1998</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">3</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Walker, T.S.</author></authors></contributors><titles><title>Microbiology</title></titles><dates><year>1998</year></dates><publisher>W.B. Saunders Company</publisher><isbn>9780721646411</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=DtlpAAAAMAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(6).
علایم حصبه بعد از 7 تا 14 روز بروز می کند و شامل: بی حالی، تب، بی اشتهایی، سرفه خشک، یبوست و سردرد می باشد. در این دو هفته از بیماری، گلبول های سفید در حد نرمای بوده و سالمونلا در مدفوع وجود ندارد. در هفته دوم از بیماری، بیمار به شدت نا خوش است به این دلیل که سالمونلاها از ماکروفاژهای آلوده آزاد می گردد. روی بدن بیمار لکه های به قطر دو تا سه میلی متر دیده می شود که شاید این ماکولوپاپولار شامل سالمونلا باشد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Walker</Author><Year>1998</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">3</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Walker, T.S.</author></authors></contributors><titles><title>Microbiology</title></titles><dates><year>1998</year></dates><publisher>W.B. Saunders Company</publisher><isbn>9780721646411</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=DtlpAAAAMAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(6).
هنگامیکه بیمار مبتلا به حصبه بهبود یابد در تمام طول زندگی در برابر تیفوئید مقاوم خواهد بود.هنگامیکه بیماری به موقع درمان پیدا نکند، فرد مبتلا به حصبه وارد مرحله ی جدیدی از بیماری می شود که فرد مبتلا به سختی رنج می کشد و دارای علایمی شامل: یبوست شدید، اسهال زرد رنگ و تب بالا می باشد.
در هفته سوم از بیماری، فرد وارد مرحله تب روده ای شده و دارای علایمی می باشد که شامل: بی حالی، کاهش شدید وزن بدن و ممکن است نفخ در ناحیه شکم نیز مشاهده شود. در هفته چهارم به تدریج علائم کم شده و دمای بدن بعد 7 تا 10 روز به حالت طبیعی باز می گردد اما ممکن بعد از دو هفته که تب پایین آمد سایر علائم نیز دوباره بروز کنند. علایمی که حیات بیمار را تهدید می کند در مرحله تب روده ای رخ می دهدPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5XYWxrZXI8L0F1dGhvcj48WWVhcj4xOTk4PC9ZZWFyPjxS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ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5XYWxrZXI8L0F1dGhvcj48WWVhcj4xOTk4PC9ZZWFyPjxS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ADDIN EN.CITE.DATA (6, 14, 15).
بیماری شبیه تب روده ای معمولا نسبت به حصبه دارای علائم خفیف تری می باشد و دارای عوارض شدید نمی باشد. دوره ی بهبود بیماری شبه حصبه که توسط سروتایپ پاراتایفی ایجاد می شود نسبت به حصبه کمتر می باشد.
شدیدترین عوارضی که طی بیماری ایجاد می شود، سوراخ شدن روده و خونریزی می باشد که معمولا در هفته سوم از بیماری ایجاد می شود. خونریزی روده با علایمی چون: شوک، دیده شدن خون در مدفوع و افت ناگهانی فشار می باشد. سوراخ شدن روده باعث ایجاد شرایط اوراژنسی می شود و فرد باید تحت مراقبت های ویژه قرار گیرد، این وضعیت به دلیل ورود محتویات روده به حفره شکمی طی سوراخ شدن روده کوچک یا بزرگ می باشدPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5QYXJyeTwvQXV0aG9yPjxZZWFyPjE5OTk8L1llYXI+PFJl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ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5QYXJyeTwvQXV0aG9yPjxZZWFyPjE5OTk8L1llYXI+PFJl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ADDIN EN.CITE.DATA (14, 15).
یکسری علائم غیر معمول نیز وجود دارد که شامل: التهاب لوزالمعده، مننژیت، عفونت کلیه یا مثانه، مشکلات روانی مثل توهم، سایکوز، میوکاردیت و عفونت ریوی می باشد که تمام این علائم آتیپیک می باشد. اگر درمان صورت نگیرد ممکن است فرد مبتلا دچار مرگ شود ولی اکثر افراد در کشورهای توسعه یافته با درمان فوری به سرعت درمان می یابندPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5FcmdpbjwvQXV0aG9yPjxZZWFyPjIwMDQ8L1llYXI+PFJl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ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5FcmdpbjwvQXV0aG9yPjxZZWFyPjIwMDQ8L1llYXI+PFJl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ADDIN EN.CITE.DATA (14-16).
