—85

3-3-5- کاهش مواد جامد محلول در آب (TSS)27

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

3-3-6- محتوای پروتئین گلبرگ27
3-3-7- رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ28
3-3-8- جذب آب28
3-3-9- شمارش باکتری ساقه و محلول گلجای28
3-3-10- فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)28
3-3-11- فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز (SOD)29
3-4- تجزیه و تحلیل داده‌ها29
فصل چهارم: نتیجه گیری
4-1- عمر گلجایی31
4-2- کاهش وزن تازه گل32
4-3- درصد ماده خشک33
4-4- قطر گل34
4-5- کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS)35
4-6- میزان پروتئین گلبرگ36
4-7- میزان کاروتنوئید گلبرگ37
4-8- جذب آب38
4-9- جمعیت باکتریایی در ته ساقه39
4-10- جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌ها40
4-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز41
4-12- فعالیت آنزیم پراکسیداز42
فصل پنجم: بحث
5-1- بحث45
5-2- نتیجه‌گیری50
5-3- پیشنهادها50
منابع51

فهرست شکل‌ها
عنوانصفحه
شکل 1-1- گل ژربرا3
شکل 1-1-2- روند رشد و اثرات بروز پیری در مراحل نمو گل9
شکل 3-1- گل‌های شاخه بریده‌ی ژربرا در مرحله‌ی برداشت22
شکل 3-2- چیدمان طرح آزمایشی23
شکل 3-3- اندازه‌گیری وزن تر شاخه گل25
شکل 3-4- اندازه‌گیری قطر گل‌ها26
شکل 3-5- رفراکتومتر دستی (مدل N-1)27
شکل 3-6- اندازه‌گیری پروتئین گلبرگ27
شکل 3-7- اندازه‌گیری رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ28
شکل 4-1- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا31
شکل 4-2- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر کاهش وزن تر گل‌های شاخه بریده ژربرا32
شکل 4-3- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر وزن درصد ماده خشک گل‌های شاخه بریده ژربرا33
شکل 4-4- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا34
شکل 4-5- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر روی کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS) هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا35
شکل 4-6- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان پروتئین گلبرگ گل‌های شاخه بریده ژربرا36
شکل 4-7- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان کاروتنوئید گل‌های شاخه بریده ژربرا37
شکل 4-8- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان جذب آب گل‌های شاخه بریده ژربرا38
شکل 4-9- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در ته ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا39
شکل 4-10- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا40
شکل 4-11- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز گل‌های شاخه بریده ژربرا41
شکل 4-12- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل فعالیت آنزیم پراکسیداز گل‌های ساقه بریده ژربرا42

فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول 4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازه‌گیری شده در گل‌های‌شاخه‌بریده‌ژربرا43

چکیده
این مطالعه به منظور بررسی اثر نیکل بر عمر پس از برداشت گل ژربرا در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. گلهای سالم ژربرا ((Gerbera jamesonii cv. ‘Intense’ از یک تولید کننده تجاری خریداری گردید و فوراً به آزمایشگاه بخش باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد رشت منتقل شد. گلها روی ارتفاع 50 سانتیمتری باز برش شد و در گلدان پلاستیکی دو لیتری محتوی محلول های مختلف نیکل برای 24 ساعت قرار گرفت. تیمار پالس شامل محلول نیکل ( 10، 20 و 30 میلی گرم بر لیتر)، سولفات و نیترات نیکل (10، 30 و 50 میلی گرم بر لیتر) بود. برای شاهد از آب مقطر استفاده شد. بعد از این دوره محلول پالس با 500 میلی لیتر محلول 3% ساکارز به علاوه 200 میلی گرم در لیتر 8-هیدروکسی کینولین سولفات جایگزین گردید. عمر گلجایی، کاهش وزن تر، درصد وزن خشک، جذب آب، شمارش باکتری های ته ساقه و محلول نگه دارنده، ، کاهش درجه بریکس و قطر گل ها، پروتئین و کارتنوئید گلبرگ ها و فعالیت آنزیم های سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز اندازه گیری شد. نتایج نشان می دهد که نیترات نیکل سبب ایجاد بیشترین میزان از عمر گلجایی (11 روز)، پروتئین ( 14%)، فعالیت سوپر اکسید دسموتاز (21/135میکرومول بر گرم ‎وزن تر) و پراکسیداز (3/6میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) گردید. سولفات و نیترات نیکل به ویژه در غلظت‌های 30 و 50 میلی‌گرم بر لیتر اثرات مفید مشابه بر عمر پس از برداشت گل‌ها داشتند. بنابراین نیکل این پتانسیل را دارد که به عنوان یک عامل نگهدارنده عمر پس از برداشت عمل کند. مطالعات بیشتر می‌تواند به روشن‌تر شدن جنبه‌های مختلف این تأثیر کمک کند.
واژگان کلیدی: عمرگلجایی، ژریرا، نیکل، سولفات نیکل، نیترات نیکل (II)

فصل اول
کلیات

1-1- مقدمهژربرا (Gerbera jamesonii) از خانواده آستراسه یکی از معروف‌ترین گلهای شاخه بریده، در جهان محسوب می‌شود. ژربرا اولین بار توسط گیاه شناسی به نام روبرت جیمسن در سال 1884 در آفریقای جنوبی کشف گردید. جنس ژربرا در حدود 30 گونه وحشی دارد که در مناطق آفریقا، آمریکای جنوبی و قسمت‌های گرمسیری آسیا گسترده اند (بنایی و همکاران،2013). به طور کلی ژربرا گیاهی است حساس به سرما با ریشه هایی عمیق که چند ساله محسوب می‌شود. گل آذین ژربرا از سه نوع گلچه، گلچه‌های شعاعی (در قسمتهای حاشیهای گل)، گلچههای موجود در قسمت صفحه مرکزی و گلچههای حد واسط تشکیل شده است. این گلچه‌ها به صورت شعاعی و فشرده کنار یکدیگر قرار گرفتهاند (شکل1-1). امروزه بیشتر ارقام تجاری ژربرا از تلاقی مصنوعی گونه‌های G.jamesonii و G.viridifiolia بدست آمده‌اند که هر دوگونه بومی آفریقای جنوبی می باشند. شهرت این گل به علت تنوع رنگ گلبرگ‌هایش و اندازه بزرگ گل‌هایش (در واقع گل آذین) می‌باشد. در صنعت گل‌کاری به صورت تک‌شاخه بریده و یا به صورت دسته گل و هم به صورت گل خشک کاربرد و طرفدار دارد (نایر و همکاران 2003). بیشتر برنامه‌های بهنژادی این گل در کشور هلند انجام می‌شود (برمر، 1994).
1086817671167گل ژربرا در رنگ‌های مختلف; زرد، صورتی، نارنجی، قرمز، سفید، کرم و بنفش یافت میشود. قطر گل‌ها 5 تا 12 سانتی متر و طول ساقه حدود 25 تا 60 سانتی متر و دارای انواع کم پَر و پُر پَراست(کافی و قهساره، 1390).
شکل 1-1- گل ژربرا

1-1-1-تاریخچه ژربرازیستگاه گونههای مهم این گل محدود به قسمت‌های شرقی آمپومالانگا و بخش‌های ایالت لیمپوپو در آفریقای جنوبی است. ژربرا در سال 1878 نزدیک منطقه باربرتون کشف شد و به همین دلیل در زبان انگلیسی به آن مینای باربرتون یا مینای ترانسوال می گویند. روبرت جیمسون این گیاه را به باغ گیاه شناسی کمبریج در انگلستان فرستاد و فردی به نام لینچ آن را کشت کرد. بر اساس گزارشات موجود این گیاه ابتدا در باغ نورویچ و سپس در باغ کیو توسط آقای تیلت به گل نشست اما اولین کسی که در اروپا موفق به دورگه‌گیری این گیاه شد، لینچ بود او این گیاه را با; Gerbera virdifolia تلاقی داد در نتیجه این تلاقی اولین ژربرا فلوریست خلق شد، این ژربرا Gerbera cantabrigiensis نام گذاری شد، لینچ واریته Brilliant را از تلاقی Natal معروف به Sir Michael Forster و Gerbera jamesonii تولید کرد، البته دو رگه‌گیری این گونه تاریخچه ای طولانی دارد با این حال به دلیل ویژگی‌های هتروزیگوتی بالا هنوز بذرهای تثبیت شده‌ای از این گیاه به دست نیامده است. لینچ، آدنت و ویل مورین هریک به طور جداگانه توانستند تغییراتی در رنگ گلهای Gerbera jamesonii که به طور وحشی می‌رویید، ایجاد کند. طبق گزارشات هیبرید های رنگی اصلاح شده توسط لینچ نسبت به واریته های فرانسوی اصلاح شده توسط آدنت بذرهای بیشتری تولید می کرد. این دو محقق در سال 1891 اولین گواهی بذر پایه را از انجمن باغبانی سلطنتی انگلستان دریافت کرداند و در سال 1904 نمونه ای از واریته‌های تولیدی را در لندن عرضه نمودند. آدنت در ریویرای فرانسه تعداد زیادی رقم به دست آورد و لینچ نیز بذرها و گیاهان خود را با وی مبادله کرد قبل از این رویداد آدنت تقریبا کارهای اصلاحی خود را با Gerbera jamesonii آغاز کرده بود و گیاهانی به رنگ قرمز کم رنگ در آفریقا تولید کرده بود وی به نتایج تلاش‌های خود اطمینان داشت و کارهای اصلاحی خود را در ریویرا مشابه باربرتون زیستگاه ژربرا ادامه داد. دییم آلمانی به همراه آدنت عهده‌دار کارهای دو رگه‌گیری شد که موفقیت آمیز بود، تا سال 1909 تلاقی های اصلاحی توسط آدنت با بیش از 3000 بار گرده افشانی هیبریدهای انگلیسی و تلاقی با گونههای آفریقایی اصلاح شده انجام شد. این ادعا با معرفی گیاهان والد و ویژگی‌های آن‌ها قابل استناد است به این ترتیب تا بهار سال 1909 تحت شرایط سخت گزینش کشت 25000 هیبرید انتخاب شده بود، در این زمان آدنت امیدوار بود حداقل پس از چند نسل بذرهای پایداری تولید شود وی در همان زمان تاکید کرد که گیاهان به طور قابل ملاحظه‌ای از نظر رنگ و شکل متنوع هستند این ویژگی امروزه کاملا مستدل شده است، بنابراین به طور قابل توجهی مانع از تولید ژربرا از طریق کشت بذر می‌شود.
در سال 1909 والتر در نشریه جدیدترین ارقام آدنت را به صورت گلهایی با اختلاف بسیار زیاد در رنگ به قطر 13 سانتی متر و طول ساقه‌هایی به اندازه 50 تا 60 سانتی متر با ماندگاری شش تا هشت روز معرفی می‌کنند، طبق گزارشات دییم عملکرد قلمه بین 36 و 60 گل در گیاه با قابلیت نگه‌داری تقریبا دو هفته ارزیابی شده است. در سال 1906 برای اولین ژربرا به خودی خود از طریق جوانه زنی بذر تکثیر شد. جینک در سال 1897 فرصتی برای ازدیاد و اصلاح ژربرا در نیویورک یافت. در پاییز 1908 رقمی به نام Gigantea به بازار معرفی شد، این گل قطری به اندازه 12 سانتی متر به رنگ سرخ و ساقه‌هایی به طول یک متر داشت تناوب گلدهی در این رقم بسیار زیاد بود و برای اولین بار در سال 1909 موفق به دریافت گواهی بذر پایه شد در این دوره زمانی ژربرا همواره به دلیل دریافت جوایز ارزشمند ملی و بین المللی توسط انجمن‌های باغبانی برای مثال در سال 1904 در شهر دوسلدرف آلمان در همان سال و 1907 در لندن، 1909 در برلین و پاریس بسیار مورد توجه قرار گرفت بیشترین جوایز در تاریخ صنعت گل کاری به اصلاح این گل اختصاص داشته است (هانسن، 1999).
1-2- تکثیر
طریقه تکثیر گل ژربرا عمدتا به سه روش انجام می‌شود: تکثیر بوسیله بذر، تقسیم بوته و کشت بافت. تقسیم بوته در اواخر بهار یا پاییز صورت می‌گیرد. نکته مهم این است که قسمت مریستمی روی خاک قرار گیرد و زیر خاک مدفون نشود. افزایش با بذر هم امکان‌پذیر است. بذرها باید تازه باشند زیرا زیوایی بذرهای مانده کاهش می‌یابد. از آنجا که ژربرا بومی مناطق گرمسیری است و حساس به سرما، بذرها برای تندش نیاز به دمای حداقل 15 درجه سانتیگراد دارند. بذرها در طی دو هفته تندش می یابند. مشکل افزایش بذری تفرقه صفات و عدم یکنواختی گل‌های تولیدی است. امروزه یکی از پرکاربردترین روش‌های افزایش ژربرا از طریق کشت بافت است (راویانت، 2009). مشاهده شده که کاشت ژربرا از اواخر اردیبهشت تا اواخر تیر ماه، گل بریدهی زیادی تولید میکند اما محصول زمستانه خوبی میتواند از طریق کاشت از مهر تا اسفند در شرایط حفاظت شده حاصل شود. برای ارقام گل درشت تراکم کاشت بهینه هشت تا ده گیاه در مترمربع است. این تراکم، نور کافی را برای گیاهان فراهم میکند. اما کاشت متراکمتر بعد از دو سال باعث کاهش عملکرد، کاهش اندازه گل و طول ساقهی گل میشود. در زمان کاشت طوقه گیاه باید در سطح خاک و کمی بالای آن قرار گیرد چون ژربرا به مقدار زیادی در سطح خاک منشعب میشود. کاشت خیلی عمیق باعث بیماری قارچی و کاشت سطحی باعث سست شدن سیستم ریشهای میشود (رشیدی، 1389).
گلدهی گیاهچههای کشت بافتی 11 تا 16 هفته بعد از انتقال آن‌ها صورت می گیرد. اولین جوانه‌های گل هنگامی که 14- 10 برگ تشکیل شدند نمایان می‌شوند. القا و تمایزیابی گلها به میزان زیادی توسط شدت نور و دما تاثیر می‌پذیرند. تقریبا در تمام طول سال گل می دهند اما روز کوتاه طبفه بندی می‌شوند. دوره گلدهی این گیاه اواخر بهار تا اواخر پاییز و اوایل زمستان است (بروهولم و همکاران ، 2008).
1-3- عملکردمیانگین متوسط تولید در حدود 160- 130 گل به ازای هر متر مربع در سال است (شرایط سایه). در گلخانه تا 200 شاخه گل هم می‌توان تولید نمود اگر همه شرایط بهینه باشد. از هر بوته می‌توان 15- 10 شاخه گل در سال برداشت کرد (راویانات، 2009).1-4- نابسامانی های فیزیولوژیک1-4-1- خمیدگی و شکستن ساقه گل این نابسامانی نتیجه رشد و بلوغ ناکافی ساقه گل می‌باشد که نهایتاً سبب افتادن ساقه می‌شود. دلایل مختلفی می‌تواند سبب بروز این حالت گردد از جمله کمبود عناصر غذایی و نسبت نامناسب آن‌ها از جمله کلسیم گاهی اوقات کاهش آبیاری و تنش خشکی یا افزایش دما به ویژه با تابش آفتاب ممکن است سبب پژمردگی و شکستن ساقه شود. آبیاری بهینه، توجه به نیازهای تغذیه‌ای گل‌ها و دمای مناسب پرورش می‌تواند سبب بهبود این حالت و جلوگیری از آن گردد.
1-4-2- پژمردگی گل نابالغپژمردگی قبل از بلوغ گل در حالیکه شاخه هنوز به گیاه متصل است و اغلب درست زمانیکه بهطور کامل توسعه یافته است، اتفاق میافتد. دلیل این مشکل احتمالا، نبود کربوهیدراتهای لازم برای دستیابی به نمو سریع گل است. این عارضه اغلب پس از یک دوره از روزهای ابری با شدت پایین نور یک روز آفتابی اتفاق میافتد. در صورت امکان باید ارقام مقاوم به این عارضه غربالگری و کشت شود (هنسان، 1985).

1-5- آفات و بیماری‌ها لارو برخی حشرات که از برگ تازه تغذیه می‌کنند، کنه (Cyclamen mite و Spider mite)، حلزون و لیسه، تریپس و شته‌ها از جمله آفات این گیاه می باشند. بیماری‌های قارچی متداول مانند: بوتریتیس، سفیدک پودری، فایتوفتورا و ریزوکتونیا هم از جمله بیماری‌های مرسوم و تهدید کننده می‌باشند (رشیدی، 1389).1-6- بیان مسالهگل‌های شاخه بریده سهم مهمی از صنعت تولید و پرورش گل‌ها و گیاهان زینتی را تشکیل می‌دهند. آنچه در رابطه با این قسمت از صنعت گل‌کاری بسیار اهمیت دارد عمر گلجایی (Vase-life) است. هر چه این ویژگی طولانی تر باشد احتمال سود دهی تولید و پرورش آن گل بیشتر می‌شود. عمر گلجایی به عوامل متعددی در طول دوره کاشت، داشت و برداشت وابسته است. اما از دیدگاه پس از برداشت، در صورت بهینه بودن شرایط تولید و همچنین تأمین دما و رطوبت مناسب برای نگهداری گل‌های شاخه بریده عمر گلجایی آن‌ها به چند عامل از جمله وجود منابع در دسترس کربوهیدرات به میزان کافی، گاز اتیلن و جمعیت باکتریایی موجود در محلول نگهداری گل‌ها بستگی دارد (رید و جیانگ، 2012). اگرچه تمام گونه‌ها به صورت یکسان تحت تاثیر این عوامل قرار نمی‌گیرند اما تمامی آن‌ها از نقطه نظر پس از برداشت مهم اند. منابع کربوهیدرات از این نظر که منبع تامین انرژی گیاه اند چون گل‌های شاخه بریده، از گیاه مادری تامین کننده جدا شده اند، گاز اتیلن از این دیدگاه که محرک و تسریع‌کننده فرآیند پیری است اگرچه ژربرا حساسیت زیادی به آن ندارد و جمعیت باکتری‌های موجود در محلول نگهدارنده و ته ساقه گل‌ها، به این خاطر که می توانند سبب گرفتگی آوندها و مرگ زودرس سلول‌های گیاهی شوند (گوپینادهان و همکاران، 2008). از طرف دیگر عنصر نیکل اثر بازدارنده بر متابولیسم کربو هیدرات‌ها، ترکیبات نیتروژن‌دار، گاز اتیلن و پاتوژن‌ها دارد (وود و ریلی، 2007).
هدف از انجام این پژوهش این بود که اثر نمک‌های مختلف نیکل بر عمر گلجایی و شاخص‌های پس از برداشت گل‌های شاخه بریده ژربرا بررسی شود و بهترین نمک با بالاترین اثر تعیین گردد.
فصل دوم
بررسی منابع

2-1- استانداردها و عوامل موثر بر عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریدهپس از برداشت گل‌های شاخه بریده آنچه اهمیت حیاتی دارد حفظ کیفیت گل میباشد. برای عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده استانداردهایی موجود است که بین نقاط مختلف دنیا مثلا در آسیا یا در اروپا متفاوت است. به هر حال، رنگ، اندازه، عطر و ظاهر گلهای شاخه بریده این استانداردها را می‌سازند که آنها هم به شرایط کشت، زمان مناسب برداشت، شرایط حمل و نقل و نگهداری پس از برداشت وابستهاند. جذب آب به میزان مناسب توسط گل شاخه بریده، تبخیر و تعرق، هدایت هیدرولیکی در آوندها همگی بر عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریده موثراند. (سیلوا، 2003).
2-1-1- متابولیسم و مسیرهای متابولیکیمتابولیسم سلولی، مجموعه واکنشها و فعالیتهای شیمیایی است که در درون سلولها رخ میدهد جذب کربن و ذخیره انرژی (فتوسنتز) و استفاده از این انرژی ذخیره شده و سوختن آن (تنفس) دو فرآیند مرکزی هستند که به طور کلی در گیاهان متابولیسم را کنترل می‌کنند (سیلوا، 2003).
پیری و ریزش
(PCD)مرگ برنامه‌ریزی شده سلول
آغازش
مرگ
رشد
بلوغ
بلوغ فیزیولوژیکی
رسیدن
تخریب غشاء
نکروزه شدن وعلایم قابل مشاهده
(پژمردگی و چروکیدگی)
آسیب سرمازدگی
1)برفرایندهای متابولیک(تنفس، سنتز پروتئینها و ...
2)نشت یونها از طریق غشاء
3)جاری شدن پروتوپلاسم
تغییرات فیزیکی در لیپیدهای غشاء
تجزیه آنزیمها و پروتئینها
اثرات
پیامدها

شکل 1-1-2- روند رشد و اثرات بروز پیری در مراحل نموگل

2-1-2- پیری، ریزش و مرگ سلولیپیری و مرگ دو فرآیند مهم در چرخه زندگی یک موجود زنده محسوب می‌شوند؛ فرآیندهایی که در طی آن مواد و ساختارهای سلولی می‌شکنند و از درون بافت در حال پیری خارج و متابولیزه می‌شوند. پیری ارگآن‌هایی مثل برگ با مرگ برنامه ریزی شده سلولی متفاوت است. سلولها در ارگانهای پیر شونده یک سری تغییرات تدریجی منظم و فروپوشاننده را تجربه می‌کنند هستهها حداقل تا آخرین مراحل تغییرات ساختاری نشان نمی‌دهند (نودن، 1997). پیری کل گیاهی، پیچیدهترین نوع پیری است که اغلب به وسیله ساختارهای زایشی القا می‌شوند. هورمون‌ها به ویژه سایتوکنین در کنترل این نوع پیری بسیار موثراند. جبرلین کنترل کننده پیری در نوک مریستم است در حالی که اتیلن باعث پیری برگ و گلبرگ‌ها می‌شوند و نهایتا سبب خشک شدن گلبرگ‌ها، ریزش گلچهها، پژمردگی و تغییرات رنگ می‌شوند (دیویس،2002).
2-1-3- پیری گلبرگهادر گلبرگ، گلهای شاخه بریده که در حال پیر شدن هستند میزان پروتئین کاهش می یابد، فعالیت آنزیم شکننده پروتئین ها یعنی پروتئاز افزایش می یابد، سیالیت غشا تغییر پیدا می کند و شدت تنفس افزایش می‌یابد (ون دورن و استید، 1997). پیری گلبرگها همراه با کاهش کیفیت مرفولوژیک، بیوشیمیایی و بیوفیزیولوژیک است. گلهای میخک در حال پیری، یک افزایش فراز گرا در تولید اتیلن نشان می دهد و قرار دادن آنها در برابر اتیلن سبب پیچیده شدن گلبرگ‌ها، آغاز افزایش سنتز اتیلن و تغییرات فیزیکی و شیمیایی در چربیهای غشای سلولی گلبرگها می‌شود (بارتولی و همکاران، 1996). داوودی یک گونه نافرازگرا است، اتیلن نقش پر رنگی در پیری گل ندارد و سبب تغییرات جزیی در غلظت پروتئین و نسبت پلی پپتیدهای غالب می‌گردد، همین موضوع علت عمر پس از برداشت طولانی داوودی می‌باشد. واکنش گل ژربرا نیز مشابه داوودی است و اتیلن تاثیر شگرفی بر پیری آن ندارد. شرایطی که سبب جلوگیری از عمل اتیلن (مثلا: کاربرد نمک‌های نقره، بنزئات سدیم، اسید بوریک) و یا سنتز آن مثلا آمینوکسی استیک اسید (AoA) و نمک‌های نیکل گردد می تواند به طور بالقوه سبب افزایش عمر پس از برداشت گل‌های شاخه بریده و به ویژه گونههای فراز گرا گردد (سیلوا، 2003).
2-1-4- آب و نقش آن در عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریدهکیفیت آب، برای نگهداری گلهای شاخه بریده بسیار اهمیت دارد. تأمین دایمی آب، که در زمان برداشت گل منقطع می‌شود، برای نمو فیزیکی گل شاخه بریده موثر است. بخشی از نمو فیزیکی، به وسیله فشار تورژسانس مثبت میسر می گردد که سبب انبساط سلول و پشتیبانی آن‌ها می‌شود. پتانسیل آب از فشار تورژسانس و پتانسیل اسمزی تشکیل می‌شود. در گیاهان در شرایط عادی (در حال رشد روی ریشه‌های خود) آب موجود در آوند چوبی تحت تنش است به علت کشش حاصل از تبخیر و تعرق که آن هم حاصل افزایش دما و کاهش رطوبت نسبی می‌باشد. آب از آوند چوبی در اثر شیب اسمزی به درون سلول‌ها وارد می‌شود. اگر پتانسیل آب سلول از پتانسیل آب سلول‌های مجاور کمتر باشد از این سلول‌ها آب بیرون کشیده می‌شود که نتیجه آن چروکیدن و جمع شدن سلول است (سیلوا، 2003). در سطح مولکولی/ بیوشیمیایی پروتئین‌های آکواپورین که سبب جریان دو طرفه آب در غشای سلول بافت‌ها و حتی ارگان‌ها می‌شوند در عمر پس از برداشت گلها موثراند (تایرمن، 1999). آب تمیز و خالص از پیش نیازهای عمر پس از برداشت بهینه گلهای شاخه بریده است. کاهش کیفیت و عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده ممکن است به وسیله انسداد آوندهای چوبی رخ دهد. از دلایل آن موارد زیر می‌باشد: رشد میکروبی، رسوب موادی مثل ترکیبات موسیلاژی در حفرات دستجات آوند چوبی، ایجاد تیلوز (ساختاری شبیه بالون که به وسیله رشد سلول‌ها در مکانهای ارتباط سلول‌های آوندی ایجاد می‌شوند)، وجود حباب هوا درون سیستم آوندی، پاسخ‌های فیزیولوژیک ساقه به برش و مرگ برنامه‌ریزی شده سلول (ون دورن و کروز،2000).

2-1-5- میکرو ارگانیسم ها در محلول نگهداری گلها
آب خالصی که در گلدان نگهداری وجود دارد بعد از مدتی به وسیله باکتری‌ها یا قارچ‌ها که روی بافت گیاهی وجود دارد و تکثیر می‌شوند، آلوده می‌گردد. ارگانیسم‌ها سبب تولید یا القای ترکیباتی مثل تانن‌ها در آوندها می‌شود که همین موضوع سبب انسداد آوندی می گردد. برای جلوگیری از چنین پدیده‌ای، در پژوهشهای مختلف مواد متفاوتی آزمایش شدهاست. از جمله مواد تست شده که سبب بهبود عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده از جمله ژربرا میشوند شامل: تیوسولفات نقره، دیکلروفن، ترکیبات آمونیوم چهارظرفیتی، 8- هیدروکسی کینولین سیترات و ترکیبات کلاته کننده می‌باشد (ایشیمورا، 1999).
لیو و همکاران (2000) نشان دادند که کاربرد 2/0 میلی مولار از تیو سولفات نقره STS)) برای دو ساعت در حدود ده روز طول عمر گلهای شاخه بریده رز را افزایش داد. محمودی و همکاران (2012) نشان دادند که کاربرد کلرید کبالت در غلظت‌های 200، 300 و 400 میلی گرم بر لیتر می‌تواند سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای مریم شود آن‌ها نتیجه گرفتند که کاربرد کلرید کبالت در غلظت 300 میلی گرم بالاترین اثر را بر افزایش عمر پس از برداشت گلها، جذب آب و کاهش وزن تر داشت. منشی‌زاده و همکاران (2011) گزارش کرده‌اند که کلرید کبالت می‌تواند سبب کاهش زردی گلچههای گل مریم و پژمردگی آنها شود.
کاربرد نمک سیلیسیم (K2SiO3) با غلظت‌های 100، 150 و 200 میلی گرم بر لیتر سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده میخک گردید (جمالی و راحمی،2011 ). یکی از دلایل، شاید افزایش مقاومت غشای سلولی به وسیله ته نشین شدن سیلیسیم در آن باشد. این عنصر این توانایی را دارد که با ترکیبات آلی درون دیواره سلولی کمپلکس تشکیل بدهد و به این وسیله غشای سلولی در برابر آنزیم های تخریب کننده مقاومت بیشتری می‌یابند (سیندر و همکاران، 2007). کتسا و همکاران (1994) گزارش کردند که استفاده از نیترات نقره درمحلول نگه دارنده گل شاخه بریدهارکیده بهعنوان عامل ضد میکرب عمل میکند. اضافه نمودن نیترات کلسیم به محلولهای محافظ طول عمر دو رقم رز را یک تا سه روز افزایش داده و شکوفایی غنچهها را بهبود بخشید. همچنین محلول های حاوی دو میلی مول در لیتر کلسیم از هر دو منبع کلرید کلسیم و نیترات کلسیم باعث افزایش ماندگاری رز رقم ایلوانا گردید (ادریسی،1387). مقایسه اثر نمک های معدنی مختلف نشان داد که ترکیبات مس بویژه نیترات مس بیشترین تاثیر را روی کیفیت وماندگاری میخک دارد (ادریسی، 1384). استفاده از تیمارهای موقت سولفات مس، هیدروکسی کینولین سولفات و کلرید کبالت بیشترین تاثیر را بر کیفیت گل شاخه بریده میخک داشتند و تیمار کلرید کبالت بیشترین طول عمر را نیز به دنبال داشت (ادریسی و همکاران، 1382). کاظمی و همکاران (2012) تاثیر سیلیکون و نیکل و استیل استیک را بر عمرگلجایی رز بررسی کردند و نتیجه گرفتند که بر افزایش طول عمر گل شاخه بریده تاثیر مثبت دارد و باعث افزایش طول عمر می‌شود. مورالی و ردی، (1992) نشان دادند که کاربرد عناصر کبالت، کلسیم، روی و نیکل به همراه محلول ساکاروز دار سبب افزایش عمر پس از برداشت گلهای شاخه بریده گلایول می‌گردد. تیمار کوتاه مدت جیبرلیک اسید با غلظت 50 میلیگرم بر لیتر به همراه محلول نگهدارنده اتانول 5/2 درصد و ساکارز سه درصد بیشترین تأثیر را بر خصوصیات کیفی و دوام عمر گل ژربرا داشت. همچنین، کاربرد مکرر اتانول نسبت به کاربرد اتانول فقط در ابتدای آزمایش، نتایج بهتری را درخصوص افزایش دوام عمر و خصوصیات کیفی گل ژربرا به همراه داشت (دانایی و همکاران، 1390). گلهای شاخه بریده مریم که در محلول ساکارز و کلرید نیکل قرار گرفته بودند عمر پس از برداشت طولانی تری نسبت به نمونه های کنترل داشتند (ردی و همکاران، 1997(.
2-2- نیکلحدود ششصد میلیون سال پیش، عناصر اصلی تشکیل‌دهنده اتمسفر کره زمین گازهای احیا کننده مانند هیدروژن، آمونیاک و متان بود. در این دوره، نیکل نقش مهمی در سوخت و ساز و موفقیت پروکاریوت‌های اولیه داشته است اما شرایط به آرامی به سمت ایجاد یک اتمسفر اکسنده تغییر یافت. این تغییر باعث جایگزین شدن عناصر روی، آهن، منگنز و مس به جای نیکل، وانادیوم و تیتانیوم گردید (وود و رایلی، 2007). در سال‌های اولیه قرن بیستم، نیکل به صورت جزئی از خاکستر گیاهی کشف گردید و شک و تردیدها در رابطه با این موضوع که نیکل نقشی در فرآیندهای متابولیکی گیاه دارد، به طور دائم وجود داشته است (بایی و همکاران، 2006). بین عناصر ضروری برای گیاهان، منحصر به فرد است به این دلیل که نقش‌های متابولیکی آن مدتی قبل از اثبات ضروری بودن این عنصر برای گیاهان مشخص شد (براون، 2007). احتمال ضروری بودن نیکل برای رشد گیاه زمانی مشخص گردید که در سال ١٩٧۵ پژوهشگران متوجه شدند که اوره آز، آنزیمی که به صورت عمومی درون گیاهان وجود دارد، برای فعال شدن نیازمند عنصر نیکل است. در واقع نیکل جزئی از آنزیم اوره آز است. به زودی مشخص شد که نیکل، برای حبوبات ضروری است (اسکیو و همکاران، 1984) و سپس برای برخی از غلات مناطق معتدله نیز ضروری بودن نیکل به اثبات رسید (براون و همکاران ، 1990). ضروریت این عنصر برای گیاهان عالی به وسیله براون و همکاران (1987) پیشنهاد شد. امروزه این عنصر به عنوان یکی از عناصر ضروری برای زندگی گیاهان شناخته می‌شود (مارشنر، 1999 ؛ سیرکو وبردزیک، 2000 ؛ گرداس و همکاران، 1999).
2-2-1- نقش نیکل در متابولیسم گیاه
در گذشته اوره آز تنها آنزیمی بود که برای نیکل، درون گیاه نقش یک عنصر "ضروری" را توجیه می‌کرد در حال حاضر هفت آنزیم نیکل‌دار مشخص شده است که دو عدد از این آنزیم‌ها (اوره آز و گلوسیلاز) فعالیت اکسایش/ احیا ندارند و پنج آنزیم دیگر در واکنش‌های اکسایش/احیا دخالت دارند شامل: متیل کوانزیم، ام ردوکتاز، نیکل سوپر اکسید دسموتاز، کربن مونو اکسید دهیدروژن، استیل کوانزیم آ سنتازو هیدروژناز (براون، 2007). این پیشنهاد که آنزیم‌های دیگری که حاوی نیکل هستند یا پروتئین‌های نیکل‌دار، درون گیاهان عالی وجود دارد با توجه به مشاهداتی بیان شده است که برخی از آنزیم‌های باکتریایی مشابه‌های موازی در گیاهان و حیوانات دارند، اما بر عکس علم آنزیم‌شناسی در باکتری‌ها، این شاخه علمی درون گیاهان هنوز در مراحل ابتدایی به سر می‌برد، پس به احتمال زیاد در آینده نزدیک آنزیم‌های دیگری درون گیاهان عالی کشف می‌شود که حاوی نیکل‌اند یا دست کم به نیکل نیازمند هستند.
2-2-1-1- یوروید
گیاهان عالی قسمت قابل توجهی از ترکیبات نیتروژن‌دار خود را به صورت یوروید یا آمید نقل و انتقال می‌دهند (شوبرت و بولوند، 1990). داده‌ها نشان می‌دهد که گونه‌های انتقال دهنده یوروید مانند گردوی آمریکایی نسبت به آنهایی که ترکیبات آمید انتقال می‌دهند نیاز به نیکل بالاتری دارند (وود ، 2006)، بنابراین این احتمال افزایش می‌یابد که گونه‌های انتقال دهنده یوروید ممکن است آنزیم‌های دیگری داشته باشند که نیازمند حضور نیکل باشد. حبوبات نواحی گرمسیری مانند سویا و همچنین گیاهانی مثل گردوی آمریکایی از جمله گیاهان انتقال دهنده یوروید هستند. اگرچه، اطلاعات چندانی در مورد کاتابولیسم و آنابولیسم یوروید درون گیاه موجود نیست (بایی و همکاران، 2006).
به نظر می‌رسد که متابولیسم یوروید در درجه اول درون تاج گیاه و میوه‌ها رخ می‌دهد (پیت و آتکینسن،1983). نتیجه نهایی کاتابولیسم یوروید تشکیل اوره و گلی اکسالیت است. پس با توجه به تولید این دو ماده، به نظر می‌رسد که حضور نیکل روی دسترسی گیاه به منابع نیتروژن ذخیره خود اثر گذار و حیاتی است. به طور کلی مسیر یوروید مهمترین مسیر برای حرکت نیتروژن از ریشه‌ها به نقاط رشد گیاه است پس نیکل برای تبدیل شکل ذخیره شده نیتروژن در دوران قبل از خفتگی ضروری است (بایی و همکاران ، 2006). مثال‌هایی از چندین جنس انتقال‌‌دهنده یورید: افرا ، توس، ممرز، گردوی امریکایی، ارغوان، چنار و بید.
2-2-2- افزایش شاخص‌های رشدپژوهش‌های ابتدایی برای مشخص کردن پاسخ‌های رشدی در گندم، سیب‌زمینی و باقلا با محلول پاشی برگی نیکل انجام گرفت که این تیمار اثرهای مثبت و افزایش‌دهنده‌ای بر فرآیندهای کلی رشد داشت (ولچ،1981 ؛ دوبرولیوبسکیو اسلاو ، 1957 ؛ روچ و بارکلی، 1946). بعد از کشف نیکل به عنوان جزئی از آنزیم اوره آز پژوهش‌های زیادی انجام شد که نشان‌دهنده نقش مثبت کاربرد نیکل بر رشد گیاه، افزایش سلامت غذایی، تندش بذر و عملکرد نهایی بوده است. موردی و آلی، (1999) در پژوهش خود نشان دادند که افزودن ٢۵ و ۵٠ میلی‌گرم نیکل به هر کیلوگرم خاک رس به صورت معناداری سبب افزایش عملکرد سبزی جعفری و کیفیت آن (سطح برگ٬ غلظت عناصر معدنی، عملکرد روغن و مزه) گردید و همچنین برگ‌ها برای مصرف توسط انسان سالم‌ترند زیرا غلظت نیترات و آمونیوم کمتری دارند. نیکل می‌تواند باعث افزایش عملکرد میوه و کیفیت آنها در گوجه فرنگی گردد (اوزو و همکاران ، 1999 ؛ پالاکویز و همکاران 1999، راو و شانتارون، 2000) نیکل اثر مثبتی بر افزایش وزن خشک گیاه گوجه فرنگی و غلظت آهن، روی و منگنز دارد.
گاد و همکاران (2007) نشان دادند که ٣٠ میلی‌گرم نیکل به ازای هر کیلوگرم خاک باعث افزایش عملکرد گوجه فرنگی می‌گردد، همچنین کیفیت ظاهری، در صد مواد جامد محلول و پارامترهای فیزیکی (طول، قطر،وزن، وزن خشک) را بهبود بخشید افزون بر این میوه‌ها میزان نیترات کمتری داشتند که باعث سلامت بیشتر میوه‌ها می‌گردد. شواهد موجود نشانگر اثر مثبت نیکل روی تندش بذرهاست؛ اندروود (1971) نشان داد که خیساندن بذرها پیش از کشت در محلول سولفات نیکل اثر معناداری بر افزایش تندش بذرهای نخود، لوبیا، گندم و کرچک دارد. ولف و برتراند (1973) نشان دادند که سولفات نیکل، اثرات مفیدی بر تندش بذر لوپن سفید دارد. غلظت‌های پایین نیکل می‌تواند تندش بذر ارقام جنس ارغوان را تحریک کنند و روی رشد دانهال حاصل از آن اثر مثبت دارد (سین، 1984). براون و همکاران، (1987) نشان دادند که بذرهای جو که در آنها نیکل حذف شده بود توانایی تندش را حتی در حضور منبع نیتروژنی به غیر از اوره نداشتند. تندش بذرهای تیموتی به وسیله غلظت‌های پایین نیترات نیکل تحریک می‌گردد (ویر، 1998). گزارش شده است که برگ گیاهان جنس آلیسوم که انباشتگر نیکل هستند هنگامی که خزان می‌کنند و می‌ریزند مانع از رشد گیاهان رقابت کننده می‌گردند (لان‌ژان و همکاران، 2007). مشاهده شده است که ٢ میلی‌گرم بر لیتراز نیترات نیکل یا سولفید نیکل باعث سرعت بخشیدن به تندش بذرهای گندم گردیده است (سنگار و همکاران، 2008).

2-2-3-تاثیر نیکل بر عمر پس از برداشتیون‌های نیکل اثر ممانعت کنندگی بر 1- آمینو سیکلوپروپان-1-کربوکسیلیک اسیداکسیداز (آ- سی-سی اکسیداز) دارد به این صورت که Ni2+ یک کمپلکس فلز- آنزیم می‌سازد (اسمیت و وودبرن، 1984). در یک مطالعه دیگر، محلول یک دهم درصد وزن در حجم از کلرید نیکل روی کاسه گل خرمالو رقم ‘Saijo’ دو مرتبه قبل از برداشت، محلول پاشی گردید. تیمار نیکل به گونه‌ای موثر جلوی نرم شدن میوه را گرفت و عمر انباری آن را افزایش داد که علت آن جلوگیری از تجمع ACC و تشکیل اتیلن بود (ژن و همکاران، 2006). اثر محدودکننده‌ای که نیکل بر تولید اتیلن درون گیاهان دارد، از این عنصر انتخابی مناسب برای بهبود عمر پس از برداشت محصولات باغبانی می‌سازد به ویژه در گل‌های بریدنی، که بدون نگرانی از تجمع این عنصر در غلظت‌های سمی می‌توان آن را به کار برد.
تیمار گل‌های میخک سولفات نیکل با غلظت 45 میلی گرم بر لیتر، توانست به گونه ای معنادار سبب بهبود عمر پس از برداشت آن‌ها در مقایسه با نمونه های شاهدگردید. بررسی ها نشان دادند که این گل‌ها به گونه ای معنادار اتیلن کمتری تولید کرده بودند و همین موضوع سبب بهبود عمر پس از برداشت آن‌ها گردید (جمالی و راحمی، 2011). همچنین کاظمی وعامری، (2012) گزارش کردند که کاربرد عنصر نیکل بر روی گلهای سوسن، سبب بهبود عمر پس از برداشت و شاخص‌هایی مثل نشت آنتوسیانین در آن‌ها گردید. از طرف دیگر عنصر نیکل اثر ممانعت کنندگی بر رشد پاتوژن ها دارد (کار و میشرا، 1974؛ گراهام و همکاران، 1985). پس به طور کلی نیکل با تاثیر گذاری بر عوامل مهمی مثل غلظت کربوهیدرات‌ها، تولید اتیلن و جمعیت پاتولوژی می تواند سبب بهبود عمر پس از برداشت گل‌ها شود.
2-2-4- علائم کمبود عنصرنیکل در گیاهان
بر اساس گونه، نیاز گیاه به نیکل جهت تکمیل چرخه رشد طبیعی در خاک‌های بدون آلودگی در حدود ٠۵/٠ تا ۵ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک گیاهی متغییر است (براون، 2007)، اما گیاهان انتقال دهنده یوروید نیاز بالاتری دارند تا حد ۵٠ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک (بایی و همکاران، 2006). در کمتر از این غلظت‌ها، نکروزه شدن نوک برگ‌ها به ویژه در خانواده لوبیا ممکن است رخ بدهد علت آن هم کاهش فعالیت آنزیم اوره آز و تجمع اوره در سطوح سمی در داخل گیاه است (اسکیو و همکاران، 1984). در برخی موارد، علائم کمبود می‌تواند شامل کاهش رشد ریشه و شاخساره باشد. کمبود نیکل می‌تواند باعث القای بیماری (گوش موشی) در درختان گردوی آمریکایی (پیکان) گردد، این بیماری یک نابسامانی فیزیولوژیکی است که در اثر کمبود نیکل در درختان گردوی آمریکایی ایجاد می‌شود. علائم این نابسامانی شامل تاخیر در باز شدن و کاهش سطح برگ، شکفتن جوانه‌ها به صورت ضعیف، زرد شدن برگ‌ها، ایجاد حالت کپه‌ای و بافت مردگی در نوک برگ‌ها. استفاده از کودهای حاوی نیکل در زمان مناسب (اواخر پاییز یا در اوایل بهار) با غلظت کافی سبب درمان این ناهنجاری و همچنین فرم شدید این بیماری که به نام بیماری واکاری باغ نامیده می‌شود می‌گردد (وود و همکاران، a2004). شیوع بیماری در نسل دوم باغ‌های جنوب شرق ایالات متحده افزایش یافته است، این بیماری هنگامی ظاهر می‌شود که نشاهای جوان در مکان‌هایی که قبلا باغ گردوی آمریکایی بوده است دوباره کشت می‌شوند. احتمال دارد وجود مقادیر زیادی عنصر روی و مس در خاک نیز سبب ایجاد این بیماری گردد. تجمع این فلزات در طی سال‌ها می‌تواند سبب از دسترس خارج شدن نیکل گردد و فرم شدید یا متداول این نابسامانی را سبب گردد. در حالت شدید، درخت دارای رشد بسیار کند، تاج کم پشت است و در نهایت مرگ درخت نیز ممکن است رخ دهد (وود و ریلی، 2007). همچنین از آن‌جا که نیکل اثر مستقیم یا غیر مستقیم روی متابولیت‌های ثانویه گیاه دارد، روشن است که احتمال حمله عوامل بیماری‌زا و آفت‌ها در کمبود نیکل گسترش می‌یابد. کمبود نیکل می‌تواند به صورت غیر مستقیم روی نقل و انتقال انرژی درون گیاهان موثر باشد (بایی و همکاران، 2006؛ وود و همکاران،b 2004).
2-2-5 - تجمع و سمیترشد بسیاری از گیاهان در غلظت‌های بیش از ۵٠ میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن خشک گیاهی نیکل صدمه می‌بیند. این اثرات در سطوح مرفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی بروز می‌کند و ممکن است به علت اثر مستقیم سمیت این عنصر باشد یا ممکن است ناشی از رقابت نیکل با سایر عناصر ضروری مانند کلسیم، منیزیم، آهن، و روی باشد و در نهایت موجب ایجاد کمبود مصنوعی و ثانویه آن‌ها گردد (اندرسون و همکاران، 1973). در مراحل ابتدایی سمیت نیکل نشانه‌های چشمگیر و روشن بروز نمی‌کند اما رشد ریشه و شاخساره ممکن است کند گردد (براون،2007). در حالت سمیت شدیدتر نیکل، زرد شدن برگ‌ها از گوشه‌ها که به سمت مرکز پیش می‌رود رخ می‌دهد که سپس قسمت‌های زرد نکروزه می‌شوند و در نهایت احتمال دارد گیاه از بین برود (براون، 2007). نیکل می‌تواند درون گیاهان تجمع یابد که در اغلب موارد کمتر از ١/٠ درصد وزن خشک گیاه است اگرچه گیاه Sepertia accuminata می‌تواند بیش از این میزان نیکل را تجمع بدهد (لی و همکاران، 1987).
در طی دوران رویشی، بیشتر نیکل به سمت برگ‌ها منتقل می‌شود و در آن‌ها تجمع می‌یابد اگرچه در زمانی که برگ‌ها به سمت پیری می‌روند بیشتر نیکل به علت خاصیت تحرک دوباره به سمت بذرها منتقل می‌شوند این مورد برای سویا (کاتاکلو و همکاران، 1987) و میمولوس (تیلستون و مکنیر، 1991) گزارش شده است. پراساد و همکاران، (1997) نشان دادند که نیکل درسنبل آبی قابلیت تجمع دارد. همچنین گیاه خردل هندی به عنوان یک گیاه انباشتگر مهم نیکل در نظر گرفته می‌شود (سین و همکاران، 2001). گیاهان دیگری نیز به عنوان تجمع‌دهنده نیکل در نظر گرفته می‌شوند مانند: گیاه سوییس وآلیسوم (کانینگهام و همکاران، 1995)، Sepertia acuminata (انسلس و همکاران، 1997) و سنبل آبی (سین و همکاران، 2001).
مرحله رشد و اندام در امر تجمع نیکل درون گیاهان موثراند. در درخت بلوط، در طی ٧٠ روز بعد از تندش بذر میزان نیکل به سرعت در طی ٣٠ روز اول افزایش یافت اما بعد از آن دچار کاهش آرام گردید (جم، 1968). دلیل دیگر این نوسان در تجمع نیکل، احتمالاً به علت فعالیت ریشه‌ها می‌باشد؛ سیستم جذب کننده نیکل و یا فعالیت متابولیکی بافت تجمع دهنده فلز درون بافت گیاهی نیز می‌توانند روی این امر تاثیرگذار باشد. در گیاه ذرت، برگ‌های جوان‌تر نسبت به برگ‌های پیرتر حاوی نیکل بالاتری هستند (مکلین و دکر، 1978). در گیاهان پامچال، شبدر سفید، الودیاو برگ عبائیعنصر نیکل در ابتدا در برگ‌ها و بعد در گل‌ها تجمع می‌یابد (راف و همکاران، 1991). تغییر فصلی در تجمع نیکل درون گیاه نیز گزارش شده است به عنوان مثال در گیاه پیچک نیلوفر (سنگارو همکاران، 2008).

فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- مواد گیاهیدر خرداد ماه سال 1392 گلهای شاخه بریدهی ژربرا که در مرحلهی تجاری (دارای دو ردیف گلچهی خارجی باز شده) برداشت شده بودند، از گلخانهای در تهران تهیه و بلافاصله برای انجام تیمار و ارزیابی صفات به آزمایشگاه پس از برداشت دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت منتقل شدند (شکل 3-1). گلها روی ارتفاع 50 سانتیمتری باز برش شده و هر چهار شاخهی گل در گلدانهای پلاستیکی به حجم دو لیتر قرارداده شدند، سپس به مقدار مورد نیاز تحت تیمار قرار گرفتند.

شکل 3-1- طریقه بسته‌بندی گلهای شاخه بریدهی ژربرا پس از برداشت
3-2- نوع طرح آزمایشیاین مطالعه بر پایه طرح کامل تصادفی با 10 تیمار شامل نیکل در سه سطح (10، 20 و 30 میلی گرم در لیتر)، سولفات نیکل و نیترات نیکل هر کدام در سه سطح (10، 30 و50 میلی گرم در لیتر) و شاهد (آب‌مقطر) با سه تکرار و در مجموع 30 پلات و در هر پلات 4 شاخه گل و در مجموع 120 شاخه گل انجام شد. تیمار به صورت پالس (به مدت 24 ساعت) و در شرایط فوتوپریود 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی بود که که توسط نور لامپهای فلورسنت سفید تامین میشد. شدت نور 12 میکرومول بر ثانیه متر مربع ، دمای 2±20 و رطوبت نسبی 60 تا 70 درصد بود و صفاتی از قبیل عمر گلجایی، کاهش وزن تر، درصد وزن خشک، جذب آب شمارش باکتریهای ته ساقه و محلول نگه دارنده، کاهش مواد جامد محلول در آب ((TSS و قطر گلها، پروتئین و کارتنوئید گلبرگ‌ها و فعالیت آنزیم های سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیداز اندازه‌گیری شد.
شکل3-2- چیدمان طرح آزمایشی
3-2-1- نحوه آمادهسازی گلها و انجام تیمارابتدا شاخه‌های ژربرا به طول 52 سانتی‌متر به صورت مورب در داخل آب 38 درجه سانتی‌گراد بریده شدند. گل‌ها با برچسب، کدگذاری شده و پس از توزین با ترازوی دیجیتال، در گلدان‌های پلاستیکی حاوی 250 میلی لیتر از تیمار های محلول نیکل با 3 سطح (10 و 20 و 30 میلی گرم در لیتر ) و نیترات نیکل در سه سطح (10 و 30 و 50 میلی گرم در لیتر) و سولفات نیکل در 3 سطح (10 و 30 و 50 میلی گرم در لیتر) به حالت پالس قرار گرفتند).برای تهیه محلول نیکل مقدار مورد نظر را در یک سی سی حلال اسید نیتریک غلیظ بر روی گرمکن با هم زدن مداوم حل شد. سه گلدان نیز به عنوان شاهد با 250 سی سی آب مقطر خالص در هر تکرار یکی قرار دادیم. پس از 24 ساعت گلها به گلدآن‌های محلول های تیمار مداوم حاوی 500 میلی لیتر محلول 3% ساکارز و 200 میلی گرم در لیتر هیدروکسی کینولین منتقل شدند .
در طول دوره آزمایش به منظور جلوگیری از انسداد آوندی هر سه روز یک بار عمل باز برش انتهای ساقه به اندازه یک سانتی‌متر درون آب 38 درجه سانتی‌گراد انجام شد.
3-2-2- معرفی تیمارهاده تیمار مورد استفاده به قرار زیر بودند:
شاهد یا (کنترل) : آب مقطر (10):Ni عنصر نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر N1
(20):Ni عنصر نیکل با غلظت 20 میلی گرم در لیتر N2
(30):Niعنصر نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر N3
(10)4:NiSOسولفات نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر SN1
(30)4:NiSO سولفات نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر SN2
(50)4:NiSOسولفات نیکل با غلظت 50 میلی گرم در لیتر SN3
(10)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 10 میلی گرم در لیتر NN1
(30)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 30 میلی گرم در لیتر NN2
(50)2:Ni(NO3) نیترات نیکل با غلظت 50 میلی گرم در لیتر NN3

3-3- اندازهگیری صفات3-3-1- طول عمر گلجاییبرای ارزیابی طول عمر گلجایی و پایان نگهداری گلهای بریده ژربرا، معیار اصلی پیچش گلبرگها و پژمردگی ظاهری گلها بود. بنابراین طول عمر هر یک از چهار شاخه گل موجود در محلول گلجا که طول عمرهای متفاوتی داشتند، اندازهگیری شده و از آنها میانگین گرفته شد. این عدد به عنوان طول عمر گلجایی آن تیمار در نظر گرفته شد.
3-3-2- کاهش وزن تر با توجه به میزان وزن تر اولیه گل‌ها، وزن تر نهایی گل‌ها، وزن باز برش‌ها و وزن ریزش‌گلبرگ‌ها، مقدار کاهش وزن تر بر حسب گرم به ازای هر شاخه گل طبق رابطه زیر محاسبه شد(شکل 3-2):
(وزن ریزش‌ها + وزن باز برش‌ها + وزن تر نهایی) – وزن تر اولیه = کاهش وزن تر

شکل 3-3- اندازه گیری وزن تر شاخه گل
3-3-3- درصد ماده خشکپس از پایان عمر گلجایی هر گل، وزن تر آن اندازه گیری شد و دو شاخه در آون در دمای 70 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. پس از اطمینان یافتن از خشک شدن، گل‌ها با ترازوی دیجیتال توزین شدند. درصد ماده خشک از رابطه زیر محاسبه شد:
100 × (وزن تر گل‌ها در روز آخر ÷ وزن خشک) = درصد ماده خشک
3-3-4- قطر گلها با کمک کولیس دیجیتال یک روز در میان اندازه گیری شد.
43561088265
شکل 3-4- اندازه گیری قطر گلها3-3-5-کاهش مواد جامد محلول در آب (TSS)برای اندازه گیری میزان مواد جامد محلول در آب از باز برش های انتهای ساقه استفاده شده است. یک یا دو قطره از عصاره باز برش‌ها روی صفحهی شیشهای رفراکتومتر دستی (مدل N-1α ساخت شرکت ATAGO کشور ژاپن) ریخته و میزان قند آن هر دو روز یک بار اندازه گیری شد. تفاضل بین اعداد به دست آمده از اندازه گیری میانگین درصد قند روز دوم و میانگین درصد قند روز آخر عمر گلجایی به عنوان میزان کاهش درصد قند در ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا در نظر گرفته شد.

شکل3-5- رفراکتومتر دستی (مدل N-1)3-3-6- محتوای پروتئین گلبرگ949960677545برای اندازه گیری میزان پروتئین در گلبرگ‌های گل شاخه بریده ژربرا در تیمارهای مختلف در روز پنجم آزمایش یک شاخه از هر پلات خارج شده و جهت استخراج پروتئین، از روش برادفورد ( 1976) استفاده شد.
شکل 3-6- اندازه گیری پروتئین گلبرگ3-3-7 - رنگیزه کاروتنوئید گلبرگدر روز پنجم آزمایش یک شاخه گل از هر پلات جهت اندازه گیری کاروتنوئید خارج شد. گلبرگ‌ها را خشک کرده و رنگیزه کاروتنوئید از روش مزومدار و مجومدار(2003) اندازه گیری شد.

شکل 3-7- اندازه گیری رنگیزه کاروتنوئید گلبرگ3-3-8- جذب آب
با توجه به حجم اولیه محلول گلجای (500 میلیلیتر) و میزان تبخیر اتاق و کاهش حجم محلول گلجای، جذب آب از فرمول زیر میباشد:
(مقدار تبخیر اتاق در همان روز+ محلول باقیمانده در پایان عمر گلجایی) – 500 = جذب آب3-3-9- شمارش باکتری ساقه و محلول گلجاینمونهگیری از انتهای ساقه و محلول گلجایی 24 ساعت پس ازشروع آزمایش انجام و شمارش باکتری به روش لویی و همکاران (2009) انجام شد.
3-3-10- فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD)برای سنجش فعالیت سینتیکی آنزیم POD از روش یین و همکاران (2007) استفاده گردید. 450 میکرولیتر محلول H2O2(225 میلیمولار) و 450 میکرولیتر محلول گایاکول (225 میلیمولار) با هم مخلوط گردید و به آن 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه و تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر دنبال شد. در محلول بلانک به جای عصاره آنزیمی، 100 میکرولیتر از بافر فسفات 50 میلی مولار (7pH=) استفاده شد.
3-3-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز (SOD)
فعالیت SOD به روش اسپکتروفتومتری و با استفاده از روش ژیا نوپلتیس و رایس(1977) و با کمی تغییر اندازه‌گیری شد. نمونه‌های بافت در داخل یک هاون و در حضور نیتروژن مایع آسیاب شد و به دمای 80- منتقل شد. مقدار 5/0 گرم از بافت منجمد شده‌ با یک میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 5/0 مول، 1/0 گرم پلی‌وینیل پولی‌پیرولیدین (PVPP) و pH 7 رقیق شد. پس از هموژنایز کردن، نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با دور 14000 در دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول رویی به آرامی برداشته شد و با ریختن در تیوب بلافاصله به دمای 80- تا اندازه‌گیری فعالیت منتقل شد.
محلول واکنش شامل EDTA 1/0 میلی مولار، بافر فسفات 50 میلی مولار، متیونین13 میلی مولار وNBT 75 میکرومولار و ریبوفلاوین دو میکرومولار (مجموعا به یک میلی‌لیتر) و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. تیوب‌های حاوی محلول واکنش به مدت 15 دقیقه درحالی‌که به آرامی شیکر می‌شدند در معرض نور فلورسانس (یک عدد لامپ فلورسانس حدود 400 لوکس) و دمای 22 درجه‌سانتی‌گراد قرار گرفتند. واکنش با انتقال تیوب‌ها به شرایط تاریکی متوقف شد و سپس جذب نمونه‌ها در طول موج 560 نانومتر قرائت شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم علاوه بر کووت‌های نمونه و بلانک از کووت شاهد نیز استفاده شد، که محتوای واکنشی نمونه بلانک و شاهد مشابه نمونه‌ی اصلی است با این تفاوت که هر دو نمونه مذکور فاقد آنزیم بودند. لازم به ذکر است که نمونه‌ی کنترل به همراه نمونه‌ها در معرض نور قرار می‌گیرد و نمونه‌ی بلانک در تاریکی قرار داده می‌شود. میزان جذب نمونه‌ها در طول موج 560 نانومتر خوانده شد.
3-4- تجزیه و تحلیل داده‌هاداده‌ها ابتدا در نرم افزار Excel ثبت شدند، سپس تجزیه و تحلیل آن‌ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و مقایسه میانگین‌ها بر اساس آزمون Tukey در سطح پنج درصد، انجام شد. رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel انجام گرفت.
فصل چهارم
نتایج

4-1- عمر گلجاییبررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارها اثر معناداری در سطح یک درصد برعمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول 4-1). نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌ها نشان می‌دهد که کاربرد عنصر نیکل به تنهایی نتوانست سبب افزایش معناداری در عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا گردد، در حالی که کاربرد سولفات نیکل و نیترات نیکل سبب بهبود عمر گلجایی و افزایش معنادار این شاخص نسبت به نمونه‌های شاهد گردید همان طور که ملاحظه می‌شود حداکثر عمر گلجایی (11 روز) در کاربرد نیترات نیکل به غلظت 50 میلی گرم در لیتر به دست آمد. اگر چه تیمار سولفات نیکل سبب افزایش معناداری در عمر گلجایی گل‌های ژربرا گردید اما تفاوت معناداری بین سطوح مختلف سولفات نیکل وجودنداشت (شکل 4-1).
7.61c
6.89c
7.05c
7.22c
9.72b
10b
10.32ab
10.5ab
11a
9.92b
عمر گلجایی(روز)
32385125095
تتیما
تیمارها
نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
شکل 4-1- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر عمر گلجایی گل‌های شاخه بریده ژربرا
4-2-کاهش وزن تازه گل133352436495همان طور که در شکل 4-2 آمده است، سطوح مختلف تیمار نیکل به تنهایی سبب افزایش یا کاهش معناداری در تغییر وزن تازه در گل‌های ژربرا نگردیدند. اما به طور کلی براساس نتایج حاصل از تجزیه واریانس، تیمارها اثر معناداری در سطح یک درصد بر میزان کاهش وزن تازه گل‌های شاخه بریده ژربرا نسبت به شاهد داشته‌اند (جدول 4-1) سطوح مختلف تیمارهای سولفات و نیترات نیکل سبب کاهش کمتر در این شاخص گردیدند. یا به عبارت دیگر کاربرد هر یک از نمک‌های نامبرده سبب ثبات بالاتر وزن تازه گل‌ها شدند. بهترین نتیجه از کاربرد نیترات نیکل به غلظت 30 میلی‌گرم بر لیتر به دست آمد که حداقل کاهش وزن تازه گل را نشان می‌دهد (شکل 4-2).
2.482a
2.55a
2.485a
2.477a
2.176bc
2.231b
2.021d
1.772e
1.99d
2.035cd
کاهش وزن تازه گل (گرم)

تیمارها
شکل4-2- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر کاهش وزن تر گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-3- درصد ماده خشک
984252147570آنالیز واریانس نشان داد که تیمارهای مختلف درسطح یک درصد بردرصد ماده خشک موثر بوده‌اند(جدول4-1) نتایج مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که در گل‌های شاخه بریده ژربرا که تیمارهای نیترات و سولفات نیکل را دریافت کرده بودند، بیشینه وزن خشک را داشتند به گونه‌ای که حداکثر درصد ماده خشک (02/16%) هنگامی به دست آمد که گل‌ها با نیترات نیکل با غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر تیمار شدند. تیمارهای عنصر نیکل به تنهایی تاثیر معناداری بر این شاخص نداشتند (شکل 4-3).
12.73d
13.71cd
12.2d
13.16cd
15.71a
14.05bc
16.02a
15.57ab
15.91a
14c
ماده خشک (درصد)

تیمارها
شکل 4-3- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر وزن درصد ماده خشک گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-4- قطر گلها
1386512783785بررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارهای نیکل، سولفات و نیترات نیکل از نظر آماری اثر معناداری در سطح پنج درصد نسبت به شاهد (آب مقطر) بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول 4-1). نتایج حاصل از مقایسه میانگین ها نشان داد که قطر گل‌هایی که تیمار30 میلی گرم بر لیتر از عنصر نیکل را دریافت کرده بودند و همچنین در گل‌هایی که توسط نمک‌های سولفات و نیترات نیکل تیمار شده بودند به گونه معنادار بیشتر از نمونه‌های شاهد بودند. حداکثر قطر گل‌ها (39/111 میلی‌متر) در ژربراهایی که توسط نیترات نیکل با غلظت 50 میلی گرم بر لیتر تیمار شده بودند به دست آمد. تفاوت معناداری بین نمونه‌هایی که تیمار سولفات نیکل دریافت کرده بودند موجود نبود (شکل 4-4).
105.53e
107.61cde
106.43de
108.42bcd
109.07abc
110.17ab
109.92abc
110.31ab
111.39a
110.22ab
قطر گل (میلی‌متر)

تیمارها
شکل 4-4- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر قطر گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-5- کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (TSS)
1847852084070بررسی نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان می‌دهد که استفاده از نیکل، سولفات و نیترات نیکل در محلول نگهدارنده نسبت به شاهد (آب مقطر) اثر معناداری در سطح پنج درصد بر روی میزان قند (TSS) موجود در ساقه گل بریده ژربرا داشته است (جدول 4-1) مقایسه میانگین داده ها نشان داد که تیمارهای30 میلی‌گرم بر لیتر عنصر نیکل و نمک‌های سولفات و نیترات نیکل همگی سبب کمترین کاهش درصد قند (TSS) شده‌اند. بهترین پاسخ‌ها در بالاترین سطح کاربردی نیترات و سولفات نیکل (50 میلی گرم بر لیتر ) به دست آمد.
1.05a
0.97ab
0.95ab
0.9b
0.75c
0.61de
0.77c
0.45f
0.51ef
0.66cd
کاهش مواد جامد محلول(درصد)

تیمارها
شکل 4-5- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر روی کاهش درصد مواد جامد محلول در آب (Tss) هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-6- پروتئین گلبرگ
نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان می‌دهد که تیمارهای استفاده شده در این آزمایش در ارتباط با حفظ میزان پروتئین در گلبرگ‌های شاخه بریده ژربرا نسبت به شاهد اثر مثبت و معناداری در سطح یک درصد داشته است جدول (4-1) نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده ها نشان داد که تیمارهای سولفات نیکل و تمام غلظت‌های نیترات نیکل سبب بهبود این پارامتر گردید به گونه‌ای که گل‌هایی که تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر از نیترات نیکل را دریافت کرده بودند بالاترین غلظت پروتئین را داشتند (14%) که در حدود سه درصد بالاتر نسبت به نمونه‌های شاهد بود شکل (4-6).
8001027368511e
11.05de
11.75cde
12.01bcde
12.53abcd
13.09abc
13.81a
13.61a
14a
13.21ab
پروتئین گلبرگ (درصد)

تیمارها
شکل 4-6- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میزان پروتئین گلبرگ گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-7- کاروتنوئید گلبرگ
همان‌طور که در جدول آنالیز واریانس مشاهده می‌شود، تیمارها عنصر نیکل و نیز سولفات و نیترات نیکل نسبت به شاهد اثر معناداری در سطح یک درصد بر روی میزان کاروتنوئید گلبرگ در گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند جدول (4-2). نتایج حاصل از مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که غلظت30 میلی‌گرم بر لیتر از عنصر نیکل و تمام غلظت‌های دو نمک سولفات و نیترات نیکل سبب افزایش معنادار کاروتنوئید گلبرگ نسبت به نمونه‌های شاهد گردد. براساس نتایج که در شکل (4-7) آورده شده است، بیشینه کاروتنوئید (92/1میکروگرم در گرم وزن تر) از گل‌هایی به دست آمد که تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر سولفات نیکل را دریافت کرده بودند که بیش از سه برابر از نمونه شاهد بود.
222885121285
0.53f
0.71ef
0.61ef
0.95de
1.13cd
1.92a
1.37bc
1.56ab
1.77ab
1.56ab
کاروتنوئید گلبرگ (میکروگرم در گرم وزن تر)

تیمارها
شکل4-7- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میران کاروتنوئید گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-8- جذب آب
نتایج تجربه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارها اثر معناداری در سطح پنج درصد بر میزان جذب آب در گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند (جدول4-2) بررسی مقایسه میانگین داده‌ها نشان می‌دهد که غلظت30میلی گرم بر لیتر از عنصر نیکل به تنهایی و تمام غلظت‌های به کار رفته از نمک‌های سولفات و نیترات نیکل سبب بهبود و افزایش جذب آب نسبت به نمونه‌های شاهد گردید. بیشترین میزان جذب آب (61/95 میلی لیتر به ازای هر گل) از گل‌هایی به دست آمده که تیمار30 میلی‌گرم بر لیتر از نیترات نیکل را دریافت کرده بودند و کمینه جذب آب هم در نمونه‌های شاهد مشاهده گردیده است (شکل4-8).
127403174253
67.21f
70f
70.7f
77d
85.5c
89.26bc
91.74ab
95.61a
92.52ab
90.18b
جذب محلول (میلی‌لیتر)

تیمارها
شکل 4-8- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر میران جذب آب گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-9-جمعیت باکتریایی در ته ساقه
2228852503170آنالیز واریانس داده‌ها نشان داد که تیمارهای مختلف عنصر نیکل، سولفات و نیترات نیکل نسبت به شاهد از نظر آماری در سطح یک درصد برکاهش جمعیت باکتریایی در ته ساقه موثر بوده‌اند (جدول4-1). براساس مقایسه میانگین داده‌ها نشان داد که، کاربرد عنصر نیکل به تنهایی با غلظت‌های20 و30 میلی گرم بر لیتر و تمام غلظت‌های دو نمک سولفات و نیترات نیکل سبب کاهش معنی‌دار کلونی‌های باکتریایی حاصل از ته ساقه گل‌ها نسبت به شاهد (آب مقطر) گردیده است. کمترین تعداد کلونی باکتریایی از ته ساقه گل‌هایی به دست آمد که بالاترین سطح (50 میلی گرم بر لیتر) از دو نمک سولفات نیکل و نیترات نیکل را دریافت کرده بودند که تقریباً 50 درصد پایین تر از نمونه هایی شاهد بود.
110.11a
(log10CFU.ml-1)شمارش باکتری ساقه
105.81a
92.5b
88.5b
75.63c
61.4e
70.43cd
62.57e
57.53f
65.22de

تیمارها
شکل 4-9- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در ته ساقه گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-10- جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌ها
همان طور که در جدول (4-1) آنالیز واریانس دیده می‌شود، تیمارهای مختلف نیکل نسبت به شاهد (آب مقطر) اثر معناداری در سطح یک درصد بر این شاخص در هنگام نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا داشته‌اند. تمام تیمارها سبب کاهش معنادار کلونی‌های باکتریایی گردیدند و بیشینه تعداد کلونی‌های از محلول نگهدارنده گل‌هایی به دست آمد که بالاترین سطح نمک‌های سولفات و نیترات نیکل (50 میلی گرم بر لیتر) را دریافت کرده بودند که در حدود 40 درصد پایین تر از نمونه‌های شاهد بود (شکل4-10).
125.88a
90.25b
95.27b
85.18bc
70.05de
60.82ef
75.11cd
61.05ef
58.03f
60.91ef
شاهد
N1
N2
N3
SN1
SN2
SN3
NN1
NN2
NN3
(log10CFU. ml-1)شمارش باکتری محلول نگهدارنده
28237154310
تیمارها
شکل 4-10- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر جمعیت باکتریایی در محلول نگهداری گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-11- فعالیت آنزیم سوپر اکسیددسموتاز
همان‌طور که در شکل (4-11) مشاهده میشود، تمام تیمارها سبب افزایش فعالیت این آنزیم نسبت به شاهد گردیدند به گونهای که کمینه فعالیت این آنزیم از نمونه های شاهد به دست آمده است (61/60 واحد در گرم وزن تر) همچنین آنالیز واریانس داده ها نشان میدهدکه اثر تیمارها از نظر آماری در سطح یک در صد بر این شاخص در گلهای شاخه بریده ژربرا معنی دار بوده است. کاربرد 30 و 50 میلی گرم سولفات نیکل و همچنین تمام غلظت‌های نیترات نیکل سبب افزایش بیش از دو برابر این آنزیم نسبت به نمونههای شاهد گردیده است. بالاترین سطح فعالیت آنزیم سوپر اکسیددسموتاز (21/135 واحد در گرم وزن تر) از گلهایی به دست آمد که بالاترین سطح نیترات نیکل را دریافت کرده بودند (50 میلی گرم در لیتر).
7048521590
60.61e
81.05d
88.56d
85.85d
100.01c
125.22ab
125.31ab
129.61ab
135.21ab
120.11b
فعالیت آنزیم SOD (IU/g.FW)

تیمارها
شکل 4-11- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز گل‌های شاخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10mg-1 NN1=10mgl-1
N2=20mgl-1 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50mgl-1 NN3=50mgl-1
4-12- فعالیت آنزیم پراکسیداز
همان طور که در جدول آنالیز واریانس مشخص شده است تیمارها اثر معنی داری در سطح یک در صد بر فعالیت آنزیم پراکسیداز گلهای شاخه بریده ژربرا داشتهاند (جدول 4-1).تیمارهای عنصر نیکل به جز تیمار 30 میلی گرم بر لیتر سبب افزایش یا کاهش فعالیت این آنزیم نسبت به نمونه های شاهد نگردید اما کاربرد دو نمک دیگر یعنی سولفات نیکل و نیترات نیکل در تمام سطحوح سبب افزایش معنی دار فعالیت این آنزیم نسبت به نمونه های شاهد گردید. حداقل فعالیت (02/4 میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) از نمونه‌های شاهد به دست امد و حداکثر فعالیت در حدود(3/6 میکرومول بر گرم وزن تر در دقیقه) از نمونه‌هایی به دست آمد که بیشینهسطح سولفات و نیترات نیکل یعنی50 میلیگرم برلیتر را دریافتکرده بودند (شکل4-12).
4.02e
4.24de
4.32de
4.53d
5.56c
6.37a
5.78bc
6.28ab
6.36a
6.17ab
فعالیت آنزیم POD(MoL/g.FW.min)
175260130810
تیمارها
شکل 4-12- اثر کاربرد تیمارهای مختلف نیکل فعالیت آنزیم پراکسیداز گل‌های ساخه بریده ژربرا نیترات نیکل سولفات نیکل نیکل
N1=10 mgl-1 SN1=10 mgl NN1=10 mgl-1
N2=20mgl-10 SN2=30mgl-1 NN2=30mgl-1
N3=30mgl-1 SN3=50 mgl-1 NN3=50 mgl-1
جدول4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازهگیری شده در گل‌های شاخه بریده ژربراکاهش بریکس پروتئین
گلبرگ قطر گل‎ها وزن خشک کاهش وزن تازه گل عمر گلجایی درجه آزادی 0/40* **63 18/82* 15/48** 1/281** 6/73** 9 تیمار
0/028 3/ 63 13/88 3/ 78 0/ 301 1/17 20 خطا
- - - - - - 29 کل
33 43 35 40 27 35 ضریب تغییرات (درصد)
* معنا دار در سطح 5 درصد
** معنا دار در سطح 1 درصد
ns عدم معنا دار بودن
ادامه جدول4-1- تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف روی صفات اندازهگیری شده در گل‌های شاخه بریده ژربرا فعالیت
POD فعالیت
SOD تعداد باکتری محلول تعداد باکتری ته ساقه جذب آب کاروتنوئید درجه آزادی 921/09** 5058/99** 2638/98** 1245/32** 155/36* 1/53** 9 تیمار
26/01 168/63 168/30 83/86 36/73 0/28 20 خطا
- - - - - - 29 کل
33 33 40 27 37 29 ضریب تغییرات (درصد)
* معنا دار در سطح 5 درصد
** معنا دار در سطح 1 درصد
ns عدم معنا دار بودن

فصل پنجم
بحث
5-1- بحثدر این مطالعه کاربرد سطوح مختلف سولفات و نیترات نیکل سبب افزایش بهبود عمر گلجایی گلهای شاخه بریده ژربرا به مدت دو الی چهار روز نسبت به شاهد گردیده است. عمر گلجایی گلهای شاخه بریده در صورت بهینه بودن شرایط نگهداری آنها به چند عامل بستگی دارد، وجود منابع در دسترس انرژی مثل کربوهیدرات‌ها، غلظت گاز اتیلن به ویژه اگر فرازگرا باشند و غلظت باکتری های موجود در محلول نگهدارنده یا در انتهای ساقه آنها که تمام این عوامل می توانند توسط یون نیکل تحت تاثیر قرار بگیرند. چرخه کربس یک مسیر بسیار مهم تولید کننده انرژی است که مقادیر مورد نیاز و کافی انرژی را جهت فرآیندهای تخصصی رشد و نمو گیاهی تامین می کند. هرگونه ایراد در این راکتور انرژی گیاهی میتواند بر قدرت عمومی گیاه و توانایی آن در جهت ادامه زندگی گیاهی تاثیر گذار باشد. نیکل کوفاکتور کوانزیم آ سنتاز است که آنزیم کوآنزیم آ تولید می کند. غیبت مقادیر کافی کوآنریم آ به این معنا است که پیرووات که از این چرخه بیرون می آید نمیتواند استیل کوآنزیم آ تولید کند و چرخه کربس را تغذیه کند این مسئله سبب کاهش تولید انرژی میگردد و باعث تجمع لاکتیک اسید در سطوح سمی میگردد (بایی و همکاران، 2006؛ وود و ریلی، 2007). بنابراین تامین نیکل کافی می تواند تضمینی برای تولید انرژی کافی و عدم تجمع مقادیر سمی لاکتیک اسید باشد.
١٢
پژوهش‌های اندکی وجود دارد که سعی کرده‌اند رابطه کمبود نیکل و آمینواسیدهای درونی گیاه را روشن کنند. کمبود نیکل در گیاه جو سبب افزایش آمینواسیدهای آزاد درونی و ترکیبات غیر پروتئینی شاخساره‌ها و بذرها به ترتیب در حدود ٢٠% و ۴٠% می‌شود (براون و همکاران، 1990). گریداس و همکاران )1999) نشان دادند که گیاهانی که دچار کمبود نیکل بودند و در محیط کشت حاوی اوره رشد نموده بودند دچار کمبود آمینو اسیدها گردیدند.
استحکام ساختارهای گیاهی، ناشی از تولید لیگنین نیز می‌تواند تحت تاثیر نیکل قرار بگیرد. یک مثال کلاسیک در این زمینه قدرت چوب درخت است. اندام‌های ضعیف و شکننده غیر معمول که در شرایط کمبود شدید نیکل ایجاد می‌شود شاهدی بر این موضوع است (وود و همکاران، c2004)، به این معنا که نیکل در فرآیندهای فیزیولوژیکی دخالت دارد که بر میزان لیگنین که در شاخساره‌ها تجمع می یابد موثر است (وود و ریلی، 2007).
نیکل بر چرخه اسید شیکمیک موثر است. این چرخه در تشکیل سایر هورمون‌های داخلی گیاه از جمله پدیده گلدهی، سالیسیلیک اسید موثر است. همین هورمون نیز روی تأثیر دارد . از طرف دیگر با توجه به نقشی که نیکل در آنزیم سنتز کننده کوانزیم آ (COA) دارد (وود و ریلی، 2007). روشن است که تامین نیکل باعث افزایش تولید استیل کوآنزیم آ، می‌گردد که برای تأمین موالونیک اسید ضروری است، خود این ماده پیش‌ساز هورمون‌های داخلی گیاه از جمله اسید آبسیزیک، جیبرلین و سیتوکینین می‌باشد.
یون نیکل خاصیت ضد اتیلنی دارد. این عنصر می تواند یک کمپلکس آنزیم- فلز ایجاد کند و همین موضوع باعث جلوگیری از عمل آنزیم آی- سی- سی- اکسیداز می گردد. در نتیجه اتیلن تولید نمیشود یا حداقل تولید آن کاهش معنی داری مییابد (ژانگ و همکاران، 2006). از آنجا که اتیلن تأثیر مستقیمی در رسیدن و فرآیند پیری دارد هر چه تولید آن کاهش یابد احتمال افزایش عمر پس از برداشت گیاه افزایش می‌یابد و این مورد در پژوهش حاضر مشاهده گردید. جمالی و راحمی (2011) گزارش کردند که کاربرد نیترات نیکل با غلظت 45 میلی گرم بر لیتر سبب بهبود عمر پس از برداشت گل‌های میخک شد.

—103

3-4- تهیه محلول مادری MS(غلظت x10) ……… …………… …………………… 47
3-5- مراحل سترون سازی51
3-5-1- سترون سازی بذرها51
3-5-2- سترون سازی محیط و وسایل کار 52
3-5-3- تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف 52
3-6- کشت گیاه در محیط های تیماری به منظور کال زایی 54
3-7- باززایی57
3-8- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت MS مایع 58
3-9- جداسازی ترکیبات فرار 58
3-10- آنالیز آماری 59
فصل چهارم: نتایج و بحث
60
4-1- نتایج کالوس سازی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 61
4-2- نتایج باززایی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 65
4-3- نتایج حاصل از اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه 70
4-4- بررسی ترکیبات شیمیایی گیاه رازیانه تحت تاثیر تیمارهای مختلف هورمونی از طریق
کشت سوسپانسیون سلولی 74………………………………………………………………………….
4-5- مقایسه درصد سطوح ترکیبات شیمیایی مشترک حاصل از کشت سوسپانسیونی گیاه رازیانه در تیمارهای مختلف هورمونی
75
4-6- اشکال طیف گاز کروماتورگراف در اسانس گیاه رازیانه تیمارشده با ترکیبات هورمونی مختلف.........................77
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری کلی
81
بحث 82
پیشنهادات86
منابع 87

چکیده انگلیسی 98……………………………………………………………… ………………….