سپتی سمی
سپتی سمی دارای علایمی است که شامل: باکتریمی، بی اشتهایی، کاهش وزن بدن، کم خونی، بزرگ شدن کبد و طحال و تب ناگهانی می باشد. پس از تهاجم به ایلئوم در بیماران دارای کم خونی ممکن است عفونت به سمت سپتی سمی سوق داده شود. درمان آنتی بیوتیکی سپتی سمی شامل: سفتریاکسون، سپیروفلوکساسین و سفوپرازون می باشد و باید از افراد مبتلا به سپتی سمی کشت خون انجام شود بدلیل آنکه باکتری در داخل خون این افراد می باشد. ممکن است باکتریمی سبب عفونت در جاهای غیر عادی بدلیل وارد شدن ارگانیسم به اندام های مختلف شود. همچنین باعث سپسیس نیز می شود ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Walker</Author><Year>1998</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">3</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Walker, T.S.</author></authors></contributors><titles><title>Microbiology</title></titles><dates><year>1998</year></dates><publisher>W.B. Saunders Company</publisher><isbn>9780721646411</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=DtlpAAAAMAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(6).
ب) گاستروانتریت
سالمونلا با تولید انتروتوکسین و تهاجم به دیواره ی روده باعث ایجاد علایمی چون استفراغ، اسهال و تهوع می شود. بیشتر سروتایپ های سالمونلا می توانند باعث ایجاد انتریت می گردند.وجودPMN ها در مدفوع باعث اثبات هجوم باکتری به بافت ها شود اما بطور غیر معمول سالمونلا از دستگاه گوارش به سایر اندام های بدن منتقل می گردد.
سالمونلا از طریق محصولات دامی آلوده به انسان انتقال می یابد و این عفونت بین انسان و دام مشترک می باشد و این یک عفونت زئونوز می باشد.
ممکن است علاوه بر فراورده های لبنی آلوده به سالمونلا، آب شده به مدفوع یا ادرار حیوانات یا غذا از دیگر منابع انتریت ناشی از سالمونلا می باشند ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Walker</Author><Year>1998</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">3</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Walker, T.S.</author></authors></contributors><titles><title>Microbiology</title></titles><dates><year>1998</year></dates><publisher>W.B. Saunders Company</publisher><isbn>9780721646411</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=DtlpAAAAMAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(6).
ج) انترو کولیت
این بیماری تظاهر عفونت سالمونلایی می باشد. در ایالات متحده آمریکا، سالمونلا تایفی موریوم و سالمونلا انتریتیدیس غالب هستند، اما انتروکولیت توسط هرکدام از 1400 سروتایپ گروه یک سالمونلا می تواند ایجاد شود. 8 تا 48 ساعت پس از خورده شدن سالمونلا، تهوع، اسهال پر حجم، سردرد، استفراغ روی می دهد و تعداد کمی گلبول سفید در مدفوع دیده می شود. تب خفیف، شایع است ولی دوره بیماری 2 تا 3 روز پایان می پذیرد.
ضایعات التهابی در روده کوچک و روده بزرگ وجود دارد. باکتریمی غیر شایع است( 2 تا 4 درصد) به غیر از مواردی که بیمار دارای نقص سیستم ایمنی است. نتیجه کشت خون منفی است ولی نتیجه کشت مدفوع برای سالمونلاها مثبت بوده و ممکن است تا چند هفته پس از رفع علائم بالینی مثبت باقی بماند ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4).
1-2-8. اپیدمیولوژی سالمونلا
سالمونلا باعث مسومیت های غذایی، حصبه، سپتی سمی و انتروکولیت می شود و از طریق دهانی وارد بدن انسان و سایر حیوانات می شودPEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5QYXJyeTwvQXV0aG9yPjxZZWFyPjE5OTk8L1llYXI+PFJl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ADDIN EN.CITE PEVuZE5vdGU+PENpdGU+PEF1dGhvcj5QYXJyeTwvQXV0aG9yPjxZZWFyPjE5OTk8L1llYXI+PFJl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ADDIN EN.CITE.DATA (15, 17, 18).
در آمریکا انتریت سومین فرم شایع مسومیت غذایی است و سالیانه حدود 50000 مورد انتریت گزارش می شود که اکثرا به وسیله سالمونلا انتریکا سرو تایپ تایفی موریوم می باشد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Walker</Author><Year>1998</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">3</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Walker, T.S.</author></authors></contributors><titles><title>Microbiology</title></titles><dates><year>1998</year></dates><publisher>W.B. Saunders Company</publisher><isbn>9780721646411</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=DtlpAAAAMAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(6).
خانوم ها سالمونلا را در داخل کیسه صفراوی خود حمل می نمایند، در حالیکه هیچگونه علایمی از خود بروز نمی دهنند به این دلیل که سالمونلا دارای تمایل بالا به لوکالیزه شدن در کیسه صفرا می باشد و باعث می شود که این ناقلان برای سالها سالمونلا را به محیط اطراف منتقل نمایند.
مقدار حدود 10⁶ تا 10⁷ دوز از سالمونلا برای ایجاد عفونت نیاز است این به دلیل آن می باشد که سالمونلا به اسید معده حساس بوده که این خصوصیت بر خلاف شیگلا می باشد. افرادی که دارو های ضد اسید معده مصرف می کنند در برابر عفونت با سالمونلا حساس تر می باشند.
مدفوع افرادی که بیماری تحت بالینی نامحسوسی دارند و یا آنهایی که ناقل هستند نسبت به افرادی که وضعیت بالینی آشکاری دارند، منبع آلودگی بسیار مهم تری هستند، مثلا زمانی که ناقلینی که در تهیه مواد غذایی شاغل هستند و ارگانیسم را دفع می نمایند. بسیاری از حیوانات از جمله دام ها، جوندگان و ماکیان به طور طبیعی با انواعی از سالمونلا آلوده می شوند و باکتری در بافت های آنها( مثل گوشت)، مدفوع و تخم ها وجود دارد. در مورد شیوع بالای سالمونلاها در محصولات مرغ تجاری به طور گسترده اطلاع رسانی شده است. در ایالات متحده آمریکا بروز تب تیفوئید کاهش یافته ولی وقوع سایر عفونت های سالمونلایی به طور چشمگیری افزایش یافته است. به احتمال زیاد مشکل در استفاده وسیع از خوراک دام و طیور حاوی مواد دارویی ضد میکروبی است که شرایط برای رشد سویه های مقاوم سالمونلا تسهیل کرده و این سویه ها به انسان انتقال یافته و می تواند در انسان بیماری ایجاد نمایند. منابعی که ممکن سبب عفونت با سالمونلا در انسان شوند شامل: آب، شیر و سایر فراورده های لبنی، صدف، تخم مرغ پودر یا فریز شده، گوشت و فراورده های گوشتی، رنگ های با منشاء حیوانی، مواد مخدر مثل ماری جوانا و حیوانات دست آموز خانگی می باشند ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4).