فهرست شکل ها
عنوان شکلصفحه
شکل 1-4- مراحل رشد جنین های جنسی و غیرجنسی...………………………………………………….……….29
شکل 4-1- کالوسهای بوجود آمده در محیط کشتهای غلظت 4میلی گرم بر لیتر و 1 میلی گرم بر لیتر.................................................................................................................................60
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه
جدول 1-1- . مقایسه مقدار تولید برخی ترکیبات دارویی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی با گیاه کامل................33
جدول 3-1- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در القاء و رشد کالوس در محیط ……………….MS51
جدول 3-2- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در باززایی رازیانه در محیط MS2/1…………..……54
جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان کالوس‌زایی…………..……………………………………………………… 58
جدول 4-2- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد……………………..………………………………………... 58
جدول 4-3- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …………..…………………………………………………..60
جدول 4-4- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ............................................................................................................ 61
HYPERLINK l "_Toc302924107" جدول HYPERLINK l "_Toc302924106" 4-5- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان باززایی...................................................................................................................................................................63

جدول 4-6- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …...............................................................................................................................63جدول 4-7- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد65… ………………………………………………………………
جدول4-8- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ………………………………….. … …….. 66
جدول4-9- نتایج تجزیه واریانس اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ...................................................................................................................... ..........................................................68
جدول4-10- مقایسه میانگین اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ........................................................................................................................................................................................69
جدول 4-11- ترکیبات شیمیایی حاصل از اسانس گیاه رازیانه....................................................................................................71

TOC h z c "شکل"
فهرست نمودارها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی………………..…………… ........59
نمودار4-2- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی61
نمودار4-3- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی 62
نمودار4-4- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی64
نمودار4-5- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی............................................................................................ 65
نمودار4-6- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی.... ...........................................................67
نمودار4-7- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ساقه گیاه رازیانه69
نمودار4-8- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ریشه گیاه رازیانه 70
نمودار4-9- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر تعداد برگ ایجاد شده در گیاه رازیانه............................................70
نمودار 4-10- مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف...................................................................................................................................................72
نمودار 4-11 مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی D-(+)-fenchone در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف....................................................................................................................................................73

فصل اول
مقدمه
مقدمه
گل ها و گیاهان، خاموش ترین موجودات و در عین حال گویاترین مظهر قدرت و عظمت آفرینش هستد. هر برگی از این موجودات زیبا، کتاب بزرگی در وصف توحید است. گلها و گیاهان نه تنها با الوان و اشکال بدیع و بیبدیل خود سفرهی طبیعت را زینت میبخشند بلکه آن را چنان سرشاری از نیروی حیاتی میسازند که هیچ بساطی را یارای رقابت با آن نیست (امیدبیگی، 1377 .( با آن که امروزه درمان بیماریها بیشتر از طریق مصرف داروهایی صورت میگیرد که منشأ صنعتی دارند و اختصاصاً در آزمایشگاهها تهیه میشوند ولی مصرف بعضی از آنها زیانهایی به بدن میرساند و عوارض جانبی بسیاری از آنها ثابت شده است. در اوایل قرن حاضر پیشرفت علم شیمی و کشف سیستمهای پیچیدهی سنتز ارگانیک منجر به توسعهی صنعت داروسازی و جایگزینی شیمی درمانی شد. بدین طریق پزشکی مدرن توانست بسیاری از بیماریها غیرقابل علاج و غالباً مرگآور را درمان کند. با وجود این گیاهان دارویی و داروهایی که از آنها تهیه میشدند هرگز به طور کامل کنار گذاشته نشدند. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی امروزه بیش از 80 درصد مردم جهان (نزدیک به 5 میلیارد نفر)، برای درمان بیماریها هنوز از داروهای گیاهی استفاده میکنند. تقریبا یک چهارم داروهای تهیه شدهی دنیا منشأ گیاهی داشته که یا مستقیماً از گیاهان عصارهگیری شده و یا براساس ترکیب گیاهی، سنتز شدهاند. واژه گیاهان دارویی تنها به تسکین دهنده آلام اطلاق نمیشود بلکه این گیاهان در زیر گروه غذا به عنوان طعم دهندهها، نوشیدنیها، شیرین کنندهها، رنگ طبیعی بوده همچنین به عنوان ماده اولیه محصولات آرایشی و بهداشتی نیز مورد استفاده قرار می گیرند (امیدبیگی، 1376).
درواقع گیاهانی که حداقل دارای صفات زیر باشند،گیاه دارویی نامیده میشوند:
1- در پیکر این گیاهان مواد ویژه ای به عنوان مواد مؤثر یا متابولیتهای ثانویه ساخته و ذخیره میشوند که برای مداوای برخی از بیماریها مورد استفاده قرار میگیرند. مواد مذکور طی فرآیندهای ویژه و پیچیده بیوشیمیایی و به مقدار بسیار کم (به طور معمول کمتر از یک درصد وزن خشک گیاه)، ساخته میشوند.
2- اغلب ممکن است اندام ویژهای چون ریشه، برگها، ساقه، گل، میوه و غیره بیشترین مواد مؤثر را داشته باشند، بنابراین همیشه نمیتوان کل اندام گیاه را منبع ماده دارویی ویژهای دانست.
3- اندام گیاهی برداشت شده، آماده سازی و فرآوری میشوند، یعنی تحت تأثیر عملیات ویژهای مانند جداسازی، خرد شدن، خشک کردن، تخمیر و غیره قرار گرفته و سپس استفاده میشوند. به طور معمول این اندامها به صورت سنتی و فقط با خشک کردن به عنوان کالای عطاری عرضه میشوند.
جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

رویکرد روز افزون استفاده از گیاهان دارویی و فرآوردههای حاصله از آن نقش این گیاهان را در چرخه اقتصاد جهانی پررنگتر کرده است. طوریکه مصرف روبه تزاید آن تنها به کشورهای در حال توسعه اختصاص نداشته، بلکه یکی از فاکتورهای مهم بهداشتی کشورهای پیشرفته نیز محسوب میگردد. در جهان 130 میلیون تن گیاه دارویی سالانه خرید و فروش میشود و حدود یک میلیون کارخانه دارویی در چند سال اخیر افزایش یافته است. طبق برآوردهای صورت گرفته در سالهای اخیر، ارزش بازارهای جهانی داروهای گیاهی که شامل گیاهان دارویی و فرآوردههای آنها است، رشد قابل توجهی داشته است. بخش اعظم بازار گیاهان دارویی دنیا، به تولید و عرضه متابولیتهای ثانویه مشتق از این گیاهان مربوط میشود. متابولیتهای ثانویه معمولاً از ارزش افزوده بسیار بالایی برخوردارند به طوریکه ارزش فروش برخی از این ترکیبات مانند شیکونین ، دیجیتوکسین و عطرهای همچون روغن جاسمین ، از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر کیلوگرم تغییر می کند. همچنین قیمت هر گرم از داروهای ضد سرطان گیاهی مانند وین بلاستین ، وینکریستین ، آجمالیسین و تاکسول به چند هزار دلار میرسد. تاکسول یکی ازترکیبات دارویی است که از پوست درخت سرخدار به دست میآید و در درمان سرطانهای سینه و تخمدان مورد استفاده قرار میگیرد. ورود دارو بودجه زیادی را به خود تخصیص میدهد این در حالی است که ایران با داشتن خصوصیات اکولوژیکی و اقلیمی متنوع، یکی از کشوهای کم نظیر در تولید گیاهان مختلف میتواند باشد به طوری که ایران از 13 اقلیم موجود در جهان، 11 اقلیم را به خود اختصاص داده است. و به تقریب 8000 گونه گیاهی که معادل 2 برابر فلور کل اروپا است ازدیگر ویژگیهای کشورمان می باشد، که این بانک ژن اهمیت اقتصادی زیادی دارد. برای مثال کشور فلیپین حجم عظیمی از درآمد خود را از فروش گیاهان دارویی و گیاهان وحشی به دیگر کشورها بدست میآورد (میرجلیلی، 1382). بنابراین، اگرچه در زمینه توسعه صنعت گیاهان دارویی در ابتدای راه هستیم، ولی میتوانیم با برنامهریزی صحیح، بخش قابل توجهی از بازارهای جهانی را به خود اختصاص دهیم. شاید در ابتدای کار نتوانیم با کشورهایی که محصولات خود را به تولید انبوه رسانده اند، رقابت نماییم، اما به لحاظ تنوع گونهای و تولید طبیعی گونههایی دارویی رقبای چندانی در جهان نداریم و در مواردی حتی بیرقیب هستیم. همه اینها منوط به این نکته است که داراییهای کشور را بشناسیم و بتوانیم از آنها استفاده بهینه نماییم. در این صورت حتی می توان تا 5 درصد از تولید ناخالص ملی را از این طریق تأمین نمود (امیری،2006).
1-3- ضرورت توجه به پرورش گیاهان دارویی
با ظهور داروهای شیمیایی و بیولوژیک، نقش و اهمیت گیاهان دارویی در تأمین سلامت بشر، در معرض فراموشی قرار گرفت .اما با گذشت زمان، استقبال از گیاهان دارویی با رشد قابل توجهی روبرو شده است. به نظر میرسد مردم جهان از یک سری نارساییهای طب مدرن خسته شده اند و به طور روز افزون به سمت داروهای گیاهی روی میآورند به همین دلیل، امروزه حدود 50 درصد داروهای تولید شده در جهان منشاء طبیعی دارند که با تغییراتی به عنوان دارو مورد استفاده قرار میگیرند که نیمی از این مقدار از منابع معدنی، حیوانی و باکتریایی بهدست میآید و نیمی دیگر منشاء گیاهی دارد. برای مثال، تمام هورمونهای مصرفی گیاهی هستند و از گیاهان مختلفی نظیر سیب زمینی مکزیکی، شنبلیله و غیره به دست میآیند. هم چنیین ترکیباتی مثل وین بلاستین و وین کریستین که از داروهای ضد سرطان هستند از گیاه بدست میآیند و یا گلیکوزیدهای قلبی از جمله این گروه داروها محسوب میشوند (قاسمی دهکردی و طالب، 1380). گیاهان دارویی به دلیل ماهیت طبیعی و وجود ترکیبات همولوگ دارویی در کنار هم، با بدن سازگاری بهتری دارند و معمولا فاقد عوارض ناخواسته هستند لذا به خصوص در موارد مصرف طولانی و در بیماریهای مزمن، بسیار مناسب میباشند. به عنوان مثال، گیاهان دارویی در بسیاری از اختلالات اعصاب و روان به عنوان بهترین انتخاب خواهند بود.
ایرانیان از دیرباز و حتی پیش از دیگران در زمینه گیاهان دارویی و کاربرد درمانی آنها از دانش پیشرفتهای برخوردار بوده است. نمونه بارز آن کتاب باستانی اوستاست. در یکی از پنج کتاب تشکیل دهنده اوستا( که در مجموع دست کم 2500 سال پیشینه دارد)، بخش های پرشماری به گیاه درمانی، معرفی گیاهان دارویی و کاربرد آنها اختصاص یافته است. در قرن هشتم و نهم میلادی، اطباء ایرانی رونق خاصی به طبابت ایران و جهان بخشیدند بهطوریکه با پیدا شدن دانشمندان و نوابغی نظیر ابوعلی سینا و محمد زکریای رازی با انشار کتابهای معروف خود (قانون و الحاوی) پیشرفتهای زیادی نصیب ملت ایران و جهان گردید. این پیشرفتها همچنین در قرون بعد نیز ادامه یافت. در قرن 13 میلادی، ابن بیطار، اختصاصات متجاوز از 1400 گیاه را که خود شخصاً می شناخت را در کتابش شرح داد (دوازده امامی، 1386).
1-4- گیاه شناسی رازیانه:
رازیانه گیاهی است علفی، معطر و چند ساله از تیره چتریانUmbelliferae با نام علمی Foeniculum vulgare که ارتفاع آن حدود 2 متر، ساقههای آن قائم، استوانه ای، منشعب و سبز رنگ است. ریشه غدهای، دوکی شکل و مستقیم، برگهای این گیاه متناوب با پهنک منقسم به قطعات نازک و نخی شکل، گلها زرد رنگ و مجتمع کوچک و منظم به صورت چتر مرکب است. شاخکهای چترهای آن بلند و شامل پایههای نامساوی است؛ به طوریکه تعداد آنها به 15 نیز میرسد. پهنای گل آذین چتری آن در حدود 15 سانتی متر است. گلهای این گیاه عسل دهندههای خوبی محسوب میشوند. میوه آن کوچک، دو فندقه به طول 6 تا 12 و عرض2 تا 4 میلی متر و دارای بوی معطر است)کمالی و همکاران،1380).

فرمانرو: گیاهان
دسته: گیاهان گلداررده: دولپهای
راسته: آپیالس
تیره: چتریان
سرده: رازیانه
گونه: F.vulgare
نام علمی: Foeniculum vulgare
1-5- اندام داروئی:
تمام اجزای رازیانه قابل استفاده است. از آن جمله شکوفهها و دانههای آنرا بلافاصله بعد از رسیدن و برگهای آنرا در تیرماه چیده و در سایه خشک میکنند و همچنین ریشه رازیانه را میتوان در اواخر پائیز برداشت نموده و خشک کرد.(سیکوتی و همکاران، 2008)
1-6- نیازهای اکولوژیکی:
رازیانه بیشتر بر روی شیبهای صخرهای و کوهستانی خشک، آهکی، آفتابگیر، قابل نفوذ و فاقد رطوبت زیاد میروید.
1-7- پراکنش جغرافیائی:
رازیانه گیاهی است مدیترانه ای، هوای گرم برای رشد و نمو آن مطلوب می باشد. به طور کلی کشت این گیاه در مناطق با هوای گرم (تابستان طولانی و زمستان بیش از اندازه سرد نداشته باشد) موفقیت آمیز است (دامژانویک و همکاران، 2005). این گیاه بومی نواحی مدیترانه و آسیا بوده، امروزه در جنوب فرانسه ، ایتالیا و سایر نقاط جهان کشت میشود. در ایران رازیانه به صورت خودرو در مناطقی مثل شمال، تهران، کرمان، کردستان، اصفهان و ... می توان یافت و در اکثر نقاط ایران قابل کشت است. جوانه زنی بذور در دمای 6-8 درجه سانتیگراد انجام میگیرد ولی درجه حرارت مطلوب برای جوانه زنی 16-65 درجه سانتی گراد میباشد. pH مناسب برای این گیاه 8/4 تا 8 است. خاکهای لومی رسی با مواد و عناصر غذائی و ترکیبات هوموسی کافی خاکهای مناسبی برای رویش این گیاه می باشد. دمای مطلوب در طول رویش و در طول زمان تشکیل میوه 20-22 درجه سانتی گراد است. در زمستانهای طولانی و بسیار سرد ریشههای گیاه دچار سرمازدگی میشوند. آبیاری در مراحلی از رشد، رویش اولیه، مرحله تشکیل ساقه و مرحله نمو گلها، تأثیر قابل توجهی بر کمیت و کیفیت مواد مؤثره این گیاه دارد.(باقری و همکاران، 1376)
در شکل زیر قسمتهای آنالیز میکرسکپی پودر رازیانه نشان داده شده است .

Tracheids Vittae Endosperm Endocarp Mesocarp
گرد رازیانه را از میوه های خشک شده گیاهی به نام فینکولوم ولگا را از تیره چتریان بدست می آورند . گردی است سبز مایل به زرد با بوی تند شبیه بوی انتول (معطر) ، مزه آن ابتدا تند و کمی شیرین سپس تلخ و کافوری می شود . در زیر میکرسکوپ شامل قسمتهای زیر می باشد :
الف- تکه هائی از پارانشیم حفره ای (سلولهای دندانه ای شکل) از قسمت مزوکارب ، زیاد و اختصاصی می باشد.
ب- تکه هائی از اپیدرم پوشش داخلی با سلولهای کف پوشش مانند همراه با پارانشیم تحتانی که در طرف راست تصویر قرار دارد و باقیمانده هائی از لوله های روغنی (تکه هائی از لوله های ترشحی شیزوشس که اطراف آن را سلولهای مخاطی احاطه نموده است) ، زیاد و اختصاصی می باشد.
پ- تکه هائی از بافت کلانشیم نزدیک آوندهای هدایت کننده با دیواره های سلولی قرمز مایل به قهوه ای زیاد و اختصاصی می باشد.
ت- قطرات زرد رنگ روغنی ، زیاد و اختصاصی نمی باشد.
ث- تکه هائی از اندوسپرم همراه با بلورهای ریز ستاره ای شکل اکسالات کلسیم ، شفاف ، دیواره های سلولی ضخیم ، خیلی زیاد ولی اختصاصی نبوده و چون در دانه های دیگر گیاهان چتریان نیز دیده میشود.
ج- تکه های شکسته شده از فیبرهای اسکرانشیم شده از کارپوفور (1) کم و اختصاصی نمی باشد.
توجه : این گرد باید فاقد تارو آوندهای بیش از 10 میلی میگرون قطر باشد. امکان مخلوط با گرد زیره نیز مشاهده است. (یاسن و همکاران، 2009)
1-8 - آفات و بیماریها:
رازیانه یک گیاه شته دوست می باشد و در شرایط مناسب به گیاه حمله می کند. آفات در طول رویش ممکن است خسارات سنگینی به رازیانه وارد کنند. خسارت عموماً از جانب سنهای لکه دار(Cygaeus) که متعلق به خانواده میریده(Miridae) هستند وارد می شود. همچنین یکی دیگر از آفات مهم رازیانه شته است. این حشرات با مکیدن شیره گیاه سبب ضعف آن و کاهش عملکرد می گردند برای مبارزه با سنها می توان از سم دیتریفون(Ditrifon). و یا وفاتوکس (Wefatox) برای مبارزه با شته ها می توان از شکارگرهای طبیعی مثل کفشدوزکها و یا سموم شیمیائی سیستماتیک مثل متاسیتوکس استفاده شود)داس و همکاران 2008)
1-9- مهمترین خاصیت درمانی و داروهای ساخته شده:
تسکین دردهای قاعدگی و ضد سرفه از مهمترین خواص داروئی این گیاه است که فرآورده های تولید شده از رازیانه نیز با خواص فراوان دارویی، التیام بخش بسیاری از بیماری ها از جمله سرفه و سرماخوردگی است. رازیانه، نوعی گیاه دارویی است که مصارف مختلفی دارد . تمام بخش های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می تواند منجر به ایجاد دانه های پوستی، مشکلات تنفسی وحالت تهوع گردد. این گیاه دارای طعم تند، تلخ و شیرین است و کمی به طعم نعنا شبیه است. مصرف رازیانه باعث افزایش شیرمادر و نیز کاهش وزن می شود. قابل توجه: مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود. رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین و مواد معدنی است: فیبر، منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین C ، B3 و غیره ویتامین C موجود در پیاز رازیانه، ضد باکتری بوده و برای سیستم ایمنی بدن بسیار مفید است. علاوه برآن، این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول ، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می کند. رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می شود و به این ترتیب فرد، دچار حمله قلبی نمی شود.این گیاه دارویی،سموم بدن راپاک می کند و بیماری التهاب دهان رااز بین می برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط آورش، مفید است. بخار حاصل از جوشاندن برگ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می دهد.مصرف دانه های رازیانه، باعث تسکین دل درد می شود و عمل هضم را آسان تر می کند، کرم روده کودکان را از بین می برد، باعث تقویت چشم می شود، حساسیت های چشم را از بین می برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(سیپوریدیس و تومیریدیس، 2003)
تمام بخش ‌های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه‌ های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می‌ تواند منجر به ایجاد دانه ‌های پوستی، مشکلات تنفسی و حالت تهوع گردد.
اما توجه داشته باشید که مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود.
1-10- پیاز رازیانه
رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین، مواد معدنی و فیبر است. منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین Cو B3 از این موارد می باشند.
این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می ‌کند .رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می‌ شود و به این ترتیب برای افرادی که دچار حمله قلبی می‌ شوند، مفید است.
این گیاه دارویی، سموم بدن را پاک می ‌کند و بیماری‌ التهاب دهان را از بین می ‌برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط‌ آورش، مفید است.(کوبوریس و واسیلاکاکیس، 2006)
1-11- دانه رازیانه
بخار حاصل از جوشاندن برگ‌ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می ‌دهد. مصرف دانه‌ های رازیانه، باعث تسکین دل درد می‌ شود، عمل هضم را آسان ‌تر می ‌کند، کرم روده کودکان را از بین می ‌برد، باعث تقویت چشم می ‌شود، حساسیت ‌های چشم را از بین می‌برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(باقری و همکاران،1376 و دانشور حسینی،1387)

1-12- نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان
کشت بافت سلول گیاهی، روشی است برای تکثیر گیاهان که از طریق آن میتوان تعداد زیادی گیاه تولید کرد. کشت بافت گیاهی گستره وسیعی را در بر میگیرد که شامل کشت پروتوپلاست، سلول، بافت و اندام گیاهی است. کشت بافت همچنین پیش نیاز مهندسی ژنتیک است زیرا از سلول تغییر یافته باید بتوان یک گیاه کامل به وجود آورد. کشت بافت بر مبنای سه توانایی اصلی گیاه استوار است :
*قدرت باززایی یا توانایی ارثی یک سلول گیاهی برای رشد و تبدیل شدن به گیاه کامل در صورت فراهم بودن شرایط محیطی و محرکهای مناسب، اگر چه به لحاظ تئوری توانایی باززایی در تمام سلولهای گیاهی وجود دارد ولی سلولهای مریستمی بهترین سلولهایی هستند که قادر به بروز این قدرت میباشند.
*عدم تمایز یا قابلیت برگشت سلولهای بالغ گیاهی به شرایط مریستمی و تولید یک نقطه رشد جدید که با تمایز مجدد یا قدرت سازماندهی و تشکیل اندام جدید ادامه مییابد.
* شایستگی یا قابلیت درون زاد یک سلول یا بافت مشخص، به رشد در مسیری ویژه (کانلی و تیان ، 2007 و تانگ و همکاران ، 2001).
کشت بافت به عنوان یک روش کاربردی در پیشرفت‌های کشاورزی نقش بارزی داشته است. مثلاً کشت تخمک منجر به تلاقی‌های بین گونه‌ها و حتی جنس‌های مختلف شده است و ریزازدیادی به افزایش سریع جمیعت از یک گیاه برتر منتهی گردیده است. از طرف دیگر، کشت بافت به تنهایی نمی‌تواند پیشرفت‌های سریع مورد نیاز برای اصلاح و بهبود محصولات را فراهم آورد. با این وجود، کشت‌بافت همراه با ژنتیک مولکولی، قابلیت بیشتری برای بهبود سریع محصولات را فراهم می‌آورد. در همان حال که تکنیک‌های ژنتیک مولکولی DNA ژن‌ها را دست‌ورزی می‌نماید، کشت سلول و بافت برای مهندسی ژنتیک ضروری خواهد بود زیرا اطلاعات ژنتیکی خارجی DNA به یک گیاه کامل وارد نمی‌شود بلکه به یک سلول وارد می‌شود. فناوری درون شیشه‌ای واسطه‌ای برای تبدیل تک سلول تغییریافته به یک گیاه کامل می‌باشد (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
ریزازدیادی به عنوان یکی از روش های نوین افزایش انبوه گیاهان به ویژه پایههای درختان میوه در چند دهه اخیر بیشتر مورد توجه بوده است. پایههای رویشی تولیدی غالبا عاری از آلودگی ، دارای خلوص ژنتیکی و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه هستند که برای تولید و احداث باغات یکدست و متراکم استفاده میشوند. استفاده از دورگههای بین گونهای به خصوص برای درختان میوه هستهدار در کشورهای پیشرفته بیشتر معمول شده است. از آنجایی که اساس احداث باغهای مکانیزه بر تولید نهالهای رویشی و یکسان استوار است لذا بررسی روشهای تکثیر رویشی مناسب به خصوص ریز ازدیادی برای تولید انبوه پایهها حائز اهمیت است. (سولوسوگلا، 2002)
اهمیت استفاده از روش کشت بافت گیاهی برای تکثیر گیاهان دارویی در حال افزایش بوده و این روش برای تکثیر بسیاری از گیاهان دارویی استفاده می شود. از جمله مزایای مهم تکثیر از طریق کشت بافت نسبت به روشهای دیگر، ایجاد گیاهان سالم، تکثیر در طول سال، احتیاج به مکان کم و هزینه کمتر است. در مراحل مختلف کشت بافت گیاهی جهت رسیدن به هدف، ممکن است از دما، نور، نوع ریزنمونه، زمان و یا محیط کشتهای مختلف با ترکیبات متفاوت استفاده شود. همچنین مدیریت آلودگی و مواد بازدارنده نیز از مسایل مهم کشت بافت است. بنابراین بدست آوردن بهترین روش برای هر گیاه از اهداف آزمایشات در این علم می باشد و این امر با تغییر فاکتورهای موثر در کشت بافت امکان پذیر میگردد. بهبود حتی چند درصدی در تولید گیاهچه در هر بار کشت میتواند در مقیاس سال برای تولید کننده از اهمیت اقتصادی زیادی برخوردار باشد.(شریفی و همکاران، 1389)
1-13- تاریخچه کشت بافت
در طول قرن 19، ایده تولید کالوس از قطعات ساقه و انتهای ریشه به واقعیت پیوست. کالوس عبارت است از یک توده سلولی از سلولهای در حال تقسیم فعال که تمایز نیافتهاند. بعد کالوس از جوانهها، قطعات ریشه و شاخساره نیز تهیه شد. برای اولین بار هامبرلت در سال 1902 واژه کشت بافت سلول را بکار برد. او تلاش کرد که سلولهای گیاهی جدا شده را بطور درون شیشهای بر روی یک محیط غذایی مصنوعی حاوی محلول Knop (شامل پپتین، آسپارژین، و ساکاروز) کشت کند. واژه کشت بافت میتواند برای هر کشت چند سلولی بر روی محیط غذایی بکار برده شود (شریفی و همکاران، 1388). تکنولوژی کشت بافت گیاهی، کاربردهای متفاوت و فراوانی دارد از آن جمله میتوان از ریزازدیادی که اساس صنعت تولید انبوه گیاهان است نام برد. پیشرفت مطالعه جنبههای متفاوت رشد و تمایز گیاهان در دهه 1960 و 1970 بسیار سریع بوده است. به کمک تکنیک کشت گیاهان مطالعه و تحقیق در زمینههای مختلف از جمله مورفولوژی، فیزیولوژی، بیوشیمی، بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک فراهم شده است. تکثیر سریع ارکیده از طریق کشت کورم اولیه توسط مورل (1960) منجر به تاسیس اولین صنعت تکثیر سریع ارکیده بر اساس کشت بافت شد. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشهای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه میشود، این تکنیک به عنوان یکی از شاخههای زیست فناوری، کاربرد گسترده ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت میشود. در این نوع کشت، شرایط به گونهای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشهای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلولها و بافتها میباشد (شریفی و همکاران، 1389).
1-14- مراحل تکنیک کشت بافت
از زمان تهیه ریز نمونه تا به دست آوردن گیاه جدید مراحلی وجود دارد که ابتدا شامل چهار مرحله شروع و برقراری کشت ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال به خاک بود (موراشیگ ، 1974) . بعدا دبرگ و مین یک مرحله به نام مرحله صفر یعنی مرحله انتخاب گیاه مادری و آماده سازی را ارائه نمودند. در نهایت امروزه برای ریز ازدیادی مراحل زیر را در نظر می گیرند که شامل پنج مرحله ی آمادگی ، آغازی ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال است. در هر یک از این مراحل ، شرایط باید به گونه ای فراهم گردد که امکان دستکاری رشد گیاه در جهت مورد علاقه فراهم گردد. اکثر این عوامل هم آنهایی هستند که رشد و نمو طبیعی گیاهان را تنظیم می کنند. در مرحله صفر یا همان آمادگی هدف به دست آوردن گیاهانی است که به آب و مواد غذایی و شرایط محیطی نظیر نور و درجه حرارت و.. دسترسی داشته و از نظر سلامتی مشکلی نداشته باشند و بتوان از آنها جهت تهیه ریز نمونه استفاده کرد. در مرحله بعدی نیز که مرحله آغازی نام دارد هدف انجام کشت های بدون آلودگی است که ریز نمونه در محیط کشت مستقر می شود.
مرحلهی صفر: مرحله پیش ازدیادی یا انتخاب و پیش تیمار گیاهان مناسب
در این مرحله گیاهان مادری که در شرایط گلخانه ای با کمترین میزان آلودگی هستند انتخاب می شوند. قبل از جمع آوری نمونههای گیاهی برای به حداقل رساندن میزان آلودگی باید گیاهان مادری با قارچ کشها و حشرهکشها سمپاشی شوند تا میزان آلودگی در کشت درون شیشه ای به حداقل برسد، کاهش آلودگی باعث رشد بهتر و تکثیر سریع تر نمونهها در محیط کشت میشود. کنترل آلودگیها به طور معمول با پیش تیمار گیاهان مادری شروع میشود.(دبرگ و مین، 1981)
مرحله ی 1 : مرحله ضد عفونی سطحی و استقرار ریز نمونهها از درخت مادری
اولین مرحله در ریز ازدیادی ضد عفونی سطحی ریز نمونهها می باشد. وقتی نمونهای سالم در شرایط استریل قرار میگیرد، میتواند به سرعت تکثیر شود. این مرحله حساسترین مرحله در ریز ازدیادی است چرا که اغلب نمونهها در این مرحله در بیشتر موارد به علت آلودگیهای میکروبی از بین میروند. در این مرحله ریز نمونهها که به صورت قطعات کوچک تقسیم شده اند با مواد شیمیایی مانند هیپوکلریت سدیم و اتیل الکل ضدعفونی سطحی و بعد از آن چندین بار با آب مقطر استریل آبشویی میکنند. بعد از یک دوره کوتاه 3 تا 5 روزه آلودگی ریزنمونهها در محیط کشت مشخص میشود و نمونههای آلوده حذف شده و نمونههای سالم واکشت میشوند. در مرحله ضد عفونی ریز نمونهها باید دقت شود غلظت مواد ضدعفونی و مدت زمان استفاده از آنها به اندازهای نباشد که به بافت ریز نمونهها صدمه زده و مرگ سلولی را سبب شده و باعث قهوهای شدن و از بین رفتن آنها شود. (جورج، 2008 )
مرحله 2: تکثیر و پرآوری ریز نمونهها
این مرحله که فاز تکثیر است، گیاهچههای حاصل از استقرار در محیط کشت مخصوص تکثیر میشوند. هدف اولیه در این مرحله تکثیر ریز نمونهها بدون از دست دادن ثبات ژنتیکی آنها است. واکشت نمونهها که می توانند به صورت، جوانههای جانبی و انتهایی، جنینهای سوماتیکی و دیگر ارگانها باشند، در محیط مخصوص تکثیر باعث افزایش تعداد نمونهها میشود. گاهی اوقات ضروری است که شاخههای تکثیر شده به محیط کشت دیگری برای طویل شدن منتقل شوند . طی واکشتهای متوالی مقدار مورد نیاز از اندام گیاهی تولید میشود. (موراشیگ ، 1974)
مرحله 3: ریشه دهی زیر شاخهها
شاخههای به دست آمده از مرحله دوم، در این مرحله برای تکمیل فرایند ریز ازدیادی باید ریشهدار شوند. بیشتر گیاهان در مرحله ریشه دهی نیاز به محیط کشتی با نصف عناصر ماکرو دارند. در این مرحله معمولا از تنظیم کنندههای رشد متفاوت از مرحله پرآوری استفاده میشود. برای موفقیت مرحله سازگاری و انتقال به خاک ، گیاهچههای دارای ساختمان ریشه مناسب و قوی ضروری است. این مرحله نیاز به کار زیاد دارد و غالبا گران است. بطوری که محاسبه شده که حدود 35 تا 75 % از کل هزینههای تولید را شامل میشود.(جورج، 1993)
مرحله 4: مرحله سازگاری به شرایط طبیعی
این مرحله آخرین مرحله از کشت درون شیشه ای است که نمونههای تکثیر شده برای انتقال به گلخانه آماده میشوند. نمونههای تکثیر شده در شرایط درون شیشهای ، تمایل به رشد انفرادی و انجام عمل فتوسنتز دارند. نمونهها به تدریج از شرایطی با رطوبت زیاد به رطوبت کم و از شدت نور به شدت نور زیاد و دمای محیطی متغیر منتقل میشوند. اگر نمونهها در محیط کشت جامد باشند، قبل از انتقال باید آگار چسبیده به اندامهای گیاهچه به آرامی توسط آب شسته شود و سپس در خاک مناسب در گلدانهای کوچک کشت شوند. نمونهها به تدریج میتوانند بعد از 3 تا 6 روز به محیط جدید با شرایط نوری طبیعی وارد شوند و بعد از آن گیاهان به مخلوط ماسه، پیت و یا کمپوست منتقل میشوند و به تدریج سازگار میگردند. آبیاری مرتب نمونهها (روزهای اول انتقال به خاک با نصف غلظت محیط کشت) و مبارزه با عوامل بیماری زا و آفات از ضروریات انتقال موفق است (جورج، 1993؛.اهلووالا، 2002).
1-15- انواع ترکیبات محیط کشت
برای انجام موفقیت آمیز کشت بافت لازم است که یک محیط متناسب با رشد گیاه با توجه به نیازهای روزانه آن که عاری از هر گونه آلودگی است تهیه گردد. برای این کار لازم است پژوهشگر با انواع نیازهای یک گیاه آشنایی داشته و بتواند این مواد را با هم ترکیب کرده و یک محیط عالی برای رشد نمونه خود آماده کند. به طور کلی مواد مورد استفاده در محیطها شامل مواد معدنی، ترکیبات آلی، مواد طبیعی و مواد کمکی میباشد که در زیر به طور مختصر در مورد هر کدام توضیحاتی داده خواهد شد.
مواد معدنی
شامل دو گروه ماکروالمنتها (ازت ، فسفر ، پتاسیم ، کلسیم ، منیزیوم و گوگرد) و میکروالمنتها (مس، روی، آهن، منگنز، کبالت، بر و ید) میباشد که به صورت نمک به محیط اضافه می شوند.
منبع هیدرات کربن
چون ریز نمونهها فاقد هیدرات کربن هستند و یا اگر کلروفیل هم داشته باشند، به علت تاریکی و کمبود دی اکسید کربن در محیط قادر به انجام فتوسنتز نیستند، لذا لازم است که ساکارز به عنوان منبع هیدرات کربن به محیط اضافه گردد. شکر از عوامل مهم و ضروری در هر محیط کشت غذایی میباشد و برای رشد و نمو سلولها ، بافتها ، اندام-ها و گیاهچهها ضروری است. وقتی یک ریز نمونه روی محیط غذایی قرار داده می شود. در ابتدا رنگ سبز خود را از دست می دهد و بنابراین نمیتواند غذای خود را فراهم کند چون قادر به فتوسنتز نیست. پس این سلولها باید به نحوی که با منبع خارجی انرژی کربنی، تغذیه شوند. ساکارز معمول ترین منبع انرژی کربن در کشت بافت است. به جز ساکارز ، منو ساکاریدهایی مثل گلوکز و فروکتوز که منابع قابل سوخت و ساز انرژی کربنی هستند میتواند به طور معنیدار ، رشد سلولهای گیاهی را نسبت به ساکارز افزایش دهند. (پیری و نظریان 1380) .
1-16- ویتامینها
ویتامینها نقش کاتالیزوری داشته و در گیاهان سنتز میشوند. در کشت بافت بسیاری از ویتامینها توسط
سلولهای در حال رشد و نمو سنتز میشوند اما مقادیر ساخته شده کمتر از مقادیر مورد نیاز است. از اینرو لازم است ویتامینهای ضروری را به مقدار مورد نیاز به محیط کشت اضافه نمود. ویتامینهای گروه B مانند تیامین، اسید نیکوتینیک، پیریدوکسین، و میواینوزیتول نسبت به بقیه بیشتر مورد نیاز هستند. از بین آنها تیامین نقش مهمتری دارد )پیری و نظریان، 1380).
1-17- اسیدهای آمینه
اسیدهای آمینه و آمینها می توانند اهمیت زیادی در ریختزایی داشته باشند. تمام فرمولهای اسید آمینه، فرم های طبیعی موجود در گیاه هستند این مواد میتوانند شاخهزایی یا ریشهزایی را افزایش دهند. آمینواسیدها هنگام کاهش نیتروژن نقش خود را ایفا میکنند. در صورت ناکافی بودن نیتروژن، مکمل نیتروژن آلی کمپلکس مانند کازئین هیدرولیزات) 5/5گرم بر لیتر( ممکن است افزوده شود. سایر مکملهای آلی عبارتند از شیر نارگیل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو. هرچند محیطهای کشت سنتتیک ترجیح داده میشوند و مکملهای آلی که طبیعت شیمیایی ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروری بکار میروند) جورج و همکاران، 2008) .
1-18- تنظیم کنندههای رشد
هورمونها موادی هستند که در یک بخش گیاه ساخته شده و از خلال بافتها حرکت کرده تا به فعالیت سلولها در بخش دیگری تاثیر بگذارد برای مثال سایتوکنین ساخته شده در ریشه به ساقه منتقل شده و سبب رشد ساقه میگردد. حال اگر رشد متوقف شود تحویل سایتوکنین کاهش یافته و رشد اندامهای هوایی کاهش مییابد. این مقدمه اهمیت هورمونها را مشخص میسازد ولی در کشت بافت هورمونهای زیر بیشتر مورد استفاده قرار میگیرند. این گروه شامل اکسین طبیعی مثل ایندول استیک اسید (IAA) و اکسین های مصنوعی نظیر ایندول بوتریک اسید (IBA) ، نفتالین استیک اسید (NAA) هستند که اکسین های مصنوعی فعال تر از اکسین طبیعی هستند. همچنین اکسین های مصنوعی به وسیله آنزیم های موجود در بافت های گیاهی تجزیه نمی شوند. اکسین معمولا شروع ریشه دهی و رشد کالوس را تحریک می کند ولی رشد ریشه و جوانه های بالینی جلوگیری می کند ، سبب طویل شدن و رشد سلولی و تقسیم سلولی نیز می شوند. در غلظت بالا باعث رشد ریشه های نابجا می شود و در غلظت کم سبب تشکیل ساقه نابجا می شود. (اربنوا و همکاران، 2002)
1-19- سایتوکنین :
کشف سایتوکنینها رابطه نزدیکی با کشت بافت دارد. در مرحله شروع کشت بافت گیاهی مشاهده شد که مالت، عصارههای نارگیل و مخمر، رشد و القای جوانههای درون شیشهای را رونق میبخشند (مشایخی، 1387). سایتوکنینها شامل سایتوکنینهای طبیعی 2ip و زآتین و سایتوکنین مصنوعی نظیر بنزیل آمینو پورین (BAP ) و کینتین هستند. مزیت انواع مصنوعی این هورمون، فعالیت بیولوژیکی بالا و ارزان بودن آنها نسبت به انواع طبیعی است. این هورمون باعث تورم بافتها شده و ازدیاد شاخه و تقسیم سلولی را تحریک کرده ولی از شروع ریشهدهی جلوگیری میکند. این هورمون در تحریک نمو جوانههای جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار اهمیت دارد. به علت پایدار بودن در برابر گرما این هورمون را میتوان قبل از اتوکلاو به محیط کشت اضافه کرد.(کرسا و همکاران، 2012)
1-20- اسید جیبر لیک :
این گروه تاکنون بیش از 100 ترکیب است که رایج ترین نوعی که در کشت بافت استفاده می شود ، GA3 است. ناپایدار در برابر گرما است بنابراین بعد از اتو کلاو و از طریق فیلتراسیون ضد عفونی شده و به محیط افزوده میشود. کاربرد این هورمون نیز طویل شدن ساقهها و رشد طولی میانگرهها است و از پدیده خواب جلوگیری کرده و آن را از بین میبرد. باید این نکته را یادآور شد که اگر میزان نسبت اکسین به سایتوکنین افزایش یابد ریشه زایی صورت میگیرد و اگر این نسبت کاهش یابد سبب ساقهزایی میشود و اگر بینابین باشد کالزایی افزایش پیدا می کند (معینی و کهریزی ، 1382).
1-21- آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل
آگار از رایجترین عوامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده میشود. آگار پلی ساکارید پیچیدهای است که از برخی گونههای نوعی جلبک به دست میآید. غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت و ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی بالای آن منجر به تنش آب در محیط میشود و غلظتهای کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله شده تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریز نمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر میشود. به علاوه کشت ریز نمونه روی محیط کشت مایع میتواند باعث شیشهای شدن کشت شود. تصور میشود آگار دارای توانایی جذب مواد است که این توانایی میتواند در حذف مواد زاید سلولی از محیط کشت به روش مشابه زغال فعال عمل نماید. همچنین این خاصیت میتواند مانع از جذب برخی مواد شیمیایی به بافت کشت شده شود. یکی از موادی که به شدت توسط آگار جذب میشود سیتوکینین است. بنابراین غلظت بیشتر آگار ، جذب سیتوکینین از محیط کشت را برای بافت مشکل میکند. متداولترین جایگزین آگار، ژل رایت است. این ماده یک پلی ساکارید پیچیده خارج سلولی است که توسط باکتری Pseudomonas elodea تولید میشود . ژل رایت نسبت به آگار دارای مواد معدنی آزاد و ناخالصیهای آلی کمتری است. البته دارای غلظتهای بالای پتاسیم و منیزیم میباشد. تنها مشکل ژل رایت این است که بعضی از کشتها در ژل رایت سریع تر از آگار ، شیشهای میشوند. اغلب ژل رایت را همراه با آگار و با نصف غلظت های مورد نیاز هر کدام به کار میبرند. به این وسیله از مزایای هر دو ماده استفاده میشود و معایب آنها نیز کاهش مییابد (باقری و همکاران 1383).
1-22- ترکیبات مورد استفاده در ضد عفونی مواد گیاهی
ضد عفونی یا استریلیزاسیون شیمیایی میتواند به روشهای مختلف انجام شود : (باقری و همکاران 1383 و باقری و صفاری 1376)
1- الکل (اتانل): برای ضد عفونی مواد گیاهی از الکل 70 درصد استفاده میشود ، زیرا الکل 96 درصد باعث دهیدراته شدن بافتها میشود. از الکل 96 درصد اغلب برای ضد عفونی ابزار و میز کار استفاده میشود.
2- هیپوکلریت سدیم (وایتکس): دارای 5 درصد ماده فعال است. معمولا از هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد استفاده می شود. چنانچه گیاهان به هیپوکلریت سدیم حساس باشند از هیپوکلریت کلسیم برای ضد عفونی استفاده میشود.
3- هیپو کلریت کلسیم: این ماده به صورت پودر است و میتوان آن را به خوبی در آب معمولی حل کرد و محلولی شفاف به دست آورد (اغلب صاف میشود). هیپوکلریت کلسیم نسبت به هیپوکلریت سدیم، آهستهتر وارد بافتهای گیاهی میشود.
4- کلرید جیوه: این ماده برای گیاه ، انسان و دام خیلی سمی است و غلظت 01/0 تا 05/0 درصد برای مدت 2 تا 12 دقیقه برای ضد عفونی به کار میرود.
1-23- استفاده از آنتی بیوتیکها در رفع آلودگیهای درون بافتی
آلودگیهای داخلی در کشت درون شیشهای درختان یکی از مشکلات بسیار جدی بوده و اغلب به علت وجود میکرو ارگانیسمهایی اتفاق میافتد که در داخل گیاه هستند و نمیتوان آنها را از طریق مواد ضد عفونی کننده خارجی از بین برد. اگر منشا آلودگی در داخل بافتهای گیاهی باشد، آلودگی معمولا هنگامی ظاهر میشود که محل آلودگی قطع شده و در هنگام واکشت امکان باز شدن و تماس با محیط کشت فراهم میشود. اغلب آلودگیهای داخلی بعد از چند واکشت آشکار میشوند. رشد ضعیف و یا نکروزه شدن بافتها، میتواند نشانه یک نوع آلودگی داخلی، مثلا به باکتری باشد به طور کلی دو راه برای مبارزه با این مسئله وجود دارد: (باقری و صفاری، 1376 و ذوالفقاری نسب، 1382).
1- کشت مریستم (چون سلول های ناحیه مریستم عاری از عوامل بیماریزا هستند)
2- اضافه کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت
اغلب پاتوژنهایی که برای گیاه مادری خطری ندارند وقتی در محیط کشت درون شیشهای قرار میگیرند، باعث ایجاد خسارت جدید و از بین رفتن مواد گیاهی میشوند. در رفع آلودگیهای داخلی گاهی استفاده از آنتیبیوتیکها مهمترین راهکار میباشد. اتوکلاو کردن آنتیبیوتیک و یا اضافه کردن آن در دمای بالا به محیط کشت باعث کاهش اثر آنتیبیوتیک میشود (الیویرا و همکاران، 2010(.
1-24- ضد عفونی محیط کشت
در بیشتر موارد محیطهای کشت با استفاده از اتو کلاو استریل میشوند و استریل در اتو کلاو توسط بخار آب انجام میشود. با قرار دادن اشیا یا مواد در معرض بخار تحت فشار در دمای 121 درجه سانتی گراد و در مدت 10 تا 30 دقیقه کلیه میکروارگانیسمها از بین میروند. موادی که امکان استریل خشک آنها وجود دارد (مثل لولههای آزمایش، فلاسکها، پتریدیشهای خالی ، کاغذ و ابزارکار) به مدت 2 تا 3 ساعت در دمای 180 درجه سانتیگراد به صورت خشک در آون استریل میشوند. برای استریل موادی که در ضمن اتو کلاو کردن به دلیل حساسیت به گرما ، خاصیت خود را از دست میدهند ، از فیلترهای غشایی استفاده می شود که از جنس استات سلولز یا نیترات سلولز ، با منافذی به قطر 22/0 تا 45/0 میکرون بوده و با به کار بردن آنها، میکروارگانیسمهایی که بزرگتر از قطر منافذ هستند، حذف میشوند (باقری و صفاری 1376 ؛ امین و همکاران 2009 ).
1-25- قهوهای شدن بافتهای گیاهی
قهوهای شدن بافتهای گیاهی و در نتیجه آن محیط کشت، از جمله مشکلاتی است که در اغلب کشتهای تک جوانهای در درختان میوه دیده میشود. این پدیده ارتباط با نوع رقم گونه گیاهی دارد و میزان قهوهای شدن در یک رقم، در فصول مختلف و بسته به سن گیاه مادری میتواند متفاوت باشد. قهوهای شدن اغلب در گونههای گیاهی که دارای مقدار زیادی تانن و یا دیگر انواع هیدروکسی فنلها هستند، رخ میدهد. ایجاد زخم در اثر جدا کردن بافتها باعث ایجاد پلی فنل اکسیداز میشود که این عامل اصلی اکسیداسیون ترکیبات فنلی است. آزاد شدن مواد فنلی موجب قهوهای شدن ریز نمونه و محیط کشت شده و باعث توقف رشد ریز نمونهها و یا مرگ آنها میشود. این قهوهای شدن بافتها یک پدیده خود کاتالیزوری است. بطوریکه ترکیبات فنلی آزاد شده باعث صدمه به بافت شده که این عمل باعث افزایش آزاد شدن ترکیبات فنلی میشوند (ایزد پناه، 1380 ؛ سیدهو، 2010).
قهوهای شدن و نکروزه شدن در ریز نمونهها ارتباط معنی داری با روشهای ضد عفونی دارد. نمونههای برگ دار به خاطر حساسیت زیاد به غلظتهای بالاتر مواد ضدعفونی، بیشتر از نمونههای بدون برگ قهوهای و نکروزه میشوند. در این میان دو ماده کلرید جیوه و نیترات نقره از بقیه مواد قویتر میباشند چرا که هر دو از فلزات سنگین بوده و دارای قدرت بالایی در واکنش با پروتئین دارند که سبب تقویت متابولیسم سلولی می شوند. در حالی که هیپو کلرید سدیم و کلسیم به خاطر درجه فعالیت کمتر، میزان خسارت وارد شده به ریز نمونهها در آن کمتر است. البته غلظتهای بالای این دو ماده نیز میتوانند باعث قهوهای شدن و نکروزه در ریز نمونهها شوند ) کمالی، 1378).
میری و همکاران (1382) در مطالعهای که بر روی بررسی کاهش اکسیداسیون فنلی و پرآوری پایههای پا کوتاه سیب انجام دادند، پیشنهاد کردند که نمونههای تازه کشت شده به مدت 6 روز در یخچال نگهداری شوند که این کار در جلوگیری از فنلی شدن بسیار موثر بود. در مرحله پر آوری ترکیب 2ip با کینتین نیز بهتر از بقیه تیمارها جواب داد:
راه حلهایی که برای کاهش فنلی شدن میتوان ارایه داد شامل :
-گرفتن ریز نمونه در زمانهای خاص که میزان ترکیبات فنلی حداقل باشد.
- در مورد سن ریز نمونه، ریز نمونههای حاصل از گیاهان نونهال کمتر از گیاهان بالغ قهوهای میشوند.
-قرار دادن ریز نمونهها در آب مقطر به مدت 3 ساعت قبل از کشت باعث کاهش مواد فنلی میشوند.
- استفاده از تیمارهای ضد اکسیداسیونی
- تکرار واکشتها در فاصله زمانی کوتاه باعث جلوگیری از انتقال مواد فنلی به سلولهای سالم میشود. حذف بخشهای قهوهای و یا تجدید محیط کشت باعث کاهش تجمع مواد فنلی میشوند که علاوه بر سمیت به دلیل خاصیت خود کاتالیزوری باعث ترشح بیشتر مواد فنلی میشوند (کمالی، 1374 ؛ میری و همکاران، 1382).
ذوالفقار نسب (1382) با بررسی بر روی کلروزه و نکروزه شدن بافتها نشان داد که نوع محیط کشت عامل مهمی در ایجاد نکروزه شدن و کلروزه شدن است. عواملی مثل رشد سریع گیاهچهها در محیطی مثل MS به دلیل وجود مقادیر زیادی از نیترات، تماس نوک برگها با دیواره ظروف کشت ، تجمع رطوبت به صورت قطره در انتهای برخی از برگها و واکشت کردن با فواصل طولانی و در نتیجه کمبود برخی عناصر غذایی از جمله عوامل موثر در کلروزه و نکروزه شدن انتهای برگها است. این در حالی است که در محیط WPM این مشکلات کمتر دیده شده است. کلسیم به عنوان عنصر مهمی در دیواره سلولی از تحرک کمتری در بافتهای گیاهی برخوردار است و حرکت آن تابع تعرق گیاه است. در شرایط درون شیشهای ، وقتی میزان رطوبت بالا باشد به علت تعرق کم ، جذب کلسیم پایین میآید و در نتیجه قهوهای شدن و مرده شدن بافتها به علت تخریب سلولها اتفاق میافتد.(حسین و همکاران، 2003)
1-26- روشهای ریزازدیادی
ریزازدیادی عبارت است از تکثیر درون شیشهای گیاه با استفاده از اندامها، بافتها، سلولها، پروتوپلاسم و غیره. اگر چه برخی منابع بیان داشتهاند که جهت ریزازدیادی میتوان از تکنیکهای کشت جوانه، نوک ریشه، برگها، رویان، پرچم و حتی سلول استفاده کرد ولی شناخته شدهترین معنی ریزازدیادی کشت جوانههای منفرد و شاخساره میباشد. از این رو معمولاً کشت شاخساره و ریزازدیادی مترادف هم بکاربرده میشود. کشت نوک شاخساره بطور وسیعی در کشاورزی، باغبانی و جنگل کاری استفاده میشود. (شریفی و همکاران، 1388). در این تحقیق با توجه به اینکه روش جنینزایی غیرجنسی و کشت جوانه انتخاب شده است به توضیح آنها خواهیم پرداخت:
1-27- جنین زایی غیر جنسی
جنینهای غیرجنسی یا مستقیما بر روی ریزنمونه ظاهر میشوند(جنین زایی مستقیم) یا غالبا از کشت کالوسها بوجود میآیند (جنین زایی غیرمستقیم). این روش از نظر حفظ ثبات ژنتیکی صددرصد تایید شده نیست، هر چند جنینزایی غیرجنسی در کشت سلولی جهت توسعه و پیشرفت تکنولوژی تولید انبوه بوسیله راکتورها و همچنین در تولید بذر سنتزی از طریق کپسوله کردن بسیار مفید واقع می شود. بنابراین، این روش زمانی که استاندارد خیلی بالایی در ثبات ژنتیکی مد نظر نیست میتواند مورد استفاده قرار بگیرد. سلولهای گیاهی دارای خاصیت توتی پوتنسی هستند یعنی میتوانند یک گیاه کامل جدید را تحت شرایط مطلوب تولید کنند. استوارد و همکارانش در امریکا و رینرت در آلمان تقریبا بطور همزمان برای اولین بار تشکیل جنین غیرجنسی در کشت سوسپانسیون سلولی هویج را در سال 59- 1958 گزارش کردند. این جنین های غیرجنسی در رشد و ساختار مشابه جنین های جنسی بودند(شکل 1-4).
755650top
شکل 1-4 مراحل رشد جنینهای جنسی و غیرجنسی
این جنینهای غیرجنسی از نظر مورفولوژیکی به ترتیب مراحل زیر را طی میکنند: کروی، قلبی و اژدری. از ظهور لپهها میتوان به تفاوت مرحله لپهای بالغ و جنین مرحله قلبی/ اژدری پی برد. در مرحله اژدری تمایز سلولی منجر به تشکیل مریستم ساقه و ریشه میشود. جنینزایی یک روند دو مرحلهای میباشد. اولین مرحله، القا جنینزایی و دومین مرحله رشد جنین میباشد که در نهایت منجر به جوانه زدن میشود. نیازهای القا جنین و رشد جنین متفاوت هستند بنابراین محیطهای متفاوتی برای هر مرحله بهکار میرود (مارتینز رویز و همکاران، 2002 ). چهار مرحله را توصیف می کند: القا، رشد اولیه، بلوغ جنین و جوانه زدن. این مراحل از نظر ساختار مورفولوژیکی و همچنین در نیازهای فیزیکی- شیمیایی تفاوت دارند.
1-28- کشت مریستم
مریستمها را بر اساس خصوصیاتی از جمله محل استقرار، منشاء، نوع بافتی که ایجاد میکنند، ساختمان سیتولوژیکی و سرانجام رشد و تمایز، تقسیم بندی میکنند. براساس محل استقرار، مریستمها را به سه گروه تقسیم بندی میکنند:
مریستمهای انتهائی که در رأس ساقه و یا نوک ریشه قرار دارند.
مریستمهای جانبی که به موازات سطح اندامِ محل استقرار خود، تمرکز مییابند.
مریستمهای بین سلولی یا مریستمهای بینابینی که در پهنه بافتهای دیگر مستقر میشوند (نجاحی، 1370).1-29- باززایی
باززایی گیاهان از یک سلول یا اندام گیاهی از قابلیت های کشت بافت است که با کشف هورمونهای گیاهی امکانپذیر گردید. توانایی باززایی گیاه از یک سلول منفرد برای دستورزی ژنتیکی موجودات حائز اهمیت است. در گیاهان امکان باززایی یک گیاه کامل از یک سلول منفرد وجود دارد و این نوعی تکثیر غیر جنسی در گیاهان محسوب میشود. علاوه بر این، کشت بافت برای مطالعات پایهای در سلولهای حیوانی و گیاهی و دستورزی میکروارگانیسمها حائز اهمیت میباشد.(شارما و همکاران، 2000)
1-30- باززایی گیاهان کشت شده
اغلب هدف نهایی هر نوع کشت سلولی، باززایی گیاهان مورد نظر است، برخی گیاهان به خوبی در شرایط درون شیشهای باززایی میشوند و برخی دیگر مشکل دارند. درصد باززایی در گیاهان بسته به گونه گیاه، شرایط محیط و ترکیبات هورمونی متفاوت است. باززایی به دو روش مستقیم و غیر مستقیم صورت میگیرد. در روش مستقیم ابتدا بافتهای مریستمی کشت شده و سپس از اندامزایی مستقیم (شاخهزایی و ریشهزایی) برای باززایی گیاهان استفاده میشود. در این نوع کشت، شاخههای فراوانی از بافت ریزنمونه بدون واسطه کالوس تولید میشود. در روش باززایی غیر مستقیم عموماً تولید گیاهان با واسطه کالوس صورت میگیرد. یعنی ابتدا بافت ریزنمونه وادار به تشکیل کالوس میشود و سپس از کالوس اندامزایی صورت میگیرد. مسیر دیگری برای باززایی گیاهان از کالوس، تولید اجسام شبه جنینی در بافت کالوس است که این فرایند جنینزایی سوماتیکی نامیده میشود. در صورتی که هورمون اکسین از محیط کشت حذف شود، برخی سلولهای کالوس به حالت مریستمی در آمده و تولید اجسام شبه جنینی را میکنند. این جنینها به علت اینکه از بافتهای سوماتیکی منشاء میگیرند، به عنوان جنینهای سوماتیکی شناخته میشوند. این جنینهای نابجا قابل انتقال به محیط مناسب بوده و گیاه کامل را تولید میکنند(شریفی و همکاران، 1389).
1-31- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشهای
به طور معمول 4 مرحله جهت تکثیر درون شیشهای گیاهان مدنظر است که شامل استقرار در محیط کشت، ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشتهای متوالی و در نهایت ریشهزایی گیاهچههای تولید شده و سازگار کردن آنها با شرایط گلخانه و بیرون می باشد
1-32- استقرار در محیط کشت
مرحله استقرار از مهمترین مراحل در طی ریزازدیادی می باشددر طی این مرحله، ریزنمونه ها گندزدایی شده و در محیط کشت های استریل و در شرایطی عاری از بیماری زا، کشت می شوند. از اهداف اولیه مرحله استقرار تولید درصد بالایی از ریزنمونههای عاری از آلودگی سطحی است. آلودگیهای درونی و ترشح ترکیبات فنلی از ریزنمونه ها،مرحله استقرار را مشکلساز می کند(استیکلن و اورابی،2005).
1-33- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشتهای متوالی
دومین مرحله از ریزازدیادی محسوب می شود که در آن ریزنمونهها تکثیر یافته و بر تعداد آنها افزوده می شود. بعد از عبور از مرحله استقرار، ریزنمونه ها باید به سمت شاخه زایی هدایت شوند، بنابراین با تغییرات هورمونی می توان به این امر نزدیک شد. همچنین محیط کشت می توان به همان صورت قبل باقی بماند یا اینکه تغییر کند که به نوع گیاه بستگی دارد ( سعادت و هنرتی ، 2002).
1-34- ریشهزایی گیاهچههای تولید شده
مرحله ریشهزایی بستگی زیادی به مرحله پرآوری دارد زیرا نمونه ها بایستی از نظر طول شاخه ها، سطح برگ و توانایی لازم برای شروع یک زندگی اتوتروف مناسب باشند، چرا که شاخساره هایی که در این مرحله ریشه دار می شوند به محیط بیرون انتقال داده خواهند شد. این مرحله نیز با ترکیبات هورمونی متفاوتی همراه است و معمولاً از غلظت سیتوکنین ها کاسته می شود(پراکسی و همکاران، 2005). همچنین ریشه زایی در شرایط درون شیشه ای دارای چندین مزیت است: از جمله این که در مدت ریشه زایی کمتر در معرض بیماری ها و تنشهای محیطی قرار می گیرد و در نتیجه ریشه هایی استریل و گیاهان عاری از بیماری تولید می شود. از معایب این روش می توان از زیادتر بودن قیمت نهال ها برای تولید در سطح تجاری و محدود بودن رشد ریشه ها به فضای داخل شیشه نام برد. در رابطه با فاز ریشهزایی، سعادت و هنری(2001) بالاترین درصد ریزشاخسارهای ریشهدار شده را با IBA در مقایسه با NAA بدست آوردند. آنها همچنـین پیشنهاد کردند که القاء ریشهزایی تحت شرایـط تاریکی(به مدت 9 روز) در حضور اکسین صـورت بگیرد، این عمـل ریشـهدار شدن ریز شاخـسارهها را تا 83% امکانپذیر مـیساخت. از طرف دیگر، سانچز-اولت (1996) نشان داد که راندمان ریشهزایی 85 درصدی از القاء ریزشاخسارهها در محیط کشت MS با عناصر اصلی رقیق شده تا 25% در تاریکی مطلق حاصل میشود. زمان القاء به غلظت اکسین بکار رفته بستگی دارد. برای غلظت 3 میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید حداقل 7 روز، در حالی که برای غلظت 5 میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید 3 روز بطول بی انجامد. وحدتی و همکاران (2004) نشان دادند که اختلاف سرعت ریشهزایی وابسته به نوع رقم استفاده شده است.
1-35- تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان در شرایط درون‌ شیشه‌ای
با ظهور بیوتکنولوژی، شاخه جدیدی از تحقیقات در عرصه متابولیت‌های ثانویه گیاهی شکل گرفته است که به بیوتکنولوژی متابولیت‌های ثانویه معروف است. این شاخه بیوتکنولوژی به تولید درون شیشه‌ای متابولیت‌های ثانویه گیاهی و همچنین دست‌ورزی مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه برای تغییر الگوی تولید متابولیت در یک گیاه و یا تولید یک فرآورده ثانویه جدید در آن می‌پردازد. از اواخر دهه 60 میلادی، فناوری کشت ‌بافت به عنوان ابزاری در جهت مطالعه و تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی معرفی شده است. برخی مزیت‎های تولید متابولیت‎های ثانویه از طریق کشت بافت شامل کنترل بهینه شرایط کشت، افزودن پیشسازهای مورد نیاز برای افزایش بازده و تولید متابولیت‎های ثانویه خاص می‎باشد ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Ramachadra2002" راماچادرا و راویشانکر، 2002). در این رابطه از روش‌های زیر برای تولید متابولیت‌های ثانویه استفاده شده است:
1-36- روش کشت کالوس
تولید متابولیت‌های با ارزش اغلب به بافت‌های تمایزیافته نظیر کرک‌های غده‌ای و مجاری رزینی بستگی دارد. این قبیل ترکیبات را به طور معمول نمی‌توان در کشت‌های سوسپانسیون سلولی القاء کرد. استفاده از کشت‌های کالوس به جای سوسپانسیون سلولی درختان در برخی موارد منجر به تشکیل مجاری و غده‌هایی می‌شود که فرآورده‌هایی چون ترپن‌ها و روغن‌های فرار در آنها تولید می‌شود. البته این کشت‌های کالوس دارای پتانسیل قابل توجهی در راستای تولید متابولیت‌های ثانویه هستند ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Yeoman1987" یومان، 1987).
1-37- روش کشت سوسپانسیون سلولی
استفاده از سیستم‌های کشت سلول گیاهی برای تولید متابولیت‌های ارزشمند، خصوصاً در صنعت مواد دارویی و غذایی ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Nickel1990" نیکل، 1990) ، عموماً یک فناوری مناسب محسوب شده و به سرعت در حال گسترش است (جدول 1-1). پیشرفت در زمینه کشت سلولی با استقرار موفق لاین‎های سلولی برخی از گیاهان دارویی که منتهی ‎به تولید درصد بالایی از ترکیبات ثانویه در شرایط کشت‎های سوسپانسیون سلولی می‌شوند، محقق می‌گردد، که این امر توسط برخی از محققان گزارش شده است ( HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Tripathi2003" تریپادی، 2003).
جدول 1-1. مقایسه مقدار تولید برخی ترکیبات دارویی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی با گیاه کامل
(اقتباس از HYPERLINK "file:///D:\Users\User\Desktop\New%20folder%20(2)\بچه%20ها\PAIAN%20NAMEHA\yasini\فصل%20اول%20یاسینی.docx" l "Misawa1997" میساوا، 1997)
گونه گیاهی نام فارسی گیاه ترکیب دارویی عملکرد (وزن خشک بر حسب درصد)
گیاه کشت سلولی
Lithospermum erythrorhizon سنگ دانه شیکونین 500/1 000/20
Morinda citrifolia توت هندی آنتراکینون‌ها 300/0 000/18
Catharanthus roseus پریوش آجمالیسین 300/0 000/1
Coleus blumei حسن یوسف رزمارینیک اسید 000/3 000/15

—d1505

2-8-4 مطالعه انجام شده برای بازیابی منگنز.............................................................................................................47
2-8-4-1 ترسیب منگنز و آهن...................................................................................................................................48
2-9 تولید منگنز الکترولیتی..............................................................................................................................................49
2-10 تولید منگنزدی اکسید الکترولیتی ......................................................................................................................50
2-11 تولید منگنز دی اکسید شیمیایی..........................................................................................................................50
فصل سوم.................................................................................................................. ........................................................51
معرفی مواد،روش ها و تجهیزات
3-1 مقدمه...................................................................................................................... ......................................................52
3-2 تهیه نمونه........................................................................................................................ ................................... ........ 52
3-3 شناسایی نمونه........................................................................................................................ .................................... 52
3-3-1 تجزیه شیمیایی نمونه................................. ................................. ................................ ................................ 52
3-3-2 مطالعات پراش پرتو ایکس(XRD) ...........................................................................................................53
3-3-3 مطالعات میکروسکوپی..................................................................................................................................53
3-3-4 تجزیه سرندی و تعیین دانه بندی و عیار کانسنگ منگنز......................................................................55
3-3-5 مطالعات درجه آزادی..........................................................................................................................................57
3-4 پرعیارسازی منگنز........................................................................................................................................................58
3-4-1 آزمایش پرعیارسازی با جیگ.........................................................................................................................58
3-4-2 آزمایش های پرعیارسازی با میزلرزان...........................................................................................................59
3-4-3 آزمایش های پرعیارسازی به روش مغناطیسی..........................................................................................59
3-4-4 انجام آزمایش های پرعیارسازی به روش فلوتاسیون.................................................................................60
3-4-5 روش آزمایش های پرعیارسازی به روش لیچینگ....................................................................................60
3-4-5-1 تئوری سینتیک لیچینگ....................................................................................................................61
الف- نفوذ از لایه مایع.....................................................................................................................................63
ب-نفوذ از میان خاکستر................................................................................................................................64
ج- واکنش شیمیایی........................................................................................................................................64
3-4-6 روش انجام آزمایش های سینتیک.....................................................................................................................66
3-4-7 نرم افزار طراحی آزمایش..................................................................................................................................... 66
3-4-8 روش انجام آزمایشها ........................................................................................................................................69
فصل چهارم........................................................................................................................................................................70
بحث و نتایج
4-1 مقدمه................................................................................................................................................................................71
4-2 آزمایش های جیگ........................................................................................................................................................71
4-3 نتایج آزمایش های میزلرزان.......................................................................................................................................72
4-4 نتایج آزمایش های پرعیار سازی به روش مغناطیسی...........................................................................................77
4-5 نتایج آزمایش های پرعیار سازی به روش فلوتاسیون............................................................................................80
4-6 نتایج آزمایش های پرعیار سازی به روش لیچینگ..............................................................................................82
الف) تعیین ماده کاهنده..................................................................................................................................................82
ب) تعیین عامل کنترل لیچینگ...................................................................................................................................83
4-6-1 طراحی آزمایش.................................................................................... ...........................................................86
4-6-1-1 آنالیز واریانس مدلها..............................................................................................................................88
4-7 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی............................................................................................................................91
4-7-1 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی منگنز........................................................................................91
4-7-2 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی آهن.............................................................................................96
4-7-3 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی سیلیس.....................................................................................99
4-8 بهینه سازی...................................................................................................................................................................99
فصل پنجم........................................................................................... ..........................................................................102
نتایح و پیشنهادات
5-1 مقدمه........................................................................................... ...............................................................................103
5-2 نتایج و پیشنهادات.....................................................................................................................................................103
مراجع.....................................................................................................................................................................................106
فهرست شکلها
عنوان......................................................................................صفحه
شکل1-1 دیاگرام پوربه منگنز ......................................................................................................................................6
شکل1-2 طرح شماتیک یک گرهک همبرگری شکل.............................................................................................13
شکل1-3 نحوهی توزیع ذخایر منگنز در دنیا..............................................................................................................17
شکل2-1 فلوشیت فرآیند بازیابی منگنز با استفاده از محلول لیچ.........................................................................28
شکل2-2 اثر مقدارSO2 بر بازیابی فلزات در کانه با عیار متوسط........................................................................31
شکل2-3 اثر مقدارSO2 بر بازیابی فلزات در کانه پر عیار.....................................................................................31
شکل2-4 اثر مقدارSO2 بر بازیابی فلزات در کانه کم عیار....................................................................................31
شکل 2-5 اندرکنش متغیرها بر بازیابی منگنز...........................................................................................................33
شکل2-6 تاثیر غلظتهای مختلف اسیدنیتریک........................................................................................................34
شکل2-7 تاثیر غلظتهای مختلف اسیداکسالیک......................................................................................................34
شکل2-8 تاثیر مقدار کاهنده بر نرخ لیچینگ منگنز.................................................................................................35
شکل2-9 اثر غلظت ملاس نیشکر بر بازیابی.................................................................................................................37
شکل2-10 اثر غلظت اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز..............................................................................................38
شکل2-11 اثر نسبت وزنی کانسنگ به کاهنده بر بازیابی منگنز..............................................................................38
شکل2-12 بازیابی منگنز بر حسب زمان در دماهای مختلف.....................................................................................38
شکل2-13 اثر غلظت اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز...............................................................................................41
شکل2-14 اثر غلظت هیدروژنپراکسید بر بازیابی منگنز............................................................................................41
شکل2-15 اثر غلظت کاهندههای متفاوت بر بازیابی منگنز........................................................................................42
شکل2-16 اثر غلظت اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز...............................................................................................42
شکل2-17 اثر غلظت اسیدهیدروکلریک بر بازیابی منگنز...........................................................................................43
شکل2-18 اثر غلظت هیدروژنپراکسید بر بازیابی منگنز...........................................................................................43
شکل2-19 بلوک دیاگرام تولید هیدرومتالورژیکی از محصولات فعال و غیرفعال.....................................................44
شکل2-20 تاثیر غلظت اسیدنیتریک بر بازیابی عناصر موجود در کانسنگ...............................................................45
شکل2-21 تاثیر غلظت ملاس بر بازیابی عناصر موجود در کانسنگ..........................................................................45
شکل2-22 تاثیر دما بر بازیابی عناصر موجود در کانسنگ............................................................................................45
شکل2-23 فلوشیت بازیابی منگنز و حذف آهن از محلول لیچ...................................................................................48
شکل2-24 دیاگرام Eh-pH برای سیستم منگنز-آهن-گوگرد.................................................................................49
شکل3-1 طیف EDX مربوط به کانی منگنزدار...........................................................................................................55
شکل3-2 طیف EDX مربوط به کانی حاوی منگنز-سیلیس-کلسیم.....................................................................56
شکل3-3 منحنی توزیع دانهبندی نمونه کانسنگ منگنز..............................................................................................58
شکل3-4 منحنی مربوط به توزیع تجمعی منگنز، آهن و سیلیس..............................................................................58
شکل3-5 منحنی مربوط به عیار منگنز، آهن و سیلیس................................................................................................58
شکل3-6 نمودار مراحل اجرای آزمایشهای پرعیارسازی..............................................................................................60
شکل3-7 نحوه ترکیب ذرات جامد......................................................................................................................................63
شکل3-8 واکنش ذره جامد با سیال اطراف آن طبق مدل هسته انقباظی.................................................................64
شکل3-9 پارامترهای محدودکننده نرخ واکنش در مدل هسته انقباظی....................................................................65

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

شکل4-1 نمودار بازیابی منگنز بر حسب زمان.................................................................................................................85
شکل4-2 نمودار تعیین عامل کنترل لیچینگ نفوذ........................................................................................................86
شکل4-3 نمودار آرنیوس.......................................................................................................................................................87
شکل4-4 اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی منگنز.........................................................................................................92
شکل4-5 نمودار کنتوری اثر متقابل درصدجامد و دما بر بازیابی منگنز....................................................................93
شکل4-6 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز................................................................94
شکل4-7 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیداکسالیک بر بازیابی منگنز....................................................................94
شکل4-8 اثر متقابل اسیدسولفوریک و دما بر بازیابی منگنز........................................................................................95
شکل4-9 اثر متقابل اسیداکسالیک و دما بر بازیابی منگنز.........................................................................................96
شکل4-10 اثر متقابل اسیداکسالیک و اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز..............................................................96
شکل4-11 اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی آهن......................................................................................................98
شکل4-12 نمودار کنتوری اثر متقابل درصدجامد و دما بر بازیابی آهن.................................................................98
شکل4-13 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیدسولفوریک بر بازیابی آهن...............................................................99
شکل4-14 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیداکسالیک بر بازیابی آهن...................................................................99
شکل4-15 اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی سیلیس................................................................................................100
فهرست جدولها
عنوان......................................................................................صفحه
جدول1-1 مشخصات ترکیبهای موجود در محصولات منگنز.........................................................................16
جدول3-1 آنالیز شیمیایی کامل نمونه برداشت شده..........................................................................................54
جدول3-2 نتایج تجزیه سرندی و تجزیه شیمیایی بخشهای مختلف ابعادی...............................................57
جدول3-3 معادلات سینتیک بر اساس مکانیسم مدل نفوذ................................................................................66
جدول3-4 معادلات سینتیک برای واکنشهای جامد-مایع.................................................................................67
جدول3-5 پارامترهای عملیاتی و سطوح آنها.........................................................................................................69
جدول3-6 آزمایشهای طراحی شده با استفاده از روش CCD.....................................................................70
جدول3-7 پارامترهای ثابت و مقادیر آنها در آزمایشهای لیچینگ احیایی...................................................71
جدول4-1 آزمایش جیگ بر روی دانه بندی(1000+3350-) میکرون..........................................................73
جدول4-2 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(1000-300+) میکرون........................................................74
جدول4-3 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(1000-300+) میکرون.........................................................75
جدول4-4 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(300-) میکرون.......................................................................76
جدول4-5 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(300-) میکرون......................................................................77
جدول4-6 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(300-) میکرون......................................................................78
جدول4-7 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(100-) میکرون.....................................................................79
جدول4-8 آزمایش مغناطیسی خشک بر روی محصول میانی دانه بندی(300-) میکرون.......................80
جدول4-9 آزمایش مغناطیسی بر روی دانه بندی(100-) میکرون................................................................81
جدول4-10 پرعیارسازی توسط فلوتاسیون مستقیم.........................................................................................84
جدول4-11 نتایج آزمایش سینتیک لیچینگ در معادله مدل نفوذ.................................................................86
جدول4-12 مقادیر لگاریتم Kدر دماهای متفاوت............................................................................................87
جدول4-13 نتایج حاصل از طراحی آزمایش........................................................................................................88
جدول4-14 نتایج آنالیز واریانس مربوط به مدلهای ارائه شده.........................................................................91
جدول4-15 مقادیر P و F برای پارامترهای عملیاتی و برهم کنش آنها.........................................................91
جدول4-16 شرایط بهینهسازی پیشنهادی توسط نرمافزار.................................................................................101
جدول4-17 مقادیر متغیرها در بهینهسازی پیشنهادی توسط نرمافزار.............................................................102
جدول4-18 نتایج آزمایش اعتبارسنجی شرایط بهینه..........................................................................................102
جدول4-19 نتایج آزمایشهای تعیین اثر دورهمزن در شرایط بهینه.................................................................102
مقدمه
هدف از فرآوری کانه منگنز تولید محصول با مشخصات موردنیاز در صنایع مصرف‌کننده است. به دلیل پایین بودن عیار منگنز در اکثر کانسارهای شناسایی ‌شده در ایران و نیاز به محصول با عیارهای بسیار بالا در اغلب صنایع مصرف‌کننده منگنز، به ‌کارگیری روش‌های مختلف پرعیارسازی برای تغلیظ سنگ استخراج‌ شده لازم و ضروری است. با توجه به کاهش ذخایر معدنی پرعیار فلزی، بالا بودن هزینه‌های معدنکاری و مقرون ‌به ‌صرفه نبودن معدنکاری در معادن فلزی با عیار پایین، استفاده از روشهایی که بتوانند فلزات ارزشمند را از منابعی با عیار کم و یا کانسنگ‌های سخت (که پرعیارسازی آن‌ها دارای پیچیدگی هست) تغلیظ کند، لازم و مفید خواهد بود.
کانسنگ منگنز استخراجی از معدن محمدآباد جیرفت، با عیار تقریبی 21 درصد، می‌تواند از منابع مهم قابل‌استفاده‌ی ذخایر سنگ منگنز در ایران باشد. در حال حاضر به دلیل پایین بودن عیار، ترکیب خاص کانی‌های منگنزدار و نوع درگیری آن‌ها با سایر کانی‌های باطله، سنگ معدن استخراجی از این معدن در صنایع مصرف‌کننده قابل‌استفاده نیست.
هدف از این تحقیق معرفی روشهایی کارآمد برای پرعیارسازی کانسنگ منگنز معدن محمدآباد جیرفت، امکان‌سنجی استفاده از روش لیچینگ در استحصال منگنز از کانه و دستیابی به مشخصات مورد نیاز در صنایع مصرف‌کننده است.
پرعیارسازی کانسنگ منگنز معمولاً با ترکیبی از روش‌ها شامل میز لرزان، جیگ، جدایش مغناطیسی شدت بالای خشک و تر، فلوتاسیون و تشویه کاهشی با استفاده از داروهای ویژه انجام می‌شود.
نمونهی معرف تهیه ‌شده، جهت انجام مطالعات شناسایی نمونه به‌طور کامل مورد تجزیه قرار گرفته و خصوصیات آن به طور دقیق بررسی شد. در مرحله بعد از شناسایی نمونه، بررسی پرعیارسازی کانسنگ منگنز معدن جیرفت به روش‌های ثقلی شامل: جیگ، میز لرزان، روش‌های مغناطیسی و سایر روش‌های فرآوری مواد معدنی مانند فلوتاسیون و لیچینگ انتخابی انجام میگیرد. در روش‌های مذکور، پارامترهای عملیاتی مؤثر در بازیابی منگنز مورد ارزیابی و بهینه‌سازی قرار میگیرند.
این تحقیق به‌منظور امکان‌سنجی پرعیارسازی و با نتیجهی حاصل که قابل ‌استفاده کردن سنگ استخراجی معدن منگنز محمدآباد جیرفت است، در مقیاس آزمایشگاهی انجام شده است. در فصل اول به کلیاتی در مورد منگنز و کانیهای منگنز پرداخته شده است. در فصل دوم ، با اشاره به مطالعات انجام شده توسط دیگر محققین، انواع روشهای فرآوری استحصال منگنز از کانسنگ منگنز معرفی شده است. فصل سوم این تحقیق شامل معرفی نمونه مورد آزمایش و مواد و تجهیزات به کار برده شده همچنین تشریح روش انجام تحقیق است. در فصل چهارم نتایج آزمایشها به همراه بحث در مورد نتایج آورده شده است. و در نهایت در فصل آخر نتیجه گیری و پیشنهادات موردنظر مطرح شده است.

فصل اول
منگنز و کانیهای منگنز
1-1 آشنایی
نام منگنز از واژه لاتین Magnes (Magnet)گرفته شده است که به خواص مغناطیسی پیرولوزیت (کانه اصلی منگنز) اشاره میکند. با نماد Mn، عدد اتمی 25، وزن اتمی94/54، وزن مخصوص 43/7 گرم بر سانتیمتر مکعب، سختی6 در مقیاس موس، جلای فلزی، شکننده و غیر قابل انعطاف، نقطه جوش 1962 درجه سانتیگراد و نقطه ذوب 1244 درجه سانتیگراد. منگنز در گروه 7 جدول تناوبی به عنوان فلز بوده و در دوره 4 قرار دارد. محتوای ایزوتوپی منگنز معمولاً با محتوای ایزوتوپی کروم تلفیق شده و در زمین شناسی ایزوتوپی به کار میرود. نسبتهای ایزوتوپی Mn-Cr شواهدی را از Al26 وPd107 به عنوان تاریخ آغاز بیستم خورشیدی تقویت میکند. تغییرات در نسبت های Cr53/Cr52 و Mn/Cr از انواع متئوریتها، نسبت اولیه Mn53/Mn55 را نشان میدهد که سیستم ایزوتوپی Mn-Cr را پیشنهاد میکند چند ظرفیتی بودن منگنز به دلیل به اشتراک گذاردن 7 الکترون در دو لایه خارجی، با توجه به توزیع 25 الکترونی منگنز، میباشد. شش ایزوتوپ پایدار منگنز Mn51، Mn52 ،Mn53،Mn54،Mn55 و Mn56 میباشند[1].
1-2خواص
خواص فیزیکی
منگنز فلزی به رنگ سفید، خاکستری - نقره ای با هاله مایل به صورتی است، که با فلز کروم در گروه ششم و با فلز آهن در گروه هشتم همجوار بوده و از نقطه نظر شیمیایی شباهتهای زیادی به آن دارد. با این وجود، از نظر خواص متالورژیکی منگنز تفاوتهایی با آهن و فلزات نزدیک به آن دارد. چرا که آهن، کبالت و نیکل خواص مفید فیزیکی خود را به عنوان یک فلز حفظ کرده و در اکثر آلیاژها به عنوان عنصر پایه عمل میکنند، درحالی که منگنزچنین نیست. علت عملکرد منگنز در این حالت این است که در شرایط عادی ترتیب قرارگیری اتمهای منگنز در ساختمان بلورین آن به گونهای است که منگنز معمولاً فلزی شکننده و غیرقابل انعطاف و شکل گیری می‌باشد. اما وقتی که منگنز با آهن (و فولاد)، آلومینیوم و سایر فلزات غیر آهنی تشکیل آلیاژ میدهد، باعث بهبود خواص فیزیکی آلیاژ می‌شود.
خواص شیمیایی
این فلز با اسید واکنش پذیری بالا و با آب به آهستگی تجزیه میشود. در ارتباط با دما منگنز به شکل‌های آلفا ، بتا و گاما دیده می‌شود. شکل‌های آلفا و بتا شکننده هستند. شکل گاما نرم و پایداراست و در صورتی که درجه حرارت پایین نگهداری نشود، سریعاً به شکل آلفا تبدیل می‌شود. دمای تغییر شکل الفا به بتا، بتا به گاما و گاما به الفا به ترتیب 720، 1100، 1236 و 1244 درجه سانتیگراد است.
1-3 کانی شناسی
منگنز در بسیاری از کانیهای موجود در پوسته زمین وجود دارد. علارغم این که بیش از 300 کانی حاوی منگنز شناسایی شدهاند، اما تعداد کانیهای منگنزدار دارای ارزش اقتصادی کمتر از 12 میباشد. مهمترین کانیهای اقتصادی منگنز عبارتند از: اکسیدها شامل کانیهای پیرولوزیت، پسیلوملان، هوسمانیت، براونیت، واد، فرانکلینیت، هیدروکسیدها (منگانیت)، کربناتها (رودوکروزیت)، سیلیکاتها (ردونیت) و سولفورها (آلاباندیت)[2].
1-4 ژئوشیمی
منگنز از نظر فراوانی، دوازدهمین عنصر فراوان در پوسته زمین است. کلارک منگنز در ترکیب پوسته جامد زمین 1/0% و در سنگهای مافیک و اولترامافیک تا 5/1% میرسد. کانیهای منگنز به صورت گسترده پراکنده شدهاند. این عنصر در طبیعت به صورت خالص تشکیل نمیشود و بیشتر به صورت اکسید، کربنات و سیلیکات وجود دارد. منگنز از لحاظ ژئو شیمیایی یک عنصر لیتوفیل قوی با اندکی خصوصیات کالکوفیل است.
منگنز در شرایط pH و Eh پائین (احیا) به دلیل پتانسیل یونی نسبتاً پائین، حلالیت بیشتری نسبت به آهن دارد و آسانتر از آهن از سنگ منشأ لیچ میشود، اما در pH و Eh بالا به دلیل تحرک بالا، ته نشینی آهن در ابتدا انجام میشود و سپس منگنز ته نشین میشود. چنانچه وقتی فعالیتهای آتشفشانی زیر دریایی به محیط آب وارد میشوند، در ابتدا آهن در فاصله نزدیک منشأ فعالیت آتش فشانی برجای گذاشته میشود و سپس منگنز به دلیل حلالیت (تحرک پذیری) بیشتر با فاصله زیادتری رسوب میکند. به عنوان مثال در بخش بالایی کانسارهای ماسیوسولفید (تیپ کوروکو)، آهن در بالای کانسار قرار میگیرد در حالی که منگنز در حاشیه آن تشکیل میشود. شکل1-1 محدوده پایداری یونهای منگنز را نشان میدهد که طبق آن پایداری Mn2+ در آبهای سطحی و دریاها به نسبت زیاد است.

شکل1-1-دیاگرام پوربه منگنز- دما 25 درجه سانتیگراد[3]
در شرایط عادی PH و Eh، ترکیبات کربناته و سیلیکاته منگنز رسوب میکنند. در شرایط اکسیدان قوی از پایداری منگنز کاسته میشود و Mn2+ به Mn4+ تبدیل شده و در نتیجه اکسید منگنز (پیرولوزیت) یا اشکال دیگر MnO2 رسوب میکنند. در شرایط احیا کننده، یونMn+2 به صورت محلول باقی میماند مگر این که این یون با مقدار کافی کربنات حل شده و یا با سیلیس ترکیب شود که در نتیجه رودوکروزیت (MnCO3) یا کانیهای سیلیکاته منگنزدار را تشکیل دهد. در محیط احیاکننده قوی نیز کانیهای آلاباندیت (MnS) یا منگانوزیت (MnO) شکل میگیرند. البته به نظر نمیرسد که محیط رسوبگذاری مناسبی برای آلاباندیت یا منگانوزیت (احیا کننده قوی) وجود داشته باشد. شرایط و محدوده تشکیل سولفید منگنز MnS بسیار محدود است. برخلاف آهن که در محیط احیایی بیشتر به صورت سولفید دیده میشود، منگنز به صورت اکسید و کربنات یافت میشود.
1-5 زمین شناسی اقتصادی
منگنز به صورت اکسید و کربنات در دنیا گسترش وسیعی دارد و کربنات آن غالباً با عناصر دیگری از قبیل کلسیم، منیزیم و آهن همراه است. ذخایر اکسید منگنز تقریباً خالص بوده و گروهی نیز حاوی مقادیر جزئی کبالت، نیکل، تنگستن، مس و باریم یا موادی نظیر رس، آهک، چرت و توف میباشند.
هیچ کانی مستقلی از منگنز در مراحل اصلی تبلور ماگمایی یافت نمیشود، لیکن تشکیل برخی از کانیهای منگنز در پگماتیتها و ذخایر پنوماتولیتی و هیدروترمال بعد از مرحله ماگمائی مشاهده شده است.
در سنگهای رسوبی نیز مینیمم فراوانی منگنز در ماسه سنگ 001/0 تا 01/0% و ماکزیمم آن در خاک سرخ پلاژیک اقیانوسی 17/0%، 68/0% و 86/0% اندازهگیری شده است. متوسط درصد منگنز در سنگهای رسوبی 056/0 % محاسبه شده است. انباشتگی درونزادی منگنز فاقد ارزش اقتصادی است، در حالی که کانسارهای عظیم آن در سنگهای رسوبی شناخته شده است و کانسارهای کوچک و بزرگ در سنگهای آتشفشانی ـ رسوبی و در سطح هوازده سنگهای دگرگونه تشکیل میشوند. کانسنگهای منگنز از نظر عیار منگنز به صورت زیر تقسیم بندی می‌شوند[5،4]:
• کانسنگ منگنز با منگنز بالاتر از ۳۵ درصد
• کانسنگ منگنز آهندار با منگنز ۲۰ تا ۳۵ درصد
• کانسنگ منگنز آهنی با منگنز بین ۱۰ تا ۲۰ درصد
• کانسنگ آهن منگنزدار با منگنز بین ۵ تا ۱۰ درصد
هر چند ذخائر منگنز ممکن است در طیف وسیعی از شرایط و تشکیلات زمین شناسی از پر کامبرین تاسنوزوئیک پیدا شوند، با این وجود ۷۰ درصد ذخائر شناخته شده در تشکیلات زمین شناسی سنوزوئیک وجود دارند و ۱۰ درصد نیز در سنگهای کامبرین یافت می‌شوند. وجود ذخائر مهم منگنز در سنگهای دوران مزوزئیک نادر است به جز در مورد ذخائر منطقه گروت آیلنت در کشور استرالیا و مولانگو در کشور مکزیک بزرگترین و اقتصادیترین ذخائر منگنز از نوع رسوبی بوده و به شکل تقریبا لایهای و گسترده در سطح یافت میشوند. مثالهای این نوع ذخایر وجود ذخائر غنی منگنز در کشورهای مراکش، نیکوپال اوکراین، چیاتورا گرجستان مورودواروکم برزیل و ماهاراشتای هندوستان هستند. انواع دیگری از ذخایر منگنز در ارتباط با تشکیلات رسوبی آهنی دوران پر کامبرین یافت شدهاند در این ذخائر منگنز به صورت کربنات و یا اکسید منگنز و معمولا با عیار کم تمرکز یافته است. مثالهای معروف این نوع ذخائر پست مازبورگ و کورومان در کشور آفریقای جنوبی و ماتوگراس برزیل هستند. نظیر ذخایر لاتریتی آهن، بوکسیت و نیکل، ذخایر بر جای منگنز نیز تحت شرایط مناطق حاره دچار هوازدگی شده و این امر منجر به غنیتر شدن کانسار و تبدیل کانی‌های منگنزدار کم عیار به کانی‌های پرعیارتری نظیر پیرولوزیت و کریپتوملان و منگانیت میشود. مثالهای بارز این نوع ذخایر در کشورهای برزیل منطقه آماپا گابن منطقه مداندا،‌ غنا، استرالیا و هندوستان وجود دارند.
1-5-1 تقسیم بندی کانسارهای منگنز (پارک و مک دیارمید ۱۹۷۵)
1-5-1-1 کانسارهای همراه با توف ها و رسوبات آواری مرتبط با مواد آتشفشانی (نوع آتش فشانی – رسوبی):
این گروه از نظر اقتصادی ارزش بیشتری دارند به عنوان مثال میتوان کانسارهای پونوپو درکوبا، دره رودخانه الکی در شیلی و کانسار منگنز ونارچ قم نام برد.
1-5-1-2 کانسارهای مستقل از فعالیتهای آتشفشانی:
مانند کانسار نیکوپول در اکراین.
1-5-1-3 کانسارهای همراه با کانسارهای آهن لایهای
در ذخایر منگنز، منگنز به دو صورت Mn+4 و Mn2+ واکنش میدهد. منگنزهای موجود در منطقه هیپوژن اغلب دو ظرفیتی بوده و به صورت انواع کانیهای کربناته و سیلیکاته ظاهر میشوند. منگنز دو ظرفیتی نسبتاً محلول و به شدت متحرک است. در منطقه سوپرژن، منگنزهای منتقل شده از منطقه هیپوژن به صورت اکسیدهای چهار ظرفیتی که در منطقه سوپرژن پایدارترند، رسوب میکنند.
بیشتر تمرکزهای اولیه منگنز که تشکیل کانسارهای مهم و اقتصادی منگنز را میدهند و یا انواع دیگر که حاصل فرآیندهای ثانویه هستند، همگی منشأ رسوبی دارند و در این ارتباط اکثر طبقهبندیها مبتنی بر شرایط منطقه رسوبگذاری و نحوه تمرکز منگنز میباشد[6].
رایجترین طبقهبندیها کانسارهای منگنز را به گروههای رسوبی، گرمابی، دگرگونی و سوپرژن تقسیم بندی میکنند.
1-5-2 تقسیم بندی کانسارهای منگنز ( گیلبرت و پارک ۱۹۷۷ )
1-5-2-1 کانسارهای رسوبی منگنز
قسمت اعظم منگنز دنیا از کانسارهای منگنز رسوبی به دست میآید. شوروی سابق یکی از اصلیترین تولیدکنندگان منگنز جهان به شمار میآید که با تولید ۹۰۱ میلیون تن در سال ۱۹۸۹ نزدیک به ۴۱% از کل تولید جهان را به خود اختصاص داده است. در حدود ۷۵% از منابع منگنز کشف شده (در خشکی) در شوروی سابق در حوضه نیکوپول در اوکراین و مابقی در حوضههای چیاتورا در گرجستان واقع شده است.
کانسارهای رسوبی براساس منشأ منگنز به ۲ زیر گروه تقسیم میشوند:
1-5-2-2 کانسارهای رسوبی – آتشفشانی
در این نوع کانسارها منشأ منگنز درونی و عمدتاً آتشفشانهای زیر دریایی میباشند. این نوع کانسارها در مناطقی به وجود آمدهاند که فعالیتهای شدید آتش فشانی زیردریایی وجود داشته باشد. این کانسارها یا همراه با سنگهای تراکی ریولیت و یا همراه با گرینستون و مقادیری از سنگها و کانههای رسوبی هستند. معمولاً کانسارهای آهن ـ منگنز محدود به کمپلکسهای دیاباز ـ پورفیری یا کوارتز ـ کراتوفیری هستند و در نزدیکی مراکز فعالیت آتشفشانی و یا در فاصلهای از آن در بین لایههایی از مواد آذرآواری قرار دارند. این کانسارها از تغییرات کانسارهای رسوبی با منشأ گرمابی در تودههای نفوذی کم عمق تشکیل شدهاند.
کانسارهای این گروه به وسیله ترکیب براونیت، هوسمانیت و رودوکروزیت از کانههای اولیه منگنز و با حضور کانیهای پسیلوملان ـ وناردیت در پوستههای هوازده، قابل تشخیص هستند و شکل کانسار به صورت لایهای است. این کانسارها لایههایی با ضخامت ۱۰-۱ متر و ۵۵ ـ ۴۰% منگنز، کمتر از ۱۰% سیلیس و ۰۶/۰-۰۳/۰% فسفر تشکیل میشوند.
این کانسارها در مناطقی که فعالیتهای آتشفشانی شدید است، ذخیرهای نسبتاً کوچک دارند. کانسار قزاقستان روسیه و کوست رینج در آمریکا نمونهای از این کانسار است[6].
1-5-2-3 کانسارهای رسوبی – غیر آتشفشانی
در این کانسارها منشأ منگنز فرآیندهای بیرونی مانند هوازدگی سنگهای سطحی تأثیر دارد. این کانسارها مجموعه ذخایر منگنز و دیگر عناصری را که عمدتاً به وسیله آبهای سطحی و زیر زمینی از مناطق هوازده خشکی به حوضههای آبی حمل میشوند را شامل میشود. این کانسارها یا همراه با رس و ماسه سنگ گلوکونیتی و یا همراه با کربناتها میباشد.
طی فرآیندهای غنیسازی، دو عنصر آهن و منگنز در مراحل مختلف مانند جدا شدن از سنگهای منبع، حمل و تهنشینی و مراحل دیاژنز از یکدیگر تفکیک میشوند و بدین ترتیب منجر به تشکیل ذخایری با نسبت بالای آهن و منگنز میگردند. با توجه بر این که حلالیت منگنز در بعضی مقادیر PH و Eh اسیدی به طور قابل توجهی از آهن و آلومینیوم بیشتر است، بسته به طبیعت فرآیند هوازدگی، آهن و منگنز ممکن است به طور یکسان تا ترجیحاً منگنز، از سنگهای منبع جدا شده باشند. هوازدگی پوسته بازالتی اقیانوسی به وسیله آب دریا در درجه حرارت پائین ممکن است منجر به حل شدن و ته نشینی اکسیدهای منگنز شود. این کانسارها ۷۵% ذخایر شناخته شده جهان را شامل میشوند.
شکل کانسار به صورت لایهای و عدسی میباشد. و بزرگترین ذخیره منگنز جهان نیکوپول در اوکراین را شامل میشوند. کانسارهای مهم منگنز به طور عمده در محدوده زمانی تشکیل شدهاند که میزان اکسیژن آزاد کاهش داشته است. کانسارهای کشف شده اکثراً متعلق به اوایل پالئوزوئیک، ژوراسیک و اواسط کرتاسه هستند. همراه کانسارهای آهن رسوبی لایهای، مقداری منگنز نیز یافت میشود.
کانسار منگنز نیکوپول واقع در شوروی سابق بزرگترین ذخیره منگنز دنیا محسوب میگردد. این کانسار در الیگوسن تشکیل شده است. این کانسار که از نوع کانسارهای رسوبی منگنز است، در سنگ میزبان کربناته قرار دارد. استراتیگرافی منطقه از پایین به طرف بالا شامل: پی سنگ کریستالین، پی سنگ هوازده، ماسه سنگ و رس، سیلتستون، ماسه سنگ گلاکونیت، لایه منگنزدار، رسهای سبز تا خاکستری، مارن و آهک است.
لایه منگنز شامل سه رخساره اکسید، مخلوط اکسید – کربنات و کربنات است، که کربناتها در حاشیه حوضه رسوبی تشکیل شده اند. رنج منگنز از ساحل به اعماق عبارتند از:
رخساره کربناته(رودوکروزیت منگانو کلسیت) اکسیدی(پیرولوزیت پسیلوملان)
محیط حاشیه حوضه رسوبی یا ساحلی ( محیط عمیق) افق منگنزدار ۲ تا ۳ متر ضخامت، ۲۵ کیلومتر عرض و ۱۵۰ کیلومتر طول دارد. رخساره اکسید حدود ۲۵ درصد ذخیره را تشکیل میدهد. عیار منگنز ۱۵ تا ۲۵ درصد است. منگنز از سنگهای مافیکی اسپلیتی کریستالین منشأ گرفته است. بافت ذخیره از نوع اُالیتی، پیزولیتی، لامیناسیون و جانشینی صدفها است. کانسارهای منگنز در کربناتها در هندوستان، برزیل و مراکش کشف شده است. منشأ منگنز به طور عمده سنگهای آتشفشانی است[6].
1-5-2-4 کانسارهای گرمابی منگنز
این کانسارها به صورت رگهای میباشد و کانیهای اقتصادی آن عمدتاً رودوکروزیت و پیرولوزیت میباشد. چشمههای آب گرم در کانسارهای موجود در قارهها و پیدایش آنها در مناطق فعال کف دریاها مثالهای جالبی از تشکیل کانیهای اکسید منگنز از سیالات هیپوژن هستند. با مقایسه ترکیب کانسارهای منگنز در چشمههای آب گرم امروزی و کانیهای منگنز رگهای هیپوژن قدیمی تشابه بین آنها به خوبی روشن میشود. در ذخایر گرمابی یک نوع پراکندگی ناحیهای مربوط به کانیهای منگنز و سایر فلزات مشاهده شده است. چشمه‌های آب گرم در کانسارهای موجود در خشکی‌ها و پیدایش آنها در مناطق فعال کف دریاها مثالهای جالبی از تشکیل کانیهای اکسید منگنز از سیالات هیپوژن هستند. با مقایسه ترکیب کانسارهای منگنز در چشمه‌های آب گرم امروزی و کانیهای منگنز رگه‌های هیپوژن قدیمی، تشابه بین آنها به خوبی روشن می‌شود. در ذخایر گرمایی یک نوع پراکندگی ناحیهای مربوط به کانیهای منگنز و سایر فلزات مشاهده شده است. در عمیقترین بخشها تنها کانیهای منگنز دو ظرفیتی (رودوکروزیت، رودونیت، تفروئیت و آلاباندیت) همراه با سولفورهای فلزات پایه (Pb, Zn, Cu) و کانسارهای طلا- نقره تشکیل میشود. با بالا آمدن محلولهای هیپوژن به طرف سطح زمین در مناطق فوقانی و امتزاج آن با نزولات اکسیژندار پائین رو، گیبسیت و براونیت که اکسیدهای با ظرفیت کم هستند و کریپتوملان، پسیلوملان، پیرولوزیت و کرونادیت که اکسیدهای با ظرفیت زیاد هستند، به صورت تابعی از میزان اکسیژن و درجه حرارت تشکیل میشوند. مانند کانسار منگنز بیوت (آمریکا) [6].
1-5-2-5 کانسارهای دگرگونی منگنز
کانسارهای دگرگونی حاوی کانیهای فراوان منگنز به تعداد زیادی یافت میشود اما تنها تعداد کمی از این کانسارها و عمدتاً آنهایی که دارای کانیهای براونیت، هوسمانیت و بیگسبیت هستند، اهمیت محلی دارند و نظر کانسار به صورت لایهای است. کانسارهای دگرگونی منگنز در ارتباط با سنگهای سیلیکاته حاوی منگنز در دوره پروتروزوئیک مانند گاندیتها و کودوریتها میباشند. گاندیتها از کوارتز، اسپسارتین، براونیت، هوسمانیت و رودوکروزیت تشکیل شدهاند و کودوریتها از فلدسپات پتاسیک، اسپسارتین و آپاتیت تشکیل یافتهاند. اینها در بین لایه‌های از مرمرها، کوارتزیت‌ها و شیستها قرار دارند. گاندیت‌ها و کوردوریت‌ها در مناطق زیادی با صدها کیلومتر مربع مساحت پراکنده هستند. طول ذخایر منگنزدار از ۳ تا ۸ کیلومتر و ضخامت آنها از ۳ تا ۶۰ متر متغیر میباشد. متوسط میزان منگنز در آنها ۱۰ تا ۲۰ درصد است. بزرگترین کانسارهای شناخته شده از این نوع در هند و برزیل وجود دارند. مانند کانسار منگنز پُست ماسبرگ در آفریقای جنوبی.
براونیت کانی مشخصهی کانسارهای دگرگونی ضعیف است، در دگرگونی شدید کانی بیگسبیت از تحول براونیت و هماتیت تشکیل میگردد و همراه آن هولاندیت، هوسمانیت و ژاکوبسیت نیز ظاهر میشوند. هولاندیت یک کانی هیپوژن است و از طریق دگرگونی مجاورتی و ناحیهای تشکیل میشود. بسیاری از کانسارهای رسوبی منگنز، متعاقباً به وسیله دگرگونی حرارتی و مجاورتی با شدتهای متفاوت تغییر پیدا میکنند و این امر باعث تغییر کانیشناسی و بافت کانسارهای قبلی میگردد، اما نقشی در تمرکز آنها ایفا نمیکند. در کانسنگهای اکسیدی دگرگون شده منگنز، براونیت و بیگسبیت بسته به حضور سیلیس، آهن و … و نیز حرارت و اکسیژن به تنهایی یا با هم تشکیل میشوند[6].
1-5-2-6 کانسارهای منگنز تجزیهای یا سوپرژن
فرآیند تشکیل این کانسارها شامل تجزیه عناصر غیر از منگنز در سنگ مادر توسط آبهای سطحی و زیرزمینی است. این فرآیند باعث متمرکز شدن مواد باقیمانده و یا تجزیه و تهنشینی مجدد منگنز در پوسته هوازده نزدیک سطح می‌شود. اکسیداسیون سوپرژن برجا و غنیسازی سنگهای منگنزدار، به خصوص در سنگهای کربناته، یا تحرک مجدد کانسارهای منگنز قبلی در جریان هوازدگی منجر به تشکیل ذخایر پرعیار و اقتصادی میگردد. سنگ مادر این نوع کانسارها باید دارای درصدکانی منگنز ( ۵ تا ۱۰ درصد ) باشد. هوازدگی در مناطق گرمسیری معمولا منجر به افزایش عیار بیش از ۵ الی ۶ درصد نمیشود. اگر اکسیداسون شدید و فراگیر باشد، پیرولوزیت و یاکریپتوملان (بسته به تمرکز پتاسیم) مستقیما از رودوکروزیت یا پیروکروزیت تشکیل می‌شود. چنانچه اکسیداسیون محدود و دارای تغییراتی از بالا به طرف پایین سطح باشد، فازهای مختلف معرف حالتهای اکسیداسیون متفاوت تقریبا به صورت زیر می‌باشد[6].
رودوکروزیت هوسمانیت منگانیت بیرنسیت نسوتیت پیرولوزیت و کریپتوملان
همانطوری که تحرک آهن و آلومنیوم به تشکیل لاتریتهای آهندار و بوکسیت منجر میشود، منگنز نیز میتواند در طول هوازدگی شیمیایی تشکیل ذخایر بازماندی منگنز با عیار بالا را بدهد. در مرحلهی اصلی تبلور ماگما به دلیل قرار گرفتن منگنز در کانیهای آهن و منیزیمدار، هیچ کانی مستقلی از منگنز تشکیل نمیشود و کانیهای منگنزدار هوازده شده و باعث تشکیل ذخایر اقتصادی منگنز میشوند که به صورت پوشش بر روی سنگهای حاوی منگنز وجود دارد. کانیهای اقتصادی این نوع شامل پسیلوملان، پیرولوسیت و منگانیت میباشد[6].
در مورد ذخایر بازماندی منگنز نیز مانند بوکسیت ها، آب و هوا ـ زهکشی ـ ماهیت سنگ مادر از عوامل تعیین کننده تمرکز ذخیره میباشند. سنگ مادری که منشأ ذخایر بازماندی هستند باید به قدر کافی غنی از منگنز باشند، به عنوان مثال ۱۰% منگنز. این نوع کانسارهای منگنز از هوازدگی شیمیایی سنگهای کربنات منگنزدار و سنگهای سیلیکات ـ کربنات حاوی منگنز تشکیل میشوند. مهمترین ذخایر منگنز بازماندی در غرب آفریقا (گابون)، آفریقای جنوبی، برزیل، هند و ونزوئلا و کانادا شناخته شدهاند[6].
1-5-2-7 گرهکهای (ندول های) منگنز
بزرگترین منابع منگنز در کف اقیانوسها و دریاچههای عهد حاضر وجود دارد که در آن کانسارهای منگنز و آهن به صورت گرهک و کنکرسیونهای نامنظم یافت میشوند (شکل 1-2). قطر گرهکها از ۱ میلیمتر تا ۲۵ سانتیمتر متغیر است و گاهی به یک متر میرسد ولیکن بیشترین پراکندگی مربوط به قطرهای ۷-۳ سانتیمتر است. نودولها معمولا ًبه شکل کروی، بیضوی، عدسی مانند و صفحهای است. گرهکها حاوی ۲۰ تا ۳۰ درصد اکسیدهای منگنز و مقداری آهن میباشند و جمع مقادیر کبالت، نیکل و مس در آنها ۲ تا ۳ درصد میباشد. گرهکها حاوی مقادیری تیتانیوم، وانادیوم و مولیبدن نیز می باشند. میزان ذخیره گرهک های منگنز قابل بازیابی ۵۰ بیلیون تا یک تریلیون تن تخمین زده شده است. سرعت رشد گرهکها یک میلیمتر در هر یک میلیون سال است. گرهکهای منگنز، پوششی که ضخامت آن به اندازه ضخامت یک گرهک میباشد را در کف اقیانوس تشکیل میدهند. در مورد منشأ گرهکها نظریههای مختلفی وجود دارند. امروزه در ایالات متحده آمریکا، آلمان و ژاپن که فاقد ذخایر بزرگ منگنز در خشکی هستند، استخراج نودولهای منگنز- آهن از کف اقیانوسهای آرام و اطلس در اعماق بیش از ۷ کیلومتری را توسط کشتیهای عظیم اکتشافی که عمل لیچینگ (هیدرومتالورژی)، گرم کردن / ذوب (پیرومتالورژی) یا ترکیبی از هر دو را انجام میدهند، آغاز شده است. نودولهای استخراجی حاوی ۳۰ – ۲۵% منگنز، ۱۲- ۱۰% آهن، ۲-۱% نیکل، ۵/۱- ۳/۰ % کبالت و ۵/۱-۱ % مس هستند. تمرکز این نودولها بر حسب تولید در سطح، حدود ۲۰ – ۱۵ کیلوگرم بر متر مربع است[6].
شکل 1- 2- طرح شماتیک یک گرهک همبرگری شکل
میزان ذخیره منگنز بین زون گسله کلاریون و کلیپرتون در حدود ۱۰۶×۲ تن با عیار ۲۵% منگنز، ۳/۱ % نیکل، ۱% مس، ۲۲% کبالت و ۵% مولیبدن تعیین شده است. میانگین منگنز در نودولها ۲۴% است که در مقایسه با میانگین منگنز تودههای معدنی که ۵۵% – ۳۵ است، از نظر اقتصادی به عنوان منبع منگنز پیشنهاد نمیشوند اما آنها حاوی ۱۴% Fe = ، ۱%Cu =، ۱% Ni = و ۲۵/۰% Co = هستند.
1-5-2-8 منگنز نقطهای
دندریتها یا شجرههای پیرولوسیت (MnO2) بر روی سطح شکستگی بسیاری از سنگها قابل مشاهده میباشند. لیکن در سنگهایی که مقدار مس درصد چند صد پیپیام است، به جای تشکیل (دندریت منگنز)، منگنز نقطهای تشکیل میشود.
1-6 اکتشاف وارزیابی ذخایر منگنز
اکتشاف و ارزیابی ذخایر منگنز نسبت به بسیاری از مواد معدنی دیگر مشکلتر است. این کانسارها معمولاً کوچک و به صورت پراکنده هستند و روشهای ژئوفیزیکی گران قیمت برای اکتشاف این تودههای کانساری مقرون به صرفه نیست.
برخلاف روشهای ژئوفیزیکی که در اکتشاف منگنز چندان موفق نیستند، روشهای ژئوشیمیایی به دلیل حلالیت بالای منگنز به عنوان ابزاری مؤثر در پروژه‌های اکتشاف می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. یکی از مشکلات عمده در مراحل اکتشاف منگنز، نگهداری نمونه معرف کانسار برای مراحل ارزیابی و آنالیز است. در گذشتههای دور بیشتر حفاریهای ضربهای برای اکتشاف منگنز استفاده میشد. امروزه بیشتر از حفاریهای چرخشی برای این منظور استفاده میشود، اگر چه در این حالت هم باید برای حفظ نمونه معرف دقت کافی شود.
1-7روشهای عمده استخراج منگنز
اکثر کانسارهای با ارزش منگنز، از غنیسازی ثانویه توسط آبهای زیرزمینی و لیچینگ سنگهای رسوبی منگنزدار تشکیل میشوند. به دلیل تنوع کانسارهای منگنز و گستردگی ترکیبات و کانیهای شناسایی شده در این کانسارها، هیچ یک از روشهای کانهآرایی به تنهایی کاربرد ندارد. در استخراج کانسنگ منگنز، هم روش استخراج روباز و هم زیرزمینی مورد استفاده قرار میگیرد.
ندولهای منگنزدار پوسته کف اقیانوسها ذخایر عظیمی از منگنز را تشکیل میدهند ولی به علت مشکلات تکنیکی زیادی در استخراج آنها وجود دارد. به منظور پر عیار سازی منگنز به دلیل تنوع کانسارهای منگنز و گستردگی ترکیبات و کانیهای شناسایی شده در این کانسارها هیچ یکی از روشهای کانهآرایی به تنهایی و حتی به همراه مجموعهای از سایر روشها، در همه کانسارهای منگنز کاربرد ندارد.
1-8 کاربردهای منگنز
در صنایع فولاد منگنز باعث نورد کردن فولاد و چکشخواری، استحکام، دوام، مقاومت در برابر سایش و شکنندگی میشود. از ترکیب منگنز و آلومینیوم و آنتیموان و کمی مس آلیاژی با خاصیت فرومغناطیس قوی حاصل میشود. منگنز خالص دارای چهار آلوتروپی میباشد. فرم آلفا در درجه حرارت معمولی پایدار است. فرم گامای این عنصر دارای خصوصیات انعطاف پذیری بالا، نرم و راحت با چاقو بریده میشود، و همچنین چکشخوار است. کاربردهای متنوع منگنز باعث میشود که این فلز را در سه نوع عیار متالورژیکی، شیمیایی و باتری طبقهبندی کرد. با توجه به جدول 1-1، عیار متالورژیکی در حدود 38 تا 55 درصد منگنز میباشد، و ممکن است با عیار شیمیایی تنها در شکل فیزیکی آن تفاوت داشته باشد. کانیهایی با عیار باطری و شیمیایی اغلب توسط محتوی MnO2 دستهبندی میشوند، که نوعا در حدود 70 تا 85 درصد (44 تا 54 درصد منگنز) میباشند[7].
جدول1-1 –مشخصات ترکیبهای موجود در محصولات منگنز[7]
نوع محصول ترکیبها درصد ترکیبها
عیار متالورژیکی منگنز
آهن
سیلیکا + آلومینا
فسفر
مس + سرب + روی 0/40
0/16
بدون محدودیت خاصی
کمتر از 3/0
کمتر از 0/1
عیار باتری منگنز
آهن
سرب
مجموع فلزات سنگین به جز آهن و سرب
مجموع غیر محلولها
pH بیشتر از 0/75
کمتر از 0/3
کمتر از 5/0
5/0
0/10
4 تا 7
عیار شیمیایی نوع A
دی اکسید منگنز
آهن بیشتر از 0/80
کمتر از 0/3
نوع B
دی اکسید منگنز
آهن
سیلیکا
آلومینا
فسفر
بیشتر از 0/85
کمتر از 0/3
کمتر از 0/3
کمتر از 0/3
کمتر از 1/0
1-9 توزیع منگنز در دنیا
برخلاف فراوانی و توزیع جغرافیایی ذخائر منگنز 95 درصد از تولید جهان فقط از 7 کشور تولید کننده باشد، همانطور که در شکل 1-3 نیز مشاهده میشود، از تولید کنندگان اصلی منگنز میتوان از آفریقای جنوبی با 62/3 میلیون تن، گابون با 45/2 میلیون تن، استرالیا با 2 میلیون تن، برزیل با 8/1 میلیون تن و هند با 1/1 میلیون تن نام برد. بیش از 80 درصد از ذخائر کشف شده جهان در دو کشور اوکراین و آفریقای جنوبی متمرکز شده است. تقریباً هیچ کشور صنعتی جهان همانند آمریکا، ژاپن و کشورهای اروپایی دارای ذخایر قابل توجه منگنز نیستند و باید همگی نیازهای خود را وارد کنند.

شکل1- 3- نحوه توزیع ذخایر منگنز در دنیا[8]
1-9-1 تولید منگنز در ایران
تاکنون در ایران بیش از 45 کانسار و نشانه معدنی منگنز شناخته شده است که در بین آنها 10 کانسار متوسط و بقیه کانسارهای کوچک و نشانه معدنی میباشند. البته امکان اکتشاف ذخایر پرعیار و بزرگ منگنز، در کشور زیاد است.
مهمترین معادن در دست بهرهبرداری، معادن ونارچ و رباط کریم است که از تولید کنندگان مهم به شمار میروند. مصرف اصلی در کشور، مربوط به صنایع فولاد وبزرگترین مصرف کننده آن کارخانه ذوب آهن اصفهان است. این کارخانه، برای تولید 2 میلیون تن فولاد، نیاز به 100000 تن سنگ منگنز با عیار 25 درصد دارد. افزون بر صنایع فولاد، صنایع دیگر نیز به میزان جزیی منگنز مصرف میکنند.
در حال حاضر، از بین کانسارها و آثار شناخته شده منگنز و آهن منگنزدار ایران، با در نظر گرفتن سطح فعالیتهای انجام شده در آنها، سه معدن و نارچ قم، رباط کریم و ناریگان را میتوان به عنوان تأمین کننده بالقوه نیازهای داخلی در نظر گرفت. از این میان، معدن ونارچ قم با توجه به شرایط نسبتاً مناسب آن از نظر سابقه بهرهبرداری و وجود اطلاعات اکتشافی، وضعیت مناسبی دارد و یکی از مهمترین تأمین کنندههای منگنز ایران است. ذخیره کانسارهای منگنز ایران است حدود 17 میلیون تن برآورده شده است (به جز ذخایر منگنز آهندار). میزان ذخایر کانسارهای آهن منگنز نیز حدود 100 میلیون تن میباشد.
تولید کانسنگ منگنز ایران، سالانه حدود 135 هزار تن است. ایران در مقایسه با دیگر کشورهای جهانی، از نظر تولید کانسنگ منگنز در مکان پانزدهم قرار دارد. به بیانی 5/0 درصد از کل تولید منگنز جهانی، به ایران تعلق دارد.
1-9-2 تولید منگنز در دنیا و توسعه های اخیر
صنعت فولاد یکی از بخشهای مهم در اقتصاد جهان محسوب میشود و به دلیل وجود کثرت حلقههای ارتباطی بالادست و پاییندست با دیگر بخشهای اقتصادی به عنوان صنعتی پیشرو و کلیدی از اهمیت خاصی برخوردار میباشد، به طوری که میزان تولید و مصرف آن نمایانگر پیشرفت صنعتی و اقتصادی کشورها و تحرک دیگر بخشهای اقتصادی است. مصرف سرانه فولاد دنیا حدود 200 کیلوگرم میباشد که این میزان در کشورهای پیشرفته صنعتی بین 350 تا 600 کیلوگرم و در کشورهای فقیر و توسعه نیافته بین 20 الی 40 کیلوگرم است. مصرف سرانه فولاد در ایران نیز حدود 290 کیلوگرم است که در حال حاضر 150 کیلوگرم آن در داخل کشور تولید شده و بقیه از کشورهای دیگر تامین میشود. ایران در بین کشورهای تولید کننده فولاد در سال 2008 با تولید حدود ده میلیون تن در رتبه نوزدهم بوده است. ایران در سال 2009 میلادی با سه پله صعود نسبت به سال 2008 شانزدهمین فولادساز بزرگ جهان لقب گرفت و در سال 2010 میلادی نیز هفدهمین فولادساز بزرگ جهان بوده است و این در حالی است که در بین 20 کشور تولید کننده عمده فولاد جهان تنها کشورهای امریکا، روسیه، مکزیک، آفریقای جنوبی و ایران دارای سه عنصر اصلی تولید فولاد یعنی سنگ آهن، انرژی و آب هستند. لذا کشور ایران از مزیت نسبی در تولید فولاد برخوردار میباشد. آلیاژهای منگنز شامل فرومنگنز و سیلیکومنگنز از مواد مصرفی در صنایع فولادسازی، تولید چدن و صنایع ریختهگری میباشند. مهمترین نقش منگنز تولید فولاد خام، اکسیژنزدایی است. میزان ظرفیت در حال بهرهبرداری فرومنگنز در داخل کشور 42 هزار تن میباشد، در حالی که میزان نیاز به این ماده در حال حاضر 71 هزار تن بوده و تا پایان برنامه چهارم بالغ بر 100 هزار تن خواهد بود. با توجه به شرایط بازار و سیاستهای توسعهای کشور در بخش فولاد چشمانداز گسترش تقاضا برای فرومنگنز وجود داشته و اجرای طرحهای تولید فرومنگنز را توجیهپذیر میسازد. در تولید منگنز سهم ایران 38/0 درصد است و دوازدهمین تولید کننده منگنز دنیا به شمار میآید. سالانه از 21 معدن منگنز کشور بیش از 134 هزار تن استخراج میشود. ذخایر این ماده معدنی نزدیک به 2/8 میلیون تن است. براساس گزارش سازمان زمینشناسی آمریکا بعد از آفریقای جنوبی، استرالیا و چین هر یک با تولید 1/3 میلیون تنی به صورت مشترک در رده دوم و گابن نیز با تولید 2 میلیون تنی در رده سوم قرار گرفتند. برزیل هم با تولید 4/1 میلیون تنی جایگاه چهارم را به خود اختصاص داد. تولید منگنز در سایر کشورهای جهان در سال قبل زیر یک میلیون تن بوده است. از دیگر تولیدکنندگان عمده منگنز در جهان میتوان به برمه، هند، قزاقستان، مالزی، مکزیک و اوکراین اشاره کرد. مجموع تولید جهانی منگنز در سال 2013 به 17 میلیون تن رسید که نسبت به تولید سال 2012 رشد 2/1 میلیون تنی را تجربه کرد. زمینهای حاوی منابع منگنز بسیار گسترده و بزرگ بوده اما در عین حال به صورت پراکنده و نامنظم توزیع شدهاند. در آمریکا ذخایر منگنز دارای عیار بسیار پایین بوده و به همین دلیل استخراج این ذخایر مستلزم صرف هزینه بسیار بالایی است. آفریقای جنوبی دارای حدود 75 درصد از کل ذخایر جهانی شناخته شده منگنز است و اوکراین نیز 10 درصد این ذخایر را در اختیار دارد. در سال 2013 پروژههای مختلفی در زمینه افزایش 5 میلیون تنی ظرفیت تولید منگنز در سراسر جهان در دست اجرا بود که بیشتر این افزایش ظرفیت نیز مربوط به آفریقای جنوبی میشود. سال قبل تولید فولاد آمریکا برنامهریزی شده بود که با افت کوچکی نسبت به سال 2012 مواجه میشود و به همین دلیل واردات فرومنگنز این کشور نیز برآورد میشود که در سال قبل با کاهش 20 درصدی نسبت به سال 2012 مواجه شده است. در نتیجه مصرف ظاهری منگنز آمریکا هم با افت 8 درصدی به 770 هزار تن رسید. در آمریکا سنگ منگز با عیار 35 درصد یا بیشتر از سال 1970 تاکنون تولید نشده است.
اداره زمین شناسی آمریکا ذخائر منگنز را در گروه ذخایر اقتصادی و پایه منتشر میکند. ذخائر اقتصادی شامل ذخایری میشوند که استخراج آنها در شرایط فعلی امکانپذیر و اقتصادی میباشد. ذخایر پایه شامل مجموعه ذخایر اقتصادی و غیراقتصادی می‌شود که از نظر عیار، ضخامت و عمق در شرایطی قرار دارند که از نظر فنی قابل معدنکاری هستند.
براساس گزارش اداره زمین شناسی آمریکا مجموع ذخایر پایه شناخته شده جهان در حدود ۵۰۰۰ میلیون تن است که برای سالها بدون تغییر باقی مانده است و ذخیره عمده جدیدی کشف نشده است. از این مقدار استخراج ۶۸۰ میلیون تن آن در شرایط فعلی اقتصادی می‌باشند.
با توجه به اینکه ذخایر منگنز موجود در خشکی‌ها قادر به تامین نیاز صنایع برای سالهای آتی هستند، به نظر نمیرسد که در آینده نزدیک استخراج ذخایر کف اقیانوسی جهت تامین منگنز اقتصادی بشوند. ولی در صورتی که این ذخایر به منظور دستیابی به مس و یا نیکل آن مورد استخراج قرار گیرند، منگنز و کبالت نیز به عنوان محصولات جانبی میتوانند تولید بشوند. با توجه به کفایت ذخائر مس و نیکل در خشکی‌ها مشخص نیست که دقیقا چه زمانی استخراج ازذخایر کف اقیانوسی اقتصادی بشود. با این حال کشورهای آمریکا،‌ چین، هندوستان، ژاپن و روسیه به تحقیقات خود در قالب پروژه‌های بلند مدت در خصوص اکتشاف و امکانپذیری استخراج ذخایر کف اقیانوسی از آبهای بینالمللی و سواحل خودشان ادامه میدهند.
فصل دوم
روشهای فرآوری کانههای منگنز
2-1مقدمه
در این قصل نگاهی اجمالی به روشهای فیزیکی پرعیارسازی کانسنگ منگنز و به طور مبسوط روش لیچینگ و مطالعات و تحقیقات گذشته در این زمینه شده است. سعی بر این بوده، که تمامی روشهای موجود معرفی شوند. این مطالعات دید مناسبی برای انجام آزمایشهای فرآوری کانسنگ منگنز مورد نظر به دست میدهد.
2-2 سنگجوری
سنگجوری سادهترین و ابتداییترین روش پرعیارسازی سنگ منگنز است که هنوز در بعضی از معادن کاربرد دارد. کانههای منگنز اغلب دارای رنگ تیره مشخص با جلای فلزی و چرب هستند که تا حد زیادی از کانههای غیرفلزی باطلهی همراه که معمولا رنگهای روشنتری دارند، قابل تشخیص هستند. از اهمیت سنگجوری دستی برای مقادیر زیاد کانی کم عیار که ریز دانه هستند کاهش یافته است. گرچه امروزه از سنگجوری دستی برای حذف تکههای آهن،چوب و... از کانسنگ معدن استفاده میشود[9]. این روش محدودیت کاربرد داشته و فقط دانههای درشت کانه با این روش قابل تفکیک هستند و این امر راندمان را به شدت کاهش داده و در مواردی عملا به کارگیری این روش را غیرممکن میسازد. با توجه به محدودیت ظرفیت این روش، در کارخانههایی با ظرفیت زیاد از روشهای «سنگجوری مکانیکی» استفاده میشود[10]. شستشوی سنگ استخراجی و یا خردایش آن در مواردی میتواند سنگ جوری را آسانتر کند.
2-3پرعیارسازی به روش ثقلی
روشهای جدایش ثقلی کانیها بر مبنای حرکت نسبی آنها در یک محیط سیال پایهگذاری شده است. نیروی مؤثر عمدتا وزن دانهها است. نیروی دیگر مقاومت سیال در برابر حرکت جسم است که به ابعاد و شکل دانهها بستگی دارد[9]. روشهای ثقلی برای آرایش تعداد زیادی از کانهها مورد استفاده قرار میگیرند. این روشها در برخی از موارد با وجود هزینه ی کم و سادگی فرآیند با دیگر روشهای پیچیده و گران قیمت نظیر فلوتاسیون قابل رقابت هستند.
تاگارت در مورد قابلیت کاربرد روشهای ثقلی رابطه 2-1 را ارائه کرده است که به کمک آن میتوان معیاری برای سنجش کیفیت پرعیارسازی بهدست آورد:
C.C =∆H-∆F∆L-∆F (2-1)
که در آن :
C.C : معیار پرعیارسازی ، ∆H: جرم مخصوص کانی سنگین، ∆F: جرم مخصوص سیال، ∆L: جرم مخصوص کانی سبک.
با توجه به این که وزن مخصوص کانیهای منگانیت، هماتیت و کوارتز به ترتیب 4/4، 2/5 و 6/2 گرم بر سانتیمتر مکعب است، معیار پرعیارسازی برای کانسنگ منگنز جیرفت برای جدایش منگانیت از هماتیت 25/1، منگانیت از کوارتز 1/2 و هماتیت از کوارتز 6/2 است. مطابق رابطه 2-1، چنانچه نسبت چگالی مؤثر بزرگتر از 5/2 باشد، دانههایی تا ابعاد 75 میکرون را میتوان با روشهای سادهی ثقلی آرایش داد. با کاهش نسبت چگالی مؤثر، ابعاد کوچکترین دانههای قابل آرایش به سرعت افزایش مییابد، به طوری که با کاهش این نسبت به 25/1، تنها دانههایی با ابعاد بزرگتر از 6 میلیمتر و با استفاده از روشهای دقیق ثقلی قابل آرایش هستند. در حد کمتر از 25/1، آرایش ثقلی مواد به طور اقتصادی امکانپذیر نیست[9].
با توجه به معیار پرعیارسازی بین دو کانی منگانیت و هماتیت امکان جدایش برای ذرات بزرگتر از 6 میلیمتر وجود دارد، به علت نزدیک بودن وزن مخصوص کانی هماتیت و منگانیت ، به نظر میرسد که کاربرد روشهای ثقلی برای جدایش این دو کانی چندان مطلوب نیست.
تقریباً تمامی روشهای جداسازی ثقلی اعم از انواع جیگ‌ها، ‌میزهای لرزان، کلاسیفایرها و مارپیچ‌ها، ‌واسطه سنگین و غیره در فرآیند پرعیار سازی منگنز کاربرد دارند. با توجه به وزن مخصوص نسبتاً بالای کانه‌های منگنز (بالاتر از 4) و تفاوت بارز آنها با کانی‌های باطله همراه در صورتی که میزان آزاد بودن و ابعاد دانه‌های کانه و باطله به گونهای باشد که درمحدوده کار دستگاههای جدا کننده ثقلی قرار گیرند، می‌توان بین 80 ـ50 درصد سنگ ورودی را پرعیار کرد. عیار منگنز در محصول خروجی تا 48 درصد نیز گزارش شده است. جیگهای مورد استفاده از انواع مختلف نظیر جیگ دنور، هارتز و دیافراگمی بودهاند که در محدوده دانه‌های درشتتر کاربرد دارند.
کانسنگ منگنز معدنی در ترکیه، با مشخصات کانی شناسی 58/18 درصد منگنز، 82/0 درصد آهن و 85/62 درصد سیلیس برای پرعیارسازی به روش ثقلی خردایش شده و به دو فراکسیون 1+ میلیمتر و 1- میلیمتر تقسیمبندی شده است. عملیات پرعیار سازی بر روی فراکسیون 1+ میلیمتر توسط جیگ و بر فراکسیون 1- میلیمتر توسط میز لرزان صورت گرفت. در نهایت عیار منگنز به 47-45 درصد رسیده است[11].
2-4 پرعیارسازی به روش مغناطیسی
به دلیل تفاوت در خواص مغناطیسی کانههای منگنز و باطله های همراه نظیر کوارتز، کلسیت و رسها روش جداسازی مغناطیسی میتواند به طور نسبتا موثری باعث جداسازی و تغلیظ سنگ منگنز شود[10].
جداسازی مغناطیسی معمولا به تنهایی کارایی لازم را در مورد سنگ منگنز نداشته و اغلب به عنوان تکمیل کنندهی بخش جداسازی ثقلی، فلوتاسیون و یا هیدرومتالورژی مورد استفاده قرار میگیرد که باعث افزایش قابل توجهی در راندمان کل عملیات خواهد شد[10].
2-5 پرعیارسازی به روش فلوتاسیون
کانیهای منگنز از نظر کاربرد روش فلوتاسیون به دو گروه تقسیمبندی میشوند. گروه اول شامل کانههایی با عیار بالایی از منگانیت یا پیرولوزیت همراه با باطلهی کلسیتیاند که با شناوری کلسیت، باطلهای غنی از منگنز (فلوتاسیون معکوس) بهدست میآید. در این حالت کانه در pH حدود 8 و با استفاده از کربنات سدیم و دکسترین زرد آمادهسازی میشود و سپس فلوتاسیون با اسید اولئیک انجام میشود. گروه دوم، کانههای منگنز حاوی پیرولوزیت، منگانیت یا پسیلوملان هستند، که با مقادیر کمی از رس و سایر ترکیبات مولد نرمه همراهاند، و با شناورسازی کانیهای منگنز قابل پرعیار شدن میشوند[12].
2-6 روش تشویه
فرآیندهای متعارف پیرومتالورژی برای استفاده از منگنز سنگ معدن اکسید با هزینههای تولید بالا و انرژی مصرف، بهرهوری پایین، و آلودگی محیط زیست همراه هستند. کاهندههای مورد استفاده برای تشویه کاهشی شامل زغال سنگ، گرافیت و یا CO ، پیریت، آمونیوم سولفیت یا کلرید آمونیوم. مشکلات اصلی این فرآیندهای هیدرومتالورژیکی پالایش منگنز از محلول لیچینگ، هزینه تولید بالا، بازده لیچینگ کم و غیره است. چنانکه، دیاکسید منگنز خالص را میتوان توسط گوگرد در دمای کمتر از 300-400 درجهی سانتیگراد احیا کرد. با استفاده از اسید سولفوریک به عنوان عامل لیچینگ، منگنز میتواند از محصولات تشویه شده باقی بماند. با این حال،MnS در طول تشویه تشکیل شده و زمانی که محصولات تشویه در محلول اسید لیچ شده؛ گازهای مضرH2S اجتناب ناپذیر است.[13]
عمل تشویه که به دنبال آن هیدرومتالورژی صورت میگیرد، نقش مهمی را در به عملآوری کانسنگ منگنز کم عیار و نودلهای منگنز بستر دریا که حاوی مقادیری نیکل، کبالت و مس به صورت اکسید دارد. این اکسیدهای فلزی در نودلها اغلب در ساختمان شبکهای از مواد معدنی آهن و منگنز رخ میدهند. بنابراین شکستن این شبکهها توسط عمل تشویه کاهشی یا محلولهای کاهشی هیدرومتالورژی گامی مهم در بهبود بازیابی فلزات با ارزش به حساب میآیند. روشهای پیشنهادی برای پیرومتالورژی ذوب کردن، تشویه کاهشی، سولفاتی و کلردیدی کردن است. در مقایسه با فرآیند هیدرومتالورژی ترکیب پیرو-هیدرومتالورژی کارایی بازیابی بهتری را نتیجه میدهد، اما این روش مستلزم مصرف انرژی بالایی است.
در تشویه سولفاته کردن، کانیهای منگنزدار در حضور اسید سولفوریک یا آمونیوم سولفات به کانیهای منگنزدار محلول در سولفات تبدیل میشوند. سولفاته کردن منگنز با گاز SO2 نیز کار شده است؛ که در این مورد گاز SO2 دو نقش بازی میکند و به عنوان کاهنده و عامل سولفاته کردن عمل میکند. تشویه سولفاتی به دنبال لیچینگ برای بازیافت باتریهای مصرفی روی-کربن بررسی شده است که با تولید سولفات منگنز و روی همراه بوده است. فرآیند شامل جدایش مکانیکی و لیچینگ اسید سولفوریک، تشویه سولفاتی در حضور اسید سولفوریک یا آمونیوم سولفات پس از لیچینگ بوده است.
ذوب یا تشویه کاهشی در دمای 700-900 درجهی سانتیگراد و سپس به دنبال آن لیچینگ با اسید سولفوریک تا به حال بیشترین روش معمول در صنعت منگنز برای تولید منگنز سولفات میانی یا نهایی برای فرآیند الکترووینینگ است.
واکنش کاهشی به صورت زیر است:
MnO2 + CO/H2 = MnO + CO2/H2O
MnO2 + C = MnO + CO(CO2)
این واکنشها تبدیل منگنز اکسید با ظرفیت بالا به ظرفیت پایینتر به صورتی که در محلول اسید سولفوریک قابل حل باشند، را نشان میدهد[14].
2-7 روش لیچینگ
برای تهیهی منگنز دی اکسید برای باتریها و منگنز فلزی از روش هیدرومتالورژی استفاده میشود[12]. بهرهگیری از روشهای مختلف هیدرومتالورژی از قبیل لیچینگ و بیولیچینگ در پرعیارسازی کانههای منگنز کاربرد وسیعی دارند[15].
فرآیندهای مستقیم لیچینگ کاهشی مختلف مورد مطالعه قرار گرفته و برای پردازش سنگ معدن منگنز کم عیار و نودلهای منگنز بستر اقیانوسها، از شستشو با آهن ، دیاکسید گوگرد، پراکسید هیدروژن، اسید نیتروژن، کاهندههای آلی و زیستی استفاده شده است. از میان این فرایندها لیچینگ با اسید ارزان سولفور دی اکسید و یا یون آهن در مقیاس پایلوت مورد توجه است.
دیاکسید منگنز در اسید سولفوریک رقیق نامحلول است اما وقتی احیا و به MnO تبدیل شد به راحتی در H2SO4 حل شده و تولید MnSO4 مینماید.
MnO + 2H+ = Mn2+ + H2O
از آنجایی که منگنز با الکترولیز محلول فوق بازیابی میشود الکترولیت بازگشتی برای لیچینگ قابل بازیابی میباشد. البته دیاکسید منگنز در حضور یک ماده احیا کننده مانند سولفات فرو، دیاکسید گوگرد، زغال یا اسیداکسالیک طی مراحل اکسایش – کاهش در اسید سولفوریک رقیق حل میشود[15].
MnO2 + 2Fe2+ + 4H+= Mn2+ + 2Fe3+ + 2H2O
واکنش فوق نتیجهی اکسایش و کاهش به شرح زیر است:
اکسایش Fe2+= Fe3+ + e-
کاهش MnO2 + 4H+ + e- = Mn2++ 2H2O
همچنین از یونهای اکسالات و اسید سولفورو به عنوان عوامل کاهش دهنده میتوان استفاده کرد:
[C2O4]2- = 2CO2 + 2 e-
SO2+ 2H2O = H2SO3 + H2O = SO42- + 4H+ + 2e-
در مرحلهی کاهش مشاهده میشود که یون منگنز چهار ظرفیتی در MnO2 به یون دو ظرفیتی کاهش مییابد:
Mn4+ + 2e- = Mn2+
به محض وقوع این واکنش نیروی جاذبهی الکتروستاتیکی در جامد متبلور ضعیف شده و یونهای H+ در محلول، یونهای اکسید را از فاز جامد جدا و تشکیل آب میدهد[15].
پارامترهای موثر بر انحلال اکسید منگنز MnO توسط اسید سولفوریک نظیر غلظت اسید، مقدار نسبت استوکیومتریک اسید، درجه حرارت و مدت زمان لیچینگ مورد بررسی قرار گرفته اند. نتایج حاصل نشان میدهد که غلظت اسید سولفوریک مصرف شده تاثیر اندکی بر میزان انحلال منگنز دارد لذا می توان از اسید رقیق برای لیچینگ استفاده کرد. با افزایش غلظت اسید میزان انحلال آهن افزایش مییابد.
دیاکسید منگنز در شرایط اکسیداسیون اسیدی یا قلیایی پایدار است. از این رو، استخراج منگنز در شرایط احیایی انجام میشود. محلول آبی SO2 ثابت کرده است که لیچ کنندهی موثری برای منگنز از سنگ معدن منگنز دیاکسید، به دلیل سرعت انحلال، عملکرد دمای اتاق، سهولت نسبی خالص سازی محلول لیچ و نداشتن مشکل بازیافت محلول، است. مطالعات بر رویMnO2 مصنوعی برای درک سازوکار لیچینگ انجام شده است. محلول آبیSO2 اکسید منگنز را با کاهش Mn4+و Mn3+فلزی به شکل Mn2+ محلول در آب تبدیل میکند و SO2 به SO42- یا S2O62- اکسیده میشود. واکنش کلی به شرح زیر داده شده است[16]:
MnO2 + SO2 = Mn2+ + SO4
MnO2 + 2SO2 = Mn2+ + S2O6
2MnOOH + SO2 + 2H+ = 2Mn2+ + SO42- + 2H2O
2MnOOH + 2SO2 + 2H+ = 2Mn2+ + S2O62- + 2H2O
SO2 ،FeSO4 ، ساکارز ، زغال چوب ، زغال سنگ و ذغال سنگ چوب نما ،پیریت و غیره را میتوان به عنوان عوامل کاهنده استفاده کرد. اکسالیک اسید میتواند به عنوان یک عامل کاهنده برای استخراج منگنز از سنگ معدن دیاکسید منگنز استفاده شود. از لیچینگ سنگ معدن منگنز با استفاده از اکسالیک اسید تولید میکروارگانیسم ها گزارش شده است. لیچینگ شیمیایی از سنگ معدن منگنز با استفاده از اکسالیک اسید ممکن است بینشی به سمت بیولیچینگ باشد. انحلال منگنز با توجه به کاهش دی اکسید با اکسالیک اسید همراه است. کاهش بین MnO2 و اکسالیک اسید در محیط اسیدی به شرح زیر داده شده[17]:
MnO2 + HOOC--COOH + 2H+ = Mn2+ + 2CO2 + 2H2O
بررسی محلولهای رقیق از دیاکسید گوگرد به عنوان عامل لیچینگ توجه محققان زیادی در این زمینه به خصوص در مورد نودلهای بستر دریاها را جلب کرده است. واکنش بین اکسید فلزی و دیاکسید گوگرد مورد مطالعه قرار گرفته است. مشاهده شده است که:
روش لیچینگ اسید سولفوریک سریع، موثر و حساس است کل واکنش انحلال فقط در 8-10 دقیقه به پایان میرسد.
انحلال در دما و فشار اتاق صورت میگیرد.
دیاکسید گوگرد گاز پسماند است، اعتقاد بر این است که 109میلیون تن SO2 در هر سال به محیط زیست جهانی اضافه شده است. به این ترتیب، با استفاده از SO2 به عنوان عامل لیچینگ، آلودگی هوا را میتوان به حداقل رساند.
محلول آبی SO2 شرایط بسیار کاهنده و بسیار اکسید کننده با اکسیژن ارائه میدهد. بنابراین، این لیچ کنندهها ممکن است برای لیچ فلزات با ارزش از مواد معدنی، سنگ معدن و کنسانتره به عنوان منابع اولیه در حالی که لجن آندی، گرد و غبار دودکشها، قطعات الکترونیکی، آلیاژهای، رشتههای از لامپهای برقی و غیره دیگر منابع ثانویه هستند، استفاده کرد[18].
2-7-1 لیچینگ کاهشی با محلول یون آهن
این فرآیند به صورت شماتیک در شکل 2-1 نشان داده شده است. ویژگی این فرایند هیدرولیز دما بالایFe(III) و رسوب منگنز به عنوان نمک مضاعف (NH4)2Mn2(SO4)3 به طور همزمان است، که سپس با انحلال Fe2O3 و همرسوبی، از هم جدا میشود. انتظار میرود محلول نسبتا خالص منگنز باردار برای الکترولیز از این راه بهدست آید.

شکل2-1- فلوشیت فرآیند بازیابی منگنز با استفاده از محلول لیچ[14]
نگرانیهای اقتصادی این فرآیند بابت هزینهی بالای H2O2 و فرآیند اتوکلاو درجه حرارت بالا است[14]. مطالعهای بر روی سینتیک واکنش بین منگنز دیاکسید و یون آهن در محلول اسیدی انجام شده، که از پتانسیل زوجهای فرو و فریک برای اندازهگیری میزان واکنش استفاده شده است. در این بررسی واکنشها به راحتی در بعضی قسمتهای فعال سطح دیاکسید منگنز و سطحی که یونهای آهن بر روی آن انتشار یافته، رخ داده است. از سوی دیگر، در مطالعهای دیگر به این نتیجه رسیدند که تحت شرایط ویژهی دور همزن، واکنش شیمیایی با انرژی فعالسازی ظاهری 28 کیلورژول بر مول، کنترل شده است. از مفاهیم الکتروشیمیایی برای سیتینک محلول MnO2 با اسیدسولفوریک در حضور پیریت استفاده شده و نتیجه گرفتند که انحلال میتواند با Fe2+ کاتدی که از اکسیداسیون پیریت با یونهای Fe3+ به دست آمده، ادامه یابد. نرخ واکنش اکسیداسیون پیریت به تدریج کاهش مییابد. مطالعهای بر مکانیسم الکتروشیمیایی محلول MnO2 در اسید هیدروکلریک در حضور Fe2+ و Fe3+ انجام شده است و متوجه شدند که با افزایش یونهای Cl- و Fe2+ در محلول سرعت کلی انحلال افزایش مییابد. در مقابل، Mn2+ و Fe3+ در محلول، مانع از رسیدن واکنش به بعضی درجات میشوند[19].
مطالعهای توسط Das et al(1982) [14]، نشان داد که واکنش منگنز دیاکسید در کانی کم عیار منگنز با فروسولفات به سه طریق انجام میگیرد:
فروسولفات طبیعی:
MnO2 + 2FeSO4 + 2H2O = MnSO4 + Fe(OH)SO4 + Fe(OH)3
فروسولفات و مقدار کمی اسید:
MnO2 + 2FeSO4 + H2SO4 = MnSO4 + Fe(OH)SO4
محلول فروسولفات و مقدار زیادی اسید:
MnO2 + 2FeSO4 + 2H2SO4 = MnSO4 + Fe(SO4)3 + 2H2O
بیشتر از 90درصد منگنز را میتوان با لیچینگ کانسنگهای کم عیار با مقدار نسبت استوکیومتری فروسولفات و در دمای 90 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و نسبت جامد به مایع 1:10 استخراج کرد. مایع لیچ تحت این شرایط ژلاتینی و فیلتر کردن آن سخت خواهد شد؛ با اضافه کردن اسیدسولفوریک فیلتراسیون به راحتی انجام شده و منگنز استخراجی بیشتر میشود[14].
در سال 2007 ذاکری و همکاران بر روی لیچینگ کاهشی منگنز با استفاده از آهن اسفنجی مطالعهای انجام دادهاند. با استفاده از اسیدسولفوریک و آهن اسفنجی بر روی نمونهی پیرولوزیت، آزمایشات لیچینگ اسیدی صورت گرفته که در 10 دقیقه با دمای 20 درجه سانتیگراد، موفق به بازیابی 98% منگنز از کانسنگ شدهاند[19].
2-7-2 لیچینگ کاهشی توسط سولفور دیاکسید یا محلولهای سولفیت
در فرآیندهای هیدرومتالورژی، سولفور دیاکسید یا نمکهای سولفیتی کاهندههای قوی برای کانیهای منگنز اکسید بالاتر مانند MnO2 و نودلهای منگنز هستند. واکنشهایی که احتمالا در حین لیچینگ منگنز دیاکسید رخ میدهند :
MnO2 + SO2 = Mn2+ + SO42-
MnO2 + 2SO2 = Mn2+ + S2O62-
2MnOOH + SO2 +2H+ = 2Mn2+ + SO42- + 2H2O
2MnOOH + SO2 +2H+ = 2Mn2+ + S2O62- + 2H2O
SO2 به SO42- و مقداری دی تیونات S2O62- اکسایش یافته که به PH محلول، پتانسیل اکسایش-کاهش و درجه حرارت بستگی دارد. در اصل این فرآیند کاهشی SO2 است. استفاده از محصول میانی دی تیونات واکنش کاهشی برای موازنه هر دو محصول کاهش یافته Mn(II) و کلسیم در محلول در حالی که کلسیم اضافی به صورت CaSO4 رسوب کرده؛ مزیت این فرآیند است. در یک پژوهش نیمه صنعتی یک سری آزمایشات بر روی منگنز با عیار 13-18% انجام شده، در اکثر موارد بازیابی منگنز به 90درصد رسید و عیار منگنز در محصول نهایی بیشتر از 60درصد رسید. برای هر واحد منگنز استخراج شده، 5/1 تا 2/2 واحد SO2 و 1/1 تا 5/1 واحد CaO مصرف شده است. در مقیاس آزمایشگاهی از دی تیونات همچنین برای لیچینگ لجنهای کم عیار منگنز(از نودلهای منگنز در بستر دریاها) استفاده میشود. عموما تشکیل دیتیونات در فرآیند شستشو با SO2 نامطلوب است. زمان ماند طولانی برای تبدیل دیتیونات به سولفات لازم است. یک فرآیند که تشکیل S2O62- را با اضافه کردن SO2 به صورت پیوسته، به زیر 1 گرم بر لیتر کاهش میدهد، توسط Ward et al.2004 بررسی و گزارش شده است. لیچینگ مستقیم SO2 بر روی نمونهی غنی منگنز انجام گرفته است (Grimanelis et al. 1992)، این واکنش سریع بوده و در زمان 10 دقیقه، بازیابی منگنز به بیشتر از 95 درصد رسیده که ناخالصی آهن همراه بسیار کم بوده است[14].
در مطالعهای سه نمونه سنگ معدن منگنز عیاربالا، عیار متوسط و کم عیار مورد لیچینگ توسط SO2 به عنوان کاهنده قرار گرفتهاند. این بررسی در دمای محیط، دور همزن 1000 دور بر دقیقه و با اندازه ذرات زیر 150 میکرون انجام شده است. مقدار کاهنده توسط نسبتهای استوکیومتری معادله زیر در نظر گرفته شده است[16]:
MnO2 + SO2 = Mn2+ + SO42-
در مجموع، استخراج منگنز با افزایش نسبت استوکیومتری مقدار SO2، افزایش مییابد [16]. در نمونه با عیار متوسط، همانطور که در نمودار شکل 2-2 مشاهده میشود؛ با نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 75/1، بازیابی منگنز 88/90 درصد میشود. با افزایش نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 5/2، میزان منگنز استخراج شده از نمونه به 17/97 درصد میسد. در نمونهی پرعیار در نمودار شکل 2-3، 40/94 درصد منگنز با نسبت استوکیومتری SO2به مقدار 5/1 استخراج شده، که با افزایش نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 2 بازیابی منگنز به 55/99 درصد میرسد. در نمونهی کم عیار، با توجه به نمودار شکل 2-4، با نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 5/1، تقریبا همهی منگنز نمونه (29/99درصد) استخراج شده است[16].
شکل2- 2- اثر مقدار SO2 بر بازیابی فلزات در کانه با عیار متوسط[16] شکل2- 3- اثر مقدار SO2 بر بازیابی فلزات در کانهی پرعیار[16]

شکل2- 4- اثر مقدار SO2 بر بازیابی فلزات در کانهی کمعیار[16]
2-7-3 لیچینگ کاهشی با استفاده از کاهندههای ارگانیک
در بسیاری از مطالعات بر روی لیچینگ کاهشی کانیهای منگنز چهار ظرفیتی که از کاهندههای ارگانیک استفاده شده، تمرکز شدهاست. این کاهندهها شامل گلوکز، ساکاروز، لاکتوز، خاک اره، گلیسیرین، اسید اکسالیک، اسید سیتریک، تارتاریک اسید و فرمیک اسید است.
کاهندههای کربوهیدراتی به دلیل هزینه کم و بی خطر بودن، مورد توجه هستند. معادله استوکیومتری آنها به صورت زیر پیشنهاد میشود:
C2H12O6 + 12MnO2 + 24H+ = 6CO2 + 12Mn2+ + 18H2O
محصولات واکنش گلوکز توسط HPLC قابل تشخیص است. در اسیدسولفوریک به عنوان واسطه، گلوکز به فرم مونوکربوکسیلیک پلیهیدروکسی اسید و فرمیک اسید اکسید میشود[14].
در بین این کاهندهها اسید اکسالیک و خاک اره به دلیل در دسترس بودن و هزینهی کم، مورد توجه کارهای صنعتی هستند. ممکن است لیچینگ شیمیایی کانههای منگنز با استفاده از اسید اکسالیک دیدی نسبت به بیولیچینگ بدهد[17]. مکانیسم بیولیچینگ عمدتا به طور غیر مستقیم در محصولات لیچینگ کانههای منگنز با اسید اکسالیک یا اسید سیتریک یافت میشود. طبق واکنش زیر، اسید اکسالیک پتانسیل بیشتری برای کاهش منگنز دی اکسید نسبت به اسید سیتریک دارد:
MnO2 + 2H+ +C2O4H2 = Mn2+ + 2H2O + 2CO2
یونهای منگنز یک لایه بر سطح کانه تشکیل میدهند، و واکنش ارائه شده، با انتشار واکنشدهندهها بر روی لایهی نفوذپذیر محصول کنترل میشود.[14]. در تحقیقی که بر روی سنگ معدن منگنز Joda در هند، آزمایشات لیچینگ با اسید اکسالیک به عنوان کاهنده، بر اساس روش فاکتوریل 24 طراحی شده است. در این تحقیق پارامترهای متغیر مقدار اسیداکسالیک، مقدار اسید سولفوریک، زمان و دما در نظر گرفته شده است. این آزمایشها نشان دادهاند که بعد از 3 ساعت، زمان تاثیری بر استخراج منگنز ندارد. اکثر واکنشها در 30 دقیقهی اول کامل میشوند. نتایج آزمایشها مشخص کرده است به ترتیب مقدار اسید اکسالیک، دما و مقدار اسید سولفوریک بیشترین اثر را بر بازیابی منگنز و به ترتیب دما، مقدار اسیدسولفوریک، مقدار اسید اکسالیک و زمان بیشترین اثر را بر بازیابی آهن در این نمونه کانسنگ دارند. با 6/30 گرم بر لیتر اسید اکسالیک، 54/0 مولار اسید سولفوریک در دمای 85 درجه سانتیگراد و زمان 105 دقیقه، 4/98 درصد منگنز از کانسنگ منگنز معدن Joda بازیابی میشود[17]. در مطالعهی دیگری که بر روی نمونهی کانسنگ منگنز سبزوار در ایران، صورت گرفته از روش سطح-پاسخ با نرمافزار DX7 استفاده شده است. مانند تحقیق قبل، در این تحقیق پارامترهای متغیر مقدار اسیداکسالیک، مقدار اسیدسولفوریک، زمان و دما در نظر گرفته شده است. بر اساس این آزمایشها و مطابق نمودارهای شکل 2-5، مقدار اسیدسولفوریک بیشترین اثر را بر روی بازیابی منگنز دارد.

شکل2- 5- اندرکنش متغیرها بر بازیابی منگنز[20]
در این مطالعه، علاوه بر تعیین اثرگذاری پارامترهای مهم بر بازیابی منگنز، بهینهسازی پارامترها و یافتن بهترین حالت بر اساس بیشترین بازیابی منگنز، کمترین بازیابی آهن و مواد مصرفی در محدودهی مشخص شده، انجام گرفته است. طبق نتایج به دست آمده، حالت اپتیمم با مقدار 7درصد اسید سولفوریک،92/42 گرم بر لیتر اسید اکسالیک در 63درجه سانتیگراد و زمان 65 دقیقه، با بازیابی منگنز 4/93 درصد، بازیابی آهن 81/15 درصد در نظر گرفته شده است[20].
یک بررسی مقایسهای بین دو کاهندهی ارگانیک، اسید اکسالیک و اسید سیتریک بر روی نمونه کانسنگ منگنز در هند انجام گرفته است. این آزمایشها با پالپ 2درصد، به مدت 6 روز به طول انجامید که در هر 3 روز، توسط تیتراسیون با اتیلن دیامین تترا استیک اسید 01/0 مولار درصد بازیابی منگنز مشخص شده است. غلظت دو کاهنده از 1 مولار تا 2 مولار متغیر بوده است. بر اساس نتایج به دست آمده از این تحقیق، در غلظت 2 مولار از اسید اکسالیک، بازیابی منگنز بعد از 6 روز ، به 66 درصد رسیده که با کاهش غلظت اسید اکسالیک تا 1 مولار بازیابی منگنز به 15درصد کاهش مییابد. همچنین، در غلظت 2 مولار از اسید سیتریک، بازیابی منگنز بعد از 6 روز، به 40 درصد رسیده که در این مورد نیز با کاهش غلظت اسید سیتریک تا 1 مولار بازیابی منگنز به 7 درصد کاهش مییابد.

شکل2- 6- تاثیر غلظتهای مختلف اسید سیتریک[21] شکل2- 7- تاثیر غلظتهای مختلف اسید اکسالیک[21]
اسید اکسالیک با فراهم کردن یون H+ و از طریق تشکیل کمپلکس اکسالات با منگنز، منگنز را به راحتی از کانه لیچ میدهد. اما اسید سیتریک قادر به تشکیل کمپلکس با منگنز نیست. با توجه به نتایج و نمودارهای شکل 2-6 و شکل 2-7 به همین دلیل اسید اکسالیک پتانسیل و ظرفیت بیشتری نسبت به اسیدسیتریک، برای لیچنگ کاهشی کانسنگهای منگنز را دارا میباشد[21].
تحقیقی دربارهی لیچینگ کانسنگ منگنز- نقره در چین انجام شده است؛ که برای جداسازی نقره از این کانسنگ، لیچینگ کاهشی صوررت گرفته است. ابتدا توسط روشهای فیزیکی(روش مغناطیسی و فلوتاسیون) جداسازی اولیه انجام شده، سپس کنسانترههای این دو مرحله با هم مخلوط شده و برای لیچینگ با اسید سولفوریک و مادهی سلولزی به عنوان کاهنده استفاده میشود. این مادهی سلولزی، CMK نام دارد که در محلول لیچینگ با اسید سولفوریک، پلی ساکارید تشکیل میدهد[22]:
n(C6H10O5) + n H2SO4 = n(C6H11O5)HSO4
n(C6H11O5)HSO4 + nH2O = n(C6H12O6) + nH2SO4
پلی ساکارید که از واکنش بالا تشکیل شده، میتواند با منگنز دیاکسید واکنش داده و منگنز دیاکسید به Mn2+ اکسایش مییابد:
MnO2 + n(C6H10O6) + H2SO4 = MnSO4 + CO2 + H2O
طی این آزمایشها اندازه ذرات مادهی CMK بررسی شده که با کاهش ابعاد این ذارت تا 1/0 میلیمتر نرخ لیچینگ منگنز به بیشتر از 90 درصد میرسد. همچنین برای تعیین میزان اثرگذاری CMK در لیچینگ، مقایسه ای با اسیداکسالیک صورت گرفته است.

شکل2- 8- تاثیر مقدار کاهنده بر نرخ لیچینگ منگنز[22]

—d1738

متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)
23/7 Distilled Water (V/V)
0/1
0/1 Glucose (W/V)
0/1 Cellobiose(W/V)
0/1 Maltose (w/V)
0/1 Xylose (W/V)
0/75 (V/V) %3 Cellolose Suspension
0/1 (W/V) % 1/0 Hemin Solution
0/2 Trypticase (W/V)
0/05 Yeast Extract (W/V)
0/45 VFA Mixture (V/V)
1/67 (V/V) %3 Cystein-HCL-Water

—d1794

2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیت‌های ثانویه14
فصل سوم- مواد و روشها
3-1- مواد گیاهی20
3-2- وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده20
3-3- مواد شیمیایی20
3-4- آماده‌سازی گیاه گزنه20
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-7- استخراج عصاره متانولی24
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل24
3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی25
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC26
3-8-1- آماده سازی نمونه26
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک27
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی27
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC29
3-9-1- آماده سازی نمونه29
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین29
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی30
3-10- مشخصات طرح31
3-11- تجزیه و تحلیل آماری31
فصل چهارم- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک34
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ34
4-1-2- تعداد برگ در بوته36
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها36
4-1-4- قطر ساقه37
4-1-5- قطر و طول ریشه37
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته.37
4-1-7-ارتفاع گیاه38
4-1-8- میزان کلروفیل38
4-2- صفات بیوشیمیایی39
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل39
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل42
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل44
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل46
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل48
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید50
4-4- نتیجه گیری کلی56
4-5- پیشنهادات56
منابع58
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- طبقه بندی ترکیبات فنلی12
جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک35
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن35
جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه36
جدول4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر40
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمایی مورد بررسی با دستگاه HPLC40
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه7
شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ، ب- فیروزجاه، پ- خشک کردن گزنه21
شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید25
شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین26
شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک28
شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک28
شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین30
شکل 3-7- کروماتوگرام استاندارد روتین31
شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ41
شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل41
شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه42
شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ43
شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل43
شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه44
شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ45
شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل45
شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه46
شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ47
شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل47
شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه48
شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ49
شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل49
شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ51
شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل51
شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه52
شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی52

1-1- مقدمه
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور است که امکان صادرات آن نیز وجود دارد. ایران از نظر آب و هوا در زمینه رشد گیاهان دارویی یکی از بهترین مناطق جهان محسوب می‌‌شود، به همین دلیل صادرات آن می‌‌تواند منبع بزرگی از درآمد برای کشور باشد (صمصام شریعت، 1382). بنابراین ضروریست تا با توجه به توان بالقوه بسیار خوب کشور در زمینه تنوع گیاهان دارویی، با شناخت گونه‌‌های گیاهی و دستیابی به اطلاعات لازم در مورد محل‌‌های رویش و خصوصیات بوم‌‌شناختی آن‌ها، گام‌‌های اساسی برای استفاده از اسانس‌‌های گیاهی و ترویج شیوه‌‌های اصولی بهره‌‌برداری از این گیاهان برداشته شود (حسنی، 1383).
گیاه دارویی به گیاهان و مشتقات آن‌ها گفته می‌‌شود که دارای مواد موثر مشخص است، در درمان بیماری یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می‌‌گیرد و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه‌‌های معتبر بین‌‌المللی ذکر شده باشد (دوازده امامی و مجنون‌‌حسینی، 1387).
فارماکوپه یک کتاب رسمی است که توسط دولت هر کشور و یا انجمن‌‌های پزشکی و داروسازی زیر نظر دولت به چاپ می‌‌رسد و حاوی حقایق علمی و اصول استاندارد‌‌سازی مواد دارویی از قبیل روش‌‌های جمع‌‌آوری مواد دارویی از منابع مختلف، آماده سازی، نگهداری، ترکیب و اختلاط داروهای مختلف و روش‌‌های اثبات آن‌ها می‌‌باشد. به علاوه این کتاب شامل دارو‌‌هایی با استعمال خارجی، نحوه نسخه‌‌نویسی، نحوه و مقدار تجویز دارو‌‌ها و اطلاعات کامل تهیه، ساخت و کاربرد داروهاست (دوازده امامی، 1382).
استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده‌‌های حاصل از آن‌ها نقش این گیاهان را در چرخه اقتصادی پر اهمیت کرده است. به طوری که مصرف رو به ازدیاد آن‌ها تنها به کشور‌‌های در حال توسعه محدود نشده است، بلکه اخیراً در کشور‌‌های توسعه یافته نیز جایگاه ویژه‌‌ای به خود اختصاص داده است. در اواخر قرن بیستم حجم مبادلات جهانی گیاهان دارویی به 200 میلیارد دلار بالغ گردیده است. بر اساس گزارش سازمان خوار و بار جهانی (FAO) ارزش صادرات گیاهان دارویی در سال 1995 بالغ بر 880 میلیون دلار بوده است. بر اساس گزارش بانک جهانی، حجم تجارت گیاهان دارویی تا سال 2050 بالغ بر 5 تریلیون دلار خواهد بود (امیدبیگی، 1384). در حالی که طی گزارشی میزان ارزش فروش گیاهان دارویی در ایران در سال 2000 میلادی تنها در حدود 37 میلیارد ریال برآورد شده است و این در حالی است که ایران جزء 8 کشور مهم دارای فلور متنوع گیاهان دارویی در دنیاست (قاسمی، 1389).
گزنه از مهمترین گیاهان دارویی است که از دوران ماقبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم آن زمان از آن برای تغذیه استفاده می‌کردند و از خواص درمانی آن اطلاع داشته‌اند. از کاربرد‌‌های دارویی آن می‌توان به کاهش قند خون، کاهش التهاب آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، درمان پروستات و اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق
تاثیر ارتفاع بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی (ریخت‌‌شناسی) گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اندام‌‌های گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گیاه گزنه چگونه است؟
1-3- فرضیهها
عوامل محیطی روی میزان ترکیبات ثانویه گیاه گزنه موثر است.
شرایط محیطی متنوع در زیستگاه‌های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیکی گیاه تاثیر می‌گذارند.
میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی تحت تاثیر ارتفاع قرار دارد.
1-4- اهداف
ارزیابی تاثیر اقلیم‌‌های مختلف بر صفات ریختی و عملکرد برخی مواد موثره گزنه.
معرفی بهترین ارتفاع و اندام دارویی گزنه از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی.
مقایسه برخی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی موجود درگزنه در ارتفاعات مختلف.
-76508-504458

2- بررسی منابع
2-1- گیاه‌شناسی گزنه
گزنه با نام علمی Urtica dioica از خانواده Urticaceae می‌باشد. گزنه، گیاهی است علفی، چند‌‌ساله، پایا، دوپایه و بندرت تکپایه، ریزوم‌‌دار، به ارتفاع 150-50 سانتیمتر، دارای کرک‌‌های گزنده، ساقه آن علفی، کمی زاویه‌‌دار و چهار پهلو، تقریباً ضخیم، ساده و یا خیلی کمانشعاب و پوشیده از کرک‌‌های گزنده، برگ‌‌ها نیزه‌‌ای، نیزه‌‌ای باریک، تخممرغی، تخممرغی پهن تا تقریبا دایره‌‌ای، نوک تیز یا نوک باریک، قاعده قلبی، باریک یا گوه‌‌ای، اندازه برگ 5/2-12×5/4-15 سانتیمتر، رنگ برگ‌‌ها سبز روشن است. برگ‌‌ها عموما گوشواره‌‌دار و گاه بدون گوشواره، متقابل و پوشیده از کرک‌‌های گزنده است. گل‌‌های آن، تک جنسی، بسیار ریز، سبز فام، مجتمع در توده‌‌های کوچک کروی، و واقع در طول محورهای خوشه‌‌ای شکل، گل‌‌های نر دارای 4 کاسبرگ هم اندازه و 4 پرچم با بساک‌‌های پهن دراز و قلوه‌‌ای شکل، ماده‌‌ها دارای 4 کاسبرگ متقابل صلیبی، دو کاسبرگ خارجی بسیار کوچک و گاهی گل فاقد آن و رنگ آن‌ها سبز مایل به زرد می‌‌باشد. گلآذین سنبله یا خوشهای مرکب، کرکی متراکم، گل‌آذین نر 4-11 سانتیمتر و ماده 5/1-9 سانتیمتر میباشد میوه آن فندقه تخم‌مرغی تا بیضوی و محتوی آلبومین روغن‌‌دار است. فندقه به طول 5/1 میلی‌‌متر و محصور در کاسه پایای گل می‌‌باشد (شکل 2-1)، (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ قهرمان، 1372).
تکثیر آن از طریق کاشت بذر در بهار یا تابستان و کاشت قطعات ریشه‌‌دار در پاییز صورت می‌‌گیرد (زرگری، 1383).

شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه (ویلر، 1981)
2-2- دامنه انتشار
این گیاه غالبا در اماکن مخروبه، باغ‌‌ها، و نقاط مرطوب خارج شهر و نواحی سایه‌‌دار و جاهایی که چهار‌‌پایان در آنجا به سر می‌‌برند، به حالت خودرو می‌‌روید. از ریشه‌‌‌‌های خزنده آن پاجوش‌‌هایی در کلیه جهات خارج می‌‌گردد که خود باعث می‌‌شود گیاه بصورت پایه‌‌های متعدد در آمده، تا محل رویش خود را به کلی فرا گیرد. انتشار عمومی گیاه گزنه در نقاط مرطوب ایران خصوصاً نواحی شمالی، غربی و مرکزی مانند اصفهان، شاهرود، بسطام و کاشان است (زرگری، 1376).
2-3- اندام‌های دارویی
برگ‌‌ها، ریشه، دانه و شیرابۀ گیاه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌‌دهند (زرگری، 1376). گلدهی آن از اواسط اردیبهشت تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد و بهترین زمان برداشت و جمع‌‌آوری برگ‌‌‌‌های این گیاه از اردیبهشت‌‌ تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی
گزنه دارای تانن، موسیلاژ، اسید فورمیک، ماده مومی، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کنندگی پوست، نیتراتپتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن‌‌دار، گوگرد و نوعی ماده رنگی به نام اورتی‌‌سین در سر شاخه هوایی می‌‌باشد (زرگری، 1376). در برگ گیاه گزنه، کلروفیل، گزانتوفیل، لوکوآنتوسیانیدین، فلاوون و فلاونول موجود است که فلاوون و فلاونول به میزان کمتری از لوکوآنتوسیانیدین در این گیاه است. تری‌‌ترپن‌‌ها و استرول‌‌ها شامل بتاسیتوسترول در گیاه موجود است. اسید فرمیک نیز در برگ وجود دارد. برگ‌‌های تازه گزنه حاوی سکرتین می‌‌باشد. همین‌‌طور دارای 5/1 درصد کلروفیل خالص است. برگ خشک گزنه 5/7 درصد کلروفیل دارد. اسیدهای فنلی نیز در این گیاه وجود دارد که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، اسکولتین و کافئوئیل مالیک اسید و کلروژنیک اسید می‌‌باشد. تری گلیسیرید، دی گلیسیرید و فسفولیپید‌‌های مختلفی هم از این گیاه جدا شده است. سیتوکنین‌‌های عمده گزنه شامل زآتین، زآتین نوکلئوتید، ایزو پنتیل آدنین، ایزو پنتیل آدنوزین، ایزو پنتیل آدنین نوکلئوتید و دی هیدرو زآتین می‌‌باشد. همچنین ترکیبات ایندولی همراه با هیستامین و 5- هیدروکسی تریپتامین و اسید‌‌هایی از جمله اسید آسکوربیک، سالیسیلیک اسید و عناصری مانند ازت، گوگرد، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و عناصر نادر مانند آهن، روی، مولیبدن و مس موجود است (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
ترکیبات فنلی موجود در گزنه که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، فیستین و میریستین می‌‌باشند. بر باکتری‌‌هایی مثل اشریشیاکلی، پروتئوس ‌‌ولگاریکوس، کلبسیلا و پسودوموناس اثر دارد و عصاره این گیاه بر سالمونلا و پروتئوس که در مقابل آنتی‌‌بیوتیک‌‌ها مقاوم است، خاصیت آنتی‌‌بیوتیکی دارد. همچنیین باعث وقفه در رشد چندین مخمر، کپک، قارچ و باکتری شده است. اثرات ضد قارچی بعضی ترکیبات موجود در گزنه نیز تائید شده است. گزنه دارای اثرات مدری است. اثرات دیورتیک این گیاه با افزایش دفع کلر و اوره همراه است و ثابت شده که مصرف 14 روزه این گیاه موجب کاهش وزن بدن و نیز کاهش فشار سیستولیک می‌‌گردد (محمودی و همکاران، 2007). گزنه بصورت خوراکی به عنوان مدر، پایین آورنده قند خون و اسید اوریک و به صورت موضعی در درمان برخی از بیماری‌‌های پوستی و مو از جمله اگزما، بیماری‌‌های التهابی و حتی در درمان ریزش مو مورد استفاده قرار می‌‌گیرد (محمودی و همکاران، 2007). اعتقاد بر این است که جوشانده گیاه و خیسانده ریشه آن در الکل بصورت لوسیون در رشد موی سر موثر است. همچنین عصاره ریشه گزنه در بعضی حالات هیپرتروف غده پروستات را بهبود می‌بخشد (آزاد بخت، 1378). از دیگر کاربردهای دارویی گزنه می‌‌توان به درمان آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، بزرگ شدگی ‌‌پروستات، حساسیت فصلی و درمان اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی
پراکنش و استقرار گیاهان اصولاً تحت تاثیر شرایط محیط و عوامل داخلی گیاه صورت می‌‌گیرد. مهم‌‌ترین عوامل موثر بر ترکیبات شیمیایی ثانویه گیاهان عوامل ژنتیکی، محیطی و اثرات متقابل آن‌ها ست. عوامل ژنتیکی مربوط به ژنوم گیاه است. از عوامل محیطی و اکولوژیکی مؤثر می‌‌توان عوامل آب و هوایی، جغرافیایی و ادافیکی (خاکی) را نام برد. عوامل آب و هوایی مانند دما، بارندگی، طول روز، نور خورشید، تبخیر و تعرق و باد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌‌های ثانویه این گیاهان دارند. ارتفاع از سطح دریا، درصد شیب و جهت آن، عرض جغرافیایی، پوشش اراضی، نزدیکی به منابع آبی به طور مستقیم یا غیر مستقیم به واسطه تأثیر بر سایر عوامل بوم شناسی بر سنتز ترکیبات ثانویه به خصوص اسانس در گیاهان موثر هستند. خصوصیات خاک مثل بافت خاک، مواد آلی، آهک، شوری و اسیدیته از فاکتورهای محیطی می‌‌باشند که باید مورد مطالعه قرار گیرند. در صورتیکه گیاه اهلی شده باشد عوامل مدیریتی نیز تاحدودی بر درصد ترکیبات ثانویه گیاهان دارویی موثر است (قاسمی، 1389). از مهمترین عوامل محیط رویش گیاهان که تاثیر بسیار عمده‌‌ای بر کمیت و کیفیت مواد موثره آن‌ها می‌‌گذارند، نور، درجه‌‌حرارت، آبیاری و ارتفاع محل می‌‌باشد (امید بیگی، 1384). بر پایه تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محـور زیـر بر آن‌ها تاثیـر می‌‌گـذارد: 1- تاثیر بر مقدار کلی ماده موثره گیاهان دارویی؛ 2- تاثیر بر عناصر تشکیل دهنده مواد موثره؛ 3- تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه (امیدبیگی، 1384).
به‍طور‌‌ کلی مواد مؤثره گیاهان دارویی که حاصل سوخت‌‌و‌‌ساز (متابولیسم) ثانویه است به ‍عنوان ترکیبــات ثانویه معروف می‌‌باشند. این ترکیبات عموماً وزن مولکولی کمتر از 1000 داشته و به ‍مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول‌های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولیـد می‌شوند. گیـاهان دارای این نوع مکانیـسم‌ها، نسبت به سایر گیاهان از سازگاری و بقای طولانی‌‌تری برخوردارند (تایز و زایگر، 1379). مهـم‍ترین آن‌ها آلــکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن‌‌های فرار (اسانس‌ها)، فنلها، تانن‌ها، فلاونوئیدها و غیره هستند. تولید این ترکیبات برای گیاه گران و هزینه‍بر می‌باشند، ولی گیاه این ترکیبات را بیهوده تولید نمی‌کند و اهـداف خاصی جهت تولید، ترشح و ذخیره آن‌ها دارد که مهم‍ترین این وظایف به شرح زیر است:
- دفع عوامل بیماریزا
- دفع آفات و حیـوانات گیاه‍خوار
- افزایش توان رقابتی گیاه بر سر منابع مانند نور، آب و مواد غذایی
- جلب حشرات و پرندگان گردهافشان
- رفع تنشهای غـیرزنده و حفاظت در برابر اشعۀ ماوراء بنفش (قاسمی، 1389).
2-6- فنل و فلاونوئید
ترکیبات فنلی به یک گروه وسیع و متنوعای از ترکیبات شیمیایی اطلاق میشود که این ترکیبات می‌‌توانند به روش‌‌های مختلفی طبقه‌‌بندی شوند. هاربورن و سیموندس این ترکیبات را به گروه‌‌هایی بر اساس تعداد کربن‌‌های موجود در مولکول طبقه‌بندی کردند (جدول 2-1) (ورمریس و نیکولسون، 2006).
ترکیبات فنولی در طی رشد و نمو با هدایت عوامل ژنتیکی و در پاسخ به محرکهای محیطی از جمله آلودگی، زخم و تابش فرابنفش ساخته میشوند که از میان آنها میتوان به لیگنینها، لیگنانها، فنلهای ساده و اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها اشاره کرد. این ترکیبات بخش جدایی ناپذیری در رژیم غذایی بشر بوده و به دلیل ویژگیهای آنتیاکسیدانی قوی و ضدسرطانی، بسیار مورد توجه است (قربانی و همکاران، 1390؛ محمد و همکاران، 2001؛ دینکا و همکاران، 2004؛ اسکین و رابینسون، 2000).
ترکیبات فنولی دارای خواص متعددی از جمله خواص آنتی باکتریال، ضدقارچ، ضدویروس، ضددیابت، ضدالرژی و ضدالتهاب هستند. اما بیشتر به منظور فعالیت‌های ضدویروسی و آنتی‌اکسیدانیشان شهرت دارند به خصوص در بعضی از اسیدهای فنولیکی مانند اسیدکلرژنیک، اسیدگالیک و اسیدکافئیک (دیمیتری جویک و همکاران، 2010).
فلاونوئیدها دسته‌‌ای از ترکیبات طبیعی هستند که در سلسله گیاهان گسترش وسیعی دارند. آن‌ها به عنوان یکی از بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی شناخته می‌‌شوند. تا به امروز متجاوز از 4000 فلاونوئید شناخته شده است که به طور وسیعی در برگ‌‌ها، دانه‌‌ها، پوسته و گل‌‌های گیاهی وجود دارند. به‌‌طور کلی فلاونوئیدها بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی فنلی در گیاهان هستند و به دلیل حضور آن‌ها در تقریبا همه گروه‌‌های گیاهی، در بیشتر مطالعات مربوط به عصاره‌‌های گیاهی مورد بررسی قرار می‌‌گیرند (مدیکا و همکاران، 2004).

جدول 2-1- طبقهبندی ترکیبات فنلی (ورمریس و نیکولسون، 2006).