1-2-9، تشخیص آزمایشگاهی سالمونلا
سالمونلا درمحیطهای S.S Agar، بیسموت سولفیت، بریلیانت گرین و HEA-SS رشد می کند ولی سایر کلی فرم ها همچون اشرشیا کلی بدلیل وجود آنتی بیوتیک ها قادر به رشد بر روی این محیط ها نیستند. در عفونت گاستروانتریت ناشی از سالمونلا، در اسمیر نازک از مدفوع اسهالی، گلبول های سفید همراه با باکتری سالمونلا در زیر میکروسکوپ دیده خواهد شد. کلونی های سالمونلا بر روی محیط بلاد آگار به صورت محدب و مرطوب به رنگ خاکستری به قطر دو تا سه میلی متر دیده می شود که این کلونی ها بعد گذشت بیست و چهار ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد ایجاد می گردد. در محیط مکانکی آگار کلونی های سالمونلا بیرنگ دیده می شود و رنگ محیط بدلیل عدم تخمیر قند لاکتوز زرد کهربایی می گردد ولی سایر باکتری های گرم منفی که جزء خانواده ی انترو باکتریاسه می باشند و تخمیر کننده ی قند لاکتوز هستند، برروی محیط مکانکی اگار کلونی هایی به رنگ صورتی ایجاد می نمایند. سالمونلا و شیگلا بر روی محیط های سلینت F و محیط مایع GN به سرعت تکثیر پیدا می کنند به این دلیل که این محیط ها مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می گردند ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Budowle</Author><Year>2005</Year><RecNum>238</RecNum><record><rec-number>238</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">238</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Budowle, Bruce</author><author>Schutzer, Steven E</author><author>Ascher, Michael S</author><author>Atlas, Ronald M</author><author>Burans, James P</author><author>Chakraborty, Ranajit</author><author>Dunn, John J</author><author>Fraser, Claire M</author><author>Franz, David R</author><author>Leighton, Terrance J</author></authors></contributors><titles><title>Toward a sys-- of microbial forensics: from sample collection to interpretation of evidence</title><secondary-title>Applied and environmental microbiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Applied and environmental microbiology</full-title></periodical><pages>2209-2213</pages><volume>71</volume><number>5</number><dates><year>2005</year></dates><isbn>0099-2240</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(19).
الف) تست های سرولوژیک
بررسی تیتر آنتی بادی و وجود آنتی بادی در سرم بیماران بویسله ی تست ویدال مشخص می گردد. آگلوتیناسیون که در اثر واکنش مستقیم بین آنتی ژنهای پیکری(O) و آنتی ژن تاژک(H) با آنتی بادی ضد آنها ایجاد می شود، اساس تست ویدال می باشد. تست ویدال به دو صورت روش اسلاید و روش لوله ای صورت می گیرد. روش اسلایدی به صورت سریع و روش لوله ای به صورت کند، صورت می پذیرد. به علت پایین بودن سرعت روش لوله ای، این روش تنها برای آنتی ژن هایی که در روش اسلایدی مثبت شده اند، صورت می پذیرد. با وجود اینکه تست ویدال آسان می باشد ولی میزان دقت و حساسیت آن پایین است ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Bhutta</Author><Year>2006</Year><RecNum>239</RecNum><record><rec-number>239</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">239</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Bhutta, Zulfiqar A</author></authors></contributors><titles><title>Current concepts in the diagnosis and treatment of typhoid fever</title><secondary-title>BMJ</secondary-title></titles><periodical><full-title>BMJ</full-title></periodical><pages>78-82</pages><volume>333</volume><number>7558</number><dates><year>2006</year></dates><isbn>0959-8138</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(20) .
حساسیت و دقت روشهای سنتی اعم از کشت و تست های سرولوژی پایین است، به این دلیل روشهای ژنوتایپینگ که بر مبنای ژنوم باکتری می باشد جایگزین روش های فنوتایپینگ شده است. از روش های ژنوتایپینگ که برای شناسایی سالمونلا تایفی استفاده می شود می توان به Nested-PCR با استفاده از پرایمر های HI-d اشاره نمود ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Bhutta</Author><Year>2006</Year><RecNum>239</RecNum><record><rec-number>239</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">239</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Bhutta, Zulfiqar A</author></authors></contributors><titles><title>Current concepts in the diagnosis and treatment of typhoid fever</title><secondary-title>BMJ</secondary-title></titles><periodical><full-title>BMJ</full-title></periodical><pages>78-82</pages><volume>333</volume><number>7558</number><dates><year>2006</year></dates><isbn>0959-8138</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(20) .
روش های جدیدی همچون Tubex و Typhidot جایگزین تست ویدال شده است. این تست ها قادر به شناسایی آنتی بادی های IgM ایجاد شده در میزبان بر ضد آنتی ژن های سالمونلا تایفی می باشد ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Bhutta</Author><Year>2006</Year><RecNum>239</RecNum><record><rec-number>239</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">239</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Bhutta, Zulfiqar A</author></authors></contributors><titles><title>Current concepts in the diagnosis and treatment of typhoid fever</title><secondary-title>BMJ</secondary-title></titles><periodical><full-title>BMJ</full-title></periodical><pages>78-82</pages><volume>333</volume><number>7558</number><dates><year>2006</year></dates><isbn>0959-8138</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(20) .