فلاونوئیدها به عنوان یکی از گستردهترین متابولیتهای ثانویه در گیاهان هستند که فعالیتهای مختلفی را بر عهده دارند. آنها دارای اثرات و عملکرد بسیار مفیدی بر سلامتی انسان هستند که دارای شش زیر گروه میباشند: فلاوونها، ایزو فلاوونها، فلاونولها، فلاونون، آنتوسیانین‌‌ها و آنتوسیانیدین. فلاونوئیدها معمولاً در واکوئل گیاهان به صورت گلیکوزید تجمع مییابند. فلاونها مخصوصا کامپفرول و کوئرستین در بسیاری از گونههای گیاهی وجود دارد که برای جوانهزنی گرده و رشد لوله گرده ضروری است (جاکولا و هوتولا، 2010؛ کاسیمیر و مین، 2008).
فلاونوئیدها ترکیبات دیفنیل پروپانوئیدهایی هستند که تقریبا در همه گیاهان یافت می‌‌شوند و نقش‌‌های فراوانی برای این ترکیبات شناخته شده است، در گیاهان عالی، فلاونوئیدها دفاع در برابر نور ماورابنفش، پاتوژن‌‌ها و علف‌‌خوران را سبب می‌‌شوند. نقش‌‌های ویژه‌‌ آن‌ها در گیاهان، در ایجاد رنگ و تثبیت نیتروژن در گیاهانی است که دارای زندگی همزیستی‌‌اند. اثرات سلامت فلاونوئیدها بیشتر در نتیجه خاصیت آنتی‌‌اکسیدانی و توانایی کلات‌‌کنندگی آن‌ها ست. مطالعات زیادی انجام شده است تا موثر بودن فلاونوئیدها به عنوان، عوامل ضدقارچی، ضدباکتری، ضدویروسی، ضداشتعال، آنتی‌‌اکسیدانت، متعادل کننده ایمنی، بازدارنده آنزیمی و عوامل موتاژنی سمی به اثبات رساند (مدیکا و همکاران، 2004).
روتین نوعی فلاونوئید است، روتین در پیشگیری و درمان افزایش فشار خون و سایر نارسائیهای قلبی و عروقی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی مطرح است (افشار و همکاران، 1376).
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد
عملکرد، میزان و کیفیت مواد ثانویه یک گیاه در رویشگاه‌‌ها و مناطق مختلف تغییر می‌‌یابد، دلیل این امر نوسان فعالیت‌‌های متابولیکی گیاه تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی است، نتیجه تاثیر طولانی عوامل محیطی، تشکیل جمعیت‌‌های تازه زیرگونه‌‌ای یا اکوتیپ‌‌های مشتق از یک گونه گیاهی خاص است (امیدبیگی، 1388). تفاوت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بین اکوتیپ‌‌های گیاهی به اثبات رسیده است و این اختلافات می‌‌تواند به منظور انتخاب بهترین کمیت و کیفیت مورد استفاده قرار گیرد (آواتو و همکاران، 1998؛ برادلی و همکاران، 1996). در دهه اخیر در کشورهای مطرح دنیا در زمینه تولید گیاهان دارویی مانند مجارستان، ایتالیا و اسلواکی بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و ترکیبات ثانویه به منظور به کارگیری در برنامه‌‌های به‌‌نژادی صورت گرفته است و اکوتیپ‌‌های برتر نسبت به ارقام اصلاح شده شناسایی گردیده‌‌اند (من و استابا، 1986). در ارزیابی خصوصیات گیاهشناسی، درصد و اجزای اسانس اکوتیپ‌‌های آویشن کرمانی توسط مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران (1389)، نتایج نشان داد که بیشترین ارتفاع بوته، قطر بوته، تعداد شاخساره، طول و عرض برگ، وزن تر و وزن خشک بوته مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین مربوط به اکوتیپ شاهرود بود، ولی تعداد شاخساره در بوته، طول برگ و عرض برگ در هیچ یک از اکوتیپ‌‌ها با اکوتیپ دیگری اختلاف معنی‌‌داری نداشت. عسکرزاده و همکاران (1387) در مقایسه 8 اکوتیپ زیرهکوهی از نقاط مختلف ایران در شرایط مزرعه به منظور بررسی عملکرد کمی و کیفی گزارش کردند که بیشترین عملکرد تکبوته مربوط به اکوتیپ منطقه خواجه خراسان و کمترین عملکرد مربوط به اکوتیپ کوه باقران بیرجند بود. نتایج مطالعه‌‌ای روی بررسی مورفولوژی، فنولوژی و برخی مشخصات کیفی چند اکوتیپ علف باغ از مناطق مختلف ایران و یک اکوتیپ خارجی در شرایط آزمایشگاه نشان داد که بالاترین ارتفاع بوته مربوط به اکوتیپ همدان و کمترین مربوط به اکوتیپ کرج، بیشترین میزان وزنتر متعلق به اکوتیپ خارجی و کمترین متعلق به اکوتیپ همدان بود در حالیکه بیشترین وزن خشک در اکوتیپ اردبیل و کمترین در اکوتیپ خارجی مشاهده شد (علیزاده و جعفری، 2011). به منظور بررسی اجزای عملکرد، مورفولوژی اکوتیپ‌‌های بومی یونجه کشور ترکیه آزمایشی توسط سینگ در سال 2002 انجام شد و نتایج این آزمایش بدین صورت بود که بالاترین ارتفاع بوته متعلق به اکوتیپ محمودی و کوتاهترین متعلق به اکوتیپ ارسیس3 بود، اکوتیپ قاسم‌‌اوغلو بیشترین تعداد ساقه و اکوتیپ‌‌های الاکوی و کایرباسی کمترین تعداد ساقه را داشتند، بیشترین تعداد غلاف در اکوتیپ محمودی و کمترین در اکوتیپ گلگورن مشاهده شد.
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیتهای ثانویه
اصولاً مواد ثانویه به اقتضای ساختار طبیعی (وراثت) و هم تحت تاثیر تهییج‌‌های غیرطبیعی(تنشی) در گیاه ساخته می‌‌شوند به‌طوری‌که حضور برخی از این مواد در تعدادی از افراد یک گونه، به‌طور مستثنی از افراد دیگر ممکن است به منزله نشانه فعالیت ژن‌‌های خاص سازگاری آن افراد نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی به شمار آید و افراد مذکور را به عنوان یک جمعیت زیرگونه‌‌ای متفاوت از بقیه که نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی پاسخ شیمیایی ویژه‌‌ای دارند معرفی کند (فیتر و هی، 1987). طی مطالعه‌‌ای با هدف بررسی توده‌‌های محلی مرزه تابستانه نتایج نشان داد که تنوع قابل توجهی از نظر صفات بیوشیمیایی بین توده‌‌ها وجود دارد، میانگین بازده اسانس توده‌های مختلف بین 57/0 و 9/2 درصد متنوع بود که کمترین مقدار آن در توده ارومیه و بیشترین آن متعلق به توده اهواز بود، توده‌‌های اراک، نیشابور، مریوان و اهواز به ترتیب با میزان کارواکرول 3/83، 3/83، 9/76 و 67 درصد در گروه توده‌های غنی از کارواکرول قرار گرفتند (هادیان، 1387).
نتایج تحقیقی با موضوع ارزیابی درصد و اجزای اسانس چندین اکوتیپ‌‌ آویشن کرمانی از مناطق مختلف کشور با ارتفاع مختلف نشان داد که بازده اسانس بر حسب حجم اسانس در 100 گرم سرشاخه خشک در اکوتیپ کرمان- راین، 5/2 درصد، در اکوتیپ کرمان- سیرچ، 9/1 درصد، در اکوتیپ یزد، 2 درصد، در اکوتیپ شاهرود، 8/1 درصد و در اکوتیپ اصفهان، 5/1 درصد بود. همچنین در بررسی میزان ترکیبات غالب اسانس، بیشترین میزان کارواکرول در اکوتیپ کرمان- راین و بیشترین میزان تیمول در اکوتیپ شاهرود مشاهده شد (مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران، 1389). زینلی و همکاران (1386) در بررسی ژنوتیپ‌‌های مختلف دو گونه نعناع لانگیفولیا و اسپیکاتا پس از استخراج اسانس، شناسایی و تعیین مقدار اجزای اسانس با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی، گزارش کردند که توده‌‌های مختلف از لحاظ میزان اسانس و ترکیبات اسانس با هم اختلاف قابل‌‌ توجهی داشتند، این محققین اختلاف در میزان اسانس را مربوط به بالا بودن تعداد برگ و ارتفاع زیاد در تیمارهای با اسانس بالا اعلام کرد و پیشنهاد کردند که از این فاکتورها می‌‌توان به عنوان معیار انتخاب در بین ژنوتیپ‌ها در جهت افزایش عملکرد اسانس استفاده نمود. نری و همکاران (2009) در آزمایشی به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی اکوتیپ‌‌های مختلف شاه‌‌بلوط شیرین مناطق مختلف ایتالیا به این نتیجه رسیدند که بالاترین میزان ساکارز در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا و کمترین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو بود درحالیکه بیشترین میزان پروتئین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو و کمترین میزان در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا مشاهده شد، همچنین درصد اسید مالیک، پلی‌‌فنل‌‌ها و خواص آنتی‌‌اکسیدانتی در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو به طور معنی‌‌داری بالاتر از اکوتیپ وال‌‌کاستلانا بود. طی مطالعه‌‌ای مقایسه‌‌ای اکوتیپ‌‌های مختلف سیر از مناطق مختلف کشور از لحاظ میزان ماده آلیسین مورد مقایسه قرار داده شدند و نشان داده شد که اختلاف در میزان آلیسین در بین اکوتیپ‌‌ها نسبتاً زیاد بود بهطوری که بالاترین میزان (13 درصد) در اکوتیپ گرگان و کمترین میزان (61/1 درصد) در اکوتیپ تالش یک بود، و اکوتیپ‌‌های تارم 1، تربت‌‌جام، بهشهر و تالش 2 از لحاظ میزان آلیسین با هم اختلاف معنی‌‌داری نداشتند.
همتی و همکاران (1386) با بررسی تاثیر اقلیم و اندامهای مختلف روی برخی فلاونویید‌‌های درختچه سرخ ولیک، نشان دادند که اثرات متقابلی بین مکان و صفات وجود دارد و آن‌ها به این نتیجه رسیدند که میزان کوئرستین در اندام کل گیاه سرخ ولیک در کلاردشت مازندران بیشتر از گرگان بود. در بررسی دیگری که جایمند و همکاران (1388) با استفاده از استخراج و اندازهگیری ترکیب‌‌های فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی در مناطق غربی ایران انجام دادند دریافتند که بهترین اکشن‌‌ها از نظر میزان ترکیب‌‌های کامفرول و کوئرستین به ترتیب شامل آذربایجان غربی، ایلام و اردبیل بودند.
یکی از محققان در سال 1973 نسبت به کاشت گونه‌‌ای گل انگشتانه‌‌ در چهار نقطه که از نظر ارتفاع متفاوت بودند (بین 660 تا 1840 متر ارتفاع از سطح دریا) اقدام نموده و پس از مطالعات لازم به این نتیجه رسید که کاشت این گیاه در ارتفاعات بالا بویژه سبب کاهش برخی کلیکوزیدها می‌‌گردد (امیدبیگی، 1384). در تحقیقاتی که در سال 1975 در اتیوپی روی گونه‌‌ای از ریحان انجام گرفت معلوم گردید که در ارتفاعات پایین مقدار لینالول موجود در اسانس گیاه مذکور افزایش می‌‌یابد، در حالی که کاشت این گیاه در ارتفاعات باعث افزایش تولید اوژنول موجود در اسانس می‌‌گردد (امید بیگی، 1384).
تجلی و همکاران (2002) با بررسی تأثیر ارتفاع و اندامها بر روی فنول و فلاونوئید گیاه Carateagus Microphylla بیان داشتند که این گیاه در ارتفاع 1000 متری، دارای بیشترین سطح فنول و فلاونوئید نسبت به گیاهان رشد یافته در ارتفاعات پست بوده است. قاسمی و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتی اکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد.
گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تأثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتی‌کسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیای غربی نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
سپهری‌‌فر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی در عصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره‌‌قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌‌باشد.
نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (2006) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمعآوری شده در سالهای متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

-104361-473572

3- مواد و روش‌ها
3-1- مواد گیاهی
در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
3-2- وسایل و دستگاههای مورد استفاده
کلروفیلسنج: جهت اندازهگیری میزان کلروفیل برگ
خطکش
ترازوی دیجیتال
آسیاب برقی
دستگاه موقعیت سنج (GPS)
سانتریفوژ آزمایشگاهی
دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
3-3- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرفها از شرکت مرک و حلالها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
3-4- آمادهسازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمعآوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال 1390 در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال 91) جهت جمعآوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمعآوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل 3-1). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با استفاده از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش 18 عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمعآوری شد با استفاده از دستگاه موقیعتسنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول 3-1). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول 3-2). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 13 صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گلآذین، تعداد گلآذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.

جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

3-7- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره 18 گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن100 میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با 10 سی‌‌سی متانول 80 درصد (نسبت 1 به 10) مخلوط شد. سپس نمونهها به مدت 24 ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک میباشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکیوالانت اسید گالیک بیان میگردد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با 16/1 میلی‌‌لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از 8-1 دقیقه استراحت، 300 میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (6/10 گرم در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در حمام بخار oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیکاسید (50، 100، 200، 250، 350 میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (50:50) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل 3-2).

شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) استفاده شد؛ به این صورت که 5/0 میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلی‌‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید 10درصد در اتانول (10 گرم آلومینیوم کلرید در 100 میلی‌‌لیتر اتانول و آبمقطر)، 1/0 میلی‌‌لیتر استاتپتاسیم یکمولار (41/2 گرم در 10 میلی‌‌لیتر آب مقطر) و 8/2 میلی‌‌لیتر آبمقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (10، 50، 100 و 200 میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل 3-3).

شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC
3-8-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- 7100
دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- 2450
آون ستون: هیتاچی ال-2300
نوع ستون: آر پی- 18 با ابعاد 6/4 250 میلی‌متر و اندازه ذرات 5 میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 1 میلیلیتر اسیداستیک، 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و 10 میلیلیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استاندارد‌‌های اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های 10، 20، 50، 100، 150 و 200 و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های 20، 25، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-4 و 3-5).
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد اسید کلروژنیک و اسید کافئیک به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد نمونهها در طول موج 330 نانومتر قرائت شد.
میزان اسید کلروژنیک و اسید کافئیک بر حسب درصد بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم. واحد مجهول (x) برحسب پی‌‌پی‌‌ام می‌‌باشد.

شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک

شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC
3-9-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فلاونوئیدی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 50 میلیلیتر متانول خالص مرک، 49 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه شده و 1 میلیلیتر اسید استیک با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر (مدت زمانی که طول می‌‌کشد تا ترکیب مورد نظر از ستون خارج شود) و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان روتین تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک نمونه بیان گردید (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد برای روتین غلظت‌‌های 20، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-6).

شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد روتین به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به روتین در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد (شکل 3-7). برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد. نمونهها در طول موج 285 نانومتر قرائت شد. میزان روتین بر حسب درصد یا میلیگرم بر گرم وزن خشک بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم.

شکل 3-7- کروماتوگرام نمونه استاندارد روتین در دقیقه 4:50
3-10- مشخصات طرح
برای انجام این تحقیق از طرح کاملاً تصادفی به صورت آشیانه‌ای استفاده شد. در این طرح اثر چهار ارتفاع در هر یک از دو استان مازندران و گلستان بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مورد بررسی قرار گرفت. برای ویژگی‌های مورفولوژیکی از پنج تکرار و برای ویژگی‌های بیوشیمیایی از سه تکرار استفاده شد. طرح آشیانه‌ای یا نستد در واقع یک طرح کاملاً تصادفی چند مشاهده‌ای می‌باشد، در این تحقیق استان به عنوان تیمار می‌باشد و ارتفاع نقش تکرار را دارد، و از آنجایی که چند نمونه در هر ارتفاع برداشت می‌شود به این طرح‌ها چند مشاهده‌ای گفته می‌شود.
3-11- تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس داده‌های به دست آمده با نرم‌افزار SAS انجام شد و به علت معنی‌دار شدن اثر متقابل ارتفاع در استان، مقایسه میانگین این اثر به کمک نرم‌افزار MSTAT و با روش آزمون دانکن صورت پذیرفت، رسم نمودارها نیز با نرم‌افزار Excel انجام شد.

-225529-624053

4- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک
نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گزنه نشان داد که بین دو استان مازندران و گلستان در تمامی صفات به جزء تعداد گل آذین در بوته اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان، در همه صفات معنی‌دار بود (جدول 4-1). جدول 4-2 مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان را برای صفات مورفولوژیک نشان میدهد.
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که مقدار هر سه صفت طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ با افزایش ارتفاع کاهش یافت به طوریکه بیشترین مقدار طول برگ (3/14 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری استان گلستان و کمترین مقـدار آن (9/6 سانتیمتر) در ارتفاع 2250 متری استان مازندران بدست آمد.
بیشترین مقدار عرض برگ (16/9 سانتیمتر) در ارتفاع 10 متری مازندران و کمترین مقدار آن (5/5 سانتی‌متر) در ارتفاع 2250 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین نسبت طول به عرض برگ (85/1) در ارتفاع 1450 متری گلستان و کمترین مقدار آن (18/1) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد.
تجزیه همبستگی نشان داد که دو صفت طول و عرض برگ همبستگی مثبت بالا (71/0=r) دارند (جدول 4-3).

جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک

*، ** و ns به ترتیب نشان معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دارمی‌باشد.
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن

در هر ستون حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است.

جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه

*، ** و ns به ترتیب نشاندهنده معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
4-1-2- تعداد برگ در بوته
با افزایش ارتفاع، تعداد برگ در بوته کاهش محسوسی نشان داد به طوریکه در ارتفاعات پایین مازندران و گلستان تعداد برگ در بوته، به ترتیب 8/84 و 2/80 عدد بود اما در ارتفاع 2250 متری این تعداد به 2/19 و 4/36 عدد کاهش یافت.
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها
با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان، تعداد گره در گزنه کاهش اما فاصله گره‌ها افزایش نشان داد. در پایین‌ترین ارتفاع مازندران و گلستان تعداد گره به ترتیب 23 و 2/26 عدد بود اما در بالاترین ارتفاع دو استان این تعداد به 6/9 و 11 عدد کاهش یافت.
بیشترین فاصله گره (48/8 سانتی‌متر) مربوط به استان مازندران و ارتفاع 1450 متری بود که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری اختلاف معنی‌دار نداشت. کمترین فاصله گره (4/3 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد. با توجه به همستگی منفی و بالا (71/0= r) بین دو صفت تعداد و فاصله گره، می‌توان نتایج حاصله را مورد انتظار دانست، یعنی در ارتفاعات افزایش فاصله گره‌ها در نتیجه کاهش تعداد گره قابل توجیه هست.
4-1-4- قطر ساقه
بیشترین میزان قطر ساقه که به ترتیب 05/7 و 98/6 میلی‌متر بود در ارتفاعات 1450 و 2250 متری گلستان و کمترین مقدار آن (44/4 میلی‌متر) در ارتفاع 10 متری مازندران مشاهده شد.
4-1-5- قطر و طول ریشه
با افزایش ارتفاع روند مشخصی برای دو صفت قطر و طول ریشه مشاهده نشد، بهطوری که بیشترین مقدار قطر ریشه (01/5 میلی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری این استان و همچنین ارتفاع 10 متری مازندران اختلاف معنی‌داری نشان نداد (05/0 ≤ P) کمترین مقدار قطر ریشه (02/3 میلی‌متر) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین مقدار طول ریشه (01/31 سانتی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد.
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته
بین دو استان از نظر تعداد گل آذین اختلاف معنی‌دار (05/0 ≤ P) مشاهده شد. میانگین تعداد گل آذین در بوته، در گلستان 8/46 عدد بود، در حالی‌که در مازندران 35/41 عدد بود. در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، مشخص شد که استان گلستان با ارتفاع 1450 متر بیشترین تعداد گل آذین (2/59 عدد) را داشت در حالیکه در ارتفاع 750 متری مازندران کمترین تعداد گل آذین (8/35 عدد) مشاهده شد.
تعداد گل آذین در بوته با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره، قطر ساقه و طول ریشه همبستگی مثبت و معنیداری نشان داد.
اندازه گل آذین در مناطق نمونه برداری کم و بیش مشابه بود، تنها در ارتفاع 1450 متری مازندران گزنه‌هایی با اندازه گل آذین بالاتر (52/5 سانتی‌متر) نسبت به سایر مناطق مشاهده شد.
4-1-7- ارتفاع گیاه
افزایش ارتفاع نقش موثری در کاهش ارتفاع گیاه گزنه داشت، بهطوری‌که نتایج نشان داد در ارتفاعات پایین (تا 750 متر) ارتفاع بوته‌ها بالا بود اما در ارتفاعات بالاتر کاهش چشمگیری در ارتفاع گیاه مشاهده شد. بیشترین ارتفاع گیاه (3/120 سانتی‌متر) در استان مازندران با ارتفاع 750 متر بدست آمد و کمترین مقدار این صفت (2/77 سانتی متر) در ارتفاع 2250 متری مازندران مشاهده شد که البته با ارتفاع 2250 متری گلستان اختلاف معنی‌دار نداشت.
ارتفاع گیاه گزنه با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره و طول ریشه همبستگی مثبت و معنی داری داشت (جدول 4-3).
4-1-8- میزان کلروفیل
با افزایش ارتفاع میزان کلروفیل روند افزایشی داشت بهطوری که بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد در حالیکه مقدار این صفت در ارتفاع 750 متری 3/27 درصد بود. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که میزان کلروفیل با طول برگ و تعداد گره، همبستگی منفی و معنی‌دار و با فاصله گره (40/0= r) همبستگی مثبت و معنی‌داری داشت (جدول 4-3).
طبق نتایج بدست آمده، صفات مورفولوژیکی و بیوشمیایی گیاه گزنه تحت تاثیر شرایط محیطی مختلف ناشی از تغییر ارتفاع محل رویش قرار گرفتند، یهطوری‌‌که ارتفاعات بالا در دو استان مازندران و گلستان به خصوص منطقه له کوه بابل با ارتفاع 2250 متر از سطح دریا، دارای بیشترین تاثیرپذیری از افزایش ارتفاع بودند. با توجه به داده‌های هواشناسی (جدول 3-1) با افزایش ارتفاع، دما به طور محسوسی کاهش یافت به‌طوری‌که میانگین دمای سالیانه از 17 درجه سانتی‌گراد در پایینترین ارتفاع به 8 درجه سانتیگراد در بالاترین ارتفاع رسید و از آنجایی که رشدونمو اندام‌های گیاهی در شرایط دمای پایین کاهش می‌یابد بسیاری از صفات مورفولوژیکی مورد بررسی در این مطالعه نظیر طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه کاهش یافت. در بسیاری از گیاهان تاثیر دمای پایین در کاهش خصوصیات رویشی به اثبات رسیده است (امیدبیگی، 1379). همزمان با کاهش دما در ارتفاعات بالا میزان کلروفیل افزایش نشان داد، افزایش درصد کلروفیل در شرایط سرد نوعی مقاومت در برابر سرما محسوب می‌شود تا گیاه بتواند تا حدودی خسارات ناشی از کاهش فتوسنتز را جبران کند (اسپیرینگ و کارلاندر، 1979).
4-2- صفات بیوشیمیایی
نتایج تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر و دستگاه HPLC نشان داد که اثر متقابل ارتفاع در استان برای تمامی صفات معنی‌دار بود (جدول 4-4 و جدول 4-5). مقایسه میانگین نیز برای این صفات انجام شد.
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج بررسی‌ها نشان داد که با افزایش ارتفاع، میزان فنل در اندام‌های مختلف گزنه افزایش می‌یابد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل برگ (57/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر، فنل کل برگ کاهش محسوسی نشان داد، ارتفاعات بالای استان گلستان نیز از فنل بالاتری نسبت به ارتفاعات پایین ر برخوردار بودند (شکل 4-1).
میزان فنل کل ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری که بیشترین میزان آن (38/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (48/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-2).
در ریشه نسبت به اندام‌های دیگر میزان فنل کل کاهش محسوسی نشان داد و حتی اختلاف کمتری در ارتفاعات مختلف مشاهده شد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل ریشه (21/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (09/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-3).

جدول 4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه HPLC

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.

شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان میزان فلاونوئید کل در اندام‌های مختلف افزایش یافت، به‌طوری‌که بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ (64/5 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، در ارتفاع 1450 متری مازندران مقدار آن به 94/4 میلی‌گرم بر گرم رسید و پس از آن ارتفاعات بالای گلستان بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ را داشته‌اند. کمترین میزان فلاونوئید برگ (3 میلی‌گرم بر گرم) مربوط به ارتفاع 50 متری گلستان بود (شکل 4-4).
مقدار فلاونوئید کل ساقه وگل نسبت به برگ کاهش نشان داد اما همچنان در ارتفاعات بالاتر مقدار بیشتری از این ماده در اندام‌های ساقه و گل وجود داشت. بیشترین میزان فلاونوئید ساقه و گل (98/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران حاصل شد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر میزان آن کاسته شد اما در سایر مناطق نمونه برداری میزان این ماده تقریباً یکسان بود و با هم اختلاف معنی‌داری نداشتند (شکل 4-5).
فلاونوئید کل ریشه کاهش چشمگیری نسبت به برگ و ساقه و گل داشت به‌طوری‌که بیشترین میزان آن (53/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و سایر مناطق مرتفع دو استان میزان تقریباً مشابهی از فلاونوئید کل را در اندام ریشه داشتند، کمترین میزان این ماده (1/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران بدست آمد (شکل 4-6).

شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل
مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ گیاه گزنه نشان داد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع میزان کلروژنیک برگ افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (29/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن ارتفاع 2250 متری گلستان مقدار کلروژنیک بالایی داشت، کمترین مقدار این ماده (1/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-7).
در اندام‌های ساقه و گل نیز بیشترین میزان اسید کلروژنیک در ارتفاعات بالا مشاهده شد، به‌طوری‌که بیشترین مقدار این ماده (3/0 میلی‌گرم بر گرم) در رویشگاه‌های 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن سایر مناطق مرتفع دو استان قرار داشتند، کمترین مقدار کلروژنیک اسید ساقه و گل (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران دیده شد (شکل 4-8).
در ریشه گزنه نسبت به اندام‌های هوایی مقدار اسید کلروژنیک کمتری دیده شد، بهطوری‌که بیشترین مقدار این ماده (13/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع مقدار این ماده در ریشه بصورت چشمگیری کاهش یافت بهطوری که در ارتفاع 50 متری گلستان به 02/0 میلی‌گرم بر گرم رسید (شکل 4-9).

شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ گیاه گزنه نشان داد که بیشترین مقدار این ماده (054/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن ارتفاع 1450 متری این استان قرار داشت، بین سایر مناطق نمونه‌برداری اختلاف معنی‌دار مشاهد نشد (شکل 4-10).
مقدار اسید کافئیک در اندام‌های ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (065/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، سایر مناطق مرتفع دو استان در جایگاه دوم قرار گرفتند و کمترین مقدار اسید کافئیک (046/0 میلی‌گرم بر گرم) در پایین‌ترین ارتفاع گلستان مشاهده شد (شکل 4-11).
نتایج بررسی‌ها نشان داد که در ریشه گزنه اسید کافئیک کمتری نسبت به سایر اندام‌ها وجود داشت و مقدار آن در ارتفاعات پایین بسیار ناچیز بود، بیشترین مقدار این اسید (021/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بود و ارتفاع1450 متری مازندران و مناطق مرتفع گلستان در رده‌های بعدی قرار گرفتند (شکل 4-12).

شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل
در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، بر میزان روتین برگ مشاهده شد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع مقدار روتین افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (34/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن، سایر مناطق مرتفع دو استان قرار گرفتند، کمترین مقدار روتین برگ (16/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-13).
نتایج مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل نیز، روندی مشابه با روتین برگ داشت، بهطوری که بیشترین مقدار آن (37/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان دیده شد (شکل 4-14).
طبق نتایج HPLC در ریشه گیاه گزنه روتین مشاهده نشد.

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید
در همه اندام‌های گیاه گزنه، مقدار فلاونوئید کل بیشتر از فنل کل بوده است. با افزایش ارتفاع از سطح دریا میزان فنل و فلاونوئید کل به صورت چشمگیری افزایش نشان داد. در ارتفاعات کمتر از 1000 متر مقدار شیب رگرسیون بسیار کمتر از ارتفاعات بالاتر بوده است. در برگ گزنه مقدار فلاونوئید کل ارتباط بیشتری با ارتفاع نسبت به فنل کل نشان داد (96/0= r2)، به‌طوری‌که در ارتفاعات بالا شیب خط رگرسیون افزایش بیشتری نشان داد (شکل 4-15).
برخلاف برگ در اندام‌های ساقه و گل مقدار فنل کل ارتباط مثبت و معنی‌دار بیشتری با ارتفاع از سطح دریا نشان داد (95/0=r2)، بطوریکه در ارتفاعات بالاتر از 1000 متر، میزان فنل کل با شیب رگرسیونی بیشتری نسبت به فلاونوئید کل افزایش یافت (شکل 4-16).
در ریشه گیاه گزنه علاوه بر کمتر بودن مقدار فنل کل نسبت به فلاونوئید کل، پاسخ کمتری (87/0=r2) هم نسبت به افزایش ارتفاع از سطح دریا مشاهده شد (شکل 4-17).
میزان اسید کلروژنیک و روتین گیاه به طور محسوسی بیشتر از اسید کافئیک بود، همچنین بیشترین ارتباط (99/0=r2) با ارتفاع از سطح دریا، مربوط به میزان اسید کلروژنیک کل گیاه بود که بهشدت تحت تاثیر ارتفاع از سطح دریا قرار گرفت (شکل 4-18).

شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ گیاه گزنه

شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل گیاه گزنه

شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه گیاه گزنه

شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی در گیاه گزنه
میزان فنل و فلاونوئید کل و همچنین ترکیبات آن‌ها با ارتفاع از سطح دریا ارتباط مثبت و معنی‌دار داشتند، بهطوری که بیشترین میزان این ترکیبات در منطقه له کوه بابل مشاهده شد. با افزایش ارتفاع علاوه بر دما میزان رطوبت نسبی نیز کاهش یافت (جدول 3-1) و به نظر می‌رسد کاهش دما و رطوبت از مهمترین عوامل تاثیرگذار در افزایش تولید ترکیبات فنل و فلاونوئیدی باشند، هر چند در منطقه له کوه مقدار مواد آلی نیز نسبت به سایر مناطق بیشتر بود (جدول 3-2). در مطالعات مختلف تاثیر رویشگاه بر میزان متابولیت‌های ثانویه در گیاهان مختلف بررسی شده است که در اکثر موارد بر نقش رویشگاه به عنوان عامل تاثیر گذار در تجمع متابولیت‌های ثانویه تاکید شده است. مکان رشد گیاه می‌تواند از طریق تغییرات دمایی و رطوبتی بر فرآیند تشکیل مواد موثره تاثیرگذار باشد، مکانیسم تاثیرات محیط بر تجمع متابولیت‌های ثانویه به درستی روشن نیست، با این وجود این نکته روشن است که محیط از طریق تاثیری که در فرایند تولید متابولیت و عوامل مرتبط در تولید آنزیم‌ها دارد، در نوع و شدت واکنش‌های شیمیایی موثر است (همتی و همکاران، 2003؛ سیوستاوا و شیم، 2002). درجه حرارت از جمله عوامل محیطی تاثیرگذار در تشکیل و تجمع متابولیت‌های ثانویه است. بررسی‌های اولیه نشان داد که در مناطقی با درجه حرارت پایینتر تجمع فلاونوئید بیشتر است (داویس و آلبریگو، 1994). میزان مواد موثره در اندام‌های گیاهان هیچگاه ثابت نیست و متناسب با مراحل رشد گیاه و بعضی شرایط محیطی قابل تغییر است. کمیت و کیفیت ترکیبات شیمیایی وابسته به تنوع ژنتیکی، شرایط محیط و فنولوژی گیاه متغیر است (پلاتی و همکاران، 2005). در ضمن اختلاف زیادی در میزان مواد موثره یک گونه در شرایط مختلف رویشی وجود دارد (هانلیدو و همکاران، 1992). کسکیتالو و همکاران (2001) اعلام داشتند که نمی‌توان رابطه روشنی بین محصول و مقدار مواد موثره در گیاهان دارویی یافت. مهمترین عوامل در تغییرات کمی و کیفی به ترتیب به نوع گونه، زمان و مکان برداشت، تغییرات فصلی و روش‌های عصارهگیری بستگی دارد. اوماه و مازا (1996) نشان دادند که با افزایش ارتفاع بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی در اندام‌های گیاهی افزوده می‌شود. ترکیبات فلاونوئیدی جاذب نور مانند فلاونها و آنتوسیانینها، در پاسخ به اشعه یو-وی و برای محافظت بافتهای درونی ساقه و برگ از آسیبهای ناشی از این اشعه، در سلولهای اپی درمال تجمع پیدا میکنند. کامپفرول و کوئرستین از جمله این فلاونوئیدها هستند که در پاسخ به این اشعه در گیاه تولید میشوند. ارتفاع جغرافیایی در میزان متابولیتهای ثانویه مؤثر بوده است که یکی از دلایل این به کیفیت تشعشعات مخصوصا Uv-B در ارتفاعات ارتباط میدهند. اشعه Uv-B در ارتفاعات بالاتر بیشتر است و در نتیجه سبب تولید بیشتر بعضی از فلاونوئیدها میشود. (جاکولا و همکاران، 2010).
همتی و همکاران (1391) نشان دادند که میزان کورسترین اندام‌های مختلف گیاه نمدار در منطقه کلاردشت مازندران در مقایسه با منطقه گرگان بیشتر بوده است، بر طبق داده‌های هواشناسی منطقه کلاردشت نسبت به گرگان از ارتفاع بیشتر و هوای خنکتر برخوردار بوده است. علاوه بر این با توجه به اینکه منطقه کلاردشت نسبت به جنگل شصت‌کلا گرگان در ارتفاع بالاتری قرار دارد و با توجه به نقش فلاونوئیدها در حفاظت گیاه در برابر نور فرابنفش، تراکم بیشتر ترکیبات فلاونوئیدی در منطقه کلاردشت توجیح‌پذیر است. تاثیر هوای خنک بر تجمع مواد موثره اندازه‌گیری شده، می‌تواند به طولانی بودن بیشتر دوره تقسیم سلولی و فعالیت بافت گیاهی در مناطق خنک مرتبط باشد. در همین رابطه تحقیقات انجام شده روی برخی فلاونوئیدهای مرکبات نشان داد که تولید آن‌ها در مناطقی با آب و هوای خنک بیشتر ازمناطق گرم می‌باشد، زیرا طول دوره تقسیم سلولی بیشتر می‌شود و در این مرحله عوامل تولید برخی فلاونوئیدها بیشتر می‌شود (داویس و آلبریگو، 1994). میزان آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی در گیاه دارویی مامیران در دو منطقه گرگان و زیارت مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد میزان این ترکیبات در منطقه زیارت نسبت به گرگان بیشتر بود، با توجه به اینکه آب و هوای دو منطقه متفاوت است و منطقه زیارت دارای ارتفاع بالاتر و هوای سردتر است این شرایط برای گیاه تنش ایجاد کرده و تولید متابولیت‌های ثانویه افزایش یافت (قربانلی و همکاران، 1388). تحقیقات مشابه نیز نشان داد که در شرایط تنش برخی از ترکیبات ثانویه به میزان قابل توجهی در گیاه افزایش می‌یابد (آتال، 1998). قاسمی و همکاران (2011) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتیاکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد. گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتیاکسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیا نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی مورد مطالعه در این تحقیق در برگ گیاه گزنه بیشتر از اندام‌های دیگر بود، در بررسی میزان فلاونوئیدهای سرخ ولیک، میزان روتین این گیاه در برگ نسبت به گل و میوه بیشتر بود (همتی و همکاران، 2006). تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در اندام‌های مختلف گیاه ممکن است در نتیجه تغییر در برخی فعالیت‌های آنزیمی و نقش پیش ماده آن باشد (پیتر و ریچارد، 1993). در حمایت از این فرضیه محققین دیگر اشاره کردند که تنظیم کننده‌های رشد و نمو مانند هورمون‌های سیتوکنین و اسید جیبرلیک ممکن است بعضی آنزیم‌های تولید کننده فلاونوئیدها را فعال کنند (سیمور و همکاران، 1993).
سپهریفر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی درعصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌باشد.
آذریوند و همکاران (1388) در تحقیقی روی اسانس برگ و گل گیاه بومادران در ارتفاعات مختلف منطقه سیاه بیشه استان مازندران به این نتیجه رسیدند که ارتفاع بر میزان اسانس این گیاه تاثیر بسزایی داشته بطوریکه میزان ترکیبات اسانسی در ارتفاعات بالاتر بیشتر بود و این میزان در گل بیشتر از برگ بوده است.
حبیبی و همکاران (1384) با بررسی اثر ارتفاع روی اسانس گیاه دارویی آویشن وحشی منطقه طالقان به این نتیجه رسیدند که با افزایش ارتفاع مقدار ترکیبات اسانسی لینانول و آلفا ترپنین که بیشترین ترکیبات اسانسی در آویشن وحشی را تشکیل می‌دهند افزایش می‌یابد بهطوری‌که در ارتفاع 1800 متری کمترین و در ارتفاع 2800 متری بیشترین مقدار بوده است.
4-4- نتیجه‌گیری کلی
در بررسی اثر ارتفاع از سطح دریا، بر ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مشخص گردید که بین دو استان مازندران و گلستان اختلاف معنیداری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان بر صفات مورد مطالعه معنی‌دار بود، بسیاری از صفات مورفولوژیکی مثل طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه با افزایش ارتفاع کاهش و مقدار کلروفیل افزایش نشان داد. کمترین مقدار طول برگ (9/6 سانتی‌متر)، کمترین مقدار عرض برگ (8/5 سانتی‌متر) کمترین ارتفاع گیاه (2/77 سانتی‌متر) و بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در منطقه له کوه مازندران با ارتفاع 2250 متر بدست آمد. از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، در ارتفاعات بالا میزان ترکیباتی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین افزایش چشمگیری نشان داد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل (16/8 میلیگرم بر گرم)، فلاونوئید کل (15/12 میلیگرم بر گرم)، اسید کلروژنیک (72/0 میلیگرم بر گرم)، اسید کافئیک (140/0 میلیگرم بر گرم) و روتین (71/0 میلیگرم بر گرم) در کل گیاه در ارتفاع 2250 متری منطقه له کوه مازندران مشاهده شد.
4-5- پیشنهادات
با توجه به خودرو بودن گیاه گزنه توصیه می‌شود با کاشت این گیاه در شرایط کنترل شده زراعی و گلخانه‌ای زمینه جهت مطالعات بیشتر در این گیاه فراهم شود.
با توجه به کمبود تحقیقات پژوهشی در گیاه گزنه پیشنهاد می‌شود تاثیر عوامل مختلف محیطی و همچنین تنش‌ها در افزایش متابولیت‌های ثانویه این گیاه مورد بررسی قرار گیرد.
ناشناس بودن گیاه دارویی گزنه باعث می‌شود انجام یکسری مطالعات پایه سیتوژنتیکی و بررسی تنوع ژنتیکی در این گیاه ضروری به نظر آید.
تحقیقات بیشتر در زمینه دیگر ترکیبات فنل و فلاونوئیدی که در این پایاننامه مورد مطالعه قرار نگرفت.
منابع
فهرست منابع
آذرنیوند، ح.، قوام عربانی، م.، سفیدکن، ف. و طویلی، ع. 1388. بررسی تاثیر ویژگی‌های اکولوژیک (خاک و ارتفاع) بر کمیت و کیفیت اسانس گل و برگ Achillea millefolium. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 25(4):571-556.
آزاد بخت، م. 1378. رده بندی گیاهان دارویی. چاپ اول. انتشارات تیمورزاده. ص 401.
افشار، ج.، و دل اذر، ع. 1373. روتین از Ruta graveolens. مجله دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، 1، ص 12-1.
امیدبیگی، ر. 1379. رهیافت‌های تولید و فرآوری گیاهان دارویی. انتشارات طراحان نشر. مشهد. جلد 1. چاپ دوم. ص 283.
امیدبیگی، ر. 1384. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد اول، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 347.
امیدبیگی، ر. 1388. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد دوم، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 430.
تایز، ل. و زایگر، ل. 1379. فیزیولوژی گـیاهی. جلد دوم. ترجمه: کافی،م. لاهوتی، م. زند، ا. شریفی، ح. گلدانی، م. و کامکار، ح. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. ص 379.
دوازده امامی، س. 1382. کاربرد گیاهان دارویی. انتشارات نصوح. ص 113.
دوازده امامی، س. و مجنون حسینی، ن. 1387. زراعت و تولید برخی گیاهان دارویی و ادویهای. چاپ دوم. انتشارات دانشگاه تهران. ص 300.
حبیبی، ح.، مظاهری، د.، مجنون حسینی، ن.، چایچی، م.ر. و فخرطباطبایی، م. 1385. اثر ارتفاع بر روغن، اسانس و ترکیبات گیاه دارویی آویشن وحشی Thymus kotschynus منطه طالقان. مجله پژوهش و سازندگی در زراعت و باغبانی. شماره 73: 10-1.
جایمند، ک.، رضایی، م.، عصاره، م. و مشکی‌زاده، س. 1388. استخراج واندازه‌گیری ترکیبهای فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی (Rosa damascene Mill) از مناطق غربی ایران، فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 555:4-47.
حسنی، ج. 1383. شناسایی و بررسی اکولوژیکی دو جنس از گیاهان معطر Thymus و Ziziphora در استان کردستان. فصلنامه تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20(1): 17-1.
زرگری، ع. 1376. گیاهان دارویی. جلد چهارم، چاپ پنجم. انتشارات دانشگاه تهران، ص970.
زرگری، ع. 1383. گیاهان دارویی. جلد پنجم. چاپ ششم، انتشارات دانشگاه تهران، ص1010.
زینلی، ح.، رزمجو، خ. ارزانی، ا. و رضایی، م. 1386. ارزیابی دو گونه نعناع پونه سنبله‌ای و پودنه از لحاظ صفات زراعی، فیتوشیمیایی و سیتوژنتیکی. سومین همایش گیاهان دارویی. تهران، دانشگاه شاهد.
سپهری‌فر، ر. و حسنلو، ط. 1388. بررسی ترکیبات پلی‌فنلی، آنتوسیانینها و فلاونوئیدهای تام و خواص آنتی‌اکسیدانی گیاه دارویی قره قاط، جمع‌آوری شده از جهار منطقه مختلف ایران. فصلنامه گیاهان دارویی، 74:33 -66.

—c2392

فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول- مقدمه
1-1- مقدمه2
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق3
1-3- فرضیهها3
1-4- اهداف3
فصل دوم- بررسی منابع
2-1- گیاهشناسی گزنه6
2-2- دامنه انتشار7
2-3- اندام‌های دارویی8
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی8
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی9
2-6- فنل و فلاونوئید10
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد13
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیت‌های ثانویه14
فصل سوم- مواد و روشها
3-1- مواد گیاهی20
3-2- وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده20
3-3- مواد شیمیایی20
3-4- آماده‌سازی گیاه گزنه20
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-7- استخراج عصاره متانولی24
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل24
3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی25
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC26
3-8-1- آماده سازی نمونه26
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک27
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی27
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC29
3-9-1- آماده سازی نمونه29
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین29
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی30
3-10- مشخصات طرح31
3-11- تجزیه و تحلیل آماری31
فصل چهارم- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک34
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ34
4-1-2- تعداد برگ در بوته36
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها36
4-1-4- قطر ساقه37
4-1-5- قطر و طول ریشه37
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته.37
4-1-7-ارتفاع گیاه38
4-1-8- میزان کلروفیل38
4-2- صفات بیوشیمیایی39
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل39
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل42
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل44
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل46
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل48
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید50
4-4- نتیجه گیری کلی56
4-5- پیشنهادات56
منابع58
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- طبقه بندی ترکیبات فنلی12
جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک35
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن35
جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه36
جدول4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر40
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمایی مورد بررسی با دستگاه HPLC40
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه7
شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ، ب- فیروزجاه، پ- خشک کردن گزنه21
شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید25
شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین26
شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک28
شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک28
شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین30
شکل 3-7- کروماتوگرام استاندارد روتین31
شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ41
شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل41
شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه42
شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ43
شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل43
شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه44
شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ45
شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل45
شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه46
شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ47
شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل47
شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه48
شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ49
شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل49
شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ51
شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل51
شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه52
شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی52

1-1- مقدمه
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور است که امکان صادرات آن نیز وجود دارد. ایران از نظر آب و هوا در زمینه رشد گیاهان دارویی یکی از بهترین مناطق جهان محسوب می‌‌شود، به همین دلیل صادرات آن می‌‌تواند منبع بزرگی از درآمد برای کشور باشد (صمصام شریعت، 1382). بنابراین ضروریست تا با توجه به توان بالقوه بسیار خوب کشور در زمینه تنوع گیاهان دارویی، با شناخت گونه‌‌های گیاهی و دستیابی به اطلاعات لازم در مورد محل‌‌های رویش و خصوصیات بوم‌‌شناختی آن‌ها، گام‌‌های اساسی برای استفاده از اسانس‌‌های گیاهی و ترویج شیوه‌‌های اصولی بهره‌‌برداری از این گیاهان برداشته شود (حسنی، 1383).
گیاه دارویی به گیاهان و مشتقات آن‌ها گفته می‌‌شود که دارای مواد موثر مشخص است، در درمان بیماری یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می‌‌گیرد و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه‌‌های معتبر بین‌‌المللی ذکر شده باشد (دوازده امامی و مجنون‌‌حسینی، 1387).
فارماکوپه یک کتاب رسمی است که توسط دولت هر کشور و یا انجمن‌‌های پزشکی و داروسازی زیر نظر دولت به چاپ می‌‌رسد و حاوی حقایق علمی و اصول استاندارد‌‌سازی مواد دارویی از قبیل روش‌‌های جمع‌‌آوری مواد دارویی از منابع مختلف، آماده سازی، نگهداری، ترکیب و اختلاط داروهای مختلف و روش‌‌های اثبات آن‌ها می‌‌باشد. به علاوه این کتاب شامل دارو‌‌هایی با استعمال خارجی، نحوه نسخه‌‌نویسی، نحوه و مقدار تجویز دارو‌‌ها و اطلاعات کامل تهیه، ساخت و کاربرد داروهاست (دوازده امامی، 1382).
استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده‌‌های حاصل از آن‌ها نقش این گیاهان را در چرخه اقتصادی پر اهمیت کرده است. به طوری که مصرف رو به ازدیاد آن‌ها تنها به کشور‌‌های در حال توسعه محدود نشده است، بلکه اخیراً در کشور‌‌های توسعه یافته نیز جایگاه ویژه‌‌ای به خود اختصاص داده است. در اواخر قرن بیستم حجم مبادلات جهانی گیاهان دارویی به 200 میلیارد دلار بالغ گردیده است. بر اساس گزارش سازمان خوار و بار جهانی (FAO) ارزش صادرات گیاهان دارویی در سال 1995 بالغ بر 880 میلیون دلار بوده است. بر اساس گزارش بانک جهانی، حجم تجارت گیاهان دارویی تا سال 2050 بالغ بر 5 تریلیون دلار خواهد بود (امیدبیگی، 1384). در حالی که طی گزارشی میزان ارزش فروش گیاهان دارویی در ایران در سال 2000 میلادی تنها در حدود 37 میلیارد ریال برآورد شده است و این در حالی است که ایران جزء 8 کشور مهم دارای فلور متنوع گیاهان دارویی در دنیاست (قاسمی، 1389).
گزنه از مهمترین گیاهان دارویی است که از دوران ماقبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم آن زمان از آن برای تغذیه استفاده می‌کردند و از خواص درمانی آن اطلاع داشته‌اند. از کاربرد‌‌های دارویی آن می‌توان به کاهش قند خون، کاهش التهاب آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، درمان پروستات و اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق
تاثیر ارتفاع بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی (ریخت‌‌شناسی) گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اندام‌‌های گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گیاه گزنه چگونه است؟
1-3- فرضیهها
عوامل محیطی روی میزان ترکیبات ثانویه گیاه گزنه موثر است.
شرایط محیطی متنوع در زیستگاه‌های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیکی گیاه تاثیر می‌گذارند.
میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی تحت تاثیر ارتفاع قرار دارد.
1-4- اهداف
ارزیابی تاثیر اقلیم‌‌های مختلف بر صفات ریختی و عملکرد برخی مواد موثره گزنه.
معرفی بهترین ارتفاع و اندام دارویی گزنه از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی.
مقایسه برخی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی موجود درگزنه در ارتفاعات مختلف.
-76508-504458

2- بررسی منابع
2-1- گیاه‌شناسی گزنه
گزنه با نام علمی Urtica dioica از خانواده Urticaceae می‌باشد. گزنه، گیاهی است علفی، چند‌‌ساله، پایا، دوپایه و بندرت تکپایه، ریزوم‌‌دار، به ارتفاع 150-50 سانتیمتر، دارای کرک‌‌های گزنده، ساقه آن علفی، کمی زاویه‌‌دار و چهار پهلو، تقریباً ضخیم، ساده و یا خیلی کمانشعاب و پوشیده از کرک‌‌های گزنده، برگ‌‌ها نیزه‌‌ای، نیزه‌‌ای باریک، تخممرغی، تخممرغی پهن تا تقریبا دایره‌‌ای، نوک تیز یا نوک باریک، قاعده قلبی، باریک یا گوه‌‌ای، اندازه برگ 5/2-12×5/4-15 سانتیمتر، رنگ برگ‌‌ها سبز روشن است. برگ‌‌ها عموما گوشواره‌‌دار و گاه بدون گوشواره، متقابل و پوشیده از کرک‌‌های گزنده است. گل‌‌های آن، تک جنسی، بسیار ریز، سبز فام، مجتمع در توده‌‌های کوچک کروی، و واقع در طول محورهای خوشه‌‌ای شکل، گل‌‌های نر دارای 4 کاسبرگ هم اندازه و 4 پرچم با بساک‌‌های پهن دراز و قلوه‌‌ای شکل، ماده‌‌ها دارای 4 کاسبرگ متقابل صلیبی، دو کاسبرگ خارجی بسیار کوچک و گاهی گل فاقد آن و رنگ آن‌ها سبز مایل به زرد می‌‌باشد. گلآذین سنبله یا خوشهای مرکب، کرکی متراکم، گل‌آذین نر 4-11 سانتیمتر و ماده 5/1-9 سانتیمتر میباشد میوه آن فندقه تخم‌مرغی تا بیضوی و محتوی آلبومین روغن‌‌دار است. فندقه به طول 5/1 میلی‌‌متر و محصور در کاسه پایای گل می‌‌باشد (شکل 2-1)، (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ قهرمان، 1372).
تکثیر آن از طریق کاشت بذر در بهار یا تابستان و کاشت قطعات ریشه‌‌دار در پاییز صورت می‌‌گیرد (زرگری، 1383).

شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه (ویلر، 1981)
2-2- دامنه انتشار
این گیاه غالبا در اماکن مخروبه، باغ‌‌ها، و نقاط مرطوب خارج شهر و نواحی سایه‌‌دار و جاهایی که چهار‌‌پایان در آنجا به سر می‌‌برند، به حالت خودرو می‌‌روید. از ریشه‌‌‌‌های خزنده آن پاجوش‌‌هایی در کلیه جهات خارج می‌‌گردد که خود باعث می‌‌شود گیاه بصورت پایه‌‌های متعدد در آمده، تا محل رویش خود را به کلی فرا گیرد. انتشار عمومی گیاه گزنه در نقاط مرطوب ایران خصوصاً نواحی شمالی، غربی و مرکزی مانند اصفهان، شاهرود، بسطام و کاشان است (زرگری، 1376).
2-3- اندام‌های دارویی
برگ‌‌ها، ریشه، دانه و شیرابۀ گیاه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌‌دهند (زرگری، 1376). گلدهی آن از اواسط اردیبهشت تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد و بهترین زمان برداشت و جمع‌‌آوری برگ‌‌‌‌های این گیاه از اردیبهشت‌‌ تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی
گزنه دارای تانن، موسیلاژ، اسید فورمیک، ماده مومی، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کنندگی پوست، نیتراتپتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن‌‌دار، گوگرد و نوعی ماده رنگی به نام اورتی‌‌سین در سر شاخه هوایی می‌‌باشد (زرگری، 1376). در برگ گیاه گزنه، کلروفیل، گزانتوفیل، لوکوآنتوسیانیدین، فلاوون و فلاونول موجود است که فلاوون و فلاونول به میزان کمتری از لوکوآنتوسیانیدین در این گیاه است. تری‌‌ترپن‌‌ها و استرول‌‌ها شامل بتاسیتوسترول در گیاه موجود است. اسید فرمیک نیز در برگ وجود دارد. برگ‌‌های تازه گزنه حاوی سکرتین می‌‌باشد. همین‌‌طور دارای 5/1 درصد کلروفیل خالص است. برگ خشک گزنه 5/7 درصد کلروفیل دارد. اسیدهای فنلی نیز در این گیاه وجود دارد که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، اسکولتین و کافئوئیل مالیک اسید و کلروژنیک اسید می‌‌باشد. تری گلیسیرید، دی گلیسیرید و فسفولیپید‌‌های مختلفی هم از این گیاه جدا شده است. سیتوکنین‌‌های عمده گزنه شامل زآتین، زآتین نوکلئوتید، ایزو پنتیل آدنین، ایزو پنتیل آدنوزین، ایزو پنتیل آدنین نوکلئوتید و دی هیدرو زآتین می‌‌باشد. همچنین ترکیبات ایندولی همراه با هیستامین و 5- هیدروکسی تریپتامین و اسید‌‌هایی از جمله اسید آسکوربیک، سالیسیلیک اسید و عناصری مانند ازت، گوگرد، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و عناصر نادر مانند آهن، روی، مولیبدن و مس موجود است (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
ترکیبات فنلی موجود در گزنه که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، فیستین و میریستین می‌‌باشند. بر باکتری‌‌هایی مثل اشریشیاکلی، پروتئوس ‌‌ولگاریکوس، کلبسیلا و پسودوموناس اثر دارد و عصاره این گیاه بر سالمونلا و پروتئوس که در مقابل آنتی‌‌بیوتیک‌‌ها مقاوم است، خاصیت آنتی‌‌بیوتیکی دارد. همچنیین باعث وقفه در رشد چندین مخمر، کپک، قارچ و باکتری شده است. اثرات ضد قارچی بعضی ترکیبات موجود در گزنه نیز تائید شده است. گزنه دارای اثرات مدری است. اثرات دیورتیک این گیاه با افزایش دفع کلر و اوره همراه است و ثابت شده که مصرف 14 روزه این گیاه موجب کاهش وزن بدن و نیز کاهش فشار سیستولیک می‌‌گردد (محمودی و همکاران، 2007). گزنه بصورت خوراکی به عنوان مدر، پایین آورنده قند خون و اسید اوریک و به صورت موضعی در درمان برخی از بیماری‌‌های پوستی و مو از جمله اگزما، بیماری‌‌های التهابی و حتی در درمان ریزش مو مورد استفاده قرار می‌‌گیرد (محمودی و همکاران، 2007). اعتقاد بر این است که جوشانده گیاه و خیسانده ریشه آن در الکل بصورت لوسیون در رشد موی سر موثر است. همچنین عصاره ریشه گزنه در بعضی حالات هیپرتروف غده پروستات را بهبود می‌بخشد (آزاد بخت، 1378). از دیگر کاربردهای دارویی گزنه می‌‌توان به درمان آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، بزرگ شدگی ‌‌پروستات، حساسیت فصلی و درمان اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی
پراکنش و استقرار گیاهان اصولاً تحت تاثیر شرایط محیط و عوامل داخلی گیاه صورت می‌‌گیرد. مهم‌‌ترین عوامل موثر بر ترکیبات شیمیایی ثانویه گیاهان عوامل ژنتیکی، محیطی و اثرات متقابل آن‌ها ست. عوامل ژنتیکی مربوط به ژنوم گیاه است. از عوامل محیطی و اکولوژیکی مؤثر می‌‌توان عوامل آب و هوایی، جغرافیایی و ادافیکی (خاکی) را نام برد. عوامل آب و هوایی مانند دما، بارندگی، طول روز، نور خورشید، تبخیر و تعرق و باد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌‌های ثانویه این گیاهان دارند. ارتفاع از سطح دریا، درصد شیب و جهت آن، عرض جغرافیایی، پوشش اراضی، نزدیکی به منابع آبی به طور مستقیم یا غیر مستقیم به واسطه تأثیر بر سایر عوامل بوم شناسی بر سنتز ترکیبات ثانویه به خصوص اسانس در گیاهان موثر هستند. خصوصیات خاک مثل بافت خاک، مواد آلی، آهک، شوری و اسیدیته از فاکتورهای محیطی می‌‌باشند که باید مورد مطالعه قرار گیرند. در صورتیکه گیاه اهلی شده باشد عوامل مدیریتی نیز تاحدودی بر درصد ترکیبات ثانویه گیاهان دارویی موثر است (قاسمی، 1389). از مهمترین عوامل محیط رویش گیاهان که تاثیر بسیار عمده‌‌ای بر کمیت و کیفیت مواد موثره آن‌ها می‌‌گذارند، نور، درجه‌‌حرارت، آبیاری و ارتفاع محل می‌‌باشد (امید بیگی، 1384). بر پایه تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محـور زیـر بر آن‌ها تاثیـر می‌‌گـذارد: 1- تاثیر بر مقدار کلی ماده موثره گیاهان دارویی؛ 2- تاثیر بر عناصر تشکیل دهنده مواد موثره؛ 3- تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه (امیدبیگی، 1384).
به‍طور‌‌ کلی مواد مؤثره گیاهان دارویی که حاصل سوخت‌‌و‌‌ساز (متابولیسم) ثانویه است به ‍عنوان ترکیبــات ثانویه معروف می‌‌باشند. این ترکیبات عموماً وزن مولکولی کمتر از 1000 داشته و به ‍مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول‌های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولیـد می‌شوند. گیـاهان دارای این نوع مکانیـسم‌ها، نسبت به سایر گیاهان از سازگاری و بقای طولانی‌‌تری برخوردارند (تایز و زایگر، 1379). مهـم‍ترین آن‌ها آلــکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن‌‌های فرار (اسانس‌ها)، فنلها، تانن‌ها، فلاونوئیدها و غیره هستند. تولید این ترکیبات برای گیاه گران و هزینه‍بر می‌باشند، ولی گیاه این ترکیبات را بیهوده تولید نمی‌کند و اهـداف خاصی جهت تولید، ترشح و ذخیره آن‌ها دارد که مهم‍ترین این وظایف به شرح زیر است:
- دفع عوامل بیماریزا
- دفع آفات و حیـوانات گیاه‍خوار
- افزایش توان رقابتی گیاه بر سر منابع مانند نور، آب و مواد غذایی
- جلب حشرات و پرندگان گردهافشان
- رفع تنشهای غـیرزنده و حفاظت در برابر اشعۀ ماوراء بنفش (قاسمی، 1389).
2-6- فنل و فلاونوئید
ترکیبات فنلی به یک گروه وسیع و متنوعای از ترکیبات شیمیایی اطلاق میشود که این ترکیبات می‌‌توانند به روش‌‌های مختلفی طبقه‌‌بندی شوند. هاربورن و سیموندس این ترکیبات را به گروه‌‌هایی بر اساس تعداد کربن‌‌های موجود در مولکول طبقه‌بندی کردند (جدول 2-1) (ورمریس و نیکولسون، 2006).
ترکیبات فنولی در طی رشد و نمو با هدایت عوامل ژنتیکی و در پاسخ به محرکهای محیطی از جمله آلودگی، زخم و تابش فرابنفش ساخته میشوند که از میان آنها میتوان به لیگنینها، لیگنانها، فنلهای ساده و اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها اشاره کرد. این ترکیبات بخش جدایی ناپذیری در رژیم غذایی بشر بوده و به دلیل ویژگیهای آنتیاکسیدانی قوی و ضدسرطانی، بسیار مورد توجه است (قربانی و همکاران، 1390؛ محمد و همکاران، 2001؛ دینکا و همکاران، 2004؛ اسکین و رابینسون، 2000).
ترکیبات فنولی دارای خواص متعددی از جمله خواص آنتی باکتریال، ضدقارچ، ضدویروس، ضددیابت، ضدالرژی و ضدالتهاب هستند. اما بیشتر به منظور فعالیت‌های ضدویروسی و آنتی‌اکسیدانیشان شهرت دارند به خصوص در بعضی از اسیدهای فنولیکی مانند اسیدکلرژنیک، اسیدگالیک و اسیدکافئیک (دیمیتری جویک و همکاران، 2010).
فلاونوئیدها دسته‌‌ای از ترکیبات طبیعی هستند که در سلسله گیاهان گسترش وسیعی دارند. آن‌ها به عنوان یکی از بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی شناخته می‌‌شوند. تا به امروز متجاوز از 4000 فلاونوئید شناخته شده است که به طور وسیعی در برگ‌‌ها، دانه‌‌ها، پوسته و گل‌‌های گیاهی وجود دارند. به‌‌طور کلی فلاونوئیدها بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی فنلی در گیاهان هستند و به دلیل حضور آن‌ها در تقریبا همه گروه‌‌های گیاهی، در بیشتر مطالعات مربوط به عصاره‌‌های گیاهی مورد بررسی قرار می‌‌گیرند (مدیکا و همکاران، 2004).

جدول 2-1- طبقهبندی ترکیبات فنلی (ورمریس و نیکولسون، 2006).

فلاونوئیدها به عنوان یکی از گستردهترین متابولیتهای ثانویه در گیاهان هستند که فعالیتهای مختلفی را بر عهده دارند. آنها دارای اثرات و عملکرد بسیار مفیدی بر سلامتی انسان هستند که دارای شش زیر گروه میباشند: فلاوونها، ایزو فلاوونها، فلاونولها، فلاونون، آنتوسیانین‌‌ها و آنتوسیانیدین. فلاونوئیدها معمولاً در واکوئل گیاهان به صورت گلیکوزید تجمع مییابند. فلاونها مخصوصا کامپفرول و کوئرستین در بسیاری از گونههای گیاهی وجود دارد که برای جوانهزنی گرده و رشد لوله گرده ضروری است (جاکولا و هوتولا، 2010؛ کاسیمیر و مین، 2008).
فلاونوئیدها ترکیبات دیفنیل پروپانوئیدهایی هستند که تقریبا در همه گیاهان یافت می‌‌شوند و نقش‌‌های فراوانی برای این ترکیبات شناخته شده است، در گیاهان عالی، فلاونوئیدها دفاع در برابر نور ماورابنفش، پاتوژن‌‌ها و علف‌‌خوران را سبب می‌‌شوند. نقش‌‌های ویژه‌‌ آن‌ها در گیاهان، در ایجاد رنگ و تثبیت نیتروژن در گیاهانی است که دارای زندگی همزیستی‌‌اند. اثرات سلامت فلاونوئیدها بیشتر در نتیجه خاصیت آنتی‌‌اکسیدانی و توانایی کلات‌‌کنندگی آن‌ها ست. مطالعات زیادی انجام شده است تا موثر بودن فلاونوئیدها به عنوان، عوامل ضدقارچی، ضدباکتری، ضدویروسی، ضداشتعال، آنتی‌‌اکسیدانت، متعادل کننده ایمنی، بازدارنده آنزیمی و عوامل موتاژنی سمی به اثبات رساند (مدیکا و همکاران، 2004).
روتین نوعی فلاونوئید است، روتین در پیشگیری و درمان افزایش فشار خون و سایر نارسائیهای قلبی و عروقی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی مطرح است (افشار و همکاران، 1376).
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد
عملکرد، میزان و کیفیت مواد ثانویه یک گیاه در رویشگاه‌‌ها و مناطق مختلف تغییر می‌‌یابد، دلیل این امر نوسان فعالیت‌‌های متابولیکی گیاه تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی است، نتیجه تاثیر طولانی عوامل محیطی، تشکیل جمعیت‌‌های تازه زیرگونه‌‌ای یا اکوتیپ‌‌های مشتق از یک گونه گیاهی خاص است (امیدبیگی، 1388). تفاوت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بین اکوتیپ‌‌های گیاهی به اثبات رسیده است و این اختلافات می‌‌تواند به منظور انتخاب بهترین کمیت و کیفیت مورد استفاده قرار گیرد (آواتو و همکاران، 1998؛ برادلی و همکاران، 1996). در دهه اخیر در کشورهای مطرح دنیا در زمینه تولید گیاهان دارویی مانند مجارستان، ایتالیا و اسلواکی بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و ترکیبات ثانویه به منظور به کارگیری در برنامه‌‌های به‌‌نژادی صورت گرفته است و اکوتیپ‌‌های برتر نسبت به ارقام اصلاح شده شناسایی گردیده‌‌اند (من و استابا، 1986). در ارزیابی خصوصیات گیاهشناسی، درصد و اجزای اسانس اکوتیپ‌‌های آویشن کرمانی توسط مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران (1389)، نتایج نشان داد که بیشترین ارتفاع بوته، قطر بوته، تعداد شاخساره، طول و عرض برگ، وزن تر و وزن خشک بوته مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین مربوط به اکوتیپ شاهرود بود، ولی تعداد شاخساره در بوته، طول برگ و عرض برگ در هیچ یک از اکوتیپ‌‌ها با اکوتیپ دیگری اختلاف معنی‌‌داری نداشت. عسکرزاده و همکاران (1387) در مقایسه 8 اکوتیپ زیرهکوهی از نقاط مختلف ایران در شرایط مزرعه به منظور بررسی عملکرد کمی و کیفی گزارش کردند که بیشترین عملکرد تکبوته مربوط به اکوتیپ منطقه خواجه خراسان و کمترین عملکرد مربوط به اکوتیپ کوه باقران بیرجند بود. نتایج مطالعه‌‌ای روی بررسی مورفولوژی، فنولوژی و برخی مشخصات کیفی چند اکوتیپ علف باغ از مناطق مختلف ایران و یک اکوتیپ خارجی در شرایط آزمایشگاه نشان داد که بالاترین ارتفاع بوته مربوط به اکوتیپ همدان و کمترین مربوط به اکوتیپ کرج، بیشترین میزان وزنتر متعلق به اکوتیپ خارجی و کمترین متعلق به اکوتیپ همدان بود در حالیکه بیشترین وزن خشک در اکوتیپ اردبیل و کمترین در اکوتیپ خارجی مشاهده شد (علیزاده و جعفری، 2011). به منظور بررسی اجزای عملکرد، مورفولوژی اکوتیپ‌‌های بومی یونجه کشور ترکیه آزمایشی توسط سینگ در سال 2002 انجام شد و نتایج این آزمایش بدین صورت بود که بالاترین ارتفاع بوته متعلق به اکوتیپ محمودی و کوتاهترین متعلق به اکوتیپ ارسیس3 بود، اکوتیپ قاسم‌‌اوغلو بیشترین تعداد ساقه و اکوتیپ‌‌های الاکوی و کایرباسی کمترین تعداد ساقه را داشتند، بیشترین تعداد غلاف در اکوتیپ محمودی و کمترین در اکوتیپ گلگورن مشاهده شد.
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیتهای ثانویه
اصولاً مواد ثانویه به اقتضای ساختار طبیعی (وراثت) و هم تحت تاثیر تهییج‌‌های غیرطبیعی(تنشی) در گیاه ساخته می‌‌شوند به‌طوری‌که حضور برخی از این مواد در تعدادی از افراد یک گونه، به‌طور مستثنی از افراد دیگر ممکن است به منزله نشانه فعالیت ژن‌‌های خاص سازگاری آن افراد نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی به شمار آید و افراد مذکور را به عنوان یک جمعیت زیرگونه‌‌ای متفاوت از بقیه که نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی پاسخ شیمیایی ویژه‌‌ای دارند معرفی کند (فیتر و هی، 1987). طی مطالعه‌‌ای با هدف بررسی توده‌‌های محلی مرزه تابستانه نتایج نشان داد که تنوع قابل توجهی از نظر صفات بیوشیمیایی بین توده‌‌ها وجود دارد، میانگین بازده اسانس توده‌های مختلف بین 57/0 و 9/2 درصد متنوع بود که کمترین مقدار آن در توده ارومیه و بیشترین آن متعلق به توده اهواز بود، توده‌‌های اراک، نیشابور، مریوان و اهواز به ترتیب با میزان کارواکرول 3/83، 3/83، 9/76 و 67 درصد در گروه توده‌های غنی از کارواکرول قرار گرفتند (هادیان، 1387).
نتایج تحقیقی با موضوع ارزیابی درصد و اجزای اسانس چندین اکوتیپ‌‌ آویشن کرمانی از مناطق مختلف کشور با ارتفاع مختلف نشان داد که بازده اسانس بر حسب حجم اسانس در 100 گرم سرشاخه خشک در اکوتیپ کرمان- راین، 5/2 درصد، در اکوتیپ کرمان- سیرچ، 9/1 درصد، در اکوتیپ یزد، 2 درصد، در اکوتیپ شاهرود، 8/1 درصد و در اکوتیپ اصفهان، 5/1 درصد بود. همچنین در بررسی میزان ترکیبات غالب اسانس، بیشترین میزان کارواکرول در اکوتیپ کرمان- راین و بیشترین میزان تیمول در اکوتیپ شاهرود مشاهده شد (مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران، 1389). زینلی و همکاران (1386) در بررسی ژنوتیپ‌‌های مختلف دو گونه نعناع لانگیفولیا و اسپیکاتا پس از استخراج اسانس، شناسایی و تعیین مقدار اجزای اسانس با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی، گزارش کردند که توده‌‌های مختلف از لحاظ میزان اسانس و ترکیبات اسانس با هم اختلاف قابل‌‌ توجهی داشتند، این محققین اختلاف در میزان اسانس را مربوط به بالا بودن تعداد برگ و ارتفاع زیاد در تیمارهای با اسانس بالا اعلام کرد و پیشنهاد کردند که از این فاکتورها می‌‌توان به عنوان معیار انتخاب در بین ژنوتیپ‌ها در جهت افزایش عملکرد اسانس استفاده نمود. نری و همکاران (2009) در آزمایشی به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی اکوتیپ‌‌های مختلف شاه‌‌بلوط شیرین مناطق مختلف ایتالیا به این نتیجه رسیدند که بالاترین میزان ساکارز در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا و کمترین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو بود درحالیکه بیشترین میزان پروتئین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو و کمترین میزان در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا مشاهده شد، همچنین درصد اسید مالیک، پلی‌‌فنل‌‌ها و خواص آنتی‌‌اکسیدانتی در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو به طور معنی‌‌داری بالاتر از اکوتیپ وال‌‌کاستلانا بود. طی مطالعه‌‌ای مقایسه‌‌ای اکوتیپ‌‌های مختلف سیر از مناطق مختلف کشور از لحاظ میزان ماده آلیسین مورد مقایسه قرار داده شدند و نشان داده شد که اختلاف در میزان آلیسین در بین اکوتیپ‌‌ها نسبتاً زیاد بود بهطوری که بالاترین میزان (13 درصد) در اکوتیپ گرگان و کمترین میزان (61/1 درصد) در اکوتیپ تالش یک بود، و اکوتیپ‌‌های تارم 1، تربت‌‌جام، بهشهر و تالش 2 از لحاظ میزان آلیسین با هم اختلاف معنی‌‌داری نداشتند.
همتی و همکاران (1386) با بررسی تاثیر اقلیم و اندامهای مختلف روی برخی فلاونویید‌‌های درختچه سرخ ولیک، نشان دادند که اثرات متقابلی بین مکان و صفات وجود دارد و آن‌ها به این نتیجه رسیدند که میزان کوئرستین در اندام کل گیاه سرخ ولیک در کلاردشت مازندران بیشتر از گرگان بود. در بررسی دیگری که جایمند و همکاران (1388) با استفاده از استخراج و اندازهگیری ترکیب‌‌های فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی در مناطق غربی ایران انجام دادند دریافتند که بهترین اکشن‌‌ها از نظر میزان ترکیب‌‌های کامفرول و کوئرستین به ترتیب شامل آذربایجان غربی، ایلام و اردبیل بودند.
یکی از محققان در سال 1973 نسبت به کاشت گونه‌‌ای گل انگشتانه‌‌ در چهار نقطه که از نظر ارتفاع متفاوت بودند (بین 660 تا 1840 متر ارتفاع از سطح دریا) اقدام نموده و پس از مطالعات لازم به این نتیجه رسید که کاشت این گیاه در ارتفاعات بالا بویژه سبب کاهش برخی کلیکوزیدها می‌‌گردد (امیدبیگی، 1384). در تحقیقاتی که در سال 1975 در اتیوپی روی گونه‌‌ای از ریحان انجام گرفت معلوم گردید که در ارتفاعات پایین مقدار لینالول موجود در اسانس گیاه مذکور افزایش می‌‌یابد، در حالی که کاشت این گیاه در ارتفاعات باعث افزایش تولید اوژنول موجود در اسانس می‌‌گردد (امید بیگی، 1384).
تجلی و همکاران (2002) با بررسی تأثیر ارتفاع و اندامها بر روی فنول و فلاونوئید گیاه Carateagus Microphylla بیان داشتند که این گیاه در ارتفاع 1000 متری، دارای بیشترین سطح فنول و فلاونوئید نسبت به گیاهان رشد یافته در ارتفاعات پست بوده است. قاسمی و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتی اکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد.
گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تأثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتی‌کسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیای غربی نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
سپهری‌‌فر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی در عصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره‌‌قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌‌باشد.
نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (2006) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمعآوری شده در سالهای متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

-104361-473572

3- مواد و روش‌ها
3-1- مواد گیاهی

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
3-2- وسایل و دستگاههای مورد استفاده
کلروفیلسنج: جهت اندازهگیری میزان کلروفیل برگ
خطکش
ترازوی دیجیتال
آسیاب برقی
دستگاه موقعیت سنج (GPS)
سانتریفوژ آزمایشگاهی
دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
3-3- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرفها از شرکت مرک و حلالها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
3-4- آمادهسازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمعآوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال 1390 در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال 91) جهت جمعآوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمعآوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل 3-1). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با استفاده از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش 18 عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمعآوری شد با استفاده از دستگاه موقیعتسنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول 3-1). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول 3-2). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 13 صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گلآذین، تعداد گلآذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.

جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

3-7- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره 18 گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن100 میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با 10 سی‌‌سی متانول 80 درصد (نسبت 1 به 10) مخلوط شد. سپس نمونهها به مدت 24 ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک میباشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکیوالانت اسید گالیک بیان میگردد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با 16/1 میلی‌‌لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از 8-1 دقیقه استراحت، 300 میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (6/10 گرم در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در حمام بخار oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیکاسید (50، 100، 200، 250، 350 میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (50:50) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل 3-2).

شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) استفاده شد؛ به این صورت که 5/0 میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلی‌‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید 10درصد در اتانول (10 گرم آلومینیوم کلرید در 100 میلی‌‌لیتر اتانول و آبمقطر)، 1/0 میلی‌‌لیتر استاتپتاسیم یکمولار (41/2 گرم در 10 میلی‌‌لیتر آب مقطر) و 8/2 میلی‌‌لیتر آبمقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (10، 50، 100 و 200 میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل 3-3).

شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC
3-8-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- 7100
دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- 2450
آون ستون: هیتاچی ال-2300
نوع ستون: آر پی- 18 با ابعاد 6/4 250 میلی‌متر و اندازه ذرات 5 میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 1 میلیلیتر اسیداستیک، 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و 10 میلیلیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استاندارد‌‌های اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های 10، 20، 50، 100، 150 و 200 و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های 20، 25، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-4 و 3-5).
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد اسید کلروژنیک و اسید کافئیک به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به اسید کلروژنیک و اسید کافئیک در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد. برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد نمونهها در طول موج 330 نانومتر قرائت شد.
میزان اسید کلروژنیک و اسید کافئیک بر حسب درصد بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم. واحد مجهول (x) برحسب پی‌‌پی‌‌ام می‌‌باشد.

شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک

شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC
3-9-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فلاونوئیدی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد.
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 50 میلیلیتر متانول خالص مرک، 49 میلی‌لیتر آب مقطر دیونیزه شده و 1 میلیلیتر اسید استیک با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر (مدت زمانی که طول می‌‌کشد تا ترکیب مورد نظر از ستون خارج شود) و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان روتین تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک نمونه بیان گردید (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد برای روتین غلظت‌‌های 20، 50، 100، 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر تهیه گردید، سپس با تزریق 20 میکرولیتر از هر نمونه سطح زیر نمونه‌‌ها محاسبه شد (چن و همکاران، 2005). هر یک از استانداردهای فوق را سه بار به دستگاه تزریق تا از کالیبره بودن دستگاه اطمینان حاصل گردد. سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی هر یک از استانداردها نمودار کالیبراسیون مربوطه رسم و معادله خط حاصل بدست آمد (شکل 3-6).

شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی
نمونه‌‌ها با سرنگ‌‌های مجهز به فیلتر واتمن کاملا صاف شد به طوری که هیچ ذره ناخالصی در آن وجود نداشته باشد. ابتدا نمونه‌‌ای از استاندارد روتین به دستگاه تزریق شد.
به منظور شناسایی پیک مربوط به روتین در نمونه‌‌های تهیه شده، زمان بازداری آن در نمونه با زمان بازداری ترکیب استاندارد در هر تزریق مقایسه شد (شکل 3-7). برای اطمینان بیشتر نمونه‌‌ای همراه با استاندارد به صورت اینترنال استاندارد تزریق شد. نمونهها در طول موج 285 نانومتر قرائت شد. میزان روتین بر حسب درصد یا میلیگرم بر گرم وزن خشک بیان می‌‌شود. X مجهول در فرمول منحنی را با جایگزین کردن سطح زیر نمودار نمونه‌‌های تزریق شده به دست می‌‌آوریم.

شکل 3-7- کروماتوگرام نمونه استاندارد روتین در دقیقه 4:50
3-10- مشخصات طرح
برای انجام این تحقیق از طرح کاملاً تصادفی به صورت آشیانه‌ای استفاده شد. در این طرح اثر چهار ارتفاع در هر یک از دو استان مازندران و گلستان بر خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مورد بررسی قرار گرفت. برای ویژگی‌های مورفولوژیکی از پنج تکرار و برای ویژگی‌های بیوشیمیایی از سه تکرار استفاده شد. طرح آشیانه‌ای یا نستد در واقع یک طرح کاملاً تصادفی چند مشاهده‌ای می‌باشد، در این تحقیق استان به عنوان تیمار می‌باشد و ارتفاع نقش تکرار را دارد، و از آنجایی که چند نمونه در هر ارتفاع برداشت می‌شود به این طرح‌ها چند مشاهده‌ای گفته می‌شود.
3-11- تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس داده‌های به دست آمده با نرم‌افزار SAS انجام شد و به علت معنی‌دار شدن اثر متقابل ارتفاع در استان، مقایسه میانگین این اثر به کمک نرم‌افزار MSTAT و با روش آزمون دانکن صورت پذیرفت، رسم نمودارها نیز با نرم‌افزار Excel انجام شد.

-225529-624053

4- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک
نتایج تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک گزنه نشان داد که بین دو استان مازندران و گلستان در تمامی صفات به جزء تعداد گل آذین در بوته اختلاف معنی‌داری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان، در همه صفات معنی‌دار بود (جدول 4-1). جدول 4-2 مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان را برای صفات مورفولوژیک نشان میدهد.
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که مقدار هر سه صفت طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ با افزایش ارتفاع کاهش یافت به طوریکه بیشترین مقدار طول برگ (3/14 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری استان گلستان و کمترین مقـدار آن (9/6 سانتیمتر) در ارتفاع 2250 متری استان مازندران بدست آمد.
بیشترین مقدار عرض برگ (16/9 سانتیمتر) در ارتفاع 10 متری مازندران و کمترین مقدار آن (5/5 سانتی‌متر) در ارتفاع 2250 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین نسبت طول به عرض برگ (85/1) در ارتفاع 1450 متری گلستان و کمترین مقدار آن (18/1) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد.
تجزیه همبستگی نشان داد که دو صفت طول و عرض برگ همبستگی مثبت بالا (71/0=r) دارند (جدول 4-3).

جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک

*، ** و ns به ترتیب نشان معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دارمی‌باشد.
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن

در هر ستون حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است.

جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه

*، ** و ns به ترتیب نشاندهنده معنی‌داری در سطح 5%، 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
4-1-2- تعداد برگ در بوته
با افزایش ارتفاع، تعداد برگ در بوته کاهش محسوسی نشان داد به طوریکه در ارتفاعات پایین مازندران و گلستان تعداد برگ در بوته، به ترتیب 8/84 و 2/80 عدد بود اما در ارتفاع 2250 متری این تعداد به 2/19 و 4/36 عدد کاهش یافت.
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها
با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان، تعداد گره در گزنه کاهش اما فاصله گره‌ها افزایش نشان داد. در پایین‌ترین ارتفاع مازندران و گلستان تعداد گره به ترتیب 23 و 2/26 عدد بود اما در بالاترین ارتفاع دو استان این تعداد به 6/9 و 11 عدد کاهش یافت.
بیشترین فاصله گره (48/8 سانتی‌متر) مربوط به استان مازندران و ارتفاع 1450 متری بود که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری اختلاف معنی‌دار نداشت. کمترین فاصله گره (4/3 سانتیمتر) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد. با توجه به همستگی منفی و بالا (71/0= r) بین دو صفت تعداد و فاصله گره، می‌توان نتایج حاصله را مورد انتظار دانست، یعنی در ارتفاعات افزایش فاصله گره‌ها در نتیجه کاهش تعداد گره قابل توجیه هست.
4-1-4- قطر ساقه
بیشترین میزان قطر ساقه که به ترتیب 05/7 و 98/6 میلی‌متر بود در ارتفاعات 1450 و 2250 متری گلستان و کمترین مقدار آن (44/4 میلی‌متر) در ارتفاع 10 متری مازندران مشاهده شد.
4-1-5- قطر و طول ریشه
با افزایش ارتفاع روند مشخصی برای دو صفت قطر و طول ریشه مشاهده نشد، بهطوری که بیشترین مقدار قطر ریشه (01/5 میلی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد که البته با مقدار آن در ارتفاع 2250 متری این استان و همچنین ارتفاع 10 متری مازندران اختلاف معنی‌داری نشان نداد (05/0 ≤ P) کمترین مقدار قطر ریشه (02/3 میلی‌متر) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد.
بیشترین مقدار طول ریشه (01/31 سانتی‌متر) در ارتفاع 1450 متری گلستان مشاهده شد.
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته
بین دو استان از نظر تعداد گل آذین اختلاف معنی‌دار (05/0 ≤ P) مشاهده شد. میانگین تعداد گل آذین در بوته، در گلستان 8/46 عدد بود، در حالی‌که در مازندران 35/41 عدد بود. در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، مشخص شد که استان گلستان با ارتفاع 1450 متر بیشترین تعداد گل آذین (2/59 عدد) را داشت در حالیکه در ارتفاع 750 متری مازندران کمترین تعداد گل آذین (8/35 عدد) مشاهده شد.
تعداد گل آذین در بوته با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره، قطر ساقه و طول ریشه همبستگی مثبت و معنیداری نشان داد.
اندازه گل آذین در مناطق نمونه برداری کم و بیش مشابه بود، تنها در ارتفاع 1450 متری مازندران گزنه‌هایی با اندازه گل آذین بالاتر (52/5 سانتی‌متر) نسبت به سایر مناطق مشاهده شد.
4-1-7- ارتفاع گیاه
افزایش ارتفاع نقش موثری در کاهش ارتفاع گیاه گزنه داشت، بهطوری‌که نتایج نشان داد در ارتفاعات پایین (تا 750 متر) ارتفاع بوته‌ها بالا بود اما در ارتفاعات بالاتر کاهش چشمگیری در ارتفاع گیاه مشاهده شد. بیشترین ارتفاع گیاه (3/120 سانتی‌متر) در استان مازندران با ارتفاع 750 متر بدست آمد و کمترین مقدار این صفت (2/77 سانتی متر) در ارتفاع 2250 متری مازندران مشاهده شد که البته با ارتفاع 2250 متری گلستان اختلاف معنی‌دار نداشت.
ارتفاع گیاه گزنه با صفاتی مثل طول برگ، تعداد برگ، تعداد گره و طول ریشه همبستگی مثبت و معنی داری داشت (جدول 4-3).
4-1-8- میزان کلروفیل
با افزایش ارتفاع میزان کلروفیل روند افزایشی داشت بهطوری که بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد در حالیکه مقدار این صفت در ارتفاع 750 متری 3/27 درصد بود. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که میزان کلروفیل با طول برگ و تعداد گره، همبستگی منفی و معنی‌دار و با فاصله گره (40/0= r) همبستگی مثبت و معنی‌داری داشت (جدول 4-3).
طبق نتایج بدست آمده، صفات مورفولوژیکی و بیوشمیایی گیاه گزنه تحت تاثیر شرایط محیطی مختلف ناشی از تغییر ارتفاع محل رویش قرار گرفتند، یهطوری‌‌که ارتفاعات بالا در دو استان مازندران و گلستان به خصوص منطقه له کوه بابل با ارتفاع 2250 متر از سطح دریا، دارای بیشترین تاثیرپذیری از افزایش ارتفاع بودند. با توجه به داده‌های هواشناسی (جدول 3-1) با افزایش ارتفاع، دما به طور محسوسی کاهش یافت به‌طوری‌که میانگین دمای سالیانه از 17 درجه سانتی‌گراد در پایینترین ارتفاع به 8 درجه سانتیگراد در بالاترین ارتفاع رسید و از آنجایی که رشدونمو اندام‌های گیاهی در شرایط دمای پایین کاهش می‌یابد بسیاری از صفات مورفولوژیکی مورد بررسی در این مطالعه نظیر طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه کاهش یافت. در بسیاری از گیاهان تاثیر دمای پایین در کاهش خصوصیات رویشی به اثبات رسیده است (امیدبیگی، 1379). همزمان با کاهش دما در ارتفاعات بالا میزان کلروفیل افزایش نشان داد، افزایش درصد کلروفیل در شرایط سرد نوعی مقاومت در برابر سرما محسوب می‌شود تا گیاه بتواند تا حدودی خسارات ناشی از کاهش فتوسنتز را جبران کند (اسپیرینگ و کارلاندر، 1979).
4-2- صفات بیوشیمیایی
نتایج تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر و دستگاه HPLC نشان داد که اثر متقابل ارتفاع در استان برای تمامی صفات معنی‌دار بود (جدول 4-4 و جدول 4-5). مقایسه میانگین نیز برای این صفات انجام شد.
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج بررسی‌ها نشان داد که با افزایش ارتفاع، میزان فنل در اندام‌های مختلف گزنه افزایش می‌یابد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل برگ (57/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر، فنل کل برگ کاهش محسوسی نشان داد، ارتفاعات بالای استان گلستان نیز از فنل بالاتری نسبت به ارتفاعات پایین ر برخوردار بودند (شکل 4-1).
میزان فنل کل ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری که بیشترین میزان آن (38/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (48/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-2).
در ریشه نسبت به اندام‌های دیگر میزان فنل کل کاهش محسوسی نشان داد و حتی اختلاف کمتری در ارتفاعات مختلف مشاهده شد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل ریشه (21/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (09/1 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان بدست آمد (شکل 4-3).

جدول 4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه HPLC

** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی‌داری در سطح 1% و غیر معنی‌دار می‌باشد.

شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج مقایسه میانگین نشان داد که با افزایش ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان میزان فلاونوئید کل در اندام‌های مختلف افزایش یافت، به‌طوری‌که بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ (64/5 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، در ارتفاع 1450 متری مازندران مقدار آن به 94/4 میلی‌گرم بر گرم رسید و پس از آن ارتفاعات بالای گلستان بیشترین میزان فلاونوئید کل برگ را داشته‌اند. کمترین میزان فلاونوئید برگ (3 میلی‌گرم بر گرم) مربوط به ارتفاع 50 متری گلستان بود (شکل 4-4).
مقدار فلاونوئید کل ساقه وگل نسبت به برگ کاهش نشان داد اما همچنان در ارتفاعات بالاتر مقدار بیشتری از این ماده در اندام‌های ساقه و گل وجود داشت. بیشترین میزان فلاونوئید ساقه و گل (98/3 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران حاصل شد و با کاهش ارتفاع به 1450 متر میزان آن کاسته شد اما در سایر مناطق نمونه برداری میزان این ماده تقریباً یکسان بود و با هم اختلاف معنی‌داری نداشتند (شکل 4-5).
فلاونوئید کل ریشه کاهش چشمگیری نسبت به برگ و ساقه و گل داشت به‌طوری‌که بیشترین میزان آن (53/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و سایر مناطق مرتفع دو استان میزان تقریباً مشابهی از فلاونوئید کل را در اندام ریشه داشتند، کمترین میزان این ماده (1/2 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران بدست آمد (شکل 4-6).

شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل
مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ گیاه گزنه نشان داد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع میزان کلروژنیک برگ افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (29/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن ارتفاع 2250 متری گلستان مقدار کلروژنیک بالایی داشت، کمترین مقدار این ماده (1/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 50 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-7).
در اندام‌های ساقه و گل نیز بیشترین میزان اسید کلروژنیک در ارتفاعات بالا مشاهده شد، به‌طوری‌که بیشترین مقدار این ماده (3/0 میلی‌گرم بر گرم) در رویشگاه‌های 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن سایر مناطق مرتفع دو استان قرار داشتند، کمترین مقدار کلروژنیک اسید ساقه و گل (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 10 متری مازندران دیده شد (شکل 4-8).
در ریشه گزنه نسبت به اندام‌های هوایی مقدار اسید کلروژنیک کمتری دیده شد، بهطوری‌که بیشترین مقدار این ماده (13/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و با کاهش ارتفاع مقدار این ماده در ریشه بصورت چشمگیری کاهش یافت بهطوری که در ارتفاع 50 متری گلستان به 02/0 میلی‌گرم بر گرم رسید (شکل 4-9).

شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل
نتایج اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ گیاه گزنه نشان داد که بیشترین مقدار این ماده (054/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران دیده شد و پس از آن ارتفاع 1450 متری این استان قرار داشت، بین سایر مناطق نمونه‌برداری اختلاف معنی‌دار مشاهد نشد (شکل 4-10).
مقدار اسید کافئیک در اندام‌های ساقه و گل نیز تحت تاثیر ارتفاع بود بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (065/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد، سایر مناطق مرتفع دو استان در جایگاه دوم قرار گرفتند و کمترین مقدار اسید کافئیک (046/0 میلی‌گرم بر گرم) در پایین‌ترین ارتفاع گلستان مشاهده شد (شکل 4-11).
نتایج بررسی‌ها نشان داد که در ریشه گزنه اسید کافئیک کمتری نسبت به سایر اندام‌ها وجود داشت و مقدار آن در ارتفاعات پایین بسیار ناچیز بود، بیشترین مقدار این اسید (021/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بود و ارتفاع1450 متری مازندران و مناطق مرتفع گلستان در رده‌های بعدی قرار گرفتند (شکل 4-12).

شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل
در بررسی اثر متقابل ارتفاع در استان، بر میزان روتین برگ مشاهده شد که در هر دو استان مازندران و گلستان با افزایش ارتفاع مقدار روتین افزایش یافت، بهطوری‌که بیشترین مقدار آن (34/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران بدست آمد و پس از آن، سایر مناطق مرتفع دو استان قرار گرفتند، کمترین مقدار روتین برگ (16/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان مشاهده شد (شکل 4-13).
نتایج مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل نیز، روندی مشابه با روتین برگ داشت، بهطوری که بیشترین مقدار آن (37/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 2250 متری مازندران و کمترین مقدار آن (17/0 میلی‌گرم بر گرم) در ارتفاع 750 متری گلستان دیده شد (شکل 4-14).
طبق نتایج HPLC در ریشه گیاه گزنه روتین مشاهده نشد.

شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)

شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر متقابل ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل
(اعداد دارای حروف مشترک فاقد اختلاف معنی‌دار میباشند)
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید
در همه اندام‌های گیاه گزنه، مقدار فلاونوئید کل بیشتر از فنل کل بوده است. با افزایش ارتفاع از سطح دریا میزان فنل و فلاونوئید کل به صورت چشمگیری افزایش نشان داد. در ارتفاعات کمتر از 1000 متر مقدار شیب رگرسیون بسیار کمتر از ارتفاعات بالاتر بوده است. در برگ گزنه مقدار فلاونوئید کل ارتباط بیشتری با ارتفاع نسبت به فنل کل نشان داد (96/0= r2)، به‌طوری‌که در ارتفاعات بالا شیب خط رگرسیون افزایش بیشتری نشان داد (شکل 4-15).
برخلاف برگ در اندام‌های ساقه و گل مقدار فنل کل ارتباط مثبت و معنی‌دار بیشتری با ارتفاع از سطح دریا نشان داد (95/0=r2)، بطوریکه در ارتفاعات بالاتر از 1000 متر، میزان فنل کل با شیب رگرسیونی بیشتری نسبت به فلاونوئید کل افزایش یافت (شکل 4-16).
در ریشه گیاه گزنه علاوه بر کمتر بودن مقدار فنل کل نسبت به فلاونوئید کل، پاسخ کمتری (87/0=r2) هم نسبت به افزایش ارتفاع از سطح دریا مشاهده شد (شکل 4-17).
میزان اسید کلروژنیک و روتین گیاه به طور محسوسی بیشتر از اسید کافئیک بود، همچنین بیشترین ارتباط (99/0=r2) با ارتفاع از سطح دریا، مربوط به میزان اسید کلروژنیک کل گیاه بود که بهشدت تحت تاثیر ارتفاع از سطح دریا قرار گرفت (شکل 4-18).

شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ گیاه گزنه

شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل گیاه گزنه

شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه گیاه گزنه

شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی در گیاه گزنه
میزان فنل و فلاونوئید کل و همچنین ترکیبات آن‌ها با ارتفاع از سطح دریا ارتباط مثبت و معنی‌دار داشتند، بهطوری که بیشترین میزان این ترکیبات در منطقه له کوه بابل مشاهده شد. با افزایش ارتفاع علاوه بر دما میزان رطوبت نسبی نیز کاهش یافت (جدول 3-1) و به نظر می‌رسد کاهش دما و رطوبت از مهمترین عوامل تاثیرگذار در افزایش تولید ترکیبات فنل و فلاونوئیدی باشند، هر چند در منطقه له کوه مقدار مواد آلی نیز نسبت به سایر مناطق بیشتر بود (جدول 3-2). در مطالعات مختلف تاثیر رویشگاه بر میزان متابولیت‌های ثانویه در گیاهان مختلف بررسی شده است که در اکثر موارد بر نقش رویشگاه به عنوان عامل تاثیر گذار در تجمع متابولیت‌های ثانویه تاکید شده است. مکان رشد گیاه می‌تواند از طریق تغییرات دمایی و رطوبتی بر فرآیند تشکیل مواد موثره تاثیرگذار باشد، مکانیسم تاثیرات محیط بر تجمع متابولیت‌های ثانویه به درستی روشن نیست، با این وجود این نکته روشن است که محیط از طریق تاثیری که در فرایند تولید متابولیت و عوامل مرتبط در تولید آنزیم‌ها دارد، در نوع و شدت واکنش‌های شیمیایی موثر است (همتی و همکاران، 2003؛ سیوستاوا و شیم، 2002). درجه حرارت از جمله عوامل محیطی تاثیرگذار در تشکیل و تجمع متابولیت‌های ثانویه است. بررسی‌های اولیه نشان داد که در مناطقی با درجه حرارت پایینتر تجمع فلاونوئید بیشتر است (داویس و آلبریگو، 1994). میزان مواد موثره در اندام‌های گیاهان هیچگاه ثابت نیست و متناسب با مراحل رشد گیاه و بعضی شرایط محیطی قابل تغییر است. کمیت و کیفیت ترکیبات شیمیایی وابسته به تنوع ژنتیکی، شرایط محیط و فنولوژی گیاه متغیر است (پلاتی و همکاران، 2005). در ضمن اختلاف زیادی در میزان مواد موثره یک گونه در شرایط مختلف رویشی وجود دارد (هانلیدو و همکاران، 1992). کسکیتالو و همکاران (2001) اعلام داشتند که نمی‌توان رابطه روشنی بین محصول و مقدار مواد موثره در گیاهان دارویی یافت. مهمترین عوامل در تغییرات کمی و کیفی به ترتیب به نوع گونه، زمان و مکان برداشت، تغییرات فصلی و روش‌های عصارهگیری بستگی دارد. اوماه و مازا (1996) نشان دادند که با افزایش ارتفاع بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی در اندام‌های گیاهی افزوده می‌شود. ترکیبات فلاونوئیدی جاذب نور مانند فلاونها و آنتوسیانینها، در پاسخ به اشعه یو-وی و برای محافظت بافتهای درونی ساقه و برگ از آسیبهای ناشی از این اشعه، در سلولهای اپی درمال تجمع پیدا میکنند. کامپفرول و کوئرستین از جمله این فلاونوئیدها هستند که در پاسخ به این اشعه در گیاه تولید میشوند. ارتفاع جغرافیایی در میزان متابولیتهای ثانویه مؤثر بوده است که یکی از دلایل این به کیفیت تشعشعات مخصوصا Uv-B در ارتفاعات ارتباط میدهند. اشعه Uv-B در ارتفاعات بالاتر بیشتر است و در نتیجه سبب تولید بیشتر بعضی از فلاونوئیدها میشود. (جاکولا و همکاران، 2010).
همتی و همکاران (1391) نشان دادند که میزان کورسترین اندام‌های مختلف گیاه نمدار در منطقه کلاردشت مازندران در مقایسه با منطقه گرگان بیشتر بوده است، بر طبق داده‌های هواشناسی منطقه کلاردشت نسبت به گرگان از ارتفاع بیشتر و هوای خنکتر برخوردار بوده است. علاوه بر این با توجه به اینکه منطقه کلاردشت نسبت به جنگل شصت‌کلا گرگان در ارتفاع بالاتری قرار دارد و با توجه به نقش فلاونوئیدها در حفاظت گیاه در برابر نور فرابنفش، تراکم بیشتر ترکیبات فلاونوئیدی در منطقه کلاردشت توجیح‌پذیر است. تاثیر هوای خنک بر تجمع مواد موثره اندازه‌گیری شده، می‌تواند به طولانی بودن بیشتر دوره تقسیم سلولی و فعالیت بافت گیاهی در مناطق خنک مرتبط باشد. در همین رابطه تحقیقات انجام شده روی برخی فلاونوئیدهای مرکبات نشان داد که تولید آن‌ها در مناطقی با آب و هوای خنک بیشتر ازمناطق گرم می‌باشد، زیرا طول دوره تقسیم سلولی بیشتر می‌شود و در این مرحله عوامل تولید برخی فلاونوئیدها بیشتر می‌شود (داویس و آلبریگو، 1994). میزان آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی در گیاه دارویی مامیران در دو منطقه گرگان و زیارت مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان داد میزان این ترکیبات در منطقه زیارت نسبت به گرگان بیشتر بود، با توجه به اینکه آب و هوای دو منطقه متفاوت است و منطقه زیارت دارای ارتفاع بالاتر و هوای سردتر است این شرایط برای گیاه تنش ایجاد کرده و تولید متابولیت‌های ثانویه افزایش یافت (قربانلی و همکاران، 1388). تحقیقات مشابه نیز نشان داد که در شرایط تنش برخی از ترکیبات ثانویه به میزان قابل توجهی در گیاه افزایش می‌یابد (آتال، 1998). قاسمی و همکاران (2011) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتیاکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد. گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتیاکسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیا نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی مورد مطالعه در این تحقیق در برگ گیاه گزنه بیشتر از اندام‌های دیگر بود، در بررسی میزان فلاونوئیدهای سرخ ولیک، میزان روتین این گیاه در برگ نسبت به گل و میوه بیشتر بود (همتی و همکاران، 2006). تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در اندام‌های مختلف گیاه ممکن است در نتیجه تغییر در برخی فعالیت‌های آنزیمی و نقش پیش ماده آن باشد (پیتر و ریچارد، 1993). در حمایت از این فرضیه محققین دیگر اشاره کردند که تنظیم کننده‌های رشد و نمو مانند هورمون‌های سیتوکنین و اسید جیبرلیک ممکن است بعضی آنزیم‌های تولید کننده فلاونوئیدها را فعال کنند (سیمور و همکاران، 1993).
سپهریفر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی درعصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌باشد.
آذریوند و همکاران (1388) در تحقیقی روی اسانس برگ و گل گیاه بومادران در ارتفاعات مختلف منطقه سیاه بیشه استان مازندران به این نتیجه رسیدند که ارتفاع بر میزان اسانس این گیاه تاثیر بسزایی داشته بطوریکه میزان ترکیبات اسانسی در ارتفاعات بالاتر بیشتر بود و این میزان در گل بیشتر از برگ بوده است.
حبیبی و همکاران (1384) با بررسی اثر ارتفاع روی اسانس گیاه دارویی آویشن وحشی منطقه طالقان به این نتیجه رسیدند که با افزایش ارتفاع مقدار ترکیبات اسانسی لینانول و آلفا ترپنین که بیشترین ترکیبات اسانسی در آویشن وحشی را تشکیل می‌دهند افزایش می‌یابد بهطوری‌که در ارتفاع 1800 متری کمترین و در ارتفاع 2800 متری بیشترین مقدار بوده است.
4-4- نتیجه‌گیری کلی
در بررسی اثر ارتفاع از سطح دریا، بر ویژگی‌های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه گزنه مشخص گردید که بین دو استان مازندران و گلستان اختلاف معنیداری وجود نداشت اما اثر متقابل ارتفاع در استان بر صفات مورد مطالعه معنی‌دار بود، بسیاری از صفات مورفولوژیکی مثل طول و عرض برگ، تعداد برگ و ارتفاع گیاه با افزایش ارتفاع کاهش و مقدار کلروفیل افزایش نشان داد. کمترین مقدار طول برگ (9/6 سانتی‌متر)، کمترین مقدار عرض برگ (8/5 سانتی‌متر) کمترین ارتفاع گیاه (2/77 سانتی‌متر) و بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در منطقه له کوه مازندران با ارتفاع 2250 متر بدست آمد. از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی، در ارتفاعات بالا میزان ترکیباتی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین افزایش چشمگیری نشان داد، بهطوری که بیشترین میزان فنل کل (16/8 میلیگرم بر گرم)، فلاونوئید کل (15/12 میلیگرم بر گرم)، اسید کلروژنیک (72/0 میلیگرم بر گرم)، اسید کافئیک (140/0 میلیگرم بر گرم) و روتین (71/0 میلیگرم بر گرم) در کل گیاه در ارتفاع 2250 متری منطقه له کوه مازندران مشاهده شد.
4-5- پیشنهادات
با توجه به خودرو بودن گیاه گزنه توصیه می‌شود با کاشت این گیاه در شرایط کنترل شده زراعی و گلخانه‌ای زمینه جهت مطالعات بیشتر در این گیاه فراهم شود.
با توجه به کمبود تحقیقات پژوهشی در گیاه گزنه پیشنهاد می‌شود تاثیر عوامل مختلف محیطی و همچنین تنش‌ها در افزایش متابولیت‌های ثانویه این گیاه مورد بررسی قرار گیرد.
ناشناس بودن گیاه دارویی گزنه باعث می‌شود انجام یکسری مطالعات پایه سیتوژنتیکی و بررسی تنوع ژنتیکی در این گیاه ضروری به نظر آید.
تحقیقات بیشتر در زمینه دیگر ترکیبات فنل و فلاونوئیدی که در این پایاننامه مورد مطالعه قرار نگرفت.
منابع
فهرست منابع
آذرنیوند، ح.، قوام عربانی، م.، سفیدکن، ف. و طویلی، ع. 1388. بررسی تاثیر ویژگی‌های اکولوژیک (خاک و ارتفاع) بر کمیت و کیفیت اسانس گل و برگ Achillea millefolium. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 25(4):571-556.
آزاد بخت، م. 1378. رده بندی گیاهان دارویی. چاپ اول. انتشارات تیمورزاده. ص 401.
افشار، ج.، و دل اذر، ع. 1373. روتین از Ruta graveolens. مجله دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، 1، ص 12-1.
امیدبیگی، ر. 1379. رهیافت‌های تولید و فرآوری گیاهان دارویی. انتشارات طراحان نشر. مشهد. جلد 1. چاپ دوم. ص 283.
امیدبیگی، ر. 1384. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد اول، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 347.
امیدبیگی، ر. 1388. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. جلد دوم، انتشارات آستان قدس رضوی. مشهد. ص 430.
تایز، ل. و زایگر، ل. 1379. فیزیولوژی گـیاهی. جلد دوم. ترجمه: کافی،م. لاهوتی، م. زند، ا. شریفی، ح. گلدانی، م. و کامکار، ح. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. ص 379.
دوازده امامی، س. 1382. کاربرد گیاهان دارویی. انتشارات نصوح. ص 113.
دوازده امامی، س. و مجنون حسینی، ن. 1387. زراعت و تولید برخی گیاهان دارویی و ادویهای. چاپ دوم. انتشارات دانشگاه تهران. ص 300.
حبیبی، ح.، مظاهری، د.، مجنون حسینی، ن.، چایچی، م.ر. و فخرطباطبایی، م. 1385. اثر ارتفاع بر روغن، اسانس و ترکیبات گیاه دارویی آویشن وحشی Thymus kotschynus منطه طالقان. مجله پژوهش و سازندگی در زراعت و باغبانی. شماره 73: 10-1.
جایمند، ک.، رضایی، م.، عصاره، م. و مشکی‌زاده، س. 1388. استخراج واندازه‌گیری ترکیبهای فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی (Rosa damascene Mill) از مناطق غربی ایران، فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 555:4-47.
حسنی، ج. 1383. شناسایی و بررسی اکولوژیکی دو جنس از گیاهان معطر Thymus و Ziziphora در استان کردستان. فصلنامه تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20(1): 17-1.
زرگری، ع. 1376. گیاهان دارویی. جلد چهارم، چاپ پنجم. انتشارات دانشگاه تهران، ص970.
زرگری، ع. 1383. گیاهان دارویی. جلد پنجم. چاپ ششم، انتشارات دانشگاه تهران، ص1010.
زینلی، ح.، رزمجو، خ. ارزانی، ا. و رضایی، م. 1386. ارزیابی دو گونه نعناع پونه سنبله‌ای و پودنه از لحاظ صفات زراعی، فیتوشیمیایی و سیتوژنتیکی. سومین همایش گیاهان دارویی. تهران، دانشگاه شاهد.
سپهری‌فر، ر. و حسنلو، ط. 1388. بررسی ترکیبات پلی‌فنلی، آنتوسیانینها و فلاونوئیدهای تام و خواص آنتی‌اکسیدانی گیاه دارویی قره قاط، جمع‌آوری شده از جهار منطقه مختلف ایران. فصلنامه گیاهان دارویی، 74:33 -66.
صمصام شریعت، ه. 1382. پرورش و تکثیر گیاهان دارویی. انتشارات مانی، ص420.
عسکرزاده، م. ع.، غلامی، ب. و نگاری، ع. 1387. بررسی عملکرد کمی و کیفی اکوتیپهای زیره کوهی کشور در شرایط آب و هوایی مشهد، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی خراسان.
فارماکوپه گیاهی ایران. 1381. کمیته تدوین فارماکوپه گیاهی ایران. تهران: وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی. معاونت غذا دارو. چاپ اول.
قاسمی، ع. 1389. گیاهان دارویی و معطر (شناخت و اثرات آن‌ها). چاپ دوم. انتشارات دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد. ص542.
قهرمان، ا. 1372. فلور رنگی ایران، جلد هفت. انتشارات موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع.
قربانلی، م.، فانی، پ. و ساطعی، آ. 1388. تغییرات فصلی میزان آلکالوئید و ترکیبات فنلی در گیاه مامیران (Chelidonium majus L.) در دو رویشگاه. فصلنامه پژوهشهای علوم گیاهی. 15(4): 3.

user8259

2-5 پرعیارسازی به روش فلوتاسیون................................................................................................................................24
2-6 روش تشویه...................................................................................................................................................................24
2-7 پرعیارسازی به روش لیچینگ...................................................................................................................................25
2-7-1 لیچینگ کاهشی با محلول یون آهن...........................................................................................................28
2-7-2 لیچینگ کاهشی توسط سولفور دیاکسید یا محلولهای سولفیت.......................................................30
2-7-3 لیچینگ کاهشی با استفاده از کاهندههای ارگانیک....................................................................................31
2-7-4 لیچینگ الکترو-کاهشی.....................................................................................................................................39
2-7-5 لیچینگ همزمان منگنز (IV) و کانیهای سولفیدی..................................................................................39
2-7-6 لیچینگ با هیدروژن پراکسید............................................................................................................................40
2-7-7 لیچینگ در محلول اسید هیدروکلریک...........................................................................................................42
2-7-8 لیچینگ با نیتروژن دیاکسید و محلول نیتریک اسید..................................................................................43
2-8 استحصال منگنز از محلول های لیچینگ.................................................................................................................45
2-8-1 بازیابی منگنز به روش استخراج حلالی............................. ...........................................................................46
2-8-2 بازیابی منگنز به روش رسوب شیمیایی........................................................................................................46
2-8-3 بازیابی منگنز به روش تبادل یونی................................................................................................................. 47
2-8-4 مطالعه انجام شده برای بازیابی منگنز.............................................................................................................47
2-8-4-1 ترسیب منگنز و آهن...................................................................................................................................48
2-9 تولید منگنز الکترولیتی..............................................................................................................................................49
2-10 تولید منگنزدی اکسید الکترولیتی ......................................................................................................................50
2-11 تولید منگنز دی اکسید شیمیایی..........................................................................................................................50
فصل سوم.................................................................................................................. ........................................................51
معرفی مواد،روش ها و تجهیزات
3-1 مقدمه...................................................................................................................... ......................................................52
3-2 تهیه نمونه........................................................................................................................ ................................... ........ 52
3-3 شناسایی نمونه........................................................................................................................ .................................... 52
3-3-1 تجزیه شیمیایی نمونه................................. ................................. ................................ ................................ 52
3-3-2 مطالعات پراش پرتو ایکس(XRD) ...........................................................................................................53
3-3-3 مطالعات میکروسکوپی..................................................................................................................................53
3-3-4 تجزیه سرندی و تعیین دانه بندی و عیار کانسنگ منگنز......................................................................55
3-3-5 مطالعات درجه آزادی..........................................................................................................................................57
3-4 پرعیارسازی منگنز........................................................................................................................................................58
3-4-1 آزمایش پرعیارسازی با جیگ.........................................................................................................................58
3-4-2 آزمایش های پرعیارسازی با میزلرزان...........................................................................................................59
3-4-3 آزمایش های پرعیارسازی به روش مغناطیسی..........................................................................................59
3-4-4 انجام آزمایش های پرعیارسازی به روش فلوتاسیون.................................................................................60
3-4-5 روش آزمایش های پرعیارسازی به روش لیچینگ....................................................................................60
3-4-5-1 تئوری سینتیک لیچینگ....................................................................................................................61
الف- نفوذ از لایه مایع.....................................................................................................................................63
ب-نفوذ از میان خاکستر................................................................................................................................64
ج- واکنش شیمیایی........................................................................................................................................64
3-4-6 روش انجام آزمایش های سینتیک.....................................................................................................................66
3-4-7 نرم افزار طراحی آزمایش..................................................................................................................................... 66
3-4-8 روش انجام آزمایشها ........................................................................................................................................69
فصل چهارم........................................................................................................................................................................70
بحث و نتایج
4-1 مقدمه................................................................................................................................................................................71
4-2 آزمایش های جیگ........................................................................................................................................................71
4-3 نتایج آزمایش های میزلرزان.......................................................................................................................................72
4-4 نتایج آزمایش های پرعیار سازی به روش مغناطیسی...........................................................................................77
4-5 نتایج آزمایش های پرعیار سازی به روش فلوتاسیون............................................................................................80
4-6 نتایج آزمایش های پرعیار سازی به روش لیچینگ..............................................................................................82
الف) تعیین ماده کاهنده..................................................................................................................................................82
ب) تعیین عامل کنترل لیچینگ...................................................................................................................................83
4-6-1 طراحی آزمایش.................................................................................... ...........................................................86
4-6-1-1 آنالیز واریانس مدلها..............................................................................................................................88
4-7 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی............................................................................................................................91
4-7-1 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی منگنز........................................................................................91
4-7-2 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی آهن.............................................................................................96
4-7-3 بررسی اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی سیلیس.....................................................................................99
4-8 بهینه سازی...................................................................................................................................................................99
فصل پنجم........................................................................................... ..........................................................................102
نتایح و پیشنهادات
5-1 مقدمه........................................................................................... ...............................................................................103
5-2 نتایج و پیشنهادات.....................................................................................................................................................103
مراجع.....................................................................................................................................................................................106
فهرست شکلها
عنوان......................................................................................صفحه
شکل1-1 دیاگرام پوربه منگنز ......................................................................................................................................6
شکل1-2 طرح شماتیک یک گرهک همبرگری شکل.............................................................................................13
شکل1-3 نحوهی توزیع ذخایر منگنز در دنیا..............................................................................................................17
شکل2-1 فلوشیت فرآیند بازیابی منگنز با استفاده از محلول لیچ.........................................................................28
شکل2-2 اثر مقدارSO2 بر بازیابی فلزات در کانه با عیار متوسط........................................................................31
شکل2-3 اثر مقدارSO2 بر بازیابی فلزات در کانه پر عیار.....................................................................................31
شکل2-4 اثر مقدارSO2 بر بازیابی فلزات در کانه کم عیار....................................................................................31
شکل 2-5 اندرکنش متغیرها بر بازیابی منگنز...........................................................................................................33
شکل2-6 تاثیر غلظتهای مختلف اسیدنیتریک........................................................................................................34
شکل2-7 تاثیر غلظتهای مختلف اسیداکسالیک......................................................................................................34
شکل2-8 تاثیر مقدار کاهنده بر نرخ لیچینگ منگنز.................................................................................................35
شکل2-9 اثر غلظت ملاس نیشکر بر بازیابی.................................................................................................................37
شکل2-10 اثر غلظت اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز..............................................................................................38
شکل2-11 اثر نسبت وزنی کانسنگ به کاهنده بر بازیابی منگنز..............................................................................38
شکل2-12 بازیابی منگنز بر حسب زمان در دماهای مختلف.....................................................................................38
شکل2-13 اثر غلظت اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز...............................................................................................41
شکل2-14 اثر غلظت هیدروژنپراکسید بر بازیابی منگنز............................................................................................41
شکل2-15 اثر غلظت کاهندههای متفاوت بر بازیابی منگنز........................................................................................42
شکل2-16 اثر غلظت اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز...............................................................................................42
شکل2-17 اثر غلظت اسیدهیدروکلریک بر بازیابی منگنز...........................................................................................43
شکل2-18 اثر غلظت هیدروژنپراکسید بر بازیابی منگنز...........................................................................................43
شکل2-19 بلوک دیاگرام تولید هیدرومتالورژیکی از محصولات فعال و غیرفعال.....................................................44
شکل2-20 تاثیر غلظت اسیدنیتریک بر بازیابی عناصر موجود در کانسنگ...............................................................45
شکل2-21 تاثیر غلظت ملاس بر بازیابی عناصر موجود در کانسنگ..........................................................................45
شکل2-22 تاثیر دما بر بازیابی عناصر موجود در کانسنگ............................................................................................45
شکل2-23 فلوشیت بازیابی منگنز و حذف آهن از محلول لیچ...................................................................................48
شکل2-24 دیاگرام Eh-pH برای سیستم منگنز-آهن-گوگرد.................................................................................49
شکل3-1 طیف EDX مربوط به کانی منگنزدار...........................................................................................................55
شکل3-2 طیف EDX مربوط به کانی حاوی منگنز-سیلیس-کلسیم.....................................................................56
شکل3-3 منحنی توزیع دانهبندی نمونه کانسنگ منگنز..............................................................................................58
شکل3-4 منحنی مربوط به توزیع تجمعی منگنز، آهن و سیلیس..............................................................................58
شکل3-5 منحنی مربوط به عیار منگنز، آهن و سیلیس................................................................................................58
شکل3-6 نمودار مراحل اجرای آزمایشهای پرعیارسازی..............................................................................................60
شکل3-7 نحوه ترکیب ذرات جامد......................................................................................................................................63
شکل3-8 واکنش ذره جامد با سیال اطراف آن طبق مدل هسته انقباظی.................................................................64
شکل3-9 پارامترهای محدودکننده نرخ واکنش در مدل هسته انقباظی....................................................................65
شکل4-1 نمودار بازیابی منگنز بر حسب زمان.................................................................................................................85
شکل4-2 نمودار تعیین عامل کنترل لیچینگ نفوذ........................................................................................................86
شکل4-3 نمودار آرنیوس.......................................................................................................................................................87
شکل4-4 اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی منگنز.........................................................................................................92
شکل4-5 نمودار کنتوری اثر متقابل درصدجامد و دما بر بازیابی منگنز....................................................................93
شکل4-6 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز................................................................94
شکل4-7 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیداکسالیک بر بازیابی منگنز....................................................................94
شکل4-8 اثر متقابل اسیدسولفوریک و دما بر بازیابی منگنز........................................................................................95
شکل4-9 اثر متقابل اسیداکسالیک و دما بر بازیابی منگنز.........................................................................................96
شکل4-10 اثر متقابل اسیداکسالیک و اسیدسولفوریک بر بازیابی منگنز..............................................................96
شکل4-11 اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی آهن......................................................................................................98
شکل4-12 نمودار کنتوری اثر متقابل درصدجامد و دما بر بازیابی آهن.................................................................98
شکل4-13 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیدسولفوریک بر بازیابی آهن...............................................................99
شکل4-14 نمودار کنتوری درصدجامد و اسیداکسالیک بر بازیابی آهن...................................................................99
شکل4-15 اثر پارامترهای عملیاتی بر بازیابی سیلیس................................................................................................100
فهرست جدولها
عنوان......................................................................................صفحه
جدول1-1 مشخصات ترکیبهای موجود در محصولات منگنز.........................................................................16
جدول3-1 آنالیز شیمیایی کامل نمونه برداشت شده..........................................................................................54
جدول3-2 نتایج تجزیه سرندی و تجزیه شیمیایی بخشهای مختلف ابعادی...............................................57
جدول3-3 معادلات سینتیک بر اساس مکانیسم مدل نفوذ................................................................................66
جدول3-4 معادلات سینتیک برای واکنشهای جامد-مایع.................................................................................67
جدول3-5 پارامترهای عملیاتی و سطوح آنها.........................................................................................................69
جدول3-6 آزمایشهای طراحی شده با استفاده از روش CCD.....................................................................70
جدول3-7 پارامترهای ثابت و مقادیر آنها در آزمایشهای لیچینگ احیایی...................................................71
جدول4-1 آزمایش جیگ بر روی دانه بندی(1000+3350-) میکرون..........................................................73
جدول4-2 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(1000-300+) میکرون........................................................74
جدول4-3 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(1000-300+) میکرون.........................................................75
جدول4-4 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(300-) میکرون.......................................................................76
جدول4-5 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(300-) میکرون......................................................................77
جدول4-6 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(300-) میکرون......................................................................78
جدول4-7 آزمایش میزلرزان بر روی دانه بندی(100-) میکرون.....................................................................79
جدول4-8 آزمایش مغناطیسی خشک بر روی محصول میانی دانه بندی(300-) میکرون.......................80
جدول4-9 آزمایش مغناطیسی بر روی دانه بندی(100-) میکرون................................................................81
جدول4-10 پرعیارسازی توسط فلوتاسیون مستقیم.........................................................................................84
جدول4-11 نتایج آزمایش سینتیک لیچینگ در معادله مدل نفوذ.................................................................86
جدول4-12 مقادیر لگاریتم Kدر دماهای متفاوت............................................................................................87
جدول4-13 نتایج حاصل از طراحی آزمایش........................................................................................................88
جدول4-14 نتایج آنالیز واریانس مربوط به مدلهای ارائه شده.........................................................................91
جدول4-15 مقادیر P و F برای پارامترهای عملیاتی و برهم کنش آنها.........................................................91
جدول4-16 شرایط بهینهسازی پیشنهادی توسط نرمافزار.................................................................................101
جدول4-17 مقادیر متغیرها در بهینهسازی پیشنهادی توسط نرمافزار.............................................................102
جدول4-18 نتایج آزمایش اعتبارسنجی شرایط بهینه..........................................................................................102
جدول4-19 نتایج آزمایشهای تعیین اثر دورهمزن در شرایط بهینه.................................................................102
مقدمه
هدف از فرآوری کانه منگنز تولید محصول با مشخصات موردنیاز در صنایع مصرف‌کننده است. به دلیل پایین بودن عیار منگنز در اکثر کانسارهای شناسایی ‌شده در ایران و نیاز به محصول با عیارهای بسیار بالا در اغلب صنایع مصرف‌کننده منگنز، به ‌کارگیری روش‌های مختلف پرعیارسازی برای تغلیظ سنگ استخراج‌ شده لازم و ضروری است. با توجه به کاهش ذخایر معدنی پرعیار فلزی، بالا بودن هزینه‌های معدنکاری و مقرون ‌به ‌صرفه نبودن معدنکاری در معادن فلزی با عیار پایین، استفاده از روشهایی که بتوانند فلزات ارزشمند را از منابعی با عیار کم و یا کانسنگ‌های سخت (که پرعیارسازی آن‌ها دارای پیچیدگی هست) تغلیظ کند، لازم و مفید خواهد بود.
کانسنگ منگنز استخراجی از معدن محمدآباد جیرفت، با عیار تقریبی 21 درصد، می‌تواند از منابع مهم قابل‌استفاده‌ی ذخایر سنگ منگنز در ایران باشد. در حال حاضر به دلیل پایین بودن عیار، ترکیب خاص کانی‌های منگنزدار و نوع درگیری آن‌ها با سایر کانی‌های باطله، سنگ معدن استخراجی از این معدن در صنایع مصرف‌کننده قابل‌استفاده نیست.
هدف از این تحقیق معرفی روشهایی کارآمد برای پرعیارسازی کانسنگ منگنز معدن محمدآباد جیرفت، امکان‌سنجی استفاده از روش لیچینگ در استحصال منگنز از کانه و دستیابی به مشخصات مورد نیاز در صنایع مصرف‌کننده است.
پرعیارسازی کانسنگ منگنز معمولاً با ترکیبی از روش‌ها شامل میز لرزان، جیگ، جدایش مغناطیسی شدت بالای خشک و تر، فلوتاسیون و تشویه کاهشی با استفاده از داروهای ویژه انجام می‌شود.
نمونهی معرف تهیه ‌شده، جهت انجام مطالعات شناسایی نمونه به‌طور کامل مورد تجزیه قرار گرفته و خصوصیات آن به طور دقیق بررسی شد. در مرحله بعد از شناسایی نمونه، بررسی پرعیارسازی کانسنگ منگنز معدن جیرفت به روش‌های ثقلی شامل: جیگ، میز لرزان، روش‌های مغناطیسی و سایر روش‌های فرآوری مواد معدنی مانند فلوتاسیون و لیچینگ انتخابی انجام میگیرد. در روش‌های مذکور، پارامترهای عملیاتی مؤثر در بازیابی منگنز مورد ارزیابی و بهینه‌سازی قرار میگیرند.
این تحقیق به‌منظور امکان‌سنجی پرعیارسازی و با نتیجهی حاصل که قابل ‌استفاده کردن سنگ استخراجی معدن منگنز محمدآباد جیرفت است، در مقیاس آزمایشگاهی انجام شده است. در فصل اول به کلیاتی در مورد منگنز و کانیهای منگنز پرداخته شده است. در فصل دوم ، با اشاره به مطالعات انجام شده توسط دیگر محققین، انواع روشهای فرآوری استحصال منگنز از کانسنگ منگنز معرفی شده است. فصل سوم این تحقیق شامل معرفی نمونه مورد آزمایش و مواد و تجهیزات به کار برده شده همچنین تشریح روش انجام تحقیق است. در فصل چهارم نتایج آزمایشها به همراه بحث در مورد نتایج آورده شده است. و در نهایت در فصل آخر نتیجه گیری و پیشنهادات موردنظر مطرح شده است.

فصل اول
منگنز و کانیهای منگنز
1-1 آشنایی
نام منگنز از واژه لاتین Magnes (Magnet)گرفته شده است که به خواص مغناطیسی پیرولوزیت (کانه اصلی منگنز) اشاره میکند. با نماد Mn، عدد اتمی 25، وزن اتمی94/54، وزن مخصوص 43/7 گرم بر سانتیمتر مکعب، سختی6 در مقیاس موس، جلای فلزی، شکننده و غیر قابل انعطاف، نقطه جوش 1962 درجه سانتیگراد و نقطه ذوب 1244 درجه سانتیگراد. منگنز در گروه 7 جدول تناوبی به عنوان فلز بوده و در دوره 4 قرار دارد. محتوای ایزوتوپی منگنز معمولاً با محتوای ایزوتوپی کروم تلفیق شده و در زمین شناسی ایزوتوپی به کار میرود. نسبتهای ایزوتوپی Mn-Cr شواهدی را از Al26 وPd107 به عنوان تاریخ آغاز بیستم خورشیدی تقویت میکند. تغییرات در نسبت های Cr53/Cr52 و Mn/Cr از انواع متئوریتها، نسبت اولیه Mn53/Mn55 را نشان میدهد که سیستم ایزوتوپی Mn-Cr را پیشنهاد میکند چند ظرفیتی بودن منگنز به دلیل به اشتراک گذاردن 7 الکترون در دو لایه خارجی، با توجه به توزیع 25 الکترونی منگنز، میباشد. شش ایزوتوپ پایدار منگنز Mn51، Mn52 ،Mn53،Mn54،Mn55 و Mn56 میباشند[1].
1-2خواص
خواص فیزیکی
منگنز فلزی به رنگ سفید، خاکستری - نقره ای با هاله مایل به صورتی است، که با فلز کروم در گروه ششم و با فلز آهن در گروه هشتم همجوار بوده و از نقطه نظر شیمیایی شباهتهای زیادی به آن دارد. با این وجود، از نظر خواص متالورژیکی منگنز تفاوتهایی با آهن و فلزات نزدیک به آن دارد. چرا که آهن، کبالت و نیکل خواص مفید فیزیکی خود را به عنوان یک فلز حفظ کرده و در اکثر آلیاژها به عنوان عنصر پایه عمل میکنند، درحالی که منگنزچنین نیست. علت عملکرد منگنز در این حالت این است که در شرایط عادی ترتیب قرارگیری اتمهای منگنز در ساختمان بلورین آن به گونهای است که منگنز معمولاً فلزی شکننده و غیرقابل انعطاف و شکل گیری می‌باشد. اما وقتی که منگنز با آهن (و فولاد)، آلومینیوم و سایر فلزات غیر آهنی تشکیل آلیاژ میدهد، باعث بهبود خواص فیزیکی آلیاژ می‌شود.
خواص شیمیایی
این فلز با اسید واکنش پذیری بالا و با آب به آهستگی تجزیه میشود. در ارتباط با دما منگنز به شکل‌های آلفا ، بتا و گاما دیده می‌شود. شکل‌های آلفا و بتا شکننده هستند. شکل گاما نرم و پایداراست و در صورتی که درجه حرارت پایین نگهداری نشود، سریعاً به شکل آلفا تبدیل می‌شود. دمای تغییر شکل الفا به بتا، بتا به گاما و گاما به الفا به ترتیب 720، 1100، 1236 و 1244 درجه سانتیگراد است.
1-3 کانی شناسی
منگنز در بسیاری از کانیهای موجود در پوسته زمین وجود دارد. علارغم این که بیش از 300 کانی حاوی منگنز شناسایی شدهاند، اما تعداد کانیهای منگنزدار دارای ارزش اقتصادی کمتر از 12 میباشد. مهمترین کانیهای اقتصادی منگنز عبارتند از: اکسیدها شامل کانیهای پیرولوزیت، پسیلوملان، هوسمانیت، براونیت، واد، فرانکلینیت، هیدروکسیدها (منگانیت)، کربناتها (رودوکروزیت)، سیلیکاتها (ردونیت) و سولفورها (آلاباندیت)[2].
1-4 ژئوشیمی
منگنز از نظر فراوانی، دوازدهمین عنصر فراوان در پوسته زمین است. کلارک منگنز در ترکیب پوسته جامد زمین 1/0% و در سنگهای مافیک و اولترامافیک تا 5/1% میرسد. کانیهای منگنز به صورت گسترده پراکنده شدهاند. این عنصر در طبیعت به صورت خالص تشکیل نمیشود و بیشتر به صورت اکسید، کربنات و سیلیکات وجود دارد. منگنز از لحاظ ژئو شیمیایی یک عنصر لیتوفیل قوی با اندکی خصوصیات کالکوفیل است.
منگنز در شرایط pH و Eh پائین (احیا) به دلیل پتانسیل یونی نسبتاً پائین، حلالیت بیشتری نسبت به آهن دارد و آسانتر از آهن از سنگ منشأ لیچ میشود، اما در pH و Eh بالا به دلیل تحرک بالا، ته نشینی آهن در ابتدا انجام میشود و سپس منگنز ته نشین میشود. چنانچه وقتی فعالیتهای آتشفشانی زیر دریایی به محیط آب وارد میشوند، در ابتدا آهن در فاصله نزدیک منشأ فعالیت آتش فشانی برجای گذاشته میشود و سپس منگنز به دلیل حلالیت (تحرک پذیری) بیشتر با فاصله زیادتری رسوب میکند. به عنوان مثال در بخش بالایی کانسارهای ماسیوسولفید (تیپ کوروکو)، آهن در بالای کانسار قرار میگیرد در حالی که منگنز در حاشیه آن تشکیل میشود. شکل1-1 محدوده پایداری یونهای منگنز را نشان میدهد که طبق آن پایداری Mn2+ در آبهای سطحی و دریاها به نسبت زیاد است.

شکل1-1-دیاگرام پوربه منگنز- دما 25 درجه سانتیگراد[3]
در شرایط عادی PH و Eh، ترکیبات کربناته و سیلیکاته منگنز رسوب میکنند. در شرایط اکسیدان قوی از پایداری منگنز کاسته میشود و Mn2+ به Mn4+ تبدیل شده و در نتیجه اکسید منگنز (پیرولوزیت) یا اشکال دیگر MnO2 رسوب میکنند. در شرایط احیا کننده، یونMn+2 به صورت محلول باقی میماند مگر این که این یون با مقدار کافی کربنات حل شده و یا با سیلیس ترکیب شود که در نتیجه رودوکروزیت (MnCO3) یا کانیهای سیلیکاته منگنزدار را تشکیل دهد. در محیط احیاکننده قوی نیز کانیهای آلاباندیت (MnS) یا منگانوزیت (MnO) شکل میگیرند. البته به نظر نمیرسد که محیط رسوبگذاری مناسبی برای آلاباندیت یا منگانوزیت (احیا کننده قوی) وجود داشته باشد. شرایط و محدوده تشکیل سولفید منگنز MnS بسیار محدود است. برخلاف آهن که در محیط احیایی بیشتر به صورت سولفید دیده میشود، منگنز به صورت اکسید و کربنات یافت میشود.
1-5 زمین شناسی اقتصادی
منگنز به صورت اکسید و کربنات در دنیا گسترش وسیعی دارد و کربنات آن غالباً با عناصر دیگری از قبیل کلسیم، منیزیم و آهن همراه است. ذخایر اکسید منگنز تقریباً خالص بوده و گروهی نیز حاوی مقادیر جزئی کبالت، نیکل، تنگستن، مس و باریم یا موادی نظیر رس، آهک، چرت و توف میباشند.
هیچ کانی مستقلی از منگنز در مراحل اصلی تبلور ماگمایی یافت نمیشود، لیکن تشکیل برخی از کانیهای منگنز در پگماتیتها و ذخایر پنوماتولیتی و هیدروترمال بعد از مرحله ماگمائی مشاهده شده است.
در سنگهای رسوبی نیز مینیمم فراوانی منگنز در ماسه سنگ 001/0 تا 01/0% و ماکزیمم آن در خاک سرخ پلاژیک اقیانوسی 17/0%، 68/0% و 86/0% اندازهگیری شده است. متوسط درصد منگنز در سنگهای رسوبی 056/0 % محاسبه شده است. انباشتگی درونزادی منگنز فاقد ارزش اقتصادی است، در حالی که کانسارهای عظیم آن در سنگهای رسوبی شناخته شده است و کانسارهای کوچک و بزرگ در سنگهای آتشفشانی ـ رسوبی و در سطح هوازده سنگهای دگرگونه تشکیل میشوند. کانسنگهای منگنز از نظر عیار منگنز به صورت زیر تقسیم بندی می‌شوند[5،4]:
• کانسنگ منگنز با منگنز بالاتر از ۳۵ درصد
• کانسنگ منگنز آهندار با منگنز ۲۰ تا ۳۵ درصد
• کانسنگ منگنز آهنی با منگنز بین ۱۰ تا ۲۰ درصد
• کانسنگ آهن منگنزدار با منگنز بین ۵ تا ۱۰ درصد

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

هر چند ذخائر منگنز ممکن است در طیف وسیعی از شرایط و تشکیلات زمین شناسی از پر کامبرین تاسنوزوئیک پیدا شوند، با این وجود ۷۰ درصد ذخائر شناخته شده در تشکیلات زمین شناسی سنوزوئیک وجود دارند و ۱۰ درصد نیز در سنگهای کامبرین یافت می‌شوند. وجود ذخائر مهم منگنز در سنگهای دوران مزوزئیک نادر است به جز در مورد ذخائر منطقه گروت آیلنت در کشور استرالیا و مولانگو در کشور مکزیک بزرگترین و اقتصادیترین ذخائر منگنز از نوع رسوبی بوده و به شکل تقریبا لایهای و گسترده در سطح یافت میشوند. مثالهای این نوع ذخایر وجود ذخائر غنی منگنز در کشورهای مراکش، نیکوپال اوکراین، چیاتورا گرجستان مورودواروکم برزیل و ماهاراشتای هندوستان هستند. انواع دیگری از ذخایر منگنز در ارتباط با تشکیلات رسوبی آهنی دوران پر کامبرین یافت شدهاند در این ذخائر منگنز به صورت کربنات و یا اکسید منگنز و معمولا با عیار کم تمرکز یافته است. مثالهای معروف این نوع ذخائر پست مازبورگ و کورومان در کشور آفریقای جنوبی و ماتوگراس برزیل هستند. نظیر ذخایر لاتریتی آهن، بوکسیت و نیکل، ذخایر بر جای منگنز نیز تحت شرایط مناطق حاره دچار هوازدگی شده و این امر منجر به غنیتر شدن کانسار و تبدیل کانی‌های منگنزدار کم عیار به کانی‌های پرعیارتری نظیر پیرولوزیت و کریپتوملان و منگانیت میشود. مثالهای بارز این نوع ذخایر در کشورهای برزیل منطقه آماپا گابن منطقه مداندا،‌ غنا، استرالیا و هندوستان وجود دارند.
1-5-1 تقسیم بندی کانسارهای منگنز (پارک و مک دیارمید ۱۹۷۵)
1-5-1-1 کانسارهای همراه با توف ها و رسوبات آواری مرتبط با مواد آتشفشانی (نوع آتش فشانی – رسوبی):
این گروه از نظر اقتصادی ارزش بیشتری دارند به عنوان مثال میتوان کانسارهای پونوپو درکوبا، دره رودخانه الکی در شیلی و کانسار منگنز ونارچ قم نام برد.
1-5-1-2 کانسارهای مستقل از فعالیتهای آتشفشانی:
مانند کانسار نیکوپول در اکراین.
1-5-1-3 کانسارهای همراه با کانسارهای آهن لایهای
در ذخایر منگنز، منگنز به دو صورت Mn+4 و Mn2+ واکنش میدهد. منگنزهای موجود در منطقه هیپوژن اغلب دو ظرفیتی بوده و به صورت انواع کانیهای کربناته و سیلیکاته ظاهر میشوند. منگنز دو ظرفیتی نسبتاً محلول و به شدت متحرک است. در منطقه سوپرژن، منگنزهای منتقل شده از منطقه هیپوژن به صورت اکسیدهای چهار ظرفیتی که در منطقه سوپرژن پایدارترند، رسوب میکنند.
بیشتر تمرکزهای اولیه منگنز که تشکیل کانسارهای مهم و اقتصادی منگنز را میدهند و یا انواع دیگر که حاصل فرآیندهای ثانویه هستند، همگی منشأ رسوبی دارند و در این ارتباط اکثر طبقهبندیها مبتنی بر شرایط منطقه رسوبگذاری و نحوه تمرکز منگنز میباشد[6].
رایجترین طبقهبندیها کانسارهای منگنز را به گروههای رسوبی، گرمابی، دگرگونی و سوپرژن تقسیم بندی میکنند.
1-5-2 تقسیم بندی کانسارهای منگنز ( گیلبرت و پارک ۱۹۷۷ )
1-5-2-1 کانسارهای رسوبی منگنز
قسمت اعظم منگنز دنیا از کانسارهای منگنز رسوبی به دست میآید. شوروی سابق یکی از اصلیترین تولیدکنندگان منگنز جهان به شمار میآید که با تولید ۹۰۱ میلیون تن در سال ۱۹۸۹ نزدیک به ۴۱% از کل تولید جهان را به خود اختصاص داده است. در حدود ۷۵% از منابع منگنز کشف شده (در خشکی) در شوروی سابق در حوضه نیکوپول در اوکراین و مابقی در حوضههای چیاتورا در گرجستان واقع شده است.
کانسارهای رسوبی براساس منشأ منگنز به ۲ زیر گروه تقسیم میشوند:
1-5-2-2 کانسارهای رسوبی – آتشفشانی
در این نوع کانسارها منشأ منگنز درونی و عمدتاً آتشفشانهای زیر دریایی میباشند. این نوع کانسارها در مناطقی به وجود آمدهاند که فعالیتهای شدید آتش فشانی زیردریایی وجود داشته باشد. این کانسارها یا همراه با سنگهای تراکی ریولیت و یا همراه با گرینستون و مقادیری از سنگها و کانههای رسوبی هستند. معمولاً کانسارهای آهن ـ منگنز محدود به کمپلکسهای دیاباز ـ پورفیری یا کوارتز ـ کراتوفیری هستند و در نزدیکی مراکز فعالیت آتشفشانی و یا در فاصلهای از آن در بین لایههایی از مواد آذرآواری قرار دارند. این کانسارها از تغییرات کانسارهای رسوبی با منشأ گرمابی در تودههای نفوذی کم عمق تشکیل شدهاند.
کانسارهای این گروه به وسیله ترکیب براونیت، هوسمانیت و رودوکروزیت از کانههای اولیه منگنز و با حضور کانیهای پسیلوملان ـ وناردیت در پوستههای هوازده، قابل تشخیص هستند و شکل کانسار به صورت لایهای است. این کانسارها لایههایی با ضخامت ۱۰-۱ متر و ۵۵ ـ ۴۰% منگنز، کمتر از ۱۰% سیلیس و ۰۶/۰-۰۳/۰% فسفر تشکیل میشوند.
این کانسارها در مناطقی که فعالیتهای آتشفشانی شدید است، ذخیرهای نسبتاً کوچک دارند. کانسار قزاقستان روسیه و کوست رینج در آمریکا نمونهای از این کانسار است[6].
1-5-2-3 کانسارهای رسوبی – غیر آتشفشانی
در این کانسارها منشأ منگنز فرآیندهای بیرونی مانند هوازدگی سنگهای سطحی تأثیر دارد. این کانسارها مجموعه ذخایر منگنز و دیگر عناصری را که عمدتاً به وسیله آبهای سطحی و زیر زمینی از مناطق هوازده خشکی به حوضههای آبی حمل میشوند را شامل میشود. این کانسارها یا همراه با رس و ماسه سنگ گلوکونیتی و یا همراه با کربناتها میباشد.
طی فرآیندهای غنیسازی، دو عنصر آهن و منگنز در مراحل مختلف مانند جدا شدن از سنگهای منبع، حمل و تهنشینی و مراحل دیاژنز از یکدیگر تفکیک میشوند و بدین ترتیب منجر به تشکیل ذخایری با نسبت بالای آهن و منگنز میگردند. با توجه بر این که حلالیت منگنز در بعضی مقادیر PH و Eh اسیدی به طور قابل توجهی از آهن و آلومینیوم بیشتر است، بسته به طبیعت فرآیند هوازدگی، آهن و منگنز ممکن است به طور یکسان تا ترجیحاً منگنز، از سنگهای منبع جدا شده باشند. هوازدگی پوسته بازالتی اقیانوسی به وسیله آب دریا در درجه حرارت پائین ممکن است منجر به حل شدن و ته نشینی اکسیدهای منگنز شود. این کانسارها ۷۵% ذخایر شناخته شده جهان را شامل میشوند.
شکل کانسار به صورت لایهای و عدسی میباشد. و بزرگترین ذخیره منگنز جهان نیکوپول در اوکراین را شامل میشوند. کانسارهای مهم منگنز به طور عمده در محدوده زمانی تشکیل شدهاند که میزان اکسیژن آزاد کاهش داشته است. کانسارهای کشف شده اکثراً متعلق به اوایل پالئوزوئیک، ژوراسیک و اواسط کرتاسه هستند. همراه کانسارهای آهن رسوبی لایهای، مقداری منگنز نیز یافت میشود.
کانسار منگنز نیکوپول واقع در شوروی سابق بزرگترین ذخیره منگنز دنیا محسوب میگردد. این کانسار در الیگوسن تشکیل شده است. این کانسار که از نوع کانسارهای رسوبی منگنز است، در سنگ میزبان کربناته قرار دارد. استراتیگرافی منطقه از پایین به طرف بالا شامل: پی سنگ کریستالین، پی سنگ هوازده، ماسه سنگ و رس، سیلتستون، ماسه سنگ گلاکونیت، لایه منگنزدار، رسهای سبز تا خاکستری، مارن و آهک است.
لایه منگنز شامل سه رخساره اکسید، مخلوط اکسید – کربنات و کربنات است، که کربناتها در حاشیه حوضه رسوبی تشکیل شده اند. رنج منگنز از ساحل به اعماق عبارتند از:
رخساره کربناته(رودوکروزیت منگانو کلسیت) اکسیدی(پیرولوزیت پسیلوملان)
محیط حاشیه حوضه رسوبی یا ساحلی ( محیط عمیق) افق منگنزدار ۲ تا ۳ متر ضخامت، ۲۵ کیلومتر عرض و ۱۵۰ کیلومتر طول دارد. رخساره اکسید حدود ۲۵ درصد ذخیره را تشکیل میدهد. عیار منگنز ۱۵ تا ۲۵ درصد است. منگنز از سنگهای مافیکی اسپلیتی کریستالین منشأ گرفته است. بافت ذخیره از نوع اُالیتی، پیزولیتی، لامیناسیون و جانشینی صدفها است. کانسارهای منگنز در کربناتها در هندوستان، برزیل و مراکش کشف شده است. منشأ منگنز به طور عمده سنگهای آتشفشانی است[6].
1-5-2-4 کانسارهای گرمابی منگنز
این کانسارها به صورت رگهای میباشد و کانیهای اقتصادی آن عمدتاً رودوکروزیت و پیرولوزیت میباشد. چشمههای آب گرم در کانسارهای موجود در قارهها و پیدایش آنها در مناطق فعال کف دریاها مثالهای جالبی از تشکیل کانیهای اکسید منگنز از سیالات هیپوژن هستند. با مقایسه ترکیب کانسارهای منگنز در چشمههای آب گرم امروزی و کانیهای منگنز رگهای هیپوژن قدیمی تشابه بین آنها به خوبی روشن میشود. در ذخایر گرمابی یک نوع پراکندگی ناحیهای مربوط به کانیهای منگنز و سایر فلزات مشاهده شده است. چشمه‌های آب گرم در کانسارهای موجود در خشکی‌ها و پیدایش آنها در مناطق فعال کف دریاها مثالهای جالبی از تشکیل کانیهای اکسید منگنز از سیالات هیپوژن هستند. با مقایسه ترکیب کانسارهای منگنز در چشمه‌های آب گرم امروزی و کانیهای منگنز رگه‌های هیپوژن قدیمی، تشابه بین آنها به خوبی روشن می‌شود. در ذخایر گرمایی یک نوع پراکندگی ناحیهای مربوط به کانیهای منگنز و سایر فلزات مشاهده شده است. در عمیقترین بخشها تنها کانیهای منگنز دو ظرفیتی (رودوکروزیت، رودونیت، تفروئیت و آلاباندیت) همراه با سولفورهای فلزات پایه (Pb, Zn, Cu) و کانسارهای طلا- نقره تشکیل میشود. با بالا آمدن محلولهای هیپوژن به طرف سطح زمین در مناطق فوقانی و امتزاج آن با نزولات اکسیژندار پائین رو، گیبسیت و براونیت که اکسیدهای با ظرفیت کم هستند و کریپتوملان، پسیلوملان، پیرولوزیت و کرونادیت که اکسیدهای با ظرفیت زیاد هستند، به صورت تابعی از میزان اکسیژن و درجه حرارت تشکیل میشوند. مانند کانسار منگنز بیوت (آمریکا) [6].
1-5-2-5 کانسارهای دگرگونی منگنز
کانسارهای دگرگونی حاوی کانیهای فراوان منگنز به تعداد زیادی یافت میشود اما تنها تعداد کمی از این کانسارها و عمدتاً آنهایی که دارای کانیهای براونیت، هوسمانیت و بیگسبیت هستند، اهمیت محلی دارند و نظر کانسار به صورت لایهای است. کانسارهای دگرگونی منگنز در ارتباط با سنگهای سیلیکاته حاوی منگنز در دوره پروتروزوئیک مانند گاندیتها و کودوریتها میباشند. گاندیتها از کوارتز، اسپسارتین، براونیت، هوسمانیت و رودوکروزیت تشکیل شدهاند و کودوریتها از فلدسپات پتاسیک، اسپسارتین و آپاتیت تشکیل یافتهاند. اینها در بین لایه‌های از مرمرها، کوارتزیت‌ها و شیستها قرار دارند. گاندیت‌ها و کوردوریت‌ها در مناطق زیادی با صدها کیلومتر مربع مساحت پراکنده هستند. طول ذخایر منگنزدار از ۳ تا ۸ کیلومتر و ضخامت آنها از ۳ تا ۶۰ متر متغیر میباشد. متوسط میزان منگنز در آنها ۱۰ تا ۲۰ درصد است. بزرگترین کانسارهای شناخته شده از این نوع در هند و برزیل وجود دارند. مانند کانسار منگنز پُست ماسبرگ در آفریقای جنوبی.
براونیت کانی مشخصهی کانسارهای دگرگونی ضعیف است، در دگرگونی شدید کانی بیگسبیت از تحول براونیت و هماتیت تشکیل میگردد و همراه آن هولاندیت، هوسمانیت و ژاکوبسیت نیز ظاهر میشوند. هولاندیت یک کانی هیپوژن است و از طریق دگرگونی مجاورتی و ناحیهای تشکیل میشود. بسیاری از کانسارهای رسوبی منگنز، متعاقباً به وسیله دگرگونی حرارتی و مجاورتی با شدتهای متفاوت تغییر پیدا میکنند و این امر باعث تغییر کانیشناسی و بافت کانسارهای قبلی میگردد، اما نقشی در تمرکز آنها ایفا نمیکند. در کانسنگهای اکسیدی دگرگون شده منگنز، براونیت و بیگسبیت بسته به حضور سیلیس، آهن و … و نیز حرارت و اکسیژن به تنهایی یا با هم تشکیل میشوند[6].
1-5-2-6 کانسارهای منگنز تجزیهای یا سوپرژن
فرآیند تشکیل این کانسارها شامل تجزیه عناصر غیر از منگنز در سنگ مادر توسط آبهای سطحی و زیرزمینی است. این فرآیند باعث متمرکز شدن مواد باقیمانده و یا تجزیه و تهنشینی مجدد منگنز در پوسته هوازده نزدیک سطح می‌شود. اکسیداسیون سوپرژن برجا و غنیسازی سنگهای منگنزدار، به خصوص در سنگهای کربناته، یا تحرک مجدد کانسارهای منگنز قبلی در جریان هوازدگی منجر به تشکیل ذخایر پرعیار و اقتصادی میگردد. سنگ مادر این نوع کانسارها باید دارای درصدکانی منگنز ( ۵ تا ۱۰ درصد ) باشد. هوازدگی در مناطق گرمسیری معمولا منجر به افزایش عیار بیش از ۵ الی ۶ درصد نمیشود. اگر اکسیداسون شدید و فراگیر باشد، پیرولوزیت و یاکریپتوملان (بسته به تمرکز پتاسیم) مستقیما از رودوکروزیت یا پیروکروزیت تشکیل می‌شود. چنانچه اکسیداسیون محدود و دارای تغییراتی از بالا به طرف پایین سطح باشد، فازهای مختلف معرف حالتهای اکسیداسیون متفاوت تقریبا به صورت زیر می‌باشد[6].
رودوکروزیت هوسمانیت منگانیت بیرنسیت نسوتیت پیرولوزیت و کریپتوملان
همانطوری که تحرک آهن و آلومنیوم به تشکیل لاتریتهای آهندار و بوکسیت منجر میشود، منگنز نیز میتواند در طول هوازدگی شیمیایی تشکیل ذخایر بازماندی منگنز با عیار بالا را بدهد. در مرحلهی اصلی تبلور ماگما به دلیل قرار گرفتن منگنز در کانیهای آهن و منیزیمدار، هیچ کانی مستقلی از منگنز تشکیل نمیشود و کانیهای منگنزدار هوازده شده و باعث تشکیل ذخایر اقتصادی منگنز میشوند که به صورت پوشش بر روی سنگهای حاوی منگنز وجود دارد. کانیهای اقتصادی این نوع شامل پسیلوملان، پیرولوسیت و منگانیت میباشد[6].
در مورد ذخایر بازماندی منگنز نیز مانند بوکسیت ها، آب و هوا ـ زهکشی ـ ماهیت سنگ مادر از عوامل تعیین کننده تمرکز ذخیره میباشند. سنگ مادری که منشأ ذخایر بازماندی هستند باید به قدر کافی غنی از منگنز باشند، به عنوان مثال ۱۰% منگنز. این نوع کانسارهای منگنز از هوازدگی شیمیایی سنگهای کربنات منگنزدار و سنگهای سیلیکات ـ کربنات حاوی منگنز تشکیل میشوند. مهمترین ذخایر منگنز بازماندی در غرب آفریقا (گابون)، آفریقای جنوبی، برزیل، هند و ونزوئلا و کانادا شناخته شدهاند[6].
1-5-2-7 گرهکهای (ندول های) منگنز
بزرگترین منابع منگنز در کف اقیانوسها و دریاچههای عهد حاضر وجود دارد که در آن کانسارهای منگنز و آهن به صورت گرهک و کنکرسیونهای نامنظم یافت میشوند (شکل 1-2). قطر گرهکها از ۱ میلیمتر تا ۲۵ سانتیمتر متغیر است و گاهی به یک متر میرسد ولیکن بیشترین پراکندگی مربوط به قطرهای ۷-۳ سانتیمتر است. نودولها معمولا ًبه شکل کروی، بیضوی، عدسی مانند و صفحهای است. گرهکها حاوی ۲۰ تا ۳۰ درصد اکسیدهای منگنز و مقداری آهن میباشند و جمع مقادیر کبالت، نیکل و مس در آنها ۲ تا ۳ درصد میباشد. گرهکها حاوی مقادیری تیتانیوم، وانادیوم و مولیبدن نیز می باشند. میزان ذخیره گرهک های منگنز قابل بازیابی ۵۰ بیلیون تا یک تریلیون تن تخمین زده شده است. سرعت رشد گرهکها یک میلیمتر در هر یک میلیون سال است. گرهکهای منگنز، پوششی که ضخامت آن به اندازه ضخامت یک گرهک میباشد را در کف اقیانوس تشکیل میدهند. در مورد منشأ گرهکها نظریههای مختلفی وجود دارند. امروزه در ایالات متحده آمریکا، آلمان و ژاپن که فاقد ذخایر بزرگ منگنز در خشکی هستند، استخراج نودولهای منگنز- آهن از کف اقیانوسهای آرام و اطلس در اعماق بیش از ۷ کیلومتری را توسط کشتیهای عظیم اکتشافی که عمل لیچینگ (هیدرومتالورژی)، گرم کردن / ذوب (پیرومتالورژی) یا ترکیبی از هر دو را انجام میدهند، آغاز شده است. نودولهای استخراجی حاوی ۳۰ – ۲۵% منگنز، ۱۲- ۱۰% آهن، ۲-۱% نیکل، ۵/۱- ۳/۰ % کبالت و ۵/۱-۱ % مس هستند. تمرکز این نودولها بر حسب تولید در سطح، حدود ۲۰ – ۱۵ کیلوگرم بر متر مربع است[6].
شکل 1- 2- طرح شماتیک یک گرهک همبرگری شکل
میزان ذخیره منگنز بین زون گسله کلاریون و کلیپرتون در حدود ۱۰۶×۲ تن با عیار ۲۵% منگنز، ۳/۱ % نیکل، ۱% مس، ۲۲% کبالت و ۵% مولیبدن تعیین شده است. میانگین منگنز در نودولها ۲۴% است که در مقایسه با میانگین منگنز تودههای معدنی که ۵۵% – ۳۵ است، از نظر اقتصادی به عنوان منبع منگنز پیشنهاد نمیشوند اما آنها حاوی ۱۴% Fe = ، ۱%Cu =، ۱% Ni = و ۲۵/۰% Co = هستند.
1-5-2-8 منگنز نقطهای
دندریتها یا شجرههای پیرولوسیت (MnO2) بر روی سطح شکستگی بسیاری از سنگها قابل مشاهده میباشند. لیکن در سنگهایی که مقدار مس درصد چند صد پیپیام است، به جای تشکیل (دندریت منگنز)، منگنز نقطهای تشکیل میشود.
1-6 اکتشاف وارزیابی ذخایر منگنز
اکتشاف و ارزیابی ذخایر منگنز نسبت به بسیاری از مواد معدنی دیگر مشکلتر است. این کانسارها معمولاً کوچک و به صورت پراکنده هستند و روشهای ژئوفیزیکی گران قیمت برای اکتشاف این تودههای کانساری مقرون به صرفه نیست.
برخلاف روشهای ژئوفیزیکی که در اکتشاف منگنز چندان موفق نیستند، روشهای ژئوشیمیایی به دلیل حلالیت بالای منگنز به عنوان ابزاری مؤثر در پروژه‌های اکتشاف می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. یکی از مشکلات عمده در مراحل اکتشاف منگنز، نگهداری نمونه معرف کانسار برای مراحل ارزیابی و آنالیز است. در گذشتههای دور بیشتر حفاریهای ضربهای برای اکتشاف منگنز استفاده میشد. امروزه بیشتر از حفاریهای چرخشی برای این منظور استفاده میشود، اگر چه در این حالت هم باید برای حفظ نمونه معرف دقت کافی شود.
1-7روشهای عمده استخراج منگنز
اکثر کانسارهای با ارزش منگنز، از غنیسازی ثانویه توسط آبهای زیرزمینی و لیچینگ سنگهای رسوبی منگنزدار تشکیل میشوند. به دلیل تنوع کانسارهای منگنز و گستردگی ترکیبات و کانیهای شناسایی شده در این کانسارها، هیچ یک از روشهای کانهآرایی به تنهایی کاربرد ندارد. در استخراج کانسنگ منگنز، هم روش استخراج روباز و هم زیرزمینی مورد استفاده قرار میگیرد.
ندولهای منگنزدار پوسته کف اقیانوسها ذخایر عظیمی از منگنز را تشکیل میدهند ولی به علت مشکلات تکنیکی زیادی در استخراج آنها وجود دارد. به منظور پر عیار سازی منگنز به دلیل تنوع کانسارهای منگنز و گستردگی ترکیبات و کانیهای شناسایی شده در این کانسارها هیچ یکی از روشهای کانهآرایی به تنهایی و حتی به همراه مجموعهای از سایر روشها، در همه کانسارهای منگنز کاربرد ندارد.
1-8 کاربردهای منگنز
در صنایع فولاد منگنز باعث نورد کردن فولاد و چکشخواری، استحکام، دوام، مقاومت در برابر سایش و شکنندگی میشود. از ترکیب منگنز و آلومینیوم و آنتیموان و کمی مس آلیاژی با خاصیت فرومغناطیس قوی حاصل میشود. منگنز خالص دارای چهار آلوتروپی میباشد. فرم آلفا در درجه حرارت معمولی پایدار است. فرم گامای این عنصر دارای خصوصیات انعطاف پذیری بالا، نرم و راحت با چاقو بریده میشود، و همچنین چکشخوار است. کاربردهای متنوع منگنز باعث میشود که این فلز را در سه نوع عیار متالورژیکی، شیمیایی و باتری طبقهبندی کرد. با توجه به جدول 1-1، عیار متالورژیکی در حدود 38 تا 55 درصد منگنز میباشد، و ممکن است با عیار شیمیایی تنها در شکل فیزیکی آن تفاوت داشته باشد. کانیهایی با عیار باطری و شیمیایی اغلب توسط محتوی MnO2 دستهبندی میشوند، که نوعا در حدود 70 تا 85 درصد (44 تا 54 درصد منگنز) میباشند[7].
جدول1-1 –مشخصات ترکیبهای موجود در محصولات منگنز[7]
نوع محصول ترکیبها درصد ترکیبها
عیار متالورژیکی منگنز
آهن
سیلیکا + آلومینا
فسفر
مس + سرب + روی 0/40
0/16
بدون محدودیت خاصی
کمتر از 3/0
کمتر از 0/1
عیار باتری منگنز
آهن
سرب
مجموع فلزات سنگین به جز آهن و سرب
مجموع غیر محلولها
pH بیشتر از 0/75
کمتر از 0/3
کمتر از 5/0
5/0
0/10
4 تا 7
عیار شیمیایی نوع A
دی اکسید منگنز
آهن بیشتر از 0/80
کمتر از 0/3
نوع B
دی اکسید منگنز
آهن
سیلیکا
آلومینا
فسفر
بیشتر از 0/85
کمتر از 0/3
کمتر از 0/3
کمتر از 0/3
کمتر از 1/0
1-9 توزیع منگنز در دنیا
برخلاف فراوانی و توزیع جغرافیایی ذخائر منگنز 95 درصد از تولید جهان فقط از 7 کشور تولید کننده باشد، همانطور که در شکل 1-3 نیز مشاهده میشود، از تولید کنندگان اصلی منگنز میتوان از آفریقای جنوبی با 62/3 میلیون تن، گابون با 45/2 میلیون تن، استرالیا با 2 میلیون تن، برزیل با 8/1 میلیون تن و هند با 1/1 میلیون تن نام برد. بیش از 80 درصد از ذخائر کشف شده جهان در دو کشور اوکراین و آفریقای جنوبی متمرکز شده است. تقریباً هیچ کشور صنعتی جهان همانند آمریکا، ژاپن و کشورهای اروپایی دارای ذخایر قابل توجه منگنز نیستند و باید همگی نیازهای خود را وارد کنند.

شکل1- 3- نحوه توزیع ذخایر منگنز در دنیا[8]
1-9-1 تولید منگنز در ایران
تاکنون در ایران بیش از 45 کانسار و نشانه معدنی منگنز شناخته شده است که در بین آنها 10 کانسار متوسط و بقیه کانسارهای کوچک و نشانه معدنی میباشند. البته امکان اکتشاف ذخایر پرعیار و بزرگ منگنز، در کشور زیاد است.
مهمترین معادن در دست بهرهبرداری، معادن ونارچ و رباط کریم است که از تولید کنندگان مهم به شمار میروند. مصرف اصلی در کشور، مربوط به صنایع فولاد وبزرگترین مصرف کننده آن کارخانه ذوب آهن اصفهان است. این کارخانه، برای تولید 2 میلیون تن فولاد، نیاز به 100000 تن سنگ منگنز با عیار 25 درصد دارد. افزون بر صنایع فولاد، صنایع دیگر نیز به میزان جزیی منگنز مصرف میکنند.
در حال حاضر، از بین کانسارها و آثار شناخته شده منگنز و آهن منگنزدار ایران، با در نظر گرفتن سطح فعالیتهای انجام شده در آنها، سه معدن و نارچ قم، رباط کریم و ناریگان را میتوان به عنوان تأمین کننده بالقوه نیازهای داخلی در نظر گرفت. از این میان، معدن ونارچ قم با توجه به شرایط نسبتاً مناسب آن از نظر سابقه بهرهبرداری و وجود اطلاعات اکتشافی، وضعیت مناسبی دارد و یکی از مهمترین تأمین کنندههای منگنز ایران است. ذخیره کانسارهای منگنز ایران است حدود 17 میلیون تن برآورده شده است (به جز ذخایر منگنز آهندار). میزان ذخایر کانسارهای آهن منگنز نیز حدود 100 میلیون تن میباشد.
تولید کانسنگ منگنز ایران، سالانه حدود 135 هزار تن است. ایران در مقایسه با دیگر کشورهای جهانی، از نظر تولید کانسنگ منگنز در مکان پانزدهم قرار دارد. به بیانی 5/0 درصد از کل تولید منگنز جهانی، به ایران تعلق دارد.
1-9-2 تولید منگنز در دنیا و توسعه های اخیر
صنعت فولاد یکی از بخشهای مهم در اقتصاد جهان محسوب میشود و به دلیل وجود کثرت حلقههای ارتباطی بالادست و پاییندست با دیگر بخشهای اقتصادی به عنوان صنعتی پیشرو و کلیدی از اهمیت خاصی برخوردار میباشد، به طوری که میزان تولید و مصرف آن نمایانگر پیشرفت صنعتی و اقتصادی کشورها و تحرک دیگر بخشهای اقتصادی است. مصرف سرانه فولاد دنیا حدود 200 کیلوگرم میباشد که این میزان در کشورهای پیشرفته صنعتی بین 350 تا 600 کیلوگرم و در کشورهای فقیر و توسعه نیافته بین 20 الی 40 کیلوگرم است. مصرف سرانه فولاد در ایران نیز حدود 290 کیلوگرم است که در حال حاضر 150 کیلوگرم آن در داخل کشور تولید شده و بقیه از کشورهای دیگر تامین میشود. ایران در بین کشورهای تولید کننده فولاد در سال 2008 با تولید حدود ده میلیون تن در رتبه نوزدهم بوده است. ایران در سال 2009 میلادی با سه پله صعود نسبت به سال 2008 شانزدهمین فولادساز بزرگ جهان لقب گرفت و در سال 2010 میلادی نیز هفدهمین فولادساز بزرگ جهان بوده است و این در حالی است که در بین 20 کشور تولید کننده عمده فولاد جهان تنها کشورهای امریکا، روسیه، مکزیک، آفریقای جنوبی و ایران دارای سه عنصر اصلی تولید فولاد یعنی سنگ آهن، انرژی و آب هستند. لذا کشور ایران از مزیت نسبی در تولید فولاد برخوردار میباشد. آلیاژهای منگنز شامل فرومنگنز و سیلیکومنگنز از مواد مصرفی در صنایع فولادسازی، تولید چدن و صنایع ریختهگری میباشند. مهمترین نقش منگنز تولید فولاد خام، اکسیژنزدایی است. میزان ظرفیت در حال بهرهبرداری فرومنگنز در داخل کشور 42 هزار تن میباشد، در حالی که میزان نیاز به این ماده در حال حاضر 71 هزار تن بوده و تا پایان برنامه چهارم بالغ بر 100 هزار تن خواهد بود. با توجه به شرایط بازار و سیاستهای توسعهای کشور در بخش فولاد چشمانداز گسترش تقاضا برای فرومنگنز وجود داشته و اجرای طرحهای تولید فرومنگنز را توجیهپذیر میسازد. در تولید منگنز سهم ایران 38/0 درصد است و دوازدهمین تولید کننده منگنز دنیا به شمار میآید. سالانه از 21 معدن منگنز کشور بیش از 134 هزار تن استخراج میشود. ذخایر این ماده معدنی نزدیک به 2/8 میلیون تن است. براساس گزارش سازمان زمینشناسی آمریکا بعد از آفریقای جنوبی، استرالیا و چین هر یک با تولید 1/3 میلیون تنی به صورت مشترک در رده دوم و گابن نیز با تولید 2 میلیون تنی در رده سوم قرار گرفتند. برزیل هم با تولید 4/1 میلیون تنی جایگاه چهارم را به خود اختصاص داد. تولید منگنز در سایر کشورهای جهان در سال قبل زیر یک میلیون تن بوده است. از دیگر تولیدکنندگان عمده منگنز در جهان میتوان به برمه، هند، قزاقستان، مالزی، مکزیک و اوکراین اشاره کرد. مجموع تولید جهانی منگنز در سال 2013 به 17 میلیون تن رسید که نسبت به تولید سال 2012 رشد 2/1 میلیون تنی را تجربه کرد. زمینهای حاوی منابع منگنز بسیار گسترده و بزرگ بوده اما در عین حال به صورت پراکنده و نامنظم توزیع شدهاند. در آمریکا ذخایر منگنز دارای عیار بسیار پایین بوده و به همین دلیل استخراج این ذخایر مستلزم صرف هزینه بسیار بالایی است. آفریقای جنوبی دارای حدود 75 درصد از کل ذخایر جهانی شناخته شده منگنز است و اوکراین نیز 10 درصد این ذخایر را در اختیار دارد. در سال 2013 پروژههای مختلفی در زمینه افزایش 5 میلیون تنی ظرفیت تولید منگنز در سراسر جهان در دست اجرا بود که بیشتر این افزایش ظرفیت نیز مربوط به آفریقای جنوبی میشود. سال قبل تولید فولاد آمریکا برنامهریزی شده بود که با افت کوچکی نسبت به سال 2012 مواجه میشود و به همین دلیل واردات فرومنگنز این کشور نیز برآورد میشود که در سال قبل با کاهش 20 درصدی نسبت به سال 2012 مواجه شده است. در نتیجه مصرف ظاهری منگنز آمریکا هم با افت 8 درصدی به 770 هزار تن رسید. در آمریکا سنگ منگز با عیار 35 درصد یا بیشتر از سال 1970 تاکنون تولید نشده است.
اداره زمین شناسی آمریکا ذخائر منگنز را در گروه ذخایر اقتصادی و پایه منتشر میکند. ذخائر اقتصادی شامل ذخایری میشوند که استخراج آنها در شرایط فعلی امکانپذیر و اقتصادی میباشد. ذخایر پایه شامل مجموعه ذخایر اقتصادی و غیراقتصادی می‌شود که از نظر عیار، ضخامت و عمق در شرایطی قرار دارند که از نظر فنی قابل معدنکاری هستند.
براساس گزارش اداره زمین شناسی آمریکا مجموع ذخایر پایه شناخته شده جهان در حدود ۵۰۰۰ میلیون تن است که برای سالها بدون تغییر باقی مانده است و ذخیره عمده جدیدی کشف نشده است. از این مقدار استخراج ۶۸۰ میلیون تن آن در شرایط فعلی اقتصادی می‌باشند.
با توجه به اینکه ذخایر منگنز موجود در خشکی‌ها قادر به تامین نیاز صنایع برای سالهای آتی هستند، به نظر نمیرسد که در آینده نزدیک استخراج ذخایر کف اقیانوسی جهت تامین منگنز اقتصادی بشوند. ولی در صورتی که این ذخایر به منظور دستیابی به مس و یا نیکل آن مورد استخراج قرار گیرند، منگنز و کبالت نیز به عنوان محصولات جانبی میتوانند تولید بشوند. با توجه به کفایت ذخائر مس و نیکل در خشکی‌ها مشخص نیست که دقیقا چه زمانی استخراج ازذخایر کف اقیانوسی اقتصادی بشود. با این حال کشورهای آمریکا،‌ چین، هندوستان، ژاپن و روسیه به تحقیقات خود در قالب پروژه‌های بلند مدت در خصوص اکتشاف و امکانپذیری استخراج ذخایر کف اقیانوسی از آبهای بینالمللی و سواحل خودشان ادامه میدهند.
فصل دوم
روشهای فرآوری کانههای منگنز
2-1مقدمه
در این قصل نگاهی اجمالی به روشهای فیزیکی پرعیارسازی کانسنگ منگنز و به طور مبسوط روش لیچینگ و مطالعات و تحقیقات گذشته در این زمینه شده است. سعی بر این بوده، که تمامی روشهای موجود معرفی شوند. این مطالعات دید مناسبی برای انجام آزمایشهای فرآوری کانسنگ منگنز مورد نظر به دست میدهد.
2-2 سنگجوری
سنگجوری سادهترین و ابتداییترین روش پرعیارسازی سنگ منگنز است که هنوز در بعضی از معادن کاربرد دارد. کانههای منگنز اغلب دارای رنگ تیره مشخص با جلای فلزی و چرب هستند که تا حد زیادی از کانههای غیرفلزی باطلهی همراه که معمولا رنگهای روشنتری دارند، قابل تشخیص هستند. از اهمیت سنگجوری دستی برای مقادیر زیاد کانی کم عیار که ریز دانه هستند کاهش یافته است. گرچه امروزه از سنگجوری دستی برای حذف تکههای آهن،چوب و... از کانسنگ معدن استفاده میشود[9]. این روش محدودیت کاربرد داشته و فقط دانههای درشت کانه با این روش قابل تفکیک هستند و این امر راندمان را به شدت کاهش داده و در مواردی عملا به کارگیری این روش را غیرممکن میسازد. با توجه به محدودیت ظرفیت این روش، در کارخانههایی با ظرفیت زیاد از روشهای «سنگجوری مکانیکی» استفاده میشود[10]. شستشوی سنگ استخراجی و یا خردایش آن در مواردی میتواند سنگ جوری را آسانتر کند.
2-3پرعیارسازی به روش ثقلی
روشهای جدایش ثقلی کانیها بر مبنای حرکت نسبی آنها در یک محیط سیال پایهگذاری شده است. نیروی مؤثر عمدتا وزن دانهها است. نیروی دیگر مقاومت سیال در برابر حرکت جسم است که به ابعاد و شکل دانهها بستگی دارد[9]. روشهای ثقلی برای آرایش تعداد زیادی از کانهها مورد استفاده قرار میگیرند. این روشها در برخی از موارد با وجود هزینه ی کم و سادگی فرآیند با دیگر روشهای پیچیده و گران قیمت نظیر فلوتاسیون قابل رقابت هستند.
تاگارت در مورد قابلیت کاربرد روشهای ثقلی رابطه 2-1 را ارائه کرده است که به کمک آن میتوان معیاری برای سنجش کیفیت پرعیارسازی بهدست آورد:
C.C =∆H-∆F∆L-∆F (2-1)
که در آن :
C.C : معیار پرعیارسازی ، ∆H: جرم مخصوص کانی سنگین، ∆F: جرم مخصوص سیال، ∆L: جرم مخصوص کانی سبک.
با توجه به این که وزن مخصوص کانیهای منگانیت، هماتیت و کوارتز به ترتیب 4/4، 2/5 و 6/2 گرم بر سانتیمتر مکعب است، معیار پرعیارسازی برای کانسنگ منگنز جیرفت برای جدایش منگانیت از هماتیت 25/1، منگانیت از کوارتز 1/2 و هماتیت از کوارتز 6/2 است. مطابق رابطه 2-1، چنانچه نسبت چگالی مؤثر بزرگتر از 5/2 باشد، دانههایی تا ابعاد 75 میکرون را میتوان با روشهای سادهی ثقلی آرایش داد. با کاهش نسبت چگالی مؤثر، ابعاد کوچکترین دانههای قابل آرایش به سرعت افزایش مییابد، به طوری که با کاهش این نسبت به 25/1، تنها دانههایی با ابعاد بزرگتر از 6 میلیمتر و با استفاده از روشهای دقیق ثقلی قابل آرایش هستند. در حد کمتر از 25/1، آرایش ثقلی مواد به طور اقتصادی امکانپذیر نیست[9].
با توجه به معیار پرعیارسازی بین دو کانی منگانیت و هماتیت امکان جدایش برای ذرات بزرگتر از 6 میلیمتر وجود دارد، به علت نزدیک بودن وزن مخصوص کانی هماتیت و منگانیت ، به نظر میرسد که کاربرد روشهای ثقلی برای جدایش این دو کانی چندان مطلوب نیست.
تقریباً تمامی روشهای جداسازی ثقلی اعم از انواع جیگ‌ها، ‌میزهای لرزان، کلاسیفایرها و مارپیچ‌ها، ‌واسطه سنگین و غیره در فرآیند پرعیار سازی منگنز کاربرد دارند. با توجه به وزن مخصوص نسبتاً بالای کانه‌های منگنز (بالاتر از 4) و تفاوت بارز آنها با کانی‌های باطله همراه در صورتی که میزان آزاد بودن و ابعاد دانه‌های کانه و باطله به گونهای باشد که درمحدوده کار دستگاههای جدا کننده ثقلی قرار گیرند، می‌توان بین 80 ـ50 درصد سنگ ورودی را پرعیار کرد. عیار منگنز در محصول خروجی تا 48 درصد نیز گزارش شده است. جیگهای مورد استفاده از انواع مختلف نظیر جیگ دنور، هارتز و دیافراگمی بودهاند که در محدوده دانه‌های درشتتر کاربرد دارند.
کانسنگ منگنز معدنی در ترکیه، با مشخصات کانی شناسی 58/18 درصد منگنز، 82/0 درصد آهن و 85/62 درصد سیلیس برای پرعیارسازی به روش ثقلی خردایش شده و به دو فراکسیون 1+ میلیمتر و 1- میلیمتر تقسیمبندی شده است. عملیات پرعیار سازی بر روی فراکسیون 1+ میلیمتر توسط جیگ و بر فراکسیون 1- میلیمتر توسط میز لرزان صورت گرفت. در نهایت عیار منگنز به 47-45 درصد رسیده است[11].
2-4 پرعیارسازی به روش مغناطیسی
به دلیل تفاوت در خواص مغناطیسی کانههای منگنز و باطله های همراه نظیر کوارتز، کلسیت و رسها روش جداسازی مغناطیسی میتواند به طور نسبتا موثری باعث جداسازی و تغلیظ سنگ منگنز شود[10].
جداسازی مغناطیسی معمولا به تنهایی کارایی لازم را در مورد سنگ منگنز نداشته و اغلب به عنوان تکمیل کنندهی بخش جداسازی ثقلی، فلوتاسیون و یا هیدرومتالورژی مورد استفاده قرار میگیرد که باعث افزایش قابل توجهی در راندمان کل عملیات خواهد شد[10].
2-5 پرعیارسازی به روش فلوتاسیون
کانیهای منگنز از نظر کاربرد روش فلوتاسیون به دو گروه تقسیمبندی میشوند. گروه اول شامل کانههایی با عیار بالایی از منگانیت یا پیرولوزیت همراه با باطلهی کلسیتیاند که با شناوری کلسیت، باطلهای غنی از منگنز (فلوتاسیون معکوس) بهدست میآید. در این حالت کانه در pH حدود 8 و با استفاده از کربنات سدیم و دکسترین زرد آمادهسازی میشود و سپس فلوتاسیون با اسید اولئیک انجام میشود. گروه دوم، کانههای منگنز حاوی پیرولوزیت، منگانیت یا پسیلوملان هستند، که با مقادیر کمی از رس و سایر ترکیبات مولد نرمه همراهاند، و با شناورسازی کانیهای منگنز قابل پرعیار شدن میشوند[12].
2-6 روش تشویه
فرآیندهای متعارف پیرومتالورژی برای استفاده از منگنز سنگ معدن اکسید با هزینههای تولید بالا و انرژی مصرف، بهرهوری پایین، و آلودگی محیط زیست همراه هستند. کاهندههای مورد استفاده برای تشویه کاهشی شامل زغال سنگ، گرافیت و یا CO ، پیریت، آمونیوم سولفیت یا کلرید آمونیوم. مشکلات اصلی این فرآیندهای هیدرومتالورژیکی پالایش منگنز از محلول لیچینگ، هزینه تولید بالا، بازده لیچینگ کم و غیره است. چنانکه، دیاکسید منگنز خالص را میتوان توسط گوگرد در دمای کمتر از 300-400 درجهی سانتیگراد احیا کرد. با استفاده از اسید سولفوریک به عنوان عامل لیچینگ، منگنز میتواند از محصولات تشویه شده باقی بماند. با این حال،MnS در طول تشویه تشکیل شده و زمانی که محصولات تشویه در محلول اسید لیچ شده؛ گازهای مضرH2S اجتناب ناپذیر است.[13]
عمل تشویه که به دنبال آن هیدرومتالورژی صورت میگیرد، نقش مهمی را در به عملآوری کانسنگ منگنز کم عیار و نودلهای منگنز بستر دریا که حاوی مقادیری نیکل، کبالت و مس به صورت اکسید دارد. این اکسیدهای فلزی در نودلها اغلب در ساختمان شبکهای از مواد معدنی آهن و منگنز رخ میدهند. بنابراین شکستن این شبکهها توسط عمل تشویه کاهشی یا محلولهای کاهشی هیدرومتالورژی گامی مهم در بهبود بازیابی فلزات با ارزش به حساب میآیند. روشهای پیشنهادی برای پیرومتالورژی ذوب کردن، تشویه کاهشی، سولفاتی و کلردیدی کردن است. در مقایسه با فرآیند هیدرومتالورژی ترکیب پیرو-هیدرومتالورژی کارایی بازیابی بهتری را نتیجه میدهد، اما این روش مستلزم مصرف انرژی بالایی است.
در تشویه سولفاته کردن، کانیهای منگنزدار در حضور اسید سولفوریک یا آمونیوم سولفات به کانیهای منگنزدار محلول در سولفات تبدیل میشوند. سولفاته کردن منگنز با گاز SO2 نیز کار شده است؛ که در این مورد گاز SO2 دو نقش بازی میکند و به عنوان کاهنده و عامل سولفاته کردن عمل میکند. تشویه سولفاتی به دنبال لیچینگ برای بازیافت باتریهای مصرفی روی-کربن بررسی شده است که با تولید سولفات منگنز و روی همراه بوده است. فرآیند شامل جدایش مکانیکی و لیچینگ اسید سولفوریک، تشویه سولفاتی در حضور اسید سولفوریک یا آمونیوم سولفات پس از لیچینگ بوده است.
ذوب یا تشویه کاهشی در دمای 700-900 درجهی سانتیگراد و سپس به دنبال آن لیچینگ با اسید سولفوریک تا به حال بیشترین روش معمول در صنعت منگنز برای تولید منگنز سولفات میانی یا نهایی برای فرآیند الکترووینینگ است.
واکنش کاهشی به صورت زیر است:
MnO2 + CO/H2 = MnO + CO2/H2O
MnO2 + C = MnO + CO(CO2)
این واکنشها تبدیل منگنز اکسید با ظرفیت بالا به ظرفیت پایینتر به صورتی که در محلول اسید سولفوریک قابل حل باشند، را نشان میدهد[14].
2-7 روش لیچینگ
برای تهیهی منگنز دی اکسید برای باتریها و منگنز فلزی از روش هیدرومتالورژی استفاده میشود[12]. بهرهگیری از روشهای مختلف هیدرومتالورژی از قبیل لیچینگ و بیولیچینگ در پرعیارسازی کانههای منگنز کاربرد وسیعی دارند[15].
فرآیندهای مستقیم لیچینگ کاهشی مختلف مورد مطالعه قرار گرفته و برای پردازش سنگ معدن منگنز کم عیار و نودلهای منگنز بستر اقیانوسها، از شستشو با آهن ، دیاکسید گوگرد، پراکسید هیدروژن، اسید نیتروژن، کاهندههای آلی و زیستی استفاده شده است. از میان این فرایندها لیچینگ با اسید ارزان سولفور دی اکسید و یا یون آهن در مقیاس پایلوت مورد توجه است.
دیاکسید منگنز در اسید سولفوریک رقیق نامحلول است اما وقتی احیا و به MnO تبدیل شد به راحتی در H2SO4 حل شده و تولید MnSO4 مینماید.
MnO + 2H+ = Mn2+ + H2O
از آنجایی که منگنز با الکترولیز محلول فوق بازیابی میشود الکترولیت بازگشتی برای لیچینگ قابل بازیابی میباشد. البته دیاکسید منگنز در حضور یک ماده احیا کننده مانند سولفات فرو، دیاکسید گوگرد، زغال یا اسیداکسالیک طی مراحل اکسایش – کاهش در اسید سولفوریک رقیق حل میشود[15].
MnO2 + 2Fe2+ + 4H+= Mn2+ + 2Fe3+ + 2H2O
واکنش فوق نتیجهی اکسایش و کاهش به شرح زیر است:
اکسایش Fe2+= Fe3+ + e-
کاهش MnO2 + 4H+ + e- = Mn2++ 2H2O
همچنین از یونهای اکسالات و اسید سولفورو به عنوان عوامل کاهش دهنده میتوان استفاده کرد:
[C2O4]2- = 2CO2 + 2 e-
SO2+ 2H2O = H2SO3 + H2O = SO42- + 4H+ + 2e-
در مرحلهی کاهش مشاهده میشود که یون منگنز چهار ظرفیتی در MnO2 به یون دو ظرفیتی کاهش مییابد:
Mn4+ + 2e- = Mn2+
به محض وقوع این واکنش نیروی جاذبهی الکتروستاتیکی در جامد متبلور ضعیف شده و یونهای H+ در محلول، یونهای اکسید را از فاز جامد جدا و تشکیل آب میدهد[15].
پارامترهای موثر بر انحلال اکسید منگنز MnO توسط اسید سولفوریک نظیر غلظت اسید، مقدار نسبت استوکیومتریک اسید، درجه حرارت و مدت زمان لیچینگ مورد بررسی قرار گرفته اند. نتایج حاصل نشان میدهد که غلظت اسید سولفوریک مصرف شده تاثیر اندکی بر میزان انحلال منگنز دارد لذا می توان از اسید رقیق برای لیچینگ استفاده کرد. با افزایش غلظت اسید میزان انحلال آهن افزایش مییابد.
دیاکسید منگنز در شرایط اکسیداسیون اسیدی یا قلیایی پایدار است. از این رو، استخراج منگنز در شرایط احیایی انجام میشود. محلول آبی SO2 ثابت کرده است که لیچ کنندهی موثری برای منگنز از سنگ معدن منگنز دیاکسید، به دلیل سرعت انحلال، عملکرد دمای اتاق، سهولت نسبی خالص سازی محلول لیچ و نداشتن مشکل بازیافت محلول، است. مطالعات بر رویMnO2 مصنوعی برای درک سازوکار لیچینگ انجام شده است. محلول آبیSO2 اکسید منگنز را با کاهش Mn4+و Mn3+فلزی به شکل Mn2+ محلول در آب تبدیل میکند و SO2 به SO42- یا S2O62- اکسیده میشود. واکنش کلی به شرح زیر داده شده است[16]:
MnO2 + SO2 = Mn2+ + SO4
MnO2 + 2SO2 = Mn2+ + S2O6
2MnOOH + SO2 + 2H+ = 2Mn2+ + SO42- + 2H2O
2MnOOH + 2SO2 + 2H+ = 2Mn2+ + S2O62- + 2H2O
SO2 ،FeSO4 ، ساکارز ، زغال چوب ، زغال سنگ و ذغال سنگ چوب نما ،پیریت و غیره را میتوان به عنوان عوامل کاهنده استفاده کرد. اکسالیک اسید میتواند به عنوان یک عامل کاهنده برای استخراج منگنز از سنگ معدن دیاکسید منگنز استفاده شود. از لیچینگ سنگ معدن منگنز با استفاده از اکسالیک اسید تولید میکروارگانیسم ها گزارش شده است. لیچینگ شیمیایی از سنگ معدن منگنز با استفاده از اکسالیک اسید ممکن است بینشی به سمت بیولیچینگ باشد. انحلال منگنز با توجه به کاهش دی اکسید با اکسالیک اسید همراه است. کاهش بین MnO2 و اکسالیک اسید در محیط اسیدی به شرح زیر داده شده[17]:
MnO2 + HOOC--COOH + 2H+ = Mn2+ + 2CO2 + 2H2O
بررسی محلولهای رقیق از دیاکسید گوگرد به عنوان عامل لیچینگ توجه محققان زیادی در این زمینه به خصوص در مورد نودلهای بستر دریاها را جلب کرده است. واکنش بین اکسید فلزی و دیاکسید گوگرد مورد مطالعه قرار گرفته است. مشاهده شده است که:
روش لیچینگ اسید سولفوریک سریع، موثر و حساس است کل واکنش انحلال فقط در 8-10 دقیقه به پایان میرسد.
انحلال در دما و فشار اتاق صورت میگیرد.
دیاکسید گوگرد گاز پسماند است، اعتقاد بر این است که 109میلیون تن SO2 در هر سال به محیط زیست جهانی اضافه شده است. به این ترتیب، با استفاده از SO2 به عنوان عامل لیچینگ، آلودگی هوا را میتوان به حداقل رساند.
محلول آبی SO2 شرایط بسیار کاهنده و بسیار اکسید کننده با اکسیژن ارائه میدهد. بنابراین، این لیچ کنندهها ممکن است برای لیچ فلزات با ارزش از مواد معدنی، سنگ معدن و کنسانتره به عنوان منابع اولیه در حالی که لجن آندی، گرد و غبار دودکشها، قطعات الکترونیکی، آلیاژهای، رشتههای از لامپهای برقی و غیره دیگر منابع ثانویه هستند، استفاده کرد[18].
2-7-1 لیچینگ کاهشی با محلول یون آهن
این فرآیند به صورت شماتیک در شکل 2-1 نشان داده شده است. ویژگی این فرایند هیدرولیز دما بالایFe(III) و رسوب منگنز به عنوان نمک مضاعف (NH4)2Mn2(SO4)3 به طور همزمان است، که سپس با انحلال Fe2O3 و همرسوبی، از هم جدا میشود. انتظار میرود محلول نسبتا خالص منگنز باردار برای الکترولیز از این راه بهدست آید.