ب) کشت مدفوع
نمونه هایی که مشکوک به عفونت با سالمونلا هستند بر روی محیط های انتخابی SS Agar و EMB وهمچنین محیط های غنی GN و سلینت F کشت داده می شوند. پس از کشت این محیط ها را داخل انکوباکتور در دمای 37 درحه سانتی گراد به مدت یک شبانه روز قرار می دهند.
بر روی کلونی های بیرنگ و SH₂ دار تست های بیوشیمیایی مناسب را انجام می دهند. سالمونلا فاقد آنزیم اوره از می باشد و در نتیجه تست اوره آن منفی است. تمام سالمونلا ها به جزء سالمونلا پارا تایفی A برو ی محیط کلیگر آیرون آگار، SH₂ تولید می نمایند. تست IMVIC برای سالمونلا پاراتایفی B و C به صورت +- و +- می باشد و این تست برای سالمونلا پارا تایفی A به صورت +- بوده و برای سالمونلا تایفی به صورت – می باشد.
هنگامیکه سالمونلا تایفی مزمن شود، در داخل کیسه صفرا کلونیزه می شود و باکتری از طریق مدفوع از بدن خارج می شود و سالمونلا را می تران از طریق کشت مدفوع جدا نمود ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Brooks</Author><Year>2012</Year><RecNum>1</RecNum><record><rec-number>1</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">1</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Brooks, G.</author><author>Carroll, K.C.</author><author>Butel, J.</author><author>Morse, S.</author></authors></contributors><titles><title>Jawetz Melnick&amp;Adelbergs Medical Microbiology 26/E</title></titles><dates><year>2012</year></dates><publisher>Mcgraw-hill</publisher><isbn>9780071790314</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=UUSXV8B9i9sC</url></related-urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Walker</Author><Year>1998</Year><RecNum>3</RecNum><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">3</key></foreign-keys><ref-type name="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Walker, T.S.</author></authors></contributors><titles><title>Microbiology</title></titles><dates><year>1998</year></dates><publisher>W.B. Saunders Company</publisher><isbn>9780721646411</isbn><urls><related-urls><url>https://books.google.com/books?id=DtlpAAAAMAAJ</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(4,6).
در مورد عفونت های گاستروانتریت و انتروکولیت باید از بیمار کشت مدفوع صورت پذیرد اما از بیماران مشکوک به تب روده ای باید کشت خون صورت گیرد. سروتایپینگ به این صورت انجام می شود که یک قطره از آنتی سرم O بر روی لام ریخته و با یک کلونی از باکتری مخلوط می کنیم، اگر آگلوتیناسیون بعد از گذشت یک الی دو دقیقه صورت گرفت، مثبت بودن تست را مشخص می کند. در سالمونلا انتریتیدیس، سالمونلا پاراتایفی C و سالمونلا تایفی آنتی ژن کپسولی بر روی آنتی ژن پیکری قرار می گیرد در نتیجه ممکن است باکتری با هیچکدام از آنتی سرم های O واکنش ندهد و لخته ایجاد نشود ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Budowle</Author><Year>2005</Year><RecNum>238</RecNum><record><rec-number>238</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">238</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author>Budowle, Bruce</author><author>Schutzer, Steven E</author><author>Ascher, Michael S</author><author>Atlas, Ronald M</author><author>Burans, James P</author><author>Chakraborty, Ranajit</author><author>Dunn, John J</author><author>Fraser, Claire M</author><author>Franz, David R</author><author>Leighton, Terrance J</author></authors></contributors><titles><title>Toward a sys-- of microbial forensics: from sample collection to interpretation of evidence</title><secondary-title>Applied and environmental microbiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Applied and environmental microbiology</full-title></periodical><pages>2209-2213</pages><volume>71</volume><number>5</number><dates><year>2005</year></dates><isbn>0099-2240</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Schaechter</Author><Year>2001</Year><RecNum>240</RecNum><record><rec-number>240</rec-number><foreign-keys><key app="EN" db-id="xa9fwp9zve5xaeexdvip992ct2twzevw29zw">240</key></foreign-keys><ref-type name="Journal Article">17</ref-type><contributors><authors><author