شکل2-1- فلوشیت فرآیند بازیابی منگنز با استفاده از محلول لیچ[14]
نگرانیهای اقتصادی این فرآیند بابت هزینهی بالای H2O2 و فرآیند اتوکلاو درجه حرارت بالا است[14]. مطالعهای بر روی سینتیک واکنش بین منگنز دیاکسید و یون آهن در محلول اسیدی انجام شده، که از پتانسیل زوجهای فرو و فریک برای اندازهگیری میزان واکنش استفاده شده است. در این بررسی واکنشها به راحتی در بعضی قسمتهای فعال سطح دیاکسید منگنز و سطحی که یونهای آهن بر روی آن انتشار یافته، رخ داده است. از سوی دیگر، در مطالعهای دیگر به این نتیجه رسیدند که تحت شرایط ویژهی دور همزن، واکنش شیمیایی با انرژی فعالسازی ظاهری 28 کیلورژول بر مول، کنترل شده است. از مفاهیم الکتروشیمیایی برای سیتینک محلول MnO2 با اسیدسولفوریک در حضور پیریت استفاده شده و نتیجه گرفتند که انحلال میتواند با Fe2+ کاتدی که از اکسیداسیون پیریت با یونهای Fe3+ به دست آمده، ادامه یابد. نرخ واکنش اکسیداسیون پیریت به تدریج کاهش مییابد. مطالعهای بر مکانیسم الکتروشیمیایی محلول MnO2 در اسید هیدروکلریک در حضور Fe2+ و Fe3+ انجام شده است و متوجه شدند که با افزایش یونهای Cl- و Fe2+ در محلول سرعت کلی انحلال افزایش مییابد. در مقابل، Mn2+ و Fe3+ در محلول، مانع از رسیدن واکنش به بعضی درجات میشوند[19].
مطالعهای توسط Das et al(1982) [14]، نشان داد که واکنش منگنز دیاکسید در کانی کم عیار منگنز با فروسولفات به سه طریق انجام میگیرد:
فروسولفات طبیعی:
MnO2 + 2FeSO4 + 2H2O = MnSO4 + Fe(OH)SO4 + Fe(OH)3
فروسولفات و مقدار کمی اسید:
MnO2 + 2FeSO4 + H2SO4 = MnSO4 + Fe(OH)SO4
محلول فروسولفات و مقدار زیادی اسید:
MnO2 + 2FeSO4 + 2H2SO4 = MnSO4 + Fe(SO4)3 + 2H2O
بیشتر از 90درصد منگنز را میتوان با لیچینگ کانسنگهای کم عیار با مقدار نسبت استوکیومتری فروسولفات و در دمای 90 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و نسبت جامد به مایع 1:10 استخراج کرد. مایع لیچ تحت این شرایط ژلاتینی و فیلتر کردن آن سخت خواهد شد؛ با اضافه کردن اسیدسولفوریک فیلتراسیون به راحتی انجام شده و منگنز استخراجی بیشتر میشود[14].
در سال 2007 ذاکری و همکاران بر روی لیچینگ کاهشی منگنز با استفاده از آهن اسفنجی مطالعهای انجام دادهاند. با استفاده از اسیدسولفوریک و آهن اسفنجی بر روی نمونهی پیرولوزیت، آزمایشات لیچینگ اسیدی صورت گرفته که در 10 دقیقه با دمای 20 درجه سانتیگراد، موفق به بازیابی 98% منگنز از کانسنگ شدهاند[19].
2-7-2 لیچینگ کاهشی توسط سولفور دیاکسید یا محلولهای سولفیت
در فرآیندهای هیدرومتالورژی، سولفور دیاکسید یا نمکهای سولفیتی کاهندههای قوی برای کانیهای منگنز اکسید بالاتر مانند MnO2 و نودلهای منگنز هستند. واکنشهایی که احتمالا در حین لیچینگ منگنز دیاکسید رخ میدهند :
MnO2 + SO2 = Mn2+ + SO42-
MnO2 + 2SO2 = Mn2+ + S2O62-
2MnOOH + SO2 +2H+ = 2Mn2+ + SO42- + 2H2O
2MnOOH + SO2 +2H+ = 2Mn2+ + S2O62- + 2H2O
SO2 به SO42- و مقداری دی تیونات S2O62- اکسایش یافته که به PH محلول، پتانسیل اکسایش-کاهش و درجه حرارت بستگی دارد. در اصل این فرآیند کاهشی SO2 است. استفاده از محصول میانی دی تیونات واکنش کاهشی برای موازنه هر دو محصول کاهش یافته Mn(II) و کلسیم در محلول در حالی که کلسیم اضافی به صورت CaSO4 رسوب کرده؛ مزیت این فرآیند است. در یک پژوهش نیمه صنعتی یک سری آزمایشات بر روی منگنز با عیار 13-18% انجام شده، در اکثر موارد بازیابی منگنز به 90درصد رسید و عیار منگنز در محصول نهایی بیشتر از 60درصد رسید. برای هر واحد منگنز استخراج شده، 5/1 تا 2/2 واحد SO2 و 1/1 تا 5/1 واحد CaO مصرف شده است. در مقیاس آزمایشگاهی از دی تیونات همچنین برای لیچینگ لجنهای کم عیار منگنز(از نودلهای منگنز در بستر دریاها) استفاده میشود. عموما تشکیل دیتیونات در فرآیند شستشو با SO2 نامطلوب است. زمان ماند طولانی برای تبدیل دیتیونات به سولفات لازم است. یک فرآیند که تشکیل S2O62- را با اضافه کردن SO2 به صورت پیوسته، به زیر 1 گرم بر لیتر کاهش میدهد، توسط Ward et al.2004 بررسی و گزارش شده است. لیچینگ مستقیم SO2 بر روی نمونهی غنی منگنز انجام گرفته است (Grimanelis et al. 1992)، این واکنش سریع بوده و در زمان 10 دقیقه، بازیابی منگنز به بیشتر از 95 درصد رسیده که ناخالصی آهن همراه بسیار کم بوده است[14].
در مطالعهای سه نمونه سنگ معدن منگنز عیاربالا، عیار متوسط و کم عیار مورد لیچینگ توسط SO2 به عنوان کاهنده قرار گرفتهاند. این بررسی در دمای محیط، دور همزن 1000 دور بر دقیقه و با اندازه ذرات زیر 150 میکرون انجام شده است. مقدار کاهنده توسط نسبتهای استوکیومتری معادله زیر در نظر گرفته شده است[16]:
MnO2 + SO2 = Mn2+ + SO42-
در مجموع، استخراج منگنز با افزایش نسبت استوکیومتری مقدار SO2، افزایش مییابد [16]. در نمونه با عیار متوسط، همانطور که در نمودار شکل 2-2 مشاهده میشود؛ با نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 75/1، بازیابی منگنز 88/90 درصد میشود. با افزایش نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 5/2، میزان منگنز استخراج شده از نمونه به 17/97 درصد میسد. در نمونهی پرعیار در نمودار شکل 2-3، 40/94 درصد منگنز با نسبت استوکیومتری SO2به مقدار 5/1 استخراج شده، که با افزایش نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 2 بازیابی منگنز به 55/99 درصد میرسد. در نمونهی کم عیار، با توجه به نمودار شکل 2-4، با نسبت استوکیومتری SO2 به مقدار 5/1، تقریبا همهی منگنز نمونه (29/99درصد) استخراج شده است[16].
شکل2- 2- اثر مقدار SO2 بر بازیابی فلزات در کانه با عیار متوسط[16] شکل2- 3- اثر مقدار SO2 بر بازیابی فلزات در کانهی پرعیار[16]

شکل2- 4- اثر مقدار SO2 بر بازیابی فلزات در کانهی کمعیار[16]
2-7-3 لیچینگ کاهشی با استفاده از کاهندههای ارگانیک
در بسیاری از مطالعات بر روی لیچینگ کاهشی کانیهای منگنز چهار ظرفیتی که از کاهندههای ارگانیک استفاده شده، تمرکز شدهاست. این کاهندهها شامل گلوکز، ساکاروز، لاکتوز، خاک اره، گلیسیرین، اسید اکسالیک، اسید سیتریک، تارتاریک اسید و فرمیک اسید است.
کاهندههای کربوهیدراتی به دلیل هزینه کم و بی خطر بودن، مورد توجه هستند. معادله استوکیومتری آنها به صورت زیر پیشنهاد میشود:
C2H12O6 + 12MnO2 + 24H+ = 6CO2 + 12Mn2+ + 18H2O
محصولات واکنش گلوکز توسط HPLC قابل تشخیص است. در اسیدسولفوریک به عنوان واسطه، گلوکز به فرم مونوکربوکسیلیک پلیهیدروکسی اسید و فرمیک اسید اکسید میشود[14].
در بین این کاهندهها اسید اکسالیک و خاک اره به دلیل در دسترس بودن و هزینهی کم، مورد توجه کارهای صنعتی هستند. ممکن است لیچینگ شیمیایی کانههای منگنز با استفاده از اسید اکسالیک دیدی نسبت به بیولیچینگ بدهد[17]. مکانیسم بیولیچینگ عمدتا به طور غیر مستقیم در محصولات لیچینگ کانههای منگنز با اسید اکسالیک یا اسید سیتریک یافت میشود. طبق واکنش زیر، اسید اکسالیک پتانسیل بیشتری برای کاهش منگنز دی اکسید نسبت به اسید سیتریک دارد:
MnO2 + 2H+ +C2O4H2 = Mn2+ + 2H2O + 2CO2
یونهای منگنز یک لایه بر سطح کانه تشکیل میدهند، و واکنش ارائه شده، با انتشار واکنشدهندهها بر روی لایهی نفوذپذیر محصول کنترل میشود.[14]. در تحقیقی که بر روی سنگ معدن منگنز Joda در هند، آزمایشات لیچینگ با اسید اکسالیک به عنوان کاهنده، بر اساس روش فاکتوریل 24 طراحی شده است. در این تحقیق پارامترهای متغیر مقدار اسیداکسالیک، مقدار اسید سولفوریک، زمان و دما در نظر گرفته شده است. این آزمایشها نشان دادهاند که بعد از 3 ساعت، زمان تاثیری بر استخراج منگنز ندارد. اکثر واکنشها در 30 دقیقهی اول کامل میشوند. نتایج آزمایشها مشخص کرده است به ترتیب مقدار اسید اکسالیک، دما و مقدار اسید سولفوریک بیشترین اثر را بر بازیابی منگنز و به ترتیب دما، مقدار اسیدسولفوریک، مقدار اسید اکسالیک و زمان بیشترین اثر را بر بازیابی آهن در این نمونه کانسنگ دارند. با 6/30 گرم بر لیتر اسید اکسالیک، 54/0 مولار اسید سولفوریک در دمای 85 درجه سانتیگراد و زمان 105 دقیقه، 4/98 درصد منگنز از کانسنگ منگنز معدن Joda بازیابی میشود[17]. در مطالعهی دیگری که بر روی نمونهی کانسنگ منگنز سبزوار در ایران، صورت گرفته از روش سطح-پاسخ با نرمافزار DX7 استفاده شده است. مانند تحقیق قبل، در این تحقیق پارامترهای متغیر مقدار اسیداکسالیک، مقدار اسیدسولفوریک، زمان و دما در نظر گرفته شده است. بر اساس این آزمایشها و مطابق نمودارهای شکل 2-5، مقدار اسیدسولفوریک بیشترین اثر را بر روی بازیابی منگنز دارد.

شکل2- 5- اندرکنش متغیرها بر بازیابی منگنز[20]
در این مطالعه، علاوه بر تعیین اثرگذاری پارامترهای مهم بر بازیابی منگنز، بهینهسازی پارامترها و یافتن بهترین حالت بر اساس بیشترین بازیابی منگنز، کمترین بازیابی آهن و مواد مصرفی در محدودهی مشخص شده، انجام گرفته است. طبق نتایج به دست آمده، حالت اپتیمم با مقدار 7درصد اسید سولفوریک،92/42 گرم بر لیتر اسید اکسالیک در 63درجه سانتیگراد و زمان 65 دقیقه، با بازیابی منگنز 4/93 درصد، بازیابی آهن 81/15 درصد در نظر گرفته شده است[20].
یک بررسی مقایسهای بین دو کاهندهی ارگانیک، اسید اکسالیک و اسید سیتریک بر روی نمونه کانسنگ منگنز در هند انجام گرفته است. این آزمایشها با پالپ 2درصد، به مدت 6 روز به طول انجامید که در هر 3 روز، توسط تیتراسیون با اتیلن دیامین تترا استیک اسید 01/0 مولار درصد بازیابی منگنز مشخص شده است. غلظت دو کاهنده از 1 مولار تا 2 مولار متغیر بوده است. بر اساس نتایج به دست آمده از این تحقیق، در غلظت 2 مولار از اسید اکسالیک، بازیابی منگنز بعد از 6 روز ، به 66 درصد رسیده که با کاهش غلظت اسید اکسالیک تا 1 مولار بازیابی منگنز به 15درصد کاهش مییابد. همچنین، در غلظت 2 مولار از اسید سیتریک، بازیابی منگنز بعد از 6 روز، به 40 درصد رسیده که در این مورد نیز با کاهش غلظت اسید سیتریک تا 1 مولار بازیابی منگنز به 7 درصد کاهش مییابد.

شکل2- 6- تاثیر غلظتهای مختلف اسید سیتریک[21] شکل2- 7- تاثیر غلظتهای مختلف اسید اکسالیک[21]
اسید اکسالیک با فراهم کردن یون H+ و از طریق تشکیل کمپلکس اکسالات با منگنز، منگنز را به راحتی از کانه لیچ میدهد. اما اسید سیتریک قادر به تشکیل کمپلکس با منگنز نیست. با توجه به نتایج و نمودارهای شکل 2-6 و شکل 2-7 به همین دلیل اسید اکسالیک پتانسیل و ظرفیت بیشتری نسبت به اسیدسیتریک، برای لیچنگ کاهشی کانسنگهای منگنز را دارا میباشد[21].
تحقیقی دربارهی لیچینگ کانسنگ منگنز- نقره در چین انجام شده است؛ که برای جداسازی نقره از این کانسنگ، لیچینگ کاهشی صوررت گرفته است. ابتدا توسط روشهای فیزیکی(روش مغناطیسی و فلوتاسیون) جداسازی اولیه انجام شده، سپس کنسانترههای این دو مرحله با هم مخلوط شده و برای لیچینگ با اسید سولفوریک و مادهی سلولزی به عنوان کاهنده استفاده میشود. این مادهی سلولزی، CMK نام دارد که در محلول لیچینگ با اسید سولفوریک، پلی ساکارید تشکیل میدهد[22]:
n(C6H10O5) + n H2SO4 = n(C6H11O5)HSO4
n(C6H11O5)HSO4 + nH2O = n(C6H12O6) + nH2SO4
پلی ساکارید که از واکنش بالا تشکیل شده، میتواند با منگنز دیاکسید واکنش داده و منگنز دیاکسید به Mn2+ اکسایش مییابد:
MnO2 + n(C6H10O6) + H2SO4 = MnSO4 + CO2 + H2O
طی این آزمایشها اندازه ذرات مادهی CMK بررسی شده که با کاهش ابعاد این ذارت تا 1/0 میلیمتر نرخ لیچینگ منگنز به بیشتر از 90 درصد میرسد. همچنین برای تعیین میزان اثرگذاری CMK در لیچینگ، مقایسه ای با اسیداکسالیک صورت گرفته است.

شکل2- 8- تاثیر مقدار کاهنده بر نرخ لیچینگ منگنز[22]
بر اساس نتایج و نمودار شکل 2-8، با افزایش مقدار CMK تا حدود 2/1 بیشتر نسبت به حالت تئوری، نرخ لیچینگ منگنز تا 94 درصد افزایش مییابد[22].
برای بازیافت باتریهای مصرف شدهی کربن- روی و همچنین باتریهای قلیایی تنها از روش تجمع و دفن در محل زبالهها استفاده میشود. اما این روش با محدودیت محل ذخیره و پیامدهای خطرناک همراه است. از روشهای تشویه برای بازیافت و استخراج روی و منگنز از این نوع باتریها میتوان استفاده کرد. با این حال، انتشار گازهای ناشی از سوزاندن در حرارت بالا (600 درجه سانتیگراد) و تقاضای انرژی بالا از اشکالات بزرگ روش تشویه است. از سوی دیگر، فرآیندهای هیدرومتالورژی مزایای اصلی دارند که شامل عملکرد نسبتا ساده، تقاضای کم انرژی و انتشار نشدن گاز در هوا هستند. در یک تحقیق در کشور ترکیه، که بر روی این نوع باتریها انجام شده است، در دو محیط اسیدی، اسیدسولفوریک و اسید هیدروکلریک با اسید اکسالیک به عنوان کاهنده در لیچینگ باتریهای قلیایی و باتریهای کربن- روی استفاده شده است. آزمایشهای این تحقیق به روش فاکتوریل کامل 24 طراحی و انجام گرفته است. پارامترهای متغیر در این آزمایشها، درصد جامد پالپ، دما، مقدار اسید سولفوریک یا مقدار اسید هیدروکلریک، غلظت اسید اکسالیک بوده است[23].
با استفاده از اسیداکسالیک، MnO2 طبق واکنشهای زیر در دو محیط اسیدی لیچینگ میشود:
MnO2 + 2HCl + C2H2O4 = MnCl2 + 2H2O + 2CO2

user8251

حیوانات نشخوارکننده (گاو، گوسفند، بز و غیره) آنزیم‌های تجزیه‌کننده فیبر را نمی‌سازند و برای استفاده از ترکیبات دیواره سلولی گیاهان متکی به میکروارگانیسم‌های مستقر در دستگاه گوارش خود می‌باشند به این ترتیب که حیوان برای میکروارگانیسم‌ها زیستگاهی فراهم می‌کند به نام شکمبه و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز با تخمیر خوراک و تولید انواع اسیدها، پروتئین‌های میکروبی و ویتامین‌ها را برای نشخوارکننده قابل استفاده می‌نمایند (راسل و همکاران، 2002).
متناسب با نوع خوراک مصرفی روزانه در گاو 100 تا 190 لیتر بزاق ترشح می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). بزاق مرکب از بی کربنات و فسفات بوده و به عنوان یک عامل بافری مهم در شکمبه عمل می‌نماید (منصوری و همکاران، 1381).
1-2- محتویات شکمبه و ویژگی‌های تخمیر در نشخوارکنندگانمحتویات شکمبه به صورت لایه‌هایی از ناحیه شکمی تا ناحیه پشتی از هم متمایز می‌باشند همچنین بین محتویات قسمت‌های قدامی و خلفی شکمبه نیز تفاوت‌هایی وجود دارد گازهای حاصل از تخمیر در قسمت فوقانی شکمبه تجمع می‌یابند، علوفه‌های بلند یک لایه بزرگ و متراکم از مواد جامد را تشکیل می‌دهند که مقدار نسبتا کمی مایع همراه آن وجود دارد و ذرات ریزتر در زیر آن قرار می‌گیرند. بخش مایع نیز پایین‌ترین قسمت را اشغال می‌کند (منصوری و همکارن، 1381).
1-2-1- گازهای حاصل از تخمیرتولید گاز در نشخوارکنندگانی نظیر گاو 2 تا 4 ساعت بعد از هر وعده غذایی به سقف 40 لیتر در ساعت می‌رسد یعنی زمانی که سرعت تخمیر در بیشترین مقدار خود می‌باشد (چیبا و همکاران، 2009). گازهای اصلی شکمبه عبارتند از:
(60%) 2CO، (30 تا 40) 4CH، مقادیر متفاوتی از 2N، مقدار کمی 2H و 2O (چیبا و همکاران، 2009). گازهای تجمع‌یافته در قسمت فوقانی شکمبه را عمدتا گازهای کربنیک و متان تشکیل می‌دهند (منصوری و همکاران، 1381). نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود (بهاتا و همکاران، 2007).
متان یک گاز گلخانه‌ای قوی می‌باشد (سیروهی و همکاران، 2012) و بعد از 2CO عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است به طوری که حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد. نشخوارکنندگان مسئول تولید 16 الی 20 درصد از گاز متان گلخانه‌ای اتمسفر می‌باشند (شکل 1-1) که 75% آن به وسیله‌ی گاوها تولید می‌شود و تولید متان حدود 2 الی 12 درصد از کل انرژی حاصله از غذا را از دسترس حیوان خارج کرده (بهاتا و همکاران، 2007) لذا امروزه متخصصین تغذیه دام به منظور کاهش اتلاف انرژی فوق، به ترکیبات ضد میکروبی مانند یونوفرها، آنتی بیوتیک‌ها و اخیرا گیاهان دارویی توجه بسیاری مبذول داشته‌اند زیرا این ترکیبات بر روی فعالیت میکروارگانیسم‌های تولیدکننده هیدروژن اثر ممانعت کنندگی دارند (سیروهی و همکاران، 2012). متان بعد از عامل اصلی اثر گلخانه‌ای است حدود 20 درصد از اثر گلخانه‌ای به دلیل حضور گاز متان می‌باشد (بهاتا و همکاران، 2007).

شکل 1-1- متابولیسم NADH H+ و تولید متان در نشخوارکنندگان1-2-2- اسیدهای چرب فرارمقدار اسیدهای چرب فرار کوتاه زنجیر 4 ساعت بعد از مصرف خوراک به حداکثر می‌رسد (آلاوونگ و همکاران، 2010). اسیدهای چرب فرار منبع اصلی تامین انرژی قابل متابولیسم برای حیوان نشخوارکننده می‌باشند (منصوری و همکاران، 1381). حدود 60 الی 70 درصد از انرژی اپیتلیوم روده از اسیدهای چرب کوتاه زنجیر، به ویژه از بوتیرات مشتق شده اسیدهای چرب کوتاه زنجیر حدود 80 درصد از انرژی نگهداری نشخوارکنندگان را تامین می‌کنند، اسیدهای چرب فرار اصلی شکمبه به ترتیب فراوانی عبارتند از: استیک، پروپیونیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، والریک، ایزو والریک، 2-متیل بوتیریک، هگزانوئیک و هپتانوئیک اسید که در بخش‌های مختلف شکمبه بر اثر تخمیر میکروبی فیبر جیره تولید می‌شوند (آلاوونگ و همکاران، 2010). تولید اسیدهای چرب فرار حاصل از تخمیر میکروبی، باعث کاهش pH شکمبه شده که توسط بزاق مجددا به حد نرمال (7/6=pH) خود باز گردانده می‌شود (سوناگاوا و همکاران، 2007). زیرا کاهش pHشکمبه تا کمتر از 2/6 سرعت هضم را کاهش داده و باعث افزایش مرحله تاخیر در هضم می‌شود. بزاق غدد بناگوشی سرشار از یون‌های نمکی (به ویژه سدیم، پتاسیم، فسفر و بی کربنات) است که ظرفیت بافری بزاق را تامین می‌کنند (منصوری و همکاران، 1381).
1-2-3- نیتروژن آمونیاکیتجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه برای تولید آمونیاک بسیار مورد توجه بوده زیرا آمونیاک برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌های شکمبه که کربوهیدرات‌ها را تخمیر می‌کنند ضروری است (منصوری و همکاران، 1381). از طرفی سنتز پروتئین میکروبی بستگی به حضور انرژی (حاصل از تخمیر مواد آلی موجود در شکمبه) و حضور نیتروژن حاصل از تجزیه‌ی منابع پروتئینی و غیر پروتئینی دارد و در عین حال آمونیاک شکمبه‌ای منبع اصلی برای سنتز پروتئین میکروبی به وسیله‌ی باکتری‌های شکمبه است (کارسلی و همکاران، 2000). آمونیاک سوبسترای مطلوب برای سنتز پروتئین توسط باکتری‌های سلولوتیک، متانزا و بعضی باکتری‌های آمیلولیتیک است (منصوری و همکاران، 1381). غلظت نرمال مورد نیاز از آمونیاک شکمبه‌ای برای حداکثر سنتز پروتئین میکروبی نامشخص است ولی در شرایط آزمایشگاهی این مقدار mg/dl 5 می‌باشد (کارسلی و همکاران، 2000).
1-2-4- ترکیب جمعیت‌های میکروبی در بخش‌های مختلف شکمبهاز نظر اکولوژیکی چند بخش مختلف در شکمبه وجود دارد و ترکیب جمعیت‌های میکروبی موجود در این بخش‌ها نیز متناسب با محل آن‌ها متفاوت می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381). مثلا باکتری‌های تجزیه کننده اوره به دیواره شکمبه می‌چسبند، قسمت عمده‌ی تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها در قسمت سطح محتویات شکمبه قرار دارند، بخش مایع عمدتا مخزن باکتری‌های هضم کننده مواد غیر سلولزی است که اجزای محلول در آب را تجزیه می‌کنند، لایه‌های پایینی شکمبه که آبکی‌تر بوده و هنوز هم دارای مقدار قابل توجهی الیاف قابل تخمیر است احتمالا غنی ترین منبع باکتری‌های سلولایتیک می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).
1-3- میکروارگانیسم‌های شکمبهثبات محیط شکمبه و جریان منظم خوراکهای با قابلیت تخمیر بالا به عنوان سوبسترا به داخل آن، شکمبه را به عنوان محل مناسبی برای استقرار و رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها جهت فعالیت‌های تخمیری مطلوب گردانده است، به طوری که در آن گونه‌های متنوع میکروبی به طور مشترک در تجزیه کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارند. به طور کلی میکروارگانیسم‌های شکمبه به سه دسته باکتری‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌های بی‌هوازی تقسیم بندی می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-1- باکتری‌هاهر میلی لیتر از مایع شکمبه حاوی 10 الی 50 بیلیون باکتری می‌باشد (چیبا 2009). تا کنون بیش از 200 گونه باکتری از شکمبه جداسازی و شناسایی شده است (منصوری و همکاران، 1381). گروه‌های اصلی باکتری‌های شکمبه عبارتند از:
الف) سلولایتیک‌ها: سلولز را هضم می‌کنند.
ب) همی سلولولایتیک‌ها: همی سلولز را هضم می‌کنند.
پ) آمیلولایتیک‌ها: نشاسته را هضم می‌کنند.
ت) پروتئولایتیک‌ها: پروتئین را هضم می‌کنند.
س) پکتینولایتیک: پکتین را هضم می‌کنند.
ج) لیپولایتیک: لیپید را هضم می‌کنند.
چ) مصرف‌کننده‌های قندها: مونوساکاریدها و دی ساکاریدها را مصرف می‌کنند.
ح) مصرف‌کننده‌های اسیدها: اسیدهای لاکتیک، سوکسینیک، مالیک و غیره را مصرف می‌کنند.
خ) تولیدکننده‌های آمونیاک
د) سنتزکننده‌های ویتامین‌ها
ز) تولیدکننده‌های متان (چیبا، 2009).
همه‌ی این باکتری‌ها بی‌هوازی می‌باشند و بیشتر آن‌ها تخمیرکننده‌ی کربوهیدرات‌ها هستند از جمله باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و باکتری‌های ثابت و متحرک. باکتری‌ها در روند تخمیر شکمبه‌ای نقش بسیار مهمی دارند (شکل 2-1)، هیدروژن ورودی منتقل می‌شود و سپس با مصرف شدن توسط متانوژن‌ها مقدار آن به تعادل می‌رسد. اگر باکتری‌های گرم مثبت کاهش یابند مقدار هیدروژن ورودی نیز کاهش می‌یابد و تخمیر به سمت پروپیونات، لاکتات و بوتیرات تغییر می‌یابد (چیبا، 2009). جمعیت زیادی از باکتری‌های آمیلولایتیک، پروتئولایتیک و باکتری‌های مصرف‌کننده اسید لاکتیک در روز اول پس از تولد در شکمبه ظاهر می‌شوند، باکتری‌های به شدت هوازی در روز دوم پس از تولد در شکمبه تجمع می‌یابند، باکتری‌های سلولایتیک و متان زا در روز چهارم ظاهر می‌شوند. 10 روز پس از تولد تعداد باکتری‌ها به حدود 108 در هر میلی‌لیتر می‌رسد (منصوری و همکاران، 1381).

شکل 1-2- روند تخمیر توسط باکتری‌های شکمبه‌ای1-3-2- تک‌یاخته‌هاتک‌یاخته‌ها متعلق به کلاس کینتوفراگمفرا و زیر کلاس وستیبولیفرا می باشند مژکداران به دو شاخه تریکوستوماتا و انتودیتیومورفیدا دسته‌بندی می‌شوند. تک‌یاخته‌ها از باکتری‌ها بزرگتر بوده و طول آن‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم تک‌یاخته‌ها در شکمبه بین 104 تا 106 در هر میلی لیتر از مایع شکمبه گزارش شده و عمده تک‌یاخته‌های شکمبه مژکدار هستند اگر چه تعداد کمی تک‌یاخته تاژکدار نیز در شکمبه پیدا شده است (شین و همکاران، 2004). تک‌یاخته‌های مژکدار بعد از باکتری‌ها و قارچ‌ها در شکمبه ظاهر می‌گردند و به ندرت تا سن 2 هفتگی در نوزاد نشخوارکنندگان یافت می‌شوند آن‌ها معمولا در خلال هفته دوم پس از تولد یعنی هنگامی که غذای جامد جایگزین غذای مایع می‌شود در شکمبه ظاهر می‌شوند (منصوری و همکاران، 1381).
1-3-3- قارچ‌هاقارچ‌های بی‌هوازی شکمبه حدود 20 درصد توده میکروبی شکمبه را تشکیل می‌دهند که در 5 جنس نئوکالیماستکیس، کائکومایسس، آنائرومایسس، پیرومایسس و ارپینومایسس تقسیم‌بندی گردیده‌اند (منصوری و همکاران، 1381). سیکل زندگی قارچ‌ها دارای دو مرحله است: مرحله متحرک (زئوسپوری) که در این مرحله به صورت آزاد در مایع شکمبه یافت می‌شوند و دارای یک یا چند تاژک هستند و مرحله رشد و تکثیر گیاهی (اسپورانژیوم) که در این مرحله به وسیله‌ی سیستم رایزوئیدی به ذرات گیاهی می‌چسبد (دنمن و همکاران، 2006). چرخه زندگی قارچ‌ها در محیط کشت 24 تا 32 ساعت است (منصوری و همکاران، 1381). تراکم زواسپورها در مایع شکمبه 103 تا 105 در هر میلی لیتر مایع شکمبه است (منصوری و همکاران، 1381). قارچ‌های شکمبه تمام آنزیم‌های لازم برای تجزیه سلولز و همی سلولز و هیدرولیز الیگوساکاریدهای آزاد را تولید می‌کنند (دنمن و همکاران، 2006).
پروسه‌ی هضم در نشخوارکنندگان به وسیله‌ی واکنش‌های شیمیایی و محصولات تخمیری حاصل از عملکرد میکروارگانیسم‌های شکمبه انجام می‌پذیرد. با گسترش استفاده از مواد شیمیایی و تهدید میکروب‌های نامطلوب در طول چند دهه گذشته، تعادل میکروبی شکمبه در معرض خطر قرار گرفته است. امروزه فلور میکروبی شکمبه به عنوان یک عامل اساسی برای دستکاری شکمبه به منظور به دست آوردن بهترین عملکرد رشد حیوان و جلوگیری از بر هم خوردن تعادل میکروبی شکمبه مورد توجه قرار گرفته است (فروم هواتز، 2010). دستکاری شکمبه‌ای از طریق بهینه‌سازی فرمول جیره، استفاده از افزودنی‌های خوراکی و افزایش یا مهار گروه خاصی از میکروب‌ها امکان پذیر می‌باشد (کالسامیگلیا و همکاران، 2006).
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در تغذیه حیوانات، به عنوان محرکهای رشد ضد میکروبی بی‌شک برای بهبود فراسنجه‌های عملکردی حیوانات و پیشگیری از بیماری‌ها سودمند است. موننسین، گازولوسید و لیدلومایسین پروپیونات، اسپیرامایسین، ویرژینیامایسین و تایلوزین فسفات رایج‌ترین آنتی بیوتیک‌هایی هستند که در نشخوارکنندگان مصرف شده و همگی به خانواده آنتی بیوتیک‌های یون دوست تعلق دارند (برودیسکو و همکاران، 2000). نحوه عمل آنها مختل کردن شیب یونها از غشای سلول باکتریهای مستعد (یعنی آنهایی که این آنتی بیوتیک‌ها به صورت تخصصی علیه آنها عمل می‌کنند) می‌باشد و نتیجه آن تغییرات مفید در الگوی تخمیر شکمبه‌ای، افزایش نسبت پروپیونات به استات تولیدی، کاهش تولید متان و کاهش تجزیه پروتئین خوراک در شکمبه است که همه این‌ها باعث افزایش بازده غذایی و همچنین کاهش بروز اسیدوز و نفخ میگردد (کالاوی و همکاران، 2003).
اما تهدید امنیت زیستی برای سلامت انسان و حیوان، ناشی از افزایش مقاومت عوامل بیماریزا به آنتی بیوتیک‌ها و تجمع بقایای آنتی بیوتیک‌ها در تولیدات دامی و محیط باعث اعتراض گسترده برای حذف آنتی بیوتیک‌های محرک رشد از جیره حیوانات شده است. تولیدات طبیعی گیاهان، جایگزین‌های بالقوه‌ای برای آنتی بیوتیک‌هایی هستند که به خوراک دام افزوده می‌شوند. در سال‌های اخیر علاقه به خواص دارویی محصولات طبیعی (گیاهان، ادویه‌ها، گیاهان دارویی) به عنوان مکمل و افزودنی خوراک دام با پتانسیل بهبود سلامت و تولیدات دام و کاستن اثرات محیطی از تغذیه دام، به طور چشمگیری افزایش یافته است(محیطی اصل و همکاران، 1389).
گیاهان دارویی یک سری از متابولیت‌های ثانویه گوناگون مانند عصاره‌ها و اسانس‌ها را تولید می‌کنند که زمانی که این ترکیبات، استخراج شده و تغلیظ گردند می‌توانند بر جمعیت گونه‌های مختلف میکروارگانیسم‌های شکمبه شامل: باکتری‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآ و ویروس‌ها و به دنبال آن بر قابلیت هضم خوراک توسط نشخوارکنندگان اثرگذار باشند زیرا قابلیت هضم خوراک در نشخوارکنندگان تحت تاثیر عوامل گیاهی، حیوانی و میکروبی قرار دارد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
از جمله مناطقی که می‌توان گیاهان داروئی خودرو را به فراوانی در آن‌ها یافت مراتع می‌باشند. مراتع با ارزش‌ترین و در عین حال ارزان‌ترین منبع خوراک دام در مناطق مختلف ایران از جمله استان اردبیل می‌باشند. از کل مساحت استان اردبیل که بالغ بر 1786730 هکتار می‌باشد 1076968/6 هکتار آن عرصه منابع طبیعی بوده که 1015000 هکتار آن را مراتع غنی از انواع گیاهان دارویی تشکیل می‌دهد. گیاهان دارویی در فصول مختلف و به فراوانی در سطح مراتع استان اردبیل یافت می‌شوند که از آن جمله می‌توان به اسطوخودوس، پنیرک، جاشیر، مرزنجوش، گلپر، هویج کوهی، مریم نخودی، بابونه، بومادران، پونه، گزنه، پولک، مریم گلی، علف چای، بارهنگ، گل گاو زبان، بولاغ اوتی، پاخری، سپیده، آویشن و غیره اشاره کرد (اداره آمار و اطلاعات سازمان جهاد کشاورزی استان اردبیل،1390).
نبود اطلاعات کافی از ارزش تغذیه‌ای گیاهان دارویی ، ارزش درمانی و موارد مصرف آنها، امکان استفاده بهینه از این منابع را در تغذیه دام و افزایش راندمان تولید، محدود ساخته است (نیکخواه،1385). در مجموع با احتساب و ارائه این گونه اطلاعات کمک قابل توجهی به افزایش تمایل کشت و مدیریت گیاهان دارویی و افزایش راندمان تولید دام صورت می‌گیرد. بنابراین در راستای تولید اطلاعات قابل استفاده در مدیریت دام و گیاهان دارویی منطقه، هدف این پژوهش تعیین اثر برخی از گیاهان دارویی مراتع استان اردبیل بر جمعیت میکروبی شکمبه تحت شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
1-4- اهمیت گیاهان داروییهزاران سال است که انسان از گیاه و عصاره‌های استخراج شده از آن‌ها استفاده می‌نماید. اولین اطلاعات ثبت شده در این خصوص به حدود 2600 سال قبل از میلاد در بین النهرین برمی‌گردد. قدیمی‌ترین سند نوشته شده در مورد تهیه عصاره‌های گیاهی به نوشته‌های مورخ یونانی، هرودوتوس برمی‌گردد (425 الی 484 قبل از میلاد مسیح).
با توجه به خصوصیات بیولوژیکی فعال و چندگانه عصاره‌های گیاهان داروئی این ترکیبات می‌توانند یک افزودنی جایگزین مناسب بسیاری از افزودنی‌های دیگر از جمله آنتی بیوتیک‌ها گردند. از جمله این خصوصیات می‌توان به فعالیت آنتی اکسیدانی، فعالیت ضدقارچی، فعالیت تسکین‌دهندگی، فعالیت ضد باکتریایی و ضد ویروسی اشاره کرد. به علاوه عصاره گیاهان داروئی به دلیل طعم و عطر خاص خود منجر به تحریک مصرف خوراک می‌شوند، کاهش تلفات و عدم نیاز به رعایت حذف پیش از کشتار در اغلب موارد و احتمال نبود ترکیبات باقیمانده مضر در تولیدات حیوانی و در عین حال حفظ سلامت محیط زیست از دیگر خواص گیاهان داروئی می‌باشد. به طور کلی میکروفلور دستگاه گوارش، مورفولوژی روده، تخلیه معده، فعالیت بخش‌های گوارشی داخلی و در نهایت فراسنجه‌های عملکردی تحت تاثیر ترکیبات گیاهی قرار می‌گیرد. عصاره‌های گیاهان داروئی باید در کشورهای کمتر توسعه یافته‌ای چون ایران بیشتر مورد توجه قرار گیرند زیرا دراین کشورها مشکلات حمل و نقل مانع بازاریابی برای محصولات کشاورزی حجیم شده و افزایش هزینه‌ها را در پی دارد اما عصاره‌های گیاهی از جمله گیاهان داروئی به دلیل کم حجم بودن این مشکلات را مرتفع نموده و استفاده از آنها مقرون به صرفه می‌باشد (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5- عوامل موثر در تولید عصاره‌های گیاهی1-5-1- اندام‌های خاص تولیدکننده عصاره‌های گیاهیمیزان و ترکیب عصاره گیاهی به نوع اندام مورد بررسی بستگی دارد. عصاره‌های گیاهی تجمع‌یافته در اندام‌های مختلف یک گیاه ممکن است به لحاظ ترکیب و مقدار متفاوت باشند. از جمله این اندام‌ها می‌توان به: پوست درخت، توت‌ها، گل‌ها، برگ‌ها، پوست میوه، رزین، ریشه، ریزوم، دانه‌ها و چوب اشاره کرد. اما در اکثر موارد اندام‌های مختلف دارای خصوصیات مشابهی هستند (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-2- ساختار ترشحیعصاره‌های گیاهی توسط ساختارهای تخصص یافته متنوعی در گیاه تولید، ذخیره و آزاد می‌شود. ساختارهای ترشحی عبارتند از:
1-5-2-1- ساختار ترشحی خارجیتریکوم‌ها، نعناع، سدابیان، گرانیاسه، سیب‌زمینی و شاهدانه خانواده شمعدانی.
اسموفورها خانواده فلفل، ارکیده و شیپوریان.
1-5-2-2- ساختار ترشحی داخلیایدوبلاستها: خانواده برگ بو، مگنولیا، فلفل، شیپوریان، زرآوند، گل یخ.
حفره: خانواده سدابیان، مورد، میوپوراسه، هیپریکاسه و بقولات.
مجاری: خانواده چتریان، شمعدانی، کاج، مورد، بقولات و آناکاردیاسه (محیطی اصل و همکاران، 1389).
1-5-3- عوامل اکولوژیکیتولید عصاره تا حد زیادی تحت زیادی تحت تاثیر عوامل اکولوژیکی و شرایط آب و هوایی از جمله تاثیرات خاک، مواد مغذی، آب، نور و دما قرار دارد. به طور کلی، افزایش نور و دما، اثر مطلوبی بر تولید عصاره‌های گیاهی دارد (فیگوییردو، 2008) تنش آبی در برخی گونه‌ها مانند اوسیوم باسیلی، ترخون (Ar--isia dracunculus) و شوید (Anethum graveolens) منجر به تولید دو برابر عصاره‌های گیاهی و تغییر در ترکیب آن‌ها می‌شود (سایمون و همکاران، 1992).
1-5-4- کشت و فرآوری گیاهمنشا گیاهان مورد استفاده برای تولید عصاره‌های گیاهی نقش مهمی در کیفیت عصاره به دست آمده دارد. امروزه گونه‌های حاوی عصاره قادر به رشد در مناطقی غیر از منطقه بومی خود می‌باشند. علاوه بر رویه مناسب کشاورزی، بهبود عملکرد محصولات باعث شده تا تولیدکنندگان کنترل لازم را بر روی تولید گیاهان دارویی و فرآیند آنها به منظور تهیه محصولی با کیفیت داشته باشد.
1-6- مشخصات گیاه‌شناسی گونه‌های مورد مطالعه1-6-1-گیاه سپیده (Crambe orientalis)این گیاه با 34 گونه یکی از بزرگ‌ترین جنس‌ها‌ی خانواده brassiceae از زیرخانواده‌های brassicaceae می‌باشد (رضوی و همکاران، 2009) خانواده brassicaceae شامل 13-19 زیرخانواده، 350 جنس و حدود 3500 گونه در جهان است.
جنس crambe در گیاه‌نامه ایران با سه گونه نمایش داده شده است C. Hispanical، C.kotschyana و C. orientalis L.
Crambe orientalis L گسترده‌ترین گونه‌ی مربوط به این جنس در ایران می‌باشد که سپیده نامیده می‌شود (شکل 3-1). این گونه به اندازه 5/1 متر رشد می‌کند و دارای ساقه و برگ‌های موج‌دار است که ممکن است به طول 5/0 متر هم برسد. گل‌ها سفید هستند و طی ماه‌های آوریل – جولای پدیدار می‌شوند. گونه‌های مختلفی از crambe ممکن است به عنوان سبزیجات، خوراک دام و یا گیاه دارویی مورد استفاده قرار گیرد (رضوی و همکاران، 2009).

شکل 1-3- گیاه دارویی Crambe orientalis LCrambe orientalis L یک گیاه پایا و دائمی به طول 30 الی 120 سانتیمتر بسته به فصل و توده جمعیت آن و گاهی 1/2 متر می‌باشد که اکثرا در مزرعه‌ها، دامنه‌ی کوه‌ها، باتلاق‌های خشک، زمین‌های سنگلاخی و خاک‌های رس رشد می‌کند. گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد که باعث شده این گیاه انتشار گسترده‌ای از غرب به شرق یافته است به طوری که از اروپا و شرق مدیترانه، به غرب آسیا و ایران گسترده شده است این گیاه برگ‌های بزرگی دارد که گاهی به طول 60 سانتیمتر می‌رسد برگ‌ها پر شکل و آویزان هستند و رایحه‌ای شبیه کلم پیچ دارد. برگ‌های جوان آن مزه و بوی خوشایندی نزدیک بوی فندق دارد (رضوی و همکاران، 2009) گل‌ها‌ی این گیاه سفید یا زرد و خوشه‌ای شکل هستند میوه‌های آن حتما به بلوغ می‌رسند مگر در باران‌های سنگین و بادهای تند (توتوس و همکاران، 2009).
تحقیقات فیتوشیمیایی اخیر روی بخش‌های هوایی برخی گونه‌های crambe حضور گلوکوزینولات‌ها و فلاونوئیدهای مختلف مانند لوتئولین، آپیژنین، کوئرستین و کامپفرول را آشکار ساخته است. این نشان می‌دهد که پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی این گیاه در عصاره‌های متانولی و دی کلرو متانولی آن مربوط به فلاونوییدهای آن است. گلوکوزینولات تجزیه شده و تبدیل به ایزوتیوسیانات می‌شود لذا عصاره و اسانس گل‌ها و برگ‌های این گیاه دارای اثرات سیتوتوکسینی و فیتوتوکسینی می‌باشند. ترکیب اصلی عصاره و اسانس گل‌ها و سرگل‌های این گیاه، 2-متیل-5-هگزن انیتریل و 3-بوتنیل ایزوتیوسیانات می‌باشد عصاره هگزانی آن فعالیت ضدمیکروبی ندارد. ولی عصاره متانولی آن دارای اثرات ضد باکتریایی قوی علیه هر دو نوع باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد که می‌تواند به دلیل ایزوتیوسیانات باشد. این ترکیبات می‌توانند به راحتی به غشا نفوذ کنند بنابراین نقش دفاعی فعالی را برای گیاهان علیه امراض و گیاه خواران بازی می‌کنند. عصاره متانولی این گیاه قوی ترین اثر را نسبت به سایر انواع عصاره‌ها دارد. عصاره‌های هگزانی، دی کلرو متانولی و متانولی این گیاه بیشترین اثر Allelopathic را نشان می‌دهند که می‌تواند مرتبط با گلوکوزینولات و ایزوتیوسیانات باشد. به خاطر پتانسیل بالای خاصیت ضدمیکروبی برگ‌های C. orientalis این گیاه می‌تواند به عنوان یک گندزدای قوی و یک آنتی بیوتیک علیه میکروارگانیسم‌ها استفاده شود (رضوی و همکاران، 2009). دانه‌ها و میوه‌ی این گیاه غنی از روغن‌های فراری از جمله میرستیک، پالمیتیک، استئاریک، اولئیک، آراشیک، آراشیدونیک، اروسیک، لینولئیک، لینولنیک، پالمیتولئیک، لیگنوسرینیک و ایکوزانوئیک اسید (جدول 1-1) می‌باشند (اخونوو و همکاران، 2012). اروسیک اسید که در میان سایر اسیدهای چرب مربوط به روغن‌های فرار کرامپ بیشترین مقدار (39/39 درصد) را دارد یک هیدروکربن دارای 22 اتم کربن و یک پیوند دو گانه (22:1) می‌باشد. این ساختار نقطه‌ی ذوب و نقطه‌ی تبخیر بالایی (C229) به این ترکیب می‌دهد. توانایی بالا در برابر حرارت زیاد و داشتن حالت مایع در دماهای پایین این روغن را به چرب‌کننده‌ای قوی مبدل ساخته است.
جدول 1-1- موقعیت و مقدار اسیدهای چرب در عصاره C.orientalisاسیدهای چرب(%)تعداد کربن‌هامقدار در گیاه (%)
پالمیتولئیک اسید16:120/0
پالمیتیک اسید16:027/3
لینولئیک اسید18:242/12
لینولنیک اسید18:321/21
اولئیک اسید18:161/1
استئاریک اسید18:053/0
آراشیدونیک اسید20:042/0
اروسیک اسید22:139/39
نروونیک اسید24:199/0
لیگنوسریک اسید24:020/0
سیس-ایکوزانوئیک اسید20:195/9
ترانس- ایکوزانوئیک اسید20:139/1
SAFA87/4
MUFA 53/53
PUFA 63/33
جمع58/91
SAFA: saturated fatty acidsMUFA:monounsaturated fatty acids PUFA:polyunsaturated fatty acids

این گیاه همچنین محتوی آلکالوئید نیز می‌باشد. ترکیبات اصلی این گیاه از گروه الکالوئیدها عبارتند از:
بوتن-1-ایزوتیوسیانات و هیدروکربن‌های 2-متیوکسی هگزن و 3-متوکسی-4-هیدروکسی استیرن. کرامپ همچنین دارای انواع فیبر از جمله هولوسلولز، آلفا سلولز، سلولز، لیگنین، خاکستر و سیلیکا می‌باشد. محتوای لیگنین کرامپ 24/5 درصد و نسبت سلولز آن 40/1 درصد می‌باشد. بالاترین قابلیت انحلال‌پذیری آن با %1 NaoH برابر 34/9% می‌باشد. نسبت هولوسلولز و -سلولز آن نیز 70/50% است (اخونوو و همکاران، 2012).
گیاه دارویی کرامپ در شرایط متفاوت از جمله در دماهای مختلف، ارتفاع، شرایط آفتابی و خشک‌سالی قادر به رشد و ادامه حیات می‌باشد.
1-6-2- گیاه گلپر (Heracleum persicum)گونه‌های مختلفی از جنس Heracleum در قرن 19 میلادی از جنوب غرب آسیا به اروپا معرفی شدند و در حال حاضر به طور گسترده‌ای در بسیاری از کشورها یافت می‌شود جنس Heracleum در دنیا دارای حدود 60 الی 70 گونه می‌باشد که همه آن‌ها گونه‌های پایا و یا دو ساله هستند تا جایی که شناخته شده گونه‌های Heracleum هیبرید و با فرمول 22=n2 می‌باشند. جنس Heracleum شامل بیش از 70 گونه در سرتاسر جهان است و در ایران 10 گونه بومی دارد (حاج هاشمی و همکاران، 2009) که بیشتر بومی مناطق البرز و شمال ایران در این مناطق تا محدوده ارتفاعی 2000 الی 3000 متری نیز رشد می‌کند (مجاب و همکاران، 2003).
Heracleum persicum که معمولا به زبان فارسی گلپر نامیده میشود (شکل 4-1) از خانواده Apiaceae بوده و از جمله گیاهان گلدار محسوب میشود این گیاه یک گیاه دو یا چند ساله پرتخم است که بومی ایران، ترکیه و عراق می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
شکل 1-4- گیاه گلپر تاریخ شناخت گونه Heracleum persicum نامشخص است و تقریبا به اوایل سال 1829 نسبت داده می‌شود (دهقان نوده و همکاران، 2010) گونه‌های H. laciniatum auct، H.tromsoensis و H.CF.pubescens هم‌خانواده و مترادف این گونه می‌باشند. گونه H.persicum که گاهی با گونه‌های H.mantegazzianum و H.sosnowskyiاشتباه گرفته می‌شود، گیاهی بلند و ایستاده است که در مناطق معتدل نیمکره شمالی و همچنین در کوههای بلند گسترده شده است. تمرکز بیش‌ترین تنوع گونه‌های آن در کوه‌های قفقاز و چین است (دهقان نوده و همکاران، 2010). از میوه‌های این گونه به طور گسترده‌ای به عنوان ادویه‌جات و از ساقه‌های جوان آن نیز در تهیه خیار شور استفاده می‌شود (همتی و همکاران، 2010). این گونه دارای روغن‌های فرار، فلاونوییدها و فورانوکومارین‌ها می‌باشد (دهقان نوده و همکاران، 2010). در ریشه این گیاه ترکیباتی از قبیل pimpinelin، isopimpinellin، bergapten، isobergapten، sphondin و furanocoumarins وجود دارد. عصاره هیدروالکلی آن حاوی تعدادی فورانوکومارین است که از آن جمله می‌توان به sphondin اشاره کرد. گزارش شده است که این ترکیب ممانعت کننده‌ی 8-beta است که این ترکیب تحریک کننده ترشح آنزیم سیکلواکشیژناز دو می‌باشد از آنجایی که این آنزیم یک نقش کلیدی در درد و التهاب دارد می‌تواند اثر تسکین‌دهنده‌ی این گیاه را توضیح دهد. بر خلاف عصاره هیدروالکلی این گیاه کومارین‌ها در روغن ضروری آن یافت نمی‌شود و اثر تسکین‌دهندگی آن ممکن است مربوط به ترکیبات استری آن باشد (حاج هاشمی و همکاران، 2009). عصاره استونی دانه‌های این گیاه دارای برخی ترکیبات ترپنی از جمله eugenol، Cineol و Linalool می‌باشد که دارای اثر بی‌حس‌کنندگی، سست‌کنندگی عضلات و همچنین اثر بازدارندگی بر رو‌ی تحرک می‌باشند. به همین دلیل ترکیبات ترپنی موجود در دانه‌ها ممکن است مسئول اثر تسکین دهندگی آن‌ها باشند (همتی و همکاران، 2010). اسانس میوه‌های گیاه شامل 95% استرهای آلیفاتیک، 4% الکل‌های آلیفاتیک و 1% مونوترپن‌ها می‌باشد. ترکیب اصلی در اسانس برگ‌های این گیاه trans-anetholeمی‌باشد (مجاب و همکاران، 2003).
روغن‌های فرار آن حاوی ترکیباتی مانند هگزیل بوتیرات (56/5%)، اکتیل استات (16/5%)هگزیل-2متیل بوتانات (56/5%)(butanoat) و هگزیل ایزوبوتیرات (3/4%) می‌باشند. به دلیل وجود این مواد فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد قارچی در این گیاه دیده می‌شود. اسانس این گیاه همچنین خاصیت سیتو توکسینی دارد که به دلیل حضور فنول‌هایی از قبیل thymol، carvacrol، آلدهیدهایی از قبیل geranial، citronella و الکل‌هایی از قبیل geraniol، linalool، citronellol و lavandulol است. عصاره هیدروآلکالوئیدی این گونه حاوی ساپونین می‌باشد عصاره هیدروالکلی و اسانس این گیاه دارای اثرantinociceptive و ضد فساد هستند. عصاره ریشه و بخش‌های هوایی این گیاه به طور کلی رشد bacillus anthracis را متوقف می‌کند. این گیاه می‌تواند هر دو نوع ایمنی هومورال و سلولی را تحریک کند و در عین حال افزایشی در پاسخ ایمنی به وجود آورد که این به دلیل حضور فلاونوئیدها یا کومارین‌ها می‌باشد که می‌توانند پاسخ هومورال را به وسیله‌ی تحریک ماکروفاژها و افزایش β-lymphocytesکه در سنتز آنتی‌بادی‌ها دخالت دارند افزایش دهند. در عین حال انواع متنوعی از فلاونوئیدهای موجود در این گیاه می‌توانند فعالیت سلول‌های T، سیتوکین‌ها، اینترفرون گاما و ماکروفاژها را به طور معنی‌دار‌ی افزایش دهند و بنابراین برای درمان بیماری‌های مربوط به سیستم ایمنی مفید باشند عصاره متانولی این گیاه به خاطر دارا بودن هگزیل استات و اکتیل بوتیرات دارای خاصیت ضد توموری می‌باشد (همتی و همکاران، 2010).
1-6-3- گیاه zosima absinthifoliaاین گیاه یکی از اعضای خانواده Apiaceae می‌باشد (رضوی و همکاران،2010). جنس zosima دارای چهار گونه است که عبارتند از:
Z. absinthifolia، Z. korovinii، Z gilliana و Z. Radians (منه من و همکاران، 2001).جنس zosimaدر ایران شامل گیاهان 6 ساله یا همیشگی است. zosima absinthifolia یک گونه‌ی شناخته شده از این جنس است که در ایران، ترکیه، عراق و کشورهای مختلف قفقاز، شرق میانه و آسیای مرکزی یافت می‌شود (شکل 5-1). این گیاه در استپ‌ها، زمین‌ها و دامنه‌های آهکی رشد می‌کند و ساقه‌های شیار دارش ممکن است به ارتفاع یک متری نیز برسد. برگ‌های این گیاه سه پر است و گل هایش به رنگ سبز روشن تا زرد می‌باشد. دوره گلدهی آن از آوریل شروع می‌شود و تا جولای ادامه می‌یابد. شکل میوه‌هایش بیضوی مایل به دایره با حاشیه‌های آماس کرده است. به غیر از گونه‌یHeracleum گونه‌ی Z. absinthifolia نیز در ایران معمولا به نام گلپر شناخته می‌شود زیرا میوه‌هایش به عنوان طعم‌دهنده و ادویه غذایی به کار برده می‌شوند (رضوی و همکاران، 2010). جنس zosimaنخستین بار در سال 1814 به وسیله‌ی هافمن معرفی شد وی همچنین تشخیص داد که گونه‌های Heracleum absinthifolium و Tordylium absinthifolium هم خانواده‌های Z. orientalis می‌باشند.

شکل 1-5- گیاه دارویی zosima absinthifoliaجنس Zosima بر اساس شکل میوه‌ها با گونه‌ی Heracleum فرق دارد. در Heracleum میوه‌ها دارای پره‌های شفاف (زائده‌های حبابی شکل) در بخش‌های جانبی هستند که تشکیل یک لبه ضخیم را می‌دهد. ارتفاع این گیاه از 30 تا 100 سانتیمتر در Z. absinthifolia، 50 تا 85 سانتیمتر در Z.gilliana، 35 تا 50 سانتیمتر در Z.koroviniiو 30 تا 50 سانتیمتر در Z.--ians متفاوت است. همه‌ی گونه‌های این جنس یک یقه‌ی لیفی محکم تولید می‌کنند که از پایه برگ‌ها تا بالاتر از ریشه ادامه دارد. ساقه در همه‌ی گونه‌ها مودار است (منه من و همکاران، 2001).
اسانس دانه‌های Z.absinthifolia که به وسیله‌ی اکتیل استات (87/4%)، اکتیل اکتانات (5% octyloctanoate) و 1-اکتانول (%2/3 1-octanol) به دست آمده دارای اثر ضد باکتریایی بالایی علیه باکتری‌های گرم مثبتی مانند Bacillus subtilis، Bacillus pumilusمی‌باشد. همچنین عصاره دانه‌های این گونه فعالیت آنتی اکسیدانی و فیتوتوکسینی نشان می‌دهد. مانند سایر گونه‌های Apiaceae گونه‌ی Z.absinthifolia نیز دارای کومارین می‌باشد (رضوی و همکاران، 2010). عصاره n- هگزانی میوه‌های این گیاه دارای سه مشتق کومارین می‌باشد که عبارتند از: imperatorin، auapteneو 7-prenyloxycoumarine.همچنین دیگر مشتقات کومارینی (bergapten، deltoin، columbianadin، isobergapten، isopimpinellin، imperatorin، pimpinellin، sophodin و umbelliferone)، انواع فلاونوئیدها (quercetin، kaempferol)، و آلکالوئیدها ازz.absinthifolia استخراج شده‌اند. از این میان deltoinو columbianadin ترکیبات اصلی هر دو عصاره n-هگزانی و اتانولی می‌باشند. در هر دو قسمت ریشه و بخش‌های هوایی محتوای deltoinبیشتر از columbianadinاست و همچنین کل محتوای deltoin وcolumbianadin در ریشه بیشتر از بخش‌های هوایی می‌باشد (باهادیر و همکاران، 2010).
Imperatorin در بسیاری از جنس‌های خانواده Apiaceae مانند Angelica، Prangosو Heracleum وجود دارد (رضوی و همکاران، 2010).
1-6-4- گیاه مریم نخودی Teucrium polium l.گیاه Teucrium polium از خانواده Lamiaceae یکی از300 گونه‌ی مربوط به جنس Teucrium است. این گیاه به صورت باستانی و بر اساس عادات بومی به عنوان چای دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرد (میرغضنفری و همکاران، 2010). جنس مریم نخودی شامل بیش از 340 گونه در سراسر جهان می‌باشد. در ایران 12 گونه یک ساله و چند ساله از این گیاه وجود دارد که 3 گونه آن انحصاری ایران می‌باشد. گل‌هایش کوچک هستند و رنگی بین صورتی تا سفید دارند. این گیاه درختچه‌ای شکل، آروماتیک و دارای برگ‌های بیضی شکل است (مقتدر، 2009). ارتفاع این گیاه 50-20 سانتیمتر است و برگ‌هایش به رنگ سبز مایل به خاکستری می‌باشند (شکل 6-1). گل‌های این گیاه در ماه‌های جون تا آگوست دیده می‌شوند. این گیاه به صورت وحشی در اروپای جنوبی، آسیای جنوب غربی و مرکزی و آفریقای شمالی رشد می‌کند.

شکل 1-6- گیاه دارویی Teucrium poliumگونه‌های دارویی مریم نخودی شامل Teucrium poliumو Teucrium chamaedrys می‌باشد از آنجا که این گیاه منجر به کاهش قند خون می‌شود برای درمان دیابت نیز به کار می‌رود. این گیاه در درمان بسیاری از بیماری‌های پاتوفیزیولوژیکی از قبیل بیماری‌های روده ای، دیابت و روماتیسم به کار می‌رود سایر اثرات درمانی این گیاه عبارتند از: اثر آنتی اکسیدانی، ضد فساد، ضد درد، ضد تب، اثر ضد میکروبی، محافظ کبد، ضد زخم معده و سیتوتوکسین. عصاره آن دارای فعالیت‌هایی از قبیل کاهش فشار خون، ضد التهاب، ضد تشنج، ضد باکتری و ضد تب می‌باشد (ساخانده و همکاران، 2000). عصاره هیدروالکلی این گیاه سطح انسولین سرم را در موش کاهش می‌دهد. ترکیبات شیمیایی عصاره متانولی این گیاه عبارتند از dimethoxyflavone-7 و 4-hydroxy-5 عصاره متانولی این گیاه ترشح انسولین را تحریک می‌کند. فقط عصاره‌های الکلی این گیاه ترشح انسولین را افزایش می‌دهند که این ممکن است به دلیل وجود ترکیبات بیواکتیو موجود در عصاره متانولی و الکلی این گیاه باشد (میرغضنفری و همکاران، 2010). آنالیز شیمیایی این گیاه وجود ترکیباتی مانند فلاونوئیدها، Cirsiliol و Iridoids را نشان می‌دهد (ساخانده و همکاران، 2000). تاکنون از گونه‌های مختلف مریم نخودی انواع نئوکلرودان، دی ترپنوئید و نیز تری ترپنوئید جداسازی شده‌اند .تعداد کمی فورانودی ترپن از عصاره‌های این گیاه به دست آمده است. حدود 28 ترکیب از اسانس این گیاه استخراج شده است که به طور کلی عبارتند از:
آلفا-پیین، لینالول، کاریوفینل، بتا پیین و غیره. به نظر می‌رسد که منطقه جغرافیایی این گیاه بر ترکیب اسانس و عصاره آن تاثیر مهم بگذارد (مقتدر، 2009). مهم‌ترین و تاکسونومیکی‌ترین گونه‌های polium عبارتند از T. polium و T.Capitatum که در نواحی مدیترانه، ایران و توران می‌باشند (دولجا و همکاران، 2010).
1-6-5- گیاه پونه (Oregano vulgare L.)پونه یک گیاه دارویی است که همچنین به عنوان یک گیاه تزئینی نیز به کار می‌رود (شکل 7-1). این گیاه متعلق به خانواده Verbenaceae می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) و از ماه آگوست به طور همزمان میوه و دانه می‌دهد (نورزی و همکاران، 2009). پونه گیاهی پرپشت و درختچه‌ای شکل می‌باشد و متعلق به مناطق نیمه خشک است (نیبلاس و همکاران، 2011).

شکل 1-7- گیاه دارویی Oregano vulgare Lاین گیاه به طور کلی از لحاظ مورفولوژیکی و شیمیایی بسیار تغییرپذیر است که مرتبط است با محل رویش آن، شکل گیاه و همچنین مسائلی از قبیل میزان آب و نیتروژن موجود در خاک، مرحله‌ی رشد و فصل رویش.به عنوان مثال: گونه‌ی vulgare L.ssp.hirtum. که در آب و هوای مدیترانه‌ای رشد می‌کندغنی از اسانس است در حالی که همین گونه در آب و هوای قاره‌ای دارای اسانس بسیار کمی می‌باشد. افزایش نیتروژن خاک به اندازه kg/ha 80 موجب افزایش ارتفاع و بازدهی گیاه می‌شود و یا کاهش آب در خاک وزن گیاه را کاهش می‌دهد ولی محتوای اسانس آن را کاهش نمی‌دهد. این گیاه دارای خواص آنتی باکتریال، آنتی اکسیدانی و آرام بخشی است (نورزی و همکاران، 2009). اسانس این گونه با گونه‌ی Oregano(Lippa palmeri S.wats) قابل مقایسه می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011).
عصاره و اسانس این گیاه حاوی حدود 45 ترکیب شیمیایی می‌باشد (نیبلاس و همکاران، 2011) که برخی از آن‌ها عبارتند از: sabinene، β-pinene، β-(z)-ocimene، β-(E)-ocimene، φ-terpinene، e-caryophyllene، germacreneD، bicyclogermacrene، α-(E,E)-farnesene،
germacrene-D-4-ol، تیمول و کارواکرول (ستین و همکاران، 2009). از این میان اصلی‌ترین و مهم‌ترین ترکیبات عبارتند از: کاواکرول، تیمول، ائوژنول، لینالول، ترپن‌ها، Cimene و Pinene (کاردازو و همکاران، 2005). زمانی که گیاه در اوج زمان گلدهی باشد بیشترین میزان اسانس و عصاره را دارد. در طول دوره گلدهی با افزایش محتوای تیمول به طور همزمان غلظت کارواکرول کاهش می‌یابد تا زمانی که دیگر در گیاه نباشد. با خشک شدن گیاه میزان آن‌ها به حدود 5/0 الی 5.1 درصد در هر برگ کاهش می‌یابد (ستین و همکاران، 2009). این ترکیبات خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضدحشرات و ضد ویروسی به گیاه بخشیده‌اند. گیاهان این خانواده به دلیل محتوای بالای ترپن‌ها مصارف دارویی دارند که عبارتند از: limonene، myrcene، durene،p-cymene که همچنین به گیاه خواص ضد میکروبی می‌بخشند(کاردازو و همکاران، 2005). فعالیت ضد باکتریایی بسیار قوی این گیاه ممکن است مربوط به محتوای بالای phenolic monoterpene و یا thymol acetate، ائوژنول و یا متیل ائوژنول موجود در این گیاه باشد. مکانیسم عمل این ترکیبات مرتبط است با آب‌گریزی ترکیبات موجود در اسانس و عصاره این گیاه که آن‌ها را قادر می‌سازد لیپید غشای سلولی باکتریایی را بشکند سپس نفوذ پذیری یون‌ها را افزایش می‌دهد و به دنبال آن یون و لیپید به درون سلول نشر پیدا می‌کنند که به نوبه خود باعث لیز شدن سلول می‌شود (نیبلاس و همکاران، 2011). در عین حال حضور فنولیک هیدروکسیل به ویژه در کارواکرول دلیلی بر فعالیت ضدپاتوژنی عصاره و اسانس این گیاه می‌باشد (کادازو وهمکاران، 2005).
یکی از گسترده ترین کاربردهای گیاهان دارویی استفاده از آن‌ها به منطور کاهش گازهای شکمبه‌ای به ویژه متان است. نشخوارکنندگان رابطه‌ای هم زیستی با میکروارگانیسم‌های شکمبه دارند به طوری که حیوان مواد مغذی مورد نیاز و شرایط مطلوب زیست میکروازگانیسم هارا فراهم می‌کند و در عوض میکروارگانیسم‌ها نیز فیبر جیره را تخمیر می‌کنند و پروتئین میکروبی را به عنوان یک منبع انرژی برای حیوان تامین می‌کنند اما در هر صورت این رابطه‌ی هم زیستی منجر به از دست دادن انرژی به شکل متان و از دست دادن پروتئین به شکل آمونیاک می‌گردد. بنابراین دستکاری شکمبه‌ای و استفاده از افزودنی‌هایی از قبیل گیاهان دارویی برای کاهش اتلاف انرژی به شکل گازهای شکمبه‌ای مورد توجه قرار گرفته است (سلامت آذر و همکاران، 2011). از این رو روش‌های بسیاری به منظور ارزیابی ارزش غذایی خوراک در شرایط آزمایشگاهی و یا به طور مستقیم بر روی حیوان مورد استفاده قرار گرفته است که یکی از پرکاربردترین آن‌ها روش آزمون گاز تست می‌باشد (گوئل و همکاران، 2006). تکنیک تولید گاز در شرایط آزمایشگاهی یک روش مفید برای ارزیابی ارزش غذایی علوفه مورد استفاده دام است چرا که تخمینی از میزان تخمیر مواد مغذی در شکمبه می‌دهد (سیروهی و همکاران، 2009). به طور کلی آزمون تولید گاز یک پارامتر مناسب برای پیش بینی قابلیت هضم، تخمیر، سنتز و تولید پروتئین میکروبی از سوبسترا به وسیله‌ی میکروب‌های شکمبه در سیستم in vitro می‌باشد (سامورت و همکاران، 2000). در روش تولید گاز ضمن آن که ثبت سرعت تخمیر خیلی آسان است، با یک انکوباسیون علاوه بر قابلیت هضم ظاهری، قابلیت هضم حقیقی را نیز می‌توان برآورد نمود، زیرا حجم گاز تولیدی بهترین شاخص و معرف برای قابلیت هضم ظاهری است و ماده آلی ناپدید شده نیز بیانگر قابلیت هضم حقیقی می‌باشد (منصوری و همکاران، 1381).

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

1-7- روش آزمون گازتولید گاز آزمایشگاهی مطابق با روش منک و استین گاس (1988) اندازه‌گیری می‌شود. در این روش، نمونه‌های مواد خوراکی (200 میلی گرم) پس از خشک شدن در غذا با دقت وزن شده، سپس در سرنگ‌های دارای پیستون قرار داده می‌شود. مایع بافری شکمبه (30 میلی لیتر) با پیپت به سرنگ‌های حاوی مواد خوراکی اضافه می‌شود (منک و استین گاس، 1988). مقدار گاز تولیدی در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت اندازه‌گیری می‌شود (منک و استین گاس، 1988). گازهای حاصل از سوبسترای مورد آزمایش در حین تخمیر آزمایشگاهی، عبارتند از دی اکسید کربن، متان و هیدروژن (هاگ و همکاران، 1998). بر اساس مشاهدات منک و استین (1988) گاز دی اکسید کربن یا از تخمیر مستقیم خوراک و یا از تاثیر اسیدهای چرب فرار بر بافر بیکربنات ناشی می‌شود. با انکوباسیون مواد خوراکی با مایع بافری شکمبه کربوهیدرات‌ها به اسیدهای چرب کوتاه زنجیر و گازها، به ویژه دی اکسیدکربن، متان و همچنین سلول‌های میکروبی تخمیر می‌شود (بلومل و ارسکوف، 1993). اسیدهای چرب حاصل با بافر بی کربنات واکنش انجام می‌دهد و در نتیجه گاز کربنیک خارج می‌شود، در نتیجه هنگام هضم الیاف، هم زمان با تولید اسیدهای چرب گاز نیز تولید می‌شود و به این ترتیب اطلاعات خوبی در مورد هضم سلولز در اختیار می‌گذارند (اسکوفیلد و همکاران، 1994). سیستم تولید گاز می‌تواند به شناسایی بهتر کمیت مواد مغذی کمک کند و دقت آن به اثبات رسیده است (سالام، 2005). گازی که بر اثر انکوباسیون مواد غذایی و تحت شرایط آزمایشگاهی آزاد می‌شود مربوط به قابلیت هضم آن ماده غذایی است و ارزش انرژی‌زایی آن ماده غذایی را برای نشخوارکنندگان بیان می‌کند (منک و همکاران، 1979).
فصل دوممواد و روش‌ها2-1- منطقه مورد مطالعه و نحوه نمونه‌برداری2-1-1- منطقه نمونه‌برداریاستان اردبیل در شمال غربی ایران واقع شده که با مساحتی برابر 1786730 هکتار حدود 09/1 درصد از مساحت کل کشور را در بر می‌گیرد. 1015000 هکتار از کل مساحت این استان را مراتع تشکیل می‌دهد که معادل 8/56 درصد از مساحت کل استان می‌باشد (بی نام، 1388). به دلیل گستردگی مراتع استان اردبیل، جهت نمونه‌برداری بخشی از مراتع منطقه آستارا انتخاب گردید. آستارا یکی از شهرستان‌های استان گیلان با 65 هزار نفر جمعیت (3600 نفر جمعیت شهری) با وسعت 334 کیلومتر مربع در شمال غربی این استان واقع گردیده است. این منطقه با ارتفاع 27 متر بالاتر از سطح دریا در موقعیت جغرافیایی 48 درجه و51 دقیقه طول شرقی و 38 درجـــه و 26 دقیقه عرض شمالی واقع گردیده است. شهرستان آستارا از سمت غرب به کوه های پوشیده ازجنگل‌های تالش و از شرق بــه سواحل دریای خزر محدود می‌شود (بی نام، 1388).
2-1-2- زمان نمونه‌برداری و انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاهنمونه‌برداری از گیاهان دارویی Crambe orientalis، Heracleum persicum،Zosima absinthi، Teucrium polium و Oregano vulgare در فصل تابستان و در تیر ماه 1390 آغاز شد. از هر نمونه گیاه دارویی دسته‌هایی به وزن تقریبی 2 الی 5/2 کیلوگرم جمع‌آوری شد. نمونه‌ها به گونه‌ای انتخاب شد که همه قسمت‌های گیاه از جمله گل، برگ، ساقه و ریشه را دربرگیرد. نمونه‌های به دست آمده به مدت یک هفته در دمای اتاق و به دور از تابش مستقیم نور خورشید خشک شدند. نمونه‌ها سپس دو بار آسیاب شده و با توری 1 میلی متری الک شدند. برای تهیه عصاره‌های متانولی هر یک از گیاهان دارویی مورد مطالعه مقدار 50 گرم از نمونه‌های آسیاب شده هر گیاه با نیم لیتر حلال متانول به وسیله دستگاه سوکسله موجود در دانشگاه محقق اردبیلی در دانشکده علوم پایه به مدت یک هفته عصاره گیری شد زیرا ابتدا عصاره هگزانی سپس عصاره دی کلرومتانولی و آنگاه عصاره متانولی از هر نمونه گیاه گرفته شد. به منظور جداسازی حلال متانول از عصاره حاصل از دستگاه rotary (روتاری) در دمای45 درجه سانتیگراد استفاده شد. عصاره‌های حاصل به شیشه‌های پنی سلین تزریق شده و به آزمایشگاه تغدیه و فیزیولوژی دام در موسسه تحقیقات علوم دامی کشور منتقل شدند.
2-2- آزمون گازبرای انجام آزمون گاز از دستگاه نیمه اتوماتیک تولید گاز مدل WT-Binder 87532 ساخت کشور آلمان استفاده گردید.
2-2-1- آماده‌سازی نمونه‌‌ها برای آزمون گازابتدا باید مقدار 200 میلی گرم از نمونه‌ها در دمای مناسب خشک گردند زیرا دمای زیاد با اثر بر پروتئین تولید گاز را کاهش می‌دهد (راب و همکاران، 1983). سپس نمونه‌ها آسیاب شده و از الک 1میلی متری عبور می‌کنند (سالام، 2005). همبستگی خطی بالایی بین مقدار سوبسترای انکوباسیون شده و مقدار گاز تولید شده در 24 ساعت وجود دارد (راب و همکاران، 1983).
2-2-2- مایع شکمبه و بافرمایع شکمبه از دام فیستولاگذاری شده گرفته می‌شود و سپس در ظرف‌های ایزوله شده قرار داده می‌شود. مایع شکمبه به وسیله پارچه سه لایه صاف می‌شود و سپس با استفاده از گاز کربنیک محیط بی‌هوازی می‌شود.مایع شکمبه به محلول بافری که در حمام آب 39 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود با نسبت حجم 2:1 (محلول بافری 2 و مایع شکمبه 1) اضافه می‌شود (سالام و همکاران، 2007). محلول بافری باید مواد معدنی مورد نیاز برای میکروارگانیسم‌ها را داشته باشد (منک و استین، 1988) خوراک‌های فیبری، خوراک‌هایی که به آرامی تجزیه می‌شوند و کاهش اندازه‌ی ذرات خوراک سرعت تولید گاز را افزایش می‌دهند که ممکن است به دلیل افزایش سطح و در نتیجه دسترسی بهتر میکروب‌ها به خوراک باشد (رایمر و همکاران، 2005).
2-2-3- زمان‌های ثبت تولید گازگاز حاصل معمولا برای علوفه بعد از 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72، و 96 ساعت از انکوباسیون گزارش می‌شود (منک و همکاران، 1979). در تمام مدت انکوباسیون محتوی دیواره سلولی (NDF) و دیواره سلولی بدون همی سلولز (ADF) با تولید گاز همبستگی منفی دارد (سالام و همکاران، 2007).
2-2-4- مزایا و معایب آزمون گازگاز تولیدی در روش آزمون گاز از تبدیل کربوهیدرات‌ها به استات، پروپیونات و بوتیرات به وجود می‌آید و میزان این گاز می‌تواند معرفی از حجم تغییرات انجام شده در بخش کربوهیدرات‌ها باشد(دویله و همکاران، 2001). از آنجا که در سیستم تولید گاز نیاز به نگهداری حیوان فیستولا شده وجود ندارد می‌توان پاسخ حیوان را با حداقل هزینه در محیط آزمایشگاهی تخمین زد (سالام، 2005). نسبت حجم پروتئین خام به حجم گاز، دقت پیش‌گویی ماده آلی قابل هضم در حیوان زنده را بهبود می‌بخشد و از سوی دیگر در این روش تعداد زیادی از نمونه‌ها را می‌توان آنالیز کرد (ماکار، 2005). از آنجایی که گاز تولیدی حاصل از تخمیر در زمان‌های متفاوتی ثبت می‌شود، امکان تعیین میزان و سرعت مواد خوراکی هم وجود دارد (منصوری و همکاران، 1381).
معایب آزمون گاز این است که تخمیر خوراک به صورت خطی با تولید گاز مرتبط نمی‌باشد و از این رو تفسیر آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هایی که پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند در مقایسه با خوراک‌هایی که استات و پروپیونات بیشتری تولید می‌کنند، گاز کمتری تولید می‌نمایند که این کار باعث پیچیده‌تر شدن تفسیر نتایج آزمون گاز می‌شود (جانگ و همکاران، 1995).
2-2-5- آماده‌سازی عصاره‌ها برای آزمون گازبرای تهیه سطوح 100، 200 و 300 میلی‌ گرم بر لیتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره به وسیله‌ی ترازوی دیجیتال توزین شده و به طور جداگانه در نیم میلی لیتر حلال متانول حل گردید سپس حجم هر یک از محلول‌های حاصل با آب مقطر به 2 میلی لیتر رسانده شد.
2-2-6- آماده‌سازی نمونه خوراک و سرنگ‌هادر این روش، برای اندازه‌گیری تخمیر از سرنگ‌های شیشه‌ای مدرج مخصوص، با قطر داخلی 32 میلی متر و طول 200 میلی متر و با حجم 100 میلی لیتر، استفاده گردید. روز قبل از آزمایش حدود 200 میلی گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمایش شامل علوفه یونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سویا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسیم 45/0 و مکمل ویتامین45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسیاب و با توری یک میلی متری الک گردیده بود، به داخل هر سرنگ ریخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پیستون و همچنین جلوگیری از خروج گاز در حین تخمیر، اطراف پیستون با وازلین آغشته گردید. پس از قرار دادن پیستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتیگراد گرم شدند. برای هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.
2-2-7- تهیه مایع شکمبهمایع شکمبه از سه گاو نر تالشی فیستولادار استفاده شد. این گاوها از نژاد تالشی با وزن متوسط 400 تا 450 کیلوگرم بودند که در سطح نگهداری با جیره مورد نظر تغذیه شده بودند. شیرابه حدود نیم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طریق فیستول جمع‌آوری و با استفاده از دو لایه پارچه مخصوص صاف گردیده و در فلاسک محتوی گاز کربنیک ریخته شد و با قرار دادن ظرف محتوی مایع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتیگراد، سریعا به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-2-8- تهیه بزاق مصنوعیبرای تهیه مخلوط بزاق مصنوعی مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحیح شده منک و استینگس (1978)، روز قبل از آزمایش مقدار کافی از محلول مواد معدنی کم نیاز (محلولA) محلول مواد معدنی اصلی (محلول C)، محلول بافر مواد معدنی (محلول B) و محلول ریزازورین 1/0% و محلول احیاکننده به طور جداگانه تهیه گردید و برای مصارف بعدی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (جداول 2-1 الی 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدنی کم نیاز (A)ترکیب شیمیاییمقدار (گرم)
کلرید کلسیم (O2H2 .2CaCl)13/2
کلرید منگنز (O2H4 .2MnCl)10/0
کلرید کبالت (O2H6 .2CoCl)1/0
کلرید آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدنی اصلی (C)نوع موادمقدار (گرم)
فسفات هیذروژن سدیم (4HPO2Na)5/7
فسفات هیدروژن پتاسیم (4PO2KH)6/2
سولفات منیزیم (O2H7 .4MgSO)0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-3- محلول بافر مواد معدنی (B)نوع موادمقدار(گرم)
بیکربنات سدیم (3NaHCO)35/0
بیکربنات آمونیوم (3HCO (4NH))4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد.
جدول 2-4- محلول ریزازورین
100 میلی گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-5- محلول احیاء کنندهنوع موادمقدار مواد
آب مقطر 47/5 میلی لیتر
سود یک نرمال (N 1 NaOH,)2/0 میلی لیتر
سولفید سدیم (O2H7 . S2Na)285/0 میلی گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکیب بزاق مصنوعینوع محلولمقدار(میلی لیتر)
آب مقطر 474/0
محلول A0/12
محلول B237/0
محلول ریزازورین 1/22
محلول احیاء کننده 49/50
2-2-9- تهیه نمونه شاهدبا توجه به اینکه مایع شکمبه گرفته شده حاوی مقداری مواد مغذی است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداری گاز تولید می‌کند، برای تصحیح گاز تولیدی با منشا مایع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و بزاق مصنوعی ریخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گیری، میانگین گاز تولیدی در این سرنگ‌ها، از حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های محتوی نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز تولیدی ناشی از تخمیر خوراک مورد آزمایش به دست آید.
2-2-10- تزریق مخلوط بزاق مصنوعی و مایع شکمبه در سرنگ‌هامقدار 474 میلی لیتر آب مقطر، 12/0 میلی لیتر محلول A، 237 میلی لیتر محلول C و 237 میلی لیتر محلول B در بالن دو لیتری ریخته شد و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتریکی هم زده می‌شد، آن را به آرامی حرارت داده تا به دمای 39 درجه سانتیگراد رسید. در مرحله بعدی محلول احیاء کننده شامل 5/47 میلی لیتر آب مقطر، 2 میلی لیتر سود یک نرمال و 285 میلی گرم O2H7 . S2Na تهیه گردید و به مخلوط بالا اضافه شد. جریان گاز کربنیک تا وقتی که شرایط بی‌هوازی گردد و رنگ معرف ریزازورین از آبی به بی‌رنگ تبدیل شود، ادامه یافت. سپس مایع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعی به نسبت 1 (مایه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعی) مخلوط گردید و در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پیپت مخصوص مقدار 30 میلی لیتر از مخلوط مایع شکمبه و محیط کشت در داخل سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک و دارای دمای 39 درجه سانتیگراد ریخته شد، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-11- تزریق عصاره‌ها به سرنگ‌هابرای تهیه‌ی سطوح مختلف عصاره‌های مورد آزمایش ابتدا مقدار 01/0 میلی گرم از هر عصاره به کمک ترازوی دیجیتال توزین گردید سپس این مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 میلی لیتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سی سی رسیده شد و با استفاده از همزن لرزه‌ای به مدت چند دقیقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمینان حاصل شود به این ترتیب سطح 100 میلی گرم بر لیتر از عصاره مورد نظر تهیه شد. برای تهیه سطوح 200 و 300 میلی گرم بر لیتر از عصاره نیز به ترتیب مقادیر 02/0 و 03/0 میلی گرم از هر عصاره توزین شد و مراحل فوق متعاقبا برای آن‌ها طی شد. بعد از آماده‌سازی سه سطح مورد آزمایش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌های از پیش آماده شده‌ی گاز تست، مقدار 6/0 میلی لیتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌های ظریف انسولین کشیده شد و با سرعت و دقت زیاد به سرنگ‌های گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پیستون حباب‌های داخل سرنگ خارج و با گیره روی لوله پلاستیکی متصل به انتهای سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد در دستگاه با سرعت چرخش یک دور در دقیقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسیون و قرائت گاز تولیدیگاز تولیدی از نمونه‌ها در زمان‌های 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسیون قرائت و ثبت گردید (منک و همکاران، 1988). هنگامی که حجم گاز و محتویات هر سرنگ به حدود 60 میلی لیتر می‌رسید گیره پلاستیکی انتهای سرنگ باز می‌شد و پیستون به جلو رانده می‌شد تا گاز خارج شده و پیستون سرنگ مجددا در موقعیت 30 میلی لیتر قرار داده شود.
2-2-13- تعیین حجم گاز تولیدی حجم گاز تولیدی بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌های شاهد، با استفاده از روابط زیر تصحیح گردید:
رابطه (1-2)(ect - 1)b + a = P
در این رابطه:
P =تولید گاز در زمان ta =تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر سریع (میلی لیتر)
b = تولید گاز از بخش تجزیه‌پذیر کند (میلی لیتر)
c = مقدار ثابت تولید گاز بخش b (میلی لیتر)
a+b = پتانسیل تولید گاز (میلی لیتر)
t = زمان انکوباسیون
رابطه (2-2)V=200(Vt-Vb)W که در این رابطه:
V = حجم گاز تصحیح شده بر حسب میلی لیتر به ازای 200 میلی گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های حاوی نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
Vb = حجم گاز تولیدی در سرنگ‌های فاقد نمونه خوراک بر حسب میلی لیتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب میلی گرم (منصوری و همکاران، 1381).
2-3- تهیه و آماده‌سازی مایع شکمبه جهت تهیه محیط کشتبا توجه به این که در مایع شکمبه مواد مغذی لازم جهت رشد کلیه میکروارگانیسم‌های شکمبه وجود دارد، در تهیه محیط کشت، جهت کشت باکتری‌های شکمبه از مایع شکمبه نیز به عنوان جزیی از ترکیب محیط کشت استفاده می‌شود. به همین منظور برای تخمین جمعیت باکتری‌ها، ابتدا از سه راس گاو فیستول‌گذاری شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذایی صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مایع شکمبه اخذ گردیده و به نسبت مساوی با هم مخلوط گردید. با استفاده از 3 لایه پارچه کرباس، مایع شکمبه صاف شد. سپس برای تهیه مایع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوریتی (1976)، مایع صاف شده شکمبه به مدت ده دقیقه در 1000× g سانتریفوژ گردید. قسمت مایع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکیب محیط کشت، در ظروف در بسته و در فریزر (18- درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-1-محیط کشتیک محیط کشت مناسب، باید شرایط محیطی لازم و مواد مغذی مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم‌ها را تامین کند (منصوری و همکاران، 1381). در محیط کشت‌هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه می‌شوند، چون جذب صورت نمی‌گیرد، برای اجتناب از اسیدی شدن بیش از حد و بالا رفتن بیش از حد فشار اسمزی محیط باید سوبسترا و همچنین میکروارگانیسم‌ها به اندازه کافی رقیق شده باشند (منصوری و همکاران، 1381). چون میزان سوبسترای قابل دسترس تعیین‌کننده فرآورده‌های تولیدی می‌باشند، غلظت سوبسترا نباید از 1% حجم محیط کشت بیشتر باشد و حتی می‌تواند کمتر نیز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهیه محیط کشت قسمت عمده اکسیژن با وارد کردن گاز کربنیک از محیط خارج می‌شود. مقادیر جزیی اکسیژن باقیمانده با کربنات سدیم یا سیستئین خارج می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). معرف ریزازورین برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن و آلودگی باکتریایی و همچنین برای تست فعالیت ضد میکروبی به کار می‌رود (پالومین و همکاران، 2002). معرف بی‌هوازی ریزازورین، شاخص مفیدی برای تشخیص مقادیر جزیی اکسیژن است. این معرف در حالت احیا شده و در عدم حضور اکسیژن بی‌رنگ بوده و در حضور اکسیژن به رنگ آبی مایل به صورتی در می‌آید (منصوری و همکاران، 1381). مایع شکمبه صاف شده و گندزدایی شده، یک منبع برای تهیه محیط کشت در مطالعاتی است که برای جدا کردن و مشخص کردن میکروارگانیسم‌ها به کار برده می‌شود و همچنین برای تامین مواد مغذی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها به محیط کشت اضافه می‌شود (منصوری و همکاران، 1381). مقدار کافی بافر و مواد معدنی مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها با اضافه کردن محلول‌های نمکی تامین می‌شود از سویی اسیدهای چرب با زنجیر منشعب، ویتامین‌ها و سایر عوامل دیگر را می‌توان به طور مستقیم به محیط کشت اضافه کرد و یا آن‌ها را از طریق اضافه کردن مایع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محیط کشت را تشکیل می‌دهد) تامین نمود (منصوری و همکاران، 1381).

2-3-2- تهیه محلول 0/1 درصد همینبرای تامین آهن مورد نیاز میکروارگانیسم‌ها از محلول 1/0 درصد همین در ترکیب محیط کشت استفاده شد. با توجه به این که همین در شرایط اسیدی و خنثی در آب حل نمی‌شود برای تهیه محلول 1/0%، ابتدا 100 میلی گرم همین را در 10 میلی لیتر آب مقطر ریخته و با ریختن چند قطره سود و قلیایی کردن محیط، همین در آب حل گردید و برای استفاده در ترکیب محیط کشت در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-3- تهیه مخلوط اسیدهای چرب فرارنسبت‌های مشخص از اسیدهای استیک، بوتیریک، ایزوبوتیریک، n- والریک، ایزووالریک وآلفا-متیل-بوتیریک اسید (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گردید و در ظرف دربسته در یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری گردید.
2-3-4- تهیه محلول مواد معدنی شماره Iبرای تهیه این محلول، مقدار 3 گرم دی پتاسیم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در یخچال نگهداری گردید.
2-3-5- محلول مواد معدنی شماره IIبرای تهیه این محلول، مقادیر مشخص از مونوپتاسیم فسفات (4PO2KH)، کلرور سدیوم، سولفات منیزیوم، کلرور کلسیم و سولفات آمونیوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دمای یخچال (4 درجه سانتیگراد) نگهداری شد.
2-3-6- تهیه محیط کشتمحیط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتری‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالی (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبیسپو و دهوریتی (1992) تهیه گردید. برای تهیه محیط کشت بی‌هوازی ابتدا محلول‌های مواد معدنی شماره I و شماره II به طور مجزا تهیه گردید (جدول 9-2) سپس نسبت‌های مشخص شده از این محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 لیتری ریخته و در حالی که جریان مستمر گاز کربنیک به داخل آن برقرار گردید و توسط همزن الکتریکی به طور مستمر هم زده می‌شد، محلول 1/0 درصد همین و قندهای محلول گلوکز، سلوبیوز، مالتوز و زایلوز اضافه گردید. از محلول 1/0 درصد ریزازورین به عنوان معرف برای برقراری شرایط بی‌هوازی استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تریپتیکاز و مخلوط اسیدهای چرب فرار، مایع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسیون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گردید و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جریان گاز کربنیک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سیستئین هیدروکلراید در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سدیم نیز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ریزازورین به محیط کشت، رنگ مخلوط بنفش می‌شود و با ادامه تزریق گاز کربنیک به تدریج محیط کشت به رنگ ارغوانی، صورتی کمرنگ درآمده و سرانجام بی‌رنگ می‌شود.
2-3-7- توزیع محیط کشتپس از آن که محلول بی‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روی بالن محتوی مخلوط محیط کشت قرار داده شد، در حالی که جریان گاز کربنیک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداری گاز کربنیک شیشه‌های پنی سیلین (به حجم 20 میلی لیتر)، دمیده شد تا هوای داخل آن خارج گردد و در حالی که دمیدن گاز کربنیک به داخل شیشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 میلی لیتر از محیط کشت اشباع شده از گاز کربنیک را به داخل لوله ریخته و سریعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محیط کشت درون شیشه‌ها ریخته شد، به منظور از بین بردن کلیه میکروارگانیسم‌های موجود در آن، بلافاصله شیشه‌های حاوی محیط کشت به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو و با دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) گردیدند. قبل از تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین pH محیط کشت اندازه‌گیری شد. با توجه به این که دمیدن گاز کربنیک موجب کاهش pHمی‌شود، با اضافه کردن مقدار کمی سود یک نرمال، pH محیط کشت به 6/6 رسانده شد و در حین تزریق به داخل شیشه‌ها نیز مرتباpH محیط کشت کنترل گردیده و در صورت لزوم برای حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمی سود یک نرمال، به محیظ کشت اضافه گردید.
2-3-8- تهیه محلول رقیق کننده بی‌هوازیبرای تهیه رقیق‌کننده بی‌هوازی (جدول 9-2) محلول‌های مواد معدنی I و II با غلظت‌های مشابه در محیط کشت به کار رفته و همچنین برای نشان دادن برقراری شرایط بی‌هوازی از محلول 1/0% ریزازورین استفاده گردید. پس از مخلوط نمودن محلول‌های مواد معدنی I و II و اضافه کردن ریزازورین و آب مقطر، جریان گاز کربنیک (از طریق شیلنگ نازکی که تا انتهای بالن امتداد یافته بود)، به داخل محلول برقرار گردید و برای اشباع کردن محلول از دی اکسید کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنیک در داخل محلول تزریق گردید. سپس سیستئین هیدروکلراید و کربنات سدیم اضافه شد و تا بی‌رنگ شدن محلول، جریان گاز کربنیک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطیسی ادامه یافت. پس از بی‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزریق محیط کشت به داخل شیشه‌های پنی سیلین به حجم 20 میلی لیتر، مقدار 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی اشباع شده از گاز کربنیک به داخل هرشیشه ریخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدایی (استریل) شدند.
2-3-9- تهیه مایع شکمبه تازهبرای هر زمان نمونه‌برداری در هر دام، ابتدا مایع شکمبه تازه از طریق فیستول از هر دام جمع‌آوری و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مایع صاف شده شکمبه در بطری پلاستیکی مخصوص که در آن قبلا گاز کربنیک دمیده شده بود، ریخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطری، هوای قسمت فوقانی آن تخلیه و درب آن محکم بسته شد و بطری در فلاسک محتوی آب 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد و برای کشت دادن بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
2-3-10- تهیه رقت‌های مختلف از مایع شکمبهتعداد 495 شیشه پنی سیلین فراهم شد که از این تعداد 270 شیشه پنی سیلین برای محیط کشت و 225 شیشه برای محلول رقیق کننده بی‌هوازی در نظر گرفته شد.
قبل از تهیه مایع شکمبه تازه، شیشه‌های محتوی محلول رقیق کننده بی‌هوازی، در انکوباتور 39 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مایع شکمبه به داخل محلول رقیق‌کننده تغییر ناگهانی دما، به جمعیت میکروبی شوک وارد ننماید. بعد از انتقال مایع صاف شده تازه شکمبه به آزمایشگاه، ابتدا مقدار 20 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه را با 180 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده‌ی بی‌هوازی مخلوط نموده(ابتدا مقدار 1 میلی لیتر از مایع صاف شده شکمبه به یک شیشه حاوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده بی‌هوازی تزریق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌ای مدت سه دقیقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهیز از ورود احتمالی میکروارگانیسم‌های موجود در محیط به داخل محلول رقیق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولین گندزدائی شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار یک میلی لیتر از مایع شکمبه رقیق شده1-10 را برداشته و به داخل شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق‌کننده استریل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌ای کاملا مخلوط گردید بدین ترتیب مخلوط 100 برابر رقیق‌شده مایع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا یک میلی لیتر از رقت 2-10 به داخل یک شیشه محتوی 9 میلی لیتر محلول رقیق کننده ریخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همین ترتیب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهیه گردید.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌های مورد استفاده در ترکیب محیط کشت
جدول 2-7محلول مواد معدنی شماره Iمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3
جدول 2-8محلول مواد معدنی شماره IIمقدار)گرم در لیتر(
4HPO2K3/0
4SO2(4NH)6/0
NaCl6/0
4MgSO0/6
2CaCl0/6
جدول 2-9مخلوط اسیدهای چرب فرارمقدار (میلی لیتر)
Acetic Acid17
Prorionic Acid6
Butyrie Acid4
Iso Butyrie Acid1
N-Valeric Acid1
Iso Valeric Acid1
Butyric Acid - 3CH - 1
محلول %0/1 ریزازورین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
محلول %0/1 همین
100 میلی گرم در صد میلی لیتر آب مقطر
جدول 2-10- اجزای محیط کشت جهت رشد باکتری‌های شکمبه
درصد در محیط کشت اجزای محیط کشت
15 Mineral Solution I (V/V)
15 Mineral Solution II (V/V)
0/1 (V/V) %1/0 Resazurin
40 Rumen Fluide (V/V)

–295

فصل دوم: کلیات
2-1مقدمه…………………....................................................... .........................7
2-2تئوری احتراق..................................................................................................7
2-2-1سوزاندن (احتراق مستقیم)....... ........................................................................7
2-2-2فساد باکتریایی...............................................................................................7
2-2-3تخمیر................................................................................................ 7….….
2-3روشهای هیدرولیز پسماندهای سلولزی..................................................................8..2-4مواد اولیه مورد استفاده در تولید بیواتانول.........................................................8…...
2-4-1مواد اولیه قندی..............................................................................................8
2-4-2مواد اولیه نشاسته…………….…...................................................................9
2-4-3مواداولیه سلولزی (لیگنوسلولز)………..……....................................................9
2-4-3-1سلوز…...................................................................................................14
2-4-3-2 همی سلولز…………….……………...........................15……………..…
2-4-3-3 لگنین15……………..……………………………………………………
2-5 بیواتانول سوخت سبز……………………………...........................17….……….
2-6 تولید بیواتانول بوسیله تخمیر کربوهیدراتها19….………….………………………….
2-7هیدرولیز……………….………….................................................................20
2-7-1هیدرولیز اسیدی…………………………………..........................................21
2-7-2هیدرولیز اسید رقیق22…..………………………………….…………………..
2-7-2-1 محصولات جانبی هیدرولیز اسید رقیق…………………………......................25
2-7-2-1-1اسید های آلی………………………..……….........................................26
2-7-2-1-2ترکیبات فنولیک27…..…………………………………………………….
2-7-2-1-3 ترکیبات فورال........................................................................................ 27
2-7-3هیدرولیز اسید غلیظ……….............................................................................28
2-7-4 هیدرولیز آنزیمی…….…….……………….……………………………….30
2-8 پیش فرآوری فیزیکی.…….……...…………………………………………….31
2-8-1انفجاربخار....................................................................................................31
2-8-2 انفجار آمونیاک و دی اکسید کربن.......................................................................32
2-8-3 پیش فرآوری شیمیایی......................................................................................32
2-8-4 پیش عملیات بیولوژیکی...................................................................................34
2-9تخمیر………………..………………………………………………...….....34
2-10 بازیابی جامدات و محصول................................................................................35
فصل سوم:روش آزمایش
3-1 مواد و سایل مورد استفاده 37...................................................................................
2-3آزمایشات 37........................................................................................................
3-3 طراحی روش آزمایش 37........................................................................................
1-2-3اثر غلظت 40.....................................................................................................
2-2-3اثر دما 40.........................................................................................................
3-2-3اثر زمان 41…..................................................................................................
3-4 نتایج تست زایلوز (XYL)..................................................................................41
1-3-3اثر غلظت 41………...………………….........................................................
2-3-3اثر دما 42........................................................................................................
3-3-3اثر زمان 42......................................................................................................
3-4 نتایج تست فورفورال(FER)................................................................................43
1-4-3غلظت 43.……...…………………….............................................................
-2-4-3دما 43............................................................................................................
-3-4-3زمان 44.........................................................................................................
3-5 نتایج تست گلوکز(GLU)....................................................................................44
1-5-3غلظت 44.........................................................................................................
2-5-3دما 45.............................................................................................................
3-5-3زمان..........................................................................................................45.فصل چهارم: نمودار و جداول
4-1مدل سازی فرآیند:..............................................................................................48
4-2بررسی انطباق نتایج حاصل از گلوکز استحصال شده در مدلهای پیشنهادی........................48
4-2-1 مدل اول......................................................................................................54
4-2-1-1بررسی صحت مدل......................................................................................54
فصل پنجم: نتیجه گیری
نتیجه گیری56……………………………………………………………………….
پیشنهادها...............................................................................................................57
مراجع....................................................................................................................58
فهرست جداول
جدول 1-1:مقایسه سه ماده قابل اشتعال اتانول، بنزین، گازوییل..................................................3
جدول 1-2برخی ویژگیهای سوختهای الکلی...........................................................................4
جدول 2-1فراوانی نسبی قندهای موجود در اجزای کربو هیدراتی چوب(%وزنی)(گلدشتاین1981)....13
جدول2-2 ترکیب گونه های مختلف زیست توده های سلولزی(%وزن خشک)(گلدشتاین،1981).......13
جدول2-3 ترکیب بازدهی مواد متفاوت برای تولید بیواتانول(پواری، 2008)................................13
جدول 24 مقایسه روشهای هیدرولیز اسیدی........................................................................22
جدول2-5 حدود درجه حرارت های تحقیق شده دوره اقامت و غلظت اسید....................................23
جدول2-6 بازده تبدیلی هیدرولیزاسیدی غلیظ(بردارسایرین،1990)............................................29
جدول2-7 میزان بازده تولیدبیواتانول از ساقه ذرت(بالات2008)..............................................29
جدول 3-1 نتایج بدست امده حاصل از انالیز بوسیله دستگاه hplc به قرار ریر است.......................32
جدول4-1 ضرایب معادله دو جذوری حاصل از تطابق داده های آزمایشی با مدل..........................49
فهرست نمودارها
نمودار 3-2-1 اثر غلظت بر روی اسید استیک.............................................................................................40
نمودار 3-2-2اثر دما بر روی اسید استیک..................................................................................................40
نمودار 3-2-3اثر زمان بر روی اسید استیک................................................................................................41
نمودار 3-3-1 اثر غلظت بر روی زایلوز....................................................................................................41
نمودار 3-3- 2 اثر ذما بر روی زایلوز........................................................................................................42
نمودار 3-3-3 اثر زمان بر روی زایلوز.......................................................................................................42
نمودار 3-4-1اثر غلطت بر روی فور فورال..................................................................................................43
نمودار 3-4-2اثر دما بر روی فورفورال........................................................................................................43
نمودار 3-4-3اثر زمان بر روی فورفورال.....................................................................................................44
نمودار 3-5- 1اثر غلظت بر روی گلوکز........................................................................................................44
نمودار 3-5- 2اثر دما بر روی گلوکز............................................................................................................45
نمودار 3-5-3 اثر زمان بر روی گلوکز..........................................................................................................45
نمودار 4-1 پاسخ سطحی برای غلظت گلوکز در هیدرولیز بصورت تابعی از دما وغلظت اسید بر طبق مدل…………… 50
نمودار 4-2پاسخ سطحی برای غلظت گلوکز در هیدرولیز بصورت تابعی از زمان وغلظت اسید بر طبق مدل....................51
نمودار 4-3 پاسخ سطحی برای غلظت زایلوز در هیدرولیز بصورت تابعی از دما و غلظت اسید بر طبق مدل....................51
نمودار 4-4 پاسخ سطحی برای غلظت زایلوز در هیدرولیز بصورت تابعی از زمان وغلظت اسید بر طبق مدل...................52
نمودار 4- 5 پاسخ سطحی برای غلظت فورفورال در هیدرولیز بصورت تابعی از زمان وغلظت اسید بر طبق مدل..............52
نمودار 4- 6 پاسخ سطحی برای غلظت فورفورال در هیدرولیز بصورت تابعی از دما وغلظت اسید بر طبق مدل.................53
نمودار 4 – 7پاسخ سطحی برای غلظت اسیداستیک در هیدرولیز بصورت تابعی از زمان وغلظت اسید بر طبق مدل....53……
نمودار 4-8 پاسخ سطحی برای غلظت اسیداستیک در هیدرولیز بصورت تابعی ازدما وغلظت اسید بر طبق مدل.................54
فهرست اشکال
شکل 2-1چرخه تولید بیو اتانول از مواد لیگنوسلولزی....................................................12..شکل 2-2 ساختار سه نوع لگنین سخت چوب، لگنین نرم چوب و لگنین علفی.......................16..شکل2-3فرآیند هیدرولیزاسید رقیق(بوردروسایرین،1995)23………………………………
شکل2-4محصولات جانبی در فرآیند هیدرولیز رقیق........................................................26
شکل2-5 نمایش عملیاتی راکتورانفجاری بخاری در یک مدل بسته (زیمباردی،2000).............32
چکیده
در این مطالعه مدلسازی هیدرولیز اسید رقیق پوست سبز گردو بعنوان یک نمونه مواد لیگنوسلولزی به منظور تولید شکر قابل تخمیر در فرایند بیواتانول مطالعه شده است. چهار پارامتر دما، زمان، غلظت اسید و جزءجامد در سه سطح مختلف بعنوان متغیر ومیزان تولید قند های شش کربنه نظیر گلوکز و پنج کربنه نظیر زایلان بعنوان محصولات اصلی و مواد بازدارنده نظیر فورفورال و اسیداستیک بعنوان محصولات فرعی و ناخواسته در نظر گرفته شده اند. واکنش در یک حمام بخار مجهز به کنترل دما و همزن انجام شده است. محصولات هیدرولیز پس از خنثی سازی و فیلتراسون و رقیق سازی توسط دستگاه کروماتورگرافی مایع اندازه گیری شده اند. جهت بررسی نقش چهار متغیر یاد شده در میزان محصولات اصلی و فرعی مطالعه شده است. سپس با در نظر گرفتن یک معادله دو مجذوری و استفاده از مدل سطحی برای بهینه سازی فرآیند هیدرولیز اسید رقیق مدل شده اند. نتایج نشان می دهد که پوست سبز گردو می تواند یک منبع لیگنوسولوزی برای تولید شکر قابل تخمیر در فرایند بیواتانول است. غلظت این ترکیبات با دما افزایش می یابد. همچنین افزایش تولید گلوکز در طی زمان مشخص می باشد. زمانی که محتوی جزءجامد افزایش می یابد، غلظت گلوکز و محصولات دیگر نیز افزایش می یابد. مدل سازی و شرایط هیدرولیز قابل بهینه سازی بر اساس دما، زمان، غلظت اسید و غلظت جامد قابل بهینه سازی است.
کلمات کلیدی :
مدل سطحی – بهینه سازی – هیدرولیز – اسید رقیق – پوست سبز گردو - گلوکز
فصل اول
مقدمه

1-1بیواتانول چیست؟
اتانول با فرمول بسته C2H5OH از گروه آلکالهای آلی است که در حالت معمولی مایعی بی رنگ با بویی ویژه است. قابلیت حل شدن اتانول در آب زیاد است بطوریکه به هر نسبتی با آب مخلوط می شود. نقطه جوش آن 3/78 و نقطه انجماد آن_115 است . دانسیته نسبی آن در 20 درجه سانتیگراد 78/0 است. الکلها سمی هستند و اتانول از لحاظ پزشکی، از الکلهای دیگر سمیت کمتری دارد. در شرایط عادی، اتانول یک مایع فرار، قابل اشتعال، صاف و بی رنگ بوده که هم در آب و هم در حلال های غیر قطبی محلول می باشد.
بیواتانول که سوختی با طبیعت کربنی است، با فرمول CH3-CH2-OH(اتیل الکل)می توانند تا بیش از 70% از گازهای گلخانه ای آزاد شده را کاهش دهد. این سوخت دارای عدد اکتان بالاتر از (108)محدوده اشتعال پذیری گسترده تر گرمای تبخیر بالاتری نسبت به بنزین دارد. به علت وجود اکسیژن بالا باعث کاهش انتشار گاز در موتور های احتراق میگردد.
از معایب بیواتانول دانسیته انرژی پایین تری نسبت به بنزین دارد(بیواتانول 66درصد انرژی بنزین را دارد)، خورندگی، تابندگی مشعل کمتر، فشار بخار پائین تر، (استارت سرد را مشکل می سازد)، اختلاط پذیری با آب و سمیت برای اکوسیستمها می باشد. برخی ویژگیها در جدول 1-1 نشان داده شده است.
جدول 1-1:مقایسه سه ماده قابل اشتعال اتانول، بنزین، گازوییل
اتانول بنزین گازوئیل
دانسیته انرژی (Mj/Kg) 6/26 8/43 8/42
دانسیته انرژی (Mj/l) 0/21 0/32 4/36
دمای شعله(C®) 1930 1977 2054
عدد اکتان 00/3 92/2 ناچیز
ناگفته نماند اعداد اکتان بالاتر در موتورهای احتراق داخل ترجیح داده می شود زیرا باعث کاهش ضربات سیلندر میگردد.
بیواتانول دارای 35% اکسیژن است. هرچه سوخت شامل اکسیژن بیشتری باشد احتراق کامل تر است و می توانند تولید NOX و ذرات معلق را که در طی فرآیند احتراق تولید می شوند به میزان قابل توجهی کاهش دهد یکی دیگر از مزایای استفاده از اتانول این است که می توانند از منابع تجدید پذیر حیات، بر پایه مواد سلولزی، که به میزان قابل توجهی در طبیعت یافت می شود، تولید شود. می توان از مواد ارزان قیمت و در دسترس استفاده نمود. مخلوطهای سوخت اتانول، به طور موفق در همه انواع وسایل و موتورهایی به کار برده می شوند که نیاز به بنزین دارند. مشهورترین مخلوط برای وسایل سبک کار بنام E85 شناخته شده است، که شامل 85% بیواتانول و 15% بنزین است.
مخلوطهایی که غلظتهایی بالاتر بیواتانول در بنزین دارند نیز مورد استفاده قرار می گیرند. مثلاً بعضی موتورها میتوانند روی مخلوطهای بالاتر از 85% بیوتانول E85 کار کنند. برخی کشورها برنامه سوخت زیستی شامل هر دو فرم برنامه مخلوط بیواتانول و بنزین را امتحان کرده اند.
همان طور که گفته شد، احتراق کامل یک سوخت به وجود میزان اکسیژن استوکیومتری نیاز دارد. محتوی اکسیژن یک سوخت کارایی احتراقش را افزایش می دهد. به همین دلیل کارایی احتراق و عدد اکتان بیواتانول بالاتر از بنزین است. و اعداد اکتان بالاتر در موتورهای احتراق داخلی ترجیح داده می شوند زیرا باعث کاهش ضربات سیلندر میگردد.
جدول 1-2برخی ویژگیهای سوختهای الکلی
ویژگی سوخت اتانول متانول ایزواکتان
عدد ستان 8 5 -
عدد اکتان 107 112 100
دمای اشتعال اتوماتیک(k) 606 737 530
گرمای ویژه تبخیرMj/kg 0.91 1.18 0.26
انرژی گرمادهی Mj/kg 26.7 19.9 44.4
1-2ضرورت استفاده از اتانول :
بیواتانول یک سوخت مایع مهم تجدید شدنی در وسایل نقلیه می باشد، که برخلاف بنزین یک سوخت آمیخته با اکسیژن، که شامل 35% اکسیژن است. بطوری که می توانند ذرات ریز و نشر NOX را از احتراق کاهش دهد. زمانی که عمل سوختن صورت می گیرد. اتانول منتج شده از تخمیر، هیچ افزایش خالصی را در میزان دی اکسید کربن جو بوجود نمیآورد.
اگر بیواتانول حاصل از توده زیستی جهت به حرکت در آوردن وسایل نقلیه با آلودگی کم استفاده شود نشر خالص CO2 کمتر از 7% از مقداری است که ماشین یکسان از بنزینی دارای فرمول جدید استفاده می کند. از طرف دیگر با ملاحظه افزایش مستمر هزینه های مواد نفتی و وا بستگی به منابع سوخت فسیلی توجه قابل ملاحظه ای به منابع انرژی دیگر معطوف شده است. تولید اتانول یا اتیل الکل C2H5OH از توده زیستی روشی جهت کاهش مصرف مواد نفتی می باشد. تولید داخل و استفاده از اتانول به عنوان سوخت می توانند باعث کاهش وابستگی به بنزین، کاهش کمبودهای تجاری ایجاد شغل در مناطق روستایی کاهش آلودگی همراه کاهش تغییرات جوی جهانی از دی اکسید کربن شود. و ادامه استفاده از سوختهای فسیلی برای بر آوردن تقاضای جهانی انرژی منجر به افزایش غلظتهای CO2 در جو و گرم شدن جهان شده است.
بدین سبب تلاشها برا ی توسعه روشهایی برای کاهش اثر انتشار گازهای گلخانه ای افزایش یافته است. غلظت CO2 اتمسفر از مقدار اولیه v ppm280 به حدود ppmv370 درسال 2000 رسید و همچنان رو به افزایش است. و دمای جو زمین را افزایش می دهد. کاهش استفاده از سوختهای فسیلی بطور قابل توجهی میزان CO2 تولید شده را کاهش داده و باعث کاهش سطوح آلودگیها می شود. بسیاری از برنامه های تحقیقاتی اخیرأ روی بهبود مفاهیم چون منابع تجدید پذیر توسعه پایدار انرژی های زیستی فرایند های سازگار با محیط زیست و غیره متمرکز نموده اند و به طور کلی فرایند استفاده از سوختهای زیستی به شرح زیر است.
سوختهای زیستی به راحتی از منایع معمول بیومس بدست می آید.
در فرآیند سوختن CO3 وجود دارد.
توانایی سازگاری قابل توجهی با محیط زیست دارد.
این سوختها توسط میکروبها تجزیه پذیرند و در چرخه طبیعی شرکت می کنند.

فصل دوم
کلیات

2-1مقدمه:
سلولز فراوا نترین پلی ساکارید در طبیعت است که حدود یک سوم وزن تمام گیاهان را تشکیل می دهد. سلولز پلیمری از گلوکز بتا است که توسط اتصالات گلیکوزیدی و به صورت رشته های موازی بهم متصلند. تئوری احتراق وهیدرولیز در فرآیند تولید بیواتانول از پسماندهای سلولزی مهم هستند.
مزایای هیدرولیز آنزیمی سلولز به قند شامل حل مشکلات ضایعات مواد سلولزی، تبدیل گلوکز به اتانول ازطریق تخمیر که بعنوان سوخت مورد استفاده قرار می گیرد و تولید اتیلن از اتانول می باشد. این مواد در صنایع شیمیایی و خود گلوکز بستگی به درجه خلوص آن در صنایع دارویی، غذایی کاربرد دارد. مناسب ترین روش تولید گلوکز روش ترکیبی (هیبرید) است که مراحل پیش فرایند آن که قبل از هیدرولیز آنزیمی انجام می شود برای حذف ناخالصی های غیر سلولزی (لیگنین و همی سلولز) می باشد.
برای اینکه بیو مس جامد به انرژی گرمایی تبدیل شود بایستی عملیات احتراق را طی نماید اگر چه تکنولوژی احتراق بسیار مختلفی در دسترس است. سه مرحله احتراق داریم که اشاره می شود.
2-2تئوری احتراق:
2-2-1سوزاندن (احتراق مستقیم)
2-2-2فساد باکتریایی: باکتری از حیوانات و گیاهان مرده تغذیه می کند. زمانیکه گیاهان و حیوانات فاسد میگردند. آنها یک گاز بیرنگ و بی بو به نام متان تولید می کنند. گاز متان از انرژی غنی است و از اجزا تشکیل دهنده گاز طبیعی است که میتوانیم برای تولید گرما و یا برق بسوزانیم.
2-2-3تخمیر: ما میتوانیم خمیر ترش (یک باکتری) برای تولید یک الکل به نام اتانول به بیومس اضافه کنیم. برای قرنها مردم غلات را برای نوشیدنی های الکلی مانند شراب و آبجو تخمیر می کردند. اتانول گاهی اوقات برای تولید سوخت موتور استفاده می شود.
بیواتانول ممکن است بوسیله تخمیر مستقیم از قندها و یا ازکربوهیدرات های دیگر که می توانند به قند تبدیل شوند همچون نشاسته و سلولز تولید شود. قندها از منابع مختلف بدست می آیند. مواد خام مورد استفاده به سه دسته از مواد خام کشاورزی تقسیم می شوند.
قندهای ساده از نیشکر، چقندر قند و میوه ها
نشاسته از حبوبات، سیب زمینی و محصولات ریشه دار
سلولز از چوب، پسماندهای کشاورزی، فاضلاب های جامد شهری، هالوفیتها(شور پسند)، جلبکها، کاغذ باطله و پسماندهای محصولی
2-3روشهای هیدرولیز پسماندهای سلولزی:
به طور کلی سه روش برای هیدرولیز سلولز و تبدیل آن به بیواتانول در صنعت یافت می شود که عبارتند از: هیدرولیز اسیدی، هیدرولیز آنزیمی و فرآیند های ترموشیمیایی که در فصل سه توضیح کامل داده خواهد شد.
2-4مواد اولیه مورد استفاده در تولید بیواتانول:
2-4-1مواد اولیه قندی: تخمیر در برگیرنده میکروارگانیسم هایی است که از قندهای قابل تخمیر برای غذا در فرایند تولید اتانول ودیگر محصولات جانبی استفاده می کند. این میکرو ارگانیسم ها می توانند نوعأ از قندهای شش کربنی استفاده نمایند که رایج ترین آنها گلوکز است. بنابراین مواد زیست توده شامل سطوح بالایی از گلوکز ساده ترین مواد جهت تبدیل به اتانول می باشد. بیو مس های قندی مستقیمأ قابل تخمیر و تبدیل به اتانول می باشند و نیاز به پیش فرآوری خاصی ندارند. معمولاً در دسترس و ارزان ترین این پسماندها ملاس چغندر قند است که محصول جانبی کارخانجات تولید قند و شکر است و40 تا50 درصد قند قابل تخمیر دارد. ماده بعدی نیشکر می باشد. به هر حال، از آنجایی که مواد قندی در زنجیره غذایی انسان موجود است، این مواد جهت استفاده در تولید اتانول بسیار گران قیمت است.
نیشکر در کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری کشت شده در حالیکه چغندر قند فقط عمدتاً در کشورهای با آب و هوای معتدل کشت می شود. برزیل بزرگترین تولید کننده نیشکر با حدود 27 درصد تولید جهانی و عملکرد 18میلیون گرم ماده خشک در هکتار می باشد در حالیکه بالاترین عملکرد در پرو رخ می دهد،که بیشتر از 32میلیون گرم ماده خشک نیشکر در هکتار تولید می کند. محصولات زراعی چقندر در بیشترکشورها کشت شده و نسبت به گندم بازدهی بیواتانول در هکتار بیشتری دارد. دیگر مزایای چقندر قند دوره کم تولید محصول، بازدهی بالاتر، مقاومت بالا به محدوده وسیعی از تغییرات آب و هوایی، نیاز آب کمتر و نیازهای کودی کمتر می باشد. در مقایسه با چقندر قند 35-40 درصد کمتر به آب و کود نیاز دارد. سورگوم شیرین یکی از امید بخش ترین مواد برای تولید بیواتانول در کشورهای در حال توسعه می باشد. از نظر تئوری، 100گرم کلوکز، در حدود 4/51 گرم اتانول و 8/48 گرم دی اکسید کربن تولید می کند. به هر حال، در عمل این میکروارگانیسم ها از برخی از گلوکزها برای رشد بهره جسته و بازده واقعی آنها کمتر از 100% می باشد.
2-4-2مواد اولیه نشاسته ای
دیگر ماده بالقوه در تولید اتانول نشاسته می باشد(یوسین ودیگران2007). مولکولهای نشاسته متشکل از زنجیره های طولانی مولکولهای گلوکز می باشد. بنابراین مواد نشاسته ای می توانند پس از شکستن مولکول های نشاسته به مولکولهای ساده گلوکز، تخمیر شوند. نمونه هایی از مواد نشاسته ای که در سراسر جهان برای تولید اتانول استفاده می شوند. شامل گیاهان گندمی، سیب زمینی، سیب زمینی شیرین و نشاسته کاساو می باشد. هر 3/25 کیلوگرم ذرت می توانند بین4/9-9/10 لیتر اتانول خالص بسته به تکنولوژیی است که مورد استفاده قرار می گیرد، تولید نماید. مواد نشاسته ای نیازمند واکنش نشاسته ای با آب هستند تا بتوانند نشاسته را به قند قابل تخمیر بشکنند(قند سازی )عملأ هیدرولیز به وسیله ترکیب کردن نشاسته با آب انجام می شود تا دوغابی شکل گیرد(فرایند ژلاتینی کردن ) و پس از تکان دادن و گرم کردن آن بتوان دیواره های سلولی را قطع کرد. آنزیمهای خاصی که بتوانند ترکیبهای شیمیایی را بشکنند در مقاطع زمانی مختلفی در طول مدت سیکل گرمایشی بدان افزوده می شوند. این نوع زیست توده پر استفاده ترین ماده برای تولید بیواتانول در امریکای جنوبی و اروپا است. گندم و ذرت عمدتاً با چنین اهدافی بکار گرفته می شوند. آمریکا دارای صنعت بزرگ بیواتانول بر پایه ذرت با ظرفیت بیشتراز 15 بیلیون لیتر در سال است، ذرت که در حال حاضر برای ساختن حدودأ 90% کل بیواتانول امریکا استفاده می شود. انتظار است تا زیست توده برتر باقی بماند اگر چه احتمالاً کم کم تا 2016 کاهش میابد.
صنعت بیواتانول بر پایه نشاسته به لحاظ تجاری بمدت سی سال زنده مانده است. در طی این زمان بهبود های چشمگیری در کارایی آنزیم، کاهش هزینه ها و زمان فراوری و افزایش عملکرد های بیواتانول صورت گرفت. دو دلیل عمده برای افزایش هزینه وجود دارد. یکی آن است که هر چقدر مخمر ساکارومایسیس نتواند از مواد نشاسته ای بهره ببرد مقادیر زیادی از آنزیمهای آمیلولایتیک بنام گلوکومیلاز و آلفا- آمیلاز نیاز به اضافه شدن دارد. دیگری آن است که مواد نشاسته ای نیاز به پختن در دمای بالا 453-413 کلوین دارد تا بهره بالای بیواتانول بدست آید.
2-4-3مواداولیه سلولزی (لیگنوسلولز)
همانند مواد قندی، مواد نشاسته ای نیز در زنجیره غذایی انسان قرار دارد در نتیجه گران قیمت می باشد، خوشبختانه گزینه سومی وجود دارد که مواد سلولزی می باشند. این مواد سازنده نسل دوم تولید بیواتانول هستند. نمونه های مواد سلولزی عبارتند از:کاغذ، مقوا، چوب و دیگر مواد گیاهی، لیگنو سلولز نیمی از کل مواد حاصل از فتو سنتز را شامل می شود. و متشکل از سه پلیمر سلولز، همی سلولز و لیگنین است. این پلیمرها پیوندهای فیزیکی و شیمیایی نزدیک و محکمی با هم دارند و همه آنها در طبیعت به وسیله باکتری ها و قارچها تجزیه می شوند. در دیواره سلولزی بافتهای آوندی گیاهان خشک زی، الیاف سلولز در میان ماده زمینه غیر بلورین لیگنین و همی سلولز محصور شده است.
این سه پلیمر با نیروهای غیر کوالان و پیوندهای تقاطعی کوالان بطور محکم به یکدیگر متصل می شوند و ترکیبی به نام لیگنو سلولز را میسازند که بیش از 90 درصد وزن خشک سلول گیاهی را تشکیل می دهند. نسبت وزنی هر یک از پلیمرها بر حسب گونه و سن گیاه و از اندامی به اندام دیر متفاوت است. بطور میانگین ماده لیگنو سلولز دارای 45 درصد سلولز،30 درصد همی سلولز و 25 درصد لیگنین است.
منابع سلولزی به وفور و در سطح وسیعی یافت می شوند. به عنوان مثال جنگلها در حدود 80% درصد از زیست توده جهان را شکل می دهند. بواسطه فراوانی و بیرون بودن از زنجیره غذایی انسان ها مواد سلولزی به طور متناسبی برای تولید اتانول ارزان قیمت می باشند. مواد سلولزی متشکل از مواد چوبی همی سلولز و سلولز می باشند و بنابراین به آنها مواد سلولزی متشکل از بافت های چوبی میگویند. درکل، سوخت های زیستی مانند بیواتانول و بیودیزلاز محصولات کشاورزی بدست می آیند.
چون سوختهای زیستی از گیاهانی به دست می آیند که هنگام رشدشان کربن هوا را جذب می کنند در نتیجه می توانند انتشار دی اکسیدکربن را جبران نموده و تغییرات آب و هوایی ناشی از احتراق(سوختن) سوختهای فسیلی را کاهش دهند. جایگزین سوختهای زیستی نسل اول به جای سوخت های فسیلی ممکن است مشکلات گرم شدن زمین و آلودگی محیط زیست را کاهش دهد. علیرغم تمام مزایای سوختهای زیستی نسل اول، این سوختها معایبی نیز دارند. یکی از آنها نابود کردن ذخایر غذایی از جمله محصولات کشاورزی مانند روغن نخل، سویا و شلغم روغنی است که به عنوان منابع مهم چربی و روغن کاربرد وسیعی دارند. ذرت و نیشکرکه منابع بیواتانول در ایالات متحده آمریکای جنوبی محسوب می شوند به ترتیب برای تولید مواد غذایی و قند به عنوان کالاهای مصرفی به کار رفته اند. با افزایش تقاضا برای این محصولات کشاورزی مطابق با افزایش تولید سوخت های زیستی درسراسر دنیا، این نگرانی وجود دارد که این رویداد باعث بالارفتن بیش از حد قیمت مواد غذایی مذکور شود. درنهایت هزینه های اضافی مربوط به قیمتهای بالای مواد غذایی به عهده مصرف کنندگان خواهند بود و بعدها باعث اعتراض و هرج ومرج می شود. برای مثال، هزاران مکزیکی به خاطر قیمت بالای توردیلا که در اصل با ذرت یکی از منابع غذایی مورد استفاده به عنوان منبع بیواتانول در ایالات متحده تهیه می شود راهپیمایی و اعتراض کردند. چون محصولات کشاورزی ماده اصلی سوخت های زیستی هستند، به محیط کشاورزی وسیعی مطابق با تقاضای بالا نیاز است. جنگل های گرمسیری که سرشار از زیستگاههای مهم و متنوع زیستی هستند به خاطر بعضی گیاهان وجانوران در معرض خطر قربانی شدن هستند. تا محصولات انرژی زیستی مانند سویا که پرورش داده شوند. درنتیجه، مقاومت اکولوژیکی تحت تاثیر قرار گرفته و باعث تشدید آلودگی زیست محیطی می شود. از سوی دیگر، اعتراضات شدیدی از سوی طرفداران محیط زیست به تولید بیش از حد محصولات انرژی زیستی شده است. این طرفداران حفاظت محیط زیست برای تحریم فرآوردهای بدست آمده از این محصولات که به صورت بی وقفه تولیدمی شوند، گرد هم جمع شده اند. با تمام مشکلات بحث برانگیز مربوط به سوختهای زیستی نسل اول، به نظر می رسد که این سوختها منبع اصلی ذخیره انرژی نامناسبی هستند. درعوض، سوختهای زیستی نسل دوم بهترین گزینه ای است که در حال حاضر وجود دارد. بیواتانول نسل دوم فقط به زیست توده سلولزی ارزان قیمتی به عنوان ماده اولیه نیاز دارد که در سرتاسر دنیا فراوان و سهل الوصول است. افزایش در سوختهای زیستی نسل اول که محصولات کشاورزی با ارزشی مانند نیشکر و ذرت را به عنوان ماده اولیه استفاده می کنند، دیگر ضروری نیست. درنتیجه قیمت بیواتانول با زیست توده ارزان بعنوان ماده اولیه با بنزین قابل رقابت است.
بیواتانول نسل دوم، سوخت های زیستی هستند که از منابع غیر خوراکی مانند زیست توده حاوی سلولز، همی سلولز ولیگنین تولید می شوند. به جز لیگنین، پلی ساکارید های بلند زنجیره هیدرولیز شده و مخلوطی از پنتوزها(C5) و هگزوزها(C6) را تولید می کنند. گلوکز یکی از هگزوزها و ماده اولیه فرایند تخمیر توسط آنزیم ها می باشد مثلاً در تولید اتانول از ذرت و نیشکر، تفاوت میان بیواتانول نسل اول و دوم این است که در نوع دوم به یک مرحله اضافی برای هیدرولیز زیست توده (بیومس) لیگنو سلولزی نیاز داریم همان طور که در شکل2 -1 نشان داده شده است .

اگر یک مرحله پردازش(تولید) اضافی در هیدرولیز لیگنو سلولز با گلوکز وجود داشته باشد، لیگنوسلولز از نظر دسترس پذیری بسیار فراوان و متنوع است. علاوه براین، به تقویت و افزایش کشاورزی در بیواتانول نسل اول که بازدهی (تولید) محصولات را مطابق با افزایش تقاضای ماده اولیه برای سوخت های زیستی افزایش می دهد، نیازی نیست. در نهایت، هزینه ماده اولیه برای لیگنو سلولز در مقایسه با محصولات کشاورزی کمتر است که برای بیواتانول نسل اول هزینه کل تولید به 70% می رسد. درنتیجه قیمت بیواتانول نسبت به سوختهای فسیلی مانند بنزین یا گازوئیل حالت رقابتی بیشتری خواهد داشت. منابع زیست توده لیگنو سلولزی برای تولید به سه نوع اصلی تقسیم شده است. یکی از آنها بقایای جنگل است که شامل چوب ها و کاه های باقی مانده از صنایع خمیر وکاغذ و عملیات قطع درختان می شود. تمام بقایای زیست توده سرشار از لیگنوسلولز است استفاده از آن به عنوان ماده اولیه مناسب می باشد و علاوه بر این، محصولات کشاورزی خاصی مانند گندم و محصولات با گردش زراعی کوتاه وجود دارند که برای اهداف کسب انرژی کشت شده اند. برای مثال گندم مانند میسکانتوس(میسکانتوس-گیگانتنوس) و سویچ گراس به عنوان راه حلی برای منابع فراوان و ارزان لیگنوسلولز وارد بازار شدند. مواد زائد درجه 2و3 نیز وجود دارد. مانند زباله های (جامد )شهری، کودهای حیوانی و زباله های ناشی از صنایع تولید موادغذایی، هالوفیتها تمام این منابع سرشار از لیگنو سلولز هستند و به جای استفاده از محصولات خوراکی مانند ذرت و نیشکر در بیواتانول نسل اول، این منابع بعنوان ماده اولیه بیواتانول استفاده می شود.
لیگنوسلولز بجز فراوان و ارزان بودن، مزایای زیست محیطی و تولید دیگری نسبت به محصولات کشاورزی متداول دیگر دارد. برای مثال، از نظر بازدهی تولید، گیاه میسکانتوس می توانند سالانه 40 تن در هکتار تولید شود. نیشکر یه مورد استثنایی است که بازدهی آن بسیار بالا یعنی85 تن در هکتار می باشد. در مقایسه با نیشکر که فقط در مناطق گرمسیری رشد می کند، طبق گزارشات گیاه میسکانتوس در برابر شرایط آب و هوایی مقاومت بیشتری دارد. بنابراین در اب و هوای سرد نیز به زیست خود ادامه می دهد. با وجود این نیشکر منبع سلولزی مهمی حساب می شود و به همراه باگاس(تفاله نیشکر) و کاه به عنوان ماده اولیه ارزان قیمت قابل استفاده اند.
جدول 2-1فراوانی نسبی قندهای موجود در اجزای کربو هیدراتی چوب (%وزنی) (گلدشتاین1981)
قند چوبهای نرم پوست چوبهای نرم چوبهای سخت پوست چوبهای سخت
گلوکز 65-62 63-57 73-55 65-53
زایلوز 13-9 15-11 39-20 36-18
مانوز 16-7 16-6 4-4/0 3-3/0
گالاکتوز 17-6 5-1 4-1 6-1
آرابینوز 5-3 11-4 2-1 8-2
رامنوز 2-1 2-1 2-1 2-1
اسیدهای ارگتنیک 7-4 0 7-4 0
جدول2-2 ترکیب گونه های مختلف زیست توده های سلولزی(%وزن خشک) (گلدشتاین،1981)
مواد سلولز همی سلولز لگنین خاکستر مواداستخراجی
جلبک 40-20 50-20 0 0 0
پنبه 95-80 20-5 0 0 0
علف 40-25 50-25 30-10 0 0
چوبهای سخت 47-43 33-28 24-16 8/0-4/0 8-2
پوست چوبهای سخت 40-22 38-20 55-30 1-6/0 8-4
چوبهای نرم 44-40 29-25 31-25 6/0-4/0 5-1
پوست چوبهای نرم 38-18 33-15 60-30 1-6/0 6-2
ساقه ذرت 47-39 31-26 5-3 16-12 3-1
در صورتی که بیواتانول نسل دوم به عنوان یک منبع مقرون به صرفه و بادوام انرژی محسوب شود، موانع و محدودیت هایی وجود دارند که باید بر طرف شوند. برای مثال، درحال حاضر تولید اتانول سلولزی گران تر از اتانول بدست آمده از ذرت یا نیشکر است. تاجایی که به اقتصاد مربوط می شود، اتانول سلولزی گزینه جالب توجه و ماندگاری برای حل مشکل افزایش قیمت نفت خام نیست. به جز فاکتور هزینه، مشکلات مربوط به دانش فنی، مسائل زیست محیطی و دسترس پذیری زیست توده نیز باید قبل از تولید اتانول سلولزی با فشار کامل به جای اتانول به دست آمده از محصولات زراعی شناسایی شده و بر طرف شوند.
تولید اتانول از موادلیگنو سلولزی شامل هیدرولیز بوده که پلیمر های سلولز را به قندهای قابل تخمیر میشکند، سپس فرآیند تخمیر را در پی داشته که قندها را به اتانول تبدیل می کند و در نهایت فرآیند تفکیک و جداسازی است که طی آن تصفیه و خالص سازی اتانول جهت تولید اتانول سوختی صورت می گیرد. با وجود این، برخی از محصولات جانبی همچون ترکیبات فوران در طول هیدرولیز شیمیایی آزاد شده و مانع از فعالیت مخمر در طول کشت می شوند که تلاشهایی در جهت غلبه بر این مشکلات صورت گرفته است(پواردی، 2008). هر چند، به دلیل قیمت بالای مواد لیگنو سلولزی اتانول عمدتأ از این مواد تولید نشده، اما پیش بینی می شود که استفاده از این ماده اولیه در آینده ای نزدیک افزایش چشمگیری خواهد داشت و علاوه بر اینکه منبع اصلی تولید اتانول گشته، بیش از دوسوم کل تولید اتانول درسال2050 را نیز در برمی گیرد.
جدول2-3ترکیب بازدهی مواد متفاوت برای تولید بیواتانول(پواری، 2008)
مواد خاکستر همی سلولز سلولز لگنین پتانسیل تولیداتانول(kg/kg)
کاه گندم 3/1 6/27 34 18 35/0
شالی برنج 9/18 7/22 37 6/13 34/0
کاه جو 1/7 44 1/37 11 46/0
ساقه تنباکو 4/2 2/28 4/42 27 40/0
باگاس 0 6/24 7/39 2/25 36/0
2-4-3-1 سلوز
فراوان ترین ترکیب آلی(پلی ساکارید) در طبیعت است حدود یک سوم وزن تمام گیاهان را تشکیل می دهد. مقدار تخمینی تولید آن در جهان40 میلیون تن در سال می رسد. سلولز پلیمری از گلوکز بتا است که در وضعیت طبیعی خود، زنجیره ای خطی متشکل از هزاران مولکول گلوکز است که توسط اتصالات گلیکوزیدی و به صورت رشته های موازی بهم متصلند. واحد اصلی تکرار شونده سلوبیوز می باشد. واحدهای پی درپی گلوکز در سلولز، نسبت به واحدهای مجاور خود180درجه به دور محور زنجیره گردش می کنند و لذا سلوبیوز انتهایی به یکی از دو شکل متفاوت استرونو شیمیایی ظاهر می شود. زنجیره پلیمر سلولز ساختار نواری مسطحی دارد که با پیوند هیدروژنی داخلی پایدار می گردند. سلولز در آب نامحلول است و قدرت کشش بالایی دارد و نسبت به تجزیه بسیار مقاومتر از سایر پلیمر های گلوکز نظیر نشاسته می باشد. فیبرهای سلولزی استحکام چوب را ایجاد کرده و شامل تقریبأ50-40 درصد وزنی چوب خشک است.
2-4-3-2 همی سلولز
در حالی که سلولز همو پلیمری خطی است. و ازگونه ای به گونه ای دیگر تفاوت چندانی ندارد، همی سلول هتروپلیمری پر انشعاب و معمولا غیر بلورین است. واحدهای قندی همی سلولز، شامل پنتوزها(دی زایلوزیاگزیلوز، ال آرابینز) و هگزوزها (دی-گالاکتوز، ال گالاکتوز، دیمانوز، ال رامنوز، ال فوکوز) و اسیدهای یورونیک(اسیددی-گلوکورونیک) هستند. این واحد ها بطور متغییر با استیل دار شدن و متیل دار شدن اصلاح می شوند. همی سلولز معمولاً 28 درصد از چوبهای نرم و 35 درصد چوبهای سخت راتشکیل می دهد. همی سلولز مخلوطی از مونوساکاریدهای پلیمرشده مختلف همچون گلوکز ومانوز، گالاکتوز، زایلوز، آرابینوز، اسیدگلوکرونیک و بقایای اسید گالاکترونیک است. زایلوز یک قند پنتوز است که از همی سلولز موجود در زیست توده های چوب سخت مشتق شده است. اما آرابینوز از قندهای پنتوز که از بقایای کشاورزی و دیگر گیاهان زراعی علفی همچون علف، مشتق شده است. در صورتیکه آرابینوز فقط 2الی4 درصد از کل پنتوز در چوبهای سخت را می سازد، همی سلولز متشکل از زنجیره های طولانی مولکول های قند است اما در برگیرنده گلوکز(قند شش کربنی) همراه با قند پنج کربنی نیز است. ساختار دقیق شکل گیری همی سلولز، می تواند بسته به نوع گیاه متفاوت باشد، از آنجایی که قند پنج کربنی شامل درصد بالایی از قندهای در دسترس است، توانایی احیای مجدد و تخمیر آنها به اتانول جهت کار آمدی و اقتصادی بودن فرایند حائز اهمیت است. اخیراٌ میکروارگانیزم های خاصی از نظر فنی مهندسی بررسی شده اند که می توانند قندهای پنج کربنی را با کارامدی بالایی به اتانول تبدیل نمایند. یک نمونه از میکروارگانیزم های از این نوع که توسط دانشگاه فلوریدا توسعه یافته است قادراست هم قند پنج کربنی و هم قند شش کربنی را تخمیر نماید. دیگر محققان میکروارگانیزم هایی با توانایی تخمیر موثر در حداقل بخشی از قند را توسعه دادند.
2-4-3-3 لگنین
لیگنین پلیمر مرکب و متقاطع و دارای اتصال عرضی، منومرهای پیوند فنلی بوده که ساختار مولکولی بزرگی را می سازند. این ماده در ساختمان دیواره سلولی وجود دارد و در مقابل حمله میکروبی و تنش اکسیدی غیر قابل نفوذ و مقاوم می باشد. لگنین در دیواره سلولی گیاهان، سرخسها، پنجه گرگیان و بویژه دربافت های آوندی انتقال مایعات وجود دارد. لگنین دار شدن، استحکام مکانیکی بافت های چوبی را افزایش می دهد و موجب سرپا باقی ماندن درختان غول پیکر بادها متر ارتفاع میگردد. طی فرایند لیگنیندار شدن، مولکولهای درحال رشد لگنین فضای بی الیاف سلولز و زنجیره های همی سلولز را پر می کنند. لگنینها را بر اساس مقدار نسبی هر یک از واحدهای ساختمانی به سه نوع لگنین سخت چوب، لگنین نرم چوب و لگنین علفی تقسیم می کنند. شکل 2-2 ساختار ان را نشان می دهد.
شکل 2-2 ساختار سه نوع لگنین سخت چوب، لگنین نرم چوب و لگنین علفی

p-Coumaryl alcohol Coniferyl alcohol Sinapyl alcohol
معمولاً نرم چوبها شامل لیگنین بیشتری از سخت چوبها هستند. مانند هالوفیتها(شور پسندها) که در اراضی شور کشور برای اولین بار در دست مطالعه و اقدام است.Zainul Abideen و همکاران (2011) در بررسی توان گونه های هالوفیت بعنوان منبع بیوماس لیگنوسلولزی نشان دادند که برخی از گونهای هالوفیت مانند Halopyrum، Karka، typha و ...در مناطق ساحلی پاکستان پتانسیل محصولات بیواتانول را دارا هستند. آنها نشان دادندکه این گراسهای دائمی مقاوم به شوری بوده و نرخ رشد بالایی برای تولید بیوماس لیگنوسلولزی با کیفیت شامل37-26% سلولز، 38-24% همی سلولز و کمتراز10% لیگنین دارند. با انجام تحقیق در این زمینه میتوان در ایران با انتخاب گیاهان دائمی با بیو ماس بالا که مواد لیگنو سلولزی مناسبی برای تبدیل شدن به اتانول دارند با توجه به اینکه ایران 365 نوع هالوفیت دائمی و یکساله دارد. برای تولید اتانول استفاده کرد. اگر چه عناصر ساختاری اصلی در لیگنین مشخص شده است، امٌا بسیاری ازجنبه های آن ناشناخته است. پیوندهای شیمیایی بین لیگنین و همی سلولز و حتی سلولز گزارش شده است. لیگنین ها به تجزیه آنزیمی و شیمیایی بسیار مقاوند.
در صورت موفق آمیز بودن اتانول از زیست توده، هزینه های اتانول کاهش چشمگیری خواهد داشت. چون قیمت ماده خام بیش از55% در هزینه تولید مشارکت دارد، مواد خام ارزان مانند بیومس لیگنو سلولزیک و ضایعات کشاورزی و غذایی، برای رقابتی کردن بیواتانول در بازار مورد توجه قرار گرفتند. بیومس لیگنوسلولز یک شامل گروه گوناگونی از مواد: باقیمانده های کشاورزی (کاه غلات، پوست برنج، ضایعات پنبه و...)، باقیمانده های جنگلی(هرس،چوب بری) و ضایعات جامد شهری می باشد. تولید بیواتانول از این مواد خام می توانند جایگزین مناسبی برای انهدام این باقیمانده ها باشد(وایمن و دیگران2007). لذا علاقه فزاینده ای به کشف استراتزی های جدید به منظور کاربرد این باقیمانده ها برای تولید بیواتانول وجود دارد. یک مشکل عمده با تولید بیواتانول در دسترس پذیری موا د خام برای تولید است. این در دسترس پذیری زیست توده ها برای تولید بیواتانول می توانند به طور قابل توجهی از فصلی به فصل دیگر فرق کند و به موقعیتهای جغرافیایی بستگی دارد. قیمت مواد خام هزینه های جمع آوری و انتقال تا حد زیادی متغییر است که می توانند هزینه های تولید بیواتانول را متاٌثر نماید. بنابراین تحقیق در خصوص گونه های بومی و محلی که قابلیت تولید بیواتانول را دارند. می توانند به توسعه این صنعت کمک بزرگی کند. اخیراٌ اتانول عمدتاٌ از گیاهان و محصولات زراعی تولید گشته و این در گرایش و تمایل به استفاده از مواد لیگنوسلولزی ارزانتر به عنوان ماده اولیه برای تولید اتانول نظیر کودزو(روان و دیگران2008) ماهولادرخت(سوتکومار و دیگران، 2008)، ضایعات حاصل از آسیاب گندم(مارکوس2008)، پوست درختان(کیم و دیگران، 2008) مشاهده میگردد.
2-5 بیواتانول سوخت سبز:
پیش رفتن کشورهای دنیا به سمت صنعتی شدن و نیز روند رشد جمعیت از جملهی عواملی هستند که نیاز روزافزون به منابع انرژی را روز به روز افزایش می دهند. باتوجه به  محدود بودن منابع سوخت های فسیلی و نیز لحاظ کردن مشکلاتی که این نمونه سوخت ها از نظر زیست-محیطی بوجود می آورند، بحث مطرح نمودن سوختی جایگزین که سازگاری بهتری با محیط زیست داشته باشد و از منابع تجدید پذیر حیات تامین شده باشد را بطور جدی مطرح می سازد. پیش بینی می شود که در سال های آتی، تولید نفت خام در دنیا از میزان کنونی آن کمتر باشد و روند رو به کاهشی را داشته باشد به گونه ای که تخمین زده می شود  که تا سال 2050 کل تولید نفت خام در دنیا از میزان 25 بیلیون بشکه به 5 بیلیون بشکه کاهش می یابد.
تمایل به تولید الکل از سلولز در تمام دنیا رو به افزایش است مواد سلولزی را میتوان برای تولید سوخت استفاده نمود به طوری که کل تولید خالص گازهای گلخانه‏ای کاهش یابد. مواد سلولزی به صورت محصول جانبی فرآیندهای صنعتی و کشاورزی قابل دسترس می باشد. فناوری تبدیل مواد سلولزی دارای مشکلات  فنی و اقتصادی متعددی بوده که از تجاری شدن این فناوری تا این لحظه جلوگیری کرده است. همانگونه که میدانیم مواد سلولزی به عنوان ضایعات کشاورزی شامل محصولات زراعی و باغی و ضایعات کارخانههای کاغذ سازی سالیانه در کشور به عنوان مواد زائد و دور ریختنی تولید می شوند.
متأسفانه دور ریختن این مواد باعث تخریب محیط زیست و سوزاندن آنها آلودگی شدید هوا را به دنبال دارد. یکی از راه های مناسب برای استفاه از این زائدات تبدیل آنها به الکل اتیلیک می باشد. محصول فوق در غلظتهای مختلف (80-100%) تولید می شود. از الکل تولیدی میتوان به عنوان سوخت به صورت خالص (E100 ) یا به صورت مخلوط با بنزین (30% الکل E30) استفاده کرد. علاوه بر آن از الکل تولیدی به عنوان حلال یا مصارف طبی استفاده می شود.
اتانول یکی از جمله موادی است که بعنوان جایگزین برای سوخت های فسیلی مطرح می باشد. با توجه به اینکه اتانول دارای 35% اکسیژن در ترکیب خود می باشد یک سوخت تمیز به شمار میرود که می تواند تولید گازهای گلخانه ای و ذرات معلق را که در طی فرایند احتراق تولید می شوند به میزان قابل ملاحظه ای کاهش دهد. یکی دیگر از مزایای استفاده از اتانول این است که می تواند از منابع تجدید پذیر حیات - بر پایه ی مواد سلولزی - که به میزان قابل توجهی در طبیعت یافت می شود تولید شود و بدین وسیله هم از مواد اولیه ی ارزان قیمت و در دسترس استفاده می نماید و هم مشکلات دور ریز این مواد و انباشته شدن آنها در محیط زیست را برطرف می نماید. برای نمونه می توان به دور ریز چوب فراورده های جنگلی و کشاورزی، دور ریز پساب کارخانه های صنعتی نظیر کارخانه های کاغذ سازی و نساجی (الیاف کتانی)، پس مانده های کارخانه ی نیشکر، برنج، گندم، ذرت و جو و نیز دور ریز کارخانه های کمپوت( نظیر هسته ی میوه جات) اشاره نمود.
تخمین زده می شود که به تنهایی در آمریکا 2 کیلوگرم پس مانده ی جامد شهری به ازای هر شهروند در روز تولید می شود و شایان ذکر است که هر تن پس مانده ی شهری از دیدگاه انرژی معادل با یک بشکه ی نفت می باشد.
بدلیل اهمیت مشکلات زیست محیطی ناشی از سوخت های فسیلی، اتحادیه ی اروپا در نوامبر سال 2001 طی قانونی کشورهای عضو را وادار به استفاده از منابع تجدید پذیر حیات برای تولید سوخت نموده است، به نحوی که بر طبق این قانون در سال 2010 می بایستی  75/5% کل سوخت مصرفی این کشورها از این منابع تامین شده باشد.
اتانول می تواند به تنهایی یا در ترکیب با بنزین و یا گازوئیل برای استفاده ی سوخت خودروها استفاده شود و ایالات متحده ی آمریکا کارخانه های تولید خودرو را موظف به طراحی موتورهای خودروی سازگار با این نمونه سوخت ها نموده است. برای نمونه، یک ترکیب خاص سوخت خودرو که E-85 نام دارد از ترکیب 85% حجمی اتانول با 15% بنزین استفاده می نماید.
یکی از مشکلات مطرح در مورد استفاده از اتانول به عنوان سوخت، بالا بودن قیمت نهایی آن می باشد که با پیشرفت فرایند تولید اتانول، روند رو به کاهش را طی می کند. برای نمونه، چنانچه برای هر تن خوراک جامد جهت تولید اتانول در آمریکا قیمت 25 دلار را در نظر بگیریم، قیمت تمام شده ی اتانول از قیمت فعلی 16/1 دلار به 76/0 دلار در سال 2015 کاهش خواهد یافت که حدود 34% کاهش قیمت را نشان می دهد. در خاتمه به منظور اینکه از میزان اتانول تولیدی به ازای خوراک ورودی تقریبی داشته باشیم هر تن تفاله ی نیشکر خشک توانایی تولید 440 لیتر اتانول را دارد. روشن است که این میزان تولید بیش از هر چیز به میزان سلولز موجود در خوراک، فرایند و شرایط عملیاتی تبدیل سلولز به اتانول بستگی دارد.
برای تهیه اتانول از مواد اولیه آلی نظیر نفت، گازطبیعی،ذغال سنگ وبیومس استفاده می شود.این روشها عبارتند از:
الف)هیدراتاسیون الکنهای بدست آمده از کراکینگ نفت
ب )فرایند آکسو از آلکانها، کربن منو اکسید وهیدروژن
ج)بوسیله تخمیر هیدرو کربنها
6-2 تولید بیواتانول بوسیله تخمیر کربوهیدراتها:
عملیات تخمیر با استفاده از مخمرهای موجود و با باکتری، از تمام پنج قند عمده زیست توده شامل گلوکز، زایلوز، مانوز، گالاکتوز و آرابینوز صورت می گیرد. بیواتانول ممکن است بوسیله تخمیر مستقیم از قندها و یا از کربوهیدراتهای دیگر که می توانند به قند تبدیل شوند همچون نشاسته و سلولز تولید شود. تخمیر قندها بوسیله مخمر، قدیمی ترین فرایند شیمیایی ترکیبی است که توسط انسان استفاده شده است و همچنان نیز جهت تولید اتیل الکل حائز اهمیت می باشد. قندها از منابع مختلف بدست می آیند که ملاس حاصل از نیشکر و یا نشاسته منتج از غلات مختلف از آن جمله اند، نام"الکل حبوباتی"به همین منظور به اتیل الکل اطلاق می شود. برخی از قندها می توانند به صورت مستقیم به بیواتانول تبدیل شوند. درحالیکه نشاسته و سلولز بایستی در ابتدا به قند هیدرولیز شده و سپس به بیواتانول تبدیل شوند. اغلب مواد خام پلی مری با قیمت های پایین تر از قندهای اصلاح شده در دسترس قرار دارند. به هرحال، هزینه های حمل و نقل مواد خام، استفاده از مواد خام بومی و منطقه ای را ضروری نموده است. متدتخمیر اساساّ شامل سه مرحله است:
شکل گیری محلول قندهای قابل تخمیر
تخمیر این قندها به بیواتانول
جداسازی و تصفیه اتانول که معمولا ّبا تقطیر انجام می شود.
تخمیر شامل میکروارگانیزم هایی است که از قندهای قابل تخمیر بعنوان غذا ها استفاده می کند و در فرآیند مذکور، اتیل الکل و دیگر محصولات جانبی را تولید می کنند. چنین میکروارگانیزم هایی می توانند از قندهای شش کربنی که گلوکز یکی از متداول ترین آنها است، استفاده نمایند. بنابراین مواد سلولزی زیست توده که شامل مقدار بالایی از گلوکز و یا مواد قابل تبدیل به گلوکز است به آسانی به اتانول تبدیل می شوند. از نظر تئوری،100 گرم گلوکز، 4/51 گرم بیواتانول و 8/48 گرم دی اکسیدکربن تولید می کند. اما در عمل، میکروارگانیزم ها از تعدادی از گلوکزها جهت رشد استفاده می کنند و بازده واقعی آنها کمتر از100% است.
هیدرولیز سلولزی، تولید گلوکز می کند که به آسانی با ارگانیزم های موجود تخمیر می شود. هیدرولیز مواد همی سلولزی تولید هگزوز و هم قندهای پنج کربنی می نماید: مانوز، گالاکتوز، زایلوز و آرابینوز که همگی با کشت های موجود تخمیر نمی شوند.
مواد همی سلولزی عموماٌ، ترکیبی از قندها را تولید می کنند که شامل: زایلوز، آرابینوز، گالاکتوز و مانوز است. اینها هم شامل قند پنج کربنی یعنی زایلوز و آرابینوز و هم شش کربنی شامل گالاکتوز و مانوز می باشد.
برای تولید بیواتانول از زیست توده، مواد همی سلولزی را به قندها و بخش سلولزی بوسیله اسیدها و یا آنزیمها به قند گلوکزی هیدرولیز می شود. بطوریکه قند گلوکزی و قندهای حاصل از مواد همی سلولزی نیز به بیواتانول تخمیر می شوند. به این ترتیب برای گرفتن اتانول از بیومس لیگنوسلولزی کربوهیدراتهایش باید شکسته شوند و به قندهای مونومر(هیدرولیزشدن) تبدیل و سپس برای استفاده از میکروارگانیسم ها تخمیر شود. از دو راه میتوان به این نتیجه رسید. هیدرولیز شیمیایی و هیدرولیز آنزیماتیک که دومین روش نیازمند یک ماده اولیه موثر و مناسب است تا حساسیت لیگنو سلولز را به فعالیت آنزیمی افزایش دهد.
7-2 هیدرولیز:
هیدرولیز بمعنای شکستن یک مولکول از طریق اضافه کردن یک مولکول آب به آن نظیر رابطه 3-1 می باشد :
( STYLEREF 1 s ‏0 SEQ رابطه * ARABIC s 1 1) C6H10O5 + H2O → C6H12O6
هیدرولیز، پیوندهای هیدروژن موجود در سلولز و همی سلولز را به اجزای قندی آن شامل پنتوزها و هگزوزها می شکند. این واکنش بوسیله اسید رقیق، اسید غلیظ یا آنزیمها تسریع می گردد. تاکنون روش های زیادی برای هیدرولیز سلولز به گلوکز بر روی مواد مختلف بررسی شده اند. با توجه به اینکه آنزیمها برای تولید اقتصادی سوخت اتانول از بیومس بسیار گران هستند، استفاده از اسید سولفوریک نسبت به آنزیمهای سلولزی می تواند ارزانتر باشد. گرچه هزینه های مرتبط با استفاده از اسید سولفوریک بطور محسوسی می تواند این هزینه ها را افزایش دهد. بزرگترین اشکال استفاده از اسید سولفوریک آنست که براحتی گلوکز را در دمای بالاتر از حد نیاز برای هیدرولیز سلولز تجزیه می کند. استفاده از فرایند اسید غلیظ در دمای پایین تبدیل کامل و سریع سلولز به گلوکز و همیسلولز به قندهای پنج کربنه را با تجزیه ناچیز آن امکان پذیرمی سازد. ایران محبوب و همکارانش (2002) هیدرولیز اسید غلیظ چوب را انجام دادند و دریافتند حداکثر استحصال قند (82-78 درصد به نسبت تئوری) در هیدرولیز با اسید سولفوریک 26 درصد بمدت 2 ساعت حاصل می گردد. این فرایند نیاز به یک مرحله خنثی سازی اسید یا تجهیزات بازیافت اسید و نیز تجهیزات مقاوم به خوردگی اسیدی نظیر سرامیک های ویژه می باشد. دمای بالای اعمال شده در هیدرولیز اسیدی باعث تولید محصولات فرعی سمی نظیر ترکیبات فورفورال1 می گردد. فشار و دمای پائین تجزیه قندها و تشکیل محصولات فرعی را بحداقل می رساند. درصورت نیاز به خنثی سازی می توان از آهک و یا سود استفاده نمود که با اسید تشکیل نمک می دهند. این نمکها انحلال پذیری پائینی دارند و بطور طبیعی بوسیله فیلتراسیون حذف می شوند. عوامل اساسی موردنیاز برای اقتصادی کردن این فرایند، بهینه سازی استحصال قند و کاهش هزینه های بازیابی اسید می باشد. مطالعات توسط ژانگ و همکارانش (2004) نشان داده که استفاده از اسید فسفریک غلیظ در دمای 50 درجه سانتیگراد نیز می تواند همیسلولزها را حل کند و لیگنین و بلورینگی سلولز را کاهش داده و آنرا آماده تولید قند به همراه غلظت غیرقابل تشخیص محصولات فرعی سمی نماید بطوریکه یک عملیات سم زدایی بوسیله جذب بر روی کربن فعال مانند زغال چوب این مواد بازدارنده را می تواند حذف نماید.
1-7-2هیدرولیز اسیدی
تحقیقات مطالعه شده نشان می دهدکه تحت شرایط کنترل شده هیدرولیز اسیدی توده زیستی لیگنوسلولز عمدتا زایلوز را از زایلان با کسری از لیگنین و سلولز باقی مانده تولید می کند. زایلان بخاطر ساختار بی نظمش در مقایسه با سلولز بیشتر مستعد هیدرولیز توسط پیش فراوری با اسید رقیق است که نیاز به شرایط پیش فراوری سخت تری به جهت ماهیت کریستالینش دارد. در طول هیدرولیز اسیدی زایلوز سریعا به فورفورال و دیگر محصولات فرعی تجزیه می شود. چنین محصولاتی برای میکروارگانیزمها بازدارنده هستند. اثر بازدارنده ترکیبات مختلف فورفورال بر روی رشد مخمر بخوبی آشکار شده است. هیدرولیز اسیدی سلولز یک واکنش ناهمگن پیچیده است و مانند واکنش های شیمیایی به عوامل فیزیکی بستگی دارد. مونوساکاریدهای تولید شده سریع تر به مواد شیمیایی غیر دلخواه تبدیل می گردند. همانطور که شرح داده شد، سلولز و همی سلولز پلیمرهای مونومرهای قند بوده و بنابراین هیدرولیز این پلیمرها تشکیل مونومرهای قند را موجب گشته که برخی از آنها توسط مخمر معمولی قابل تخمیر می باشند. تولید قندهای مونومر از سلولز و همی سلولز در بازده های بالا بسیار دشوارتر از قندهای استخراجی از محصولات زراعی همچون نیشکر یا نشاسته می باشد. امروزه حداقل دو روش هیدرولیز وجود داشته که در فرآیند گسترش تولید اتانول همچنان مورد علاقه بسیاری از محققین می باشد هیدرولیز شیمیایی( اسیدی) و آنزیمی. هیدرولیز شیمیایی مواد لیگنو سلولزی را برای دوره زمانی در دمای معین در معرض مواد شیمیایی قرار داده تا منتج به منومرهایی از پلیمرهای سلولز و همی سلولز می شود. اسیدها غالبا در هیدرولیز شیمیایی به کار می روند. اسید سولفوریک بیشترین تحقیق را داشته (هاریس و همکاران, 1984)، گر چه دیگر اسیدها مانند HCl ( هاشم و راشاد, 1993) نیز به کار رفته اند، هیدرولیز اسیدی را می توان به دو روش هیدرولیز اسید غلیظ و هیدرولیز اسید رقیق انجام داد. مقایسه ای بین این شیوه ها در جدول 24 آمده است.
جدول 24 مقایسه روشهای هیدرولیز اسیدیروش هیدرولیزمزایامعایبهیدرولیز اسید غلیظکار در دمای پایینبازده بالای شکرمصرف بالای اسید، خوردگی تجهیزاتمصرف انرژی برای بازیافت اسیدزمان بالای واکنش ( 2 تا 6 ساعت)هیدرولیز اسید رقیقمصرف پایین اسیدزمان اقامت کمعمل در دمای بالا ، بازده پایین شکر، خوردگی تجهیزات
تشکیل محصولات جانبی ناخواسته2-7-2هیدرولیز اسید رقیق
قدیمی ترین تکنولوژی برای تبدیل توده زیستی سلولز به بیواتانول هیدرولیز اسیدرقیق است (گراف2000). در هیدرولیز اسید رقیق جزء همی سلولز در دمای کمتر از جزء سلولز از حالت پلیمری درمی آید. اسیدسولفوریک رقیق با توده زیستی برای هیدرولیز همی سلولز به زایلوز و دیگر قندها مخلوط می شود. فرآیندهای اسید رقیق شامل محلولی در حدود 1% غلظت اسیدسولفوریک در یک راکتور جریان پیوسته در دمای بالا(488کلوین)می باشد. بالاترین حد بازیابی قند در اکثر فرایندهای اسید رقیق به حدود50% محدود می شود. مشکل اصلی برای فرآیندهای اسید رقیق این است که چگونه میتوان گلوکز را بالاتر از70% در یک فرآیند صنعتی به لحاظ اقتصادی رسانده و در حالیکه نرخ بالای هیدرولیز سلولز را حفظ کرده و تجزیه گلوکز را به حداقل رسانیم. اسیدهای قوی می توانند ناحیه کریستالی را کاهش داده اما گلوکز را تجزیه می کنند.
بزرگترین مزیت فرآوریهای اسیدرقیق سرعت سریع واکنش شان است که فراوری پیوسته را تسهیل می بخشد. در حالی که بزرگترین عیب آنها بازدهی قندی پایین شان می باشد. برای فرآوری های پیوسته سریع بخاطر اجازه دادن به نفوذ کافی اسید زیست توده باید همچنین به لحاظ اندازه چنان کاهش یابند که ابعاد ذره حداکثر محدوده چند میلیمتری باشد. در شکل 2-3 فرایند هیدرولیز اسید رقیق نشان داده شده است. (بوردر و سایرین، 1995)

شکل2-3 فرآیند هیدرولیز اسید رقیق(بوردر و سایرین، 1995)

دانلود پایان نامه ارشد- مقاله تحقیق

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : homatez.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

اولین مرحله برای هیدرولیز همی سلولز در شرایط آرام صورت می گیرد. (بطور نمونه 5/0% اسید سولفوریک و دمای 160درجه سلسیوس) و در دومین مرحله هیدرولیز بخش مقاومتر یعنی سلولز با شرایط کمی شدیدتر(20% اسید سولفوریک و دما200درجه سلسیوس) صورت می گیرد. بعد از خنثی سازی، مایع هیدرولیز شده به دست امده به اتانول تخمیر رفته و لیگنین باقی مانده از راکتور های هیدرولیز در دیگهای بخار برای تولید برق یا بخار به کار میرود.
بسته به نوع راکتور مورد استفاده بازدهی از 24% تا 64% متغیر است. بعضی از پروسس های قدیمی با استفاده از اسید سولفوریک رقیق تا24درصد تئوری بازدهی داشته است(لارسن و دیگران، 1999). اما با تغییر راکتور تا 64% افزایش یافته است. در جدول 2-5 خلاصه ای از حدود درجه حرارت های تحقیق شده دوره ای اقامت و غلظت اسید نشان داده شده است.
جدول2-5 حدود درجه حرارت های تحقیق شده دوره اقامت و غلظت اسید
شرایط هیدرولیز رقیق دما(C°) اسید سولفوریک(%) زمان(دقیقه) بازده گلوکز% بازده زایلوز%
مرحله اول 200 4/0 5 9/49
5/63
مرحله دوم 215 7/0 3 مرحله اول 190 7/0 3 1/50 8/70
مرحله دوم 215 4/0 3 بازد ه ها به عنوان درصدی از حالت تئوری نشان داده شده اند.
تارگت و شاگردانش(تارگت و سایرین، 2000) گزارش دادند که هر راکتوری که به کار گرفته می شود بازده گلوکز از این فرآیند معمولاً فراتر از 65-70% نمیرود به این معنی که فرایند از لحاظ اقتصادی غیر عملی است چندین مولف توضیح های متفاوتی بر روی علل بازدهء پایین به دست آمده با این فن آوری شرح داده اند. این کاهش می توانند بعلت تجزیه قندهای تخمیری یا شکل گیری الیگومرهای سلولز مقاوم به مخمر صورت پذیرد. تحقیقات اخیر توسط انجمن ملی تحقیق بر روی بیواتانول2نشان می دهد که این بازده توسط تغییر ترکیب راکتور می توانند تا 85% بالا برود(ترگت و سایرین، 2000). هیدرولیزات حاوی 4/1 تا 5 گرم بر لیتر از فورفورال و4/2 تا 5/6 گرم بر لیتر از HMF(5-هیدروکسی متیل فورفورال)می باشد. اخیرا ًپیشرفت مهمی از فن آوری هیدرولیز با اسید بطور آزمایشی اثبات شده که بازدهی بیشتر از 95% از همی سلولز و 85% از سلولز قابل حصول در سیستم راکتور صافی دار مضاعف که شبیه به فرآیند ناهمسوست امکان دارد(ترگت و همکاران، 1997). در بین شیوه های هیدرولیز شیمیایی، هیدرولیز اسید رقیق، بیشترین کاربرد را دارد و می توانند به عنوان آزمایش قبل از هیدرولیز آنزیمی برای هیدرولیز لیگنو سلولز به قندها به کار گرفت.
اولین فرآیند هیدرولیز اسید رقیق استفاده شده احتمالاً فرآیند شولر(فیث1945)است. که مواد چوبی را در اسید سولفوریک 5/0% در11-12بار برای 45 دقیقه در فرآیند ناپیوسته مورد استفاده قرار می دهد. این روزها، بیشتر فرآیند هیدرولیز اسید رقیق در راکتور ناپیوسته با زمان نگهداری چند دقیقه صورت می گیرد(کریمی و دیگران، 2006). راکتور ناپیوسته، بیشترین راکتور مورد استفاده در مطالعات سنتیک هیدرولیز و برای آزمایشگاه و مطالعات آزمایشی تولید اتانول از لیگنو سلولز است( سامن 1945، میلاتی و سایرین 2005، براندبرگ و سایرین 2005). بخش عمده همی سلولز(بیش از80%)، را میتوان با هیدرولیز در دمای کمتر از200 درجه سانتیگراد هیدرولیز کرد، اما حداکثر محصول کل گلوکز در دمای هیدرولیز بالاتر از 220 درجه سانتیگراد رخ می دهد. این امر به علت مقاومت زیاد سلولز به هیدرولیز است. نقص اصلی هیدرولیز اسید رقیق، بویژه در مرحله اول، تجزیه قندها و تشکیل چندین محصول فرعی که از تشکیل اتانول در طی تخمیر ممانعت می کند می باشد. ممانعت گران احتمالی که می توانند در طی هیدرولیز اسید رقیق تشکیل شوند و اجزاء اصلی شان در شکل3-2 نشان داده شده است. ممانعت گران بالقوه، فورفورال، 5-هیدروکسی متیل فورفورال (HMF)، اسید لولینیک، اسید استیک، اسید فورمیک،اسیداورونیک، اسید4-هیدروکسی بنزوئیک، اسیدوانیلیک، وانیلین، فنول، فورمالدئید می باشد که گر چه برخی مما نعت گران مانند، ترکیبات ترپن، اساساً در چوب هستند اما ظاهراً بیشتر ممانعت گران در طی هیدرولیز تشکیل می شوند.
در حالی که بهبود فرآیند آنزیمی، یعنی بهبود سرعت فرآیند و سهولت تولید آنزیم به لحاظ اقتصادی قابل پیش بینی است، توسعه و گسترش هیدرولیز اسید رقیق همچنان ادامه دارد(لی و سایرین، 1999). بررسی ها و تحقیقات گوناگونی در انواع مختلف راکتور از جمله راکتورهای پلاگ، راکتورهای تراوشی، راکتورهای جریان معکوس و جریان هم جهت صورت گرفته است، کلیه این تحقیقات علاوه بر پیشرفتهای اخیر در بررسی سینیتکی بود که در پی ارزیابی دامنه گسترده تری از شرایط واکنش بر حسب دما و غلظت اسید صورت گرفت. علاوه بر این، بررسی ها و تحقیقات دقیق و گسترده ای نیز جهت غلبه بر مشکلات فنی نظیر تحقیق در زمینه سم زدایی ماده سمی حاصل شده در طول هیدرولیز اسیدرقیق صورت گرفته است.
فرآیند هیدرولیز اسید رقیق به جهت وجود تفاوت های بین همی سلولز و سلولز در دو مرحله صورت می گیرد (آگیولار و سایرین2002، لارسون و سایرین1999و سائمان1945). اولین مرحله در شرایط معتدل تری صورت گرفته که بازده بالاتری در تولید محصولات هیدرولیز همی سلولز همچون مونومرهای مانوز و زایلوز را نتیجه می دهد. مرحله دوم جهت هیدرولیز جزء مقاوم ترسلولز و به منظور تولید مونومرهای گلوکز بهینه سازی می شود. هیدرولیزاتهای مایع از هر مرحله بازیابی شده و بعد از جدا شدن از ماده جامد ولیگنین قبل کشت خنثی سازی و سم زدایی می شوند. سلولز ولیگنین باقیمانده به صورت جامد در راکتورهای هیدرولیز بجا مانده و به عنوان سوخت دیگ بخار برای تولید الکتریسیته (برق) یا بخار به کار می روند.
فرآیند اسیدرقیق دو مرحله ای معمولاً به دلایل زیر بر هیدرولیز اسیدرقیق یک مرحله ای ترجیح داده می شود:
1) مراحل جداگانه هیدرولیز همی سلولز و سلولز، به محصول قند بالاتری منجر می شود. بعلاوه در فرآیند دو مرحله ای هیدرولیز محصولی با محتوی قند هگزوز بالا بدست می آید که می تواند به راحتی به اتانول تخمیر گردد. اما ترکیب پنتوز و هگزوز معمولاًبرای تخمیر مشکل ساز است زیرا پنتوز به سختی تخمیر می گردد.
2) مصرف انرژی حداقل میگردد زیرا مایع قبل از هیدرولیز مرحله دوم حذف می شود.
3) محلول قند حاصل شده غلیظ تر می باشد.
4) تجزیه کمتر مواد هیدرولیز شده در مرحله اول به بازدهی بالاتر قند منتهی می شود.
5) تعداد ممانعت گرکمتر در طی هیدرولیز دو مرحله ای تشکیل می شود.
2-7-2-1 محصولات جانبی هیدرولیز اسید رقیق
هیدرولیز اسید رقیق یک فرآیند سریع و ارزان جهت دستیابی به قند از مواد لیگنوسلولزی می باشد. با وجود این تولید چندین محصول جانبی در طول فرآیند از جمله معایب اصلی هیدرولیز اسیدرقیق به شمار می آید(سائمن1945). برخی از این محصولات برای فرآیند تخمیر میکروارگانیسم ها از جمله مخمر سمی می باشند(پالمکوسیت و هان هاجردال، 2000). بازداری ایجاد شده توسط این ترکیبات بازده و قابلیت تولید را کاهش می دهد. همچنین رشد سلول را مختل می سازد. تحقیقات و بررسی های زیادی به جلوگیری از این مشکل بازداری اختصاص یافته اند. برای مثال، تبدیل مواد سمی به ترکیب دیگری که برای مخمر غیرسمی بوده یا سمیت کمتری داشته و همچنین افزایش مقاومت مخمر در برابر این مواد سمی از این جمله است.

شکل2-4محصولات جانبی در فرآیند هیدرولیز رقیق
سلولز همی سلولز ولیگنین در طول فرآیند هیدرولیزاسید به ترتیب به گلوکز، مانوزیا زایلوز و ترکیبات فنولیک می شکنند. به محض تشکیل مونومرها، تجزیه های بیشتری در طول این فرآیند رخداده و ترکیبات پیش بینی نشده دیگری همچون هیدروکسی متیل فورفورال(HMF) از هگزوزها و فورفورال از پنتوزها را نتیجه می دهند. هیدروکسی متیل فورفورال و فورفورال نیز عمدتاً به اسیدلویولینیک و اسید فرمیک تجزیه می شوند. علاوه بر این، الیفاتیک اسیدها عمدتاً استیک اسید، از گروهای استیل موجود در همی سلولزها آزاد می شوند، در حالی که لیگنین تجزیه شده و ترکیبات فنولیک آزاد می کند(شکل2-2).
2-7-2-1-1 اسید های آلی
تعداد زیادی از آلیفاتیکها اسیدها در هیدرولیزاتهای اسیدرقیق وجود داشته که ازعصاره های چوب، تجزیه لیگنین و تجزیه قند بدست می آید. اسید استیک اصلی ترین جزو اسیدی در هیدرولیزاتها بوده و عمدتاً از تجزیه گروه استیل در پلی ساکاریدها تولید می شود در حالی که اسیدلویولینیک و اسیدفرمیک محصولات تجزیه قندی می باشند. اسیدهای ناگسسته برای سلول ها مضر بوده و مانع از رشد سلولی می شوند. آنها محلول در چربی بوده و بنابراین می توانند به صورت سیتوسول در سرتاسر غشاء پلاسما پخش و منتشر شوند و ممکن است به صورت درون سلولی تفکیک شوند(طاهرزاده و سایرین،1997).
2-7-2-1-2ترکیبات فنولیک
تعدادی ترکیب فنولیک وجود داشته که در هیدرولیزاتهای لیگنو سلولزی یافت می شوند، از جمله انها3-متوکسی-4-هیدروکسی بنزالدئید، 4-هیدروکسی استوفنون، وانیلین، سیرینگ آلدئید، استروانیلون، فرولیک اسید، وانیلیک اسید و4 -هیدروکسی بنزوئیک اسید را میتوان برشمرد. این ترکیبات عمدتاً از تجزیه لیگنین و همچنین عصاره های آروماتیک چوب آزاد می شوند. فنل آلدئیدها و فنل کتونها به عنوان بدترین بازدارنده ها یافت می شوند. علاوه بر این، بررسی نشان داد که ترکیبات فنولیک با وزن مولکولی پائین سمی تر می باشند (پالمکویست و هان هاگردال، 2000). ترکیبات فنولیک به دلیل اثر بازدارندگی شان در تخمیر هیدرولیزاتهای لینگوسلولزیک، بازدارنده های مهمی به شمار می ایند.
2-7-2-1-3 ترکیبات فورال
فورفورال و 5-هیدروکسی متیل فورفورال(HMF) به ترتیب بعنوان دیگر محصولات هیدرولیز پنتوزها و هگزوزها شناخته شده اند. پنتوزها در بازده بالا فورفورال میسازند، اما هگزوزها از طریق یک شبه فرآیند هیدروکسی متیل فورفورال می دهندکه با ادامه حرارت دهی لویولینیک و فرمیک اسید نیز تولید می کنند.
فورفورال به عنوان یک بازدارنده قوی برای مخمر سایکرومایسیس1شناخته شده است. غلظت بالای g/L1 فورفورال در کاهش قابل توجه سرعت انتشارCO₂، تکثیر سلول وکل تعداد سلول ها در مرحله اول تخمیر موثر شناخته شد(پالمکویست و سایرین، 1999، طاهرزاده و سایرین،1999).
هیدروکسی متیل فورفورال از نظر شیمیایی به فورفورال مربوط می شود و بنابراین اثرات بازدارندگی مشابهی همچون فورفورال دارد، جز اینکه سرعت تبدیل آن پایین تر بوده که احتمالاًبه دلیل نفوذ پذیری پایین غشاء می باشد(لارسون و سایرین، 1999).
2-7-3هیدرولیز اسید غلیظ
هیدرولیز لینگوسلولز با اسیدهای سولفوریک یا اسید هیدروکلریک غلیظ، فرآیند نسبتا قدیمی است. براکونوت در 1819، ابتدا دریافت که سلولز را می توان به قند قابل تخمیر توسط اسیدهای غلیظ تبدیل کرد(شرارد وکرشمان, 1945). در این روش معمولا اسیدسولفوریک و اسید هیدروکلریک بکار میرود. فرآیندهای اسید غلیظ محصول قند بالاتری می دهند (٪90 محصول گلوکز تئوریکی) و لذا محصول اتانول بالاتری در مقایسه با فرآیند اسید رقیق تولید می نمایند بعلاوه فرآیند اسید غلیظ می تواند در دمای پایین (40 درجه سانتیگراد) عمل کند که مزیت آشکار آن در مقایسه با فرآیند اسید رقیق حاصل می شود. با این حال غلظت اسید در این شیوه بسیار بالا است (٪70-30) و گرما دهی اسید غلیظ در طی هیدرولیز آنها را بسیار خورنده می سازد. بنابراین فرآیند به آلیاژ گران یا ساختار غیر فلزی خاصی مانند سرامیک های ویژه نیاز دارد. بازیافت اسید، فرآیند اضافه نسبت به سایرین بوده و فرآیند خنثی سازی آن مقادیر زیادی سنگ گچ تولید می کند. بعلاوه، تاثیر زیست محیطی کاربرد اسیدهای هیدروکلریک را محدود می کند. سرمایه گذاری بالا و هزینه نگهداری به شدت سرمایه گذاری تجاری بالقوه برای این فرآیند را می کاهد( کاتزن و سایرین 1995, جونز سمرا 1984). علی رغم معایب ذکرشده، فرآیند اسید غلیظ هنوز مورد توجه است. اخیرا این شیوه توسط گروه محققان آلمان در فرآیندی به نام " بیوسولفورال1" به کار رفته است. در این فرآیند، زیست توده ‌با اسید سولفوریک ٪70 اشباع شده و سپس با افزودن آب هیدرولیز می شود. بخشی از اسید توسط غشاء‌ آنیونی بازیابی شده و بخشی دیگر به شکل H2S از آزمایش فاضلاب غیر هوازی به دست می آید. ادعا شده این فرایند،‌ هزینه کل کمی برای تولید اتانول دارد سوسپانسیون به منظور جداسازی محلول قند 5 کربنه و 6 کربنه از مواد جامد باقیمانده ( بیشتر لیگنین و سلولز ) صاف می شود و پس از خنثی سازی مناسب محلول به واحد فرمانتور فرستاده می شود. برای تسهیل در مرحله ی بعدی هیدرولیز سلولز به پساب جامد اسید غلیظ زده می شود.
سپس با اسید سولفوریک 30% مخلوط شده و برای کاهش حجم حلاّل و به دست آوردن یک اسید با غلظت70% حرارت داده می شود. مرحله نهایی شامل این محلول در آب گرم به یک مخزن هیدرولیتیک جائیکه اسید غلیظ 10% به دست می آید می باشد. این محلول تقریباً دو ساعت در دمای100درجه سلسیوس حرارت داده می شود. در این مرحله هیدرولیز سلولز کامل می شود درحالیکه از هر گونه تجزیه نامطلوب شکر اجتناب می شود. بعد از آن محلول حرارت داده می شود تا هیدرولیز کاملی از سلولز به دست آید. محلول نهایی فیلتر می شود و مایع محلول نهایی محتوای 10% اسید و 10% گلوکز می باشد که با هیدروکسید کلسیم خنثی می شود و بعد از اینکه سنگ گچ تولید شده جدا شد، قندها به واحد تخمیر فرستاده می شوند. لیگنین جامد باقیمانده برای تولید نیرو سوزانده می شود. کل هیدرولیز سلولز در دو مرحله انجام شده است. اسید غلیظ70% ساختمان کریستالی سلولز را با شکافتن پیوندهای هیدروژنی که بین زنجیره های سلولز است از هم می پاشاند، مرحله ی هیدرولیز مسئول واکنش هیدرولیتیک زنجیره های سلولز ایزوله می باشد. بازده تبدیل هیدرولیز سلولز و همی سلولز زیست توده های متفاوت توسط اسید غلیظ در جدول2-6 گزارش شده است. جدول2-7 نیز میزان بازدهی تولید بیواتانول ازساقه ذرت را نشان می دهد(دمیرباس 2005، بالات2008)
جدول2-6 بازده تبدیلی هیدرولیزاسیدی غلیظ(بردارسایرین،1990)
بازده تبدیل(%) همی سلولزبه زایلوز سلولزبه گلوکز
ساقه الفافا 96 88
علوفه ذرت 92 90
باگاس 90 86
جدول2-7 میزان بازده تولیدبیواتانول از ساقه ذرت(بالات2008)
مقدار ساقه ذرت(کیلوگرم) 1000
میزان سلولز(کیلوگرم) 430
بازدهی تبدیل سلولز 76/0
بازدهی استوکیومتری اتانول 51/0
بازدهی تخمیر گلوکز 75/0
بازده اتانول از گلوکز(کیلوگرم) 130
مقدار ساقه ذرت به کیلوگرم 1000
میزان همی سلولز(کیلوگرم) 290
بازدهی تبدیل همی سلولز 9/0
بازدهی استوکیومتری اتانول 51/0
بازدهی تخمیرزایلوز 5/0
بازده اتانول از زایلوز 66
میزان کل تولید اتانول از1000کیلوگرم ساقه ذرت(کیلوگرم) 196
2-7-4 هیدرولیز آنزیمی
روش دیگر هیدرولیز، هیدرولیز آنزیمی است. آنزیمها پروتئینهای گیاهی هستند که باعث انجام واکنشهای شیمیایی مشخص می شوند. دو تکنولوژی در این زمینه گسترش یافته است. روشهای تبدیل میکروبی مستقیم و آنزیمی(دمیر باس2005)، با انجام فراوری مناسب، هیدرولیز آنزیمی بازده بیشتری نسبت به هیدرولیز شیمیایی دارد ولی هزینه ها ی آن بالاست. تولید اقتصادی و به صرفه ی آنزیم سلولز یک راه برای اقتصادی کردن تولید بیواتانول از لیگنو سلولز ها در یک فرآیند آنزیمی است. مواد لیگنوسلولز یک سو بسترای خیلی پیچیده است و به همین دلیل نیازمند یک مخلوط موثرآنزیمی است که توانایی شکافتن پیوندهای متفاوت درون زنجیره ی پلیمری سلولز را داشته باشد(داین 2006). توانایی و محدودیت مخلوط های گوناگون آنزیمی برای هیدرولیز کامل ساختارهای پلی ساکاریدی دیواره سلولی گیاه کانون تلاش های تحقیقی قابل توجه در طی سالهای اخیر بوده است. تولید سلولاز فعال و ارزان با توجه به موارد زیر صورت می گیرد. بهبود کیفیت آنزیم، طولانی کردن عمر آنزیم، افزایش قدرت تولید و بازدهی آنزیم وکاهش هزینه های محیط رشد و مواد، آنزیم های سلولاز پروتئین هایی هستند با وزن مولکولی در محدوده ی بین30000 تا AMU160000 و یک گونه ی بیضی گون منظم با ابعادی از حداقل30 تا حداکثر200 انگسترم هستند.
آنها توانایی شکستن زنجیره ی سلولز به قندهای مونومر تشکیل دهنده اش را دارند. سطح داخلی چوب که می توانند یک نمونه بیومس فرض شود. خیلی بزرگ است اما تنها20% از حجم خلل و فرج آن برای سایز مولکولهای سلولز قابل دسترسی است. بنابراین عملیات مقدماتی بر روی زیست توده برای افزایش سطح قابل دسترس لازم است.
این در صورتی به دست می آید که لیگنین و همی سلولز چسبان اطراف سلولز با کاهش بلورینگی و پلیمریزاسیون نازک شود. مزیت نهاییش اینست که این مسئله مقدار آنزیم هیدرولیتیکی مورد نیاز را کاهش می دهد که هنوز هزینه اصلی فرایند هیدرولیز است. اگر چه پیشرفت زیادی در بیو تکنولوژی برای کاهش هزینه ی آنزیم صورت گرفته اما هنوز 45% کل هزینه ها را آنزیم بر عهده دارد(فن1987، فیلپدیس و سایرین1977). اساساً پیش فراوری به کار رفته می تواند بسته به مکانیسم بکار رفته برای سوبسترا فیزیکی، گرمایی، شیمیایی و بیولوژیکی باشد. گاهی اوقات ترکیب دو تا یا بیشتر از اینها باعث بهبود بازدهی می گردد.
2-8 پیش فرآوری فیزیکی:

–337

3) مقدار حلال پلیمریزاسیون و اندازه مولکولهای آن
4) تعداد گروههای عاملی اطراف یون فلزی
5) درجه پیوند عرضی اطراف یون فلزی.
1-6- مزایای پلیمرهای قالبی نسبت به جاذبهای متداول استخراج فاز جامداهمیت و کاربرد گسترده پلیمرهای قالب مولکولی و یونی به دلیل مزایایی است که این نوع جاذب ها نسبت به جاذبهای دیگر دارند از جمله این مزایا میتوان به موارد زیر اشاره کرد[21]:
گزینش پذیری بالا
درجه تخلخل بالا
تشکیل و شکست سریع پیوندها
هزینه پایین
پایداری مکانیکی بالا
مقاومت در مقابل گرما و فشار
قابل استفاده بودن در محیطهای شیمیایی سخت و خشن (به شدت اسیدی یا بازی
غیر مخرب بودن
1-7- انواع روشهای تولید پلیمرهای قالبیپلیمرها مولکولهای بزرگی هستند که از اتصال تعداد بسیاری مولکول بسیار کوچکتر ساخته شدهاند. مولکولهای کوچکی که مولکول پلیمر را به وجود میآورند مونومر نامیده میشود و پلیمریزاسیون یک واکنش شیمیایی است که در آن مولکولهای کوچک و ساده که اصطلاحاً تکپار نامیده میشوند، با یکدیگر پیوند برقرار کرده و مولکولی بزرگ با وزن مولکولی چندین برابر مولکول اولیه را به وجود میآورند. در یک مولکول پلیمر صدها، هزاران و دهها هزار و حتی تعداد زیادتری از مولکولها را میتوان یافت که به هم متصل شدهاند وزن مولکولی آنها ممکن است به میلیون ها برسد. برای بدست آوردن یک پلیمر با میل ترکیبی و گزینش پذیری بالا نسبت به گونه هدف انتخاب اجزای پلیمر و درصد ترکیب آنها از اهمیت بالایی برخوردار میباشد. مهمترین اجزای پلیمرهای قالب عبارتند از:
1-7-1- مولکول الگومولکول الگو در تمامی فرآیندهای قالب‎زنی مولکولی اهمیت اساس در جهتدهی آرایش یابی گروههای عاملی که به مونومرهای عاملی قفل میشوند، دارد. از نقطه نظر سازگاری با روش پلیمریزاسیون رادیکالی، الگو بایستی از نظر شیمیایی در شرایط پلیمریزاسیون خنثی باشد و چناچه الگو در واکنش‎های رادیکالی شرکت کند یا به هر دلیلی در شرایط پلیمریزاسیون پایدار نباشد، باید از روش‎های آلترناتیو استفاده کرد. بررسی‎های منطقی ذیل در مورد مولکول الگو باید انجام شود: (1) آیا ملکول الگو دارای گروه پلیمرشونده است؟ (2) آیا مولکول الگو دارای گروه عاملی است که بالقوه جلوی پلیمریزاسیون را گرفته یا کند کرده؟ (3) آیا مولکول الگو در برابر دمای بالا و یا نورکافت پایدار می‎ماند؟ قالب زنی مولکولهای آلی (مثل: داروها، افتکشها، اسیدهای آمینه و پپتیدها، بازهای نوکلئوتید، استروئیدها وقندها) اکنون بهخوبی تثبیت شده وتقریباً روتین است. الگوهای فعال نوری در بسیاری موارد برای بهینه کردن به کار می‎روند. در این موارد دقت ساختار قالب (حفره با سایتهای اتصالیاش) توسط قابلیت آن برای تفکیک راسمیک که میتواند به روش ناپیوسته یا با کاربرد آن پلیمر بعنوان ساپورت کروماتوگرافی سنجیده شود.
یکی از خواص دیگر روش قالب‎زنی مولکولی آنست که میتوان برای طیف گستردهای از آنالیت‎ها بهکاربرد اما همه مولکولهای الگو را نمیتوان مستقیما برای فرآیند قالب مولکولی به کار برد. غالب از مولکول‎های آلی کوچک بهعنوان الگو استفاده می‎کنند. با وجود این، روش‎های استاندارد برای ترکیبات آلی بزرگتر نظیر پروتئین‎ها، سلول‎ها، پیشنهاد شده‎اند برای ملکول‎های بزرگتر هنوز در حال تلاش‎اند. دلیل اصلی آن است که مولکول‎های بزرگتر کمتر صلب بوده و بنابرین ایجاد حفره‎های پیوندی به خوبی طراحی شده در فرایند قالب گیری را تسهیل نمی‎کنند. علاوه بر این، ساختار ثانوی و سومی بیومولکول‎های بزرگ نظیر پروتئینها وقتی که در معرض حرارت و نور شکافت حین سنتز پلیمر قالب مولکولی قرارمی‎گیرند، متـأثر میشوند. باز پیوند نیز مشکل است زیرا مولکول‎های بزرگ نظیر پپتیدها وپروتئینها براحتی برای اشغال مجدد حفره‎های گیرنده داخل شبکه پلیمری نمی‎شوند.
1-7-2- مونومر عاملیانتخاب دقیق مونومر عاملی یک اولویت مهم برای ایجاد برهمکنش‎های مکمل با مولکول الگو و سوبستراست. در مورد قالبزنی ملکولی بهروش غیرکووالانسی، اثرات تغییر نسبت مونومر عاملی به الگو نیازی نیست زیرا الگو تعداد مونومرهای عاملی که می‎توانند پیوند یابند را تعیین می‎کنند. بعلاوه، مونومرهای عاملی به نسبت استوکیومتری اتصال می‎یابند. در مورد قالب‎زنی غیرکووالانسی نسبت بهینه مونومر/الگو از طریق ارزیابی چند پلیمر ساخته شده با فورمولاسیون‎های مختلف با افزایش مقدار الگو بدست می‎آید[22]. دلیلی که برای آن تصور می‎شود .تشکیل کمپلکس محلول بین مونومر عاملی و الگو است که تحت کنترل اصل لوشاتلیه قرار دارد.

Methacrylic acid (MAA) (HEMA)2-Hydroxy ethyl methacrylate

Trans-4-[P-(N,N-Dimethylamino)styry]-N-vinylbenzylpyridinum chloride

N,N,N-trimethylaminoethyl methacrylate
Chloride
N, O-bismethacryloyl ethanolamine

شکل (1-7) ساختار شیمایی تعدادی از مونومرهای عاملی خنثی

2-(Methacryloxy)ethyl phosphate (AMPSA)
Acrylic acidTFMAA
Itaconic acid

2-(Methacryloyloxy)ethyl phosphate p-Vinylbenzoic acid
شکل (1-8) ساختار شیمایی تعدادی از مونومرهای عاملی اسیدی

4-vinylpyridine Diethylaminoethyl methacrylate

p-Aminostyrene 1-Vinylimdazole

4(5)-Vinylimdazole 2.6-Bis-acrylaamidopyridine
شکل (1-9) ساختار شیمایی تعدادی از مونومرهای عاملی بازی1-7-3- لیگاند جهت افزایش میل ترکیبی و گزینشپذیری پلیمر قالب یونی و یون هدف استفاده میشود. با توجه به یون قالب شده لیگاند مورد نظر استفاده میشود. لیگاندهای مورد استفاده در این تکنیک به دو دسته تقسیم میشوند، الف) لیگاندهای که در ساختار خود پیوند دوگانه کربن-کربن دارند و قابلیت پلیمریزه شدن دارند، ب) لیگاندهای فاقد پیوند دوگانه کربن-کربن، این لیگانده دام شیکه اتصال عرضی پلیمر گیر میافتد.
1-7-4- آغازگر بسیاری از آغازگرهای شیمیایی با خواص شیمیایی متفاوت را میتوان به عنوان منبع رادیکال‎ها در پلیمریزاسیون رادیکالی به کار برد. معمولاً به مقدار کمتری در مقایسه با مونومرها مثلاً : 1درصد وزنی یا 1درصد مولی نسبت به کل مول‎های پیوندهای دوگانه پلیمر شونده به کار برده میشود. سرعت و حالت تجزیه آغازگر به رادیکال‎ها را میتوان بهطریقی از جمله حرارت، تابش نور، وسایل الکتروشیمیایی آغاز وکنترل کرد. مثلاً، آغازگر آزوبیسایزوبوتیرونیتریل به نحو مناسبی از طریق نورکافت یا شکافت گرمایی رادیکالهای با مرکز کربن پایدار شده تولید میکند که قادر به آغاز کردن و گسترش تعداد مونومرهای وینیلی میباشد.
گاز اکسیژن پلیمریزاسیون رادیکالی آزاد را کند می‎کند، بنابراین به منظور به حداکثر رسانی انتشار مونومر بایستی باز تولید پیوسته را بهبود بخشید، حذف اکسیژن محلول بلافاصله قبل از شکل‎گیری توصیه می‎شود. حذف اکسیژن محلول با اولتراسونیک یا با عبور گاز خنثایی مانند: نیتروژن یا آرگون از محلول انجام داد.
1-7-5- مونومر اتصال دهنده عرضی به طور کلی مونومر اتصال دهنده عرضی سه وظیفه مهم برعهده دارد، اول از همه، نقش مهمی در کنترل مورفولوژی شبکه پلیمری تولید شده دارد، که نوع ذرات پلیمری (ژل، ذرات متخلخل در ابعاد ماکرو، یا پودر میکروژل) را تعیین میکند. دومین نقش آن را میتوان ایجاد پایداری برای سایتهای پیوندی قالب شده نام برد، و در آخر، نقش آن در پایداری مکانیکی شبکه پلیمری. غلظت بالای مونومر اتصال دهنده عرضی باعث شیشهای شدن پلیمر و ایجاد شبکههای متعدد و در نتیجه انتقال جرم پایین میشود و غلظت پایین آن باعث کاهش گزینشپذیری و کاهش طول عمر پلیمر قالب یونی میشود. از نقطه نظر پلیمریزاسیون جهت دستیابی به ذراتی باتخلخل دائم، همچنین تولید ذراتی با پایداری مکانیکی بالا، نسبتهای بالایی از مونومر اتصال دهنده عرضی مصرف میشود[23].
1-8- شرایط پلیمریزاسیونچندین تحقیق نشان داده است که پلیمریزاسیون پلیمرهای قالب ملکولی در دماهای پایین پلیمرهای با انتخابگری بیشتری نسبت به پلیمرهای که در دماهای بالاتر سنتز می‎شوند دارند. معمولاٌ بیشتر از دمای 60 درجه سانتی‎گراد به عنوان دمای پلیمریزاسیون استفاده می‎کنند اما آغاز واکنش پلیمریزاسیون خیلی سریع است به همین دلیل کنترل آن خیلی مشکل است که همین منجر به تکرارپذیری کمتر قالب‎زنی مولکولی می‎شود. به علاوه دماهای نسبتاٌ بالا یک اثر منفی بر روی پایداری کمپلکس دارد که تکرارپذیری فازهای ساکن یکپارچه را کاهش می‎دهد و در ستون‎های کروماتوگرافی باعث کاهش فشار زیاد ستون می‎شود، بنابراین دمای نسبتاٌ پایین با زمان طولانی‎تر واکنش انتخاب می‎شود تا پلیمریزاسیون تکرارپذیرتر بهدست آید. در جاهای که تشکیل کمپلکس توسط تشکیل پیوند هیدروژنی تشگیل می‎شود دماهای پایین‎تر ترجیح داده می‎شود و تحت این شرایط آغازگرهای فتوشیمیایی به خوبی جایگزین می‎شود، و به خوبی در دماهای پایین اجرا میشود. برای مثال مسباخ و همکارانش [24] تحقیقی را بر روی انتخابگری پلیمر قالب‎زنی انانتیومر 1-PheNHPh نشان دادند، یک پلیمر به طور حرارتی در دمای 60 درجه سانتی گراد وپلیمر دیگر در دمای صفر درجه سانتی‎گراد پلیمر شد. نتایج نشان دادند که پلیمری که در دمای پایین‎تر انجام شد نسبت به پلیمری که به طور حرارتی تهیه شده بود گزینشپذیرتر است. دلیل این امر بر اساس اصل لوشاتلیه که پیش بینی میکند که در دماهای پایین‎تر تشکیل کمپلکس قبل از پلیمریزاسیون بهتر پایدارتر است. بنابراین تعداد و احتمال و کیفیت سایتهای پیوندی را افزایش می‎دهد[25].
1-9- روشهای پلیمریزاسیونروشهای پلیمریزاسیون را بصورتهای مختلفی میتوان دسته بندی نمود. بر اساس امکان تشکیل مولکول دیگری غیر از پلیمر دو دسته هستند:
1-9-1- پلیمرهای تراکمیپلیمرهای تراکمی ترکیباتی هستند که از مونومرهای چندعاملی توسط انواع گوناگون واکنشهای تراکمی در شیمی آلی حاصل میشوند این واکنشها با حذف مولکولهای کوچکتری چون آب همراه میباشند.
1-9-2- واکنشهای پلیمریزاسیون زنجیرهایدر پلیمریزاسیونهای زنجیرهای وجود یک مرکز فعال برای شروع واکنش لازم و ضروری میباشد. به همین دلیل در این نوع واکنشها حضور شروع کننده عمدتاً ضروری است. نوع شروع کننده خصوصیات مرکز فعال را تعیین میکند. این مرکز فعال میتواند رادیکال آزاد، کاتیون، آنیون و یا مراکز یونی ویژه مانند کاتالیزورهای کوردینانسیونی باشد. براساس محیط انجام واکنش، امروزه در تکنولوژی پلیمرهای قالب مولکولی از چندین نوع روش پلیمریزاسیون استفاده میکند، که عبارتند از: پلیمریزاسیون تودهای، پلیمریزاسیون محلولی، پلیمریزاسیون تعلیقی، پلیمریزاسیون امولسیونی و پلیمریزاسیون تهنشینی.

شکل (1-10) انواع پیونددهندههای عرضی.ادامه شکل (1-10)
1-9-2-1- پلیمریزاسیون تودهایدر این روش مونومرها و آغازگر بدون حلال یا با غلظت بالا فرآیند پلیمریزاسیون را انجام میدهند. پلیمریزاسیون جرمی و یا تودهای یکی از ساده ترین فرآیندهای پلیمریزاسیون است و نیاز به مهارت خاصی ندارد و به علت عدم مصرف مواد افزودنی، ناخالصی در این گونه سیستم ها ناچیز بوده و بنابراین به دستگاههای تخلیص کننده خاص احتیاجی نیست. با توجه به موارد فوق، پلیمریزاسیون تودهای پرکاربردترین روش در سنتز پلیمرهای قالب یونی محسوب میشود، با این وجود، عملیات خرد کردن و آسیاب کردن، همچنین غربال کردن ذرات پلیمری حاصل برای به دست آوردن ذراتی بااندازه مناسب (معمولا قطری در محدوده 20 تا 100 میکرومتر) در این روش، اغلب خسته کننده و وقت گیر بوده و منجر به تولید ذراتی میشود که به لحاظ شکل و اندازه نامنظم میباشند. همچنین ممکن است تعدادی از مکانها و حفرات فعال در طول عملیات آماده سازی ذرات پلیمری تخریب شوند. همچنین در این روش، هنگام انجام پلیمریزاسیون، ویسکوزیته افزایش یافته و این امر مشکلاتی را در حمل ونقل محصول به وجود میآورد. همچنین، به دلیل این که واکنشهای زنجیرهای عموماً گرمازا هستند و افزایش ویسکوزیته از خروج گرما جلوگیری میکند، گرمای بیش از حد در برخی قسمتهای محصول ایجاد شده و سبب زغال شدن و تخریب آن میگردد. به همین دلیل، علیرغم مزایای این روش و انتخاب آن به عنوان روش برگزیده تهیه آزمایشگاهی، پلیمریزاسیون تودهای کاربرد زیادی در صنعت ندارد[26و27]. نمونهای از پلیمر تهیه شده با این روش در شکل (1-11) نشان داده شده است.
جدول (1-3) خلاصه پلیمرهای قالب تهیه شده به روشهای مختلفمعایب مزایا نوع پلیمیریزاسیون
روش خسته کننده است، وقت گیر بوده، ذراتی تولید می شود که به لحاظ شکل و اندازه نامنظم می باشند. روشی ساده است، نیاز به مهارت خاصی ندارد، ناخالصی ناچیز بوده. تودهای
عاری کردن محصول از ذرات بسیار ریز حلال در پایان سخت است، انتخاب حلال کاملاً بی اثر سخت است، طولانی شدن زمان انجام کامل واکنش. انتقال حرارت کم، بوجود آمدن پدیده ژل در این سیستم ها ناچیز است، کنترل دمایی با سهو لت بیشتری انجام میشود. پلیمریزاسیون محلولی
شرایط پلیمریزاسیون بدقت کنترل شود، حلال مصرفی در این روش زیاد است، زمان پلیمریزاسیون طولانی. گرمای کمتری تولید می شود، در مقیاس های صنعتی بیشتر استفاده می شود، ذرات پلیمری کروی شکل می شود. پلیمریزاسیون رسوبی
آب با بیشتر تولیدات قالبی ناسازگار است، جزءبندی فازهای سیستم سخت است، سورفکتانت ویژه پلیمریزاسیون مورد نیاز است. کروی بودن اندازه ذرات، کوچک بودن اندازه ذرات، فاز پیوسته عموماً آب است.
پلیمریزاسیون امولسیونی
همزدن مکانیکی و حضور عوامل معلق کننده برای معلق نگاه داشتن مونومر ضروری می باشد، اندازه و میزان تخلخل ذرات پلیمری با تغییر شرایط پلیمریزاسیون قابل تنظیم میباشد، تولید ذرات کروی شکل به حالت انبوه و متراکم، روشی مؤثر است زیرا تعداد زیادی از قطرات ریز با این روش پلیمریزه میشوند. پلیمریزاسیون تعلیقی
center46200
شکل (1-11) پلیمریزاسیون تودهای [27]شکل (1-12) پلیمریزاسیون تعلیقی[27]1-9-2-2- روش پلیمریزاسیون محلولیبرای رفع مشکلات موجود در پلیمریزاسیون تودهای ، از روش پلیمریزاسیون محلولی استفاده میشود. در این روش، مونومر و پلیمر هر دو در یک حلال، محلول بوده و به علت وجود محیط حلالی، ویسکوزیته مخلوط نسبت به پلیمریزاسیون تودهای کمتر است که در نتیجه نه تنها اختلاط بهتر انجام گرفته و کارآیی شروع کننده افزایش مییابد، بلکه مسائلی مانند انتقال حرارت کم و بوجود آمدن پدیده ژل در این سیستم ها ناچیز است. به همین دلیل میتوان در این گونه سیستم ها به مقادیر تبدیل بالاتری رسید.به عبارت دیگر، از روشهای غلبه بر مشکلات موجود در پلیمریزاسیون تودهای ، حل کردن مونومر در یک حلال مناسب است. از آنجا که در این روش، در مقایسه با پلیمریزاسیون تودهای ، کنترل دمایی با سهولت بیشتری انجام میشود، مشکلات مربوط به گرمازا بودن واکنش، رفع خواهد شد. به عبارت دیگر در این روش به دلیل این که مونومر با یک مایع بیاثر رقیق میشود، کنترل دمای واکنش بسیار آسانتر خواهد شد. گرمای حاصل از واکنش را میتوان با بازگرداندن و یا رفلاکس حلال، از محیط واکشن خارج نمود. البته، معایبی نیز برای پلیمریزاسیون محلولی وجود دارد. عاری کردن محصول از ذرات بسیار ریز حلال در خاتمه عمل، با مشکل همراه است. انتخاب حلال کاملا بیاثر، به آسانی امکانپذیر نیست، بدین معنا که همواره انتقال زنجیر به حلال و محدود شدن وزن مولکولی محصول وجود خواهد داشت. این نکته، دارای اهمیت زیادی بوده و دلیل کاربرد کم روش محلولی در تولید پلیمرهای مهم اقتصادی است. همچنین دمای پلیمریزاسیون به نقطه جوش حلال محدود میشود و در بسیاری از موارد این مسئله منجر به طولانی شدن زمان انجام کامل واکنش میگردد. به عبارت دیگر دمای واکنش از نقطه جوش حلال به کار رفته بالاتر نخواهد رفت و این امر سرعت واکنش را محدود میکند[27و28].
1-9-2-3- پلیمریزاسیون تعلیقی (سوسپانسیونی)
در حقیقت این روش نیز برای جبران نقایص پلیمریزاسیون تودهای به کار میرود. این روش، بسیار شبیه به پلیمریزاسیون محلولی است، با این تفاوت که مونومر به جای حل شدن در یک مایع بیاثر (مانند آب) با استفاده از یک حلال پخش کننده به صورت معلق در آن در میآید. انتقال حرارت و کاهش ویسکوزیته مانند پلیمریزاسیون محلولی است، همچنین همزدن مکانیکی و حضور عوامل معلق کننده برای معلق نگاه داشتن مونومر، ضروری میباشد. این روش، روشی مؤثر است زیرا تعداد زیادی از قطرات ریز با این روش پلیمریزه میشوند. روش فوق منجر به تولید ذرات کروی شکل به حالت انبوه و متراکم میشود، و در صورتی که سیستم به اندازه کافی رقیق باشد، ذرات کره مانند متحدالشکل ریزی تولید میشوند (در محدوده 5 تا 50 میکرومتر). در این روش پلیمریزاسیون، اندازه و میزان تخلخل ذرات پلیمری با تغییر شرایط پلیمریزاسیون قابل تنظیم میباشد[27]. نمونهای از پلیمر تهیه شده با این روش در شکل (1-12) نشان داده شده است.
1-9-2-4- روش پلیمریزاسیون امولسیونیدر یک پلیمریزاسیون امولسیونی، مونومرها به صورت ذرات بسیار ریز (فاز ناپیوسته) در یک فاز پیوسته سیال، توسط عوامل پایدارکننده سطحی (به صورت معلق) از طریق واکنش رادیکال آزاد پلیمریزه میشوند. فاز پیوسته عموما آب بوده و ذرات معلق کلوئیدی در اندازهای بسیار کمتر از یک میکرون میباشند. کروی و کوچک بودن اندازه ذرات، یکی از مزایای عمده این نوع پلیمریزاسیون است. در این سیستم نیز از آب به عنوان حامل استفاده میشود. در اینجا نیز برخی عوامل معلق ساز به نام سورفکتانت به سیستم افزوده میشود. معلق سازها در واقع مایسلهایی ایجاد میکند و به این ترتیب قسمت عمدهای از مونومر را که به صورت قطرههای کوچک پراکنده میشوند انحلالپذیر میکند. رادیکالهای شروع کننده که در آب حل میشوند به درون مایسلهایی که مملو از مونومر هستند، نفوذ میکنند و پلیمریزاسیون شروع میشود. مایسلها مانند مکانهایی که در آنها مونومر به پلیمر تبدیل میشود عمل میکنند[28].
شکل (1-13) پلیمریزاسیون تهنشینی[27]1-9-2-5- پلیمریزاسیون تهنشینی (رسوبی)این روش از جمله روشهای پلیمریزاسیون هست که باعث بدست آمدن ذرات پلیمری کروی شکل میشود. دراین روش پلیمریزاسیون هنگامی که پلیمر تشکیل شده به لحاظ اندازه یا وزن به یک حد مشخص میرسد، شروع به ته نشینی میکند و اغلب اندازه ذرات بیشتراز 10 میکرو متر نمیشود. در این روش برای بدست آوردن محصول با کیفیت بالا باید شرایط پلیمریزاسیون به دقت کنترل شود. پلیمریزاسیون تهنشینی، تقریباً مشابه روش پلیمریزاسیون تودهای میباشد با این تفاوت که حجم حلال مصرفی در این روش بسیار بیشتر میباشد (در حدود 2 تا 10 برابر). در نتیجه استفاده از حجمهای بیشتر حلال، شانس تماس بین گونه هدف و مونومر عاملی نیز کمتر میشود که منجر به زمان پلیمریزاسیون طولانیتر این روش در مقایسه با روش تودهای میشود. همچنین از آنجایی که فاصله بین گونه هدف و مونومر عاملی در این روش نسبتا زیاد میباشد و در نتیجه گرمای کمتری نیز در این روش سنتزی در مقایسه با سایر روشها تولید میشود که باعث کاربرد بیشتر این روش درمقیاسهای صنعتی میشود. در این روش عموماً ذراتی در ابعاد3/0 تا 10 میکرومتر تولید میشوند[26]. از جمله معایب این روش میتوان به زمان بر بودن آن، همچنین نیاز به شرایط ویژه برای آن اشاره کرد. نمونهای از پلیمر تهیه شده با این روش در شکل (1-13) نشان داده شده است.
1-10- اهمیت و کاربردهای پلیمرهای قالبیدر تحقیقات انجام شده در زمینه پلیمرهای قالبی، جدای از اهمیت گونه الگوی به کار رفته (داروها، سموم، ترکیبات آلی، کاتیون ها و...) توسعه دانش فنی ساخت پلیمرهای قالب مولکولی یا یونی بسیار حائز اهمیت است. این پلیمرهای هوشمند، پلیمرهای سنتزی با گزینشپذیری بالا برای مولکول الگو هستند. با توجه به مزایایی نظیر گزینشپذیری، آزادی عمل برای طراحی مولکولی، پایداری مکانیکی و شیمیایی، سادگی و ارزان قیمت بودن، تحقیقات گستردهای در این زمینه صورت گرفته، که منجر به کاربردهای متعدد این روش شده است. از طرفی، بسیاری از مفاهیم مربوط به این علم نیز ازجمله نوع برهمکنشها، ویژگی نانوحفرهها و ... با انتخاب مولکولهای الگوی متفاوت به دست آمده است. در گذشته برای سنتز ترکیباتی که برهمکنش مناسبی با گونه مورد نظر داشته باشند یا حفره مشابهی با گونه مورد نظر داشته و از آنها بتوان برای اندازه گیری یا جداسازی این گونهها استفاده کرد، طی مدتهای طولانی با روشهای پیچیده، پرهزینه و چند مرحلهای این مواد تهیه میشدند. در صورتی که با دستیابی به دانش فنی ساخت پلیمرهای قالب مولکولی برای بسیاری از مواد میتوان به راحتی، با هزینه پایین و در زمان کمتر، این آنتی بادیهای مصنوعی را ساخت. امتیاز دیگر این روش، گزینش پذیری بالای آن است که نسبت به روش های دیگر بسیار بیشتر است. اهمیت دیگر پلیمرهای قالب مولکولی در روش های جداسازی و اندازهگیری داروها، سادگی این روشها و امکان اتوماسیون روشهاست. از آنجا که پلیمرهای قالب مولکولی یا یونی ، توانایی جذب کاملا گزینشی گونه هدف را دارند، امکان جداسازی گزینشی گونه هدف در ماتریسهای پیچیده به طور مستقیم وجود دارد. این روش نسبت به روشهای دیگر مبتنی بر روش استخراج مایع -مایع حد تشخیص را 100 تا 1000 برابر پایین میآورد. در ادامه به بعضی از کاربردهای این نوع پلیمرها اشاره میشود.
1-10-1- جداسازیکاربرد پلیمرهای قالب مولکول به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی، بیشترین کار پژوهشی روی آن صورت گرفته است. قالب زنی یک راه ساده و مستقیمی را برای جداسازی انتخابی مواد فراهم می‎کند. لیست مولکول‎هایی را که مورد آزمون قرارگرفته‎اند شامل بیوملکول‎های نظیر آمینواسید‎ها[9و29] پپتیدهای کوچک[30[، پروتئینها[31]، کربوهیدراتها[32] و تعدادی از مولکولهای دارویی کوچک میباشند. در زمینه جداسازی، مسئله تفکیک انانتیومرها با استفاده از پلیمرهای قالب در مرکز توجه بسیاری از پژوهش‎ها بوده است. شماری از فازهای ساکن کایرال تجاری وجود دارند که برای جداسازی انانتیومرها استفاده می‎شوند. فازهای ساکن کایرال قالبی یک نظم وترتیب شویش قابل پیش بینی دارند که فازهای ساکن کایرال تجاری موجود فاقد آنند. اولین نمونه استفاده از پلیمرهای قالب ملکول به عنوان فاز ساکن کایرال قالب زنی توسط مسباخ وهمکارانش[24] گزارش شد. در این گزارش مسباخ جداسازی انانتیومری مستقیم β- گیرنده (-)-تیمولول (شکل(1-3)) را با استفاده از یک فاز ساکن کایرال تهیه شده به روش قالب زنی مولکولی انجام داد.

شکل (1-14) ساختار گیرنده بتا- آدرنرجیک تیمول، اتنول و پروپانول[24]
شکل (1-15) تصویر میکرووسکوپ الکترونی غشای نفوذپذیر یون اورانیل]33[با وجودی که عمده پژوهش های جداسازی بر روی تهیه فاز های ساکن برای HPLC متمرکز شده است[25]، پلیمرهای قالب ملکول نیز برای تکنیک‎های تجزیه‎ای دیگری مورد استفاده قرار گرفته اند. یکی از کاربردهای مهم پلیمرهای قالب ملکول در استخراج فاز جامد است. انتخابگری ار پیش تعیین شده پلیمر‎‎‎‎‎های قالبی و داشتن انتخابگری بالای جاذب‎ها می‎تواند این سیستمها را بسیار کارا سازد. مواد استخراج فاز جامد قالب مولکولی توانایی خود را برا بهبود حساسیت برای آنالیز نمونه‎های زیست محیطی مقادیر بسیارکم از طریق استخراج حجم‎های بزرگ نمونه نشان داده است. الکتروفورز کاپیلاری با استفاده از فاز ساکن قالب مولکولی و رانش فاز متحرک الکترواسمزی نیز بررسی شده‎اند[34]. این روش پتانسیل را دارد که عملکرد بهتری نسبت به HPLC داشته باشد و نیز مزیت به حداقل رسانی مصرف مواد شیمیایی به ویژه مولکول الگو را دارد. استفاده از غشاهای پلیمر قالب مولکولی برای انتقال مولکول‎ها زمینه تحقیقات وسیعی است. جداسازی برپایه غشاها بالقوه دارای کارایی بیشتر نسبت به تکنیکهای جداسازی رقیب است. کاربرد‎های بالقوه آن در صنایع جداسازی گازها، پتروشیمی و دارویی وجود دارد.
1-10-2- ساخت غشاءاستفاده از تکنولوژی پلیمر قالب مولکولی و یونی در ساخت غشاهای مختلف ازدیگر کاربردهای جدید آنها میباشد. غشاهای ساخته شده با این روش تمایل به جذب بالاتر و انتخابگری بالاتر در نفوذ مولکولها و یونهای هدف نشان میدهند. اولین غشاء با استفاده از پلیمر قالب یونی در سال 2001 به وسیله کیماروو همکارانش جهت جداسازی یون اورانیل از طریق پلیمریزاسیون رسوبی ساخته شد[34]. شکل (1-15) تصویر میکرووسکوپ الکترونی غشای نفوذپذیر یون اورانیل را به خوبی نشان میدهد.
1-10-3- ساخت حسگر یا الکترودساخت حسگرهای شیمیایی، الکتروشیمیایی و زیستی از جمله کاربردهای جدید پلیمرهای قالب مولکولی و یونی در تشخیصهای پزشکی، تجزیه نمونههای محیطی و غذایی و کنترل آلودگی میباشد. براساس نوع مبدل، حسگرها براساس خواص الکتروشیمیایی یا خواص طیف سنجی هستند. پلیمرهای قالبی با گستره وسیعی از انتقال دهندههای علائم پتانسیومتری و آمپرومتری ترکیب شدهاند. اولین الکترود یون گزین بر اساس تکنولوژی پلیمر قالب یونی و خواص الکتروشیمیایی جهت تشخیص یونهای کلسیم و منیزیم در سال1991به وسیله روساتزین و همکارانش ساخته شد که با روش پتانسیومتری این یونهای کلسیم و منیزیم با فاکتور گزینشپذیری به ترتیب 6 و7/1 تشخیص داده شدند[35] و اولین حسگر بر اساس تکنولوژی پلیمر قالب یونی و مبدل طیف سنجی (فلئورسانس) نیز در سال1997 به وسیله موری و همکارانش برای یون سرب ساخته شد[36].
بازنگری جدیدی، حسگرهای الکتروشیمیایی مبتنی بر پلیمرهای دارای قالب مولکولی را تحت پوشش قرار میدهد. بدین صورت که در طراحی این حسگرها درصدی از پلیمرهای قالب مولکولی به عنوان اصلاحگر اضافه میشود. حالا از این حسگر در محلول حاوی آنالیت مورد نظر که در ساخت پلیمر از آن استفاده شده و این پلیمر قابلیت جذب آن را دارد به عنوان الکترود شناساگر استفاده میشود. بر این اساس، شاهد کاربرد روزافزون این مواد پلیمری در حسگرهای الکتروشیمیایی (پتانسیومتری، آمپرومتری، هدایت سنجی) و همچنین حسگرهای نوری میباشیم.
پلیمرهای قالب ملکول به عنوان عناصر تشخیص در ابزارهای حسگرهای شیمیایی استفاده می‎شوند. حسگرهای زیستی از عنصر تشخیصی مثل یک آنتیبادی یا آنزیم به همراه یک مبدل استفاده می‎برند. یک سیگنال شیمیایی حاصله از پیوند آنالیت به گیرنده که بعداً به یک سیگنال الکتریکی یا نوری تبدیل میشود را بتواند رصد شود. در بسیاری موارد، توسعه اجزاء تشخیص دهنده فراتر از روشهای تبدیل سیگنال نظیر نوری، مقاومتی، موج اکوستیک سطحی یا اندازه‎گیری ظرفیت الکتریکی قرار می‎گیرد. پتانسیل قابل توجهی برای ابزارهای حسگر شیمیایی چنانچه اجزاء تشخیص دهنده موجود باشند.
مزیت‎های بالقوه‎ای که با استفاده از پلیمرهای قالب ملکولی به عنوان عنصرتشخیص دهنده به جای گیرنده‎های بیولوژیکی حاصل می‎شود. از آنجاییکه پلیمرهای قالب ملکولی گیرنده‎هایی مصنوعی‎اند، ذخیره‎ای مجازی از آنالیت‎ها دارند. بعلاوه، پلیمرهای قالب ملکولی در مقابل شرایط نامساعد پایدارند که قابل قیاس با حسگر های برپایه بیولوژیکی نیست . مضافا، قابلیت آنها برای بکارگیری عنصر سیگنال دهنده، نظیر میله فلوئورسانس، که درمجاورت سایت پیوندی می‎توان در سنسور استفاده کرد. ممکن است سنسورهایی با آرایهای از پلیمرهای قالبی برای تعدادی از آنالیت‎ها جهت ساخت یک سنسور تکی که قادر به شناسایی مواد متعدد باشد، به کار برد. استفاده از اسپکتروسکپی لومینسانس ترکیب شده با فایبر اپتیک سیستم‎هایی برای کاربرد حسگرها مهیا میکند. استفاده از پلیمر قالب‎زنی مولکولی در ترکیب با این سیستم می‎تواند انتخابگری شیمیایی را به این نوع حسگرها اضافه کند. این تکنولوژی برای تشخیص انواع زیادی از ترکیبات شامل عوامل عصبی، علف کش، مولکولهای دارویی[36] و بیومولکولها به کار می‎رود[37]. مسباخ و همکاران با استفاده از یک ابزار حسگر الیاف نوری بر پایه پلیمرهای قالب ملکولی یک آمینو اسید فلوئورسانسنشان (دانسیل-ال-فنیل آلانین) را نشان دادند. این مواد با استفاده از متاکرلیک اسید و 2- وینیلپیریدین بعنوان مونومر ها و اتیلنگلیکولدیمتاکریلات به عنوان مونومر شبکه کننده تهیه شدند. یک سیستم ساخته شد که درآن ذرات پلیمر در مقابل نوک الیاف نوری با استفاده از یک تور نایلون نگه داشته شد[39]
1-10-4- گیرنده های مصنوعیعیارسنج پیوندی برای تعیین مقادیر کم ترکیبات سرم خون و سایر سیستمها و برای غربال کردن ترکیبات متمایل به یک گیرنده بکار می‎روند. عیار سنج از این نوع به یک گیرنده اختصاصی، اغلب یک آنتیبادی که اختصاصاً به مولکول مورد بررسی نیاز دارد. آنتیبادیها غالباً خواص بسیار عالی تشخیصی برای مولکول متقابل (آنتی ژن) نشان میدهد. اما، کاربرد آنها در شرایط سخت بخاطر حساسیت محدود آن است وآنچه که می‎توان در نظر داشت هزینه بالای تولید آن است. آنتی بادیهای مصنوعی و گیرندههایی که بروش قالب زنی مولکولی تهیه میشوند از نظر تئوری مکمل جاذب همتاهای طبیعیشان هستند . چندین بررسی نشان داده که پلیمرهای قالب مولکولی می‎توانند بعنوان نسخههای مصنوعی آنتی بادی‎ها عمل کنند و بعنوان اجزای در ایمنی سنجی بکار روند. این بررسی‎ها با استفاده ازروش‎های رادیولیگاند پیوندی و روش پیوند پیمانه‎ای مقایسه شده‎اند و اولین کاربرد پلیمر قالب مولکولی به عنوان جزء تشخیص در یک عیارسنج لیگاند پیوندی رادیو نشان برای تشخیص دیازپام وتئوفیلین درسرم انسانی بود. نتاج حاصله قابل مقایسه با روش تثبیت شده برای این داروها بود. روش بکار گرفته برای این تحقیق استفاده از ممانعت پیوند رادیونشان به آنالیت در سرم بود. مقدار رادیولیگاند متصل به پلیمر به صورت عکس متناسب با غلظت آنالیت در سرم بود[39].
1-10-5- کاتالیستهایکی از چالش برانگیزترین کاربردهای پلیمر قالب مولکولی ساخت کاتالیستهای طراحی شده است. به دلیل قابلیت آرایش دادن گروهای عاملی در ماتریس پلیمرهای قالب مولکولی خود را وارد این کاربرد کرده‎اند. روشهای تهیه پلیمرهای قالب مولکولی کاتالیستی شامل: (1) استفاده از یک الگوکه گروه‎های کاتالیست داخل سایت های پیوندی (2) استفاده از حالت گذرا مشابه مولکول الگو (3) استفاده از کمپلکس‎های کئوردینه برا ی تاثیرگذاری روی واکنش کاتالیستی.
1-11- عنصر نیکل[41] این عنصر کاربردهای فراوانی در طبیعت دارد و برای ساخت فولاد ضدزنگ و دیگر آلیاژهای ضد زنگ و خوردگی مثل اینوار و مانل که الیاژى از نیکل و کبالت که در برابر خوردگى مقاوم است به کار میرود. برای ساخت لولههای نیکلی و مسی و همینطور برای نمکزدایی گیاهان و تبدیل آب شور به آب مایع استفاده میشود. نیکل استفادههای فراوانی برای ساخت سکهها و فولاد نیکلی برای زرهها و کلیدها کاربرد دارد و همینطور از نیکل میتوان آلیاژهای نیکروم و پرمالوی و آلیاژی از مس را تهیه کرد. از نیکل برای ساخت شیشههای به رنگ سبز استفاده میشود. صفحات نیکلی میتواند نقش محافظت کننده برای دیگر فلزات را داشته باشد. نیکل همچنین کاتالیزوری برای هیدروژندار کردن روغنهای گیاهی است. همچنین صنعت سرامیک و ساخت آلیاژی از آهن و نیکل که خاصیت مغناطیسی دارد و باتری های قوی ادیسون کاربرد دارد. از ترکیبات مهم نیکل میتوان سولفات و آکسید را نام برد. نیکل طبیعی مخلوطی از 5 ایزوتوپ پایدار است. همچنین 9 ایزوتوپ ناپایدار دیگر نیز شناخته شده است. مقدارنیکل در طبیعت بسیار کم است. انسان در زمینه های مختلف از نیکل استفاده میکند. یکی از عمدهترین کاربردهای نیکل، در صنعت فولاد است. از نیکل به عنوان یکی از اجزا سازنده فولاد و سایر محصولات فلزی استفاده میشود. حتی از نیکل در جواهرات هم استفاده میشود. مقدار اندک نیکل برای انسان ضروری است اما اگر مقدار آن افزایش یابد، برای سلامت انسان خطرناک است. مصرف بالای نیکل احتمال مبتلا شدن به سرطان ریه، سرطان بینی، سرطان حنجره و سرطان پروستات را افزایش میدهد. پس از این که فرد در معرض گاز نیکل قرار گرفت، دچار کسالت و سرگیجه میشود. آب آوردن ریهها مشکلات تنفسی کاهش توانایی تولید مثل، آسم، برونشیت مزمن، حساسیتهایی از قبیل خارش پوست (به خصوص در هنگام استفاده از جواهرات) نارسایی قلبی از دیگر عوارض آن میباشد. از لحاظ تقسیم بندی برنامه سم شناسی ملی آمریکا، نیکل و ترکیبات آن جز عوامل سرطانزا محسوب میشوند و از نظر طبقه بندی آژانس بین المللی تحقیقات سرطان ترکیبات نیکل در گروه یک قرار میگیرند. گروه یک شامل عناصری میباشد که شواهد کافی در مورد سرطانزایی آنها وجود دارد. در این تقسیمبندی عنصر نیکل در گروه 2B قرار دارد. گروه 2B عناصری هستند که ممکن است در انسان سرطان ایجاد کنند. کارخانهها و سوزاندن زبالهها دو عامل اصلی در تولید نیکل و ورود آن به هوا میباشند. مقدار نیکلی که در هوا وجود دارد به مراتب از نیکل موجود در زمین بیشتر است. مدت زمان از بین رفتن نیکل موجود در هوا زیاد است. زمانیکه هرزآبها جریان پیدا میکنند، مقداری نیکل را وارد آبهای سطحی میکنند. بخش اعظم ترکیبات نیکل در طبیعت جذب ذرات خاک و رسوبات شده و در نهایت به صورت غیر متحرک در میآیند. در زمینهای اسیدی نیکل بسیار متحرک میشود و معمولاً در آبهای زیرزمینی شسته میشود. در حال حاضر دانشمندان میدانند که غلظت بالای نیکل در خاکهای ماسهای به گیاهان صدمه میزند و همچنین غلظت بالای نیکل در آبهای سطحی سبب کاهش تعداد و رشد جلبکها میشود. رشد موجودات ذره بینی نیز در حضور نیکل کاهش پیدا میکند، اما معمولاً با گذشت زمان در برابر نیکل مقاوم میشوند. مقدار اندک نیکل باید در غذای جانوران وجود داشته باشد. اما زمانی که مقدار نیکل از حد مجاز خود فراتر رود، میتواند برای جانوران مضر و خطرناک باشد. جانورانی که در نزدیکی پالایشگاه زندگی میکنند، بر اثر دریافت مقدار زیاد نیکل به انواع مختلف سرطان مبتلا میشوند. از آنجایی که نیکل در بافتهای گیاهی و جانوری نمیتواند تجمع پیدا کند، اثری در زنجیره غذایی ندارد.
1-12- مروری بر کارهای گذشتهدر سال 2004 ارسوز و همکارانش با استفاده از پلیمرهای قالب یونی سنتز شده در استخراج فاز جامد به روش F= یونهای نیکل را در نمونههای زیستی و غذای پیشتغلیظ کردند. که حد تشخیص این روش 3/0 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[42].
در سال 2006 چانگ و همکارانش بااستفاده از جاذب سیلیکاژل سطحی در استخراج فاز جامد به روش ICP-AES یونهای نیکل را در نمونههای آبی اندازه گیری کردند. که حد تشخیص این روش 16/0 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[43].
در سال 2008 رومانی و همکارانش با استفاده از پلیمرهای قالب یونی سنتز شده در استخراج فاز جامد یونهای نیکل را از نمونههای آب شور جداسازی کردند. که این کار با روش ICP-OES صورت پذیرفت. حد تشخیص این روش3/0 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[44].
در سال 2008 سراجی و همکارانش با استفاده از پلیمرهای قالب یونی سنتز شده استخراج گزینش¬پذیر فاز جامد یونهای نیکل را در نمونههای آبی انجام دادند. حد تشخیص این روش 2/0 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[45].
درسال 2009 رومانی و همکارانش با استفاده از پلیمرهای قالب یونی سنتز شده به روش CP-OES، یونهای نیکل را در نمونههای آب شوراندازه گیری کردند. که حد تشخیص این روش 26/0 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[46].
در سال 2010 سینگ و همکارانش با استفاده از پلیمرهای قالب یونی سنتز شده با روش F= یونهای نیکل را در نمونههای آب دریایی اندازه گرفتند. حد تشخیص این روش 6/1 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[47].
در سال 2011 خواجه و همکارانش با استفاده از لیگاند 40،20،7،5،3-پنتاهیدروکسیفلاون(مورین) نانو ذرات پلیمری قالب یونی سنتز، و از آن برای اندازهگیری و جداسازی گزینشپذیر یونهای سرب در نمونههای مختلف استفاده کردند. حد تشخیص این روش 92 نانوگرم بر لیتر گزارش شده است[48].
. در سال 2012 بهبهانی و همکارانش از نانو ذرات پلیمری قالب یونی سنتز شده برای استخراج گزینشپذیر و پیشتغلیظ یونهای نیکل از نمونههای زیستی به روش F= استفاده کردند. حد تشخیص این روش15/0 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[49]
در سال 2013 رجبی و همکارانش از نانو ذرات پلیمری قالب یونی سنتز شده برای اندازهگیری یونهای پتاسیم در نمونههای آبی بر اساس دیسیکلوهگزیل 18C6 استفاده کردند. حد تشخیص این روش 8/3 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[50].
در سال 2014 شمسیپور و همکارانش با استفاده از لیگاند 40،20،7،5،3-پنتاهیدروکسیفلاون(مورین) نانو ذرات پلیمری قالب یونی سنتز کردند که برای اندازهگیری و جداسازی گزینشپذیر یونهای روی در نمونههای مختلف استفاده کردند. حد تشخیص این روش 3/0 میکروگرم بر لیتر گزارش شده است[51].

جدول (1-4) مقایسه کارهای گذشته اندازهگیری یون نیکلشماره لیگاند اندازه نانو ذرات pH مقدار جاذب (mg) گستره
خطی
(µgL−1) حد تشخیص
(μgL−1) انحراف استاندارد (درصد) روش کار منابع
1 5-وینیل-هیدروکسیکینولین 10 میکروومتر 0/9 300 --- 26/0 0/6 ICP-OES [42]
2 متاکریلوهیستیدندیهیدراته ---- 0/7 30 3/0-25 3/0 1/4 F= [43]
3 آمینوفانکشنالیزد
سیلیکاژل ---- 0/8 20 ---- 16/0 48/1 ICP-AES [44]
4 8- هیدروکسیکینولین 10 میکروومتر 5/8 100-300 ---- 3/0 0/6 ICP-OES [45]
5 وینیلبنزوات ---- 5/6 100 25-125 3/0 06/1 GTA-= [4]
6 دیتیزون 53-106
میکروومتر 0/8 100 5-100 6/1 4/3 F= [47]
8 40،20،7،5،3-پنتاهیدروکسیفلاون 50-70 نانو
متر
0/8 20 3-10 0/1 4/2 UV-Vis Spectrophotometry تحقیق حاضر
فصل دومبخش تجربی2-1- دستگاه‌ها و وسایل مورد نیازدر این تحقیق از دستگاههای زیر استفاده گردید.
دستگاه اسپکتروفوتومتر جذبی UV-Vis مدل 25-Lambda، سانتریفیوژ (Wehingen) Z 206 A، همزن مغناطیسیIKA RH basic 2(Italy) ، آون DIGITA-STERILIEZR مدل CSL60، دستگاه FT-IR مدل 460 PLUS، دستگاه میکرووسکوپ الکترونی روبشی مدل EM10C-100 KV-ZEISS، ، ترازو، و کلیه اندازهگیریهای pH به وسیلهی pH متر مدل 827 ساخت شرکت متراهم انجام شد.
در این تحقیق از وسایل زیر استفاده گردید.
سل کوارتز (3×1×1 سانتیمتری)، بشر، پیپت، پوار، میکرووپیپت، اسپاتول ، کاغذ توزین، لوله آزمایش، شیشه ساعت و هاون.
2-2- مواد شیمیائی لازمنیتریک اسید %65 (حجمی/حجمی)، سولفوریکاسید %98 (حجمی/حجمی)، هیدروکلریکاسید %37 (حجمی/حجمی)، استونیتریل، لیگاند مورد استفاده، 40،20،7،5،3-پنتاهیدروکسیفلاون (مورین)، اتیلنگلیکولدیمتاکریلات، متاکریلیکاسید و 2،ˊ2 آزوبیس ایزوبوتیرونیتریل از شرکتهای معتبر مواد شیمیایی تهیه شدند.
جدول (2-1) ویژگیهای متاکریلک اسید ساختار
7-19-64 CAC number
C4H6O2 فرمول
85 درصد خلوص(درصد)
86 جرم مولکول(گرم بر مول)
015/1 چگالی(گرم بر سانتیمتر مکعب)
161 نقطه جوش(درجه سانتیگراد)
جدول (2-2) ویژگیهای اتیلن گلیکولدی متاکریلات ساختار
5-90-97 CAC number
[H2C=C(CH3)CO2CH2-]2 فرمول
7/99 درصد خلوص(درصد)
198 جرم مولکول(گرم بر مول)
1/11 چگالی(گرم بر سانتیمتر مکعب)
108 نقطه جوش(درجه سانتیگراد)

جدول (2-3) ویژگیهای 2وˊ2-آزوبیسایزو بوتیرو نیتریل ساختار
1-67-78 CAC number
(CH3)2C(CN)N=NC(CH3)2CN فرمول
98 درصد خلوص(درصد)
164 جرم مولکول(گرم بر مول)
1/1 چگالی(گرم بر سانتیمتر مکعب)
5/101 نقطه جوش(درجه سانتیگراد)
نمکهای مورد نیاز شامل آهن نیترات 9 آبه، آلومینیم نیترات 9 آبه، نیکل نیترات 6 آبه، کبالت نیترات 5 آبه، منگنز نیترات 4 آبه، کادمیم نیترات 4 آبه، لیتیم نیترات، کلسیم نیترات 4 آبه، روی نیترات 4 آبه، مس نیترات 3 آبه، سدیم نیترات، پتاسیم نیترات، سدیم کلرید، با بالاترین درجه خلوص و بدون نیاز به خالصسازی بیشتر، همگی از شرکتهای معتبر تهیه شدند
2-3- سنتز نانو ذرات پلیمر قالب یون برای اندازهگیری یون نیکلنانو ذرات پلیمری قالب یونی نیکل به وسیله روش پلیمریزاسیون رسوبی ساخته شد[51]. جهت ساخت پلیمر مورد نظر 2/0 میلیمول از لیگاند مورین، 1/0 میلیمول از نمک نیکلنیترات 6 آبه ، 6/1 میلیمول از مونومر عاملی (متاکریلیک اسید) درون 23 میلیلیتر اتانول-استونیتریل) حجمی/حجمی; 2:1 (به عنوان حلال پلیمریزاسیون حل شدند. به منظور کامل شدن واکنش تشکیل کمپلکس، محلول حاصل به مدت یک ساعت در این حالت هم زده شد. سپس 8 میلیمول از مونومر اتصال دهنده عرضی (اتیلنگلیکولدیمتاکریلات) و 60 میلیگرم از آغازگر به محلول تهیه شده قبلی اضافه گردید. با توجه به اینکه مولکولهای اکسیژن درون محلول باعث به دام اندازی آغازگر شده و باعث کندی فرایند پلیمریزاسیون میشود، محلول حاصل به مدت 10 دقیقه توسط عبور گاز نیتروژن، پاکسازی و گاززدایی شد. در نهایت، به منظور انجام فرآیند پلیمریزاسیون محلول حاصل به مدت 24 ساعت درون حمام روغن گرم با دمای 80 درجهسانتیگراد قرار داده شد. بعد از این زمان، ذرات پلیمری حاصل درون یک هاون پودر شد. جهت حذف مونومرهای واکنش نداده، ذرات پلیمری در ابتدا توسط مقدار کافی آب مقطر شسته شدند. در ادامه به منظور حذف یونهای نیکل قالب شده از درون شبکه پلیمری و ایجاد سایتها و حفرات گزینشپذیر ذرات حاصل با غلظت 6 مولار اسیدکلریدریک شسته شدند، تا جایی که محلول حاصل شستشو عاری از هرگونه یون نیکل باشد. در ادامه فرآیند آماده سازی، با توجه به اسیدی بودن پلیمرقالب یونی، پلیمر پودر شده حاصل بوسیله آب دوبار تقطیر شسته شد تا pH آب شسته شده خنثی شود و سپس در دمای 60 درجه سانتیگراد خشک شد.
2-4- سنتز پلیمر قالب نشده((NIPذرات پلیمر قالب نشده به وسیله روش پلیمریزاسیون رسوبی ساخته شد. جهت ساخت پلیمر مورد نظر 2/0 میلیمول از لیگاند مورین، 6/1 میلیمول از مونومر عاملی (متاکریلیک اسید) درون 23 میلیلیتر اتانول-استونیتریل به عنوان حلال پلیمریزاسیون حل شدند. به منظور کامل شدن واکنش تشکیل کمپلکس، محلول حاصل به مدت یک ساعت در این حالت هم زده شد. سپس 8 میلیمول از مونومر اتصال دهنده عرضی (اتیلنگلیکولدیمتاکریلات) و 60 میلیگرم از آغازگر به محلول تهیه شده قبلی اضافه گردید. با توجه به اینکه مولکولهای اکسیژن درون محلول باعث به دام اندازی آغازگر شده و باعث کندی فرایند پلیمریزاسیون میشود، محلول حاصل به مدت 10 دقیقه توسط عبور گاز نیتروژن، پاک سازی و گاززدایی شد. در نهایت، به منظور انجام فرآیند پلیمریزاسیون محلول حاصل به مدت 24 ساعت درون حمام روغن گرم با دمای 80 درجه سانتیگراد قرار داده شد. بعد از این زمان، ذرات پلیمری حاصل درون یک هاون پودر شد.
2-5- محلول‌سازی
2-5-1- تهیه محلولهای لازم برای بررسی تشکیل و تعیین نسبت فلز به لیگاند کمپلکس برای تهیه محلول 3-10×0/1 مولار نیکل مقدار 3-10×9/2 گرم از نیکل نیترات جامد در یک بالن حجمی 10 میلیلیتری حل کرده تا محلول 3-10×0/1 مولار نیکل تهیه و به با اتانول به حجم رسانده شد.
برای تهیه محلول 3-10×0/1 مولار مقدار 3-10×0/3 گرم از مورین جامد در یک بالن حجمی 10 میلیلیتری حل کرده تا محلول 3-10×0/1 مولار مورین تهیه و با اتانول به حجم رسانده شد.
2-5-2- تهیه محلول مادرنیکل
محلول 1000 میلیگرم بر لیتر از نیکل با انحلال 05/0 گرم از نمک نیکل نیترات 6 آبه با وزن مولکولی 0/291 گرم بر مول در حداقل آب دوبار تقطیر حل و به حجم رساندن با آب مقطر دریک بالن حجمی حجمی 50 میلی‎لیتری تهیه شد.
2-5-3- تهیه محلول مادر دیمتیلگلیاکسیم برای اندازهگیری اسپکتروفتومتریمحلول4+10×0/1 میلیگرم بر لیتر از دیمتیلگلیاکسیم از انحلال 05/0گرم دیمتیلگلیاکسیم توسط آب دوبار تقطیر در بالن حجمی 50 میلیلیتر حل کرده و سپس با آب دو بار تقطیر به حجم رسانده شد و تمام محلولهای مورد نیاز با رقیق کردن این محلول به دست آمد.
2-5-4- تهیه محلولهای کاتیونهای مختلف برای بررسی اثرات مزاحمتمحلولهای 1000-500 میلیگرم بر لیتر از هرکدام از یونهای، سدیم، کادمیم، کبالت، جیوه، سرب، زینک، مس، منگنر، منساخته شد، به این ترتیب که مقدار مورد نیاز از نمکهای NaCl، KCl،AgNO3، Cd(NO3)2.4H2O، Co(NO3)2.6H2O، HgCl2، Pb(NO3)2.4H2O، Cu(NO3)2.3H2O، Zn(NO3)2.6H2O، Mn(NO3)2.4H2O، Mg(NO3)2.6H2O، Fe(NO3)3.9H2O، Cr(NO3)3.9H2O توزین شد و در بالن حجمی 10 میلیلیتری با آب دوبار تقطیر حل و سپس به حجم رسانده شد. محلولهای رقیق تر مورد نیاز از رقیق کردن این محلولها ساخته شدند.
2-6- آماده سازی نمونههای آب برای اندازهگیری نیکلنمونههای حقیقی استفاده شده مربوط به اندازهگیری نیکل به روش اسپکتروفتومتری عبارتند ازسه نمونه: آب آشامیدنی شهر یاسوج و آب رودخانه بشار یاسوج و آب ابشار یاسوج. نیکل موجود در50 میلیلیتر از هر کدام از نمونههای آب پس از افزودن مقداری اسیدکلریدریک و قرار دادن نمونه به مدت 20 دقیقه در حمام بخار با دمای 80 درجه سانتیگراد و سپس قرار دادن نمونه به مدت 30 دقیقه زیر لامپ ماوراء بنفش به دست آمد. که این محلول جهت اندازهگیری به روش افزایش استاندارد مورد استفاده قرار داده شد[52].
2-7- پیشتغلیظ یون نیکل با استفاده از پلیمرهای قالب یون تهیه شدهمحلول 3-10×0/1 مولار لیگاند و یون نیکل تهیه شد. سپس 2 میلیلیتر اتانول به سل اضافه و 100 میکرولیتر از محلول لیگاند به حلال درون سل اضافه شد. سپس با افزودن حجمهای مشخصی از یون نیکل طیف جذبی مجصول در هر نقطه ثبت گردید. داده‎های مربوط به طیف جذبی محلول لیگاند در محدوده طول موج 270 تا 570 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر به دست آمد. سپس حجم مشخصی از محلول یون نیکل به طور مرحله‎ای به سل اضافه شد. ابتدا 10 میلیلیتر از محلول 2 میلیگرم بر لیتر از محلول نیکل را در بالن حجمی 10 میلیلیتری تهیه شد و با آب مقطر به حجم رسانیده شد، سپس به وسیله محلول سود و اسیدکلریدریک (رقیق) pH محلول روی 8 تنظییم شد. سپس20 میلیگرم از نانو ذرات پلیمری قالب یون به آن اضافه و به مدت 45 دقیقه روی همزن مغناطیسی قرار گرفت تا جذب صورت پذیرد و بعد از این مرحله محلول را به مدت 6 دقیقه سانتریفیوژ شد و جاذب رسوب کرده با 2 میلیلیتر اسیدکلریدریک به مدت 16 دقیقه شتششو داده شد و بعد دوباره به مدت 6 دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس محلول بالای را برداشته شد و به آن به در ابتدا به میزان سه برابر دیمتیلگلیاکسیم، و سپس 1 میلیلیتر از پرسولفات و 1 میلیلیتر آمونیاک اضافه شد و با آب مقطر به حجم 10 میلیلیتر رسانده شد. و در انتها با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis طیف آن گرفته شد[۵۳].
فصل سومبررسی نتایج و نتیجهگیری3-1- بررسی تشکیل و تعیین نسبت فلز به لیگاند کمپلکس بین یون نیکل و مورینبه منظور بررسی تشکیل و تعیین نسبت فلز به لیگاند کمپلکس بین یون نیکل و مورین بر اساس روش پیشنهادی (2-7) داده‎های مربوط به طیف جذبی محلول لیگاند در محدوده طول موج 270 تا 570 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر به دست آمد، سپس حجم مشخصی از محلول یون نیکل به طور مرحله‎ای به سل اضافه شد. داده‎های مربوط به طیف جذبی محلول کمپلکس حاصل پس از هر مرحله افزایش محلول یون فلزی به محلول درون سل، توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر به دست آمد. افزایش محلول یون فلزی تا زمانی که با تغییر نسبت فلز به لیگاند افزایشی در جذب مشاهده شود، ادامه پیدا می‎کند. منحنی نسبت مولی، در طول موج 416 نانومتر مربوط به کمپلکس ترسیم شد. استوکیومتری تشکیل کمپلکس بین یون نیکل و مورین با استفاده از روش نسبت مولی نشان دهنده نسبت فلز به لیگاند (2:1) میباشد[54].
جدول (3-1) جذب بر حسب حجم یون نیکل اضافه شده در طول موج 416 نانومترجذب حجم یون نیکل اضافه شده(میکرو لیتر)
32/0 0
47/0 10
60/0 20